特開 2024-56730 ケトヘキソキナーゼ（ＫＨＫ）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024056730

(43)【公開日】2024-04-23

(54)【発明の名称】ケトヘキソキナーゼ（ＫＨＫ）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20240416BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240416BHJP

   C12Q 1/06 20060101ALI20240416BHJP

   C12Q 1/48 20060101ALI20240416BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20240416BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240416BHJP

   A61K 47/54 20170101ALI20240416BHJP

   A61P 19/06 20060101ALI20240416BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20240416BHJP

   A61P 3/06 20060101ALI20240416BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20240416BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20240416BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20240416BHJP

   A61P 9/12 20060101ALI20240416BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240416BHJP

   A61K 47/18 20170101ALI20240416BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 130Z

C12N5/10 ZNA

C12Q1/06

C12Q1/48 Z

A61K31/713

A61P43/00 111

A61K47/54

A61P19/06

A61P1/16

A61P3/06

A61P3/10

A61P13/12

A61P9/00

A61P9/12

A61K45/00

A61K47/18

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2024008864

(22)【出願日】2024-01-24

(62)【分割の表示】P 2020573233の分割

【原出願日】2019-09-17

(31)【優先権主張番号】62/732,600

(32)【優先日】2018-09-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＢＲＩＪ

２．ＰＹＴＨＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】505369158

【氏名又は名称】アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＡＬＮＹＬＡＭ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100157956

【弁理士】

【氏名又は名称】稲井 史生

(74)【代理人】

【識別番号】100170520

【弁理士】

【氏名又は名称】笹倉 真奈美

(72)【発明者】

【氏名】グレゴリー・ヒンクル

(57)【要約】      （修正有）

【課題】ケトヘキソキナーゼ（ＫＨＫ）遺伝子を標的とするＲＮＡｉ剤を提供する。
【解決手段】ケトヘキソキナーゼ（ＫＨＫ）遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、該ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含んでおり、センス鎖は、特定の配列を有するヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、特定の配列を有するヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤を提供する。本発明は、対象におけるＫＨＫ遺伝子発現を阻害するためのＲＮＡｉ剤を使用する方法およびＫＨＫ関連疾患の治療方法または予防方法も提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ケトヘキソキナーゼ(ＫＨＫ)遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(ｄｓＲＮＡ)剤であって、該ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含んでおり、該センス鎖は、配列番号：１のヌクレオチド８９～１０７、１７６～１９４、２６４～２８２、４７４～４９２、５０８～５２６、５２９～５４７、５６２～５８０、６１６～６４６、６８２～７００、７０５～７２３、７０５～７５７、７０５～７９９、７３９～７５７、７３９～７９９、７６０～７９９、８０４～８２２、８３７～８５５、８９２～９１０、９５９～９７７、９９２～１０１０、９２２～１０４１、１０１３～１０４１、１０６９～１１０８、１１６９～１１４０、１１１１～１１４０、１１５５～１１９６、１２２１～１２６１、１２６７～１２９４または１３２０～１３５０のいずれか１つのヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含み、該アンチセンス鎖は、配列番号：２のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む、二本鎖リボ核酸(ｄｓＲＮＡ)剤。

【請求項2】

ケトヘキソキナーゼ(ＫＨＫ)遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(ｄｓＲＮＡ)剤であって、該ｄｓＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含んでおり、該アンチセンス鎖は、表３または５に列挙したアンチセンス配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む相補性領域を含む、二本鎖リボ核酸(ｄｓＲＮＡ)剤。

【請求項3】

アンチセンス鎖が、ＡＤ－７２５０６、ＡＤ－７２３１９、ＡＤ－７２５０２、ＡＤ－７２５１３、ＡＤ－７２４９９、ＡＤ－７２３０３、ＡＤ－７２５００、ＡＤ－７２５２２、ＡＤ－７２５１２、ＡＤ－７２３０４、ＡＤ－７２５１４、ＡＤ－７２２５７、ＡＤ－７２２９５、ＡＤ－７２３３２、ＡＤ－７２５０７、ＡＤ－７２３１１、ＡＤ－７２５０１、ＡＤ－７２５０８、ＡＤ－７２２９３、ＡＤ－７２３２２、ＡＤ－７２２６４、ＡＤ－７２２９０、ＡＤ－７２３３８、ＡＤ－７２３１５、ＡＤ－７２２７２、ＡＤ－７２３３７、ＡＤ－７２２９８、ＡＤ－７２５０３、ＡＤ－７２３２７、ＡＤ－７２５２１、ＡＤ－７２３０９、ＡＤ－７２３１３、ＡＤ－７２５１７、ＡＤ－７２３１６、ＡＤ－７２３３５またはＡＤ－７２３１７からなる群から選択されるいずれか１つの二本鎖アンチセンス配列と３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む、請求項２記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項4】

センスおよびアンチセンス鎖が、表３または５の配列のいずれかから選択される配列を含む、請求項１～３いずれか一項記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項5】

ｄｓＲＮＡが、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１～４いずれか一項記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項6】

センス鎖の全てのヌクレオチドおよびアンチセンス鎖の全てのヌクレオチドが、修飾を含む、請求項１～４いずれか一項記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項7】

ケトヘキソキナーゼ(ＫＨＫ)遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(ｄｓＲＮＡ)剤であって、該ｄｓＲＮＡ剤が、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含んでおり、
該センス鎖は、配列番号：１のヌクレオチド８９～１０７、１７６～１９４、２６４～２８２、４７４～４９２、５０８～５２６、５２９～５４７、５６２～５８０、６１６～６４６、６８２～７００、７０５～７２３、７０５～７５７、７０５～７９９、７３９～７５７、７３９～７９９、７６０～７９９、８０４～８２２、８３７～８５５、８９２～９１０、９５９～９７７、９９２～１０１０、９２２～１０４１、１０１３～１０４１、１０６９～１１０８、１１６９～１１４０、１１１１～１１４０、１１５５～１１９６、１２２１～１２６１、１２６７～１２９４または１３２０～１３５０のいずれか１つのヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含み、該アンチセンス鎖は、配列番号：２のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含み、
該センス鎖の実質的に全てのヌクレオチドおよび該アンチセンス鎖の実質的に全てのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドであり、
該センス鎖は、３'末端に結合したリガンドにコンジュゲートされている、
二本鎖リボ核酸(ｄｓＲＮＡ)剤。

【請求項8】

センス鎖の全てのヌクレオチドおよびアンチセンス鎖の全てのヌクレオチドが、修飾を含んでいる、請求項７記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項9】

少なくとも１つの修飾ヌクレオチドが、デオキシ-ヌクレオチド、３'末端デオキシ-チミン(ｄＴ)ヌクレオチド、２'-Ｏ-メチル修飾ヌクレオチド、２'-フルオロ修飾ヌクレオチド、２'-デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックヌクレオチド、アンロックヌクレオチド、立体配座的に拘束されたヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、非塩基性ヌクレオチド、２'-アミノ修飾ヌクレオチド、２'-Ｏ-アリル修飾ヌクレオチド、２'-Ｃ-アルキル修飾ヌクレオチド、２'-ヒドロキシル修飾ヌクレオチド、２'-メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２'-Ｏ-アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミデート、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１,５－アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５'－ホスフェートを含むヌクレオチドおよび５'－ホスフェート模倣体を含むヌクレオチドからなる群から選択される、請求項７記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項10】

修飾ヌクレオチドが、３'末端デオキシ-チミンヌクレオチド(ｄＴ)の短い配列を含む、請求項９記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項11】

相補性領域が、少なくとも１７個のヌクレオチド長である、請求項２または３記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項12】

相補性領域が、１９～２１個のヌクレオチド長である、請求項２または３記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項13】

相補性領域が、１９個のヌクレオチド長である、請求項１２記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項14】

各鎖が、３０個のヌクレオチド長以下である、請求項１～３および７いずれか一項記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項15】

少なくとも１つの鎖が、少なくとも１つのヌクレオチドの３'オーバーハングを含む、請求項１～３および７いずれか一項記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項16】

少なくとも１つの鎖が、少なくとも２つのヌクレオチドの３'オーバーハングを含む、請求項１～３および７いずれか一項記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項17】

リガンドを更に含んでいる、請求項１～３いずれか一項記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項18】

リガンドが、ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖の３'末端にコンジュゲートしている、請求項１７記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項19】

リガンドが、Ｎ-アセチルガラクトサミン(ＧａｌＮＡｃ)誘導体である、請求項７または１７記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項20】

リガンドが、

【化1】

である、請求項１９記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項21】

ｄｓＲＮＡ剤が、以下のスキーム：

【化2】

(式中、Ｘは、ＯまたはＳである)
に示される通りにコンジュゲートされている、請求項１９記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項22】

ＸがＯである、請求項２１記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項23】

相補性領域が、表３または５のアンチセンス配列の一つを含んでいる、請求項２または３記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項24】

相補性領域が、表３または５のアンチセンス配列の一つを含んでなる、請求項２または３記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項25】

細胞内のケトヘキソキナーゼ(ＫＨＫ)遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(ｄｓＲＮＡ)剤であって、該ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含んでおり、該アンチセンス鎖は、ＫＨＫをコードするｍＲＮＡに対する相補性領域を含んでおり、各鎖は、約１４～約３０個のヌクレオチド長であって、式(ＩＩＩ)：
センス：５'ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－(ＸＸＸ)_ｉ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－(ＺＺＺ)_ｊ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３'
アンチセンス：３'ｎ_ｐ'－Ｎ_ａ'－(Ｘ'Ｘ'Ｘ')_ｋ－Ｎ_ｂ'－Ｙ'Ｙ'Ｙ'－Ｎ_ｂ'－(Ｚ'Ｚ'Ｚ')_ｌ－Ｎ_ａ'－ｎ_ｑ'５'
(ＩＩＩ)
(式中、ｉ、ｊ、ｋおよびｌは、互いに独立して、０または１であり；
ｐ、ｐ'、ｑおよびｑ'は、互いに独立して、０～６であり；
各Ｎ_ａおよびＮ_ａ'は、独立して、０～２５個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示し、これらは、修飾または非修飾あるいはそれらの組み合わせのいずれかであり、各配列は、少なくとも２つの異なる修飾ヌクレオチドを含み；
各Ｎ_ｂおよびＮ_ｂ'は、独立して、０～１０個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示し、これらは、修飾または非修飾あるいはそれらの組み合わせのいずれかであり；
各々ｎ_ｐ、ｎ_ｐ'、ｎ_ｑおよびｎ_ｑ'は、存在または非存在であってもよく、これらは、独立してオーバーハングヌクレオチドを示し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ'Ｘ'Ｘ'、Ｙ'Ｙ'Ｙ'およびＺ'Ｚ'Ｚ'の各々は、独立して、３つの連続するヌクレオチド上の３つの同一修飾の１つのモチーフを表し；
Ｎ_ｂ上の修飾は、Ｙ上の修飾と異なり、Ｎ_ｂ'上の修飾は、Ｙ'上の修飾と異なり；および
該センス鎖は、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされている)
により示される、二本鎖リボ核酸(ｄｓＲＮＡ)剤。

【請求項26】

ｉが０であるか；ｊが０であるか；ｉが１であるか；ｊが１であるか；ｉおよびｊの両方が０であるか；またはｉおよびｊの両方が１である、請求項２５記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項27】

ｋが０であるか；ｌが０であるか；ｋが１であるか；ｌが１であるか；ｋおよびｌの両方が０であるか；またはｋおよびｌの両方が１である、請求項２５記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項28】

ＸＸＸがＸ'Ｘ'Ｘ'に相補的であり、ＹＹＹがＹ'Ｙ'Ｙ'に相補的であり、ＺＺＺがＺ'Ｚ'Ｚ'に相補的である、請求項２５記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項29】

ＹＹＹモチーフが、センス鎖の切断部位またはその近傍に存在する、請求項２５記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項30】

Ｙ'Ｙ'Ｙ'モチーフが、アンチセンス鎖の５'末端から１１、１２および１３位置に存在する、請求項２５記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項31】

Ｙ'が、２'－Ｏ－メチルである、請求項３０記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項32】

式(ＩＩＩ)が、式(ＩＩＩａ)：
センス：５'ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－ＹＹＹ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３'
アンチセンス：３'ｎ_ｐ'－Ｎ_ａ'－Ｙ'Ｙ'Ｙ'－Ｎ_ａ'－ｎ_ｑ'５'
(ＩＩＩａ)
により示される、請求項２９記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項33】

式(ＩＩＩ)が、式(ＩＩＩｂ)：
センス：５'ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－ＺＺＺ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３'
アンチセンス：３'ｎ_ｐ'－Ｎ_ａ'－Ｙ'Ｙ'Ｙ'－Ｎ_ｂ'－Ｚ'Ｚ'Ｚ'－Ｎ_ａ'－ｎ_ｑ'５'
(ＩＩＩｂ)
(式中、各Ｎ_ｂおよびＮ_ｂ'は、独立して、１～５つの修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示す)
により示される、請求項２９記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項34】

式(ＩＩＩ)が、式(ＩＩＩｃ)：
センス：５'ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－ＸＸＸ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３'
アンチセンス：３'ｎ_ｐ'－Ｎ_ａ'－Ｘ'Ｘ'Ｘ'－Ｎ_ｂ'－Ｙ'Ｙ'Ｙ'－Ｎ_ａ'－ｎ_ｑ'５'
(ＩＩＩｃ)
(式中、各Ｎ_ｂおよびＮ_ｂ'は、独立して、１～５つの修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示す)
により示される、請求項２９記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項35】

式(ＩＩＩ)が、式(ＩＩＩｄ)：
センス：５'ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－ＸＸＸ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－ＺＺＺ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３'
アンチセンス：３'ｎ_ｐ'－Ｎ_ａ'－Ｘ'Ｘ'Ｘ'－Ｎ_ｂ'－Ｙ'Ｙ'Ｙ'－Ｎ_ｂ'－Ｚ'Ｚ'Ｚ'－Ｎ_ａ'－ｎ_ｑ'５'
(ＩＩＩｄ)
(式中、各Ｎ_ｂおよびＮ_ｂ'は、独立して、１～５つの修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示し、各Ｎ_ａおよびＮ_ａ'は、独立して、２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示す)
により示される、請求項２９記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項36】

二本鎖領域が、１５～３０個のヌクレオチド対長である、請求項７または２５記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項37】

二本鎖領域が、１７～２３個のヌクレオチド対長である、請求項３６記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項38】

二本鎖領域が、１７～２５個のヌクレオチド対長である、請求項３６記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項39】

二本鎖領域が、２３～２７個のヌクレオチド対長である、請求項３６記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項40】

二本鎖領域が、１９～２１個のヌクレオチド対長である、請求項３６記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項41】

二本鎖領域が、２１～２３個のヌクレオチド対長である、請求項７または２５記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項42】

各鎖が、１５～３０個のヌクレオチド長である、請求項２５記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項43】

各鎖が、１９～３０個のヌクレオチド長である、請求項７、２５および３５いずれか一項記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項44】

ヌクレオチド上の修飾が、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２'－メトキシエチル、２'－Ｏ－アルキル、２'－Ｏ－アリル、２'－Ｃ－アリル、２'－フルオロ、２'－デオキシ、２'－ヒドロキシルおよびその組み合わせ、からなる群から選択される、請求項７または２５記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項45】

ヌクレオチド上の修飾が、２'-Ｏ-メチルまたは２'-フルオロ修飾である、請求項４４記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項46】

リガンドが、一価、二価または三価の分枝鎖リンカーを介して結合された１以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である、請求項７または２５記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項47】

リガンドが、

【化3】

である、請求項２５記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項48】

リガンドが、センス鎖の３'末端に結合されている、請求項２５記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項49】

ＲＮＡｉ剤が、以下のスキーム：

【化4】

に示されるリガンドにコンジュゲートされている、請求項４８記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項50】

剤が、少なくとも１つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間の結合をさらに含む、請求項７または２５記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項51】

ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間の結合が、１本鎖の３'末端に存在する、請求項５０記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項52】

鎖が、アンチセンス鎖である、請求項５１記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項53】

鎖が、センス鎖である、請求項５１記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項54】

ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間の結合が、１本鎖の５'末端に存在する、請求項５０記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項55】

鎖が、アンチセンス鎖である、請求項５４記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項56】

鎖が、センス鎖である、請求項５４記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項57】

ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間の結合が、１本鎖の５'末端および３'末端双方に存在する、請求項５０記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項58】

鎖が、アンチセンス鎖である、請求項５７記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項59】

２本鎖のアンチセンス鎖の５'末端の１つの位置の塩基対が、ＡＵ塩基対である、請求項７または２５記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項60】

Ｙヌクレオチドが、２'-フルオロ修飾を含む、請求項２５記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項61】

Ｙ'ヌクレオチドが、２'-Ｏ-メチル修飾を含む、請求項２５記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項62】

ｐ'＞０である、請求項２５記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項63】

ｐ'＝２である、請求項２５記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項64】

ｑ'＝０であり、ｐ＝０であり、ｑ＝０であり、ｐ'オーバーハングヌクレオチドが標的ｍＲＮＡに相補的である、請求項６３記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項65】

ｑ'＝０であり、ｐ＝０であり、ｑ＝０であり、ｐ'オーバーハングヌクレオチドが標的ｍＲＮＡに対して非相補的である、請求項６３記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項66】

センス鎖が、２１個のヌクレオチド全てを有しており、アンチセンス鎖が、２３個のヌクレオチド全てを有している、請求項５７記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項67】

少なくとも１つのｎ_ｐ'が、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに結合されている、請求項６２～６６いずれか一項記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項68】

全てのｎ_ｐ'が、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに結合されている、請求項６７記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項69】

ＲＮＡｉ剤が、表３または５に記載のＲＮＡｉ剤の群から選択される、請求項２５記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項70】

センス鎖の全てのヌクレオチドおよびアンチセンス鎖の全てのヌクレオチドが、修飾を含んでいる、請求項２５記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項71】

細胞内のケトヘキソキナーゼ(ＫＨＫ)遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(ｄｓＲＮＡ)剤であって、該ｄｓＲＮＡ剤が、センス鎖およびアンチセンス鎖を含んでおり、該センス鎖が、配列番号：１のヌクレオチド８９～１０７、１７６～１９４、２６４～２８２、４７４～４９２、５０８～５２６、５２９～５４７、５６２～５８０、６１６～６４６、６８２～７００、７０５～７２３、７０５～７５７、７０５～７９９、７３９～７５７、７３９～７９９、７６０～７９９、８０４～８２２、８３７～８５５、８９２～９１０、９５９～９７７、９９２～１０１０、９２２～１０４１、１０１３～１０４１、１０６９～１１０８、１１６９～１１４０、１１１１～１１４０、１１５５～１１９６、１２２１～１２６１、１２６７～１２９４または１３２０～１３５０のいずれか一つのヌクレオチド配列の少なくとも１４個の連続するヌクレオチドを含み、該アンチセンス鎖が、ＫＨＫをコードしているｍＲＮＡに対する相補性領域を含んでおり、各鎖は、約１４～約３０個のヌクレオチド長であって、ここで該ｄｓＲＮＡ剤は、式(ＩＩＩ)：
センス：５'ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－(ＸＸＸ)_ｉ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－(ＺＺＺ)_ｊ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３'
アンチセンス：３'ｎ_ｐ'－Ｎ_ａ'－(Ｘ'Ｘ'Ｘ')_ｋ－Ｎ_ｂ'－Ｙ'Ｙ'Ｙ'－Ｎ_ｂ'－(Ｚ'Ｚ'Ｚ')_ｌ－Ｎ_ａ'－ｎ_ｑ'５'
(ＩＩＩ)
(式中、
ｉ、ｊ、ｋおよびｌは、互いに独立して、０または１であり；
ｐ、ｐ'、ｑおよびｑ'は、互いに独立して、０～６であり；
各Ｎ_ａおよびＮ_ａ'は、独立して、０～２５個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示し、これらは、修飾または非修飾あるいはそれらの組み合わせのいずれかであり、各配列は、少なくとも２つの異なる修飾ヌクレオチドを含んでおり；
各Ｎ_ｂおよびＮ_ｂ'は、独立して、０～１０個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示し、これらは、修飾または非修飾あるいはそれらの組み合わせのいずれかであり；
各々ｎ_ｐ、ｎ_ｐ'、ｎ_ｑおよびｎ_ｑ'は、存在または非存在であってもよく、これらは、独立してオーバーハングヌクレオチドを示し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ'Ｘ'Ｘ'、Ｙ'Ｙ'Ｙ'およびＺ'Ｚ'Ｚ'の各々は、独立して、３つの連続するヌクレオチド上の３つの同一修飾の１つのモチーフを表し、該修飾は、２'－Ｏ－メチルまたは２'-フルオロ修飾であり；
Ｎ_ｂ上の修飾は、Ｙ上の修飾と異なり、Ｎ_ｂ'上の修飾は、Ｙ'上の修飾と異なり；および
該センス鎖は、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされている)
により示される、ｄｓＲＮＡ剤。

【請求項72】

細胞内のケトヘキソキナーゼ(ＫＨＫ)遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(ｄｓＲＮＡ)剤であって、該ｄｓＲＮＡ剤が、センス鎖およびアンチセンス鎖を含んでおり、該センス鎖が、配列番号：１のヌクレオチド８９～１０７、１７６～１９４、２６４～２８２、４７４～４９２、５０８～５２６、５２９～５４７、５６２～５８０、６１６～６４６、６８２～７００、７０５～７２３、７０５～７５７、７０５～７９９、７３９～７５７、７３９～７９９、７６０～７９９、８０４～８２２、８３７～８５５、８９２～９１０、９５９～９７７、９９２～１０１０、９２２～１０４１、１０１３～１０４１、１０６９～１１０８、１１６９～１１４０、１１１１～１１４０、１１５５～１１９６、１２２１～１２６１、１２６７～１２９４または１３２０～１３５０のいずれか１つのヌクレオチド配列の少なくとも１４個の連続するヌクレオチドを含み、該アンチセンス鎖が、ＫＨＫをコードするｍＲＮＡに対する相補性領域を含んでおり、各鎖は、約１４～約３０個のヌクレオチド長であって、ここで該ｄｓＲＮＡ剤は、式(ＩＩＩ)：
センス：５'ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－(ＸＸＸ)_ｉ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－(ＺＺＺ)_ｊ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３'
アンチセンス：３'ｎ_ｐ'－Ｎ_ａ'－(Ｘ'Ｘ'Ｘ')_ｋ－Ｎ_ｂ'－Ｙ'Ｙ'Ｙ'－Ｎ_ｂ'－(Ｚ'Ｚ'Ｚ')_ｌ－Ｎ_ａ'－ｎ_ｑ'５'
(ＩＩＩ)
(式中、
ｉ、ｊ、ｋおよびｌは、互いに独立して、０または１であり；
各々ｎ_ｐ、ｎ_ｑおよびｎ_ｑ'は、存在または非存在であってもよく、これらは独立して、オーバーハングヌクレオチドを示しており；
ｐ、ｑおよびｑ'は、各々独立して０～６であり；
ｎ_ｐ'＞０であり、かつ少なくとも１つのｎ_ｐ'は、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに結合しており；
各Ｎ_ａおよびＮ_ａ'は、独立して、０～２５個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示し、これらは、修飾または非修飾あるいはそれらの組み合わせのいずれかであり、各配列は、少なくとも２つの異なる修飾されたヌクレオチドを含んでおり；
各Ｎ_ｂおよびＮ_ｂ'は、独立して、０～１０個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示し、これらは、修飾または非修飾あるいはそれらの組み合わせのいずれかであり；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ'Ｘ'Ｘ'、Ｙ'Ｙ'Ｙ'およびＺ'Ｚ'Ｚ'は、各々独立して、３つの連続するヌクレオチド上の３つの同一修飾の１つのモチーフを表し、該修飾は、２'－Ｏ－メチルまたは２'-フルオロ修飾であり；
Ｎ_ｂ上の修飾は、Ｙ上の修飾と異なり、Ｎ_ｂ'上の修飾は、Ｙ'上の修飾と異なり；および
該センス鎖は、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされている)
により示される、二本鎖リボ核酸(ｄｓＲＮＡ)剤。

【請求項73】

細胞内のケトヘキソキナーゼ(ＫＨＫ)遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(ｄｓＲＮＡ)剤であって、該ｄｓＲＮＡ剤が、センス鎖およびアンチセンス鎖を含んでおり、該センス鎖が、配列番号：１のヌクレオチド８９～１０７、１７６～１９４、２６４～２８２、４７４～４９２、５０８～５２６、５２９～５４７、５６２～５８０、６１６～６４６、６８２～７００、７０５～７２３、７０５～７５７、７０５～７９９、７３９～７５７、７３９～７９９、７６０～７９９、８０４～８２２、８３７～８５５、８９２～９１０、９５９～９７７、９９２～１０１０、９２２～１０４１、１０１３～１０４１、１０６９～１１０８、１１６９～１１４０、１１１１～１１４０、１１５５～１１９６、１２２１～１２６１、１２６７～１２９４または１３２０～１３５０のいずれか１つのヌクレオチド配列の少なくとも１４個の連続するヌクレオチドを含み、該アンチセンス鎖が、ＫＨＫをコードするｍＲＮＡに対する相補性領域を含んでおり、各鎖は、約１４～約３０個のヌクレオチド長であって、ここで該ｄｓＲＮＡ剤は、式(ＩＩＩ)：
センス：５'ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－(ＸＸＸ)_ｉ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－(ＺＺＺ)_ｊ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３'
アンチセンス：３'ｎ_ｐ'－Ｎ_ａ'－(Ｘ'Ｘ'Ｘ')_ｋ－Ｎ_ｂ'－Ｙ'Ｙ'Ｙ'－Ｎ_ｂ'－(Ｚ'Ｚ'Ｚ')_ｌ－Ｎ_ａ'－ｎ_ｑ'５'
(ＩＩＩ)
(式中、ｉ、ｊ、ｋおよびｌは、各々独立して、０または１であり；
各ｎ_ｐ、ｎ_ｑおよびｎ_ｑ'は、存在または非存在であってもよく、これらは、独立して、オーバーハングヌクレオチドを示し；
ｐ、ｑおよびｑ'は、各々独立して、０～６であり；
ｎ_ｐ'＞０であり、かつ少なくとも１つのｎ_ｐ'がホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに結合されており；
各Ｎ_ａおよびＮ_ａ'は、独立して、０～２５個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示し、これらは、修飾または非修飾あるいはそれらの組み合わせのいずれかであり、各配列は、少なくとも２つの異なる修飾ヌクレオチドを含んでおり；
各Ｎ_ｂおよびＮ_ｂ'は、独立して、０～１０個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示し、これらは、修飾または非修飾あるいはそれらの組み合わせのいずれかであり；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ'Ｘ'Ｘ'、Ｙ'Ｙ'Ｙ'およびＺ'Ｚ'Ｚ'は、各々独立して、３つの連続するヌクレオチド上の３つの同一修飾の１つのモチーフを表し、該修飾は、２'－Ｏ－メチルまたは２'-フルオロ修飾であり；
Ｎ_ｂ上の修飾は、Ｙ上の修飾と異なり、Ｎ_ｂ'上の修飾は、Ｙ'上の修飾と異なり；および
該センス鎖は、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされており、ここで該リガンドは、一価、二価または三価の分枝鎖リンカーを介して結合された１以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である)
により示される、二本鎖リボ核酸(ｄｓＲＮＡ)剤。

【請求項74】

細胞内のケトヘキソキナーゼ(ＫＨＫ)遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(ｄｓＲＮＡ)剤であって、該ｄｓＲＮＡ剤が、センス鎖およびアンチセンス鎖を含んでおり、該センス鎖が、配列番号：１のヌクレオチド８９～１０７、１７６～１９４、２６４～２８２、４７４～４９２、５０８～５２６、５２９～５４７、５６２～５８０、６１６～６４６、６８２～７００、７０５～７２３、７０５～７５７、７０５～７９９、７３９～７５７、７３９～７９９、７６０～７９９、８０４～８２２、８３７～８５５、８９２～９１０、９５９～９７７、９９２～１０１０、９２２～１０４１、１０１３～１０４１、１０６９～１１０８、１１６９～１１４０、１１１１～１１４０、１１５５～１１９６、１２２１～１２６１、１２６７～１２９４または１３２０～１３５０のいずれか１つのヌクレオチド配列の少なくとも１４個の連続するヌクレオチドを含み、該アンチセンス鎖が、ＫＨＫをコードするｍＲＮＡに対する相補性領域を含んでおり、各鎖は、約１４～約３０個のヌクレオチド長であって、ここで該ｄｓＲＮＡ剤は、式(ＩＩＩ)：
センス：５'ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－(ＸＸＸ)_ｉ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－(ＺＺＺ)_ｊ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３'
アンチセンス：３'ｎ_ｐ'－Ｎ_ａ'－(Ｘ'Ｘ'Ｘ')_ｋ－Ｎ_ｂ'－Ｙ'Ｙ'Ｙ'－Ｎ_ｂ'－(Ｚ'Ｚ'Ｚ')_ｌ－Ｎ_ａ'－ｎ_ｑ'－５'
(ＩＩＩ)
(式中、
ｉ、ｊ、ｋおよびｌは、各々独立して、０または１であり；
各々ｎ_ｐ、ｎ_ｑおよびｎ_ｑ'は、存在または非存在であってもよく、これらは、独立してオーバーハングヌクレオチドを示し；
ｐ、ｑおよびｑ'は、各々独立して、０～６であり；
ｎ_ｐ'＞０であり、かつ少なくとも１つのｎ_ｐ'は、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに結合されており；
各Ｎ_ａおよびＮ_ａ'は、独立して、０～２５個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示し、これらは、修飾または非修飾あるいはそれらの組み合わせのいずれかであり、各配列は、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含んでおり；
各Ｎ_ｂおよびＮ_ｂ'は、独立して、０～１０個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示し、これらは、修飾または非修飾あるいはそれらの組み合わせのいずれかであり；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ'Ｘ'Ｘ'、Ｙ'Ｙ'Ｙ'およびＺ'Ｚ'Ｚ'は、各々独立して、３つの連続するヌクレオチド上の３つの同一修飾の１つのモチーフを表し、該修飾は、２'－Ｏ－メチルまたは２'-フルオロ修飾であり；
Ｎ_ｂ上の修飾は、Ｙ上の修飾と異なり、Ｎ_ｂ'上の修飾は、Ｙ'上の修飾と異なり；
該センス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含んでおり、該センス鎖は、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされており、該リガンドは、一価、二価または三価の分枝鎖リンカーを介して結合された１以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である)
により示される、二本鎖リボ核酸(ｄｓＲＮＡ)剤。

【請求項75】

細胞内のケトヘキソキナーゼ(ＫＨＫ)遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(ｄｓＲＮＡ)剤であって、該ｄｓＲＮＡ剤が、センス鎖およびアンチセンス鎖を含んでおり、該センス鎖が、配列番号：１のヌクレオチド８９～１０７、１７６～１９４、２６４～２８２、４７４～４９２、５０８～５２６、５２９～５４７、５６２～５８０、６１６～６４６、６８２～７００、７０５～７２３、７０５～７５７、７０５～７９９、７３９～７５７、７３９～７９９、７６０～７９９、８０４～８２２、８３７～８５５、８９２～９１０、９５９～９７７、９９２～１０１０、９２２～１０４１、１０１３～１０４１、１０６９～１１０８、１１６９～１１４０、１１１１～１１４０、１１５５～１１９６、１２２１～１２６１、１２６７～１２９４または１３２０～１３５０のいずれか１つのヌクレオチド配列の少なくとも１４個の連続するヌクレオチドを含み、該アンチセンス鎖が、ＫＨＫをコードするｍＲＮＡに対する相補性領域を含んでおり、各鎖は、約１４～約３０個のヌクレオチド長であって、ここで該ｄｓＲＮＡ剤は、式(ＩＩＩ)：
センス：５'ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－ＹＹＹ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３'
アンチセンス：３'ｎ_ｐ'－Ｎ_ａ'－Ｙ'Ｙ'Ｙ'－Ｎ_ａ'－ｎ_ｑ'５'
(ＩＩＩａ)
(式中、
各々ｎ_ｐ、ｎ_ｑおよびｎ_ｑ'は、存在していても、存在していなくてもよく、独立してオーバーハングヌクレオチドを示し；
ｐ、ｑおよびｑ'は、各々独立して、０～６であり；
ｎ_ｐ'＞０であり、かつ少なくとも１つのｎ_ｐ'は、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに結合されており；
各Ｎ_ａおよびＮ_ａ'は、独立して、０～２５個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示し、これらは、修飾または非修飾あるいはそれらの組み合わせのいずれかであり、各配列は、少なくとも２つの異なる修飾ヌクレオチドを含んでおり；
ＹＹＹおよびＹ'Ｙ'Ｙ'は、各々独立して、３つの連続するヌクレオチド上の３つの同一修飾の１つのモチーフを表し、該修飾は、２'－Ｏ－メチルまたは２'-フルオロ修飾であり；
該センス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含んでおり；
該センス鎖は、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされており、該リガンドは、一価、二価または三価の分枝鎖リンカーを介して結合された１以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である)
により示される、二本鎖リボ核酸(ｄｓＲＮＡ)剤。

【請求項76】

細胞内のケトヘキソキナーゼ(ＫＨＫ)遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(ｄｓＲＮＡ)剤であって、該ｄｓＲＮＡ剤が、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含んでおり、
該センス鎖が、配列番号：１のヌクレオチド８９～１０７、１７６～１９４、２６４～２８２、４７４～４９２、５０８～５２６、５２９～５４７、５６２～５８０、６１６～６４６、６８２～７００、７０５～７２３、７０５～７５７、７０５～７９９、７３９～７５７、７３９～７９９、７６０～７９９、８０４～８２２、８３７～８５５、８９２～９１０、９５９～９７７、９９２～１０１０、９２２～１０４１、１０１３～１０４１、１０６９～１１０８、１１６９～１１４０、１１１１～１１４０、１１５５～１１９６、１２２１～１２６１、１２６７～１２９４または１３２０～１３５０のいずれか１つのヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含み、該アンチセンス鎖が、配列番号：２の対応するヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含み、
該センス鎖の実質的に全てのヌクレオチドが、２'-Ｏ-メチル修飾および２'-フルオロ修飾からなる群から選択される修飾を含み；
該センス鎖は、５'末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含んでおり；
該アンチセンス鎖の実質的に全てのヌクレオチドが、２'-Ｏ-メチル修飾および２'-フルオロ修飾からなる群から選択される修飾を含み；
該アンチセンス鎖は、５'末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合および３'末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含んでおり；および
該センス鎖は、３'末端で一価、二価または三価の分枝鎖リンカーを介して結合された１以上のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされている)
に示される、二本鎖リボ核酸(ｄｓＲＮＡ)剤。

【請求項77】

センス鎖の全てのヌクレオチドおよびアンチセンス鎖の全てのヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである、請求項７６記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項78】

各鎖が、１９～３０個のヌクレオチド長である、請求項７６記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項79】

請求項１～３、７、２５または７０～７５いずれか一項記載のｄｓＲＮＡ剤を含む、細胞。

【請求項80】

請求項１～３、７、２４または７０～７５いずれか一項記載のｄｓＲＮＡ剤を含むケトヘキソキナーゼ(ＫＨＫ)遺伝子の発現を阻害するための、医薬組成物。

【請求項81】

請求項１～３いずれか一項記載のｄｓＲＮＡ剤および脂質製剤を含む、医薬組成物。

【請求項82】

脂質製剤が、ＬＮＰまたはＭＣ３を含む、請求項８１記載の医薬組成物。

【請求項83】

細胞内のケトヘキソキナーゼ(ＫＨＫ)遺伝子の発現を阻害する方法であって、
(ａ)細胞を、請求項１～３、７、２５および７１～７６いずれか一項記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤または請求項８０～８２いずれか一項記載の医薬組成物と接触させる工程；および
(ｂ)工程(ａ)において生成された細胞を、ＫＨＫ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解物を得るために十分な時間維持し、それにより細胞内のＫＨＫ遺伝子の発現を阻害する工程、
を含む、方法。

【請求項84】

細胞が、対象内にある、請求項８３記載の方法。

【請求項85】

対象がヒトである、請求項８４記載の方法。

【請求項86】

ＫＨＫの発現が、適切なコントロールと比較して、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または検出限界値以下まで阻害される、請求項８３～８５いずれか一項記載の方法。

【請求項87】

ケトヘキソキナーゼ(ＫＨＫ)の発現低下により利益を得る疾患または障害を有する対象の治療方法であって、治療上有効量の請求項１～３、７、２５および７１～７６いずれか一項記載の二本鎖リボ核酸(ｄｓＲＮＡ)剤または請求項８０～８２いずれか一項記載の医薬組成物を対象に投与し、それにより対象を治療することを特徴とする、治療方法。

【請求項88】

ケトヘキソキナーゼ(ＫＨＫ)の発現低下により利益を得る疾患または障害を有する対象における少なくとも１つの症状を予防する方法であって、予防上有効量の請求項１～３、７、２５および７１～７６いずれか一項記載のｄｓＲＮＡ剤または請求項８０～８２いずれか一項記載の医薬組成物を対象に投与して、ＫＨＫの発現低下により利益を得る障害を有する対象における少なくとも１つの症状を予防することを特徴とする、方法。

【請求項89】

ｄｓＲＮＡを対象に投与することにより、フルクトース代謝の低下が生じる、請求項８７または８８記載の方法。

【請求項90】

障害が、ＫＨＫ関連疾患である、請求項８７または８８記載の方法。

【請求項91】

ＫＨＫ関連疾患が高尿酸血症を含む、請求項９０記載の方法。

【請求項92】

ＫＨＫ関連疾患が痛風である、請求項９０記載の方法。

【請求項93】

ＫＨＫ関連疾患が肝臓疾患を含む、請求項９０記載の方法。

【請求項94】

肝臓疾患が、非アルコール性脂肪肝疾患(ＮＡＦＬＤ)または非アルコール性脂肪性肝炎(ＮＡＳＨ)である、請求項９３記載の方法。

【請求項95】

ＫＨＫ関連疾患が、脂質異常症または異常な脂質沈着または機能不全を含む、請求項９０記載の方法。

【請求項96】

脂質異常症が、１以上の高脂血症、高ＬＤＬコレステロール、低ＨＤＬコレステロール、高トリグリセリド血症、食後高トリグリセリド血症、脂肪細胞機能障害、内臓脂肪沈着、肥満症およびメタボリックシンドロームを含む、請求項９５記載の方法。

【請求項97】

ＫＨＫ関連疾患が、血糖コントロールの障害を含む、請求項９０記載の方法。

【請求項98】

血糖コントロールの障害が、インスリンに対する免疫応答に関連しない１以上のインスリン耐性、ＩＩ型糖尿病およびグルコース不耐性を含む、請求項９７記載の方法。

【請求項99】

ＫＨＫ関連疾患が、腎臓疾患を含む、請求項９０記載の方法。

【請求項100】

肝臓疾患が、少なくとも１つの急性腎臓障害、尿細管機能障害、近位尿細管の炎症性変化および慢性腎臓疾患を含む、請求項９３記載の方法。

【請求項101】

ＫＨＫ関連疾患が心血管疾患を含む、請求項９０記載の方法。

【請求項102】

心血管疾患が、少なくとも１つの高血圧症および内皮細胞機能障害を含む、請求項１０１記載の方法。

【請求項103】

対象が、ヒトである、請求項８７～１０２いずれか一項記載の方法。

【請求項104】

対象が、腎機能障害を有するか、またはその傾向がある、請求項１０３記載の方法。

【請求項105】

ＫＨＫ関連疾患を治療するための剤を投与することをさらに含む、請求項８７～１０４いずれか一項記載の方法。

【請求項106】

ｄｓＲＮＡ剤が、約０.０１ｍｇ/ｋｇ～約５０ｍｇ/ｋｇの用量で投与される、請求項８７～１０５いずれか一項記載の方法。

【請求項107】

ｄｓＲＮＡ剤が、対象に皮下投与される、請求項８７～１０６いずれか一項記載の方法。

【請求項108】

対象におけるＫＨＫのレベルを測定することをさらに含む、請求項８７～１０７いずれか一項記載の方法。

【請求項109】

対象におけるフルクトース代謝のレベルを測定することをさらに含む、請求項８７～１０８いずれか一項記載の方法。

【請求項110】

対象における尿酸レベルを測定することをさらに含む、請求項８７～１０９いずれか一項記載の方法。

【請求項111】

対象における血清脂質レベルを測定することをさらに含む、請求項８７～１１０いずれか一項記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

(関連出願の相互参照)
本出願は、２０１８年９月１８日に提出された米国仮出願番号６２/７３２,６００号について優先権を主張するものであり、引用によりその全体を本明細書中に組み込む。

【0002】

配列表
本願発明は、ＡＳＣＩＩフォーマットの電子書式により提出した配列表を含み、出典明示によりその全てが本明細書に組み込まれる。当該ＡＳＣＩＩのコピーは、２０１９年９月１３日に作成し、ファイル名は１２１３０１-０６０２０_ＳＬ.ｔｘｔであり、３０９,３２５バイトのサイズである。

【背景技術】

【0003】

疫学研究により、欧米の食生活が、現代の肥満の流行の主要な原因の１つであることが示されている。フルクトース摂取の増加は、栄養価が高い清涼飲料水や加工食品の使用に関連しており、肥満蔓延に対する主な要因であると考えられている。高フルクトースコーンシロップは、１９６７年までに食品業界において広く使用され始めた。グルコースおよびフルクトースは、分子当たりのカロリー値が同じであるが、これら２つの糖は、異なる代謝経路により代謝され、異なるＧＬＵＴトランスポーターを利用する。フルクトースは、グルコース代謝経路とは違い、殆どが独占的に肝臓で代謝され、またフルクトース代謝経路は、生成物によるフィードバック阻害による制御は受けない(Khaitan Z et al., (2013) J. Nutr. Metab. 2013, Article ID 682673, 1-12)。ヘキソキナーゼおよびホスホフルクトキナーゼ(ＰＦＫ)は、グルコースからのグリセルアルデヒド－３－Ｐの産生を調節するが、一方肝臓でフルクトースのフルクトース－１－リン酸へのリン酸化を担うフルクトキナーゼまたはケトヘキソキナーゼ(ＫＨＫ)は、フルクトース－１－リン酸の濃度が増加してもダウンレギュレートされない。そのため、結果として細胞内に流入する全てのフルクトースは、急速にリン酸化される(Khaitan Z et al., (2013) J. Nutr. Metab. 2013, Article ID 682673, 1-12)。フルクトースをフルクトース－１－リン酸にリン酸化するためのＡＴＰの継続的な利用により、細胞内のリン酸枯渇、ＡＴＰ枯渇、ＡＭＰデアミナーゼの活性化および尿酸の形成が引き起こされる(Khaitan Z. et al., (2013) J. Nutr. Metab. Article ID 682673, 1-12)。増加した尿酸は、ＫＨＫの上方制御を更に促進し(Lanaspa M.A. et al., (2012) PLOS ONE 7(10):1-11)、内皮細胞および脂肪細胞機能障害を引き起こす。続いて、フルクトース－１－リン酸は、アルドラーゼＢの作用によってグリセロアルデヒドに転化され、グリセルアルデヒド－３－リン酸へとリン酸化される。後者は下流の解糖経路へと進み、ピルビン酸を形成してクエン酸サイクルに入り、そこから、十分な供給条件下で、クエン酸塩は、ミトコンドリアからサイトゾルに移送され、脂質合成のためのアセチルコエンザイムＡを提供する(図１)。

【0004】

ＫＨＫによるフルクトースのリン酸化、その後の脂質合成の活性化により、例えば、脂肪肝、高トリグリセリド血症、脂質異常症およびインスリン耐性へと至る。腎近位尿細管細胞における炎症性変化も、ＫＨＫ活性によって誘導されることが示されている(Cirillo P. et al., (2009) J. Am. Soc. Nephrol. 20: 545-553)。ＫＨＫによるフルクトースのリン酸化は、肝臓疾患(例えば、脂肪肝、脂肪性肝炎)、脂質異常症(例えば、高脂血症、高ＬＤＬコレステロール、低ＨＤＬコレステロール、高トリグリセリド血症、食後高トリグリセリド血症)、血糖コントロールの障害(例えば、インスリン耐性、ＩＩ型糖尿病)、心血管疾患(例えば、高血圧、内皮細胞機能障害など)、腎臓病(例えば、急性腎障害、尿細管機能障害、近位尿細管の炎症性変化、慢性腎臓病など)、メタボリックシンドローム、脂肪細胞機能障害、内臓脂肪沈着、肥満、高尿酸血症、痛風、摂食障害および過剰な糖渇望などが挙げられる。従って、ＫＨＫ活性に関連する疾患、障害および症状を治療するための組成物および方法が、当該技術分野において必要とされている。

【0005】

(発明の要約)
本発明は、ケトヘキソキナーゼ(ＫＨＫ)を標的とするＲＮＡｉ剤、例えば二本鎖ＲＮＡｉ剤を含む組成物を提供する。本発明は、ＫＨＫの発現を阻害するため、またはＫＨＫ遺伝子の発現を低下させることで利益を得る疾患、例えば肝臓疾患(例えば、脂肪肝、脂肪性肝炎、特に非アルコール性脂肪性肝炎(ＮＡＳＨ)、脂質異常症(例えば、高脂血症、高ＬＤＬコレステロール、低ＨＤＬコレステロール、高トリグリセリド血症、食後高トリグリセリド血症)、血糖コントロールの障害(例えば、インスリン耐性、ＩＩ型糖尿病など)、心血管疾患(例えば、高血圧、内皮細胞機能障害)、腎臓疾患(例えば、急性腎障害、尿細管機能障害、近位尿細管の炎症性変化、慢性腎臓病)、メタボリックシンドローム、脂肪細胞機能障害、内臓脂肪沈着、肥満症、高尿酸血症、痛風、摂食障害および過剰な糖への渇望などを有する対象を治療するために本発明の組成物を使用する方法も提供する。

【0006】

ある側面において、本発明は、ケトヘキソキナーゼ(ＫＨＫ)の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(ｄｓＲＮＡ)剤を提供するものであって、ここで該ｄｓＲＮＡは、センス鎖とアンチセンス鎖を含んでおり、該センス鎖は、配列番号：１のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含み、該アンチセンス鎖は、配列番号：２のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む二本鎖リボ核酸(ｄｓＲＮＡ)剤を提供する。

【0007】

ある実施態様において、該センス鎖は、配列番号：１のヌクレオチド８９～１０７、１７６～１９４、２６４～２８２、４７４～４９２、５０８～５２６、５２９～５４７、５６２～５８０、６１６～６４６、６８２～７００、７０５～７２３、７０５～７５７、７０５～７９９、７３９～７５７、７３９～７９９、７６０～７９９、８０４～８２２、８３７～８５５、８９２～９１０、９５９～９７７、９９２～１０１０、９２２～１０４１、１０１３～１０４１、１０６９～１１０８、１１６９～１１４０、１１１１～１１４０、１１５５～１１９６、１２２１～１２６１、１２６７～１２９４または１３２０～１３５０のいずれか１つのヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。ある実施態様において、該センス鎖は、配列番号：１のヌクレオチド配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチド、または配列番号：１のヌクレオチド配列の前記部分のうちの１つを含む。

【0008】

ある実施態様において、特定の実施態様では、センス鎖およびアンチセンス鎖は、表３または表５のヌクレオチド配列のいずれか１つからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。

【0009】

ある実施態様において、センス鎖またはアンチセンス鎖は、表３または表５に示されるＡＤ－７２５０６、ＡＤ－７２３１９、ＡＤ－７２５０２、ＡＤ－７２５１３、ＡＤ－７２４９９、ＡＤ－７２３０３、ＡＤ－７２５００、ＡＤ－７２５２２、ＡＤ－７２５１２、ＡＤ－７２３０４、ＡＤ－７２５１４、ＡＤ－７２２５７、ＡＤ－７２２９５、ＡＤ－７２３３２、ＡＤ－７２５０７、ＡＤ－７２３１１、ＡＤ－７２５０１、ＡＤ－７２５０８、ＡＤ－７２２９３、ＡＤ－７２３２２、ＡＤ－７２２６４、ＡＤ－７２２９０、ＡＤ－７２３３８、ＡＤ－７２３１５、ＡＤ－７２２７２、ＡＤ－７２３３７、ＡＤ－７２２９８、ＡＤ－７２５０３、ＡＤ－７２３２７、ＡＤ－７２５２１、ＡＤ－７２３０９、ＡＤ－７２３１３、ＡＤ－７２５１７、ＡＤ－７２３１６、ＡＤ－７２３３５、ＡＤ－７２３１７からなる群から選択される二本鎖のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、センス鎖およびアンチセンス鎖は、表３または表５に示されるＡＤ－７２５０６、ＡＤ－７２３１９、ＡＤ－７２５０２、ＡＤ－７２５１３、ＡＤ－７２４９９、ＡＤ－７２３０３、ＡＤ－７２５００、ＡＤ－７２５２２、ＡＤ－７２５１２、ＡＤ－７２３０４、ＡＤ－７２５１４、ＡＤ－７２２５７、ＡＤ－７２２９５、ＡＤ－７２３３２、ＡＤ－７２５０７、ＡＤ－７２３１１、ＡＤ－７２５０１、ＡＤ－７２５０８、ＡＤ－７２２９３、ＡＤ－７２３２２、ＡＤ－７２２６４、ＡＤ－７２２９０、ＡＤ－７２３３８、ＡＤ－７２３１５、ＡＤ－７２２７２、ＡＤ－７２３３７、ＡＤ－７２２９８、ＡＤ－７２５０３、ＡＤ－７２３２７、ＡＤ－７２５２１、ＡＤ－７２３０９、ＡＤ－７２３１３、ＡＤ－７２５１７、ＡＤ－７２３１６、ＡＤ－７２３３５、ＡＤ－７２３１７からなる群から選択される二本鎖のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。

【0010】

ある態様において、本発明は、ケトヘキソキナーゼ(ＫＨＫ)遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(ｄｓＲＮＡ)剤を提供するものであって、ここで該ｄｓＲＮＡは、センス鎖とアンチセンス鎖を含み、該アンチセンス鎖は、表３または５に記載のアンチセンス配列のうちのいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む相補性領域を含む。ある実施態様においては、ｄｓＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、該アンチセンス鎖は、ＡＤ-７２５０６、ＡＤ－７２３１９、ＡＤ－７２５０２、ＡＤ－７２５１３、ＡＤ－７２４９９、ＡＤ－７２３０３、ＡＤ－７２５００、ＡＤ－７２５２２、ＡＤ－７２５１２、ＡＤ－７２３０４、ＡＤ－７２５１４、ＡＤ－７２２５７、ＡＤ－７２２９５、ＡＤ－７２３３２、ＡＤ－７２５０７、ＡＤ－７２３１１、ＡＤ－７２５０１、ＡＤ－７２５０８、ＡＤ－７２２９３、ＡＤ－７２３２２、ＡＤ－７２２６４、ＡＤ－７２２９０、ＡＤ－７２３３８、ＡＤ－７２３１５、ＡＤ－７２２７２、ＡＤ－７２３３７、ＡＤ－７２２９８、ＡＤ－７２５０３、ＡＤ－７２３２７、ＡＤ－７２５２１、ＡＤ－７２３０９、ＡＤ－７２３１３、ＡＤ－７２５１７、ＡＤ－７２３１６、ＡＤ－７２３３５またはＡＤ－７２３１７からなる群から選択される二本鎖のいずれか１つのアンチセンス配列のうちのいずれか１つのアンチセンス配列とは３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む相補性領域を含む。

【0011】

ある実施態様においては、ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。ある実施態様では、センス鎖の全てのヌクレオチドおよびアンチセンス鎖の全てのヌクレオチドが修飾を含む。

【0012】

ある態様において、本発明は、ケトヘキソキナーゼ(ＫＨＫ)遺伝子の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供するものであって、ここで該二本鎖ＲＮＡ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖とアンチセンス鎖を含んでおり、該センス鎖は、配列番号：１のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含み、該アンチセンス鎖は、配列番号：２のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含み、該センス鎖の実質的に全てのヌクレオチドおよび該アンチセンス鎖の実質的に全てのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドであり、該センス鎖は、３'末端に結合したリガンドにコンジュゲートされている、二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。ある実施態様において、該センス鎖は、配列番号：１のヌクレオチド８９～１０７、１７６～１９４、２６４～２８２、４７４～４９２、５０８～５２６、５２９～５４７、５６２～５８０、６１６～６４６、６８２～７００、７０５～７２３、７０５～７５７、７０５～７９９、７３９～７５７、７３９～７９９、７６０～７９９、８０４～８２２、８３７～８５５、８９２～９１０、９５９～９７７、９９２～１０１０、９２２～１０４１、１０１３～１０４１、１０６９～１１０８、１１６９～１１４０、１１１１～１１４０、１１５５～１１９６、１２２１～１２６１、１２６７～１２９４または１３２０～１３５０のいずれか１つのヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み、該アンチセンス鎖は、配列番号：２のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含んでおり、ここで該センス鎖の実質的に全てのヌクレオチドおよび該アンチセンス鎖の実質的に全てのヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドであり、該センス鎖は、３'末端に結合したリガンドにコンジュゲートしている。ある実施態様において、該センス鎖は、配列番号：１の少なくとも１５個の連続するヌクレオチド、または配列番号：１のヌクレオチド配列の前記部分の内のいずれか１つ、および配列番号：２の対応する部分の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含んでおり、該センス鎖および該アンチセンス鎖は互いに相補的である。

【0013】

ある態様において、本発明は、ＫＨＫの発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供するものであって、該二本鎖ＲＮＡｉ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖とアンチセンス鎖を含んでおり、該センス鎖は、配列番号：１のヌクレオチド８９～１０７、１７６～１９４、２６４～２８２、４７４～４９２、５０８～５２６、５２９～５４７、５６２～５８０、６１６～６４６、６８２～７００、７０５～７２３、７０５～７５７、７０５～７９９、７３９～７５７、７３９～７９９、７６０～７９９、８０４～８２２、８３７～８５５、８９２～９１０、９５９～９７７、９９２～１０１０、９２２～１０４１、１０１３～１０４１、１０６９～１１０８、１１６９～１１４０、１１１１～１１４０、１１５５～１１９６、１２２１～１２６１、１２６７～１２９４または１３２０～１３５０のいずれか１つのヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含み、該アンチセンス鎖は、配列番号：２のヌクレオチド配列の対応する位置から３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含んでおり、該アンチセンス鎖は、該センス鎖の３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチドと相補的である。ある実施態様において、該センス鎖の実質的に全てのヌクレオチドおよび該アンチセンス鎖の実質的に全てのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドであって、該センス鎖は、３'末端に結合したリガンドにコンジュゲートしている。

【0014】

ある実施態様において、該センス鎖は、配列番号：１のヌクレオチド８９～１０７、１７６～１９４、２６４～２８２、４７４～４９２、５０８～５２６、５２９～５４７、５６２～５８０、６１６～６４６、６８２～７００、７０５～７２３、７０５～７５７、７０５～７９９、７３９～７５７、７３９～７９９、７６０～７９９、８０４～８２２、８３７～８５５、８９２～９１０、９５９～９７７、９９２～１０１０、９２２～１０４１、１０１３～１０４１、１０６９～１１０８、１１６９～１１４０、１１１１～１１４０、１１５５～１１９６、１２２１～１２６１、１２６７～１２９４または１３２０～１３５０のいずれか１つの少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含み、該アンチセンス鎖は、配列番号：２のヌクレオチド配列の対応する位置から少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含んでおり、該アンチセンス鎖は、センス鎖の３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチドに相補的である。ある実施態様において、該センス鎖のヌクレオチドの実質的に全てのヌクレオチドまたは該アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドであるか、または両方の鎖の実質的に全てのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドであり；該センス鎖は、３'末端に結合したリガンドにコンジュゲートされている。

【0015】

ある態様において、本発明は、ＫＨＫの発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供するものであって、該二本鎖ＲＮＡｉ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含んでおり、該センス鎖は、配列番号：１のヌクレオチド８９～１０７、１７６～１９４、２６４～２８２、４７４～４９２、５０８～５２６、５２９～５４７、５６２～５８０、６１６～６４６、６８２～７００、７０５～７２３、７０５～７５７、７０５～７９９、７３９～７５７、７３９～７９９、７６０～７９９、８０４～８２２、８３７～８５５、８９２～９１０、９５９～９７７、９９２～１０１０、９２２～１０４１、１０１３～１０４１、１０６９～１１０８、１１６９～１１４０、１１１１～１１４０、１１５５～１１９６、１２２１～１２６１、１２６７～１２９４または１３２０～１３５０のいずれか１つの少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含み、該アンチセンス鎖は、配列番号：２のヌクレオチド配列の対応する位置から少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含み、該アンチセンス鎖は、センス鎖の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドに相補的である。ある実施態様において、アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドである。ある実施態様において、両方の鎖の実質的に全てのヌクレオチドが修飾されている。好ましい実施態様において、センス鎖は、３'末端に結合したリガンドにコンジュゲートされている。

【0016】

ある実施態様において、アンチセンス鎖は、表３および５いずれかに記載されたアンチセンス配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む相補性領域を含む。例えば、ある実施態様において、該アンチセンス鎖は、ＡＤ－７２５０６、ＡＤ－７２３１９、ＡＤ－７２５０２、ＡＤ－７２５１３、ＡＤ－７２４９９、ＡＤ－７２３０３、ＡＤ－７２５００、ＡＤ－７２５２２、ＡＤ－７２５１２、ＡＤ－７２３０４、ＡＤ－７２５１４、ＡＤ－７２２５７、ＡＤ－７２２９５、ＡＤ－７２３３２、ＡＤ－７２５０７、ＡＤ－７２３１１、ＡＤ－７２５０１、ＡＤ－７２５０８、ＡＤ－７２２９３、ＡＤ－７２３２２、ＡＤ－７２２６４、ＡＤ－７２２９０、ＡＤ－７２３３８、ＡＤ－７２３１５、ＡＤ－７２２７２、ＡＤ－７２３３７、ＡＤ－７２２９８、ＡＤ－７２５０３、ＡＤ－７２３２７、ＡＤ－７２５２１、ＡＤ－７２３０９、ＡＤ－７２３１３、ＡＤ－７２５１７、ＡＤ－７２３１６、ＡＤ－７２３３５およびＡＤ－７２３１７からなる群から選択される二本鎖のうちのいずれか１つのアンチセンス配列と３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む相補性領域を含んでいてもよい。ある実施態様において、該アンチセンス鎖は、前記二本鎖のアンチセンス配列のうちのいずれか１つの少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む配列番号：１に相補的な領域を含んでいる。

【0017】

いくつかの実施態様においては、センス鎖の全てのヌクレオチドおよびアンチセンス鎖の全てのヌクレオチドが修飾を含んでいる。

【0018】

ある実施態様においては、修飾ヌクレオチドの少なくとも１つは、デオキシヌクレオチド、３'末端デオキシチミン(ｄＴ)ヌクレオチド、２'-Ｏ-メチル修飾ヌクレオチド、２'-フルオロ修飾ヌクレオチド、２'-デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックヌクレオチド、アンロックヌクレオチド、立体配座的に拘束されたヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、非塩基性ヌクレオチド、２'-アミノ修飾ヌクレオチド、２'-Ｏ-アリル修飾ヌクレオチド、２'-Ｃ-アルキル修飾ヌクレオチド、２'-ヒドロキシ修飾ヌクレオチド、２'-メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２'-Ｏ-アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダート、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１,５-アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５'-ホスフェートを含むヌクレオチドおよび５'-ホスフェート模倣体を含むヌクレオチドからなる群から選択される。別の実施態様において、修飾ヌクレオチドは、３'末端デオキシ-チミンヌクレオチド(ｄＴ)の短い配列を含む。

【0019】

ある実施態様において、センス鎖の実質的に全てのヌクレオチドは修飾されている。ある実施態様において、アンチセンス鎖の実質的に全てのヌクレオチドは修飾されている。ある実施態様において、センス鎖およびアンチセンス鎖の双方のヌクレオチドは、実質的に全て修飾されている。

【0020】

ある実施態様において、二本鎖は、表５に示される修飾アンチセンス鎖ヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、二本鎖は、表５に示される修飾センス鎖ヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、二本鎖は、表５に示される修飾二本鎖を含む。

【0021】

ある実施態様において、アンチセンス鎖と標的ｍＲＮＡヌクレオチド配列との間の相補性領域は、少なくとも１７個のヌクレオチド長である。例えば、アンチセンス鎖と標的との間の相補性領域は、１９～２１個のヌクレオチド長であり、例えば、該相補性領域は、２１個のヌクレオチド長である。好ましい実施態様では、各鎖は３０以下のヌクレオチド長である。

【0022】

別の実施態様において、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤の鎖の片方または両方は、最大６６個のヌクレオチド長、例えば、３６～６６、２６～３６、２５～３６、３１～６０、２２～４３、２７～５３個のヌクレオチド長であり、ＫＨＫ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的である少なくとも１９個の連続するヌクレオチド領域を有する。いくつかの実施態様において、該センス鎖および該アンチセンス鎖は、１８～３０個の連続するヌクレオチドの二本鎖を形成する。

【0023】

一実施態様において、ｄｓＲＮＡ剤の少なくとも１本の鎖は、少なくとも１つのヌクレオチドの３'オーバーハングを含む。ある実施態様において、少なくとも１本の鎖は、少なくとも２つのヌクレオチド、例えば、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のヌクレオチドの３'オーバーハングを含む。別の実施態様において、ＲＮＡｉ剤の少なくとも１本の鎖は、少なくとも１つのヌクレオチドの５'オーバーハングを含む。ある実施態様において、少なくとも１本の鎖は、少なくとも２つのヌクレオチド、例えば、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のヌクレオチドの５'オーバーハングを含む。更に別の実施態様において、ＲＮＡｉ剤の一本鎖の３'末端および５'末端の両方は、少なくとも１つのヌクレオチドのオーバーハングを含む。

【0024】

ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、さらにリガンドを含む。ある実施態様において、リガンドは、Ｎ-アセチルガラクトサミン(ＧａｌＮａｃ)である。リガンドは、一価、二価または三価の分岐鎖リンカーを介してＲＮＡｉ剤に結合された１または複数のＧａｌＮＡｃであってもよい。リガンドは、二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の３'末端、二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の５'末端、二本鎖ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖の３'末端または二本鎖ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖の５'末端にコンジュゲートされていてもよい。

【0025】

いくつかの実施態様において、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、複数の一価リンカーを介して二本鎖ＲＮＡｉ剤の複数のヌクレオチドに各々独立して結合された複数の、例えば、２、３、４、５または６つのＧａｌＮＡｃを含む。

【0026】

ある実施態様において、リガンドは、

【化1】

である。

【0027】

ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、以下の略図に示したようなリガンドにコンジュゲートされている：

【化2】

(式中、Ｘは、ＯまたはＳである)。一実施態様において、ＸはＯである。

【0028】

ある実施態様において、相補性領域は、表３または表５のアンチセンスヌクレオチド配列のいずれか１つを含む。別の実施態様において、相補性領域は、表３または表５のアンチセンスヌクレオチド配列の１つを含んでなる。

【0029】

別の態様において、本発明は、ＫＨＫ遺伝子の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供するものであって、該二本鎖ＲＮＡｉ剤は、センス鎖を含み、該センス鎖は、配列番号：１のヌクレオチド８９～１０７、１７６～１９４、２６４～２８２、４７４～４９２、５０８～５２６、５２９～５４７、５６２～５８０、６１６～６４６、６８２～７００、７０５～７２３、７０５～７５７、７０５～７９９、７３９～７５７、７３９～７９９、７６０～７９９、８０４～８２２、８３７～８５５、８９２～９１０、９５９～９７７、９９２～１０１０、９２２～１０４１、１０１３～１０４１、１０６９～１１０８、１１６９～１１４０、１１１１～１１４０、１１５５～１１９６、１２２１～１２６１、１２６７～１２９４または１３２０～１３５０のいずれか１つのヌクレオチド配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含み、該センス鎖は、アンチセンス鎖に相補的であり、該アンチセンス鎖は、ＫＨＫをコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含んでおり、各鎖は、約１４～約３０個のヌクレオチド長であって、該ｄｓＲＮＡ剤は、式(ＩＩＩ)：
センス：５'ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－(ＸＸＸ)_ｉ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－(ＺＺＺ)_ｊ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３'
アンチセンス：３'ｎ_ｐ'－Ｎ_ａ'－(Ｘ'Ｘ'Ｘ')_ｋ－Ｎ_ｂ'－Ｙ'Ｙ'Ｙ'－Ｎ_ｂ'－(Ｚ'Ｚ'Ｚ')_ｌ－Ｎ_ａ'－ｎ_ｑ'５'
(ＩＩＩ)
(式中、
ｉ、ｊ、ｋおよびｌは、各々独立して、０または１であり；
ｐ、ｐ'、ｑおよびｑ'は、各々独立して、０～６であり；
各Ｎ_ａおよびＮ_ａ'は、各々独立して、修飾または未修飾のいずれか、あるいはそれらの組み合わせである０～２５個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを表し、各配列は、少なくとも２つの異なる修飾ヌクレオチドを含んでおり；
各Ｎ_ｂおよびＮ_ｂ'は、各々独立して、修飾または未修飾のいずれか、あるいはそれらの組み合わせである０～１０個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎ_ｐ、ｎ_ｐ'、ｎ_ｑおよびｎ_ｑ'は、各々独立してオーバーハングヌクレオチドを表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ'Ｘ'Ｘ'、Ｙ'Ｙ'Ｙ'およびＺ'Ｚ'Ｚ'は、各々独立して、連続する３つのヌクレオチド上の３つの同一修飾の１つのモチーフを表し；
Ｎ_ｂ上の修飾は、Ｙ上の修飾と異なり、Ｎ_ｂ'上の修飾は、Ｙ'上の修飾と異なり； 該センス鎖は、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされている)
で表される、二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。

【0030】

ある実施態様において、ｉは０であるか；ｊは０であるか；ｉは１であるか；ｊは１であるか；ｉおよびｊの両方は０であるか；またはｉおよびｊの両方は１である。別の実施態様において、ｋは０であるか；ｌは０であるか；ｋは１であるか；ｌは１であるか；ｋおよびｌの両方は０であるか；またはｋおよびｌの両方は１である。別の実施態様において、ＸＸＸはＸ'Ｘ'Ｘ'と相補的であり、ＹＹＹはＹ'Ｙ'Ｙ'と相補的であり、ＺＺＺはＺ'Ｚ'Ｚ'と相補的である。別の実施態様において、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位またはその近傍に存在する。別の実施態様において、ＹＹＹモチーフは、アンチセンス鎖の５'末端から１１、１２および１３位に存在する。一実施態様において、Ｙ'は２'－Ｏ－メチルである。

【0031】

例えば、式(ＩＩＩ)は、式(ＩＩＩａ)：
センス：５'ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－ＹＹＹ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３'
アンチセンス：３'ｎ_ｐ'－Ｎ_ａ'－Ｙ'Ｙ'Ｙ'－Ｎ_ａ'－ｎ_ｑ'５' (ＩＩＩａ)
により示され得る。

【0032】

別の実施態様において、式(ＩＩＩ)は、式(ＩＩＩｂ)：
センス：５'ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－ＺＺＺ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３'
アンチセンス：３'ｎ_ｐ'－Ｎ_ａ'－Ｙ'Ｙ'Ｙ'－Ｎ_ｂ'－Ｚ'Ｚ'Ｚ'－Ｎ_ａ'－ｎ_ｑ'５'
(ＩＩＩｂ)
(式中、各Ｎ_ｂおよびＮ_ｂ'は、１～５個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を独立して示す)
により示され得る。

【0033】

あるいは、式(ＩＩＩ)は、式(ＩＩＩｃ)：
センス：５'ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－ＸＸＸ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３'
アンチセンス：３'ｎ_ｐ'－Ｎ_ａ'－Ｘ'Ｘ'Ｘ'－Ｎ_ｂ'－Ｙ'Ｙ'Ｙ'－Ｎ_ａ'－ｎ_ｑ'５'
(ＩＩＩｃ)
(式中、各Ｎ_ｂおよびＮ_ｂ'は、１～５個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を独立して示す)
により示され得る。

【0034】

さらに、式(ＩＩＩ)は、式(ＩＩＩｄ)：
センス：５'ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－ＸＸＸ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－ＺＺＺ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３'
アンチセンス：３'ｎ_ｐ'－Ｎ_ａ'－Ｘ'Ｘ'Ｘ'－Ｎ_ｂ'－Ｙ'Ｙ'Ｙ'－Ｎ_ｂ'－Ｚ'Ｚ'Ｚ'－Ｎ_ａ'－ｎ_ｑ'５'
(ＩＩＩｄ)
(式中、各Ｎ_ｂおよびＮ_ｂ'は、１～５個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を独立して示し、各Ｎ_ａおよびＮ_ａ'は、２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を独立して示す)
により示され得る。

【0035】

ある実施態様において、二本鎖領域は、１５～３０個のヌクレオチド対長である。例えば、二本鎖領域は、１７～２３個のヌクレオチド対長であり得る。二本鎖領域は、長さが１７～２５個のヌクレオチド対であり得る。二本鎖領域は、２３～２７個のヌクレオチド対長であり得る。二本鎖領域は、１９～２１個のヌクレオチド対長であり得る。二本鎖領域は、２１～２３個のヌクレオチド対長であり得る。

【0036】

ある実施態様において、各鎖は、１５～３０個のヌクレオチドを有する。別の実施態様において、各鎖は、１９～３０個のヌクレオチドを有する。

【0037】

ヌクレオチド上の修飾は、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２-メトキシエチル、２'-Ｏ-アルキル、２'-Ｏ-アリル、２'-Ｃ-アリル、２'-フルオロ、２'-デオキシ、２'-ヒドロキシルおよびそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。ある実施態様において、ヌクレオチド上の修飾は、２'-Ｏ-メチルまたは２'-フルオロ修飾である。

【0038】

ある実施態様において、リガンドは、Ｎ-アセチルガラクトサミン(ＧａｌＮａｃ)である。リガンドは、一価、二価または三価の分岐鎖リンカーを介してＲＮＡｉ剤に結合された１つ以上のＧａｌＮＡｃであってもよい。リガンドは、二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の３'末端、二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の５'末端、二本鎖ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖の３'末端または二本鎖ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖の５'末端にコンジュゲートされていてもよい。

【0039】

ある実施態様において、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、複数の一価リンカーを介して二本鎖ＲＮＡｉ剤の複数のヌクレオチドに各々独立して結合された複数の、例えば２、３、４、５または６のＧａｌＮＡｃを含む。一実施態様において、リガンドは

【化3】

である。

【0040】

リガンドは、センス鎖の３'末端に結合され得る。

【0041】

リガンドにコンジュゲートされたｄｓＲＮＡｉ剤の構造の例は、以下のスキームに示される：

【化4】

。

【0042】

ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤は、さらに少なくとも１つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合を含む。例えば、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合は、一方の鎖、即ちセンス鎖またはアンチセンス鎖の３'末端に存在し得るか；または、センス鎖およびアンチセンス鎖の両鎖の末端に存在し得る。

【0043】

ある実施態様において、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合は、片方の鎖、即ちセンス鎖またはアンチセンス鎖の５'末端；または両方の末端、即ちセンス鎖およびアンチセンス鎖の末端に存在し得る。

【0044】

ある実施態様において、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合は、片方の鎖、即ちセンス鎖またはアンチセンス鎖の５'末端および３'末端の両方にあるか；または両方の鎖、センス鎖およびアンチセンス鎖の末端に存在し得る。

【0045】

ある実施態様において、二本鎖のアンチセンス鎖の５'末端の１つの位置の塩基対は、ＡＵ塩基対である。

【0046】

ある実施態様において、Ｙヌクレオチドは、２'-フルオロ修飾を含む。別の実施態様において、Ｙ'ヌクレオチドは、２'－Ｏ－メチル修飾を含む。別の実施態様において、ｐ'＞０である。ある実施態様において、ｐ'＝２である。いくつかの実施態様において、ｑ'＝０であり、ｐ＝０であり、ｑ＝０であって、ｐ'オーバーハングヌクレオチドは標的ｍＲＮＡに相補的である。いくつかの実施態様において、ｑ'＝０であり、ｐ＝０であり、ｑ＝０であって、ｐ'オーバーハングヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡに相補的ではない。

【0047】

ある実施態様において、センス鎖は、合計２１個のヌクレオチドを有しており、アンチセンス鎖は合計２３個のヌクレオチドを有する。

【0048】

ある実施態様において、少なくとも１つのｎ_ｐ'は、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合されている。他の実施態様において、全てのｎ_ｐ'は、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合されている。

【0049】

ある実施態様において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、表３および５に記載のｄｓＲＮＡｉ剤の群から選択される。ある実施態様において、センス鎖の全てのヌクレオチドおよびアンチセンス鎖の全てのヌクレオチドが修飾を含んでいる。

【0050】

ある態様において、本発明は、細胞におけるＫＨＫの発現を阻害することができる二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供するものであって、該ｄｓＲＮＡｉ剤は、センス鎖を含み、該センス鎖は、配列番号：１のヌクレオチド８９～１０７、１７６～１９４、２６４～２８２、４７４～４９２、５０８～５２６、５２９～５４７、５６２～５８０、６１６～６４６、６８２～７００、７０５～７２３、７０５～７５７、７０５～７９９、７３９～７５７、７３９～７９９、７６０～７９９、８０４～８２２、８３７～８５５、８９２～９１０、９５９～９７７、９９２～１０１０、９２２～１０４１、１０１３～１０４１、１０６９～１１０８、１１６９～１１４０、１１１１～１１４０、１１５５～１１９６、１２２１～１２６１、１２６７～１２９４または１３２０～１３５０のいずれか１つの少なくとも１５個の連続するヌクレオチド部分を含み、該センス鎖は、アンチセンス鎖に相補的であって、該アンチセンス鎖は、ＫＨＫをコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖は、約１４～約３０個のヌクレオチド長であって、ここで該ｄｓＲＮＡ剤は、式(ＩＩＩ)：
センス：５'ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－(ＸＸＸ)_ｉ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－(ＺＺＺ)_ｊ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３'
アンチセンス：３'ｎ_ｐ'－Ｎ_ａ'－(Ｘ'Ｘ'Ｘ')_ｋ－Ｎ_ｂ'－Ｙ'Ｙ'Ｙ'－Ｎ_ｂ'－(Ｚ'Ｚ'Ｚ')_ｌ－Ｎ_ａ'－ｎ_ｑ'５'
(ＩＩＩ)
(式中、
ｉ、ｊ、ｋおよびｌは、各々独立して０または１であり；
ｐ、ｐ'、ｑおよびｑ'は、各々独立して０～６であり；
各Ｎ_ａおよびＮ_ａ'は、独立して、修飾または未修飾であるか、あるいはそれらの組み合わせのいずれかである０～２５個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示し、各配列は、少なくとも２つの異なる修飾ヌクレオチドを含んでおり；
各Ｎ_ｂおよびＮ_ｂ'は、各々独立して、修飾または未修飾であるか、あるいはそれらの組み合わせのいずれかである０～１０個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示し；
各ｎ_ｐ、ｎ_ｐ'、ｎ_ｑおよびｎ_ｑ'は、各々独立して、存在しても、存在していなくてもよいが、オーバーハングヌクレオチドを示し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ'Ｘ'Ｘ'、Ｙ'Ｙ'Ｙ'およびＺ'Ｚ'Ｚ'は、各々独立して、３つの連続するヌクレオチド上に３つの同一修飾のうちの１つのモチーフを表し、該修飾は、２－Ｏ－メチル修飾または２'－フルオロ修飾であり；
Ｎ_ｂ上の修飾は、Ｙ上の修飾と異なり、Ｎ_ｂ'上の修飾は、Ｙ'上の修飾と異なり； 該センス鎖は、少なくとも１つのリガンドとコンジュゲートされている)
で表される、二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。

【0051】

ある態様において、本発明は、細胞におけるＫＨＫの発現を阻害することができる二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供するものであって、該ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖を含み、該センス鎖は、好ましくは、配列番号：１のヌクレオチド８９～１０７、１７６～１９４、２６４～２８２、４７４～４９２、５０８～５２６、５２９～５４７、５６２～５８０、６１６～６４６、６８２～７００、７０５～７２３、７０５～７５７、７０５～７９９、７３９～７５７、７３９～７９９、７６０～７９９、８０４～８２２、８３７～８５５、８９２～９１０、９５９～９７７、９９２～１０１０、９２２～１０４１、１０１３～１０４１、１０６９～１１０８、１１６９～１１４０、１１１１～１１４０、１１５５～１１９６、１２２１～１２６１、１２６７～１２９４または１３２０～１３５０のいずれか１つの少なくとも１５個の連続するヌクレオチド部分を含んでおり、該アンチセンス鎖は、ＫＨＫをコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖は、約１４～約３０個のヌクレオチド長であって、ここで該ｄｓＲＮＡ剤は、式(ＩＩＩ)：
センス：５'ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－(ＸＸＸ)_ｉ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－(ＺＺＺ)_ｊ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３'
アンチセンス：３'ｎ_ｐ'－Ｎ_ａ'－(Ｘ'Ｘ'Ｘ')_ｋ－Ｎ_ｂ'－Ｙ'Ｙ'Ｙ'－Ｎ_ｂ'－(Ｚ'Ｚ'Ｚ')_ｌ－Ｎ_ａ'－ｎ_ｑ'５'
(ＩＩＩ)
(式中、
ｉ、ｊ、ｋおよびｌは、各々独立して、０または１であり；
各ｎ_ｐ、ｎ_ｑおよびｎ_ｑ'は、これら各々は、存在していても、または存在していなくてもよいが、独立して、オーバーハングヌクレオチドを示し；
ｐ、ｑおよびｑ'は、各々独立して、０～６であり；
ｎ_ｐ'＞０であり、少なくとも１つのｎ_ｐ'は、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合されており；
各Ｎ_ａおよびＮ_ａ'は、各々独立して、修飾または非修飾あるいはそれらの組み合わせのいずれかである０～２５個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示し、各配列は、少なくとも２つの異なる修飾ヌクレオチドを含んでおり；
各Ｎ_ｂおよびＮ_ｂ'は、独立して、修飾または非修飾あるいはそれらの組み合わせのいずれかである０～１０個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示し； ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ'Ｘ'Ｘ'、Ｙ'Ｙ'Ｙ'およびＺ'Ｚ'Ｚ'は、各々独立して、３つの連続するヌクレオチド上の３つ同一修飾のうちの１つのモチーフを示し、該修飾は、２'-Ｏ-メチル修飾または２'-フルオロ修飾であり；
Ｎ_ｂ上の修飾は、Ｙ上の修飾と異なり、Ｎ_ｂ'上の修飾は、Ｙ'上の修飾と異なり；
該センス鎖は、少なくとも１つのリガンドとコンジュゲートされている)
で表される、二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。

【0052】

ある実施態様において、本発明は、細胞内においてＫＨＫの発現を阻害することができる二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供するものであって、該二本鎖ＲＮＡｉ剤は、センス鎖を含み、該センス鎖は、配列番号：１のヌクレオチド８９～１０７、１７６～１９４、２６４～２８２、４７４～４９２、５０８～５２６、５２９～５４７、５６２～５８０、６１６～６４６、６８２～７００、７０５～７２３、７０５～７５７、７０５～７９９、７３９～７５７、７３９～７９９、７６０～７９９、８０４～８２２、８３７～８５５、８９２～９１０、９５９～９７７、９９２～１０１０、９２２～１０４１、１０１３～１０４１、１０６９～１１０８、１１６９～１１４０、１１１１～１１４０、１１５５～１１９６、１２２１～１２６１、１２６７～１２９４または１３２０～１３５０のいずれか１つのヌクレオチドの少なくとも１５個の連続するヌクレオチド部分を含み、該センス鎖は、アンチセンス鎖に相補的であり、該アンチセンス鎖は、ＫＨＫをコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含んでおり、各鎖は、約１４～約３０個のヌクレオチド長であって、ここで該ｄｓＲＮＡ剤は、式(ＩＩＩ)：
センス：５'ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－(ＸＸＸ)_ｉ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－(ＺＺＺ)_ｊ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３'
アンチセンス：３'ｎ_ｐ'－Ｎ_ａ'－(Ｘ'Ｘ'Ｘ')_ｋ－Ｎ_ｂ'－Ｙ'Ｙ'Ｙ'－Ｎ_ｂ'－(Ｚ'Ｚ'Ｚ')_ｌ－Ｎ_ａ'－ｎ_ｑ'５'
(ＩＩＩ)
(式中、
ｉ、ｊ、ｋおよびｌは、各々独立して、０または１であり；
各ｎ_ｐ、ｎ_ｑおよびｎ_ｑ'は、これら各々は、存在していても、または存在していなくてもよいが、独立して、オーバーハングヌクレオチドを示し；
ｐ、ｑおよびｑ'は、各々独立して、０～６であり；
ｎ_ｐ'＞０であり、少なくとも１つのｎ_ｐ'は、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合されており；
各Ｎ_ａおよびＮ_ａ'は、各々独立して、修飾または非修飾あるいはそれらの組み合わせのいずれかである０～２５個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示し、各配列は、少なくとも２つの異なる修飾ヌクレオチドを含んでおり；
各Ｎ_ｂおよびＮ_ｂ'は、独立して、修飾または非修飾あるいはそれらの組み合わせのいずれかである０～１０個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示しており；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ'Ｘ'Ｘ'、Ｙ'Ｙ'Ｙ'およびＺ'Ｚ'Ｚ'は、各々独立して、３つの連続するヌクレオチド上の３つの同一修飾のうちの１つのモチーフを示し、該修飾は、２'－Ｏ－メチル修飾または２'－フルオロ修飾であり；
Ｎ_ｂ上の修飾は、Ｙ上の修飾と異なり、Ｎ_ｂ'上の修飾は、Ｙ'上の修飾と異なり；
該センス鎖は、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートしており、該リガンドは、２価または３価の分岐鎖リンカーを介して結合された１以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である)
で示される、二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。

【0053】

ある実施態様において、本発明は、細胞内においてＫＨＫの発現を阻害することができる二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供するものであって、該ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖を含み、該センス鎖は、配列番号：１のヌクレオチド８９～１０７、１７６～１９４、２６４～２８２、４７４～４９２、５０８～５２６、５２９～５４７、５６２～５８０、６１６～６４６、６８２～７００、７０５～７２３、７０５～７５７、７０５～７９９、７３９～７５７、７３９～７９９、７６０～７９９、８０４～８２２、８３７～８５５、８９２～９１０、９５９～９７７、９９２～１０１０、９２２～１０４１、１０１３～１０４１、１０６９～１１０８、１１６９～１１４０、１１１１～１１４０、１１５５～１１９６、１２２１～１２６１、１２６７～１２９４または１３２０～１３５０のいずれか１つの少なくとも１５個の連続するヌクレオチド部分を含み、該センス鎖は、アンチセンス鎖に相補的であり、該アンチセンス鎖は、ＫＨＫをコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含んでおり、各鎖は、約１４～約３０個のヌクレオチド長であって、ここで該ｄｓＲＮＡ剤は、式(ＩＩＩ)：
センス：５'ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－(ＸＸＸ)_ｉ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－(ＺＺＺ)_ｊ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３'
アンチセンス：３'ｎ_ｐ'－Ｎ_ａ'－(Ｘ'Ｘ'Ｘ')_ｋ－Ｎ_ｂ'－Ｙ'Ｙ'Ｙ'－Ｎ_ｂ'－(Ｚ'Ｚ'Ｚ')_ｌ－Ｎ_ａ'－ｎ_ｑ'５'
(ＩＩＩ)
(式中、
ｉ、ｊ、ｋおよびｌは、各々独立して、０または１であり；
各ｎ_ｐ、ｎ_ｑおよびｎ_ｑ'は、これら各々は、存在していても、または存在していなくてもよいが、独立して、オーバーハングヌクレオチドを示し；
ｐ、ｑおよびｑ'は、各々独立して、０～６であり；
ｎ_ｐ'＞０であり、少なくとも１つのｎ_ｐ'は、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合されており；
各Ｎ_ａおよびＮ_ａ'は、各々独立して、修飾または非修飾あるいはそれらの組み合わせのいずれかである０～２５個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なる修飾ヌクレオチドを含んでおり；
各Ｎ_ｂおよびＮ_ｂ'は、各々独立して、修飾または非修飾あるいはそれらの組み合わせのいずれかである０～１０個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ'Ｘ'Ｘ'、Ｙ'Ｙ'Ｙ'およびＺ'Ｚ'Ｚ'は、各々独立して、３つの連続するヌクレオチド上の３つの同一修飾のうちの１つのモチーフを表し、該修飾は２'-Ｏ-メチル修飾または２'-フルオロ修飾であり；
Ｎ_ｂ上の修飾は、Ｙ上の修飾と異なり、Ｎ_ｂ'上の修飾は、Ｙ'上の修飾と異なり；
該センス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含んでおり；
該センス鎖は、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされており、該リガンドは、２価または３価の分岐鎖リンカーを介して結合された１または複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である)
で示される、二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。

【0054】

ある態様において、本発明は、細胞内においてＫＨＫの発現を阻害することができる二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供するものであって、該ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖を含み、該センス鎖は、配列番号：１のヌクレオチド８９～１０７、１７６～１９４、２６４～２８２、４７４～４９２、５０８～５２６、５２９～５４７、５６２～５８０、６１６～６４６、６８２～７００、７０５～７２３、７０５～７５７、７０５～７９９、７３９～７５７、７３９～７９９、７６０～７９９、８０４～８２２、８３７～８５５、８９２～９１０、９５９～９７７、９９２～１０１０、９２２～１０４１、１０１３～１０４１、１０６９～１１０８、１１６９～１１４０、１１１１～１１４０、１１５５～１１９６、１２２１～１２６１、１２６７～１２９４または１３２０～１３５０のいずれか１つの少なくとも１５個の連続するヌクレオチド部分を含み、該センス鎖は、アンチセンス鎖に相補的であり、該アンチセンス鎖は、ＫＨＫをコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含んでおり、各鎖は、約１４～約３０ヌクレオチド長であって、ここで該ｄｓＲＮＡ剤は、式(ＩＩＩ)：
センス：５'ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－ＹＹＹ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３'
アンチセンス：３'ｎ_ｐ'－Ｎ_ａ'－Ｙ'Ｙ'Ｙ'－Ｎ_ａ'－ｎ_ｑ'５'
(ＩＩＩａ)
(式中、
各ｎ_ｐ、ｎ_ｑおよびｎ_ｑ'は、これら各々は、存在していても、または存在していなくてもよいが、独立して、オーバーハングヌクレオチドを示し；
ｐ、ｑおよびｑ'は、各々独立して、０～６であり；
ｎ_ｐ'＞０であり、少なくとも１つのｎ_ｐ'は、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合されており；
各Ｎ_ａおよびＮ_ａ'は、各々独立して、修飾または非修飾あるいはそれらの組み合わせのいずれかである０～２５個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示し、各配列は、少なくとも２つの異なる修飾ヌクレオチドを含んでおり；
ＹＹＹおよびＹ'Ｙ'Ｙ'は、各々独立して、３つの連続するヌクレオチド上の３つの同一修飾のうちの１つのモチーフを表し、該修飾は、２'－Ｏ－メチル修飾または２'－フルオロ修飾であり；
該センス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含んでおり；
該センス鎖は、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされており、該リガンドは、２価または３価の分岐鎖リンカーを介して結合された１以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である)
で示される、二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。

【0055】

ある態様において、本発明は、ＫＨＫの発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供するものであって、該二本鎖ＲＮＡｉ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含んでおり、該センス鎖は、配列番号：１のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチド、例えば配列番号：１のヌクレオチド８９～１０７、１７６～１９４、２６４～２８２、４７４～４９２、５０８～５２６、５２９～５４７、５６２～５８０、６１６～６４６、６８２～７００、７０５～７２３、７０５～７５７、７０５～７９９、７３９～７５７、７３９～７９９、７６０～７９９、８０４～８２２、８３７～８５５、８９２～９１０、９５９～９７７、９９２～１０１０、９２２～１０４１、１０１３～１０４１、１０６９～１１０８、１１６９～１１４０、１１１１～１１４０、１１５５～１１９６、１２２１～１２６１、１２６７～１２９４または１３２０～１３５０のいずれか１つのヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドが異なる１５個の連続するヌクレオチドを含んでおり、該アンチセンス鎖は、配列番号：２のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含んでおり、該センス鎖の実質的に全てのヌクレオチドが、２'-Ｏ-メチル修飾および２'-フルオロ修飾から選択される修飾を含んでおり、該センス鎖は、５'末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含んでおり、該アンチセンス鎖の実質的に全てのヌクレオチドが、２'-Ｏ-メチル修飾および２'-フルオロ修飾から選択される修飾を含んでおり、該アンチセンス鎖は、５'末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合および３'末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含んでおり、該センス鎖は、一価、あるいは分鎖枝の二価または三価のリンカーを介して結合された１以上のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされている。ある実施態様において、該センス鎖は、配列番号：１の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドまたは配列番号：１の前記の部分のいずれか１つと、配列番号：２の対応する部分の少なくとも１５個の連続するヌクレオチド配列とを含んでおり、該アンチセンス鎖は、該センス鎖中の３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチドと相補的である。ある実施態様において、該センス鎖および該アンチセンス鎖は、配列番号：１の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドと配列番号：２を含んでいるか、または配列番号：１の所定部分のいずれか一つと配列番号：２の対応する部分を含んでいる。

【0056】

ある実施態様において、センス鎖の全てのヌクレオチドおよびアンチセンス鎖の全てのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである。ある実施態様において、各鎖は、１９～３０個のヌクレオチドを有する。

【0057】

ある実施態様において、センス鎖の実質的に全てのヌクレオチドが修飾されている。ある実施態様において、アンチセンス鎖の実質的に全てのヌクレオチドが修飾されている。ある実施態様において、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方の実質的に全てのヌクレオチドが修飾される。

【0058】

ある態様において、本発明は、本明細書に記載のｄｓＲＮＡ剤を含む細胞を提供する。

【0059】

ある態様において、本発明は、ｄｓＲＮＡ剤の少なくとも１つの鎖をコードするベクターを提供するものであって、該アンチセンス鎖は、ＫＨＫをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的な領域を含んでおり、該ｄｓＲＮＡは、３０塩基対以下の長さであり、該ｄｓＲＮＡ剤は、切断のためにｍＲＮＡを標的とする。ある実施態様において、相補性領域は、少なくとも１５個のヌクレオチド長である。ある実施態様において、相補性領域は、１９～２３個のヌクレオチド長である。

【0060】

ある態様において、本発明は、本明細書に記載のベクターを含む細胞を提供する。

【0061】

ある態様において、本発明は、本発明のｄｓＲＮＡ剤を含むＫＨＫ遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物を提供する。ある実施態様において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、非緩衝液で投与される。ある実施態様において、非緩衝溶液とは、生理食塩水または水である。別の実施態様において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、緩衝液と共に投与される。そのような実施態様において、該緩衝溶液は、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、リン酸塩またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。例えば、緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)であってもよい。

【0062】

ある態様において、本発明は、本発明のｄｓＲＮＡ剤と脂質製剤を含む医薬組成物を提供する。ある実施態様において、脂質製剤は、ＬＮＰを含む。ある実施態様において、脂質製剤は、ＭＣ３を含む。

【0063】

ある態様において、本発明は、細胞におけるＫＨＫ発現を阻害する方法を提供するものであって、この方法は、(ａ)細胞を本発明のｄｓＲＮＡ剤または本発明の医薬組成物と接触させる工程；および(ｂ)工程(ａ)を行った細胞を、ＫＨＫ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解物を得るために十分な時間維持して、それによって細胞中のＫＨＫ遺伝子の発現を阻害する工程を特徴とする。ある実施態様において、該細胞は、対象、例えば、ヒト対象、例えば、女性または男性体内に存在する。ある実施態様において、該対象は、腎機能が低下しているか、または腎機能が低下する傾向を示す。好ましい実施態様において、ＫＨＫ発現は、適切なコントロールと比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の割合で阻害されるか、あるいは検出限界値以下まで低下される。ある実施態様において、該センス鎖は、配列番号：１と３つ以下のミスマッチを有する少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むか、または配列番号：１のヌクレオチド８９～１０７、１７６～１９４、２６４～２８２、４７４～４９２、５０８～５２６、５２９～５４７、５６２～５８０、６１６～６４６、６８２～７００、７０５～７２３、７０５～７５７、７０５～７９９、７３９～７５７、７３９～７９９、７６０～７９９、８０４～８２２、８３７～８５５、８９２～９１０、９５９～９７７、９９２～１０１０、９２２～１０４１、１０１３～１０４１、１０６９～１１０８、１１６９～１１４０、１１１１～１１４０、１１５５～１１９６、１２２１～１２６１、１２６７～１２９４または１３２０～１３５０のいずれか１つと配列番号：２の対応する部分の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含んでおり、該アンチセンス鎖は、該センス鎖中の３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチドに相補的である。ある実施態様において、該センス鎖および該アンチセンス鎖は、配列番号：１と配列番号：２の少なくとも１５個の連続するヌクレオチド配列を含んでいるか、または配列番号：１の所定部分の１つと配列番号：２の対応する部分を含んでおり、該アンチセンス鎖は、該センス鎖中の３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチド配列と相補的であるものである。

【0064】

ある態様において、本発明は、ＫＨＫ発現の低下により利益を得る疾患または障害に罹患している対象を治療する方法を提供するものであって、該方法は、本発明のｄｓＲＮＡ剤または本発明の医薬組成物の治療的上有効な量を対象に投与することで、対象を治療することを特徴とする。

【0065】

ある態様において、本発明は、ＫＨＫ発現の低下により利益を得る疾患または障害に罹患している対象における少なくとも１つの症状を予防するための方法を提供するものであって、該方法は、予防上有効な量の本発明のｄｓＲＮＡ剤または本発明の医薬組成物を対象に投与することにより、ＫＨＫ発現の低下により利益を得る障害に罹患している対象の少なくとも１つの症状を予防することを特徴とする。

【0066】

ある実施態様において、ｄｓＲＮＡ剤を患者に投与することにより、フルクトース代謝の低下が引き起こされる。ある実施態様において、ｄｓＲＮＡの投与により、高いＫＨＫを示す対象において、対象におけるＫＨＫのレベル、特に肝臓ＫＨＫ、特にＫＨＫ-Ｃの低下が引き起こされる。ある実施態様において、ｄｓＲＮＡの投与により、対象におけるフルクトース代謝の低下が引き起こされる。ある実施態様において、ｄｓＲＮＡの投与により、高い血清尿酸を示す対象(例えば、痛風に関連して高い血清尿酸を示す対象)における尿酸レベル(例えば、血清尿酸)のレベルが低下する。ある実施態様において、ｄｓＲＮＡの投与により、少なくとも１つの異常な血清脂質レベルを有する対象における、血清脂質、例えば、食後トリグリセリド、ＬＤＬ、ＨＤＬまたはコレステロールを含むトリグリセリドの正常化がおこる。ある実施態様において、ｄｓＲＮＡの投与により、脂質沈着の正常化、例えば、肝臓における脂質沈着の低下(例えば、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨの低下)、内臓脂肪沈着の低下、体重低下がおこる。ある実施態様において、ｄｓＲＮＡの投与により、インスリンに対する免疫応答に関連しない異常なインスリン応答または異常なグルコース応答を示す対象において、インスリン応答またはグルコース応答の正常化がおこる。ある実施態様において、ｄｓＲＮＡの投与により、腎機能の改善または腎機能の損失率の防止または低下がおこる。ある実施態様において、ｄｓＲＮＡは、高血圧、即ち血圧上昇を低下させる。

【0067】

ある実施態様において、ＫＨＫ関連疾患は、肝臓疾患、例えば、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨのような脂肪肝疾患である。ある実施態様において、ＫＨＫ関連疾患は、脂質異常症、例えば、血清トリグリセリドの上昇、血清ＬＤＬの上昇、血清コレステロールの上昇、血清ＨＤＬの低下、食後高トリグリセリド血症である。別の実施態様では、ＫＨＫ関連疾患とは、血糖コントロールの障害、例えば、インスリンに対する免疫応答に起因しないインスリン耐性、グルコース耐性、ＩＩ型糖尿病である。ある実施態様において、ＫＨＫ関連疾患は、心血管疾患、例えば、高血圧、内皮細胞機能障害である。ある実施態様において、ＫＨＫ関連疾患は、腎臓疾患、例えば、急性腎臓障害、尿細管機能障害、近位尿細管の炎症性変化、慢性腎臓疾患である。ある実施態様において、疾患はメタボリックシンドロームである。ある実施態様において、ＫＨＫ関連疾患は、脂質沈着または機能障害、例えば、内臓脂肪沈着、脂肪肝、肥満である。ある実施態様において、ＫＨＫ関連疾患は、尿酸上昇に関する疾患、例えば、痛風、高尿酸血症である。ある実施態様において、ＫＨＫ関連疾患は、過度の糖渇望などの摂食障害である。

【0068】

ある実施態様において、本発明は、さらに、ＫＨＫ関連疾患を有する対象に追加の薬剤を投与することをさらに含む。

【0069】

ある実施態様において、様々なＫＨＫ関連疾患のための当業者には既知の治療は、本発明のＲＮＡｉ剤と組み合わせて使用される。そのような治療法は、以下に検討されている。

【0070】

様々な実施態様において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、約０.０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、または約０.５ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇの用量で対象に投与される。いくつかの実施態様において、ｄｓＲＮＡ剤は、約１０ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇの用量で対象に投与される。ある実施態様において、ｄｓＲＮＡ剤は、０.５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１.５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇから選択される用量で対象に投与される。ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤は、約０.１ｍｇ／ｋｇ～約５.０ｍｇ／ｋｇの用量で、約１週間に１回、約１ヶ月に１回、約２ヶ月に１回または約四半期に１回(すなわち、約３ヶ月に１回)に１回投与される。

【0071】

ある実施態様において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、１週間に１回、対象に投与される。ある実施態様において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、１ヵ月に１回、対象に投与される。ある実施態様において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、対象に四半期に１回(すなわち、３ヶ月に１回)投与される。

【0072】

ある実施態様において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、対象に皮下投与される。

【0073】

ある実施態様において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、対象に筋肉内投与される。

【0074】

様々な実施態様において、本発明の方法は、対象の尿酸値、特に血清尿酸値を測定することをさらに含む。様々な実施態様において、本発明の方法は、対象における尿酸フルコトース値を測定することをさらに含む。様々な実施態様において、本発明の方法は、対象における血清脂質レベルを測定することをさらに含む。ある実施態様において、本発明の方法は、対象におけるインスリンまたはグルコース感受性を測定することをさらに含む。ある実施態様において、フルクトース代謝の発現レベルまたは活性レベルにおける低下は、ＫＨＫ関連疾患が治療または予防されていることを示す。

【図面の簡単な説明】

【0075】

【図1】図１は、フルクトースの古典的な脂質合成経路および別の脂質合成経路を示す。古典的経路において、トリグリセリド(ＴＧ)は、アルドラーゼＢ(Ａｌｄｏ Ｂ)および脂肪酸合成酵素(ＦＡＳ)を含む複数の酵素作用によるフルクトース代謝の直接的な生成物である。別の経路において、フルクトースがフルクトース-１-リン酸(Ｆ-１-Ｐ)にリン酸化される間に起こるヌクレオチドのターンオーバーにより生成される尿酸は、ミトコンドリアの酸化ストレス(ｍｔＲＯＳ)を作りだし、これによりクレブス回路中のアコニターゼ(ＡＣＯ_２)の活性を低下させる。その結果、ＡＣＯ_２の基質であるクエン酸塩が蓄積し、サイトゾルに放出され、それがＡＴＰクエン酸リアーゼ(ＡＣＬ)と脂肪酸合成酵素の活性化によりＴＧ合成の基質として作用する。ＡＭＰＤ２、ＡＭＰデアミナーゼ２；ＩＭＰ、イノシン一リン酸；ＰＯ_４、リン酸塩(Jonshon et. al., (2013) Diabetes.62:3307-3315)。

【図2】図２は、ケトヘキソキナーゼＡの転写物(ＮＭ＿０００２２１.２、配列番号：３)、ケトヘキソキナーゼＣの転写物(ＮＭ＿００６４８８.２、配列番号：１)および転写変異体Ｘ５の転写物(ＸＭ＿００５２６４２９８.１、配列番号：５)についてのヒトＫＨＫ遺伝子におけるエクソン配置を示す。

【発明を実施するための形態】

【0076】

本発明は、ＫＨＫを標的とするＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤を含む組成物を提供する。本発明は、ＫＨＫ発現を阻害するために本発明の組成物を使用する方法、ならびにＫＨＫ関連疾患、障害および／または症状、例えば、肝臓疾患(例えば、脂肪肝、脂肪性肝炎、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ)、脂質異常症(例えば、高脂血症、高ＬＤＬコレステロール、低ＨＤＬコレステロール、高トリグリセリド血症、食後高トリグリセリド血症)、血糖コントロールの障害(例えば、インスリンに対して免疫応答に起因しないインスリン耐性、ＩＩ型糖尿病)、心血管疾患(例えば、高血圧症、内皮細胞機能障害)、腎臓病(例えば、急性腎障害、尿細管機能障害、近位尿細管の炎症性変化、慢性腎臓病)、メタボリックシンドローム、脂肪細胞機能障害、内臓脂肪沈着、肥満、高尿酸血症、痛風、摂食障害および過剰な糖への渇望を治療するために本発明の組成物を使用する方法も提供する(Khaitan Z. et al., (2013) J. Nutr. Metab., Article ID 682673, 1-12；Diggle C.P. et al., (2009) J. Hisotchem. Cytochem., 57(8): 763-774；Cirillo P. et al., (2009) J. Am. Soc. Nephrol., 20: 545-553；Lanaspa M.A. et al., (2012) PLOS ONE 7(10): 1-11)。

【0077】

ＫＨＫ(ケトヘキソキナーゼ)遺伝子は、染色体２ｐ２３上に位置し、フルクトキナーゼとしても知られているケトヘキソキナーゼをコードしている。ＫＨＫは、アルコールをリン酸受容体とするホスホトランスフェラーゼ酵素である。ＫＨＫは、炭水化物キナーゼのリボキナーゼファミリーに属する(Trinh et al., ACTA Cryst., D65:201-211)。ケトヘキソキナーゼの２つのアイソフォーム、ＫＨＫ－ＡおよびＫＨＫ－Ｃが特定されており、これらは、完全長ｍＲＮＡの選択的スプライシングにより得られる。これらのアイソフォームは、エクソン３ａまたは３ｃいずれを含むかにより異なり、位置７２～１１５の３２個のアミノ酸が異なる(例えば、図２を参照)。ＫＨＫ－Ｃ ｍＲＮＡは、主に肝臓、腎臓および小腸において高レベルで発現される。ＫＨＫ－Ｃは、ＫＨＫ－Ａよりはるかに低い、フルクトース結合に対するＫ_ｍを有し、結果として、食事性フルクトースをリン酸化するのに非常に有効である。ヒトＫＨＫ－Ｃ ｍＲＮＡ転写物の配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１５３２１８４４７(ＮＭ＿００６４８８．２；配列番号１)に見られる。ヒトＫＨＫ－Ａ ｍＲＮＡ転写物の配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１５３２１８４４６(ＮＭ＿０００２２１.２；配列番号３)に見られる。完全長ヒトＫＨＫ ｍＲＮＡの配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：５３０３６７５５２(ＸＭ＿００５２６４２９８.１；配列番号５)で提供されており、これを使用した(図２)。

【0078】

本発明は、ＫＨＫ遺伝子の発現を調節するためのｉＲＮＡ剤、組成物および方法を提供する。ある実施態様において、ＫＨＫの発現が、ＫＨＫ特異的ｉＲＮＡ剤を用いて低下されることにより、フルクトースからフルクトース－１－リン酸へのリン酸化を低下させ、それにより尿酸値の増加および脂質合成の増加を防ぎ、フルクトース代謝経路を経る代謝へと至る。このように、本発明のｉＲＮＡ組成物を用いたＫＨＫ遺伝子の発現または活性の阻害は、食事性フルクトースの脂質合成効果を低下させ、それに伴う対象中の尿酸の蓄積を防ぐための治療法として有用である。このような阻害は、肝臓疾患(例えば、脂肪肝、脂肪性肝炎、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ)、脂質異常症(例えば、高脂血症、高ＬＤＬコレステロール、低ＨＤＬコレステロール、高トリグリセリド血症、食後高トリグリセリド血症)、血糖コントロールの障害(例えば、インスリン耐性、糖尿病)、心血管疾患(例えば、高血圧症、内皮細胞機能障害)、腎臓病(例えば、急性腎障害、尿細管機能障害、近位尿細管の炎症性変化、慢性腎臓病)、メタボリックシンドローム、脂肪細胞機能障害、内臓脂肪沈着、肥満、高尿酸血症、痛風、摂食障害および過剰な糖への渇望などの疾病、障害または症状を治療するために有用である。

【0079】

本発明は、ケトヘキソキナーゼ(ＫＨＫ)遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体(ＲＩＳＣ)介在性切断に影響を与えるｉＲＮＡ組成物を提供する。この遺伝子は、細胞内、例えば、ヒトなどの対象の体内細胞に存在し得る。これらのｉＲＮＡを用いることにより、哺乳類において、対応遺伝子(ＫＨＫ遺伝子)のｍＲＮＡを標的とした分解が可能となる。

【0080】

本発明のｉＲＮＡは、他の哺乳類のＫＨＫオーソログに保存されている遺伝子の部分を含むヒトＫＨＫ遺伝子を標的とするように設計されている。理論によって制限されることを意図しないが、前記特性と、これらのｉＲＮＡにおける特異的な標的部位または特異的な修飾の組み合わせまたは部分的な組み合わせが、本発明のｉＲＮＡに改善された有効性、安定性、効力、耐久性および安全性を与えると考えられる。

【0081】

従って、本発明は、ＫＨＫ遺伝子の発現を阻害または低下することにより利益を得る障害、例えばＫＨＫ関連疾患を有する対象を、ＫＨＫ遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体(ＲＩＳＣ)介在性切断を行うｉＲＮＡ組成物を使用して治療するための方法も提供する。

【0082】

非常に少ない投与量で本発明のｉＲＮＡは、特に、ＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)を特異的かつ効率的に媒介し、その結果、対応遺伝子(ＫＨＫ遺伝子)の発現を有意に阻害することができる。

【0083】

本発明のｉＲＮＡは、約３０個以下のヌクレオチド長である領域を有するＲＮＡ鎖(アンチセンス鎖)、例えば、１５～３０、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３または２１～２２個のヌクレオチド長を含んでいてもよく、この領域は、ＫＨＫ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に実質的に相補的である。

【0084】

ある実施態様において、本発明のｉＲＮＡは、より長いヌクレオチド長、例えば最大６６個のヌクレオチド、例えば３６～６６、２６～３６、２５～３６、３１～６０、２２～４３、２７～５３個のヌクレオチド長であり、ＫＨＫ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的である少なくとも１９個の連続するヌクレオチドの領域を含み得るＲＮＡ鎖(アンチセンス鎖)を含む。より長いアンチセンス鎖長を有するこれらのｉＲＮＡは、好ましくは、該センス鎖と該アンチセンス鎖が、１８～３０個の連続するヌクレオチドの二本鎖を形成する２０～６０個のヌクレオチド長の第二のＲＮＡ鎖(センス鎖)を含む。

【0085】

本発明のｉＲＮＡの使用により、哺乳動物における対応遺伝子(ＫＨＫ遺伝子)のｍＲＮＡの標的分解が可能となる。非常に少ない投与量にて本発明のｉＲＮＡは、特に、ＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)を特異的かつ効率的に媒介することができ、その結果、対応遺伝子(ＫＨＫ遺伝子)の発現を有意に阻害することができる。インビトロおよびインビボアッセイを用いて、我々は、ＫＨＫ遺伝子を標的とするｉＲＮＡがＲＮＡｉを媒介することが可能であり、その結果、ＫＨＫの発現を有意に阻害するとともに、フルクトース代謝を低下させて、ＫＨＫ関連疾患に関連する１つ以上の症状を低下させることが可能であることを実証した。従って、これらのｉＲＮＡを含む方法および組成物は、ＫＨＫ関連疾患に罹患している対象を治療するのに有用である。本明細書に記載の方法および組成物は、対象におけるＫＨＫ、好ましくは対象におけるＫＨＫ-Ｃ、例えば対象における肝臓のＫＨＫ-Ｃのレベルを低下させるのに有用である。

【0086】

以下の詳細な説明は、ＫＨＫ遺伝子の発現を阻害するためのｉＲＮＡを含む組成物の製造方法および使用方法、ならびにＫＨＫ遺伝子発現の低下により利益を得る疾患および障害を有する対象を治療するための組成物、使用および方法を開示する。

【0087】

Ｉ．定義
本発明をより容易に理解できるように、いくつかの用語がまず定義される。更に、パラメーターの値または値の範囲が記載されるときは常に、記載される値の中間の値および範囲も、本発明の一部であることが意図されることに留意されたい。

【0088】

冠詞「ａ」および「ａｎ」は、その冠詞の文法上の目的語の１つまたは２つ以上(即ち、少なくとも１つ)を指すために本明細書において使用される。例として、「要素(ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ)」は、１つの要素または２つ以上の要素、例えば、複数の要素を意味する。

【0089】

「を含む」という用語は、「を含むがこれらに限定するものではない」という語句を意味するために本明細書において使用され、かつこの語句と互換的に使用される。

【0090】

「または」という用語は、文脈上明らかに別の意味を示さない限り、「および／または」という用語を意味するために本明細書において使用され、かつこの用語と互換的に使用される。

【0091】

「約」という用語は、本明細書において、当分野における許容範囲の典型的な範囲内を意味するために使用される。例えば、「約」は、平均から約２の標準偏差であると理解され得る。ある実施態様において、「約」は、±１０％を意味する。ある実施態様においては、「約」は、±５％を意味する。「約」が、一連の数値または範囲の前に存在する場合、「約」は、一連の数値または範囲内の各数値を修飾できると理解される。

【0092】

数字または一連の数値の前の用語「少なくとも」は、文脈から明らかなように、用語「少なくとも」に隣接する数、および論理的に含まれる可能性のある全ての後続する数または整数を含むと理解される。例えば、核酸分子中のヌクレオチドの数は整数でなければならない。例えば、「２１個のヌクレオチドの核酸分子の少なくとも１８個のヌクレオチド」は、１８、１９、２０または２１個のヌクレオチドが所定の性質を有することを意味する。「少なくとも」が、一連の数値または範囲の前に存在する場合、「少なくとも」は、一連の数値または範囲内の各数を修飾し得ることが理解される。

【0093】

本明細書で使用されるとおり、「以下」または「より少ない」は、この用語に隣接する数値および論理的に低い値または整数として、文脈からゼロまでの論理的な値として理解される。例えば、「２以下のヌクレオチド」のオーバーハングを有する二本鎖は、２、１または０個のヌクレオチドのオーバーハングを有する。「以下」が、一連の数値または範囲の前に存在する場合、「以下」とは、一連の数値または範囲内の数字の各数を修飾し得ることが理解される。

【0094】

本明細書において使用されるとおり、「ケトヘキソキナーゼ」または「ＫＨＫ」は、フルクトースのフルクトース-１-リン酸への変換を触媒する酵素である。この遺伝子産物は、食事性フルクトースを異化する経路における最初の酵素である。様々なアイソフォームをコードする選択的転写変異体が同定されている。この遺伝子は、フルクトキナーゼとしても知られている。ＫＨＫに関する更なる情報は、例えば、ＮＣＢＩ遺伝子データベース(www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/3975)において提供されている(出願日の時点で、参照により本明細書に組み込まれる)。

【0095】

本明細書で使用されるとおり、用語「ＫＨＫ」と互換的に使用される「ケトヘキソキナーゼ」は、ＫＨＫタンパク質をコードする天然に存在する遺伝子を指す。ヒトＫＨＫ遺伝子の参照配列のアミノ酸および全コード配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ:１５３２１８４４７(ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＭ＿００６４８８；配列番号：1；配列番号：２)、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１５３２１８４４６(ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＭ＿０００２２１.２；配列番号：３および４)およびＧｅｎＢａｎｋ登録番号７６７９１４４８０(ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＸＭ＿００５２６４２９８.２；配列番号：５および６)に存在し得る。ヒトＫＨＫ遺伝子の哺乳類のオートログは、例えば、ＧＩ：８８７２０９８１９(ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＭ＿００８４３９.４、マウス；配列番号：７および配列番号：８)；ＧＩ：１２６４３２５４７(ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＭ＿０３１８５５.３、ラット；配列番号：９および配列番号：１０)；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：９８２２９１２４５(ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＸＭ＿００５５７６３２１、カニクイザル；配列番号：１１および配列番号：１２)に見い出される。

【0096】

ＫＨＫプレｍＲＮＡの選択的スプライシングにより産生される２種のＫＨＫアイソフォームが存在する。ＫＨＫ－Ｃは、フルクトース代謝を行う臓器、例えば肝臓、腎臓、腸に多く存在している。これは非常に活性が高く、殆どのフルクトース代謝に関与している。ＫＨＫ－Ａは、フルクトースに対する親和性が低く、殆どの組織で広く発現している。本明細書で提供されるｉＲＮＡ剤は、１つまたは両方のＫＨＫアイソフォームを、サイレンシングすることができる。好ましい実施態様において、ｉＲＮＡ剤は、少なくともＫＨＫ－Ｃをサイレンシングすることが可能であり、少なくともＫＨＫ－Ｃアイソフォームの発現が阻害される。

【0097】

天然に存在する多くのＳＮＰが知られており、例えば、ヒトＫＨＫにおけるＳＮＰを提供するＮＣＢＩ(www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi?locusId=3795)のＳＮＰデータベース(出願日の時点で、参照により本明細書に組み込まれる)に見出され得る。好ましい実施態様において、そのような天然に存在する変異体は、ＫＨＫ遺伝子配列の範囲内に含まれる。

【0098】

ＫＨＫｍＲＮＡ配列の追加の例は、公知のデータベース、例えばＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔおよびＯＭＩＭを使用して容易に入手できる。

【0099】

本明細書で使用されるとおり、「標的配列」とは、ＫＨＫ遺伝子の転写の間に形成されるｍＲＮＡ分子、例えば一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡのヌクレオチド配列の連続する部分を指す。配列の標的部分は、少なくとも、ＫＨＫ遺伝子の転写の間に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の該当部分またはその近傍で、ｉＲＮＡに特異的な切断のための基質としての役割を果たすのに十分な長さであろう。ある実施態様において、標的配列は、ＫＨＫのタンパク質コード領域内に存在する。

【0100】

標的配列は、約９～３６個のヌクレオチド長、例えば、約１５～３０個のヌクレオチド長であり得る。例えば、標的配列は、約１５～３０個のヌクレオチド、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３または２１～２２個のヌクレオチド長であり得る。上記範囲およびその間の範囲の長さも、本発明の一部であると考えられる。

【0101】

本明細書において使用されるとおり、「配列を含む鎖」という用語は、標準的なヌクレオチドの命名法を用いて示される配列によって表されるヌクレオチドの鎖を含むオリゴヌクレオチドを指す。

【0102】

「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」および「Ｕ」は、それぞれ一般的に、塩基としてグアニン、シトシン、アデニンおよびウラシルを含むヌクレオチドを表す。しかし、「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語は、以下に更に詳述されるように、修飾ヌクレオチドまたは代用置換部分(Surrogate replacement moiety)も指し得ることが理解されよう(例えば、表２を参照されたい)。当業者には、グアニン、シトシン、アデニンおよびウラシルが、かかる置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対合の特性を、実質的に変化させない別の置換部分に置き換えられていてもよいことは十分に認識されよう。例えば、限定するものではないが、その塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシンまたはウラシルを含むヌクレオチドと塩基対合し得る。従って、ウラシル、グアニンまたはアデニンを含むヌクレオチドは、本発明に関するｄｓＲＮＡのヌクレオチド配列において、例えば、イノシンを含むヌクレオチドに置き換えられてもよい。別の例では、オリゴヌクレオチド中のいずれかの箇所のアデニンおよびシトシンを、それぞれグアニンおよびウラシルで置換して、標的ｍＲＮＡとのＧ－Ｕゆらぎ塩基対合を形成させることができる。このような置換部分を含有する配列は、本発明に記載の組成物および方法に好適である。

【0103】

本明細書において互換的に使用される「ｉＲＮＡ」、「ＲＮＡｉ剤」、「ｉＲＮＡ剤」、「ＲＮＡ干渉剤」という用語は、その用語が本明細書において定義されるとおり、ＲＮＡを含有し、且つＲＮＡ誘導サイレンシング複合体(ＲＩＳＣ)を介した経路によるＲＮＡ転写物の標的化された切断を媒介する剤を指す。ｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)として知られるプロセスによってｍＲＮＡ配列に特異的な分解を導く。ｉＲＮＡは、細胞、例えば、哺乳類対象などの対象の細胞内でのＫＨＫ遺伝子の発現を調節する(例えば、阻害する)。

【0104】

一実施態様において、本発明のＲＮＡｉ剤は、標的ＲＮＡ配列、例えば、ＫＨＫ標的ｍＲＮＡ配列と相互作用して、標的ＲＮＡの切断を導く一本鎖ＲＮＡを含む。理論に制限されることは望まないが、細胞中に導入される長い二本鎖ＲＮＡが、ダイサー(Dicer)として知られるＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによってｓｉＲＮＡに分解されると考えられる(Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15:485)。リボヌクレアーゼＩＩＩ様酵素であるダイサーは、ｄｓＲＮＡをプロセシングして、特徴的な２つの塩基３'オーバーハングを有する１９～２３塩基対の短い干渉ＲＮＡにする(Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363)。次に、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体(ＲＩＳＣ)に取り込まれ、ここで１つまたは複数のヘリカーゼが、ｓｉＲＮＡ二本鎖をほどいて、相補的なアンチセンス鎖を標的の認識に導くことを可能にする(Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309)。適切な標的ｍＲＮＡに結合すると、ＲＩＳＣ中の１つまたは複数のエンドヌクレアーゼが標的を切断して、サイレンシングを誘導する(Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188)。すなわち、一態様において、本発明は、細胞中で生成され、かつ標的遺伝子、即ちＫＨＫ遺伝子のサイレンシングを行うＲＩＳＣ複合体の形成を促進する一本鎖ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)に関する。従って、「ｓｉＲＮＡ」という用語はまた、上記のようなｉＲＮＡを指すために本明細書において使用される。

【0105】

ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤は、標的ｍＲＮＡを阻害するために細胞または生物に導入される一本鎖ｓｉＲＮＡ(ｓｓＲＮＡｉ)であり得る。一本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＲＩＳＣエンドヌクレアーゼであるArgonaute２に結合した後、標的ｍＲＮＡを切断する。一本鎖ｓｉＲＮＡは、一般に、１５～３０個のヌクレオチドであり、化学的に修飾される。一本鎖ｓｉＲＮＡの設計および試験は、米国特許第８,１０１,３４８号明細書およびLima et al., (2012) Cell 150:883-894において説明されており、各内容の全てが、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されるいずれのアンチセンスヌクレオチド配列も、本明細書に記載されるような一本鎖ｓｉＲＮＡまたはLima et al., (2012) Cell 150:883-894に記載された方法により化学的に修飾された一本鎖ｓｉＲＮＡとして使用され得る。

【0106】

ある実施態様において、本発明の組成物、使用および方法に用いるための「ｉＲＮＡ」は、二本鎖ＲＮＡであり、本明細書においては「二本鎖ＲＮＡｉ剤」、「二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)分子」、「ｄｓＲＮＡ剤」または「ｄｓＲＮＡ」と呼ばれる。「ｄｓＲＮＡ」という用語は、標的ＲＮＡ(即ち、ＫＨＫ遺伝子)に対する「センス」および「アンチセンス」配向を有することが示される、２本の逆平行で、かつ実質的に相補的な核酸鎖を含む二本鎖構造を有するリボ核酸分子の複合体を指す。本発明のある実施態様において、二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)は、本明細書においてＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉと呼ばれる転写後遺伝子サイレンシング機構による標的ＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)の分解を引き起こす。

【0107】

一般に、ｄｓＲＮＡ分子のそれぞれの鎖のヌクレオチドの大部分は、リボヌクレオチドであるが、本明細書において詳細に記載されるように、各鎖または両方の鎖は、１つまたは複数の非リボヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドも含み得る。更に、本明細書において使用されるとおり、「ｉＲＮＡ剤」は、化学修飾を有するリボヌクレオチドを含んでいてもよく；ｉＲＮＡ剤は、複数のヌクレオチドの実質的な修飾を含み得る。本明細書において使用されるとおり、「修飾ヌクレオチド」という用語は、独立して、修飾された糖部分、修飾されたヌクレオチド間結合または修飾された核酸塩基またはその組み合わせを有するヌクレオチドを指す。したがって、修飾ヌクレオチドという用語は、ヌクレオシド間結合、糖部分または核酸塩基に対する、例えば、官能基または原子の置換、付加または除去を包含する。本発明の剤に使用するのに好適な修飾は、本明細書に開示されるか、または当該技術分野において公知のあらゆるタイプの修飾を含む。ｓｉＲＮＡタイプの分子に使用される際のこのようないずれの修飾も、本明細書および特許請求の範囲の目的のための「ｉＲＮＡ」または「ＲＮＡｉ剤」に包含される。

【0108】

ｄｓＲＮＡ分子のそれぞれの鎖のヌクレオチドの大部分は、リボヌクレオチドであるが、本明細書において詳細に記載されるように、各鎖または両方の鎖は、１つまたは複数の非リボヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドも含み得る。更に、本明細書において使用されるとおり、「ｉＲＮＡ」は、化学修飾を有するリボヌクレオチドを含んでいてもよく；ｉＲＮＡ剤は、複数のヌクレオチドの実質的な修飾を含み得る。本明細書において使用されるとおり、「修飾ヌクレオチド」という用語は、独立して、修飾された糖部分、修飾されたヌクレオチド間結合または修飾された核酸塩基を有するヌクレオチドを指す。したがって、修飾ヌクレオチドという用語は、ヌクレオシド間結合、糖部分または核酸塩基に対する、例えば、官能基または原子の置換、付加または除去を包含する。本発明の剤に使用するのに好適な修飾は、本明細書に開示されるか、または当該技術分野において公知のあらゆるタイプの修飾を含む。ｓｉＲＮＡタイプの分子に使用される際のこのようないずれの修飾も本明細書および特許請求の範囲の目的のための「ｉＲＮＡ」または「ＲＮＡｉ剤」に包含される。

【0109】

二本鎖領域は、ＲＩＳＣ経路を介した所望の標的ＲＮＡの特異的な分解を可能にする任意の長さのものであってもよく、約９～３６塩基対の長さ、例えば、約１５～３０塩基対の長さ、例えば、約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５または３６塩基対の長さ、例えば、約１５～３０、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３または２１～２２塩基対の長さの範囲であり得る。上記した範囲および長さに対するその中間の範囲および長さも、本発明の一部であると考えられる。

【0110】

二本鎖構造を形成する２本の鎖は、１つの大きなＲＮＡ分子の異なる部分であってもよく、またはそれらは別のＲＮＡ分子であってもよい。２本の鎖が、１つのより大きな分子の一部分であって、二本鎖構造を形成する１本の鎖の３'末端ともう一方の鎖の５'末端との間にあるヌクレオチドの連続した鎖によって結合されている場合、この結合しているＲＮＡ鎖は、「ヘアピンループ」と呼ばれる。ヘアピンループは、少なくとも１つの不対ヌクレオチドを含み得る。ある実施態様において、ヘアピンループは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも２３個またはそれ以上の不対ヌクレオチドを含み得る。ある実施態様において、ヘアピンループは、１０または数個の不対ヌクレオチドであってもよい。ある実施態様において、ヘアピンループは、８または数個の不対ヌクレオチドであってもよい。ある実施態様において、ヘアピンループは、４～１０個の不対ヌクレオチドであってもよい。ある実施態様において、ヘアピンループは、４～８個の不対ヌクレオチドであってもよい。

【0111】

ｄｓＲＮＡの２つの実質的に相補的な鎖が、別のＲＮＡ分子によって構成される場合、それらの分子は、共有結合され得るが、必ずしも共有結合される必要はない。２本の鎖が、二本鎖構造を形成する１本の鎖の３'末端とその他方の鎖の５'末端との間のヌクレオチドの連続した鎖以外の手段によって共有結合的に結合されている場合、この結合している構造は、「リンカー」と呼ばれる。ＲＮＡ鎖は、同数または異なる数のヌクレオチドを有し得る。塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡの最も短い鎖のヌクレオチドの数から、二本鎖に存在するあらゆるオーバーハングを引いた数である。二本鎖構造に加えて、ＲＮＡｉは、１つまたは複数のヌクレオチドオーバーハングを含み得る。

【0112】

ある実施態様において、本発明のｉＲＮＡ剤は、ｄｓＲＮＡであって、この各鎖は１９～２３個のヌクレオチドを含んでおり、標的ＲＮＡ配列(例えば、ＫＨＫ遺伝子)と相互作用し、理論に縛られることを望まないが、細胞内に導入された長い二本鎖ＲＮＡは、ダイサーとして知られるタイプＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによってｓｉＲＮＡに分解される(Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15:485)。リボヌクレアーゼＩＩＩ型酵素であるダイサーは、ｄｓＲＮＡをプロセシングして、特徴的な２つの塩基３'オーバーハングを有する１９～２３塩基対の短い干渉ＲＮＡにする(Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363)。その後、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体(ＲＩＳＣ)に取り込まれ、ここで１つまたは複数のヘリカーゼがｓｉＲＮＡ二本鎖をほどいて、相補的なアンチセンス鎖を、標的認識に誘導することを可能にする(Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309)。適切な標的ｍＲＮＡに結合すると、ＲＩＳＣ内の１つまたは複数のエンドヌクレアーゼが標的を切断して、サイレンシングを誘導する(Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188)。

【0113】

いくつかの実施態様では、本発明のｉＲＮＡは、標的ＲＮＡ配列、例えばＫＨＫ標的ｍＲＮＡ配列と相互作用して、標的ＲＮＡの切断を行う２４～３０個のヌクレオチドのｄｓＲＮＡである。理論に縛られることを望まないが、細胞内に導入された長い二本鎖ＲＮＡは、ダイサーとして知られるＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによってｓｉＲＮＡに分解される(Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15:485)。リボヌクレアーゼＩＩＩ型酵素であるダイサーは、ｄｓＲＮＡをプロセシングして、特徴的な２つの塩基の３'オーバーハングを有する１９～２３塩基対の短い干渉ＲＮＡにする(Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363)。その後、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体(ＲＩＳＣ)に取り込まれ、ここで１または複数のヘリカーゼがｓｉＲＮＡ二本鎖をほどいて、相補的なアンチセンス鎖を標的認識に誘導することを可能にする(Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309)。適切な標的ｍＲＮＡに結合すると、ＲＩＳＣ内の１つまたは複数のエンドヌクレアーゼが標的を切断して、サイレンシングを誘導する(Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188)。

【0114】

本明細書において使用されるとおり、「ヌクレオチドオーバーハング」という用語は、二本鎖ｉＲＮＡから突出する少なくとも１つの不対ヌクレオチドを指す。例えば、ｄｓＲＮＡの１本の鎖の３'末端が、他方の鎖の５'末端を越えて伸びているか、またはその逆である場合、ヌクレオチドオーバーハングが存在する。ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つのヌクレオチドのオーバーハングを含み得るか；あるいは、オーバーハングは、少なくとも２つのヌクレオチド、少なくとも３つのヌクレオチド、少なくとも４つのヌクレオチド、少なくとも５つのヌクレオチドまたはそれ以上を含み得る。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシヌクレオチド／ヌクレオシドを含むヌクレオチド／ヌクレオシドアナログを含み得るか、またはそれらから成り得る。オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖またはそれらの任意の組み合わせであり得る。更に、オーバーハングのヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖またはセンス鎖のいずれかの５'末端、３'末端または両方の末端に存在し得る。

【0115】

ある実施態様において、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３'末端および／または５'末端に１～１０個のヌクレオチド、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のヌクレオチドのオーバーハングを有する。該センス鎖または該アンチセンス鎖、またはその両方上のオーバーハングは、１０より長いヌクレオチド、例えば１～３０個のヌクレオチド、２～３０個のヌクレオチド、１０～３０個のヌクレオチドまたは１０～１５個のヌクレオチドの長さを包含し得る。ある実施態様において、伸長したオーバーハングは、自己相補部分を包含し得る、即ち、該オーバーハングは、安定なヘアピン構造を形成できる、例えば少なくとも３つのヌクレオチドの二本鎖、または少なくとも４つのヌクレオチドの二本鎖を包含し得る。ある実施態様において、伸長したオーバーハングは、二本鎖のセンス鎖上に存在する。ある実施態様において、伸長したオーバーハングは、二本鎖のセンス鎖の３'末端上に存在する。ある実施態様において、伸長したオーバーハングは、二本鎖のセンス鎖の５'末端上に存在する。ある実施態様において、伸長したオーバーハングは、二本鎖のアンチセンス鎖上に存在する。ある実施態様において、伸長したオーバーハングは、二本鎖のアンチセンス鎖の３'末端上に存在する。ある実施態様において、伸長されたオーバーハングは、二本鎖のアンチセンス鎖の５'末端に存在する。ある実施態様において、オーバーハング中のヌクレオチドの１つまたは複数が、ヌクレオシドチオリン酸で置換される。ある実施態様において、オーバーハングは、該オーバーハングが、生理条件下において安定なヘアピン構造を形成できる自己相補部分を包含する。

【0116】

「平滑な」または「平滑末端」は、二本鎖ＲＮＡｉ剤の該当する末端に不対ヌクレオチドが存在しない、即ち、ヌクレオチドオーバーハングが存在しないことを意味する。「平滑末端」二本鎖ＲＮＡｉ剤は、その全長にわたって二本鎖である、即ち、分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングが存在しないｄｓＲＮＡである。本発明のＲＮＡｉ剤は、一方の末端にヌクレオチドオーバーハングが存在しないＲＮＡｉ剤(即ち、１つのオーバーハングおよび１つの平滑末端を有する剤)または両方の末端にヌクレオチドオーバーハングが存在しないＲＮＡｉ剤を含む。

【0117】

「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」という用語は、例えば、標的配列、例えば、ＫＨＫ ｍＲＮＡに実質的に相補的な領域を含むｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡの鎖を指す。本明細書において使用される際、「相補性領域」という用語は、本明細書において定義されるように、配列、例えば標的配列、例えば、ＫＨＫヌクレオチド配列に実質的に相補的なアンチセンス鎖の領域を指す。相補性領域が、標的配列と完全には相補的でない場合、その分子の内部領域または末端領域にミスマッチが存在し得る。一般に、ほとんどの許容されるミスマッチは、末端領域、例えば、ｉＲＮＡの５'末端および／または３'末端の５、４、３または２つのヌクレオチド中に存在する。ある実施態様において、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖中のヌクレオチドミスマッチを包含する。ある実施態様において、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、センス鎖中のヌクレオチドミスマッチを包含する。ある実施態様において、ヌクレオチドミスマッチは、例えば、ｉＲＮＡの３'末端から５、４、３、２または１つのヌクレオチド中に存在する。別の実施態様において、ヌクレオチドミスマッチは、例えば、ｉＲＮＡの３'末端に存在する。

【0118】

本明細書において使用される際の「センス鎖」または「パッセンジャー鎖」という用語は、その用語が本明細書において定義されるように、アンチセンス鎖の領域と実質的に相補的な領域を含むｉＲＮＡの鎖を指す。

【0119】

本明細書において使用される通り、「実質的に全てのヌクレオチドが修飾される」とは、広範囲であるが全てというわけではなく修飾されており、５、４、３、２または１以下の非修飾ヌクレオチドを包含することができる。

【0120】

本明細書において使用される通り、「切断領域」という用語は、切断部位に直接隣接して位置する領域を指す。切断部位とは、切断が生じる標的上の部位である。ある実施態様において、切断領域は、切断部位のいずれかの末端で、切断部位に直接隣接した３つの塩基を含む。ある実施態様において、切断領域は、切断部位のいずれかの末端で、切断部位に直接隣接した２つの塩基を含む。ある実施態様において、切断部位は、アンチセンス鎖のヌクレオチド１０および１１によって結合される部位で特異的に生じ、切断領域は、ヌクレオチド１１、１２および１３を含む。

【0121】

本明細書において使用される通り、別段の記載が無い限り、「相補的な」という用語は、当業者に理解されるように、第１のヌクレオチド配列を第２のヌクレオチド配列と関連して記載するのに使用される場合に、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、所定の条件下で、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズし、二本鎖構造を形成する能力を指す。このような条件は、例えば、ストリンジェントな条件であることも可能で、ストリンジェントな条件には、４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ(ｐＨ６.４)、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃または７０℃で１２～１６時間と、その後の洗浄を含み得る(例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照)。生物の内部で起こり得る生理学的に関連した条件などの他の条件を適用することができる。当業者は、ハイブリダイズされたヌクレオチドの最終的な用途に従って、２つの配列の相補性の試験に最も適切な条件の組を決定することができるであろう。

【0122】

本明細書に記載されるｉＲＮＡ中、例えば、ｄｓＲＮＡ中の相補的な配列は、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドへの第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの、一方または両方のヌクレオチド配列の全長にわたる塩基対合を含む。このような配列は、本明細書において互いに対して「完全に相補的な」と言うことができる。しかし、第１の配列が、本明細書において第２の配列に対して「実質的に相補的な」という場合、２つの配列は、完全に相補的であり得るか、またはそれらの最終的な用途に最適な条件下で、例えば、ＲＩＳＣ経路を介した遺伝子発現の阻害に最適な条件下でハイブリダイズする能力を保持しながら、最大で３０塩基対の二本鎖に対してハイブリダイゼーションを行うと、それらは、１つまたは複数であるが、一般に５つ以下、４つ以下、３つ以下または２つ以下のミスマッチ塩基対を形成し得る。しかし、２つのオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーション後に１つまたは複数の一本鎖オーバーハングを形成するように設計されている場合、このようなオーバーハングは、相補性の決定に関してはミスマッチとみなされないものとする。例えば、本明細書に記載する目的のために、２１ヌクレオチド長の一方のオリゴヌクレオチドと、２３ヌクレオチド長の他方のオリゴヌクレオチドとを含むｄｓＲＮＡは、長い方のオリゴヌクレオチドが、短い方のオリゴヌクレオチドに対して完全に相補的な２１ヌクレオチドの配列を含む場合、「完全に相補的」ということができる。

【0123】

本明細書において使用される際の「相補的な」配列は、それらのハイブリダイズする能力に関連する上記の要件が満たされる限り、非ワトソン－クリック塩基対および／または非天然および修飾ヌクレオチドから形成される塩基対を含むこともでき、またはこのような塩基対から完全に形成されることも可能である。このような非ワトソン－クリック塩基対としては、限定はされないが、Ｇ：Ｕゆらぎ型またはフーグスティーン型塩基対が挙げられる。

【0124】

本明細書における「相補的な」、「完全に相補的な」および「実質的に相補的な」という用語は、それらを使用する状況から理解されるように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との間で、または二本鎖ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖と標的配列との間で、塩基対合に関して使用され得る。

【0125】

本明細書において使用される通り、メッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)「の少なくとも一部に実質的に相補的な」ポリヌクレオチドは、目的のｍＲＮＡ(例えば、ＫＨＫをコードするｍＲＮＡ)の連続する部分に実質的に相補的なポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、その配列がＫＨＫ遺伝子をコードするｍＲＮＡの連続する部分と実質的に相補的である場合、ＫＨＫｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である。

【0126】

従って、ある実施態様において、本明細書に開示されたアンチセンスポリヌクレオチドは、標的ＫＨＫ配列と完全に相補的である。別の実施態様において、本明細書に開示されたアンチセンスポリヌクレオチドは、標的ＫＨＫ配列と実質的に相補的であって、配列番号：１、３、５、７、９および１１、好ましくは配列番号：１、３および５のいずれか一つのヌクレオチド配列の相当領域と、または配列番号：１、３、５、７、９および１１、好ましくは配列番号：１、３および５のいずれか一つのフラグメントと、その全長にわたって、少なくとも約８０％相補的、例えば少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％相補的または１００％相補的である連続するヌクレオチド配列を含んでいる。

【0127】

一実施態様において、本発明のＲＮＡｉ剤は、アンチセンスポリヌクレオチドに実質的に相補的であるセンス鎖を包含しており、そしてこれは、標的ＫＨＫ配列に相補的であって、かつ表３または表５のいずれか１つのセンス鎖ヌクレオチド配列と、あるいは表３または表５のいずれか１つのセンス鎖の断片と、その全長にわたって、少なくとも約８０％相補的、例えば約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％相補的または１００％相補的である連続するヌクレオチド配列を含んでいる。

【0128】

ある実施態様において、本発明のｉＲＮＡは、標的ＫＨＫ配列に実質的に相補的であるアンチセンス鎖を包含しており、表３または表５のアンチセンス鎖のいずれか一つのヌクレオチド配列の相当領域と、あるいは表３または表５のアンチセンス鎖のいずれか１つの断片と、全長にわたって、少なくとも約８０％相補的、例えば約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％相補的あるいは約１００％相補的である連続するヌクレオチド配列を含んでいる。

【0129】

一般に、各鎖のヌクレオチドの大部分は、リボヌクレオチドであるが、本明細書において詳細に記載されるように、各鎖または両方の鎖は、１つまたは複数の非リボヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドも含み得る。更に、「ｉＲＮＡ」は、化学修飾を有するリボヌクレオチドを含み得る。このような修飾は、本明細書に開示された、または当該技術分野において公知のあらゆるタイプの修飾を含み得る。ｄｓＲＮＡ分子に使用されるような、いずれのこのような修飾も、本明細書および特許請求の範囲の目的のために「ｉＲＮＡ」に包含される。

【0130】

本発明のある態様において、本発明の方法および組成物に使用するための薬剤は、アンチセンス阻害機構を介して標的ｍＲＮＡを阻害する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子である。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、標的ｍＲＮＡ中の配列に相補的である。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡに塩基対合し、翻訳メカニズムを物理的に妨害することによって、化学量論的に翻訳を阻害し得る(Dias, N.et al.,(2002) Mol Cancer Ther 1:347-355を参照)。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、約１４～約３０ヌクレオチド長であってもよく、また標的配列に相補的な配列を有し得る。例えば、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、本明細書に記載されるアンチセンス配列のいずれか１つからの少なくとも約１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれ以上の連続するヌクレオチドである配列を含み得る。

【0131】

本明細書において使用される際の「細胞をｉＲＮＡと接触させる」という句は、任意の可能な手段によって細胞を接触させる工程を含む。細胞をｉＲＮＡと接触させる工程は、細胞をｉＲＮＡと細胞をインビトロで接触させる工程または細胞をｉＲＮＡと細胞をインビボで接触させる工程を含む。接触は、直接または間接的に行われ得る。したがって、例えば、ｉＲＮＡは、その方法を個々に行うことによって細胞と物理的に接触されてもよく、あるいはｉＲＮＡは、それを後で細胞と接触させることが可能な状況に置いてもよい。

【0132】

細胞をインビトロで接触させる工程は、例えば、細胞をｉＲＮＡと共にインキュベートすることによって行われ得る。細胞をインビボで接触させる工程は、ｉＲＮＡが接触される細胞が存在する組織に接触後に到達するように、例えば、ｉＲＮＡを、細胞が存在する組織中または組織の近傍に注入することによって、またはｉＲＮＡを、別の領域、例えば、血流または皮下腔中に注入することによって行われ得る。例えば、ｉＲＮＡは、目的の部位、例えば、肝臓にｉＲＮＡを動員するリガンド、例えば、ＧａｌＮＡｃ３などのＧａｌＮＡｃを含むか、および／またはそれに結合されてもよい。インビトロおよびインビボでの接触方法を組み合わせることも可能である。例えば、細胞は、ｉＲＮＡとインビトロで接触された後に、対象に移植されてもよい。

【0133】

ある実施態様において、細胞をｉＲＮＡと接触させる工程は、細胞中への取り込みや吸収を、促進させるか、または行うことによって、「導入する」または「ｉＲＮＡを細胞中に送達する」工程を含む。ｉＲＮＡの吸収または取り込みは、自発拡散(unaided diffusive)または能動的な細胞プロセスによって、または補助的な薬剤またはデバイスによって行われ得る。細胞中へのｉＲＮＡの導入は、インビトロおよび／またはインビボであってもよい。例えば、インビボでの導入の場合、ｉＲＮＡは、組織部位に注入されるか、または全身投与され得る。インビボでの送達は、米国特許第５,０３２,４０１号明細書および同第５,６０７,６７７号明細書および米国特許出願公開第２００５／０２８１７８１号明細書に記載されるようなβ－グルカン送達系によって行うこともでき、これらの全ての内容は、参照により本明細書に援用される。細胞中へのインビトロでの導入は、エレクトロポレーションおよびリポフェクションなどの当該技術分野において公知の方法を含む。更なる手法が、本明細書において後述され、および／または当該技術分野において公知である。

【0134】

「脂質ナノ粒子」または「ＬＮＰ」という用語は、核酸分子(例えば、ｉＲＮＡまたはｉＲＮＡが転写されるプラスミド)などの薬学的に有効な分子を封入する脂質層を含むベシクルである。ＬＮＰは、米国特許第６,８５８,２２５号明細書、同第６,８１５,４３２号明細書、同第８,１５８,６０１号明細書および同第８,０５８,０６９号明細書に記載されており、例えば、全ての内容は参照により本明細書に援用される。

【0135】

本明細書において使用されるとおり、「対象」は、内因的または外因的に標的遺伝子を発現する、霊長類(ヒト、非ヒト霊長類、例えば、サルおよびチンパンジーなど)、非霊長類(ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、マウス、ウマおよびクジラなど)を含む哺乳動物または鳥類(例えば、アヒルまたはガチョウ)などの動物である。ある実施態様において、対象は、ヒト、例えば、本明細書に記載されるように、標的遺伝子を発現または複製の低下により利益を得るであろう疾患、障害または症状について治療または評価されるヒト；ＫＨＫ遺伝子発現の低下により利益を得るであろう疾患、障害または症状に対するリスクのあるヒト；ＫＨＫ遺伝子発現の低下により利益を得るであろう疾患、障害または症状を有するヒト；または、ＫＨＫ遺伝子発現の低下により利益を得る疾患、障害または症状について治療されるヒトである。ある実施態様において、対象はヒトの女性である。別の実施態様においては、対象はヒトの男性である。

【0136】

本明細書において使用されるとおり、「治療する」または「治療」という用語は、有益な結果または所望の結果、例えば、ＫＨＫ遺伝子発現またはＫＨＫタンパク質産生、特に高いＫＨＫ遺伝子発現または高いＫＨＫタンパク質産生に関連する１つ以上の症候または症状の緩和または改善などを含むが、これらに限定するものではない。「治療」とは、治療しない場合に予測される生存期間と比較して、生存期間を延長させることも意味し得る。

【0137】

対象における、ＫＨＫ遺伝子発現またはＫＨＫタンパク質産生のレベル、または疾患マーカーまたは症状に関する文脈上での「低下」という用語は、このようなレベルの統計的に有意な低下を指す。低下とは、例えば、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％、または検出方法の検出レベル以下であり得る。ある実施態様において、標的の発現が、標準化される、即ち、前記障害がない個人に対して正常範囲内であると認められるレベルに、例えば、体重、血圧または血清脂質レベルの正常範囲内まで低下される。本明細書で使用されるように、対象における「低下」とは、対象の細胞における遺伝子発現またはタンパク質産生の低下を指すことができるが、対象の全ての細胞または組織における発現を低下させることが必要なわけではない。例えば、本明細書で使用されるように、対象における低下とは、対象における肝臓中の遺伝子発現またはタンパク質産生の低下を含むことができる。

【0138】

用語「低下」は、疾患または症状の症候を正常化させることに関連して使用することも可能であって、即ち、ＫＨＫ関連疾患に罹患している対象における範囲を、ＫＨＫ関連疾患に罹患していない正常対象における範囲へ、またはＫＨＫ関連疾患に罹患していない対象における正常範囲まで、その範囲の差を低下させることを含む。例えば、正常体重が７０ｋｇの対象者の体重が、治療前に９０ｋｇ(２０ｋｇの体重過剰)であり、治療後に８０ｋｇ(１０ｋｇの体重過剰)であった場合、その対象の体重は、正常体重に対して５０％(１０／２０×１００％)低下している。同様に、女性のＨＤＬレベルが、５０ｍｇ／ｄＬ(低い)から５７ｍｇ／ｄＬに上昇し、正常レベルが６０ｍｇ／ｄＬである場合、対象者の治療前のレベルと正常レベルとの差が、７０％低下している(対象者レベルと正常レベルとの差１０ｍｇ／ｄＬが、７ｍｇ／ｄＬまで低下している、７／１０×１００％)。本明細書で使用されるように、疾患が、症状として高い値に関連している場合、「正常」とは、正常の上限値とみなされる。疾患が、症状に対して低い値と関連している場合、「正常」とは、正常の下限値であると考えられる。

【0139】

本明細書で使用されるように、「予防」または「予防すること」は、ＫＨＫ遺伝子の発現またはＫＨＫタンパク質の産生の低下により利益を得る疾患、障害または症状に対して使用される場合、対象者が、前記疾患、障害または症状に関連する症状、例えばＫＨＫ遺伝子発現、ＫＨＫ活性または高いフルクトース代謝に関する症候または症状を発症する可能性の低下を意味する。メカニズムに限定されることなく、ＫＨＫにより触媒されるフルクトースのリン酸化は、フルクトース-１-リン酸を形成させて、ＡＴＰおよび細胞内リン酸の枯渇、ＡＭＰレベルの増加に至るフィードバック阻害によって制御されず、尿酸産生をもたらすことが知られている。さらに、フルクトース－１－リン酸は、グリセルアルデヒドに代謝されて、アセチルＣｏ－Ａ刺激脂肪酸合成の産生を増加させるクエン酸サイクルへに供給される。高い尿酸および脂肪酸の合成に関連がある疾患および症状は、例えば、肝臓疾患(例えば、脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎(ＮＡＳＨ)を含む脂肪性肝炎)、脂質異常症(例えば、高脂血症、高ＬＤＬコレステロール、低ＨＤＬコレステロール、高トリグリセリド血症、食後高トリグリセリド血症)、血糖コントロールの障害(例えば、インスリンに対する免疫応答に関連しないインスリン耐性、ＩＩ型糖尿病)、心血管疾患(例えば、高血圧、内皮細胞機能障害)、腎臓病(例えば、急性腎障害、尿細管機能障害、近位尿細管の炎症性変化、慢性腎臓病)、メタボリックシンドローム、脂質沈着または機能障害の疾患(例えば、脂肪細胞機能障害、内臓脂肪沈着、肥満)、高い尿酸の疾患(例えば、高尿酸血症、痛風)および過剰な糖への渇望などの摂食障害である。疾患、障害または症状を発症しないこと、またはこのような疾患、障害または症状に関連した症状または併存疾患の発症を低下させること(例えば、疾患または障害について臨床的に認められた尺度で少なくとも約１０％まで)、または症候または症状または疾患進行の出現を数日、数週間、数ヶ月または数年まで遅延することは、有効な予防であるとみなされる。

【0140】

本明細書において使用されるとおり、「ケトヘキソキナーゼに関連する疾病」または「ＫＨＫ関連疾患」という用語は、ＫＨＫ遺伝子発現またはＫＨＫタンパク質産生によって引き起こされるか、またはそれに関連がある疾患または障害である。用語「ＫＨＫ関連疾患」には、ＫＨＫ遺伝子発現、複製またはタンパク質活性の低下により利益がある疾患、障害または症状を包含する。ＫＨＫ関連疾患の非制限的な例には、例えば、肝臓疾患(例えば、脂肪肝、脂肪性肝炎、例えば非アルコール性肝炎(ＮＡＳＨ))、脂質異常症(例えば、高脂血症、高ＬＤＬコレステロール、低ＬＤＬコレステロール、高トリグリセリド血症、食後高トリグリセリド血症)、血糖コントロールの障害(例えば、インスリンに対する免疫応答に関連しないインスリン耐性、ＩＩ型糖尿病)、心血管疾患(例えば、高血圧症、内皮細胞機能障害)、腎臓疾患(例えば、急性腎障害、尿細管機能障害、近位尿細管の炎症性変化、慢性腎臓病)、メタボリックシンドローム、脂質沈着または機能障害の疾患(例えば、脂肪細胞機能障害、内臓脂肪沈着、肥満など)、尿酸上昇の疾患(高尿酸血症、痛風など)および過剰な糖への渇望などの摂食障害が挙げられる。様々な疾患または症状の症候および症候に関するさらなる詳細は、本明細書に提供され、また当分野において周知である。

【0141】

ある実施態様において、ＫＨＫ関連疾患は、高い尿酸(例えば、高尿酸血症、痛風)と関連している。

【0142】

ある実施態様において、ＫＨＫ関連疾患は、高い脂質レベル(例えば、脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎(ＮＡＳＨ)を含む脂肪性肝炎、脂質異常症)と関連している。

【0143】

本明細書において使用される「治療有効量」とは、ＫＨＫ関連疾患に罹患している対象に投与される場合、この疾患の治療を行うのに(例えば、存在している疾患あるいは疾患またはその関連する併存症の１以上の症状を、低下、緩和または維持することによって)、十分なｉＲＮＡの量を含むことが意図される。「治療有効量」とは、ｉＲＮＡが投与される方法、疾病およびその重症度、ならびに治療される対象の病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構成、ＫＨＫ遺伝子発現により媒介される病態形成過程の段階、存在するならば、従前治療または併用治療のタイプおよび他の個体特性に応じて変化し得る。

【0144】

本明細書において使用される「予防的に有効な量」とは、ＫＨＫ関連疾患の症状をまだ(または、現在のところ)発症していないか、または示していないが、ＫＨＫ関連疾患に罹患する傾向を有する対象に投与される場合、この疾患または疾患の１つまたは複数の症状の発症または進行を予防または遅延させるのに十分なｉＲＮＡの量を含むことが意図される。「予防的に有効な量」とは、ｉＲＮＡが投与される方法、疾患に罹患する危険度、ならびに治療される患者の病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構成、存在するならば、従前の治療または併用治療のタイプ、および他の個体特性に応じて変化し得る。

【0145】

「治療有効量」または「予防的に有効な量」とは、任意の治療に適用される妥当なベネフィット／リスク比である所望の局所または全身的作用をもたらすｉＲＮＡの量も含む。本発明の方法に用いられるｉＲＮＡは、このような治療に適用される妥当なベネフィット/リスク比を得るのに十分な量で投与され得る。

【0146】

「薬学的に許容され得る」という語句は、妥当な医学的判断の範囲内で、妥当なベネフィット／リスク比に見合って、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、あるいは他の問題または合併症を伴わずに、ヒト対象および動物対象の組織と接触して使用するのに好適な化合物、材料、組成物または剤形を指すために本明細書において用いられる。

【0147】

本明細書において使用される「薬学的に許容され得る担体」という語句は、身体の１つの器官、または部分から、身体の別の器官、または部分へと対象に化合物を運搬または輸送するのに関与する薬学的に許容され得る材料、組成物またはビヒクル、例えば、液体または固体充填剤、希釈剤、賦形剤、製造助剤(例えば、潤滑剤、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムまたはステアリン酸亜鉛またはステアリン酸)、または溶媒封入材料などを意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合し、治療される対象に有害でないという意味で「許容でき」なければならない。薬学的に許容され得る担体としての機能し得る材料のいくつかの例としては：(１)ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖類；(２)トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；(３)ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロース、およびその誘導体；(４)トラガカント粉末；(５)麦芽；(６)ゼラチン；(７)ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルクなどの滑沢剤；(８)カカオ脂および坐薬用ワックスなどの賦形剤；(９)ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油などの油；(１０)プロピレングリコールなどのグリコール；(１１)グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール；(１２)オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；(１３)寒天；(１４)水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；(１５)アルギン酸；(１６)発熱性物質除去蒸留水；(１７)等張食塩水；(１８)リンゲル液；(１９)エチルアルコール；(２０)ｐＨ緩衝液；(２１)ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ無水物；(２２)ポリペプチドおよびアミノ酸などの増量剤；(２３)血清アルブミン、ＨＤＬおよびＬＤＬなどの血清成分；ならびに(２２)医薬製剤に用いられる他の非毒性の適合する物質が挙げられる。

【0148】

本明細書において使用される「試料」という用語は、対象から単離された類似の体液、細胞または組織、ならびに対象中に存在する体液、細胞または組織の集合体を含む。生体体液の例としては、血液、血清および漿液、血漿、脳脊髄液、眼液、リンパ液、尿、唾液などが挙げられる。組織試料は、組織、器官または局所領域から得た試料を含み得る。例えば、試料は、特定の器官、器官の部分またはそれらの器官中の体液または細胞から得られ得る。ある実施態様において、試料は、肝臓(例えば、全肝臓または肝臓の特定の部分、または肝臓中の細胞の特定のタイプ、例えば肝細胞など)から得られてもよい。ある実施態様において、「対象から得られる試料」は、対象から得られた尿を指す。ある実施態様において、「対象から得られる試料」は、対象から得られた血液(血漿または血清に容易に変換され得る)を指す。

【0149】

ＩＩ．本発明のｉＲＮＡ
本発明は、ＫＨＫ遺伝子の発現を阻害するｉＲＮＡを提供する。好ましい実施態様において、ｉＲＮＡは、ＫＨＫ関連疾患に罹患し易い対象内の細胞、例えば、ヒトなどの哺乳動物内の細胞などにおいてＫＨＫ遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(ｄｓＲＮＡ)分子を含む。ｄｓＲＮＡｉ剤は、ＫＨＫ遺伝子の発現中に形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部に対して相補的である相補性領域を有するアンチセンス鎖を含む。相補性領域は、約３０ヌクレオチド長以下(例えば、約３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９または１８ヌクレオチド長以下)である。ＫＨＫ遺伝子を発現する細胞と接触すると、ｉＲＮＡは、例えば、ＰＣＲまたは分岐鎖ＤＮＡ(ｂＤＮＡ)に基づく方法、あるいはタンパク質に基づく方法(例えば、ウエスタンブロット法またはフローサイトメトリー技術を用いた免疫蛍光分析などによる)によりアッセイした際に、少なくとも約２０％、ＫＨＫ遺伝子(例えば、ヒト、霊長類、非霊長類または鳥類のＫＨＫ遺伝子)の発現を阻害する。好ましい実施態様において、発現の阻害は、実施例２に示されるｑＰＣＲ法、好ましくは適切な種にマッチした細胞株におけるｉＲＮＡの１０ｎＭの濃度で、本明細書において示される方法で細胞株に送達することにより決定される。

【0150】

ｄｓＲＮＡは、２本のＲＮＡ鎖を含んでおり、この２本のＲＮＡ鎖は、相補的であり、ｄｓＲＮＡが使用される条件下で二本鎖構造を形成するようにハイブリダイズする。ｄｓＲＮＡの１本の鎖(アンチセンス鎖)は、標的配列に対して実質的に相補的、一般には完全に相補的な相補性領域を含む。標的配列は、ＫＨＫ遺伝子の発現中に形成されるｍＲＮＡの配列から得られる得る。他方の鎖(センス鎖)は、アンチセンス鎖と相補的な領域を含んでおり、そのため２本の鎖がハイブリダイズして、好適な条件下で組み合わされた際に二本鎖構造を形成する。本明細書のいずれかの箇所に記載されるとおり、また当該技術分野において公知のとおり、ｄｓＲＮＡの相補的配列は、別々のオリゴヌクレオチド上にあるのではなく、１つの核酸分子の自己相補性領域として含まれることも可能である。

【0151】

一般に、二本鎖構造は、１５～３０個の塩基対の長さ、例えば、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３または２１～２２塩基対の長さである。上記範囲および長さの中間の範囲および長さも、本発明の一部であると考えられる。

【0152】

同様に、標的配列の相補性領域は、１５～３０個のヌクレオチド長、例えば、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３または２１～２２ヌクレオチド長である。上記範囲および長さの中間の範囲および長さも、本発明の一部であると考えられる。

【0153】

ある実施態様において、ｄｓＲＮＡは、約１５～約２３個のヌクレオチド長、または約２５～約３０個のヌクレオチド長である。一般に、ｄｓＲＮＡは、ダイサー酵素のための基質としての役割を果たすのに十分に長い。例えば、約２１～２３個のヌクレオチド長より長いｄｓＲＮＡがダイサーのための基質としての役割を果たし得ることは当該技術分野において周知である。当業者も認識するであろうが、切断のために標的化されたＲＮＡの領域は、殆どの場合、より大きいＲＮＡ分子(ｍＲＮＡ分子であることが多い)の一部である。関連する場合、ｍＲＮＡ標的の「一部」は、ＲＮＡｉ特異的切断(即ち、ＲＩＳＣ経路を介した切断)のための基質として存在できるほど十分な長さのｍＲＮＡ標的の連続する配列である。

【0154】

二本鎖領域が、ｄｓＲＮＡの一次機能部分、例えば、約９～約３６塩基対、例えば、約１０～３６、１１～３６、１２～３６、１３～３６、１４～３６、１５～３６、９～３５、１０～３５、１１～３５、１２～３５、１３～３５、１４～３５、１５～３５、９～３４、１０～３４、１１～３４、１２～３４、１３～３４、１４～３４、１５～３４、９～３３、１０～３３、１１～３３、１２～３３、１３～３３、１４～３３、１５～３３、９～３２、１０～３２、１１～３２、１２～３２、１３～３２、１４～３２、１５～３２、９～３１、１０～３１、１１～３１、１２～３１、１３～３２、１４～３１、１５～３１、１５～３０、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３または２１～２２塩基対であることも当業者は認識するであろう。そのため、一実施態様において、所望のＲＮＡを切断のために標的とする機能性二本鎖、例えば１５～３０塩基対にプロセシングされる程度まで、３０塩基対を超える二本鎖領域を有するＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子複合体は、ｄｓＲＮＡである。したがって、当業者は、一実施態様において、ｍｉＲＮＡがｄｓＲＮＡであることを認識するであろう。別の実施態様において、ｄｓＲＮＡは、天然ｍｉＲＮＡではない。別の実施態様において、ＫＨＫの発現を標的とするのに有用なｉＲＮＡ剤は、より大きいｄｓＲＮＡの切断によって標的細胞中で生成されない。

【0155】

本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、１つまたは複数の一本鎖ヌクレオチドオーバーハング、例えば、１～４、２～４、１～３、２～３、１、２、３または４つのヌクレオチドを更に含み得る。少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、その平滑末端の同等物と比べて優れた阻害特性を有し得る。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシヌクレオチド／ヌクレオシドを含むヌクレオチド／ヌクレオシドアナログを含むか、またはそれらから構成され得る。オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖またはそれらの任意の組み合わせ上にあり得る。更に、オーバーハングのヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖またはセンス鎖の５'末端、３'末端または両方の末端上に存在し得る。

【0156】

ある実施態様において、センス鎖またはアンチセンス鎖、またはその両方の鎖上のオーバーハングは、１０個のヌクレオチドよりも伸長した長さ、例えば、１０～３０個のヌクレオチド、１０～２５個のヌクレオチド、１０～２０個のヌクレオチドまたは１０～１５個のヌクレオチドよりも伸長した長さを含むことができる。ある実施態様において、伸長されたオーバーハングは、二本鎖のセンス鎖上に存在する。特定の実施態様において、伸長されたオーバーハングは、二本鎖のセンス鎖の３'末端上に存在する。ある実施態様において、伸長されたオーバーハングは、二本鎖のセンス鎖の５'末端に存在する。ある実施態様において、伸長されたオーバーハングは、二本鎖のアンチセンス鎖上に存在する。ある実施態様において、伸長されたオーバーハングは、二本鎖のアンチセンス鎖の３'末端上に存在する。ある実施態様において、伸長されたオーバーハングは、二本鎖のアンチセンス鎖の５'末端上に存在する。ある実施態様において、伸長されたオーバーハング中のヌクレオチドのうちの１つ以上は、ヌクレオシドチオリン酸で置換されている。

【0157】

ｄｓＲＮＡは、例えば、自動ＤＮＡ合成装置(例えば、Biosearch, Applied Biosystems，Inc.から市販されているものなど)を使用して、更に説明されるが当該技術分野において公知の標準方法によって合成され得る。

【0158】

本発明の二本鎖ＲＮＡｉ化合物は、２工程の手順を用いて製造され得る。まず、二本鎖ＲＮＡ分子の個々の鎖が別々に製造される。次に、構成要素の鎖がアニーリングされる。ｓｉＲＮＡ化合物の個々の鎖は、溶液相または固相有機合成または両方を用いて調製され得る。有機合成は、非天然または修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖が容易に調製され得るという利点を提供する。同様に、本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、溶液相または固相有機合成または両方を用いて製造され得る。

【0159】

一態様において、本発明のｄｓＲＮＡは、少なくとも２つのヌクレオチド配列、センス配列およびアンチセンス配列を含む。センス鎖は、表３および５に示される配列の群から選択され、センス鎖の対応するアンチセンス鎖は、表３および５に示される配列の群から選択される。この態様において、２つの配列の一方が２つの配列の他方に相補的であり、配列の一方が、ＫＨＫ遺伝子の発現中に生成されるｍＲＮＡの配列に実質的に相補的である。したがって、この態様では、ｄｓＲＮＡは、２つのオリゴヌクレオチドを含むことになり、ここで１つのオリゴヌクレオチドが、表３または５のセンス鎖として表され、第２のオリゴヌクレオチドが、表３または５のセンス鎖の対応するアンチセンス鎖として表される。ある実施態様において、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は、別個のオリゴヌクレオチドに含まれる。別の実施態様において、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は、１つのオリゴヌクレオチドに含まれる。

【0160】

表３の配列は、修飾配列または結合配列として記載されていないが、本発明のｉＲＮＡのＲＮＡ、例えば本発明のｄｓＲＮＡが、修飾またはコンジュゲートされた表３に記載された配列、または修飾またはコンジュゲートされていない表５に記載された配列のいずれか１つを含んでもよいことは理解されるであろう。言い換えれば、本発明は、本明細書に記載されているような、修飾されていない、コンジュゲートされていない、修飾および／または結合された表３および表５に記載のｄｓＲＮＡを含む。

【0161】

当業者は、約２０～２３個の塩基対、例えば、２１個の塩基対の二本鎖構造を有するｄｓＲＮＡが、ＲＮＡ干渉を誘導するのに特に有効であることが認められたことを十分に認識している(Elbashir et al., EMBO 2001, 20:6877-6888)。しかし、他の当業者が、より短いか、またはより長いＲＮＡ二本鎖構造も有効であり得ることを見出した(Chu and Rana (2007) RNA 14:1714-1719；Kim et al. (2005) Nat Biotech 23:222-226)。上記の実施態様において、表３および５の１つに示されるオリゴヌクレオチド配列の性質によって、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、最小で２１ヌクレオチド長の少なくとも１本の鎖を含み得る。一端または両端におけるごくわずかな数のヌクレオチドを差し引いた表３および５の配列のうちの１つを有するより短い二本鎖が、上記のｄｓＲＮＡと比較して、同様に有効であり得ることが当然予測され得る。従って、表３および５に示される配列のうちの１つから得られる、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の連続するヌクレオチド配列を有するｄｓＲＮＡであって、ＫＨＫ遺伝子の発現を阻害する能力が、完全な配列を含むｄｓＲＮＡと、約５、１０、１５、２０、２５または３０％以下の阻害％が異なるｄｓＲＮＡが、本発明の範囲内にあるものと考えられる。

【0162】

さらに、表３および５に示されるＲＮＡは、ＲＩＳＣを介した切断を受けやすいＫＨＫ転写物中の部位を特定する。したがって、本発明は、これらの部位のうちの１つ以内を標的とするｉＲＮＡを更に取り上げる。本明細書に使用されるとおり、ｉＲＮＡが、その特定の部位内のいずれかの箇所で転写物の切断を促す場合、ｉＲＮＡは、ＲＮＡ転写物の特定の部位内を標的とするといえる。このようなｉＲＮＡは、一般に、ＫＨＫ遺伝子中の選択された配列に隣接する領域から得られた更なるヌクレオチド配列に結合された、表３および５に示される配列のうちの１つからの少なくとも約１５個の連続するヌクレオチドを含むであろう。

【0163】

標的配列は、一般に、約１５～３０個のヌクレオチド長であるが、任意の所与の標的ＲＮＡの切断を導くために、この範囲内の特定の配列の適合性は様々である。本明細書に記載される様々なソフトウェアパッケージおよび指針は、任意の所与の遺伝子標的に対して最適な標的配列を同定するための指針を提供するが、所与のサイズ(非限定的な例として、２１ヌクレオチド)の「ウインドウ」または「マスク」を、標的ＲＮＡ配列上に文字通りまたは比喩的に(例えば、インシリコを含む)配置して、標的配列としての役割を果たし得るサイズ範囲内に入る配列を同定するという経験的手法を取ることもできる。可能性のある配列の完全なセットが、選択された任意の所与の標的サイズについて同定されるまで、最初の標的配列位置の１つのヌクレオチドの上流または下流へと徐々に配列「ウインドウ」を移動させることによって、次の可能性のある標的配列を同定することができる。このプロセスは、最適に機能する配列を同定するために(本明細書に記載されるかまたは当該技術分野において公知のアッセイを用いて)同定した配列の系統的合成および試験とともに、ｉＲＮＡ剤を用いて標的化されるときに、標的遺伝子の発現の最良の阻害を仲介するＲＮＡ配列を同定することができる。したがって、同定された配列、例えば、表３および５における同定された配列が、有効な標的配列を表すが、同等またはより良好な阻害特性を有する配列を同定するために、所与の配列の１つのヌクレオチド上流または下流へと徐々に「ウインドウを移動させる」ことによって、阻害効率の更なる最適化が達成され得ると考えられる。

【0164】

さらに、例えば、表３および５において同定された任意の配列について、より長い配列またはより短い配列を生成するためにヌクレオチドを系統的に追加または除去し、より長いまたは短いサイズのウインドウをその位置から標的ＲＮＡの上方または下方に移動させることによって生成される配列を試験することによって、更なる最適化が達成され得ると考えられる。また、当該技術分野において公知のおよび／または本明細書に記載される阻害アッセイにおいて、新規な候補標的を生成するためのこの手法を、それらの標的配列に基づいたｉＲＮＡの有効性の試験と結び付けることで、阻害の効率が更に向上され得る。更にまた、このような最適化された配列は、例えば、本明細書に記載されるかまたは当該技術分野において公知の修飾ヌクレオチドの導入、オーバーハングの追加または変更、あるいは発現阻害因子として分子を更に最適化するための当該技術分野において公知のおよび／または本明細書に説明される別の修飾(例えば、血清安定性または循環半減期の増加、熱安定性の増加、膜透過送達の向上、特定の位置または細胞型への標的化、サイレンシング経路酵素との相互作用の増加、エンドソームからの放出の増加)によって調整され得る。

【0165】

本明細書に記載されるｉＲＮＡは、標的配列との１つまたは複数のミスマッチを含み得る。一実施態様において、本明細書に記載されるｉＲＮＡは、３つ以下のミスマッチを含む。ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、標的配列とのミスマッチを含む場合、ミスマッチの領域が相補性領域の中心に位置しないのが好ましい。ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列とのミスマッチを含む場合、ミスマッチは、相補性領域の５'末端または３'末端のいずれかからの最後の５つのヌクレオチド内に存在が制限されているのが好ましい。例えば、２３個のヌクレオチドのｉＲＮＡ剤について、ＫＨＫ遺伝子の領域に相補的な鎖は、一般に、中央の１３個のヌクレオチド内にミスマッチを全く含まない。本明細書に記載される方法または当該技術分野において公知の方法を用いて、標的配列とのミスマッチを含むｉＲＮＡがＫＨＫ遺伝子の発現を阻害するのに有効であるかどうかを決定することができる。ＫＨＫ遺伝子の発現を阻害する際のミスマッチを有するｉＲＮＡの有効性を考慮することは、特に、ＫＨＫ遺伝子における特定の相補性領域が集団内に多型配列変異を有することが分かっている場合に重要である。

【0166】

ＩＩ．本発明の修飾ｉＲＮＡ
ある実施態様において、本発明のｉＲＮＡのＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡは、修飾されておらず、例えば、当該技術分野において公知のおよび本明細書に記載される化学修飾および／またはコンジュゲートを含まない。別の実施態様において、本発明のｉＲＮＡのＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡは、安定性または他の有益な特性を向上させるために化学的に修飾されている。本発明のある実施態様において、本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの実質的に全てが修飾される。本発明の別の実施態様において、ｉＲＮＡのヌクレオチドの全てが修飾されるか、またはｉＲＮＡのヌクレオチドの実質的に全てが修飾される、即ち５つ以下、４つ以下、３つ以下、２つ以下または１つ以下の非修飾ヌクレオチドが、ｉＲＮＡの鎖内に存在している。

【0167】

本発明に関する核酸は、参照により本明細書に援用される"Current protocols in nucleic acid chemistry," Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USAに記載されるものなどの当該技術分野において十分に確立された方法によって合成または修飾され得る。修飾としては、例えば、末端修飾、例えば、５'末端修飾(リン酸化、コンジュゲート、逆結合)または３'末端修飾(コンジュゲート、ＤＮＡヌクレオチド、逆結合など)；塩基修飾、例えば、安定塩基、不安定塩基または広範なパートナーと塩基対合する塩基による置換、塩基の除去(非塩基性ヌクレオチド)またはコンジュゲート塩基；糖修飾(例えば、２'位または４'位で)または糖の置換；または骨格修飾、例えば、ホスホジエステル結合の修飾または置換などが挙げられる。本明細書に記載される実施態様に有用なｉＲＮＡ化合物の具体例としては、限定はされないが、修飾された骨格を含むＲＮＡまたは天然のヌクレオシド間結合を含まないＲＮＡが挙げられる。修飾された骨格を有するＲＮＡとしては、特に、骨格中にリン原子を有さないものが挙げられる。本明細書の目的のために、また当該技術分野において時折言及されるように、ヌクレオシド間骨格中にリン原子を含まない修飾ＲＮＡは、オリゴヌクレオシドであるとみなすことも可能である。ある実施態様において、修飾ｉＲＮＡは、そのヌクレオシド間骨格中にリン原子を有する。

【0168】

修飾ＲＮＡ骨格としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネートおよび他のアルキルホスホネート(例えば、３'－アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネート)、ホスフィネート、ホスホロアミデート(例えば、３'－アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデート)、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、通常の３'－５'結合を有するボラノホスフェート、これらの２'－５'結合アナログならびにヌクレオシド単位の隣接する対が３'－５'～５'－３'または２'－５'～５'－２'に結合している反転極性を有するものが挙げられる。様々な塩、混合塩および遊離酸形態も含まれる。

【0169】

上記のリン含有結合の製造を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、米国特許第３,６８７,８０８号明細書；同第４,４６９,８６３号明細書；同第４,４７６,３０１号明細書；同第５,０２３,２４３号明細書；同第５,１７７,１９５号明細書；同第５,１８８,８９７号明細書；同第５,２６４,４２３号明細書；同第５,２７６,０１９号明細書；同第５,２７８,３０２号明細書；同第５,２８６,７１７号明細書；同第５,３２１,１３１号明細書；同第５,３９９,６７６号明細書；同第５,４０５,９３９号明細書；同第５,４５３,４９６号明細書；同第５,４５５,２３３号明細書；同第５,４６６,６７７号明細書；同第５,４７６,９２５号明細書；同第５,５１９,１２６号明細書；同第５,５３６,８２１号明細書；同第５,５４１,３１６号明細書；同第５,５５０,１１１号明細書；同第５,５６３,２５３号明細書；同第５,５７１,７９９号明細書；同第５,５８７,３６１号明細書；同第５,６２５,０５０号明細書；同第６,０２８,１８８号明細書；同第６,１２４,４４５号明細書；同第６,１６０,１０９号明細書；同第６,１６９,１７０号明細書；同第６,１７２,２０９号明細書；同第６,２３９,２６５号明細書；同第６,２７７,６０３号明細書；同第６,３２６,１９９号明細書；同第６,３４６,６１４号明細書；同第６,４４４,４２３号明細書；同第６,５３１,５９０号明細書；同第６,５３４,６３９号明細書；同第６,６０８,０３５号明細書；同第６,６８３,１６７号明細書；同第６,８５８,７１５号明細書；同第６,８６７,２９４号明細書；同第６,８７８,８０５号明細書；同第７,０１５,３１５号明細書；同第７,０４１,８１６号明細書；同第７,２７３,９３３号明細書；同第７,３２１,０２９号明細書；および米国再発行特許第ＲＥ３９４６４号明細書が挙げられ、これら各々の全ての内容が、援用により本明細書に組み込まれる。

【0170】

内部にリン原子を含まない修飾ＲＮＡ骨格は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つまたは複数の短鎖ヘテロ原子または複素環式ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらとしては、モルホリノ結合(一部がヌクレオシドの糖部分から形成された)を有するもの；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびに混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ_２構成要素部分を有する他のものが挙げられる。

【0171】

上記のオリゴヌクレオシドの製造を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、米国特許第５,０３４,５０６号明細書；同第５,１６６,３１５号明細書；同第５,１８５,４４４号明細書；同第５,２１４,１３４号明細書；同第５,２１６,１４１号明細書；同第５,２３５,０３３号明細書；同第５,６４,５６２号明細書；同第５,２６４,５６４号明細書；同第５,４０５,９３８号明細書；同第５,４３４,２５７号明細書；同第５,４６６,６７７号明細書；同第５,４７０,９６７号明細書；同第５,４８９,６７７号明細書；同第５,５４１,３０７号明細書；同第５,５６１,２２５号明細書；同第５,５９６,０８６号明細書；同第５,６０２,２４０号明細書；同第５,６０８,０４６号明細書；同第５,６１０,２８９号明細書；同第５,６１８,７０４号明細書；同第５,６２３,０７０号明細書；同第５,６６３,３１２号明細書；同第５,６３３,３６０号明細書；５,６７７,４３７号明細書；および同第５,６７７,４３９号明細書が挙げられ、これら各々の全ての内容が、援用により本明細書に組み込まれる。

【0172】

適切なＲＮＡ模倣体が、ｉＲＮＡにおける使用のために考えられ、ここで糖およびヌクレオシド間結合の両方、即ち、ヌクレオチド単位の骨格が、新規な基で置換される。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されている、このようなオリゴマー化合物の１つであるＲＮＡ模倣体は、ペプチド核酸(ＰＮＡ)と呼ばれる。ＰＮＡ化合物において、ＲＮＡの糖骨格が、アミド含有骨格、特に、アミノエチルグリシン骨格で置換される。核酸塩基は、保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合される。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、米国特許第５,５３９,０８２；同第５,７１４,３３１号明細書；および同第５,７１９,２６２号明細書が挙げられ、これら各々の全ての内容が、援用により本明細書に組み込まれる。本発明のｉＲＮＡに使用するのに好適な更なるＰＮＡ化合物は、例えば、Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500に記載されている。

【0173】

本発明に取り上げられるある実施態様は、ホスホロチオエート骨格を有するＲＮＡおよびヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオシドを含み、特に、上記米国特許第５,４８９,６７７号明細書に関する－－ＣＨ_２－－ＮＨ－－ＣＨ_２－、－－ＣＨ_２－－Ｎ(ＣＨ_３)－－Ｏ－－ＣＨ_２－－［メチレン(メチルイミノ)またはＭＭＩ骨格として知られている］、－－ＣＨ_２－－Ｏ－－Ｎ(ＣＨ_３)－－ＣＨ_２－－、－－ＣＨ_２－－Ｎ(ＣＨ_３)－－Ｎ(ＣＨ_３)－－ＣＨ_２－－および－－Ｎ(ＣＨ_３)－－ＣＨ_２－－ＣＨ_２－－［式中、天然のホスホジエステル骨格は、－－Ｏ－－Ｐ－－Ｏ－－ＣＨ_２－－として表される］、上記米国特許第５,６０２,２４０号明細書のアミド骨格を含む。ある実施態様において、本明細書に取り上げられるＲＮＡは、上記米国特許第５,０３４,５０６号明細書のモルホリノ骨格構造を有する。

【0174】

修飾ＲＮＡは、１つまたは複数の置換された糖部分も含有し得る。本明細書に取り上げられるｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡは、２'位において、ＯＨ；Ｆ；Ｏ－、Ｓ－またはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－またはＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－またはＮ－アルキニル；またはＯ－アルキル－Ｏ－アルキルのうちの１つを含むことができ、ここで該アルキル、該アルケニルおよび該アルキニルは、置換または非置換のＣ_１～Ｃ_１０アルキルまたはＣ_２～Ｃ_１０アルケニルおよびアルキニルであり得る。適切な修飾の例は、Ｏ[(ＣＨ_２)_ｎＯ]_ｍＣＨ_３、Ｏ(ＣＨ_２)_ｎＯＣＨ_３、Ｏ(ＣＨ_２)_ｎＮＨ_２、Ｏ(ＣＨ_２)_ｎＣＨ_３、Ｏ(ＣＨ_２)_ｎＯＮＨ_２およびＯ(ＣＨ_２)_ｎＯＮ［(ＣＨ_２)_ｎＣＨ_３)］_２を含んでおり、式中、ｎおよびｍが、１～約１０である。別の実施態様において、ｄｓＲＮＡは、２'位において、Ｃ_１～Ｃ_１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ－アルカリルまたはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ_３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、ＳＯＣＨ_３、ＳＯ_２ＣＨ_３、ＯＮＯ_２、ＮＯ_２、Ｎ_３、ＮＨ_２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、挿入基、ｉＲＮＡの薬力学的特性を改善する基またはｉＲＮＡの薬物動態特性を向上させる基、および同様の特性を有する別の置換基のうちの１つを含む。ある実施態様において、修飾は、２'－メトキシエトキシ(２'－Ｏ－(２－メトキシエチル)または２'－ＭＯＥとしても知られている２'－Ｏ－－ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３)(Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504)、即ち、アルコキシ－アルコキシ基を含む。別の修飾の例は、本明細書において以下の実施例に記載される、２'－ＤＭＡＯＥとしても知られている２'－ジメチルアミノオキシエトキシ、即ち、Ｏ(ＣＨ_２)_２ＯＮ(ＣＨ_３)_２基、および２'－ジメチルアミノエトキシエトキシ(当該技術分野において、２'－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチルまたは２'－ＤＭＡＥＯＥとしても知られている)、即ち、２'－Ｏ－－ＣＨ_２－－Ｏ－－ＣＨ_２－－Ｎ(ＣＨ_２)_２である。更なる修飾の例には、以下のものが含まれる：５'－Ｍｅ－２'－Ｆヌクレオチド、５'－Ｍｅ－２'－ＯＭｅヌクレオチド、５'－Ｍｅ－２'－デオキシヌクレオチド(これらの３つのファミリーの中で、ＲおよびＳアイソマーの両方)；２'－アルコキシアルキル；および２'－ＮＭＡ(Ｎ－メチルアセトアミド)。

【0175】

別の修飾は、２'－メトキシ(２'－ＯＣＨ_３)、２'－アミノプロポキシ(２'－ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２)および２'－フルオロ(２'－Ｆ)を含む。同様の修飾を、ｉＲＮＡのＲＮＡにおける他の位置、特に３'末端ヌクレオチド上または２'－５'結合ｄｓＲＮＡ中の糖の３'位および５'末端ヌクレオチドの５'位で行うこともできる。ｉＲＮＡは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体も有し得る。このような修飾された糖構造の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、米国特許第４,９８１,９５７号明細書；同第５,１１８,８００号明細書；同第５,３１９,０８０号明細書；同第５,３５９,０４４号明細書；同第５,３９３,８７８号明細書；同第５,４４６,１３７号明細書；同第５,４６６,７８６号明細書；同第５,５１４,７８５号明細書；同第５,５１９,１３４号明細書；同第５,５６７,８１１号明細書；同第５,５７６,４２７号明細書；同第５,５９１,７２２号明細書；同第５,５９７,９０９号明細書；同第５,６１０,３００号明細書；同第５,６２７,０５３号明細書；同第５,６３９,８７３号明細書；同第５,６４６,２６５号明細書；同第５,６５８,８７３号明細書；同第５,６７０,６３３号明細書；および同第５,７００,９２０号明細書が挙げられ、これらのうちのいくつかは、本出願と権利者が同一である。これら各々の全ての内容が、援用により本明細書に組み込まれる。

【0176】

ｉＲＮＡは、核酸塩基(当該技術分野において多くの場合、単に「塩基」と称される)修飾または置換も含み得る。本明細書において使用される際、「非修飾」または「天然」核酸塩基は、プリン塩基アデニン(Ａ)およびグアニン(Ｇ)、並びにピリミジン塩基チミン(Ｔ)、シトシン(Ｃ)およびウラシル(Ｕ)を含む。修飾核酸塩基は、デオキシ－チミン(ｄＴ)、５－メチルシトシン(５－ｍｅ－Ｃ)、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６－メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよび他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－ハロウラシルおよびシトシン、５－プロピニルウラシルおよびシトシン、６－アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５－ウラシル(シュードウラシル)、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルおよび他の８－置換アデニンおよびグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチルおよび他の５－置換ウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、７－デアザグアニンおよび７－デアザアデニンならびに３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンなどの別の合成および天然核酸塩基を含む。更なる核酸塩基としては、米国特許第３,６８７,８０８号明細書に開示されるもの；Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008に開示されるもの；The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990に開示されているもの、これらはEnglisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613に開示されている；およびSanghvi, Y S., Chapter 15, dsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993に開示されるものが挙げられる。これらの核酸塩基のいくつかは、本発明に取り上げられるオリゴマー化合物の結合親和性を高めるのに特に有用である。これらとしては、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシルおよび５－プロピニルシトシンを含む、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジンおよびＮ－２、Ｎ－６および０－６置換プリンが挙げられる。５－メチルシトシン置換基は、核酸二本鎖安定性を０.６～１.２℃上昇させることが示されており(Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278)、これは典型的な塩基置換であって、特に２'－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組み合わされる場合は尚更である。

【0177】

上記の修飾された核酸塩基ならびに他の修飾された核酸塩基のいくつかの製造を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、上記の米国特許第３,６８７,８０８号明細書、同４,８４５,２０５号明細書；同５,１３０,３０号明細書；同５,１３４,０６６号明細書；同５,１７５,２７３号明細書；同５,３６７,０６６号明細書；同５,４３２,２７２号明細書；同５,４５７,１８７号明細書；同５,４５９,２５５号明細書；同５,４８４,９０８号明細書；同５,５０２,１７７号明細書；同５,５２５,７１１号明細書；同５,５５２,５４０号明細書；同５,５８７,４６９号明細書；同５,５９４,１２１号明細書、同５,５９６,０９１号明細書；同５,６１４,６１７号明細書；同５,６８１,９４１号明細書；同５,７５０,６９２号明細書；同６,０１５,８８６号明細書；同６,１４７,２００号明細書；同６,１６６,１９７号明細書；同６,２２２,０２５号明細書；同６,２３５,８８７号明細書；同６,３８０,３６８号明細書；同６,５２８,６４０号明細書；同６,６３９,０６２号明細書；同６,６１７,４３８号明細書；同７,０４５,６１０号明細書；同７,４２７,６７２号明細書；および同第７,４９５,０８８号明細書が挙げられ、これら各々の全ての内容が、援用により本明細書に組み込まれる。

【0178】

ｉＲＮＡのＲＮＡは、１つまたは複数のロック核酸(ＬＮＡ)を含むようにも修飾され得る。ロック核酸は、修飾されたリボース部分を有するヌクレオチドであり、リボース部分は、２'および４'炭素を結合する追加の架橋を含む。この構造は、３'末端の構造的立体配置におけるリボースを効果的に「固定する(ロックする)」。ｓｉＲＮＡにロック核酸を加えると、血清中のｓｉＲＮＡ安定性が増加し、オフターゲット効果が低下することが示されている(Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447；Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843；Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193)。

【0179】

ある実施態様において、本発明のｉＲＮＡは、ＵＮＡ(アンロック核酸：unlocked nucleic acid)ヌクレオチであるヌクレオチドの１つまたは複数のモノマーを含む。ＵＮＡは、非環式のアンロック核酸であって、いずれの糖結合も除かれて、アンロック「糖」残基を形成する。一つの例において、ＵＮＡは、Ｃ１'-Ｃ４'間の結合(すなわち、Ｃ１'とＣ４'間の共有結合である炭素-酸素-炭素結合)が除かれたモノマーも含む。別の例において、糖のＣ２'－Ｃ３'結合(すなわち、Ｃ２'とＣ３'炭素間の共有結合である炭素-炭素結合)が除去されている(Nuc. Acids Symp. Series, 52, 133-134 (2008) and Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039を参照されたい；出典明示により、本明細書に組み込まれる)。

【0180】

ＵＮＡの調製を教示する代表的な米国特許公報としては、限定はされないが、米国特許第８,３１４,２２７号明細書；および米国特許出願公開第２０１３／００９６２８９号明細書；同第２０１３／００１１９２２号明細書；および同第２０１１／０３１３０２０号明細書が挙げられ、これら各々の全ての内容が、援用により本明細書に組み込まれる。

【0181】

ｉＲＮＡのＲＮＡは、１つまたは複数の二環式糖部分を含むように修飾され得る。「二環式糖」は、２個の原子の架橋によって修飾されたフラノシル環である。「二環式ヌクレオシド」(「ＢＮＡ」)は、糖環の２個の炭素原子を結合して、それにより二環式環系を形成する架橋を含む糖部分を有するヌクレオシドである。ある実施態様において、架橋は、糖環の４'－炭素および２'－炭素を結合する。したがって、ある実施態様において、本発明の剤は、１つまたは複数のロック核酸(ＬＮＡ：locked nucleic acid)を含み得る。ロック核酸は、修飾されたリボース部分を有するヌクレオチドであり、該リボース部分は、２'および４'炭素を結合する追加の架橋を含む。言い換えると、ＬＮＡは、４'－ＣＨ_２－Ｏ－２'架橋を含む二環式糖部分を含むヌクレオチドである。この構造は、３'－末端構造の立体配置におけるリボースを効果的に「固定(ロック)する」。ｓｉＲＮＡにロック核酸を加えると、血清中のｓｉＲＮＡ安定性が増加し、オフターゲット効果が低下することが示されている(Elmen, J.et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1)：439-447；Mook, OR.et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3)：833-843；Grunweller, A.et al.,(2003) Nucleic Acids Research 31(12)：3185-3193)。本発明のポリヌクレオチドに使用するための二環式ヌクレオシドの例としては、限定はされないが、４'および２'リボシル環原子の間の架橋を含むヌクレオシドが挙げられる。ある実施態様において、本発明のアンチセンスポリヌクレオチド剤としては、４'－２'架橋を含む１つまたは複数の二環式ヌクレオシドが挙げられる。このような４'－２'架橋二環式ヌクレオシドの例としては、限定はされないが、４'－(ＣＨ_２)－Ｏ－２'(ＬＮＡ)；４'－(ＣＨ_２)－Ｓ－２'；４'－(ＣＨ_２)_２－Ｏ－２'(ＥＮＡ)；４'－ＣＨ(ＣＨ_３)－Ｏ－２'(「拘束エチル」または「ｃＥｔ」とも呼ばれる)および４'－ＣＨ(ＣＨ_２ＯＣＨ_３)－Ｏ－２'(およびそのアナログ；例えば、米国特許第７,３９９,８４５合明細書を参照)；４'－Ｃ(ＣＨ_３)(ＣＨ_３)－Ｏ－２'(およびそのアナログ；例えば、米国特許第８,２７８,２８３号明細書を参照)；４'－ＣＨ_２－Ｎ(ＯＣＨ_３)－２'(およびそのアナログ；例えば、米国特許第８,２７８,４２５号明細書を参照)；４'－ＣＨ_２－Ｏ－Ｎ(ＣＨ_３)－２'(例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７１５７０号明細書を参照)；４'－ＣＨ_２－Ｎ(Ｒ)－Ｏ－２'(ここで、Ｒが、Ｈ、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルである)または保護基(例えば、米国特許第７,４２７,６７２号明細書を参照)；４'－ＣＨ_２－Ｃ(Ｈ)(ＣＨ_３)－２'(例えば、Chattopadhyaya et al., J.Org. Chem., 2009, 74, 118-134を参照)；および４'－ＣＨ_２－Ｃ(＝ＣＨ_２)－２'(およびそのアナログ；例えば、米国特許第８,２７８,４２６号明細書を参照されたい)が挙げられる。これら各々の全ての内容が、援用により本明細書に組み込まれる。

【0182】

ロック核酸ヌクレオチドの調製を教示する更なる代表的な米国特許および米国特許公報としては、限定はされないが、米国特許第６,２６８,４９０号明細書；同６,５２５,１９１号明細書；同６,６７０,４６１号明細書；同６,７７０,７４８号明細書；同６,７９４,４９９号明細書；同６,９９８,４８４号明細書；同７,０５３,２０７号明細書；同７,０３４,１３３号明細書；同７,０８４,１２５号明細書；同７,３９９,８４５号明細書；同７,４２７,６７２号明細書；同７,５６９,６８６号明細書；同７,７４１,４５７号明細書；同８,０２２,１９３号明細書；同８,０３０,４６７号明細書；同８,２７８,４２５号明細書；同８,２７８,４２６号明細書；同８,２７８,２８３号明細書；米国特許出願公開第２００８／００３９６１８号明細書；および米国特許出願公開第２００９／００１２２８１号明細書が挙げられ、これら各々の全ての内容が、援用により本明細書に組み込まれる。

【0183】

例えば、α－Ｌ－リボフラノースおよびβ－Ｄ－リボフラノースを含む１つまたは複数の立体化学的な糖配置を有する上記の二環式ヌクレオシドのいずれかが調製され得る(国際公開第９９／１４２２６号パンフレットを参照)。

【0184】

ｉＲＮＡのＲＮＡは、１つまたは複数の拘束エチルヌクレオチドを含むようにも修飾され得る。本明細書において使用されるとおり、「拘束エチルヌクレオチド」または「ｃＥｔ」は、４'－ＣＨ(ＣＨ_３)－Ｏ－２'架橋を含む二環式糖部分を含むロック核酸である。一実施態様において、拘束エチルヌクレオチドは、本明細書において「Ｓ－ｃＥｔ」と呼ばれるＳ立体配置にある。

【0185】

本発明のｉＲＮＡは、１つまたは複数の「立体配座的に拘束されたヌクレオチド」(「ＣＲＮ」)も含み得る。ＣＲＮは、リボースのＣ２'およびＣ４'炭素またはリボースのＣ３および－Ｃ５'炭素を結合するリンカーを有するヌクレオチドアナログである。ＣＲＮは、リボース環を安定した立体配置へと固定し、ｍＲＮＡに対するハイブリダイゼーションの親和性を高める。リンカーは、酸素を安定性および親和性のために最適な位置に配置するのに十分な長さを有し、リボース環の歪み(puckering)を少なくする。

【0186】

上記のＣＲＮのいくつかの調製を教示する代表的な公報としては、限定はされないが、米国特許出願公開第２０１３／０１９０３８３号明細書；およびＰＣＴ公報の国際公開第２０１３／０３６８６８号パンフレットが挙げられ、これら各々の全ての内容が、援用により本明細書に組み込まれる。

【0187】

ＲＮＡ分子の末端に対する潜在的に安定した修飾は、Ｎ－(アセチルアミノカプロイル)－４－ヒドロキシプロリノール(Ｈｙｐ－Ｃ６－ＮＨＡｃ)、Ｎ－(カプロイル－４－ヒドロキシプロリノール(Ｈｙｐ－Ｃ６)、Ｎ－(アセチル－４－ヒドロキシプロリノール(Ｈｙｐ－ＮＨＡｃ)、チミジン－２'－Ｏ－デオキシチミジン(エーテル)、Ｎ－(アミノカプロイル)－４－ヒドロキシプロリノール(Ｈｙｐ－Ｃ６－アミノ)、２－ドコサノイル－ウリジン－３”－ホスフェート、逆方向塩基ｄＴ(ｉｄＴ)などを含み得る。この修飾の開示は、ＰＣＴ公開番号国際公開第２０１１／００５８６１号パンフレットに見られる。

【0188】

本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの他の修飾には、５'ホスフェートまたは５'ホスフェート模倣体、例えば、ｉＲＮＡのアンチセンス鎖上の５'末端ホスフェートまたはホスフェート模倣体が含まれる。適切なリン酸塩模倣体は、例えば米国特許公開第２０１２／０１５７５１１号に開示されており、その内容の全てが参照により本明細書に組み込まれる。

【0189】

Ａ．本発明のモチーフを含む修飾ｉＲＮＡ
本発明のある態様において、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤としては、例えば、ＷＯ２０１３/０７５０３５(この全内容が、参照により本明細書に組み込まれる)に開示される化学修飾を有する薬剤が挙げられる。ＷＯ２０１３／０７５０３５は、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖中、特に、切断部位またはその近傍に、３つの連続するヌクレオチド上に３つの同じ修飾のモチーフを提供する。ある実施態様において、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、あるいは完全に修飾されてもよい。これらのモチーフの導入により、存在する場合は、センス鎖またはアンチセンス鎖の修飾パターンが中断される。ＤｓＲＮＡｉ剤は、例えば、センス鎖上で、ＧａｌＮＡｃ誘導体リガンドと、所望によりコンジュゲートされていてもよい。

【0190】

より具体的には、二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖が、ｄｓＲＮＡｉ剤の少なくとも１つの鎖の切断部位またはその近傍に３つの連続するヌクレオチド上の３つの同一修飾の１つまたは複数のモチーフを有するように完全に修飾された場合、ｄｓＲＮＡｉ剤の遺伝子サイレンシング活性が見られた。

【0191】

従って、本発明は、標的遺伝子(即ち、ＫＨＫ遺伝子)の発現をインビボで阻害できる二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。ＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む。ＲＮＡｉ剤の各鎖は、独立して、１２～３０個のヌクレオチド長であってよい。例えば、各鎖は、独立して、１４～３０個のヌクレオチド長、１７～３０個のヌクレオチド長、２５～３０個のヌクレオチド長、２７～３０個のヌクレオチド長、１７～２３個のヌクレオチド長、１７～２１個のヌクレオチド長、１７～１９個のヌクレオチド長、１９～２５個のヌクレオチド長、１９～２３個のヌクレオチド長、１９～２１個のヌクレオチド長、２１～２５個のヌクレオチド長または２１～２３個のヌクレオチド長であり得る。

【0192】

センス鎖およびアンチセンス鎖は、通常、本明細書において「ｄｓＲＮＡｉ剤」とも呼ばれる二本鎖ＲＮＡ(「ｄｓＲＮＡ」)を形成する。ｄｓＲＮＡｉ剤の二本鎖領域は、１２～３０個のヌクレオチド対長であり得る。例えば、二本鎖領域は、１４～３０個のヌクレオチド対長、１７～３０個のヌクレオチド対長、２７～３０個のヌクレオチド対長、１７～２３個のヌクレオチド対長、１７～２１個のヌクレオチド対長、１７～１９個のヌクレオチド対長、１９～２５個のヌクレオチド対長、１９～２３個のヌクレオチド対長、１９～２１個のヌクレオチド対長、２１～２５個のヌクレオチド対長、または２１～２３個のヌクレオチド対長であり得る。別の例では、二本鎖領域は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６および２７個のヌクレオチド長から選択される。

【0193】

ある実施態様において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、１つまたは両方の鎖の３'末端、５'末端、または両方の末端において１つまたは複数のオーバーハング領域またはキャッピング基を含み得る。オーバーハングは、独立して、１～６個のヌクレオチド長、例えば、２～６個のヌクレオチド長、１～５個のヌクレオチド長、２～５個のヌクレオチド長、１～４個のヌクレオチド長、２～４個のヌクレオチド長、１～３個のヌクレオチド長、２～３個のヌクレオチド長または１～２個のヌクレオチド長であり得る。ある実施態様において、オーバーハング領域は、上記に示されるような伸長されたオーバーハング領域を含むことができる。オーバーハングは、１つの鎖が他の鎖より長い結果であるか、または同じ長さの２つの鎖が互い違いになっている結果である可能性がある。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとのミスマッチを形成し得るか、またはオーバーハングは、標的とされる遺伝子配列に相補的であり得るか、または別の配列であり得る。第１および第２の鎖もまた、例えば、ヘアピンを形成するように別の塩基によって、または他の非塩基リンカーによっても結合され得る。

【0194】

ある実施態様において、ｄｓＲＮＡｉ剤のオーバーハング領域中のヌクレオチドは、各々独立して、以下に限定するものではないが、２'－Ｆ、２'－Ｏメチル、チミジン(Ｔ)、２'－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルウリジン(Ｔｅｏ)、２'－Ｏ－メトキシエチルアデノシン(Ａｅｏ)、２'－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルシチジン(ｍ５Ｃｅｏ)およびそれらの任意の組み合わせなどの２'－糖修飾を含んでおり、修飾または非修飾ヌクレオチドであり得る。例えば、ＴＴは、いずれかの鎖上のいずれかの末端のためのオーバーハング配列であり得る。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとのミスマッチを形成し得るか、またはオーバーハングは、標的とされる遺伝子配列に相補的であり得るか、または別の配列であり得る。

【0195】

ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖、アンチセンス鎖または両方の鎖における５'－または３'－オーバーハングは、リン酸化されてもよい。ある実施態様において、オーバーハング領域は、２つのヌクレオチド間にホスホロチオエートを有する２つのヌクレオチドを含み、ここで２つのヌクレオチドは、同じかまたは異なり得る。ある実施態様において、オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖または両方の鎖の３'末端に存在する。ある実施態様において、この３'－オーバーハングは、アンチセンス鎖中に存在する。ある実施態様において、この３'－オーバーハングは、センス鎖中に存在する。

【0196】

ｄｓＲＮＡｉ剤は、その全体的安定性に影響を与えずに、ＲＮＡｉの干渉活性を強化し得る１つのオーバーハングのみを含んでいてもよい。例えば、一本鎖オーバーハングは、センス鎖の３'末端またはアンチセンス鎖の３'末端に位置してもよい。ＲＮＡｉは、アンチセンス鎖の５'末端(または、センス鎖の３'末端)に位置するか、またはその反対に位置する平滑末端を有していてもよい。一般に、ｄｓＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、３'末端にヌクレオチドオーバーハングを有し、かつ５'末端は平滑である。理論に制限されることは望まないが、アンチセンス鎖の５'末端およびアンチセンス鎖の３'末端オーバーハングにおける非対称の平滑末端は、ＲＩＳＣプロセスへのガイド鎖導入に有利に作用する。

【0197】

ある実施態様において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、１９個のヌクレオチド長の二本鎖平滑末端であり、センス鎖は、５'末端から７位、８位、９位に３つの連続するヌクレオチド上の３つの２'－Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５'末端から１１位、１２位、１３位の３つ連続するヌクレオチドに３つの２'－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。

【0198】

別の実施態様において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、２０個のヌクレオチド長の二本鎖平滑末端であり、センス鎖は、５'末端から８位、９位、１０位に３つの連続するヌクレオチド症の３つの２'－Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５'末端から１１位、１２位、１３位に３つ連続するヌクレオチドに３つの２'－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。

【0199】

更に別の実施態様において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、２１個のヌクレオチド長の二本鎖平滑末端であり、センス鎖は、５'末端から９位、１０位、１１位に３つの連続するヌクレオチド上に３つの２'－Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５'末端から１１位、１２位、１３位に３つ連続するヌクレオチドにおける３つの２'－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。

【0200】

ある実施態様において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、２１個のヌクレオチドセンス鎖および２３個のヌクレオチドアンチセンス鎖を含んでおり、センス鎖は、５'末端から９位、１０位、１１位に３つの連続するヌクレオチド上の３つの２'－Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含み；アンチセンス鎖は、５'末端から１１位、１２位、１３位に３つの連続するヌクレオチド上の３つの２'－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、ここでｉＲＮＡ剤の一方の末端は平滑であるが、もう一方の末端は、２つのヌクレオチドオーバーハングを含んでいる。好ましくは、２つのヌクレオチドオーバーハングは、アンチセンス鎖の３'末端にある。

【0201】

２つのヌクレオチドオーバーハングが、アンチセンス鎖の３'末端にある場合、末端の３つのヌクレオチドの間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合があり得、３つのうちの２つのヌクレオチドが、オーバーハングヌクレオチドであり、第３のヌクレオチドは、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖の５'末端およびアンチセンス鎖の５'末端の両方における末端の３つのヌクレオチドの間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を更に有する。ある実施態様において、モチーフの一部であるヌクレオチドを含む、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖中の全てのヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである。ある実施態様において、各残基は、独立して、２'－Ｏ－メチルまたは３'－フルオロで修飾されている(例えば、別のモチーフ中で)。所望により、ｄｓＲＮＡｉ剤は、リガンド(好ましくは、ＧａｌＮＡｃ_３)を更に含む。

【0202】

ある実施態様において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、該センス鎖は、２５～３０個のヌクレオチド残基長であり、５'末端ヌクレオチド(１位)を起点として、第１の鎖の１～２３位が、少なくとも８つのリボヌクレオチドを含み；アンチセンス鎖は、３６～６６ヌクレオチド残基長であり、３'末端ヌクレオチドを起点として、センス鎖の１～２３位と対合される位置において少なくとも８つのリボヌクレオチドを含んで、二本鎖を形成し；アンチセンス鎖の少なくとも３'末端ヌクレオチドが、センス鎖と対合されず、最大で６つの連続する３'末端ヌクレオチドが、センス鎖と対合されず、それによって、１～６つのヌクレオチドの３'一本鎖オーバーハングを形成し；アンチセンス鎖の５'末端は、センス鎖と対合されない１０～３０個の連続するヌクレオチドを含み、それによって１０～３０個のヌクレオチド一本鎖５'オーバーハングを形成し；少なくともセンス鎖５'末端および３'末端ヌクレオチドは、センス鎖およびアンチセンス鎖が最大の相補性のために整列される場合、アンチセンス鎖のヌクレオチドと対合される塩基であり、それによってセンス鎖とアンチセンス鎖との間に実質的に二本鎖の領域を形成し；アンチセンス鎖は、二本鎖核酸が哺乳動物細胞中に導入されたときに標的遺伝子の発現を低下させる程度に、アンチセンス鎖長の少なくとも１９個のリボヌクレオチドに沿った標的ＲＮＡに対して十分相補的であり；センス鎖は、３つの連続するヌクレオチド上の３つの２'－Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、ここで該モチーフのうちの少なくとも１つが、切断部位またはその近傍に存在する。アンチセンス鎖は、切断部位またはその近傍に３つの連続するヌクレオチドに３つの２'－Ｏ－メチル修飾のうちの少なくとも１つのモチーフを含む。

【0203】

ある実施態様において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここでｄｓＲＮＡｉ剤は、少なくとも２５、かつ２９以下のヌクレオチド長を有する第１の鎖と、５'末端から１１位、１２位、１３位に３つの連続するヌクレオチドにおいて３つの２'－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含んでいる３０個以下のヌクレオチド長を有する第２の鎖を含んでおり；第１の鎖の３'末端および第２の鎖の５'末端は、平滑末端を形成し、第２の鎖は、その３'末端で第１の鎖より１～４個のヌクレオチドが長く、二本鎖領域は、少なくとも２５個のヌクレオチド長であって、第２の鎖は、ＲＮＡｉ剤が哺乳動物細胞中に導入されたときに標的遺伝子の発現を低下させる程度に、第２の鎖長の少なくとも１９個のヌクレオチドに沿って標的ｍＲＮＡに対して十分相補的であり、ｄｓＲＮＡｉ剤のダイサー切断により、優先的に、第２の鎖の３'末端を含むｓｉＲＮＡをもたらすことにより、哺乳動物における標的遺伝子の発現を低下させる。所望により、ｄｓＲＮＡｉ剤は、リガンドを更に含む。

【0204】

ある実施態様において、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、３つの連続するヌクレオチドにおける３つの同一修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、モチーフの１つは、センス鎖の切断部位に存在する。

【0205】

ある実施態様において、ｄｓＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖も、３つの連続するヌクレオチドにおける３つの同一修飾の少なくとも１つのモチーフも含むことができ、これらモチーフの１つは、アンチセンス鎖の切断部位またはその近傍に存在する。

【0206】

１７～２３個のヌクレオチド長の二本鎖領域を有するｄｓＲＮＡｉ剤では、アンチセンス鎖の切断部位は、通常、５'末端から１０位、１１位および１２位の近傍である。したがって、３つの同一修飾のモチーフは、アンチセンス鎖の５'末端から１つ目のヌクレオチドから数え始めて、またはアンチセンス鎖の５'末端から、二本鎖領域内の１つ目の対合ヌクレオチドから数え始めて、アンチセンス鎖の９位、１０位、１１位；１０位、１１位、１２位；１１位、１２位、１３位；１２位、１３位、１４位；または１３位、１４位、１５位に存在し得る。アンチセンス鎖中の切断部位はまた、５'末端からのｄｓＲＮＡｉ剤の二本鎖領域の長さに応じて変化し得る。

【0207】

ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、鎖の切断部位に３つの連続するヌクレオチドにおいて３つの同一修飾の少なくとも１つのモチーフを含んでいてもよく；アンチセンス鎖は、鎖の切断部位またはその近傍に３つの連続するヌクレオチドにおける３つの同一修飾の少なくとも１つのモチーフを有し得る。センス鎖およびアンチセンス鎖がｄｓＲＮＡ二本鎖を形成する場合、センス鎖およびアンチセンス鎖は、センス鎖における３つのヌクレオチドの１つのモチーフおよびアンチセンス鎖における３つのヌクレオチドの１つのモチーフが、少なくとも１つのヌクレオチドの重複を有し、即ち、センス鎖中のモチーフの３つのヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、アンチセンス鎖中のモチーフの３つのヌクレオチドのうちの少なくとも１つと塩基対を形成するように整列され得る。あるいは、少なくとも２つのヌクレオチドが重複してもよく、または全ての３つのヌクレオチドが重複してもよい。

【0208】

ある実施態様において、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、３つの連続するヌクレオチドにおける３つの同一修飾の２つ以上のモチーフを含み得る。第１のモチーフは、鎖の切断部位またはその近傍に存在してもよく、他のモチーフは、ウイング修飾であり得る。本明細書における「ウイング修飾」という用語は、同じ鎖の切断部位またはその近傍のモチーフから離れた鎖の別の部分に存在するモチーフを指す。ウイング修飾は、第１のモチーフに隣接するか、または少なくとも１つまたは複数のヌクレオチドによって隔てられている。モチーフが、互いに直接隣接している場合、モチーフの化学構造は、互いに異なり、モチーフが、１つまたは複数のヌクレオチドによって隔てられている場合、化学構造は、同じかまたは異なり得る。２つ以上のウイング修飾が存在し得る。例えば、２つのウイング修飾が存在する場合、各ウイング修飾は、切断部位またはその近傍の第１のモチーフに対して１つの端部にまたはリードモチーフのいずれかの側に存在し得る。

【0209】

センス鎖と同様に、ｄｓＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、３つの連続するヌクレオチドにおける３つの同一修飾の２つ以上のモチーフを含んでいてもよく、モチーフの少なくとも１つが、鎖の切断部位またはその近傍に存在する。このアンチセンス鎖は、センス鎖に存在し得るウイング修飾と同様の配列に１つまたは複数のウイング修飾を含んでもよい。

【0210】

ある実施態様において、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖におけるウイング修飾は、通常、鎖の３'末端、５'末端または両方の末端に第１の１または２つの末端ヌクレオチドを含まない。

【0211】

ある実施態様において、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖におけるウイング修飾は、通常、鎖の３'末端、５'末端または両方の末端の二本鎖領域内に第１の１または２つの対合ヌクレオチドを含まない。

【0212】

ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖が、各々少なくとも１つのウイング修飾を含む場合、ウイング修飾は、二本鎖領域の同じ末端に位置してもよく、１つ、２つまたは３つのヌクレオチドの重複を有し得る。

【0213】

ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖が、各々少なくとも２つのウイング修飾を含む場合、センス鎖およびアンチセンス鎖は、１つの鎖からの２つの修飾が、各々、二本鎖領域の１つの末端に位置しており、１つ、２つまたは３つのヌクレオチドの重複を有するように；１つの鎖からの２つの修飾が、各々、二本鎖領域のもう一方の末端に位置しており、１つ、２つまたは３つのヌクレオチドの重複を有するように；１つの鎖からの２つの修飾が、リードモチーフの各側に位置しており、二本鎖領域中に１つ、２つまたは３つのヌクレオチドの重複を有するように整列され得る。

【0214】

ある実施態様において、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖中の全てのヌクレオチド、例えばモチーフの一部であるヌクレオチドが修飾されてもよい。各ヌクレオチドは、同じまたは異なる修飾で修飾されてもよく、この修飾は、非結合リン酸酸素および／または結合リン酸酸素の１つまたは複数の一方または両方の１つまたは複数の変更；リボース糖の成分、例えば、リボース糖の２'ヒドロキシルの変更；「脱リン(dephospho)」リンカーによるリン酸部分の大規模な置換；天然の塩基の修飾または置換；およびリボース－リン酸骨格の置換または修飾を含み得る。

【0215】

核酸が、サブユニットのポリマーであるため、例えば、塩基、またはリン酸部分、またはリン酸部分の非結合Ｏの修飾といった修飾の多くは、核酸内の繰り返される位置で起こる。場合によっては、修飾は、核酸中の目的の位置の全てに存在し得るが、多くの場合、そうではない。例として、修飾は、３'または５'末端位置のみに存在してもよく、末端領域、例えば、末端ヌクレオチド上の位置または鎖の最後の２、３、４、５または１０個のヌクレオチドのみに存在してもよい。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域またはその両方に存在してもよい。修飾は、ｄｓＲＮＡｉ剤の二本鎖領域のみに存在していてもよく、またはｄｓＲＮＡｉ剤の一本鎖領域のみに存在してもよい。例えば、非結合Ｏ位置でのホスホロチオエート修飾は、一方または両方の末端のみに存在していてもよく、末端領域、例えば、末端ヌクレオチド上の位置または鎖の最後の２、３、４、５または１０のヌクレオチドのみに存在してもよいか、あるいは二本鎖および一本鎖領域、特に、末端に存在していてもよい。５'末端または両方の末端が、リン酸化されることもできる。

【0216】

例えば、安定性を高めること、オーバーハング中に特定の塩基を含むこと、または一本鎖オーバーハング、例えば、５'または３'オーバーハング、またはその両方に修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド代用物(surrogate)を含むことが可能であり得る。例えば、オーバーハング中にプリンヌクレオチドを含むことが望ましい可能性がある。ある実施態様において、３'または５'オーバーハング中の塩基の全てまたは一部が、例えば、本明細書に記載される修飾で修飾されてもよい。修飾は、例えば、当該技術分野において公知の修飾によるリボース糖の２'位における修飾の使用、例えば、核酸塩基のリボ糖の代わりにデオキシリボヌクレオチド、２'－デオキシ－２'－フルオロ(２'－Ｆ)または２'－Ｏ－メチル修飾の使用、およびリン酸基の修飾、例えば、ホスホロチオエート修飾を含み得る。オーバーハングは、標的配列と相同である必要はない。

【0217】

ある実施態様において、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、独立して、ＬＮＡ、ＣＲＮ、ｃＥＴ、ＵＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２'－メトキシエチル、２'－Ｏ－メチル、２'－Ｏ－アリル、２'－Ｃ－アリル、２'－デオキシ、２'－ヒドロキシルまたは２'－フルオロで修飾される。鎖は、２つ以上の修飾を含み得る。一実施態様において、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、独立して、２'－Ｏ－メチルまたは２'－フルオロで修飾される。

【0218】

少なくとも２つの異なる修飾が、通常、センス鎖およびアンチセンス鎖に存在する。それらの２つの修飾は、２'－Ｏ－メチルまたは２'－フルオロ修飾またはその他の修飾であってもよい。

【0219】

ある実施態様において、Ｎ_ａおよび／またはＮ_ｂは、交互のパターン修飾を含む。本明細書において使用される際の「交互のモチーフ」という用語は、１つまたは複数の修飾を有するモチーフを指し、各修飾が、１つの鎖のヌクレオチドに交互に存在する。交互のヌクレオチドは、１つおきのヌクレオチドに１つまたは３つおきのヌクレオチドに１つ、または同様のパターンを指し得る。例えば、Ａ、ＢおよびＣがそれぞれ、ヌクレオチドに対する１つのタイプの修飾を表す場合、交互のモチーフは、「ＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢ・・・」、「ＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ・・・」、「ＡＡＢＡＡＢＡＡＢＡＡＢ・・・」、「ＡＡＡＢＡＡＡＢＡＡＡＢ・・・」、「ＡＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ・・・」、または「ＡＢＣＡＢＣＡＢＣＡＢＣ・・・」などであり得る。

【0220】

交互のモチーフに含まれる修飾のタイプは、同じかまたは異なり得る。例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄが、各々、ヌクレオチド上の１つのタイプの修飾を表す場合、交互のパターン、即ち、１つおきのヌクレオチドにおける修飾は、同じであってもよいが、センス鎖またはアンチセンス鎖の各々が、「ＡＢＡＢＡＢ・・・」、「ＡＣＡＣＡＣ・・・」、「ＢＤＢＤＢＤ・・・」または「ＣＤＣＤＣＤ・・・」などの交互のモチーフ内の修飾のいくつかの可能性から選択され得る。

【0221】

ある実施態様において、本発明のｄｓＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖における交互のモチーフの修飾パターンに対してシフトされたセンス鎖における交互のモチーフの修飾パターンを含む。このシフトは、センス鎖のヌクレオチドの修飾基が、アンチセンス鎖のヌクレオチドの異なる修飾の基に対応するか、その逆であるようなシフトであり得る。例えば、センス鎖は、ｄｓＲＮＡ二本鎖におけるアンチセンス鎖と対合される場合、センス鎖における交互のモチーフは、鎖の５'から３'へと「ＡＢＡＢＡＢ」から開始してもよく、アンチセンス鎖における交互のモチーフは、二本鎖領域内の鎖の５'から３'へと「ＢＡＢＡＢＡ」から開始されてもよい。別の例として、センス鎖における交互のモチーフは、鎖の５'から３'へと「ＡＡＢＢＡＡＢＢ」から開始してもよく、アンチセンス鎖における交互のモチーフは、二本鎖領域内の鎖の５'から３'へと「ＢＢＡＡＢＢＡＡ」から開始してもよく、それにより、センス鎖とアンチセンス鎖との間の修飾パターンの完全なまたは部分的なシフトが存在する。

【0222】

ある実施態様において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、センス鎖における２'－Ｏ－メチル修飾および２'－Ｆ修飾の交互のモチーフのパターンを含み、このパターンは、最初に、アンチセンス鎖における２'－Ｏ－メチル修飾および２'－Ｆ修飾の交互のモチーフのパターンに対するシフトを有し、即ち、センス鎖における２'－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドが、アンチセンス鎖における２'－Ｆ修飾ヌクレオチドと塩基対を形成し、その逆も同様である。センス鎖の１位は、２'－Ｆ修飾から開始してもよく、アンチセンス鎖の１位は、２'－Ｏ－メチル修飾から開始してもよい。

【0223】

センス鎖またはアンチセンス鎖への、３つの連続するヌクレオチド上の３つの同一修飾の１つまたは複数のモチーフの導入により、センス鎖またはアンチセンス鎖中に存在する最初の修飾パターンが中断される。センス鎖またはアンチセンス鎖に３つの連続するヌクレオチド上の３つの同一修飾の１つまたは複数のモチーフを導入することによる、センス鎖またはアンチセンス鎖の修飾パターンのこの中断は、標的遺伝子の対する遺伝子サイレンシング活性を増強し得る。

【0224】

ある実施態様において、３つ連続するヌクレオチド上の３つの同一修飾のモチーフが、鎖のいずれかに導入される場合、モチーフに隣接するヌクレオチドの修飾は、モチーフの修飾と異なる修飾である。例えば、モチーフを含む配列の一部は、「...Ｎ_ａＹＹＹＮ_ｂ...」であり、ここで、「Ｙ」は、３つの連続するヌクレオチドにおける３つの同一修飾のモチーフの修飾を表し、「Ｎ_ａ」および「Ｎ_ｂ」は、Ｙの修飾と異なる、モチーフ「ＹＹＹ」に隣接するヌクレオチドの修飾を表し、Ｎ_ａおよびＮ_ｂは、同じかまたは異なる修飾であり得る。あるいは、Ｎ_ａまたはＮ_ｂは、ウイング修飾が存在する場合、存在していてもまたは存在していなくてもよい。

【0225】

ｉＲＮＡは、少なくとも１つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合を更に含み得る。ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合の修飾は、鎖のいずれかの位置の、センス鎖またはアンチセンス鎖または両方の鎖の任意のヌクレオチドに存在し得る。例えば、ヌクレオチド間結合の修飾は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖中の全てのヌクレオチドに存在していてもよく；各ヌクレオチド間結合の修飾は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖において交互のパターンで存在してもよく；またはセンス鎖またはアンチセンス鎖は、交互のパターンで両方のヌクレオチド間結合の修飾を含み得る。センス鎖におけるヌクレオチド間結合の修飾の交互のパターンは、アンチセンス鎖と同じかまたは異なっていてもよく、またセンス鎖におけるヌクレオチド間結合の修飾の交互のパターンは、アンチセンス鎖におけるヌクレオチド間結合の修飾の交互のパターンに対するシフトを有し得る。一実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、６-８ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。ある実施態様において、アンチセンス鎖は、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を５'末端で含み、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を３'末端で含み、該センス鎖は、少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を５'末端または３'末端のいずれかに含む。

【0226】

ある実施態様において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、オーバーハング領域にホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合の修飾を含む。例えば、オーバーハング領域は、２つのヌクレオチド間にホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合を有する２つのヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチド間結合の修飾は、オーバーハングヌクレオチドを、二本鎖領域内の末端の対合ヌクレオチドと結合するために形成され得る。例えば、少なくとも２、３、４または全てのオーバーハングヌクレオチドが、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合によって結合されてもよく、任意選択で、オーバーハングヌクレオチドを、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドと結合する更なるホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合が存在していてもよい。例えば、末端の３つのヌクレオチド間に少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合が存在してもよく、３つのヌクレオチドのうちの２つが、オーバーハングヌクレオチドであり、第３のヌクレオチドが、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。これら末端の３つのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３'末端、センス鎖の３'末端、アンチセンス鎖の５'末端および／またはアンチセンス鎖の５'末端に存在し得る。

【0227】

ある実施態様において、２つのヌクレオチドオーバーハングは、アンチセンス鎖の３'末端にあり、末端の３つのヌクレオチド間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合が存在しており、３つのヌクレオチドのうちの２つが、オーバーハングヌクレオチドであり、第３のヌクレオチドが、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。所望により、ｄｓＲＮＡｉ剤は、センス鎖の５'末端およびアンチセンス鎖の５'末端の両方において、末端の３つのヌクレオチド間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を更に有し得る。

【0228】

ある実施態様において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、標的とのミスマッチ、二本鎖中のミスマッチまたはそれらの組み合わせを含む。ミスマッチは、オーバーハング領域または二本鎖領域でおこり得る。塩基対は、解離または融解(例えば、特定の対合の結合または解離の自由エネルギーに対してであり、最も簡単な手法は、個々の塩基対ごとに対を調べることであるが、類似のまたは同様の分析も使用できる)を促進する傾向に基づいて評価され得る。解離の促進に関して：Ａ：Ｕが、Ｇ：Ｃより好ましく；Ｇ：Ｕが、Ｇ：Ｃより好ましく；Ｉ：Ｃが、Ｇ：Ｃより好ましい(Ｉ＝イノシン)。ミスマッチ、例えば、非標準または標準以外の対合(本明細書の他の箇所に記載される)が、標準的な(Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ)対合より好ましく；ユニバーサル塩基を含む対合が、標準的な対合より好ましい。

【0229】

ある実施態様において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｕ、Ｉ：Ｃの群から独立して選択されるアンチセンス鎖の５'末端からの二本鎖領域内の最初の１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの塩基対のうちの少なくとも１つ、および二本鎖の５'末端におけるアンチセンス鎖の解離を促進するためのミスマッチ対、例えば、非標準または標準以外の対合またはユニバーサル塩基を含む対合を含む。

【0230】

ある実施態様において、アンチセンス鎖の５'末端からの二本鎖領域内の１位におけるヌクレオチドは、Ａ、ｄＡ、ｄＵ、ＵおよびｄＴから選択される。あるいは、アンチセンス鎖の５'末端からの二本鎖領域内の最初の１、２または３塩基対のうちの少なくとも１つは、ＡＵ塩基対である。例えば、アンチセンス鎖の５'末端からの二本鎖領域内の第１の塩基対は、ＡＵ塩基対である。

【0231】

ある実施態様において、センス鎖の３'末端のヌクレオチドはデオキシチミン(ｄＴ)であるか、またはアンチセンス鎖の３'末端のヌクレオチドはデオキシチミン(ｄＴ)である。例えば、デオキシ－チミンヌクレオチドの短い配列があり、例えば、センス鎖、アンチセンス鎖または両方の鎖の３'末端に２つのｄＴヌクレオチドが存在する。

【0232】

ある実施態様において、センス鎖配列は、式(Ｉ)：
５'ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－(ＸＸＸ)_ｉ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－(ＺＺＺ)_ｊ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３' (Ｉ)
(式中、
ｉおよびｊは、各々独立して、０または１であり；
ｐおよびｑは、各々独立して、０～６であり；
各Ｎ_ａは、独立して、０～２５個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含んでおり；
各Ｎ_ｂは、独立して、０～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎ_ｐおよびｎ_ｑは、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ここで、Ｎ_ｂおよびＹは、同じ修飾を有さず；
ＸＸＸ、ＹＹＹおよびＺＺＺは、各々独立して、３つ連続するヌクレオチドにおける３つの同一修飾の１つのモチーフを表す)
により示され得る。好ましくは、ＹＹＹは、全て２'－Ｆ修飾ヌクレオチドである。

【0233】

ある実施態様において、Ｎ_ａまたはＮ_ｂは、交互のパターンの修飾を含む。

【0234】

ある実施態様において、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位またはその近傍に存在する。例えば、ｄｓＲＮＡｉ剤が、１７～２３ヌクレオチド長の二本鎖領域を有する場合、ＹＹＹモチーフは、５'末端から１つ目のヌクレオチドから数え始めて；または所望により、５'末端から、二本鎖領域内の１つ目の対合ヌクレオチドから数え始めて、センス鎖の切断部位またはその近傍に存在し得る(例えば：６位、７位、８位；７位、８位、９位；８位、９位、１０位；９位、１０位、１１位；１０位、１１位、１２位；または１１位、１２位、１３位に存在し得る)。

【0235】

ある実施態様において、ｉが１であり、ｊが０であるか、またはｉが０であり、ｊが１であるか、またはｉおよびｊの両方が１である。従って、センス鎖は、以下の式によって表され得る：
５'ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－ＺＺＺ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３'(Ｉｂ)；
５'ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－ＸＸＸ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３'(Ｉｃ)；または
５'ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－ＸＸＸ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－ＺＺＺ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３'(Ｉｄ)。

【0236】

センス鎖が、式(Ｉｂ)によって表される場合、Ｎ_ｂは、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎ_ａは、独立して、２～２０、２～１５または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。

【0237】

センス鎖が、式(Ｉｃ)として表される場合、Ｎ_ｂは、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎ_ａは、独立して、２～２０、２～１５、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。

【0238】

センス鎖が、式(Ｉｄ)として表される場合、各Ｎ_ｂは、独立して、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。好ましくは、Ｎ_ｂは、０、１、２、３、４、５または６である。各Ｎ_ａは、独立して、２～２０、２～１５または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。

【0239】

Ｘ、ＹおよびＺの各々は、互いに同じか、または異なっていてよい。

【0240】

別の実施態様において、ｉが０であり、ｊが０であり、センス鎖は、以下の式によって表され得る：
５'ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－ＹＹＹ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３' (Ｉａ)。

【0241】

センス鎖が、式(Ｉａ)によって表される場合、各Ｎ_ａは、独立して、２～２０、２～１５または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。

【0242】

一実施態様において、ＲＮＡｉのアンチセンス鎖配列は、
式(ＩＩ)：
５'ｎ_ｑ'－Ｎ_ａ'－(Ｚ'Ｚ'Ｚ')_ｋ－Ｎ_ｂ'－Ｙ'Ｙ'Ｙ'－Ｎ_ｂ'－(Ｘ'Ｘ'Ｘ')_ｌ－Ｎ'_ａ－ｎ_ｐ'３'
(ＩＩ)
(式中、
ｋおよびｌは、各々独立して、０または１であり；
ｐ'およびｑ'は、各々独立して、０～６であり；
各Ｎ_ａ'は、独立して、０～２５個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各Ｎ_ｂ'は、独立して、０～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎ_ｐ'およびｎ_ｑ'は、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ここで、Ｎ_ｂ'およびＹ'は、同じ修飾を有さず；
Ｘ'Ｘ'Ｘ'、Ｙ'Ｙ'Ｙ'およびＺ'Ｚ'Ｚ'は、各々独立して、３つの連続するヌクレオチドに３つの同一修飾の１つのモチーフを表す)
によって表され得る。

【0243】

ある実施態様において、Ｎ_ａ'またはＮ_ｂ'は、交互のパターンの修飾を含む。

【0244】

Ｙ'Ｙ'Ｙ'モチーフは、アンチセンス鎖の切断部位またはその近傍に存在する。例えば、ｄｓＲＮＡｉ剤が、１７～２３個のヌクレオチド長の二本鎖領域を有する場合、Ｙ'Ｙ'Ｙ'モチーフは、５'末端から１つ目のヌクレオチドから数えて；または所望により、５'末端から、二本鎖領域内の１つ目の対合ヌクレオチドから数えて、アンチセンス鎖の９位、１０位、１１位；１０位、１１位、１２位；１１位、１２位、１３位；１２位、１３位、１４位；または１３位、１４位、１５位に存在し得る。好ましくは、Ｙ'Ｙ'Ｙ'モチーフは、１１位、１２位、１３位に存在する。

【0245】

ある実施態様において、Ｙ'Ｙ'Ｙ'モチーフは、全て２'－ＯＭｅ修飾ヌクレオチドである。

【0246】

ある実施態様において、ｋが１であり、ｌが０であるか、またはｋが０であり、ｌが１であるか、またはｋおよびｌの両方が１である。

【0247】

従って、アンチセンス鎖は、以下の式：
５'ｎ_ｑ'－Ｎ_ａ'－Ｚ'Ｚ'Ｚ'－Ｎ_ｂ'－Ｙ'Ｙ'Ｙ'－Ｎ_ａ'－ｎ_ｐ'３' (ＩＩｂ)；
５'ｎ_ｑ'－Ｎ_ａ'－Ｙ'Ｙ'Ｙ'－Ｎ_ｂ'－Ｘ'Ｘ'Ｘ'－ｎ_ｐ'３' (ＩＩｃ)；または
５'ｎ_ｑ'－Ｎ_ａ'－Ｚ'Ｚ'Ｚ'－Ｎ_ｂ'－Ｙ'Ｙ'Ｙ'－Ｎ_ｂ'－Ｘ'Ｘ'Ｘ'－Ｎ_ａ'－ｎ_ｐ'３' (ＩＩｄ)
によって表され得る。

【0248】

アンチセンス鎖が、式(ＩＩｂ)により表される場合、Ｎ_ｂ'は、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎ_ａ'は、独立して、２～２０、２～１５または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。

【0249】

アンチセンス鎖が、式(ＩＩｃ)として表される場合、Ｎ_ｂ'は、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎ_ａ'は、独立して、２～２０、２～１５または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。

【0250】

アンチセンス鎖が、式(ＩＩｄ)として表される場合、各Ｎ_ｂ'は、独立して、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎ_ａ'は、独立して、２～２０、２～１５または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。好ましくは、Ｎ_ｂは、０、１、２、３、４、５または６である。

【0251】

別の実施態様において、ｋが０であり、ｌが０であり、アンチセンス鎖は、以下の式によって表され得る：
５'ｎ_ｐ'－Ｎ_ａ'－Ｙ'Ｙ'Ｙ'－Ｎ_ａ'－ｎ_ｑ'３' (Ｉａ)。

【0252】

アンチセンス鎖が、式(ＩＩａ)として表される場合、各Ｎ_ａ'は、独立して、２～２０、２～１５または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。

【0253】

Ｘ'、Ｙ'およびＺ'の各々が、互いに同じか、または異なっていてよい。

【0254】

センス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、独立して、ＬＮＡ、ＣＲＮ、ＵＮＡ、ｃＥｔ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２'－メトキシエチル、２'－Ｏ－メチル、２'－Ｏ－アリル、２'－Ｃ－アリル、２'－ヒドロキシルまたは２'－フルオロで修飾され得る。例えば、センス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、独立して、２'－Ｏ－メチルまたは２'－フルオロで修飾される。各Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｘ'、Ｙ'およびＺ'は、特に、２'－Ｏ－メチル修飾または２'－フルオロ修飾を表し得る。

【0255】

ある実施態様において、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、二本鎖領域が２１個のヌクレオチドである場合、５'末端から１つ目のヌクレオチドから数え始めて；または所望により、５'末端から、二本鎖領域内の１つ目の対合ヌクレオチドから数え始めて、鎖の９位、１０位および１１位に存在するＹＹＹモチーフを含んでいてもよく；Ｙは、２'－Ｆ修飾を表す。センス鎖は、二本鎖領域の反対側の末端にウイング修飾としてＸＸＸモチーフまたはＺＺＺモチーフを更に含んでいてもよく；ＸＸＸおよびＺＺＺは、各々独立して、２'－ＯＭｅ修飾または２'－Ｆ修飾を表す。

【0256】

ある実施態様において、アンチセンス鎖は、５'末端から１つ目のヌクレオチドから数え始めて；または所望により、５'末端から、二本鎖領域内の１つ目の対合ヌクレオチドから数え始めて、鎖の１１位、１２位、１３位に存在するＹ'Ｙ'Ｙ'モチーフを含んでいてもよく；Ｙ'は、２'－Ｏ－メチル修飾を表す。アンチセンス鎖は、二本鎖領域の反対側の末端にウイング修飾としてＸ'Ｘ'Ｘ'モチーフまたはＺ'Ｚ'Ｚ'モチーフを更に含んでいてもよく；Ｘ'Ｘ'Ｘ'およびＺ'Ｚ'Ｚ'は各々独立して、２'－ＯＭｅ修飾または２'－Ｆ修飾を表す。

【0257】

上の式(Ｉａ)、(Ｉｂ)、(Ｉｃ)、および(Ｉｄ)のいずれか１つによって表されるセンス鎖はそれぞれ、式(ＩＩａ)、(ＩＩｂ)、(ＩＩｃ)、および(ＩＩｄ)のいずれか１つによって表されるアンチセンス鎖と二本鎖を形成する。

【0258】

従って、本発明の方法に使用するためのｄｓＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含んでいてもよく、各鎖は、１４～３０個のヌクレオチドを有し、ｉＲＮＡ二本鎖は、式(ＩＩＩ)：
センス：５'ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－(ＸＸＸ)_ｉ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－(ＺＺＺ)_ｊ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３'
アンチセンス：３'ｎ_ｐ'－Ｎ_ａ'－(Ｘ'Ｘ'Ｘ')_ｋ－Ｎ_ｂ'－Ｙ'Ｙ'Ｙ'－Ｎ_ｂ'－(Ｚ'Ｚ'Ｚ')_ｌ－Ｎ_ａ'－ｎ_ｑ'５' (ＩＩＩ)
(式中、
ｉ、ｊ、ｋおよびｌは、各々独立して、０または１であり；
ｐ、ｐ'、ｑおよびｑ'は、各々独立して、０～６であり；
各Ｎ_ａおよびＮ_ａ'が、独立して、０～２５個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾ヌクレオチドを含み；
各Ｎ_ｂおよびＮ_ｂ'が、独立して、０～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
ここで、各ｎ_ｐ'、ｎ_ｐ、ｎ_ｑ'およびｎ_ｑは、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し、これら各々は、存在していても、または存在していなくてもよい；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ'Ｘ'Ｘ'、Ｙ'Ｙ'Ｙ'およびＺ'Ｚ'Ｚ'は、各々独立して、３つの連続するヌクレオチドにおいて３つの同一修飾の１つのモチーフを表す)
によって表される。

【0259】

ある実施態様において、ｉが０であり、ｊが０であるか；または、ｉが１であり、ｊが０であるか；または、ｉが０であり、ｊが１であるか；または、ｉおよびｊの両方が０であるか；または、ｉおよびｊの両方が１である。別の実施態様において、ｋが０であり、ｌが０であるか；または、ｋが１であり、ｌが０であり；ｋが０であり、ｌが１であり；またはｋおよびｌの両方が０であるか；または、ｋおよびｌの両方が１である。

【0260】

ｉＲＮＡ二本鎖を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖の組み合わせの例示には、以下の式：
５'ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－ＹＹＹ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３'
３'ｎ_ｐ'－Ｎ_ａ'－Ｙ'Ｙ'Ｙ'－Ｎ_ａ'ｎ_ｑ'５'
(ＩＩＩａ)

５'ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－ＺＺＺ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３'
３'ｎ_ｐ'－Ｎ_ａ'－Ｙ'Ｙ'Ｙ'－Ｎ_ｂ'－Ｚ'Ｚ'Ｚ'－Ｎ_ａ'ｎ_ｑ'５'
(ＩＩＩｂ)

５'ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－ＸＸＸ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３'
３'ｎ_ｐ'－Ｎ_ａ'－Ｘ'Ｘ'Ｘ'－Ｎ_ｂ'－Ｙ'Ｙ'Ｙ'－Ｎ_ａ'－ｎ_ｑ'５'
(ＩＩＩｃ)

５'ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－ＸＸＸ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－ＺＺＺ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３'
３'ｎ_ｐ'－Ｎ_ａ'－Ｘ'Ｘ'Ｘ'－Ｎ_ｂ'－Ｙ'Ｙ'Ｙ'－Ｎ_ｂ'－Ｚ'Ｚ'Ｚ'－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ'５'
(ＩＩＩｄ)
が挙げられる。

【0261】

ｄｓＲＮＡｉ剤が、式(ＩＩＩａ)によって表される場合、各Ｎ_ａは、独立して、２～２０、２～１５または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。

【0262】

ｄｓＲＮＡｉ剤が、式(ＩＩＩｂ)によって表される場合、各Ｎ_ｂは、独立して、１～１０、１～７、１～５または１～４個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎ_ａは、独立して、２～２０、２～１５または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。

【0263】

ｄｓＲＮＡｉ剤が、式(ＩＩＩｃ)として表される場合、各Ｎ_ｂ、Ｎ_ｂ'は、独立して、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎ_ａは、独立して、２～２０、２～１５または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。

【0264】

ｄｓＲＮＡｉ剤が、式(ＩＩＩｄ)として表される場合、各Ｎ_ｂ、Ｎ_ｂ'は、独立して、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎ_ａ、Ｎ_ａ'は、独立して、２～２０、２～１５または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。Ｎ_ａ、Ｎ_ａ'、Ｎ_ｂおよびＮ_ｂ'のそれぞれは、独立して、交互のパターンの修飾を含む。

【0265】

式(ＩＩＩ)、(ＩＩＩａ)、(ＩＩＩｂ)、(ＩＩＩｃ)および(ＩＩＩｄ)中のＸ、ＹおよびＺの各々は、互いに同じか、または異なっていてもよい。

【0266】

ｄｓＲＮＡｉ剤が、式(ＩＩＩ)、(ＩＩＩａ)、(ＩＩＩｂ)、(ＩＩＩｃ)、および(ＩＩＩｄ)によって表される場合、Ｙヌクレオチドの少なくとも１つが、Ｙ'ヌクレオチドの１つと塩基対を形成し得る。或いは、Ｙヌクレオチドの少なくとも２つが、対応するＹ'ヌクレオチドと塩基対を形成し；またはＹヌクレオチドの全ての３つが全て、対応するＹ'ヌクレオチドと塩基対を形成する。

【0267】

ｄｓＲＮＡｉ剤が、式(ＩＩＩｂ)または(ＩＩＩｄ)によって表される場合、Ｚヌクレオチドの少なくとも１つが、Ｚ'ヌクレオチドの１つと塩基対を形成し得る。あるいは、Ｚヌクレオチドの少なくとも２つが、対応するＺ'ヌクレオチドと塩基対を形成し；またはＺヌクレオチドの全ての３つが全て、対応するＺ'ヌクレオチドと塩基対を形成する。

【0268】

ｄｓＲＮＡｉ剤が、式(ＩＩＩｃ)または(ＩＩＩｄ)として表される場合、Ｘヌクレオチドの少なくとも１つが、Ｘ'ヌクレオチドの１つと塩基対を形成し得る。あるいは、Ｘヌクレオチドの少なくとも２つが、対応するＸ'ヌクレオチドと塩基対を形成し；またはＸヌクレオチド全ての３つが全て、対応するＸ'ヌクレオチドと塩基対を形成する。

【0269】

ある実施態様において、Ｙヌクレオチド上の修飾は、Ｙ'ヌクレオチド上の修飾と異なり、Ｚヌクレオチド上の修飾は、Ｚ'ヌクレオチド上の修飾と異なり、またはＸヌクレオチド上の修飾は、Ｘ'ヌクレオチド上の修飾と異なる。

【0270】

ある実施態様において、ｄｓＲＮＡｉ剤が、式(ＩＩＩｄ)によって表される場合、Ｎ_ａ修飾は、２'－Ｏ－メチルまたは２'－フルオロ修飾である。別の実施態様において、ＲＮＡｉ剤が、式(ＩＩＩｄ)によって表される場合、Ｎ_ａ修飾は、２'－Ｏ－メチルまたは２'－フルオロ修飾であり、ｎ_ｐ'＞０であり、少なくとも１つのｎ_ｐ'が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合される。さらに別の実施態様において、ＲＮＡｉ剤が、式(ＩＩＩｄ)によって表される場合、Ｎ_ａ修飾は、２'－Ｏ－メチルまたは２'－フルオロ修飾であり、ｎ_ｐ'＞０であり、少なくとも１つのｎ_ｐ'は、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され、センス鎖は、二価または三価の分枝鎖リンカーを介して結合された１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされる(以下に記載)。別の実施態様において、ｉＲＮＡ剤が、式(ＩＩＩｄ)によって表される場合、Ｎ_ａ修飾は、２'－Ｏ－メチルまたは２'－フルオロ修飾であり、ｎ_ｐ'＞０であり、少なくとも１つのｎ_ｐ'が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され、センス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み、センス鎖は、一価、二価または三価の分枝鎖リンカーを介して結合された１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされる。

【0271】

ある実施態様において、ｄｓＲＮＡｉ剤が、式(ＩＩＩａ)によって表される場合、Ｎ_ａ修飾は、２'－Ｏ－メチルまたは２'－フルオロ修飾であり、ｎ_ｐ'＞０であり、少なくとも１つのｎ_ｐ'は、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され、センス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み、センス鎖は、二価または三価の分枝鎖リンカーを介して結合された１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされる。

【0272】

ある実施態様において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、式(ＩＩＩ)、(ＩＩＩａ)、(ＩＩＩｂ)、(ＩＩＩｃ)および(ＩＩＩｄ)によって表される少なくとも２つの二本鎖を含む多量体であり、この二本鎖は、リンカーによって結合される。リンカーは、切断可能であるか、または切断不可能であり得る。所望により、多量体は、リガンドを更に含む。二本鎖のそれぞれは、同じ遺伝子または２つの異なる遺伝子を標的とすることができ；または二本鎖のそれぞれは、２つの異なる標的部位において同じ遺伝子を標的とすることができる。

【0273】

ある実施態様において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、式(ＩＩＩ)、(ＩＩＩａ)、(ＩＩＩｂ)、(ＩＩＩｃ)および(ＩＩＩｄ)によって表される３つ、４つ、５つ、６つまたはそれ以上の二本鎖を含む多量体であり、この二本鎖は、リンカーによって結合される。リンカーは、切断可能であるか、または切断不可能であり得る。所望により、多量体は、リガンドを更に含む。二本鎖のそれぞれは、同じ遺伝子または２つの異なる遺伝子を標的とすることができ；または二本鎖のそれぞれは、２つの異なる標的部位において同じ遺伝子を標的とすることができる。

【0274】

ある実施態様において、式(ＩＩＩ)、(ＩＩＩａ)、(ＩＩＩｂ)、(ＩＩＩｃ)および(ＩＩＩｄ)の少なくとも１つによって表される２つのｄｓＲＮＡｉ剤は、５'末端、および３'末端の一方または両方で互いに結合され、所望により、リガンドにコンジュゲートされる。ｄｓＲＮＡｉ剤のそれぞれは、同じ遺伝子または２つの異なる遺伝子を標的とすることができ；または該剤のそれぞれは、２つの異なる標的部位において同じ遺伝子を標的とすることができる。

【0275】

様々な刊行物に、本発明の方法に使用され得る多量体ｉＲＮＡが記載されている。このような刊行物としては、国際公開第２００７／０９１２６９号パンフレット、米国特許第７,８５８,７６９号明細書、国際公開第２０１０／１４１５１１号パンフレット、国際公開第２００７／１１７６８６号パンフレット、国際公開第２００９／０１４８８７号パンフレットおよび国際公開第２０１１／０３１５２０号パンフレットが挙げられ、それぞれの全ての内容が、参照により本明細書に組み込まれる。

【0276】

以下により詳細に説明されるとおり、ｉＲＮＡに対する１つまたは複数の炭水化物部分のコンジュゲーションを含むｉＲＮＡは、ｉＲＮＡの１以上の特性を最適化することができる。多くの場合、炭水化物部分は、ｉＲＮＡの修飾サブユニットに結合される。例えば、ｉＲＮＡの１つまたは複数のリボヌクレオチドサブユニットのリボース糖は、別の部分、例えば、炭水化物リガンドが結合される非炭水化物(好ましくは、環状の)担体で置換され得る。サブユニットのリボース糖がこのように置換されたリボヌクレオチドサブユニットは、本明細書において、リボース置換修飾サブユニット(ＲＲＭＳ)と呼ばれる。環状担体は、炭素環系であってもよく、即ち、全ての環原子が、炭素原子であり、または複素環系、即ち、１つまたは複数の環原子が、ヘテロ原子、例えば、窒素、酸素、硫黄であり得る。環状担体は、単環系であってもよく、または２つ以上の環、例えば縮合環を含んでいてもよい。環状担体は、完全に飽和した環系であってもよく、または１つまたは複数の二重結合を含んでいてもよい。

【0277】

リガンドは、担体を介してポリヌクレオチドに結合され得る。担体は、(ｉ)少なくとも１つの「骨格結合点」、好ましくは、２つの「骨格結合点」および(ｉｉ)少なくとも１つの「テザー結合点(tethering attachment point)」を含む。本明細書において使用される際の「骨格結合点」は、官能基、例えば、ヒドロキシル基を指すか、または一般的に、リボ核酸の骨格、例えば、リン酸塩または修飾リン酸塩(例えば、硫黄を含有する)骨格中への担体の組み込みに利用可能であり且つそれに適した結合を指す。「テザー結合点」(ＴＡＰ)は、ある実施態様において、選択された部分を連結する環状担体の構成環原子、例えば、炭素原子またはヘテロ原子(骨格結合点を提供する原子と異なる)を指す。この部分は、例えば、炭水化物、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖および多糖であり得る。所望により、選択された部分は、介在するテザー(intervening tether)によって環状担体に結合される。したがって、環状担体は、多くの場合、官能基、例えば、アミノ基を含むか、または一般的には、構成環への別の化学成分、例えば、リガンドの組み込みまたは連結(tethering)に適した結合を提供する。

【0278】

ｉＲＮＡは、担体を介してリガンドにコンジュゲートされてもよく、この担体は、環式基または非環式基であり得る；好ましくは、環式基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１,３］ジオキソラン、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル(pyridazinonyl)、テトラヒドロフリルおよびデカリンから選択され；好ましくは、非環式基は、セリノール骨格またはジエタノールアミン骨格から選択される。

【0279】

ある特定の実施態様において、本発明の方法に使用するためのｉＲＮＡは、表３または５に列挙される薬剤の群から選択される薬剤である。これらの薬剤は、リガンドを更に含み得る。

【0280】

ＩＩＩ．リガンドにコンジュゲートされたｉＲＮＡ
本発明のｉＲＮＡのＲＮＡの別の修飾は、ｉＲＮＡの活性、細胞分布または細胞取り込み(例えば、細胞中への)を向上させる１つまたは複数のリガンド、部分またはコンジュゲートをｉＲＮＡに化学的に結合することを含む。このような部分としては、限定はされないが、コレステロール部分(Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556)、コール酸(Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060)、チオエーテル、例えば、ベリル－Ｓ－トリチルチオール(Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309；Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770)、チオコレステロール(Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533-538)、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基(Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10:1111-1118；Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327-330；Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49-54)、リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチル－アンモニウム１,２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－ホスホネート(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654；Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783)、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖(Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973)またはアダマンタン酢酸(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654)、パルミチル部分(Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237)またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ－カルボニルオキシコレステロール部分(Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937)などの脂質部分が挙げられるが、これらに限定するものではない。

【0281】

ある実施態様において、リガンドは、それが組み込まれるｉＲＮＡ剤の分布、標的化または寿命を変化させる。好ましい実施態様において、リガンドは、例えば、このようなリガンドのない種と比較して、選択された標的(例えば、分子、細胞または細胞型)、区画(例えば、細胞または器官の区画)、身体の組織、器官または領域に対する親和性の増強を提供する。好ましいリガンドは、二本鎖核酸における二本鎖の対合に関与しない。

【0282】

リガンドは、タンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)、低比重リポタンパク(ＬＤＬ)またはグロブリン)；炭水化物(例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、Ｎ－アセチルガラクトサミンまたはヒアルロン酸)；または脂質などの天然の物質を含み得る。リガンドはまた、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸などの組み換え体または合成分子であり得る。ポリアミノ酸の例としては、ポリアミノ酸であるポリリジン(ＰＬＬ)、ポリＬ－アスパラギン酸、ポリＬ－グルタミン酸、スチレン－マレイン酸無水物コポリマー、ポリ(Ｌ－ラクチド－コ－グリコリド)コポリマー、ジビニルエーテル－無水マレイン酸コポリマー、Ｎ－(２－ヒドロキシプロピル)メタクリルアミドコポリマー(ＨＭＰＡ)、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ポリビニルアルコール(ＰＶＡ)、ポリウレタン、ポリ(２－エチルアクリル酸)、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドポリマーまたはポリホスファジンである。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン(ＰＬＬ)、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、擬似ペプチド－ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩またはα－へリックスペプチドが挙げられる。

【0283】

リガンドはまた、標的基、例えば、細胞または組織標的剤、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば、腎細胞などの特定の細胞型に結合する抗体を含み得る。標的基は、サイロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤タンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタメート、ポリアスパルテート、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、フォレート、ビタミンＢ１２、ビタミンＡ、ビオチン、ＲＧＤペプチドまたはＲＧＤペプチド模倣体であり得る。

【0284】

リガンドの他の例としては、色素、挿入剤(例えばアクリジン)、架橋剤(例えばソラレン、マイトマイシンＣ)、ポルフィリン(ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン)、多環式芳香族炭化水素(例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン)、人工エンドヌクレアーゼ(例えば、ＥＤＴＡ)、親油性分子(例えば、コレステロール)、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１,３－ビス－Ｏ(ヘキサデシル)グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１,３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－(オレオイル)リトコール酸、Ｏ３－(オレオイル)コレン酸、ジメトキシトリチルまたはフェノキサジン)およびペプチドコンジュゲート(例えば、アンテナペディア(Antennapedia)ペプチド、Ｔａｔペプチド)、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ(例えば、ＰＥＧ－４０Ｋ)、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］_２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン(例えば、ビオチン)、輸送／吸収促進剤(例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸)、合成リボヌクレアーゼ(例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン－イミダゾールコンジュゲート、Ｅｕ３＋テトラアザ大員環複合体)、ジニトロフェニル、ＨＲＰまたはＡＰが挙げられる。

【0285】

リガンドは、タンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、コリガンド(co-ligand)、または抗体、例えば、肝細胞などの特定の細胞型に結合する抗体に対する特異親和性を有する分子であり得る。リガンドは、ホルモンおよびホルモン受容体を含んでもよい。リガンドはまた、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン、多価マンノースまたは多価フコースなどの非ペプチド種を含み得る。リガンドは、例えば、リポ多糖、３８ＭＡＰキナーゼの活性化因子またはＮＦ－κＢの活性化因子であり得る。

【0286】

リガンドは、例えば、細胞骨格を破壊することによって、例えば、細胞の微小管、マイクロフィラメントまたは中間径フィラメントを破壊することによって、細胞中へのｉＲＮＡ剤の取り込みを増加させることができる物質、例えば、薬剤であり得る。薬剤は、例えば、タクソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャスプラキノリド、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシンまたはミオセルビンであり得る。

【0287】

ある実施態様において、本明細書に記載されるｉＲＮＡに結合されたリガンドは、薬物動態学的調節剤(ＰＫ調節剤)としての役割を果たす。ＰＫ調節剤としては、親油性物質(lipophile)、胆汁酸、ステロイド、リン脂質アナログ、ペプチド、タンパク質結合剤、ＰＥＧ、ビタミンなどが挙げられる。例示的なＰＫ調節剤としては、限定はされないが、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチンなどが挙げられる。多くのホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチドは、血清タンパク質に結合することも知られており、そのため、骨格中に複数のホスホロチオエート結合を含む短いオリゴヌクレオチド、例えば、約５塩基、１０塩基、１５塩基または２０塩基のオリゴヌクレオチドもまた、リガンド(例えば、ＰＫ調節リガンド)として本発明に適している。更に、血清成分(例えば、血清タンパク質)に結合するアプタマーも、本明細書に記載される実施態様においてＰＫ調節リガンドとして使用するのに好適である。

【0288】

本発明のリガンドコンジュゲートｉＲＮＡｓは、オリゴヌクレオチドへの結合分子の結合から誘導されるものなどの反応性のペンダント官能基を有するオリゴヌクレオチドの使用によって合成され得る(後述される)。この反応性オリゴヌクレオチドは、市販のリガンド、様々な保護基のいずれかを有する合成されたリガンド、または結合基が結合されたリガンドと直接反応されてもよい。

【0289】

本発明のコンジュゲートに使用されるオリゴヌクレオチドは、固相合成に関する周知技術によって好都合におよび日常的に作製され得る。このような合成のための装置は、例えば、Applied Biosystems (Foster City, Calif.)を含めたいくつかの業者によって販売されている。当該技術分野において公知のこのような合成のための任意の他の手段は、追加的に、または別法として用いられてもよい。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などの他のオリゴヌクレオチドを調製するための同様の技術を使用することも公知である。

【0290】

本発明の配列特異的結合ヌクレオシドを有するリガンドコンジュゲートｉＲＮＡｓおよびリガンド分子において、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドは、標準的なヌクレオチドまたはヌクレオシド前駆体、結合基を既に担持しているヌクレオチドまたはヌクレオシドコンジュゲート前駆体、リガンド分子を既に担持しているリガンド－ヌクレオチドまたはヌクレオシドコンジュゲート前駆体または非ヌクレオシドリガンド含有ビルディングブロックを用いて、好適なＤＮＡ合成装置において組み立てられ得る。

【0291】

結合基を既に有するヌクレオチドコンジュゲート前駆体を用いる場合、通常、配列特異的結合ヌクレオシドの合成が完了してから、リガンド分子が、結合基と反応して、リガンドコンジュゲートオリゴヌクレオチドが形成される。ある実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドまたは結合ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチド合成に常法的に使用される市販の、標準的なホスホロアミダイトおよび非標準的なホスホロアミダイトに加えて、リガンド－ヌクレオシドコンジュゲートから得られるホスホロアミダイトを用いて、自動合成装置によって合成される。

【0292】

Ａ．脂質コンジュゲート
ある実施態様において、リガンドまたはコンジュゲートは、脂質または脂質ベースの分子である。このような脂質または脂質ベースの分子は、好ましくは、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)に結合する。ＨＳＡ結合リガンドは、身体の標的組織、例えば、非腎臓標的組織へのコンジュゲートの分配を可能にする。例えば、標的組織は、肝臓、例えば肝臓の実質細胞などであり得る。ＨＳＡに結合し得る他の分子も、リガンドとして使用され得る。例えば、ナプロキセンまたはアスピリンが使用され得る。脂質または脂質ベースのリガンドは、(ａ)コンジュゲートの分解に対する耐性を増大し、(ｂ)標的細胞または細胞膜への標的化または輸送を増大し、または(ｃ)血清タンパク質、例えば、ＨＳＡへの結合を調整するのに使用され得る。

【0293】

脂質ベースのリガンドを用いて、標的組織に対するコンジュゲートの結合を阻害すること、例えば、制御することができる。例えば、より強くＨＳＡに結合する脂質または脂質ベースのリガンドは、腎臓に対して標的化されにくく、そのため身体から除去される可能性が低い。より弱くＨＳＡに結合する脂質または脂質ベースのリガンドを用いて、コンジュゲートを腎臓に対して標的化することができる。

【0294】

ある態様において、脂質ベースのリガンドは、ＨＳＡに結合する。好ましくは、脂質ベースのリガンドは、コンジュゲートが非腎臓組織に好ましく分配されるような十分な親和性でＨＳＡに結合する。しかし、親和性は、ＨＳＡ－リガンド結合が不可逆的となり得る程度に強力でないのが好ましい。

【0295】

別の実施態様において、コンジュゲートが腎臓に好ましく分配されるように、脂質ベースのリガンドは、ＨＳＡに弱く結合するか、または全く結合しない。腎細胞を標的とする別の部分も、脂質ベースのリガンドの代わりに、またはそれと共に使用され得る。

【0296】

別の態様において、リガンドは、標的細胞、例えば、増殖細胞によって取り込まれる成分、例えばビタミンである。これらは、例えば、悪性または非悪性の望ましくない細胞増殖、例えば、癌細胞を特徴とする障害を治療するのに特に有用である。例示的なビタミンは、ビタミンＡ、ＥおよびＫを含む。別の例示的なビタミンは、ビタミンＢ、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサールまたは他のビタミン或いは肝細胞などの標的細胞によって取り込まれる栄養素を含む。ＨＡＳおよび低比重リポタンパク(ＬＤＬ)も含まれる。

【0297】

Ｂ．細胞透過剤
別の態様において、リガンドは、細胞透過剤、好ましくは、らせん状細胞透過剤である。好ましくは、この剤は両親媒性である。例示的な剤は、ｔａｔまたはアンテナペディアなどのペプチドである。この剤がペプチドである場合、それは、ペプチジル模倣体、逆転異性体、非ペプチドまたは擬ペプチド結合、およびＤ－アミノ酸の使用を含めて修飾され得る。らせん状剤は、好ましくはα－へリックス剤であり、これは、好ましくは、親油性および疎油性相を有する。

【0298】

リガンドは、ペプチドまたはペプチド模倣体であり得る。ペプチド模倣体(本明細書においてオリゴペプチド模倣体とも呼ばれる)は、天然ペプチドに類似した規定の三次元構造へとフォールディングできる分子である。ペプチドおよびペプチド模倣体のｉＲＮＡ剤への結合は、例えば細胞認識および吸収を強化することにより、ｉＲＮＡの薬物動態分布に影響を及ぼし得る。ペプチドまたはペプチド模倣体部分は、約５～５０個のアミノ酸の長さ、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０個のアミノ酸の長さであり得る。

【0299】

ペプチドまたはペプチド模倣体は、例えば、細胞透過性ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または疎水性ペプチド(例えば、主に、Ｔｙｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅからなる)であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、拘束(constrained)ペプチドまたは架橋ペプチドであり得る。別の代替法において、ペプチド部分は、疎水性膜輸送配列(ＭＴＳ)を含むことができる。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ(配列番号１３)を有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含有するＲＦＧＦアナログ(例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ(配列番号１４)も、標的部分であり得る。ペプチド部分は、細胞膜を介して、ペプチド、オリゴヌクレオチドおよびタンパク質を含む大きな極性分子を運搬することができる「送達」ペプチドであり得る。例えば、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質に由来する配列(ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ(配列番号１５)およびショウジョウバエのアンテナペディア(Drosophila Antennapedia)タンパク質(ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ(配列番号１６)は、送達ペプチドとして機能することが可能であることが分かっている。ペプチドまたはペプチド模倣体は、ファージディスプレイライブラリーまたは１ビーズ-１化合物(ＯＢＯＣ)コンビナトリアルライブラリーから特定されたペプチドなどのＤＮＡのランダム配列によってコードされ得る(Lam et al., Nature, 354:82-84, 1991)。細胞標的の目的のために組み込まれたモノマー単位を介してｄｓＲＮＡ剤に結合されたペプチドまたはペプチド模倣体の例は、アルギニン－グリシン－アスパラギン酸(ＲＧＤ)－ペプチドまたはＲＧＤ模倣体などのペプチドである。ペプチド部分は、約５つのアミノ酸から約４０個のアミノ酸の長さの範囲であり得る。ペプチド部分は、構造修飾、例えば安定性または直接立体配座特性を高める修飾を有し得る。後述される構造修飾のいずれも用いることができる。

【0300】

本発明の組成物および方法において使用するためのＲＧＤペプチドは、直鎖状または環状であっても良く、また特定の組織に対する標的化を促進するために、修飾、例えば、グリコシル化またはメチル化されていてもよい。ＲＧＤ含有ペプチドおよびペプチド模倣体は、Ｄ－アミノ酸、ならびに合成ＲＧＤ模倣体を使用し得る。ＲＧＤに加えて、インテグリンリガンドを標的とする別の部分を使用することができる。このリガンドの好ましいコンジュゲートは、ＰＥＣＡＭ－１またはＶＥＧＦを標的とする。

【0301】

「細胞透過性ペプチド」は、細胞、例えば、細菌または真菌細胞などの微生物細胞、あるいはヒト細胞などの哺乳動物細胞を透過することが可能である。微生物細胞透過性ペプチドは、例えば、α－へリックス直鎖状ペプチド(例えば、ＬＬ－３７またはＣｅｒｏｐｉｎ Ｐ１)、ジスルフィド結合含有ペプチド(例えば、α－デフェンシン、β－デフェンシンまたはバクテネシン(bactenecin))、または１もしくは２つの優勢なアミノ酸のみを含有するペプチド(例えば、ＰＲ－３９またはインドリシジン)であり得る。細胞透過性ペプチドは、核局在化シグナル(ＮＬＳ)も含み得る。例えば、細胞透過性ペプチドは、ＨＩＶ－１ ｇｐ４１の融合ペプチドドメインおよびＳＶ４０大型Ｔ抗原のＮＬＳに由来する、ＭＰＧなどの二分両親媒性ペプチドであり得る(Simeoni et al., Nucl. Acids Res. 31:2717-2724, 2003)。

【0302】

Ｃ．炭水化物コンジュゲート
本発明の組成物および方法のある実施態様において、ｉＲＮＡは、炭水化物をさらに含む。炭水化物コンジュゲートｉＲＮＡは、本明細書に記載されるように、インビボでの核酸の送達に有利であり、また組成物は、インビボでの治療的使用に好適である。本明細書において使用される際、「炭水化物」は、少なくとも６個の炭素原子(直鎖状、分枝鎖状または環状であってもよい)を有し、各炭素原子に酸素、窒素または硫黄原子が結合している１つまたは複数の単糖単位から構成されている炭水化物それ自体である化合物；またはその一部として、１つまたは複数の単糖単位から構成されている炭水化物部分を有し、単糖単位の各々が、少なくとも６個の炭素原子(直鎖状、分枝鎖状または環状であってもよい)を有し、各炭素原子に酸素、窒素または硫黄原子が結合している化合物のいずれかを指す。代表的な炭水化物としては、糖(単糖、二糖、三糖および約４、５、６、７、８、または９つの単糖単位を含むオリゴ糖)、ならびにデンプン、グリコーゲン、セルロースおよび多糖ゴムなどの多糖が挙げられる。特定の単糖としては、ＨＢＶ以上(例えば、ＨＢＶ、Ｃ６、Ｃ７またはＣ８)の糖が挙げられ；二糖および三糖としては、２つまたは３つの単糖単位(例えば、ＨＢＶ、Ｃ６、Ｃ７またはＣ８)を有する糖が挙げられる。

【0303】

ある実施態様において、本発明の組成物および方法に使用するための炭水化物コンジュゲートは、単糖である。一実施態様において、単糖は、

【化5】

などのＮ-アセチルガラクトサミンである。

【0304】

別の実施態様において、本発明の組成物および方法に使用するための炭水化物コンジュゲートは、下記：

【化6】

【化7】

【化8】

【化9】

【化10】

【化11】

【化12】

【化13】

からなる群から選択される。

【0305】

本明細書に記載される実施態様に使用するための別の代表的な炭水化物コンジュゲートとしては、

【化14】

(ＸまたはＹの一つが、オリゴヌクレオチドである場合、もう一方は水素である)
を含むが、これに限定するものではない。

【0306】

本発明のある実施態様においては、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、一価のリンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合される。いくつかの実施態様においては、ＧａｌＮａｃまたはＧａｌＮａｃ誘導体は、２価のリンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合される。本発明のさらに他の実施態様においては、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、３価のリンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合される。

【0307】

ある実施態様においては、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ｉＲＮＡ剤と結合した１つのＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。別の実施態様では、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、複数(例えば、２、３、４、５または６)のＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含み、各々独立して、複数の一価のリンカーを介して二本鎖ＲＮＡｉ剤の複数のヌクレオチドと結合されている。

【0308】

いくつかの実施態様では、例えば、本発明のｉＲＮＡ剤の２本の鎖が、一方の鎖の３'末端と、もう一方の鎖の５'末端との間の複数の不対合ヌクレオチドからなるヘアピンループを形成するヌクレオチドが途切れない鎖によって接続された１つのより大きな分子の一部である場合、ヘアピンループ内の各不対合ヌクレオチドは、独立して、１価リンカーを介して結合されたＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含んでいてもよい。

【0309】

ある実施態様において、炭水化物コンジュゲートは、限定はされないが、ＰＫ調節剤または細胞透過性ペプチドなどの上述したような１つまたは複数の別のリガンドをさらに含む。

【0310】

本発明での使用に好適な更なる炭水化物コンジュゲートには、ＰＣＴ公報の国際公開第２０１４／１７９６２０号パンフレットおよび国際公開第２０１４／１７９６２７号パンフレットに記載されているものが含まれ、それぞれの全ての内容が参照により本明細書に組み込まれる。

【0311】

Ｄ．リンカー
ある実施態様において、本明細書に記載されるコンジュゲートまたはリガンドは、切断可能または切断不可能であり得る様々なリンカーを用いて、ｉＲＮＡオリゴヌクレオチドに結合され得る。

【0312】

「リンカー」または「結合基」という用語は、化合物の２つの部分を結合する有機部分、例えば、化合物の２つの部分を共有結合する有機部分を意味する。リンカーは、通常、直接的な結合または酸素もしくは硫黄などの原子、ＮＲ８、Ｃ(Ｏ)、Ｃ(Ｏ)ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ_２、ＳＯ_２ＮＨなどの単位、または限定はされないが、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアルケニル、置換もしくは非置換のアルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロアリール(１つまたは複数のメチレンがＯ、Ｓ、Ｓ(Ｏ)、ＳＯ_２、Ｎ(Ｒ８)、Ｃ(Ｏ)、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換の複素環式基により中断または終端され得る)などの原子の鎖を含み；ここで、Ｒ８は、水素、アシル、脂肪族または置換された脂肪族である。一実施態様において、リンカーは、約１～２４個の原子、２～２４、３～２４、４～２４、５～２４、６～２４、６～１８、７～１８、８～１８、７～１７、８～１７、６～１６、７～１６または８～１６個の原子である。

【0313】

切断可能な結合基は、細胞の外部では十分安定であるが、標的細胞内に入った後、切断されて、リンカーが一緒に保持する２つの部分を放出するものである。好ましい実施態様において、切断可能な結合基は、標的細胞内または第一の参照条件(例えば、細胞内条件を模倣または表すように選択され得る)下で、対象の血液中、または第二の参照条件(例えば、血液または血清に見出される条件を模倣または表すよう選択され得る)下の少なくとも約１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍または約１００倍速く切断される。

【0314】

切断可能な結合基は、切断剤、例えば、ｐＨ、酸化還元電位または分解性分子の存在に感受性である。一般に、切断剤は、血清または血液中と比較して細胞内部に広く存在しており、またはより高いレベルもしくは活性にて存在する。このような分解剤の例としては、特定の基質のために選択されるか、または基質特異性を有さない酸化還元剤、例えば、還元により酸化還元切断可能な結合基を分解できるメルカプタンなどの細胞内に存在する酸化もしくは還元酵素；エステラーゼ；エンドソームまたは酸性環境を形成し得る薬剤、例えば、ｐＨを５以下にする薬剤；一般的な酸として作用することにより、酸による切断可能な結合基を加水分解または分解できる酵素、ペプチダーゼ(基質特異的であり得る)およびホスファターゼが挙げられる。

【0315】

ジスルフィド結合などの切断可能な結合基は、ｐＨに影響を受け易い可能性がある。ヒト血清のｐＨは７.４であるが、平均細胞内ｐＨは、僅かに低く、約７.１～７.３の範囲である。エンドソームは、５.５～６.０の範囲内のより酸性のｐＨを有し、リソソームは、ほぼ５.０の、更により酸性のｐＨを有する。いくつかのリンカーは、好ましいｐＨで切断される切断可能な結合基を有することによって、細胞内部でリガンドからカチオン性脂質を放出し、または細胞の所望の区画内へ放出するであろう。

【0316】

リンカーは、特定の酵素により切断可能な、切断可能な結合基を含み得る。リンカーに組み込まれる切断可能な結合基のタイプは、標的とされる細胞に依って変化し得る。例えば、肝臓を標的とするリガンドは、エステル基を含むリンカーを介して、カチオン性脂質に結合され得る。肝細胞はエステラーゼを多く含んでいるため、このリンカーは、エステラーゼが多くない細胞種と比較して、肝細胞内でより効率的に切断されるであろう。エステラーゼを多く含むその他の細胞種としては、肺、腎皮質および精巣の細胞が挙げられる。

【0317】

ペプチド結合を含むリンカーは、肝細胞および滑膜細胞などのペプチダーゼを多く含む細胞種を標的とする際に使用することができる。

【0318】

一般に、切断可能な候補結合基の適切性は、分解剤(または分解条件)の候補結合基を切断する能力を試験することにより評価することができる。また、血液中で、または他の非標的組織と接触した際に、切断可能な候補結合基が、切断に抵抗する能力を試験することも望まれる。すなわち、一つには、第一の条件と第二の条件との間の切断に対する相対的な感受性を決定することができ、この第一の条件は、標的細胞内での切断を示すよう選択され、この第二の条件は、他の組織内または体液、例えば血液または血清中で切断を示すよう選択される。この評価は、無細胞系内、細胞内、細胞培養物中、器官内もしくは組織培養物中または全動物内で行うことができる。無細胞または培養条件で最初の評価を行い、全動物における更なる評価によって確認することが有用であり得る。好ましい実施態様において、有用な候補化合物は、血液または血清(または細胞外条件を模倣するよう選択されたインビトロでの条件下)と比較して、細胞内(または細胞内条件を模倣するよう選択されたインビトロでの条件下)で少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または約１００倍速く切断される。

【0319】

ｉ．酸化還元的に切断可能な結合基
一実施態様において、切断可能な結合基は、還元または酸化後に切断される酸化還元的に切断可能な結合基である。還元的に切断可能な結合基の例は、ジスルフィド結合基(－Ｓ－Ｓ－)である。切断可能な候補結合基が、「還元的に切断可能な結合基」として好適であるかどうか、または例えば特定のｉＲＮＡ部分および特定の標的化剤との使用に好適であるかどうかを決定するために、本明細書に記載される方法に注目し得る。例えば、候補は、ジチオスレイトール(ＤＴＴ)または当該技術分野において公知の試薬を用いた他の還元剤とのインキュベーションによって評価することができ、これは、細胞、例えば標的細胞内で観察され得る切断の速度を模倣するものである。この候補は、血液または血清の条件を模倣するよう選択された条件下でも評価され得る。その１つにおいて、候補化合物は、血液中で約１０％以下が切断される。他の実施態様において、有用な候補化合物は、血液中(または、細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロでの条件下)と比較して、細胞内(または、細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロでの条件下)で少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または約１００倍速く分解される。候補化合物の切断速度は、細胞内媒体を模倣するように選択された条件下での標準的な酵素反応速度アッセイを用いて決定され、細胞外媒体を模倣するように選択された条件と比較され得る。

【0320】

ｉｉ．リン酸塩ベースの切断可能な結合基
別の実施態様において、切断可能なリンカーは、リン酸塩ベースの切断可能な結合基を含む。リン酸塩ベースの切断可能な結合基は、リン酸基を分解または加水分解する薬剤によって切断される。細胞内でリン酸基を切断する薬剤の一例は、細胞内のホスファターゼなどの酵素である。リン酸塩ベースの結合基の例は、－Ｏ－Ｐ(Ｏ)(ＯＲｋ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(ＯＲｋ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(ＳＲｋ)－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ(Ｏ)(ＯＲｋ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｏ)(ＯＲｋ)－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ(Ｏ)(ＯＲｋ)－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(ＯＲｋ)－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ(Ｓ)(ＯＲｋ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｏ)(Ｒｋ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(Ｒｋ)－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ(Ｏ)(Ｒｋ)－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ(Ｓ)(Ｒｋ)－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ(Ｏ)(Ｒｋ)－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(Ｒｋ)－Ｓ－である。好ましい実施態様は、－Ｏ－Ｐ(Ｏ)(ＯＨ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(ＯＨ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(ＳＨ)－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ(Ｏ)(ＯＨ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｏ)(ＯＨ)－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ(Ｏ)(ＯＨ)－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(ＯＨ)－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ(Ｓ)(ＯＨ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｏ)(Ｈ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(Ｈ)－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ(Ｏ)(Ｈ)－Ｏ、－Ｓ－Ｐ(Ｓ)(Ｈ)－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ(Ｏ)(Ｈ)－Ｓ－および－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(Ｈ)－Ｓ－である。好ましい実施態様は、－Ｏ－Ｐ(Ｏ)(ＯＨ)－Ｏ－である。これらの候補は、上述した方法と類似した方法を用いて評価することができる。

【0321】

ｉｉｉ．酸切断可能な結合基
別の実施態様において、切断可能なリンカーは、酸切断可能な結合基を含む。酸切断可能な結合基は、酸性条件下で切断される結合基である。好ましい実施態様において、酸切断可能な結合基は、約６.５以下(例えば、約６.０、５.５、５.０またはそれ以下)のｐＨを有する酸性環境内で、または一般的な酸として作用し得る酵素などの薬剤により、切断される。細胞内では、エンドソームおよびリソソームなどの特定の低ｐＨ小器官は、酸切断可能な結合基のための切断環境を提供し得る。酸切断可能な結合基の例には、限定はされないが、ヒドラゾン、エステルおよびアミノ酸のエステルが挙げられる。酸切断可能な基は、一般式－Ｃ＝ＮＮ－、Ｃ(Ｏ)Ｏまたは－ＯＣ(Ｏ)で表され得る。好ましい実施態様は、エステルの酸素に結合した炭素(アルコキシ基)が、アリール基、置換アルキル基または第三級アルキル基(例えば、ジメチルペンチルまたはｔ－ブチルなど)である場合である。これらの候補は、上述した方法と類似した方法を用いて評価することができる。

【0322】

ｉｖ．エステルベースの結合基
別の実施態様において、切断可能なリンカーは、エステルベースの切断可能な結合基を含む。エステルベースの切断可能な結合基は、細胞内のエステラーゼおよびアミラーゼなどの酵素により切断される。エステルベースの切断可能な結合基の例としては、限定はされないが、アルキレン、アルケニレンおよびアルキニレン基のエステルが挙げられる。エステル切断可能な結合基は、一般式－Ｃ(Ｏ)Ｏ－、または－ＯＣ(Ｏ)－で表される。これらの候補は、上述した方法と類似した方法を用いて評価することができる。

【0323】

ｖ．ペプチドベースの切断基
更に別の実施態様において、切断可能なリンカーは、ペプチドベースの切断可能な結合基を含む。ペプチドベースの切断可能な結合基は、細胞内のペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素により切断される。ペプチドベースの切断可能な基は、オリゴペプチド(例えば、ジペプチド、トリペプチドなど)およびポリペプチドを与えるような、アミノ酸間で形成されるペプチド結合である。ペプチドベースの切断可能な基は、アミド基(－Ｃ(Ｏ)ＮＨ－)を含まない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンの間で形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸間で形成されてペプチドおよびタンパク質を与えるアミド結合の特別なタイプである。ペプチドベースの切断基は、一般に、アミノ酸間で形成されてペプチドおよびタンパク質を与えるペプチド結合(即ち、アミド結合)に限定され、アミド官能基全部は含まない。ペプチドベースの切断可能な結合基は、一般式－ＮＨＣＨＲＡＣ(Ｏ)ＮＨＣＨＲＢＣ(Ｏ)－で表され、式中、ＲＡおよびＲＢは、隣接する２つのアミノ酸のＲ基である。これらの候補は、上述した方法と類似した方法を用いて評価することができる。

【0324】

ある実施態様において、本発明のｉＲＮＡは、リンカーを介して炭水化物とコンジュゲートされる。本発明の組成物および方法のリンカーとのｉＲＮＡ炭水化物コンジュゲートの非限定的な例としては、限定はされないが、下記のものが挙げられる：

【化15】

【化16】

(式中、ＸまたはＹの内の一つは、オリゴヌクレオチドであり、もう一方は水素である)。

【0325】

本発明の組成物および方法のある実施態様において、リガンドは、二価または三価の分枝鎖リンカーを介して結合された１つまたは複数の「ＧａｌＮＡｃ」(Ｎ－アセチルガラクトサミン)誘導体である。

【0326】

ある実施態様において、本発明のｄｓＲＮＡは、式(ＸＸＸＩＩ)～(ＸＸＸＶ)：

【化17】

[式中、
ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂおよびｑ５Ｃは、各々独立して、０～２０を表し、繰返し単位は、同一または異なり得る；
Ｐ^２Ａ、Ｐ^２Ｂ、Ｐ^３Ａ、Ｐ^３Ｂ、Ｐ^４Ａ、Ｐ^４Ｂ、Ｐ^５Ａ、Ｐ^５Ｂ、Ｐ^５Ｃ、Ｔ^２Ａ、Ｔ^２Ｂ、Ｔ^３Ａ、Ｔ^３Ｂ、Ｔ^４Ａ、Ｔ^４Ｂ、Ｔ^４Ａ、Ｔ^５Ｂ、Ｔ^５Ｃは、各々独立して、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ(Ｏ)、ＮＨＣ(Ｏ)、ＣＨ_２、ＣＨ_２ＮＨまたはＣＨ_２Ｏであり；
Ｑ^２Ａ、Ｑ^２Ｂ、Ｑ^３Ａ、Ｑ^３Ｂ、Ｑ^４Ａ、Ｑ^４Ｂ、Ｑ^５Ａ、Ｑ^５Ｂ、Ｑ^５Ｃは、各々独立して、存在しないか、アルキレン、置換アルキレンであり、ここで１つまたは複数のメチレンは、１つまたは複数のＯ、Ｓ、Ｓ(Ｏ)、ＳＯ_２、Ｎ(Ｒ^Ｎ)、Ｃ(Ｒ')＝Ｃ(Ｒ”)、Ｃ≡ＣまたはＣ(Ｏ)により中断または終端されてもよく；
Ｒ^２Ａ、Ｒ^２Ｂ、Ｒ^３Ａ、Ｒ^３Ｂ、Ｒ^４Ａ、Ｒ^４Ｂ、Ｒ^５Ａ、Ｒ^５Ｂ、Ｒ^５Ｃは、各々独立して、存在しないか、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ_２、Ｃ(Ｏ)Ｏ、Ｃ(Ｏ)ＮＨ、ＮＨＣＨ(Ｒ^ａ)Ｃ(Ｏ)、－Ｃ(Ｏ)－ＣＨ(Ｒ^ａ)－ＮＨ－、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ－Ｏ、

【化18】

ヘテロシクリルであり；
Ｌ^２Ａ、Ｌ^２Ｂ、Ｌ^３Ａ、Ｌ^３Ｂ、Ｌ^４Ａ、Ｌ^４Ｂ、Ｌ^５Ａ、Ｌ^５ＢおよびＬ^５Ｃは、リガンドを表し；即ち、各々独立して、単糖(例えば、ＧａｌＮＡｃなど)、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖または多糖であり；
Ｒ^ａは、Ｈまたはアミノ酸側鎖である]
のいずれかに示された構造の基から選択される二価または三価の分枝鎖リンカーにコンジュゲートされている。三価コンジュゲートＧａｌＮＡｃ誘導体は、標的遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡｉ剤、例えば、式(ＸＸＸＶ)：

【化19】

(式中、Ｌ^５Ａ、Ｌ^５ＢおよびＬ^５Ｃは、ＧａｌＮＡｃ誘導体などの単糖を表す)
とともに使用するために特に有用である。

【0327】

ＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートする好適な二価および三価の分枝鎖状の結合基の例としては、限定はされないが、式ＩＩ、ＶＩＩ、ＸＩ、ＸおよびＸＩＩＩとして上記した構造が挙げられる。

【0328】

ＲＮＡコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許としては、次のものに限定しないが、米国特許第４,８２８,９７９号；４,９４８,８８２号；５,２１８,１０５号；５,５２５,４６５号；５,５４１,３１３号；５,５４５,７３０号；５,５５２,５３８号；５,５７８,７１７号；５,５８０,７３１号；５,５９１,５８４号；５,１０９,１２４号；５,１１８,８０２号；５,１３８,０４５号；５,４１４,０７７号；５,４８６,６０３号；５,５１２,４３９号；５,５７８,７１８号；５,６０８,０４６号；４,５８７,０４４号；４,６０５,７３５号；４,６６７,０２５号；４,７６２,７７９号；４,７８９,７３７号；４,８２４,９４１号；４,８３５,２６３号；４,８７６,３３５号；４,９０４,５８２号；４,９５８,０１３号；５,０８２,８３０号；５,１１２,９６３号；５,２１４,１３６号；５,０８２,８３０号；５,１１２,９６３号；５,２１４,１３６号；５,２４５,０２２号；５,２５４,４６９号；５,２５８,５０６号；５,２６２,５３６号；５,２７２,２５０号；５,２９２,８７３号；５,３１７,０９８号；５,３７１,２４１号；５,３９１,７２３号；５,４１６,２０３号；５,４５１,４６３号；５,５１０,４７５号；５,５１２,６６７号；５,５１４,７８５号；５,５６５,５５２号；５,５６７,８１０号；５,５７４,１４２号；５,５８５,４８１号；５,５８７,３７１号；５,５９５,７２６号；５,５９７,６９６号；５,５９９,９２３号；５,５９９,９２８号；５,６８８,９４１号；６,２９４,６６４号；６,３２０,０１７号；６,５７６,７５２号；６,７８３,９３１号；６,９００,２９７号；７,０３７,６４６号；および８,１０６,０２２号が挙げられ、これらのそれぞれの全ての内容が、参照により本明細書に援用される。

【0329】

所与の化合物の全ての位置が、必ずしも均一に修飾されている必要はなく、実際には、上記の修飾のうちの２つ以上を、単一の化合物中にまたは更にはｉＲＮＡ内の単一のヌクレオシドに組み込むことができる。本発明は、キメラ化合物であるｉＲＮＡ化合物も含む。

【0330】

所与の化合物の全ての位置が均一に修飾されている必要はなく、実際には、上記の修飾のうちの２つ以上を、単一の化合物中にまたは更にはｉＲＮＡ内の単一のヌクレオシドに組み込むことができる。本発明は、キメラ化合物であるｉＲＮＡ化合物も含む。

【0331】

本明細書の文脈において、「キメラ」ｉＲＮＡ化合物または「キメラ」は、少なくとも１つのモノマー単位、即ち、ｄｓＲＮＡ化合物の場合はヌクレオチドからそれぞれ構成される２つ以上の化学的に異なる領域を含むｉＲＮＡ化合物、好ましくは、ｄｓＲＮＡｉ剤である。これらのｉＲＮＡは、通常、少なくとも１つの領域を含み、ここで、ＲＮＡは、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増加、細胞取り込みの増加、または標的核酸に対する結合親和性の増加をｉＲＮＡに与えるように修飾される。ｉＲＮＡの更なる別の領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することが可能な酵素のための基質としての役割を果たし得る。例として、ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。したがって、ＲＮアーゼＨの活性化は、ＲＮＡ標的の切断をもたらし、それによって、遺伝子発現のｉＲＮＡ阻害の効率を大幅に高める。その結果として、キメラｄｓＲＮＡが使用される場合、同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシｄｓＲＮＡと比較して、より短いｉＲＮＡによって同等の結果が得られることが多い。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動によって、および必要に応じて、当該技術分野において公知の関連する核酸ハイブリダイゼーション技術により常法的に検出され得る。

【0332】

場合によっては、ｉＲＮＡのＲＮＡは、非リガンド基によって修飾され得る。多くの非リガンド分子が、ｉＲＮＡの活性、細胞分布または細胞取り込みを向上させるためにｉＲＮＡにコンジュゲートされており、このようなコンジュゲートを行うための手順は、科学文献から得られる。このような非リガンド部分は、例えばコレステロール(Kubo, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2007, 365(1):54-61；Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553)、コール酸(Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053)、チオエーテル、例えば、ヘキシル－Ｓ－トリチルチオール (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306；Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765)、チオコレステロール(Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533)、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基(Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111；Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327；Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49)、リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１,２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホネート(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651；Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777)、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖(Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969)またはアダマンタン酢酸(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651)、パルミチル部分(Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229)、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分(Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923)などの脂質部分を含んでいる。このようなＲＮＡコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許が上に列挙されている。典型的なコンジュゲートプロトコルは、配列の１つまたは複数の位置にアミノリンカーを有するＲＮＡの合成を含む。次に、適切なカップリング剤または活性化試薬を用いて、アミノ基をコンジュゲートされた分子と反応させる。コンジュゲート反応は、固体担体に結合されたままのＲＮＡを用いて、または溶液相中のＲＮＡの切断後に行うことができる。ＨＰＬＣによるＲＮＡコンジュゲートの精製により、通常、純粋なコンジュゲートが得られる。

【0333】

ＩＶ．本発明のｉＲＮＡの送達
細胞、例えば、ヒト対象(例えば、ＫＨＫ遺伝子発現に関連する疾病、障害または症状を有する対象などのｉＲＮＡ剤を必要とする対象)などの対象中の細胞への本発明のｉＲＮＡの送達は、いくつかの様々な方法で行うことができる。例えば、送達は、細胞を、本発明のｉＲＮＡとインビトロまたはインビボのいずれかで接触させることによって行われ得る。インビボ送達はまた、ｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡを含む組成物を対象に投与することによって直接行われ得る。あるいは、インビボ送達は、ｉＲＮＡの発現をコードし、それを導く１つまたは複数のベクターを投与することによって、間接的に行われ得る。これらの代替例は、以下に更に説明される。

【0334】

一般に、核酸分子を(インビトロまたはインビボで)送達する任意の方法は、本発明のｉＲＮＡとともに使用するために適合され得る(例えば、全体が参照により本明細書に援用される、Akhtar S. and Julian RL. (1992) Trends Cell. Biol. 2(5):139-144および国際公開第９４／０２５９５号パンフレットを参照)。インビボ送達の場合、ｉＲＮＡ分子を送達するための検討因子としては、例えば、送達される分子の生物学的安定性、非特異的効果の防止および標的組織における送達される分子の蓄積が挙げられる。ｉＲＮＡの非特異的効果は、局所投与によって、例えば、組織への直接注入または移植によって、あるいは製剤を局所的に投与することによって、最小限に抑えられ得る。治療部位への局所投与は、薬剤の局所濃度を最大にして、薬剤による悪影響を受ける可能性があるか、または薬剤が分解され得る全身組織に対する剤の曝露を制限して、投与されるｉＲＮＡ分子の総投与量を少なくすることができる。いくつかの研究により、ｄｓＲＮＡｉが局所投与された場合の遺伝子産物のノックダウンの成功が示されている。例えば、カニクイザルの硝子体内注射によるＶＥＧＦ ｄｓＲＮＡの眼内送達(Tolentino, MJ, et al (2004) Retina 24:132-138)およびマウスの網膜下注射(Reich, SJ., et al (2003) Mol. Vis. 9:210-216)は、両方とも、加齢性黄斑変性症の実験モデルにおける新血管形成を防ぐことを示した。更に、マウスにおけるｄｓＲＮＡの直接腫瘍内投与が腫瘍容積を減少させ(Pille, J., et al (2005) Mol. Ther.11:267-274)、担癌マウスを延命させることができた(Kim, WJ., et al (2006) Mol. Ther. 14:343-350；Li, S., et al (2007) Mol. Ther. 15:515-523)。ＲＮＡ干渉は、直接注入による中枢神経系への局所送達(Dorn, G., et al. (2004) Nucleic Acids 32:e49；Tan, PH., et al (2005) Gene Ther. 12:59-66；Makimura, H., et al (2002) BMC Neurosci. 3:18；Shishkina, GT., et al (2004) Neuroscience 129:521-528；Thakker, ER., et al (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:17270-17275；Akaneya,Y., et al (2005) J. Neurophysiol. 93:594-602)および鼻腔内投与による肺への局所送達(Howard, KA., et al (2006) Mol. Ther. 14:476-484；Zhang, X., et al (2004) J. Biol. Chem. 279:10677-10684；Bitko, V., et al (2005) Nat. Med. 11:50-55)による成功も示している。疾病の治療のためにｉＲＮＡを全身投与するために、ＲＮＡは、修飾され得るか、あるいは薬剤送達システムを用いて送達することが可能であり；両方の方法は、インビボでのエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡの急速な分解を防ぐように作用する。ＲＮＡまたは医薬担体の修飾は、標的組織へのｉＲＮＡの標的化を可能にし、望ましくないオフターゲット効果を回避することもできる。ｉＲＮＡ分子は、細胞取り込みを向上させて、分解を防ぐコレステロールなどの親油基への化学的結合によって修飾され得る。例えば、親油性コレステロール部分にコンジュゲートされたＡｐｏＢに対するｉＲＮＡを、マウスに全身投与して、肝臓および空腸の両方においてａｐｏＢ ｍＲＮＡのノックダウンを得た(Soutschek, J., et al (2004) Nature 432:173-178)。アプタマーへのｉＲＮＡのコンジュゲートは、前立腺癌のマウスモデルにおける腫瘍増殖を阻害し、腫瘍退縮を仲介することが示されている(McNamara, JO, et al (2006) Nat. Biotechnol. 24:1005-1015)。別の実施態様において、ｉＲＮＡは、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソームまたはカチオン性送達システムなどの薬剤送達システムを用いて送達され得る。正に帯電したカチオン性送達システムは、ｉＲＮＡ分子(負に帯電した)の結合を促進し、また、負に帯電した細胞膜での相互作用を向上させて、細胞によるｉＲＮＡを効率的に取り込むことができる。カチオン性脂質、デンドリマーまたはポリマーは、ｉＲＮＡに結合され得るか、またはｉＲＮＡを包む小胞またはミセル(例えば、Kim SH, et al (2008) Journal of Controlled Release 129(2):107-116を参照)を形成するように誘導され得る。小胞またはミセルの形成は、全身投与される場合のｉＲＮＡの分解を更に防ぐ。カチオン性ｉＲＮＡ複合体を作製し、投与するための方法は、十分当業者の能力の範囲内である(例えば、全体が参照により本明細書に援用される、Sorensen, DR, et al (2003) J. Mol. Biol 327:761-766；Verma, UN, et al (2003) Clin. Cancer Res. 9:1291-1300；Arnold, AS et al (2007) J. Hypertens. 25:197-205を参照)。ｉＲＮＡの全身送達に有用な薬剤送達システムのいくつかの非限定的な例としては、ＤＯＴＡＰ(ＳSorensen, DR., et al (2003)、上記参照；Verma, UN, et al (2003)、上記を参照)、オリゴファクタミン、つまり「固体核酸脂質粒子」(Zimmermann, TS, et al (2006) Nature 441:111-114)、カルジオリピン(Chien, PY, et al (2005) Cancer Gene Ther. 12:321-328；Pal, A, et al (2005) Int J. Oncol. 26:1087-1091)、ポリエチレンイミン(Bonnet ME, et al (2008) Pharm. Res. Aug 16 Epub ahead of print；Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659)、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ(ＲＧＤ)ペプチド(Liu, S. (2006) Mol. Pharm. 3:472-487)およびポリアミドアミン(Tomalia, DA, et al (2007) Biochem. Soc. Trans. 35:61-67；Yoo, H., et al (1999) Pharm. Res. 16:1799-1804)が挙げられる。ある実施態様において、ｉＲＮＡは、全身投与のためにシクロデキストリンとともに複合体を形成する。投与のための方法およびｉＲＮＡｓおよびシクロデキストリンの医薬組成物は米国特許第７,４２７,６０５号明細書に見出され、全体が参照により本明細書に援用される。

【0335】

Ａ．ベクターでコードされた本発明のｉＲＮＡ
ＫＨＫ遺伝子を標的とするｉＲＮＡは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターに挿入された転写単位から発現され得る(例えば、Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:5-10；Skillern, Aらの国際ＰＣＴ公開番号国際公開第００／２２１１３号パンフレットを参照)。発現は、使用される特定の構築体および標的組織または細胞種に応じて、一時的(およそ数時間から数週間)でもあり得るし、または持続されることも可能である(数週間から数カ月またはそれ以上)。これらの導入遺伝子は、線状構築体、環状プラスミドまたはウイルスベクターとして導入することができ、これらは、組み込みベクターまたは非組み込みベクターであり得る。導入遺伝子は、染色体外プラスミドとして継承できるように構築することもできる(Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292)。

【0336】

ｉＲＮＡの個々の１つまたは複数の鎖は、発現ベクターにおけるプロモーターから転写され得る。２本の別個の鎖が発現されて、例えば、ｄｓＲＮＡを生成する場合、２つの別個の発現ベクターが、標的細胞中に、共導入(例えば、トランスフェクションまたは感染によって)され得る。あるいは、ｄｓＲＮＡの各個々の鎖が、同じ発現プラスミド上に位置するこれら双方のプロモーターによって転写され得る。一実施態様において、ｄｓＲＮＡは、ステム・ループ構造を有するように、リンカーポリヌクレオチド配列によって接合される逆方向反復ポリヌクレオチドとして発現される。

【0337】

ｉＲＮＡ発現ベクターは、一般に、ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。真核細胞と適合する発現ベクター、好ましくは、脊椎動物細胞と適合する発現ベクターを用いて、本明細書に記載されるｉＲＮＡの発現のための組み換え構築体を産生することができる。真核細胞の発現ベクターは、当該技術分野において周知であり、多くの商業的供給源から入手可能である。通常、所望の核酸セグメントを挿入するのに好都合な制限部位を含むこのようなベクターが提供される。ｉＲＮＡ発現ベクターの送達は、全身投与、例えば、静脈内または筋肉内投与によるか、患者から移植された標的細胞に投与した後に患者に再導入することによるか、または所望の標的細胞への導入を可能にする任意の他の手段などにより送達できる。

【0338】

本明細書に記載される方法および組成物とともに用い得るウイルスベクター系としては、限定はされないが、(ａ)アデノウイルスベクター；(ｂ)レトロウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルスなどを含むが、これらに限定されない；(ｃ)アデノ随伴ウイルスベクター；(ｄ)単純ヘルペスウイルスベクター；(ｅ)ＳＶ４０ベクター；(ｆ)ポリオーマウイルスベクター；(ｇ)パピローマウイルスベクター；(ｈ)ピコルナウイルスベクター；(ｉ)オルソポックス(orthopox)、例えば、ワクシニアウイルスベクターまたは鳥ポックス、例えばカナリア痘または鶏痘などのポックスウイルスベクター；および(ｊ)ヘルパー依存性または弱毒アデノウイルスが挙げられる。複製欠損性ウイルスも有利であり得る。異なるベクターが、細胞のゲノムに組み込まれるか、または組み込まれないであろう。構築体は、必要に応じて、トランスフェクションのためのウイルス配列を含み得る。あるいは、構築体は、エピソーム複製が可能なベクター、例えばＥＰＶおよびＥＢＶベクターに組み込まれ得る。ｉＲＮＡの組み換え発現のための構築体は、一般に、標的細胞内でのｉＲＮＡの発現を確実にするために、調節エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサーなどを必要とする。ベクターおよび構築体について考慮される別の態様は、当分野では既知である。

【0339】

Ｖ．本発明の医薬組成物
本発明は、本発明のｉＲＮＡを含む医薬組成物および製剤も含む。一実施態様において、本明細書に記載されるｉＲＮＡと薬学的に許容され得る担体を含有する医薬組成物も本明細書に提供される。ｉＲＮＡを含有する医薬組成物は、ＫＨＫ遺伝子の発現または活性に関連する疾患または障害を治療するのに有用である。このような医薬組成物は、送達様式に基づいて製剤化される。一例は、非経口投与を介した、例えば、皮下(ＳＣ)または静脈内(ＩＶ)送達による全身投与用に製剤化される組成物である。本発明の医薬組成物は、ＫＨＫ遺伝子の発現を阻害するのに十分な投与量で投与され得る。

【0340】

本発明の医薬組成物は、ＫＨＫ遺伝子の発現を阻害するのに十分な投与量で投与され得る。一般的に、本発明のｉＲＮＡの適切な用量は、約０.００１～約２００.０ｍｇ／ｋｇ体重/日、通常、約１～５０ｍｇ／体重ｋｇ／日の範囲にある。通常、本発明のｉＲＮＡの適切な用量は、約０.１ｍｇ／ｋｇ～約５.０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０.３ｍｇ／ｋｇ～約３.０ｍｇ／ｋｇの範囲である。反復投与レジメンは、定期的に、例えば、隔日または１回／年で治療量のｉＲＮＡを投与すること包含し得る。ある実施態様において、ｉＲＮＡは、約１回／月～約１回／四半期(即ち、約３ヶ月に１回)にて投与される。

【0341】

最初の治療レジメンの後、治療剤は、より少ない頻度で投与され得る。例えば、毎週または隔週で３ヶ月間の投与後、投与は、月に１回、６ヶ月間または１年間またはそれ以上にわたって繰り返され得る。

【0342】

医薬組成物は、一日１回投与することができ、またはｉＲＮＡは、１日を通して適切な間隔で、２、３以上の分割用量として投与され、または更には、連続注入もしくは徐放製剤を介した送達を用いて投与されてもよい。その場合、各分割用量に含まれるｉＲＮＡは、総一日投与量を達成するよう、それに応じてより少量である必要がある。投与単位はまた、例えば数日間の期間にわたりｉＲＮＡの持続放出を提供する従来の徐放性製剤を使用して、数日間にわたり送達用に配合されてもよい。徐放性製剤は、当技術分野にて周知であり、薬剤を特定の部位に送達するのに特に有用であるため、本発明の薬剤とともに使用することができる。この実施態様において、投与単位は、一日用量の対応する倍数を含む。

【0343】

別の実施態様において、医薬組成物の単回投与は、長期継続が可能であるので、その後の用量は、３、４または５日以下の間隔、あるいは１、２、３または４週間以下の間隔で投与される。本発明のある実施態様において、本発明の医薬組成物の単回投与は、週に１回投与される。本発明の他の実施態様において、本発明の医薬組成物の単回投与は、２ヶ月に１回投与される。

【0344】

当業者は、非限定的に疾病または疾患の重症度、治療歴、対象の全体的な健康または年齢、ならびに存在する他の疾病を含む所定の因子が対象を効果的に治療するのに必要な投与量および時間に影響し得ることを認識するであろう。更に、治療的有効量の組成物による対象の治療は、単一の治療または一連の治療を含み得る。本発明により包含される個々のｉＲＮＡに関する有効な投与量、およびインビボでの半減期は、従来の方法論を用いて、または当分野では既知の適切な動物モデルを使用したインビボでの試験に基づいて概算することができる。様々な疾患および症状についての適切な動物モデルは、本明細書において提供される。

【0345】

本発明の医薬組成物は、局所的または全身的治療が必要かどうか、および治療される部位に応じて、いくつかの方法で投与され得る。投与は、局所投与(例えば、経皮パッチによる)、例えば、ネブライザーなどによる、粉末またはエアロゾルの吸入または吹送による経肺投与；気管内、鼻腔内、表皮および経皮、経口または非経口投与であり得る。非経口投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射または注入；例えば、埋め込みデバイスによる皮下投与；または、例えば、実質内、髄腔内もしくは脳室内投与による頭蓋内投与が挙げられる。

【0346】

ｉＲＮＡは、特定の組織(例えば、血管内皮細胞)を標的とするような様式で送達され得る。

【0347】

局所投与または経皮投与用の医薬組成物および製剤には、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、液滴、坐薬、噴霧剤、液剤および散剤が挙げられる。従来の医薬担体、水性、粉末または油性基剤、増粘剤などが必要であり、または所望され得る。被覆コンドーム、手袋なども有用であり得る。好適な局所製剤は、本発明を特徴付けるｉＲＮＡが、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート化剤および界面活性剤などの局所送達薬剤との混合物であるものを含む。好適な脂質およびリポソームは、中性(例えば、ジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン)、陰イオン性(例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ)および陽イオン性(例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ)を含む。本発明を特徴付けるｉＲＮＡは、リポソーム中に封入されることができ、またはリポソームに対して、特に陽イオン性リポソームに対して錯体を形成することができる。あるいは、ｉＲＮＡは、脂質に対して、特に陽イオン性脂質に対して錯体化されてもよい。好適な脂肪酸およびエステルには、非限定的にアラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１－モノカプレート、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはＣ_１～２０アルキルエステル(例えば、ミリスチン酸イソプロピルＩＰＭ)、モノグリセリド、ジグリセリドまたはこれらの薬学的に許容され得る塩が挙げられる)。局所製剤は、米国特許第６,７４７,０１４号明細書に詳細に記載されており、この内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0348】

Ａ．膜分子集合体を含むｉＲＮＡ製剤
本発明の組成物および方法に使用するためのｉＲＮＡは、膜分子集合体、例えば、リポソームまたはミセル中の送達用に製剤化され得る。本明細書において使用される際、「リポソーム」という用語は、少なくとも１つの二重層、例えば、１つの二重層または複数の二重層に配置された両親媒性の脂質から構成される小胞を指す。リポソームは、親油性材料および水性内部から形成される膜を有する単層および多層の小胞を含む。水性部分は、ｉＲＮＡを含有する。親油性材料は、水性外部から水性内部を分離しており、通常、ｉＲＮＡ組成物を含まないが、場合に依り含んでいてもよい。リポソームは、作用部位への活性成分の移送および送達に有用である。リポソーム膜は生体膜と構造が類似しているため、リポソームが組織に付着すると、リポソームの二重層は細胞膜の二重層と融合する。リポソームおよび細胞の融合が進むにつれて、ｉＲＮＡを含む内部の水性物質が、細胞に送達され、ここでｉＲＮＡは、標的ＲＮＡに特異的に結合することができ、ＲＮＡ干渉を仲介することができる。場合によっては、リポソームはまた、例えば、ｉＲＮＡを特定の細胞種に向うように、特異的に標的化される。

【0349】

ｉＲＮＡ剤を含有するリポソームは、様々な方法によって調製され得る。一例において、リポソームの脂質成分は、ミセルが脂質成分と共に形成されるように、洗剤に溶解される。例えば、脂質成分は、両親媒性のカチオン性脂質または脂質コンジュゲートであり得る。洗剤は、高い臨界ミセル濃度を有することができ、非イオン性であり得る。例示的な洗剤としては、コール酸塩、ＣＨＡＰＳ、オクチルグルコシド、デオキシコール酸塩およびラウロイルサルコシンが挙げられる。次に、ｉＲＮＡ剤の調製物は、脂質成分を含むミセルに加えられる。脂質におけるカチオン性基は、ｉＲＮＡ剤と相互作用し、ｉＲＮＡ剤周辺で縮合して、リポソームを形成する。縮合の後、洗剤は、例えば透析によって除去されて、ｉＲＮＡ剤のリポソーム製剤が得られる。

【0350】

必要に応じて、縮合を補助する担体化合物は、例えば、制御添加によって、縮合反応中に加えられ得る。例えば、担体化合物は、核酸以外のポリマー(例えば、スペルミンまたはスペルミジン)であり得る。縮合を補助するために、ｐＨを調整することも可能である。

【0351】

送達ビヒクルの構成成分としてポリヌクレオチド／カチオン性脂質複合体を組み込む安定したポリヌクレオチド送達ビヒクルを生成するための方法が、例えば本明細書に援用される国際公開第９６／３７１９４号パンフレットに更に記載されており、この全ての内容が参照により本明細書に組み込まれる。リポソーム形成は、Felgner, P. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8:7413-7417, 1987；米国特許第４,８９７,３５５号明細書；米国特許第５,１７１,６７８号明細書；Bangham, et al. M. Mol. Biol. 23:238, 1965；Olson, et al. Biochim. Biophys. Acta 557:9, 1979；Szoka, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 75: 4194, 1978；Mayhew, et al. Biochim. Biophys. Acta 775:169, 1984；Kim, et al. Biochim. Biophys. Acta 728:339, 1983；およびFukunaga, et al. Endocrinol. 115:757, 1984に記載される例示的な方法の１つまたは複数の態様も含み得る。送達ビヒクルとして使用するのに適切なサイズの脂質集合体を調製するための一般的に使用される技術としては、超音波処理ならびに凍結融解および押し出しが挙げられる(例えば、Mayer, et al. Biochim. Biophys. Acta 858:161, 1986を参照)。一貫して小さく(５０～２００ｎｍ)、かつ比較的均一な集合体が望まれる場合、顕微溶液化(Microfluidization)を使用することができる(Mayhew, et al. Biochim. Biophys. Acta 775:169, 1984)。これらの方法は、ｉＲＮＡ剤の調製物をリポソームにパッケージングするために適用し易い。

【0352】

リポソームは、大きく２つに分類される。陽イオン性リポソームは、負に帯電された核酸分子と相互作用して安定な複合体を形成する正に帯電されたリポソームである。正に帯電された核酸／リポソーム複合体は、負に帯電された細胞表面に結合し、エンドソーム内に移行される。エンドソーム内の酸性ｐＨのために、リポソームが破れ、それらの内容物が細胞質内に放出される(Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985)。

【0353】

ｐＨ感受性であるか、または負に帯電されたリポソームは、核酸と複合体化するのではなく、むしろ核酸を捕捉する。核酸および脂質の両方は同様に帯電されるため、複合体形成ではなく反発が起こる。それにも係わらず、いくつかの核酸はこれらのリポソームの水性内部に取り込まれる。ｐＨ感受性リポソームは、チミジンキナーゼ遺伝子をコードする核酸を培養物中の細胞単層に送達するために使用されている。外来遺伝子の発現が、標的細胞内で検出されている(Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274)。

【0354】

リポソーム組成物のある１つの主要タイプは、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質を含む。例えば、中性リポソーム組成物は、ジミリストイルホスファチジルコリン(ＤＭＰＣ)またはジパルミトイルホスファチジルコリン(ＤＰＰＣ)から形成され得る。陰イオン性リポソーム組成物は、一般に、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成されるが、陰イオン性膜融合リポソームは、主としてジオレイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)から形成される。他のタイプのリポソーム組成物は、例えば、大豆ＰＣおよび卵ＰＣなどのホスファチジルコリン(ＰＣ)から形成される。他のタイプは、２つ以上のリン脂質、ホスファチジルコリンおよびコレステロールの混合物から形成される。

【0355】

リポソームを細胞中にインビトロおよびインビボで導入するための他の方法の例としては、米国特許第５,２８３,１８５号明細書；米国特許第５,１７１,６７８号明細書；国際公開第９４／００５６９号パンフレット；国際公開第９３／２４６４０号パンフレット；国際公開第９１／１６０２４号パンフレット；Felgner, J. Biol. Chem. 269:2550, 1994；Nabel, Proc. Natl. Acad. Sci. 90:11307, 1993；Nabel, Human Gene Ther. 3:649, 1992；Gershon, Biochem. 32:7143, 1993；およびStrauss EMBO J. 11:417, 1992が挙げられる。

【0356】

非イオン性リポソーム系、特に非イオン性界面活性剤およびコレステロールを含む系も試験されて、皮膚への薬物の送達におけるそれらの有用性が決定されている。Novasome(商標)Ｉ(ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル)およびＮｏｖａｓｏｍｅ(商標)ＩＩ(ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル)を含む非イオン性リポソーム製剤を使用して、シクロスポリン－Ａをマウス皮膚の真皮に送達した。結果はそのような非イオン性リポソーム系が皮膚の異なる層中へのシクロスポリン－Ａの堆積を促進するのに有効であることを示した(Hu et al. S.T.P.Pharma. Sci., 1994, 4(6) 466)。

【0357】

リポソームは、「立体的に安定化された」リポソームも含み、本明細書で使用されるこの用語は、１つまたは複数の特定の脂質を含むリポソームを指し、その特定の脂質は、リポソームに組み込まれた際、そのような特定の脂質を含まないリポソームと比較して、循環寿命が増長する。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームのベシクル形成脂質部分の一部が、(Ａ)モノシアロガングリオシドＧ_Ｍ１などの１つまたは複数の糖脂質を含むもの、または(Ｂ)ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)部分などの１つまたは複数の親水性ポリマーで誘導体化されているものである。任意の特定の理論に束縛されるものではないが、当技術分野では、少なくともガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはＰＥＧ－誘導体化脂質を含む立体的に安定化されたリポソームに関しては、これらの立体的に安定化されたリポソームの増強された循環半減期は、細網内皮系(ＲＥＳ)の細胞内への取り込みの低下に由来すると考えられている(Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42；Wu et al., Cancer Research, 1993, 53, 3765)。

【0358】

１つまたは複数の糖脂質を含む様々なリポソームが、当技術分野にて既知である。Papahadjopoulosら(Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64)は、リポソームの血中半減期を改善するモノシアロガングリオシドＧ_Ｍ１、硫酸ガラクトセレブロシドおよびホスファチジルイノシトールの能力を報告している。これらの知見は、Gabizonらにより詳説されている(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949)。米国特許第４,８３７,０２８号明細書および国際公開第８８／０４９２４号パンフレット(両方ともAllen et al.による)は、(１)スフィンゴミエリンおよび(２)ガングリオシドＧ_Ｍ１または硫酸ガラクトセレブロシドエステルを含むリポソームを開示している。米国特許第５,５４３,１５２号明細書(Webb et al.)は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示している。１,２－ｓｎ－ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、国際公開第９７／１３４９９号パンフレット(Lim et al)に開示されている。

【0359】

ある実施態様において、カチオン性リポソームが使用される。カチオン性リポソームには、細胞膜に融合することができるという利点がある。非カチオン性リポソームは、それほど効率的には細胞膜と融合できないが、インビボでマクロファージによって取り込まれ、ｉＲＮＡ剤をマクロファージに送達するのに使用され得る。

【0360】

リポソームの更なる利点としては、以下の点が挙げられる：天然のリン脂質から得られるリポソームは、生体適合性があり、かつ生分解可能であり；リポソームは、広範囲の水溶性薬剤および脂溶性薬剤を組み込むことができ；リポソームは、その内部の区画中に封入されたｉＲＮＡ剤を、代謝および分解から保護することができる(Rosoff, in "Pharmaceutical Dosage Forms," Lieberman, Rieger and Banker (Eds.)。リポソーム製剤の調製における重要な考慮事項は、脂質表面電荷、小胞サイズおよびリポソームの水溶性の容積である。

【0361】

正に帯電した合成カチオン性脂質である、Ｎ－[１－(２,３－ジオレイルオキシ)プロピル]－Ｎ,Ｎ,Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド(ＤＯＴＭＡ)を用いて、核酸と自発的に相互作用して、組織培養細胞の細胞膜の負に帯電した脂質と融合し、ｉＲＮＡ剤の送達をもたらすことが可能な脂質－核酸複合体を形成する小さなリポソームを形成することができる(例えば、Felgner, P. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8:7413-7417, 1987；およびＤＯＴＭＡおよびＤＮＡとのその使用の説明については米国特許第４,８９７,３５５号明細書を参照)。

【0362】

ＤＯＴＭＡアナログである、１,２－ビス(オレイルオキシ)－３－(トリメチルアンモニア)プロパン(ＤＯＴＡＰ)は、リン脂質と組み合わせて使用して、ＤＮＡ複合小胞を形成することができる。Lipofectin(商標)(Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md.)は、負に帯電したポリヌクレオチドと自発的に相互作用して、複合体を形成する正に帯電したＤＯＴＭＡリポソームを含む生体組織培養細胞中に高アニオン性の核酸を送達するための効果的な薬剤である。十分に正に帯電したリポソームが使用される場合、得られる複合体の正味電荷も正である。このように調製される正に帯電した複合体は、負に帯電した細胞表面に自発的に付着し、細胞膜と融合し、機能性核酸を、例えば、組織培養細胞中に効率的に送達する。別の市販のカチオン性脂質である、１,２－ビス(オレイルオキシ)－３,３－(トリメチルアンモニア)プロパン(「ＤＯＴＡＰ」)(Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana)は、オレオイル部分がエーテル結合ではなく、エステルによって結合された点でＤＯＴＭＡとは異なる。

【0363】

その他の報告されたカチオン性脂質化合物は、様々な官能基にコンジュゲートされたもの、例えば、２種類の脂質のうちの１つにコンジュゲートされたカルボキシスペルミンを包含し、また例えば５-カルボキシスペルミルグリシンジオクタオレオイルアミド(「ＤＯＧＳ」)(Transfectam(登録商標), Promega, Madison, Wisconsin)およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン ５-カルボキシスペルミル-アミド(「ＤＰＰＥＳ」)(例えば、米国特許第５,１７１,６７８号を参照されたい)などの化合物を包含する。

【0364】

別のカチオン性脂質コンジュゲートは、ＤＯＰＥと組み合わせてリポソームに製剤化されたコレステロールによる脂質の誘導体(「ＤＣ－Ｃｈｏｌ」)を含む(Gao, X. and Huang, L., Biochim. Biophys. Res. Commun. 179:280, 1991を参照)。ポリリジンをＤＯＰＥにコンジュゲートすることによって作製されるリポポリリジンは、血清の存在下におけるトランスフェクションに有効であると報告されている(Zhou, X. et al., Biochim. Biophys. Acta 1065:8, 1991)。特定の細胞株では、コンジュゲートされたカチオン性脂質を含有するこれらのリポソームは、ＤＯＴＭＡ含有組成物よりも低い毒性を示し、より効率的なトランスフェクションを提供するとされている。他の市販のカチオン性脂質製品としては、ＤＭＲＩＥおよびＤＭＲＩＥ－ＨＰ(Vical, La Jolla, California)およびリポフェクタミン(ＤＯＳＰＡ)(Life Technology, Inc., Gaithersburg, Maryland)が挙げられる。オリゴヌクレオチドの送達に好適な他のカチオン性脂質が、国際公開第９８／３９３５９号パンフレットおよび国際公開第９６／３７１９４号パンフレットに記載されている。

【0365】

リポソーム製剤は、局所投与に特に適しており、リポソームは、他の製剤に優るいくつかの利点を示す。このような利点としては、投与される薬剤の全身への高い吸収率に関連する副作用の低下、所望の標的における投与薬剤の蓄積の増加、およびｉＲＮＡ剤を皮膚に投与する能力が挙げられる。ある実施において、ｉＲＮＡ剤を表皮細胞に送達するために、また真皮組織、例えば、皮膚へのｉＲＮＡ剤の浸透を促進するためにもリポソームが使用される。例えば、リポソームは、局所的に適用され得る。リポソームとして製剤化される薬剤の皮膚への局所送達が報告されている(例えば、Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, vol. 2,405-410 and du Plessis et al., Antivirus Research, 18, 1992, 259-265；Mannino, R. J. and Fould-Fogerite, S., Biotechniques 6:682-690, 1988；Itani, T. et al. Gene 56:267-276. 1987；Nicolau, C. et al. Meth. Enz. 149:157-176, 1987；Straubinger, R. M. and Papahadjopoulos, D. Meth. Enz. 101：512-527, 1983；Wang, C. Y. and Huang, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851-7855, 1987を参照されたい)。

【0366】

非イオン性リポソーム系、特に、非イオン性界面活性剤およびコレステロールを含む系も、皮膚への薬剤の送達におけるそれらの有用性を決定するために試験されている。Ｎｏｖａｓｏｍｅ Ｉ(登録商標)(ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル)およびＮｏｖａｓｏｍｅ ＩＩ(登録商標)(ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル)を含む非イオン性リポソーム製剤が、マウス皮膚の真皮に薬剤を送達するのに使用された。ｉＲＮＡ剤を含むこのような製剤は、皮膚疾患を治療するのに有用である。

【0367】

ｉＲＮＡを含むリポソームは、高度な可変形体を製造できる。このような変形性は、リポソームが、リポソームの平均半径より小さい孔を透過するのを可能にし得る。例えば、トランスファーソームは、変形可能なリポソームの一種である。トランスファーソームは、表面縁の活性化因子、通常、界面活性剤を、標準的なリポソーム組成物に加えることによって作製され得る。ｉＲＮＡを含むトランスファーソームは、皮膚のケラチノサイトにｉＲＮＡを送達するために、例えば、皮下感染によって送達され得る。無傷の哺乳動物皮膚を通過するために、脂質小胞は、好適な経皮勾配の影響下で、５０ｎｍ未満の直径をそれぞれ有する一連の微細孔を通過しなければならない。更に、脂質特性のため、これらのトランスファーソームは、自己最適化(例えば、毛穴の形状に適応できる)、自己修復性であり得、多くの場合、破砕せずにそれらの標的に到達し、多くの場合、自己担持性(self-loading)であり得る。

【0368】

本発明に適した他の製剤が、ＷＯ２００８/０４２９７３にも記載されている。

【0369】

トランスファーソームは、リポソームの更なる別の一タイプであり、薬物送達ビヒクルとして、魅力的な候補物質である高度に変形可能な脂質凝集体である。トランスファーソームは、脂質小滴として記載することもでき、この脂質小滴は、高度に変形可能であるため、小滴よりも小さい孔内を容易に透過することができる。トランスファーソームは、それらが使用される環境に適合可能であり、例えば自己最適性(皮膚内の孔の形状に適応する)であり、自己修復性であり、断片化することなくそれらの標的に多く到達し、また多くの場合自己担持性である。トランスファーソームを作製するためには、通常は界面活性剤である表面縁の活性化因子を標準的なリポソーム組成物に加えることが可能である。トランスファーソームは、皮膚に血清アルブミンを送達するのに使用されている。トランスファーソーム仲介による血清アルブミンの送達は、血清アルブミンを含む溶液の皮下注射と同様に効果的であることが示されている。

【0370】

界面活性剤は、エマルション(マイクロエマルションを含む)およびリポソームなどの製剤に広い用途を見出している。天然および合成の両方の多数の異なるタイプの界面活性剤を分類およびランキングする最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス(ＨＬＢ)の使用によるものである。親水性基(「頭部」としても知られている)の性質は、製剤中に使用される異なる界面活性剤を類別する最も有用な手段を提供する(Rieger, in "Pharmaceutical Dosage Forms", Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285)。

【0371】

界面活性剤分子がイオン化されていない場合、この界面活性剤は非イオン性界面活性剤に分類される。非イオン性界面活性剤は、医薬および美容製品に広い用途を見出し、広範囲のｐＨ値にわたって使用可能である。一般に、それらのＨＬＢ値は、それらの構造に応じて２～約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤には、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、ショ糖エステルおよびエトキシル化エステルなどの非イオン性エステルが挙げられる。非イオン性アルカノールアミド、および脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコールおよびエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーなどのエーテルも、このクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤クラスの最も人気のあるメンバーである。

【0372】

界面活性剤分子が水中に溶解または分散した際に負電荷を保有する場合、この界面活性剤は陰イオン性に分類される。陰イオン性界面活性剤には、せっけんなどのカルボキシレート、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミド、アルキルスルフェートおよびエトキシル化アルキルスルフェートなどの硫酸エステル、アルキルベンゼンスルホネートなどのスルホネート、アシルイセチオネート、アシルタウレートおよびスルホスクシネートならびにホスフェートが挙げられる。陰イオン性界面活性剤類の最も重要なメンバーは、アルキルスルフェートおよびせっけんである。

【0373】

界面活性剤分子が水中に溶解または分散した際に正電荷を保有する場合、この界面活性剤は陽イオン性に分類される。陽イオン性界面活性剤には、第四級アンモニウム塩およびエトキシル化アミンが挙げられる。第四級アンモニウム塩は、最も使用されているこのクラスのメンバーである。

【0374】

界面活性剤分子が正または負電荷のいずれかを保有する能力を有する場合、この界面活性剤は両性に分類される。両性界面活性剤には、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ－アルキルベタインおよびホスファチドが挙げられる。

【0375】

薬剤製品、製剤およびエマルション中での界面活性剤の使用は、概説されている(Rieger, in "Pharmaceutical Dosage Forms", Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285)。

【0376】

本発明の方法に使用するためのｉＲＮＡは、ミセル製剤として提供され得る。「ミセル」とは、分子の全ての疎水性部分が内側を向いて、親水性部分を周囲の水相と接触させるように、両親媒性分子が球体構造で配置されている特定のタイプの分子集合体として本明細書において定義される。環境が疎水性である場合、逆の配置が存在する。

【0377】

経皮膜を介した送達に好適な混合ミセル製剤は、ｉＲＮＡの水溶液、アルカリ金属Ｃ_８～Ｃ_２２アルキル硫酸塩およびミセル形成化合物を混合することによって調製され得る。例示的なミセル形成化合物としては、レシチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の薬学的に許容され得る塩、グリコール酸、乳酸、カモミール抽出物、キュウリ抽出物、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、モノオレイン、モノオレエート、モノラウレート、ルリヂサ油、月見草油、メントール、トリヒドロキシオキソコラニルグリシンおよびその薬学的に許容され得る塩、グリセリン、ポリグリセリン、リジン、ポリリジン、トリオレイン、ポリオキシエチレンエーテルおよびその類似体、ポリドカノールアルキルエーテルおよびその類似体、ケノデオキシコール酸塩、デオキシコール酸塩およびそれらの混合物が挙げられる。ミセル形成化合物は、アルカリ金属アルキル硫酸塩の添加と同時にまたはその後に加えられてもよい。混合ミセルは、成分の実質的にあらゆる種類の混合により形成されるが、より小さいサイズのミセルを提供するためには激しく混合することで形成される。

【0378】

１つの方法において、ＲＮＡｉおよび少なくともアルカリ金属アルキル硫酸塩を含有する第１のミセル組成物が調製される。次に、第１のミセル組成物は、少なくとも３つのミセル形成化合物と混合されて、混合ミセル組成物が形成される。別の方法において、ミセル組成物は、ＲＮＡｉ、アルカリ金属アルキル硫酸塩およびミセル形成化合物の少なくとも１つを混合し、その後激しく混合しながら残りのミセル形成化合物を加えることにより調製される。

【0379】

フェノールまたはｍ－クレゾールが、混合ミセル組成物に加えられて、製剤を安定化し、細菌増殖から保護してもよい。あるいは、フェノールまたはｍ－クレゾールは、ミセル形成成分とともに加えられてもよい。グリセリンなどの等張剤も、混合ミセル組成物の形成後に加えられてもよい。

【0380】

スプレーとしてミセル製剤を送達するために、製剤をエアロゾルディスペンサーに入れることが可能であり、またディスペンサーに噴射剤が充填される。加圧下にある噴射剤は、ディスペンサー中で液体形態である。成分の比率は、水相および噴射剤相が１つになるように、即ち、１つの相が存在するように調整される。２つの相が存在する場合、例えば、定量弁によって、内容物の一部を投薬する前にディスペンサーを振とうする必要がある。医薬品の投薬用量は、微細なスプレー状で定量弁から噴射される。

【0381】

噴射剤は、水素含有クロロフルオロカーボン、水素含有フルオロカーボン、ジメチルエーテルおよびジエチルエーテルを含み得る。特定の実施態様において、ＨＦＡ １３４ａ(１,１,１,２テトラフルオロエタン)が使用されてもよい。

【0382】

必須成分の特定の濃度は、比較的単純な実験によって決定され得る。口腔を介した吸収では、注射または胃腸管を介した投与のための投与量の、例えば、少なくとも２倍または３倍に増加させることが望ましいことが多い。

【0383】

Ｂ．脂質粒子
本発明のｉＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡｉ剤は、脂質製剤中、例えばＬＮＰ中に完全に封入されてもよく、または他の核酸－脂質粒子を形成してもよい。

【0384】

本明細書で使用される用語「ＬＮＰ」は、安定な核酸－脂質粒子を指す。ＬＮＰは、通常、陽イオン性脂質、非陽イオン性脂質および粒子の凝集を防止する脂質(例えば、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート)を含む。ＬＮＰは、静脈内(ｉ.ｖ.)注射後の循環寿命が長く、かつ遠位部位(例えば、投与部位から物理的に分離された部位)に蓄積するため、全身適用に極めて有用である。ＬＮＰは「ｐＳＰＬＰ」を含み、ｐＳＰＬＰは、ＰＣＴ公開第国際公開第００／０３６８３号パンフレットに示されているように、封入された縮合剤－核酸複合体を含む。本発明の粒子は、典型的には、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、より典型的には約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、より典型的には約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、最も典型的には約７０ｎｍ～約９０ｎｍの平均粒径を有しており、かつ実質的に無毒である。加えて、核酸は、本発明の核酸－脂質粒子中に存在する場合、水性溶液中で、ヌクレアーゼによる分解に耐性である。核酸－脂質粒子、およびそれらの調製方法は、例えば米国特許第５,９７６,５６７号明細書；米国特許第５,９８１,５０１号明細書；米国特許第６,５３４,４８４号明細書；米国特許第６,５８６,４１０号明細書；米国特許第６,８１５,４３２号明細書；米国特許出願公開第２０１０／０３２４１２０号明細書およびＰＣＴ公開国際公開第９６／４０９６４号パンフレットに開示されている。

【0385】

一実施態様において、脂質対薬物の比(質量／質量比)(例えば、脂質対ｄｓＲＮＡの比)は、約１：１～約５０：１、約１：１～約２５：１、約３：１～約１５：１、約４：１～約１０：１、約５：１～約９：１または約６：１～約９：１の範囲内であろう。上記の範囲の中間の範囲も、本発明の一部であるものと考えられる。

【0386】

陽イオン性脂質は、例えば、Ｎ,Ｎ－ジオレイル－Ｎ,Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド(ＤＯＤＡＣ)、Ｎ,Ｎ－ジステアリル－Ｎ,Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド(ＤＤＡＢ)、Ｎ－(Ｉ－(２,３－ジオレイルオキシ)プロピル)－Ｎ,Ｎ,Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド(ＤＯＴＡＰ)、Ｎ－(Ｉ－(２,３－ジオレイルオキシ)プロピル)－Ｎ,Ｎ,Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド(ＤＯＴＭＡ)、Ｎ,Ｎ－ジメチル－２,３－ジオレイルオキシ)プロピルアミン(ＤＯＤＭＡ)、１,２－ジリノレイルオキシ－Ｎ,Ｎ－ジメチルアミノプロパン(ＤＬｉｎＤＭＡ)、１,２－ジリノレニルオキシ－Ｎ,Ｎ－ジメチルアミノプロパン(ＤＬｅｎＤＭＡ)、１,２－ジリノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン(ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ)、１,２－ジリノレイオキシ－３－(ジメチルアミノ)アセトキシプロパン(ＤＬｉｎ－ＤＡＣ)、１,２－ジリノレイオキシ－３－モルホリノプロパン(ＤＬｉｎ－ＭＡ)、１,２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン(ＤＬｉｎＤＡＰ)、１,２－ジリノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン(ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ)、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン(ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ)、１,２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩(ＤＬｉｎ－ＴＭＡ.Ｃｌ)、１,２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩(ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃｌ)、１,２－ジリノレイルオキシ－３－(Ｎ－メチルピペラジノ)プロパン(ＤＬｉｎ－ＭＰＺ)または３－(Ｎ,Ｎ－ジリノレイルアミノ)－１,２－プロパンジオール(ＤＬｉｎＡＰ)、３－(Ｎ,Ｎ－ジオレイルアミノ)－１,２－プロパンジオ(ＤＯＡＰ)、１,２－ジリノレイルオキソ－３－(２－Ｎ,Ｎ－ジメチルアミノ)エトキシプロパン(ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ)、１,２－ジリノレニルオキシ－Ｎ,Ｎ－ジメチルアミノプロパン(ＤＬｉｎＤＭＡ)、２,２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１,３］－ジオキソラン(ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ)またはその類似体、(３ａＲ,５ｓ,６ａＳ)－Ｎ,Ｎ－ジメチル－２,２－ジ((９Ｚ,１２Ｚ)－オクタデカ－９,１２－ジエニル)テトラヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ［ｄ］［１,３］ジオキソール－５－アミン(ＡＬＮ１００)、(６Ｚ,９Ｚ,２８Ｚ,３１Ｚ)－ヘプタトリアコンタ－６,９,２８,３１－テトラエン－１９－イル４－(ジメチルアミノ)ブタノエート(ＭＣ３)、１,１'－(２－(４－(２－((２－(ビス(２－ヒドロキシドデシル)アミノ)エチル)(２－ヒドロキシドデシル)アミノ)エチル)ピペラジン－１－イル)エチルアザネジイル)ジドデカン－２－オール(Ｔｅｃｈ Ｇ１)またはこれらの混合物であってもよい。陽イオン性脂質は、粒子中に存在する全脂質の約２０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％、または約４０ｍｏｌ％からなり得る。

【0387】

ある実施態様において、化合物２,２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１,３］－ジオキソランが、脂質－ｓｉＲＮＡナノ粒子を調製するのに使用され得る。

【0388】

ある実施態様において、脂質－ｓｉＲＮＡ粒子は、４０％の２,２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１,３］－ジオキソラン：１０％のＤＳＰＣ：４０％のコレステロール：１０％のＰＥＧ－Ｃ－ＤＯＭＧ(モルパーセント)を含み、６３.０±２０ｎｍの粒度および０.０２７ｓｉＲＮＡ／脂質比を有する。

【0389】

イオン性／非陽イオン性脂質は、非限定的にジステアロイルホスファチジルコリン(ＤＳＰＣ)、ジオレイルホスファチジルコリン(ＤＯＰＣ)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(ＤＰＰＣ)、ジオレイルホスファチジルグリセロール(ＤＯＰＧ)、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(ＤＰＰＧ)、ジオレイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(ＰＯＰＣ)、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン(ＰＯＰＥ)、ジオレイル－ホスファチジルエタノールアミン４－(Ｎ－マレイミドメチル)－シクロヘキサン－１－カルボキシレート(ＤＯＰＥ－ｍａｌ)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＰＰＥ)、ジミリストイルホスホエタノールアミン(ＤＭＰＥ)、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン(ＤＳＰＥ)、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－トランスＰＥ、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＳＯＰＥ)、コレステロールまたはこれらの混合物を含む陰イオン性脂質または中性脂質であり得る。非陽イオン性脂質は、コレステロールが含まれる場合、粒子中に存在する全脂質の約５ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％、または約５８ｍｏｌ％で存在することができる。

【0390】

粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質は、例えば、非限定的にＰＥＧ－ジアシルグリセロール(ＤＡＧ)、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル(ＤＡＡ)、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド(Ｃｅｒ)またはそれらの混合物を含むポリエチレングリコール(ＰＥＧ)－脂質であり得る。ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、例えば、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル(Ｃｉ_２)、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル(Ｃｉ_４)、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル(Ｃｉ_６)またはＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル(Ｃｉ_８)とすることができる。粒子の凝集を防止するコンジュゲート脂質は、粒子中に存在する全脂質の０ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％または２ｍｏｌ％で存在することができる。

【0391】

ある実施態様において、核酸－脂質粒子は更に、粒子中に存在する全脂質の例えば約１０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％または約４８ｍｏｌ％のコレステロールを含む。

【0392】

一実施態様において、リピドイドＮＤ９８・４ＨＣｌ(ＭＷ １４８７)(参照；２００８年３月２６日に出願された米国特許出願第１２／０５６,２３０号明細書は、参照により本明細書に組み込まれる)、コレステロール(Sigma-Aldrich)およびＰＥＧ－Ｃｅｒａｍｉｄｅ Ｃ１６(Avanti Polar Lipids)が、脂質－ｄｓＲＮＡナノ粒子(即ち、ＬＮＰ０１粒子)を調製するのに使用され得る。エタノール中の各原液は、以下のとおりに調製され得る：ＮＤ９８、１３３ｍｇ／ｍｌ；コレステロール、２５ｍｇ／ｍｌ、ＰＥＧ－Ｃｅｒａｍｉｄｅ Ｃ１６、１００ｍｇ／ｍｌ。次に、ＮＤ９８、コレステロールおよびＰＥＧ－Ｃｅｒａｍｉｄｅ Ｃ１６原液は、例えば、４２：４８：１０のモル比で組み合わせられ得る。組み合わされた脂質溶液は、エタノールの終濃度が約３５～４５％であり、酢酸ナトリウムの終濃度が約１００～３００ｍＭとなるようにｄｓＲＮＡ水溶液(例えば、酢酸ナトリウム中(ｐＨ５))と混合され得る。脂質－ｄｓＲＮＡナノ粒子は、通常、混合時に自然に形成される。所望の粒度分布に応じて、得られるナノ粒子混合物は、例えば、Ｌｉｐｅｘ押出機(Northern Lipids，Inc)などのサーモバレル押出機(thermobarrel extruder)を用いて、ポリカーボネート膜(例えば、１００ｎｍのせん断)を通して押し出され得る。場合によっては、押し出し工程を省略できる。エタノール除去および同時の緩衝液交換は、例えば、透析または接線流ろ過によって達成され得る。緩衝液は、例えば、約ｐＨ７、例えば、約ｐＨ６.９、約ｐＨ７.０、約ｐＨ７.１、約ｐＨ７.２、約ｐＨ７.３または約ｐＨ７.４のリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)と交換され得る。

【0393】

【化20】

【0394】

ＬＮＰ０１製剤が、例えば、参照により本明細書に援用される国際出願公開番号国際公開第２００８／０４２９７３号パンフレットに記載されている。

【0395】

更なる脂質－ｄｓＲＮＡ製剤の例が、表１に記載される。

【表1-1】

【表1-2】

ＤＳＰＣ：ジステアロイルホスファチジルコリン
ＤＰＰＣ：ジパルミトイルホスファチジルコリン
ＰＥＧ－ＤＭＧ：ＰＥＧ－ジジミリストイル(ｄｉｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ)グリセロール(Ｃ１４－ＰＥＧ、またはＰＥＧ－Ｃ１４)(２０００の平均分子量を有するＰＥＧ)
ＰＥＧ－ＤＳＧ：ＰＥＧ－ジスチリルグリセロール(Ｃ１８－ＰＥＧまたはＰＥＧ－Ｃ１８)(２０００の平均分子量を有するＰＥＧ)
ＰＥＧ－ｃＤＭＡ：ＰＥＧ－カルバモイル－１,２－ジミリスチルオキシプロピルアミン(２０００の平均分子量を有するＰＥＧ)
ＳＮＡＬＰ(ｌ,２－ジリノレニルオキシ－Ｎ,Ｎ－ジメチルアミノプロパン(ＤＬｉｎＤＭＡ))を含む製剤が、２００９年４月１５日に出願された国際公開第２００９／１２７０６０号パンフレットに記載されており、これを参照により本明細書に組み込まれる。

【0396】

ＸＴＣを含む製剤は、例えば、２０１０年１月２９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２２６１４号明細書に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。

【0397】

ＭＣ３を含む製剤が、例えば、２０１０年６月１０日に出願された米国特許出願公開第２０１０／０３２４１２０号明細書に記載されており、この全ての内容が参照により本明細書に組み込まれる。

【0398】

ＡＬＮＹ－１００を含む製剤は、例えば、２００９年１１月１０日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０９／６３９３３号明細書に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。

【0399】

Ｃ１２-２００を含む製剤は、ＷＯ２０１０／１２９７０９に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。

【0400】

経口投与用の組成物および製剤には、散剤または顆粒、微粒子、ナノ粒子、縣濁剤または水もしくは非水性媒体中の液剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、薬袋、錠剤または小型錠剤が挙げられる。増粘剤、風味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤が、所望され得る。ある実施態様では、経口製剤は、本発明を特徴付けるｄｓＲＮＡが、１種または複数種の透過促進剤界面活性剤およびキレート剤とともに投与されるものである。好適な界面活性剤には、脂肪酸もしくはエステルまたはその塩、胆汁酸および／またはその塩が挙げられる。好適な胆汁酸／塩には、ケノデオキシコール酸(ＣＤＣＡ)およびウルソデオキシケノデオキシコール酸(ＵＤＣＡ)、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ－２４,２５－ジヒドロ－フシジン酸ナトリウムおよびグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが挙げられる。好適な脂肪酸には、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１－モノカプレート、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、モノグリセリド、ジグリセリドまたはこれらの薬学的に許容され得る塩(例えば、ナトリウム)が挙げられる。ある実施態様において、浸透促進剤の組み合わせ、例えば胆汁酸／塩と組み合わせた脂肪酸／塩が使用される。例示的な１つの組み合わせは、ラウリン酸、カプリン酸およびＵＤＣＡのナトリウム塩である。更なる浸透促進剤には、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン－２０－セチルエーテルが挙げられる。本発明を特徴付けるＤｓＲＮＡは、噴霧乾燥粒子、またはマイクロもしくはナノ粒子を形成するために錯体化されたものを含む顆粒形態で経口的に送達され得る。ｄｓＲＮＡ錯体化剤には、ポリ－アミノ酸；ポリイミン；ポリアクリレート；ポリアルキルアクリレート、ポリオキセタン、ポリアルキルシアノアクリレート；陽イオン化ゼラチン、アルブミン、スターチ、アクリレート、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)およびスターチ；ポリアルキルシアノアクリレート；ＤＥＡＥ－誘導体化ポリイミン、プルラン、セルロースおよびスターチが挙げられる。好適な錯体化剤には、キトサン、Ｎ－トリメチルキトサン、ポリ－Ｌ－リシン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ(ＴＤＡＥ)、ポリアミノスチレン(例えば、ｐ－アミノ)、ポリ(メチルシアノアクリレート)、ポリ(エチルシアノアクリレート)、ポリ(ブチルシアノアクリレート)、ポリ(イソブチルシアノアクリレート)、ポリ(イソヘキシルシアノアクリレート)、ＤＥＡＥ－メタクリレート、ＤＥＡＥ－ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ－アクリルアミド、ＤＥＡＥ－アルブミンおよびＤＥＡＥ－デキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ(Ｄ,Ｌ－乳酸)、ポリ(ＤＬ－乳酸－コ－グリコール酸(ＰＬＧＡ)、アルギン酸塩およびポリエチレングリコール(ＰＥＧ)が挙げられる。ｄｓＲＮＡ用の経口製剤およびそれらの調製物は、その各々が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６,８８７,９０６号明細書、米国特許出願公開第２００３/００２７７８０号明細書および米国特許第６,７４７,０１４号明細書に記載されている。

【0401】

非経口、実質内(脳内へ)、くも膜下腔内、脳室内または肝内投与用の組成物および製剤には、無菌水性溶液を挙げることができ、その無菌水性溶液は、緩衝液、希釈剤ならびに他の好適な添加剤、例えば、これに限定しないが浸透促進剤、担体化合物および他の薬学的に許容され得る担体または賦形剤などを含み得る。

【0402】

本発明の医薬組成物は、非限定的に、液剤、乳剤およびリポソーム含有製剤を含む。これらの組成物は、非限定的に、予め形成された液剤、自己乳化型固体および自己乳化型半固体を含む多様な構成成分から生成され得る。製剤は、肝癌腫などの肝臓疾患を治療する際、肝臓を標的とするものを含む。

【0403】

単位剤形にて扱い易く存在し得る本発明の医薬製剤は、医薬産業にて周知の従来の技術に従って調製することができる。そのような技術は、活性成分を医薬担体または賦形剤と混合する工程を含む。一般に、製剤は、活性成分を液体担体または微粉化固体担体または両方と、均一かつ十分に混合した後、必要であれば、その生成物を成形して製造される。

【0404】

本発明の組成物は、非限定的に、錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、液体シロップ剤、ソフトゲル剤、坐薬および浣腸などの多数の可能な剤形のいずれかに処方され得る。本発明の組成物は、水性、非水性または混合媒体中の懸濁液としても処方され得る。水性懸濁液は、更に、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキストランを含む懸濁液の粘度を増大させる物質を含んでもよい。懸濁液は、安定剤も含み得る。

【0405】

Ｃ．追加の製剤
ｉ．エマルション
本発明のｉＲＮＡは、エマルションとして調製され、製剤化され得る。エマルションは、一般的に、１つの液体が、通常、直径が０.１μｍを超える液滴の形態の別の液体中に分散された不均一系である(例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY；Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199；Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245；Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335；Higuchi et al., in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301)。エマルションは、多くの場合、互いに十分に混合され、かつ分散された２つの非混和性液体相を含む二層系である。一般に、エマルションは、油中水(ｗ／ｏ)または水中油(ｏ／ｗ)の種類のいずれかであり得る。水性相が微小液滴として塊の油相中に微細に分割されおよび分散された場合、得られた組成物は、油中水(ｗ／ｏ)エマルションと呼ばれる。あるいは、油相が微小液滴として、大量の水性相中に微細に分割され、かつ分散された場合、得られる組成物は、水中油(ｏ／ｗ)エマルションと呼ばれる。エマルションは、分散相および活性薬物に加えて追加の構成成分を含むことができ、その構成成分は、水性相、油相中の溶液として、またはそれ自体が別個の相として存在し得る。必要に応じて、エマルション中に乳化剤、安定剤、染料および抗酸化剤などの医薬賦形剤も存在し得る。医薬エマルションは、例えば、油中水中油型(ｏ／ｗ／ｏ)および水中油中水型(ｗ／ｏ／ｗ)エマルションの場合など、３つ以上の相からなる多層エマルションも可能で有る。そのような複合製剤は、多くの場合、単純な二成分エマルションが提供しない所定の利点を提供する。ｏ／ｗエマルションの個々の油小滴が、小さい水小滴を囲い込む多層エマルションは、ｗ／ｏ／ｗエマルションを構成する。同様に、油の連続相中で安定化された水の小球中に囲い込まれた油小滴の系は、ｏ／ｗ／ｏエマルションを提供する。

【0406】

エマルションは、熱力学的安定性を、殆ど有さないか、または全く有さないことを特徴付とする。多くの場合、エマルションの分散または不連続相は、外部または連続相中に良好に分散され、乳化剤または製剤の粘度を用いてこの形態に維持される。エマルション相のいずれかは、エマルション型軟膏ベースおよびクリームの場合のように半固体または固体であり得る。エマルションを安定化させる他の手段には、エマルションのいずれかの相に組み込まれ得る乳化剤の使用が含まれる。乳化剤は、合成界面活性剤、天然乳化剤、吸収基剤および微細に分散した固体の４つのカテゴリーに大きく分類され得る(例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY；Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199を参照)。

【0407】

界面活性剤としても知られている合成界面活性剤は、エマルションの製剤化に広範な適用性が見出されており、文献に概説されている(例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY；Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285；Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1, p. 199)。界面活性剤は、通常、両親媒性であり、親水性部分および疎水性部分を含む。界面活性剤の疎水性に対する親水性の比率は、親水性／親油性バランス(ＨＬＢ)と言われており、製剤調製の際の界面活性剤の分類および選択の際の貴重な手段である。界面活性剤は、親水性基の性質に基づいて、異なる種類、即ち、非イオン性、アニオン性、カチオン性および両性に分類され得る(例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285)。

【0408】

エマルション製剤中に使用される天然に存在する乳化剤には、ラノリン、蜜蝋、ホスファチド、レシチンおよびアカシアが挙げられる。吸収性基材は、無水ラノリンおよび親水性ワセリンなどのように、水を取り込んでｗ／ｏエマルションを形成するが、それらの半固体稠度を依然として維持する親水性特性を有している。微粉化固体は、特に、界面活性剤との組み合わせにおいて、また粘稠な製剤において、良好な乳化剤として使用される。これらには、極性無機固体(例えば、重金属水酸化物など)、非膨潤粘土(例えば、ベントナイト、アタパルジャイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド状ケイ酸アルミニウムおよびコロイド状ケイ酸アルミニウムマグネシウムなど)、顔料および非極性固体(例えば、炭素またはトリステアリン酸グリセリルなど)が挙げられる。

【0409】

非常に多様な非乳化材料もエマルション製剤中に含まれ、エマルションの特性に寄与する。それらには、脂肪、油、蝋、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、湿潤剤、親水性コロイド、保存剤および抗酸化剤が挙げられる(Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335；Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199)。

【0410】

親水性コロイドまたは親水コロイドには、多糖(例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、カラゲナン、グアーガム、カラヤガムおよびトラガカント)などの天然に存在するゴムおよび合成ポリマー、セルロース誘導体(例えば、カルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース)および合成ポリマー(例えば、カルボマー、セルロースエーテル、およびカルボキシビニルポリマー)が挙げられる。これらは、水中に分散するか、または水中で膨潤して、分散相の小滴の周囲に強力な界面フィルムを形成することにより、また、外部相の粘度を増大させることにより、エマルションを安定化するコロイド溶液を形成する。

【0411】

エマルションは、多くの場合、微生物の増殖を容易に支持し得る炭水化物、タンパク質、ステロールおよびホスファチドなどの多数の成分を含むため、これらの製剤は、多くの場合、保存剤を組み込んでいる。製剤に含まれる、通常使用される保存剤には、メチルパラベン、プロピルパラベン、第四級アンモニウム塩、塩化ベンズアルコニウム、ｐ－ヒドロキシ安息香酸のエステルおよびホウ酸が挙げられる。抗酸化剤も、通常、エマルション製剤に加えて、製剤の変質を防止する。使用される抗酸化剤は、トコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンなどのフリーラジカルスカベンジャー、またはアスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウムなどの還元剤、ならびにクエン酸、酒石酸およびレシチンなどの抗酸化剤協作剤であり得る。

【0412】

皮膚、経口および非経口経路を介したエマルション製剤の適用ならびにそれらの製造方法は、文献に概説されている(例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY；Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199)。経口送達用のエマルション製剤は、製剤化の容易性、吸収および生物学的利用能という有効性を理由として、非常に広範に使用されている(例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY；Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245；Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199)。鉱油基剤の緩下剤、油溶性ビタミンおよび高脂肪栄養製剤が、ｏ／ｗ型エマルションとして一般的に経口投与されている材料に含まれる。

【0413】

ｉｉ．マイクロエマルション
本発明の一実施態様において、ｉＲＮＡは、マイクロエマルションとして製剤化される。マイクロエマルションは、単一の光学的に等方性で、かつ熱力学的に安定した液体溶液である、水、油および両親媒性物質の系として定義され得る(例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY；Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245を参照)。通常、マイクロエマルションは、最初に油を水性界面活性剤溶液中に分散させた後、十分な量の第四の構成成分、一般に中間鎖長のアルコールを加えて透明な系を形成することにより調製される。従って、マイクロエマルションは、表面活性分子の界面フィルムにより、安定化されている２つの非混和性液体からなる熱力学的に安定な等方性の透明な分散物として記載されている(Leung and Shah, in: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185-215)。マイクロエマルションは、通常、油、水、界面活性剤、補助界面活性剤および電解質を含む３～５つの構成成分の組み合わせを用いて調製される。マイクロエマルションが油中水(ｗ／ｏ)タイプまたは水中油(ｏ／ｗ)タイプのいずれのものであるかは、使用される油および界面活性剤の特性と、界面活性剤分子の極性頭部および炭化水素尾部の構造および幾何学的充填(geometric packing)に依って変化する(Schott, in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 271)。

【0414】

状態図を用いる現象論的手法が広範に研究されており、マイクロエマルションを製剤化する方法についての広範な知識を当業者に提供している(例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 33を参照)。従来のエマルションと比較して、マイクロエマルションは、自発的に形成する熱力学的に安定な小滴の製剤中で水不溶性薬物を可溶化する利点を提供する。

【0415】

マイクロエマルションの調製に使用される界面活性剤には、単独でまたは補助界面活性剤との組み合わせで、非限定的に、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、モノラウリン酸テトラグリセロール(ＭＬ３１０)、モノオレイン酸テトラグリセロール(ＭＯ３１０)、モノオレイン酸ヘキサグリセロール(ＰＯ３１０)、ペンタオレイン酸ヘキサグリセロール(ＰＯ５００)、モノカプリン酸デカグリセロール(ＭＣＡ７５０)、モノオレイン酸デカグリセロール(ＭＯ７５０)、セスキオレイン酸デカグリセロール(ＳＯ７５０)、デカオレイン酸デカグリセロール(ＤＡＯ７５０)が挙げられる。通常、エタノール、１－プロパノールおよび１－ブタノールなどの短鎖アルコールである補助界面活性剤は、界面活性剤フィルム中に浸透し、その結果、界面活性剤分子間に生成された空隙空間によって不規則フィルムを形成することにより、界面流動性を増大させる役割を果たす。しかし、マイクロエマルションは、補助界面活性剤を使用することなく調製されることができ、アルコールフリー自己乳化型マイクロエマルション系は、当技術分野にて既知である。水性相は、典型的には、非限定的に、水、薬物の水性溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコールおよびエチレングリコールの誘導体とすることができる。油相は、非限定的に、Ｃａｐｔｅｘ ３００、Ｃａｐｔｅｘ ３５５、Ｃａｐｍｕｌ ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖(Ｃ８～Ｃ１２)モノ、ジおよびトリ－グリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８～Ｃ１０グリセリド、植物油およびシリコーン油などの材料を含むことができる。

【0416】

マイクロエマルションは、薬物可溶化および薬物吸収向上の観点から特に興味深い。脂質ベースのマイクロエマルション(ｏ／ｗおよびｗ／ｏの両方)は、ペプチドを含む薬物の経口バイオアベイラビリティを向上させるために提案されている(例えば、米国特許第６,１９１,１０５号明細書、米国特許第７,０６３,８６０号明細書、米国特許第７,０７０,８０２号明細書、米国特許第７,１５７,０９９号明細書、Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390；Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205を参照されたい)。マイクロエマルションは、薬物可溶化の改善、酵素加水分解からの薬物の保護、界面活性剤誘導による膜流動性および透過性の変更に起因する薬物吸収増強の可能性、調製の容易性、固体剤形以上の経口投与の容易性、臨床的効果の改善および毒性低下という利点を提供する(例えば、米国特許第６,１９１,１０５号明細書；米国特許第７,０６３,８６０号明細書；米国特許第７,０７０,８０２号明細書；米国特許第７,１５７,０９９号明細書；Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385；Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-14を参照されたい)。多くの場合、マイクロエマルションは、周囲温度にて、マイクロエマルションの構成成分が一緒にされた際に自発的に形成され得る。このことは、易熱性薬物、ペプチドまたはｉＲＮＡを処方する際に、特に有利であり得る。マイクロエマルションは、美容および医薬用途の両方において活性構成成分の経費送達にも有効である。本発明のマイクロエマルション組成物および製剤は、胃腸管からのｉＲＮＡおよび核酸の全身吸収の増大ならびにｉＲＮＡおよび核酸の局部細胞取り込みの改善を促進することが期待される。

【0417】

本発明のマイクロエマルションは、モノステアリン酸ソルビタン(Grill(登録商標) 3)、ラブラソール(登録商標)および透過促進剤などの追加の構成成分および添加剤を含んで、製剤の特性を改善し、かつ本発明のｉＲＮＡおよび核酸の吸収を向上させ得る。本発明のマイクロエマルション中で使用される浸透促進剤は、５つの広範囲のカテゴリーの１つに属するものとして分類され得る－界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤および非キレート化非界面活性剤(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92)。これらのクラスの各々は、上記に概説されている。

【0418】

ｉｉｉ．微粒子
本発明のｉＲＮＡは、粒子、例えば、微粒子に組み込まれてもよい。微粒子は、噴霧乾燥によって生成され得るが、凍結乾燥、蒸発、流体床乾燥、真空乾燥またはこれらの技術の組み合わせを含む他の方法によって生成されてもよい。

【0419】

ｉｖ．浸透促進剤
一実施態様において、本発明は、動物の皮膚への、核酸、特にｉＲＮＡの効率的な送達を行うために様々な浸透促進剤を用いる。殆どの薬剤は、イオン化および非イオン化の両方の形態で溶液中に存在する。しかし、通常、脂溶性または親油性の薬剤のみが、細胞膜を容易に通過する。通過される膜が、浸透促進剤で処理されている場合、非親油性薬剤でも細胞膜を通過できることが判っている。浸透促進剤は、細胞膜を通過する非親油性薬剤の拡散の補助に加えて、親油性薬剤の浸透性も向上させる。

【0420】

浸透促進剤は、即ち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤および非キレート性の非界面活性剤の５つの大きいカテゴリーのうちの１つに属するものとして分類され得る(例えば、Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002；Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92を参照)。そのような化合物は、当分野において周知である。

【0421】

ｖ．担体
本発明の所定の組成物は、製剤中に担体化合物も組み込んでいる。本明細書で使用される「担体化合物」または「担体」とは、核酸またはその類似体を指すことができ、これは、不活性(即ち、生物学的活性自体を有さない)であるが、生物学的活性を有する核酸のバイオアベイラビリティを低下させるインビボのプロセスにより、例えば、生物学的に活性な核酸を分解すること、または循環血からの核酸除去を促進することにより、核酸として認識されるものである。核酸および担体化合物の共投与は、通常、過剰量の後者の物質を用いる共投与により、おそらくは共通の受容体に対する担体化合物と核酸との競合に起因して、肝臓、腎臓または他の循環外リザーバ(extracirculatory reservoir)中で回収される核酸の量が、実質的に低下し得る。例えば、肝組織内での部分的なホスホロチオエートの回収は、それがポリイノシン酸、デキストラン硫酸塩、ポリシチジル酸または４－アセトアミド－４'イソチオシアノ－スチルベン－２,２'－ジスルホン酸と共投与された際、低下され得る(Miyao et al., DsRNA Res.Dev., 1995,5,115-121;Takakura et al., DsRNA & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183)。

【0422】

ｖｉ．賦形剤
担体化合物とは対照的に、「医薬担体」または「賦形剤」は、動物に１つまたは複数の核酸を送達するための薬学的に許容され得る溶媒、懸濁剤、または任意の他の薬理学的に不活性なビヒクルである。賦形剤は、液体または固体とすることができ、計画された投与方法を考慮に入れて、核酸および医薬組成物の他の所定の構成成分と組み合わされた際に、目的とする嵩や稠度などを提供するように選択される。典型的な医薬担体には、非限定的に、結合剤(例えば、α化トウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど)；充填剤(例えば、乳糖および他の糖、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレートまたはリン酸水素カルシウムなど)；滑沢剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアリン酸塩、水素化植物油、トウモロコシ澱粉、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど)；錠剤崩壊剤(例えば、澱粉、澱粉グリコール酸ナトリウムなど)；および湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど)が挙げられる。

【0423】

核酸と有害な反応をしない、非－非経口投与に薬学的に許容され得る好適な有機または無機賦形剤も、本発明の組成物の処方に使用され得る。薬学的に許容され得る好適な担体には、非限定的に、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。

【0424】

核酸の局所投与用の製剤には、アルコールなどの通常の溶媒中の無菌および非無菌水性溶液、非水性溶液、または液体もしくは固体油ベース中の核酸溶液を挙げることができる。溶液は、緩衝剤、希釈剤および他の好適な添加剤も含み得る。核酸と有害な反応をしない、非－非経口投与に薬学的に許容され得る好適な有機または無機賦形剤を使用し得る。

【0425】

薬学的に許容され得る好適な賦形剤には、非限定的に、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。

【0426】

ｖｉｉ．他の構成成分
本発明の組成物は更に、医薬組成物中に従来見出される他の補助構成成分も、当技術分野にて確立されたそれらの使用レベルで含有し得る。それ故、例えば、組成物は、例えば、鎮痒薬、収斂薬、局所麻酔薬もしくは抗炎症薬剤など、更なる適合可能な医薬的に活性な材料を含有することができ、または染料、風味剤、保存剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤および安定剤などの本発明の組成物の様々な剤形を物理的に処方するのに有用な更なる材料を含有することができる。しかし、それらの材料は、加えられた際に、本発明の組成物の構成成分の生物学的活性を必要以上に妨害するべきではない。製剤は滅菌されてもよく、また所望により、製剤の核酸と有害な相互作用をしない補助剤、例えば滑沢剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝液、着色料、調味料および芳香性物質などと混合される。

【0427】

水性懸濁液は、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランを含む、懸濁液の粘度を増大させる物質を含み得る。懸濁液は、安定剤も含み得る。

【0428】

ある実施態様において、本発明に関する医薬組成物は、(ａ)１つまたは複数のｉＲＮＡと、(ｂ)非ｉＲＮＡメカニズムによって機能し、ＫＨＫ関連疾患を治療するのに有用な１つまたは複数の剤とを含む。

【0429】

このような化合物の毒性および治療効果は、例えば、ＬＤ_５０(個体群の５０％の致死量)およびＥＤ_５０(個体群の５０％に治療に有効な用量)を決定するための、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定され得る。毒性作用と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、ＬＤ_５０／ＥＤ_５０比として表され得る。高い治療指数を示す化合物が好ましい。

【0430】

細胞培養アッセイおよび動物試験から得られるデータは、ヒトに使用するためのある範囲の投与量を製剤化するのに使用され得る。本発明における本明細書に取り上げられる組成物の投与量は、一般に、殆ど、または全く毒性を伴わずにＥＤ_５０を含む血中濃度の範囲内である。投与量は、用いられる剤形および用いられる投与経路に応じて、この範囲内で変化し得る。本発明に関する方法に使用される任意の化合物では、治療に有効な用量は、細胞培養アッセイにより最初に推測され得る。用量は、細胞培養物中で測定して、ＩＣ_５０(即ち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度)を含む、化合物の、または適切な場合には、標的配列のポリペプチド産物の循環血漿濃度範囲を動物モデル内で達成する(例えば、ポリペプチド濃度の低下を達成する)ように処方され得る。そのような情報を使用して、ヒトでの有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。

【0431】

上記に述べたそれらの投与に加えて、本発明を特徴付けるｉＲＮＡは、ＫＨＫ発現により仲介される病態形成過程の治療に有効な他の既知の薬剤と組み合わせて投与されてもよい。いずれの場合でも、投与する医師は、当技術分野にて既知のまたは本明細書に記載される標準的な有効性の基準を使用して観察された結果に基づいて、ｉＲＮＡの量および投与時間を調整することができる。

【0432】

ＶＩ．ＫＨＫ発現を阻害するための方法
本発明は、細胞内のＫＨＫ遺伝子の発現を阻害する方法も提供する。この方法は、細胞を、細胞内のＫＨＫの発現を阻害するのに有効な量でＲＮＡｉ剤、例えば二本鎖ＲＮＡｉ剤と接触させて、これにより細胞内のＫＨＫの発現を阻害することを含む。

【0433】

細胞とｉＲＮＡ、例えば二本鎖ＲＮＡｉ剤との接触は、インビトロまたはインビボで行われ得る。インビボで細胞をｉＲＮＡと接触させることには、細胞または細胞群を、対象、例えばヒトの対象において、ｉＲＮＡと接触させることが含まれる。細胞を接触させるインビトロおよびインビボ方法の組み合わせもまた可能である。細胞との接触は、上記の通りに、間接的または直接的であってもよい。更に、細胞の接触は、標的化リガンド、例えば、本明細書に記載の、または当分野では既知の任意のリガンドにより達成されてもよい。好ましい実施態様において、標的化リガンドは、炭化水素基、例えばＧａｌＮＡｃ３リガンド、またはＲＮＡｉ剤を目的の部位に導くその他のリガンドであっても良い。

【0434】

本明細書において使用される「阻害する」という用語は、「低下させる」、「サイレンシングする」、「下方制御する」、「抑制する」および他の類似語と互換的に使用され、任意のレベルの阻害を含む。

【0435】

「ＫＨＫの発現を阻害する」という語句は、任意のＫＨＫ遺伝子(例えば、マウスＫＨＫ遺伝子、ラットＫＨＫ遺伝子、サルＫＨＫ遺伝子またはヒトＫＨＫ遺伝子など)ならびにＫＨＫ遺伝子の変異体または突然変異体の発現の阻害を示すことを意図される。即ち、ＫＨＫ遺伝子とは、遺伝子操作された細胞、一群の細胞または生体という文脈において、野性型ＫＨＫ遺伝子、変異体ＫＨＫ遺伝子または突然変異体ＫＨＫ遺伝子であってもよい。

【0436】

「ＫＨＫ遺伝子の発現阻害」は、ＫＨＫ遺伝子の任意の阻害レベル、例えば、ＫＨＫ遺伝子の発現を少なくとも部分的に抑制するレベルを包含する。ＫＨＫ遺伝子の発現は、ＫＨＫ遺伝子発現に関連があるあらゆる可変レベルまたはレベル変化、例えばＫＨＫｍＲＮＡレベルまたはＫＨＫタンパク質レベルに基づいて評価され得る。このレベルは、個々の細胞または細胞群について、例えば、対象から得られるサンプルについて、評価され得る。ある実施態様において、発現は、対象における肝臓細胞について評価され得る。

【0437】

阻害は、コントロールレベルと比較して、ＫＨＫ発現に関連する１つ以上の変数の絶対レベルまたは相対レベルの低下によって評価されてもよい。コントロールレベルは、当技術分野で利用されるあらゆるタイプのコントロールレベル、例えば、投与前のベースラインレベル、または未処理またはコントロール(例えば、緩衝剤のみのコントロールまたは不活性剤のコントロールなど)で処理された類似の対象、細胞またはサンプルから決定されたレベルであってもよい。

【0438】

ＫＨＫ関連疾患の症候の進行の程度および期間は、症候により異なることは理解される。例えば、脂質に関する症候、例えば、空腹時脂質レベル、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、肥満；肝機能および腎機能に関する症候ならびにグルコースまたはインスリン反応に関する症候は、１日以内または１週間以内では臨床学的に有意に変化しない持続性のある症候である。他のマーカー、例えば、血清尿酸値およびグルコース値、尿中フルクトース値は、数日以内に変化する可能性が高い。血圧は、フルクトースに反応して一時的および持続的に上昇する可能性がある。フルクトースは、おそらく満腹感を減退させることにより、少なくとも部分的な体重増加をもたらすので、カロリー制限と組み合わせたフルクトース消費は、体重増加に至らない可能性がある。

【0439】

さらに、対象者の病状に依るが、例えば、腸内のＧＬＵＴ５トランスポーターの発現変動に起因して、成人の３分の１および小児の３分の２もの人々が、フルクトースの吸収不良を起こしている(Johnson et. al., (2013) Diabetes. 62:3307-3315)。しかし、フルクトースへの反復曝露により、フルクトースの吸収は増加され得る。フルクトース代謝は、フルクトースの供給源に依存して異なること、例えば、高フルクトースコーンシロップ中のフルクトースと天然果実中のフルクトースでは異なることが実証されており、清涼飲料水として提供されるような高濃度では、グルコースは、ポリオール経路によってフルクトースに変換され得る。しかし、フルクトースは、グルコースよりも高い代謝効果を示す。体組成、例えば除脂肪体重もまた、フルクトース代謝に影響を与えることが実証されている。したがって、試験およびコントロール両方のタイミングを慎重に選択しなければならない。

【0440】

本発明の方法のいくつかの実施態様では、ＫＨＫ遺伝子の発現、好ましくは肝臓におけるＫＨＫ遺伝子の発現は、適切なコントロールと比較して、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％、またはアッセイの検出レベル以下まで阻害される。さらに、発現レベルをモニタリングするために肝臓サンプルを取得することは、当分野において常法ではないことは理解されよう。従って、ある実施態様において、ＫＨＫ発現のレベルは、対象に臨床的利益を提供するのに十分に、例えば、少なくともＫＨＫ関連疾患の症候または症状を治療または予防するのに十分に阻害される。

【0441】

ＫＨＫ遺伝子の発現の阻害は、第１の細胞または細胞群と実質的に同一であるが、ＫＨＫ遺伝子の発現が阻害されるように処理されていないかまたは処理されなかった第二の細胞または細胞群(ｉＲＮＡで処理されていないか、または目的の遺伝子を標的とするｉＲＮＡで処理されていないコントロール細胞)と比較して、ＫＨＫ遺伝子が転写され、かつＫＨＫ遺伝子の発現が阻害されるように処理されているか、または処理された(例えば、本発明のｉＲＮＡを、細胞または細胞に接触させることによって、または細胞が存在するかまたは存在していた対象に本発明のｉＲＮＡを投与することによって)第一の細胞または細胞群(そのような細胞は、例えば、対象に由来するサンプル中に存在してもよい)により発現されるｍＲＮＡ量の低下により示され得る。好ましい実施態様において、阻害は、記載された細胞型において実施例２に記載された方法により評価され、ここでＲＮＡｉ剤を、実施例２に記載された方法を用いて１０ｎＭの濃度で送達し、記載のＰＣＲ法を用いて評価した処理された細胞中のｍＲＮＡのレベルをコントロール細胞中のｍＲＮＡのレベルの％として表して、以下の式を用いて計算した：

【数1】

【0442】

別の実施態様では、ＫＨＫ遺伝子の発現の阻害は、ＫＨＫ遺伝子発現と機能的に関連するパラメーターの低下、例えば、ＫＨＫタンパク質発現またはフルクトース代謝の低下という点から評価されてもよい。ＫＨＫ遺伝子のサイレンシングは、ＫＨＫを発現するあらゆる細胞にて、即ち発現構築体からの同種または異種細胞いずれかにて、当技術分野では既知のあらゆるアッセイにより決定され得る。

【0443】

ＫＨＫタンパク質の発現阻害は、細胞または細胞群によって発現されるＫＨＫタンパク質レベル(例えば、対象から得たサンプル中に発現されるタンパク質のレベル)の低下により示され得る。上記に説明したとおり、ｍＲＮＡ抑制を評価するために、処理された細胞または細胞群におけるタンパク質発現レベルの阻害は、同様に、コントロール細胞または細胞群におけるタンパク質レベルの％として表されてもよい。

【0444】

ＫＨＫ遺伝子の発現阻害を評価するために使用することができるコントロール細胞または細胞群には、まだ本発明のＲＮＡｉ剤を接触させていない細胞または細胞群が含まれる。例えば、コントロール細胞または細胞群は、対象をＲＮＡｉ剤で処理する前に、個々の対象(例えば、ヒトまたは動物対象)から取得してもよい。

【0445】

ある実施態様において、試料中のＫＨＫの発現レベルは、転写されたポリヌクレオチドまたはその一部、例えばＫＨＫ遺伝子のｍＲＮＡを検出することにより決定される。ＲＮＡは、例えば、酸性フェノール／グアニジンイソチオシアネート抽出(RNAzol B; Biogenesis)、ＲＮｅａｓｙ(商標登録)ＲＮＡ調製キット(Qiagen(商標登録))またはＰＡＸｇｅｎｅ(商標登録)(PreAnalytix, Switzerland)を使用することを含むＲＮＡ抽出技術を使用して、細胞から抽出され得る。リボ核酸ハイブリダイゼーションを利用する一般的なアッセイ形式としては、核ラン・オンアッセイ、ＲＴ-ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護アッセイ、ノーザンブロット、イン・サイチュ・ハイブリダイゼーションおよびマイクロアレイ分析が挙げられる。

【0446】

ある実施態様において、ＫＨＫの発現レベルは、核酸プローブを用いて決定される。本明細書で使用されるように、「プローブ」という用語は、特定のＫＨＫに選択的に結合することができるあらゆる分子を指す。プローブは、当業者であれば合成することができるか、または適切な生物学的製剤から得ることができる。プローブは、標識されるよう特異的に設計され得る。プローブとして利用できる分子の例としては、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体および有機分子が挙げられるが、これらに限定されない。

【0447】

単離されたｍＲＮＡは、サザン分析またはノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)分析およびプローブアレイを含むが、これらに限定されないハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイにおいて使用することができる。ｍＲＮＡレベルの決定のための１つの方法は、単離されたｍＲＮＡを、ＫＨＫ ｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる核酸分子(プローブ)と接触させることを含む。一実施態様では、単離したｍＲＮＡを固体表面上に固定化して、プローブと接触させる(例えば、アガロースゲル上で泳動させ、ゲルからニトロセルロースのような膜にｍＲＮＡを移して)。別の実施態様では、プローブは固体表面に固定化され、ｍＲＮＡは、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ(登録商標)遺伝子チップアレイ内でプローブと接触される。当業者は、ＫＨＫ ｍＲＮＡのレベルを決定する際に使用するための既知のｍＲＮＡ検出方法を容易に適用し得る。

【0448】

サンプル中のＫＨＫの発現レベルを決定するための別法には、例えば、サンプル中のｍＲＮＡの核酸増幅または逆転写酵素(ｃＤＮＡを調製する)方法、例えば、ＲＴ-ＰＣＲ(Mullis, 1987, 米国特許第4,683,202号に記載されている実験の態様)、リガーゼ連鎖反応(Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193)、自家持続配列複製法(Guatelli et al., (1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878)、転写増幅系(Kwoh et al.,(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177)、Q-βレプリカーゼ(Lizardi, et al., (1988)Bio/Technology 6:1197)、ローリングサークル型複製(Lizardi, et al., 米国特許第5,854,033号)またはあらゆる他の核酸増幅法が挙げられ、その後当技術分野の当業者には既知の技術を用いて増幅分子を検出を行う。これらの検出スキームは、そのような分子が、極めて少ない数で存在する場合に、核酸分子を検出するのに特に有用である。本発明の特別な態様において、ＫＨＫの発現レベルは、定量的な蛍光ＲＴ-ＰＣＲ(すなわち、ＴａｑＭａｎＴＭシステム)によって決定される。

【0449】

ＫＨＫ ｍＲＮＡの発現レベルは、メンブレンブロット(例えば、ノーザン、サザン、ドットなどのハイブリダイゼーション分析に使用されるようなもの)またはマイクロウェル、サンプルチューブ、ゲル、ビーズまたはファイバー(または、結合した核酸を含むあらゆる固体支持体)を使用してモニタリングできる(米国特許第5,770,722号、第5,874,219号、第5,744,305号、第5,677,195号および第5,445,934号を参照のこと；これらは、出典明示により本明細書に組み込まれる)。ＫＨＫ発現レベルの決定は、溶液中の核酸プローブを使用することも含む。

【0450】

好ましい実施態様において、ｍＲＮＡ発現レベルは、分岐鎖ＤＮＡ(ｂＤＮＡ)アッセイまたはリアルタイムＰＣＲ(ｑＰＣＲ)を用いて評価される。本明細書に提示された実施例に記載され、例示された方法および条件を使用することが好ましい。

【0451】

ＫＨＫタンパク質発現のレベルは、タンパク質レベルの測定のために当技術分野で既知のあらゆる方法を用いて決定することができる。そのような方法としては、例えば、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)、薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ)、超臨界クロマトグラフィー、流体またはゲル沈殿反応、吸収分光法、比色アッセイ、分光分析アッセイ、フローサイトメトリー、免疫拡散(シングルまたはダブル)、免疫電気泳動、ウェスタン・ブロッティング、ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)、酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)、免疫蛍光アッセイ、電気化学発光アッセイなどが挙げられる。

【0452】

ある実施態様において、ＫＨＫ関連疾患の治療における本発明の方法の有効性は、ＫＨＫｍＲＮＡレベルまたはＫＨＫの低下(肝生検による)により評価される。

【0453】

ある実施態様において、ＫＨＫ関連疾患の治療における本発明の方法の有効性は、対象において、前述の疾患の少なくとも１つの症候または症状の正常化、例えば、血清尿酸レベルの正常化、血清脂質の正常化、体重の正常化、肝臓などの内臓における脂質沈着の正常化；グルコースまたはインスリン反応性の正常化；血糖の正常化、腎機能の正常化、肝機能の正常化、血圧の正常化について、対象を評価することによってモニタリングすることができる。これらの症状は、当技術分野で知られている任意の方法を使用して、インビトロまたはインビボで適切なコントロールと比較して評価できる。本発明の方法のいくつかの実施態様では、ｉＲＮＡが対象内の特定の部位に送達されるように、ｉＲＮＡを対象に投与する。ＫＨＫプレｍＲＮＡの選択的スプライシングによって産生される２つのＫＨＫアイソフォームがある。ＫＨＫ－Ｃは、フルクトース代謝器官、例えば、肝臓、腎臓、腸に多く存在している。それは非常に活性が高く、殆どのフルクトース代謝を担っている。ＫＨＫ-Ａは、フルクトースに対する親和性が低く、殆どの組織で広範囲に発現している。本明細書で提供されるｉＲＮＡ剤は、ＫＨＫの１つまたは両方のアイソフォームをサイレンシングすることができる。好ましい実施態様では、ｉＲＮＡ剤は、少なくともＫＨＫ-Ｃをサイレンシングすることが可能であり、少なくともＫＨＫ-Ｃアイソフォームの発現は阻害される。ノックアウトマウスを用いた研究は、ＫＨＫ-Ｃの発現を阻害することが、過剰なフルクトース消費によりもたらされる有害作用を低下させるために必要かつ十分であることを実証している(例えば、Marek et al. (2015) Diabetes．64:508-518)。ＫＨＫの発現の阻害は、対象内の特定部位の体液または組織に由来するサンプル中のＫＨＫ ｍＲＮＡまたはＫＨＫタンパク質のレベルまたは変化を測定して評価できる。

【0454】

本明細書で使用されるように、分析物のレベルを検出または決定するという用語は、タンパク質、ＲＮＡなどの物質が存在するかどうかを決定する工程を行うことを意味すると理解される。本明細書で使用される通り、検出または決定する方法は、使用した方法の検出レベル以下である分析物のレベルを検出または決定することを含む。

【0455】

ＶＩＩ．ＫＨＫ関連疾患の治療法または予防法
本発明は、細胞内でのＫＨＫの発現を低下させ、および／または阻害するために、本発明のｉＲＮＡ剤および／または本発明のｉＲＮＡ剤を含有する組成物を使用する方法も提供する。当該方法は、細胞に本発明のｄｓＲＮＡを接触させ、細胞をＫＨＫ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解物を得るのに十分な時間維持し、それによって細胞におけるＫＨＫ遺伝子の発現を阻害することを含む。遺伝子の発現の低下は、当該技術分野において公知の任意の方法によって評価され得る。例えば、ＫＨＫの発現の低下は、当業者に周知の方法、例えば、ノーザンブロット法、ｑＲＴ－ＰＣＲを用いて、例えば肝臓サンプル中のＫＨＫのｍＲＮＡ発現レベルを決定することにより；ウエスタンブロット法、免疫学的方法などの当業者に周知の方法を用いてＫＨＫのタンパク質レベルを測定することにより決定されてもよい。ＫＨＫの発現の低下は、１以上のフルクトース代謝の指標(例えば、フルクトース代謝がない事を示す尿中のフルクトースの存在)を検出することによりフルクトース代謝の低下を測定することにより間接的に評価されてもよい。フルクトース代謝の過程は、本明細書においても説明されている。

【0456】

本発明の方法において、細胞は、インビトロまたはインビボで接触されてもよく、即ち、細胞は対象中に存在し得る。

【0457】

本発明の方法を用いた処理に好適な細胞は、ＫＨＫ遺伝子、好ましくはＫＨＫ-Ｃ遺伝子を発現するあらゆる細胞であり得る。本発明の方法に使用するのに好適な細胞は、哺乳動物細胞、例えば、霊長類細胞(ヒト細胞または非ヒト霊長類細胞、例えば、サル細胞またはチンパンジー細胞など)、非霊長類細胞(ウシの細胞、ブタの細胞、ラクダの細胞、ラマの細胞、ウマの細胞、ヤギの細胞、ウサギの細胞、ヒツジの細胞、ハムスター細胞、モルモットの細胞、ネコの細胞、イヌの細胞、ラットの細胞、マウスの細胞、ライオンの細胞、トラの細胞、クマの細胞または水牛の細胞など)、鳥類の細胞(例えば、アヒルの細胞またはガチョウの細胞)またはクジラの細胞であり得る。一実施態様において、細胞は、ヒト細胞、例えばヒト肝細胞である。

【0458】

ＫＨＫ発現は、細胞において、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％またはアッセイの検出レベル以下のレベルまで阻害される。

【0459】

本発明のインビボ方法は、ｉＲＮＡを含有する組成物を対象に投与することを含んでいてもよく、ｉＲＮＡは、処理される哺乳動物のＫＨＫ遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列を含む。処理される生物が、ヒトなどの哺乳類である場合、組成物は、限定はされないが、経口、腹腔内、または頭蓋内(例えば、脳室内、実質内およびくも膜下腔内)、筋肉内、経皮、気道(エアゾール)、経鼻、直腸、および局所(口腔および舌下を含む)投与を含めた非経口経路を含む当該技術分野において公知の任意の手段によって投与され得る。特定の実施態様において、組成物は、静脈内注入または注射によって投与される。ある実施態様において、組成物は、皮下注射によって投与される。

【0460】

ある実施態様において、投与は、デポー注射による。デポー注射は、長時間にわたりｉＲＮＡを継続して放出することができる。したがって、デポー注射は、所望の効果、例えば、ＫＨＫの所望の阻害、または治療または予防効果を得るのに必要な投与の頻度を低減し得る。デポー注射はまた、より一貫した血清濃度を提供することができる。デポー注射は、皮下注射または筋肉内注射を含み得る。好ましい実施態様において、デポー注射は、皮下注射である。

【0461】

ある実施態様において、投与は、ポンプによる。ポンプは、外部ポンプまたは手術により埋め込まれたポンプであってもよい。特定の実施態様において、ポンプは、皮下に埋め込まれた浸透圧ポンプである。他の実施態様において、ポンプは、注入ポンプである。注入ポンプは、静脈内、皮下、動脈内、または硬膜外注入に使用され得る。好ましい実施態様において、注入ポンプは、皮下注入ポンプである。他の実施態様において、ポンプは、ｉＲＮＡを肝臓に送達する、手術により埋め込まれたポンプである。

【0462】

投与方法は、局所治療または全身治療のいずれが所望されるかに基づいて、および治療される領域に基づいて選択され得る。投与の経路および部位は、標的化を向上させるように選択され得る。

【0463】

一態様において、本発明は、哺乳類におけるＫＨＫ遺伝子の発現を阻害するための方法も提供する。本発明は、哺乳類に、哺乳動物の細胞内でのＫＨＫ遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡを含む組成物を投与すること、ＫＨＫ遺伝子のｍＲＮＡ転写物が分解するまで十分な時間該哺乳類への投与を維持することにより、細胞内のＫＨＫ遺伝子の発現を阻害することを含む。遺伝子の発現の低下は、当該技術分野において公知のあらゆる方法、例えば、本明細書に記載されるｑＲＴ－ＰＣＲにより評価されてもよい。タンパク質産生の低下は、当該技術分野において公知の任意の方法によって、本明細書に記載されるＥＬＩＳＡ法といった方法によって評価され得る。一実施態様において、肝穿刺生検試料は、ＫＨＫ遺伝子および／またはタンパク質の発現の低下をモニタリングするための組織材料として役立つ。

【0464】

本発明は、治療が必要な対象の治療方法をさらに提供する。本発明の治療方法は、本発明のｉＲＮＡを対象に投与すること、例えばＫＨＫ発現の低下または阻害により利益を得る対象に、治療上有効量のＫＨＫ遺伝子を標的とするｉＲＮＡまたはＫＨＫ遺伝子を標的とするｉＲＮＡを含む医薬組成物を投与することを含む。

【0465】

本発明のｉＲＮＡは、「遊離ｉＲＮＡ」として投与されてもよい。遊離ｉＲＮＡは、医薬組成物の非存在下にて投与されてもよい。それ自体で(naked)ｉＲＮＡは、適切な緩衝溶液中に存在していてもよい。緩衝溶液は、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩もしくはリン酸塩またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。一実施態様において、緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)である。ｉＲＮＡを含有する緩衝液のｐＨおよび浸透圧は、対象に投与するのに適切となるよう調整され得る。

【0466】

あるいは、本発明のｉＲＮＡは、ｄｓＲＮＡリポソーム製剤などの医薬組成物として投与され得る。

【0467】

ＫＨＫ遺伝子発現の低下または阻害に利益を得る対象は、高いＫＨＫ発現の障害を有する対象、本明細書において議論されている対象である。

【0468】

本発明は、ｉＲＮＡまたはその医薬組成物を使用するための方法、例えば、ＫＨＫ発現の低下または阻害により利益を得る対象(例えば、ＫＨＫ関連疾患に罹患している対象)を治療するための、別の医薬組成物または別の治療方法、例えばこれらの疾患を治療するために現在用いられる方法と組み合わせて使用するための方法をさらに提供する。例えば、ある実施態様において、ＫＨＫを標的とするｉＲＮＡは、本明細書のいずれかに記載のＫＨＫ関連疾患を治療する際に有用な剤と組み合わせて投与される。投与される剤は、対象が罹患している特定のＫＨＫ関連疾患に依って変わる。

【0469】

ｉＲＮＡおよび追加の治療剤は、同時に、または同一組成物にて、例えば、非経口により投与されてもよいか、または追加の治療剤は、当分野においてまたは本明細書に記載した別の方法により、別々の時点で、別々の組成物の一部として投与されてもよい。

【0470】

一実施態様において、本方法は、標的ＫＨＫ遺伝子の発現が低下されるように、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、１２、１６、１８、２４時間、２８、３２または約３６時間低下される。一実施態様において、標的ＫＨＫ遺伝子の発現が、延長期間の間、例えば、少なくとも約２、３、４日またはそれ以上の期間、例えば約一週間、二週間、三週間または四週間かそれ以上で低下されるように、本明細書に関する組成物を投与する。

【0471】

好ましくは、本明細書に記載の方法および組成物のために有用なｉＲＮＡは、特異的に標的ＫＨＫ遺伝子のＲＮＡ(一次またはプロセシング後)を標的とする。ｉＲＮＡを用いてこれら遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法は、本明細書に記述した通りに製造および実施され得る。

【0472】

本発明の方法に関するｉＲＮＡの投与は、高いＫＨＫの障害を有する患者における前記疾患または障害に関する、重症度、症候、症状またはマーカーを低下させ得る。本明細書における「低下」とは、かかるレベルにおける統計学的に有意な低下を意味する。低下(対象における高いレベルと正常レベルとの差の絶対値低下または低下)とは、例えば、少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％、あるいは使用したアッセイの検出限界値以下であり得る。

【0473】

疾患の治療または予防の効力は、例えば、疾患の進行、疾患の寛解、重症度、痛みの低下、クオリティ・オブ・ライフ、治療効果を維持するのに必要な投薬量、疾患マーカーのレベルまたは治療や予防のための標的とする所定の疾患に適切なその他の測定可能なパラメーターを測定することにより評価され得る。前記パラメーターのいずれか一つを測定することにより治療または予防の効力をモニタリングすることは、十分に当業者の能力の範囲内であろう。本明細書に議論されるとおり、測定される特定のパラメーターは、対象が罹患しているＫＨＫ関連疾患に依って変化する。

【0474】

治療後の読み値と開始時の読み値の比較により、治療が有効であるかどうかの指標が医師に提供される。前記パラメーターのいずれか一つまたはそれらの組み合わせを測定して治療または予防の効力をモニタリングすることは、十分に当業者の能力の範囲内であろう。ＫＨＫを標的とするｉＲＮＡまたはその医薬組成物の投与に関連して、ＫＨＫ関連疾患「に対して有効」とは、臨床学的に適切な手法にて投与することにより、少なくとも統計学的に有意な効果、例えば、症状の改善、治癒、疾患の低下、寿命延長、クオリティー・ライフの改善またはＫＨＫ関連障害の治療に長けた医師によって一般的に有効であると認識されるその他の効果を提供することを示す。

【0475】

治療効果または予防効果とは、疾患状態の１以上のパラメーターの統計学的に有意な改善がある場合のエビデンス、あるいは、それらが予測される症状の悪化または進行がない場合のエビデンスである。例えば、疾患の測定可能なパラメーターにおける少なくとも１０％の望ましい変化、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上の変化が有効な治療指標であり得る。所定のｉＲＮＡ剤または薬剤の効果は、当業者には既知の疾患についての実験動物モデルを用いても判断され得る。実験動物モデルを用いて場合に、治療効力は、マーカーまたは症状において統計学的に有意な低下が観察された場合に実証される。

【0476】

あるいは、効力は、臨床学的に許容される疾患重症度の評価尺度を基準とした診断に関する当業者により決定される疾患の重症度の低下により測定され得る。あらゆるポジティブな変化、例えば、適切なスケールを用いて測定される疾患の重症度の低下は、本明細書に記載のｉＲＮＡまたはｉＲＮＡ製剤を用いて十分な治療を示す。

【0477】

対象は、ｉＲＮＡ、例えば約０.０１ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／ｋｇの治療量が投与され得る。

【0478】

ｉＲＮＡは、一定期間または定期的に静脈内点滴により投与され得る。ある実施態様において、初回治療レジメンの後、治療は、基本的には頻度を減らして投与される。ｉＲＮＡの投与は、ＫＨＫレベル、例えば、患者の細胞、組織、血液、尿またはその他の器官のＫＨＫレベルを、少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％、あるいは使用されたアッセイ方法の検出レベル以下まで低下し得る。ＫＨＫ-Ｃは肝臓内で発現されるが、この治療を肝臓中のＫＨＫ－Ｃ発現を測定することでモニタリングする可能性は低い。ある実施態様において、治療の効力は、罹患している対象からＫＨＫ関連疾患の１以上の症候または症状を測定することにより評価される。

【0479】

ｉＲＮＡの全用量投与前に、患者に、より少ない量の投与量、例えば５％を投与して、輸液反応およびアレルギー反応などの薬物副作用がモニタリングされる。別の例において、患者は、望ましくない免疫刺激効果、例えば、高いサイトカイン(例えば、ＴＮＦ-αまたはＩＮＦ-α)レベルについてモニタリングされ得る。

【0480】

あるいは、ｉＲＮＡは、皮下投与、即ち、皮下注射により投与され得る。１回以上の注射を、ｉＲＮＡの望ましい一日用量を対象に使用して送達され得る。注射は、ある期間中、反復されてもよい。投与は、定期的に繰り返されてもよい。ある実施態様において、初回の治療療法の後、治療は、基本的には頻度を減らして投与される。反復投薬療法とは、定期的に、例えば隔日毎または一年に１回、治療量のｉＲＮＡを投与することを包含し得る。ある実施態様において、ｉＲＮＡは、約１か月に１回～約４半期に１回(即ち、約３か月毎に１回)投与される。

【0481】

ＩＸ．ＫＨＫ-関連疾患についての診断基準および治療
様々なＫＨＫ関連疾患についての診断基準、治療剤および考慮事項を下記に示す。

【0482】

Ａ．高尿酸血症
血清尿酸レベルは、臨床検査の値として日常的には得られない。しかし、高尿酸血症(高い尿酸)は、多くの疾患および症状、例えば、痛風、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、メタボリックシンドローム、インスリン耐性(インスリンへの免疫応答をもたらさない)、心血管疾患、高血圧症およびＩＩ型糖尿病に関連がある。ＫＨＫ発現の低下は、高い血清尿酸レベルに関連した１以上の症状の予防または治療において有用であり得ると考えられる。さらに、対象は、高い尿酸値と関連する１以上の明白な兆候または症状がなくても、血清尿酸レベルが正常な血清尿酸レベル、例えば、６.８ｍｇ/ｄｌ以下、好ましくは６ｍｇ/ｄｌ以下への正常化により臨床的利益を得ると考えられる。

【0483】

高尿酸血症の動物モデルが挙げられ、例えば、１以上の脂肪蓄積、例えば脂肪肝、インスリン耐性、ＩＩ型糖尿病、肥満症、例えば、内臓肥満症、メタボリックシンドローム、アディポネクチン分泌の低下、腎臓の機能低下および炎症を誘導し得る、例えばラットおよびマウスにおける高フルクトース食を含む(例えば、Johnson et al. (2013) Diabates. 62:3307-3315を参照されたい)。オキソン酸、即ちウリカーゼ阻害剤の投与を用いて、高尿酸血症を誘導することができる(例えば、Mazalli et al. (2001) Hypertens. 38:1101-1106を参照されたい)。高尿酸血症の遺伝モデルには、Jackson Laboratory (/jaxmice.jax.org/strain/002223.html)から入手できる血清尿酸レベルが１０倍高いレベルのB6;129S7-Uo^xtm1Bay/Jマウスが挙げられる。

【0484】

高尿酸血症についての様々な治療は、当技術分野で知られている。しかし、これらの薬剤の中には、限定された集団でしか使用できないものもある。例えば、アロプリノールは、キサンチンオキシダーゼ阻害剤であり、これを使用して、多くの症状、例えば、痛風、虚血再灌流傷害、高血圧、心血管疾患(アテローム性動脈硬化症および脳卒中を含む)ならびに炎症性疾患を治療するために、血清尿酸レベルを低下させることができる(Pacher et al., (2006) Pharma. Rev. 58:87-114)。しかし、アプロプリノールの使用は、腎機能障害に罹患している対象、例えば、慢性腎臓病、甲状腺機能低下症、高インスリン血症またはインスリン耐性の対象；または腎臓病または腎機能障害の素因を有する対象、例えば、高血圧患者、代謝障害患者、糖尿病患者および高齢者には禁忌である。さらに、アロプリノールは、経口凝固剤またはプロベンシドを服用している対象、および利尿剤、特にチアジド系利尿剤または腎機能を低下させ得る薬剤または腎毒性の可能性を有する別の薬剤を服用している対象には、服用させるべきではない。

【0485】

ある実施態様において、本発明の組成物および方法は、高尿酸血症を治療するための別の組成物および方法、例えば、アロプリノール、オキシプリノール、フェブキソスタットと組み合わせて使用される。ある実施態様において、本発明の組成物および方法は、腎機能が低下しているか、または、例えば、年齢、共存疾患または薬物相互作用のために腎機能が低下しているか、または低下しやすい対象の治療に使用される。

【0486】

Ｂ．痛風
痛風は、成人の約４０人に１人が罹患しており、最も多いのは３０～６０歳の男性である。痛風は、女性には余り罹患者はいない。痛風は、治療することにより、関節損傷を将来的に回避することができる数少ないタイプの関節炎の一つである。痛風は、尿酸の不十分な腎クリアランスまたは過剰な尿酸産生による高尿酸血症を理由とする関節内の尿酸結晶への炎症反応によって引き起こされる急性炎症性関節炎の再発発作を特徴とする。フルクトール関連性痛風は、腎臓、腸、肝臓で発現しているトランスポーターの亜種と関連している場合がある。痛風は、関節や皮下に尿酸一ナトリウム(ＭＳＵ)の結晶である痛風結節が形成されて沈着することを特徴とする。痛風に伴う痛みは、痛風結節の大きさとは関係なく、ＭＳＵ結晶に対する免疫反応の結果である。血清尿酸と痛風結節の大きさの減少率との間には、直線的な逆相関がある。例えば、非痛風結節性の痛風患者１８人を対象とした１つの研究では、血清尿酸は、尿酸低下療法を開始してから３ヶ月以内に、全対象において２.７～５.４ｍｇ／ｄＬ(０.１６～０.３２ｍＭ)まで低下した(Pascual and Sivera (2007) Ann. Rheum. Dis. 66:1056-1058)。しかし、痛風歴が１０年未満の患者では、無症状の膝関節または最初のＭＴＰ関節からＭＳＵ結晶が消失するのに１２ヶ月かかったのに対し、痛風歴が１０年以上の患者では１８ヶ月かかった。従って、痛風の効果的な治療には、痛風結節の完全なクリアランスまたは全症状(例えば、関節痛および腫脹、炎症)の解消を求めるのではなく、単に血清尿酸値の低下に関連した痛風の少なくとも１つの徴候または症状(例えば、痛風発作の重症度または頻度の低下)の減少をめざすべきであろう。

【0487】

痛風の動物モデルには、オキソン酸誘発性の高尿酸血症が挙げられる(例えば、Jang et al. (2014) Mycobiology. 42:296-300を参照されたい)。

【0488】

痛風に対する現在利用できる治療法は、多くの対象において、禁忌であるか、または有効ではない。痛風患者における尿酸値を低下させるための一般的な第一選択薬であるアロプリノールは、上述したように、多くの患者、特に腎機能が低下している患者においては禁忌とされている。さらに、多くの対象が、アロプリノールによる治療に失敗しており、例えば、対象が治療しても痛風発作を起こすか、または対象がアロプリノールに関連した発疹または過敏症反応を起こす。

【0489】

ある実施態様において、本発明の組成物および方法は、血清尿酸を減少させるために他の薬剤と組み合わせて使用される。ある実施態様において、本発明の組成物および方法は、痛風の症状を治療するための薬剤、例えば、鎮痛剤または抗炎症剤、例えば、ＮＳＡＩＤＳと組み合わせて使用される。ある実施態様において、本発明の組成物および方法は、例えば、年齢、共存疾患または薬物相互作用のために、腎機能が低下しているか、または腎機能が低下しやすい対象の治療のために使用される。

【0490】

Ｃ．肝臓疾患
ＮＡＦＬＤは、フルクトース代謝の上昇と関連がある高尿酸血症と関連している(Xu et al. (2015) J. Hepatol. 62:1412-1419)。非アルコール性脂肪性肝疾患(ＮＡＦＬＤ)の定義には、(ａ)画像検査または組織学的検査のいずれかによる脂肪肝のエビデンスがあり、(ｂ)著しいアルコール摂取、脂肪症薬の使用、または遺伝性疾患などの二次的な肝脂肪蓄積の原因がないことが必要である。多くの患者においては、ＮＡＦＬＤは、肥満、糖尿病および脂質異常症などの代謝系リスク因子と関連している。ＮＡＦＬＤは、組織学的に、さらに非アルコール性脂肪肝(ＮＡＦＬ)と非アルコール性脂肪性肝炎(ＮＡＳＨ)に分類される。ＮＡＦＬは、肝細胞の風船様変性という肝細胞傷害のエビデンスがない肝性脂肪症として定義される。ＮＡＳＨは、線維化の有無に拘わらず、肝細胞の損傷(風船様変性)を伴う肝性脂肪症および炎症の存在として定義されている(Chalasani et al.(2012) Hepatol. 55:2005-2023)。単純脂肪肝を有する患者は、組織学的に進行したとしても非常に遅く、一方でＮＡＳＨ罹患患者は、肝硬変期の疾患へと組織学的な進行を示す可能性があることが一般的に認められている。ＮＡＦＬＤとＮＡＳＨ患者についての長期的な予後については、いくつかの研究で報告されている。それらの知見を以下にまとめることができる：(ａ)ＮＡＦＬＤ患者は、コントロール群と比較して全死亡率が増加していた；(ｂ)ＮＡＦＬＤ、ＮＡＦＬおよびＮＡＳＨ患者における最も一般的な死因は、心血管疾患である；(ｃ)ＮＡＳＨ患者(ＮＡＦＬではない)は肝臓関連の死亡率が増加する。

【0491】

ＮＡＦＬＤの動物モデルには、様々な高脂肪または高フルクトース飼育動物モデルが含まれる。ＮＡＦＬＤの遺伝子モデルには、ジャクソン研究所から入手可能なＢ６.１２９Ｓ７－Ｌｄｌｒ^{ｔｍ１Ｈｅｒ}／ＪおよびＢ６.１２９Ｓ４－Ｐｔｅｎ^{ｔｍ１Ｈｗｕ}／Ｊマウスが挙げられる。

【0492】

ＮＡＦＬＤの治療は、通常、ＮＡＦＬＤ発症の原因となった症状を管理することである。例えば、脂質異常症の患者は、必要に応じて、コレステロールまたはトリグリセリドを正常化する薬剤で治療され、ＮＡＦＬＤのさらなる進行を治療または予防する。ＩＩ型糖尿病の患者は、グルコースまたはインスリン感受性を正常にする薬剤を用いて治療される。ライフスタイルの変更、例えば食事や運動の変更も、ＮＡＦＬＤを治療するために用いられる。ＮＡＦＬＤのマウスモデルにおいて、アロプリノールによる治療は、両方の脂肪肝の発症を予防しただけでなく、マウスの確立された脂肪肝を有意に改善した(Xu et al., J. Hepatol. 62:1412-1419, 2015)。

【0493】

ある実施態様において、本発明の組成物および方法は、血清尿酸を減少させるための他の薬剤と組み合わせて使用される。ある実施態様において、本発明の組成物および方法は、ＮＡＦＬＤの症状を治療するための薬剤と組み合わせて使用される。ある実施態様において、本発明の組成物および方法は、例えば、年齢、併存疾患または薬物相互作用を理由とした、腎機能が低下している対象または腎機能が低下しやすい対象を治療するために使用される。

【0494】

Ｄ．脂質異常症、血糖コントロールの障害、メタボリックシンドロームおよび肥満
脂質異常症(例えば、高脂血症、高ＬＤＬコレステロール、低ＨＤＬコレステロール、高トリグリセリド血症、食後高トリグリセリド血症)、血糖コントロールの障害(例えば、インスリン耐性、ＩＩ型糖尿病)、メタボリックシンドローム、脂肪細胞機能障害、内臓脂肪沈着、肥満および過度の糖渇望は、フルクトース代謝の上昇に関連している。症状の特徴または診断基準は、以下のものが挙げられる。代謝障害の動物モデルおよび構成要素の特徴には、様々な高脂肪または高フルクトース飼料を用いた動物モデルが含まれる。遺伝子モデルには、ジャクソン研究所から入手可能な、一般的にｏｂまたはｏｂ／ｏｂマウスとして知られているレプチン欠損Ｂ６.Ｃｇ－Ｌｅｐ^ｏｂ／Ｊが含まれる。

【0495】

脂質の正常空腹時レベルおよび異常空腹時レベルを、以下の表に示す。

【表A】

【0496】

食後高トリグリセリド血症は、主にトリグリセリドを多く含むリポ蛋白質(ＴＲＬ)の過剰産生または異化作用の低下によって引き起こされ、肥満およびインスリン耐性などの遺伝的変異および病状の素因の結果である。

【0497】

インスリン耐性は、以下の少なくとも１つの存在により特徴づけられる：
１．２回別々に測定した空腹時血糖値が１００～１２５ｍｇ／ｄＬであるか；または
２．経口グルコース耐性試験がブドウ糖摂取後２時間後のグルコースレベル１４０～１９９ｍｇ／ｄＬの結果を示す。

【0498】

本明細書で使用されるように、インスリン耐性は、インスリン依存性糖尿病、特にＩ型糖尿病の後期に頻繁に起こるような、投与されたインスリンに対する免疫応答の結果であるインスリンに対する応答の欠如を含まない。
ＩＩ型糖尿病は、以下の少なくとも１つを特徴とする：
１．２回の異なる時点で測定した空腹時血糖値が１２６ｍｇ／ｄＬ以上である；
２．ヘモグロビンＡ１ｃ(Ａ１Ｃ)試験の結果が、６.５％以上であるか；または
３．経口グルコース耐性試験で、グルコース摂取後２時間の時点でのブドウ糖値＞２００ｍｇ／ｄＬの結果を示す。

【0499】

ＩＩ型糖尿病およびインスリン耐性のための薬物療法としては、メトホルミン(例えば、グルコファージ、グルメッツァ)、スルホニル尿素(例えば、グリブリド、グリピジド、グリメピリドなど)、メグリチニド(例えば、リパグリニド、ナテグリニドなど)、チアゾリジン系薬剤(例えば、リパグリニド、ナテグリニド)、チアゾリジン系薬剤(ロシグリタゾン、ピオグリタゾン)、ＤＰＰ－４阻害剤(シタグリプチン、サキサグリプチン、リナグリプチン)、ＧＬＰ－１受容体拮抗剤(エキセナチド、リラグルチド)およびＳＧＬＴ２阻害剤(例えば、カナグリフロジン、ダパグリフロジン)などの血糖値を正常化する薬剤による治療が挙げられる。

【0500】

肥満とは、過剰な体脂肪の疾患として特徴づけられる。体格指数(ＢＭＩ)は、体重をキログラム(ｋｇ)で割ることで計算され、身長をメートル(ｍ)の２乗で割って計算されるが、全員ではないが殆どの人の体脂肪の合理的な推定値を提供している。一般的には、ＢＭＩが１８.５未満は低体重、８.５～２４.９は正常、２５.０～２９.９は過体重、３０.０～３４.９は肥満(クラスＩ)、３５～３９.９は肥満(クラスＩＩ)および４０.０以上は極度の肥満(クラスＩＩＩ)として特徴づけられる。

【0501】

皮下脂肪に対する内臓脂肪を評価するための方法は、例えば、Wajchenberg (2000) Subcutaneous and visceral adipose tissue: their relation to the metabolic syndrome, Endocr Rev. 21:697-738に示されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。

【0502】

メタボリックシンドロームは、以下の５つの代謝系リスク因子のうち少なくとも３つとして定義される状態の集積であることを特徴とする：
１．太いウエストライン(女性の場合は＞３５インチ、男性の場合は＞４０インチ)；
２．高いトリグリセリド値(＞１５０ｍｇ／ｄｌ)；
３．低ＨＤＬコレステロール(女性は＜５０ｍｇ／ｄｌ、男性は＜４０ｍｇ／ｄｌ)；
４．高血圧(＞１３０／８５)または高血圧治療薬の服用中；および
５．高い空腹時血糖値(＞１００ｍｇ／ｄｌ)または高血糖治療薬の服用中。

【0503】

ＮＡＦＬＤと同様に、メタボリックシンドロームを治療するための薬剤は、存在する特定のリスク因子に依って変わる；例えば、脂質が異常な場合には脂質を正常化し、グルコースまたはインスリンが異常な場合にはグルコースまたはインスリン感受性を正常化するもの。

【0504】

メタボリックシンドローム、インスリン耐性およびＩＩ型糖尿病は、腎機能の低下または潜在的な腎機能の低下に関連していることが多い。

【0505】

ある実施態様において、本発明の組成物および方法は、脂質異常症、血糖コントロールの障害、メタボリックシンドロームおよび肥満を有する対象の治療に使用するためのものである。例えば、ある実施態様において、本発明の組成物および方法は、メタボリックシンドローム、インスリン耐性またはＩＩ型糖尿病および慢性腎臓疾患に罹患している対象に使用するためのものである。ある実施態様において、心血管疾患、甲状腺機能低下症または炎症性疾患のうちの１つ以上を有するメタボリックシンドローム、インスリン耐性、またはＩＩ型糖尿病を有する対象；または高齢者(例えば、６５歳以上)の対象に使用するためのものである。ある実施態様において、組成物および方法は、薬剤表示に示されるような腎機能を低下させ得る薬剤も摂取するメタボリックシンドローム、インスリン耐性またはＩＩ型糖尿病を有する対象に使用するためのものである。例えば、ある態様において、本発明の組成物および方法は、経口凝固剤またはプロベンシドで治療されているメタボリックシンドローム、インスリン耐性またはＩＩ型糖尿病を有する対象に使用するためのものである。例えば、ある実施態様において、本発明の組成物および方法は、利尿剤、特にチアジド系利尿剤で治療されているメタボリックシンドローム、インスリン耐性またはＩＩ型糖尿病を有する対象に使用するためのものである。

【0506】

ある実施態様において、本発明の組成物および方法は、血清尿酸を低下させるために他の薬剤と組み合わせて使用される。ある実施態様において、本発明の組成物および方法は、メタボリックシンドローム、インスリン耐性またはＩＩ型糖尿病の症状を治療するための薬剤と組み合わせて使用される。ある実施態様において、対象は、例えば、血圧低下薬剤、例えば、利尿剤、β遮断剤、ＡＣＥ阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体遮断剤、カルシウムチャネル遮断剤、α遮断剤、α－２受容体拮抗剤、α－およびβ－の複合遮断剤、中枢作動薬、末梢性アドレナリン阻害剤および血管透析剤；コレステロール低下薬剤、例えば、スタチン、選択的コレステロール吸収阻害剤、樹脂または脂質低下療法；または血糖を正常化させるための薬剤、例えば、メトホルミン、スルホニル尿素、メグリチニド、チアゾリジンジオン、ＤＰＰ－４阻害剤、ＧＬＰ－１受容体拮抗剤およびＳＧＬＴ２阻害剤などが挙げられる。

【0507】

ある実施態様において、本発明の組成物および方法は、例えば、年齢、共存疾患または薬物相互作用のために、腎機能が低下しているか、または腎機能が低下しやすい対象の治療のために使用される。

【0508】

ｉＲＮＡおよび追加の治療剤は、同時または同じ組み合わせにおいて、例えば非経口的に投与することができ、または追加の治療剤を、別個の組成物の一部として、または別々の時点で、または当当業者には既知または本明細書に記載されている別の方法で投与することができる。

【0509】

Ｅ．心血管系疾患
ある実施態様において、本発明の組成物および方法は、心血管疾患を有する対象の治療に使用するためのものである。例えば、ある実施態様において、本発明の組成物および方法は、心血管疾患および慢性腎臓病を有する対象における使用のためのものである。ある実施態様において、組成物および方法は、代謝性障害、インスリン抵抗性、高インスリン血症、糖尿病、甲状腺機能低下症または炎症性疾患のうちの１つ以上に罹患している心血管疾患を有する対象において使用するためのものである。ある実施態様において、組成物および方法は、薬剤の適応に示されるような腎機能を低下させる可能性がある薬剤を服用している心血管疾患を有する対象に使用するためのものである。例えば、ある実施態様において、本発明の組成物および方法は、経口凝固剤またはプロベンシドで治療されている心血管疾患を有する対象において使用するためのものである。例えば、ある実施態様において、本発明の組成物および方法は、利尿剤、特にチアジド系利尿剤で治療されている心血管疾患を有する対象において使用するためのものである。例えば、ある実施態様において、本発明の組成物および方法は、アロプリノールを用いる治療に失敗した心血管疾患を有する対象に使用するためのものである。

【0510】

ある実施態様において、本発明の組成物および方法は、血清尿酸を減少させるために他の薬剤と組み合わせて使用される。特定の実施態様では、本発明の組成物および方法は、心血管疾患の症状を治療するための薬剤、例えば血圧を低下させるための薬剤、例えば、利尿剤、β遮断剤、ＡＣＥ阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体遮断剤、カルシウムチャネル遮断剤、α遮断剤、α－２受容体拮抗剤、α－およびβ遮断剤の併用剤、中枢作動薬、末梢性アドレナリン阻害剤および血管拡張剤；またはコレステロール低下薬、例えば、スタチン、選択的コレステロール吸収阻害剤、樹脂または脂質低下療法剤などが挙げられる。

【0511】

Ｆ．腎臓疾患
腎臓疾患には、例えば、急性腎不全、尿細管機能障害、近位尿細管の炎症性変化および慢性腎臓病が含まれる。

【0512】

急性腎不全は、腎臓が、突然、血液中の老廃物を濾過することができなくなり、その結果、血清中に危険なレベルの老廃物が蓄積され、全身の化学的不均衡が生じるときに発症する。急性腎不全は、数時間または数日の間に急速に進行し、既に入院している患者、特に集中治療を必要とする重篤な患者に最も多くみられる。急性腎不全は、致命的な場合もあり、集中的な治療を要する。しかし、急性腎不全は可逆的な場合もある。あるいは良好な健康状態であれば、正常または正常近くまで腎機能が回復する場合もある。

【0513】

慢性腎臓疾患は、慢性腎不全とも呼ばれ、腎臓の機能が徐々に失われていく症状をいう。慢性腎臓病が進行すると、危険なレベルの体液、電解質、老廃物が体内に蓄積する。腎臓疾患の症候および症状は、吐き気、嘔吐、食欲不振、倦怠感および脱力感、睡眠障害、尿量変化、精神的鋭敏性の低下、筋肉の収縮や痙攣、しゃっくり、足や足首のむくみ、持続的なかゆみ、胸痛、心臓内膜周辺の体液滞留による息切れ、肺の体液滞留による息切れ、コントロールが難しい高血圧(高血圧)などが挙げられる。慢性腎臓病の徴候や症状は、非特異的であることが多く、徐々に進行する可能性があり、不可逆的な障害が発生するまで判らないこともある。

【0514】

腎臓病の治療は、腎臓障害の原因となっている有害物質または症状を排除すること、例えば、血圧を正常化して腎機能を改善すること、腎臓障害を誘発する薬剤による治療を終了すること、腎臓障害の原因となっている炎症を軽減すること、または腎機能をサポートするための腎支援(腎透析など)を行うことによって行われる。

【0515】

腎機能は、通常、ＢＵＮ(血中尿素窒素)、クレアチニン(血液)、クレアチニン(尿)またはクレアチニンクリアランスのうちの１つ以上の常法の臨床検査を用いて決定される(例えば、www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/article/003435.htm)。これらの検査は、他の臓器の症状も診断するものでもある。

【0516】

一般的に、６～２０ｍｇ/ｄＬのＢＵＮレベルは、正常であると考えられているが、正常値は検査機関により変動し得る。ＢＵＮ値の上昇は、糸球体腎炎、腎盂腎炎、急性尿細管壊死などの腎臓病または腎不全を示し得る。

【0517】

血中クレアチニンの正常な結果は、男性では０.７～１.３ｍｇ／ｄＬおよび女性では０.６～１.１ｍｇ／ｄＬ範囲である。高い血中クレアチニンは、腎臓の損傷や故障、感染症または血流低下による腎機能の低下を示し得る。

【0518】

尿クレアチニン(２４時間のサンプル)の値は、５００～２０００ｍｇ／日の範囲である。その結果は、年齢と除脂肪体重の量により異なる。正常な結果は、男性の場合、１日あたりの体重１ｋｇあたり１４～２６ｍｇである。

【0519】

女性の場合は、１日に体重１ｋｇあたり１１～２０ｍｇである。異常な結果は、尿細管細胞の損傷、腎不全、腎臓への血流低下、腎臓感染症(腎盂腎炎)などの腎臓障害を示し得る。

【0520】

クレアチニンのクリアランス試験は、尿中のクレアチニン値と血液中のクレアチニン値を比較することで、腎機能に関する情報を得るために役立つ。クリアランスは、多くの場合、毎分ミリリットル(ｍｌ／分)で測定される。正常値は、男性で９７～１３７ｍｌ／分、女性で８８～１２８ｍｌ／分である。正常値よりも低いクレアチニンクリアランスは、尿細管細胞の損傷、腎不全、腎臓への血流低下または腎臓における糸球体濾過の低下などの腎損傷を示し得る。

【0521】

ある実施態様において、本発明の組成物および方法は、腎臓病の治療に使用することができる。本願の薬剤は、腎臓に損傷を与えないと考えられる。

【0522】

本発明は、限定的に解釈されるべきではないが、以下の実施例によってさらに説明される。本出願を通して、引用された全ての参考文献、特許および公開された特許出願の内容全体ならびに配列表は、参照により本明細書に組み込まれる。

【実施例0523】

実施例１．ｉＲＮＡ合成
試薬供給源
試薬の入手元が、別段記載されていない場合は、分子生物学用の試薬供給社から、分子生物学に用いるための基準の品質/純度で入手することが出来る。

【0524】

転写物およびsｉＲＮＡ設計
ヒトＫＨＫを標的とするｄｓＲＮＡ試薬セット(human NCBI refseqID: XM_005264298；NCBI GeneID: 3795)を、ＲとＰｙｔｈｏｎのカスタムスクリプトを用いて設計した。ヒトＫＨＫ ＲＥＦＳＥＱ ｍＲＮＡは、２１４４塩基長を有する。ｄｓＲＮＡ剤のセットを設計するための理論的根拠と方法は、以下の通りである：位置１０～位置２１４４４までの全ての可能性のある１９量体 ＲＮＡｉ剤の予測される有効性を、多くの脊椎動物遺伝子を標的とする２万以上の様々なｄｓＲＮＡ剤の設計物からのｍＲＮＡノックダウンにより得た実測値により得た線形モデルを用いて決定した。Ｐｙｔｈｏｎカスタムスクリプトは、１０の位置から始まる標的ｍＲＮＡに沿って１１塩基毎に系統的にＲＮＡｉ剤を選択することにより、ｄｓＲＮＡのセットを構築した。各々の位置で予測される有効性が、正確に全ての１１番目のＲＮＡｉ剤での有効性よりも優れている場合は、隣接するＲＮＡ剤(ｍＲＮＡの５'末端に対して１か所、ｍＲＮＡの３'末端に対して１か所)を設計物のセットと交換する。低複雑性ＲＮＡｉ剤、即ち、シャノンエントロピー測定値が１.３５未満であるものは、そのセットから除外された。

【0525】

非修飾ＫＨＫセンスおよびアンチセンス鎖配列の詳細なリストは、表３に示される。修飾ＫＨＫセンス配列およびアンチセンス鎖配列の詳細なリストは、表５に示される。

【0526】

ＲＮＡｉ剤を、当業者には既知の技術を用いて合成して、アニーリングした。

【0527】

実施例２－インビトロスクリーニング
細胞培養およびトランスフェクション：
Ｈｅｐ３Ｂ(ＡＴＣＣ)細胞を、４.９μｌのＯｐｔｉ-ＭＥＭ＋０.１μｌのリポフェクタミン ＲＮＡｉＭａｘ/ウェル(Invitrogen(登録商標), Carlsbad CA. cat # 13778-150)を、３８４ウェルプレート中で５μｌのｄｓＲＮＡ Duplex/ウェルに加えてトランスフェクトして、室温で１５分間インキュベートした。～５ｘ１０^３細胞を含有する４０μｌのＥＭＥＭを、次いでsｉＲＮＡ混合物に加えた。細胞を、２４時間インキュベートした後、ＲＮＡ精製を行った。単回用量実験を、１０ｎＭの最終二本鎖濃度で行った。

【0528】

ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ ｍＲＮＡ単離キットを用いた全ＲＮＡ単離：
ＤＹＮＡＢＥＡＤ(Invitrogen, cat#61012)を用いて、ＢｉｏＴｅｋ-ＥＬ４０６プラットフォームにおいて自動化プロトコルを用いて、ＲＮＡを単離した。要約すると、３μlの磁性ビーズを含む５０μｌの溶解／結合緩衝液および２５μｌの溶解緩衝液を、細胞と共にプレートに加えた。プレートを、室温で１０分間にわたって電磁振とう機においてインキュベートした後に、電磁ビーズを捕捉して、上清を除去した。次に、ビーズに結合したＲＮＡを、１５０μｌの洗浄緩衝液Ａで２回、そして洗浄緩衝液Ｂで１回洗浄した。次に、ビーズを１５０μｌの溶出緩衝液で洗い、再度捕捉して、上清を除去した。

【0529】

ＡＢＩ高性能ｃＤＮＡ逆転写キット(Applied Biosystems, Foster City, CA, Cat #4368813)を用いたｃＤＮＡ合成：
反応あたりに、１μｌ １０ｘ緩衝液、０.４μｌ ２５ｘ ｄＮＴＰ、１μｌ １０ｘ ランダムプライマー、０.５μｌ 逆転写酵素、０.５μｌ ＲＮａｓｅ阻害剤および６.６μｌのＨ_２Ｏを含有する１０μｌのマスターミックスを、上記にて単離したＲＮＡに加えた。プレートを密閉して、混合し、電磁振とう機において室温で１０分間、その後３７℃で２時間インキュベートした。

【0530】

リアルタイムＰＣＲ：
２μｌのｃＤＮＡを、３８４ウェルプレート(Roche cat # 04887301001)中で、ウェルあたり０.５μｌのＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎ Ｐｒｏｂｅ(Hs99999905 m1)、０.５μｌ ＫＨＫプローブ(Hs00240827_m1)および５μｌ Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０ プローブ・マスター・ミックス(Roche Cat # 04887301001)を含有するマスター・ミックスに加えた。リアルタイムＰＣＲを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ リアルタイムＰＣＲシステム(Roche)にて行った。各二本鎖を、少なくとも２回試験して、データを、非標的化コントロールｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトしたナイーブ細胞または細胞に対して正規化した。

【0531】

相対的な倍加変化を計算するために、ΔΔＣｔ法を用いてリアルタイムデータを分析し、１０ｎＭ ＡＤ-１９５５でトランスフェクションを行った細胞またはモックトランスフェクションを行った細胞を用いて行ったアッセイに対して正規化した。

【0532】

表２．核酸配列の表示に用いたヌクレオチドモノマーの略語。これらのモノマーは、オリゴヌクレオチド中に存在する場合、５'-３'-ホスホジエステル結合により互いに結合していることは理解されよう。

【表2-1】

【表2-2】

【0533】

【表3-1】

【表3-2】

【表3-3】

【表3-4】

【表3-5】

【表3-6】

【表3-7】

【表3-8】

【表4-1】

【表4-2】

【表4-3】

【表4-4】

【表4-5】

【表5-1】

【表5-2】

【表5-3】

【表5-4】

【表5-5】

【表5-6】

【表5-7】

【0534】

均等物
当業者は、本明細書に記載される特定の実施態様および方法の多くの均等物を認識するか、または単なる日常的な実験を用いて確認することができる。このような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。

【図1】

【図2】

【配列表】

2024056730000001.app

【手続補正書】

【提出日】2024-02-21

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項1】

本願明細書または図面に記載された発明。

【外国語明細書】