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特開2024-58473筋線維芽細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの発現抑制剤、線維症治療用医薬組成物、並びに、ｉｎ ｖｉｔｒｏで筋線維芽細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの産生を抑制する方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024058473
(43)【公開日】2024-04-25
(54)【発明の名称】筋線維芽細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの発現抑制剤、線維症治療用医薬組成物、並びに、ｉｎ ｖｉｔｒｏで筋線維芽細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの産生を抑制する方法
(51)【国際特許分類】
A61K 31/7028 20060101AFI20240418BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240418BHJP
A61K 31/795 20060101ALI20240418BHJP
C12N 5/077 20100101ALI20240418BHJP
【ＦＩ】
A61K31/7028
A61P43/00 105
A61K31/795
C12N5/077
【審査請求】未請求
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022165869
(22)【出願日】2022-10-14
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 発行日：２０２２年１０月３日、刊行物：ＧＬＹＣＯＢＩＯＬＯＧＹ，ｃｗａｃ０６７，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｇｌｙｃｏｂ／ｃｗａｃ０６７
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】504145342
【氏名又は名称】国立大学法人九州大学
(71)【出願人】
【識別番号】000108454
【氏名又は名称】ソマール株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100141139
【弁理士】
【氏名又は名称】及川 周
(74)【代理人】
【識別番号】100147267
【弁理士】
【氏名又は名称】大槻 真紀子
(74)【代理人】
【識別番号】100178847
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 映美
(74)【代理人】
【識別番号】100175824
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 淳一
(72)【発明者】
【氏名】伊勢 裕彦
(72)【発明者】
【氏名】松尾 早織
【テーマコード（参考）】
4B065
4C086
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065BD29
4B065BD32
4B065BD35
4B065CA44
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA05
4C086FA04
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZB21
(57)【要約】
【課題】筋線維芽細胞や活性化星細胞を不活性化することで線維化を抑制し、且つ、正常な線維芽細胞に復帰させることが可能な筋線維芽細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの発現抑制剤を提供する。
【解決手段】筋線維芽細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの発現抑制剤は、一般式（Ｉ）で表される化合物を含む。なお、一般式（Ｉ）中、ｎ１１は２以上１０以下の整数である。Ｒ１１は炭素数１以上１８以下のアルキル基である。
［化１］
【選択図】なし
【解決手段】筋線維芽細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの発現抑制剤は、一般式（Ｉ）で表される化合物を含む。なお、一般式（Ｉ）中、ｎ１１は２以上１０以下の整数である。Ｒ１１は炭素数１以上１８以下のアルキル基である。
［化１］
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記一般式（Ｉ）で表される化合物を含む、筋線維芽細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの発現抑制剤。
（一般式（Ｉ）中、ｎ１１は２以上１０以下の整数である。Ｒ１１は炭素数１以上１８以下のアルキル基である。）
【化1】
【請求項2】
前記化合物の重量平均分子量Ｍｗが１０００以上８０００以下である、請求項１に記載の筋線維芽細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの発現抑制剤。
【請求項3】
前記化合物の数平均分子量Ｍｎが５００以上７０００以下である、請求項１又は２に記載の筋線維芽細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの発現抑制剤。
【請求項4】
前記化合物において、重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎの比Ｍｗ／Ｍｎが１．０以上２．５以下である、請求項１又は２に記載の筋線維芽細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの発現抑制剤。
【請求項5】
請求項１又は２に記載の筋線維芽細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの発現抑制剤を有効成分として含有する、線維症治療用医薬組成物。
【請求項6】
線維症が、筋線維芽細胞及び活性化された星細胞からなる線維症である、請求項５に記載の線維症治療用医薬組成物。
【請求項7】
請求項１又は２に記載の筋線維芽細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの発現抑制剤を筋線維芽細胞に結合させることを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏで筋線維芽細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの産生を抑制する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、筋線維芽細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの発現抑制剤、線維症治療用医薬組成物、並びに、ｉｎ ｖｉｔｒｏで筋線維芽細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの産生を抑制する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
組織の線維化は、繰り返される傷害に伴う慢性炎症によって引き起こされる。慢性炎症は、線維芽細胞や星状細胞を変化させ、組織を筋線維芽細胞に維持し、星状細胞を活性化させる。この活性化により、これらの細胞の増強とコラーゲン等の細胞外マトリックスの豊富な産生が促進される。このようにして生じた組織線維化、癌、自己免疫等の慢性炎症性疾患は、断続的且つ反復的な組織傷害による継続的な炎症によって引き起こされる。繰り返される組織傷害によって引き起こされる重篤な組織傷害は、死にゆく細胞から放出される大量の細胞片の発生をもたらす。損傷細胞や死滅細胞から放出される細胞残屑に含まれる細胞内分子の中には、炎症細胞に組織の損傷を認識させる役割を果たすものがあり、損傷関連分子パターン（DAMPs）と呼ばれている（非特許文献１）。DAMPsは、危険信号として、組織の損傷や感染等の有害な状況から宿主組織を守るために炎症反応を誘導する。High-mobility group box 1（HMGB1）、熱ショックタンパク質（HSP）、アデノシン三リン酸（ATP）等は、細胞内で明確に定義された機能を有しているが、これらの分子が死にかけた細胞から漏れ出た後、細胞外空間でDAMPとして作用する。重度の組織損傷後の豊富なDAMPsの存在は、炎症性サイトカイン及び線維形成促進サイトカインを分泌する免疫細胞のリクルートと活性化を誘発する（非特許文献２）。最終的に、これらのサイトカインは、星状細胞や線維芽細胞の活性化星状細胞や筋線維芽細胞へのトランス分化を誘導し、組織のリモデリングの際に過形成や線維化を促進する（非特許文献３）。このように組織の線維化は、繰り返される傷害に伴う慢性炎症によって引き起こされる。慢性炎症では、豊富なコラーゲンの沈着とともに実質細胞が排出されることで、最終的に線維化組織の機能不全が引き起こされる。
【0003】
組織の線維化から回復するためには、筋線維芽細胞や活性化星状細胞を選択的に標的とし、各細胞の活性化を抑制する必要がある。例えば、ＳＥＲＰＩＮＥ２に暴露されたヒト肺線維芽細胞におけるコラーゲン１Ａ１及び／又はα－平滑筋アクチン（αＳＭＡ）の発現レベルを阻害するために、ヒと肺線維芽細胞にＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストを投与する方法（特許文献１）が提案されている。また、慢性炎症や線維化部位を標的とする治療薬としては、例えば、特手のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は特定のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、及びαＳＭＡからなる群より選択される少なくとも１種を含有する、線維症治療薬（特許文献２）が提案されている。また、発明者らは、これまでに、Ｏ結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化タンパク質様物質を用いて疾患部又はその付近でＧＤＦ１５の発現を増加させ、効果的に抗炎症作用や増殖抑制する方法（特許文献３）を提案している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特表２０１２－５０９９４１号公報
【特許文献2】特開２０２２－０６６０２６号公報
【特許文献3】国際公開第２０２１／０９５８２８号
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Bianchi ME., “DAMPs, PAMPs and alarmins: all we need to know about danger.”, J Leukoc Biol., Vol. 81, Issue 1, pp. 1-5, 2007. doi: 10.1189/jlb.0306164. Epub 2006 Oct 10. PMID: 17032697.
【非特許文献2】Bolourani, S., “The interplay of DAMPs, TLR4, and proinflammatory cytokines in pulmonary fibrosis.”, J. Mol. Med. (Berl)., Vol. 99, Issue 10, pp. 1373-1384, 2021.
【非特許文献3】An, P. et al., “Hepatocyte mitochondria-derived danger signals directly activate hepatic stellate cells and drive progression of liver fibrosis.”, Nat. Commun., Vol. 11, Article No. 2362, 2020.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
上述のような知見はあるものの、筋線維芽細胞や活性化星細胞、さらには線維化組織に効率的に治療剤を届け、しかも筋線維芽細胞や活性化星細胞を不活性化することにより線維化を抑制し、且つ正常な線維芽細胞に復帰させることが可能な抗線維化剤はこれまでに知られていない。
【0007】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、筋線維芽細胞や活性化星細胞を不活性化することで線維化を抑制し、且つ、正常な線維芽細胞に復帰させることが可能な筋線維芽細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの発現抑制剤及びこれを含有する線維症治療用医薬組成物を提供する。また、前記筋線維芽細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの発現抑制剤を用いた、ｉｎ ｖｉｔｒｏで筋線維芽細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの産生を抑制する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0008】
発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、特定のＮ－アセチルグルコサミンを構成単位とする化合物が筋線維芽細胞や活性化星状細胞を標的とし、これらの細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの発現を抑制することを見出し、本発明を完成するに至った。
【0009】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
（１） 下記一般式（Ｉ）で表される化合物を含む、筋線維芽細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの発現抑制剤。
（１） 下記一般式（Ｉ）で表される化合物を含む、筋線維芽細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの発現抑制剤。
【0010】
【化1】
【0011】
（一般式（Ｉ）中、ｎ１１は２以上１０以下の整数である。Ｒ１１は炭素数１以上１８以下のアルキル基である。）
【0012】
（２） 前記化合物の重量平均分子量Ｍｗが１０００以上８０００以下である、（１）に記載の筋線維芽細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの発現抑制剤。
（３） 前記化合物の数平均分子量Ｍｎが５００以上７０００以下である、（１）又は（２）に記載の筋線維芽細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの発現抑制剤。
（４） 前記化合物において、重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎの比Ｍｗ／Ｍｎが１．０以上２．５以下である、（１）～（３）のいずれか一つに記載の筋線維芽細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの発現抑制剤。
（５） （１）～（４）のいずれか一つに記載の筋線維芽細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの発現抑制剤を有効成分として含有する、線維症治療用医薬組成物。
（６） 線維症が、筋線維芽細胞及び活性化された星細胞からなる線維症である、（５）に記載の線維症治療用医薬組成物。
（７） （１）～（４）のいずれか一つに記載の筋線維芽細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの発現抑制剤を筋線維芽細胞に結合させることを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏで筋線維芽細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの産生を抑制する方法。
（３） 前記化合物の数平均分子量Ｍｎが５００以上７０００以下である、（１）又は（２）に記載の筋線維芽細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの発現抑制剤。
（４） 前記化合物において、重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎの比Ｍｗ／Ｍｎが１．０以上２．５以下である、（１）～（３）のいずれか一つに記載の筋線維芽細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの発現抑制剤。
（５） （１）～（４）のいずれか一つに記載の筋線維芽細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの発現抑制剤を有効成分として含有する、線維症治療用医薬組成物。
（６） 線維症が、筋線維芽細胞及び活性化された星細胞からなる線維症である、（５）に記載の線維症治療用医薬組成物。
（７） （１）～（４）のいずれか一つに記載の筋線維芽細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの発現抑制剤を筋線維芽細胞に結合させることを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏで筋線維芽細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの産生を抑制する方法。
【発明の効果】
【0013】
上記態様の筋線維芽細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの発現抑制剤、並びに、線維症治療用医薬組成物によれば、筋線維芽細胞や活性化星細胞を不活性化することで線維化を抑制し、且つ、正常な線維芽細胞に復帰させることができる。また、上記態様の方法によれば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで筋線維芽細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの産生を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】実施例１における化合物（Ｉ－１）処理及び未処理のヒト線維芽細胞（ＮＨＤＦ）間での遺伝子発現の差を示す散布図である。
【図2】実施例１における化合物（Ｉ－１）処理及び未処理のヒトＮＨＤＦでの増殖に関連する遺伝子発現のヒートマップである。
【図3】実施例１における化合物（Ｉ－１）又は死んだＨｅＬａ細胞を添加したヒトＮＨＤＦ及びＴＧＦβ刺激ヒトＮＨＤＦ（筋線維芽細胞）の細胞生存率を示すグラフである。
【図4】実施例２における化合物（Ｉ－１）で処理したヒトＮＨＤＦ及びＴＧＦβ刺激ヒトＮＨＤＦ（筋線維芽細胞）でのαＳＭＡ、Ｃｏｌ１ａ２、ｐ５３、ｐ２１及びβ－アクチンの発現を示すウェスタンブロットである。
【図5A】実施例２におけるビメンチンノックダウンヒトＮＨＤＦ及びヒトＮＨＤＦのビメンチンの発現を示すウェスタンブロットである。
【図5B】実施例２における化合物（Ｉ－１）で処理したビメンチンノックダウンヒトＮＨＤＦ及びヒトＮＨＤＦのαＳＭＡ及びｃｏｌ１ａ２の発現を示すウェスタンブロットである。
【図6】実施例２における化合物（Ｉ－１）で処理したヒト筋線維芽細胞でのＴｙｒ７０５ ＳＴＡＴ３のリン酸化を示すウェスタンブロットである。
【図7】実施例３におけるＧｌｃＮＡｃ、ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃモノマー、化合物（Ｉ－１）、又は化合物（Ｉ’－２）を添加したヒト筋線維芽細胞でのαＳＭＡ及びｃｏｌ１ａ２の発現を示すウェスタンブロットである。
【図8A】実施例４における化合物（Ｉ－１）処理及び未処理のヒト筋線維芽細胞間での遺伝子発現の差を示す散布図である。
【図8B】実施例４における死んだＨｅＬａ細胞処理及び未処理のヒト筋線維芽細胞間での遺伝子発現の差を示す散布図である。
【図9】実施例４における化合物（Ｉ－１）又は死んだＨｅＬａ細胞で処理したヒト筋線維芽細胞での遺伝子発現に関するベン図（上）及び著しく発現が変化した遺伝子のリスト（下）である。
【図10A】実施例４における化合物（Ｉ－１）又は死んだＨｅＬａ細胞で処理したヒト筋線維芽細胞での増殖に関連する遺伝子発現のヒートマップである。
【図10B】実施例４における化合物（Ｉ－１）又は死んだＨｅＬａ細胞で処理したヒト筋線維芽細胞での細胞周期に関連する遺伝子発現のヒートマップである。
【図11】実施例４における化合物（Ｉ－１）又は死んだＨｅＬａ細胞で処理したヒト筋線維芽細胞の細胞生存率を示すグラフである。
【図12】実施例４における死んだＨｅＬａ細胞で処理したヒト筋線維芽細胞での炎症に関連する遺伝子発現のヒートマップである。
【図13】実施例４における化合物（Ｉ－１）又は死んだＨｅＬａ細胞で処理したヒト筋線維芽細胞での各種タンパク質の発現を示すウェスタンブロットである。
【図14】実施例４における１００μＭ ＰＵＧＮＡｃ及び１０ｍＭ グルコサミンを添加又は未添加の死んだＨｅＬａ細胞で処理したヒト筋線維芽細胞での各種タンパク質の発現を示すウェスタンブロットである。
【図15】実施例４における１００μＭ ＰＵＧＮＡｃ及び１０ｍＭ グルコサミンを添加又は未添加の死んだＨｅＬａ細胞で処理したヒト筋線維芽細胞でのＭＭＰ１の発現を示すウェスタンブロットである。
【図16】実施例４における死んだＨｅＬａ細胞由来の細胞片から漏出したＯ－ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質又は化合物（Ｉ－１）と細胞表面ビメンチンとの相互作用に基づくシグナル伝達を示す概略図である。
【図17】実施例５におけるフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識した化合物（Ｉ－１）を静脈内投与した正常マウス及び四塩化炭素処理マウスの心臓、肝臓、腎臓、脾臓、及び肺でのＦＩＴＣ標識化合物（Ｉ－１）の蓄積量を示すグラフである。
【図18】実施例５におけるＦＩＴＣ標識化合物（Ｉ－１）を投与した四塩化炭素処理マウスの肝臓の凍結切片での核染色（ＤＡＰＩ）の結果、ＦＩＴＣ標識化合物（Ｉ－１）の蓄積、及びデスミン免疫染色の結果を示す蛍光像である。
【図19】実施例５におけるＦＩＴＣ標識化合物（Ｉ－１）又はＰＢＳを投与した四塩化炭素処理マウスの肝臓の凍結切片でのαＳＭＡ、ＭＭＰ１３、ＡＮＧＰＴＬ４、ＨＭＯＸ１、及びＳＯＤ２の免疫染色像である。
【図20】実施例５におけるマウスへの四塩化炭素及び化合物（Ｉ－１）の投与スケジュールを示す図である。
【図21】実施例５における化合物（Ｉ－１）又はＰＢＳを投与した四塩化炭素処理マウスの肝切片でのシリウスレッド染色及びαＳＭＡ染色の結果を示す顕微鏡像である。
【図24】実施例５における化合物（Ｉ－１）又はＰＢＳを投与した四塩化炭素処理マウスの肝臓でのｃｏｌ１ａ２、αＳＭＡ及びＧＡＰＤＨの発現を示すウェスタンブロットである。
【図27A】比較例１におけるＦＩＴＣで標識した化合物（Ｉ’－３）を投与した正常マウスの心臓、肝臓、腎臓、脾臓、及び肺でのＦＩＴＣ標識化合物（Ｉ’－３）の蓄積量を示すグラフである。
【図27B】比較例１における化合物（Ｉ’－３）を投与した四塩化炭素処理マウスの心臓、肝臓、腎臓、脾臓、及び肺でのＦＩＴＣ標識化合物（Ｉ’－３）の蓄積量を示すグラフである。
【図28】比較例２における化合物（Ｉ’－１）又はＰＢＳを投与した四塩化炭素処理マウス及び正常マウスでのコラーゲンの蓄積量を示すグラフである。
【図29】比較例２における化合物（Ｉ’－１）又はＰＢＳを投与した四塩化炭素処理マウス及び正常マウスの肝切片でのシリウスレッド染色の結果を示す顕微鏡像である。
【発明を実施するための形態】
【0015】
≪筋線維芽細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの発現抑制剤≫
本実施形態の筋線維芽細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの発現抑制剤（以下、単に「本実施形態の発現抑制剤」と称する場合がある）は、下記一般式（Ｉ）で表される化合物（以下、「化合物（Ｉ）」と称する場合がある）を含む。
本実施形態の筋線維芽細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの発現抑制剤（以下、単に「本実施形態の発現抑制剤」と称する場合がある）は、下記一般式（Ｉ）で表される化合物（以下、「化合物（Ｉ）」と称する場合がある）を含む。
【0016】
【化2】
【0017】
一般式（Ｉ）中、ｎ１１は２以上１０以下の整数である。Ｒ１１は炭素数１以上１８以下のアルキル基である。
【0018】
本実施形態の発現抑制剤によれば、後述する実施例に示すように、化合物（Ｉ）が細胞表面のビメンチンに結合及び作用することで、筋線維芽細胞におけるα－平滑筋アクチン（αＳＭＡ）及びコラーゲンの発現を抑制することができる。その結果、筋線維芽細胞及び星細胞を不活性化して、組織の線維化を抑制し、正常な線維芽細胞に復帰させることができる。
【0019】
次いで、本実施形態の発現抑制剤に含まれる化合物（Ｉ）について詳述する。
【0020】
＜化合物（Ｉ）＞
化合物（Ｉ）は、Ｎ－アセチルグルコサミン単位と、アクリル酸２－カルボキシエチル単位とを有し、末端に炭素数１以上１８以下のアルキル基を有するポリマーである。化合物（Ｉ）は末端にアルキル基を有することで、化合物（Ｉ）同士が会合しやすくなり、化合物（Ｉ）の血中滞留性を向上することができる。これにより、化合物（Ｉ）のビメンチン及びデスミンとの結合性を向上することができ、これら細胞表面分子に比較的長い期間に亘って持続的に作用することで、筋線維芽細胞におけるα－平滑筋アクチン（αＳＭＡ）及びコラーゲンの発現を効果的に抑制することができる。
化合物（Ｉ）は、Ｎ－アセチルグルコサミン単位と、アクリル酸２－カルボキシエチル単位とを有し、末端に炭素数１以上１８以下のアルキル基を有するポリマーである。化合物（Ｉ）は末端にアルキル基を有することで、化合物（Ｉ）同士が会合しやすくなり、化合物（Ｉ）の血中滞留性を向上することができる。これにより、化合物（Ｉ）のビメンチン及びデスミンとの結合性を向上することができ、これら細胞表面分子に比較的長い期間に亘って持続的に作用することで、筋線維芽細胞におけるα－平滑筋アクチン（αＳＭＡ）及びコラーゲンの発現を効果的に抑制することができる。
【0021】
［ｎ１１］
一般式（Ｉ）中、ｎ１１は、２以上１０以下の整数であり、好ましくは３以上１０以下の整数であり、より好ましくは５以上１０以下の整数であり、さらに好ましくは１０である。ｎ１１は、化合物（Ｉ）中のＮ－アセチルグルコサミン基の価数を示す。ｎ１１が上記下限値以上であることで、単位面積当たりのＮ－アセチルグルコサミン量を良好なものとすることができ、ビメンチンとの結合性を向上することができる。一方で、ｎ１１が上記上限値以下であることで、後述する実施例に示すように、αＳＭＡ及びコラーゲンの発現を抑制することができる。
一般式（Ｉ）中、ｎ１１は、２以上１０以下の整数であり、好ましくは３以上１０以下の整数であり、より好ましくは５以上１０以下の整数であり、さらに好ましくは１０である。ｎ１１は、化合物（Ｉ）中のＮ－アセチルグルコサミン基の価数を示す。ｎ１１が上記下限値以上であることで、単位面積当たりのＮ－アセチルグルコサミン量を良好なものとすることができ、ビメンチンとの結合性を向上することができる。一方で、ｎ１１が上記上限値以下であることで、後述する実施例に示すように、αＳＭＡ及びコラーゲンの発現を抑制することができる。
【0022】
［Ｒ１１］
一般式（Ｉ）中、Ｒ１１は炭素数１以上１８以下のアルキル基であり、好ましくは炭素数６以上１８以下のアルキル基である。アルキル基としては、直鎖状であってもよく、分岐鎖状であってもよいが、直鎖状であることがより好ましい。このようなアルキル基としては、例えば、ｎ－ヘキシル基、ｎ－ヘプチル基、ｎ－オクチル基、ｎ－ノニル基、ｎ－デシル基、ｎ－ウンデシル基、ｎ－ドデシル基、ｎ－トリデシル基、ｎ－テトラデシル基、ｎ－ペンタデシル基、ｎ－ヘキサデシル基、ｎ－ヘプタデシル基、ｎ－オクタデシル基等が挙げられるが、これらに限定されない。中でも、Ｒ１１はｎ－ドデシル基であることが好ましい。
一般式（Ｉ）中、Ｒ１１は炭素数１以上１８以下のアルキル基であり、好ましくは炭素数６以上１８以下のアルキル基である。アルキル基としては、直鎖状であってもよく、分岐鎖状であってもよいが、直鎖状であることがより好ましい。このようなアルキル基としては、例えば、ｎ－ヘキシル基、ｎ－ヘプチル基、ｎ－オクチル基、ｎ－ノニル基、ｎ－デシル基、ｎ－ウンデシル基、ｎ－ドデシル基、ｎ－トリデシル基、ｎ－テトラデシル基、ｎ－ペンタデシル基、ｎ－ヘキサデシル基、ｎ－ヘプタデシル基、ｎ－オクタデシル基等が挙げられるが、これらに限定されない。中でも、Ｒ１１はｎ－ドデシル基であることが好ましい。
【0023】
好ましい化合物（Ｉ）としては、例えば、以下の式（Ｉ－１）で表される化合物（以下、「化合物（Ｉ－１）」と称する場合がある）等が挙げられる。なお、化合物（Ｉ－１）は好ましい化合物（Ｉ）の一例に過ぎず、好ましい化合物（Ｉ）はこれに限定されない。
【0024】
【化3】
【0025】
＜化合物（Ｉ）の製造方法＞
化合物（Ｉ）の製造方法は特に限定はなく、ラジカル重合やリビングラジカル重合、連鎖移動剤（ＲＡＦＴ剤）を用いた可逆的付加－開裂連鎖移動型重合法（ＲＡＦＴ重合法）等を用いることができる。中でも、化合物（Ｉ）の分子量の制御、及び、化合物（Ｉ）の末端へのアルキル基の導入し易さの点から、ＲＡＦＴ重合法を用いることが好ましい。
化合物（Ｉ）の製造方法は特に限定はなく、ラジカル重合やリビングラジカル重合、連鎖移動剤（ＲＡＦＴ剤）を用いた可逆的付加－開裂連鎖移動型重合法（ＲＡＦＴ重合法）等を用いることができる。中でも、化合物（Ｉ）の分子量の制御、及び、化合物（Ｉ）の末端へのアルキル基の導入し易さの点から、ＲＡＦＴ重合法を用いることが好ましい。
【0026】
重合方法の具体例としては、まず、Ｎ－アセチルグルコサミンとアクリル酸２－カルボキシエチルをモル比で１：１の割合で混合し、ＤＭＴ－ＭＭ、ＤＭＳＯ又は水等の溶液中で縮合反応させて、ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃモノマーを調製する。次いで、ＲＡＦＴ重合法によりpoly(N-ethylacrylic acid-0-2-acetamide-2-deoxy-β-D-glucopyranosylamine)（以下、「ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃポリマー」という）を得ることができる。
【0027】
ＲＡＦＴ重合法に用いられるＲＡＦＴ剤としては、例えば、2-(ドデシルチオカルボノチオイルチオ)-2-メチルプロパン酸（ＤＴＭＰＡ）等を用いることができる。また、ＲＡＦＴ重合法に用いられるラジカル重合開始剤としては、例えば、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）等を用いることができる。
【0028】
このようにして得た化合物（Ｉ）は、細胞との作用性を向上させるために、ＲＡＦＴ重合法由来のアルキル基を除去しないことが重要である。
【0029】
＜化合物（Ｉ）の物性＞
［重量平均分子量（Ｍｗ）］
化合物（Ｉ）の重量平均分子量（Ｍｗ）は、細胞への作用を向上させる点から、１，０００以上８，０００以下であることが好ましく、重合による化合物（Ｉ）の収率性を向上させる点から、１，５００以上７，５００以下であることがより好ましく、αＳＭＡ及びコラーゲンの発現を抑制する点から、２，０００以上６，０００以下であることがさらに好ましい。
［重量平均分子量（Ｍｗ）］
化合物（Ｉ）の重量平均分子量（Ｍｗ）は、細胞への作用を向上させる点から、１，０００以上８，０００以下であることが好ましく、重合による化合物（Ｉ）の収率性を向上させる点から、１，５００以上７，５００以下であることがより好ましく、αＳＭＡ及びコラーゲンの発現を抑制する点から、２，０００以上６，０００以下であることがさらに好ましい。
【0030】
［数平均分子量（Ｍｎ）］
化合物（Ｉ）の数平均分子量（Ｍｎ）は、細胞への作用を向上させる点から、５００以上７，０００以下であることが好ましく、重合による化合物（Ｉ）の収率性を向上させる点から、１，０００以上６，５００以下であることがより好ましく、αＳＭＡ及びコラーゲンの発現を抑制する点から、１，５００以上６，０００以下であることがさらに好ましい。
化合物（Ｉ）の数平均分子量（Ｍｎ）は、細胞への作用を向上させる点から、５００以上７，０００以下であることが好ましく、重合による化合物（Ｉ）の収率性を向上させる点から、１，０００以上６，５００以下であることがより好ましく、αＳＭＡ及びコラーゲンの発現を抑制する点から、１，５００以上６，０００以下であることがさらに好ましい。
【0031】
［重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎの比Ｍｗ／Ｍｎ］
重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎの比Ｍｗ／Ｍｎは１．０以上２．５以下が好ましく、αＳＭＡ及びコラーゲンの発現を抑制し、且つ、ＭＭＰ１、ＡＮＧＰＴＬ４、ＨＭＯＸ１及びＳＯＤ２の発現を向上させる点から、１．２以上２．２以下がより好ましい。Ｍｗ／Ｍｎが上記範囲であることで、細胞培養材料表面にＮ－アセチルグルコサミンを多く存在させることができ、細胞表面のビメンチンやデスミンをより多く捉えることができるようになる。
重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎの比Ｍｗ／Ｍｎは１．０以上２．５以下が好ましく、αＳＭＡ及びコラーゲンの発現を抑制し、且つ、ＭＭＰ１、ＡＮＧＰＴＬ４、ＨＭＯＸ１及びＳＯＤ２の発現を向上させる点から、１．２以上２．２以下がより好ましい。Ｍｗ／Ｍｎが上記範囲であることで、細胞培養材料表面にＮ－アセチルグルコサミンを多く存在させることができ、細胞表面のビメンチンやデスミンをより多く捉えることができるようになる。
【0032】
なお、重量平均分子量Ｍｗ及び数平均分子量Ｍｎは、例えば、プルランを分子量の標準曲線として用いたゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって測定することができる。Ｍｗ／Ｍｎは、ＧＰＣにより測定された重量平均分子量Ｍｗ及び数平均分子量Ｍｎから算出される。
【0033】
≪線維症治療用医薬組成物≫
本実施形態の線維症治療用医薬組成物は、上述した発現抑制剤を有効成分として含有する。
本実施形態の線維症治療用医薬組成物は、上述した発現抑制剤を有効成分として含有する。
【0034】
なお、ここでいう「有効成分として含有する」とは、治療的に有効量の上述した発現抑制剤、すなわち、化合物（Ｉ）を含有することを意味する。
【0035】
本実施形態の線維症治療用医薬組成物は、ヒ卜又はその他の哺乳動物、例えば、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル等に、経口的或いは非経口的に投与することができる。非経口投与としては、例えば、静脈投与、皮下投与、経皮投与、経肺投与、経粘膜投与、直腸投与等が挙げられる。
【0036】
本実施形態の線維症治療用医薬組成物は、化合物（Ｉ）を経口又は非経口投与に通常用いられる薬学的に許容される担体、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、崩壊補助剤、滑沢剤、湿潤剤等や、添加剤等と混合し、所望の形態に製剤化することにより調製することができる。本実施形態の線維症治療用医薬組成物の剤形としては、例えば、頼粒剤、散剤、錠剤（糖衣錠を含む）、丸剤、バッカル剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤、乳剤、懸濁剤、クリーム剤、軟膏剤、点眼剤、注射剤、点滴剤、点鼻剤、貼付剤、坐剤等が挙げられる。
【0037】
本実施形態の線維症治療用医薬組成物中の化合物（Ｉ）の含有量はαＳＭＡ及びコラーゲンの発現を抑制し、線維化の改善が得られれば特に限定はないが、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上、さらに好ましくは１０質量％以上である。
【0038】
＜線維症＞
本明細書における「線維症」とは、薬物等の化学的刺激、過度の圧負荷、炎症反応等のストレスにより組織実質細胞の脱落や組織の機能低下が起こり、それを補う過程で生じた過剰な線維芽細胞の遊走増殖、及び、その後の細胞外マトリックスタンパク質の合成沈着による組織の機能障害を伴った硬直化を意味し、誘発刺激の別や発症部位は特に限定されない。このように繰り返される組織傷害によって引き起こされ重度の組織損傷となった後、炎症性サイトカイン及び線維形成促進サイトカインを分泌する免疫細胞のリクルートと活性化を誘発し、最終的にこれらのサイトカインは、星状細胞や線維芽細胞の活性化星状細胞や筋線維芽細胞へのトランス分化を誘導し、組織のリモデリングの際に過形成や線維化が促進される。このような組織線維化疾患としては、例えば肺、腸脱、腎臓、心臓、肝臓等の内臓組織の線維症が挙げられる。
本明細書における「線維症」とは、薬物等の化学的刺激、過度の圧負荷、炎症反応等のストレスにより組織実質細胞の脱落や組織の機能低下が起こり、それを補う過程で生じた過剰な線維芽細胞の遊走増殖、及び、その後の細胞外マトリックスタンパク質の合成沈着による組織の機能障害を伴った硬直化を意味し、誘発刺激の別や発症部位は特に限定されない。このように繰り返される組織傷害によって引き起こされ重度の組織損傷となった後、炎症性サイトカイン及び線維形成促進サイトカインを分泌する免疫細胞のリクルートと活性化を誘発し、最終的にこれらのサイトカインは、星状細胞や線維芽細胞の活性化星状細胞や筋線維芽細胞へのトランス分化を誘導し、組織のリモデリングの際に過形成や線維化が促進される。このような組織線維化疾患としては、例えば肺、腸脱、腎臓、心臓、肝臓等の内臓組織の線維症が挙げられる。
【0039】
本実施形態の線維症治療用医薬組成物が対象とする線維症には、抗腫瘍剤、抗生物質、抗菌剤、抗不整脈剤、消炎剤、抗リウマチ剤、インターフェロン又は小柴胡湯等の薬剤の投与により引き起こされる組織線維化疾患、並びに、慢性腎炎、間質性心筋炎及び間質性腸脱炎等の疾患に伴う組織線維化疾患も含まれる。具体的には、ブレオマイシン投与の副作用で生じる肺の線維症や、間質性肺炎の際又はその後に生じる肺線維症；間質性腸脱炎の際に生じる腸脱の線維症や腸脱頚部硬化症；遺伝子異常等によって生じる腎線維症、及び腎不全（腎硬化症）；心筋梗塞後のリモデリングによって生じる心内膜線維症；肝細胞の損傷によって生じる肝線維症、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、それに伴う門脈圧元進症及び肝硬変；過剰な組織修復によって生じるケロイド、その他、硬化性腹膜炎、前立腺肥大症、強皮症、子宮平滑筋腫、後腹膜線維症、及び骨髄線維症等を例示することができる。
【0040】
本実施形態の線維症治療用医薬組成物は、ＳＴＡＴ３のリン酸化を抑制することでαＳＭＡやコラーゲンの発現量を低下させ、ＭＭＰ１、ＨＭＯＸ１及びＡＮＧＰＴＬ４の発現を上昇させ、筋線維芽細胞や活性化星細胞を正常な線維芽細胞や星細胞に修復、線維化を改善するものである。従って、筋線維芽細胞や活性化星細胞からなる線維症、例えば肝臓の場合、活性化した星細胞が筋線維芽様細胞に形質転換し、細胞外基質を産生することによって線維化が進行する。しかしながら、本実施形態の線維症治療用医薬組成物を用いることで肝線維化を改善させ、肝機能の改善と肝癌発生を抑制することが可能となる。同様に膵線維化等に対して用いることも可能である。
【0041】
≪その他実施形態≫
一実施形態において、本発明は、上述した発現抑制剤、すなわち、化合物（Ｉ）の有効量を、治療を必要とする患者又は患畜に投与することを含む、線維症の治療方法を提供する。ここで、化合物（Ｉ）としては、上記「筋線維芽細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの発現抑制剤」において説明されたものと同様のものを用いることができる。また、適用対象となる線維症としては、上記「線維症治療用医薬組成物」において説明されたものと同様のものが挙げられる。
一実施形態において、本発明は、上述した発現抑制剤、すなわち、化合物（Ｉ）の有効量を、治療を必要とする患者又は患畜に投与することを含む、線維症の治療方法を提供する。ここで、化合物（Ｉ）としては、上記「筋線維芽細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの発現抑制剤」において説明されたものと同様のものを用いることができる。また、適用対象となる線維症としては、上記「線維症治療用医薬組成物」において説明されたものと同様のものが挙げられる。
【0042】
また、一実施形態において、本発明は、上述した発現抑制剤を線維化組織及び細胞に結合させることを含む、線維症の治療方法を提供する。
【0043】
結合の方法は特に限定されないが、線維化組織及び細胞に直接上述した発現抑制剤を添加する、又は製剤化した上述した発現抑制剤を経口的に或いは非経口的に投与し、化合物（Ｉ）を患部及びその付近に到達させる方法等が挙げられる。
【0044】
また、一実施形態において、本発明は、上述した発現抑制剤を製造するための、化合物（Ｉ）の使用を提供する。ここで、化合物（Ｉ）としては、上記「筋線維芽細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの発現抑制剤」において説明されたものと同様のものを用いることができる。
【0045】
≪ｉｎ ｖｉｔｒｏで筋線維芽細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの産生を抑制する方法≫
本実施形態の方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで筋線維芽細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの産生を抑制する方法であって、上述した発現抑制剤を筋線維芽細胞に結合させることを含む。
本実施形態の方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで筋線維芽細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの産生を抑制する方法であって、上述した発現抑制剤を筋線維芽細胞に結合させることを含む。
【0046】
本実施形態の方法によれば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで筋線維芽細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの産生を抑制することができる。
【0047】
発現抑制剤としては、上記「筋線維芽細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの発現抑制剤」において説明されたものと同様のものを用いることができる。
【0048】
筋線維芽細胞は、例えば、予め線維芽細胞をＴＧＦ－βで刺激することで、線維芽細胞から分化誘導させることができる。
【0049】
結合の方法は特に限定されないが、例えば、培地に化合物（Ｉ）を添加して筋線維芽細胞を培養する方法等が挙げられる。
【0050】
培地中の化合物（Ｉ）の濃度は、例えば、１μＭ以上１００μＭ以下とすることができ、好ましくは１０μＭ以上５０μＭ以下である。
【0051】
化合物（Ｉ）存在下での筋線維芽細胞の培養は、温度が、通常、３０℃以上４０℃以下、好ましくは３７℃程度（３７±２℃）、二酸化炭素含有割合が、通常、３体積％以上１５体積％以下、好ましくは５体積％程度（５±２体積％）の環境下で行う。
【0052】
化合物（Ｉ）存在下での筋線維芽細胞の培養期間は、通常、２４時間以上、好ましくは２４時間以上４８時間以下である。
【実施例0053】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0054】
＜材料及び方法＞
［筋線維芽細胞の準備］
マイクロプラズマ汚染がないことを確認した成人の皮膚から分離した初代培養ヒト皮膚線維芽細胞（タカラバイオ株式会社製）を、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（富士フイルム和光純薬株式会社製）を添加したＨＦＤＭ－１（＋）培地（細胞科学技術研究所製）で、３７℃、５ｖ／ｖ％ＣＯ２加湿インキュベーター内で培養した。続いてこの培地中に１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－βを添加し筋線維芽細胞を得た。この筋線維芽細胞を得るためのヒト皮膚線維芽細胞は３～６継代で維持された細胞を用いた。
［筋線維芽細胞の準備］
マイクロプラズマ汚染がないことを確認した成人の皮膚から分離した初代培養ヒト皮膚線維芽細胞（タカラバイオ株式会社製）を、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（富士フイルム和光純薬株式会社製）を添加したＨＦＤＭ－１（＋）培地（細胞科学技術研究所製）で、３７℃、５ｖ／ｖ％ＣＯ２加湿インキュベーター内で培養した。続いてこの培地中に１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－βを添加し筋線維芽細胞を得た。この筋線維芽細胞を得るためのヒト皮膚線維芽細胞は３～６継代で維持された細胞を用いた。
【0055】
［ＨｅＬａ細胞の調整］
ＨｅＬａ細胞は理研ＢＲＣから入手し、５ｖ／ｖ％ＣＯ２加湿インキュベーターにて３７℃で、５ｖ／ｖ％ウシ胎児血清を添加したダルベッコ改変イーグル培地にて培養した。
ＨｅＬａ細胞は理研ＢＲＣから入手し、５ｖ／ｖ％ＣＯ２加湿インキュベーターにて３７℃で、５ｖ／ｖ％ウシ胎児血清を添加したダルベッコ改変イーグル培地にて培養した。
【0056】
［死んだＨｅＬａ細胞の細胞片の調製］
低張溶液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１０ｍＭ ＫＣｌ、及び０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）で懸濁したＨｅＬａ細胞をマイクロチップ超音波処理装置（BRANSON Sonifier 250、Emerson Electric社製）を用いて、５０％のデューティーサイクルで１０秒間（冷却期間:０．５秒）処理して、死んだＨｅＬａ細胞の細胞片を調製した。
低張溶液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１０ｍＭ ＫＣｌ、及び０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）で懸濁したＨｅＬａ細胞をマイクロチップ超音波処理装置（BRANSON Sonifier 250、Emerson Electric社製）を用いて、５０％のデューティーサイクルで１０秒間（冷却期間:０．５秒）処理して、死んだＨｅＬａ細胞の細胞片を調製した。
【0057】
［マイコプラズマ汚染の有無の確認］
使用するヒト皮膚線維芽細胞及びＨｅＬａ細胞がマイコプラズマで汚染されていないことをMycoplasma Detection Kit for Endpoint PCR, OneStep, VendorGeM（Minerva Biolabs Gmbh製）を用いて確認した。
使用するヒト皮膚線維芽細胞及びＨｅＬａ細胞がマイコプラズマで汚染されていないことをMycoplasma Detection Kit for Endpoint PCR, OneStep, VendorGeM（Minerva Biolabs Gmbh製）を用いて確認した。
【0058】
＜化合物の製造＞
［製造例１］
（化合物（Ｉ－１）の製造）
５ｇのＧｌｃＮＡｃを５０ｍＬの水に溶解し、ＮＨ４ＣＯ３を飽和させるまで加えた。ナスフラスコで攪拌し、３０～３５℃で４～５日間、蓋を開けた開放系でインキュベーションし、ＮＨ４ＣＯ３の沈澱がなくなったら適宜加えた。ＴＬＣでＧｌｃＮＡｃ－ＮＨ2の合成を確認した。４～５日後、水を反応液に加えエバポレーター（３０℃）を行うことで、余分なＮＨ4ＣＯ3を取り除いた。なお、この操作は匂いがしなくなるまで、何度も繰り返し行った。エバポレーター後、凍結乾燥を行った。次にＧｌｃＮＡｃ－ＮＨ2（４．５ｍｏｌ：約１ｇ）をＤＭＳＯ（１０ｍＬ）に溶解して、2-carboxyethyl acrylate（４．５ｍｍｏｌ）を加えた。溶解後に、ＤＭＴ－ＭＭ（６．８ｍｍｏｌ）を加えて１８時間、室温（２５℃程度）でインキュベーションを行った。インキュベーション後、反応物を２００～３００ｍＬのクロロホルムに滴下した。沈澱物が得られるので、桐山ロートで回収した。回収した沈澱物をメタノールで溶解させ、不溶物を桐山ロートで取り除き、メタノールで溶解したものを回収した。エバポレーターを行い、メタノールを除去した。メタノールを除去した固形物を水で溶解し、その後、分取型ＨＰＬＣ（水／アセトニトリル）で精製を行い、ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃモノマー（分子量３４６）を得た。
［製造例１］
（化合物（Ｉ－１）の製造）
５ｇのＧｌｃＮＡｃを５０ｍＬの水に溶解し、ＮＨ４ＣＯ３を飽和させるまで加えた。ナスフラスコで攪拌し、３０～３５℃で４～５日間、蓋を開けた開放系でインキュベーションし、ＮＨ４ＣＯ３の沈澱がなくなったら適宜加えた。ＴＬＣでＧｌｃＮＡｃ－ＮＨ2の合成を確認した。４～５日後、水を反応液に加えエバポレーター（３０℃）を行うことで、余分なＮＨ4ＣＯ3を取り除いた。なお、この操作は匂いがしなくなるまで、何度も繰り返し行った。エバポレーター後、凍結乾燥を行った。次にＧｌｃＮＡｃ－ＮＨ2（４．５ｍｏｌ：約１ｇ）をＤＭＳＯ（１０ｍＬ）に溶解して、2-carboxyethyl acrylate（４．５ｍｍｏｌ）を加えた。溶解後に、ＤＭＴ－ＭＭ（６．８ｍｍｏｌ）を加えて１８時間、室温（２５℃程度）でインキュベーションを行った。インキュベーション後、反応物を２００～３００ｍＬのクロロホルムに滴下した。沈澱物が得られるので、桐山ロートで回収した。回収した沈澱物をメタノールで溶解させ、不溶物を桐山ロートで取り除き、メタノールで溶解したものを回収した。エバポレーターを行い、メタノールを除去した。メタノールを除去した固形物を水で溶解し、その後、分取型ＨＰＬＣ（水／アセトニトリル）で精製を行い、ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃモノマー（分子量３４６）を得た。
【0059】
次いで、ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃモノマー（分子量３４６）５０ｍｇを１ｍＬのマイクロチューブに量り取り、２５０μＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して、溶液（１）を調製した。
【0060】
ＲＡＦＴ剤（2-(ドデシルチオカルボノチオイルチオ)-2-メチルプロパン酸（DTMPA）、シグマ社製）を約５．２６ｍｇ（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃモノマーの１／１０モル当量）を１ｍＬのマイクロチューブに量り取り、２００μＬに溶解して、溶液（２）を調製した。
【0061】
さらにアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）１ｍｇ（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃモノマーに対して２質量％）をマイクロチューブに量り取り、ＡＩＢＮ １ｍｇがＤＭＳＯ５０μＬに溶解するようにＤＭＳＯを加えて、溶液（３）を調製した。
【0062】
溶液（１）２５０μＬに溶液（２）２００μＬを混合した後、溶液（３）５０μＬを混合し、脱気後（凍結融解脱気を三回程度繰り返した）、６５℃で約１８時間インキュベーションを行ない重合した。重合後、イソプロパノール（ＩＰＡ）で重合物を沈澱させ、遠心分離後回収して水に溶解し、透析（ＭＷ１００－５００）を約１日行い、未反応のモノマーを除いた。透析後、凍結乾燥し、下記式（Ｉ－１）で表される化合物（化合物（Ｉ－１））を得た。
【0063】
【化4】
【0064】
化合物（Ｉ－１）の重量平均分子量は４０００、数平均分子量は３１００、Ｍｗ／Ｍｎは１．３、Ｎ－アセチルグルコサミン基の個数は１０であった。
【0065】
これら各平均分子量はGel Permeation Chromatography（ＧＰＣ）装置（製品名:ＬＣ－９１１０Ｇ ＮＥＸＴ、日本分析工業（株）社製）を用いて、次の条件で測定した。カラムは、ＪＡＩＧＥＬ－ＧＳ５１０を用いて、溶離液は２００ｍＭ硝酸ナトリウム／アセ卜二トリル＝８０／２０（容量比）で行った。流量は１ｍＬ/ｍｉｎ、検出器はＲＩ検出器、カラム温度は４０℃で行った。分子量の標準曲線はプルランで実施した。以降の化合物についても同様の方法を用いて、各平均分子量を測定した。
【0066】
［比較製造例１］
（化合物（Ｉ’－１）の製造）
化合物（Ｉ－１）１０ｍｇを１ｍＬマイクロチューブに量り取り、水１００μＬに溶解した。還元剤として水素化ほう素ナトリウム１ｍｇを１ｍＬマイクロチューブに量り取り、水１００μＬに還元剤１ｍｇが溶解するように水を加えた。これら各溶液１００μＬを混合し、末端をチオール化後、ＩＰＡに滴下し、沈殿（反応物）を回収した。次いで、水に１～３Ｍ酢酸ナトリウムを加え。ｐＨ７～８になるように調整した溶媒１００μＬを準備し、これに反応物を溶解した。反応物と等量のモル数のマレイミドを、ｐＨを調整した溶媒１００μＬに溶解し、前記反応物を溶解した溶液とこの溶液とを混合し、１～２時間放置した。この溶液をＩＰＡに滴下し、沈殿を回収後、反応物を水に溶解し、凍結乾燥を行い、下記式（Ｉ’－１）で表される化合物（化合物（Ｉ’－１））を得た。
（化合物（Ｉ’－１）の製造）
化合物（Ｉ－１）１０ｍｇを１ｍＬマイクロチューブに量り取り、水１００μＬに溶解した。還元剤として水素化ほう素ナトリウム１ｍｇを１ｍＬマイクロチューブに量り取り、水１００μＬに還元剤１ｍｇが溶解するように水を加えた。これら各溶液１００μＬを混合し、末端をチオール化後、ＩＰＡに滴下し、沈殿（反応物）を回収した。次いで、水に１～３Ｍ酢酸ナトリウムを加え。ｐＨ７～８になるように調整した溶媒１００μＬを準備し、これに反応物を溶解した。反応物と等量のモル数のマレイミドを、ｐＨを調整した溶媒１００μＬに溶解し、前記反応物を溶解した溶液とこの溶液とを混合し、１～２時間放置した。この溶液をＩＰＡに滴下し、沈殿を回収後、反応物を水に溶解し、凍結乾燥を行い、下記式（Ｉ’－１）で表される化合物（化合物（Ｉ’－１））を得た。
【0067】
【化5】
【0068】
化合物（Ｉ’－１）の重量平均分子量は４０００、数平均分子量は３１００、Ｍｗ／Ｍｎは１．３、Ｎ－アセチルグルコサミン基の個数は１０であった。
【0069】
［比較製造例２］
（化合物（Ｉ’－２）の製造）
化合物（Ｉ－１）の製造方法において、ＲＡＦＴ剤の配合割合を約０．７３ｍｇ（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃモノマーの１／７２モル当量）とした以外は全て化合物（Ｉ－１）と同様にして、下記式（Ｉ’－２）で表される化合物（化合物（Ｉ’－２））を作製した。
（化合物（Ｉ’－２）の製造）
化合物（Ｉ－１）の製造方法において、ＲＡＦＴ剤の配合割合を約０．７３ｍｇ（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃモノマーの１／７２モル当量）とした以外は全て化合物（Ｉ－１）と同様にして、下記式（Ｉ’－２）で表される化合物（化合物（Ｉ’－２））を作製した。
【0070】
【化6】
【0071】
化合物（Ｉ’－２）の重量平均分子量は２５０００、数平均分子量は１３０００、Ｍｗ／Ｍｎは１．９、Ｎ－アセチルグルコサミン基の個数は７２であった。
【0072】
［比較製造例３］
（化合物（Ｉ’－３）の製造）
化合物（Ｉ－１）の製造方法において、ＲＡＦＴ剤の配合割合を約０．８８ｍｇ（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃモノマーの１／６０モル当量）とした以外は全て化合物（Ｉ－１）と同様にして、下記式（Ｉ’－３）で表される化合物（化合物（Ｉ’－３））を作製した。
（化合物（Ｉ’－３）の製造）
化合物（Ｉ－１）の製造方法において、ＲＡＦＴ剤の配合割合を約０．８８ｍｇ（ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃモノマーの１／６０モル当量）とした以外は全て化合物（Ｉ－１）と同様にして、下記式（Ｉ’－３）で表される化合物（化合物（Ｉ’－３））を作製した。
【0073】
【化7】
【0074】
化合物（Ｉ’－３）の重量平均分子量は２１０００、数平均分子量は１１５００、Ｍｗ／Ｍｎは１．８、Ｎ－アセチルグルコサミン基の個数は６０であった。
【0075】
［実施例１］
（化合物（Ｉ－１）のヒ卜線維芽細胞に対する影響）
化合物（Ｉ－１）のヒ卜線維芽細胞（ＮＨＤＦ）に対する影響を、ＤＮＡマイクロアレイを用いて確認した。
（化合物（Ｉ－１）のヒ卜線維芽細胞に対する影響）
化合物（Ｉ－１）のヒ卜線維芽細胞（ＮＨＤＦ）に対する影響を、ＤＮＡマイクロアレイを用いて確認した。
【0076】
まず、ＮＨＤＦに５０μｇ／ｍＬの化合物（Ｉ－１）を添加し、２４時間インキュベーションを行った。インキュベーション後、ｍＲＮＡを回収しＤＮＡマイクロアレイを実施し、化合物（Ｉ－１）の遺伝子発現変化を確認した。ＤＮＡマイクロアレイは、Agilent Technologies社のマイクロアレイシステムを使用し実施した。その結果を図１に示す。なお、ＤＮＡマイクロアレイ解析は、化合物（Ｉ－１）で処理したＮＨＤＦ対ＮＨＤＦの発現、並びに、Ｚスコア＞２．０及び＜－２．０における約１０００遺伝子の発現変化をそれぞれ示す。さらに増殖と細胞周期に関する遺伝子発現レベルについてヒートマップ解析を実施した。その結果を図２に示す。
【0077】
図１の結果から、化合物（Ｉ－１）を添加したＮＨＤＦにおいて、化合物（Ｉ－１）がバキュロウイルスIAP repeat-containing protein 5（ＢＩＲＣ５；ｓｕｒｖｉｖｉｎ）等の細胞周期進行に関連する遺伝子発現の低下と、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤１Ａ（ＣＤＫＮ１Ａ；ｐ２１）等の細胞周期停止に関連する遺伝子発現の上昇させていることが分かった。
【0078】
また、図２の結果から、化合物（Ｉ－１）がＮＨＤＦの増殖が著しく抑制させていることが分かった。
【0079】
さらに、図２の結果から、培養による細胞数の違いについて、次の条件で実験を行った。
【0080】
５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、又は２５０μｇ／ｍＬの化合物（Ｉ－１）をＮＨＤＦとＴＧＦ－β刺激ＮＨＤＦに添加し、３日後の細胞生存率を求めた。比較のため死んだＨｅＬａ細胞（２．５×１０４細胞及び５×１０４細胞）も化合物（Ｉ－１）と同様にして添加した。細胞数はCellCounting Kit-8（富士フイルム和光社製）を用いて算出し、細胞生存率を推定した。データは平均±S.D.、n=6、常法型ANOVAとした。結果を図３に示す。
【0081】
図３の結果から、化合物（Ｉ－１）を３日間添加することにより、ＮＨＤＦ、及びＴＧＦ－β刺激ＮＨＤＦにおいて、細胞生存率が低下していた。このことから、化合物（Ｉ－１）はＮＨＤＦの細胞周期進行を抑制させることができることが分かった。
【0082】
これら結果から化合物（Ｉ－１）は細胞増殖性を抑制する効果があることが分かった。
【0083】
［実施例２］
（化合物（Ｉ－１）のヒ卜筋線維芽細胞に対する影響１）
予め準備した筋線維芽細胞に化合物（Ｉ－１）を５０μｇ／ｍＬ添加し、２４時間及び４８時間経過後の筋線維芽細胞におけるαＳＭＡとコラーゲン（ｃｏｌｌａ２）、ｐ５３、ｐ２１及びβ－ａｃｔｉｎの発現をウェスタンブロッティングにより観察した。その結果を図４に示す。なお、比較対照としてＴＧＦ－βで刺激をせず、且つ、化合物（Ｉ－１）を添加していないヒト皮膚線維芽細胞、ＴＧＦ－βで刺激をせず、且つ、化合物（Ｉ－１）を添加したヒト皮膚線維芽細胞、及び、化合物（Ｉ－１）を添加していない筋線維芽細胞も準備した。
（化合物（Ｉ－１）のヒ卜筋線維芽細胞に対する影響１）
予め準備した筋線維芽細胞に化合物（Ｉ－１）を５０μｇ／ｍＬ添加し、２４時間及び４８時間経過後の筋線維芽細胞におけるαＳＭＡとコラーゲン（ｃｏｌｌａ２）、ｐ５３、ｐ２１及びβ－ａｃｔｉｎの発現をウェスタンブロッティングにより観察した。その結果を図４に示す。なお、比較対照としてＴＧＦ－βで刺激をせず、且つ、化合物（Ｉ－１）を添加していないヒト皮膚線維芽細胞、ＴＧＦ－βで刺激をせず、且つ、化合物（Ｉ－１）を添加したヒト皮膚線維芽細胞、及び、化合物（Ｉ－１）を添加していない筋線維芽細胞も準備した。
【0084】
図４の結果から、化合物（Ｉ－１）を添加した筋線維芽細胞において、２４時間、及び４８時間ともにαＳＭＡとコラーゲンのダウンレギュレーションと、ｐ５３及びｐ２１のアップレギュレーションが確認された。このｐ５３の発現上昇はｐ３８ＭＡＰＫのリン酸化によって制御されているものと考えられる。また、化合物（Ｉ－１）による遺伝子発現の変化は死んだＨｅＬａ細胞の細胞片によるものと同様であることから、αＳＭＡとコラーゲン（ｃｏｌ１ａ２）のダウンレギュレーションには、Ｎ－アセチルグルコサミンとの相互作用が必須であることが分かった。
【0085】
【0086】
図５Ａ及び図５Ｂの結果から、ビメンチンノックダウンＮＨＤＦに化合物（Ｉ－１）を添加してもαＳＭＡとコラーゲンのダウンレギュレーションの発生がみられなかった。このことから、αＳＭＡとコラーゲンのダウンレギュレーションは化合物（Ｉ－１）と細胞表面のビメンチンの相互作用によって起こっていることが分かった。
【0087】
ここでαＳＭＡとコラーゲンの発現はsignal transducer and activator of transcription 3（ＳＴＡＴ３）によって制御されることから、化合物（Ｉ－１）によるＳＴＡＴ３のＴｙｒ７０５のリン酸化について、確認した。
【0088】
具体的には、予め準備した筋線維芽細胞に化合物（Ｉ－１）を５０μｇ／ｍＬ添加し、２４時間及び４８時間経過後の筋線維芽細胞におけるＳＴＡＴ３とｐｈｏｓｐｈｏ－Ｔｙｒ７０５ ＳＴＡＴ３の発現をウェスタンブロッティングにより観察した。その結果を図６に示す。なお、比較対照としてＴＧＦ－βで刺激をせず、且つ、化合物（Ｉ－１）を添加していないヒト皮膚線維芽細胞、ＴＧＦ－βで刺激をせず、且つ、化合物（Ｉ－１）を添加したヒト皮膚線維芽細胞、及び、化合物（Ｉ－１）を添加していない筋線維芽細胞も準備した。
【0089】
図６の結果から、筋線維芽細胞はＳＴＡＴ３のＴｙｒ７０５のリン酸化が増加しているが、化合物（Ｉ－１）を添加した筋線維芽細胞ではＳＴＡＴ３のＴｙｒ７０５のリン酸化が抑制されていた。化合物（Ｉ－１）がこのリン酸化を抑制することで、αＳＭＡとコラーゲンの発現量低下が誘導されたものと推察された。
【0090】
［実施例３］
（Ｎ－アセチルグルコサミン基の価数のヒ卜筋線維芽細胞に対する影響）
予め準備した筋線維芽細胞に、化合物（Ｉ’－２）２５０μｇ／ｍＬ若しくは５０μｇ／ｍＬ、化合物（Ｉ－１）５０μｇ／ｍＬ、化合物（Ｉ－１）の製造の過程で得られるＡＣ－ＧｌｃＮＡｃモノマー（分子量３４６）５０μｇ／ｍＬ、又は、化合物（Ｉ－１）の製造時に使用したＧｌｃＮＡｃ ５０μｇ／ｍＬをそれぞれ添加し、４８時間経過後の筋線維芽細胞におけるαＳＭＡとコラーゲン（ｃｏｌｌａ２）及びβ－ａｃｔｉｎの発現をウェスタンブロッティングにより観察した。その結果を図７に示す。
（Ｎ－アセチルグルコサミン基の価数のヒ卜筋線維芽細胞に対する影響）
予め準備した筋線維芽細胞に、化合物（Ｉ’－２）２５０μｇ／ｍＬ若しくは５０μｇ／ｍＬ、化合物（Ｉ－１）５０μｇ／ｍＬ、化合物（Ｉ－１）の製造の過程で得られるＡＣ－ＧｌｃＮＡｃモノマー（分子量３４６）５０μｇ／ｍＬ、又は、化合物（Ｉ－１）の製造時に使用したＧｌｃＮＡｃ ５０μｇ／ｍＬをそれぞれ添加し、４８時間経過後の筋線維芽細胞におけるαＳＭＡとコラーゲン（ｃｏｌｌａ２）及びβ－ａｃｔｉｎの発現をウェスタンブロッティングにより観察した。その結果を図７に示す。
【0091】
図７の結果から、ＡＣ－ＧｌｃＮＡｃモノマーやＧｌｃＮＡｃ単糖、及び化合物（Ｉ’－２）ではαＳＭＡ及びコラーゲンの発現を低下させることができていないこと、さらにはＧｌｃＮＡｃの価数を挙げても効果が増強されることがないことが示された。このことから、抗線維化効果を発揮するのに好ましいＧｌｃＮＡｃ価数は約１０であり、ＧｌｃＮＡｃ１０量体程度が好ましいことが分かった。
【0092】
［実施例４］
（化合物（Ｉ－１）のヒ卜筋線維芽細胞に対する影響２）
化合物（Ｉ－１）及び参考として死んだＨｅＬａ細胞の細胞片を添加したヒ卜筋線維芽細胞における種々の遺伝子の発現を、ＤＮＡマイクロアレイを用いて確認した。
（化合物（Ｉ－１）のヒ卜筋線維芽細胞に対する影響２）
化合物（Ｉ－１）及び参考として死んだＨｅＬａ細胞の細胞片を添加したヒ卜筋線維芽細胞における種々の遺伝子の発現を、ＤＮＡマイクロアレイを用いて確認した。
【0093】
筋線維芽細胞に５０μｇ／ｍＬの化合物（Ｉ－１）を添加し、４８時間インキュベーションを行った。また、筋線維芽細胞に５×１０４ｃｅｌｌｓ／１０μＬの死んだＨｅＬａ細胞の細胞片を添加し、同様に、４８時間インキュベーションを行った。各々インキュベーション後、ｍＲＮＡを回収し、ＤＮＡマイクロアレイを実施し、化合物（Ｉ－１）及び死んだＨｅＬａ細胞の細胞片による遺伝子発現の変化を確認した。ＤＮＡマイクロアレイは、Agilent Technologies社のマイクロアレイシステムを使用し、実施した。なお、ＤＮＡマイクロアレイ解析は、筋線維芽細胞と化合物（Ｉ－１）又は死んだＨｅＬａ細胞の細胞片で処理した筋線維芽細胞との間の遺伝子発現＞１．５倍及び＜０．６６倍の変化、並びに、Ｚスコア＞２及び＜－２に基づき実施した。この結果について化合物（Ｉ－１）の結果を図８Ａに、死んだＨｅＬａ細胞の細胞片の結果を図８Ｂに、各筋線維芽細胞における遺伝子発現に関するベン図及び著しく発現が変化した遺伝子のリストを図９に示す。
【0094】
図８Ａ及び図８Ｂの結果から、死んだＨｅＬａ細胞からの細胞片を添加した筋線維芽細胞対筋線維芽細胞、及び化合物（Ｉ－１）を添加した筋線維芽細胞対筋線維芽細胞では、前者が１４５５の遺伝子、後者が１２４９の遺伝子が差次的に発現していることが分かった。
【0095】
さらに、図９の結果から、筋線維芽細胞間で共通の遺伝子発現があることが分かった。
【0096】
DAVID Bioinformatics Resources 6.8によるKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) パスウェイ解析により、化合物（Ｉ－１）を添加した筋線維芽細胞では細胞周期パスウェイ（P=4.3E-15）が低下しているが、死んだＨｅＬａ細胞からの細胞片を添加した筋線維芽細胞では関節リウマチ経路（P=2.6E-5）が増加していた。化合物（Ｉ－１）及び死んだＨｅＬａ細胞からの細胞片を添加した筋線維芽細胞に共通する遺伝子発現は細胞周期経路のダウンレギュレーション（P=4.3E-7）であり、これらのパスウェイ解析から死んだＨｅＬａ細胞からの細胞片は様々な炎症性遺伝子を活性化し、化合物（Ｉ－１）は多くの増殖関連遺伝子をダウンレギュレートすることを確認した。
【0097】
また、マイクロアレイデータに基づくヒートマップ解析の結果を図１０に示す。
【0098】
図１０の結果から、化合物（Ｉ－１）を添加した筋線維芽細胞及び死んだＨｅＬａ細胞の細胞片を添加した筋線維芽細胞における細胞周期及び増殖関連遺伝子のダウンレギュレーション、並びに、細胞周期停止遺伝子のアップレギュレーションが確認された。これらのことは、図１１において、化合物（Ｉ－１）又は死んだＨｅＬａ細胞の細胞片の添加後３日目における筋線維芽細胞の細胞生存率において有意な減少を示していることからも分かった。炎症性遺伝子発現のヒートマップ解析は、死んだＨｅＬａ細胞の細胞片を添加した筋線維芽細胞において、炎症の活性化を示した（図１２）。
【0099】
さらに、以下に示す表１～表３の結果から、化合物（Ｉ－１）を添加した筋線維芽細胞及び死んだＨｅＬａ細胞の細胞片を添加した筋線維芽細胞において著しく発現が変動した遺伝子があることが分かった。これは、ＤＡＭＰは細胞片に含まれるためであり、２つの間で最も有意にアップレギュレートされた遺伝子はマトリックスメタロプロテアーゼ１（ＭＭＰ１）及びスーパーオキシドジムスターゼ２（ＳＯＤ２）であり、ダウンレギュレートされた遺伝子はｃｏｌ１ａ１、ＡＣＴＧ２及びトランスジェリン（ＴＡＧＬＮ）であった。それに加え、化合物（Ｉ－１）を添加した筋線維芽細胞において顕著にアップレギュレートされた遺伝子はヘムオキシゲナーゼ１（ＨＭＯＸ１）、アンジオポエチン様４（ＡＮＧＰＴＬ４）、及び分泌型リンタンパク質１（ＳＰＰ１：オステオポンチン）であり、ダウンレギュレートされた遺伝子はｃｏｌ１ａ２、ＢＩＲＣ５及びトロンボスポンジ１（ＴＨＢＳ１）であった。また、死んだＨｅＬａ細胞の細胞片を添加した筋線維芽細胞において顕著にアップレギュレートされた遺伝子は、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ６、及びインターロイキンー１（ＩＬ－１）で、ダウンレギュレートされた遺伝子はカドヘリン１５（ＣＤＨ１５）であった。
【0100】
【表1】
【0101】
【表2】
【0102】
【表3】
【0103】
また、筋線維芽細胞に化合物（Ｉ－１）又は死んだＨｅＬａ細胞の細胞片を添加し４８時間経過後のＡＮＧＰＴＬ４とＴＨＢＳ１の状態をウェスタンブロットにより観察した。その結果を図１３に示す。
【0104】
図１３では前記マイクロアレイの結果と同様、ＡＮＧＰＴＬ４とＴＨＢＳ１とがダウンレギュレートされていることが確認できた。さらに、化合物（Ｉ－１）を添加した筋線維芽細胞においてはαＳＭＡ，コラーゲン、ＴＨＢＳ１がダウンレギュレートされ、マトリックスメタロプロテアーゼ１（ＭＭＰ１）、スーパーオキシドジムスターゼ２（ＳＯＤ２）、ヘムオキシゲナーゼ１（ＨＭＯＸ１）、リポ蛋白リパーゼはアンジオポエチン様４（ＡＮＧＰＴＬ４）、分泌型リンタンパク質１（ＳＰＰ１：オステオポンチン）、特にＳＯＤ２、ＡＮＧＰＴＬ４及びＭＭＰ１がアップレギュレートされることが分かった。
【0105】
次いで、筋線維芽細胞に、１００μＭ ＰＵＧＮＡｃと１０ｍＭグルコサミンで処理した死んだＨｅＬａ細胞の細胞片を添加し４８時間経過後の各遺伝子の発現状態をウェスタンブロットにより観察した。その結果を図１４及び図１５に示す。
【0106】
図１４及び図１５の結果から、死んだＨｅＬａ細胞の細胞片の添加によるｃｏｌ１ａ２及びＴＨＢＳ１のダウンレギュレーション、並びに、ＳＯＤ２、ＡＮＧＰＴＬ４、ＭＭＰ１のアップレギュレーションは、細胞片を０．５×１０５ｃｅｌｌ及び１×１０５ｃｅｌｌ加えることにより増強した。また、さらにこれら細胞片を１００μＭ ＰＵＧＮＡｃと１０ｍＭグルコサミンで処理することで、Ｏ－ＧｌｃＮＡｃ修飾が増強することがわかった。このことから、これらの分子の発現は、細胞片に含まれるＯ－ＧｌｃＡＮｃ修飾タンパク質によって制御されていることがわかった。
【0107】
前記ＭＭＰ１は線維組織に沈着したコラーゲンを分解し、ＡＮＧＰＴＬ４は創傷治癒において創傷治癒を促進しｃｏｌ１ａ２を減少させる等、抗線維化、抗炎症作用を持つ遺伝子と考えられている。ＳＯＤ２とＨＭＯＸ１は、様々な酸化ストレスに対して保護作用を発揮する。これらの遺伝子の発現が上昇することで、抗酸化作用による線維化の緩和が期待される。
【0108】
図１６に遺伝子発現の相関図を示す。ＴＨＢＳ１は、潜在性ＴＧＦ－βを活性化型ＴＧＦ－βに変換する役割を担っており、線維化の進行に関与している。したがって、ＴＨＢＳ１のダウンレギュレーションは、ＴＧＦ－βの活性化を抑制することにより、進行を抑制する。細胞片からのＯ－ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質及び化合物（Ｉ－１）と細胞表面のビメンチンとの相互作用は、ｐ３８ＭＡＰＫ経路に続いてｐ５３の発現を活性化し、ｐ５３の誘導によってＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害する。また、ＭＭＰ１、ＳＯＤ２、ＡＮＧＰＴＬ４、ＨＭＯＸ１の発現誘導はｐ３８ＭＡＰＫ経路で制御されており、ｃｏｌ１ａ１、ｃｏ１ａ２、αＳＭＡ、ＢＩＲＣ５、ＴＨＢＳ１、ＴＡＧＬＮの誘導はＳＴＡＴ３経路で制御されている。このことから、これらの遺伝子発現の変化は、これらの相互作用によって誘導され、抗線維化作用をもたらすことが期待される。さらに、これらの遺伝子発現変化は、死んだＨｅＬａ細胞の細胞片と化合物（Ｉ－１）との間で共通していたことから、死んだ細胞から漏れたＯ－ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質によって誘導されることが分かった。
【0109】
［実施例５］
（四塩化炭素投与マウスに対する化合物（Ｉ－１）による治療効果）
５週齢の雄性ＩＣＲマウスに、オリーブオイルで希釈した２０ｖ／ｖ％四塩化塩素（ＣＣｌ４）溶液を５ｍＬ／ｋｇ体重で週２回、８週間腹腔内投与して肝線維化モデルマウスを作製した。この肝線維化モデルマウスと正常マウスに、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識した化合物（Ｉ－１）を４００μｇ／ｍＬ静脈内注射した。注射後４８時間に、２５ｖ／ｖ％イソフルラン麻酔下で頸椎脱臼により犠牲にしたこれらのマウスから、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、及び肺組織を分離した。各組織をＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｗ／ｖ％ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ ｓｏｄｉｕｍ、０．１ｖ／ｖ％ＳＤＳ、１ｖ／ｖ％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ―１００、５ｍＭ ＥＤＴＡ及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（ナカライテスク社製））で均質に溶解させた。ライセートをマイクロチップソニケーター（BRANSON Sonifier 250；Emerson Electric社製）を用いて５０％のデューティーサイクルで３０秒間超音波処理した。超音波処理物を４℃で１５分間２０，０００×ｇで遠心分離して不溶解物を除去した。そのときの上清（１００μＬ）を平底の９６ウェルブラックプレートに分注し、マイクロプレートリーダー（Infinite 200PRO M Plex；Nano QuantPlate、テカングループ社製）を用いて溶液の蛍光強度を測定した。その結果を図１７に示す。
（四塩化炭素投与マウスに対する化合物（Ｉ－１）による治療効果）
５週齢の雄性ＩＣＲマウスに、オリーブオイルで希釈した２０ｖ／ｖ％四塩化塩素（ＣＣｌ４）溶液を５ｍＬ／ｋｇ体重で週２回、８週間腹腔内投与して肝線維化モデルマウスを作製した。この肝線維化モデルマウスと正常マウスに、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識した化合物（Ｉ－１）を４００μｇ／ｍＬ静脈内注射した。注射後４８時間に、２５ｖ／ｖ％イソフルラン麻酔下で頸椎脱臼により犠牲にしたこれらのマウスから、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、及び肺組織を分離した。各組織をＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｗ／ｖ％ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ ｓｏｄｉｕｍ、０．１ｖ／ｖ％ＳＤＳ、１ｖ／ｖ％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ―１００、５ｍＭ ＥＤＴＡ及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（ナカライテスク社製））で均質に溶解させた。ライセートをマイクロチップソニケーター（BRANSON Sonifier 250；Emerson Electric社製）を用いて５０％のデューティーサイクルで３０秒間超音波処理した。超音波処理物を４℃で１５分間２０，０００×ｇで遠心分離して不溶解物を除去した。そのときの上清（１００μＬ）を平底の９６ウェルブラックプレートに分注し、マイクロプレートリーダー（Infinite 200PRO M Plex；Nano QuantPlate、テカングループ社製）を用いて溶液の蛍光強度を測定した。その結果を図１７に示す。
【0110】
図１７の結果から、四塩化炭素を投与していない正常マウス体内での化合物（Ｉ－１）の生体内分布としては腎臓が最も多く、次いで肝臓に多く集積していた。一方、四塩化炭素投与マウスでは、化合物（Ｉ－１）の蓄積量は肝臓が最も多く、次いで腎臓、肺の順であった。
【0111】
さらに、四塩化炭素投与マウスの線維化肝臓で増大した活性化星状細胞にＦＩＴＣ標識化合物（Ｉ－１）が蓄積しているかを確認した。具体的には、まず、上清のタンパク質濃度を、Protein Assay Bicinchoninate Kit（ナカライテスク社製）を用いて、メーカーの説明書に従って測定し、四塩化炭素で８週間処理したマウスの肝臓の凍結切片における化合物（Ｉ－１）の蛍光強度を観察した。肝組織は４ｖ／ｖ％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳで２日間固定し、２０ｗ／ｖ％スクロース含有ＰＢＳに浸漬させた。肝組織をTissue-Tek（登録商標） OCT compound（サクラファインテックジャパン社製）に埋め込み、クライオスタット（CryoStarTM NX70；Thermo Fisher Scientific社製）を用いて１２μｍ厚の凍結切片を作製した。切片を免疫組織染色用ブロッキング剤（Blocking One Histo；ナカライテクス社製）で１０分間ブロッキングし、ウサギ抗デスミン抗体（１：５０希釈；16520-1-AP；Proteintech社製）を用いて、４℃で一晩インキュベートした。次いで二次抗体としてＣＦ５５５標識ウサギ抗ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（１：５００希釈；20038；Biotium社製）を用いて、２時間、室温（２５℃程度）でインキュベートした。
【0112】
免疫染色後，肝切片の自家蛍光を消光するため、製造元の指示に従ってTrueBlack（登録商標） Lipofuscin Autofluorescence Quencher（Biotium社製）で処理した。これらの肝切片をFluoro-KEEPER Antifade Reagent Non-Hardening Type with DAPI（ナカライテスク社製）で包埋した。これらの肝切片の画像は、蛍光顕微鏡（BZ-X710；株式会社キーエンス社製）を用いて撮影することで行った。結果を図１８に示す。
【0113】
図１８の結果から、化合物（Ｉ－１）がデスミン発現領域に集積していることが分かった。ここで約５０００Ｄａの化合物は腎排泄によって容易に除去されることが知られており、化合物（Ｉ－１）の重量平均分子量（Ｍｗ）が４０００であることから、化合物（Ｉ－１）は正常マウスの腎臓に蓄積されたと推測される。しかし、図１８の結果は、化合物（Ｉ－１）が四塩化炭素投与マウスの線維化肝臓において細胞表面のデスミンを介して活性化星状細胞に選択的に相互作用していることを示唆した。これらの結果から、血中の化合物（Ｉ－１）は重量平均分子量が低いため腎排泄により容易に除去されるが、線維化肝の活性化星状細胞を選択的に標的としていることが分かった。
【0114】
次に、線維化肝臓を有する四塩化炭素投与マウスに化合物（Ｉ－１）を投与した際のＭＭＰ１３、ＡＮＧＰＴＬ４、ＨＭＯＸ１、ＳＯＤ２等の抗線維化タンパク質の発現が誘導されるか否かについて確認した。
【0115】
具体的には、前述の方法に従って、肝組織の１２μｍ厚の凍結切片を調製した。凍結切片を０．１ｖ／ｖ％Ｈ２Ｏ２含有メタノールを用いて３０分間不活性化し、２．５ｖ／ｖ％ウマ血清含有ＰＢＳを用いて２０分間、室温（２５℃程度）でブロッキングした。ブロッキング後、これらの凍結切片を、ウサギ抗αＳＭＡ抗体（１：１００希釈；１４３９５－１－ＡＰ；Proteintech社製）、ウサギ抗ＭＭＰ１３（１：１００希釈；１８１６５－１－ＡＰ；Proteintech社製）、ウサギ抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体（１：１００倍希釈；１８３７４－１－ＡＰ；Proteintech社製）、ウサギ抗ＨＭＯＸ１抗体（１：１００倍希釈；１０７０１－１－ＡＰ；Proteintech社製）、又はウサギ抗ＳＯＤ２抗体（１：１００倍希釈；ＧＴＸ１１６０９３；GeneTex社製)を用いて、４℃で一晩、インキュベーションした。インキュベーション後、凍結切片をImmPRESS（登録商標） Horse Anti-Rabbit IgG Polymer Kit（Vector Laboratories社製）を用いて反応時間３０分間でインキュベートした。次いでPeroxidase Stain DAB Kit and Metal Enhancer for DAB Stain（ナカライテクス社製）を用いて５分間反応させた。肝臓のコラーゲン沈着を検出するために、これらの凍結切片に対するシリウスレッド染色を、Picro-Sirius Red Staining Kit（ScyTek Laboratories社製）を用いて行った。これらの凍結切片をＰＢＳで１回洗浄し、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むPicro-Sirius Red溶液に１時間浸漬した。１時間後、凍結切片を０．５ｖ／ｖ％グリセロール酢酸溶液で２回洗浄した。染色した凍結切片を明視野顕微鏡（ZEISS Primovert；Carl Zeiss社製）で観察し、HDMI（登録商標）カメラTureChrome II（池田理化社製）を用いて画像を撮影した。結果を図１９に示す。
【0116】
図１９の結果から、静脈内投与４８時間後の肝切片では、ＭＭＰ１３（マウスはＭＭＰ１の代替としてＭＭＰ１３を発現）、ＡＮＧＰＴＬ４、ＨＭＯＸ１及びＳＯＤ２の発現が観察された。化合物（Ｉ－１）を投与した四塩化炭素投与マウスでは、線維化した肝臓でαＳＭＡが高発現しているグリッソン嚢でこれらのタンパク質が顕著に発現していた。また、ＰＢＳを投与した四塩化炭素投与マウスでは、ＭＭＰ１３とＡＮＧＰＴＬ４の弱い発現が認められたが、ＨＭＯＸ１とＳＯＤ２の発現は見られなかった。これらの結果から線維化肝臓の活性化星状細胞が、化合物（Ｉ－１）と相互作用することにより、これらのタンパク質を発現していることを分かった。
【0117】
このように四塩化炭素投与マウスに化合物（Ｉ－１）を投与することで活性化星状細胞のＭＭＰ１３、ＡＮＧＰＴＬ４、ＨＭＯＸ１、ＳＯＤ２が誘導され、肝線維化が改善することがわかった。これらの結果から、化合物（Ｉ－１）による筋線維芽細胞や活性化星状細胞からのこれらの抗線維化因子の誘導が、肺線維症や非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）等、種々の組織の線維化を緩和できることが推察される。また、肝臓におけるＨＭＯＸ１、ＳＯＤ２、ＡＧＰＴＬ４のアップレギュレーションは、ＮＡＳＨを緩和し、中でもＡＮＧＰＴＬ４は、活性化された肝星細胞における低密度リポタンパク質による遊離コレステロールの蓄積を抑制することにより、ＮＡＳＨを改善する。さらに、ＡＮＧＰＴＬ４は、瘢痕関連コラーゲン産生を抑制することにより、過形成や線維化を伴う過度の創傷治癒を抑制すること、及びＡＮＧＰＴＬ４が肺線維症を進行させるということが知られている。よって、化合物（Ｉ－１）は、ＨＭＯＸ１やＭＭＰ１等、他の因子の発現を誘導することにより肺線維症を改善することができると推察される。動脈硬化、自己免疫疾患、癌等の多くの慢性炎症性疾患は、筋線維芽細胞の拡大がこれらの炎症性疾患を悪化させることが原因である。そのため、化合物（Ｉ－１）によって筋線維芽細胞を不活性化することで、それらの治療にも化合物（Ｉ－１）を使用できる可能性がある。
【0118】
次に、化合物（Ｉ－１）を投与することによる線維化肝臓の改善について検討した。四塩化炭素で肝線維化を誘導したモデルマウスを週２回、５週間調製した。化合物（Ｉ－１）（４００μｇ／ｂｏｄｙ）又はＰＢＳを１週間に２回、１週間にわたってマウスに投与した。その時の四塩化炭素と化合物（Ｉ－１）及びＰＢＳの投与スケジュールを図２０に示す。図２０に示すスケジュールで、正常マウス、四塩化炭素投与マウスにＰＢＳを投与したマウス、四塩化炭素投与マウスに化合物（Ｉ－１）を投与したマウスを調製した。最終の四塩化炭素投与から１週間後、各マウスの肝臓凍結切片からランダムに選んだ１０～４０枚の画像から、αＳＭＡ免疫染色及びシリウスレッド染色陽性領域をImageJ2 ver.2.3.0/1.53fで数値化した。さらに、２００μＬのＰＢＳで希釈した化合物（Ｉ－１）３００μｇ、又はコントロールとして２００μＬのＰＢＳのみを、それぞれ、最終の四塩化炭素投与から１週間後（四塩化炭素投与開始から５週間後）に、週２回、１週間、四塩化炭素で処理したマウスに静脈内注射した。化合物（Ｉ－１）の最終投与から３日後、これらから肝臓を分離し、Sirius-Red染色を行った。その結果を図２１、図２２及び図２３に示す。
【0119】
ＰＢＳを投与した四塩化炭素投与マウスの肝切片では、コラーゲンの沈着とαＳＭＡの発現が強く検出された。一方、化合物（Ｉ－１）を投与した四塩化炭素投与マウスの肝切片ではαＳＭＡ及びコラーゲンの発現は共に減少していることが分かった。これは図２１～２３の結果からも明らかであった。シリウスレッド染色においては、シリウスレッド陽性の領域は、ＰＢＳ投与の四塩化炭素投与マウスに比べて、化合物（Ｉ－１）投与の四塩化炭素投与マウスでは半分以下の値であった（図２２）。αＳＭＡ免疫染色の結果においては、αＳＭＡ陽性の領域は、ＰＢＳ投与の四塩化炭素投与マウスに比べて、化合物（Ｉ－１）投与の四塩化炭素投与マウスでは５分の１程度の値となった（図２３）。
【0120】
次いで、これらの肝組織をＲＩＰＡ緩衝液でホモジナイズして溶解液を調製し、ウェスタンブロッティングにより、これら肝組織におけるコラーゲン沈着量及びαＳＭＡ発現量を確認した。その結果を図２４、図２５及び図２６に示す。
【0121】
図２４～２６の結果から、化合物（Ｉ－１）を投与した四塩化炭素投与マウスではｃｏｌ１ａ２及びαＳＭＡの発現が減少していた。これらの結果から化合物（Ｉ－１）がαＳＭＡの発現及びコラーゲン沈着を減少させることにより、肝線維症の改善を促進させたことが推察される。
【0122】
［比較例１］
（四塩化炭素投与マウスに対する化合物（Ｉ’－３）の投与）
実施例５において、線維化肝における重量平均分子量が異なる化合物の蓄積効率を確認した。具体的には、化合物（Ｉ－１）を化合物（Ｉ’－３）（ＧｌｃＮＡｃ数：６０、Ｍｗ：２１０００、Ｍｎ：１１５００）に変更した以外は全て実施例５と同様にして四塩化炭素投与マウスに対する抗線維化効果を評価した。この結果を図２７Ａ及び図２７Ｂに示す。
（四塩化炭素投与マウスに対する化合物（Ｉ’－３）の投与）
実施例５において、線維化肝における重量平均分子量が異なる化合物の蓄積効率を確認した。具体的には、化合物（Ｉ－１）を化合物（Ｉ’－３）（ＧｌｃＮＡｃ数：６０、Ｍｗ：２１０００、Ｍｎ：１１５００）に変更した以外は全て実施例５と同様にして四塩化炭素投与マウスに対する抗線維化効果を評価した。この結果を図２７Ａ及び図２７Ｂに示す。
【0123】
図２７Ａ及び図２７Ｂの結果から、脾臓と肝臓に化合物（Ｉ’－３）が顕著に蓄積していることが分かった。化合物（Ｉ’－３）の蓄積量は脾臓で最も多かった。これは、化合物（Ｉ’－３）の重量平均分子量が高い（２１０００である）ため、これらのポリマーは脾臓と肝臓の網状内皮系に非特異的に捕捉されたことによるものであると推察された。
【0124】
このことから、化合物（Ｉ’－３）は化合物（Ｉ－１）に比べて腎排泄性が低いため、抗線維化剤として使用するのに適さないものであると考えられる。
【0125】
［比較例２］
（四塩化炭素投与マウスに対する化合物（Ｉ’－１）の投与）
実施例５において、化合物（Ｉ－１）を化合物（Ｉ’－１）に変更した以外は全て実施例５と同様にして四塩化炭素投与マウスの肝臓へのコラーゲンの蓄積を評価した。
（四塩化炭素投与マウスに対する化合物（Ｉ’－１）の投与）
実施例５において、化合物（Ｉ－１）を化合物（Ｉ’－１）に変更した以外は全て実施例５と同様にして四塩化炭素投与マウスの肝臓へのコラーゲンの蓄積を評価した。
【0126】
具体的には、実施例５と同様の方法にて準備した四塩化炭素で肝線維化を誘導したモデルマウスに、化合物（Ｉ’－１）（４００μｇ／ｂｏｄｙ）又はＰＢＳを１週間に２回、１週間に亘ってマウスに投与し、最終の四塩化炭素投与から１週間後、これらの肝臓のコラーゲン蓄積量と沈着状態をシリウスレッド染色により評価した。コラーゲンの蓄積量は５０μｇ／ｍＬのヒドロキシプロリンとモデルマウスの肝臓の各２０μＬを透明平底９６ｗｅｌｌマイクロプレートの別々のウェルに入れた。また、別途Reagent A ８μＬとOxidation buffer ９０μＬを混合した。次いで、この混合液９０μＬを各ウェルに加え、プレートをタップして混合し、室温（２５℃程度）下で１０分間インキュベートした。インキュベート後、Reagent B ９０μＬを全てのウェルに加え、ピペッティングにより濁りを均一にし、３７℃で９０分間インキュベートした。その後、５６０ｎｍの吸光度を測定した。その結果を図２８に示す。また、実施例５と同様にして肝臓のコラーゲン沈着を検出するために、凍結切片に対するシリウスレッド染色を実施した。その結果を図２９に示す。
【0127】
【産業上の利用可能性】
【0128】
本実施形態の筋線維芽細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの発現抑制剤、並びに、線維症治療用医薬組成物は、筋線維芽細胞や活性化星細胞のα－平滑筋アクチン及びコラーゲンの発現を抑制し、組織の修復に利用することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27A】
【図27B】
【図28】
【図29】
