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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024057094
(43)【公開日】2024-04-23
(54)【発明の名称】プログラムＤＮＡ駆動型自己集合ＲＮＡハイドロゲル
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20240416BHJP
C12P 21/00 20060101ALI20240416BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20240416BHJP
C07K 2/00 20060101ALN20240416BHJP
C07K 14/47 20060101ALN20240416BHJP
C07K 14/62 20060101ALN20240416BHJP
C07K 16/00 20060101ALN20240416BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z ZNA
C12P21/00 C
C12M1/00 A
C07K2/00
C07K14/47
C07K14/62
C07K16/00
【審査請求】有
【請求項の数】15
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024034499
(22)【出願日】2024-03-07
(62)【分割の表示】P 2022525268の分割
【原出願日】2020-10-29
(31)【優先権主張番号】10-2019-0136416
(32)【優先日】2019-10-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2020-0077146
(32)【優先日】2020-06-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】520448511
【氏名又は名称】プロジェニア インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＰＲＯＧＥＮＥＥＲ ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100130845
【弁理士】
【氏名又は名称】渡邉 伸一
(74)【代理人】
【識別番号】100201020
【弁理士】
【氏名又は名称】野中 信宏
(74)【代理人】
【識別番号】100140350
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 和宏
(72)【発明者】
【氏名】アン、 ソ ヨン
(72)【発明者】
【氏名】ベランパッティ クリシュナモーシー、 スリビスヤ
(72)【発明者】
【氏名】ウム、 スン ホ
(72)【発明者】
【氏名】オウ、 スン
(72)【発明者】
【氏名】シン、 スン ウォン
(57)【要約】
【課題】本出願は、各モノマーユニットが１つ以上のＧ－四重鎖配列を含む、反復モノマーユニットを有する核酸ハイドロゲル（例えば、ＲＮＡハイドロゲル）の構築に関する方法及び組成物を提供する。
【解決手段】これらのＧ－四重鎖配列は、核酸コンカテマーが適切な条件下でハイドロゲルに自己集合するように、核酸コンカテマーを架橋する。いくつかの実施形態では、核酸コンカテマーの各モノマー単位は、目的のポリペプチドのコード配列を含み；核酸コンカテマーによって形成された核酸ハイドロゲルは、ポリペプチドを大量に発現するために使用することができる。いくつかの実施形態では、Ｇ－四重鎖配列を含む少なくとも２つのＲＮＡコンカテマーが製造され、一方はスペーサーをさらに含み、他方は目的のポリペプチドをコードする配列をさらに含む。これら２つのＲＮＡコンカテマーは組み合わされ、自己集合して、単一のワイドバンドＲＮＡハイドロゲルを形成する。
【選択図】なし
【解決手段】これらのＧ－四重鎖配列は、核酸コンカテマーが適切な条件下でハイドロゲルに自己集合するように、核酸コンカテマーを架橋する。いくつかの実施形態では、核酸コンカテマーの各モノマー単位は、目的のポリペプチドのコード配列を含み；核酸コンカテマーによって形成された核酸ハイドロゲルは、ポリペプチドを大量に発現するために使用することができる。いくつかの実施形態では、Ｇ－四重鎖配列を含む少なくとも２つのＲＮＡコンカテマーが製造され、一方はスペーサーをさらに含み、他方は目的のポリペプチドをコードする配列をさらに含む。これら２つのＲＮＡコンカテマーは組み合わされ、自己集合して、単一のワイドバンドＲＮＡハイドロゲルを形成する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ｉ）第１のプロモーター配列、及び（ｉｉ）第１のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列を含む、第１の環状ＤＮＡテンプレート。
【請求項2】
第１のプロモーター配列が相補的核酸配列にハイブリダイズして第１の部分二本鎖ＤＮＡ分子を形成し、
第１の部分二本鎖ＤＮＡ分子が二本鎖領域及び一本鎖領域を含み、
二本鎖領域が相補的核酸配列にハイブリダイズした第１のプロモーター配列を含み、
一本鎖領域が第１のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列を含む、請求項１に記載の第１の環状ＤＮＡテンプレート。
第１の部分二本鎖ＤＮＡ分子が二本鎖領域及び一本鎖領域を含み、
二本鎖領域が相補的核酸配列にハイブリダイズした第１のプロモーター配列を含み、
一本鎖領域が第１のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列を含む、請求項１に記載の第１の環状ＤＮＡテンプレート。
【請求項3】
スペーサーをさらに含み、スペーサーがポリチミンを含む、請求項１に記載の第１の環状ＤＮＡテンプレート。
【請求項4】
目的のポリペプチドのコード配列をさらに含む、請求項１に記載の第１の環状ＤＮＡテンプレート。
【請求項5】
第１のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列が、ＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡ（配列番号：１）の配列を含む、請求項１に記載の第１の環状ＤＮＡテンプレート。
【請求項6】
第１のプロモーター配列が、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、Ｌａｃプロモーター、ａｒａＢａｄプロモーター、Ｔｒｐプロモーター、Ｔａｃプロモーター、及びＳＰ６プロモーターからなる群から選択される、請求項１に記載の第１の環状ＤＮＡテンプレート。
【請求項7】
複数のモノマーを含む第１の核酸コンカテマーであって、各モノマーが、（ｉ）第１のＧ－四重鎖モチーフ、及び（ｉｉ）ポリチミンを含むスペーサー又は目的のポリペプチドのコード配列を含む、第１の核酸コンカテマー。
【請求項8】
第１の核酸コンカテマーがＲＮＡコンカテマーであり、第１のＧ－四重鎖モチーフがＵＡＧＧＧＵＵＡＧＧＧＵ（配列番号：２）を含む、請求項７に記載の第１の核酸コンカテマー。
【請求項9】
第１の核酸コンカテマーがＤＮＡコンカテマーであり、第１のＧ－四重鎖モチーフがＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴ（配列番号：２０）を含む、請求項７に記載の第１の核酸コンカテマー。
【請求項10】
請求項７に記載の第１の核酸コンカテマーを含む、核酸ハイドロゲル。
【請求項11】
請求項１０に記載の核酸ハイドロゲル、リボソーム、及び／又はアミノ酸の混合物を含む、タンパク質発現系。
【請求項12】
第１の環状ＤＮＡテンプレート及び第２の環状ＤＮＡテンプレートを含む組成物であって、
第１の環状ＤＮＡテンプレートは、（ｉ）第１のプロモーター配列、（ｉｉ）第１のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列、及び（ｉｉｉ）ポリチミンを含むスペーサーを含み、
第２の環状ＤＮＡテンプレートは、（ｉ）第２のプロモーター配列、（ｉｉ）第２のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列、及び（ｉｉｉ）目的のポリペプチドのコード配列を含み、
第１及び第２の環状ＤＮＡテンプレートの総量に対する第１の環状ＤＮＡテンプレートのモル分率は、２５％～７５％の範囲である、組成物。
第１の環状ＤＮＡテンプレートは、（ｉ）第１のプロモーター配列、（ｉｉ）第１のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列、及び（ｉｉｉ）ポリチミンを含むスペーサーを含み、
第２の環状ＤＮＡテンプレートは、（ｉ）第２のプロモーター配列、（ｉｉ）第２のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列、及び（ｉｉｉ）目的のポリペプチドのコード配列を含み、
第１及び第２の環状ＤＮＡテンプレートの総量に対する第１の環状ＤＮＡテンプレートのモル分率は、２５％～７５％の範囲である、組成物。
【請求項13】
（１）第１のプロモーター配列が相補的核酸配列にハイブリダイズして第１の部分二本鎖ＤＮＡ分子を形成し、
第１の部分二本鎖ＤＮＡ分子が二本鎖領域及び一本鎖領域を含み、
第１の部分二本鎖ＤＮＡ分子の二本鎖領域が、相補的核酸配列にハイブリダイズした第１のプロモーター配列を含み、
第１の部分二本鎖ＤＮＡ分子の一本鎖領域が、第１のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列を含み、
（２）第２のプロモーター配列が相補的核酸配列にハイブリダイズして第２の部分二本鎖ＤＮＡ分子を形成し、
第２の部分二本鎖ＤＮＡ分子が二本鎖領域及び一本鎖領域を含み、
第２の部分二本鎖ＤＮＡ分子の二本鎖領域が、相補的核酸配列にハイブリダイズした第２のプロモーター配列を含み、
第２の部分二本鎖ＤＮＡ分子の一本鎖領域が、第２のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列を含む、請求項１２に記載の組成物。
第１の部分二本鎖ＤＮＡ分子が二本鎖領域及び一本鎖領域を含み、
第１の部分二本鎖ＤＮＡ分子の二本鎖領域が、相補的核酸配列にハイブリダイズした第１のプロモーター配列を含み、
第１の部分二本鎖ＤＮＡ分子の一本鎖領域が、第１のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列を含み、
（２）第２のプロモーター配列が相補的核酸配列にハイブリダイズして第２の部分二本鎖ＤＮＡ分子を形成し、
第２の部分二本鎖ＤＮＡ分子が二本鎖領域及び一本鎖領域を含み、
第２の部分二本鎖ＤＮＡ分子の二本鎖領域が、相補的核酸配列にハイブリダイズした第２のプロモーター配列を含み、
第２の部分二本鎖ＤＮＡ分子の一本鎖領域が、第２のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項14】
第１のＧ－四重鎖モチーフと第２のＧ－四重鎖モチーフが同じヌクレオチド配列を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項15】
第１のプロモーター配列と第２のプロモーター配列が、同じヌクレオチド配列を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項16】
第１のプロモーター配列と第２のプロモーター配列が、異なるヌクレオチド配列を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項17】
スペーサーが、３０～１２０個のチミンを含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項18】
コード配列が、２０～３００ヌクレオチドの範囲内である長さを有する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項19】
コード配列とスペーサーの長さ比が、１：０．２～１：２の範囲内である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項20】
目的のポリペプチドが、インスリン、トランス活性化転写活性化因子（ＴＡＴ）、ＨｉＢｉＴ、及び単一ドメイン抗体からなる群から選択される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項21】
１種以上のＲＮＡポリメラーゼ、リボヌクレオチドの混合物、及び／又はバッファーをさらに含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項22】
鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼをさらに含み、それによりローリングサークル増幅を行うことが可能である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項23】
環状ＤＮＡテンプレート及び二本鎖ＤＮＡコンストラクトを含む組成物であって、
環状ＤＮＡテンプレートは、（ｉ）第１のプロモーター配列、（ｉｉ）第１のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列、及び（ｉｉｉ）ポリチミンを含むスペーサーを含み、
二本鎖ＤＮＡコンストラクトは、（ｉ）第２のプロモーター配列、（ｉｉ）第２のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列、及び（ｉｉｉ）目的のポリペプチドのコード配列を含む、組成物。
環状ＤＮＡテンプレートは、（ｉ）第１のプロモーター配列、（ｉｉ）第１のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列、及び（ｉｉｉ）ポリチミンを含むスペーサーを含み、
二本鎖ＤＮＡコンストラクトは、（ｉ）第２のプロモーター配列、（ｉｉ）第２のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列、及び（ｉｉｉ）目的のポリペプチドのコード配列を含む、組成物。
【請求項24】
第１の核酸コンカテマー及び第２の核酸コンカテマーを含む核酸ハイドロゲルであって、
第１の核酸コンカテマーは、請求項１２に記載の組成物の第１の環状ＤＮＡテンプレートのローリングサークル転写又は増幅によって生成され、
第２の核酸コンカテマーは、請求項１２に記載の組成物の第２の環状ＤＮＡテンプレートのローリングサークル転写又は増幅によって生成される、核酸ハイドロゲル。
第１の核酸コンカテマーは、請求項１２に記載の組成物の第１の環状ＤＮＡテンプレートのローリングサークル転写又は増幅によって生成され、
第２の核酸コンカテマーは、請求項１２に記載の組成物の第２の環状ＤＮＡテンプレートのローリングサークル転写又は増幅によって生成される、核酸ハイドロゲル。
【請求項25】
第１のＲＮＡ分子及び第２のＲＮＡ分子を含む核酸ハイドロゲルであって、
第１のＲＮＡ分子は、（ｉ）第１のＧ－四重鎖モチーフ、及び（ｉｉ）ポリアデニンを含むスペーサーを含み、
第２のＲＮＡ分子は、（ｉ）第２のＧ－四重鎖モチーフ、及び（ｉｉ）目的のポリペプチドのコード配列を含む、核酸ハイドロゲル。
第１のＲＮＡ分子は、（ｉ）第１のＧ－四重鎖モチーフ、及び（ｉｉ）ポリアデニンを含むスペーサーを含み、
第２のＲＮＡ分子は、（ｉ）第２のＧ－四重鎖モチーフ、及び（ｉｉ）目的のポリペプチドのコード配列を含む、核酸ハイドロゲル。
【請求項26】
第１のＲＮＡ分子が複数のモノマーを含むＲＮＡコンカテマーであって、各モノマーが、第１のＧ－四重鎖モチーフ、及び、ポリアデニンを含むスペーサー又は目的のポリペプチドのコード配列を含む、請求項２５の核酸ハイドロゲル。
【請求項27】
請求項２４に記載の核酸ハイドロゲル、リボソーム、及び／又はアミノ酸の混合物を含む、タンパク質発現系。
【請求項28】
目的のポリペプチドを発現させるためのキットであって、該キットは、
（１）第１のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることによって第１の環状ＤＮＡテンプレートを形成することができる第１のＤＮＡ分子であって、第１の環状ＤＮＡテンプレートは、（ｉ）第１のプロモーター配列、（ｉｉ）第１のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列、及び（ｉｉｉ）ポリチミンを含むスペーサーを含む、第１のＤＮＡ分子、
（２）第１のプロモーター配列に相補的な第１のスプリントオリゴヌクレオチドであって、
第１のＤＮＡテンプレートは第１のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして環化し、第１の環状ＤＮＡテンプレートを形成することができる、第１のスプリントオリゴヌクレオチド、及び／又は
（３）第２のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして第２の環状ＤＮＡテンプレートを形成することができる第２のＤＮＡ分子であって、第２の環状ＤＮＡテンプレートは、（ｉ）第２のプロモーター配列、（ｉｉ）第２のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列、及び（ｉｉｉ）目的のポリペプチドのコード配列を含む、第２のＤＮＡ分子、
（４）第２のプロモーター配列に相補的な第２のスプリントオリゴヌクレオチドであって、
第２のＤＮＡテンプレートは、第２のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして環化し、第２の環状ＤＮＡテンプレートを形成することができる、第２のスプリントオリゴヌクレオチド
を含む、キット。
（１）第１のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることによって第１の環状ＤＮＡテンプレートを形成することができる第１のＤＮＡ分子であって、第１の環状ＤＮＡテンプレートは、（ｉ）第１のプロモーター配列、（ｉｉ）第１のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列、及び（ｉｉｉ）ポリチミンを含むスペーサーを含む、第１のＤＮＡ分子、
（２）第１のプロモーター配列に相補的な第１のスプリントオリゴヌクレオチドであって、
第１のＤＮＡテンプレートは第１のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして環化し、第１の環状ＤＮＡテンプレートを形成することができる、第１のスプリントオリゴヌクレオチド、及び／又は
（３）第２のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして第２の環状ＤＮＡテンプレートを形成することができる第２のＤＮＡ分子であって、第２の環状ＤＮＡテンプレートは、（ｉ）第２のプロモーター配列、（ｉｉ）第２のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列、及び（ｉｉｉ）目的のポリペプチドのコード配列を含む、第２のＤＮＡ分子、
（４）第２のプロモーター配列に相補的な第２のスプリントオリゴヌクレオチドであって、
第２のＤＮＡテンプレートは、第２のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして環化し、第２の環状ＤＮＡテンプレートを形成することができる、第２のスプリントオリゴヌクレオチド
を含む、キット。
【請求項29】
請求項２３に記載の組成物を含む、目的のポリペプチドを発現させるためのキット。
【請求項30】
第１のＧ四重鎖モチーフと第２のＧ－四重鎖モチーフが、同じ又は異なる配列を有する、請求項２８に記載のキット。
【請求項31】
第１のプロモーター配列と第２のプロモーター配列が、同一又は異なる、請求項２８に記載のキット。
【請求項32】
スペーサーが、３０～１２０個のチミンを含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項33】
コード配列が、２０～３００ヌクレオチドの範囲にある長さを有する、請求項２８に記載のキット。
【請求項34】
コード配列とスペーサーの長さ比が、１：０．２～１：２の範囲内である、請求項２８に記載のキット。
【請求項35】
目的のポリペプチドが、インスリン、ＨｉＢｉＴ、トランス活性化転写活性化因子（ＴＡＴ）、及び単一ドメイン抗体からなる群から選択される、請求項２８に記載のキット。
【請求項36】
１種以上のＤＮＡリガーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、リボヌクレオチドの混合物、及び／又は１種以上のバッファーをさらに含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項37】
鎖置換活性を有し、それによりローリングサークル増幅を行うことができる、ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項３６に記載のキット。
【請求項38】
核酸ハイドロゲルを調製する方法であって、
（１）（ｉ）第１のプロモーター配列、及び（ｉｉ）第１のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列を含む第１の環状ＤＮＡテンプレートを提供する工程；及び、
（２）第１の環状テンプレートに対してローリングサークル転写又は増幅を行って第１の核酸コンカテマーを生成する工程を含み、
第１の核酸コンカテマーが核酸ハイドロゲルを形成する、方法。
（１）（ｉ）第１のプロモーター配列、及び（ｉｉ）第１のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列を含む第１の環状ＤＮＡテンプレートを提供する工程；及び、
（２）第１の環状テンプレートに対してローリングサークル転写又は増幅を行って第１の核酸コンカテマーを生成する工程を含み、
第１の核酸コンカテマーが核酸ハイドロゲルを形成する、方法。
【請求項39】
第１の環状ＤＮＡテンプレートが、ポリチミンを含むスペーサーをさらに含み、
工程（１）が、（ｉ）第２のプロモーター配列、（ｉｉ）第２のＧ－四重鎖モチーフ、及び（ｉｉｉ）目的のポリペプチドのコード配列を含む、第２の環状ＤＮＡテンプレートを提供することをさらに含み、
工程（２）が、第２の環状ＤＮＡテンプレートのローリングサークル転写又は増幅を行って第２の核酸コンカテマーを生成することをさらに含み、第１及び第２の核酸コンカテマーが核酸ハイドロゲルを形成する、請求項３８に記載の方法。
工程（１）が、（ｉ）第２のプロモーター配列、（ｉｉ）第２のＧ－四重鎖モチーフ、及び（ｉｉｉ）目的のポリペプチドのコード配列を含む、第２の環状ＤＮＡテンプレートを提供することをさらに含み、
工程（２）が、第２の環状ＤＮＡテンプレートのローリングサークル転写又は増幅を行って第２の核酸コンカテマーを生成することをさらに含み、第１及び第２の核酸コンカテマーが核酸ハイドロゲルを形成する、請求項３８に記載の方法。
【請求項40】
無細胞合成系でタンパク質を製造する方法であって、該方法が、
（ｉ）請求項１０又は２４の核酸ハイドロゲルを、目的のポリペプチドの翻訳を可能にする条件下で無細胞合成系と組み合わせることを含む、方法。
（ｉ）請求項１０又は２４の核酸ハイドロゲルを、目的のポリペプチドの翻訳を可能にする条件下で無細胞合成系と組み合わせることを含む、方法。
【請求項41】
無細胞合成系が、リボソーム及び／又はアミノ酸の混合物を含む、請求項４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願との相互参照
本出願は、２０１９年１０月３０日に出願された韓国出願第１０－２０１９－０１３６４１６号、及び２０２０年６月２４日に出願された韓国出願第１０－２０２０－００７７１４６号の優先権と利益を主張し、これらの各々は全ての目的のために参照によりその全体が組み込まれる。
本出願は、２０１９年１０月３０日に出願された韓国出願第１０－２０１９－０１３６４１６号、及び２０２０年６月２４日に出願された韓国出願第１０－２０２０－００７７１４６号の優先権と利益を主張し、これらの各々は全ての目的のために参照によりその全体が組み込まれる。
【0002】
技術分野
本発明は、無細胞系における核酸又はポリペプチドの製造に関する。
本発明は、無細胞系における核酸又はポリペプチドの製造に関する。
【背景技術】
【0003】
ＲＮＡは現在、ＲＮＡ干渉の使用により、変異した標的を、タンパク質からゲノム内のＲＮＡに変える治療用途に使用されている。ＲＮＡ部位は、遺伝的ソースコードと触媒レパートリーの両方として機能するユニークな能力により、調節タンパク質産生のための行動設計図としての用途を超えて、優れた薬物ターゲットとなる。しかし、ＲＮＡは化学的に不安定であり、生産設備の収量が少ないため、実用化はかなり限定されている。
【0004】
ハイドロゲルは、水性媒体をホストする超分子集合体であり、液体の溶質輸送特性と固体の機械的特性の両方を有している。ハイドロゲルは、高い含水率、良好な構造的特徴、及び生体適合性から、特に生物医学的な用途に有用である。核酸ハイドロゲルは一般に知られているが、従来の核酸ハイドロゲルの製造方法は、典型的には共有結合による架橋など複雑な手順を必要とする。そのため、これらの技術では、商業的生産に必要とされる十分な収量でＲＮＡハイドロゲルを製造することができなかった。また、現在のＲＮＡハイドロゲルの安定性、機械的性能、機能的特性も十分ではない。
【発明の概要】
【0005】
いくつかの実施形態では、本明細書では、（ｉ）プロモーター配列、及び（ｉｉ）第１のＧ－四重鎖（Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ）モチーフに相補的な配列を含む環状ＤＮＡテンプレートが開示される。
【0006】
いくつかの実施形態では、プロモーター配列は、相補的核酸配列にハイブリダイズして、第１の部分二本鎖ＤＮＡ分子を形成し；第１の部分二本鎖ＤＮＡ分子は、二本鎖領域と一本鎖領域を含み；二本鎖領域は、相補的核酸配列にハイブリダイズした第１のプロモーター配列を含み；一本鎖領域は、第１のＧ－四重鎖モチーフに相補な配列を含む。
【0007】
いくつかの実施形態では、環状ＤＮＡテンプレートは、スペーサーをさらに含み、スペーサーは、ポリチミン（すなわち、２つ以上のチミン）を含む。いくつかの実施形態では、第１の環状ＤＮＡテンプレートは、目的のポリペプチドのコード配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列は、ＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡ（配列番号：１）の配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のプロモーター配列は、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、Ｌａｃプロモーター、ａｒａＢａｄプロモーター、Ｔｒｐプロモーター、Ｔａｃプロモーター、及びＳＰ６プロモーターからなる群から選択される。
【0008】
また、本明細書では、複数のモノマーを含む核酸コンカテマーであって、該核酸コンカテマーは、各モノマーが、（ｉ）Ｇ－四重鎖モチーフ、及び（ｉｉ）ポリチミンを含むスペーサー又は目的のポリペプチドのコード配列を含む核酸コンカテマーが提供される。いくつかの実施形態では、核酸コンカテマーはＲＮＡコンカテマーであり、Ｇ－四重鎖モチーフはＵＡＧＧＧＵＵＡＧＧＧＵ（配列番号：２）を含む。いくつかの実施形態では、Ｇ－四重鎖モチーフは、ＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴ（配列番号：２０）を含む。
【0009】
また、本明細書では、上記実施形態のいずれかの核酸コンカテマーを含む核酸ハイドロゲルが提供される。
【0010】
また、本明細書では、上記に開示された核酸ハイドロゲル、リボソーム、及び／又はアミノ酸の混合物を含むタンパク質発現系が提供される。
【0011】
また、本明細書では、第１の環状ＤＮＡテンプレート及び第２の環状ＤＮＡテンプレートを含む組成物であって、第１の環状ＤＮＡテンプレートが、（ｉ）第１のプロモーター配列、（ｉｉ）第１のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列、及び（ｉｉｉ）ポリチミンを含むスペーサーを含み、第２の環状ＤＮＡテンプレートが、（ｉ）第２のプロモーター配列、（ｉｉ）第２のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列、及び（ｉｉｉ）目的のポリペプチドのコード配列を含み、第１及び第２の環状ＤＮＡテンプレートの総量に対する第１の環状ＤＮＡテンプレートのモル分率は、２５％から７５％の範囲である、組成物が提供される。
【0012】
いくつかの実施形態では、第１のプロモーター配列は、相補的核酸配列にハイブリダイズして、第１の部分二本鎖ＤＮＡ分子を形成する。第１の部分二本鎖ＤＮＡ分子は、二本鎖領域と一本鎖領域を含む。第１の部分二本鎖ＤＮＡ分子の二本鎖領域は、相補的核酸配列にハイブリダイズした第１のプロモーター配列を含み、第１の部分二本鎖ＤＮＡ分子の一本鎖領域は、第１のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列を含む。
【0013】
いくつかの実施形態では、第２のプロモーター配列は、相補的核酸配列にハイブリダイズして、第２の部分二本鎖ＤＮＡ分子を形成する。第２の部分二本鎖ＤＮＡ分子は、二本鎖領域と一本鎖領域を含む。第２の部分二本鎖ＤＮＡ分子の二本鎖領域は、相補的核酸配列にハイブリダイズした第２のプロモーター配列を含み、第２の部分二本鎖ＤＮＡ分子の一本鎖領域は、第２のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列を含む。
【0014】
いくつかの実施形態では、第１のＧ－四重鎖モチーフと第２のＧ－四重鎖モチーフは、同じヌクレオチド配列を含む。第１のプロモーター配列及び第２のプロモーター配列は、同じヌクレオチド配列又は異なるヌクレオチド配列を含んでよい。いくつかの実施形態では、スペーサーは、３０～１２０個のチミン（配列番号：３２）を含む。いくつかの実施形態では、コード配列は、２０～３００ヌクレオチドの範囲内である長さを有する。いくつかの実施形態では、コード配列とスペーサーの長さ比は、１：０．２～１：２の範囲内である。いくつかの実施形態では、目的のポリペプチドは、インスリン、転写活性化因子（ＴＡＴ）、ＨｉＢｉＴ、及び単一ドメイン抗体からなる群から選択される。
【0015】
上述の実施形態のいずれかの組成物は、１種以上のＲＮＡポリメラーゼ、リボヌクレオチドの混合物、及び／又はバッファーをさらに含んでもよい。いくつかの実施形態では、組成物は、鎖置換活性を有し、それにより、ローリングサークル増幅を行うことが可能なＤＮＡポリメラーゼをさらに含む。
【0016】
また、本明細書では、環状ＤＮＡテンプレート及び二本鎖ＤＮＡコンストラクトを含む組成物が提供され、環状ＤＮＡテンプレートは、（ｉ）第１のプロモーター配列、（ｉｉ）第１のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列、及び（ｉｉｉ）ポリチミンを含むスペーサーを含む。二本鎖ＤＮＡコンストラクトは、（ｉ）第２のプロモーター配列、（ｉｉ）第２のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列、及び（ｉｉｉ）目的のポリペプチドのコード配列を含む。
【0017】
また、本明細書では、第１の核酸コンカテマー及び第２の核酸コンカテマーを含む核酸ハイドロゲルが提供される。第１の核酸コンカテマーは、本開示で提供される第１の環状ＤＮＡテンプレートのローリングサークル転写又は増幅によって製造され、第２の核酸コンカテマーは、本開示で提供される第２の環状ＤＮＡテンプレートのローリングサークル転写又は増幅によって製造される。
【0018】
また、本明細書では、第１のＲＮＡ分子及び第２のＲＮＡ分子を含む核酸ハイドロゲルが提供され、第１のＲＮＡ分子は、（ｉ）第１のＧ－四重鎖モチーフ、及び（ｉｉ）ポリアデニン（すなわち、２つ以上のアデニン）を含むスペーサーを含み、第２のＲＮＡ分子は、（ｉ）第２のＧ－四重鎖モチーフ、及び（ｉｉ）目的のポリペプチドのコード配列を含む。
【0019】
いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡ分子は、複数のモノマーを含むＲＮＡコンカテマーであり、各モノマーは、第１のＧ－四重鎖モチーフ、及び、ポリアデニンを含むスペーサー又は目的のポリペプチドのコード配列を含む。
【0020】
また、本明細書では、本明細書に開示される任意の核酸ハイドロゲル、リボソーム、及び／又はアミノ酸の混合物を含むタンパク質発現系も開示される。
【0021】
また、本明細書では、目的のポリペプチドを発現させるためのキットが開示され、該キットは、（１）第１のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることにより第１の環状ＤＮＡテンプレートを形成できる第１のＤＮＡ分子であって、第１の環状ＤＮＡテンプレートは、（ｉ）第１のプロモーター配列、（ｉｉ）第１のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列、及び（ｉｉｉ）ポリチミンを含むスペーサーを含む。第１のＤＮＡ分子、（２）第１のプロモーター配列に相補的である第１のスプリントオリゴヌクレオチドであって、第１のＤＮＡテンプレートは第１のスプリントオリゴヌクレオチドとハイブリダイズして環化し、第１の環状のＤＮＡテンプレートを形成することができる、第１のスプリントオリゴヌクレオチド、及び／又は、（３）第２のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることにより第２の環状ＤＮＡテンプレートを形成することができる第２のＤＮＡ分子であって、第２の環状ＤＮＡテンプレートが、（ｉ）第２のプロモーター配列、（ｉｉ）第２のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列、及び（ｉｉｉ）目的のポリペプチドのコード配列を含む、第２のＤＮＡ分子、及び（４）第２のプロモーター配列に相補的な第２のスプリントオリゴヌクレオチドであって、第２のＤＮＡテンプレートは第２のスプリントオリゴヌクレオチドとハイブリダイズして環化し、第２の環状ＤＮＡテンプレートを形成することができる、第２のスプリントオリゴヌクレオチド、を含む。
【0022】
いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に開示される第１の環状ＤＮＡテンプレート及び第２の環状ＤＮＡテンプレートを含む任意の組成物を含む。いくつかの実施形態では、第１のＧ－四重鎖モチーフ及び第２のＧ－四重鎖モチーフは、同じ又は異なる配列を有する。いくつかの実施形態では、第１のプロモーター配列及び第２のプロモーター配列は、同一又は異なる配列を有する。いくつかの実施形態では、スペーサーは、３０～１２０個のチミン（配列番号：３２）を含む。いくつかの実施形態では、コード配列は、２０～３００ヌクレオチドの範囲にある長さを有する。いくつかの実施形態では、コード配列とスペーサーの長さ比は、１：０．２～１：２の範囲内である。いくつかの実施形態では、目的のポリペプチドは、インスリン、ＨｉＢｉＴ、トランス活性化転写活性化因子（ＴＡＴ）、及び単一ドメイン抗体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、キットは、１種以上のＤＮＡリガーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、リボヌクレオチドの混合物、及び／又は１種以上のバッファーをさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼをさらに含み、したがって、ローリングサークル増幅を行うことができる。
【0023】
また、本明細書では、（１）（ｉ）第１のプロモーター配列、及び（ｉｉ）第１のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列を含む第１の環状ＤＮＡテンプレートを提供すること；及び、（２）第１の環状テンプレートに対してローリングサークル転写又は増幅を行って第１の核酸コンカテマーを生成し、第１の核酸コンカテマーが核酸ハイドロゲルを形成すること、を含む、核酸ハイドロゲルの調製方法が開示される。
【0024】
いくつかの実施形態では、第１の環状ＤＮＡテンプレートは、ポリチミンを含むスペーサーをさらに含み、ステップ（１）は、（ｉ）第２のプロモーター配列、（ｉｉ）第２のＧ－四重鎖モチーフ、及び（ｉｉｉ）目的のポリペプチドのコード配列を含む第２の環状ＤＮＡテンプレートを提供することをさらに含み、ステップ（２）は、第２の環状ＤＮＡテンプレートのローリングサークル転写又は増幅を行って、第２の核酸コンカテマーを生成することをさらに含み、ここで、第１及び第２の核酸コンカテマーが核酸ハイドロゲルを形成する。
【0025】
また、本明細書では、無細胞合成系でタンパク質を製造する方法が開示され、該方法は、本明細書に開示された核酸ハイドロゲルのいずれかを、目的のポリペプチドの翻訳を可能にする条件下で無細胞合成系と組み合わせることを含む。いくつかの実施形態では、無細胞合成系は、リボソーム及び／又はアミノ酸の混合物を含む。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【図1】図１Ａ～１Ｆは、自己集合したローリングサークル転写（「ＲＣＴ」）生成物が固有の機能性を有するＲＮＡＧ－四重鎖（ＲＧ４）ゲルを形成することを示す。図１Ａは、ＲＮＡ部位がＲＣＴによってＲＧ４を形成した自己集合プロセスの概略的なフレームワークを示す。ＲＣＴのテンプレートとして、Ｇ－四重鎖（「Ｇ４」）モチーフに相補的な配列と、ユーザーに所望の用途に適した機能的配列を含む環状ＤＮＡを用いた。架橋領域と機能性配列の相対的な位置や配列は異なっていてもよい。反復したＧ－四重鎖モチーフを有するＲＣＴから合成されたタンデムに繰り返される長い一本鎖ＲＮＡ（ＲＮＡコンカテマー）は、３次元ハイドロゲル集合体の理想的な足場として機能する。図１Ｂは、ゲル化時間に対するＲＣＴ生成物を図示したものである（左から右に向けて、ＲＧｘコンカテマーは０，４８時間、ＲＧ４コンカテマーは０，３，６，９，１２，２４，４８時間）。白い矢印は、ＲＣＴ生成物の位置を示す（ＲＧ４ハイドロゲルではゲル相、ＲＧｘ溶液では溶液相）。図１Ｃは、様々な多角形モールドでパターン化したＲＧ４ハイドロゲルを示す。スケールバーは１０ｍｍを示す。図１Ｄは、３次元円筒形モールドで作製したＲＧ４ハイドロゲルの側面図であり、スケールバーは５ｍｍを示す。図１Ｅは、孔及び反復微細構造を示すためにＳＹＢＲグリーンＩＩで染色したＲＧ４ハイドロゲルの共焦点顕微鏡画像（スケールバー：６０μｍ）である。図１Ｆは、凍結乾燥したＲＧ４ハイドロゲルのＦＥ－ＳＥＭ画像であり、スケールバーは１００μｍである。図１Ｇは、図１Ｆの一部を拡大した図であり、スケールバーは２０μｍを示す。
【図2】図２Ａ～２Ｃは、ＲＧ４の分光学的な検証及び同定を示す。図２Ａは、様々な塩条件下でのＲＣＴ生成物としてのＧ４及びスクランブルＧ４モチーフ（非Ｇ４）のハーフユニットを含むｓＧ４ｓ及びｓＧｘｓの円二色性（ＣＤ）分析である。１００ｍＭのＫＣｌ及びＮａＣｌの条件に供されたｓＧ４の２６２ｎｍの明確な正のピークと２４０ｎｍの溝は、ハイドロゲルの形成に関連する現象として知られる二次構造の変化を示すが、ｓＧｘ、「塩なし」、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２では変化が見られなかった。図２Ｂは、ｓＧ４及びｓＧｘと相互作用したときのチオフラビンＴ（ＴｈＴ）の蛍光スペクトルを示し、ＴｈＴプローブがＲＧ４ｓに特異的に結合する（挿入図）ことを示す蛍光強度の顕著な増強が観察された。ｔ検定において統計的Ｐ値０．００１で、ＴｈＴに対する特異性の低いｓＧｘに比べてｓＧ４では７．１倍増強した。図２Ｃは、ｐＨ５．４でヘミンと複合体化したときのＡＢＴＳ２－からＡＢＴＳ・－への酸化（挿入図）についてのＲＧ４及びＲＧｘによって促進された酵素活性の比較を示す。ＲＧ４とＲＧｘはいずれもヘミンのペルオキシダーゼ活性を増加させたが、これは、ヘミンとＲＧ４及びＲＧｘの自己封入（ｓｅｌｆ－ｅｎｃｌｏｓｅｄ）保存モジュールが相互作用したためである可能性がある。しかし、ＲＧ４ゲルと複合化したヘミンのペルオキシダーゼ活性はより速く増加した。
【図3D】図３Ｄは、ハイドロゲルへのＴｈＴ拡散の実験的及び理論的評価を示す。左から右への６つの画像は、２６０秒間隔の共焦点顕微鏡画像である。ＴｈＴ及びリボソームに関する理論的仮定１及び２（本開示では理論的推定１及び２とも呼ぶ）を、それらの拡散速度を推定するために検証した。
【図3E-F】図３Ｅは、ＲＧ４の細孔径を推定するためのＡＦＭ解析による顕微鏡画像である。図３Ｆは、多孔質の性質を明確に表す拡大ＡＦＭ画像である。主図と拡大図のスケールバーは、それぞれ２００ｎｍと５０ｎｍを示す。
【図4A-C】図４Ａ～４Ｆは、ＲＮＡｓｅに富むＦＢＳ血清中におけるＲＧ４ハイドロゲルの安定性を示す。図４Ａは、安定性試験について血清中のＲＣＴ生成物を図示したものである。ＲＧ４ネットワーク（下部から）及び上清（ＲＧ４ハイドロゲルの解離生成物）中のＲＮＡ量の定量的な推定。ＦＢＳ中でのアニール後の転写産物のばく露時間ベースの分解を、様々な時間で、ＲＧ４上清（図４Ｂ）及びＲＧ４（図４Ｃ）のゲル画像のバンド強度から分析した。矢印は、ＲＧ４の分解の開始を示す。
【図4D-F】ＲＮＡの分解は、４８時間におけるＲＮＡ量の減少によって示されるＲＧ４上清について観察された（図４Ｄ）。図４Ｅは、血清に起因するＲＮＡ分子の半減期がバンド強度を用いて推定されたことを示し、ＲＧｘはＲＧ４よりも分解が速かった。図４Ｆは、ＲＧ４ハイドロゲルとＲＧｘの時間ベースの定量的ゲル電気泳動評価を示す。ＲＧ４におけるＧ４形成は、ＲＮＡ合成時間及び合成されたＲＮＡの総量を伸長させることが予想された。
【図5A】図５Ａ～５Ｄは、タンパク質発現系と発現されたタンパク質の翻訳収量を図示したものである。図５Ａは、ＲＧ４ハイドロゲルテンプレートからのタンパク質発現プロセスの描写である。切断したＲＧ４ハイドロゲルを、リボソームを含む無細胞タンパク質発現ライセートミックスに添加した。
【図5B-D】図５Ｂは、ＤＮＡ及びＲＮＡテンプレートから発現したＨｉＢｉＴペプチドの相対量を、生成した相対発光（ＲＬ）シグナルで特徴付けたものを示す。＊ＲＮＡは、切断したＷ－ＲＧ４ハイドロゲルを示す。アニールしたＲＧ４は、そのハイドロゲル性を失ったため、より低い収量を示した。図５Ｃは、切断及び尿素処理した翻訳産物のＲＬによって特徴付けられる、種々のテンプレートを用いて発現したＴＡＴ及びインスリンの相対量を示す。図５Ｄは、ＨｉＢｉＴ発現タンパク質の小麦胚芽無細胞発現系を用いた非連結翻訳を、ｆＲＮＡとＷ－ＲＧ４ハイドロゲルとの比較で示したものである。Ｗ－ＲＧ４ １５０は、翻訳反応混合物の体積が１５０μｌであることを表し、８倍の収量増加が観察された。
【図5E】図５Ｅは、プラスミドクローニング技術を用いたワイドバンド（ｗｉｄｅｂａｎｄ）ＲＧ４ハイドロゲル（Ｗ－ＲＧ４）の模式図である。配列番号：７の配列を含むスペーサーテンプレートから転写された６０Ｔ ＲＧ４とベクターｐＫ７－レトリズマブからのＲＮＡ転写物との統合によりＷ－ＲＧ４ハイドロゲルが生成される。図５Ｅは、配列番号：３４として「６０Ｔ」を開示している。
【図5F-G】図５Ｆは、レトリズマブに対応する検出されたバンドの強度を定量化した結果を示す。図５Ｇは、６０Ｔ ＲＧ４のスペーサーテンプレートの濃度を様々に変えて角括弧で示した、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによりレトリズマブタンパク質の発現を解析した結果を示す。
【図5H】図５Ｈは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳プロセスにおける相分離したＲＮＡ液滴の模式図である。ＲＮＡ及びＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）液滴を構成するｉｎ ｖｉｖｏの重要な成分である。これらのＲＮＰは、細胞が時空間的・機能的に制御された方法で自身を組織化し得る方法を模倣している。細胞内ＲＮＰシステムに類似したＲＮＡハイドロゲルは、タンパク質成分の拡散を促進し、それによりタンパク質効率を高めることができる。
【図5I-J】図５Ｉ及び５Ｊは、ライセート包埋Ｗ－ＲＧ４ゲルからのＨｉＢｉＴの無細胞発現終了の結果を示す。図５Ｉは、様々なライセート包埋Ｗ－ＲＧ４とライセートフリーＷ－ＲＧ４からのＨｉＢｉＴ発現を、異なるテンプレート調製条件下で比較したものである。１５０Ｔ Ｗ－ＲＧ４のスペーサテンプレートと組み合わせたＨｉＢｉＴテンプレートを用いて、包埋ライセートの存在下で生成したＷ－ＲＧ４ハイドロゲルは、３時間の転写反応（ゲル形成）に続く２時間の翻訳後に最高のタンパク質発現を示した。この発現レベルは、ライセートフリーＷ－ＲＧ４の発現量よりも高かった。図５Ｉは、配列番号：３３として「３０Ｔ」、配列番号：３５として「９０Ｔ」、配列番号：３７として「１５０Ｔ」を開示している。図５Ｊは、ライセートフリーＷ－ＲＧ４ハイドロゲルとライセート包埋Ｗ－ＲＧ４ハイドロゲルからのＨｉＢｉＴ発現の結果を示す。ライセート包埋ハイドロゲル（Ｌ－ゲル）は、ライセート成分を翻訳反応混合物にさらに添加することなく、ＨｉＢｉＴを発現させることに成功した。翻訳反応液に添加した追加のライセートは、ライセート包埋ハイドロゲルのＨｉＢｉＴの発現をさらに促進した（Ｌ－Ｌ－ゲル）。
【図6A-B】図６Ａ～６Ｄは、ＤＮＡ ＲＣＴテンプレートの作製とＲＮＡ生成物の転写を示す。図６Ａは、ＤＮＡローリングサークル転写（ＲＣＴ）テンプレートの作製後にＲＮＡ生成物の転写を行う模式図である。Ｔ７プロモータープライマーの相補鎖、Ｇ四重鎖架橋配列、及びポリＴスペーサーを含む前駆体テンプレートをアニールしてＴ７プロモーター領域で部分二本鎖を形成した。ライゲーションに成功したテンプレートは、Ｔ７プロモーターによって開始されるＧ－四重鎖（ＲＧ４）を有する長い反復ＲＮＡ鎖の転写に参加することができた。図６Ｂは、３０Ｔ ＲＧ４、３０Ｔ ＲＧｘ、及び種々のチミンスペーサー（３Ｔ、１０Ｔ（配列番号：３８）、３０Ｔ（配列番号：３３）、６０Ｔ（配列番号：３４）、９０Ｔ（配列番号：３５）、及び１２０Ｔ（配列番号：３６））についての未処理（ｂａｒｅ）の、アニールした、及びライゲーションした前駆体テンプレートのＰＡＧＥ分析を示す。巨大なネットワークとして、ＲＧ４ゲルは移動せず、一方、非ゲル化ＲＧｘ生成物は僅かに移動した。バンド移動の違いにより、作製の各ステップにおいて異なるスペーサーを有するテンプレートの形成に成功したことが確認できた。塗りつぶされた菱形（◆）は、サンプルの作製に成功したことを示す。３Ｔ及び１０Ｔ（配列番号：３８）のスペーサー長では、中空のひし形（◇）で示されるように、環状ＤＮＡテンプレートを合成できなかったが、３０Ｔ（配列番号：３３）以上のスペーサー長では、バンド移動に大きな差を示した。３Ｔは他のバンドから遠く離れており、これは長い線状ＤＮＡテンプレートを示している可能性があり、そのＲＮＡ産物は穏やかにゲル化しただけであった。
【図6C-D】図６Ｃは、バイアル倒立試験により評価した、様々な長さのスペーサーを有するＲＧ４のゲル化を示す。スペーサー長が３Ｔ及び１０Ｔ（配列番号：３８）のＲＧ４は、立体長が線状ＤＮＡを環状化させるのに不十分であったためゲル化しなかった（下向き矢印で示す）が、スペーサー長が３０Ｔ（配列番号：３３）以上では、環状テンプレートを形成してゲル化（上向き矢印で示す）するのに十分な長さであった。図６Ｄは、様々なスペーサー長を有するテンプレートに由来する転写中の総ＲＮＡの濃度を示す。３Ｔ及び１０Ｔについては環状ＤＮＡテンプレートは作製されなかったが、３ＴについてのＲＮＡ転写収量は、環状テンプレートからの転写収量と同じくらい多かった。図６Ａ～６Ｄでは、配列番号：３８として「１０Ｔ」、配列番号：３３として「３０Ｔ」、配列番号：３４として「６０Ｔ」、配列番号：３５として「９０Ｔ」、及び配列番号：３６として「１２０Ｔ」を開示している。
【図7】図７は、ＲＧ４ゲルの回復試験の結果を示す。回復試験は、ゲル化プロセスが可逆的であるかどうかを調べるために実施した。まず、ＲＧ４ゲルを９５℃で２時間変性させた。次に、変性したＲＧ４ゲルを４℃、２５℃、又は３７℃で４８時間アニールすると、ＲＧ４ゲルは自己集合ゲル特性を失っていた。上向きの矢印は形成されたハイドロゲルを、下向きの矢印は熱処理後にゲル状態に戻ることができなかった液体を示す。
【図8A】図８は、表面トポロジー特性評価のためのＲＧ４ゲルのＡＦＭ画像を示す。図８Ａは、間欠接触モードでトポロジー画像を得るために、マイカ基板上に作製したＲＧ４ゲルの表面を走査しているＡＦＭチップを模式的に示す。カンチレバーの先端に保持された微小探針が目的の表面を走査することで、振動振幅の減衰を引き起こし、それによってトポグラフィー画像を生成する。
【図8B-E】図８Ｂ～図８Ｅは、それぞれ３０Ｔ（配列番号：３３）、６０Ｔ（配列番号：３４）、９０Ｔ（配列番号：３５）、及び１２０Ｔ（配列番号：３６）の異なるスペーサー長を有するＲＮＡ分子がＲＣＴプロセス中に自己集合し、孔径に形態的差異を示している、ＡＦＭ画像を示す。ゲルはスペーサーが長くなるにつれて、より柔軟になり、細孔サイズもスペーサーの長さに応じて増大した。スケールバーは２００ｎｍを示す。
【図8F-H】図８Ｆ～図８Ｈは、ＩｍａｇｅＪソフトウェア及びＡＦＭ画像を用いて分析した、それぞれ３０Ｔ（配列番号：３３）、６０Ｔ（配列番号：３４）、及び１２０Ｔ（配列番号：３６）を有するＲＧ４ゲルの孔径（面積）分布を示すヒストグラムを示す。
【図9】図９Ａ及び図９Ｂは、ＲＧ４ゲルの共焦点顕微鏡画像を示す。図９Ａは、ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ＩＩをロードしたＲＧ４ゲルの共焦点顕微鏡画像を示す。矢印で示すように、サンプルはマイクロメータースケールで作製した（図に記載されている短幅と長幅はそれぞれ６９．１μｍと１２８．４μｍである）。図９Ｂは、センチメートルスケールで作製したＲＧ４ゲルの３次元共焦点顕微鏡画像を示す。周期的に相互接続された多孔質構造が明らかであり、ハイドロゲルの形成を示す。スケールバーは５０μｍを示す。
【図11】図１１Ａ～１１Ｆは、様々な塩条件下での合成ｓＧ４及びｓＧｘの円二色性（ＣＤ）分析を示す。Ｇ－四重鎖部分（ｓＧ４）及びスクランブルＧ－四重鎖部分（ｓＧｘ）を有する合成ＲＮＡアナログからの用量依存ＣＤスペクトルである。塩濃度（ＫＣｌ、ＮａＣｌ、及びＭｇＣｌ２、それぞれ図１１Ａ～１１Ｃのとおり）に対してｓＧ４の楕円率スペクトル及びＲＮＡセグメントの安定性に変化が生じることが予想された。ｓＧ４については、ＫＣｌ及びＮａＣｌの存在下では、２６４ｎｍに顕著なピークが、２４０ｎｍに谷が観察されたが、ＭｇＣｌ２では、観察されなかった。一価の陽イオン、特にＫ＋とＮａ＋は、２つのグアニン四連子（ｔｅｔｒａｄ）の間の空洞に特異的に適合し、複合体形成に適したイオン半径によってＧ－四重鎖構造を安定化させる。塩溶液の濃度をＫＣｌ、ＮａＣｌ、又はＭｇＣｌ２ ０．１ｍＭから１００ｍＭまで変化させることにより、ｓＧ４では、２６０ｎｍのピークはＫＣｌとＮａＣｌでは濃度依存的に増加したが、ＭｇＣｌ２では意味のある変化は観察されなかった。スクランブル非ゲル化ｓＧｘオリゴヌクレオチドとカチオンの間の構造活性関係は、図１１Ｄ～１１Ｆに示されるように、言及された塩条件と塩なしの条件の間で二次構造プロファイルに差異は生じなかった。
【図12】図１２Ａ～１２Ｈは、Ｇ－四重鎖を有する、及び有しないＲＣＴ生成物におけるヘミンのペルオキシダーゼ様活性の最適化を示す。Ｈ２Ｏ２の存在下でのＡＢＴＳ基質の酸化触媒のためのヘミンとのＧ－四重鎖相互作用の模式図である。触媒反応におけるＲＣＴ生成物の時間及びｐＨ依存性キネティクスをｐＨ４．４からｐＨ７．９の範囲で試験した。ＡＢＴＳ２－からＡＢＴＳ・－への酸化反応におけるヘミンとＲＧ４ゲル複合体との間の速度論的挙動は、λ＝３９５ｎｍでの吸光度の増加によって特徴づけられた。ＲＧ４ゲルは、酵素反応がｐＨに対して耐性があり、形成された生成物の安定性と酵素反応の両方を補助するため、ｐＨ４．４からｐＨ７．９の範囲でペルオキシダーゼ活性の改善を示した。ＲＧｘ生成物も同様の傾向を示したが、ペルオキシダーゼ活性の増加はＲＧ４よりも緩やかであり、ヘミンと自己封入モジュールとの間にわずかな相互作用がある可能性が示された。ＲＧ４とＲＧｘは、ｐＨ５．４からｐＨ７．９の範囲の反応バッファーで有効な酵素活性を示したが、遊離ヘミンでは、ＲＣＴ複合体中のヘミンの脱プロトン化のため、及び、塩基性環境ではＨ２Ｏ２に対して脆弱なため、活性が認められないか無視できる程度であり、低活性となった（４３、４４）。したがって、ヘミン－ＲＧ４ゲルは、ＲＧｘと比較してペルオキシダーゼ活性が増強されたが、遊離ヘミンはｐＨ＞４．９での活性がなくなった。
【図13】図１３Ａ～１３Ｄは、ＡＦＭ画像により、ペルオキシダーゼ活性中のＲＣＴ生成物の自己ビオチン化について調査した結果を示す。Ｈ２Ｏ２とビオチンチラミドの存在下でヘミンによって触媒されるＧ－四重鎖を、自己ビオチン化について調査した（４５）。ＲＧ４とＲＧｘのビオチン化部位を特定するために、Ｇ４領域の自己ビオチン化部位に選択的に結合するストレプトアビジンを添加した。触媒試薬による処理前と処理後のＡＦＭ画像を撮影し、その断面高さを評価した。ビオチン化部位へのストレプトアビジンの結合を確認するため，未処理及び処理済みのＲＣＴ生成物におけるストレプトアビジン結合による断面高さの違い（輝点として識別される）を測定した。未処理及び処理済みのＲＧ４の平均ステップ高さ変動は、それぞれ６．６ｎｍと２２．９ｎｍであった。ストレプトアビジンの結合は均一ではなかったが、Ｇ４付近にストレプトアビジンが存在することが形態から確認された。ＲＧｘの表面形態は、孔がなく、未処理及び処理済みのサンプルで３０～４０ｎｍの高さ変動を示した。このことから、自己ビオチン化やストレプトアビジン結合が起こらず、Ｇ－四重鎖が存在しないことが確認された。スケールバーは２００ｎｍを示す。
【図14】図１４Ａ～１４Ｄは、ＲＧ４ゲル及びＲＧｘ生成物の弾性率の測定結果を示す。図１４Ａは、ナノメートルスケールでインデンテーション深さを測定するＡＦＭインデンテーション法を用いて得られたフォースカーブである。弾性率は、ヘルツのフィッティングモデルを用いて、そのベストフィット領域で求めた。図１４Ｂは、ＲＣＴ生成物のヤング率をゲル化時間に対してフォースモードで求めたことを示す。０、３、６時間では、弾性率はゼロに近く、これは、６時間後にゲル化は始まらないが、弾性率はゲル特性の前兆として増加した。適用された力に対する耐性は時間依存的であることがわかった。ＲＧｘ生成物の弾性率は、試験したすべての時間間隔にわたってゼロのままであった。図１４Ｃ及び図１４Ｄは、材料の弾性部分と固体状態の挙動を表す貯蔵弾性率、及びサンプルの粘度と液体状態の挙動を表す損失弾性率をそれぞれ示す（４６）。ＲＧ４ゲルは非ニュートン的な非線形挙動を示し、様々な作製時間と広範囲の角周波数で貯蔵弾性率と損失弾性率の両方に凹型パターンが見られた。ＲＧ４ゲルは大きな貯蔵弾性率と低い損失弾性率を示し、これは固体様の性質を示す。両弾性率の緩やかな増加が観察され、作製後１２時間から応答が大きく減少した。ＲＧｘの弾性率はゼロに近く、これは粘性であることを示す。
【図15】図１５は、ＲＧ４ハイドロゲル中のＧ－四重鎖の定量と密度計算を示す。Ｑｕｂｉｔ（商標）ＲＮＡ ＢＲアッセイキットに含まれるＲＮＡ特異的蛍光色素を用いて、総ＲＮＡの濃度を測定した。ＲＣＴサイクルの１単位の濃度は、総ＲＮＡとＧ－四重鎖の濃度に基づいて計算した。拡散性を計算するために、ＲＧ４ハイドロゲル中のＲＮＡ量に基づいてＧ－四重鎖構造間の平均距離を計算した。３次元分布におけるＧ－四重鎖間の推定距離は２１．１１ｎｍであった。
【図16】図１６Ａ及び１６Ｂは、血清中のＲＣＴ生成物の安定性を描く代表的な電気泳動図である。異なるばく露時間におけるＲＮａｓｅに富むウシ胎児血清（ＦＢＳ）に対するＲＮＡハイドロゲルの応答性（存在又は分解）を、ＲＧ４ハイドロゲルの安定性を評価するためにゲル電気泳動を使用して実証した。図１６Ａは、ＦＢＳ環境におけるアニール後の転写産物の反応時間ベースの安定性を、アガロースゲル電気泳動によって定量的に評価したことを示す。４８時間でのＲＮＡ量の減少によって示されるように、ＲＧ４とＲＧｘの両方でＲＮＡの分解が観察された。ＲＧ４ではＲＮＡ分子の豊富さが、ＲＧｘでは不安定さが観察された。図１６Ｂは、ＲＧｘを血清に長時間ばく露し、４８時間分解させたことを示す。矢印は、ＲＧｘの分解の開始を示す。
【図17A-B】図１７Ａ～１７Ｄは、ＨｉＢｉＴコードＲＣＴ生成物の作製結果を示す。図１７Ａは、ガラスバイアル内で作製したＨｉＢｉＴコードＲＧ４（Ｈ－ＲＧ４）及びＲＧｘ（Ｈ－ＲＧｘ）生成物を比較したものであり、倒立させてハイドロゲル化を確認した。３０Ｔスペーサー（配列番号：３３）及びＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列を含むＤＮＡテンプレートから転写されたＲＮＡコンカテマーがハイドロゲル化して３０Ｔ ＲＧ４ハイドロゲルを形成したのに対し、ＨｉＢｉＴコードＲＣＴ生成物はハイドロゲル化の肉眼で見える証拠を示さず、バイアルの底に張り付いていた。上向きの矢印は形成されたゲルを示し、下向きの矢印はゲル化に失敗した液体を示す。図１７Ｂは、ＨｉＢｉＴ－Ｇ４及びＨｉＢｉＴ－Ｇｘテンプレートについての環状テンプレート形成のＰＡＧＥ分析を示す。ハイドロゲル化は失敗したが、作製ステップによって異なる移動位置が確認できる。各プロセスで作製に成功したテンプレートを、塗りつぶされた菱形（◆）で示す。
【図17C-D】図１７Ｃは、ハイドロゲル形成を妨げると考えられる、Ｈ－ＲＧ４に予想される二次構造を示す。ハイドロゲル化の失敗は、Ｈ－ＲＧ４の間で複雑な二次構造が形成され、Ｇ４モチーフとの相互作用が阻害された結果、起きた可能性がある。構造１及び構造２の形成確率は、ｏｘＤＮＡによってそれぞれ９６．４８％及び２５．３９％であると推定された。Ｇ－四重鎖部分は、灰色で表示されている。図１７Ｃは、配列番号：２９～３１をそれぞれ、出現順に開示している。図１７Ｄは、様々なＨｉＢｉＴコードＲＮＡテンプレートのタンパク質発現効率をＨｉＢｉＴペプチドからの相対発光（ＲＬ）により特徴付けたことを示す。Ｈ－ＲＧ４生成物は、ハイドロゲル化しないと思われ、Ｈ－ＲＧｘとのタンパク質発現効率の差を示さなかった。Ｈ－ＲＧ４はＨ－ＲＧｘに比べ、アニール時にタンパク質発現量が低下する傾向があり、これはＧ４の形成に依るものである可能性がある。下記表１に示す操作条件を用いて、ｏｘＤＮＡ粗視化分子動力学シミュレーションモデルにより、構造１及び構造２の発生確率を推定した。ＲＣＴ生成の１サイクルでの部分的な相補結合は、剛性の非特異的な二次構造による立体障害によって、ＲＧ４のハイドロゲル化を妨げていると考えられる。この妨害は、ワイドバンドとして挙動する支持体ＲＧ４を組み込むことで抑制された。
【0027】
【表1】
【図18A】図１８Ａ～１８Ｅは、ＲＣＴ生成物をハイドロゲル化するために使用することができるワイドバンドシステムを示す。図１８Ａは、ワイドバンドＲＧ４ハイドロゲル（Ｗ－ＲＧ４）作製の模式図である。タンパク質発現のためのプログラムされた自己集合ＲＧ４ハイドロゲルの利点を最大化するために、ハイドロゲル化したＲＧ４成分により、以前はハイドロゲル化しなかったＲＣＴ生成物のハイドロゲル化を可能にする方法を設計した。それらの生成物は、３０Ｔ ＲＧ４ハイドロゲル（配列番号：６の配列を有するＤＮＡテンプレートのローリングサークル転写から生成されるＲＮＡコンカテマーによって形成されるハイドロゲル）と同様の安定なハイドロゲル（Ｗ－ＲＧ４）を形成することが示された。図１８Ａは、配列番号：３３として「３０Ｔ」を開示している。
【図18B-C】図１８Ｂは、異なるモル分率の３０Ｔ ＲＧ４によるＷ－ＲＧ４の形成を、バイアル倒立によってハイドロゲル化を確認すると同時に転写したことを示す。示されたモル分率（２５％、５０％、７５％）は、スペーサーテンプレートである３０Ｔ ＲＧ４のモル分率を意味する。タンパク質をコードするＲＧ４テンプレート（Ｈ－ＲＧ４）はハイドロゲル化しないように見えたが、包埋されたＧ－四重鎖は支持体ＲＧ４生成物の部分構造と相互作用してハイドロゲルの生成に成功した。予想されたとおり、Ｈ－ＲＧ４のモル分率が増加し、３０Ｔ ＲＧ４のモル分率が減少すると、ハイドロゲルの剛性は低下した。図１８Ｃは、アニーリング後のワイドバンドＲＮＡハイドロゲルのアガロースゲル電気泳動の分析結果である。ＨｉＢｉＴコードＲＧ４ハイドロゲルは、転写段階から急速かつ改善された発現パターンを示し、Ｇ－四重鎖形成体のモル分率が低下するとＲＮＡが消失した。ハイドロゲル化ＲＧ４は、架橋されたＧ４により、ハイドロゲル化しない１００％Ｈ－ＲＧ４よりも移動が少なかった。
【図18D-E】図１８Ｄは、Ｗ－ＲＧ４ハイドロゲルのタンパク質発現効率を、発現したＨｉＢｉＴからの相対発光（ＲＬ）シグナルを使用して特徴付けたことを示す。ハイドロゲル化されたＷ－ＲＧ４は、２５％及び１００％のＨ－ＲＧ４と比較して、効率の向上を示した。タンパク質生産収量は、７５％のモル分率で最大となった。図１８Ｅは、ＡＦＭを用いた７５％Ｗ－ＲＧ４のナノインデンテーション測定から得られたフォースカーブを示す。ヤング率は、ベストフィット領域で９．７１ｋＰａと推定された。
【図19】図１９は、異なるカットアウト数を有するＷ－ＲＧ４のタンパク質発現効率を示す。Ｗ－ＲＧ４からのタンパク質発現の最適化は、翻訳成分の接近性を改善するためにハイドロゲルを切断することによって行った。カットアウト数が３００のときに効率が最大となり、薄いハイドロゲルパッド（３３）を模倣してタンパク質発現に関与する酵素及び基質の拡散を促進することにより、未切断サンプルとは対照的にタンパク質効率が著しく向上した。
【図20】図２０は、線状ＨｉＢｉＴ－Ｇｘテンプレート及び転写ＲＮＡの段階的な作製についてのＰＡＧＥ分析を示す図である。Ｔ７プロモーターとのアニーリング前後の線状ＨｉＢｉＴテンプレートについて、テンプレートのバンド位置の識別可能な差異が見られた。線状ＨｉＢｉＴ－Ｇｘ ＲＮＡは、アニーリングした線状ＨｉＢｉＴ－Ｇｘテンプレートから転写され、ＤＮＡテンプレートの位置に明瞭なバンドを示した。転写されたＲＮＡが瞬時に分解されるため、残留バンドも確認できる。塗りつぶされたひし形（◆）は、各ステップで作製に成功したテンプレート又は転写ＲＮＡを示す。
【図21A-B】図２１Ａ～２１Ｅは、タンパク質発現増強のための反応パラメータ：反応時間、カオトロピック処理、反応温度、及びテンプレート量の最適化を示す。（Ａ）反応時間に対する、遊離ＤＮＡ（ｆＤＮＡ）及びＲＮＡ（ｆＲＮＡ）とＷ－ＲＧ４の相対発光（「ＲＬ」）の比較。Ｗ－ＲＧ４は他のテンプレートよりも優れた性能を示したが、翻訳反応時間が２時間を超えると、可溶性ＨｉＢｉＴの減少に対応するＲＬの減少が観察された。発現したＨｉＢｉＴペプチド間の封入体による干渉が疑われた。（Ｂ）凝集したペプチドを可溶化するための尿素処理前後のＨｉＢｉＴ翻訳産物のＲＬ。ＤＩＷ、ライセート、及びＨｉＢｉＴは、それぞれ蒸留水、テンプレートを含まない翻訳混合物、及びＨｉＢｉＴ翻訳混合物に相当する。ＤＩＷ＊、ライセート＊、及びＨｉＢｉＴ＊は、尿素処理したサンプルを示す。翻訳産物では、尿素処理後にＲＬの顕著な増加が観察された。
【図21C】（Ｃ）翻訳産物の尿素処理後のＲＬで特徴付けられる、様々なテンプレートから発現したＨｉＢｉＴペプチドの相対量。
【図21D】（Ｄ）ＲＬに対するＨｉＢｉＴの温度依存的発現収量。３７℃未満では封入体により生じる時間依存的なＲＬ低下は見られず、２５℃で最適な発現が達成された。
【図21E】（Ｅ）タンパク質効率収量に関する様々なＲＮＡテンプレート量の影響。ＲＣＴ生成物３～２２μｌを翻訳に使用した場合、一貫した収量が観察された。
【図22A】図２２Ａ～２２Ｂは、ＨｉＢｉＴタグ付きＴＡＴ及びインスリンＧ－四重鎖テンプレートのＰＡＧＥ分析を示す。図２２Ａは、ＨｉＢｉＴタグ付きＴＡＴ及びインスリンＧ－四重鎖をコードする環状テンプレートの作製を示す。連続プロセスについてバンド移動の際立った違いが観察され、これはテンプレートの環状化とライゲーションの成功を示す。
【発明を実施するための形態】
【0028】
発明の詳細な説明
概要
本出願は、反復モノマー単位を有する核酸コンカテマーからの核酸ハイドロゲル（例えば、ＲＮＡハイドロゲル）の構築に関連する方法及び組成物を提供する。各モノマー単位は、１つ又は複数のＧ－四重鎖配列を含む。これらのＧ－四重鎖配列は、コンカテマーが自己集合して（すなわち、外部架橋剤を必要とせずに）ハイドロゲルになるように、核酸コンカテマーを架橋する。核酸コンカテマーは、環状ＤＮＡテンプレートのローリングサークル増幅又はローリングサークル転写によって製造することができる。いくつかの実施形態では、核酸コンカテマーの各モノマー単位は、目的のポリペプチドのコード配列を含む。核酸コンカテマーによって形成された核酸ハイドロゲルは、ポリペプチドを大量に発現させるために使用することができる。いくつかの実施形態では、Ｇ－四重鎖配列を含む少なくとも２つのＲＮＡコンカテマーが製造され、一方はスペーサーをさらに含み、他方は目的のポリペプチドをコードする配列をさらに含む。これら２つのＲＮＡコンカテマーは組み合わされ、自己集合して、本開示のワイドバンドＲＮＡハイドロゲルと呼ばれる１つのＲＮＡハイドロゲルを形成する。
概要
本出願は、反復モノマー単位を有する核酸コンカテマーからの核酸ハイドロゲル（例えば、ＲＮＡハイドロゲル）の構築に関連する方法及び組成物を提供する。各モノマー単位は、１つ又は複数のＧ－四重鎖配列を含む。これらのＧ－四重鎖配列は、コンカテマーが自己集合して（すなわち、外部架橋剤を必要とせずに）ハイドロゲルになるように、核酸コンカテマーを架橋する。核酸コンカテマーは、環状ＤＮＡテンプレートのローリングサークル増幅又はローリングサークル転写によって製造することができる。いくつかの実施形態では、核酸コンカテマーの各モノマー単位は、目的のポリペプチドのコード配列を含む。核酸コンカテマーによって形成された核酸ハイドロゲルは、ポリペプチドを大量に発現させるために使用することができる。いくつかの実施形態では、Ｇ－四重鎖配列を含む少なくとも２つのＲＮＡコンカテマーが製造され、一方はスペーサーをさらに含み、他方は目的のポリペプチドをコードする配列をさらに含む。これら２つのＲＮＡコンカテマーは組み合わされ、自己集合して、本開示のワイドバンドＲＮＡハイドロゲルと呼ばれる１つのＲＮＡハイドロゲルを形成する。
【0029】
核酸ハイドロゲル（例えば、ＲＮＡハイドロゲル）は、異なる寸法及び形状で成形することができ、これらの核酸ハイドロゲルは、良好で柔らかい機械的特性及び優れた物理化学的安定性を示す。本明細書に開示された核酸ハイドロゲルは、広範な生物学的用途（例えば、触媒、タンパク質発現）のためのプラットフォームとして機能することができる。ＲＮＡハイドロゲルタンパク質生産系は、沢山のＤＮＡからＲＮＡが生産され、細胞骨格に囲まれた細胞質内の限られた空間内でタンパク質が急に発現する細胞内環境に酷似している（４２）。ハイドロゲル中のゲルマトリックスは、細胞に機械的支持を与える細胞骨格の役割によく似ている。核酸ハイドロゲルは、（例えば、タンパク質発現中の）酵素反応に有益な十分な水性空間を有している。核酸ハイドロゲルは、多孔性とタンパク質コード配列の近傍という有用な特徴を有し、これにより、核酸ハイドロゲル中のＲＮＡテンプレートにリボソームが自由にアクセスできる。これらの特徴により、本明細書に開示された核酸ハイドロゲルは、理想的な無細胞タンパク質生産プラットフォームとして機能することができる。
【0030】
本明細書に開示された核酸ハイドロゲルを用いてタンパク質を生産することは、容易に行うことができる簡単で合理的な手順である。また、核酸ハイドロゲルタンパク質生産システムは、タンパク質生産効率と汎用性をさらに改善するために、より長い反応期間で連続モードでタンパク質を生産するように構成することができる。多種の工学的機能性を有することで、核酸ハイドロゲルは、多重リアルタイム病原体検出、無毒、不燃性で、環境に優しいエネルギー源としてのバイオ燃料細胞、バイオインプラント及び抗体薬物複合体など、いくつかの分野で最先端技術の応用範囲を拡大することができる。
【0031】
用語
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、内容が明らかにそうでないことを示さない限り、複数の言及を含む。したがって、例えば、「抗体（ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」への言及は、任意に、２つ以上のそのような分子の組み合わせを含む、など。
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、内容が明らかにそうでないことを示さない限り、複数の言及を含む。したがって、例えば、「抗体（ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」への言及は、任意に、２つ以上のそのような分子の組み合わせを含む、など。
【0032】
本明細書で使用される用語「約」は、当技術分野の当業者に容易に知られるそれぞれの値の通常の誤差範囲を指し、例えば±２０％、±１０％、又は±５％は、言及された値の意図される意味の範囲内であることを指す。
【0033】
本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は、オープンエンドである。主題の核酸（又はアミノ酸配列）に関連して使用される場合、主題の配列を部分として又はその配列全体として含む核酸配列（又はアミノ酸配列）を指す。
【0034】
用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は互換的に使用され、本明細書で使用される場合、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び上記の合成形態及び混合ポリマーのセンス及びアンチセンス鎖の双方を指す。特定の実施形態では、ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、又はいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾形態、及びそれらの組合せを指す。この用語はまた、ＤＮＡの一本鎖及び二本鎖の形態を含むが、これらに限定されない。さらに、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、例えば、環状ＤＮＡテンプレート、本明細書に開示される核酸コンカテマーは、天然に存在するヌクレオチド及び／又は天然に存在しないヌクレオチド連結によって一緒に連結された、天然に存在するヌクレオチド及び修飾ヌクレオチドのいずれか又は両方を含み得る。核酸分子は、当業者によって容易に理解されるように、化学的又は生化学的に修飾されてもよく、あるいは非天然又は誘導体化されたヌクレオチド塩基を含んでもよい。このような修飾としては、例えば、標識、メチル化、１つ以上の天然に存在するヌクレオチドのアナログでの置換、非荷電連結（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホラミデート、カルバメートなど）、荷電連結（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）などのヌクレオチド間修飾、ペンダント部分（例えば、ポリペプチド）、インターカレーター（例えば、アクリジン、プソラレンなど）、キレーター、アルキレーター、及び修飾連結（例えば、アルファアノマー核酸など）などが挙げられる。上記の用語はまた、一本鎖、二本鎖、部分二重鎖、三重鎖、ヘアピン、環状及びパドロックコンフォメーションを含む任意のトポロジカルコンフォメーションを含むことが意図される。核酸配列への言及は、他に指定されない限り、その相補体を包含する。したがって、特定の配列を有する核酸分子への言及は、その相補的な配列を有するその相補鎖を包含すると理解されるべきである。また、この用語は、同じポリペプチド配列をコードするコドン最適化核酸を含む。
【0035】
本明細書で使用される場合、用語「コンカテマー」は、核酸配列のタンデムリピートを含む核酸分子を指す。核酸コンカテマーは、核酸合成によって、又は、例えば、環状ＤＮＡテンプレートのローリングサークル増幅又はローリングサークル転写によって製造することができる。
【0036】
本明細書で使用される場合、用語「無細胞合成」は、生物学的抽出物及び／又は規定の試薬を含む反応混合物における核酸、ポリペプチド、低分子及び／又はウイルス粒子のインビトロ合成を意味する。反応混合物は、高分子の生産のためのテンプレート、例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡなど；合成しようとする高分子のためのモノマー、例えば、アミノ酸、ヌクレオチドなど；及び合成に必要な補因子、酵素、及びその他の試薬、例えば、リボソーム、非荷電ｔＲＮＡ、天然及び／又は非天然アミノ酸で荷電したｔＲＮＡ、ポリメラーゼ、転写因子、ｔＲＮＡ合成酵素などを含むこととなる。
【0037】
用語「ライセート」は、タンパク質合成機構に必要な成分を含む任意の細胞由来の調製物であり、このような細胞成分は、所望のタンパク質をコードする核酸を発現することが可能であり、生物学的成分の大部分は、再構成されたものよりもむしろ、細胞の溶解から生じる濃度で存在する。ライセートは、ライセートが追加の細胞成分、例えば、アミノ酸、核酸、酵素などで補充されるように、さらに変更されてもよい。ライセートはまた、溶解後に追加の細胞成分が除去又は分解されるように改変されてもよい。
【0038】
本明細書で使用される場合、用語「ＲＧｘ」は、ＲＮＡコンカテマーによって形成される非Ｇ－四重鎖構造を指す。
【0039】
本明細書で使用される場合、「ｓＧｘ」と互換的に使用される用語「ＲＧｘコンカテマー」は、ＲＧｘを形成するＲＮＡコンカテマーを意味する。一実施形態では、ＲＧｘコンカテマーは、配列番号：１３の複数のコピーを含む。
【0040】
本明細書で使用される場合、用語「ＲＧｘ溶液」は、ＲＧｘによって形成される粘性溶液を指す。
【0041】
本明細書で使用される場合、用語「ＲＧ４」は、ＲＮＡコンカテマーによって形成されるＲＮＡ Ｇ－四重鎖を指す。いくつかの実施形態では、ＲＮＡコンカテマーは、ローリングサークル転写によって生成される。
【0042】
本明細書で使用される場合、「ｓＧ４」と互換的に使用される用語「ＲＧ４コンカテマー」は、ＲＧ４を形成するＲＮＡコンカテマーを指す。
【0043】
本明細書で使用される場合、「ＲＧ４ゲル」と互換的に使用される用語「ＲＧ４ハイドロゲル」は、ＲＧ４のゲル化から生じたハイドロゲルを意味する。
【0044】
本明細書で使用される場合、用語「Ｈ－ＲＧ４ハイドロゲル」又は「Ｈ－ＲＧ４ゲル」は、配列番号：１４の配列を含むＤＮＡテンプレートのローリングサークル転写から生成されるＲＮＡコンカテマーによって形成されるハイドロゲルを指す。
【0045】
本明細書で使用される場合、用語「Ｗ－ＲＧ４ハイドロゲル」又は「ワイドバンド（ｗｉｄｅｂａｎｄ）ＲＧ４ハイドロゲル」は、少なくとも一方がＲＧ４コンカテマーである２つの異なるＲＮＡ分子によって形成されるハイドロゲルを指す。一実施形態では、両方のＲＮＡ分子はＲＧ４コンカテマーであり、一方はポリアデニンを含み、他方は目的のポリペプチドをコードしている。一実施形態では、２つのＲＮＡ分子のうちの一方は、ポリアデニンを含むＲＧ４コンカテマーであり、他方は、目的のポリペプチドをコードするＲＮＡ分子である。
【0046】
本明細書で使用される場合、用語「ｎＴ ＲＧ４、」は、ｎ個のチミンを含むＤＮＡテンプレートのローリングサークル転写から生成されるＲＮＡコンカテマーを指す。例えば、用語「３０Ｔ ＲＧ４」、「６０Ｔ ＲＧ４」、「９０Ｔ ＲＧ４」、「１２０Ｔ ＲＧ４」、又は「１５０Ｔ ＲＧ４」は、３０（配列番号：３３）、６０（配列番号：３４）、９０（配列番号：３５）、１２０（配列番号：３６）又は１５０（配列番号：３７）のチミンを含むＤＮＡテンプレートのローリングサークル転写から生成されるＲＮＡコンカテマーを指す。ｎは任意の整数であり得る。いくつかの実施形態では、ｎは、３～４００の範囲、例えば、１０～３００、２０～２００、２５～１８０、又は３０～１５０の範囲にある。転写され、ｎＴ ＲＧ４を生成するＤＮＡテンプレートは、ｎＴ ＲＧ４のスペーサーテンプレートと称される。一例において、３０Ｔ ＲＧ４のためのスペーサーテンプレートは、配列番号：６の配列を含む。
【0047】
本開示を通じて、用語「ゲル」と用語「ハイドロゲル」は、交換可能に使用される。
【0048】
本明細書で使用される場合、用語「コード配列（ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」、「タンパク質コード配列（ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」、「タンパク質コード配列（ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、ＤＮＡ配列を指し、これは転写されてＲＮＡ転写物を形成することができ、該ＲＮＡ転写物は翻訳されて目的のポリペプチドを産生することができる。文脈に応じて、本明細書で言及される、目的のタンパク質のコード配列又は目的のタンパク質をコードするコード配列は、目的のタンパク質をコードするセンス鎖の配列（例えば、配列番号：２６）であっても、又はアンチセンス鎖の配列（例えば、配列番号：２１）であってもよい。本明細書で使用されるコード配列は、標的配列とも呼ばれる。
【0049】
本明細書で使用される場合、用語「非コード配列」は、転写され得るが翻訳できないゲノム配列を指す。
【0050】
本明細書で使用される場合、用語「モル分率」は、混合物中の試薬のモル数のパーセントを指す。例えば、スペーサーテンプレート分子とコーディングテンプレート分子の両方を含む混合物中のスペーサーテンプレートのモル分率が７５％であることは、スペーサーテンプレート分子のモル数の割合が７５％であり、コーディングテンプレート分子のモル数の割合が２５％であることを意味する。
【0051】
Ｇ四重鎖モチーフ
本明細書に開示されるＧ－四重鎖モチーフは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は少なくとも４つの連続するグアニン（Ｇｓ）を含む。場合によって、Ｇ－四重鎖モチーフ中のヌクレオチドの少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又は少なくとも５０％がグアニンである。Ｇ－四重鎖モチーフの非限定的な例は、Ｐｈａｎ， ＦＥＢＳ Ｊ． ２７７， １１０７－１１１７ （２０１０）及びＰｌａｔｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １８６１ （２０１７） １４２９－１４４７に開示されており、これらの開示の全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に開示されるＧ－四重鎖モチーフは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は少なくとも４つの連続するグアニン（Ｇｓ）を含む。場合によって、Ｇ－四重鎖モチーフ中のヌクレオチドの少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又は少なくとも５０％がグアニンである。Ｇ－四重鎖モチーフの非限定的な例は、Ｐｈａｎ， ＦＥＢＳ Ｊ． ２７７， １１０７－１１１７ （２０１０）及びＰｌａｔｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １８６１ （２０１７） １４２９－１４４７に開示されており、これらの開示の全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0052】
いくつかの実施形態では、Ｇ－四重鎖モチーフは、ＲＮＡ配列（ＲＮＡ Ｇ－四重鎖モチーフ）である。ＲＮＡ Ｇ－四重鎖モチーフの非限定的な例としては、ＵＡＧＧＧＵＵＡＧＧＧＵ（配列番号：２）及びＧＧＧＵＵＡＧＧＧＵ（配列番号：２２）が挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｇ－四重鎖モチーフは、ＤＮＡ配列（ＤＮＡ Ｇ－四重鎖モチーフ）である。ＤＮＡ Ｇ－四重鎖モチーフの非限定的な例としては、ＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴ（配列番号：２０）が挙げられる。
【0053】
また、本開示に包含されるのは、本明細書に開示されるか、又は参照により組み込まれる対応するＤＮＡ Ｇ－四重鎖モチーフから誘導することができるＲＮＡ Ｇ－四重鎖モチーフである。例えば、ＲＮＡ Ｇ－四重鎖モチーフは、例えば、ＤＮＡ Ｇ－四重鎖モチーフ中のデオキシリボヌクレオチドをそれぞれの対応するリボヌクレオチドで置き換え、窒素塩基チミンをウラシルで置き換えることにより、ＤＮＡ Ｇ－四重鎖モチーフから誘導することができる。一例として、ＵＡＧＧＧＵＵＡＧＧＧＵ（配列番号：２）は、上記のアプローチを使用してＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴ（配列番号：２０）から誘導することができる。逆に、ＤＮＡ Ｇ－四重鎖モチーフは、例えば、リボヌクレオチドをそれぞれの対応するデオキシリボヌクレオチドで置き換え、窒素塩基ウラシルをチミンで置き換えることによって、本明細書に開示されるか、又は参照により組み込まれるＲＮＡ Ｇ－四重鎖モチーフのいずれかから誘導することも可能である。これらのＤＮＡ Ｇ－四重鎖モチーフもまた、本開示に包含される。
【0054】
Ｇ－四重鎖モチーフを有するＲＮＡコンカテマーの製造
いくつかの実施形態において、本開示における方法及び組成物は、ローリングサークル転写によってＲＮＡコンカテマーを生成するために使用することができる。
いくつかの実施形態において、本開示における方法及び組成物は、ローリングサークル転写によってＲＮＡコンカテマーを生成するために使用することができる。
【0055】
環状ＤＮＡテンプレート
ローリングサークル転写で使用される環状ＤＮＡテンプレートは、一本鎖直鎖ＤＮＡから生成されてもよく、該直鎖ＤＮＡは、所望のＲＮＡ配列に相補的である配列を含んでいる。一本鎖直鎖ＤＮＡは、核酸ライブラリーからの化学合成単離、又は組換え技術によるものを含めた、当業者に既知の任意の方法によって調製することができる。
ローリングサークル転写で使用される環状ＤＮＡテンプレートは、一本鎖直鎖ＤＮＡから生成されてもよく、該直鎖ＤＮＡは、所望のＲＮＡ配列に相補的である配列を含んでいる。一本鎖直鎖ＤＮＡは、核酸ライブラリーからの化学合成単離、又は組換え技術によるものを含めた、当業者に既知の任意の方法によって調製することができる。
【0056】
一本鎖直鎖ＤＮＡは、スプリントオリゴヌクレオチドの助けを借りて、ＤＮＡリガーゼにより環状化されて環状ＤＮＡテンプレートを形成することができる。スプリントオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡの一端に相補的な第１の配列と、直鎖ＤＮＡ分子の他端に相補的な第２の配列とを含む。スプリントオリゴヌクレオチドは、一本鎖直鎖ＤＮＡの２つの末端の配列にハイブリダイズすることによって、該２つの末端を近接させる。次に、ＤＮＡリガーゼを使用して、ＤＮＡ分子の両端を結合させ、環状の一本鎖ＤＮＡテンプレートを形成する。スプリントオリゴヌクレオチドは、次に、ＤＮＡコンカテマーを形成するためのローリングサークル増幅を開始するための、又はＲＮＡコンカテマーを形成するためのローリングサークル転写を開始するための、プライマーとして機能することができる。一つの例示的な実施形態が図１Ａに示されており、この場合、スプリントオリゴヌクレオチドは、環状テンプレート中のＴ７プロモーター配列に相補的な配列を有している。非限定的な例として、配列番号：６の配列を有する一本鎖ＤＮＡ分子が、配列番号：１２の配列を有するスプリントオリゴヌクレオチドにアニールされ、ＤＮＡ分子の両端が一緒になってスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることになる。ＤＮＡリガーゼの存在下で、２つの末端が結合して環状ＤＮＡテンプレートを形成する。
【0057】
環状一本鎖ＤＮＡテンプレートは、スペーサー又は目的のコード配列に作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、スプリントオリゴヌクレオチドは、環状ＤＮＡテンプレート中のプロモーター配列に相補的である。一実施形態では、スプリントオリゴヌクレオチドは、配列番号：１２の配列を有する。本明細書で使用されるプロモーター配列は、広範囲のプロモーターに由来し得る。プロモーターは、変異プロモーター、トランケートプロモーター、又はハイブリッドプロモーターであってよい。プロモーターは、構成的プロモーターであってもよいし、誘導的プロモーターであってもよい。好適なプロモーターの非限定的な例としては、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、Ｌａｃプロモーター、ａｒａＢａｄプロモーター、Ｔｒｐプロモーター、Ｔａｃプロモーター、又はＳＰ６プロモーターが挙げられる。
【0058】
環状一本鎖ＤＮＡテンプレートは、リプレッサー、アクチベーター、転写及び翻訳エンハンサー、ＤＮＡ結合タンパク質などを含むがこれらに限定されない１つ以上の他の調節配列をさらに含んでもよい。
【0059】
このような環状ＤＮＡテンプレートはまた、以下にさらに説明するように、例えば、目的のポリペプチドのコード配列又はスペーサー配列などの１つ以上の機能的配列を含んでいてもよい。
【0060】
スペーサー
スペーサーは、環状ＤＮＡテンプレート中のプロモーター配列とＧ４四重鎖モチーフの間に位置する。典型的には、スペーサーは非コード配列である。スペーサーは、複数のチミンを含んでもよい。いくつかの実施形態では、スペーサーは、１５～２２０、例えば、２０～２００、２５～１５０、又は３０～１２０ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、スペーサー中のヌクレオチドの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％が、チミン（Ｔ）である。いくつかの実施形態では、スペーサーは、少なくとも１０（配列番号：３９）、少なくとも１２（配列番号：４０）、少なくとも１３（配列番号：４１）、少なくとも１４（配列番号：４２）、少なくとも１５（配列番号：４３）、少なくとも１６（配列番号：４４）、少なくとも２０（配列番号：４５）の連続チミンを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーのすべてのヌクレオチドがチミンである。いくつかの実施形態では、スペーサーは、３Ｔ、１０Ｔ（配列番号：３８）、３０Ｔ（配列番号：３３）、６０Ｔ（配列番号：３４）、９０Ｔ（配列番号：３５）、１２０Ｔ（配列番号：３６）、又は１５０Ｔ（配列番号：３７）を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、３Ｔ、１０Ｔ（配列番号：３８）、３０Ｔ（配列番号：３３）、６０Ｔ（配列番号：３４）、９０Ｔ（配列番号：３５）、１２０Ｔ（配列番号：３６）、又は１５０Ｔ（配列番号：３７）からなる。いくつかの実施形態では、環状ＤＮＡテンプレートはスペーサーを含み、該スペーサーは、配列番号：６～９、及び１１からなる群から選択される配列を含む。
スペーサーは、環状ＤＮＡテンプレート中のプロモーター配列とＧ４四重鎖モチーフの間に位置する。典型的には、スペーサーは非コード配列である。スペーサーは、複数のチミンを含んでもよい。いくつかの実施形態では、スペーサーは、１５～２２０、例えば、２０～２００、２５～１５０、又は３０～１２０ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、スペーサー中のヌクレオチドの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％が、チミン（Ｔ）である。いくつかの実施形態では、スペーサーは、少なくとも１０（配列番号：３９）、少なくとも１２（配列番号：４０）、少なくとも１３（配列番号：４１）、少なくとも１４（配列番号：４２）、少なくとも１５（配列番号：４３）、少なくとも１６（配列番号：４４）、少なくとも２０（配列番号：４５）の連続チミンを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーのすべてのヌクレオチドがチミンである。いくつかの実施形態では、スペーサーは、３Ｔ、１０Ｔ（配列番号：３８）、３０Ｔ（配列番号：３３）、６０Ｔ（配列番号：３４）、９０Ｔ（配列番号：３５）、１２０Ｔ（配列番号：３６）、又は１５０Ｔ（配列番号：３７）を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、３Ｔ、１０Ｔ（配列番号：３８）、３０Ｔ（配列番号：３３）、６０Ｔ（配列番号：３４）、９０Ｔ（配列番号：３５）、１２０Ｔ（配列番号：３６）、又は１５０Ｔ（配列番号：３７）からなる。いくつかの実施形態では、環状ＤＮＡテンプレートはスペーサーを含み、該スペーサーは、配列番号：６～９、及び１１からなる群から選択される配列を含む。
【0061】
コード配列
コード配列は、目的のポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、コード配列の長さは、２０～３００ヌクレオチド、例えば、２５～２００ヌクレオチド、又は３０～１６６ヌクレオチドの範囲であってよい。下限の観点からは、コード配列は、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、又は少なくとも１００ヌクレオチドの長さを有する。上限の観点からは、コード配列は、３００ヌクレオチド以下、２００ヌクレオチド以下、又は１６６ヌクレオチド以下の長さを有する。
コード配列は、目的のポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、コード配列の長さは、２０～３００ヌクレオチド、例えば、２５～２００ヌクレオチド、又は３０～１６６ヌクレオチドの範囲であってよい。下限の観点からは、コード配列は、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、又は少なくとも１００ヌクレオチドの長さを有する。上限の観点からは、コード配列は、３００ヌクレオチド以下、２００ヌクレオチド以下、又は１６６ヌクレオチド以下の長さを有する。
【0062】
目的のポリペプチドの非限定的な例としては、単一ドメイン抗体、単鎖抗体、抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ又はＦａｂフラグメント）などの抗体、成長ホルモン（例えば、インスリン）、ホルモン又は成長因子の受容体；ＣＤ－３、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ－１９などのＣＤタンパク質；インターロイキン；インターフェロン；Ｔ細胞受容体；酵素；ウイルス抗原；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレッシン；調節タンパク質（例えば、ＴＡＴタンパク質）；及び上に列挙した任意のポリペプチドの断片が挙げられる。いくつかの実施形態では、目的のポリペプチドは、単量体可変抗体ドメイン、例えば、単一ＶＨＨドメインを含む、単一ドメイン抗体である。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、抗ＣＤ４０リガンド（「抗ＣＤ４０Ｌ」）単一ドメイン抗体である。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、レトリズマブである。
【0063】
いくつかの実施形態では、コード配列は、配列番号：２３、２４、２５及び２７からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする。
【0064】
いくつかの実施形態では、コード配列は、環状ＤＮＡテンプレート中のプロモーター配列とＧ４四重鎖モチーフの間に位置する。いくつかの実施形態では、コード配列は、発現コンストラクト中にある。いくつかの実施形態では、コード配列は、配列番号：１４、１６、１８、及び２６からなる群から選択される配列を有する。
【0065】
本発明により製造される目的のポリペプチドは、以下の目的又は効果の１つ以上に使用することができる：細菌、ウイルス、真菌及びその他の寄生虫を含むがこれらに限定されない感染性物質の成長、感染又は機能を阻害すること、又は殺すこと；身長、体重、髪の色、目の色、皮膚、脂肪量と除脂肪量の比、その他の組織の色素形成、又は臓器もしくは体の部分のサイズもしくは形状（例えば、乳房の増大や減少、骨の形態もしくは形状の変化など）を含むがこれらに限定されない、身体的特徴に影響（抑制又は増強）を与えること；バイオリズム、又は概日サイクル又はリズムに影響を与えること；男性又は女性の被験者の生殖能力に影響を与えること；食事性脂肪、脂質、タンパク質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、補因子又はその他の栄養因子もしくは成分の代謝、異化、同化、処理、利用、貯蔵又は排泄に影響を与えること；
食欲、性欲、ストレス、認知（認知障害を含む）、うつ病（うつ病障害を含む）、暴力的行動などを含むがこれらに限定されない行動特性に影響を与えること；鎮痛作用又はその他の疼痛軽減作用を提供すること；造血系以外の系統の胚性幹細胞の分化及び成長を促進すること；ホルモン又は内分泌活性；酵素の場合、酵素の欠陥の修正及び欠乏関連疾患の治療；過増殖性疾患（例えば、乾癬など）の治療；免疫グロブリン様活性（例えば、抗原又は補体と結合する能力）；及び、ワクチン組成物中の抗原として作用し、当該タンパク質又は当該タンパク質と交差反応性を有する他の物質もしくは存在に対する免疫反応を向上させる能力。
食欲、性欲、ストレス、認知（認知障害を含む）、うつ病（うつ病障害を含む）、暴力的行動などを含むがこれらに限定されない行動特性に影響を与えること；鎮痛作用又はその他の疼痛軽減作用を提供すること；造血系以外の系統の胚性幹細胞の分化及び成長を促進すること；ホルモン又は内分泌活性；酵素の場合、酵素の欠陥の修正及び欠乏関連疾患の治療；過増殖性疾患（例えば、乾癬など）の治療；免疫グロブリン様活性（例えば、抗原又は補体と結合する能力）；及び、ワクチン組成物中の抗原として作用し、当該タンパク質又は当該タンパク質と交差反応性を有する他の物質もしくは存在に対する免疫反応を向上させる能力。
【0066】
本発明により製造されるポリペプチドは、当業者に知られている任意の目的に使用することができる。好ましい用途としては、診断的用途、予防的及び治療的用途を含む医療的用途が挙げられる。例えば、タンパク質は、局所的又は他のタイプの投与のために調製することができる。別の好ましい医学的用途は、ワクチン調製のための用途である。従って、本発明により製造されたタンパク質は、薬学的に許容される溶液に可溶化又は懸濁され、対象への投与のための医薬組成物を形成する。医学的目的のための適切なバッファー及び医薬組成物の投与方法を以下にさらに記載する。医学的組成物はまた、獣医学的目的のような、ヒト以外の対象に投与され得ることは、当業者によって理解されるであろう。
【0067】
ＲＮＡポリメラーゼ
本開示におけるＲＮＡポリメラーゼは、上記のようにＤＮＡテンプレート中のプロモーターを認識することができる任意のＲＮＡポリメラーゼであり得る。ＲＮＡポリメラーゼの非限定的な例としては、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、又はＴ３ ＲＮＡ ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。
本開示におけるＲＮＡポリメラーゼは、上記のようにＤＮＡテンプレート中のプロモーターを認識することができる任意のＲＮＡポリメラーゼであり得る。ＲＮＡポリメラーゼの非限定的な例としては、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、又はＴ３ ＲＮＡ ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【0068】
転写
ローリングサークル転写は、以下の成分の１種以上を含む反応混合物中で行うことができる：上記のような環状ＤＮＡテンプレート、目的の遺伝子が作動可能に連結されているプロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ポリメラーゼ）、及び任意でテンプレートが作動可能に連結されている任意の制御配列に向けられた１種以上の転写因子、リボヌクレオチド３リン酸（ｒＮＴＰｓ）、バッファー、任意で他の転写因子及び補因子。
ローリングサークル転写は、以下の成分の１種以上を含む反応混合物中で行うことができる：上記のような環状ＤＮＡテンプレート、目的の遺伝子が作動可能に連結されているプロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ポリメラーゼ）、及び任意でテンプレートが作動可能に連結されている任意の制御配列に向けられた１種以上の転写因子、リボヌクレオチド３リン酸（ｒＮＴＰｓ）、バッファー、任意で他の転写因子及び補因子。
【0069】
ローリングサークル転写は、好適な温度、例えば、２５℃～４０℃、又は約３７℃で行われてよい。転写反応は、１時間から一晩の期間続いてもよい。
【0070】
任意に、ローリングサークル転写の最後に、ＲＮＡ転写物は、当技術分野で良く知られている方法を用いて反応混合物から精製される。一実施形態では、ＲＮＡは、ＢＩＯ－ＲＡＤ（ＨＥＲＣＵＬＥＳ，ＣＡ）から入手可能な管状ＰＡＧＥカラム、例えばＰＲＥＰＣＥＬＬ ４９１を用いて転写混合物から精製することができる。
【0071】
Ｇ－四重鎖モチーフを有するＤＮＡコンカテマーの製造
いくつかの実施形態では、Ｇ－四重鎖モチーフを有するＤＮＡコンカテマーは、上記に開示されたような環状ＤＮＡテンプレートを用いたローリングサークル増幅によって生成することができる。これらのＤＮＡコンカテマーは、ＤＮＡハイドロゲルを形成することができる。
いくつかの実施形態では、Ｇ－四重鎖モチーフを有するＤＮＡコンカテマーは、上記に開示されたような環状ＤＮＡテンプレートを用いたローリングサークル増幅によって生成することができる。これらのＤＮＡコンカテマーは、ＤＮＡハイドロゲルを形成することができる。
【0072】
ローリングサークル増幅は、鎖置換活性を有する、すなわち、合成中に遭遇する下流ＤＮＡを置換することができるＤＮＡポリメラーゼを使用して行うことができる。鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、環状ＤＮＡテンプレートに相補的な配列の複数のコピーを有するＤＮＡコンカテマーを生成することが可能である。ローリングサークル増幅を行うのに使用できる好適なＤＮＡポリメラーゼとしては、これらに限定されるものではないが、全てＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）から入手可能な、Ｐｈｉ２９ポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ，ラージフラグメント、及びＤｅｅｐ－ＶｅｎｔＲ ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【0073】
Ｇ－四重鎖
上記のように製造された核酸コンカテマーは、Ｇ－四重鎖を形成することができる。図１Ａは、核酸コンカテマー中のＧ－四重鎖モチーフが集合してＲＮＡ Ｇ－四重鎖（図１Ａ中「Ｇ４」と示す）を形成する模式的なフレームワークを示す図である。ＨｉＢｉＴコード配列を含むＲＮＡ Ｇ－四重鎖は、Ｈ－ＲＧ４と称される。図１Ａに示されるように、Ｇ－四重鎖は、典型的には、フーグスティーン水素結合を介して環状に会合する４つのグアニン塩基からそれぞれなる、複数の積層Ｇ－四連子を含む四本鎖らせん核酸構造を含む。これらのＧ－四連子は、中央のカチオン（例えば、Ｋ＋又はＮａ＋）への配位によって、さらに安定化され得る。合計２層以上のＧ－四連子が積層された構造体を総称してＧ－四連子コアと呼ぶ。Ｇ－四連子コアを構成する４つのグアニン列は、それぞれ１本（連続列）又は２本（不連続列）別々のグアニン伸張から生じることができる。Ｇ－四重鎖の特性は、Ｐｈａｎ， ＦＥＢＳ Ｊ． ２７７，１１０７－１１１７（２０１０）で議論されており、その開示全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
上記のように製造された核酸コンカテマーは、Ｇ－四重鎖を形成することができる。図１Ａは、核酸コンカテマー中のＧ－四重鎖モチーフが集合してＲＮＡ Ｇ－四重鎖（図１Ａ中「Ｇ４」と示す）を形成する模式的なフレームワークを示す図である。ＨｉＢｉＴコード配列を含むＲＮＡ Ｇ－四重鎖は、Ｈ－ＲＧ４と称される。図１Ａに示されるように、Ｇ－四重鎖は、典型的には、フーグスティーン水素結合を介して環状に会合する４つのグアニン塩基からそれぞれなる、複数の積層Ｇ－四連子を含む四本鎖らせん核酸構造を含む。これらのＧ－四連子は、中央のカチオン（例えば、Ｋ＋又はＮａ＋）への配位によって、さらに安定化され得る。合計２層以上のＧ－四連子が積層された構造体を総称してＧ－四連子コアと呼ぶ。Ｇ－四連子コアを構成する４つのグアニン列は、それぞれ１本（連続列）又は２本（不連続列）別々のグアニン伸張から生じることができる。Ｇ－四重鎖の特性は、Ｐｈａｎ， ＦＥＢＳ Ｊ． ２７７，１１０７－１１１７（２０１０）で議論されており、その開示全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0074】
Ｇ四重鎖は、よく知られている結合アッセイによって検出することができる。いくつかの実施形態では、蛍光ターンオンリガンドであるチオフラビンＴ（ＴｈＴ）が関与するアッセイによって検出することができる。Ｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．（２０１９）及びＭｏｈａｎｔｙ ｅｔ ａｌ．，２０１３。Ｇ四重鎖がＴｈＴに結合すると、蛍光強度が顕著に増強され、蛍光強度の顕著な増強の検出は、Ｇ四重鎖の存在を示すことになる。ローリングサークル転写によって生成されたＲＮＡ転写物は、Ｇ四重鎖を生成することができる。一つの例示的な例を図２Ｂに示す。ここでは、ＴｈＴ検出法を用いて４８８ｎｍで蛍光強度の顕著な増強が観察され、これはＧ四重鎖の存在を示している。
【0075】
いくつかの実施形態では、Ｇ四重鎖はまた、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１９）に開示されているように、ヘミンと複合化されたときの自己ビオチン化に関連するシグナルを検出することによって可視化することができる。１つの例示的な実施形態では、Ｇ－四重鎖は、Ｈ２Ｏ２及びビオチンチラミドの存在下でヘミンと混合される。適切に形成されたＧ－四重鎖は自己ビオチン化し、Ｇ－四重鎖に付加されたビオチン基はストレプトアビジンと結合して明るいシグナルを生成することとなる。図１３に示すように、短いＧ四重鎖ＲＮＡ ＵＡＧＧＧＵＵＡＧＧＧＵ（配列番号：２）のコピーを含むＲＧ４コンカテマーは、明るいスポットを生じ、これは、ＲＧ４四重鎖を形成できたことを実証している。一方、短いスクランブルＲＮＡ：ＵＡＣＵＧＵＵＡＣＵＧＵ（配列番号：１３）のコピーを含むＲＧｘコンカテマーは、そのようなスポットの欠如によって示されるように、四重鎖を形成することができなかった。
【0076】
ワイドバンドハイドロゲル
いくつかの実施形態では、２つの核酸コンカテマーを組み合わせて、ワイドバンドハイドロゲルと称される単一のハイドロゲルを形成する。２つの核酸コンカテマーの各々は、環状ＤＮＡテンプレートからのローリングサークル転写又はローリングサークル増幅によって生成することができ、各々は、プロモーター及びＧ４四重鎖モチーフを含む。２つの環状ＤＮＡテンプレートの一方は、スペーサーをさらに含み、他方は、目的のポリペプチドのコード配列をさらに含む。上述したスペーサー及びコード配列のいずれも、ワイドバンドハイドロゲルを製造するために本明細書に開示された環状ＤＮＡテンプレートにおいて使用することができる。
いくつかの実施形態では、２つの核酸コンカテマーを組み合わせて、ワイドバンドハイドロゲルと称される単一のハイドロゲルを形成する。２つの核酸コンカテマーの各々は、環状ＤＮＡテンプレートからのローリングサークル転写又はローリングサークル増幅によって生成することができ、各々は、プロモーター及びＧ４四重鎖モチーフを含む。２つの環状ＤＮＡテンプレートの一方は、スペーサーをさらに含み、他方は、目的のポリペプチドのコード配列をさらに含む。上述したスペーサー及びコード配列のいずれも、ワイドバンドハイドロゲルを製造するために本明細書に開示された環状ＤＮＡテンプレートにおいて使用することができる。
【0077】
いくつかの実施形態では、両方の核酸コンカテマーがＤＮＡコンカテマーである。いくつかの実施形態では、両方の核酸コンカテマーがＲＮＡコンカテマーである。２つのＲＮＡコンカテマーによって形成されたワイドバンドハイドロゲルは、Ｗ－ＲＧ４と称される。図１８Ａは、２つの環状ＤＮＡテンプレートのローリングサークル転写からの例示的なワイドバンドハイドロゲルの形成を示す。
【0078】
２つの環状ＤＮＡテンプレートで使用されるプロモーターは、同じであっても、異なっていてもよい。同様に、２つの環状ＤＮＡテンプレートにおけるＧ四重鎖モチーフは、同じであっても、同じでなくてもよい。本願に開示されるプロモーター及びＧ四重鎖モチーフのいずれも、本願に開示されるワイドバンドハイドロゲルを形成するために使用することができる。
【0079】
２つのテンプレートの比率
本発明者らは、驚くべきことに、２つのＤＮＡ環状テンプレートを適切な割合で使用することにより、翻訳効率を向上できることを発見した。第１の環状ＤＮＡは、（ｉ）第１のプロモーター配列、（ｉｉ）第１のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列、及び（ｉｉｉ）ポリチミンを含むスペーサーを含む。第２の環状ＤＮＡテンプレートは、（ｉ）第２のプロモーター配列、（ｉｉ）第２のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列、及び（ｉｉｉ）目的のポリペプチドのコード配列を含む。スペーサーを含む環状ＤＮＡテンプレートは、「スペーサーテンプレート」とも呼ばれ、コード配列を含む環状ＤＮＡテンプレートは、「コーディングテンプレート」とも呼ばれる。いくつかの実施形態では、スペーサーテンプレートとコーディングテンプレートの両方の混合物におけるスペーサーテンプレートのモル分率は、２５％～７５％の範囲である。図１８Ｂ～１８Ｄに示すように、２５％～７５％の範囲のモル分率でスペーサーテンプレートを含む混合物は、いずれも十分に高い量の目的のポリペプチド（図１８のＨｉＢｉＴポリペプチド）を産生した。スペーサーテンプレートのモル分率が７５％のものが最も高い収量を示した。
本発明者らは、驚くべきことに、２つのＤＮＡ環状テンプレートを適切な割合で使用することにより、翻訳効率を向上できることを発見した。第１の環状ＤＮＡは、（ｉ）第１のプロモーター配列、（ｉｉ）第１のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列、及び（ｉｉｉ）ポリチミンを含むスペーサーを含む。第２の環状ＤＮＡテンプレートは、（ｉ）第２のプロモーター配列、（ｉｉ）第２のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列、及び（ｉｉｉ）目的のポリペプチドのコード配列を含む。スペーサーを含む環状ＤＮＡテンプレートは、「スペーサーテンプレート」とも呼ばれ、コード配列を含む環状ＤＮＡテンプレートは、「コーディングテンプレート」とも呼ばれる。いくつかの実施形態では、スペーサーテンプレートとコーディングテンプレートの両方の混合物におけるスペーサーテンプレートのモル分率は、２５％～７５％の範囲である。図１８Ｂ～１８Ｄに示すように、２５％～７５％の範囲のモル分率でスペーサーテンプレートを含む混合物は、いずれも十分に高い量の目的のポリペプチド（図１８のＨｉＢｉＴポリペプチド）を産生した。スペーサーテンプレートのモル分率が７５％のものが最も高い収量を示した。
【0080】
いくつかの実施形態では、配列番号：６～９からなる群から選択される配列を含むスペーサーテンプレート、及び配列番号：１４、１６、及び１８からなる群から選択される配列を含むコーディングテンプレートである。
【0081】
いくつかの実施形態では、コード配列の長さとスペーサー配列の長さの比率は、１：０．２～１：２の範囲内、又は約１：１である。
【0082】
プラスミドワイドバンドハイドロゲル
いくつかの実施形態では、ワイドバンドハイドロゲルは、１）スペーサー（「スペーサーテンプレート」）及びＧ四重鎖モチーフを含む環状テンプレートのＲＣＴから生成されたＲＮＡコンカテマーと、２）上述のように、目的のポリペプチドのコード配列を含む発現コンストラクトから転写されたｍＲＮＡとのゲル化によって形成される。いくつかの実施形態では、発現コンストラクト中のコード配列によってコードされる目的のペプチドは、少なくとも２０アミノ酸残基、少なくとも３０アミノ酸残基、少なくとも４０アミノ酸残基、少なくとも６０アミノ酸残基からなる。一実施形態では、コード配列は、単一ドメイン抗体をコードする。一実施形態では、コード配列は、抗ＣＤ４０Ｌ単一ドメイン抗体（配列番号：２６）をコードする。いくつかの実施形態では、発現コンストラクトは、配列番号：２７の配列を含む。一実施形態では、Ｗ－ＲＧ４ハイドロゲルは、１）配列番号：７を含む環状ＤＮＡテンプレートのＲＣＴから生成されたＲＮＡコンカテマー、及び２）配列番号：２６を含むプラスミドから転写されたｍＲＮＡのゲル化によって形成される。
いくつかの実施形態では、ワイドバンドハイドロゲルは、１）スペーサー（「スペーサーテンプレート」）及びＧ四重鎖モチーフを含む環状テンプレートのＲＣＴから生成されたＲＮＡコンカテマーと、２）上述のように、目的のポリペプチドのコード配列を含む発現コンストラクトから転写されたｍＲＮＡとのゲル化によって形成される。いくつかの実施形態では、発現コンストラクト中のコード配列によってコードされる目的のペプチドは、少なくとも２０アミノ酸残基、少なくとも３０アミノ酸残基、少なくとも４０アミノ酸残基、少なくとも６０アミノ酸残基からなる。一実施形態では、コード配列は、単一ドメイン抗体をコードする。一実施形態では、コード配列は、抗ＣＤ４０Ｌ単一ドメイン抗体（配列番号：２６）をコードする。いくつかの実施形態では、発現コンストラクトは、配列番号：２７の配列を含む。一実施形態では、Ｗ－ＲＧ４ハイドロゲルは、１）配列番号：７を含む環状ＤＮＡテンプレートのＲＣＴから生成されたＲＮＡコンカテマー、及び２）配列番号：２６を含むプラスミドから転写されたｍＲＮＡのゲル化によって形成される。
【0083】
いくつかの実施形態では、発現コンストラクトとスペーサーテンプレートのモル比は、１：２～１：４００、例えば、１：５～１：２００、１：１０～１：１２０、又は１：１２～１：１０２の範囲であってよい。
【0084】
使用することができる発現コンストラクト（例えば、ベクター）の非限定的な例としては、ｐＫ７、ｐＩＶＥＸ、ｐＥＴ、ｐＴＸＢ、ｐＵＣ、及びｐＦ３Ｋが挙げられる。いくつかの実施形態では、転写混合物中で使用されるスペーサーテンプレートとベクターのモル比は、１：１～１０００：１、例えば、１０：１～２００：１の範囲内である。
【0085】
ゲル化
核酸コンカテマー（又はワイドバンドシステムのように２つの核酸コンカテマー）によって形成されるＧ－四重鎖（例えば、ＲＧ４）は、ハイドロゲルに自己集合することができる。この形成は、Ｇ－四重鎖モチーフ中のグアニン間の非共有結合性相互作用により容易となる。Ｇ－四重鎖ハイドロゲルは、周囲温度（例えば、２０℃～４０℃）で、血清、人工涙液、若しくは細胞培養培地、又はリン酸緩衝食塩水などの種々の液体を核酸に加えることによって即時に調製することができる。いくつかの実施形態では、ゲル化は、０～１００時間、例えば、３～６０時間、又は３～４８時間かかり得る。いくつかの実施形態では、ゲル化は、例えば、３、６、９、１２、２４、又は４８時間かかり得る。
核酸コンカテマー（又はワイドバンドシステムのように２つの核酸コンカテマー）によって形成されるＧ－四重鎖（例えば、ＲＧ４）は、ハイドロゲルに自己集合することができる。この形成は、Ｇ－四重鎖モチーフ中のグアニン間の非共有結合性相互作用により容易となる。Ｇ－四重鎖ハイドロゲルは、周囲温度（例えば、２０℃～４０℃）で、血清、人工涙液、若しくは細胞培養培地、又はリン酸緩衝食塩水などの種々の液体を核酸に加えることによって即時に調製することができる。いくつかの実施形態では、ゲル化は、０～１００時間、例えば、３～６０時間、又は３～４８時間かかり得る。いくつかの実施形態では、ゲル化は、例えば、３、６、９、１２、２４、又は４８時間かかり得る。
【0086】
ゲル化は様々な方法で検出することができる。ゲル化の一般的な診断方法の１つにバイアル倒立試験がある。バイアル倒立試験は、サンプルの入ったバイアルを逆さまに置き、サンプルが自重で流れるかどうかを観察するものである。サンプルが自重で流れない場合、ゲルである。
【0087】
図１Ａ～１Ｇに示すように、配列番号：２の配列のコピーを含む例示的なＲＧ４は、ハイドロゲル（ＲＧ４ハイドロゲル）を形成した。ハイドロゲルの形成は即時に目視でき、ハイドロゲルの体積は０～４８時間の間に成長した。ＲＧ４のゲル化により、バイアル倒立試験で試験すると重力に対抗する強い弾性を示す単一の塊状材料が形成された。一方、配列番号：１３の配列のコピーを含むＲＧｘは、ハイドロゲルを形成せず、代わりに、容器の底に瞬時に滑り落ちる、粘性の非ゲル溶液を生成した。
【0088】
ハイドロゲルの特性評価
構造
上記に開示されたように形成されたハイドロゲル（ＲＧ４又はＷ－ＲＧハイドロゲル）は、様々な多角形の型に入れて様々な形状に成形することができる。例えば、本明細書に開示されるハイドロゲルは、円形状、三角形、長方形、及び星形（図１Ｃ）、並びに３次元円筒形（図１Ｄ）に成形することができる。本明細書に開示されるハイドロゲルは、すべて相互接続された多孔質構造を有し、これは、画像解析、例えば、共焦点画像解析によって検出することができる。例示的な画像化結果が図９及び図１Ｅに示されており、これは、ＲＧ４ハイドロゲルにおける周期的な相互連結多孔質構造の存在を示している。
構造
上記に開示されたように形成されたハイドロゲル（ＲＧ４又はＷ－ＲＧハイドロゲル）は、様々な多角形の型に入れて様々な形状に成形することができる。例えば、本明細書に開示されるハイドロゲルは、円形状、三角形、長方形、及び星形（図１Ｃ）、並びに３次元円筒形（図１Ｄ）に成形することができる。本明細書に開示されるハイドロゲルは、すべて相互接続された多孔質構造を有し、これは、画像解析、例えば、共焦点画像解析によって検出することができる。例示的な画像化結果が図９及び図１Ｅに示されており、これは、ＲＧ４ハイドロゲルにおける周期的な相互連結多孔質構造の存在を示している。
【0089】
粘弾性と機械的特性
本明細書に開示されるＲＧ４ゲルは、優れた粘弾性及び機械的特性を有し、それにより様々な生物学的用途のための理想的なプラットフォームとなる。これらの特性を評価するために、様々な方法を使用することができる。いくつかの実施形態において、ハイドロゲルの粘弾性特性は、当技術分野においてよく知られている方法、例えば、ｗｗｗ．ｒｈｅｏｌｏｇｙｔｅｓｔｉｎｇｓｅｒｖｉｃｅｓ．ｃｏｍ／（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるような回転アッセイ、振動アッセイ、及び垂直アッセイを用いて試験することができる。いくつかの実施形態では、温度スイープレオロジー試験を使用して、温度ランプの上昇及び低下に伴う粘度変化を測定する。いくつかの実施形態では、ハイドロゲルの粘弾性特性は、回転レオメーター、例えば、ＡＲＥＳ－Ｇ２（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｅｗ Ｃａｓｔｌｅ，ＤＥ）を用いて調べることができる。
本明細書に開示されるＲＧ４ゲルは、優れた粘弾性及び機械的特性を有し、それにより様々な生物学的用途のための理想的なプラットフォームとなる。これらの特性を評価するために、様々な方法を使用することができる。いくつかの実施形態において、ハイドロゲルの粘弾性特性は、当技術分野においてよく知られている方法、例えば、ｗｗｗ．ｒｈｅｏｌｏｇｙｔｅｓｔｉｎｇｓｅｒｖｉｃｅｓ．ｃｏｍ／（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるような回転アッセイ、振動アッセイ、及び垂直アッセイを用いて試験することができる。いくつかの実施形態では、温度スイープレオロジー試験を使用して、温度ランプの上昇及び低下に伴う粘度変化を測定する。いくつかの実施形態では、ハイドロゲルの粘弾性特性は、回転レオメーター、例えば、ＡＲＥＳ－Ｇ２（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｅｗ Ｃａｓｔｌｅ，ＤＥ）を用いて調べることができる。
【0090】
いくつかの実施形態では、ハイドロゲルの剛性は、ヤング率試験を用いて評価することができる。ヤング率試験は、単軸変形の線形弾性レジメにおいて、材料における応力（単位面積当たりの力）と歪み（比例変形）との間の関係を定義するものである。一実施形態では、ヤング率は、Ｈｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）に記載されているように、曲線の傾きから得られるセンチメートルスケールでの圧縮試験により測定した。本明細書に開示されるＲＧ４ゲルのセンチメートルスケールでの圧縮試験により測定したヤング率は、典型的には１２ｋＰａ～１００ｋＰａ、例えば、２０ｋＰａ～５８ｋＰａの範囲内、又は約３８．４ｋＰａである。図３Ａに示すように、本明細書で製造されたＲＧ４ゲルの弾性率は、６～５０ｋＰａの範囲であり、これは、既報のソフトゲル（２３、２４、２５）に匹敵するものであった。
【0091】
一実施形態では、ナノメートルスケールの原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）に基づくインデンテーション試験法が使用される。ＡＦＭに基づく試験は、典型的には、フォースカーブを用いて柔らかい水和サンプルの弾性率を分析するために使用される。ＡＦＭに基づくインデンテーション試験を使用する方法はよく知られており、（２６、２７）に記載されているとおりである。本明細書に開示されるＲＧ４ゲルは、弾性率の優れた時間依存性増加を示し、弾性率の時間依存性増加は、ＤＮＡベースのゲルについて報告されているものよりも驚くほど顕著に高い。一実施形態では、弾性率の時間依存性増加は、４８時間で５～２０ｋＰａ（例えば、約１０．９３ｋＰａ）の範囲のである。１つの例示的な例を図１４Ａ及び図１４Ｂに示す。
【0092】
いくつかの実施形態では、ハイドロゲルの貯蔵弾性率は、動的機械分析法を用いて測定することができる。Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＤＯＩ：１０．１００２／０４７１４４０２６４．ｐｓｔ１０２．ｐｕｂ２を参照されたい。一般に、これらのアプローチは、強制振動測定を行うことによって高分子材料の粘弾性特性を分析する。一実施形態では、ハイドロゲルの貯蔵弾性率は、動的周波数スキャンを使用して測定することができる。本明細書に開示されるＲＧ４ゲルは、２４時間において貯蔵弾性率が損失弾性率よりも高いことで示されるように、固体様が支配的な構造を有する（図１４Ｃ及び図１４Ｄ）。さらに、ＲＧ４ゲルは、ＲＧｘ溶液の１０倍以上の高い貯蔵弾性率を示す。図３Ｂを参照されたい。
【0093】
ハイドロゲルの保水及び吸水能は、一般に（３１）に記載される方法を用いて分析することができる。一実施形態では、保水及び吸水能は、ゲルの体積脱水率及び再水和率を測定することによって決定される。具体的には、ＲＧ４ハイドロゲルの保水・吸水性を評価するために、初期質量のために必要な調製したばかりのハイドロゲルの質量、及び再水和質量のために必要な乾燥ハイドロゲルの質量を測定した。保水・吸収能は、以下の式１を用いて算出することができる。
【0094】
【数1】
ρ＿１：膨潤媒体（純水）の密度
ρ＿２：ポリマー（膨潤媒体を除くゲル成分）の密度
ｍ＿ｓｗ：膨潤したゲルの質量
ｍ＿ｄ：乾燥ゲルの質量
【0095】
本願で開示されるＲＧ４ゲルは、優れた保水及び吸水能を有する。本明細書に開示されるＲＧ４ハイドロゲルは、典型的には、５００％～５０００％の膨潤度を有する。１つの例示的な例を図３Ｃに示し、ここで、膨潤度は１１６４．１％である。
【0096】
さらに、ＲＧ４ハイドロゲルは、膨潤－再水和サイクルを受けることができ、少なくとも４００％、少なくとも５００％の再膨潤度を示す。１つの例示的な実施形態では、ＲＧ４ハイドロゲルは、７３４．２％の再膨潤度（又は再水和度）を示した（図３Ｃ、「再水和」）。再膨潤度とは、脱水したゲルを水又は水溶液と接触させて再水和させたときの膨潤の度合いである。一実施形態では、再膨潤度は、脱水されたハイドロゲルに対する（水又は水溶液と接触した後の）再水和されたハイドロゲルの体積比によって表される。したがって、ＲＧ４ハイドロゲルは、翻訳が高効率で起こることができる高水分含有環境を維持することができる。
【0097】
本明細書に開示されるＲＧ４ゲルは、高い拡散性を有する。これにより、反応成分及び生成物（例えば、リボソーム）が自由に拡散でき、さらに、ハイドロゲルの細孔を通じて出入りできる。これらの特徴により、翻訳効率をさらに高めることができる。ハイドロゲルの拡散性は、ハイドロゲルを横切る物質（例えば、ＴｈＴ又はリボソーム）の拡散速度を測定することによって評価できる。拡散速度は、共焦点顕微鏡で捕捉した物質の移動距離及び拡散に必要な時間によって決定することができる。１つの例示的な実施形態では、Ｇ４－ＲＮＡハイドロゲル中への拡散速度の理論計算値は、以下の式を用いて計算することができる（３２）。
【0098】
【数2】
【0099】
無限希釈での拡散率（Ｄ０）は、ハイドロゲルの多孔性は考慮せず、溶液中の拡散に関するストークス－アインシュタインの法則により、以下のように与えられる（４９）。
【0100】
【数3】
η：媒体溶液の動的粘度、２０℃で１．００１６ｍＰａ・ｓ、３７℃で０．６９６ｍＰａ・ｓ（５０）
【0101】
媒体の透水係数は以下のように与えられる（５１）。
【0102】
【数4】
φ：ゲル中のポリマーの体積分率、乾燥ハイドロゲルの質量により推定して０．０８５２
【0103】
拡散溶質のモル拡散流束（Ｊ）はフィックの第一法則により以下のように与えられる（５２）。
【0104】
【数5】
ｘ：拡散溶質の移動距離、ＴｈＴは５７３．４μｍ、ハイドロゲルパッドは１０μｍ
【0105】
多孔質ハイドロゲル内に輸送される溶質の拡散速度（ｖ）は以下のように与えられる（５３）。
【0106】
【数6】
【0107】
一例では、リボソームが深さ２０μｍのハイドロゲルに完全に拡散するのに必要な時間（３３）は、４．５～５．５μｍ／秒の範囲であった。場合によって、リボソームは、約１．８秒及び約２．２秒でハイドロゲルの片側１０μｍを拡散する。図３Ｄを参照されたい。
【0108】
ハイドロゲルの細孔サイズを測定するために、様々な方法を用いることができる。一実施形態では、細孔サイズは、ＲＧ４ハイドロゲル中のＧ４構造間で計算した平均距離であると推定され、かつ／又はＡＦＭ画像（図３Ｅ及び図１５）からの細孔サイズ推定に基づく。いくつかの実施形態では、ＲＧ４ハイドロゲルは、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像から決定されたハイドロゲル中のＧ４構造間の平均距離を細孔サイズとして使用する場合、１～３０ｎｍ、例えば、２～２５ｎｍ、３～１０ｎｍの範囲、又は約５．６５ｎｍの細孔サイズを有する。
【0109】
機能
本明細書に開示されるＲＧ４ハイドロゲルは、様々な用途のための足場として機能するだけでなく、それが複合体を形成する生物活性物質（例えば、酵素）の活性を高めることができる。いくつかの実施形態では、ＲＧ４は、それが酵素と複合体を形成するとき、ペルオキシダーゼ（例えば、ヘミン）の活性を増強できる。この増強は、酵素の基質、例えば、２，２’－アジノ－ビス－３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸（ＡＢＴＳ）の比色変化が関与する比色反応を用いて検出することができる。図２Ｃを参照されたい。ペルオキシダーゼ活性の向上（Ａ３９５ｎｍの吸光度の増加によって反映される）は、広いｐＨ範囲（例えばｐＨ４．９～ｐＨ７．９）にわたって検出された。図１２を参照されたい。このことにより、ゲル中のＧ４架橋が、足場としての役割に加え、酵素活性を促進することが示された。
本明細書に開示されるＲＧ４ハイドロゲルは、様々な用途のための足場として機能するだけでなく、それが複合体を形成する生物活性物質（例えば、酵素）の活性を高めることができる。いくつかの実施形態では、ＲＧ４は、それが酵素と複合体を形成するとき、ペルオキシダーゼ（例えば、ヘミン）の活性を増強できる。この増強は、酵素の基質、例えば、２，２’－アジノ－ビス－３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸（ＡＢＴＳ）の比色変化が関与する比色反応を用いて検出することができる。図２Ｃを参照されたい。ペルオキシダーゼ活性の向上（Ａ３９５ｎｍの吸光度の増加によって反映される）は、広いｐＨ範囲（例えばｐＨ４．９～ｐＨ７．９）にわたって検出された。図１２を参照されたい。このことにより、ゲル中のＧ４架橋が、足場としての役割に加え、酵素活性を促進することが示された。
【0110】
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、生物活性物質と複合体化された上記に開示されたＲＧ４ハイドロゲルを提供し、場合によりＲＧ４は生物活性物質の活性を増強する。この増強は、ＲＧ４ハイドロゲルと複合体化されていない生物活性物質の活性に対して、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、又は少なくとも６０％であり得る。
【0111】
好適な生物活性物質としては、これらに限定されるものではないが、ポリペプチド、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ）、抗体、成長因子、抗原、リポソーム、低分子干渉ＲＮＡ、又はポリヌクレオチド、治療剤（例えば、薬剤、毒素、免疫調節剤、キレーター、抗体、抗体－薬剤結合体、光活性剤又は色素、及びラジオアイソトープ）などの生体又は化学化合物、あるいは化学誘引物質が挙げられる。生物活性物質は、天然に存在するものであっても、人工的に合成されたものであってもよい。
【0112】
安定性
本明細書に開示されるＲＧ４ハイドロゲルは、半減期が少なくとも３０時間、少なくとも３５時間、又は少なくとも４０時間であり、安定である。核酸ハイドロゲルに関連して使用される場合、用語「半減期」は、ゲル中の核酸含有量がその初期量の５０％に減少するのに必要な時間を意味する。ＲＧ４ハイドロゲルの半減期は、ＲＧｘ溶液よりも著しく長い（図４Ｅ）。実施例６、図４Ａに示すように、例示的なＲＧ４は、４８．９時間の間、その初期ＲＮＡ含有量の少なくとも５３．４％を維持できたが、ＲＧｘは３８．３時間後にその初期ＲＮＡ含有量の２１．６％を維持しただけであった。同じ条件下でＲＧ４ゲルはＲＧｘよりも分解が遅かったが、これはＲＧ４が一体性の高い性質を有することに起因すると思われる。
本明細書に開示されるＲＧ４ハイドロゲルは、半減期が少なくとも３０時間、少なくとも３５時間、又は少なくとも４０時間であり、安定である。核酸ハイドロゲルに関連して使用される場合、用語「半減期」は、ゲル中の核酸含有量がその初期量の５０％に減少するのに必要な時間を意味する。ＲＧ４ハイドロゲルの半減期は、ＲＧｘ溶液よりも著しく長い（図４Ｅ）。実施例６、図４Ａに示すように、例示的なＲＧ４は、４８．９時間の間、その初期ＲＮＡ含有量の少なくとも５３．４％を維持できたが、ＲＧｘは３８．３時間後にその初期ＲＮＡ含有量の２１．６％を維持しただけであった。同じ条件下でＲＧ４ゲルはＲＧｘよりも分解が遅かったが、これはＲＧ４が一体性の高い性質を有することに起因すると思われる。
【0113】
収量
ＲＧ４中のＲＮＡの分解が遅いだけでなく、ＲＧ４中のＧ四重鎖の形成により、転写段階でのＲＮＡ合成時間が延長される。図４Ｆに示すように、ＲＧｘとは対照的に、ＲＧ４中のＲＮＡ量は、転写反応開始から４時間経過後も増加し続けている。この転写時間の延長とＲＧ４ゲルの高い安定性により、ＲＣＴ中に多量のＲＮＡを産生することが可能となる。図４Ｆに示す１つの例示的な例では、ＲＧ４ハイドロゲルからのＲＮＡ収量は、ＲＧｘ溶液よりも少なくとも３倍高いものであった。この高いＲＮＡ収量は、下流の翻訳プロセスにおける高いタンパク質産生に寄与することになる。
ＲＧ４中のＲＮＡの分解が遅いだけでなく、ＲＧ４中のＧ四重鎖の形成により、転写段階でのＲＮＡ合成時間が延長される。図４Ｆに示すように、ＲＧｘとは対照的に、ＲＧ４中のＲＮＡ量は、転写反応開始から４時間経過後も増加し続けている。この転写時間の延長とＲＧ４ゲルの高い安定性により、ＲＣＴ中に多量のＲＮＡを産生することが可能となる。図４Ｆに示す１つの例示的な例では、ＲＧ４ハイドロゲルからのＲＮＡ収量は、ＲＧｘ溶液よりも少なくとも３倍高いものであった。この高いＲＮＡ収量は、下流の翻訳プロセスにおける高いタンパク質産生に寄与することになる。
【0114】
無細胞タンパク質生産
本明細書に記載されるように製造されたＲＧ４ハイドロゲルは、無細胞タンパク質合成に使用することができる。いくつかの実施形態では、翻訳の開始前にＲＧ４ハイドロゲルが形成されるように、翻訳は転写と非連結化される。無細胞タンパク質合成翻訳混合物は、これらに限定されるものではないが、１種以上の細胞抽出物／ライセート、ＡＴＰ又はエネルギー源（例えば、ピルビン酸、グルコース及びグルタミン酸）、補因子、酵素、及びポリペプチドの供給に必要な他の物質、例えば、リボソーム、ｔＲＮＡ、ポリアミンポリメラーゼ転写因子、アミノアシル合成酵素、シャペロン、伸長因子、開始因子等を含むことができる。無細胞タンパク質合成系において有用であり得る他の成分は、Ｓｐｉｒｉｎ ＆ Ｓｗａｒｔｚ（２００８） Ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙに記載の無細胞合成のための方法に記載されている。
本明細書に記載されるように製造されたＲＧ４ハイドロゲルは、無細胞タンパク質合成に使用することができる。いくつかの実施形態では、翻訳の開始前にＲＧ４ハイドロゲルが形成されるように、翻訳は転写と非連結化される。無細胞タンパク質合成翻訳混合物は、これらに限定されるものではないが、１種以上の細胞抽出物／ライセート、ＡＴＰ又はエネルギー源（例えば、ピルビン酸、グルコース及びグルタミン酸）、補因子、酵素、及びポリペプチドの供給に必要な他の物質、例えば、リボソーム、ｔＲＮＡ、ポリアミンポリメラーゼ転写因子、アミノアシル合成酵素、シャペロン、伸長因子、開始因子等を含むことができる。無細胞タンパク質合成系において有用であり得る他の成分は、Ｓｐｉｒｉｎ ＆ Ｓｗａｒｔｚ（２００８） Ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙに記載の無細胞合成のための方法に記載されている。
【0115】
いくつかの実施形態では、翻訳反応において使用される細胞ライセート（ライセートとも呼ばれる）は、転写及び／又は翻訳機構を保存する条件下で細胞を溶解することによって調製され得る。細胞ライセートを調製するために使用できる細胞型の非限定的な例としては、大腸菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽細胞、及びＨｅｌａ細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞ライセートは、翻訳に必要とされる成分を含む。そのような成分としては、リボソーム、アミノ酸、ｔＲＮＡ、ｔＲＮＡ合成酵素、エネルギー源（クレアチンリン酸）、クレアチンキナーゼ、及び／又はそれらの任意の組合せが挙げられる。細胞ライセート及びその製造方法はまた、Ｋｕｒｕｍａ ａｎｄ Ｕｅｄａ Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １０，１３２８－１３４４（２０１５）、及び、Ｇｒｅｇｏｒｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｐｒｏｔｏｃ．２０１９ Ｍａｒ；２（１）：２４に記載されており、その開示内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。無細胞タンパク質合成試薬は、例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）から商業的に入手可能である。
【0116】
ハイドロゲルがＤＮＡハイドロゲルである場合、上述したように、インビトロ転写に適した試薬及び条件を用いてまずＲＮＡに転写し、次に本明細書に開示する無細胞タンパク質系に供することができる。
【0117】
本明細書に開示される核酸ハイドロゲル、例えば、Ｗ－ＲＧ４ゲルは、タンパク質を大量に生産することができる。１つの例示的な例では、Ｗ－ＲＧ４のタンパク質発現収量は、１１アミノ酸ペプチドタグであるＨｉＢｉＴの発現が、遊離ＤＮＡテンプレート（ｆＤＮＡ）に対して１１７倍、遊離ＲＮＡ（ｆＲＮＡ）テンプレートに対して８倍増強されることが示された。遊離ＤＮＡ／ＲＮＡテンプレートとは、溶液中のＤＮＡ／ＲＮＡを指す。図５Ｂを参照されたい。
【0118】
任意に、カオトロピック処理、反応時間、温度、容量などのパラメータは、核酸ハイドロゲルタンパク質生産系のタンパク質収量を最大化するように変更することができる。１つのアプローチでは、翻訳反応は、１２時間以下、１０時間以下、６時間以下、５時間以下、４時間以下、３時間以下、又は２時間以下継続するように制御される。１つの例示的なアッセイにおいて、タンパク質生産は、翻訳開始から２時間程度でピークに達することが示されている。図２１Ａを参照されたい。反応時間を制御するために、所定の長さの時間（例えば、翻訳の開始から２、３、１２、又は４８時間）翻訳を進行させた後、反応混合物を高温、例えば、約９５℃に供して翻訳に必要な酵素を変性させ、それによりタンパク質生産を終了させる。あるいは、１種以上のカオトロピック剤（例えば、８Ｍ尿素）を添加して翻訳を終了させることもできる。
【0119】
１つのアプローチにおいて、反応温度は、１６℃から３７℃の範囲の温度、例えば、２５℃に制御される。図２１Ｄを参照されたい。別のアプローチでは、例えば凝集ペプチドを可溶化することによって、タンパク質の可溶性を増大させることができる１種以上の試薬を翻訳混合物に添加し、タンパク質発現を改善する。そのような試薬の非限定的な例としては、Ｔｗｅｅｎ－２０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ＣＨＡＰＳ、又はＳＤＳなどの界面活性剤が挙げられる。図２１Ｂを参照されたい。さらに別のアプローチでは、無細胞合成系に添加されるＷ－ＲＧ４ハイドロゲルの体積を、タンパク質産生を増加させるように最適化できる。一実施形態では、使用されるＷ－ＲＧ４の体積は、３～２２μＬの範囲である。さらに別のアプローチでは、翻訳反応混合物（Ｗ－ＲＧ４を含む）の体積を、５０～２００μＬの範囲、例えば、１５０μＬに制御し、高いタンパク質収量を達成する。図２１Ｅを参照されたい。
【0120】
タンパク質は、翻訳プロセスの終了時に回収し、精製することができる。タンパク質精製、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、及び結晶化のための方法は、Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。
【0121】
ライセート包埋ハイドロゲル
いくつかの実施形態では、上記のような細胞ライセートを、ＲＧ４コンカテマーを生成する転写反応に添加する。これらのＲＧ４コンカテマーによって形成されるハイドロゲルは、細胞ライセートを含むので、本明細書ではライセート包埋ハイドロゲル（ｌｙｓａｔｅ－ｅｍｂｅｄｄｅｄ ｈｙｄｒｏｇｅｌ）（例えば、ライセート包埋Ｗ－ＲＧ４ハイドロゲル）と称する。対照的に、細胞ライセートが全く存在しない状態の転写物によって形成されたハイドロゲルは、ライセートフリーハイドロゲル（ｌｙｓａｔｅ－ｆｒｅｅ ｈｙｄｒｏｇｅｌ）と称する。他に特記しない限り、本開示で開示されるＷ－ＲＧ４ハイドロゲルは、ライセートフリーＷ－ＲＧ４ハイドロゲルである。
いくつかの実施形態では、上記のような細胞ライセートを、ＲＧ４コンカテマーを生成する転写反応に添加する。これらのＲＧ４コンカテマーによって形成されるハイドロゲルは、細胞ライセートを含むので、本明細書ではライセート包埋ハイドロゲル（ｌｙｓａｔｅ－ｅｍｂｅｄｄｅｄ ｈｙｄｒｏｇｅｌ）（例えば、ライセート包埋Ｗ－ＲＧ４ハイドロゲル）と称する。対照的に、細胞ライセートが全く存在しない状態の転写物によって形成されたハイドロゲルは、ライセートフリーハイドロゲル（ｌｙｓａｔｅ－ｆｒｅｅ ｈｙｄｒｏｇｅｌ）と称する。他に特記しない限り、本開示で開示されるＷ－ＲＧ４ハイドロゲルは、ライセートフリーＷ－ＲＧ４ハイドロゲルである。
【0122】
細胞ライセートと転写混合物（細胞ライセートを除く）の体積比は、変更してもよい。場合によって、体積比は、１：１～１：３の範囲、例えば、約１：２、又は約１：２．５である。
【0123】
驚くべきことに、これらのライセート包埋ハイドロゲルは、同じ翻訳条件下で、対応するライセートフリーハイドロゲルよりもはるかに高い収量でタンパク質を生成することができ、また、タンパク質収量は対応するライセートフリーハイドロゲルよりも短時間でピークレベルに到達した。ライセート包埋Ｗ－ＲＧ４とそれに対応するライセートフリーＷ－ＲＧ４は、同じ核酸成分を共有している。一つの例示的な例を、図５Ｊに示す。図５Ｊは、大腸菌細胞から調製したライセートを含む翻訳混合物と３時間インキュベートした場合、ライセート包埋Ｗ－ＲＧ４（「Ｌ－Ｌ－ゲル」）が、ライセートフリー対応物（「未処理ゲル（Ｒａｗ ｇｅｌ）」）よりも著しく多量のタンパク質を生成したことを示す。
【0124】
また、ライセート包埋ハイドロゲルの生産に用いる転写反応の期間を制御することが望ましいことも分かった。転写が比較的長い時間（例えば、４８時間）進行すると、Ｗ－ＲＧ４ハイドロゲルの生産効率が低下する場合がある。図５Ｉを参照されたい。したがって、いくつかの実施形態では、ライセート包埋ハイドロゲルを使用する場合、転写反応時間の持続時間は４８時間以下、例えば、４０時間以下、３０時間以下、２０時間以下、１０時間以下、５時間以下、又は約３時間である。いくつかの実施形態では、転写反応の持続時間は、１時間から４０時間、２時間から２０時間、２．５時間から１０時間の範囲、又は約３時間である。
【0125】
いくつかの実施形態では、ライセート包埋ハイドロゲルは、細胞ライセートを含まない翻訳混合物と組み合わされる。図５Ｊに示すように、ライセート包埋ハイドロゲル（「Ｌ－ゲル」）は、翻訳プロセス中に大腸菌細胞ライセートを一切補充せずにフィード溶液（タンパク質合成バッファーとしても知られている）のみとインキュベートした場合に、十分な量のタンパク質を産生することが可能であった。フィード溶液は、典型的には、アミノ酸、及び翻訳に好適な１種以上のバッファー及び塩を含む。いくつかの実施形態では、フィード溶液はまた、エネルギー変換酵素（例えば、クレアチンキナーゼ）を含む。この結果は、ライセート包埋Ｗ－ＲＧ４が、翻訳混合物中に外部からのライセートが提供されないことが好ましいか又は要求される、移植用又は注射用の治療用途に有用であることを示唆している。
【0126】
タンパク質の生産性をさらに向上させるための追加的な改変
上記に開示したように、Ｗ－ＲＧ４ハイドロゲルは、高効率及び高収量でタンパク質を生成することができる。いくつかの実施形態では、ハイドロゲルを切断して翻訳成分の接近性を向上させ、それにより、翻訳効率をさらに向上させる。切り込みは、例えば、ピペットチップを使用してハイドロゲルに穴を開けるなど、様々な手段で導入することができる。ハイドロゲルに作製される切り込みの数を、カットアウト数（ｃｕｔ－ｏｕｔ ｎｕｍｂｅｒ）と称する。いくつかの実施形態では、Ｗ－ＲＧ４は、２５０～４００の範囲、例えば、約３００のカットアウト数を有する。１つの例示的な例が図１９に示されており、３００のカットアウト数を有するＷ－ＲＧ４ゲルは、タンパク質産生をさらに増大させることができることを実証している。
上記に開示したように、Ｗ－ＲＧ４ハイドロゲルは、高効率及び高収量でタンパク質を生成することができる。いくつかの実施形態では、ハイドロゲルを切断して翻訳成分の接近性を向上させ、それにより、翻訳効率をさらに向上させる。切り込みは、例えば、ピペットチップを使用してハイドロゲルに穴を開けるなど、様々な手段で導入することができる。ハイドロゲルに作製される切り込みの数を、カットアウト数（ｃｕｔ－ｏｕｔ ｎｕｍｂｅｒ）と称する。いくつかの実施形態では、Ｗ－ＲＧ４は、２５０～４００の範囲、例えば、約３００のカットアウト数を有する。１つの例示的な例が図１９に示されており、３００のカットアウト数を有するＷ－ＲＧ４ゲルは、タンパク質産生をさらに増大させることができることを実証している。
【0127】
キット
本出願はまた、目的のポリペプチドを発現させるためのキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、スプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることによって環状ＤＮＡテンプレートを形成することができる一本鎖ＤＮＡ分子を含む。環状ＤＮＡは、（ｉ）プロモーター配列、（ｉｉ）Ｇ－四重鎖モチーフに相補的な配列、及び（ｉｉｉ）目的のポリペプチドのコード配列又はスペーサーを含む。スプリントオリゴヌクレオチドは、プロモーター配列に相補的である。
本出願はまた、目的のポリペプチドを発現させるためのキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、スプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることによって環状ＤＮＡテンプレートを形成することができる一本鎖ＤＮＡ分子を含む。環状ＤＮＡは、（ｉ）プロモーター配列、（ｉｉ）Ｇ－四重鎖モチーフに相補的な配列、及び（ｉｉｉ）目的のポリペプチドのコード配列又はスペーサーを含む。スプリントオリゴヌクレオチドは、プロモーター配列に相補的である。
【0128】
いくつかの実施形態では、キットは、第１のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることによって第１の環状ＤＮＡテンプレートを形成することができる第１の一本鎖ＤＮＡ分子、第２のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることによって第２の環状ＤＮＡテンプレートを形成することができる第２の一本鎖ＤＮＡ分子を含む。第１の環状ＤＮＡは、（ｉ）第１のプロモーター配列、（ｉｉ）第１のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列、及び（ｉｉｉ）スペーサーを含む。第２の環状ＤＮＡは、（ｉ）第２のプロモーター配列、（ｉｉ）第２のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列、及び（ｉｉｉ）スペーサーを含む。キットは、第１のプロモーター配列に相補的な配列を有する第１のスプリントオリゴヌクレオチド、及び／又は、第２のプロモーター配列に相補的な配列を有する第２のスプリントオリゴヌクレオチドをさらに含んでもよい。一実施形態では、第１及び／又は第２のスプリントオリゴヌクレオチドは、配列番号：１２の配列を有する。
【0129】
本明細書に開示されるキットは、ＤＮＡテンプレートの環化及び／又はローリングサークル転写を行うのに有用な１種以上の試薬をさらに含んでもよい。これらの試薬としては、これらに限定されるものではないが、リガーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、１種以上のリボヌクレオチド三リン酸（ｒＮＴＰ）、及び転写に好適なバッファーが挙げられる。
【0130】
いくつかの実施形態では、キットは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳に好適な１種以上の試薬、例えば、リボソーム、及びアミノ酸の混合物をさらに含んでもよい。
【0131】
以下の実施例は、説明目的のために提供されるものであり、本発明を限定することを意図するものではない。当業者であれば、本質的に同じ結果を得るために変更又は修正することができる様々な重要でないパラメータを容易に認識するであろう。
【0132】
実施形態１． （ｉ）第１のプロモーター配列、及び（ｉｉ）第１のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列を含む、第１の環状ＤＮＡテンプレート。
【0133】
実施形態２． 第１のプロモーター配列が相補的核酸配列にハイブリダイズして第１の部分二本鎖ＤＮＡ分子を形成し、第１の部分二本鎖ＤＮＡ分子が二本鎖領域及び一本鎖領域を含み、二本鎖領域が相補的核酸配列にハイブリダイズした第１のプロモーター配列を含み、一本鎖領域が第１のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列を含む、実施形態１に記載の第１の環状ＤＮＡテンプレート。
【0134】
実施形態３． スペーサーをさらに含み、スペーサーがポリチミンを含む、先の実施形態のいずれかに記載の第１の環状ＤＮＡテンプレート。
【0135】
実施形態４． 目的のポリペプチドのコード配列をさらに含む、先述の実施形態のいずれかに記載の第１の環状ＤＮＡテンプレート。
【0136】
実施形態５． 第１のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列が、ＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡ（配列番号：１）の配列を含む、先の実施形態のいずれかに記載の第１の環状ＤＮＡテンプレート。
【0137】
実施形態６． 第１のプロモーター配列が、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、Ｌａｃプロモーター、ａｒａＢａｄプロモーター、Ｔｒｐプロモーター、Ｔａｃプロモーター、及びＳＰ６プロモーターからなる群から選択される、先の実施形態のいずれかに記載の第１の環状ＤＮＡテンプレート。
【0138】
実施形態７． 複数のモノマーを含む第１の核酸コンカテマーであって、各モノマーが、（ｉ）第１のＧ－四重鎖モチーフ、及び（ｉｉ）ポリチミンを含むスペーサー又は目的のポリペプチドのコード配列を含む、第１の核酸コンカテマー。
【0139】
実施形態８． 第１の核酸コンカテマーがＲＮＡコンカテマーであり、第１のＧ－四重鎖モチーフがＵＡＧＧＧＵＵＡＧＧＧＵ（配列番号：２）を含む、実施形態７に記載の第１の核酸コンカテマー。
【0140】
実施形態９． 第１の核酸コンカテマーがＤＮＡコンカテマーであり、第１のＧ－四重鎖モチーフがＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴ（配列番号：２０）を含む、実施形態７～８のいずれかに記載の第１の核酸コンカテマー。
【0141】
実施形態１０． 実施形態７～９のいずれかに記載の第１の核酸コンカテマーを含む核酸ハイドロゲル。
【0142】
実施形態１１． 実施形態１０に記載の核酸ハイドロゲル、リボソーム、及び／又はアミノ酸の混合物を含む、タンパク質発現系。
【0143】
実施形態１２． 第１の環状ＤＮＡテンプレート及び第２の環状ＤＮＡテンプレートを含む組成物であって、第１の環状ＤＮＡテンプレートは、（ｉ）第１のプロモーター配列、（ｉｉ）第１のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列、及び（ｉｉｉ）ポリチミンを含むスペーサーを含み、第２の環状ＤＮＡテンプレートは、（ｉ）第２のプロモーター配列、（ｉｉ）第２のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列、及び（ｉｉｉ）目的のポリペプチドのコード配列を含み、第１及び第２の環状ＤＮＡテンプレートの総量に対する第１の環状ＤＮＡテンプレートのモル分率は、２５％～７５％の範囲である、組成物。
【0144】
実施形態１３． （１）第１のプロモーター配列が相補的核酸配列にハイブリダイズして第１の部分二本鎖ＤＮＡ分子を形成し、第１の部分二本鎖ＤＮＡ分子が二本鎖領域及び一本鎖領域を含み、第１の部分二本鎖ＤＮＡ分子の二本鎖領域が、相補的核酸配列にハイブリダイズした第１のプロモーター配列を含み、第１の部分二本鎖ＤＮＡ分子の一本鎖領域が、第１のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列を含み、（２）第２のプロモーター配列が相補的核酸配列にハイブリダイズして第２の部分二本鎖ＤＮＡ分子を形成し、第２の部分二本鎖ＤＮＡ分子が二本鎖領域及び一本鎖領域を含み、第２の部分二本鎖ＤＮＡ分子の二本鎖領域が、相補的核酸配列にハイブリダイズした第２のプロモーター配列を含み、第２の部分二本鎖ＤＮＡ分子の一本鎖領域が、第２のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列を含む、実施形態１２に記載の組成物。
【0145】
実施形態１４． 第１のＧ－四重鎖モチーフと第２のＧ－四重鎖モチーフが同じヌクレオチド配列を含む、実施形態１２又は１３に記載の組成物。
【0146】
実施形態１５． 第１のプロモーター配列と第２のプロモーター配列が、同じヌクレオチド配列を含む、実施形態１２～１４のいずれかに記載の組成物。
【0147】
実施形態１６． 第１のプロモーター配列と第２のプロモーター配列が、異なるヌクレオチド配列を含む、実施形態１２～１５のいずれかに記載の組成物。
【0148】
実施形態１７． スペーサーが、３０～１２０個のチミン（配列番号：３２）を含む、実施形態１２～１６のいずれかに記載の組成物。
【0149】
実施形態１８． コード配列が、２０～３００ヌクレオチドの範囲内である長さを有する、実施形態１２～１７のいずれかに記載の組成物。
【0150】
実施形態１９． コード配列とスペーサーの長さ比が、１：０．２～１：２の範囲内である、実施形態１２～１８のいずれかに記載の組成物。
【0151】
実施形態２０． 目的のポリペプチドが、インスリン、トランス活性化転写活性化因子（ＴＡＴ）、ＨｉＢｉＴ、及び単一ドメイン抗体からなる群から選択される、実施形態１２～１９のいずれかに記載の組成物。
【0152】
実施形態２１． １種以上のＲＮＡポリメラーゼ、リボヌクレオチドの混合物、及び／又はバッファーをさらに含む、実施形態１２～２０のいずれかに記載の組成物。
【0153】
実施形態２２． 鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼをさらに含み、それによりローリングサークル増幅を行うことが可能である、実施形態１２～２０のいずれかに記載の組成物。
【0154】
実施形態２３． 環状ＤＮＡテンプレート及び二本鎖ＤＮＡコンストラクトを含む組成物であって、環状ＤＮＡテンプレートは、（ｉ）第１のプロモーター配列、（ｉｉ）第１のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列、及び（ｉｉｉ）ポリチミンを含むスペーサーを含み、二本鎖ＤＮＡコンストラクトは、（ｉ）第２のプロモーター配列、（ｉｉ）第２のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列、及び（ｉｉｉ）目的のポリペプチドのコード配列を含む、組成物。
【0155】
実施形態２４． 第１の核酸コンカテマー及び第２の核酸コンカテマーを含む核酸ハイドロゲルであって、第１の核酸コンカテマーは、実施形態１２～２０のいずれかに記載の組成物の第１の環状ＤＮＡテンプレートのローリングサークル転写又は増幅によって生成され、第２の核酸コンカテマーは、実施形態１２～２０のいずれかに記載の組成物の第２の環状ＤＮＡテンプレートのローリングサークル転写又は増幅によって生成される、核酸ハイドロゲル。
【0156】
実施形態２５． 第１のＲＮＡ分子及び第２のＲＮＡ分子を含む核酸ハイドロゲルであって、第１のＲＮＡ分子は、（ｉ）第１のＧ－四重鎖モチーフ、及び（ｉｉ）ポリアデニンを含むスペーサーを含み、第２のＲＮＡ分子は、（ｉ）第２のＧ－四重鎖モチーフ、及び（ｉｉ）目的のポリペプチドのコード配列を含む、核酸ハイドロゲル。
【0157】
実施形態２６． 第１のＲＮＡ分子が複数のモノマーを含むＲＮＡコンカテマーであって、各モノマーが、第１のＧ－四重鎖モチーフ、及び、ポリアデニンを含むスペーサー又は目的のポリペプチドのコード配列を含む、実施形態２５の核酸ハイドロゲル。
【0158】
実施形態２７． 実施形態２４～２６のいずれかに記載の核酸ハイドロゲル、リボソーム、及び／又はアミノ酸の混合物を含む、タンパク質発現系。
【0159】
実施形態２８． 目的のポリペプチドを発現させるためのキットであって、該キットは、
（１）第１のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることによって第１の環状ＤＮＡテンプレートを形成することができる第１のＤＮＡ分子であって、第１の環状ＤＮＡテンプレートは、（ｉ）第１のプロモーター配列、（ｉｉ）第１のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列、及び（ｉｉｉ）ポリチミンを含むスペーサーを含む、第１のＤＮＡ分子、
（２）第１のプロモーター配列に相補的な第１のスプリントオリゴヌクレオチドであって、第１のＤＮＡテンプレートは第１のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして環化し、第１の環状ＤＮＡテンプレートを形成することができる、第１のスプリントオリゴヌクレオチド、及び／又は
（３）第２のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして第２の環状ＤＮＡテンプレートを形成することができる第２のＤＮＡ分子であって、第２の環状ＤＮＡテンプレートは、（ｉ）第２のプロモーター配列、（ｉｉ）第２のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列、及び（ｉｉｉ）目的のポリペプチドのコード配列を含む、第２のＤＮＡ分子、
（４）第２のプロモーター配列に相補的な第２のスプリントオリゴヌクレオチドであって、第２のＤＮＡテンプレートは、第２のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして環化し、第２の環状ＤＮＡテンプレートを形成することができる、第２のスプリントオリゴヌクレオチド
を含む、キット。
（１）第１のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることによって第１の環状ＤＮＡテンプレートを形成することができる第１のＤＮＡ分子であって、第１の環状ＤＮＡテンプレートは、（ｉ）第１のプロモーター配列、（ｉｉ）第１のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列、及び（ｉｉｉ）ポリチミンを含むスペーサーを含む、第１のＤＮＡ分子、
（２）第１のプロモーター配列に相補的な第１のスプリントオリゴヌクレオチドであって、第１のＤＮＡテンプレートは第１のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして環化し、第１の環状ＤＮＡテンプレートを形成することができる、第１のスプリントオリゴヌクレオチド、及び／又は
（３）第２のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして第２の環状ＤＮＡテンプレートを形成することができる第２のＤＮＡ分子であって、第２の環状ＤＮＡテンプレートは、（ｉ）第２のプロモーター配列、（ｉｉ）第２のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列、及び（ｉｉｉ）目的のポリペプチドのコード配列を含む、第２のＤＮＡ分子、
（４）第２のプロモーター配列に相補的な第２のスプリントオリゴヌクレオチドであって、第２のＤＮＡテンプレートは、第２のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして環化し、第２の環状ＤＮＡテンプレートを形成することができる、第２のスプリントオリゴヌクレオチド
を含む、キット。
【0160】
実施形態２９． 実施形態１２～２３のいずれかに記載の組成物を含む、目的のポリペプチドを発現させるためのキット。
【0161】
実施形態３０． 第１のＧ四重鎖モチーフと第２のＧ四重鎖モチーフが、同じ又は異なる配列を有する、実施形態２８又は２９に記載のキット。
【0162】
実施形態３１． 第１のプロモーター配列と第２のプロモーター配列が、同一又は異なる、実施形態２８又は２９に記載のキット。
【0163】
実施形態３２．
スペーサーが、３０～１２０個のチミン（配列番号：３２）を含む、実施形態２８～３１のいずれか１つに記載のキット。
スペーサーが、３０～１２０個のチミン（配列番号：３２）を含む、実施形態２８～３１のいずれか１つに記載のキット。
【0164】
実施形態３３．
コード配列が、２０～３００ヌクレオチドの範囲にある長さを有する、実施形態２８～３２のいずれか１つに記載のキット。
コード配列が、２０～３００ヌクレオチドの範囲にある長さを有する、実施形態２８～３２のいずれか１つに記載のキット。
【0165】
実施形態３４． コード配列とスペーサーの長さ比が、１：０．２～１：２の範囲内である、実施形態２８～３３のいずれかに記載のキット。
【0166】
実施形態３５． 目的のポリペプチドが、インスリン、ＨｉＢｉＴ、トランス活性化転写活性化因子（ＴＡＴ）、及び単一ドメイン抗体からなる群から選択される、実施形態２８～３４のいずれかに記載のキット。
【0167】
実施形態３６． １種以上のＤＮＡリガーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、リボヌクレオチドの混合物、及び／又は１種以上のバッファーをさらに含む、実施形態２８～３５のいずれかに記載のキット。
【0168】
実施形態３７． 鎖置換活性を有し、それによりローリングサークル増幅を行うことができる、ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、実施形態２８～３６のいずれかに記載のキット。
【0169】
実施形態３８． 核酸ハイドロゲルを調製する方法であって、（１）（ｉ）第１のプロモーター配列、及び（ｉｉ）第１のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列を含む第１の環状ＤＮＡテンプレートを提供する工程；及び、（２）第１の環状テンプレートに対してローリングサークル転写又は増幅を行って第１の核酸コンカテマーを生成する工程を含み、第１の核酸コンカテマーが核酸ハイドロゲルを形成する、方法。
【0170】
実施形態３９． 第１の環状ＤＮＡテンプレートが、ポリチミンを含むスペーサーをさらに含み、工程（１）が、（ｉ）第２のプロモーター配列、（ｉｉ）第２のＧ－四重鎖モチーフ．及び（ｉｉｉ）目的のポリペプチドのコード配列を含む、第２の環状ＤＮＡテンプレートを提供することをさらに含み、工程（２）が、第２の環状ＤＮＡテンプレートのローリングサークル転写又は増幅を行って第２の核酸コンカテマーを生成することをさらに含み、第１及び第２の核酸コンカテマーが核酸ハイドロゲルを形成する、実施形態３８に記載の方法。
【0171】
実施形態４０． 無細胞合成系でタンパク質を製造する方法であって、該方法が、請求項１０又は２４～２６の核酸ハイドロゲルを、目的のポリペプチドの翻訳を可能にする条件下で無細胞合成系と組み合わせることを含む、方法。
【0172】
実施形態４１． 無細胞合成系が、リボソーム及び／又はアミノ酸の混合物を含む、実施形態４０に記載の方法。
【実施例0173】
例１． 材料
塩化ナトリウム、塩化カリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、アガロース、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、ヘミン、ＡＢＴＳ、及びＨ２Ｏ２はＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ＵｌｔｒａＰｕｒｅ Ｄｎａｓｅ／Ｒｎａｓｅ－Ｆｒｅｅ蒸留水、ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ＩＩ、ＴｈＴ、及びＦＢＳはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。３０％アクリルアミド－ビス－アクリルアミド溶液（２９：１）、ＡＰＳ（過硫酸アンモニウム）、及び１０×ＴＢＥ（Ｔｒｉｓ／ホウ酸／ＥＤＴＡ）バッファーはＰａｎＲｅａｃ Ａｐｐｌｉｃｈｅｍから購入した。ビオチントチラミドはＩｒｉｓ Ｂｉｏｔｅｃｈから購入し、ストレプトアビジンはＲｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。尿素はＤａｅｊｕｎｇから購入した。
塩化ナトリウム、塩化カリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、アガロース、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、ヘミン、ＡＢＴＳ、及びＨ２Ｏ２はＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ＵｌｔｒａＰｕｒｅ Ｄｎａｓｅ／Ｒｎａｓｅ－Ｆｒｅｅ蒸留水、ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ＩＩ、ＴｈＴ、及びＦＢＳはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。３０％アクリルアミド－ビス－アクリルアミド溶液（２９：１）、ＡＰＳ（過硫酸アンモニウム）、及び１０×ＴＢＥ（Ｔｒｉｓ／ホウ酸／ＥＤＴＡ）バッファーはＰａｎＲｅａｃ Ａｐｐｌｉｃｈｅｍから購入した。ビオチントチラミドはＩｒｉｓ Ｂｉｏｔｅｃｈから購入し、ストレプトアビジンはＲｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。尿素はＤａｅｊｕｎｇから購入した。
【0174】
特記しない限り、ＵｌｔｒａＰｕｒｅ Ｄｎａｓｅ／Ｒｎａｓｅ－Ｆｒｅｅ蒸留水を、全ての実験に使用した。本開示におけるアニーリングプロトコルでは、特記しない限り、９５℃から４℃まで０．５℃／３０秒で徐々に冷却した。
【0175】
実施例２. ＲＧ４ハイドロゲルの調製
ＲＧ４ハイドロゲルは、ローリングサークル転写（ＲＣＴ）を用いて転写したＲＮＡの自己集合によって作製した。ＲＣＴのための環状テンプレートは、Ｇ－四重鎖部分、目的のタンパク質のコード配列、及びＴ７プロモーターを有する線状テンプレートをライゲーションすることによって作製した。この線状テンプレートに、部分相補配列とＴ７プロモータープライマーを含む短鎖をアニールし、環状テンプレートを形成した。各鎖の濃度は、１００ｍＭ ＮａＣｌ中４５μＭであった。アニーリングした環状テンプレートは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）でライゲーションした。アニーリングしたテンプレートの濃度は１０μＭであり、バッファー及びＴ４ ＤＮＡリガーゼの量はＴ４ ＤＮＡリガーゼキットから提供され、その中で０．１×の全ライゲーション溶液と混合物を１６℃で１６時間インキュベートした。Ｈｉｓｃｒｉｂｅ Ｔ７高収量ＲＮＡ合成キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、１μＭのライゲーションした環状テンプレートを用いてＲＮＡを転写し、その後３７℃でインキュベートした。２時間のインキュベーションでＲＮＡの収量が最大になると予想されたが、転写開始後４８時間プロセスを継続した。すべてのテンプレートについて、同じモル数の出発物質を使用した。
ＲＧ４ハイドロゲルは、ローリングサークル転写（ＲＣＴ）を用いて転写したＲＮＡの自己集合によって作製した。ＲＣＴのための環状テンプレートは、Ｇ－四重鎖部分、目的のタンパク質のコード配列、及びＴ７プロモーターを有する線状テンプレートをライゲーションすることによって作製した。この線状テンプレートに、部分相補配列とＴ７プロモータープライマーを含む短鎖をアニールし、環状テンプレートを形成した。各鎖の濃度は、１００ｍＭ ＮａＣｌ中４５μＭであった。アニーリングした環状テンプレートは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）でライゲーションした。アニーリングしたテンプレートの濃度は１０μＭであり、バッファー及びＴ４ ＤＮＡリガーゼの量はＴ４ ＤＮＡリガーゼキットから提供され、その中で０．１×の全ライゲーション溶液と混合物を１６℃で１６時間インキュベートした。Ｈｉｓｃｒｉｂｅ Ｔ７高収量ＲＮＡ合成キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、１μＭのライゲーションした環状テンプレートを用いてＲＮＡを転写し、その後３７℃でインキュベートした。２時間のインキュベーションでＲＮＡの収量が最大になると予想されたが、転写開始後４８時間プロセスを継続した。すべてのテンプレートについて、同じモル数の出発物質を使用した。
【0176】
ｐＩＤＴＢｌｕｅプラスミド（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ， ＩＡ）中のレトリズマブ－Ｇ４をＮｄｅＩ及びＳａｌＩで切断し、ｐＫ７プラスミドにクローニングしてｐＫ７－レトリズマブ－Ｇ４プラスミドを生成した。２０ｎｇのプラスミドを無細胞発現のポジティブコントロールとして用い、２０ｎｇのプラスミドを０．１２５μＭ、０．２５μＭ、０．５μＭ、０．７５μＭ、又は１μＭの６０Ｔ ＲＧ４のスペーサーテンプレートと共に転写してゲル化を誘導した。
【0177】
実施例３． ハイドロゲルの特性評価
レオロジー解析
ＲＣＴ生成物のレオロジー特性を、円筒型中で調製したＲＣＴ生成物２００μＬを用いて、ＡＲＥＳ－Ｇ２（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により特性評価した。
レオロジー解析
ＲＣＴ生成物のレオロジー特性を、円筒型中で調製したＲＣＴ生成物２００μＬを用いて、ＡＲＥＳ－Ｇ２（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により特性評価した。
【0178】
ＲＧ４ハイドロゲルの顕微鏡による分析
共焦点顕微鏡による分析． カバーガラス間に作製した薄く調製したＲＧ４ハイドロゲルをＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ＩＩで染色し、ＬＳＭ７１０共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）で可視化した。
共焦点顕微鏡による分析． カバーガラス間に作製した薄く調製したＲＧ４ハイドロゲルをＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ＩＩで染色し、ＬＳＭ７１０共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）で可視化した。
【0179】
電界放出型走査電子顕微鏡（ＦＥ－ＳＥＭ）分析． ＲＧ４ハイドロゲル及びＲＧｘを－８０℃で凍結し、２４時間凍結乾燥した。凍結乾燥したサンプルをイリジウムでコーティングし、ＳＥＭ（ＪＥＭ ＡＲＭ２００Ｆ，Ｊｅｏｌ）を用いて、電圧１５．０ｋＶで特性評価した。
【0180】
ＡＦＭ分析． アルミニウム還流コーティングを施した市販のＤＮＰ－Ｓプローブカンチレバー（公称バネ定数０．１２Ｎ／ｍ、先端半径１０ｎｍ、駆動周波数１６～２８ｋＨｚ）を用いて、ＲＣＴ生成物のフォース－インデンテーション曲線をＳｃａｎＡｓｙｓｔモードにより求めた。このアプローチカーブを用いて、ヘルツの接触力学モデルをフィッティングすることにより、ハイドロゲルのヤング率を測定した。ＲＣＴ生成物の表面形状は、ナノスコープＶコントローラ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｉｎｃ．）を備えたマルチモード走査プローブ顕微鏡を用い、大気中で、ピークフォースタッピングモードを用いて分析した。得られたトポグラフィー画像を平坦化して、バックグラウンドスロープとコントラストを除去した。ＲＧ４ハイドロゲルを確実に平坦に作製するために、マイカ基板上に転写ミックスを３０μＬ分注した。
【0181】
ストレプトアビジン標識． ＲＣＴ生成物をマイカ上で調製し、２００μＬの１００μＭヘミン溶液（ｐＨ７．９の２０ｍＭリン酸バッファー、１％ＤＭＳＯ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ ＫＣｌ）とともに３時間インキュベーションした。その後、５０μＬの６ｍＭビオチンチラミド（ｐＨ７．９の２０ｍＭリン酸バッファー、１％ＤＭＳＯ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ ＫＣｌ）及び５０μＬの４．５ｍＭ Ｈ２Ｏ２（ｐＨ７．９の２０ｍＭリン酸バッファー、１％ＤＭＳＯ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ ＫＣｌ）を５分間隔で連続的に添加した。反応液を除去した後、１０μＭストレプトアビジン溶液を１０μＬ添加した。１００ｍＭ ＫＣｌを用いて未結合のストレプトアビジンを十分に洗浄した後、トポグラフィー解析を行った。
【0182】
ＲＧ４ハイドロゲルの分光学的解析
ＲＮＡの定量． 転写したＲＣＴ生成物の量は、アニーリング後、ＲＮＡ ＢＲアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて必要とされる５０倍希釈を確保し、Ｑｕｂｉｔ Ｆｌｅｘフルオロメータ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて測定した。
ＲＮＡの定量． 転写したＲＣＴ生成物の量は、アニーリング後、ＲＮＡ ＢＲアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて必要とされる５０倍希釈を確保し、Ｑｕｂｉｔ Ｆｌｅｘフルオロメータ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて測定した。
【0183】
ＣＤスペクトル解析． 四重鎖及び非四重鎖ＲＮＡ発現アナログ、ｓＧ４及びｓＧｘのそれぞれによるコンフォメーション状態を特定するために、Ｊ－８１５ ＣＤスペクトロメーター（ＪＡＳＣＯ）を用いて２２０ｎｍから３００ｎｍの波長範囲でＣＤスペクトルを記録した。
【0184】
ＲＧ４結合ＴｈＴからの蛍光シグナルの特性評価． １０μｌの１μＭ ｓＧ４及びｓＧｘを１００ｍＭ ＮａＣｌ及び１００ｍＭ ＫＣｌ中で、４０μＬの１０μＭ ＴｈＴ溶液と混合し、１５分後にフルオロメータ（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）により蛍光スペクトル（λｅｘ＝４４０ｎｍ，λｅｍ＝４６０～５１０ｎｍ）を測定した。
【0185】
ＲＧ４結合ヘミンの酵素活性． １０μＬの転写したＲＣＴ生成物を４０μＬの１００μＭヘミン溶液（ｐＨ７．９の２０ｍＭリン酸バッファー、１％ＤＭＳＯ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ ＫＣｌ）と１６時間インキュベートした。その後、２５μＬの３．２ｍＭ ＡＢＴＳ２－（２０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ４．４から７．９まで変化、１％ＤＭＳＯ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ ＫＣｌ）と２５μＬの０．３ｍＭ Ｈ２Ｏ２（２０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ４．４から７．９まで変化、１％ＤＭＳＯ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ ＫＣｌ）を十分に混合しながら溶液に連続的に添加した。ＡＢＴＳ２－がＡＢＴＳ・－に酸化されることによって生じるλ＝３９０ｎｍでの溶液の比色変化を、分光光度計（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）を用いて４時間連続的に特性評価した。
【0186】
ＲＧ４ハイドロゲルへのＴｈＴの拡散． カバーガラス上に作製したＲＧ４ハイドロゲルに、濃度１０μＭのＴｈＴ溶液を、ハイドロゲルの上部や下部にＴｈＴが吸収されないようにして添加した。
【0187】
ゲル電気泳動解析
ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）電気泳動（１２％）を、アニーリング及びライゲーションした環状テンプレートの特性評価に使用し、２％アガロースゲルを、アニーリング後の転写ＲＮＡの特性評価に使用した。プレキャストＭｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）トリス－トリシンＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（１６．５％）を、全無細胞発現からのレトルジマブ蛋白質の分離のために実施した。
ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）電気泳動（１２％）を、アニーリング及びライゲーションした環状テンプレートの特性評価に使用し、２％アガロースゲルを、アニーリング後の転写ＲＮＡの特性評価に使用した。プレキャストＭｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）トリス－トリシンＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（１６．５％）を、全無細胞発現からのレトルジマブ蛋白質の分離のために実施した。
【0188】
分解の特性評価． １０μＬのＲＣＴ生成物を４０μＬの１００％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）と混合し、ＲＮａｓｅに富む環境を提供した。ＲＮＡの総量を特性評価するために、各時間間隔後にサンプルを－２０℃で保存して、血清のさらなる影響を最小にし、続いてワイブルフィットモデルを用いたゲル電気泳動分析のためにアニーリングした。
【0189】
タンパク質発現
１１μＬのＲＣＴ生成物を、ＮＥＢ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）無細胞大腸菌タンパク質合成系（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いた、５０μＬバッチの非連結翻訳のテンプレートとして使用した。キットで別途提供されるＴ７ポリメラーゼは意図的に除いた。翻訳は、特に指定がない限り、２５℃で２時間行った。タンパク質の発現収量を高めるために、タンパク質封入（ｐｒｏｔｅｉｎ－ｅｎｃｏｄｅｄｅｄ）ＲＧ４ハイドロゲルをピペットチップで刺したところ、３００回切断したゲルが最も収量が高かった。連結翻訳には、ライゲーションしたＤＮＡテンプレート（１μＭ）、ｆＤＮＡ及びｆＲＮＡテンプレート、及び同等数の出発物質をコントロールテンプレートとして使用した。非連続翻訳では、１０μｇを使用したｆＲＮＡを除いて、製造元から提供されているマニュアルに従い、１１μＬの７５％Ｗ－ＲＧ４を小麦胚芽抽出物と総量５０μＬで２５℃、２時間混合した。様々な体積のテンプレート溶液を使用して、タンパク質効率を推定した。
１１μＬのＲＣＴ生成物を、ＮＥＢ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）無細胞大腸菌タンパク質合成系（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いた、５０μＬバッチの非連結翻訳のテンプレートとして使用した。キットで別途提供されるＴ７ポリメラーゼは意図的に除いた。翻訳は、特に指定がない限り、２５℃で２時間行った。タンパク質の発現収量を高めるために、タンパク質封入（ｐｒｏｔｅｉｎ－ｅｎｃｏｄｅｄｅｄ）ＲＧ４ハイドロゲルをピペットチップで刺したところ、３００回切断したゲルが最も収量が高かった。連結翻訳には、ライゲーションしたＤＮＡテンプレート（１μＭ）、ｆＤＮＡ及びｆＲＮＡテンプレート、及び同等数の出発物質をコントロールテンプレートとして使用した。非連続翻訳では、１０μｇを使用したｆＲＮＡを除いて、製造元から提供されているマニュアルに従い、１１μＬの７５％Ｗ－ＲＧ４を小麦胚芽抽出物と総量５０μＬで２５℃、２時間混合した。様々な体積のテンプレート溶液を使用して、タンパク質効率を推定した。
【0190】
レトルジマブの非連結翻訳のために、ＮＥＢ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（登録商標）無細胞大腸菌タンパク質合成系（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いた５０μＬバッチの非連結翻訳のためのテンプレートとして１２μＬのＲＣＴ生成物を使用した。翻訳キットの成分を用いたが、この中でＴ７ ポリメラーゼは意図的に除いた。翻訳を３０℃で８時間継続すると、最適なタンパク質発現が得られることが判明した。
【0191】
発現したＨｉＢｉＴタグ付きタンパク質からの発光の特性評価
Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ＨｉＢｉＴ細胞外検出システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）において、２μＬの処理後翻訳産物を８μＬのＨｉＢｉＴ検出試薬と混合した。得られた発光シグナルを、４分間の回転振とうの後、ルミノメーター（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で特性評価した。その後、９５℃、１０分間の加熱阻害を行った。凝集タンパク質を可溶化するため、混合物を等量の８Ｍ尿素と２時間インキュベートした。相対発光単位（ＲＬＵ）をブランク細胞の発光を基準として正規化した。
Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ＨｉＢｉＴ細胞外検出システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）において、２μＬの処理後翻訳産物を８μＬのＨｉＢｉＴ検出試薬と混合した。得られた発光シグナルを、４分間の回転振とうの後、ルミノメーター（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で特性評価した。その後、９５℃、１０分間の加熱阻害を行った。凝集タンパク質を可溶化するため、混合物を等量の８Ｍ尿素と２時間インキュベートした。相対発光単位（ＲＬＵ）をブランク細胞の発光を基準として正規化した。
【0192】
例４. プログラムＲＮＡゲルの設計及び組み立て
自然界に存在するテロメアＲＮＡリピートの二次構造由来のＧ－四重鎖モチーフを選択し（１２、１３）、ＤＮＡテンプレートから転写されたＲＮＡがビルディングブロック、架橋剤、及び機能性材料として機能するプログラム化ＤＮＡ駆動型ＲＮＡゲルを作製した。また、ポリチミン（ｐｏｌｙＴ）のようなスペーサー配列、又はタンパク質コード部位などの機能性モチーフを集合体に埋め込んだ。一本鎖ＤＮＡテンプレート（配列番号：４～１０のいずれか）及びＴ７プロモータープライマー（配列番号：１２）をアニールして環状ＤＮＡを形成し、その後Ｔ４酵素ライゲーションを行った（図１Ａ及び図６Ａ）。ＲＧ４は、Ｇ４の二次構造化会合により、３次元（３－Ｄ）ゲルに自己集合した。Ｇ４を形成できない意図的にスクランブルされた塩基配列（Ｇｘ）（配列番号：１０）をＲＧｘと称する比較群として作製した。ＲＧ４及びＲＧｘを、ＰＡＧＥ分析によって特性評価した。ＲＧ４ゲルはバルク構造体であるため、移動せず、ウェル付近に留まったが、ＲＧｘはウェル内を移動した（図６Ｂ）。
自然界に存在するテロメアＲＮＡリピートの二次構造由来のＧ－四重鎖モチーフを選択し（１２、１３）、ＤＮＡテンプレートから転写されたＲＮＡがビルディングブロック、架橋剤、及び機能性材料として機能するプログラム化ＤＮＡ駆動型ＲＮＡゲルを作製した。また、ポリチミン（ｐｏｌｙＴ）のようなスペーサー配列、又はタンパク質コード部位などの機能性モチーフを集合体に埋め込んだ。一本鎖ＤＮＡテンプレート（配列番号：４～１０のいずれか）及びＴ７プロモータープライマー（配列番号：１２）をアニールして環状ＤＮＡを形成し、その後Ｔ４酵素ライゲーションを行った（図１Ａ及び図６Ａ）。ＲＧ４は、Ｇ４の二次構造化会合により、３次元（３－Ｄ）ゲルに自己集合した。Ｇ４を形成できない意図的にスクランブルされた塩基配列（Ｇｘ）（配列番号：１０）をＲＧｘと称する比較群として作製した。ＲＧ４及びＲＧｘを、ＰＡＧＥ分析によって特性評価した。ＲＧ４ゲルはバルク構造体であるため、移動せず、ウェル付近に留まったが、ＲＧｘはウェル内を移動した（図６Ｂ）。
【0193】
合成時間に対するＲＧ４のゲル化を、バイアル倒立試験を用いて評価した。この実験では、ゲル化時間は、左から右に、ＲＧｘについては０、４８時間、ＲＧ４については０、３、６、９、１２、２４、４８時間であった（図１Ｂ）。白い矢印は、ＲＣＴ生成物の位置を示す（ＲＧ４ではゲル相、ＲＧｘでは溶液相）。ゲル化したＲＧ４は、重力に対抗する強い弾性を示す単一の塊状材料として現れ、一方、ＲＧｘは、図１Ｂの白い下向き矢印で示すように、容器の底に瞬時に滑り落ちる粘性の非ゲル溶液を生成した。
【0194】
また、様々なチミン数のスペーサー長（３Ｔ、１０Ｔ（配列番号：３８）、３０Ｔ（配列番号：３３）、６０Ｔ（配列番号：３４）、９０Ｔ（配列番号：３５）、及び１２０Ｔ（配列番号：３６））を、ＲＧ４の多彩なゲル化挙動を評価するために試験した（図６Ｂ及び図６Ｃ）。３０Ｔから１２０Ｔのスペーサーは、環状テンプレートの構築に成功することで完全にゲル化し、転写収量の向上が認められた。興味深いことに、３Ｔ及び１０Ｔの短いスペーサーを有するＲＧ４（配列番号：３８）はゲル化せず、溶液状態のままであったが、これは立体長が線状ＤＮＡが環状化するには不十分であったためである（１４）（図６Ｂ及び図６Ｄ）。驚くべきことに、アニールしたＲＧ４ゲルは、そのゲル特性を失い、様々な温度でインキュベートした後でもゲル特性が戻ることはなかった（図７）。このように、ＲＧ４ゲルの作製の成功には、転写と組み合わせたＧ４架橋剤の遅延形成が不可欠であった。様々なスペーサー長を有するＲＧ４ゲルのポアサイズにおけるトポロジーの違いを、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像からポアの下の平均面積を使用して評価した：３０Ｔ（配列番号：３３）、６０Ｔ（配列番号：３４）、及び１２０Ｔ（配列番号：３６）スペーサーについて、それぞれ１００．１ｎｍ２、４３７．２ｎｍ２、及び３０７１．６ｎｍ２（図８）。
【0195】
ＲＧ４ゲルを円形状、三角形、長方形、星形（図１Ｃ）及び３次元円筒形（図１Ｄ）にセンチメートル及びマイクロメートルのスケールで精密にパターン化した（図９Ａ）。ゲルマトリックス中の細孔と架橋の特性を確認した（図１Ｅ及び図９Ｂ）。凍結乾燥したＲＧ４ゲルは、ＲＮＡゲルの相互接続された細孔又は足場の性質に対応するしわの寄った表面形態を示した。これに対し、ＲＧｘはゲルを形成することができず、その代わりに、細孔のない、規則的なしわのない形態を示した（図１０）。
【0196】
実施例５. ＲＮＡゲルマトリックス中のＧ－四重鎖架橋剤の検証
工学的ＲＧ４コンカテマー（配列番号：２を含む）の構造的特徴及び塩溶液の用量に対するそれらの特異的反応を、それらの円二色性（ＣＤ）スペクトルの楕円率変化により分析したところ、Ｇ－四重鎖（１５～１７）の平行折りが示された（図２Ａ及び図１１）。ＲＮＡコンカテマー（配列番号：２を含むｓＧ４、及び配列番号：１３を含むｓＧｘ）がＧ－四重鎖構造を形成する能力を検出するために、蛍光ターンオンリガンド、チオフラビンＴ（ＴｈＴ）を用いた（１８、１９）。蛍光強度の著しい増大が４８８ｎｍで観察され（図２Ｂ）、ＴｈＴプローブがＲＧ４ｓに特異的に結合することが示された。
工学的ＲＧ４コンカテマー（配列番号：２を含む）の構造的特徴及び塩溶液の用量に対するそれらの特異的反応を、それらの円二色性（ＣＤ）スペクトルの楕円率変化により分析したところ、Ｇ－四重鎖（１５～１７）の平行折りが示された（図２Ａ及び図１１）。ＲＮＡコンカテマー（配列番号：２を含むｓＧ４、及び配列番号：１３を含むｓＧｘ）がＧ－四重鎖構造を形成する能力を検出するために、蛍光ターンオンリガンド、チオフラビンＴ（ＴｈＴ）を用いた（１８、１９）。蛍光強度の著しい増大が４８８ｎｍで観察され（図２Ｂ）、ＴｈＴプローブがＲＧ４ｓに特異的に結合することが示された。
【0197】
ＲＧ４ゲル中のＧ４の存在と固有の機能を検証するために、ＲＧ４ゲルがヘミンと複合化したときにペルオキシダーゼ活性を発揮する能力を、ｐＨ４．４からｐＨ７．９の範囲で調べた（図２Ｃ及び図１２）。Ｇ４ドメインとヘミンの相互作用により、２，２’－アジノビス－３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸（ＡＢＴＳ）の比色変化で特徴づけられるペルオキシダーゼ活性の著しい向上が生じた。広いｐＨ範囲にわたってペルオキシダーゼ活性及び全体的な効率が向上したことから、ゲル内のＧ４架橋が足場であることに加え、酵素活性にも関することが示された（２０、２１）。また、Ｇ４モジュールのヘミンとの固有活性を利用して、自己ビオチン化及びストレプトアビジン結合を用いて、ＡＦＭ画像においてＧ４の可視化も行った（２２）。ＲＧ４（処理前後）では、輝点により高さプロファイルの違いが観察されたが、ＲＧｘではそのような輝点はなく、Ｇ４及び自己ビオチン化部位がないことが確認された（図１３）。
【0198】
実施例６. ＲＧ４ゲルの物理化学的及び機械的挙動の変化
ゲルの機械的特性を評価するためにＲＧ４ゲルのヤング率を試験した。センチメートルスケールでの圧縮試験により測定したヤング率は、曲線の傾きから得られ、３８．４ｋＰａであった（２３）（図３Ａ）。この弾性率は、既報のソフトゲルの範囲にあることが分かった（２４、２５）。さらに、ＡＦＭに基づくナノメートルスケールのインデンテーション試験法を用いて、フォースカーブにより、やわらかい水和サンプルの弾性率を解析した（２６、２７）。バイアル倒立試験と密接に対応する弾性率の時間依存的な増加が観察され（図１Ｂ）、４８時間で～１０．９３ｋＰａであり（図１４Ａ及び図１４Ｂ）、これは、ＤＮＡベースのゲルで報告されたものよりも著しく高いものであった（２８）。貯蔵弾性率は２４時間後の損失弾性率よりも常に高く（図１４Ｃ、図１４Ｄ）、ＲＧ４ゲル中の架橋領域により、固体的性質が支配的であったことが示唆された（２９、３０）（図３Ｂ）。
ゲルの機械的特性を評価するためにＲＧ４ゲルのヤング率を試験した。センチメートルスケールでの圧縮試験により測定したヤング率は、曲線の傾きから得られ、３８．４ｋＰａであった（２３）（図３Ａ）。この弾性率は、既報のソフトゲルの範囲にあることが分かった（２４、２５）。さらに、ＡＦＭに基づくナノメートルスケールのインデンテーション試験法を用いて、フォースカーブにより、やわらかい水和サンプルの弾性率を解析した（２６、２７）。バイアル倒立試験と密接に対応する弾性率の時間依存的な増加が観察され（図１Ｂ）、４８時間で～１０．９３ｋＰａであり（図１４Ａ及び図１４Ｂ）、これは、ＤＮＡベースのゲルで報告されたものよりも著しく高いものであった（２８）。貯蔵弾性率は２４時間後の損失弾性率よりも常に高く（図１４Ｃ、図１４Ｄ）、ＲＧ４ゲル中の架橋領域により、固体的性質が支配的であったことが示唆された（２９、３０）（図３Ｂ）。
【0199】
ＲＧ４ゲルの体積脱水率及び再水和率を測定することにより、ＲＧ４ゲルの保水・吸水能を解析した（図３Ｃ及び前述した式（１））。我々の真新しいＲＧ４ゲルは、水とハイドロゲルネットワークの強い相互作用により、１１６４．１％の膨潤度を有し、元の体積の１０６４．１％を保持する優れた保水能を示した（２８）。さらに、ＲＧ４ハイドロゲルは膨潤－脱膨潤を繰り返すことができ、最大７３４．２％の再膨潤度を示した（図３Ｃ）。これらの特性は、粘性環境に起因する反応ラグに抵抗することにより、転写収量の向上（図６Ｄ）に関与している。
【0200】
多孔質ハイドロゲルへのＴｈＴ及びリボソームの拡散の挙動を、実験と理論の両方で分析した。ＴｈＴの移動距離を共焦点顕微鏡で捕捉したところ、１５５０秒で５７３．４μｍであった（図３Ｄ）。我々は、理論的な仮定を裏付けるために、多孔質媒体中を輸送される分子の拡散性を定義したモデルを選択した（３２）（前述した式（２）～（６））。理論推定値１及び２を用いた、深さ２０μｍのハイドロゲル中にリボソームが完全に拡散するのに必要な時間は（３３）、それぞれ１．８秒及び２．２秒であった（図３Ｄ及び以下の表２）。
【0201】
【表2】
【0202】
リガンドの拡散速度は、リガンドがハイドロゲルネットワーク内で自由に移動できるだけでなく、その制御可能な細孔サイズを物質が出入りできることを示す。細孔サイズは、ＲＧ４ハイドロゲル内のＧ４構造間の計算平均距離及びＡＦＭ画像での細孔サイズ推定に基づいて推定した（図３Ｅ及び図１５）。
【0203】
分解試験（図４Ａ）では、ＲＧ４及びＲＧｘ（ＲＧ４ゲル及び上清）中のＲＮＡ量をアガロースゲル電気泳動を用いて時系列的に評価した（図４Ｂ、図１６）。３時間まではＲＧ４上清にごくわずかな量のＲＮＡが存在したが、４８時間では最大７４％のＲＮＡが観察された（図４Ｃ及び図４Ｄ）。ＲＧ４のＲＮＡは、ＲＧｘ（３８．３時間）よりも長い期間（４８．９時間）持ちこたえ、それぞれの量は５３．４％及び２１．６％であった。ＲＧｘは、、同じ条件では、ＲＧ４よりも早く分解されたが、これは、ＲＧ４ハイドロゲルの高い一体性のため、及び、ゲル形態では、溶液相と比較してＲＮＡが濃縮されているためである（１１）（図４Ｅ）。ＲＧ４中のＲＮＡ量は増加し続け、ＲＧｘとは異なり、１２時間後に高い収量が得られた（図４Ｆ）。このように、高い転写収量及び低い分解速度から観察されるＲＮＡ量の増加は、これらのＲＮＡを翻訳することによって得られるタンパク質収量の向上にも寄与するであろう。
【0204】
実施例７. ＲＧ４ハイドロゲルによる各種タンパク質の発現の促進
１．ＨｉＢｉＴ
ＲＧ４ハイドロゲルのそれらの特性に影響され、そのタンパク質生産能力を図示したように評価した（図５Ａ）。ポリＴスペーサー領域をタンパク質コード配列（配列番号：２１）に置換し、ＲＧ４ハイドロゲルを作製した後、タンパク質の非連結翻訳を行った。ＨｉＢｉＴは１１アミノ酸のペプチドタグであり、ｉｎ ｖｉｔｒｏシステムでは発現しにくい、内在性タンパク質や短いタンパク質分子の動態を調べるために広く用いられている（３４）。
ＨｉＢｉＴのラージサブユニットＬｇＢｉＴ（登録商標）に対する高い親和性により、明るい発光シグナルが生成され、発現タンパク質の検出が簡素化される。ＨｉＢｉＴをコードするＲＧ４（Ｈ－ＲＧ４）（同様の方法で作製された配列番号：１４の配列を有する環状ＤＮＡテンプレートのＲＣＴ生成物）は、固有のＧ４を持っているものの、非堅牢性を示す粘性のように見えたが、その３０Ｔ ＲＧ４ハイドロゲル（配列番号：６の配列を有する対応する環状ＤＮＡテンプレートのＲＣＴ生成物）は形成に成功した（図１７Ａ）。我々のシステムでベストプラクティスを達成するために、我々は、３０Ｔ ＲＧ４（配列番号：６の配列を有する環状ＤＮＡテンプレートのＲＣＴ生成物）を補充することによって、Ｈ－ＲＧ４をハイドロゲル化を可能にし、ワイドバンドＲＧ４（Ｗ－ＲＧ４）を作製する方法を使用した。これらのテンプレートを融合すると、混合時の多価の相互作用により、強固なハイドロゲルが生成された（１１）（図１８Ａ～１８Ｃ）。Ｗ－ＲＧ４は、混合比７５％でタンパク質効率が上昇し（図１８Ｄ）、９．７１ｋＰａの弾性強度を有していた（図１８Ｅ）。次に、このＷ－ＲＧ４を３００回切断した（図１９）。Ｗ－ＲＧ４のタンパク質発現量を遊離テンプレートと比較したところ、遊離ＤＮＡテンプレート（ｆＤＮＡ）に対して１１７倍の増強、遊離ＲＮＡ（ｆＲＮＡ）テンプレートに対して８倍の増強が観察された（図５Ｂ）。さらに、カオトロピック処理、反応時間、種類、容量、温度のパラメータを変化させることで、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのタンパク質発現の増強が達成された（図２１）。
１．ＨｉＢｉＴ
ＲＧ４ハイドロゲルのそれらの特性に影響され、そのタンパク質生産能力を図示したように評価した（図５Ａ）。ポリＴスペーサー領域をタンパク質コード配列（配列番号：２１）に置換し、ＲＧ４ハイドロゲルを作製した後、タンパク質の非連結翻訳を行った。ＨｉＢｉＴは１１アミノ酸のペプチドタグであり、ｉｎ ｖｉｔｒｏシステムでは発現しにくい、内在性タンパク質や短いタンパク質分子の動態を調べるために広く用いられている（３４）。
ＨｉＢｉＴのラージサブユニットＬｇＢｉＴ（登録商標）に対する高い親和性により、明るい発光シグナルが生成され、発現タンパク質の検出が簡素化される。ＨｉＢｉＴをコードするＲＧ４（Ｈ－ＲＧ４）（同様の方法で作製された配列番号：１４の配列を有する環状ＤＮＡテンプレートのＲＣＴ生成物）は、固有のＧ４を持っているものの、非堅牢性を示す粘性のように見えたが、その３０Ｔ ＲＧ４ハイドロゲル（配列番号：６の配列を有する対応する環状ＤＮＡテンプレートのＲＣＴ生成物）は形成に成功した（図１７Ａ）。我々のシステムでベストプラクティスを達成するために、我々は、３０Ｔ ＲＧ４（配列番号：６の配列を有する環状ＤＮＡテンプレートのＲＣＴ生成物）を補充することによって、Ｈ－ＲＧ４をハイドロゲル化を可能にし、ワイドバンドＲＧ４（Ｗ－ＲＧ４）を作製する方法を使用した。これらのテンプレートを融合すると、混合時の多価の相互作用により、強固なハイドロゲルが生成された（１１）（図１８Ａ～１８Ｃ）。Ｗ－ＲＧ４は、混合比７５％でタンパク質効率が上昇し（図１８Ｄ）、９．７１ｋＰａの弾性強度を有していた（図１８Ｅ）。次に、このＷ－ＲＧ４を３００回切断した（図１９）。Ｗ－ＲＧ４のタンパク質発現量を遊離テンプレートと比較したところ、遊離ＤＮＡテンプレート（ｆＤＮＡ）に対して１１７倍の増強、遊離ＲＮＡ（ｆＲＮＡ）テンプレートに対して８倍の増強が観察された（図５Ｂ）。さらに、カオトロピック処理、反応時間、種類、容量、温度のパラメータを変化させることで、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのタンパク質発現の増強が達成された（図２１）。
【0205】
２． ＴＡＴとインスリン
この確信を持って、我々はさらに、医療システムにおいて緊急の必要性のある治療用タンパク質生産の側面を探求した。タンパク質治療薬の処方物をＲＮＡハイドロゲルを使用して合理的に送達することができるという治療上の重要性のために、トランス活性化転写活性化因子（ＴＡＴ）及びインスリンタンパク質を選択した。この研究で使用したＴＡＴのコード配列は、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）ＴＡＴタンパク質の一部である１０アミノ酸の機能性塩基領域 配列番号：２４を含む（３５）。この研究で使用したインスリンコード配列は、ヒトインスリンのＢ鎖の３０アミノ酸 配列番号：２３を含む（３６）。
この確信を持って、我々はさらに、医療システムにおいて緊急の必要性のある治療用タンパク質生産の側面を探求した。タンパク質治療薬の処方物をＲＮＡハイドロゲルを使用して合理的に送達することができるという治療上の重要性のために、トランス活性化転写活性化因子（ＴＡＴ）及びインスリンタンパク質を選択した。この研究で使用したＴＡＴのコード配列は、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）ＴＡＴタンパク質の一部である１０アミノ酸の機能性塩基領域 配列番号：２４を含む（３５）。この研究で使用したインスリンコード配列は、ヒトインスリンのＢ鎖の３０アミノ酸 配列番号：２３を含む（３６）。
【0206】
ＨｉＢｉＴタグを埋め込んだＴＡＴ及びインスリンテンプレート（それぞれ配列番号：１６及び１８）は、ｆＤＮＡテンプレートと比較して、Ｗ－ＲＧ４がそれぞれ１０倍及び１８倍増加した（図５Ｃ及び図２２）。ＨｉＢｉＴを発現する非連結翻訳を、キャップに依存しない翻訳系として確立されている小麦胚芽系を用いて行ったところ、８倍の収量増加が観察された（図５Ｄ）。ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）とそれに結合するＲＮＡ分子は凝縮してリボ核タンパク質（ＲＮＰ）と呼ばれる膜のないオルガネラを形成し、相分離を促進する。我々の無細胞系では細胞骨格のようなオルガネラがないため、我々は、ＲＮＡがその中で播種、核形成、相分離するＲＮＡハイドロゲルを開発した（図５Ｈ）。また、無細胞系は短いペプチドの生産には不向きである。構造的に長いＲＮＡを限られたスペースに配置することで、ｍｉＲＮＡの局在化が可能になり、その結果、発現収量が増加する。この効率は、タンパク質発現に関与する配列の長さや種類によって大きく異なる（３９）。転写されたＲＮＡ上のＲＢＰ（我々の場合リボソーム）の位置が足場内で近接しているため、翻訳成分が容易にアクセスできる。空間的な障害を克服し（４０）、細胞機能の無細胞評価を通じて包括的な課題に取り組むことにより、効率をさらに向上させることができる（４１）（図２３）。
【0207】
３． 単一ドメイン抗体レトリズマブ
また、ｐＫ７－レトリズマブ－Ｇ４プラスミドの発現カセットに由来するｍＲＮＡを介して、Ｗ－ＲＧ４アプローチを用いて１４ｋＤａ単一ドメイン抗体レトリズマブのタンパク質産生を試験した（図５Ｅ）。レトリズマブは、ＣＤ４０Ｌを標的とする免疫調節目的のために開発されたＦｃ修飾ヒトＩｇＧ１融合タンパク質コンストラクトである（３７、３８）。このアッセイのために、ｐＩＤＴＢｌｕｅプラスミド（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）中のレトリズマブ－Ｇ４をＮｄｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ｐＫ７プラスミドにクローニングしてｐＫ７－レトリズマブ－Ｇ４プラスミドを作製した。ｐＫ７－レトリズマブ－Ｇ４プラスミド２０ｎｇを無細胞発現のポジティブコントロールとして使用し、ｐＫ７－レトリズマブ－Ｇ４プラスミド２０ｎｇを、０．１２５μＭ、０．２５μＭ、０．５μＭ、０．７５μＭ、又は１μＭのスペーサーテンプレート（プラスミドとスペーサーテンプレートのモル比は、６０Ｔ ＲＧ４について、それぞれ、１：１２．７６、１：２５．５１、１：５１．０２、１：７６．５３、及び１：１０２．０４）とともに転写してゲル化を誘導した。
また、ｐＫ７－レトリズマブ－Ｇ４プラスミドの発現カセットに由来するｍＲＮＡを介して、Ｗ－ＲＧ４アプローチを用いて１４ｋＤａ単一ドメイン抗体レトリズマブのタンパク質産生を試験した（図５Ｅ）。レトリズマブは、ＣＤ４０Ｌを標的とする免疫調節目的のために開発されたＦｃ修飾ヒトＩｇＧ１融合タンパク質コンストラクトである（３７、３８）。このアッセイのために、ｐＩＤＴＢｌｕｅプラスミド（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）中のレトリズマブ－Ｇ４をＮｄｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ｐＫ７プラスミドにクローニングしてｐＫ７－レトリズマブ－Ｇ４プラスミドを作製した。ｐＫ７－レトリズマブ－Ｇ４プラスミド２０ｎｇを無細胞発現のポジティブコントロールとして使用し、ｐＫ７－レトリズマブ－Ｇ４プラスミド２０ｎｇを、０．１２５μＭ、０．２５μＭ、０．５μＭ、０．７５μＭ、又は１μＭのスペーサーテンプレート（プラスミドとスペーサーテンプレートのモル比は、６０Ｔ ＲＧ４について、それぞれ、１：１２．７６、１：２５．５１、１：５１．０２、１：７６．５３、及び１：１０２．０４）とともに転写してゲル化を誘導した。
【0208】
６０Ｔ ＲＧ４テンプレートからのＲＣＴ生成物とプラスミドからのｍＲＮＡ転写物が一緒になって、Ｗ－ＲＧ４ハイドロゲルを形成する。翻訳を、３０℃で８時間行った。図５Ｆ及び５Ｇは、６０Ｔ－ＲＧ４テンプレートを使用した場合、発現が最大２倍まで増強されたことを示す。
【0209】
４．ライセート包埋Ｗ－ＲＧ４ゲルを用いたタンパク質生産
図５Ｉは、ライセート包埋Ｗ－ＲＧ４を用いたタンパク質産生と、細胞ライセートが存在しない状態で産生したＷ－ＲＧ４（ライセートフリーＷ－ＲＧ４）からのタンパク質産生の結果を示す。特記のない限り、本開示で開示されるＷ－ＲＧ４は、ライセートフリーＷ－ＲＧ４である。
図５Ｉは、ライセート包埋Ｗ－ＲＧ４を用いたタンパク質産生と、細胞ライセートが存在しない状態で産生したＷ－ＲＧ４（ライセートフリーＷ－ＲＧ４）からのタンパク質産生の結果を示す。特記のない限り、本開示で開示されるＷ－ＲＧ４は、ライセートフリーＷ－ＲＧ４である。
【0210】
表３に示す以下の成分を混合することにより、ライセート包埋Ｗ－ＲＧ４ゲルを生成した。
【0211】
【表3】
【0212】
７５％のＨｉＢｉＴ－ＲＧ４テンプレート（配列番号：１４）と、２５％の３０Ｔ－ＲＧ４用スペーサーテンプレート（配列番号：６）、９０Ｔ－ＲＧ４用スペーサーテンプレート（配列番号：８）、又は１５０Ｔ－ＲＧ４用スペーサーテンプレート（配列番号：１１）を含むテンプレート混合物１．１μｌを上記転写反応混合物に添加した。７５％及び２５％は、全テンプレート混合物中のＨｉＢｉＴ－ＲＧ４テンプレート及びスペーサーテンプレートのそれぞれのモル分率を意味する。転写反応混合物を３７℃で３時間又は４８時間インキュベートし、この間にこれらのテンプレートからＲＮＡ転写物を生成し、ハイドロゲルを形成した。
【0213】
ライセート／Ｒｎａｓｅインヒビター混合物を添加しないこと以外は、上記と同様のプロトコルで、ＨｉＢｉＴを発現するライセートフリーＷ－ＲＧ４を生成した。また、ライセート包埋Ｗ－ＲＧ４の生成には０．３μＬのＤｎａｓｅフリー、Ｒｎａｓｅフリー水を使用したのに対し、ライセートフリーＷ－ＲＧ４の生成には３．３μＬのＤｎａｓｅフリー、Ｒｎａｓｅフリー水を使用した。
【0214】
ハイドロゲルを形成した後、ＮＥＢ Ｅｘｐｒｅｓｓ無細胞大腸菌タンパク質合成システム（ＮＥＢ＃Ｅ５３６０）を用いて翻訳反応を行った。１１μｌのライセートフリーＷ－ＲＧ４又はライセート包埋Ｗ－ＲＧ４を２５μＬのタンパク質合成バッファー、１０μＬのライセート／Ｒｎａｓｅインヒビター混合物（ライセートとＲｎａｓｅインヒビターの体積比は１２対１）、及び１０４μＬのＤｎａｓｅフリーＲｎａｓｅフリー水とともにインキュベートし、タンパク質の翻訳を開始させた。翻訳反応は２５℃に維持し、２時間後に終了させた。
【0215】
図５Ｉに示すように、３時間の転写反応で形成されたライセート包埋Ｗ－ＲＧ４（「３ｈ ｗ／ライセート」）は、ライセートフリーの対照サンプル（「３ｈ ｗ／ｏライセート」）と比較して、より多くのＨｉＢｉＴを生成した。４８時間の転写反応（ゲル調製時間）後に形成されたＷ－ＲＧ４から生成したＨｉＢｉＴ量は、３時間の転写反応後に形成されたＷ－ＲＧ４から生成したＨｉＢｉＴ量より少なく、これはハイドロゲルに包埋した細胞ライセートの包埋に伴うＲＮＡ分解に起因する可能性がある。
【0216】
翻訳反応混合物中の細胞ライセートのタンパク質産生への効果を試験し、その結果を図５Ｊに示す。ライセートフリーＷ－ＲＧ４（「未処理Ｗ－ＲＧ４」）及びライセート包埋Ｗ－ＲＧ４ゲルを、１５０ポリチミン（配列番号：１１）を含むスペーサーテンプレート及びＨｉＢｉＴ－ＲＧ４テンプレート（配列番号：１４）を上述の方法でローリングサークル転写することによって生成した。ライセートフリーＷ－ＲＧ４を、１２μＬのライセートを含む翻訳混合物（ＮＥＢ＃Ｅ５３６０）とインキュベートし（「未処理ゲル」）；ライセート包埋Ｗ－ＲＧ４をライセートを含まない翻訳混合物とインキュベートし（「Ｌ－ゲル」）；ライセート包埋Ｗ－ＲＧ４を１０μＬのライセートを含む翻訳混合物とインキュベートした（「Ｌ－Ｌ－ゲル」）。３つの翻訳混合液はすべてフィード溶液（タンパク質合成用バッファーとしても知られている）を含む。これらの反応物からの相対的なタンパク質生成レベルを、ＲＬＵ値によって示した。３０Ｔ ＲＧ４（配列番号：６）のテンプレートからの翻訳をネガティブコントロールとして使用した。すべての翻訳反応は３時間後に終了させた。
【0217】
図５Ｊは、翻訳工程中にライセートを追加導入したライセート包埋Ｗ－ＲＧ４が最も高い発現収量を示したことを示す（「Ｌ－Ｌ－ゲル」）。驚くべきことに、ライセート包埋Ｗ－ＲＧ４は、細胞ライセートを翻訳反応混合物に添加しない場合（「Ｌ－ゲル」）でも、収率は低いものの、十分なタンパク質を産生することができた。ライセート包埋Ｗ－ＲＧ４からの発現が成功したことは、これらのライセート包埋Ｗ－ＲＧ４ゲルが自給的なタンパク質発現系として機能する可能性があることを示している。したがって、これらのライセート包埋Ｗ－ＲＧ４ゲルは、翻訳に外部からのライセートを使用しないことが望ましい、あるいは必要な移植型又は注射型の治療用途に有用であり得る。
【0218】
参考文献
【0219】
【表4】
【0220】
参照による組み込み
アメリカ合衆国におけるすべての目的のために、本開示で言及される各出版物及び特許文書のすべては、そのような各出版物又は文書が参照により本明細書に組み込まれることが具体的かつ個別に示されている場合と同じ程度に、すべての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
アメリカ合衆国におけるすべての目的のために、本開示で言及される各出版物及び特許文書のすべては、そのような各出版物又は文書が参照により本明細書に組み込まれることが具体的かつ個別に示されている場合と同じ程度に、すべての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0221】
特定の実施例及び図を参照して本発明を参照してきたが、日常的な開発及び最適化の問題として、また当業者の範囲内で、特定の文脈又は意図された使用に適合するように変更を加え、等価物を置換することができ、それにより、特許請求されたもの及びそれらの等価物の範囲から逸脱することなく本発明の利益を達成することができる。
【0222】
配列の説明
この例示的な配列リストにおいて、下線はＧ－四重鎖モチーフを表す。二重下線は、スクランブルＧ－四重鎖モチーフを表す。全ての配列は、５’→３’の方向で記載されている。
この例示的な配列リストにおいて、下線はＧ－四重鎖モチーフを表す。二重下線は、スクランブルＧ－四重鎖モチーフを表す。全ての配列は、５’→３’の方向で記載されている。
【0223】
【化1】
【0224】
【化2】
【0225】
【化3】
【0226】
【化4】
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E-F】
【図4A-C】
【図4D-F】
【図5A】
【図5B-D】
【図5E】
【図5F-G】
【図5H】
【図5I-J】
【図6A-B】
【図6C-D】
【図7】
【図8A】
【図8B-E】
【図8F-H】
【図9】
【図10】
【図11A-B】
【図11C】
【図11D-E】
【図11F】
【図12A-D】
【図12E-H】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17A-B】
【図17C-D】
【図18A】
【図18B-C】
【図18D-E】
【図19】
【図20】
【図21A-B】
【図21C】
【図21D】
【図21E】
【図22A】
【図22B】
【図23】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-03-07
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
第１の環状ＤＮＡテンプレート及び第２の環状ＤＮＡテンプレートを含む無細胞合成系でタンパク質を生産するための組成物であって、
第１の環状ＤＮＡテンプレートは、（ｉ）第１のプロモーター配列、（ｉｉ）第１のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列、及び（ｉｉｉ）スペーサーを含み、
第２の環状ＤＮＡテンプレートは、（ｉ）第２のプロモーター配列、（ｉｉ）第２のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列、及び（ｉｉｉ）目的のポリペプチドのコード配列を含む、組成物。
第１の環状ＤＮＡテンプレートは、（ｉ）第１のプロモーター配列、（ｉｉ）第１のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列、及び（ｉｉｉ）スペーサーを含み、
第２の環状ＤＮＡテンプレートは、（ｉ）第２のプロモーター配列、（ｉｉ）第２のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列、及び（ｉｉｉ）目的のポリペプチドのコード配列を含む、組成物。
【請求項2】
請求項１に記載の組成物であって、第１及び第２の環状ＤＮＡテンプレートの総量に対する第１の環状ＤＮＡテンプレートのモル分率は、２５％～７５％の範囲である、組成物。
【請求項3】
（１）第１のプロモーター配列が相補的核酸配列にハイブリダイズして第１の部分二本鎖ＤＮＡ分子を形成し、
第１の部分二本鎖ＤＮＡ分子が二本鎖領域及び一本鎖領域を含み、
第１の部分二本鎖ＤＮＡ分子の二本鎖領域が、相補的核酸配列にハイブリダイズした第１のプロモーター配列を含み、
第１の部分二本鎖ＤＮＡ分子の一本鎖領域が、第１のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列を含み、
（２）第２のプロモーター配列が相補的核酸配列にハイブリダイズして第２の部分二本鎖ＤＮＡ分子を形成し、
第２の部分二本鎖ＤＮＡ分子が二本鎖領域及び一本鎖領域を含み、
第２の部分二本鎖ＤＮＡ分子の二本鎖領域が、相補的核酸配列にハイブリダイズした第２のプロモーター配列を含み、
第２の部分二本鎖ＤＮＡ分子の一本鎖領域が、第２のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列を含む、請求項１に記載の組成物。
第１の部分二本鎖ＤＮＡ分子が二本鎖領域及び一本鎖領域を含み、
第１の部分二本鎖ＤＮＡ分子の二本鎖領域が、相補的核酸配列にハイブリダイズした第１のプロモーター配列を含み、
第１の部分二本鎖ＤＮＡ分子の一本鎖領域が、第１のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列を含み、
（２）第２のプロモーター配列が相補的核酸配列にハイブリダイズして第２の部分二本鎖ＤＮＡ分子を形成し、
第２の部分二本鎖ＤＮＡ分子が二本鎖領域及び一本鎖領域を含み、
第２の部分二本鎖ＤＮＡ分子の二本鎖領域が、相補的核酸配列にハイブリダイズした第２のプロモーター配列を含み、
第２の部分二本鎖ＤＮＡ分子の一本鎖領域が、第２のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項4】
第１のＧ－四重鎖モチーフと第２のＧ－四重鎖モチーフが同じヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項5】
第１のプロモーター配列と第２のプロモーター配列が、同じヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項6】
第１のプロモーター配列と第２のプロモーター配列が、異なるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項7】
スペーサーが、３０～１２０個のチミンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項8】
コード配列が、２０～３００ヌクレオチドの範囲内である長さを有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項9】
コード配列とスペーサーの長さ比が、１：０．２～１：２の範囲内である、請求項１に記載の組成物。
【請求項10】
目的のポリペプチドが、インスリン、トランス活性化転写活性化因子（ＴＡＴ）、ＨｉＢｉＴ、及び単一ドメイン抗体からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項11】
１種以上のＲＮＡポリメラーゼ、リボヌクレオチドの混合物、及び／又はバッファーをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項12】
鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼをさらに含み、それによりローリングサークル増幅を行うことが可能である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項13】
環状ＤＮＡテンプレート及び二本鎖ＤＮＡコンストラクトを含む無細胞合成系でタンパク質を生産するための組成物であって、
環状ＤＮＡテンプレートは、（ｉ）第１のプロモーター配列、（ｉｉ）第１のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列、及び（ｉｉｉ）スペーサーを含み、
二本鎖ＤＮＡコンストラクトは、（ｉ）第２のプロモーター配列、（ｉｉ）第２のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列、及び（ｉｉｉ）目的のポリペプチドのコード配列を含む、組成物。
環状ＤＮＡテンプレートは、（ｉ）第１のプロモーター配列、（ｉｉ）第１のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列、及び（ｉｉｉ）スペーサーを含み、
二本鎖ＤＮＡコンストラクトは、（ｉ）第２のプロモーター配列、（ｉｉ）第２のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列、及び（ｉｉｉ）目的のポリペプチドのコード配列を含む、組成物。
【請求項14】
無細胞合成系でタンパク質を調製する方法であって、
（１）（ｉ）第１のプロモーター配列、及び（ｉｉ）第１のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列を含む第１の環状ＤＮＡテンプレートを提供する工程；
（２）第１の環状テンプレートに対してローリングサークル転写又は増幅を行って第１の核酸コンカテマーを生成する工程、
ここで、第１の核酸コンカテマーが核酸ハイドロゲルを形成する；及び
（３）核酸ハイドロゲルを無細胞合成系と組み合わせる工程；
を含む、方法。
（１）（ｉ）第１のプロモーター配列、及び（ｉｉ）第１のＧ－四重鎖モチーフに相補的な配列を含む第１の環状ＤＮＡテンプレートを提供する工程；
（２）第１の環状テンプレートに対してローリングサークル転写又は増幅を行って第１の核酸コンカテマーを生成する工程、
ここで、第１の核酸コンカテマーが核酸ハイドロゲルを形成する；及び
（３）核酸ハイドロゲルを無細胞合成系と組み合わせる工程；
を含む、方法。
【請求項15】
第１の環状ＤＮＡテンプレートが、ポリチミンを含むスペーサーをさらに含み、
工程（１）が、（ｉ）第２のプロモーター配列、（ｉｉ）第２のＧ－四重鎖モチーフ、及び（ｉｉｉ）目的のポリペプチドのコード配列を含む、第２の環状ＤＮＡテンプレートを提供することをさらに含み、
工程（２）が、第２の環状ＤＮＡテンプレートのローリングサークル転写又は増幅を行って第２の核酸コンカテマーを生成することをさらに含み、第１及び第２の核酸コンカテマーが核酸ハイドロゲルを形成し、
工程（３）が、目的のポリペプチドの翻訳を可能にする条件下で行われる、
請求項１４に記載の方法。
工程（１）が、（ｉ）第２のプロモーター配列、（ｉｉ）第２のＧ－四重鎖モチーフ、及び（ｉｉｉ）目的のポリペプチドのコード配列を含む、第２の環状ＤＮＡテンプレートを提供することをさらに含み、
工程（２）が、第２の環状ＤＮＡテンプレートのローリングサークル転写又は増幅を行って第２の核酸コンカテマーを生成することをさらに含み、第１及び第２の核酸コンカテマーが核酸ハイドロゲルを形成し、
工程（３）が、目的のポリペプチドの翻訳を可能にする条件下で行われる、
請求項１４に記載の方法。
【外国語明細書】