特開 2024-58664 シアリルＴｎ抗原糖鎖に特異的に結合する一本鎖抗体、それら抗体をキメラ抗原受容体の一部として導入する方法、およびそれらキメラ抗原受容体を発現したナチュラルキラー細胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024058664

(43)【公開日】2024-04-25

(54)【発明の名称】シアリルＴｎ抗原糖鎖に特異的に結合する一本鎖抗体、それら抗体をキメラ抗原受容体の一部として導入する方法、およびそれらキメラ抗原受容体を発現したナチュラルキラー細胞

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20240418BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240418BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240418BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20240418BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z

C12N5/10 ZNA

C12N15/12

C07K14/705

【審査請求】未請求

【請求項の数】7

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023177936

(22)【出願日】2023-10-14

(31)【優先権主張番号】P 2022165505

(32)【優先日】2022-10-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 日本糖質学会「第４０回日本糖質学会年会」、２０２１年１０月１５日発行

(71)【出願人】

【識別番号】307011381

【氏名又は名称】株式会社スディックスバイオテック

(72)【発明者】

【氏名】隅田 泰生

【テーマコード（参考）】

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA94X

4B065AB01

4B065BA02

4H045AA10

4H045BA09

4H045DA50

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

【課題】癌は１９８１年から３０年以上日本人の死因の第１位となっている。世界中で、種々の癌に対するマーカー分子や分子標的薬開発のための標的分子の検索が行われているが、癌特異的な蛋白質として使用できるものは限られている。そこで近年、癌特異的に発現する糖鎖が注目されている。
【解決手段】独自の糖鎖ナノテクノロジーとファージディスプレイ法を組み合わせて開発したシアリルＴｎ抗原糖鎖に特異的に結合する一本鎖抗体の遺伝子を、キメラ抗原受容体の一部として遺伝子導入したナチュラルキラー細胞の製造を可能とした。この細胞は肝癌や膵癌などの免疫細胞療法に利用できる。
【選択図】図６

【特許請求の範囲】

【請求項1】

シアリルＴｎ抗原糖鎖発現癌細胞に特異的に結合する一本鎖抗体を抗原認識部位として導入したキメラ抗原受容体を含む、ナチュラルキラー細胞。

【請求項2】

前記一本鎖抗体は、肝臓癌細胞または膵臓癌細胞に特異的に結合する一本鎖抗体である、請求項１に記載のナチュラルキラー細胞。

【請求項3】

請求項１の一本鎖抗体は、配列番号１から９として示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。

【請求項4】

前記キメラ抗原受容体は、
（ａ）イムノグロブリン重鎖シグナルペプチド、
（ｂ）Ｃ末端にＭｙｃ－ｔａｇを有する、シアリルＴｎ抗原糖鎖発現細胞の細胞表層糖鎖に特異的に結合する一本鎖抗体、
（ｃ）ＣＤ２８由来ヒンジ及び膜貫通蛋白質ドメイン、
（ｄ）シグナル伝達のための４－１ＢＢ細胞内蛋白質ドメイン、および、
（ｅ）シグナル伝達のためのＣＤ３ζＴ細胞受容体ドメイン、
を含み、かつ、前記（ａ）～（ｅ）が、Ｎ末端からＣ末端にかけて、この順に発現するキメラ抗原受容体である、請求項１に記載のナチュラルキラー細胞。

【請求項5】

配列番号１０、１１、または１２として示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、キメラ抗原受容体。

【請求項6】

請求項４に記載のキメラ抗原受容体をコードする、配列番号１３、１４または１５として示される塩基配列を有する核酸コンストラクト。

【請求項7】

請求項６に記載の核酸コンストラクトをそれぞれＮＫ－９２ ＭＩ細胞に導入したＣＡＲ－ＮＫ細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、シアリルＴｎ抗原糖鎖に特異的に結合する一本鎖抗体の製造、抗体の遺伝子を導入したキメラ抗原受容体および当該キメラ抗原受容体を導入したナチュラルキラー細胞に関する。

【背景技術】

【0002】

糖鎖は、生体内に普遍的に存在する生体分子で、糖蛋白質や糖脂質、プロテオグリカンのような複合糖質の形で存在する。細胞表層の糖鎖は、糖鎖－蛋白質間や糖鎖－糖鎖同士の相互作用を介して、細胞接着や情報伝達、ウイルスや細菌の感染などに関与し、生体内で極めて多様な生理機能を担う。

【0003】

糖鎖の構造や発現量は、炎症や疾患などの細胞内外の環境変化に応じて、動的に変化することが知られている。細胞が癌化すると、特定の糖鎖の過剰発現や欠損が起きたり、一部が欠損した不完全な構造の糖鎖が出現することがある。また、正常細胞には存在しない糖鎖構造が発現することもある。このように、癌化によって、様々な糖鎖の発現変化が起こる。したがって、癌の進行度や転移性、患者の予後などが糖鎖で予測できると期待されている。

【0004】

厚労省の統計（日本人対象）では、２０２１年度に１，４３９，８５６人（男：７３８，１４１人、女：７０１，７１５人）が亡くなっており、死因別では、悪性新生物＜腫瘍＞の死亡数は３８，１５０５人（死亡総数に占める割合は２６．５％）、死亡率（人口１０万対）は３１０．７であった。癌は１９８１年から３０年以上日本人の死因の第１位となっている。世界中で、種々の癌に対するマーカー分子の検索が行われているが、癌特異的な蛋白質として使用できるものは限られている。そこで近年、癌特異的に発現する糖鎖が注目されている。

【0005】

上記の特異的な糖鎖は、癌マーカーとしての利用だけでなく、分子標的薬開発のための標的分子としても利用されている。疾患特異的な糖鎖に対する分子標的薬は、新たな診断薬や医薬品の開発にも繋がることから、近年盛んに研究されている。

【0006】

一方、抗糖鎖抗体の作製においては、（ｉ）疾患特異的な糖鎖構造の同定が非常に難しいこと、（ｉｉ）糖鎖の抗原性が低く、実験動物に免疫してハイブリドーマを得る従来の手法では抗体の作製が難しいこと、（ｉｉｉ）糖鎖の抗原性を向上させるために、糖脂質への誘導や抗原性の高い蛋白質との複合化などが必要なことなど、技術的に様々な課題があり、簡便且つ効率的に特異性の高い抗糖鎖抗体を作製可能な新たな手法の確立が求められている。

【0007】

一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、抗体の抗原結合部位を含む領域であるＦａｂの重鎖（ＶＨ）と軽鎖（ＶＬ）から構成される抗体の一種であり、リンカーペプチドによりＶＨとＶＬ同士がつながった構造を持つ。目的のｓｃＦｖを探索・単離する有効な手法としてファージディスプレイ法があり、ウイルスの一種であるバクテリオファージ表面にｓｃＦｖを提示させ、多数のライブラリーの中から特定の抗原に結合するｓｃＦｖ提示ファージを効率的に選別・濃縮する。得られたｓｃＦｖ提示ファージは、大腸菌の蛋白質発現系を用いて、可溶性のｓｃＦｖを発現させることができ、産生されたｓｃＦｖは、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）等のエピトープタグを用いたアフィニティー精製により、高純度に精製することが出来る。さらには、ＩｇＧ抗体へと誘導出来るため、特異性の高いヒト由来抗体を作製する技術として大きな注目を集めている。

【0008】

発明者らは、効率的に疾患特異的な糖鎖に対する抗体を得る手法を確立するために、ファージライブラリー法と独自のシュガーチップ技術（特許文献１、２、非特許文献１、２）を用いて、シアリルＴｎ抗原糖鎖に対する抗糖鎖抗体の開発を行ってきた。

【0009】

シアリルＴｎ抗原糖鎖の構造には、シアル酸成分にＮ－アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）、またはＮ－グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）を含有する２種類が見出されている。

【0010】

Ｎｅｕ５Ａｃ構造を含むＴｎ抗原（Ｎｅｕ５Ａｃ－Ｔｎ）は、ヒトを含む多くの哺乳動物に発現する。正常な細胞にも発現するが、癌細胞では過剰に発現することが知られており、胃癌や卵巣癌の診断マーカーの１つとして既に臨床利用されている（非特許文献３）

【0011】

本願では、癌関連糖鎖抗原に対する抗体を開発するための標的分子として、シアリルＴｎ（ＳＴｎ）抗原の一つであるＮｅｕ５Ｇｃ－Ｔｎ抗原に着目した。Ｎｅｕ５Ｇｃ含有ＳＴｎ（Ｎｅｕ５Ｇｃ－Ｔｎ）は、ヒトでは発現しないと考えられてきた。すなわち、Ｎｅｕ５Ｇｃは、ヌクレオチド供与体であるＣＭＰ－Ｎｅｕ５ＡｃをＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ｇｃに変換する水酸化酵素が作用することによって合成されるが、ヒトではＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ水酸化酵素の遺伝子が欠損しており（非特許文献４）、ヒトではＮｅｕＧｃは発現しないと考えられていた。

【0012】

しかし、正常な細胞とは異なる癌細胞の代謝が原因で、経口摂取した赤身肉などからＮｅｕ５Ｇｃが代謝的に取り込まれて、ヒトの癌細胞にＮｅｕ５Ｇｃ－Ｔｎが発現することが示唆された（非特許文献５，６）。したがって、ヒトにおいてＮｅｕ５Ｇｃ－Ｔｎ抗原は、より癌特異性の高い抗原であると考えられる。

【0013】

そこで、Ｎ－グリコリルシアリルＴｎ抗原糖鎖（Ｎｅｕ５Ｇｃα２－６ＧａｌＮＡｃα－）を化学合成し、スペーサーを介して独自のリンカー化合物と複合化後、金ナノ粒子を化学修飾した光ファイバーの先端に固定化して、ファイバー型シュガーチップを作製し、そのシュガーチップを用いてヒトＢ細胞から調製した遺伝子をＭ１３ファージに導入したファージライブラリー（多様性：１ｘ１０^８）をスクリーニングしたところ、多数のｓｃＦｖ提示ファージが選別できた。

【0014】

先行研究において、大腸菌の蛋白質発現系を用いてファージミドからｓｃＦｖを調製すると、約１ヶ月後には、細胞への結合性を観察できなくなり、構造安定性に欠けることが課題であった。そこで、ｓｃＦｖの安定性を改善するために、ｐＥＴ発現システムを用いた遺伝子組み換えにより、エピトープタグの一部であるＭｙｃエピトープタグの一部を除去した可溶性のｓｃＦｖを調製した。

【0015】

この方法を、上記、段落番号００１３で選別したｓｃＦｖ提示ファージに応用して、Ｎ－グリコリルシアリルＴｎ抗原糖鎖やＮ－アセチルシアリルＴｎ抗原糖鎖に強く結合する可溶性のｓｃＦｖを９種類得ることに成功した。

【0016】

皮膚Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞型リンパ腫、ホジキンリンパ腫または、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫といった膜蛋白質ＣＣＲ４のｍＲＮＡを産生する悪性腫瘍に対する免疫細胞療法として、抗ＣＣＲ４一本鎖抗体をキメラ抗原受容体（以下「ＣＡＲ」という）の一部として担持させたＴ細胞（以下「ＣＡＲ－Ｔ」という）が報告されている（特許文献５）。また、血液悪性腫瘍に対するＣＡＲの構成およびその使用方法として、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、およびＣＤ５２抗原に対する抗原認識ドメインを有するキメラ抗原レセプターポリペプチドを担持させたＣＡＲ－Ｔ細胞およびＣＡＲ－ナチュラルキラー（以下「ＮＫ」という）細胞が報告されている（特許文献６）。

【0017】

日本では、２０１９年にＣＡＲ－Ｔ細胞療法が臨床承認され、再発又は難治性Ｂ細胞性
急性リンパ芽球性白血病を対象とした治療が行われている。

【0018】

しかし、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法では、Ｔ細胞の活性化に伴うサイトカイン放出症候群や、異なるドナー由来のＴ細胞を用いた場合に移植対片宿主病を引き起こすことが課題である（非特許文献７、非特許文献８）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0019】

【特許文献1】特許第４８０２３０９号

【特許文献2】特許第５２７８９９２号

【特許文献3】特開２０１４－１００１１６号公報

【特許文献4】特開２０１９－１９９４７２号公報

【特許文献5】特表２０１９－５３６４６９号公報

【特許文献6】特開２０２１－７８５１４号公報

【非特許文献】

【0020】

【非特許文献1】Ｗａｋａｏ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ．１８：２４９９－２５０４（２００８）

【非特許文献2】Ｗａｋａｏ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１７：１０８６－１０９１（２０１７）

【非特許文献3】最新 臨床検査項目辞典、監修：櫻林郁之介・熊坂一成、医歯薬出版株式会社、２００８

【非特許文献4】Ｒｏｌａｎｄ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ． Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． （１９８２） ４０， １３１－２３４．

【非特許文献5】Ｖｅｒｅｄ Ｐ． Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． （２０１１） ７１（９）， ３３５２－３３６３］）

【非特許文献6】［Ａｎｎｉｅ Ｎ． Ｓ．， ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ． Ｏｎｃｏｌ． （２０１４） ４（３３） １－１３

【非特許文献7】Ｋａｔｓｕｙａ Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１２６：２５７０－２５７７（２０１５）

【非特許文献8】Ｏｅｌｓｎｅｒ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ． １９：２３５－２４９（２０１７）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0021】

上記のような状況にあって、本発明の一実施形態は、シアリルＴｎ抗原糖鎖発現癌細胞に対する優れた特異性を有し、かつ、安全性の高い免疫細胞を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0022】

免疫細胞の一種であるＮＫ細胞は、Ｔ細胞と異なり、活性化に伴う炎症性サイトカインの放出がほぼなく、炎症性サイトカインによって起こるサイトカイン放出症候群を引き起こしにくい。また、異なるドナー由来のＮＫ細胞またはＮＫ細胞に由来する細胞株を治療時に摂取した場合であっても、移植対片宿主病を引き起こさない。そのため、ＣＡＲを導入したＮＫ（以下「ＣＡＲ－ＮＫ」という。）細胞を用いれば、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法で問題となるサイトカイン放出症候群といった副反応を誘発せずに、安全性の高い免疫細胞療法を提供することが期待できる。

【0023】

したがって、本発明の一実施形態は、シアリルＴｎ抗原糖鎖発現癌細胞に特異的に結合する一本鎖抗体を抗原認識部位として導入したキメラ抗原受容体および当該キメラ抗原受容体を含むナチュラルキラー細胞に関する。

【0024】

また、本発明の一実施形態は、配列番号１０、１１または１２として示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、キメラ抗原受容体に関する。

【発明の効果】

【0025】

本発明の一実施形態に係るＣＡＲ－ＮＫ細胞によれば、（Ｉ）シアリルＴｎ抗原糖鎖発現癌細胞に特異的に結合する一本鎖抗体を抗原認識部位として導入したＣＡＲを含むため、該癌細胞に対する優れた特異性を有し、かつ、（ＩＩ）前記ＣＡＲが、ＮＫ細胞に導入されているため、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法で問題となる、移植対片宿主病、および、サイトカイン放出症候群といった、臓器不全や死に至ることもある副反応を誘発せずに、直接腫瘍細胞を排除できる、安全性が高いＣＡＲ－ＮＫ細胞を提供できる。このような特異性および安全性に優れる免疫細胞である、本発明の一実施形態に係るＣＡＲ－ＮＫ細胞は、癌の免疫細胞療法に好適に利用できると期待できる。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】ＮＫ－９２ ＭＩ細胞に導入するＣＡＲ遺伝子の概略図の１つ（例として、ｓｃＦｖとしてＳＧＴＮ１－１０－３５を用いた場合を記載）である（ＳＦＦＶ： ｓｐｌｅｅｎ ｆｏｃｕｓ－ｆｏｒｍｉｎｇ ｖｉｒｕｓ由来プロモーター領域、 ＳＰ： ＣＤ８－ｌｅａｄｅｒ シグナルペプチド、ＳＧＴＮ１－１０－３５： ｓｃＦｖ、 Ｌ： リンカー部、 Ｍ： Ｍｙｃ－ｔａｇ、 ＣＤ２８ｈ： ヒンジ領域、ＣＤ２８ ＴＭ： 膜貫通蛋白質ドメイン、４－１ＢＢ： 細胞内蛋白質ドメイン、ＣＤ３ζ： Ｔ細胞受容体ドメイン、ＣＭＶ： Ｃｙｔｏｍｅｇａｒｏｖｉｒｕｓ由来プロモーター領域、ＥＧＦＰ： 蛍光性蛋白質）。

【図2】ＮＫ－９２ ＭＩ細胞に導入する９種のＣＡＲ蛋白質の概略図である（例として、ｓｃＦｖとしてＳＧＴＮ１－１０－３５を用いた場合を記載）。

【図3】可溶性蛋白質として製造したｓｃＦｖ（ｐ－ＳＧＴＮ１－１０－３５など９種の蛋白質）の、ファイバー型シュガーチップ４種（それぞれ、糖鎖としてＮｅｕ５Ｇｃ－Ｔｎ抗原糖鎖、Ｎｅｕ５Ａｃ－Ｔｎ抗原糖鎖、Ｎｅｕ５Ａｃα２－６Ｇａｌ－、βＧａｌＮＡｃ－を固定化）を用いた糖鎖結合解析の結果である。

【図4】可溶性蛋白質として製造したｓｃＦｖ（ｐ－ＳＧＴＮ１－１０－３５、ｐ－ＳＧＴＮ１－１０－７７、ｐ－ＳＧＴＮ１－１０－８９）のＨｅｐＧ２およびＰＡＮＣ－１細胞の細胞膜蛋白質に対する結合活性を示した図である。

【図5】ＳＧＴＮ１－１０－３５，ＳＧＴＮ１－１０－７７，ＳＧＴＮ１－１０－８９をｓｃＦｖ部位として組み込んだＣＡＲ－コンストラクトを２９３Ｔ細胞へコトランスフェクションしたときの細胞と細胞上清の緑色蛍光の有無をまとめた表である。

【図6】ＳＧＴＮ１－１０－８９をｓｃＦｖ部位として組み込んだＣＡＲ－コンストラクトをＮＫ－９２ ＭＩ細胞にトランスフェクションしたＣＡＲ－ＮＫ－９２ ＭＩ細胞およびＮＫ－９２ ＭＩ細胞のＨｅｐＧ２細胞に対する細胞障害活性を示した図である。

【発明を実施するための形態】

【0027】

発明の一実施形態に係るＮＫ細胞（以下、「本ＮＫ細胞」という）は、シアリルＴｎ抗原糖鎖発現癌細胞に特異的に結合するｓｃＦｖを抗原認識部位として有する）ＣＡＲを含む、ＮＫ細胞である。本ＮＫ細胞は、ＣＡＲを導入したＮＫ細胞（ＣＡＲ－ＮＫ）であるとも言える。

【0028】

ＣＡＲは、抗原を特異的に認識する抗体の抗原認識部位とＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の細胞内ドメインから構成され、抗原の認識により、強力な免疫応答を誘導するため、免疫細胞療法に導入されている。

【0029】

本ＮＫ細胞は、上記のように、シアリルＴｎ抗原糖鎖発現癌細胞に特異的に結合するｓｃＦｖを抗原認識部位として導入したＣＡＲを含むため、シアリルＴｎ抗原糖鎖発現癌細胞に対して、特異的かつ強力な免疫応答が誘導される。その結果、本ＮＫ細胞は、癌細胞に対して強い細胞傷害性を発揮できるため、癌の免疫細胞療法に好適に利用できると期待できる。

【0030】

本ＮＫ細胞が含むＣＡＲを構成するｓｃＦｖは、シアリルＴｎ抗原糖鎖発現細胞に特異的に結合できる限り特に限定されないが、癌細胞に対する特異性に優れ、健常細胞に対する細胞障害性が低いことから、シアリルＴｎ抗原糖鎖発現細胞の細胞表層糖鎖に特異的に結合するｓｃＦｖであることが好ましい。好ましくは、本ＮＫ細胞が含むＣＡＲを構成するｓｃＦｖは、シアリルＴｎ抗原糖鎖に特異的に結合する。

【0031】

シアリルＴｎ抗原糖鎖発現細胞の細胞表層糖鎖に特異的に結合するｓｃＦｖとしては、本発明者らが開発した、シアリルＴｎ抗原の糖鎖に特異的に結合する（抗原とする）ｓｃＦｖを好適に利用することができる。より具体的に、本ＮＫ細胞が含むＣＡＲに導入されるｓｃＦｖは、以下のいずれかであることが好ましい：
（１）配列番号１から９に示されるアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ。
（２）配列番号１から９に示されるアミノ酸配列から１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつシアリルＴｎ抗原糖鎖発現細胞表層の糖鎖に特異的に結合するｓｃＦｖ。
（３）配列番号１から９に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＡＴＬ細胞表層の糖鎖に特異的に結合するｓｃＦｖ。
（４）配列番号１から９に示される塩基配列にコードされるｓｃＦｖ。
（５）配列番号１から９に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされるｓｃＦｖであって、かつシアリルＴｎ抗原糖鎖発現細胞表層の糖鎖に特異的に結合するｓｃＦｖ。
（６）配列番号１から９に示される塩基配列と９０％以上の同一性を有するポリヌクレオチドにコードされるｓｃＦｖであって、かつシアリルＴｎ抗原糖鎖発現細胞表層の糖鎖に特異的に結合するｓｃＦｖ。
（７）配列番号１から９に示される塩基配列において、１または複数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列にコードされるｓｃＦｖであって、かつシアリルＴｎ抗原糖鎖発現細胞表層の糖鎖に特異的に結合するｓｃＦｖ。

【0032】

（１）に関して、配列番号１から９で示されるアミノ酸配列は、本発明者らによって特定後、一部改変された、シアリルＴｎ抗原糖鎖に特異的に結合する９種類のｓｃＦｖのアミノ酸配列である。配列番号１はＳＧＴＮ１－１０－３５のアミノ酸配列に、配列番号２はＳＧＴＮ１－１０－７７のアミノ酸配列に、配列番号３はＳＧＴＮ１－１０－８９のアミノ酸配列に、配列番号４はＳＧＴＮ１－３－８のアミノ酸配列に、配列番号５はＳＧＴＮ１－３－２８のアミノ酸配列に、配列番号６はＳＧＴＮ１－３－５５のアミノ酸配列に、配列番号７はＳＧＴＮ１－３－７２のアミノ酸配列に、配列番号８はＳＧＴＮ１－３－７７のアミノ酸配列に、配列番号９はＳＧＴＮ１－３－９２のアミノ酸配列に、それぞれ対応する。

【0033】

前記（２）に関して、アミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加される数の上限は、例えば、２５個、２０個、１５個、１０個、５個、３個、２個または１個でありうる。

【0034】

前記（３）に関して、アミノ酸配列の同一性は、例えば、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％である。なお、アミノ酸配列の同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴＸを利用して決定することができる。

【0035】

前記（５）に関して、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」とは、６×ＳＳＣの塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、５０～６０℃にて１６時間ハイブリダイゼーションを行い、０．１×ＳＳＣの塩濃度の溶液中で洗浄した後に、ハイブリダイズする条件を言う。

【0036】

前記（６）に関して、塩基配列の同一性は、例えば、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または１００％である。

【0037】

前記（７）に関して、塩基が置換、欠失、挿入および／または付加される数の上限は、例えば、７５個、５０個、３７個、２５個、１５個、１０個、８個、５個、３個、２個または１個でありうる。

【0038】

本発明の一実施形態において、シアリルＴｎ抗原糖鎖発現細胞特異的な結合性を有するｓｃＦｖを抗原認識部位に有するＣＡＲを導入するＮＫ細胞としては、特に限定されず、患者由来ＮＫ細胞、または、ＮＫ細胞の細胞株である、ＮＫ－９２ ＭＩ細胞、ＮＫ－９２細胞、もしくは、ＫＨＹＧ－１細胞などにも導入可能である。中でも、安定して安価に培養が可能であることから、ＮＫ細胞としては、細胞株を使用することが好ましい。

【0039】

本発明の一実施形態において、ＣＡＲ遺伝子をＮＫ細胞に導入する方法は特に限定されないが、例えば、非増殖性ウイルスベクター（レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクターなど）、増殖性ウイルスベクター（腫瘍溶解性ウイルスベクターなど）、非ウイルスベクター（プラスミド、Ｎａｋｅｄ ＤＮＡを内包するリポソームなど）、または、バクテリアベクター等のＣＡＲ遺伝子を有する各種のベクターを用いて導入することができる。

【0040】

以下、本発明の一実施形態に係るＣＡＲ（「本ＣＡＲ」ともいう）および本ＮＫ細胞の一例について、図１および図２を用いてより具体的に説明するが、本ＣＡＲおよび本ＮＫ細胞は、係る態様に限定されるものではない。

【0041】

図１は、設計した、ＣＡＲコンストラクト遺伝子の概略図を、ｓｃＦｖがＳＧＴＮ１－１０－３５である場合について示すものであり、図２は発現するＣＡＲ蛋白質の概略図である。

【0042】

設計したＣＡＲコンストラクトは、イムノグロブリン重鎖シグナルペプチド－抗原認識部位（ｓｃＦｖ）－リンカー部－ヒンジ領域－膜貫通蛋白質ドメイン－細胞内蛋白質ドメイン－Ｔ細胞受容体ドメインから構成される。イムノグロブリン重鎖シグナルペプチドは、細胞内で発現したＣＡＲを細胞表層に輸送するシグナルペプチドであり、例えば、ＣＤ８－ｌｅａｄｅｒ蛋白質を用いることができる。

【0043】

抗原認識部位には、シアリルＴｎ抗原糖鎖発現細胞に特異的に結合する一本鎖抗体を、好ましくは、本発明者らが開発した、Ｎ－グリコリルシアリルＴｎ抗原糖鎖を抗原とするｓｃＦｖ（ＳＧＴＮ１－１０－３５（配列番号１）、ＳＧＴＮ１－１０－７７（配列番号２）、ＳＧＴＮ１－１０－８９（配列番号３）、ＳＧＴＮ１－３－８（配列番号４）、ＳＧＴＮ１－３－２８（配列番号５）、ＳＧＴＮ１－３－５５（配列番号６）、ＳＧＴＮ１－３－７２（配列番号７）、ＳＧＴＮ１－３－７７（配列番号８）、ＳＧＴＮ１－３－９２（配列番号９））の一部を用いることができる。また、このｓｃＦｖ領域には、ＣＡＲの検出を容易にするため、エピトープタグの一つであるＭｙｃ－ｔａｇを連結させてもよい。

【0044】

ＭＡＱＶＱＬＶＱＳＧＶＥＶＫＫＡＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＳＦＴＳＨＷＩＧＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＩＭＨＰＲＤＳＤＴＩＹＳＰＳＦＱＧＱＶＳＩＳＡＤＫＳＩＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＲＬＹＷＹＧＳＧＫＲＦＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＳＴＧＳＮＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＥＳＩＧＤＹＬＮＷＹＱＱＲＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＧＡＳＶＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＴＮＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＴＳＩＴＰＰＹＴＦＧＰＲＴＫＶＤＩＫＡＡＡＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号１）

【0045】

ＭＡＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＷＩＮＡＧＮＧＮＴＫＹＳＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＲＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＨＬＧＡＡＡＧＥＮＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＳＴＧＳＡＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＳＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＡＤＦＧＴＥＦＴＬＴＩＳＧＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＬＳＴＦＰＦＴＦＧＰＧＴＫＶＤＩＫＡＡＡＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号２）

【0046】

ＭＡＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＲＹＰＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＳＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＭＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＤＬＦＱＧＬＰＹＦＨＹＹＧＭＤＶＷＧＰＧＴＭＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＳＴＧＳＤＩＱＬＴＱＳＰＳＴＬＳＧＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＶＬＩＹＫＡＳＴＬＥＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＮＳＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＡＡＡＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号３）

【0047】

ＭＡＥＶＱＬＬＥＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＱＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＡＬＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＷＧＳＧＧＭＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＳＴＧＳＡＩＱＭＴＱＳＰＳＹＶＳＡＳＶＧＤＳＶＴＩＴＣＲＡＲＱＤＩＫＮＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＶＱＩＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＧＮＮＦＰＹＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫＡＡＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号４）

【0048】

ＭＡＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＩＩＮＰＳＧＧＳＴＳＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＧＡＦＷＳＧＹＭＤＶＷＧＫＧＴＭＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＳＴＧＳＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＶＳＳＲＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＹＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＡＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＡＮＳＦＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＤＩＫＡＡＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号５）

【0049】

ＭＡＱＭＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＧＮＳＥＷＤＦＤＬＷＧＲＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＳＴＧＳＥＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＶＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＩＮＮＮＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＴＲＡＳＳＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＶＳＳＬＱＳＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＮＮＷＰＰＲＦＴＦＧＰＧＴＫＶＤＩＫＡＡＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号６）

【0050】

ＭＡＱＬＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＳＳＤＧＹＹＷＳＷＩＲＱＨＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＹＹＳＧＮＴＹＹＮＰＳＬＲＳＲＶＳＭＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＮＳＶＴＤＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＩＹＬＤＰＥＹＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＳＴＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＡＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＧＴＹＹＣＱＱＡＮＧＦＰＲＧＬＡＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＡＡＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号７）

【0051】

ＭＡＱＭＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＡＹＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＤＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＡＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＤＤＳＤＶＹＹＣＡＫＩＲＳＲＮＦＮＤＡＧＧＡＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＳＴＧＳＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＤＲＡＡＬＳＣＲＡＳＱＳＶＲＮＮＹＶＡＷＹＱＲＫＰＧＲＡＰＸＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＡＴＳＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＡＡＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号８）

【0052】

ＭＡＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＲＹＰＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＳＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＭＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＤＬＦＱＧＬＰＹＦＨＹＹＧＭＤＶＷＧＰＧＴＭＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＳＴＧＳＤＩＱＬＴＱＳＰＳＴＬＳＧＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＶＬＩＹＫＡＳＴＬＥＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＮＳＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＡＡＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号９）

【0053】

ヒンジ領域、膜貫通蛋白質ドメインにはＣＤ２８蛋白質を用いることができ、膜貫通蛋白質ドメインには４－１ＢＢシグナル伝達蛋白質を用いることができる。また、Ｔ細胞受容体ドメインには、ＣＤ３ζ蛋白質を用いることができる。また、設計したＣＡＲは、ＳＦＦＶ（ｓｐｌｅｅｎ ｆｏｃｕｓ－ｆｏｒｍｉｎｇ ｖｉｒｕｓ）プロモーターを転写開始領域にもつ。

【0054】

本発明の一実施形態に係るキメラ抗原受容体としては、以下の配列番号１０、１１または１２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むキメラ抗原受容体を好適に使用することができる。すなわち、本発明の一実施形態において、以下の配列番号１０、１１または１２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むキメラ抗原受容体を提供する。

【0055】

ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＧＳＭＡＱＶＱＬＶＱＳＧＶＥＶＫＫＡＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＳＦＴＳＨＷＩＧＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＩＭＨＰＲＤＳＤＴＩＹＳＰＳＦＱＧＱＶＳＩＳＡＤＫＳＩＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＲＬＹＷＹＧＳＧＫＲＦＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＳＴＧＳＮＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＥＳＩＧＤＹＬＮＷＹＱＱＲＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＧＡＳＶＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＴＮＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＴＳＩＴＰＰＹＴＦＧＰＲＴＫＶＤＩＫＡＡＡＴＧＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号１０）

【0056】

（ａ）１～２１位の配列は、イムノグロブリン重鎖シグナルペプチドである、ＣＤ８－Ｌｅａｄｅｒのアミノ酸配列に対応し、２２～２３位の配列はリンカー部に対応し、（ｂ）２４～２７０位の配列は、シアリルＴｎ抗原糖鎖に特異的な結合性を有するｓｃＦｖ（ＳＧＴＮ１－１０－３５）のアミノ酸配列に対応し、２７１～２７５位の配列はリンカー部に対応し、２７６～２８５位の配列は、Ｍｙｃ－ｔａｇのアミノ酸配列に対応し、（ｃ）２８６～３２５位の配列は、ＣＤ２８由来のヒンジのアミノ酸配列に、３２６～３５２位の配列は、ＣＤ２８由来膜貫通蛋白質ドメインのアミノ酸配列にそれぞれ対応し、（ｄ）３５３～３９４位の配列は、４－１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列に対応し、（ｅ）３９５～５０５位の配列は、ＣＤ３ζ Ｔ細胞受容体ドメインのアミノ酸配列に対応する。

【0057】

ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＧＳＭＡＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＷＩＮＡＧＮＧＮＴＫＹＳＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＲＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＨＬＧＡＡＡＧＥＮＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＳＴＧＳＡＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＳＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＡＤＦＧＴＥＦＴＬＴＩＳＧＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＬＳＴＦＰＦＴＦＧＰＧＴＫＶＤＩＫＡＡＡＴＧＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号１１）。

【0058】

配列番号１１で示される配列中、（ａ）１～２１位の配列は、イムノグロブリン重鎖シグナルペプチドである、ＣＤ８－Ｌｅａｄｅｒのアミノ酸配列に対応し、２２～２３位の配列はリンカー部に対応し、（ｂ）２４～２６８位の配列は、シアリルＴｎ抗原糖鎖に特異的な結合性を有するｓｃＦｖ（ＳＧＴＮ１－１０－７７）のアミノ酸配列に対応し、２６９～２７３位の配列はリンカー部に対応し、２７４～２８３位の配列は、Ｍｙｃ－ｔａｇのアミノ酸配列に対応し、（ｃ）２８４～３２３位の配列は、ＣＤ２８由来のヒンジのアミノ酸配列に、３２４～３５０位の配列は、ＣＤ２８由来膜貫通蛋白質ドメインのアミノ酸配列にそれぞれ対応し、（ｄ）３５１～３９２位の配列は、４－１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列に対応し、（ｅ）３９３～５０３位の配列は、ＣＤ３ζ Ｔ細胞受容体ドメインのアミノ酸配列に対応する。

【0059】

ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＧＳＭＡＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＲＹＰＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＳＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＭＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＤＬＦＱＧＬＰＹＦＨＹＹＧＭＤＶＷＧＰＧＴＭＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＳＴＧＳＤＩＱＬＴＱＳＰＳＴＬＳＧＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＶＬＩＹＫＡＳＴＬＥＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＮＳＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＡＡＡＴＧＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号１２）。

【0060】

配列番号１２で示される配列中、（ａ）１～２１位の配列は、イムノグロブリン重鎖シグナルペプチドである、ＣＤ８－Ｌｅａｄｅｒのアミノ酸配列に対応し、２２～２３位の配列はリンカー部に対応し、（ｂ）２４～２７２位の配列は、シアリルＴｎ抗原糖鎖に特異的な結合性を有するｓｃＦｖ（ＳＧＴＮ１－１０－８９）のアミノ酸配列に対応し、２７３～２７７位の配列はリンカー部に対応し、２７８～２８７位の配列は、Ｍｙｃ－ｔａｇのアミノ酸配列に対応し、（ｃ）２８８～３２７位の配列は、ＣＤ２８由来のヒンジのアミノ酸配列に、３２８～３５４位の配列は、ＣＤ２８由来膜貫通蛋白質ドメインのアミノ酸配列にそれぞれ対応し、（ｄ）３５５～３９６位の配列は、４－１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列に対応し、（ｅ）３９７～５０７位の配列は、ＣＤ３ζ Ｔ細胞受容体ドメインのアミノ酸配列に対応する。

【0061】

本発明の一実施形態に係るキメラ抗原受容体としては、以下の配列番号１０、１１または１２に示される塩基配列によりコードされるポリペプチドを含むキメラ抗原受容体を好適に使用することができる。すなわち、本発明の一実施形態において、本キメラ抗原受容体をコードする、以下の配列番号１３、１４または１５に示される塩基配列を有する核酸コンストラクトを提供する。核酸コンストラクトとしては、タンパク質発現に用いられるものであればよく、ＤＮＡまたはＲＮＡが含まれる。

【0062】

ＡＴＧＧＣＣＴＴＡＣＣＡＧＴＧＡＣＣＧＣＣＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＧＣＣＴＴＧＣＴＧＣＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＡＧＧＣＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＴＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＴＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＡＡＧＧＣＣＧＧＧＧＡＧＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡＴＣＴＣＴＴＧＴＡＡＧＧＧＴＴＣＴＧＧＡＴＡＣＡＧＣＴＴＴＡＣＴＡＧＣＣＡＣＴＧＧＡＴＣＧＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＣＣＡＧＡＴＧＣＣＣＧＧＧＡＡＡＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＧＡＴＣＡＴＧＣＡＴＣＣＴＣＧＴＧＡＣＴＣＴＧＡＴＡＣＣＡＴＡＴＡＣＡＧＴＣＣＧＴＣＣＴＴＣＣＡＡＧＧＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＡＴＴＴＣＡＧＣＣＧＡＣＡＡＧＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＣＴＧＣＡＡＴＧＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＧＣＣＴＣＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＡＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＣＴＡＴＡＴＴＧＧＴＡＴＧＧＴＴＣＧＧＧＧＡＡＧＡＧＧＴＴＣＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴＴＣＡＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＧＴＣＧＡＣＧＧＧＡＴＣＧＡＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＧＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＴＣＧＧＧＣＡＡＧＴＧＡＧＡＧＣＡＴＴＧＧＣＧＡＣＴＡＣＴＴＡＡＡＴＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＧＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＧＴＧＣＡＴＣＣＧＴＴＴＴＧＣＡＡＡＧＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＡＴＣＴＴＣＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＧＡＣＴＴＣＣＡＴＴＡＣＣＣＣＣＣＣＧＴＡＣＡＣＴＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＡＡＡＧＴＧＧＡＴＡＴＣＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＣＣＧＧＴＧＡＡＣＡＡＡＡＡＣＴＣＡＴＣＴＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＴＣＴＧＡＴＴＧＡＡＧＴＴＡＴＧＴＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＡＣＣＴＡＧＡＣＡＴＧＡＧＡＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＡＡＣＣＡＴＴＡＴＣＣＡＧＴＧＡＡＡＧＧＧＡＡＡＣＡＣＣＴＴＴＧＴＣＣＡＡＧＴＣＣＣＴＡＴＴＴＣＣＣＧＧＡＣＣＴＴＣＴＡＧＣＣＴＴＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＴＧＧＣＴＴＧＣＴＡＴＡＧＣＴＴＧＣＴＡＧＴＡＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＡＡＡＣＧＧＧＧＣＡＧＡＡＡＧＡＡＡＣＴＣＣＴＧＴＡＴＡＴＡＴＴＣＡＡＡＣＡＡＣＣＡＴＴＴＡＴＧＡＧＡＣＣＡＧＴＡＣＡＡＡＣＴＡＣＴＣＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＴＧＴＡＧＣＴＧＣＣＧＡＴＴＴＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＴＧＴＧＡＡＣＴＧＡＧＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＧＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＣＴＡＴＡＡＣＧＡＧＣＴＣＡＡＴＣＴＡＧＧＡＣＧＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＴＧＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＣＧＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＧＧＧＡＡＡＧＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＴＡＡＧＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＴＧＡＧＡＴＴＧＧＧＡＴＧＡＡＡＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＧＡＧＧＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＡＣＧＡＴＧＧＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＧＧＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＣＴＴＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＣＧＣＴＡＡ（配列番号１３）。

【0063】

配列番号１３で示される配列中、（ａ’）１～６３位の配列は、ＣＤ８－Ｌｅａｄｅｒを含むアミノ酸配列をコードする塩基配列に、６４～６９位の配列は、リンカーのアミノ酸配列をコードする塩基配列にそれぞれ対応し、（ｂ’）７０～８１０位の配列は、シアリルＴｎ抗原糖鎖に特異的な結合性を有するｓｃＦｖ（ＳＧＴＮ１－１０－３５）に含まれるアミノ酸配列をコードする塩基配列に、８１１～８２５位の配列はリンカー部に対応し、８２６～８５５位の配列は、Ｍｙｃ－ｔａｇを含むアミノ酸配列をコードする塩基配列にそれぞれ対応し、（ｃ’）８５６～９７５位の配列は、ＣＤ２８由来ヒンジのアミノ酸配列をコードする塩基配列に、９７６～１０５６位の配列は、ＣＤ２８由来膜貫通蛋白質ドメインのアミノ酸配列をコードする塩基配列にそれぞれ対応し、（ｄ’）１０５７～１１８２位の配列は、４－１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列をコードする塩基配列に対応し、（ｅ’）１１８３～１５１５位の配列は、ＣＤ３ζ Ｔ細胞受容体ドメインのアミノ酸配列をコードする塩基配列に対応する。

【0064】

ＡＴＧＧＣＣＴＴＡＣＣＡＧＴＧＡＣＣＧＣＣＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＧＣＣＴＴＧＣＴＧＣＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＡＧＧＣＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＴＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＴＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＴＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＴＡＧＣＴＡＴＧＣＴＡＴＧＣＡＴＴＧＧＧＴＧＣＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＣＧＧＡＣＡＡＡＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＴＣＡＡＣＧＣＴＧＧＣＡＡＴＧＧＴＡＡＣＡＣＡＡＡＡＴＡＴＴＣＡＣＡＧＡＡＧＴＴＣＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＴＡＣＣＡＧＧＧＡＣＡＣＡＴＣＣＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＡＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＧＣＣＡＴＴＴＡＧＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＴＧＧＣＧＡＧＡＡＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴＴＣＡＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＧＴＣＧＡＣＧＧＧＡＴＣＧＧＣＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＴＴＣＣＧＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＴＣＧＧＧＣＧＡＧＴＣＡＧＧＧＴＡＴＴＡＧＣＡＧＣＴＧＧＴＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＣＴＧＣＡＴＣＣＡＧＴＴＴＧＣＡＡＡＧＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＡＴＴＣＡＧＣＧＧＣＧＣＴＧＡＴＴＴＴＧＧＧＡＣＡＧＡＡＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＧＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＧＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＡＴＴＧＡＧＴＡＣＴＴＴＣＣＣＡＴＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＡＧＴＧＧＡＴＡＴＣＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＣＣＧＧＴＧＡＡＣＡＡＡＡＡＣＴＣＡＴＣＴＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＴＣＴＧＡＴＴＧＡＡＧＴＴＡＴＧＴＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＡＣＣＴＡＧＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＡＡＣＣＡＴＴＡＴＣＣＡＴＴＧＡＡＡＧＧＧＡＡＡＣＡＣＣＴＴＴＧＴＣＣＡＡＧＴＣＣＣＣＴＡＴＴＴＣＣＣＧＧＡＣＣＴＴＣＴＡＡＧＣＣＣＴＴＴＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＴＧＧＣＴＴＧＣＴＡＴＡＧＣＴＴＧＣＴＡＧＴＡＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＡＡＡＣＧＧＧＧＣＡＧＡＡＡＧＡＡＡＣＴＣＣＴＧＴＡＴＡＴＡＴＴＣＡＡＡＣＡＡＣＣＡＴＴＴＡＴＧＡＧＡＣＣＡＧＴＡＣＡＡＡＣＴＡＣＴＣＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＴＧＴＡＧＣＴＧＣＣＧＡＴＴＴＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＴＧＴＧＡＡＣＴＧＡＧＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＧＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＣＴＡＴＡＡＣＧＡＧＣＴＣＡＡＴＣＴＡＧＧＡＣＧＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＴＧＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＣＧＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＧＧＧＡＡＡＧＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＴＡＡＧＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＴＧＡＧＡＴＴＧＧＧＡＴＧＡＡＡＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＧＡＧＧＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＡＣＧＡＴＧＧＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＧＧＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＣＴＴＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＣＧＣＴＡＡ（配列番号１４）。

【0065】

配列番号１４で示される配列中、（ａ’）１～６３位の配列は、ＣＤ８－Ｌｅａｄｅｒを含むアミノ酸配列をコードする塩基配列に、６４～６９位の配列は、リンカーのアミノ酸配列をコードする塩基配列にそれぞれ対応し、（ｂ’）７０～８０４位の配列は、シアリルＴｎ抗原糖鎖に特異的な結合性を有するｓｃＦｖ（ＳＧＴＮ１－１０－７７）に含まれるアミノ酸配列をコードする塩基配列に、８０５～８１９位の配列はリンカー部に対応し、８２０～８４９位の配列は、Ｍｙｃ－ｔａｇを含むアミノ酸配列をコードする塩基配列にそれぞれ対応し、（ｃ’）８５０～９６９位の配列は、ＣＤ２８由来ヒンジのアミノ酸配列をコードする塩基配列に、９７０～１０５０位の配列は、ＣＤ２８由来膜貫通蛋白質ドメインのアミノ酸配列をコードする塩基配列にそれぞれ対応し、（ｄ’）１０５１～１１７６位の配列は、４－１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列をコードする塩基配列に対応し、（ｅ’）１１７７～１５０９位の配列は、ＣＤ３ζ Ｔ細胞受容体ドメインのアミノ酸配列をコードする塩基配列に対応する。

【0066】

ＡＴＧＧＣＣＴＴＡＣＣＡＧＴＧＡＣＣＧＣＣＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＧＣＣＴＴＧＣＴＧＣＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＡＧＧＣＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＣＡＧＧＴＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＡＴＧＡＴＴＡＴＧＣＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＧＣＡＡＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＧＴＡＴＴＡＧＴＴＧＧＡＡＴＧＧＴＧＧＴＡＡＣＡＴＡＧＡＣＴＡＴＧＣＧＧＡＣＴＣＴＧＴＧＡＧＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＴＣＣＣＴＣＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＧＡＣＡＧＴＣＴＧＡＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＴＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＡＡＧＣＣＣＣＣＧＧＡＡＴＧＣＴＴＡＴＣＴＡＣＴＡＣＴＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＣＧＴＣＴＧＧＧＧＣＡＡＡＧＧＧＡＣＡＡＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＴＴＣＡＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴＴＣＡＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＧＣＡＧＣＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＣＣＣＣＴＣＧＧＴＧＴＣＡＧＴＧＴＣＣＣＣＡＧＧＡＣＡＧＡＣＧＧＣＣＡＧＧＡＴＣＡＣＣＴＧＣＴＣＴＧＧＡＧＡＴＣＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＴＡＴＧＴＴＴＡＴＴＧＧＴＡＣＣＡＡＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＴＴＴＴＡＣＴＡＡＴＡＴＡＴＡＡＧＧＡＴＡＴＴＧＡＧＡＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴＧＡＧＣＧＡＴＴＣＴＣＣＧＧＣＴＣＣＡＣＴＴＣＡＧＧＧＡＣＡＡＣＡＧＴＣＡＣＧＴＴＧＡＣＣＡＴＣＡＡＴＧＧＡＧＴＣＣＡＧＧＣＧＧＡＡＧＡＣＧＡＧＧＣＴＧＡＣＴＡＴＴＣＣＴＧＴＣＡＡＴＣＡＧＣＧＧＡＣＡＧＴＡＴＡＡＡＣＴＴＡＴＣＣＧＧＴＧＴＴＣＧＧＣＧＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＡＧＧＴＧＣＧＧＣＧＣＡＧＧＣＧＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＡＣＡＡＡＡＡＣＴＣＡＴＣＴＣＡＧＡＧＡＧＧＡＴＣＴＧＡＴＴＧＡＡＧＴＡＴＧＴＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＡＣＣＴＡＧＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＡＡＣＣＡＴＴＡＴＣＣＡＴＧＴＧＡＡＡＧＧＧＡＡＡＣＡＣＣＴＴＴＧＴＣＣＡＡＧＴＣＣＣＣＴＡＴＴＴＣＣＣＧＧＡＣＣＴＴＣＴＡＡＧＣＣＣＴＴＴＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＴＧＧＣＴＴＧＣＴＡＴＡＧＣＴＴＧＣＴＡＧＴＡＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＡＡＡＣＧＧＧＧＣＡＧＡＡＡＧＡＡＡＣＴＣＣＴＧＴＡＴＡＴＡＴＴＣＡＡＡＣＡＡＣＣＡＴＴＴＡＴＧＡＧＡＣＣＡＧＴＡＣＡＡＡＣＴＡＣＴＣＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＴＧＴＡＧＣＴＧＣＣＧＡＴＴＴＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＴＧＴＧＡＡＣＴＧＡＧＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＧＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＣＴＡＴＡＡＣＧＡＧＣＴＣＡＡＴＣＴＡＧＧＡＣＧＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＴＧＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＣＧＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＧＧＧＡＡＡＧＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＴＡＡＧＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＴＧＡＧＡＴＴＧＧＧＡＴＧＡＡＡＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＧＡＧＧＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＡＣＧＡＴＧＧＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＧＧＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＣＴＴＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＣＧＣＴＡＡ（配列番号１５）。

【0067】

配列番号１５で示される配列中、（ａ’）１～６３位の配列は、ＣＤ８－Ｌｅａｄｅｒを含むアミノ酸配列をコードする塩基配列に、６４～６９位の配列は、リンカーのアミノ酸配列をコードする塩基配列にそれぞれ対応し、（ｂ’）７０～８１６位の配列は、シアリルＴｎ抗原糖鎖に特異的な結合性を有するｓｃＦｖ（ＳＧＴＮ１－１０－８９）に含まれるアミノ酸配列をコードする塩基配列に、８１７～８３１位の配列はリンカー部に対応し、８３２～８６１位の配列は、Ｍｙｃ－ｔａｇを含むアミノ酸配列をコードする塩基配列にそれぞれ対応し、（ｃ’）８６２～９８１位の配列は、ＣＤ２８由来ヒンジのアミノ酸配列をコードする塩基配列に、９８２～１０６２位の配列は、ＣＤ２８由来膜貫通蛋白質ドメインのアミノ酸配列をコードする塩基配列にそれぞれ対応し、（ｄ’）１０６３～１１８８位の配列は、４－１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列をコードする塩基配列に対応し、（ｅ’）１１８９～１５２１位の配列は、ＣＤ３ζ Ｔ細胞受容体ドメインのアミノ酸配列をコードする塩基配列に対応する。

【0068】

ＣＡＲコンストラクト遺伝子の組み込まれたレンチウイルスベクターは、ＣＡＲ遺伝子とは別に、蛍光性蛋白質であるＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）を発現する遺伝子も有していてもよい。ＥＧＦＰは、ＣＭＶ（ｃｙｔｏｍｅｇａｒｏｖｉｒｕｓ）プロモーターを転写開始領域にもつ。ＥＧＦＰ遺伝子を有する場合、ＣＡＲ遺伝子導入細胞は、ＥＧＦＰ遺伝子も共に遺伝子導入されるため、ＥＧＦＰの発現による蛍光の有無から、ＣＡＲの導入が予測可能となる。

【0069】

ＮＫ－９２ ＭＩ細胞へのＣＡＲ遺伝子の導入は、本発明者らが開発したシアリルＴｎ抗原糖鎖に特異的な結合性するｓｃＦｖをＣＡＲの抗原認識部位として遺伝子的に組み込んだレンチウイルスベクターを用いることが好ましい。レンチウイルスベクターをパッケージングしたリコンビナントレンチウイルスを用いることで、ウイルスの感染を介したＮＫ－９２ ＭＩ細胞内へのＣＡＲ遺伝子の輸送と、ＮＫ－９２ ＭＩ細胞遺伝子へのＣＡＲ遺伝子の導入を達成することができる。

【0070】

ＣＡＲ遺伝子の導入に際しては、例えば、１×１０^５個のＮＫ－９２ ＭＩ細胞に３×１０^７ ＴＵのレンチウイルスを接種させることでウイルスを感染させることができる。また、レンチウイルスを播種したＮＫ－９２ ＭＩ細胞は、例えば、ＭＥＭα培地（１２．５％ ウシ胎児血清，１％ペニシリンストレプトマイシン含有）を用い、３７℃、５％二酸化炭素ガス雰囲気下で培養することができる。

【0071】

レンチウイルスベクターとして、ＣＡＲとは別に、蛍光性蛋白質であるＥＧＦＰも発現する遺伝子を有するレンチウイルスベクターを用いる場合、ＣＡＲ遺伝子導入ＮＫ－９２ ＭＩ細胞は、ＥＧＦＰをＣＡＲと共に発現する。そのため、ＣＡＲ導入細胞は、ＥＧＦＰの蛍光を指標にセルソーターで分離することができる。分離した細胞は、例えば、ＭＥＭα培地（１２．５％ ウシ胎児血清，１％ ペニシリンストレプトマイシン含有）を用いて、３７℃、５％二酸化炭素ガス雰囲気下で培養することで、高発現率のＣＡＲ－ＮＫ－９２ ＭＩ 細胞を得ることができる。

【0072】

ＣＡＲ－ＮＫ－９２ ＭＩ 細胞の細胞傷害性は、例えば、肝癌患者の肝臓細胞から樹
立したＨｅｐＧ２細胞や、膵臓癌細胞から樹立されたＰＡＮＣ－１細胞とＣＡＲ－ＮＫ－９２ ＭＩ 細胞を共培養し、フローサイトメトリー解析や顕微鏡観察等により評価することができる。

【0073】

本発明者らが開発した、肝臓癌細胞から樹立されたＨｅｐＧ２細胞や膵臓癌細胞樹立されたＰＡＮＣ－１細胞に結合するが、ＡＴＬ患者のＴ細胞から樹立したＳ１Ｔ細胞やＭＯＬＴ４細胞など非ＡＴＬリンパ球癌細胞には結合しないｓｃＦｖ（ＳＧＴＮ１－１０－３５，ＳＧＴＮ１－１０－７７，ＳＧＴＮ１－１０－８９，ＳＧＴＮ１－３－８，ＳＧＴＮ１－３－２８、ＳＧＴＮ１－３－５５、ＳＧＴＮ１－３－７２、ＳＧＴＮ１－３－７７、ＳＧＴＮ１－３－９２）は、糖鎖ナノテクノロジーとファージディスプレイ法、さらに遺伝子工学を組み合わせて確立することができる。

【0074】

本発明には、以下の態様が含まれる。
〈１〉シアリルＴｎ抗原糖鎖発現細胞に特異的に結合する一本鎖抗体を抗原認識部位として導入したキメラ抗原受容体を含む、ナチュラルキラー細胞。
〈２〉前記一本鎖抗体は、配列番号１から９として示されるシアリルＴｎ抗原糖鎖に特異的に結合する一本鎖抗体である、〈１〉に記載のナチュラルキラー細胞。
〈３〉前記キメラ抗原受容体は、
（ａ）イムノグロブリン重鎖シグナルペプチド、
（ｂ）Ｃ末端にＭｙｃ－ｔａｇを有する、シアリルＴｎ抗原糖鎖に特異的に結合する一本鎖抗体、
（ｃ）ＣＤ２８由来ヒンジ及び膜貫通蛋白質ドメイン、
（ｄ）シグナル伝達のための４－１ＢＢ細胞内蛋白質ドメイン、および、
（ｅ）シグナル伝達のためのＣＤ３ζＴ細胞受容体ドメイン、
を含み、かつ、前記（ａ）～（ｅ）が、Ｎ末端からＣ末端にかけて、この順に発現するキメラ抗原受容体である、〈１〉に記載のナチュラルキラー細胞。
〈４〉配列番号１０，１１または１２として示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、キメラ抗原受容体。
〈５〉〈４〉に記載のキメラ抗原受容体をコードする、配列番号１３、１４または１５として示される塩基配列。また、本発明には、以下の態様も含まれる。
〈１’〉癌細胞への細胞傷害性を増強し、低副反応性を特徴とするシアリルＴｎ抗原発現癌細胞に特異的に結合する一本鎖抗体をＣＡＲの抗原認識部位として導入したＮＫ細胞。
〈２’〉癌細胞の細胞表層糖鎖に対する一本鎖抗体をＣＡＲの抗原認識部位として導入することを特徴とする〈１’〉に記載のシアリルＴｎ抗原糖鎖に特異的に結合する一本鎖抗体をＣＡＲの抗原認識部位として導入したＮＫ細胞。
〈３’〉（ａ）イムノグロブリン重鎖シグナルペプチド
（ｂ）請求項１に記載の成人Ｔ細胞白血病細胞の細胞表層糖鎖に対する一本鎖抗体であって、Ｃ末端にＭｙｃ－ｔａｇを有する一本鎖抗体
（ｃ）ＣＤ２８由来ヒンジ及び膜貫通蛋白質ドメイン
（ｄ）シグナル伝達のための４－１ＢＢ細胞内蛋白質ドメイン
（ｅ）シグナル伝達のためのＣＤ３ζＴ細胞受容体ドメイン
を含むキメラ抗原受容体であり、（ａ）～（ｅ）が、Ｎ末端からＣ末端の順に発現するＣＡＲ。
〈４’〉配列番号１０として示されるアミノ酸配列を含む〈３’〉に記載のＣＡＲ。
〈５’〉配列番号１３として示される〈３’〉に記載のＣＡＲを発現させる塩基配列。

【0075】

図２に示す構造を有する配列番号１０．１１，および１２で示されるポリペプチド（ＳＧＴＮ１－１０－３５、ＳＧＴＮ１－１０－７７，ＳＧＴＮ１－１０－８９）を含むＣＡＲをコードする、配列番号１３、１４、および１５で示される塩基配列を含む遺伝子（ＣＡＲ遺伝子）を、レンチウイルスベクターを用いてヒト腎臓由来の２９３Ｔ細胞に導入した。なお、前記レンチウイルスベクターは、ＣＡＲとは別に、蛍光性蛋白質であるＥＧＦＰも発現する遺伝子を有していた。遺伝子導入率の高い細胞を、ＣＡＲとは別に細胞内で発現する蛍光性蛋白質の蛍光強度を指標に、セルソーターで分離・回収することで、ｓｃＦｖ（ＳＧＴＮ１－１０－３５、ＳＧＴＮ１－１０－７７，ＳＧＴＮ１－１０－８９）を含むＣＡＲ遺伝子を導入した２９３Ｔ細胞を得た。なお、この際陰性対照として、シアリルＴｎ抗原に結合しないｓｃＦｖの遺伝子（ＳＧＴＮ１－１０－３６）を導入したＣＡＲ遺伝子、また陽性対照として先行特許文献（特願２０２２－１２８９６１）に記載のＡＴＬ細胞に特異的に結合するｓｃＦｖの遺伝子（Ｓ１ＴＳＣＦＲ３－１）もそれぞれ２９３Ｔ細胞に導入した。

【0076】

図示のように、ＣＡＲ遺伝子を導入した２９３Ｔ細胞は、いずれもＥＧＦＰによる緑色蛍光が観測された。またＣＡＲ遺伝子を加えないＨＥＫ２９３細胞は緑色蛍光は観測されなかった。これらから、ＨＥＫ２９３細胞に、それぞれのＣＡＲ遺伝子を導入できたことを示している。緑色蛍光が観測された細胞上清には、ＣＡＲ遺伝子が組み込まれた高濃度のレンチウイルスベクターが存在するため、これをＮＫ－９２ ＭＩ細胞に、同様な方法で導入してシアリルＴｎ抗原糖鎖に結合するＣＡＲを有するＣＡＲ－ＮＫ－９２ ＭＩ細胞を製造することができる。

【実施例0077】

〔実施例１〕
実施例１ではｓｃＦｖの糖鎖結合性について検討した。

【0078】

９種類のｓｃＦｖのシアル酸含有糖鎖に対する結合特異性をファイバー型シュガーチップを用いて評価した。ファイバー型シュガーチップにはＮｅｕ５Ｇｃα２－６ＧａｌＮＡｃα－（Ｎｅｕ５Ｇｃ－Ｔｎ－ｃｈｉｐ）、Ｎｅｕ５Ａｃα２－６ＧａｌＮＡｃα－（Ｎｅｕ５Ａｃ－Ｔｎ－ｃｈｉｐ）、Ｎｅｕ５Ａｃα２－６Ｇａｌ－ｃｈｉｐ、αＧａｌＮＡｃ－ｃｈｉｐの４種類をそれぞれ固定化したものを用いた。

【0079】

ＬＰＲセンサーでシグナルをモニタリングしながら、ファイバー型シュガーチップ先端をＰＢＳ－Ｔ（５００μＬ）に浸漬し、１００秒間撹拌した。次いで、ファイバー型シュガーチップ先端を２μＭのｓｃＦｖ溶液（５００μＬ）に浸漬し、２００秒間攪拌してｓｃＦｖの結合と乖離を観測、その後ＰＢＳ－Ｔ（５００μＬ）に浸漬し１００秒間攪拌してｓｃＦｖの乖離を観測した。

【0080】

観測結果を図３に示す。各々のｓｃＦｖ（可溶性蛋白質であることを明確にするため、”ｐ－”を付記している）は、それぞれ異なる強度で２つのシアリルＴｎ抗原糖鎖に結合した。一方、シアリルＴｎ抗原糖鎖とは異なるシアル酸含有糖鎖の結合強度は高いものではなかった。

【0081】

〔実施例２〕
ＨｅｐＧ２細胞またはＰＡＮＣ－１細胞の細胞膜画分、に対するｓｃＦｖの結合活性について検討した。実験の具体的な手順は、以下の通りであった。
１．細胞膜蛋白質の抽出を以下の様におこなった。すなわち、それぞれ培養後、－８０℃に保存されていたＨｅｐＧ２細胞またはＰＡＮＣ－１細胞を３℃℃に加温したＰＢＳ（５ｍＬ）に加えて融解後、遠心分離（１，２００ｒｐｍ、５分、室温）して細胞沈殿物を回収した。沈殿に再度ＰＢＳ（９ｍＬ）を加えて懸濁後、遠心分離（１，２００ｒｐｍ、５分、室温）し、上清を除去する操作（洗浄）を２回行った。得られた細胞沈殿物にＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ、１ｍＬ）を加え、氷冷しながらホモジナイザー（５分）と超音波照射（１０分）を用いて細胞を破砕した。懸濁液をエッペンチューブに移し、超遠心分離（４０，０００ｒｐｍ、６０分、４℃）して、細胞膜画分を含む沈殿物を回収した。この沈殿に１％Ｔｒｉｒｏｎ Ｘ－１００水溶液（１ｍＬ）を加えて撹拌後、室温で３０分間静置した。氷冷しながら超音波照射（２０分）して沈殿を分散後、超遠心分離（４０，０００ｒｐｍ、６０分、４℃）して、可溶性膜画分を含む上清を回収した。上清を凍結乾燥後、凍結乾燥物を水（１ｍＬ）に溶解して、ミクロチューブに移した。攪拌しながら、メタノール（４００μＬ）、クロロホルム（１００μＬ）、純水（４００μＬ）を加え、遠心分離（１３，０００×ｇ、１分、室温）した。水層を除去後、有機層にメタノール（４００μＬ）を加えて撹拌した。遠心分離（１，３０００×ｇ、１分、室温）後に得られた沈殿物に、アルゴンガスを吹き付けて乾燥後、ＰＢＳ－Ｔ（５００μＬ）に溶解して細胞膜蛋白質溶液を得た。
２．細胞膜蛋白質を用いたＥＬＩＳＡを以下の様に行った。即ち、９６ウェルプレートにＨｅｐＧ２またはＰＡＮＣ－１膜蛋白質溶液（５０μｇ）を加え、４℃で一晩静置した。ＰＢＳ－Ｔで各ウェルを洗浄後、１％ ＢＳＡ含有ＰＢＳ（ブロッキングバッファー、３００μＬ）を加えて４ ℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔで各ウェルを洗浄後、４倍ずつ連続希釈したｓｃＦｖ溶液（０．１３－２．０μｇ／ｍＬ、５０μＬ）を加え、室温で３時間振とうした。ＰＢＳ－Ｔで各ウェルを洗浄後、ブロッキングバッファーで希釈したＡｎｔｉ－Ｈｉｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ（１，５００倍希釈）およびＡｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ＨＲＰ（１，０００倍希釈）（５０μＬ）を加え、３０分間振とうした。ＰＢＳ－Ｔで各ウェルを洗浄後、ＴＭＢ（５０μＬ）を加えて化学発光を観察した。適宜、Ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（５０μＬ）を加えて発色を停止させた。その後、各ウェルの吸光度（Ａｂｓ_４５０－Ａｂｓ_６２０）を測定した。

【0082】

ＥＬＩＳＡの解析結果の一部を図４に示す。図４より明らかなように、ｓｃＦｖは肝癌由来細胞、膵癌由来細胞にそれぞれ異なる強度比で結合した。この結果から、ＣＡＲ－コンストラクトに用いるｓｃＦｖは癌細胞に対する結合性を有していることが示唆された。

【0083】

〔実施例３〕
実施例３では、シアリルＴｎ抗原糖鎖に特異的な結合性を有するｓｃＦｖをＣＡＲの抗原結合部位として導入したＣＡＲ－ＮＫ細胞を開発するために、まずＣＡＲ－コンストラクトの調製とヒトの腎臓由来の２９３Ｔ細胞への遺伝子導入を検討した。実験の具体的な手順は、以下の通りであった。
１．可溶性ｓｃＦｖを調製するためのｐＥＴ－２６ｂ（＋）プラスミドから制限酵素ＮｏｔＩとＮｃｏＩを用いて、ｓｃＦｖ（例えばＳＧＴＮ１－１０－３５）の遺伝子を切り取り、別途同じ制限酵素で処理したｐＵＣ５７－ＫａｎプラスミドにＬｉｇａｔｉｏｎ反応で導入した。
２．このプラスミドを大腸菌で増やした後抽出精製し、制限酵素ＢａｍＨＩとＡｇｅＩを用いてｓｃＦｖの遺伝子を含むＤＮＡ断片を切り出し精製した。同時に、先行発明の特許文献（特願２０２２－１２８９６１）で用いたＣＡＲ－コンストラクト遺伝子が含まれるレンチウイルスベクターを同じ制限酵素で処理して精製した。そして両者をＬｉｇａｔｉｏｎ反応で連結し、シアリルＴｎ糖鎖に結合するｓｃＦｖを含むレンチウイルスベクターを調製した。このウイルスベクターを大腸菌に感染させ、ウイルスベクターを約３０マイクログラム得た。
３．調製したレンチウイルスベクターは、常法にしたがいｐＧＰ ｖｅｃｔｏｒ（ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を搭載）、ｐＥ ｖｅｃｔｏｒ（エンベロープをコードするｅｎｖ遺伝子を搭載）と２９３Ｔ細胞にコトランスフェクションすることによって、レンチウイルスに目的のＣＡＲ－コンストラクトを組み込んだ。

【0084】

図５に結果を示した。図５より明らかなように、ＣＡＲ遺伝子を導入した２９３Ｔ細胞は、いずれもＥＧＦＰによる緑色蛍光が観測された。またＣＡＲ遺伝子を加えないＨＥＫ２９３細胞は緑色蛍光は観測されなかった。これらから、ＨＥＫ２９３細胞に、それぞれのＣＡＲ遺伝子を導入できたことを示している。

【0085】

〔実施例４〕
実施例４では、シアリルＴｎ抗原糖鎖に特異的な結合性を有するｓｃＦｖをＣＡＲの抗原結合部位として導入したＣＡＲ－ＮＫ細胞を開発し、その細胞傷害性について検討した。

【0086】

ＮＫ細胞には、ＮＫ－９２ ＭＩ細胞を用い、図２に示す構造を有する配列番号１で示されるポリペプチド（ＳＧＴＮ１－１０－３５）を含むＣＡＲをコードする、配列番号１０で示される塩基配列を含む遺伝子（ＣＡＲ遺伝子）を、レンチウイルスベクターを用いてＮＫ－９２ ＭＩ細胞に導入した。なお、前記レンチウイルスベクターは、ＣＡＲとは別に、蛍光性タンパク質であるＥＧＦＰも発現する遺伝子を有していた。遺伝子導入率の高い細胞を、ＣＡＲとは別に細胞内で発現する蛍光性タンパク質の蛍光強度を指標に、セルソーターで分離・回収することで、ｓｃＦｖ（ＳＧＴＮ１－１０－３５）を含むＣＡＲ遺伝子を導入したＮＫ－９２ ＭＩ細胞（以下、ＳＧＴＮ－３５－ＣＡＲ－ＮＫ－９２ ＭＩ細胞という）を得た。また、同様な方法で配列番号３で示されるポリペプチド（ＳＧＴＮ１－１０－８９）を含むＣＡＲをコードする、配列番号１２で示される塩基配列を含む遺伝子（ＣＡＲ遺伝子）を導入したＮＫ－９２ ＭＩ細胞（以下、ＳＧＴＮ－８９－ＣＡＲ－ＮＫ－９２ ＭＩ細胞という）を得た。同様な方法で配列番号２で示されるポリペプチドを含むＣＡＲをコードする、配列番号１１で示される塩基配列を含む遺伝子（ＣＡＲ遺伝子）を導入したＮＫ－９２ ＭＩ細胞を得ることができる。さらに、同様な方法で配列番号４～９で示されるポリペプチドを含むＣＡＲをコードする塩基配列を含む遺伝子（ＣＡＲ遺伝子）を導入したＮＫ－９２ ＭＩ細胞を得ることができる。

【0087】

ＨｅｐＧ２細胞をターゲット細胞として、得られたＳＧＴＮ－８９－ＣＡＲ－ＮＫ－９２ ＭＩ細胞（ソーティング率７％、９３％はＮＫ－９２ ＭＩ細胞）をエフェクター細胞として用いて、ＳＧＴＮ－８９－ＣＡＲ－ＮＫ－９２ ＭＩ細胞の細胞傷害活性を評価した。結果を図６に示す。共培養前日にＨｅｐＧ２細胞２×１０^５個を播種し、ＨｅｐＧ２細胞が接着したウェルに、ＳＧＴＮ－８９－ＣＡＲ－ＮＫ－９２ ＭＩ細胞（ソーティング率７％）を２×１０^５個含む培養液を入れて４時間共培養し、トリプシンを作用させてＨｅｐＧ２細胞をウェルから遊離させて、フローサイトメトリーを用いて評価した。ＳＧＴＮ－８９－ＣＡＲ－ＮＫ－９２ ＭＩ細胞（ソーティング率７％）と共培養した場合、ＨｅｐＧ２細胞の比率は２５．７／７３．９＝３４．８％であった。

【0088】

また、ＣＡＲを導入していないＮＫ－９２ ＭＩ細胞とＨｅｐＧ２細胞との４時間との共培養では、ＨｅｐＧ２細胞の比率は３０．６／６９．０＝４４．３％であった。

【0089】

一方、培養時間を２４時間とした場合には、ＳＧＴＮ－８９－ＣＡＲ－ＮＫ－９２ ＭＩ細胞（ソーティング率７％）と共培養した場合は、ＨｅｐＧ２細胞の比率は９．１／９０．５＝１０．１％であった。

【0090】

また、ＣＡＲを導入していないＮＫ－９２ ＭＩ細胞とＨｅｐＧ２細胞との２４時間共培養では、ＨｅｐＧ２細胞の比率が１９．０／８０．５＝２３．６％であった。

【0091】

図示はしないが、成人Ｔ細胞白血病細胞であるＳ１Ｔ細胞とＳＧＴＮ－８９－ＣＡＲ－ＮＫ－９２ ＭＩ細胞（ソーティング率７％）を２４時間共培養し、フローサイトメトリー解析を行ったところ、Ｓ１Ｔ細胞はほとんど死滅せず、Ｓ１Ｔ細胞の比率は６９．８／３０．１＝２３１％であった。一方、ＣＡＲを導入していないＮＫ－９２ ＭＩ細胞との共培養では、６１．１／３８．６＝１５８％であった。なお、Ｓ１Ｔ細胞に特異的に結合するｓｃＦｖをＣＡＲとして組み込んだＣＡＲ－ＮＫ細胞（先行発明：特願２０２２－１２８９６１）との共培養では、Ｓ１Ｔ細胞の比率は７．８／９２＝８．４％であった。

【0092】

以上から、ＮＫ－９２ ＭＩ細胞へのＳＧＴＮ１－１０－８９を含むＣＡＲの導入は、肝癌細胞であるＨｅｐＧ２細胞に対する細胞傷害活性を増強したことが示唆された。

【0093】

〔まとめ〕
癌は１９８１年から３０年以上日本人の死因の第１位となっている。世界中で、種々の癌に対するマーカー分子や分子標的薬開発のための標的分子の検索が行われており、近年、癌特異的に発現する糖鎖が注目されている。シアリルＴｎ抗原は、胃癌や卵巣癌などのマーカーとして使用されている癌関連糖鎖抗原である。

【0094】

さらに、本発明では遺伝子欠損のためヒトには存在しないはずのＮ－グリコリルシアリルＴｎ抗原にも結合する一本鎖抗体を９種類を見いだし、キメラ抗原受容体の一部として遺伝子導入したナチュラルキラー細胞を製造する。

【0095】

本発明により開発が可能となるのは、シアリルＴｎ抗原糖鎖に特異的な結合性を有するｓｃＦｖを抗原認識部位に有するＮＫ細胞である。

【0096】

先行発明（特願２０２２－１２８９６１）で、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）細胞の糖鎖に結合する一本鎖抗体の遺伝子を本発明と同じ方法で導入したＣＡＲ－ＮＫ－９２ ＭＩ細胞は、ＣＡＲを導入していないＮＫ－９２ ＭＩ細胞では不十分であったＡＴＬ細胞に対する細胞傷害性を向上した。つまり、この発明の一実施形態に係るＣＡＲ－ＮＫ細胞は、ＡＴＬ患者に用いた場合、ＡＴＬ患者のＡＴＬ細胞を死滅させることが出来る可能性があり、ＡＴＬに対する免疫細胞療法による治療が可能となると考えられた。

【0097】

したがって、先行研究と同様なＣＡＲ遺伝子を組み込んで発明により開発するＣＡＲ－ＮＫ－９２ ＭＩ細胞は、シアリルＴｎ抗原糖鎖発現癌に対する免疫細胞療法の開発を可能とするものである。

【0098】

現在、国内で臨床利用される免疫細胞療法では、患者由来のＴ細胞に抗ＣＤ１９抗体をＣＡＲの抗原認識部位として導入したＣＡＲ－Ｔ細胞が用いられる（製品名：キムリア）。しかしながら、その薬価は３０００万円を超え、非常に高額なものである。

【0099】

ＣＡＲ－Ｔ細胞では、患者ごとにＴ細胞のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）が異なるため、他の患者由来のＴ細胞や細胞株を用いた場合、投与したＣＡＲ－Ｔ細胞が異物として免疫機能に認識されるため、移植対片宿主病（ＧＶＨＤ）を引き起こす。したがって、実際に患者に投与するＣＡＲ－Ｔ細胞には、ドナー由来のＴ細胞を単離して利用する必要があり、ＣＡＲ－Ｔ細胞の調整に、時間と費用がかかる。

【0100】

しかし、ＮＫ細胞は、異なる患者のＮＫ細胞や細胞株を別の患者に投与してもＧＶＨＤを引き起こさないことが知られている。したがって、本発明により開発したＣＡＲ－ＮＫ－９２ ＭＩ細胞は、ＧＶＨＤを引き起こさずに、シアリルＴｎ抗原糖鎖発現癌に対し安全な免疫細胞療法が可能である。

【0101】

さらに、本発明の一実施形態に係るＮＫ－９２ ＭＩ細胞は、細胞株であるため、開発したＣＡＲ－ＮＫ－９２ ＭＩ細胞は安定して安価に培養が可能である。したがって、現在臨床利用されているＴ細胞ベースの免疫細胞療法よりも、安全かつ安価に利用可能であると予想される。治療効果の高い免疫細胞療法を低コスト化可能な点で、産業面にも貢献できると考えられる。

【産業上の利用可能性】

【0102】

本発明の一実施形態に係る、シアリルＴｎ抗原糖鎖発現細胞特異的な結合性を有するｓｃＦｖを抗原認識部位に有するＣＡＲ－ＮＫ細胞は、肝癌や膵癌、卵巣癌等に対する新たな治療法として安全かつ効果的な免疫細胞療法の開発を導く。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

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