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特開2024-56915フルクトース－６－リン酸３－エピマー化酵素およびその用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024056915
(43)【公開日】2024-04-23
(54)【発明の名称】フルクトース－６－リン酸３－エピマー化酵素およびその用途
(51)【国際特許分類】
C12N 9/90 20060101AFI20240416BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20240416BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240416BHJP
【ＦＩ】
C12N9/90 ZNA
C12N15/09 Z
C12N1/15
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024021880
(22)【出願日】2024-02-16
(62)【分割の表示】P 2022525218の分割
【原出願日】2020-10-28
(31)【優先権主張番号】10-2019-0134730
(32)【優先日】2019-10-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2020-0141069
(32)【優先日】2020-10-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(71)【出願人】
【識別番号】500578515
【氏名又は名称】サムヤン コーポレイション
(74)【代理人】
【識別番号】110002837
【氏名又は名称】弁理士法人アスフィ国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ホ，ジンソル
(72)【発明者】
【氏名】ジョン，インソク
(72)【発明者】
【氏名】チェ，ウンス
(57)【要約】 （修正有）
【課題】フルクトース－６－リン酸のエピマー化酵素タンパク質、前記酵素タンパク質をコードする核酸分子、前記核酸分子を含む組換えベクターおよび形質転換微生物、ならびにこれらを利用したアルロース生産用組成物を提供する。
【解決手段】Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｕｎｄｅｎｓｅ ＤＳＭ １７０４９由来の酵素であり得るフルクトース－６－リン酸（ｆｒｕｃｔｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）エピマー化酵素タンパク質、前記酵素タンパク質を発現する微生物、前記酵素タンパク質を発現する形質転換微生物、前記微生物の菌体、前記微生物の菌体破砕物、前記微生物の培養物、前記微生物の培養上清液、前記微生物の培養上清液の濃縮物およびこれらの粉末からなる群より選択された１種以上、並びに、マンガンイオンおよびニッケルイオンからなる群より選択された１種以上の金属イオンを含む、アルロース生産用組成物とする。
【選択図】なし
【解決手段】Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｕｎｄｅｎｓｅ ＤＳＭ １７０４９由来の酵素であり得るフルクトース－６－リン酸（ｆｒｕｃｔｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）エピマー化酵素タンパク質、前記酵素タンパク質を発現する微生物、前記酵素タンパク質を発現する形質転換微生物、前記微生物の菌体、前記微生物の菌体破砕物、前記微生物の培養物、前記微生物の培養上清液、前記微生物の培養上清液の濃縮物およびこれらの粉末からなる群より選択された１種以上、並びに、マンガンイオンおよびニッケルイオンからなる群より選択された１種以上の金属イオンを含む、アルロース生産用組成物とする。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１のアミノ酸配列を有し、フルクトース－６－リン酸（Ｆｒｕｃｔｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）をアルロース－６－リン酸（ａｌｌｕｌｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）に転換させるフルクトース－６－リン酸（ｆｒｕｃｔｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）エピマー化酵素タンパク質、前記酵素タンパク質を発現する微生物、前記酵素タンパク質を発現する形質転換微生物、前記微生物の菌体、前記微生物の菌体破砕物、前記微生物の培養物、前記微生物の培養上清液、前記微生物の培養上清液の濃縮物およびこれらの粉末からなる群より選択された１種以上、並びに、
マンガンイオンおよびニッケルイオンからなる群より選択された１種以上の金属イオンを含む、アルロース生産用組成物。
マンガンイオンおよびニッケルイオンからなる群より選択された１種以上の金属イオンを含む、アルロース生産用組成物。
【請求項2】
前記酵素は、配列番号２のヌクレオチド配列によりコードされるものである、請求項１に記載のアルロース生産用組成物。
【請求項3】
前記酵素は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｕｎｄｅｎｓｅに由来し、４０～７０℃の酵素反応温度およびｐＨ６～８の酵素反応ｐＨを有するものである、請求項１に記載のアルロース生産用組成物。
【請求項4】
前記酵素は、マンガンイオン、コバルトイオンまたはニッケルイオンにより活性が増加するものである、請求項１に記載のアルロース生産用組成物。
【請求項5】
前記組成物は、アルロース－６－リン酸の脱リン酸化酵素、これを発現する微生物または前記微生物の培養物を追加的に含む、請求項１～４のいずれかに記載のアルロース生産用組成物。
【請求項6】
前記組成物は、ブドウ糖６－リン酸をフルクトース－６－リン酸に転換する異性化酵素、これを発現する微生物または前記微生物の培養物を追加的に含む、請求項１～５のいずれかに記載のアルロース生産用組成物。
【請求項7】
前記組成物は、（ａ）（ｉ）デンプン、マルトデキストリン、スクロースまたはその組み合わせ；（ｉｉ）リン酸（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）；（ｉｉｉ）アルロース－６－リン酸脱リン酸化酵素；（ｉｖ）ブドウ糖－６－リン酸－異性化酵素；（ｖ）ホスホグルコムターゼまたはブドウ糖リン酸化酵素；および（ｖｉ）α－グルカノホスホリラーゼ、デンプンホスホリラーゼ、マルトデキストリンホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、α－アミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、グルコアミラーゼまたはスクラーゼ；または
（ｂ）前記項目（ａ）の酵素を発現する微生物または前記微生物の培養物を追加的に含む、アルロース－６－リン酸の脱リン酸化酵素を追加的に含む、請求項１～６のいずれかに記載のアルロース生産用組成物。
（ｂ）前記項目（ａ）の酵素を発現する微生物または前記微生物の培養物を追加的に含む、アルロース－６－リン酸の脱リン酸化酵素を追加的に含む、請求項１～６のいずれかに記載のアルロース生産用組成物。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか一項に記載のアルロース生産用組成物を利用して、フルクトース－６－リン酸をアルロース－６－リン酸に転換させる工程を含む、アルロースを製造する方法。
【請求項9】
前記アルロース－６－リン酸にフィターゼ（ｐｈｙｔａｓｅ）、これを発現する微生物、または前記微生物の培養物を接触させることで、前記アルロース－６－リン酸をアルロースに転換する工程を追加的に含む、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記フルクトース－６－リン酸をアルロース－６－リン酸に転換させる工程は、４０～７０℃の反応温度およびｐＨ６～８の反応ｐＨで行われるものである、請求項８に記載の方法。
【請求項11】
ヘキソキナーゼ（ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ）を利用して、果糖または果糖含有物質からフルクトース－６－リン酸を製造する工程を追加的に行うものである、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、リン酸化糖エピマー化酵素タンパク質、より詳しくは、フルクトース－６－リン酸（ｆｒｕｃｔｏｓｅ－６－ｐｈｏｐｈａｔｅ）の３－エピマー化酵素タンパク質、前記酵素タンパク質をコードする核酸分子、前記核酸分子を含む組換えベクターおよび形質転換菌株、前記菌株を利用したアルロース生産用組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
リン酸化糖のエピマー化酵素は、多様なリン酸化糖にある炭素に結合されたエピマー化酵素であって、ケトヘキソース－６－リン酸エピマー化酵素は、Ｃ３またはＣ４をエピマー化することができる。前記ケトヘキソースは、果糖（ｆｒｕｃｔｏｓｅ）、アルロース、ソルボース（ｓｏｒｂｏｓｅ）、およびタガトース（ｔａｇａｔｏｓｅ）からなる群より選択された１種以上のケトヘキソースであり得る。
【0003】
フルクトース－６－リン酸のエピマー化酵素は、３－エピマー化酵素と４－エピマー化酵素を含む。具体的に、アルロース－３－エピマー化酵素（Ｄ－アルロース－３－ｅｐｉｍｅｒａｓｅ、ＥＣ５．１．３．３０）は果糖（Ｄ－ｆｒｕｃｔｏｓｅ）を３－エピマー化（３－ｅｐｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ、３番炭素エピマー化）してアルロース－６－リン酸を生産する。
【0004】
前記酵素を使用して果糖からアルロースを生産する場合、基質として使用する果糖と産物であるアルロースとの間の一定水準の反応平衡が存在して、効率が非常に低い。したがって、前記酵素を利用した単一反応を通じて高純度アルロースを製造しようとする場合、最終反応液から果糖を分離して除去する追加工程が必要である。
【0005】
産業的に果糖を原料にしてアルロースを製造しようとする場合に、使用される酵素は産業的生産条件、特に熱安定性が高く、最大限高い転換率を有さなければならず、また糖を基質として使用することから、糖の褐変化がアルカリ条件で簡単に起こるため、できる限り糖の褐変が防止される転換反応条件を満たす必要がある。
【0006】
したがって、産業的に使用するためには、適した基質転換率、酵素の熱安定性、および酵素反応条件を少なくとも一つ以上満たし、果糖を原料にしてリン酸化果糖を製造する酵素およびこれを利用したリン酸化果糖の生産方法が切実に必要であるのが実情である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明の一例は、フルクトース－６－リン酸の３－エピマー化酵素タンパク質、前記酵素タンパク質をコードする核酸分子、前記核酸分子を含む組換えベクターおよび形質転換微生物に関する。
【0008】
本発明の他の一例は、フルクトース－６－リン酸の３－エピマー化酵素タンパク質、前記酵素を発現する微生物の菌体、前記菌体の破砕物、前記微生物の培養物、前記微生物の培養物上清液またはこれらの抽出物からなる群より選択された１種以上を含む、フルクトース－６－リン酸を利用してアルロース－６－リン酸を製造する方法、およびアルロース－６－リン酸の製造用組成物に関する。
【0009】
本発明の追加の一例は、フルクトース－６－リン酸の３－エピマー化酵素タンパク質、前記酵素を発現する微生物の菌体、前記菌体の破砕物、前記微生物の培養物、前記微生物
の培養物上清液またはこれらの抽出物からなる群より選択された１種以上を含む、フルクトース－６－リン酸を利用してケトヘキソース、例えばアルロースを生産する組成物およびアルロース生産方法に関する。
の培養物上清液またはこれらの抽出物からなる群より選択された１種以上を含む、フルクトース－６－リン酸を利用してケトヘキソース、例えばアルロースを生産する組成物およびアルロース生産方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明の目的を達成するために、本発明の一例は、配列番号１のアミノ酸配列と配列相同性が７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上または９９％以上であるアミノ酸配列を含むフルクトース－６－リン酸の３－エピマー化酵素タンパク質に関する。例えば、このような相同性を有し、前記配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質と相応する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を有しても本発明の範囲内に含まれることは自明である。
【0011】
本発明の具体的な一例は、配列番号１のアミノ酸配列と配列相同性が７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上または９９％以上であるアミノ酸配列を含むフルクトース－６－リン酸３－エピマー化酵素を提供する。前記フルクトース－６－リン酸３－エピマー化酵素は、配列番号２のヌクレオチド配列または配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上または９９％以上の相同性を有するヌクレオチド配列によりコードされるものであり得る。
【0012】
前記数値の相同性を示すアミノ酸配列として、実質的に前記酵素と同一であるか相応するフルクトース－６－リン酸３－エピマー化酵素タンパク質であれば制限なしに含むことができる。またこのような相同性を有する配列として、実質的にフルクトース－６－リン酸３－エピマー化酵素機能を示すアミノ酸配列であれば、一部配列が欠失、変形、置換または付加されたタンパク質変異体も本発明の範囲内に含まれる。
【0013】
前記で用語「相同性」または「一致性」は、与えられたアミノ酸配列または塩基配列と一致する程度を意味し、百分率で表示され得る。本明細書で、与えられたアミノ酸配列または塩基配列と同一または類似の活性を有するその相同性配列が「％相同性」で表示される。
【0014】
本発明によるフルクトース－６－リン酸３－エピマー化酵素は、フルクトース－６－リン酸（ｆｒｕｃｔｏｓｅ ６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の３－エピマー化反応を触媒し、具体的にフルクトース－６－リン酸の３－エピマー化反応を行ってアルロース－６－リン酸に転換することができる。
【0015】
本発明によるフルクトース－６－リン酸３－エピマー化酵素タンパク質は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｕｎｄｅｎｓｅ由来の酵素、具体的にＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｕｎｄｅｎｓｅ ＤＳＭ １７０４９由来の酵素であり得る。
【0016】
前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｕｎｄｅｎｓｅ由来フルクトース－６－リン酸３－エピマー化酵素の反応温度範囲は、４０～７０℃、４５～７５℃、４５～７７℃、５０～７０℃または５０～７５℃であり得る。前記最適温度は、例えば、ｐＨ７．０条件で５分間反応進行時の結果であり得るが、これに制限されない。フルクトース－６－リン酸３－エピマー化酵素の最適温度条件は６０℃であり、４０～７０℃条件にわたる広い温度条件範囲で酵素最大活性の５０％以上の活性を有する。
【0017】
前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｕｎｄｅｎｓｅ由来フルクトース－６－リン酸３－エピマー化酵素の反応ｐＨ範囲は、ｐＨ６～８、ｐＨ６～７．５、ｐＨ６．５～８、ｐＨ６．５～７．５、ｐＨ７～８、またはｐＨ７～７．５であり得、ｐＨ７．０～７．５条件で最大活性を有し、ｐＨ６．０～８．０範囲で酵素最大活性の８０％以上の活性を有する。
【0018】
前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｕｎｄｅｎｓｅ由来フルクトース－６－リン酸３－エピマー化酵素の最大のアルロース生成量は、１６重量％以上、１８重量％以上、２０重量％以上、２５重量％以上、２７重量％以上、３０重量％以上または３２重量％以上であり得る。具体的に、前記酵素の最大アルロース生成量は、酵素０．１ｍｇ／ｍｌを２０ｇ／Ｌフルクトース－６－リン酸を溶解した溶解液に添加して反応を行ったものであり得、より詳しくは、前記酵素０．１ｍｇ／ｍｌを２０ｇ／Ｌフルクトース－６－リン酸を溶解した溶解液に添加してｐＨ７．０および５０℃条件で酵素反応を行って測定したものであり得る。
【0019】
前記アルロース最大転換率は、下記数式１により計算され得る。前記アルロース最大転換率を求めるための酵素反応の時間は、８時間以上、１０時間以上、１２時間以上、１４時間以上または１６時間以上であり得、前記反応時間の上限は１８時間以下、または２０時間以下であり得、具体的な反応時間は前記下限と上限を組み合わせた範囲であり得、例えば１６時間～２０時間であり得る。
［数式１］
アルロース最大転換率（％）＝（アルロース生成量（ｇ／Ｌ）／フルクトース－６－リン酸投与量ｇ／Ｌ）＊（アルロース分子量／フルクトース－６－リン酸分子量）＊１００
［数式１］
アルロース最大転換率（％）＝（アルロース生成量（ｇ／Ｌ）／フルクトース－６－リン酸投与量ｇ／Ｌ）＊（アルロース分子量／フルクトース－６－リン酸分子量）＊１００
【0020】
前記酵素反応の生成物の糖類中でのアルロース生成比率（重量％）は、下記数式により計算され得る。前記アルロース生成比率を求めるための酵素反応時間は、２時間～６時間、３時間～６時間、または４時間～６時間であり得、例えば４時間～６時間であり得る。
［数式２］
前記アルロース生成比率（重量％）＝アルロース生成量／（果糖生成量＋アルロース生成量）＊１００
［数式２］
前記アルロース生成比率（重量％）＝アルロース生成量／（果糖生成量＋アルロース生成量）＊１００
【0021】
本発明によるフルクトース－６－リン酸３－エピマー化酵素タンパク質は、金属イオンにより酵素活性が増加または減少することができる。具体的に、フルクトース－６－リン酸３－エピマー化酵素タンパク質は、Ｍｎ、ＣｏおよびＮｉイオンにより酵素活性が増加し、例えば金属イオンがない条件の酵素活性に比べて１．１倍以上、１．２倍以上、１．３倍以上、または１．５倍以上の活性を示し、特にＭｎとＣｏイオンは２倍以上、または３倍以上の活性、具体的に金属イオンがない条件に比べて２倍～５倍以下、２倍～４倍以下、３倍～５倍以下、または３倍～５倍以下の活性を示す。フルクトース－６－リン酸３－エピマー化酵素タンパク質は、Ｃａ、Ｃｕ、Ｆｅ、またはＺｅイオンにより活性が減少する特性を有する。したがって、フルクトース－６－リン酸３－エピマー化酵素タンパク質を利用してアルロースを生産する条件は、Ｃａ、Ｃｕ、Ｆｅ、およびＺｅイオンからなる群より選択された少なくとも１種以上の金属イオンを含まないことが好ましい。
【0022】
本発明の一例によるフルクトース－６－リン酸３－エピマー化酵素が配列番号１のアミノ酸配列と配列相同性が７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上または９９％以上であるアミノ酸配列を含み、前記配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質と相応する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を有しても本発明の範囲内に含まれることは自明である。
【0023】
前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｕｎｄｅｎｓｅ由来フルクトース－６－リン酸３－エピマー化酵素タンパク質は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＡＦ１４－１０由来ｒ
ｉｂｕｌｏｓｅ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ３－ｅｐｉｍｅｒａｓｅ（ＲｕＦＰ３Ｅ：アミノ酸配列－配列番号５）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ． ＤＬ－ＶＩＩＩ由来ｒｉｂｕｌｏｓｅ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ３－ｅｐｉｍｅｒａｓｅ（ＣＤＦＰ３Ｅ：アミノ酸配列－配列番号７）、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｒｉｂｂｅｎｓｉｓ由来ｒｉｂｕｌｏ
ｓｅ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ３－ｅｐｉｍｅｒａｓｅ（ＰｋＦＰ３Ｅ：アミノ酸配列－配列番号９）とアミノ酸配列同一性を分析した結果、ＲｕＦＰ３Ｅと５９．０５％であり、ＣＤＦＰ３Ｅと６３％であり、ＰｋＦＰ３Ｅとアミノ酸配列同一性は６０．９６％であって、配列番号１のアミノ酸配列と配列相同性が７０％未満であった。
ｉｂｕｌｏｓｅ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ３－ｅｐｉｍｅｒａｓｅ（ＲｕＦＰ３Ｅ：アミノ酸配列－配列番号５）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ． ＤＬ－ＶＩＩＩ由来ｒｉｂｕｌｏｓｅ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ３－ｅｐｉｍｅｒａｓｅ（ＣＤＦＰ３Ｅ：アミノ酸配列－配列番号７）、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｒｉｂｂｅｎｓｉｓ由来ｒｉｂｕｌｏ
ｓｅ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ３－ｅｐｉｍｅｒａｓｅ（ＰｋＦＰ３Ｅ：アミノ酸配列－配列番号９）とアミノ酸配列同一性を分析した結果、ＲｕＦＰ３Ｅと５９．０５％であり、ＣＤＦＰ３Ｅと６３％であり、ＰｋＦＰ３Ｅとアミノ酸配列同一性は６０．９６％であって、配列番号１のアミノ酸配列と配列相同性が７０％未満であった。
【0024】
また、フルクトース６－リン酸からアルロース６－リン酸への転換活性を分析したＨＰＬＣの結果、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣｌＦＰ３Ｅ酵素ではアルロースピークが確認されたが、前記ＲｕＦＰ３Ｅ、ＣＤＦＰ３ＥおよびＰｋＦＰ３Ｅではアルロースピークが確認されなかった。そこで、ＣｌＦＰ３Ｅ酵素以外の他の候補群酵素はＦ６Ｐに対する活性がなかったため、脱リン酸化酵素（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）を処理した時、反応工程の最初基質であるＦ６Ｐからリン酸（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）が除去された形態の果糖のみが生成されたことを確認することができる（図７ａ、７ｂ）。
【0025】
本発明の追加の例として、本発明のフルクトース－６－リン酸３－エピマー化酵素をコードする核酸分子を提供する。本発明によるフルクトース－６－リン酸３－エピマー化酵素をコードする核酸の具体的な一例は、前記フルクトース－６－リン酸３－エピマー化酵素は、配列番号２のヌクレオチド配列、または配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上または９９％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含むことができる。
【0026】
本発明はまた他の一様態として、本発明のフルクトース－６－リン酸３－エピマー化酵素をコードする核酸を含むベクターまたは形質転換体を提供する。
【0027】
本明細書で用語「形質転換」は、標的タンパク質をコードする核酸を含むベクターを宿主細胞内に導入して宿主細胞内で前記核酸がコードするタンパク質が発現することができるようにすることを意味する。形質転換された核酸は宿主細胞内で発現さえできれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか染色体以外に位置するか関係なしにこれら全てを含むことができる。また、前記核酸は、標的タンパク質をコードするＤＮＡおよびＲＮＡを含む。前記核酸は、宿主細胞内に導入されて発現され得るものであれば、いかなる形態で導入されるものでも関係ない。例えば、前記核酸は、自己発現するのに必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）の形態で宿主細胞に導入され得る。前記発現カセットは、通常、前記核酸に作動可能に連結されているプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、転写終結信号、リボソーム結合部位および翻訳終結信号を含むことができる。前記発現カセットは、自己複製が可能な発現ベクター形態であり得る。また、前記核酸は、それ自体の形態で宿主細胞に導入されて宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであり得るが、これに限定されない。
【0028】
また、前記で用語「作動可能に連結」されたとは、本発明の目的タンパク質をコードする核酸の転写を開始および媒介するようにするプロモーター配列と前記遺伝子配列が機能的に連結されていることを意味する。
【0029】
本発明のベクターを形質転換させる方法は、核酸を細胞内に導入するいかなる方法も含まれ、宿主細胞により当該分野で公知されているとおり、適した標準技術を選択して行うことができる。例えば、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈澱、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈澱、微細注入法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、陽イオンリポゾーム法、および酢酸リチウム－ＤＭＳＯ法などがあるが、これに制限されない。
【0030】
前記宿主細胞としては、ＤＮＡの導入効率が高く、導入されたＤＮＡの発現効率が高い宿主を使用することが良く、例えば大腸菌であり得るが、これに制限されるのではない。
【0031】
本発明はまた他の一様態として、本発明によるフルクトース－６－リン酸３－エピマー化酵素タンパク質、前記酵素タンパク質を発現する微生物、前記酵素タンパク質を発現する形質転換微生物、前記微生物の菌体、前記微生物の菌体破砕物、前記微生物の培養物、前記微生物の培養上清液、前記微生物の培養上清液の濃縮物およびこれらの粉末からなる群より選択された１種以上を含むケトヘキソース、例えばアルロース生産用組成物を提供する。
【0032】
前記培養物は、フルクトース－６－リン酸３－エピマー化酵素を生産する微生物から生産された酵素を含むものであって、前記菌株を含むか菌株を含まないｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ形態であり得る。前記破砕物は、フルクトース－６－リン酸３－エピマー化酵素を生産する微生物の菌体を破砕した破砕物または前記破砕物を遠心分離して得られた上清液を意味するものであって、前記ポリホスフェート依存型ブドウ糖リン酸化酵素を生産する微生物から生産された酵素を含むものである。
【0033】
前記菌株の培養物は、前記フルクトース－６－リン酸３－エピマー化酵素を生産する微生物から生産された酵素を含むものであって、前記微生物菌体を含むか含まないｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ形態であり得る。本明細書において、別途の言及がない限り、使用されるフルクトース－６－リン酸３－エピマー化酵素を生産する微生物は、前記菌株の菌体、前記菌株の培養物、前記菌体の破砕物、前記破砕物の上清液、およびこれらの抽出物からなる群より選択された１種以上を含むものを意味する。
【0034】
本発明によるケトヘキソース、例えばアルロース生産方法は、微生物から得られた酵素を利用するため、環境にやさしく、簡単な酵素反応により果糖からアルロース生産を以前になかった方法で転換させ、生産経費を大幅に低減する一方で、生産効果を極大化することができる。
【0035】
本発明によるアルロース生産用組成物は、Ｍｎ、ＣｏおよびＮｉイオンからなる群より選択された１種以上の金属イオンを追加的に含むことができる。前記金属イオンの濃度は、０．５ｍＭ～２０ｍＭであり得、例えば、０．５ｍＭ～１０ｍＭ、１．０ｍＭ～１０ｍＭ、１．５ｍＭ～８．０ｍＭ、２．０ｍＭ～８．０ｍＭ、３．０ｍＭ～７．０ｍＭ、４．０ｍＭ～６．０ｍＭ、または０．２ｍＭ～１０ｍＭであり得る。
【0036】
前記アルロース生産用組成物を利用してアルロースを生産する場合、酵素または酵素を生産する微生物を利用した反応温度および反応ｐＨ条件は、前記酵素の反応温度および反応ｐＨ条件で前述したとおりである。
【0037】
前記アルロース生産用組成物は、果糖をフルクトース－６－リン酸に転換するヘキソキナーゼ酵素、前記酵素タンパク質を発現する形質転換微生物、前記微生物の菌体、前記微生物の菌体破砕物、前記微生物の培養物、前記微生物の培養上清液、前記微生物の培養上清液の濃縮物およびこれらの粉末からなる群より選択された１種以上を含むことができる。
【0038】
前記フルクトース－６－リン酸は、果糖または果糖含有物質をヘキソキナーゼ処理して得たものが好ましいが、他の化学的合成方法などにより提供される場合にも本発明の保護範囲に含まれる。
【0039】
前記フルクトース－６－リン酸は、ブドウ糖－６－リン酸から製造され得、前記アルロ
ース生産用組成物は、ブドウ糖－６－リン酸を異性化してフルクトース－６－リン酸に転換するブドウ糖－６－リン酸異性化酵素を追加的に含むことができる。
ース生産用組成物は、ブドウ糖－６－リン酸を異性化してフルクトース－６－リン酸に転換するブドウ糖－６－リン酸異性化酵素を追加的に含むことができる。
【0040】
前記ブドウ糖－６－リン酸は、ブドウ糖を直接リン酸化して製造されたり、ブドウ糖－１－リン酸から転換され得る。ブドウ糖は、デンプンまたはデンプン加水分解物、例えばデキストリンなどをブドウ糖生成アミラーゼで処理して得られたブドウ糖であり得、ブドウ糖－１－リン酸は、前記ブドウ糖にリン酸化酵素を処理して得られるものであり得る。前記ケトヘキソース生産用組成物は、ブドウ糖－６－リン酸を製造するための酵素システムを追加的に含むことができる。
【0041】
具体的に、本発明のアルロース生産用組成物に含まれる酵素およびアルロース生産に利用される基質は制限されない。本発明のアルロース生産用組成物は、（ａ）（ｉ）デンプン、マルトデキストリン、スクロースまたはその組み合わせ、ブドウ糖、ブドウ糖－１－リン酸、ブドウ糖－６－リン酸、またはフルクトース－６－リン酸；（ｉｉ）リン酸（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）；（ｉｉｉ）アルロース－６－リン酸脱リン酸化酵素；（ｉｖ）ブドウ糖－６－リン酸－異性化酵素；（ｖ）ホスホグルコムターゼまたはブドウ糖リン酸化酵素；および／または（ｖｉ）α－グルカンホスホリラーゼ、デンプンホスホリラーゼ、マルトデキストリンホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、α－アミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、グルコアミラーゼまたはスクラーゼ；または（ｂ）前記項目（ａ）の酵素を発現する微生物または前記項目（ａ）の酵素を発現する微生物の培養物を追加的に含むことができるが、これに制限されない。
【0042】
具体的に、本発明のデンプン／マルトデキストリンホスホリラーゼ（ｓｔａｒｃｈ／ｍａｌｔｏｄｅｘｔｒｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ、ＥＣ２．４．１．１）およびα－グルカンホスホリラーゼは、リン酸（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）をブドウ糖に転移させてデンプンまたはマルトデキストリンからブドウ糖－１－リン酸を生産する活性を有するタンパク質であればいかなるタンパク質も含むことができる。
【0043】
本発明のスクロースホスホリラーゼ（ｓｕｃｒｏｓｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ、ＥＣ２．４．１．７）は、リン酸をブドウ糖に転移させてスクロースからブドウ糖－１－リン酸を生産する活性を有するタンパク質であればいかなるタンパク質も含むことができる。
【0044】
本発明のデンプン液化糖化酵素であるα－アミラーゼ（α－ａｍｙｌａｓｅ、ＥＣ３．２．１．１）、プルラナーゼ（ｐｕｌｌｕｌａｎｓｅ、ＥＣ３．２．１．４１）、グルコアミラーゼ（ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ、ＥＣ３．２．１．３）およびイソアミラーゼ（ｉｓｏａｍｙｌａｓｅ）は、デンプンまたはマルトデキストリンをブドウ糖に転換させる活性を有するタンパク質であればいかなるタンパク質も含むことができる。
【0045】
本発明のスクラーゼ（ｓｕｃｒａｓｅ、ＥＣ３．２．１．２６）は、スクロースをブドウ糖に転換させる活性を有するタンパク質であればいかなるタンパク質も含むことができる。本発明に適用可能なホスホグルコムターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｍｕｔａｓｅ、ＥＣ５．４．２．２）は、ブドウ糖－１－リン酸をブドウ糖－６－リン酸に転換させる活性を有するタンパク質であればいかなるタンパク質も含むことができる。ブドウ糖リン酸化酵素（ｇｌｕｃｏｋｉｎａｓｅ）は、ブドウ糖にリン酸を転移させてブドウ糖－６－リン酸に転換する活性を有するタンパク質であればいかなるタンパク質も含むことができる。具体的に、前記ブドウ糖リン酸化酵素は、ポリホスフェート依存型ブドウ糖リン酸化酵素であり得る。
【0046】
本発明のブドウ糖－６－リン酸異性化酵素は、ブドウ糖－６－リン酸をフルクトース－
６－リン酸に転換させる活性を有するタンパク質であればいかなるタンパク質も含むことができる。
６－リン酸に転換させる活性を有するタンパク質であればいかなるタンパク質も含むことができる。
【0047】
本発明のアルロース－６－リン酸脱リン酸化酵素は、アルロース－６－リン酸をアルロースに転換させる活性を有するタンパク質であればいかなるタンパク質も含むことができる。より具体的に、前記アルロース－６－リン酸脱リン酸化酵素は、非可逆的にアルロース－６－リン酸をアルロースに転換させる活性を有するタンパク質であり得る。前記アルロース生産用組成物は、アルロース－６－リン酸で脱リン酸化反応を行うフィターゼ（ｐｈｙｔａｓｅ）、例えばアルロース６－リン酸の脱リン酸化酵素（ａｌｌｕｌｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）を追加的に含むことができるが、これに限定されない。前記ケトヘキソース生産用組成物は、アルロース－６－リン酸の脱リン酸化酵素（ａｌｌｕｌｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、前記アルロース－６－リン酸の脱リン酸化酵素を発現する微生物または前記アルロース－６－リン酸脱リン酸化酵素を発現する微生物の培養物を追加的に含むことができる。
【0048】
前記ケトヘキソース生産用組成物を利用してケトヘキソース、例えばアルロース－６－リン酸を生産する酵素または酵素を生産する微生物を利用した反応温度および反応ｐＨ条件は、前記酵素の反応温度および反応ｐＨ条件で前述したとおりである。
【0049】
前記方法は、ヘキソキナーゼ（ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ）を利用して、果糖または果糖含有物質からフルクトース－６－リン酸を製造する工程を追加的に含むことができるか、および／または脱リン酸化酵素をこれを発現する微生物、または前記微生物の培養物を接触させてリン酸を除去する工程を追加的に含むことができる。
【0050】
前記リン酸基を除去する工程は、アルロース－６－リン酸脱リン酸化酵素（ａｌｌｕｌｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、前記アルロース－６－リン酸脱リン酸化酵素を発現する微生物または前記アルロース－６－リン酸脱リン酸化酵素を発現する微生物の培養物を利用して行ってアルロースを製造することができる。前記アルロース６－リン酸は、他の酵素または化学的な方法などによりリン酸基が除去されることもできる。
【0051】
本発明の一例は、フルクトース－６－リン酸３－エピマー化酵素、前記フルクトース－６－リン酸３－エピマー化酵素を発現する微生物または前記フルクトース－６－リン酸３－エピマー化酵素を発現する微生物の培養物を接触させてフルクトース－６－リン酸をアルロース－６－リン酸に転換する工程を含むアルロース製造方法を提供する。
【0052】
本発明の製造方法は、前記フルクトース－６－リン酸をアルロース－６－リン酸に転換する工程の後に、アルロース－６－リン酸にアルロース－６－リン酸脱リン酸化酵素、前記アルロース－６－リン酸脱リン酸化酵素を発現する微生物または前記アルロース－６－リン酸脱リン酸化酵素を発現する微生物の培養物を接触させることで、前記アルロース－６－リン酸をアルロースに転換する工程を追加的に含むことができる。
【0053】
また、本発明の製造方法は、前記フルクトース－６－リン酸をアルロース－６－リン酸に転換する工程の前に、ブドウ糖－６－リン酸にブドウ糖－６－リン酸－異性化酵素、前記ブドウ糖－６－リン酸－異性化酵素を発現する微生物または前記ブドウ糖－６－リン酸－異性化酵素を発現する微生物の培養物を接触させることで、前記ブドウ糖－６－リン酸をフルクトース－６－リン酸に転換する工程を追加的に含むことができる。
【0054】
また、本発明の製造方法は、前記ブドウ糖－６－リン酸をフルクトース－６－リン酸に転換する工程の前に、ブドウ糖－１－リン酸（Ｇｌｕｃｏｓｅ－１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
）にホスホグルコムターゼ、前記ホスホグルコムターゼを発現する微生物または前記ホスホグルコムターゼを発現する微生物の培養物を接触させることで、前記ブドウ糖－１－リン酸をブドウ糖－６－リン酸に転換する工程を追加的に含むことができる。
）にホスホグルコムターゼ、前記ホスホグルコムターゼを発現する微生物または前記ホスホグルコムターゼを発現する微生物の培養物を接触させることで、前記ブドウ糖－１－リン酸をブドウ糖－６－リン酸に転換する工程を追加的に含むことができる。
【0055】
本発明の製造方法は、前記ブドウ糖－６－リン酸をフルクトース－６－リン酸に転換する工程の前に、ブドウ糖（Ｇｌｕｃｏｓｅ）にブドウ糖リン酸化酵素、前記ブドウ糖リン酸化酵素を発現する微生物または前記ブドウ糖リン酸化酵素を発現する微生物の培養物、およびリン酸を接触させることで、前記ブドウ糖をブドウ糖－６－リン酸に転換する工程を追加的に含むことができる。
【0056】
本発明の製造方法は、ブドウ糖－１－リン酸をブドウ糖－６－リン酸に転換する工程の前に、デンプン、マルトデキストリン、スクロースまたはその組み合わせにα－グルカンホスホリラーゼ、デンプンホスホリラーゼ、マルトデキストリンホスホリラーゼまたはスクロースホスホリラーゼ；前記ホスホリラーゼを発現する微生物；または前記ホスホリラーゼを発現する微生物の培養物、およびリン酸を接触させることで、前記デンプン、マルトデキストリン、スクロースまたはその組み合わせをブドウ糖－１－リン酸に転換する工程を追加的に含むことができる。
【0057】
本発明の製造方法は、前記ブドウ糖をブドウ糖－６－リン酸に転換する工程の前に、デンプン、マルトデキストリン、スクロースまたはその組み合わせにα－アミラーゼ、プルラナーゼ、グルコアミラーゼ、スクラーゼまたはイソアミラーゼ；前記アミラーゼ、プルラナーゼまたはスクラーゼを発現する微生物；または前記アミラーゼ、プルラナーゼまたはスクラーゼを微生物の培養物を接触させることで、前記デンプン、マルトデキストリン、スクロースまたはその組み合わせをブドウ糖に転換する工程を追加的に含むことができる。
【0058】
本発明の製造方法は、ブドウ糖に４－α－グルカノトラスファラーゼ、前記４－α－グルカノトラスファラーゼを発現する微生物または前記４－α－グルカノトラスファラーゼを発現する微生物の培養物を接触させることで、前記ブドウ糖をデンプン、マルトデキストリンまたはスクロースに転換する工程を追加的に含むことができる。
【0059】
このような方法で生産されたアルロースは、機能性食品および医薬品に添加されて有用に使用することができる。
【発明の効果】
【0060】
本発明によるフルクトース－６－リン酸３－エピマー化酵素は、高い酵素転換率、酸性または中性の反応ｐＨ条件および高い熱安定性の特性のうちの少なくとも一つ以上を満たすため、産業的規模でフルクトース－６－リン酸３－エピマー化酵素を利用したケトヘキソースの生産に有用に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【0061】
【図1】本発明の一例によるフルクトース－６－リン酸の３－エピマー化酵素タンパク質の発現および精製を確認した電気泳動写真である。
【図2】本発明の一例によるフルクトース－６－リン酸の３－エピマー化酵素タンパク質のＢＩＯ－ＬＣで分析した結果を示す。
【図3】本発明の一例によりアルロース－６－リン酸フォスファターゼの酵素反応を通じて反応液のリン酸化糖を脱リン酸化させた後、ＬＣで分析した結果である。
【図4】本発明の一例によりフルクトース－６－リン酸の３－エピマー化酵素タンパク質の温度特性を分析した結果を示すグラフである。
【図5】本発明の一例によりフルクトース－６－リン酸の３－エピマー化酵素タンパク質のｐＨ特性を分析した結果を示すグラフである。
【図6】本発明の一例によりフルクトース－６－リン酸の３－エピマー化酵素タンパク質の金属イオン影響を示す結果を示すグラフである。
【図7a】公知の３種類のｒｉｂｕｌｏｓｅ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ３－ｅｐｉｍｅｒａｓｅを利用したアルロース生産を行った後に得られた反応物のＨＰＬＣ分析結果である。
【図7b】公知の３種類のｒｉｂｕｌｏｓｅ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ３－ｅｐｉｍｅｒａｓｅを利用したアルロース生産を行った後に得られた反応物のＨＰＬＣ分析結果である。
【発明を実施するための形態】
【実施例0062】
本発明は、下記の実施例を挙げてより詳しく説明するが、下記の実施例に権利範囲が限定される意図ではない。
【0063】
実施例１： フルクトース－６－リン酸３－エピマー化酵素の生産
フルクトース－６－リン酸３－エピマー化酵素として機能すると予想される候補酵素をスクリーニングして、最も優れた効果を示すと予想される酵素としてＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｕｎｄｅｎｓｅ ＤＳＭ １７０４９菌株に由来する酵素（ＣｌＦＰ３Ｅ）のアミノ酸配列（配列番号１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２）をＩＤＴ ｇｅｎｅ合成を通じて遺伝子合成依頼して確保した。合成された配列番号２のＣｌＦＰ３Ｅ ＤＮＡ塩基配列を基本にしてプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）を考案し、ＰＣＲを実施して当該遺伝子の塩基配列を増幅した。ＰＣＲ増幅に使用された順方向配列と逆方向プライマー配列は下記のとおりである。
フルクトース－６－リン酸３－エピマー化酵素として機能すると予想される候補酵素をスクリーニングして、最も優れた効果を示すと予想される酵素としてＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｕｎｄｅｎｓｅ ＤＳＭ １７０４９菌株に由来する酵素（ＣｌＦＰ３Ｅ）のアミノ酸配列（配列番号１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２）をＩＤＴ ｇｅｎｅ合成を通じて遺伝子合成依頼して確保した。合成された配列番号２のＣｌＦＰ３Ｅ ＤＮＡ塩基配列を基本にしてプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）を考案し、ＰＣＲを実施して当該遺伝子の塩基配列を増幅した。ＰＣＲ増幅に使用された順方向配列と逆方向プライマー配列は下記のとおりである。
【0064】
【表1】
【0065】
大量で得たＣｌＦＰ３Ｅ遺伝子は、制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩを使用してｐＥＴ２１ａ ｖｅｃｔｏｒに導入してｐＥＴ２１＿ＣｌＦＰ３Ｅを製造し、これを大腸菌ＥＲ２５６６菌株に形質転換した。酵素のタンパク質発現のための組換えＥ．ｃｏｌｉは５０μｇ／ｍｌのアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）を含有するＬＢ培地で作製されたアガープレートでコロニーで確保した。
４ｍｌのＬＢ培地で種培養後、１００ｍｌのＬＢ培地で本培養を行い、培養条件は３７℃で２００ｒｐｍ条件で６００ｎｍで吸光度値０．６になる時まで培養後、ＩＰＴＧ ０．１ｍＭを添加して目的タンパク質の発現を誘導した。誘導（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）後、２５℃で約１６時間程度菌株培養後、遠心分離して菌体を回収した。前記回収された菌体はライシスバッファー（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）（５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ７．０）、３００ｍＭ
ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール（ｉｍｉｄａｚｏｌｅ））に懸濁して、ビードビーター（ｂｅａｄｂｅａｔｅｒ）を利用して細胞破砕し、細胞破砕溶液から目的タンパク質ＣｌＦＰ３Ｅの過発現をＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｇｅｌ分析を通じて確認した。前記目的タンパク質ＣｌＦＰ３Ｅの過発現分析結果を図１に示す。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｇｅｌ分析を通じて確認したＣｌＦＰ３Ｅの分子量は約２８ＫＤａであった。
また、細胞ペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を除去した後、細胞上清液のみを得てＮｉ－ＮＴＡカラム（Ｎｉ－ＮＴＡ ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ、Ｑｉａｇｅｎ）に結合（ｂｉｎｄｉｎｇ
）させた後、洗浄バッファー（ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）（５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ７．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール（ｉｍｉｄａｚｏｌｅ））でカラムに結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）されないタンパク質を除去し、最後の過程で溶出バッファー（ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）（５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ７．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｍＭイミダゾール（ｉｍｉｄａｚｏｌｅ））で目的タンパク質を溶出した。最終的に確保したタンパク質は、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ７．０）で転換して以降の使用のために保管した。
４ｍｌのＬＢ培地で種培養後、１００ｍｌのＬＢ培地で本培養を行い、培養条件は３７℃で２００ｒｐｍ条件で６００ｎｍで吸光度値０．６になる時まで培養後、ＩＰＴＧ ０．１ｍＭを添加して目的タンパク質の発現を誘導した。誘導（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）後、２５℃で約１６時間程度菌株培養後、遠心分離して菌体を回収した。前記回収された菌体はライシスバッファー（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）（５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ７．０）、３００ｍＭ
ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール（ｉｍｉｄａｚｏｌｅ））に懸濁して、ビードビーター（ｂｅａｄｂｅａｔｅｒ）を利用して細胞破砕し、細胞破砕溶液から目的タンパク質ＣｌＦＰ３Ｅの過発現をＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｇｅｌ分析を通じて確認した。前記目的タンパク質ＣｌＦＰ３Ｅの過発現分析結果を図１に示す。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｇｅｌ分析を通じて確認したＣｌＦＰ３Ｅの分子量は約２８ＫＤａであった。
また、細胞ペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を除去した後、細胞上清液のみを得てＮｉ－ＮＴＡカラム（Ｎｉ－ＮＴＡ ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ、Ｑｉａｇｅｎ）に結合（ｂｉｎｄｉｎｇ
）させた後、洗浄バッファー（ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）（５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ７．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール（ｉｍｉｄａｚｏｌｅ））でカラムに結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）されないタンパク質を除去し、最後の過程で溶出バッファー（ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）（５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ７．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｍＭイミダゾール（ｉｍｉｄａｚｏｌｅ））で目的タンパク質を溶出した。最終的に確保したタンパク質は、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ７．０）で転換して以降の使用のために保管した。
【0066】
実施例２： 酵素の転換活性の評価
実施例１で得られた精製されたＣｌＦＰ３Ｅ酵素０．１ｍｇ／ｍｌを、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ７．０）に２０ｇ／Ｌのフルクトース－６－リン酸を溶解した溶解液に添加して５０℃で酵素反応を行った。
酵素反応液の分析は、Ｂｉｏ－ＬＣ分析を通じて基質と比較して新規に生成された物質を確認したが、アルロース－６－リン酸標準物質が存在せず、正確な確認が不可であり、追加的にアルロース－６－リン酸（Ａ６ＰＰ）の脱リン酸化酵素を処理した後、生成されたアルロースを最終的に確認した。Ｂｉｏ－ＬＣ分析を通じてはＣｌＦＰ３Ｅ酵素反応時、Ｆ６Ｐの減少とＡ６Ｐと考えられる新たなピーク（ｐｅａｋ）が生成されることを確認した。前記Ｂｉｏ－ＬＣ分析結果を下記図２に示す。
Ａ６ＰＰ酵素反応を通じて反応液のリン酸化糖を脱リン酸化させた後、ＬＣで分析した結果は次のとおりである。Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ－８７Ｃ ｃｏｌｕｍｎを使用して８０℃温度で０．６ｍｌ／ｍｉｎの流速条件で分析し、その結果を図３に示す。前記分析結果、果糖とアルロースを確認することができた。
アルロース－６－リン酸フォスファターゼ（Ａ６ＰＰ）酵素反応を通じて脱リン酸化させた反応液の最終産物であるアルロースの生成量を定量して計算したＣｌＦＰ３Ｅの最終転換率は３４．３％と計算された。本実施例の反応生成物は、酵素反応を１６時間行って得たＣｌＦＰ３Ｅの最終転換率であり、アルロース最大転換率は、下記数式により計算される。
［数式１］
アルロース最大転換率（％）＝（アルロース生成量（ｇ／Ｌ）／フルクトース－６－リン酸投与量（ｇ／Ｌ））＊（アルロース分子量／フルクトース－６－リン酸分子量）＊１００
実施例１で得られた精製されたＣｌＦＰ３Ｅ酵素０．１ｍｇ／ｍｌを、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ７．０）に２０ｇ／Ｌのフルクトース－６－リン酸を溶解した溶解液に添加して５０℃で酵素反応を行った。
酵素反応液の分析は、Ｂｉｏ－ＬＣ分析を通じて基質と比較して新規に生成された物質を確認したが、アルロース－６－リン酸標準物質が存在せず、正確な確認が不可であり、追加的にアルロース－６－リン酸（Ａ６ＰＰ）の脱リン酸化酵素を処理した後、生成されたアルロースを最終的に確認した。Ｂｉｏ－ＬＣ分析を通じてはＣｌＦＰ３Ｅ酵素反応時、Ｆ６Ｐの減少とＡ６Ｐと考えられる新たなピーク（ｐｅａｋ）が生成されることを確認した。前記Ｂｉｏ－ＬＣ分析結果を下記図２に示す。
Ａ６ＰＰ酵素反応を通じて反応液のリン酸化糖を脱リン酸化させた後、ＬＣで分析した結果は次のとおりである。Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ－８７Ｃ ｃｏｌｕｍｎを使用して８０℃温度で０．６ｍｌ／ｍｉｎの流速条件で分析し、その結果を図３に示す。前記分析結果、果糖とアルロースを確認することができた。
アルロース－６－リン酸フォスファターゼ（Ａ６ＰＰ）酵素反応を通じて脱リン酸化させた反応液の最終産物であるアルロースの生成量を定量して計算したＣｌＦＰ３Ｅの最終転換率は３４．３％と計算された。本実施例の反応生成物は、酵素反応を１６時間行って得たＣｌＦＰ３Ｅの最終転換率であり、アルロース最大転換率は、下記数式により計算される。
［数式１］
アルロース最大転換率（％）＝（アルロース生成量（ｇ／Ｌ）／フルクトース－６－リン酸投与量（ｇ／Ｌ））＊（アルロース分子量／フルクトース－６－リン酸分子量）＊１００
【0067】
実施例３： 酵素の温度特性の分析
ＣｌＦＰ３Ｅ酵素活性に温度が及ぼす影響を確認するために、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ７．０）に１０ｇ／Ｌのフルクトース－６－リン酸を溶解した後、０．０１ｍｇ／ｍｌのＣｌＦＰ３Ｅ精製タンパク質を添加して４０～８０℃の間の多様な温度条件で５分間反応を進行した。
その後、Ａ６ＰＰ酵素を添加して全ての反応組成物を脱リン酸化させた後、ＨＰＬＣ分析を通じてアルロース生成量を定量分析した。前記反応温度による酵素の相対活性を最も活性が高く測定された６０℃の活性を基準にして図４に示した。
ＣｌＦＰ３Ｅ酵素活性に温度が及ぼす影響を確認するために、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ７．０）に１０ｇ／Ｌのフルクトース－６－リン酸を溶解した後、０．０１ｍｇ／ｍｌのＣｌＦＰ３Ｅ精製タンパク質を添加して４０～８０℃の間の多様な温度条件で５分間反応を進行した。
その後、Ａ６ＰＰ酵素を添加して全ての反応組成物を脱リン酸化させた後、ＨＰＬＣ分析を通じてアルロース生成量を定量分析した。前記反応温度による酵素の相対活性を最も活性が高く測定された６０℃の活性を基準にして図４に示した。
【0068】
実験の結果、ＣｌＦＰ３Ｅの最適温度条件は６０℃と確認され、４０～７０℃条件にわたる広い温度条件範囲で酵素最大活性の５０％以上の活性を有していることを確認することができた。
【0069】
実施例４： 酵素のｐＨ特性の分析
ＣｌＦＰ３Ｅ酵素活性にｐＨが及ぼす影響を確認するために、ｐＨ５．０～８．５の間
の緩衝溶液（ｐＨ５．０～６．５、クエン酸ナトリウム／ｐＨ６．５～８．５、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）に１０ｇ／Ｌのフルクトース－６－リン酸を溶解した後、０．０１ｍｇ／ｍｌのＣｌＦＰ３Ｅ精製タンパク質を添加して６０℃温度で５分の条件で酵素反応を進行した。その後、Ａ６ＰＰ酵素を添加して全ての反応組成物を脱リン酸化させた後、ＨＰＬＣ分析を通じてアルロース生成量を定量分析した。前記反応ｐＨによる酵素活性の結果は最も活性が良かったｐＨ７．５を基準にして相対活性で図５に示す。
ＣｌＦＰ３Ｅ酵素活性にｐＨが及ぼす影響を確認するために、ｐＨ５．０～８．５の間
の緩衝溶液（ｐＨ５．０～６．５、クエン酸ナトリウム／ｐＨ６．５～８．５、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）に１０ｇ／Ｌのフルクトース－６－リン酸を溶解した後、０．０１ｍｇ／ｍｌのＣｌＦＰ３Ｅ精製タンパク質を添加して６０℃温度で５分の条件で酵素反応を進行した。その後、Ａ６ＰＰ酵素を添加して全ての反応組成物を脱リン酸化させた後、ＨＰＬＣ分析を通じてアルロース生成量を定量分析した。前記反応ｐＨによる酵素活性の結果は最も活性が良かったｐＨ７．５を基準にして相対活性で図５に示す。
【0070】
実験の結果、ｐＨ７．０～７．５条件で最大活性を確認することができ、ｐＨ６．０～８．０範囲で酵素最大活性の８０％以上の活性を有することを確認することができた。
【0071】
実施例５： 酵素の金属イオン影響の分析
反応時に添加する金属イオンの種類によるＣｌＦＰ３Ｅの活性を確認するために、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ７．０）に１０ｇ／Ｌのフルクトース－６－リン酸を溶解した後、それぞれの金属イオン（ＭｇＣｌ2、ＭｎＣｌ2、ＣａＣｌ2、ＣｏＣｌ2、ＣｕＣｌ2、ＮｉＳＯ4、ＦｅＳＯ4、ＺｅＳＯ4）５ｍＭを添加した。各金属イオンを含む反応バッファーに０．０１ｍｇ／ｍｌのＣｌＦＰ３Ｅ生成たんぱく質を添加して６０℃温度で５分間反応を進行した。
その後、Ａ６ＰＰ酵素を添加して全ての反応組成物を脱リン酸化させた後、ＨＰＬＣ分析を通じてアルロース生成量を定量分析した。前記金属イオンの種類による酵素の相対活性を金属イオンを入れない実験群を基準にして図６に示す。
反応時に添加する金属イオンの種類によるＣｌＦＰ３Ｅの活性を確認するために、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ７．０）に１０ｇ／Ｌのフルクトース－６－リン酸を溶解した後、それぞれの金属イオン（ＭｇＣｌ2、ＭｎＣｌ2、ＣａＣｌ2、ＣｏＣｌ2、ＣｕＣｌ2、ＮｉＳＯ4、ＦｅＳＯ4、ＺｅＳＯ4）５ｍＭを添加した。各金属イオンを含む反応バッファーに０．０１ｍｇ／ｍｌのＣｌＦＰ３Ｅ生成たんぱく質を添加して６０℃温度で５分間反応を進行した。
その後、Ａ６ＰＰ酵素を添加して全ての反応組成物を脱リン酸化させた後、ＨＰＬＣ分析を通じてアルロース生成量を定量分析した。前記金属イオンの種類による酵素の相対活性を金属イオンを入れない実験群を基準にして図６に示す。
【0072】
実験の結果、ＭｎＣｌ2とＣｏＣｌ2を添加した時、金属イオンを入れない条件よりも３倍以上の活性を確認することができた。ＣｌＦＰ３Ｅ酵素は、マンガンとコバルトを補因子（ｃｏｆａｃｔｏｒ）で使用する酵素であることが分かった。またニッケルによっても活性が増加した。酵素活性を減少させるものはＣａＣｌ2、ＣｕＣｌ2、ＦｅＳＯ4、Ｚｅ
ＳＯ4であった。
ＳＯ4であった。
【0073】
比較例１： ｒｉｂｕｌｏｓｅ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ３－ｅｐｉｍｅｒａｓｅを利用したアルロース生産分析
Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＡＦ１４－１０由来ｒｉｂｕｌｏｓｅ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ３－ｅｐｉｍｅｒａｓｅ（ＲｕＦＰ３Ｅ：アミノ酸配列－配列番号５および核酸配列－配列番号６）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ． ＤＬ－ＶＩＩＩ由来ｒｉｂｕｌｏｓｅ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ３－ｅｐｉｍｅｒａｓｅ（ＣＤＦＰ３Ｅ：アミノ酸配列－配列番号７および核酸配列－配列番号８）、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｒｉｂｂｅｎｓｉｓ由来ｒｉｂｕｌｏｓｅ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ３－ｅｐｉｍｅｒａｓｅ（ＰｋＦＰ３Ｅ：アミノ酸配列－配列番号９および核酸配列－配列番号１０）のポリヌクレオチドを遺伝子合成依頼して確保した。
前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｕｎｄｅｎｓｅ ＤＳＭ １７０４９菌株に由来するフルクトース－６－リン酸３－エピマー化酵素（ＣｌＦＰ３Ｅ）のアミノ酸配列（配列番号１）とアミノ酸配列相同性を分析した結果、配列番号５のアミノ酸配列を有するＲｕＦＰ３Ｅとアミノ酸配列同一性は５９．０５％であり、配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＦＰ３Ｅとアミノ酸配列同一性は６３％であり、配列番号９のアミノ酸配列を有するＰｋＦＰ３Ｅとアミノ酸配列同一性は６０．９６％であった。
合成された配列番号２のＣｌＦＰ３ＥのＤＮＡ塩基配列を基本にして、前記実施例１と実質的に同様な方法で大量で遺伝子を得た。実施例１と実質的に同様な方法で、前記得られた遺伝子をＥ．ｃｏｌｉに導入して発現させた後に目的タンパク質を溶出した。最終的に確保したタンパク質は５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ７．０）で転換して以降の使用のために保管した。
フルクトース６－リン酸からアルロース６－リン酸への転換活性を分析するために、実施例２と同様な方法で、前記得られた酵素を利用してフルクトース－６－リン酸を基質で
使用した酵素反応を行った。前記酵素反応後に、アルロース－６－リン酸フォスファターゼ（Ａ６ＰＰ）酵素を利用した脱リン酸化反応を行った後、前記反応産物液を高性能液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ－Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＨＰＬＣ）を使用してアルロース生成量で測定した。
ＨＰＬＣ分析条件は、Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ－８７Ｃカラム（ＢＩＯ－ＲＡＤ）が装着されたＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ、ＵＳＡ）のＲＩＤ（Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ Ｉｎｄｅｘ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ ＲＩＤ）を利用した。移動相溶媒は水を使用し、温度は８０℃、流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎにして行った。前記ＨＰＬＣ分析結果を図７ａおよび７ｂに示す。本実施例の反応生成物は、酵素反応を４時間行って得られた酵素のアルロース転換率を得たものであり、ＦＰ３Ｅ候補群酵素に対してスクリーニング（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）をするための実験で、アルロース生成の中間工程で反応を停止した反応液を分析した結果である。図７ａおよび７ｂでＣｌＦＰ３Ｅのアルロース転換率は１６％と確認され、実施例２で得られた最大転換率と比較して約５０％水準に反応進行された。本実施例のＣｌＦＰ３Ｅの全体生成物のうち、アルロース生成比率は７５重量％であり、アルロース生成比率は下記数式により計算される。
［数式２］
前記アルロース生成比率（重量％）＝アルロース生成量／（果糖生成量＋アルロース生成量）×１００
Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＡＦ１４－１０由来ｒｉｂｕｌｏｓｅ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ３－ｅｐｉｍｅｒａｓｅ（ＲｕＦＰ３Ｅ：アミノ酸配列－配列番号５および核酸配列－配列番号６）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ． ＤＬ－ＶＩＩＩ由来ｒｉｂｕｌｏｓｅ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ３－ｅｐｉｍｅｒａｓｅ（ＣＤＦＰ３Ｅ：アミノ酸配列－配列番号７および核酸配列－配列番号８）、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｒｉｂｂｅｎｓｉｓ由来ｒｉｂｕｌｏｓｅ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ３－ｅｐｉｍｅｒａｓｅ（ＰｋＦＰ３Ｅ：アミノ酸配列－配列番号９および核酸配列－配列番号１０）のポリヌクレオチドを遺伝子合成依頼して確保した。
前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｕｎｄｅｎｓｅ ＤＳＭ １７０４９菌株に由来するフルクトース－６－リン酸３－エピマー化酵素（ＣｌＦＰ３Ｅ）のアミノ酸配列（配列番号１）とアミノ酸配列相同性を分析した結果、配列番号５のアミノ酸配列を有するＲｕＦＰ３Ｅとアミノ酸配列同一性は５９．０５％であり、配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＦＰ３Ｅとアミノ酸配列同一性は６３％であり、配列番号９のアミノ酸配列を有するＰｋＦＰ３Ｅとアミノ酸配列同一性は６０．９６％であった。
合成された配列番号２のＣｌＦＰ３ＥのＤＮＡ塩基配列を基本にして、前記実施例１と実質的に同様な方法で大量で遺伝子を得た。実施例１と実質的に同様な方法で、前記得られた遺伝子をＥ．ｃｏｌｉに導入して発現させた後に目的タンパク質を溶出した。最終的に確保したタンパク質は５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ７．０）で転換して以降の使用のために保管した。
フルクトース６－リン酸からアルロース６－リン酸への転換活性を分析するために、実施例２と同様な方法で、前記得られた酵素を利用してフルクトース－６－リン酸を基質で
使用した酵素反応を行った。前記酵素反応後に、アルロース－６－リン酸フォスファターゼ（Ａ６ＰＰ）酵素を利用した脱リン酸化反応を行った後、前記反応産物液を高性能液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ－Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＨＰＬＣ）を使用してアルロース生成量で測定した。
ＨＰＬＣ分析条件は、Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ－８７Ｃカラム（ＢＩＯ－ＲＡＤ）が装着されたＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ、ＵＳＡ）のＲＩＤ（Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ Ｉｎｄｅｘ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ ＲＩＤ）を利用した。移動相溶媒は水を使用し、温度は８０℃、流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎにして行った。前記ＨＰＬＣ分析結果を図７ａおよび７ｂに示す。本実施例の反応生成物は、酵素反応を４時間行って得られた酵素のアルロース転換率を得たものであり、ＦＰ３Ｅ候補群酵素に対してスクリーニング（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）をするための実験で、アルロース生成の中間工程で反応を停止した反応液を分析した結果である。図７ａおよび７ｂでＣｌＦＰ３Ｅのアルロース転換率は１６％と確認され、実施例２で得られた最大転換率と比較して約５０％水準に反応進行された。本実施例のＣｌＦＰ３Ｅの全体生成物のうち、アルロース生成比率は７５重量％であり、アルロース生成比率は下記数式により計算される。
［数式２］
前記アルロース生成比率（重量％）＝アルロース生成量／（果糖生成量＋アルロース生成量）×１００
【0074】
図７ａおよび７ｂに示したように、実施例１のＣｌＦＰ３Ｅ酵素を除いた他の候補群酵素ではアルロースピークが確認されなかった。そこで、ＣｌＦＰ３Ｅ酵素以外に他の候補群酵素はＦ６Ｐに対する活性がなかったため、脱リン酸化酵素（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）を処理した時、反応工程の最初基質であるＦ６Ｐでリン酸（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）が除去された形態である果糖のみが生成されたことを確認することができた。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7a】
【図7b】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-03-15
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
フルクトース－６－リン酸（Ｆｒｕｃｔｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）のエピマー化酵素タンパク質。