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▶ アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024059641
(43)【公開日】2024-05-01
(54)【発明の名称】糖タンパク質の製造
(51)【国際特許分類】
C12N 9/16 20060101AFI20240423BHJP
C12N 15/55 20060101ALN20240423BHJP
【ＦＩ】
C12N9/16 B ZNA
C12N15/55
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024013870
(22)【出願日】2024-02-01
(62)【分割の表示】P 2020552865の分割
【原出願日】2019-03-13
(31)【優先権主張番号】62/650,583
(32)【優先日】2018-03-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】503102674
【氏名又は名称】アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ゴダワト，ラフル
(72)【発明者】
【氏名】デウィット，メーガン
(72)【発明者】
【氏名】スイ，シーグアン
(72)【発明者】
【氏名】ラジェンドラン，サラヴァナムールシー
(57)【要約】 （修正有）
【課題】最終タンパク質生成物特性の制御が改善されたアルカリホスファターゼを製造する方法を提供する。
【解決手段】ａ．組換えアルカリホスファターゼ発現チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を培地に接種し；ｂ．ＣＨＯ細胞を培地中で培養し；ｃ．約２．１～４．３モル／モルの総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）を有する収集清澄化培養液（ＨＣＣＦ）を形成するために、組換えアルカリホスファターゼを（ｃ）の細胞培養物から精製ステップによって単離し；ｄ．濾過プール（ＵＦＤＦ）を形成するために追加的なタンパク質精製ステップを実施し、ＵＦＤＦは、約１３～２７℃で約１～６０時間にわたって且つ約１．７～５．３ｇ／Ｌのタンパク質濃度で保持し；ｅ．ＵＦＤＦにクロマトグラフィーステップを施し、組換えアルカリホスファターゼは、約０．７～３．５モル／モルのＴＳＡＣを有する、を含む、組換えアルカリホスファターゼを作製する方法である。
【選択図】なし
【解決手段】ａ．組換えアルカリホスファターゼ発現チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を培地に接種し；ｂ．ＣＨＯ細胞を培地中で培養し；ｃ．約２．１～４．３モル／モルの総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）を有する収集清澄化培養液（ＨＣＣＦ）を形成するために、組換えアルカリホスファターゼを（ｃ）の細胞培養物から精製ステップによって単離し；ｄ．濾過プール（ＵＦＤＦ）を形成するために追加的なタンパク質精製ステップを実施し、ＵＦＤＦは、約１３～２７℃で約１～６０時間にわたって且つ約１．７～５．３ｇ／Ｌのタンパク質濃度で保持し；ｅ．ＵＦＤＦにクロマトグラフィーステップを施し、組換えアルカリホスファターゼは、約０．７～３．５モル／モルのＴＳＡＣを有する、を含む、組換えアルカリホスファターゼを作製する方法である。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
組換えアルカリホスファターゼを作製する方法であって、
ａ．組換えアルカリホスファターゼを発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を培地に接種することと；
ｂ．前記ＣＨＯ細胞を培地中で培養することと；
ｃ．約２．１モル／モル～約４．３モル／モルの総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）を有する収集清澄化培養液（ＨＣＣＦ）を形成するために、前記組換えアルカリホスファターゼを（ｃ）の細胞培養物から少なくとも１つの精製ステップによって単離することと；
ｄ．濾過プール（ＵＦＤＦ）を形成するために少なくとも１つの追加的なタンパク質精製ステップを実施することであって、前記ＵＦＤＦは、約１３℃～約２７℃の温度で約１時間～約６０時間にわたって且つ約１．７ｇ／Ｌ～約５．３ｇ／Ｌのタンパク質濃度で保持される、実施することと；
ｅ．部分精製組換えアルカリホスファターゼを得るために前記ＵＦＤＦに少なくとも１つのクロマトグラフィーステップを施すことであって、前記組換えアルカリホスファターゼは、約０．７モル／モル～約３．５モル／モルのＴＳＡＣを有する、施すことと
を含む方法。
ａ．組換えアルカリホスファターゼを発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を培地に接種することと；
ｂ．前記ＣＨＯ細胞を培地中で培養することと；
ｃ．約２．１モル／モル～約４．３モル／モルの総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）を有する収集清澄化培養液（ＨＣＣＦ）を形成するために、前記組換えアルカリホスファターゼを（ｃ）の細胞培養物から少なくとも１つの精製ステップによって単離することと；
ｄ．濾過プール（ＵＦＤＦ）を形成するために少なくとも１つの追加的なタンパク質精製ステップを実施することであって、前記ＵＦＤＦは、約１３℃～約２７℃の温度で約１時間～約６０時間にわたって且つ約１．７ｇ／Ｌ～約５．３ｇ／Ｌのタンパク質濃度で保持される、実施することと；
ｅ．部分精製組換えアルカリホスファターゼを得るために前記ＵＦＤＦに少なくとも１つのクロマトグラフィーステップを施すことであって、前記組換えアルカリホスファターゼは、約０．７モル／モル～約３．５モル／モルのＴＳＡＣを有する、施すことと
を含む方法。
【請求項2】
組換えアルカリホスファターゼを作製する方法であって、
ａ．組換えアルカリホスファターゼを発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を培地に接種することと；
ｂ．前記ＣＨＯ細胞を培地中で培養することと；
ｃ．栄養補充剤を（ｂ）の細胞培養物に添加することと；
ｄ．濾過プール（ＵＦＤＦ）を形成するために、前記組換えアルカリホスファターゼを（ｃ）の前記細胞培養物から少なくとも１つの精製ステップによって単離することと；
ｅ．前記組換えアルカリホスファターゼを前記ＵＦＤＦから回収することであって、前記ＵＦＤＦ中の前記組換えアルカリホスファターゼは、前記回収を施されるとき、約２．１モル／モル～約４．３モル／モルの総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）を有する、回収することと
を含む方法。
ａ．組換えアルカリホスファターゼを発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を培地に接種することと；
ｂ．前記ＣＨＯ細胞を培地中で培養することと；
ｃ．栄養補充剤を（ｂ）の細胞培養物に添加することと；
ｄ．濾過プール（ＵＦＤＦ）を形成するために、前記組換えアルカリホスファターゼを（ｃ）の前記細胞培養物から少なくとも１つの精製ステップによって単離することと；
ｅ．前記組換えアルカリホスファターゼを前記ＵＦＤＦから回収することであって、前記ＵＦＤＦ中の前記組換えアルカリホスファターゼは、前記回収を施されるとき、約２．１モル／モル～約４．３モル／モルの総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）を有する、回収することと
を含む方法。
【請求項3】
シアリダーゼは、前記細胞培養物、前記ＨＣＣＦ及び／又は前記ＵＦＤＦから選択的に除去される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
外因性シアリルトランスフェラーゼは、前記細胞培養物、前記ＨＣＣＦ及び／又は前記ＵＦＤＦに添加される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項5】
前記培地中での前記ＣＨＯ細胞の前記培養は、約３６℃～約３８℃の温度におけるものである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記培地中での前記ＣＨＯ細胞の前記培養は、約３７℃の温度におけるものである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記栄養補充剤は、ＣＨＯ細胞の前記培地への接種の少なくとも１日後に前記細胞培養物に添加される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記栄養補充剤は、３つ以上の異なる時点で添加される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記培地は、ＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）３０２無血清培地；ＣＤ ＤＧ４４培地；ＢＤ Ｓｅｌｅｃｔ（商標）培地；ＳＦＭ４ＣＨＯ培地；及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記ＣＨＯ細胞の前記培養は、０．２５Ｌ～２５，０００Ｌのバイオリアクター内におけるものである、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記ＣＨＯ細胞の前記培養は、１００Ｌ～２５，０００Ｌのバイオリアクター内におけるものである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記ＣＨＯ細胞の前記培養は、２０００Ｌ～２０，０００Ｌのバイオリアクター内におけるものである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記細胞培養物の温度は、前記接種の約８０時間～約１２０時間後に減少される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
（ｄ）は、接種の約１０～約１４日後に行われる、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記ＨＣＣＦの前記ＴＳＡＣは、約２．２モル／モル～約３．６モル／モルである、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記ＨＣＣＦの前記ＴＳＡＣは、約２．２モル／モル～約３．４モル／モルである、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記少なくとも１つの追加的な精製ステップは、収集清澄化、濾過、限外濾過、ダイアフィルトレーション、ウイルス不活性化、親和性捕捉及びそれらの組み合わせの少なくとも１つを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記少なくとも１つの追加的な精製ステップは、限外濾過及び／又はダイアフィルトレーションを含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記ＵＦＤＦは、約１４℃～約２６℃の温度で保持される、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記ＵＦＤＦは、約１５℃～約２６℃の温度で保持される、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記ＵＦＤＦは、約１５℃～約２５℃の温度で保持される、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記ＵＦＤＦは、約１９℃～約２５℃の温度で保持される、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記ＵＦＤＦは、約１０時間～約５０時間にわたって保持される、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
前記ＵＦＤＦは、約１２時間～約４８時間にわたって保持される、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記ＵＦＤＦは、約１４時間～約４２時間にわたって保持される、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記ＵＦＤＦは、約１７時間～約３４時間にわたって保持される、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記ＵＦＤＦは、約１９時間～約３３時間にわたって保持される、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
前記ＵＦＤＦは、約２５時間～約３８時間にわたって保持される、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記ＵＦＤＦは、約２９時間～約３５時間にわたって保持される、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
前記ＵＦＤＦは、約２．０ｇ／Ｌ～約４．３ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
前記ＵＦＤＦは、約２．４ｇ／Ｌ～約３．７ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
前記ＵＦＤＦは、約３．１ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する、請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
前記ＵＦＤＦは、約３．０ｇ／Ｌ～約４．５ｇ／Ｌのアルカリホスファターゼ濃度を有する、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項34】
前記ＵＦＤＦは、約３．３ｇ／Ｌ～約４．１ｇ／Ｌのアルカリホスファターゼ濃度を有する、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
前記少なくとも１つのクロマトグラフィーステップは、タンパク質アフィニティークロマトグラフィーである、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
前記少なくとも１つのクロマトグラフィーステップは、プロテインＡクロマトグラフィーである、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
ステップ（ｄ）は、ウイルス不活性化ステップをさらに含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項38】
ステップ（ｅ）は、少なくとも１つの追加的なクロマトグラフィー及び／又は精製ステップをさらに含む、請求項１～３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項39】
前記少なくとも１つの追加的なクロマトグラフィーステップは、カラムクロマトグラフィーを含む、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項40】
前記カラムクロマトグラフィーは、疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む、請求項１～３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項41】
前記少なくとも１つの追加的な精製ステップは、追加的なダイアフィルトレーションを含む、請求項１～４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項42】
前記少なくとも１つの追加的なクロマトグラフィー及び／又は精製ステップは、疎水性相互作用クロマトグラフィー及び／又は少なくとも１つの追加的なダイアフィルトレーションステップを含む、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項43】
前記少なくとも１つの追加的なクロマトグラフィー及び／又は精製ステップは、約０．９モル／モル～約３．９モル／モルのＴＳＡＣを有する組換えアルカリホスファターゼを得るために実施される、請求項１～４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項44】
前記少なくとも１つの追加的なクロマトグラフィー及び／又は精製ステップは、約１．１モル／モル～約３．２モル／モルのＴＳＡＣを有する組換えアルカリホスファターゼを得るために実施される、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項45】
前記少なくとも１つの追加的なクロマトグラフィー及び／又は精製ステップは、約１．４モル／モル～約２．６モル／モルのＴＳＡＣを有する組換えアルカリホスファターゼを得るために実施される、請求項１～４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項46】
前記少なくとも１つの追加的なクロマトグラフィー及び／又は精製ステップは、約１．２モル／モル～約３．０モル／モルのＴＳＡＣを有する組換えアルカリホスファターゼを得るために実施される、請求項１～４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項47】
前記組換えアルカリホスファターゼは、Ｗ－ｓＡＬＰ－Ｘ－Ｆｃ－Ｙ－Ｄｎ－Ｚ（式中、
Ｗは、不在であるか、又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり；
Ｘは、不在であるか、又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり；
Ｙは、不在であるか、又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり；
Ｚは、不在であるか、又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり；
Ｆｃは、結晶化可能領域断片であり；
Ｄｎは、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸塩又はそれらの組み合わせであり、ここで、ｎ＝１０又は１６であり；及び
ｓＡＬＰは、可溶性アルカリホスファターゼである）
の構造を含む、請求項１～４６のいずれか一項に記載の方法。
Ｗは、不在であるか、又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり；
Ｘは、不在であるか、又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり；
Ｙは、不在であるか、又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり；
Ｚは、不在であるか、又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり；
Ｆｃは、結晶化可能領域断片であり；
Ｄｎは、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸塩又はそれらの組み合わせであり、ここで、ｎ＝１０又は１６であり；及び
ｓＡＬＰは、可溶性アルカリホスファターゼである）
の構造を含む、請求項１～４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項48】
前記組換えアルカリホスファターゼは、アスホターゼアルファ（配列番号１）を含む、請求項１～４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項49】
前記タンパク質アフィニティークロマトグラフィーから得られる前記組換えアルカリホスファターゼは、約２℃～約８℃で貯蔵される、請求項１～４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項50】
接種後、栄養補充剤を（ｂ）の前記細胞培養物に添加することをさらに含む、請求項１～４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項51】
ＵＦＤＦ中の前記組換えアルカリホスファターゼは、前記回収を施されるとき、約２．２モル／モル～約３．６モル／モルの総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）を有する、請求項１～５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項52】
前記ＵＦＤＦ中の前記組換えアルカリホスファターゼは、前記回収を施されるとき、約２．２モル／モル～約３．４モル／モルの総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）を有する、請求項１～５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項53】
組換えアルカリホスファターゼ活性を測定することをさらに含む、請求項１～５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項54】
哺乳動物細胞培養物中に生成される組換えアルカリホスファターゼであって、前記細胞培養物から生成された収集清澄化培養液（ＨＣＣＦ）中の前記組換えアルカリホスファターゼは、常に約１．２モル／モル以上の総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）を有し、前記哺乳動物細胞培養物は、約１００Ｌ～約２５，０００Ｌである、組換えアルカリホスファターゼ。
【請求項55】
組換えアルカリホスファターゼを含む濾過プール（ＵＦＤＦ）であって、約１００Ｌ～約２５，０００Ｌの細胞培養物から生成され、約２．０～約４．３ｇ／Ｌのタンパク質濃度において約１９℃～約２５℃で約１４～約４２時間にわたって保持される、濾過プール（ＵＦＤＦ）。
【請求項56】
請求項１～５３のいずれか一項に記載の方法によって生成される組換えアルカリホスファターゼ。
【請求項57】
請求項５６に記載の組換えアルカリホスファターゼ及び少なくとも１つの薬学的に許容できる担体、希釈剤、賦形剤又はそれらの組み合わせを含む医薬製剤。
【請求項58】
対象における無機ピロリン酸塩（ＰＰｉ）の切断を増強するために、請求項５６に記載の組換えアルカリホスファターゼを使用する方法。
【請求項59】
アルカリホスファターゼ欠損に関連する病態を患っている対象を治療する方法であって、治療有効量の、請求項５６に記載の組換えアルカリホスファターゼを前記対象に投与することを含む方法。
【請求項60】
総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）を、ＴＳＡＣを含有する組換えタンパク質において制御する方法であって、前記組換えタンパク質を哺乳動物細胞培養物中で培養することと、ＵＦＤＦを提供するために少なくとも１つの精製ステップを実施することとを含み、温度、タンパク質濃度及び／又は保持時間は、前記ＵＦＤＦ中で制御される、方法。
【請求項61】
前記組換えタンパク質は、組換え糖タンパク質である、請求項６０に記載の方法。
【請求項62】
前記組換えタンパク質は、アルカリホスファターゼタンパク質である、請求項６０又は６１に記載の方法。
【請求項63】
前記組換えタンパク質は、アスホターゼアルファである、請求項６０～６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項64】
前記少なくとも１つの精製ステップは、限外濾過及び／又はダイアフィルトレーションを含む、請求項６０～６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項65】
前記少なくとも１つの精製ステップは、プロテインＡクロマトグラフィーを含む、請求項６０～６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項66】
哺乳動物細胞培養物中のグリコシダーゼ活性を制御する方法であって、組換えタンパク質を哺乳動物細胞培養物中で培養することと、ＵＦＤＦを提供するために少なくとも１つの精製ステップを実施することとを含み、温度、タンパク質濃度及び／又は保持時間は、前記グリコシダーゼ活性を制御するために前記ＵＦＤＦ中で制御される、方法。
【請求項67】
前記組換えタンパク質は、組換え糖タンパク質である、請求項６６に記載の方法。
【請求項68】
前記組換えタンパク質は、アルカリホスファターゼタンパク質である、請求項６６又は６７に記載の方法。
【請求項69】
前記組換えタンパク質は、アスホターゼアルファである、請求項６６～６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項70】
前記少なくとも１つの精製ステップは、限外濾過及び／又はダイアフィルトレーションを含む、請求項６６～６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項71】
前記少なくとも１つの精製ステップは、プロテインＡクロマトグラフィーを含む、請求項６６～７０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
概して、本開示は、組換えポリペプチド及び組換え糖タンパク質、即ちアルカリホスファターゼを製造する方法、特に限定されないが、アスホターゼアルファを含む組換え融合タンパク質を製造する方法に関する。
【0002】
疾患、特に骨格徴候を有する疾患、例えば低ホスファターゼ症を治療するための有効な治療用分子及び方法を開発することが当技術分野で求められている。組換えポリペプチド及び組換え糖タンパク質、例えばアスホターゼアルファでは、生成物の物理パラメータの制御が特に重要である。
【0003】
組換えアルカリホスファターゼを作製する方法であって、（ａ）組換えアルカリホスファターゼを発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を培地に接種することと、（ｂ）ＣＨＯ細胞を培地中で培養することと、（ｃ）接種の少なくとも１日後に（ｂ）の細胞培養物に栄養補充剤を添加することと、（ｄ）約１．５モル／モル～約４．０モル／モルの総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）を有する収集清澄化培養液（ＨＣＣＦ）を形成するために、少なくとも１つの精製ステップによって（ｃ）の細胞培養物から組換えアルカリホスファターゼを単離することと、（ｅ）濾過プール（ＵＦＤＦ）を形成するために少なくとも１つの追加的なタンパク質精製ステップを実施することであって、ＵＦＤＦは、約１３℃～約２７℃の温度で約１時間～約６０時間にわたって且つ約１．７ｇ／Ｌ～約５．３ｇ／Ｌのタンパク質濃度で保持される、実施することと；（ｆ）部分精製組換えアルカリホスファターゼを得るためにＵＦＤＦに少なくとも１つのクロマトグラフィーステップを施すことであって、組換えアルカリホスファターゼは、約０．９モル／モル～約３．０モル／モルのＴＳＡＣを有する、施すこととを含む方法。
【背景技術】
【0004】
低ホスファターゼ症（ＨＰＰ）は、機能的な組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＳＡＬＰ）の産生が不能になる重篤で極希少な遺伝性代謝障害である。それは、骨及び歯の低石灰化によって特徴付けられる非石灰化骨マトリックスの蓄積（例えば、くる病、骨軟化症）をもたらす。成長する骨が適切に石灰化しないとき、成長の障害により、関節及び骨の美観が損なわれる。この結果は、したがって、運動能力、呼吸機能に影響し、さらに死に至ることがある。ＨＰＰの様々な形態として、出生時、乳児性、若年性（又は小児性）及び成人ＨＰＰが挙げられる。近年、主として症状発現時の年齢に基づき、出生時、良性出生前、小児性、若年性、成人及び歯限局型ＨＰＰを含む６つの臨床形態が定義されている。アスホターゼアルファは、内因性ＴＮＳＡＬＰレベルの欠陥に対処するように設計されている、承認されたファーストインクラスの標的化酵素置換治療薬である。ＴＮＳＡＬＰを伴うＨＰＰの治療の最初の報告については、Ｗｈｙｔｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２ Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３６６：９０４－１３を参照されたい。
【0005】
アスホターゼアルファ（ＳＴＲＥＮＳＩＱ（登録商標），Ａｌｅｘｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）は、ヒトＴＮＳＡＬＰの触媒ドメイン、ヒト免疫グロブリンＧ１のＦｃドメイン及び骨標的化ドメインとして用いられるデカアスパラギン酸ペプチド（即ちＤ１０）からなる可溶性の融合糖タンパク質である。インビトロで、アスホターゼアルファは、ハイドロキシアパタイトに対し、デカアスパラギン酸ペプチドを欠如する可溶性のＴＮＳＡＬＰの場合よりも高い親和性で結合し、それにより、アスホターゼアルファのＴＮＳＡＬＰ部分は、余分な局所性の無機ピロリン酸（ＰＰｉ）を効率的に分解し、正常な石灰化を骨に回復させることを可能にする。ピロリン酸加水分解は、骨石灰化を促進し、その効果は、非臨床試験において評価される種の中で類似していた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
治療的に有効なアルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）を商業規模量で作製するには、複雑で高感度な多段階プロセスが必要である。本開示は、最終タンパク質生成物特性の制御が改善された、アスホターゼアルファなどのアルカリホスファターゼを含む糖タンパク質を製造する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本明細書で開示されるのは、アルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）の作製における効率を増加させるために用いることができる改善された製造プロセスである。本明細書に記載の方法は、組換えタンパク質、例えば培養された哺乳動物細胞、特に培養されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞によって産生されるアルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）の酵素活性について維持、貯蔵、調節及び／又は改善するためにも用いられ得る。かかるアルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）は、治療における使用、例えば対象、例えばヒト対象における低下したアルカリホスファターゼタンパク質レベル及び／又は機能（例えば、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）、ＨＰＰ等の不十分な切断）に関連した状態の治療に適している。
【0008】
一態様では、本開示は、アルカリホスファターゼ機能を有する組換えポリペプチドを作製する方法を提供する。様々な実施形態では、アルカリホスファターゼ機能は、当技術分野で公知のアルカリホスファターゼの任意の機能、例えばホスホエタノールアミン（ＰＥＡ）、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）及びピリドキサール５’－リン酸（ＰＬＰ）を含む天然基質に対する酵素活性を含み得る。かかる組換えポリペプチドは、アスホターゼアルファ（配列番号１）を含み得る。
【0009】
いくつかの実施形態では、本開示は、組換えアルカリホスファターゼを作製する方法であって、（ａ）組換えアルカリホスファターゼを発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を培地に接種することと；（ｂ）ＣＨＯ細胞を培地中で培養することと；（ｃ）約２．１モル／モル～約４．３モル／モルの総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）を有する収集清澄化培養液（ＨＣＣＦ）を形成するために、組換えアルカリホスファターゼを（ｃ）の細胞培養物から少なくとも１つの精製ステップによって単離することと；（ｄ）濾過プール（ＵＦＤＦ）を形成するために少なくとも１つの追加的なタンパク質精製ステップを実施することであって、ＵＦＤＦは、約１３℃～約２７℃の温度で約１時間～約６０時間にわたって且つ約１．７ｇ／Ｌ～約５．３ｇ／Ｌのタンパク質濃度で保持される、実施することと；（ｅ）部分精製組換えアルカリホスファターゼを得るためにＵＦＤＦに少なくとも１つのクロマトグラフィーステップを施すことであって、組換えアルカリホスファターゼは、約０．７モル／モル～約３．５モル／モルのＴＳＡＣを有する、施すこととを含む方法を対象とする。
【0010】
いくつかの実施形態では、本開示は、接種後に（ｂ）の細胞培養物に栄養補充剤を添加することをさらに含む方法を対象とする。
【0011】
いくつかの実施形態では、本開示は、組換えアルカリホスファターゼを作製する方法であって、（ａ）組換えアルカリホスファターゼを発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を培地に接種することと；（ｂ）ＣＨＯ細胞を培地中で培養することと；（ｃ）接種の少なくとも１日後に（ｂ）の細胞培養物に栄養補充剤を添加することと；（ｄ）濾過プールを形成するために、組換えアルカリホスファターゼを（ｃ）の細胞培養物から少なくとも１つの精製ステップによって単離することと；（ｅ）濾過プールから組換えアルカリホスファターゼを回収することであって、濾過プール中の組換えアルカリホスファターゼは、回収を施されるとき、約２．１～約４．３モル／モルの総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）を有する、回収することとを含む方法を提供する。
【0012】
いくつかの実施形態では、濾過プール中の組換えアルカリホスファターゼは、回収を施されるとき、約２．２モル／モル～約３．６モル／モルのＴＳＡＣを有する。いくつかの実施形態では、濾過プール中の組換えアルカリホスファターゼは、回収を施されるとき、約２．２モル／モル～約３．４モル／モルのＴＳＡＣを有する。
【0013】
いくつかの実施形態では、シアリダーゼは、細胞培養物、ＨＣＣＦ及び／又はＵＦＤＦから選択的に除去される。いくつかの実施形態では、外因性シアリルトランスフェラーゼは、細胞培養物、ＨＣＣＦ及び／又はＵＦＤＦに添加される。
【0014】
いくつかの実施形態では、培地中のＣＨＯ細胞の培養は、約３６℃～約３８℃の温度におけるものである。いくつかの実施形態では、培地中のＣＨＯ細胞の培養は、約３７℃の温度におけるものである。いくつかの実施形態では、栄養補充剤は、ＣＨＯ細胞の培地への接種の少なくとも１日後に細胞培養物に添加される。いくつかの実施形態では、栄養補充剤は、３つ以上の異なる時点で添加される。いくつかの実施形態では、培地は、ＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）３０２無血清培地；ＣＤ ＤＧ４４培地；ＢＤ Ｓｅｌｅｃｔ（商標）培地；ＳＦＭ４ＣＨＯ培地；及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0015】
いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞の培養は、０．２５Ｌ～２５，０００Ｌのバイオリアクター内におけるものである。いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞の培養は、１００Ｌ～２５，０００Ｌのバイオリアクター内におけるものである。いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞の培養は、２０００Ｌ～２０，０００Ｌのバイオリアクター内におけるものである。いくつかの実施形態では、細胞培養物の温度は、接種の約８０時間～約１２０時間後に減少される。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）は、接種の約１０～約１４日後に行われる。
【0016】
いくつかの実施形態では、ＨＣＣＦのＴＳＡＣは、約２．２モル／モル～約３．６モル／モルである。いくつかの実施形態では、ＨＣＣＦのＴＳＡＣは、約２．２モル／モル～約３．４モル／モルである。いくつかの実施形態では、１つの追加的な精製ステップは、収集清澄化、濾過、限外濾過、ダイアフィルトレーション、ウイルス不活性化、親和性捕捉及びそれらの組み合わせの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、１つの追加的な精製ステップは、限外濾過及び／又はダイアフィルトレーションを含む。
【0017】
いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約１４℃～約２６℃の温度で保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約１５℃～約２６℃の温度で保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約１５℃～約２５℃の温度で保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約１９℃～約２５℃の温度で保持される。
【0018】
いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約１０時間～約５０時間にわたって保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約１２時間～約４８時間にわたって保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約１４時間～約４２時間にわたって保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約１７時間～約３４時間にわたって保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約１９時間～約３３時間にわたって保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約２５時間～約３８時間にわたって保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約２９時間～約３５時間にわたって保持される。
【0019】
いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約２．０ｇ／Ｌ～約４．３ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約２．４ｇ／Ｌ～約３．７ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約３．１ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約３．０ｇ／Ｌ～約４．５ｇ／Ｌのアルカリホスファターゼ濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約３．３ｇ／Ｌ～約４．１ｇ／Ｌのアルカリホスファターゼ濃度を有する。いくつかの実施形態では、アルカリホスファターゼは、アスホターゼアルファである。
【0020】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのクロマトグラフィーステップは、タンパク質アフィニティークロマトグラフィーである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのクロマトグラフィーステップは、プロテインＡクロマトグラフィーである。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）は、ウイルス不活性化ステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｅ）は、少なくとも１つの追加的なクロマトグラフィーステップ及び／又は精製ステップをさらに含む。
【0021】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加的なクロマトグラフィーステップは、カラムクロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態では、カラムクロマトグラフィーは、疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加的な精製ステップは、追加的なダイアフィルトレーションを含む。いくつかの実施形態では、１つの追加的なクロマトグラフィー及び／又は精製ステップは、疎水性相互作用クロマトグラフィー及び／又は少なくとも１つの追加的なダイアフィルトレーションステップを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加的なクロマトグラフィーステップは、約０．９モル／モル～約３．９モル／モルのＴＳＡＣを有する組換えアルカリホスファターゼを得るために実施される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加的なクロマトグラフィーステップは、約１．１モル／モル～約３．２モル／モルのＴＳＡＣを有する組換えアルカリホスファターゼを得るために実施される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加的なクロマトグラフィーステップは、約１．４モル／モル～約３．０モル／モルのＴＳＡＣを有する組換えアルカリホスファターゼを得るために実施される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加的なクロマトグラフィーステップは、約１．２モル／モル～約３．０モル／モルのＴＳＡＣを有する組換えアルカリホスファターゼを得るために実施される。
【0022】
いくつかの実施形態では、組換えアルカリホスファターゼは、Ｗ－ｓＡＬＰ－Ｘ－Ｆｃ－Ｙ－Ｄｎ－Ｚ（式中、（ｉ）Ｗは、不在であるか、又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり；（ｉｉ）Ｘは、不在であるか、又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり；（ｉｉｉ）Ｙは、不在であるか、又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり；（ｉｖ）Ｚは、不在であるか、又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり；（ｖ）Ｆｃは、結晶化可能領域断片であり；（ｖｉ）Ｄｎは、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸塩又はそれらの組み合わせであり、ここで、ｎ＝１０又は１６であり；及び（ｖｉｉ）ｓＡＬＰは、可溶性アルカリホスファターゼである）の構造を含む。いくつかの実施形態では、組換えアルカリホスファターゼは、アスホターゼアルファ（配列番号１）を含む。
【0023】
いくつかの実施形態では、タンパク質アフィニティークロマトグラフィーから得られる組換えアルカリホスファターゼは、約２℃～約８℃で貯蔵される。
【0024】
いくつかの実施形態では、本開示は、組換えアルカリホスファターゼ活性を測定することをさらに含む方法を提供する。
【0025】
いくつかの実施形態では、本開示は、哺乳動物細胞培養物中に生成される組換えアルカリホスファターゼであって、細胞培養物から生成される濾過プール中の組換えアルカリホスファターゼは、約１．２モル／モル以上の総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）を有し、哺乳動物細胞培養物は、約１００Ｌ～約２５，０００Ｌである、組換えアルカリホスファターゼを提供する。
【0026】
いくつかの実施形態では、本開示は、組換えアルカリホスファターゼを含む濾過プール（ＵＦＤＦ）であって、約１００Ｌ～約２５，０００Ｌの細胞培養物から生成され、約２．０～約４．３ｇ／Ｌのタンパク質濃度において約１９℃～約２５℃で約１４～約４２時間にわたって保持される、濾過プール（ＵＦＤＦ）を提供する。
【0027】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載のような方法によって生成される組換えアルカリホスファターゼを提供する。
【0028】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載のような方法によって生成される組換えアルカリホスファターゼ及び少なくとも１つの薬学的に許容できる担体、希釈剤、賦形剤又はそれらの組み合わせを含む医薬製剤を提供する。
【0029】
いくつかの実施形態では、本開示は、対象における無機ピロリン酸塩（ＰＰｉ）の切断を増強するために、本明細書に記載の方法によって作製された組換えアルカリホスファターゼを使用する方法を提供する。
【0030】
いくつかの実施形態では、本開示は、アルカリホスファターゼ欠損に関連する病態を患っている対象を治療する方法であって、治療有効量の、本明細書に記載の方法によって生成される組換えアルカリホスファターゼを対象に投与することを含む方法を対象とする。
【0031】
いくつかの実施形態では、本開示は、総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）を、ＴＳＡＣを含有する組換えタンパク質において哺乳動物細胞培養物を通して制御する方法であって、少なくとも１つの精製ステップ及び少なくとも１つのクロマトグラフィーステップを含む方法を対象とする。
【0032】
いくつかの実施形態では、本開示は、組換えタンパク質を産生する哺乳動物細胞培養物におけるグリコシダーゼ活性を制御する方法であって、少なくとも１つの精製ステップ及び少なくとも１つのクロマトグラフィーステップを含む方法を対象とする。
【0033】
いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は、組換え酵素である。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は、アルカリホスファターゼタンパク質である。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は、アスホターゼアルファである。いくつかの実施形態では、グリコシダーゼは、シアリダーゼである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの精製ステップは、限外濾過及び／又はダイアフィルトレーションを含み、また少なくとも１つのクロマトグラフィーステップは、プロテインＡクロマトグラフィーを含む。
【0034】
貼付の図面は、以下の通りである。
【図面の簡単な説明】
【0035】
【図1】アスホターゼアルファの作製のための本明細書に記載の方法の実施形態を図示する。
【図2】温度変化の存在下及び不在下で様々な栄養補助剤の添加とともに増殖される細胞でのタンパク質シアリル化を表す。Ｂｒｘ－１＝温度変化を伴うコントロールプロセス；Ｂｒｘ－２＝温度変化を伴うコントロールプロセス；Ｂｒｘ－３＝温度変化を伴うＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ ２＋５；Ｂｒｘ－４＝温度変化を伴うＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ ２＋５；Ｂｒｘ５＝温度変化を伴うＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ ６；Ｂｒｘ－６＝温度変化を伴わないＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ ６；Ｂｒｘ－７＝温度変化を伴うＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ ７ａ＋７ｂ；Ｂｒｘ－８＝温度変化を伴わないＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ ７ａ＋７ｂ。１４日目の値が示される。
【図3A-3B】ＨＣＣＦ収集後の濃縮／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）の保持中のＴＳＡＣの減少とタンパク質濃度（図３Ａ）及び温度（図３Ｂ）との間の相関を表す。図３Ａは、ＴＳＡＣの減少速度における増加が、ＵＦ１濃度における１ｇ／Ｌの増加（位置１（ＬＮＨ）：平均：２．１ｇ／Ｌ及び位置２（ＬＢＨ）：平均：３．３ｇ／Ｌ）について０．１１モル／モル／１０時間であることを示唆する。図３Ｂは、ＴＳＡＣの減少速度における増加が、ＵＦ１保持温度における１℃の増加について０．１１モル／モル／１０時間であることを示唆する。
【図4】実施例２に記載の通り、３つの１０Ｌの清澄化収集ロットの各々において実施された小規模ＵＦ／ＤＦ１操作及び保持時間の概要である。
【図5】収集バッチ＃ＡにおけるプロテインＡクロマトグラフィープールステップでのＴＳＡＣ対保持時間、温度及びタンパク質濃度を表す。３つのタンパク質濃度（１．８８ｇ／Ｌ、３．０９ｇ／Ｌ及び４．４４ｇ／Ｌ）；３つの保持温度（１５℃、１９℃及び２５℃）；及び５つの保持時間（１２、２４、３６、４８及び６０時間）が試験された。
【図6】収集バッチ＃ＢにおけるプロテインＡクロマトグラフィープールステップでのＴＳＡＣ対保持時間、温度及びタンパク質濃度を表す。３つのタンパク質濃度（２．２５ｇ／Ｌ、３．６９ｇ／Ｌ及び５．２５ｇ／Ｌ）；３つの保持温度（１５℃、１９℃及び２５℃）；及び５つの保持時間（１２、２４、３６、４８及び６０時間）が試験された。
【図7】収集バッチ＃ＣにおけるプロテインＡクロマトグラフィープールステップでのＴＳＡＣ対保持時間、温度及びタンパク質濃度を表す。３つのタンパク質濃度（１．７７ｇ／Ｌ、２．８７ｇ／Ｌ及び４．０５ｇ／Ｌ）；３つの保持温度（１５℃、１９℃及び２５℃）；及び５つの保持時間（１２、２４、３６、４８及び６０時間）が試験された。
【図8】５１の製造バッチにおけるプロテインＡクロマトグラフィーステップ（ＰｒｏＡ）後及びバルク原薬充填ステップ（ＢＤＳ）時のＴＳＡＣ測定を示す。
【図9】３９の製造バッチにおける細胞培養液（ＣＣＦ）及び収集清澄化培養液（ＨＣＣＦ）でのＴＳＡＣ測定を示す。
【図10】３９の製造バッチにおける収集清澄化培養液（ＨＣＣＦ）、プロテインＡクロマトグラフィーステップ（ＰｒｏＡ）及びバルク原薬充填ステップ（ＢＤＳ）でのＴＳＡＣ測定を示す。
【図11】ＨＣＣＦからフィットモデル分析を実施することによって作出されたＪＭＰモデルの使用にかけてのＴＳＡＣの減少を示す。実際の実験結果も含まれる。
【図12】ＨＣＣＦからのＴＳＡＣの減少の関数としての保持時間、タンパク質濃度及び保持温度についてのＪＭＰモデルの予測プロファイラー出力を含む。
【発明を実施するための形態】
【0036】
定義
「約」、「およそ」：本明細書で用いられるとき、用語「約」及び「およそ」は、１つ以上の特定の細胞培養条件又は数値に適用されると、その培養条件、条件又は数値について述べられた参照値に類似する種々の値を指す。特定の実施形態では、用語「約」は、その培養条件、条件又は数値について述べられた参照値の２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１パーセント又はそれ未満の種々の値を指す。
「約」、「およそ」：本明細書で用いられるとき、用語「約」及び「およそ」は、１つ以上の特定の細胞培養条件又は数値に適用されると、その培養条件、条件又は数値について述べられた参照値に類似する種々の値を指す。特定の実施形態では、用語「約」は、その培養条件、条件又は数値について述べられた参照値の２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１パーセント又はそれ未満の種々の値を指す。
【0037】
「アミノ酸」：用語「アミノ酸」は、本明細書で用いられるとき、通常、ポリペプチド又はそれらのアミノ酸の類似体若しくは誘導体の形態で用いられる２０の天然に存在するアミノ酸のいずれかを指す。本開示のアミノ酸は、細胞培養物に対する培地中に提供され得る。培地中に提供されるアミノ酸は、塩として又は水和物形態で提供され得る。
【0038】
「バッチ培養」：用語「バッチ培養」は、本明細書で用いられるとき、培地（下記「培地」の定義を参照されたい）を含む、最終的に細胞を培養するのに用いられる成分のすべて及び細胞自体が培養プロセスの開始時に提供される、細胞を培養する方法を指す。バッチ培養は、典型的には、ある時点で停止され、培地中の細胞及び／又は成分は、収集され、任意選択的に精製される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、バッチ培養において用いられる。
【0039】
「バイオリアクター」：用語「バイオリアクター」は、本明細書で用いられるとき、細胞培養物（例えば、哺乳動物細胞培養物）の増殖のために用いられる任意の容器を指す。バイオリアクターは、細胞の培養にとって有用である限り、任意のサイズであり得る。典型的には、バイオリアクターは、少なくとも１リットル、１０、１００、２５０、５００、１０００、２５００、５０００、８０００、１０，０００、１２，００００、２０，０００リットル若しくはそれを超えるか又はそれらの間の任意の容積となる。いくつかの実施形態では、バイオリアクターは、１００リットル～２５，０００リットル、５００リットル～２０，０００リットル、１，０００リットル～２０，０００リットル、２，０００リットル～２０，０００リットル、５，０００リットル～２０，０００リットル又は１０，０００リットル～２０，０００リットルである。限定されないが、ｐＨ及び温度を含むバイオリアクターの内部条件は、典型的には、培養期間中に調節される。バイオリアクターは、ガラス、プラスチック又は金属を含む、本開示の培養条件下の培地に懸濁される哺乳類又は他の細胞培養物を保持することに適した任意の材料から構成され得る。用語「産生バイオリアクター」は、本明細書で用いられるとき、目的のポリペプチド又はタンパク質の作製に用いられる最終バイオリアクターを指す。大規模細胞培養産生バイオリアクターの容積は、典型的には、少なくとも５００リットルであり、１０００、２５００、５０００、８０００、１０，０００、１２，００００、２０，０００リットル若しくはそれを超えるか又はそれらの間の任意の容積であり得る。当業者は、本開示の実行における使用に適したバイオリアクターについて理解し、選択できるであろう。
【0040】
「細胞密度」：用語「細胞密度」は、本明細書で用いられるとき、所与の培地の体積中に存在する細胞の数を指す。
【0041】
「細胞生存度」：用語「細胞生存度」は、本明細書で用いられるとき、培養下の細胞が所与の培養条件又は実験バリエーションのセット下で生存する能力を指す。この用語は、本明細書で用いられるとき、特定の時点で生存している細胞の、その時点の培養下での細胞の総数（生存及び死滅）に対する割合も指す。
【0042】
「培養物」及び「細胞培養物」：これらの用語は、本明細書で用いられるとき、細胞集団の生存及び／又は増殖に適した条件下で培地（下記「培地」の定義を参照されたい）に懸濁される細胞集団を指す。当業者に明白であるように、これらの用語は、本明細書で用いられるとき、細胞集団及び集団が懸濁される培地を含む組み合わせを指し得る。
【0043】
「流加培養」：用語「流加培養」は、本明細書で用いられるとき、培養プロセスの開始後のいずれかの時点で追加的成分が培養物に提供される、細胞を培養する方法を指す。提供される成分は、典型的には、培養プロセス中に枯渇している、細胞のための栄養補助剤を含む。流加培養は、典型的には、ある時点で停止され、培地中の細胞及び／又は成分は、収集され、任意選択的に精製される。流加培養は、対応する流加バイオリアクター内で実施され得る。いくつかの実施形態では、本方法は、流加培養を含む。
【0044】
「断片」：用語「断片」は、本明細書で用いられるとき、ポリペプチドを指し、所与のポリペプチドの、そのポリペプチドに固有の又は特徴的な任意の分離部分として定義される。この用語は、本明細書で用いられるとき、完全長ポリペプチドの活性の少なくとも一部を保持する、所与のポリペプチドの任意の分離部分も指す。いくつかの実施形態では、保持される活性の割合は、完全長ポリペプチドの活性の少なくとも１０％である。様々な実施形態では、保持される活性の割合は、完全長ポリペプチドの活性の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％である。他の実施形態では、保持される活性の割合は、完全長ポリペプチドの活性の少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％である。一実施形態では、保持される活性の割合は、完全長ポリペプチドの活性の１００％である。この用語は、本明細書で用いられるとき、完全長ポリペプチド中に見出される少なくとも確立された配列要素を含む、所与のポリペプチドの任意の部分も指す。いくつかの実施形態では、配列要素は、完全長ポリペプチドの少なくとも４～５アミノ酸に及ぶ。いくつかの実施形態では、配列要素は、完全長ポリペプチドの少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０又はそれを超えるアミノ酸に及ぶ。
【0045】
「糖タンパク質（Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）」又は「糖タンパク質（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）」：これらの用語は、本明細書で用いられるとき、炭水化物基（シアル酸など）がポリペプチド鎖に結合したタンパク質又はポリペプチドを指す。
【0046】
「培地（ｍｅｄｉｕｍ）」、「培地（ｍｅｄｉａ）」「細胞培地」及び「培地（ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ）」：これらの用語は、本明細書で用いられるとき、哺乳動物細胞の増殖に栄養を与える栄養分を含有する溶液を指す。典型的には、これらの溶液は、最低限の増殖及び／又は生存に対して細胞が必要とする必須及び非必須アミノ酸、ビタミン、エネルギー源、脂質及び微量元素を提供する。溶液は、ホルモン及び増殖因子を含む、最小速度を超えて増殖及び／又は生存を増強する成分も含有し得る。溶液は、例えば、細胞生存及び増殖にとって最適なｐＨ及び塩濃度に向けて配合される。いくつかの実施形態では、培地は、「限定培地」、即ちタンパク質、加水分解物又は未知組成物の成分を含有しない無血清培地であり得る。限定培地は、動物由来成分を含まず、すべての成分は、既知の化学構造を有する。いくつかの実施形態では、培地は、基礎培地、即ち炭素源、水、塩、アミノ酸及び窒素の供給源（例えば、動物、例えば牛肉又は酵素抽出物）を含有する非限定培地である。様々な培地は、市販されており、当業者に公知である。いくつかの実施形態では、培地は、ＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）３０２無血清培地（Ｓｉｇｎａｍ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、ＣＤ ＤＧ４４培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、ＢＤ Ｓｅｌｅｃｔ培地（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）又はそれらの混合物、ＢＤ Ｓｅｌｅｃｔ培地とＳＦＭ４ＣＨＯ培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ ＵＴ）との混合物から選択される。いくつかの実施形態では、培地は、ＳＦＭ４ＣＨＯ培地とＢＤ Ｓｅｌｅｃｔ（商標）培地との組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、培地は、ＳＦＭ４ＣＨＯ培地とＢＤ Ｓｅｌｅｃｔ（商標）培地との組み合わせを、９０／１０、８０／２０、７５／２５、７０／３０、６０／４０又は５０／５０から選択される比で含む。いくつかの実施形態では、培地は、ＳＦＭ４ＣＨＯ培地とＢＤ Ｓｅｌｅｃｔ（商標）培地との組み合わせを７０／３０～９０／１０の比で含む。いくつかの実施形態では、培地は、ＳＦＭ４ＣＨＯ培地とＢＤ Ｓｅｌｅｃｔ（商標）培地との組み合わせを７５／２５の比で含む。
【0047】
「重量モル浸透圧濃度」及び「容積モル浸透圧濃度」：重量モル浸透圧濃度は、水溶液中に溶解した溶質粒子の浸透圧の尺度である。溶質粒子は、イオン及び非イオン化分子の両方を含む。重量モル浸透圧濃度は、１ｋｇの溶液に溶解した浸透圧的に活性な粒子の濃度（即ちオスモル）として表される（３８℃で１ｍＯｓｍ／ｋｇのＨ２Ｏは、１９ｍｍＨｇの浸透圧に等しい）。それに対し、「容積モル浸透圧濃度」は、１リットルの溶液に溶解した溶質粒子の数を指す。本明細書で用いられるとき、略記「ｍＯｓｍ」は、「ミリオスモル／ｋｇ溶液」を意味する。
【0048】
「灌流培養」：用語「灌流培養」は、本明細書で用いられるとき、培養プロセスの開始後に追加的成分が培養物に連続的又は半連続的に提供される、細胞を培養する方法を指す。提供される成分は、典型的には、培養プロセス中に枯渇している、細胞のための栄養補助剤を含む。培地中の細胞及び／又は成分の一部は、典型的には、連続又は半連続ベースで収集され、任意選択的に精製される。いくつかの実施形態では、栄養補助剤は、本明細書に記載されるとき、灌流培養下で添加され、即ち、それらは、定められた期間にわたって連続的に提供される。
【0049】
「ポリペプチド」：用語「ポリペプチド」は、本明細書で用いられるとき、ペプチド結合を介して一緒に連結されるアミノ酸の連続鎖を指す。この用語は、任意の長さのアミノ酸鎖を指すために用いられるが、当業者は、この用語が長い鎖に限定されず、ペプチド結合を介して一緒に連結される２つのアミノ酸を含む最小長さの鎖を指し得ることを理解するであろう。
【0050】
「タンパク質」：用語「タンパク質」は、本明細書で用いられるとき、分離単位として機能する１つ以上のポリペプチドを指す。単一のポリペプチドが分離機能単位であり、分離機能単位を形成するために他のポリペプチドとの永久的な物理的会合を必要としない場合、用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書で用いられるとき、交換可能に用いられる。
【0051】
「組換え発現されるポリペプチド」及び「組換えポリペプチド」：これらの用語は、本明細書で用いられるとき、ポリペプチドを発現するように遺伝子操作されている宿主細胞から発現されるポリペプチドを指す。組換え発現されるポリペプチドは、通常、哺乳類宿主細胞において発現されるポリペプチドに一致又は類似し得る。組換え発現されるポリペプチドは、宿主細胞に対して外来性でもあり得、即ち通常、宿主細胞において発現されるペプチドに対して異種性であり得る。代わりに、組換え発現されるポリペプチドは、ポリペプチドの一部が、通常、哺乳類宿主細胞において発現されるポリペプチドに一致又は類似するアミノ酸配列を有する一方、他の部分が宿主細胞に対して外来性である点でキメラであり得る。
【0052】
「播種」：用語「播種」は、本明細書で用いられるとき、細胞培養物をバイオリアクター又は別の容器に提供するプロセスを指す。細胞は、別のバイオリアクター又は容器内で予め増殖され得る。代わりに、細胞は、それらをバイオリアクター又は容器に提供する直前に凍結及び解凍され得る。この用語は、単細胞を含む任意の数の細胞を指す。様々な実施形態では、アルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）は、細胞が約１．０×１０５細胞／ｍＬ、１．５×１０５細胞／ｍＬ、２．０×１０５細胞／ｍＬ、２．５×１０５細胞／ｍＬ、３．０×１０５細胞／ｍＬ、３．５×１０５細胞／ｍＬ、４．０×１０５細胞／ｍＬ、４．５×１０５細胞／ｍＬ、５．０×１０５細胞／ｍＬ、５．５×１０５細胞／ｍＬ、６．０×１０５細胞／ｍＬ、６．５×１０５細胞／ｍＬ、７．０×１０５細胞／ｍＬ、７．５×１０５細胞／ｍＬ、８．０×１０５細胞／ｍＬ、８．５×１０５細胞／ｍＬ、９．０×１０５細胞／ｍＬ、９．５×１０５細胞／ｍＬ、１．０×１０６細胞／ｍＬ、１．５×１０６細胞／ｍＬ、２．０×１０６細胞／ｍＬの密度又はより高い密度で播種されるプロセスによって作製される。特定の一実施形態では、かかるプロセスにおいて、細胞は、約４．０×１０５細胞／ｍＬ、５．５×１０５細胞／ｍＬ又は８．０×１０５細胞／ｍＬの密度で播種される。
【0053】
「総シアル酸含量」又は「ＴＳＡＣ」：この用語は、本明細書で用いられるとき、特定のタンパク質分子上のシアル酸（炭水化物）の量を指す。それは、タンパク質の１モルあたりのモルでのＴＳＡＣ又は「モル／モル」として表される。ＴＳＡＣ濃度は、精製プロセス中に測定される。例えば、ＴＳＡＣ定量化の一方法は、ＴＳＡＣが酸加水分解を用いてアスホターゼアルファから放出され、その後、放出されたＴＳＡＣが、アンペロメトリック電気化学検出法を伴う高性能アニオン交換クロマトグラフィー（「ＨＰＡＥ－ＰＡＤ」）を用いた電気化学的検出を介して検出される。
【0054】
「力価」：用語「力価」は、本明細書で用いられるとき、細胞培養物によって産生される組換え発現されたポリペプチド又はタンパク質の総量が所与量の培地容量で除されたものを指す。力価は、典型的には、１ｍＬの培地あたりの数ミリグラム単位のポリペプチド又はタンパク質で表される。
【0055】
本明細書で用いられるアクロニムは、例えば、ＨＣＣＦ：収集清澄化培養液；ＵＦ：限外濾過、ＤＦ：ダイアフィルトレーション；ＶＣＤ：生細胞密度；ＩＶＣＣ：積分生細胞濃度；ＴＳＡＣ：総シアル酸含量；ＨＰＡＥ－ＰＡＤ：アンペロメトリック電気化学検出を伴う高性能アニオン交換クロマトグラフィー；ＳＥＣ：サイズ排除クロマトグラフィー；ＡＥＸ：アニオン交換クロマトグラフィー；ＬｏＣ：ラボオンチップ；及びＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ：マトリックス支援レーザー脱離／イオン化－飛行時間型を含む。
【0056】
本明細書で用いられるとき、用語「疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラム」は、固定相又は樹脂に対するタンパク質と疎水性基との間の疎水性相互作用により、目的タンパク質の断片及び凝集物、他のタンパク質若しくはタンパク質断片及び細胞片などの他の汚染物質を含む不純物又は他の精製ステップからの残留不純物からタンパク質が分離される、固定相又は樹脂及び移動相又は液相を含むカラムを指す。固定相又は樹脂は、疎水性リガンドが結合される基材マトリックス又は支持体、例えば架橋アガロース、シリカ又は合成共重合体材料を含む。かかる固定相又は樹脂の例として、フェニル、ブチル、オクチル、ヘキシル及び他のアルキルで置換されたアガロース、シリカ又は他の合成高分子が挙げられる。カラムは、固定相を含む任意のサイズであり得るか、又はオープン及びバッチプロセスで処理され得る。いくつかの実施形態では、組換えアルカリホスファターゼは、ＨＩＣを用いて細胞培養物から単離される。
【0057】
本明細書で用いられるとき、用語「調製物」は、目的のタンパク質を産生する細胞培養物からの目的のタンパク質（例えば、本明細書に記載の組換えアルカリホスファターゼ）及び少なくとも１つの不純物を含む溶液並びに／又は細胞培養物からかかる目的のタンパク質を抽出、濃縮及び／若しくは精製するために用いられる溶液を指す。例えば、目的のタンパク質（例えば、本明細書に記載の組換えアルカリホスファターゼ）の調製物は、細胞培養物中で増殖し、かかる目的のタンパク質を産生する細胞をホモジナイズ溶液中でホモジナイズすることによって調製され得る。いくつかの実施形態では、次に、調製物に１つ以上の精製／単離プロセス、例えばクロマトグラフィーステップが施される。
【0058】
本明細書で用いられるとき、用語「溶液」は、液体形態での２つ以上の物質の均一の分子混合物を指す。詳細には、いくつかの実施形態では、精製されるタンパク質、例えば本開示における組換えアルカリホスファターゼ又はその融合タンパク質（例えば、アスホターゼアルファ）は、溶液中の１つの物質を表す。用語「緩衝液」又は「緩衝溶液」は、その共役酸－塩基の範囲の作用により、ｐＨの変化に抗する溶液を指す。ｐＨを約ｐＨ５～約ｐＨ７の範囲で制御する緩衝液の例として、ヘペス、クエン酸塩、リン酸塩及び酢酸塩並びに他のミネラル酸又は有機酸緩衝液並びにこれらの組み合わせが挙げられる。塩のカチオンは、ナトリウム、アンモニウム及びカリウムを含む。本明細書で用いられるとき、用語「負荷緩衝液／溶液」又は「平衡緩衝液／溶液」は、塩又はタンパク質調製物をクロマトグラフィーカラム、例えばＨＩＣカラムに負荷するためにタンパク質調製物と混合される塩を含有する緩衝液／溶液を指す。この緩衝液／溶液は、タンパク質を負荷する前にカラムを平衡化し、且つ負荷後にカラムを洗浄するためにも用いられる。「溶出緩衝液／溶液」は、タンパク質をカラムから溶出するために用いられる緩衝液／溶液を指す。本明細書で用いられるとき、用語「溶液」は、水を含む緩衝液又は非緩衝液のいずれかを指す。
【0059】
用語「シアル酸」は、一般に、９炭素骨格を有する単糖の、ノイラミン酸のＮ－又はＯ－置換誘導体を指す。シアル酸は、具体的にはＮ－アセチルノイラミン酸化合物も指し得、ときにＮｅｕ５Ａｃ又はＮＡＮＡと略記される。シアル酸の存在は、吸収、血清半減期及び血清からの糖タンパク質の排除並びに糖タンパク質の物理、化学及び免疫原性特性に影響を与えることがある。本開示のいくつかの実施形態では、アルカリホスファターゼ、例えばアスホターゼアルファに会合されるシアル酸は、生理的状態下での分子の半減期に影響する。いくつかの実施形態では、アスホターゼアルファの総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）の正確且つ予測可能な制御は、組換えアスホターゼアルファにとっての決定的な品質特性として役立つ。いくつかの実施形態では、ＴＳＡＣは、１．２～３．０モル／モルのアスホターゼアルファ単量体である。いくつかの実施形態では、ＴＳＡＣは、バイオリアクター内での組換えタンパク質作製プロセスにおいて生成される。いくつかの実施形態では、本開示は、哺乳動物細胞培養物を通して、ＴＳＡＣを含有する組換えタンパク質中の総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）を制御する方法であって、少なくとも１つの精製ステップ及び少なくとも１つのクロマトグラフィーステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、精製及びクロマトグラフィーステップは、グリコシダーゼ活性の低下、したがって組換えタンパク質の総シアル酸含量の増加をもたらす。
【0060】
用語「シアリル化」は、グリコシル化の特定のタイプ、即ち１つ以上のシアル酸分子の生体分子への付加、特に１つ以上のシアル酸分子のタンパク質への付加を指す。本開示のいくつかの実施形態では、シアリル化は、シアリルトランスフェラーゼ酵素により実施される。いくつかの実施形態では、シアリルトランスフェラーゼは、シアル酸を新生オリゴ糖及び／又は糖タンパク質のＮ又はＯ結合型糖鎖に付加する。いくつかの実施形態では、シアリルトランスフェラーゼは、組換えアルカリホスファターゼを産生する細胞内に天然に存在する。いくつかの実施形態では、シアリルトランスフェラーゼは、組換えアルカリホスファターゼを産生する細胞を培養するのに用いられる細胞培地及び／又は栄養補充剤中に存在する。いくつかの実施形態では、シアリルトランスフェラーゼは、当技術分野で公知の組換えタンパク質発現方法を用いて組換え的に作製される。いくつかの実施形態では、組換えアルカリホスファターゼとは別々に作製される組換えシアリルトランスフェラーゼは、細胞培養物、収集清澄化培養液（ＨＣＣＦ）及び／又は濾過プールに外因性に添加される。
【0061】
本開示のいくつかの実施形態では、シアル酸基は、加水分解により糖タンパク質から除去される（即ち「脱シアリル化」）。いくつかの実施形態では、脱シアリル化は、グリコシダーゼ酵素により実施される。本明細書で用いられるとき、「配糖体ヒドロラーゼ」とも称される「グリコシダーゼ」は、配糖体の糖をアルコール又は別の糖単位に連結する結合の加水分解を触媒する酵素である。グリコシダーゼの例として、アミラーゼ、キシラナーゼ、セルラーゼ及びシアリダーゼが挙げられる。いくつかの実施形態では、脱シアリル化は、シアリダーゼ酵素により実施される。いくつかの実施形態では、シアリダーゼは、糖タンパク質、糖脂質、オリゴ糖、コロミン酸及び／又は合成基質における末端シアル酸残基のグリコシド結合を加水分解する。いくつかの実施形態では、シアリダーゼは、組換えアルカリホスファターゼを産生する細胞培地中に存在する。いくつかの実施形態では、シアリダーゼ活性は、総タンパク質濃度に依存し、且つ／又はそれと相関する。いくつかの実施形態では、シアリダーゼは、シアリダーゼが活性化される、決定的に高いタンパク質濃度になる時点まで本質的に不活性である。いくつかの実施形態では、シアリダーゼは、組換えアルカリホスファターゼを産生する細胞培養物のＨＣＣＦ又は濾過プール中に存在する。いくつかの実施形態では、シアリダーゼは、組換えアルカリホスファターゼ、例えばアスホターゼアルファにおけるグリコシル化部位からシアル酸部分を除去し、組換えアルカリホスファターゼのＴＳＡＣを有効に減少させる。いくつかの実施形態では、シアリダーゼは、細胞培養物、ＨＣＣＦ及び／又は濾過プールから選択的に除去される。シアリダーゼは、例えば、シアリダーゼに特異的な阻害剤、抗体、イオン交換及び／又はアフィニティークロマトグラフィー、免疫沈降などの１つ又は組み合わせにより選択的に除去され得る。バイオプロセス条件がタンパク質のシアル酸含量にどのように影響するかの概要については、Ｇｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．９（４）：３６６－３７３（１９９３）（その開示は、その全体がここで参照により援用される）を参照されたい。いくつかの実施形態では、本開示は、組換えタンパク質を産生する哺乳動物細胞培養物中のグリコシダーゼ活性を制御する方法であって、少なくとも１つの精製及び少なくとも１つのクロマトグラフィーステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、精製及びクロマトグラフィーステップは、グリコシダーゼ活性の低下、したがって組換えタンパク質の総シアル酸含量の増加をもたらす。
【0062】
ＨＣＣＦとして略記される用語「収集清澄化培養液」は、細胞培養物、例えばバイオリアクター内の細胞培養物から収集された清澄化濾液を指す。ＨＣＣＦは、典型的には、細胞培養物中に存在することがある細胞及び細胞片（例えば、不溶性生体分子など）を含まない。本開示のいくつかの実施形態では、ＨＣＣＦは、遠心分離、深濾過、滅菌濾過及び／又はクロマトグラフィーを通して生成される。いくつかの実施形態では、バイオリアクターからの細胞培養物は、ＨＣＣＦを生成するため、まず遠心分離及び／又は濾過され、次に少なくとも１つのクロマトグラフィーステップが施される。いくつかの実施形態では、ＨＣＣＦは、少なくとも１つのクロマトグラフィーステップ前及び／又は後に濃縮される。いくつかの実施形態では、ＨＣＣＦは、少なくとも１つのクロマトグラフィーステップ後に希釈される。いくつかの実施形態では、組換えアルカリホスファターゼを産生する細胞培養物からのＨＣＣＦは、組換えアルカリホスファターゼ及び汚染物質タンパク質を含有する。いくつかの実施形態では、ＨＣＣＦ中の汚染物質タンパク質は、シアリダーゼ酵素を含む。
【0063】
用語「濾過」及び「フロー濾過」は、溶液又は懸濁液中の成分をそれらのサイズ及び電荷差に基づいて分離するために膜を用いる圧力駆動プロセスを指す。フロー濾過は、通常のフロー濾過又は「タンジェンシャルフローフィルトレーション」であり得、ＴＦＦ又はクロスフロー濾過としても知られる。ＴＦＦは、典型的にはタンパク質を清澄化、濃縮及び精製するために用いられる。ＴＦＦプロセス中、流体は、少なくとも１つの膜の表面に沿う接線方向にポンピングされる。適用圧力は、流体の一部を、その膜を通して下流側に「濾液」として押すように機能する。膜孔を貫通するには大き過ぎる微粒子及び高分子は、上流側に「残余分」として保持される。ＴＦＦは、例えば、精密濾過、限外濾過（ウイルス濾過及び高性能ＴＦＦを含む）、逆浸透、ナノ濾過及びダイアフィルトレーションを含む様々な形態で用いられ得る。本開示のいくつかの実施形態では、ＴＦＦ形態の１つ以上は、タンパク質の処理及び／又は精製を意図して併用される。いくつかの実施形態では、限外濾過及びダイアフィルトレーションは、組換えアルカリホスファターゼを精製することを意図して併用される。限外濾過及びダイアフィルトレーションは、本明細書で説明される。
【0064】
「限外濾過」又は「ＵＦ」は、緩衝液交換、脱塩又は濃縮において緩衝液成分からタンパク質を分離するために用いられる精製プロセスである。保持されるタンパク質に応じて、約１ｋＤ～約１０００ｋＤの範囲内の膜分子量限界が用いられる。いくつかの実施形態では、ＵＦは、ＴＦＦプロセスである。
【0065】
「ダイアフィルトレーション」又は「ＤＦ」は、膜を通してより小さい分子を洗浄し、より大きい分子を保持液中に残し、最終的に濃度を変更しないような精製プロセスである。典型的には、生成物収量及び／又は純度を増加させるため、ＤＦは、別の精製プロセスと併用される。ＤＦ中、溶液（例えば、水又は緩衝液）は、サンプルリザーバー内に導入される一方、濾液は、単位操作から除去される。所望される生成物が保持液中に存在する場合のプロセスでは、ダイアフィルトレーションにより、成分が生成物プールから濾液中に洗浄され、それにより緩衝液が交換され、望ましくない種の濃度が減少する。生成物が濾液中に存在するとき、ダイアフィルトレーションにより、それが膜を通して収集容器内に洗浄される。いくつかの実施形態では、ＤＦは、ＴＦＦプロセスである。
【0066】
ときに「ＵＦＤＦプール」又は「ＵＦＤＦ」とも称される用語「濾過プール」は、濾過プロセスから、典型的には限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）組み合わせプロセスからの流体の総体積を指す。タンパク質精製との関連において、ＵＦＤＦは、限外濾過／ダイアフィルトレーションプロセスからの保持液を指す。
【0067】
本開示は、細胞培養物（例えば、限定されないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む哺乳動物細胞）によって発現される組換えタンパク質の収率、酵素機能及び一貫性を改善する方法を提供する。具体的には、組換えタンパク質は、例えば、発酵プロセスを通して特定の細胞型（例えば、限定されないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む哺乳動物細胞）によって産生され得る。細胞の接種及び増殖、タンパク質発現の誘導及びタンパク質発現のための様々なパラメータの最適化の全プロセスは、上流処理ステップと称される。それに対し、下流処理ステップは、例えば、産生タンパク質の回収及び精製（即ち細胞及び培地に由来する他の不純物並びに／又は汚染物質からの産生タンパク質の分離）を含み得る。例示的な下流プロセスステップは、例えば、収集物からのタンパク質の捕捉、宿主細胞片、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）及び宿主細胞ＤＮＡの除去、内毒素、ウイルス及びその他の封じ込め、緩衝液交換並びに配合調節などを含む。
【0068】
本開示は、細胞培養によって産生されるアルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）の収率、酵素機能及び一貫性を改善する方法を提供する。
【0069】
本開示は、組換えタンパク質を発現する細胞（例えば、限定されないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む哺乳動物細胞）を培養する方法を提供する。本開示は、細胞培養によるアルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）の作製を意図した製造システムを提供する。特定の実施形態では、細胞増殖、生存度及び／又はタンパク質産生若しくは品質に対して有害である１つ以上の代謝生成物の産生を最小化するシステムが提供される。特定の実施形態では、細胞培養は、バッチ培養、流加培養、培養又は連続培養である。
【0070】
アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）
本開示は、組換え細胞培養におけるアルカリホスファターゼタンパク質（例えば、アスホターゼアルファ）の製造に関する。アルカリホスファターゼタンパク質は、少なくともいくらかのアルカリホスファターゼ活性を含む任意のポリペプチド又はポリペプチドを含む分子を含む。様々な実施形態では、本明細書で開示されるアルカリホスファターゼは、当技術分野で公知のアルカリホスファターゼの任意の機能、例えばホスホエタノールアミン（ＰＥＡ）、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）及びピリドキサール５’－リン酸（ＰＬＰ）を含む天然基質に対する酵素活性を含み得る、アルカリホスファターゼ機能を有する任意のポリペプチドを含む。
本開示は、組換え細胞培養におけるアルカリホスファターゼタンパク質（例えば、アスホターゼアルファ）の製造に関する。アルカリホスファターゼタンパク質は、少なくともいくらかのアルカリホスファターゼ活性を含む任意のポリペプチド又はポリペプチドを含む分子を含む。様々な実施形態では、本明細書で開示されるアルカリホスファターゼは、当技術分野で公知のアルカリホスファターゼの任意の機能、例えばホスホエタノールアミン（ＰＥＡ）、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）及びピリドキサール５’－リン酸（ＰＬＰ）を含む天然基質に対する酵素活性を含み得る、アルカリホスファターゼ機能を有する任意のポリペプチドを含む。
【0071】
特定の実施形態では、かかるアルカリホスファターゼタンパク質は、本明細書で開示される方法によって作製され、次いで精製された後、アルカリホスファターゼ関連疾患又は障害を治療又は予防するために用いられ得る。例えば、かかるアルカリホスファターゼタンパク質は、内因性アルカリホスファターゼの減少及び／又は機能不全を有するか、又は過剰発現された（例えば、正常レベルを超える）アルカリホスファターゼ基質を有する対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、本開示におけるアルカリホスファターゼタンパク質は、組換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、アルカリホスファターゼタンパク質は、融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、本開示におけるアルカリホスファターゼタンパク質は、細胞型、組織（例えば、結合、筋肉、神経又は上皮組織）又は臓器（例えば、肝臓、心臓、腎臓、筋肉、骨、軟骨、靱帯、腱など）を特異的に標的にする。例えば、かかるアルカリホスファターゼタンパク質は、完全長アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）又は少なくとも１つのアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の断片を含み得る。いくつかの実施形態では、アルカリホスファターゼタンパク質は、骨標的部分（例えば、下記のような負に荷電したペプチド）に連結される可溶性ＡＬＰ（ｓＡＬＰ）を含む。いくつかの実施形態では、アルカリホスファターゼタンパク質は、免疫グロブリン部分（完全長又は断片）に連結される可溶性ＡＬＰ（ｓＡＬＰ）を含む。例えば、かかる免疫グロブリン部分は、結晶化可能領域断片（Ｆｃ）を含み得る。いくつかの実施形態では、アルカリホスファターゼタンパク質は、骨標的部分と免疫グロブリン部分（完全長又は断片）との両方に連結される可溶性ＡＬＰ（ｓＡＬＰ）を含む。本明細書で開示されるアルカリホスファターゼタンパク質のより詳細な説明については、ＰＣＴ公開の国際公開第２００５／１０３２６３号パンフレット及び国際公開第２００８／１３８１３１号パンフレット（それらの両方の教示は、その全体が参照により本明細書に援用される）を参照されたい。
【0072】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のアルカリホスファターゼタンパク質は、ｓＡＬＰ－Ｘ、Ｘ－ｓＡＬＰ、ｓＡＬＰ－Ｙ、Ｙ－ｓＡＬＰ、ｓＡＬＰ－Ｘ－Ｙ、ｓＡＬＰ－Ｙ－Ｘ、Ｘ－ｓＡＬＰ－Ｙ、Ｘ－Ｙ－ｓＡＬＰ、Ｙ－ｓＡＬＰ－Ｘ及びＹ－Ｘ－ｓＡＬＰ（式中、Ｘは、本明細書に記載のように骨標的部分を含み、且つＹは、本明細書に記載のように免疫グロブリン部分を含む）からなる群から選択される構造のいずれか１つを含む。一実施形態では、アルカリホスファターゼタンパク質は、Ｗ－ｓＡＬＰ－Ｘ－Ｆｃ－Ｙ－Ｄｎ／Ｅｎ－Ｚ（式中、Ｗは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｘは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｙは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｚは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｆｃは、結晶化可能領域断片であり、Ｄｎ／Ｅｎは、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸又はそれらの組み合わせであり、ここで、ｎ＝８～２０であり、及びｓＡＬＰは、可溶性アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）である）の構造を含む。いくつかの実施形態では、Ｄｎ／Ｅｎは、ポリアスパラギン酸配列である。例えば、Ｄｎは、ポリアスパラギン酸配列であり得、ここで、ｎは、８～２０の任意の数（両方が含まれる）である（例えば、ｎは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０であり得る）。一実施形態では、Ｄｎは、Ｄ１０又はＤ１６である。いくつかの実施形態では、Ｄｎ／Ｅｎは、ポリグルタミン酸配列である。例えば、Ｅｎは、ポリグルタミン酸配列であり得、ここで、ｎは、８～２０の任意の数（両方が含まれる）である（例えば、ｎは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９及び２０であり得る）。一実施形態では、Ｅｎは、Ｅ１０又はＥ１６である。
【0073】
例えば、かかるｓＡＬＰは、免疫グロブリン分子の完全長又は断片（例えば、結晶化可能領域断片（Ｆｃ））に融合され得る。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、Ｗ－ｓＡＬＰ－Ｘ－Ｆｃ－Ｙ－Ｄｎ－Ｚ（式中、Ｗは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｘは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｙは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｚは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｆｃは、結晶化可能領域断片であり、Ｄｎは、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸又はそれらの組み合わせであり、ここで、ｎ＝１０又は１６であり、及び前記ｓＡＬＰは、可溶性アルカリホスファターゼである）の構造を含む。一実施形態では、ｎ＝１０である。別の実施形態では、Ｗ及びＺは、前記ポリペプチドに不在である。いくつかの実施形態では、前記Ｆｃは、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態では、前記Ｆｃは、ＩｇＧ－１、ＩｇＧ－２、ＩｇＧ－３、ＩｇＧ－３及びＩｇＧ－４からなる群から選択される免疫グロブリンの定常ドメインである。一実施形態では、前記Ｆｃは、免疫グロブリンＩｇＧ－１の定常ドメインである。特定の一実施形態では、前記Ｆｃは、配列番号１のＤ４８８－Ｋ７１４に示される配列を含む。
【0074】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるアルカリホスファターゼは、Ｗ－ｓＡＬＰ－Ｘ－Ｆｃ－Ｙ－Ｄｎ－Ｚ（式中、Ｗは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｘは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｙは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｚは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｆｃは、結晶化可能領域断片であり、Ｄｎは、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸又はそれらの組み合わせであり、ここで、ｎ＝１０又は１６であり、及び前記ｓＡＬＰは、可溶性アルカリホスファターゼである）の構造を含む。かかるｓＡＬＰは、ホスホエタノールアミン（ＰＥＡ）、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）及びピリドキサール５’－リン酸（ＰＬＰ）の少なくとも１つの切断を触媒する能力がある。様々な実施形態では、本明細書で開示されるｓＡＬＰは、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）の切断を触媒する能力がある。かかるｓＡＬＰは、Ｃ末端の糖脂質アンカー（ＧＰＩ）を有しないアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の活性のあるアンカー型のすべてのアミノ酸を含み得る。かかるＡＬＰは、組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＡＬＰ）、胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＡＬＰ）、胚細胞アルカリホスファターゼ（ＧＣＡＬＰ）及び腸アルカリホスファターゼ（ＩＡＰ）又は本明細書で開示されるそれらのキメラ若しくは融合型又は変異体の少なくとも１つであり得る。特定の一実施形態では、ＡＬＰは、組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＡＬＰ）を含む。別の実施形態では、本明細書で開示されるｓＡＬＰは、配列番号１のＬ１－Ｓ４８５に示される配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによってコードされる。さらに別の実施形態では、本明細書で開示されるｓＡＬＰは、配列番号１のＬ１－Ｓ４８５に示される配列を含む。
【0075】
一実施形態では、アルカリホスファターゼタンパク質は、ＴＮＡＬＰ－Ｆｃ－Ｄ１０（配列番号１、下に列挙の通り）の構造を含む。下線部のアスパラギン（Ｎ）残基は、予想されるグリコシル化部位（即ちＮ１２３、２１３、２５４、２８６、４１３及び５６４）に対応する。太字下線部のアミノ酸残基（Ｌ４８６－Ｋ４８７及びＤ７１５－Ｉ７１６）は、それぞれｓＡＬＰとＦｃとの間及びＦｃとＤ１０ドメインとの間のリンカーに対応する。
【化1】
【0076】
この実施形態では、ポリペプチドは、５つの部分から構成される。アミノ酸Ｌ１－Ｓ４８５を有する第１の部分（ｓＡＬＰ）は、触媒機能を有する、ヒト組織非特異的アルカリホスファターゼ酵素の可溶性部分である。第２の部分は、リンカーとしてアミノ酸Ｌ４８６－Ｋ４８７を有する。アミノ酸Ｄ４８８－Ｋ７１４を有する第３の部分（Ｆｃ）は、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有するヒト免疫グロブリンγ１（ＩｇＧ１）のＦｃ部分である。第４の部分は、リンカーとしてアミノ酸Ｄ７１５－Ｉ７１６を有する。第５の部分は、アスホターゼアルファが骨の鉱物相に結合することを可能にする骨標的部分であるアミノ酸Ｄ７１７－Ｄ７２６（Ｄ１０）を有する。さらに、各ポリペプチド鎖は、６つの予想されるグリコシル化部位及び１１のシステイン（Ｃｙｓ）残基を有する。Ｃｙｓ１０２は、遊離システインとして存在する。各ポリペプチド鎖は、Ｃｙｓ１２２とＣｙｓ１８４、Ｃｙｓ４７２とＣｙｓ４８０、Ｃｙｓ５２８とＣｙｓ５８８及びＣｙｓ６３４とＣｙｓ６９２との間に４つの鎖内ジスルフィド結合を有する。２つのポリペプチド鎖は、両方の鎖上のＣｙｓ４９３間及び両方の鎖上のＣｙｓ４９６間の２つの鎖間ジスルフィド結合によって連結される。これらの共有結合構造的特徴に加えて、哺乳類アルカリホスファターゼは、各ポリペプチド鎖上において、亜鉛に対する２つの部位、マグネシウムに対する１つの部位及びカルシウムに対する１つの部位を含む４つの金属結合部位を有すると考えられる。
【0077】
ＡＬＰには、４つの既知のアイソザイム、即ちさらに下に記される組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＡＬＰ）、胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＡＬＰ）（例えば、ジェンバンク受入番号ＮＰ＿１１２６０３及びＮＰ＿００１６２３に記述される通り）、胚細胞アルカリホスファターゼ（ＧＣＡＬＰ）（例えば、ジェンバンク受入番号Ｐ１０６９６に記述される通り）及び腸アルカリホスファターゼ（ＩＡＰ）（例えば、ジェンバンク受入番号ＮＰ＿００１６２２に記述される通り）が存在する。これらの酵素は、酷似する三次元構造を有する。それら触媒部位の各々は、２個のＺｎ及び１個のＭｇを含む、酵素活性にとって必要な金属イオンに対する４つの金属結合ドメインを有する。これらの酵素は、リン酸のモノエステルの加水分解を触媒し、高濃度のリン酸受容体の存在下でトランスリン酸化反応も触媒する。ＡＬＰ（例えば、ＴＮＡＬＰ）に対する３つの既知の天然基質は、ホスホエタノールアミン（ＰＥＡ）、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）及びピリドキサール５’－リン酸（ＰＬＰ）を含む（Ｗｈｙｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ９５：１４４０－１４４５）。これらのアイソザイム間の整列化は、国際公開第２００８／１３８１３１号パンフレット（その教示は、その全体が参照により本明細書に援用される）の図３０に示される。
【0078】
本開示におけるアルカリホスファターゼタンパク質は、任意のＡＬＰタンパク質の二量体又は多量体を単独で又は組み合わせて含み得る。キメラＡＬＰタンパク質又は融合タンパク質、例えばＫｉｆｆｅｒ－Ｍｏｒｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．２０１４ ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９：ｅ８９３７４（その全教示は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載のキメラＡＬＰタンパク質も作製され得る。
【0079】
特定の一実施形態では、本明細書で開示されるアルカリホスファターゼは、配列番号１に示される配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるアルカリホスファターゼは、配列番号１に対して８０％、８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるアルカリホスファターゼは、配列番号１に対して９５％又は９９％の同一性を有する配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによってコードされる。別の実施形態では、本明細書で開示されるアルカリホスファターゼは、配列番号１に示される配列を含む。
【0080】
ＴＮＡＬＰ
上に示される通り、ＴＮＡＬＰは、糖脂質を通してそのＣ末端に固定される膜結合タンパク質である（ヒトＴＮＡＬＰについては、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ０５１８６を参照されたい）。この糖脂質アンカー（ＧＰＩ）は、翻訳後、一時的な膜アンカーとＧＰＩの付加に対するシグナルとの両方として役立つ疎水性Ｃ末端の除去後に付加される。したがって、一実施形態では、可溶性ヒトＴＮＡＬＰは、疎水性Ｃ末端配列の１番目のアミノ酸、即ちアラニンが停止コドンで置換されるＴＮＡＬＰを含む。そのように形成された可溶性ＴＮＡＬＰ（本明細書中でｓＴＮＡＬＰと称される）は、ＧＰＩ膜アンカーを欠如する触媒部位の形成に必要である、ＴＮＡＬＰの天然アンカー型のすべてのアミノ酸を含有する。公知のＴＮＡＬＰとして、例えばヒトＴＮＡＬＰ［ジェンバンク受入番号ＮＰ－０００４６９、ＡＡＩ１０９１０、ＡＡＨ９０８６１、ＡＡＨ６６１１６、ＡＡＨ２１２８９及びＡＡＩ２６１６６］；アカゲザルＴＮＡＬＰ［ジェンバンク受入番号ＸＰ－００１１０９７１７］；ラットＴＮＡＬＰ［ジェンバンク受入番号ＮＰ＿０３７１９１］；イヌＴＮＡＬＰ［ジェンバンク受入番号ＡＡＦ６４５１６］；ブタＴＮＡＬＰ［ジェンバンク受入番号ＡＡＮ６４２７３］、マウスＴＮＡＬＰ［ジェンバンク受入番号ＮＰ＿０３１４５７］、ウシＴＮＡＬＰ［ジェンバンク受入番号ＮＰ＿７８９８２８、ＮＰ＿７７６４１２、ＡＡＭ８２０９及びＡＡＣ３３８５８］並びにネコＴＮＡＬＰ［ジェンバンク受入番号ＮＰ＿００１０３６０２８］が挙げられる。
上に示される通り、ＴＮＡＬＰは、糖脂質を通してそのＣ末端に固定される膜結合タンパク質である（ヒトＴＮＡＬＰについては、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ０５１８６を参照されたい）。この糖脂質アンカー（ＧＰＩ）は、翻訳後、一時的な膜アンカーとＧＰＩの付加に対するシグナルとの両方として役立つ疎水性Ｃ末端の除去後に付加される。したがって、一実施形態では、可溶性ヒトＴＮＡＬＰは、疎水性Ｃ末端配列の１番目のアミノ酸、即ちアラニンが停止コドンで置換されるＴＮＡＬＰを含む。そのように形成された可溶性ＴＮＡＬＰ（本明細書中でｓＴＮＡＬＰと称される）は、ＧＰＩ膜アンカーを欠如する触媒部位の形成に必要である、ＴＮＡＬＰの天然アンカー型のすべてのアミノ酸を含有する。公知のＴＮＡＬＰとして、例えばヒトＴＮＡＬＰ［ジェンバンク受入番号ＮＰ－０００４６９、ＡＡＩ１０９１０、ＡＡＨ９０８６１、ＡＡＨ６６１１６、ＡＡＨ２１２８９及びＡＡＩ２６１６６］；アカゲザルＴＮＡＬＰ［ジェンバンク受入番号ＸＰ－００１１０９７１７］；ラットＴＮＡＬＰ［ジェンバンク受入番号ＮＰ＿０３７１９１］；イヌＴＮＡＬＰ［ジェンバンク受入番号ＡＡＦ６４５１６］；ブタＴＮＡＬＰ［ジェンバンク受入番号ＡＡＮ６４２７３］、マウスＴＮＡＬＰ［ジェンバンク受入番号ＮＰ＿０３１４５７］、ウシＴＮＡＬＰ［ジェンバンク受入番号ＮＰ＿７８９８２８、ＮＰ＿７７６４１２、ＡＡＭ８２０９及びＡＡＣ３３８５８］並びにネコＴＮＡＬＰ［ジェンバンク受入番号ＮＰ＿００１０３６０２８］が挙げられる。
【0081】
本明細書で用いられるとき、用語「細胞外ドメイン」は、（例えば、ペプチドシグナルを伴わない）天然タンパク質の任意の機能的細胞外部分を指すことを意味する。元のアミノ酸１～５０１（分泌時、１８～５０１）、アミノ酸１～５０２（分泌時、１８～５０２）、アミノ酸１～５０４（分泌時、１８～５０４）又はアミノ酸１～５０５（分泌時、１８～５０５）を保持する組換えｓＴＮＡＬＰポリペプチドは、酵素活性がある（Ｏｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １２６：６９４－６９９を参照されたい）。これは、アミノ酸残基が天然タンパク質のＣ末端からその酵素活性に影響することなく除去され得ることを示す。さらに、可溶性ヒトＴＮＡＬＰは、１つ以上のアミノ酸置換を含み得、かかる置換は、ｓＴＮＡＬＰの酵素活性を低下させないか又は少なくとも完全に阻害することはない。例えば、低ホスファターゼ症（ＨＰＰ）の原因となることが知られる特定の突然変異は、ＰＣＴ公開の国際公開第２００８／１３８１３１号パンフレットに列挙されており、機能的ｓＴＮＡＬＰを維持するために回避される必要がある。
【0082】
負に荷電したペプチド
本開示のアルカリホスファターゼタンパク質は、所定の細胞型、組織又は臓器に対してアルカリホスファターゼタンパク質を特異的に標的にすることがある標的部分を含み得る。いくつかの実施形態では、かかる所定の細胞型、組織又は臓器は、骨組織である。かかる骨標的部分は、任意の公知のポリペプチド、ポリヌクレオチド又は当技術分野で公知の小分子化合物を含み得る。例えば、負に荷電したペプチドは、骨標的部分として用いられ得る。いくつかの実施形態では、かかる負に荷電したペプチドは、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸又はそれらの組み合わせ（例えば、少なくとも１つのアスパラギン酸と少なくとも１つのグルタミン酸とを含むポリペプチド、例えばアスパラギン酸及びグルタミン酸残基の組み合わせを含む負に荷電したペプチド）であり得る。いくつかの実施形態では、かかる負に荷電したペプチドは、Ｄ６、Ｄ７、Ｄ８、Ｄ９、Ｄ１０、Ｄ１１、Ｄ１２、Ｄ１３、Ｄ１４、Ｄ１５、Ｄ１６、Ｄ１７、Ｄ１８、Ｄ１９、Ｄ２０又は２０を超えるアスパラギン酸を有するポリアスパラギン酸であり得る。いくつかの実施形態では、かかる負に荷電したペプチドは、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ８、Ｅ９、Ｅ１０、Ｅ１１、Ｅ１２、Ｅ１３、Ｅ１４、Ｅ１５、Ｅ１６、Ｅ１７、Ｅ１８、Ｅ１９、Ｅ２０又は２０を超えるグルタミン酸を有するポリグルタミン酸であり得る。一実施形態では、かかる負に荷電したペプチドは、Ｄ１０～Ｄ１６又はＥ１０～Ｅ１６からなる群から選択される少なくとも１つを含み得る。
本開示のアルカリホスファターゼタンパク質は、所定の細胞型、組織又は臓器に対してアルカリホスファターゼタンパク質を特異的に標的にすることがある標的部分を含み得る。いくつかの実施形態では、かかる所定の細胞型、組織又は臓器は、骨組織である。かかる骨標的部分は、任意の公知のポリペプチド、ポリヌクレオチド又は当技術分野で公知の小分子化合物を含み得る。例えば、負に荷電したペプチドは、骨標的部分として用いられ得る。いくつかの実施形態では、かかる負に荷電したペプチドは、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸又はそれらの組み合わせ（例えば、少なくとも１つのアスパラギン酸と少なくとも１つのグルタミン酸とを含むポリペプチド、例えばアスパラギン酸及びグルタミン酸残基の組み合わせを含む負に荷電したペプチド）であり得る。いくつかの実施形態では、かかる負に荷電したペプチドは、Ｄ６、Ｄ７、Ｄ８、Ｄ９、Ｄ１０、Ｄ１１、Ｄ１２、Ｄ１３、Ｄ１４、Ｄ１５、Ｄ１６、Ｄ１７、Ｄ１８、Ｄ１９、Ｄ２０又は２０を超えるアスパラギン酸を有するポリアスパラギン酸であり得る。いくつかの実施形態では、かかる負に荷電したペプチドは、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ８、Ｅ９、Ｅ１０、Ｅ１１、Ｅ１２、Ｅ１３、Ｅ１４、Ｅ１５、Ｅ１６、Ｅ１７、Ｅ１８、Ｅ１９、Ｅ２０又は２０を超えるグルタミン酸を有するポリグルタミン酸であり得る。一実施形態では、かかる負に荷電したペプチドは、Ｄ１０～Ｄ１６又はＥ１０～Ｅ１６からなる群から選択される少なくとも１つを含み得る。
【0083】
スペーサー
いくつかの実施形態では、本開示のアルカリホスファターゼタンパク質は、ＡＬＰ部分と標的部分との間にスペーサー配列を含む。一実施形態では、かかるアルカリホスファターゼタンパク質は、ＡＬＰ（例えば、ＴＮＡＬＰ）部分と負に荷電したペプチド標的部分との間にスペーサー配列を含む。かかるスペーサーは、任意のポリペプチド、ポリヌクレオチド又は小分子化合物であり得る。いくつかの実施形態では、かかるスペーサーは、結晶化可能領域断片（Ｆｃ）の断片を含み得る。有用なＦｃ断片は、ヒンジ並びにＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むＩｇＧのＦｃ断片を含む。かかるＩｇＧは、ＩｇＧ－１、ＩｇＧ－２、ＩｇＧ－３、ＩｇＧ－３及びＩｇＧ－４又はそれらの任煮の組み合わせのいずれかであり得る。
いくつかの実施形態では、本開示のアルカリホスファターゼタンパク質は、ＡＬＰ部分と標的部分との間にスペーサー配列を含む。一実施形態では、かかるアルカリホスファターゼタンパク質は、ＡＬＰ（例えば、ＴＮＡＬＰ）部分と負に荷電したペプチド標的部分との間にスペーサー配列を含む。かかるスペーサーは、任意のポリペプチド、ポリヌクレオチド又は小分子化合物であり得る。いくつかの実施形態では、かかるスペーサーは、結晶化可能領域断片（Ｆｃ）の断片を含み得る。有用なＦｃ断片は、ヒンジ並びにＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むＩｇＧのＦｃ断片を含む。かかるＩｇＧは、ＩｇＧ－１、ＩｇＧ－２、ＩｇＧ－３、ＩｇＧ－３及びＩｇＧ－４又はそれらの任煮の組み合わせのいずれかであり得る。
【0084】
この理論に制限されることなく、骨標的化ｓＡＬＰ融合タンパク質（例えば、アスホターゼアルファ）で用いられるＦｃ断片がスペーサーとして作用し、ｓＴＮＡＬＰ－Ｆｃ－Ｄ１０の発現がｓＴＮＡＬＰ－Ｄ１０の発現よりも高いと仮定すると、タンパク質がより効率的に折り畳まれることを可能にすると考えられる。１つの考えられる説明は、Ｆｃ断片の導入が、本明細書に例示されるｓＡＬＰ配列のＣ末端に付加される高度に負に荷電したＤ１０配列の存在によって引き起こされる斥力を軽減することである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のアルカリホスファターゼタンパク質は、ｓＡＬＰ－Ｆｃ－Ｄ１０、ｓＡＬＰ－Ｄ１０－Ｆｃ、Ｄ１０－ｓＡＬＰ－Ｆｃ、Ｄ１０－Ｆｃ－ｓＡＬＰ、Ｆｃ－ｓＡＬＰ－Ｄ１０及びＦｃ－Ｄ１０－ｓＡＬＰからなる群から選択される構造を含む。他の実施形態では、上記の構造中のＤ１０は、他の負に荷電したポリペプチド（例えば、Ｄ８、Ｄ１６、Ｅ１０、Ｅ８、Ｅ１６など）で置換される。
【0085】
本開示にとって有用なスペーサーは、例えば、Ｆｃを含むポリペプチド並びにｓＡＬＰ配列のＣ末端に付加される高度に負に荷電した骨標的配列（例えば、Ｄ１０）の存在によって引き起こされる斥力を軽減することができる親水性及び柔軟性ポリペプチドを含む。
【0086】
二量体／四量体
具体的な実施形態では、本開示の骨標的化ｓＡＬＰ融合タンパク質は、二量体又は四量体を形成するように会合される。
具体的な実施形態では、本開示の骨標的化ｓＡＬＰ融合タンパク質は、二量体又は四量体を形成するように会合される。
【0087】
二量体立体配置では、鎖間ジスルフィド結合の形成によって課せられる立体障害は、おそらく、正常細胞内に存在する最小の触媒活性タンパク質二量体に会合するためのｓＡＬＰドメインの会合性を阻止する。
【0088】
骨標的化ｓＡＬＰは、任意選択的に、１）負に荷電したペプチド（例えば、骨標識剤）から下流、及び／又は２）負に荷電したペプチド（例えば、骨標識剤）とＦｃ断片との間、及び／又は３）スペーサー（例えば、Ｆｃ断片）とｓＡＬＰ断片との間に１つ以上の追加的なアミノ酸をさらに含み得る。例えば、骨標的コンジュゲートを作製するために用いられるクローニング方法により、これらの位置に外因性アミノ酸が導入される場合にこれが生じ得る。しかし、外因性アミノ酸は、さらなるＧＰＩアンカーシグナルをもたらさないように選択される必要がある。設計された配列が宿主細胞のトランスアミダーゼによって切断される可能性は、Ｉｋｅｚａｗａ，２００２ Ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ（ＧＰＩ）－ａｎｃｈｏｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｂｉｏｌ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ．２５：４０９－１７に記載のように予測可能である。
【0089】
本開示は、例えば、本明細書中で明記されるものを含むグリコシル化、アセチル化、アミド化、封鎖、ホルミル化、γ－カルボキシグルタミン酸水酸化、メチル化、リン酸化、ピロリドンカルボン酸及び硫酸化によって翻訳後修飾される融合タンパク質も包含する。
【0090】
アスホターゼアルファ
アスホターゼアルファは、２つのＴＮＡＬＰ－Ｆｃ－Ｄ１０ポリペプチド（それぞれ配列番号１に示されるような７２６アミノ酸を有する）からなる可溶性Ｆｃ融合タンパク質である。各々のポリペプチド又は単量体は、５つの部分から構成される。アミノ酸Ｌ１－Ｓ４８５を有する第１の部分（ｓＡＬＰ）は、触媒機能を有する、ヒト組織非特異的アルカリホスファターゼ酵素の可溶性部分である。第２の部分は、リンカーとしてアミノ酸Ｌ４８６－Ｋ４８７を有する。アミノ酸Ｄ４８８－Ｋ７１４を有する第３の部分（Ｆｃ）は、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有するヒト免疫グロブリンγ１（ＩｇＧ１）のＦｃ部分である。第４の部分は、リンカーとしてＤ７１５－Ｉ７１６を有する。第５の部分は、アスホターゼアルファが骨の鉱物相に結合することを可能にする骨標的部分であるアミノ酸Ｄ７１７－Ｄ７２６（Ｄ１０）を有する。さらに、各ポリペプチド鎖は、６つの予想されるグリコシル化部位及び１１のシステイン（Ｃｙｓ）残基を有する。Ｃｙｓ１０２は、遊離システインとして存在する。各ポリペプチド鎖は、４つの鎖内ジスルフィド結合をＣｙｓ１２２とＣｙｓ１８４、Ｃｙｓ４７２とＣｙｓ４８０、Ｃｙｓ５２８とＣｙｓ５８８及びＣｙｓ６３４とＣｙｓ６９２との間に有する。２つのポリペプチド鎖は、両方の鎖上のＣｙｓ４９３間及び両方の鎖上のＣｙｓ４９６間での２つの鎖間ジスルフィド結合によって連結される。これらの共有結合構造的特徴に加えて、哺乳類アルカリホスファターゼは、各ポリペプチド鎖上において、亜鉛に対する２つの部位、マグネシウムに対する１つの部位及びカルシウムに対する１つの部位を含む４つの金属結合部位を有すると考えられる。
アスホターゼアルファは、２つのＴＮＡＬＰ－Ｆｃ－Ｄ１０ポリペプチド（それぞれ配列番号１に示されるような７２６アミノ酸を有する）からなる可溶性Ｆｃ融合タンパク質である。各々のポリペプチド又は単量体は、５つの部分から構成される。アミノ酸Ｌ１－Ｓ４８５を有する第１の部分（ｓＡＬＰ）は、触媒機能を有する、ヒト組織非特異的アルカリホスファターゼ酵素の可溶性部分である。第２の部分は、リンカーとしてアミノ酸Ｌ４８６－Ｋ４８７を有する。アミノ酸Ｄ４８８－Ｋ７１４を有する第３の部分（Ｆｃ）は、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有するヒト免疫グロブリンγ１（ＩｇＧ１）のＦｃ部分である。第４の部分は、リンカーとしてＤ７１５－Ｉ７１６を有する。第５の部分は、アスホターゼアルファが骨の鉱物相に結合することを可能にする骨標的部分であるアミノ酸Ｄ７１７－Ｄ７２６（Ｄ１０）を有する。さらに、各ポリペプチド鎖は、６つの予想されるグリコシル化部位及び１１のシステイン（Ｃｙｓ）残基を有する。Ｃｙｓ１０２は、遊離システインとして存在する。各ポリペプチド鎖は、４つの鎖内ジスルフィド結合をＣｙｓ１２２とＣｙｓ１８４、Ｃｙｓ４７２とＣｙｓ４８０、Ｃｙｓ５２８とＣｙｓ５８８及びＣｙｓ６３４とＣｙｓ６９２との間に有する。２つのポリペプチド鎖は、両方の鎖上のＣｙｓ４９３間及び両方の鎖上のＣｙｓ４９６間での２つの鎖間ジスルフィド結合によって連結される。これらの共有結合構造的特徴に加えて、哺乳類アルカリホスファターゼは、各ポリペプチド鎖上において、亜鉛に対する２つの部位、マグネシウムに対する１つの部位及びカルシウムに対する１つの部位を含む４つの金属結合部位を有すると考えられる。
【0091】
アスホターゼアルファは、次のようにも特徴付けることができる。Ｎ末端からＣ末端へ、アスホターゼアルファは、（１）ヒト組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＳＡＬＰ）の可溶性触媒ドメイン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ０５１８６）、（２）ヒト免疫グロブリンＧ１ Ｆｃドメイン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ０１８５７）、及び（３）骨標的化ドメインとして用いられるデカアスパラギン酸ペプチド（Ｄ１０）を含む（Ｎｉｓｈｉｏｋａ ｅｔ ａｌ．２００６ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ ８８：２４４－２５５）。タンパク質は、２つの一次タンパク質配列からホモ二量体に会合する。この融合タンパク質は、６つの確認された複雑なＮ－グリコシル化部位を有する。これらのＮ－グリコシル化部位の５つは、ｓＡＬＰドメイン上に位置し、１つは、Ｆｃドメイン上に位置する。アスホターゼアルファ上に存在する別の重要な翻訳後修飾は、酵素とＦｃ－ドメイン構造とを安定化するジスルフィド架橋の存在である。全部で４つの分子内ジスルフィド架橋が１単量体あたりに存在し、２つの分子内ジスルフィド架橋が二量体中に存在する。アルカリホスファターゼドメインの１つのシステインが遊離している。
【0092】
アスホターゼアルファは、低ホスファターゼ症（ＨＰＰ）の治療のための酵素置換治療薬として用いられている。ＨＰＰを有する患者では、ＴＮＳＡＬＰをコードする遺伝子における機能欠失変異は、ＴＮＳＡＬＰ酵素活性の欠損を引き起こし、基質、例えば無機ピロリン酸（ＰＰｉ）及びピリドキサール－５’－リン酸（ＰＬＰ）の循環レベルの上昇をもたらす。アスホターゼアルファのＨＰＰを有する患者への投与により、ＰＰｉが切断され、カルシウムとの組み合わせのために無機リン酸塩が放出され、それによりハイドロキシアパタイト結晶形成及び骨石灰化が促進され、正常な骨格表現型が回復される。アスホターゼアルファ及び治療におけるその使用に関するさらなる詳細については、ＰＣＴ公開の国際公開第２００５／１０３２６３号パンフレット及び国際公開第２００８／１３８１３１号パンフレットを参照されたい。
【0093】
いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書に記載の通り、通常の手段により、活性に対して潜在的な負の影響を有する金属イオンの濃度を最小化するか、又は活性に対して潜在的な正の影響を有する金属イオンの濃度を増加させるか、又はその両方によって作製されるアルカリホスファターゼと比べて、作製されるアルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）の改善された酵素活性を有するアルカリホスファターゼ（アスホターゼアルファ）を提供する。活性は、任意の公知の方法によって測定され得る。かかる方法は、例えば、作製されるアルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）の、アルカリホスファターゼの基質、例えばホスホエタノールアミン（ＰＥＡ）、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）及びピリドキサール５’－リン酸（ＰＬＰ）に対する酵素活性を測定するインビトロ及びインビボアッセイを含む。
【0094】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるアルカリホスファターゼは、配列番号１に示される配列を含むポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチドに対して完全に相補的な配列と比べて、高ストリンジェンシー条件下で第２のポリヌクレオチドにハイブリダイズする第１のポリヌクレオチドによってコードされる。かかる高ストリンジェンシー条件は、６×ＳＳＣ、５×デンハート試薬、０．５％ＳＤＳ及び１００ｍｇ／ｍｌの変性断片化されたサケ精子ＤＮＡにおける６８℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション並びに室温で１０分間の２×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳでの洗浄、室温で１０分間の２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳでの洗浄、及び６５℃で５分間、３回の０．１×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳでの洗浄を含み得る。
【0095】
作製プロセス
本明細書に記載のアルカリホスファターゼタンパク質（例えば、アスホターゼアルファ）は、当技術分野で公知の方法を用いて、哺乳類又は他の細胞、特にＣＨＯ細胞によって産生され得る。かかる細胞は、培養ディッシュ、フラスコガラス又はバイオリアクター内で増殖され得る。細胞培養及び組換えタンパク質作製のための特定のプロセスは、当技術分野で公知であり、例えばＮｅｌｓｏｎ ａｎｄ Ｇｅｙｅｒ，１９９１ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌ．１３：１１２－１４３及びＲｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｔｏ ＢｉｏＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍａｒｃｈ ２００８，２０－２５に記載されている。例示的なバイオリアクターは、バッチ、流加及び連続反応器を含む。いくつかの実施形態では、アルカリホスファターゼタンパク質は、流加バイオリアクター内で作製される。
本明細書に記載のアルカリホスファターゼタンパク質（例えば、アスホターゼアルファ）は、当技術分野で公知の方法を用いて、哺乳類又は他の細胞、特にＣＨＯ細胞によって産生され得る。かかる細胞は、培養ディッシュ、フラスコガラス又はバイオリアクター内で増殖され得る。細胞培養及び組換えタンパク質作製のための特定のプロセスは、当技術分野で公知であり、例えばＮｅｌｓｏｎ ａｎｄ Ｇｅｙｅｒ，１９９１ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌ．１３：１１２－１４３及びＲｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｔｏ ＢｉｏＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍａｒｃｈ ２００８，２０－２５に記載されている。例示的なバイオリアクターは、バッチ、流加及び連続反応器を含む。いくつかの実施形態では、アルカリホスファターゼタンパク質は、流加バイオリアクター内で作製される。
【0096】
細胞培養プロセスは、例えば、限定されないが、ｐＨの変化、温度、温度変化、温度変化のタイミング、細胞培地組成、細胞培養栄養補助剤、原料のロット間変動、培地濾過用材料、バイオリアクター規模の差異、ガス処理方法（空気、酸素及び二酸化炭素）などを含む変動する物理化学的環境によって引き起こされる変動性を有する。本明細書で開示される通り、製造されたアルカリホスファターゼタンパク質の収量、相対活性特性及びグリコシル化特性は、損なわれ得、これらのパラメータの１つ以上における変更により特定値の範囲内で制御され得る。
【0097】
細胞培養物中での組換えタンパク質作製では、必要な転写制御因子を伴う組換え遺伝子は、バイオテクノロジー技術における公知の方法により、まず宿主細胞に移される。任意選択的に、レシピエント細胞に選択的利点を与える第２の遺伝子が導入される。遺伝子導入から数日後、適用され得る選択薬剤の存在下において、選択遺伝子を発現する細胞のみが生存する。そのような選択のための２つの例示的遺伝子は、ヌクレオチド代謝に関与する酵素のジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）及びグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）である。両方の場合において、適切な代謝産物（ＤＨＦＲの場合にはヒポキサンチン及びチミジン並びにＧＳの場合にはグルタミン）の不在下で選択が生じ、いかなる非形質転換細胞の増殖も阻止される。一般に、組換えタンパク質の効率的発現において、生物製剤をコードする遺伝子及び選択遺伝子が同じプラスミド上に存在するか否かは重要でない。
【0098】
選択後、生存細胞は、単細胞として第２の培養容器に導入され得、培養物は、クローン集団を生成するために拡大される。最終的に、個別クローンは、組換えタンパク質の発現について評価され、最高の生産者は、さらなる培養及び分析のために保持される。これらの候補から、組換えタンパク質の作製のため、適切な増殖及び生産性特性を有する１つの細胞株が選択される。次に、作製需要及び最終生成物の要件によって決定される培養プロセスが開発される。
【0099】
細胞
任意の哺乳動物細胞型又は非哺乳動物細胞型がポリペプチドを作製するために培養され得るが、本開示に従って利用され得る。用いられ得る哺乳動物細胞の非限定例として、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞＋／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，１９８０ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６）；ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫株（ＮＳＯ／１、ＥＣＡＣＣ受入番号：８５１１０５０３）；ヒト網膜芽細胞腫（ＰＥＲ．Ｃ６（ＣｒｕＣｅｌｌ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））；ＳＶ４０（ＣＯＳ－７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚性腎臓株（懸濁培養下での増殖のためにサブクローニングされた２９３又は２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９７７ Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９）；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３－２５１（１９８０））；サル腎細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ－Ｉ ５８７）；ヒト頸部がん細胞（ＨｅＬａ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝腫瘍株（Ｈｅｐ Ｇ２）が挙げられる。特定の実施形態では、ポリペプチド及びタンパク質の培養及び発現は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株から行われる。
任意の哺乳動物細胞型又は非哺乳動物細胞型がポリペプチドを作製するために培養され得るが、本開示に従って利用され得る。用いられ得る哺乳動物細胞の非限定例として、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞＋／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，１９８０ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６）；ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫株（ＮＳＯ／１、ＥＣＡＣＣ受入番号：８５１１０５０３）；ヒト網膜芽細胞腫（ＰＥＲ．Ｃ６（ＣｒｕＣｅｌｌ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））；ＳＶ４０（ＣＯＳ－７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚性腎臓株（懸濁培養下での増殖のためにサブクローニングされた２９３又は２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９７７ Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９）；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３－２５１（１９８０））；サル腎細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ－Ｉ ５８７）；ヒト頸部がん細胞（ＨｅＬａ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝腫瘍株（Ｈｅｐ Ｇ２）が挙げられる。特定の実施形態では、ポリペプチド及びタンパク質の培養及び発現は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株から行われる。
【0100】
加えて、ポリペプチド又はタンパク質を発現する任意の数の市販及び非市販のハイブリドーマ細胞株が本開示に従って利用され得る。当業者は、ハイブリドーマ細胞株が異なる栄養の需要を有し得、且つ／又は最適な増殖及びポリペプチド若しくはタンパク質発現に対して異なる培養条件を必要とし得ることを理解し、且つ必要に応じて条件を変更することができるであろう。
【0101】
上記の通り、多くの場合、細胞は、タンパク質又はポリペプチドを高レベルで産生するように選択又は改変されることになる。多くの場合、細胞は、タンパク質を高レベルで産生するため、例えば目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の導入により、且つ／又は目的のポリペプチドをコードする遺伝子（内因性であるか又は導入される）の発現を調節する調節エレメントの導入により遺伝子操作される。
【0102】
播種密度
本開示では、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が培地に接種、即ち播種される。様々な播種密度を用いることができる。いくつかの実施形態では、１．０×１０４細胞／ｍＬ～１．０×１０７細胞／ｍＬの播種密度を用いることができる。いくつかの実施形態では、１．０×１０５細胞／ｍＬ～１．０×１０６細胞／ｍＬの播種密度を用いることができる。いくつかの実施形態では、４．０×１０５細胞／ｍＬ～８．０×１０５細胞／ｍＬの播種密度を用いることができる。いくつかの実施形態では、播種密度の増加は、ＳＥＣによって測定されるとき、アスホターゼアルファ品質の断片化に影響し得る。いくつかの実施形態では、播種密度は、断片生成のリスクを低減するために接種時に制御される。
本開示では、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が培地に接種、即ち播種される。様々な播種密度を用いることができる。いくつかの実施形態では、１．０×１０４細胞／ｍＬ～１．０×１０７細胞／ｍＬの播種密度を用いることができる。いくつかの実施形態では、１．０×１０５細胞／ｍＬ～１．０×１０６細胞／ｍＬの播種密度を用いることができる。いくつかの実施形態では、４．０×１０５細胞／ｍＬ～８．０×１０５細胞／ｍＬの播種密度を用いることができる。いくつかの実施形態では、播種密度の増加は、ＳＥＣによって測定されるとき、アスホターゼアルファ品質の断片化に影響し得る。いくつかの実施形態では、播種密度は、断片生成のリスクを低減するために接種時に制御される。
【0103】
温度
以前の結果によると、温度は、増殖速度、凝集、断片化及びＴＳＡＣを含むいくつかのパラメータに対する影響を有する可能性があることが示された。いくつかの実施形態では、温度は、ＣＨＯ細胞を培地で培養するとき、一定のままである。いくつかの実施形態では、温度は、ＣＨＯ細胞を培地で培養するとき、約３０℃～約４０℃、又は約３５℃～約４０℃、又は約３７℃～約３９℃である。いくつかの実施形態では、培地中でＣＨＯ細胞を培養するとき、温度は、約３０℃、約３０．５℃、約３１℃、約３１．５℃、約３２℃、約３２．５℃、約３３℃、約３３．５℃、約３４℃、約３４．５℃、約３５℃、約３５．５℃、約３６℃、約３６．５℃、約３７℃、約３７．５℃、約３８℃、約３８．５℃、約３９℃、約３９．５℃又は約４０℃である。いくつかの実施形態では、温度は、接種後の４０～２００時間にわたって一定である。いくつかの実施形態では、温度は、接種後の５０～１５０時間、又は６０～１４０時間、又は７０～１３０時間、又は８０～１２０時間、又は９０～１１０時間にわたって一定である。いくつかの実施形態では、温度は、接種後の８０～１２０時間にわたって一定である。いくつかの実施形態では、温度は、接種後の９０時間、９２時間、９４時間、９６時間、９８時間、１００時間、１０２時間、１０４時間、１０６時間、１０８時間又は１１０時間にわたって一定である。
以前の結果によると、温度は、増殖速度、凝集、断片化及びＴＳＡＣを含むいくつかのパラメータに対する影響を有する可能性があることが示された。いくつかの実施形態では、温度は、ＣＨＯ細胞を培地で培養するとき、一定のままである。いくつかの実施形態では、温度は、ＣＨＯ細胞を培地で培養するとき、約３０℃～約４０℃、又は約３５℃～約４０℃、又は約３７℃～約３９℃である。いくつかの実施形態では、培地中でＣＨＯ細胞を培養するとき、温度は、約３０℃、約３０．５℃、約３１℃、約３１．５℃、約３２℃、約３２．５℃、約３３℃、約３３．５℃、約３４℃、約３４．５℃、約３５℃、約３５．５℃、約３６℃、約３６．５℃、約３７℃、約３７．５℃、約３８℃、約３８．５℃、約３９℃、約３９．５℃又は約４０℃である。いくつかの実施形態では、温度は、接種後の４０～２００時間にわたって一定である。いくつかの実施形態では、温度は、接種後の５０～１５０時間、又は６０～１４０時間、又は７０～１３０時間、又は８０～１２０時間、又は９０～１１０時間にわたって一定である。いくつかの実施形態では、温度は、接種後の８０～１２０時間にわたって一定である。いくつかの実施形態では、温度は、接種後の９０時間、９２時間、９４時間、９６時間、９８時間、１００時間、１０２時間、１０４時間、１０６時間、１０８時間又は１１０時間にわたって一定である。
【0104】
温度変化
細胞培養プロセス、特に非連続プロセス（例えば、バイオリアクターにおける流加プロセス）の実行時間は、通常、典型的には実行期間にわたって減少する細胞の残存生存度によって制限される。したがって、細胞生存度における時間を延長することは、組換えタンパク質の産生を改善するために所望される。生成物品質への関心はまた、細胞死が培養上清にシアリダーゼを放出し得、発現されるタンパク質のシアル酸含量を減少させる可能性があることから、生細胞密度における減少を最小化し、高い細胞生存度を維持するという動機付けをもたらす。タンパク質精製への関心は、生細胞密度における減少を最小化し、高い細胞生存度を維持するというさらに別の動機付けをもたらす。培養物中の細胞片及び死細胞の内容物は、培養実行の終了時にタンパク質生成物を単離及び／又は精製する能力に対して負の影響を与え得る。したがって、細胞を培養下でより長期間にわたり生存可能に維持することにより、細胞によって産生される所望の糖タンパク質の品質における劣化及び究極的低下を引き起こすことがある、細胞性タンパク質及び酵素（例えば、細胞性プロテアーゼ及びシアリダーゼ）による培地の汚染において低下が認められる。
細胞培養プロセス、特に非連続プロセス（例えば、バイオリアクターにおける流加プロセス）の実行時間は、通常、典型的には実行期間にわたって減少する細胞の残存生存度によって制限される。したがって、細胞生存度における時間を延長することは、組換えタンパク質の産生を改善するために所望される。生成物品質への関心はまた、細胞死が培養上清にシアリダーゼを放出し得、発現されるタンパク質のシアル酸含量を減少させる可能性があることから、生細胞密度における減少を最小化し、高い細胞生存度を維持するという動機付けをもたらす。タンパク質精製への関心は、生細胞密度における減少を最小化し、高い細胞生存度を維持するというさらに別の動機付けをもたらす。培養物中の細胞片及び死細胞の内容物は、培養実行の終了時にタンパク質生成物を単離及び／又は精製する能力に対して負の影響を与え得る。したがって、細胞を培養下でより長期間にわたり生存可能に維持することにより、細胞によって産生される所望の糖タンパク質の品質における劣化及び究極的低下を引き起こすことがある、細胞性タンパク質及び酵素（例えば、細胞性プロテアーゼ及びシアリダーゼ）による培地の汚染において低下が認められる。
【0105】
細胞培養物における高い細胞生存度を達成するため、多くの方法が適用され得る。１つは、正常温度での初期培養後に培養温度を低下させることを含む。例えば、Ｒｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：４２３－４２７）を参照されたい。一般に、目的のタンパク質を発現する能力がある哺乳類又は他の細胞型は、細胞数を増加させるため、最初に正常温度下で増殖される。各細胞型におけるかかる「正常」温度は、一般に約３７℃（例えば、約３５℃～約３９℃、例えば３５．０℃、３５．５℃、３６．０℃、３６．５℃、３７．０℃、３７．５℃、３８．０℃、３８．５℃及び／又は３９．０℃など）である。特定の一実施形態では、アスホターゼアルファを作製するための温度は、最初に約３７℃に設定される。適度に高い細胞密度が達成されるとき、そこでタンパク質産生を促進するため、全細胞培養物における培養温度が変更され得る（例えば、低減される）。ほとんどの場合、温度の低下により、細胞が細胞周期の非増殖Ｇ１部分の方に変化し、以前のより高い温度環境と比べて細胞密度及び生存度が増加することがある。さらに、より低い温度は、細胞性タンパク質の産生速度を増加させ、タンパク質の翻訳後修飾（例えば、グリコシル化）を促進し、新規に産生されるタンパク質の断片化又は凝集を低減し、タンパク質のフォールディング及び三次元構造の形成を促進し（したがって活性を維持する）、且つ／又は新規に産生されるタンパク質の分解を低減することにより、組換えタンパク質の産生を促進する可能性もある。いくつかの実施形態では、温度は、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃又は１０℃低下する。いくつかの実施形態では、温度は、約２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃又は３５℃まで低下する。いくつかの実施形態では、より低い温度は、約３０℃～約３５℃（例えば、３０．０℃、３０．５℃、３１．０℃、３１．５℃、３２．０℃、３２．５℃、３３．０℃、３３．５℃、３４．０℃、３４．５℃及び／又は３５．０℃）である。他の実施形態では、アスホターゼアルファを作製するための温度は、最初に約３５．０℃～約３９．０℃に設定され、次に約３０．０℃～約３５．０℃に変更される。一実施形態では、アスホターゼアルファを作製するための温度は、最初に約３７．０℃に設定され、次に約３０℃に変更される。別の実施形態では、アスホターゼアルファを作製するための温度は、最初に約３６．５℃に設定され、次に約３３℃に変更される。さらに別の実施形態では、アスホターゼアルファを作製するための温度は、最初に約３７．０℃に設定され、次に約３３℃に変更される。さらなる実施形態では、アスホターゼアルファを作製するための温度は、最初に約３６．５℃に設定され、次に約３０℃に変更される。他の実施形態では、温度変更の複数（例えば、２つ以上）のステップが適用され得る。
【0106】
異なる温度に変更する前、特定の温度で培養物を維持するための時間は、細胞生存度及び目的のタンパク質を産生する能力を維持しながら、十分な（又は所望の）細胞密度を達成するように決定され得る。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、異なる温度に変更する前、初期温度下で生細胞密度が約１０５細胞／ｍＬ～約１０７細胞／ｍＬ（例えば、１×１０５、１．５×１０５、２．０×１０５、２．５×１０５、３．０×１０５、３．５×１０５、４．０×１０５、４．５×１０５、５．０×１０５、５．５×１０５、６．０×１０５、６．５×１０５、７．０×１０５、７．５×１０５、８．０×１０５、８．５×１０５、９．０×１０５、９．５×１０５、１．０×１０６、１．５×１０６、２．０×１０６、２．５×１０６、３．０×１０６、３．５×１０６、４．０×１０６、４．５×１０６、５．０×１０６、５．５×１０６、６．０×１０６、６．５×１０６、７．０×１０６、７．５×１０６、８．０×１０６、８．５×１０６、９．０×１０６、９．５×１０６、１×１０７細胞／ｍＬ又はそれを超える）に達するまで増殖される。一実施形態では、細胞培養物は、異なる温度に変更する前、初期温度下で生細胞密度が約２．５～約３．４×１０６細胞／ｍＬに達するまで増殖される。別の実施形態では、細胞培養物は、異なる温度に変更する前、初期温度下で生細胞密度が約２．５～約３．２×１０６細胞／ｍＬに達するまで増殖される。さらに別の実施形態では、細胞培養物は、異なる温度に変更する前、初期温度下で生細胞密度が約２．５～約２．８×１０６細胞／ｍＬに達するまで増殖される。
【0107】
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、温度変化が接種から５０～１５０時間後、又は６０～１４０時間後、又は７０～１３０時間後、又は８０～１２０時間後、又は９０～１１０時間後に生じることを提供する。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、温度が接種から約８０時間～１５０時間後、接種から約９０時間～１００時間後又は接種から約９６時間後に低下することを提供する。いくつかの実施形態では、温度変化は、接種から８０～１２０時間後に生じる。いくつかの実施形態では、温度変化は、接種から９０時間後、９２時間後、９４時間後、９６時間後、９８時間後、１００時間後、１０２時間後、１０４時間後、１０６時間後、１０８時間後又は１１０時間後に生じる。いくつかの実施形態では、温度変化後の温度は、ＣＨＯ細胞が収集されるまで維持される。
【0108】
ｐＨ
細胞培養下の増殖培地のｐＨの変更は、細胞タンパク質の分解活性、分泌及びタンパク質産生レベルに影響する可能性がある。細胞株の大部分は、約ｐＨ７～８で十分に増殖する。細胞増殖における最適ｐＨの変動は、様々な細胞株中で比較的小さいが、いくつかの正常な線維芽細胞株の挙動は、ｐＨ７．０～７．７で最高であり、形質転換細胞の挙動は、典型的には７．０～７．４のｐＨで最高である（Ｅａｇｌｅ，１９７３ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｐＨ ｏｎ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ８２：１－８）。いくつかの実施形態では、アスホターゼアルファを作製するための培地のｐＨは、約６．５～７．７のｐＨ（例えば、６．５０、６．５５、６．６０、６．６５、６．７０、６．７５、６．８０、６．８５、６．９０、６．９５、７．００、７．０５、７．１０、７．１５、７．２０、７．２５、７．３０、７．３５、７．３９、７．４０、７．４５、７．５０、７．５５、７．６０、７．６５又は７．７０）である。
細胞培養下の増殖培地のｐＨの変更は、細胞タンパク質の分解活性、分泌及びタンパク質産生レベルに影響する可能性がある。細胞株の大部分は、約ｐＨ７～８で十分に増殖する。細胞増殖における最適ｐＨの変動は、様々な細胞株中で比較的小さいが、いくつかの正常な線維芽細胞株の挙動は、ｐＨ７．０～７．７で最高であり、形質転換細胞の挙動は、典型的には７．０～７．４のｐＨで最高である（Ｅａｇｌｅ，１９７３ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｐＨ ｏｎ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ８２：１－８）。いくつかの実施形態では、アスホターゼアルファを作製するための培地のｐＨは、約６．５～７．７のｐＨ（例えば、６．５０、６．５５、６．６０、６．６５、６．７０、６．７５、６．８０、６．８５、６．９０、６．９５、７．００、７．０５、７．１０、７．１５、７．２０、７．２５、７．３０、７．３５、７．３９、７．４０、７．４５、７．５０、７．５５、７．６０、７．６５又は７．７０）である。
【0109】
培地
いくつかの実施形態では、バッチ培養が用いられ、ここでは追加的な培地が接種後に添加されない。いくつかの実施形態では、流加培養が用いられ、ここでは１回以上のボーラス投与で培地が接種後に添加される。いくつかの実施形態では、２、３、４、５又は６回のボーラス投与で培地が接種後に添加される。
いくつかの実施形態では、バッチ培養が用いられ、ここでは追加的な培地が接種後に添加されない。いくつかの実施形態では、流加培養が用いられ、ここでは１回以上のボーラス投与で培地が接種後に添加される。いくつかの実施形態では、２、３、４、５又は６回のボーラス投与で培地が接種後に添加される。
【0110】
様々な実施形態では、アルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）は、培地が余分なボーラス投与で産生バイオリアクターに添加されるプロセスによって作製される。例えば、培地が１、２、３、４、５、６回又はそれを超えるボーラス投与で添加され得る。特定の一実施形態では、培地が３回のボーラス投与で添加される。様々な実施形態では、培地のかかる余分なボーラス投与は、様々な量で添加され得る。例えば、培地のかかるボーラス投与は、産生バイオリアクターにおける培地の元の容量の約２０％、２５％、３０％、３３％、４０％、４５％、５０％、６０％、６７％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１２５％、１３０％、１３３％、１４０％、１５０％、１６０％、１６７％、１７０％、１７５％、１８０％、１９０％、２００％又はそれを超える量で添加され得る。特定の一実施形態では、培地のかかるボーラス投与は、元の容量の約３３％、６７％、１００％又は１３３％の量で添加され得る。様々な実施形態では、余分なボーラス投与のかかる添加は、細胞増殖又はタンパク質産生の期間中の様々な時点で行われ得る。例えば、ボーラス投与は、プロセスにおける１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目又はそれよりも後に添加され得る。特定の一実施形態では、培地のかかるボーラス投与は、一日おきに（例えば、（１）３日目、５日目及び７日目、（２）４日目、６日目及び８日目、又は（３）５日目、７日目及び９日目に添加され得る。実際、培地のボーラス投与での補助剤の頻度、量、時点及び他のパラメータは、上記の制限に従って自由に組み合わされ、実験練習によって決定され得る。
【0111】
様々な培地が市販されている。いくつかの実施形態では、培地は、ＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）３０２無血清培地、ＣＤ ＤＧ４４培地、ＢＤ Ｓｅｌｅｃｔ（商標）培地、ＳＦＭ４ＣＨＯ培地又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、培地は、市販の培地、例えばＳＦＭ４ＣＨＯ培地及びＢＤ Ｓｅｌｅｃｔ（商標）培地の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、培地は、市販の培地、例えばＳＦＭ４ＣＨＯ培地及びＢＤ Ｓｅｌｅｃｔ（商標）培地の組み合わせを、９０／１０、８０／２０、７５／２５、７０／３０、６０／４０又は５０／５０から選択される比で含む。
【0112】
栄養補助剤
様々な栄養補助剤は、「フィード培地」とも称され、市販され、当業者に公知である。栄養補助剤は、接種が行われてから細胞培養物に添加される（培養培地と異なる）培地を含む。場合により、栄養補助剤は、培養下で増殖する細胞によって消費される栄養分を代替するために用いることができる。いくつかの実施形態では、栄養補助剤は、所望のタンパク質の産生を最適化するか又は所望のタンパク質の活性を最適化するために添加される。極めて多数の栄養補助剤が開発されており、市販されている。栄養補助剤の明示的な目的がプロセス開発の局面を高めることである一方、すべての細胞及び／又は産生されるすべてのタンパク質のために機能する普遍的な栄養補助剤は存在しない。所望の力価及び増殖特性を達成するため、所望の細胞株、産生タンパク質及び所与の基本培地と組み合わせて機能し得る、スケーラブルであり且つ適切な細胞培養栄養補助剤の選択は、ルーチン的でない。特定の細胞株、特定の産生タンパク質及び基本培地の組み合わせを用いて複数の市販の栄養補助剤をスクリーニングし、最適な補助剤を同定する典型的手法は、細胞培養プロセス中に存在する無数の変数に起因し、成功しない可能性がある。いくつかの実施形態では、栄養補助剤は、Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｆｅｅｄ Ｃ＋ＡＧＴ（商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（商標）２＋Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（商標）４の組み合わせ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）、Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（商標）２＋Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（商標）５の組み合わせ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）、Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（商標）６（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）及びＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（商標）７ａ＋Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（商標）７ｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。
様々な栄養補助剤は、「フィード培地」とも称され、市販され、当業者に公知である。栄養補助剤は、接種が行われてから細胞培養物に添加される（培養培地と異なる）培地を含む。場合により、栄養補助剤は、培養下で増殖する細胞によって消費される栄養分を代替するために用いることができる。いくつかの実施形態では、栄養補助剤は、所望のタンパク質の産生を最適化するか又は所望のタンパク質の活性を最適化するために添加される。極めて多数の栄養補助剤が開発されており、市販されている。栄養補助剤の明示的な目的がプロセス開発の局面を高めることである一方、すべての細胞及び／又は産生されるすべてのタンパク質のために機能する普遍的な栄養補助剤は存在しない。所望の力価及び増殖特性を達成するため、所望の細胞株、産生タンパク質及び所与の基本培地と組み合わせて機能し得る、スケーラブルであり且つ適切な細胞培養栄養補助剤の選択は、ルーチン的でない。特定の細胞株、特定の産生タンパク質及び基本培地の組み合わせを用いて複数の市販の栄養補助剤をスクリーニングし、最適な補助剤を同定する典型的手法は、細胞培養プロセス中に存在する無数の変数に起因し、成功しない可能性がある。いくつかの実施形態では、栄養補助剤は、Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｆｅｅｄ Ｃ＋ＡＧＴ（商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（商標）２＋Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（商標）４の組み合わせ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）、Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（商標）２＋Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（商標）５の組み合わせ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）、Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（商標）６（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）及びＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（商標）７ａ＋Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（商標）７ｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0113】
Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（商標）７ａは、１つ以上のアミノ酸、ビタミン、塩、微量元素、ポロクサマー及びグルコースを含む第１の動物由来成分を含まない（ＡＤＣＦ）栄養補助剤として説明することができ、第１のＡＤＣＦ栄養補助剤は、ヒポキサンチン、チミジン、インスリン、Ｌ－グルタミン、増殖因子、ペプチド、タンパク質、加水分解物、フェノールレッド及び２－メルカプトエタノールを含まない。Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（商標）７ａは、化学的に規定された補助剤である。語句「動物由来成分を含まない」又は「ＡＤＣＦ」は、成分が直接的に動物供給源に由来しない、例えばウシ供給源に由来しない補助剤を指す。いくつかの実施形態では、栄養補助剤は、Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（商標）７ａである。
【0114】
Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（商標）７ｂは、１つ以上のアミノ酸を含む第２のＡＤＣＦ栄養補助剤として説明することができ、第２のＡＤＣＦ栄養補助剤には、ヒポキサンチン、チミジン、インスリン、Ｌ－グルタミン、増殖因子、ペプチド、タンパク質、加水分解物、フェノールレッド、２－メルカプトエタノール及びポロクサマーを欠如する。Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（商標）７ｂは、化学的に規定された補助剤である。いくつかの実施形態では、栄養補助剤は、Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（商標）７ｂである。
【0115】
いくつかの実施形態では、市販の栄養補助剤の組み合わせが用いられる。用語「栄養補助剤」は、単一の栄養補助剤とともに栄養補助剤の組み合わせの両方を指す。例えば、いくつかの実施形態では、栄養補助剤の組み合わせは、Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（商標）７ａ及びＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（商標）７ｂの組み合わせを含む
【0116】
様々な実施形態では、アルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）は、栄養補助剤の余分な添加物が産生バイオリアクターに添加されるプロセスによって作製される。いくつかの実施形態では、栄養補助剤は、ある期間、例えば１分～２時間の範囲の期間にわたって添加される。いくつかの実施形態では、栄養補助剤は、ボーラス投与で添加される。例えば、栄養補助剤は、１、２、３、４、５、６回又はそれを超えるボーラス投与で添加され得る。いくつかの実施形態では、栄養補助剤は、３つ以上の異なる時点、例えば２～６つの異なる時点で添加される。様々な実施形態では、栄養補助剤のかかる余分なボーラス投与は、様々な量で添加され得る。例えば、栄養補助剤のかかるボーラス投与は、産生バイオリアクター内の培地の元の容量の約１％～２０％、１％～１０％又は１％～５％（ｗ／ｖ）の量で添加され得る。特定の一実施形態では、栄養補助剤のかかるボーラス投与は、元の容量の１％～２０％、１％～１０％又は１％～５％（ｗ／ｖ）の量で添加され得る。
【0117】
いくつかの実施形態では、栄養補充剤の組み合わせが用いられ、第１の栄養補充剤、例えばＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（商標）７ａが培地の０．５％～４％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される。いくつかの実施形態では、栄養補充剤の組み合わせが用いられ、第２の栄養補充剤、例えばＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（商標）７ｂが培地の０．０５％～０．８％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される。栄養補充剤の組み合わせがＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（商標）７ａ及びＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（商標）７ｂを含むような特定の実施形態では、栄養補充剤のボーラスが元の体積の１％～２０％、１％～１０％又は１％～５％（ｗ／ｖ）の量で添加され得る。
【0118】
様々な実施形態では、追加的ボーラスのかかる添加は、接種後の様々な時点で行われ得る。例えば、ボーラスは、接種の１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日後又はそれ以降に添加され得る。実際、栄養補充剤のボーラス添加の頻度、量、時点及び他のパラメータは、上記の制限に応じて自由に組み合わされ、実験実施により決定され得る。
【0119】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、組換えポリペプチドの作製中に亜鉛を前記培地に添加することをさらに含む。いくつかの実施形態では、亜鉛は、前記培地中で約１～約３００μＭの亜鉛濃度をもたらすように添加され得る。一実施形態では、亜鉛は、培地中で約１０～約２００μＭ（例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０又は１５０μＭ）の亜鉛濃度をもたらすように添加され得る。いくつかの実施形態では、亜鉛は、約２５μＭ～約１５０μＭ又は約６０μＭ～約１５０μＭの培地中の亜鉛濃度をもたらすように添加される。一実施形態では、亜鉛は、約３０、６０又は９０μＭの亜鉛の培地中の亜鉛濃度をもたらすように添加される。いくつかの実施形態では、亜鉛は、前記培地にボーラス投与で連続的に、半連続的に又はそれらを組み合わせで添加される。いくつかの実施形態では、亜鉛は、接種から１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、８日後、９日後、１０日後、１１日後、１２日後及び／又は１３日後に添加される。
【0120】
収集
先行試験により、収集タイミングの遅延が生存度及びＴＳＡＣ低下に関連したため、収集タイミングが他のＣＱＡに対する潜在的影響を有し得ることが示唆された。様々な実施形態では、アルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）は、約２００時間、２１０時間、２２０時間、２３０時間、２４０時間、２５０時間、２６０時間、２６４時間、２７０時間、２８０時間、２８８時間（即ち１２日）又は１２日以降の時点で収集される。
先行試験により、収集タイミングの遅延が生存度及びＴＳＡＣ低下に関連したため、収集タイミングが他のＣＱＡに対する潜在的影響を有し得ることが示唆された。様々な実施形態では、アルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）は、約２００時間、２１０時間、２２０時間、２３０時間、２４０時間、２５０時間、２６０時間、２６４時間、２７０時間、２８０時間、２８８時間（即ち１２日）又は１２日以降の時点で収集される。
【0121】
下流プロセス
用語「下流プロセス」は、本明細書で用いられるとき、一般に、培養細胞又は発酵培養液などの供給源から産生されるアルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）の回収及び精製のためのプロセスの全部又は一部を指す。
用語「下流プロセス」は、本明細書で用いられるとき、一般に、培養細胞又は発酵培養液などの供給源から産生されるアルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）の回収及び精製のためのプロセスの全部又は一部を指す。
【0122】
一般に、下流処理は、純度及び濃度における前進的な改善を通して、生成物をその天然状態から組織、細胞又は発酵培養液の成分としてもたらす。例えば、不溶物の除去は、微粒子を含まない液体中の溶質としての生成物の捕捉（例えば、細胞、細胞片又は他の微粒子状物質を発酵培養液から分離すること）を含む第１のステップであり得る。これを達成するための例示的操作は、例えば、濾過、遠心分離、沈降、沈殿、綿状沈殿、電気集塵、重力沈降などを含む。追加的操作は、固体供給源、例えば植物及び動物組織から生成物を回収するために例えば粉砕、均質化又は浸出を含み得る。第２のステップは、その特性が所望の生成物の場合と著しく異なる成分を除去する「生成物単離」ステップであり得る。大部分の生成物において、水が主要な不純物であり、単離ステップは、その大部分を除去し、処理対象の材料の体積を低減し、生成物を濃縮するように設計される。溶媒抽出、吸着、限外濾過及び沈降は、このステップにおいて単独で又は組み合わせて用いられ得る。次のステップは、物理及び化学特性において生成物と酷似する汚染物質を分離する生成物精製に関する。考えられる精製方法は、例えば、親和性、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、サイズ排除、逆相クロマトグラフィー、限外濾過－ダイアフィルトレーション、結晶化及び分別沈殿を含む。いくつかの実施形態では、下流プロセスは、収集清澄化、限外濾過、ダイアフィルトレーション、ウイルス不活性化、親和性捕捉及びそれらの組み合わせの少なくとも１つを含む。下流プロセスは、本明細書で説明される。
【0123】
総シアル酸含量の測定
例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒからの炭水化物定量の商業的方法が利用可能である。一般に、ＴＳＡＣが酸加水分解を用いて糖タンパク質、例えばアスホターゼアルファから放出され、放出された糖／ＴＳＡＣは、アンペロメトリック電気化学検出法を伴う高性能アニオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥ－ＰＡＤ）などのカラムクロマトグラフィーを用いた電気化学的検出を介して検出される。得られるレベルは、内部標準に対して１モルあたりで定量化され、総モルのタンパク質の関数として表される。
例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒからの炭水化物定量の商業的方法が利用可能である。一般に、ＴＳＡＣが酸加水分解を用いて糖タンパク質、例えばアスホターゼアルファから放出され、放出された糖／ＴＳＡＣは、アンペロメトリック電気化学検出法を伴う高性能アニオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥ－ＰＡＤ）などのカラムクロマトグラフィーを用いた電気化学的検出を介して検出される。得られるレベルは、内部標準に対して１モルあたりで定量化され、総モルのタンパク質の関数として表される。
【0124】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、組換えアルカリホスファターゼの総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）を測定することをさらに含む。本明細書に記載の通り、ＴＳＡＣは、生理的状態における組換えアルカリホスファターゼの半減期に影響し、したがって例えばアスホターゼアルファなどの組換え生成されたアルカリホスファターゼにとって決定的な品質特性として機能する。再現性及びｃＧＭＰに対して、ＴＳＡＣ範囲の厳格な管理が重要である。いくつかの実施形態では、ＴＳＡＣは、約０．８モル／モル～約４．０モル／モルの組換えアルカリホスファターゼである。いくつかの実施形態では、ＴＳＡＣは、約０．９モル／モル～約３．０モル／モルの組換えアルカリホスファターゼである。いくつかの実施形態では、ＴＳＡＣは、約１．０モル／モル～約２．８モル／モルの組換えアルカリホスファターゼである。いくつかの実施形態では、ＴＳＡＣは、約１．２モル／モル～約３．０モル／モルの組換えアルカリホスファターゼである。いくつかの実施形態では、ＴＳＡＣは、約１．２モル／モル～約２．４モル／モルの組換えアルカリホスファターゼである。いくつかの実施形態では、ＴＳＡＣは、約０．９モル／モル、約１．０モル／モル、約１．１モル／モル、約１．２モル／モル、約１．３モル／モル、約１．４モル／モル、約１．５モル／モル、約１．６モル／モル、約１．７モル／モル、約１．８モル／モル、約１．９モル／モル、約２．０モル／モル、約２．１モル／モル、約２．２モル／モル、約２．３モル／モル、約２．４モル／モル、約２．５モル／モル、約２．６モル／モル、約２．７モル／モル、約２．８モル／モル、約２．９モル／モル又は約３．０モル／モルの組換えアルカリホスファターゼである。
【0125】
いくつかの実施形態では、組換えアルカリホスファターゼのＴＳＡＣは、下流処理中に減少する。いくつかの実施形態では、組換えアルカリホスファターゼのＴＳＡＣは、組換えアルカリホスファターゼを含有する溶液、例えば細胞培養物、ＨＣＣＦ及び／又はＵＦＤＦ濾過プール中に存在するシアリダーゼ酵素の結果として減少する。いくつかの実施形態では、約０．９モル／モル～約３．０モル／モルの組換えアルカリホスファターゼのＴＳＡＣを得るため、シアリダーゼは、細胞培養物、ＨＣＣＦ及び／又はＵＦＤＦ濾過プールから選択的に除去される。シアリダーゼは、例えば、シアリダーゼに特異的な阻害剤、抗体、イオン交換及び／又はアフィニティークロマトグラフィー、免疫沈降などの１つ又は組み合わせにより選択的に除去され得る。
【0126】
いくつかの実施形態では、シアル酸部分は、組換えアルカリホスファターゼを含有する溶液、例えば細胞培養物、ＨＣＣＦ及び／又はＵＦＤＦ濾過プール中に存在するシアリルトランスフェラーゼ酵素により、組換えアルカリホスファターゼに添加される。いくつかの実施形態では、約０．９～約３．０モル／モルの組換えアルカリホスファターゼのＴＳＡＣを得るため、組換えシアリルトランスフェラーゼは、細胞培養物、ＨＣＣＦ及び／又はＵＦＤＦ濾過プールに外因性に添加される。
【0127】
組換えアルカリホスファターゼ活性の測定
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、組換えアルカリホスファターゼ活性を測定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、活性は、ｐＮＰＰに基づくアルカリホスファターゼ酵素アッセイ及び無機ピロリン酸（ＰＰｉ）加水分解アッセイの少なくとも１つから選択される方法から選択される。いくつかの実施形態では、組換えアルカリホスファターゼＫｃａｔ及びＫｍ値の少なくとも１つは、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）加水分解アッセイにおいて増加する。いくつかの実施形態では、本方法は、積分生細胞濃度（ＩＶＣＣ）を決定することを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、組換えアルカリホスファターゼ活性を測定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、活性は、ｐＮＰＰに基づくアルカリホスファターゼ酵素アッセイ及び無機ピロリン酸（ＰＰｉ）加水分解アッセイの少なくとも１つから選択される方法から選択される。いくつかの実施形態では、組換えアルカリホスファターゼＫｃａｔ及びＫｍ値の少なくとも１つは、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）加水分解アッセイにおいて増加する。いくつかの実施形態では、本方法は、積分生細胞濃度（ＩＶＣＣ）を決定することを含む。
【0128】
最終ステップは、生成物の研磨、即ち安定であり、容易に輸送可能であり、且つ便宜的な形態での生成物のパッケージングで完了するプロセスとして用いられ得る。２～８℃での貯蔵、－２０℃～－８０℃での凍結、結晶化、乾燥、凍結乾燥、フリーズドライ及び噴霧乾燥は、この最終ステップにおける例示的方法である。生成物の研磨では、生成物及びその使用意図に応じて、さらに生成物を滅菌し、生成物の安全性を損なう可能性がある微量汚染物質（例えば、ウイルス、内毒素、代謝廃棄生成物及び発熱物質）を除去又は非活性化し得る。
【0129】
生成物回収方法は、本明細書で考察される２つ以上のステップを組み合わせ得る。例えば、吸着流動床（ＥＢＡ）では、不溶物の除去及び生成物単離が単一ステップで実施される。ＥＢＡのレビューとしては、Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２００５ Ｊｕｎ；Ｃｈａｐｔｅｒ ８：Ｕｎｉｔ ８．８を参照されたい。さらに、親和性クロマトグラフィーでは、単離及び精製が単一ステップでなされることが多い。
【0130】
培養細胞において産生される組換えタンパク質を精製するための下流プロセスのレビューとしては、Ｒｅａ，２００８ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｃ－ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＢｉｏＰｈａｒｍ Ｉｎｔ．Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ Ｍａｒｃｈ ２：２０－２５を参照されたい。本明細書で開示されるアルカリホスファターゼのための下流プロセスは、下記の例示的ステップの少なくとも１つ又は任意の組み合わせを含み得る。
【0131】
収集清澄化プロセス
本方法のいくつかの実施形態では、組換えアルカリホスファターゼは、収集清澄化培養液（ＨＣＣＦ）を形成するための少なくとも１つの精製ステップ、即ち「収集する」ステップ又は収集清澄化ステップにより、細胞培養物から単離される。細胞培養物を「収集すること」は、典型的には細胞培養物を培養容器、例えばバイオリアクターから収集するプロセスを指す。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの精製ステップは、濾過、遠心分離及びそれらの組み合わせの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、収集清澄化ステップは、細胞及び細胞片（例えば、不溶性生体材料）を除去するため、収集された細胞培養物を遠心分離及び／又は濾過し、生成物、即ち組換えアルカリホスファターゼを回収することを含む。いくつかの実施形態では、細胞及び細胞片は、クロマトグラフィーに適した清澄化濾液を得るために除去される。いくつかの実施形態では、清澄化濾液は、収集清澄化培養液又はＨＣＣＦとして知られる。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、ＨＣＣＦを生成するため、遠心分離と深濾過との組み合わせが施される。このステップにおいて使用可能な溶液は、回収用緩衝液（例えば、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５０）を含み得る。好適な回収用緩衝液の組成物は、当業者によって選択され得る。
本方法のいくつかの実施形態では、組換えアルカリホスファターゼは、収集清澄化培養液（ＨＣＣＦ）を形成するための少なくとも１つの精製ステップ、即ち「収集する」ステップ又は収集清澄化ステップにより、細胞培養物から単離される。細胞培養物を「収集すること」は、典型的には細胞培養物を培養容器、例えばバイオリアクターから収集するプロセスを指す。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの精製ステップは、濾過、遠心分離及びそれらの組み合わせの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、収集清澄化ステップは、細胞及び細胞片（例えば、不溶性生体材料）を除去するため、収集された細胞培養物を遠心分離及び／又は濾過し、生成物、即ち組換えアルカリホスファターゼを回収することを含む。いくつかの実施形態では、細胞及び細胞片は、クロマトグラフィーに適した清澄化濾液を得るために除去される。いくつかの実施形態では、清澄化濾液は、収集清澄化培養液又はＨＣＣＦとして知られる。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、ＨＣＣＦを生成するため、遠心分離と深濾過との組み合わせが施される。このステップにおいて使用可能な溶液は、回収用緩衝液（例えば、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５０）を含み得る。好適な回収用緩衝液の組成物は、当業者によって選択され得る。
【0132】
いくつかの実施形態では、ＨＣＣＦは、約２．１モル／モル～約４．３モル／モルの総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）を有する。いくつかの実施形態では、ＨＣＣＦは、約２．２モル／モル～約３．６モル／モルのＴＳＡＣを有する。いくつかの実施形態では、ＨＣＣＦは、約２．２モル／モル～約３．４モル／モルのＴＳＡＣを有する。いくつかの実施形態では、ＨＣＣＦは、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３．０、約３．１、約３．２、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４又は約４．５モル／モルのＴＳＡＣを有する。
【0133】
収集後の限外濾過及び／又はダイアフィルトレーション
本方法のいくつかの実施形態では、「ＵＦＤＦプール」又は「ＵＦＤＦ」としても知られる濾過プールを形成するため、少なくとも１つの精製ステップ後、追加的な精製ステップが実施される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの精製ステップは、濃縮及び緩衝液希釈が意図される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの精製ステップは、収集清澄化、濾過、限外濾過、ダイアフィルトレーション、ウイルス不活性化、親和性捕捉及びそれらの組み合わせの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの精製ステップは、限外濾過（ＵＦ）及び／又はダイアフィルトレーション（ＤＦ）を含む。ＵＦプロセスにおける例示的ステップとして、例えばフィルター膜の使用前の洗浄／貯蔵、洗浄後／貯蔵後のフラッシュ、平衡化（例えば、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５０を含有する緩衝液を用いる）、負荷、濃縮、希釈／フラッシュ／回収（例えば、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５０を含有する緩衝液を用いる）及びフィルター膜の使用前のフラッシュ／洗浄／貯蔵が挙げられる。
本方法のいくつかの実施形態では、「ＵＦＤＦプール」又は「ＵＦＤＦ」としても知られる濾過プールを形成するため、少なくとも１つの精製ステップ後、追加的な精製ステップが実施される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの精製ステップは、濃縮及び緩衝液希釈が意図される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの精製ステップは、収集清澄化、濾過、限外濾過、ダイアフィルトレーション、ウイルス不活性化、親和性捕捉及びそれらの組み合わせの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの精製ステップは、限外濾過（ＵＦ）及び／又はダイアフィルトレーション（ＤＦ）を含む。ＵＦプロセスにおける例示的ステップとして、例えばフィルター膜の使用前の洗浄／貯蔵、洗浄後／貯蔵後のフラッシュ、平衡化（例えば、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５０を含有する緩衝液を用いる）、負荷、濃縮、希釈／フラッシュ／回収（例えば、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５０を含有する緩衝液を用いる）及びフィルター膜の使用前のフラッシュ／洗浄／貯蔵が挙げられる。
【0134】
いくつかの実施形態では、ＵＦ／ＤＦ後、ＵＦＤＦは、約１．７ｇ／Ｌ～約５．３ｇ／Ｌのタンパク質濃度まで希釈され、次に貯蔵及び／又はさらなる精製前に約１３℃～約２７℃で約１～約６０時間にわたって維持される。ＵＦＤＦを「保持する」又は「維持する」は、本明細書で用いられるとき、同じ温度（±約１℃以内）で目標時間、即ち「保持時間」（±約２時間以内）、維持されているＵＦＤＦを指す。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、組換えアルカリホスファターゼ作製プロセスにおける制御ポイントとして役立つように保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、均一な生成物品質を保証するために保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、下流処理を容易にするために保持される。
【0135】
いくつかの実施形態では、組換えアルカリホスファターゼのＴＳＡＣは、ＵＦＤＦの保持時間中に減少する。いくつかの実施形態では、ＴＳＡＣの減少は、ＵＦＤＦの保持時間中にタンパク質濃度、時間の長さ及び／又は温度と相関する。
【0136】
いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦの保持時間の開始は、クロマトグラフィーステップの終了直後である。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦの保持時間の開始は、ＵＦ／ＤＦの終了直後である。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦの保持時間の開始は、ＵＦ／ＤＦステップ終了時の再循環の完了直後である。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦの保持時間の開始は、ＵＦ／ＤＦの生成物の濾過及び移動の完了直後である。
【0137】
いくつかの実施形態では、所望されるタンパク質濃度を得るため、ＵＦＤＦは、希釈される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約１．０ｇ／Ｌ～約６．０ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約１．７ｇ／Ｌ～約５．３ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約２．０ｇ／Ｌ～約５．０ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約２．３ｇ／Ｌ～約４．３ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約３．０ｇ／Ｌ～約４．５ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約３．３ｇ／Ｌ～約４．１ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約２．０ｇ／Ｌ、約２．１ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ、約２．３ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／ｌ、約２．７ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ、約２．９ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ、約３．１ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ、約３．３ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ、約３．７ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ、約３．９ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ、約４．１ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ、約４．３ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ又は約４．５ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する。
【0138】
いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、組換えアルカリホスファターゼと他のタンパク質との組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約２．０ｇ／Ｌ～約６．０ｇ／Ｌのアルカリホスファターゼ濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約２．５ｇ／Ｌ～約５．０ｇ／Ｌのアルカリホスファターゼ濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約３．０ｇ／Ｌ～約４．５ｇ／Ｌのアルカリホスファターゼ濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約３．３ｇ／Ｌ～約４．１ｇ／Ｌのアルカリホスファターゼ濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約３．０ｇ／Ｌ、約３．１ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ、約３．３ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ、約３．７ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ、約３．９ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ、約４．１ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ、約４．３ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ又は約４．５ｇ／Ｌのアルカリホスファターゼ濃度を有する。
【0139】
いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約１時間～約６０時間にわたって保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約１０時間～約５０時間にわたって保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約１２時間～約４８時間にわたって保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約１４時間～約４２時間にわたって保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約１７時間～約３４時間にわたって保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約１９時間～約３３時間にわたって保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約２５～約３８時間にわたって保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約２９～約３５時間にわたって保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間又は約２０時間にわたって保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約２９時間、約３０時間、約３１時間、約３２時間、約３３時間、約３４時間又は約３５時間にわたって保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約４２時間、約４３時間、約４４時間、約４５時間、約４６時間、約４７時間又は約４８時間にわたって保持される。
【0140】
いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約１０℃～約３０℃の温度で保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約１３℃～約２７℃の温度で保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約１４℃～約２６℃の温度で保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約１５℃～約２６℃の温度で保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約１５℃～約２５℃の温度で保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、約１９℃～約２５℃の温度で保持される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、保持時間の終了時、さらなる下流処理ステップが実施されるまで貯蔵される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、瞬間冷凍後、－８０℃で貯蔵される。
【0141】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加的な精製ステップは、ウイルス不活性化ステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、ウイルス不活性化ステップは、ウイルス粒子を化学的に不活性化するための溶剤／洗剤ウイルス不活性化プロセスを含む。例示的な溶剤／洗剤は、１０％ポリソルベート８０、３％ＴＮＢＰ、５０ｍＭリン酸ナトリウム及び１００ｍＭ ＮａＣｌを含み得る。
【0142】
クロマトグラフィー
本方法のいくつかの実施形態では、部分精製組換えアルカリホスファターゼを得るため、ＵＦＤＦは、少なくとも１つのクロマトグラフィーステップを施される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、部分精製組換えアルカリホスファターゼを得るために少なくとも１つのクロマトグラフィーステップを施され、ここで、組換えアルカリホスファターゼは、約０．９モル／モル～約３．０モル／モルの総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）を有する。いくつかの実施形態では、生成物をさらに精製し、且つ／又は不純物／汚染物質を分離するために少なくとも１つのクロマトグラフィーステップが実施される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのクロマトグラフィーステップは、タンパク質クロマトグラフィーである。いくつかの実施形態では、タンパク質クロマトグラフィーは、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー（ＲＰ）、アフィニティークロマトグラフィー、吸着流動床（ＥＢＡ）、混合モードクロマトグラフィー及び／又は疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）である。いくつかの実施形態では、タンパク質クロマトグラフィーは、アフィニティークロマトグラフィーである。いくつかの実施形態では、タンパク質クロマトグラフィーは、プロテインＡクロマトグラフィーである。いくつかの実施形態では、プロテインＡクロマトグラフィーは、生成物（即ちアルカリホスファターゼ、例えばアスホターゼアルファ）を捕捉する。例えば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｍａｂ Ｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅプロテインＡクロマトグラフィーのプロセスが用いられ得る。プロテインＡクロマトグラフィーで用いられる例示的な緩衝液及び溶液は、例えば、平衡化／洗浄緩衝液（例えば、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５０）、溶出緩衝液（例えば、５０ｍＭトリス、ｐＨ１１．０）、剥離緩衝液（例えば、１００ｍＭクエン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ３．２）、フラッシング緩衝液、清浄液（例えば、０．１Ｍ ＮａＯＨ）などを含む。
本方法のいくつかの実施形態では、部分精製組換えアルカリホスファターゼを得るため、ＵＦＤＦは、少なくとも１つのクロマトグラフィーステップを施される。いくつかの実施形態では、ＵＦＤＦは、部分精製組換えアルカリホスファターゼを得るために少なくとも１つのクロマトグラフィーステップを施され、ここで、組換えアルカリホスファターゼは、約０．９モル／モル～約３．０モル／モルの総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）を有する。いくつかの実施形態では、生成物をさらに精製し、且つ／又は不純物／汚染物質を分離するために少なくとも１つのクロマトグラフィーステップが実施される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのクロマトグラフィーステップは、タンパク質クロマトグラフィーである。いくつかの実施形態では、タンパク質クロマトグラフィーは、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー（ＲＰ）、アフィニティークロマトグラフィー、吸着流動床（ＥＢＡ）、混合モードクロマトグラフィー及び／又は疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）である。いくつかの実施形態では、タンパク質クロマトグラフィーは、アフィニティークロマトグラフィーである。いくつかの実施形態では、タンパク質クロマトグラフィーは、プロテインＡクロマトグラフィーである。いくつかの実施形態では、プロテインＡクロマトグラフィーは、生成物（即ちアルカリホスファターゼ、例えばアスホターゼアルファ）を捕捉する。例えば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｍａｂ Ｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅプロテインＡクロマトグラフィーのプロセスが用いられ得る。プロテインＡクロマトグラフィーで用いられる例示的な緩衝液及び溶液は、例えば、平衡化／洗浄緩衝液（例えば、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５０）、溶出緩衝液（例えば、５０ｍＭトリス、ｐＨ１１．０）、剥離緩衝液（例えば、１００ｍＭクエン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ３．２）、フラッシング緩衝液、清浄液（例えば、０．１Ｍ ＮａＯＨ）などを含む。
【0143】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのクロマトグラフィーステップは、追加的なクロマトグラフィー及び／又は精製ステップを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加的なクロマトグラフィーステップは、カラムクロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態では、カラムクロマトグラフィーは、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー（ＲＰ）、アフィニティークロマトグラフィー、吸着流動床（ＥＢＡ）、混合モードクロマトグラフィー及び／又は疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）である。いくつかの実施形態では、カラムクロマトグラフィーは、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を含む。いくつかの実施形態では、ＨＩＣでは、ブチルセファロース又はＣＡＰＴＯ（登録商標）ブチルアガロースカラムが用いられる。ＣＡＰＴＯ（登録商標）ブチルアガロースＨＩＣプロセスにおいて用いられる例示的な緩衝液及び溶液として、例えば添加希釈液／平衡化前緩衝液（例えば、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１．４Ｍ硫酸ナトリウム、ｐＨ７．５０）、平衡化緩衝液／洗浄緩衝液／溶出緩衝液（例えば、すべてがリン酸ナトリウム及び硫酸ナトリウムを含有する）、ストリップ緩衝液（例えば、リン酸ナトリウムを含有する）などが挙げられる。ブチルＨＩＣプロセスにおいて用いられる例示的な緩衝液及び溶液として、例えば添加希釈液／平衡化前緩衝液（例えば、１０ｍＭヘペス、２．０Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７．５０）、平衡化緩衝液／洗浄緩衝液／溶出緩衝液（例えば、すべてがリン酸ナトリウム又はヘペス及び硫酸アンモニウムを含有する）及びストリップ緩衝液（例えば、リン酸ナトリウムを含有する）が挙げられる。
【0144】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加的な精製ステップは、追加的なダイアフィルトレーションを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加的なクロマトグラフィー及び／又は精製ステップは、疎水性相互作用クロマトグラフィー及び／又は少なくとも１つの追加的なダイアフィルトレーションステップを含む。いくつかの実施形態では、追加的なダイアフィルトレーションステップは、疎水性相互作用クロマトグラフィーステップ後に実施される。いくつかの実施形態では、追加的なダイアフィルトレーションステップは、生成物濃縮及び／又は緩衝液交換を意図して実施される。このプロセスにおいて用いられる例示的な緩衝液及び溶液は、例えば、平衡化緩衝液（例えば、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．７５）、ダイアフィルトレーション緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．７５）などを含む。
【0145】
いくつかの実施形態では、約０．５モル／モル～約４．０モル／モルのＴＳＡＣを有する組換えアルカリホスファターゼを得るために少なくとも１つの追加的なクロマトグラフィー及び／又は精製ステップが実施される。いくつかの実施形態では、約０．９モル／モル～約３．９モル／モルのＴＳＡＣを有する組換えアルカリホスファターゼを得るために少なくとも１つの追加的なクロマトグラフィー及び／又は精製ステップが実施される。いくつかの実施形態では、約１．１モル／モル～約３．２モル／モルのＴＳＡＣを有する組換えアルカリホスファターゼを得るために少なくとも１つの追加的なクロマトグラフィー及び／又は精製ステップが実施される。いくつかの実施形態では、約１．４モル／モル～約２．６モル／モルのＴＳＡＣを有する組換えアルカリホスファターゼを得るために少なくとも１つの追加的なクロマトグラフィー及び／又は精製ステップが実施される。いくつかの実施形態では、約１．２モル／モル～約３．０モル／モルのＴＳＡＣを有する組換えアルカリホスファターゼを得るために少なくとも１つの追加的なクロマトグラフィー及び／又は精製ステップが実施される。いくつかの実施形態では、約０．８モル／モル、約０．９モル／モル、１．０モル／モル、約１．１モル／モル、約１．２モル／モル、約１．３モル／モル、約１．４モル／モル、約１．５モル／モル、約１．６モル／モル、約１．７モル／モル、約１．８モル／モル、約１．９モル／モル、約２．０モル／モル、約２．１モル／モル、約２．２モル／モル、約２．３モル／モル、約２．４モル／モル、約２．５モル／モル、約２．６モル／モル、約２．７モル／モル、約２．８モル／モル、約２．９モル／モル、約３．０モル／モル、約３．１モル／モル、約３．２モル／モル、約３．３モル／モル、約３．４モル／モル、約３．５モル／モル、約３．６モル／モル、約３．７モル／モル、約３．８モル／モル、約３．９モル／モル又は約４．０モル／モルのＴＳＡＣを有する組換えアルカリホスファターゼを得るために少なくとも１つの追加的なクロマトグラフィーステップが実施される。
【0146】
追加的な下流プロセス
いくつかの実施形態では、追加的な下流プロセスは、少なくとも１つの精製ステップ、追加的な精製ステップ、少なくとも１つのクロマトグラフィーステップ及び／又は追加的なクロマトグラフィーステップに加えて実施される。いくつかの実施形態では、追加的な下流プロセスは、生成物、即ち組換えアルカリホスファターゼをさらに精製する。
いくつかの実施形態では、追加的な下流プロセスは、少なくとも１つの精製ステップ、追加的な精製ステップ、少なくとも１つのクロマトグラフィーステップ及び／又は追加的なクロマトグラフィーステップに加えて実施される。いくつかの実施形態では、追加的な下流プロセスは、生成物、即ち組換えアルカリホスファターゼをさらに精製する。
【0147】
いくつかの実施形態では、追加的な下流プロセスは、任意のウイルス粒子をさらに除去するためのウイルス減少濾過プロセスを含む。いくつかの実施形態では、ウイルス減少濾過プロセスは、ナノ濾過である。
【0148】
いくつかの実施形態では、追加的な下流プロセスは、少なくとも１つのさらなるクロマトグラフィーステップを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのさらなるクロマトグラフィーステップは、タンパク質クロマトグラフィーである。いくつかの実施形態では、タンパク質クロマトグラフィーは、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー（ＲＰ）、アフィニティークロマトグラフィー、吸着流動床（ＥＢＡ）、混合モードクロマトグラフィー及び／又は疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）である。いくつかの実施形態では、第３のクロマトグラフィーステップは、混合モードクロマトグラフィー、例えばＣＡＰＴＯ（登録商標）Ａｄｈｅｒｅアガロースクロマトグラフィーである。市販の混合モード材料として、例えば疎水力及び静電力の組み合わせによる中性又は弱塩基性ｐＨでの結合及び低ｐＨでの静電荷反発による溶出を可能にする、ヒドロカルビルアミンリガンドを含有する樹脂（例えば、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹからのＰＰＡ Ｈｙｐｅｒｃｅｌ及びＨＥＡ Ｈｙｐｅｒｃｅｌ）（Ｂｒｅｎａｃ ｅｔ ａｌ．，２００８ Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ．１１７７：２２６－２３３を参照されたい）；芳香族残基による疎水性相互作用を得て、硫黄原子がチオフィリック相互作用により標的タンパク質の結合を促進する、４－メルカプト－エチル－ピリジンリガンドを含有する樹脂（ＭＥＰ Ｈｙｐｅｒｃｅｌ，Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（Ｌｅｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔ．７：４２－４８）；異なる伝導率でタンパク質の塩耐性吸着をもたらす、イオン基の近傍に水素結合基及び芳香族残基を有するリガンドを含有する、ＣＡＰＴＯ（登録商標）ＭＭＣ混合モードクロマトグラフィー及びＣＡＰＴＯ（登録商標）ａｄｈｅｒｅアガロースクロマトグラフィー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ）などの樹脂（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０ Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ．１２１７：２１６－２２４）；及び他の公知のクロマトグラフィー材料、例えば色素リガンドとの親和性樹脂、ハイドロキシアパタイト及びいくつかのイオン交換樹脂（限定されないが、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＣＧ５０（Ｒｏｈｍ＆Ｈａａｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）又はＬｅｗａｔｉｔ ＣＮＰ１０５（Ｌａｎｘｅｓｓ，Ｃｏｌｏｇｎｅ、ＤＥ）を含む）が挙げられる。例示的なアガロースＨＩＣクロマトグラフィーステップでは、このプロセスで用いられる例示的な緩衝液及び溶液として、例えば平衡化前緩衝液（例えば、０．５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６．００）、平衡化／洗浄緩衝液（例えば、２０ｍＭリン酸ナトリウム、４４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５０）、添加滴定緩衝液（例えば、２０ｍＭリン酸ナトリウム、３．２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ５．７５）、プール希釈緩衝液（例えば、２５ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４０）及びストリップ緩衝液（０．１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．２０が挙げられる。
【0149】
いくつかの実施形態では、追加的な下流プロセスは、ウイルスクリアランスのためのウイルス濾過ステップを含む。いくつかの実施形態では、ウイルス濾過ステップは、サイズ排除クロマトグラフィーにより実施される。このプロセスにおいて用いられる例示的な緩衝液及び溶液は、例えば、使用前及び生成後のフラッシュ緩衝液（例えば、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．７５）を含む。
【0150】
いくつかの実施形態では、追加的な下流プロセスは、製剤化プロセスを含む。いくつかの実施形態では、製剤化プロセスは、さらなる濃縮及び／又は緩衝液交換を意図した少なくとも１つのさらなる限外濾過及び／又はダイアフィルトレーションを含む。このプロセスにおいて用いられる例示的な緩衝液及び溶液は、例えば、フィルターフラッシュ／平衡化／ダイアフィルトレーション／回収用緩衝液（例えば、２５ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４０）を含む。
【0151】
いくつかの実施形態では、追加的な下流プロセスは、バルク充填プロセスを含む。いくつかの実施形態では、バルク充填プロセスは、滅菌濾過を含む。滅菌濾過のための例示的なフィルターは、Ｍｉｌｌｉｐａｋ６０又は同等サイズのＰＶＤＦフィルターである（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ。
【0152】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される通り、培養細胞からアルカリホスファターゼを作製、精製及び／又は分離するために用いられるステップは、収集清澄化プロセス（又は無傷細胞及び細胞片を細胞培養物から除去するための類似プロセス）、限外濾過（ＵＦ）プロセス（又は作製されたアルカリホスファターゼを濃縮するための類似プロセス）、ダイアフィルトレーション（ＤＦ）プロセス（又は先行プロセスから作製されたアルカリホスファターゼを含む緩衝液を変更又は希釈するための類似プロセス）、ウイルス不活性化プロセス（又はウイルス粒子を不活性化又は除去するための類似プロセス）、親和性捕捉プロセス（又は作製されたアルカリホスファターゼを捕獲し、それを緩衝液／溶液成分の残りから分離するためのクロマトグラフィー方法のいずれか１つ）、配合プロセス及びバルク充填プロセスからなる群から選択されるステップの少なくとも１つをさらに含む。一実施形態では、培養細胞からアルカリホスファターゼを作製、精製及び／又は分離するためのステップは、本明細書で開示される通り、少なくとも、収集清澄化プロセス（又は無傷細胞及び細胞片を細胞培養物から除去するための類似プロセス）、収集後限外濾過（ＵＦ）プロセス（又は作製されたアルカリホスファターゼを濃縮するための類似プロセス）、収集後ダイアフィルトレーション（ＤＦ）プロセス（又は先行プロセスから作製されたアルカリホスファターゼを含む緩衝液を変更又は希釈するための類似プロセス）、溶媒／洗剤ウイルス不活性化プロセス（又はウイルス粒子を化学的に不活性化するための類似プロセス）、中間体精製プロセス（例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）又は作製されたアルカリホスファターゼを捕獲し、それを緩衝液／溶液成分の残りから分離するためのクロマトグラフィー方法のいずれか１つ）、ＨＩＣ後ＵＦ／ＤＦプロセス（又は作製されたアルカリホスファターゼに対して濃縮及び／又は緩衝液交換するための類似プロセス）、ウイルス減少濾過プロセス（又は任意のウイルス粒子又は他の不純物若しくは汚染物質をさらに除去するための類似プロセス）；混合モードクロマトグラフィー（例えば、ＣＡＰＴＯ（登録商標）Ａｄｈｅｒｅアガロースクロマトグラフィー又は作製されたアルカリホスファターゼをさらに精製及び／若しくは濃縮するための類似プロセス）、配合プロセス及びバルク充填プロセスを含む。一実施形態では、本明細書に提供される方法の分離ステップは、収集清澄化、限外濾過、ダイアフィルトレーション、ウイルス不活性化、親和性捕捉、ＨＩＣクロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー及びそれらの組み合わせの少なくとも１つをさらに含む。図１は、組換えアルカリホスファターゼ、アスホターゼアルファの作製プロセスの実施形態の代表的図面である。
【0153】
いくつかの実施形態では、本開示は、総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）を含有する組換えタンパク質中のＴＳＡＣを、哺動物細胞培養物を通して制御する方法であって、少なくとも１つの精製ステップ及び少なくとも１つのクロマトグラフィーステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、組換えタンパク質を産生する哺乳動物細胞培養物中でグリコシダーゼ活性を制御する方法であって、少なくとも１つの精製ステップ及び少なくとも１つのクロマトグラフィーステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの精製ステップは、濾過、遠心分離、収集清澄化、濾過、限外濾過、ダイアフィルトレーション、ウイルス不活性化、親和性捕捉及びそれらの組み合わせの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのクロマトグラフィーステップは、タンパク質クロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質クロマトグラフィーは、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー（ＲＰ）、アフィニティークロマトグラフィー、吸着流動床（ＥＢＡ）、混合モードクロマトグラフィー及び／又は疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）である。いくつかの実施形態では、精製ステップ及びクロマトグラフィーステップは、限外濾過／ダイアフィルトレーション及びプロテインＡクロマトグラフィーである。
【0154】
本明細書中に引用されるすべての参考文献は、その全体が参照により援用される。前述の本開示は、理解を明確にすることを意図して図面及び実施例を通してある程度詳細に記載されているが、特定の小さい変更及び修正が実施されることは、当業者に自明である。したがって、説明及び実施例は、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例0155】
実施例１：アスホターゼアルファの作製及びＴＳＡＣの測定
アスホターゼアルファ（又は他の目的の糖タンパク質）を公知の方法により製造する。特に、適切な増殖培地中に一定分量に分け、次いで制御された温度、ｐＨ、ＤＯ２及び撹拌でのバイオリアクター内でさらに増殖させるサンプルである適切な組換え細胞株（即ちＭＳＸの存在下で選択される、ＧＳ抵抗性マーカーを保有するトランスフェクトＣＨＯ細胞）から接種物増殖を実施する。アスホターゼアルファにおける典型的な生成方法は、ＣＨＯ細胞を用いたフェドバッチバイオリアクターの方法であるが、他の方法も許容できる。所望される細胞密度及び／又は細胞生存度に至っているとき、生の細胞培養液（ＣＣＦ）からの一次回収を遠心分離及び深濾過により実施し、結果として収集細胞培養液（ＨＣＣＦ）を得る。
アスホターゼアルファ（又は他の目的の糖タンパク質）を公知の方法により製造する。特に、適切な増殖培地中に一定分量に分け、次いで制御された温度、ｐＨ、ＤＯ２及び撹拌でのバイオリアクター内でさらに増殖させるサンプルである適切な組換え細胞株（即ちＭＳＸの存在下で選択される、ＧＳ抵抗性マーカーを保有するトランスフェクトＣＨＯ細胞）から接種物増殖を実施する。アスホターゼアルファにおける典型的な生成方法は、ＣＨＯ細胞を用いたフェドバッチバイオリアクターの方法であるが、他の方法も許容できる。所望される細胞密度及び／又は細胞生存度に至っているとき、生の細胞培養液（ＣＣＦ）からの一次回収を遠心分離及び深濾過により実施し、結果として収集細胞培養液（ＨＣＣＦ）を得る。
【0156】
ＨＣＣＦを限外濾過及びダイアフィルトレーションによりさらに精製し、ＵＦＤＦを形成させる。さらなるクロマトグラフ精製ステップ、例えばウイルス不活性化、プロテインＡクロマトグラフィー（プロテインＡプールをもたらす）、マルチモーダルクロマトグラフィー精製並びに追加的な限外濾過及びダイアフィルトレーションステップを実施する。最終のバルク原薬又は精製した組換えアスホターゼアルファを放出仕様について試験する。バルク原薬は、投与に適した最終パッケージングをもたらす最終のフィルフィニッシュステップに進む。
【0157】
製造中、ＴＳＡＣ含量は、重要な値であり、密に監視される。しかし、ＴＳＡＣに対する保持時間及び温度の具体的影響は、完全には理解されなかった。したがって、製造の様々な段階でのアスホターゼアルファサンプル中のシアル酸の同定及び定量は、アンペロメトリック電気化学検出法を伴う高性能アニオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥ－ＰＡＤ）（炭水化物の検出及び定量のための商用システム、即ちＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃなどが利用可能である）により実施した。まず、サンプルに内部標準を添加し、サンプルをロータリー蒸発装置内で乾燥させ、シアル酸が酸加水分解（０．１Ｍ ＨＣｌ）を介して放出された。サンプルを再び乾燥させ、残留酸を除去し、次にキャピラリーイオンクロマトグラフィーシステム（Ｄｉｏｎｅｘ ＩＣ－５０００）に注入される水で再構成した。注入後、サンプルに、５％酢酸塩緩衝液～３０％酢酸塩緩衝液の、シアル酸種の分離のための酢酸塩勾配を用いて、アルカリ環境下において、アニオン交換クロマトグラフィーを各注入の終了時の５％酢酸塩緩衝液で５分の平衡化とともに３０分かけて施す。炭水化物分離のために設計されたＨＰＬＣカラム（即ちＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１００カラム、ラテックスでコーティングされた非多孔性ビーズの固定相がアルカリ性移動相と同時に電荷に基づいて分離する場合）内で分離が生じる。分離後、サンプルは、アンペロメトリック電気化学検出法を介して検出された。反復する波形により、サンプルが金電極の表面で酸化され、ここで、酸化されたサンプルと金電極との間の電気的能力の差が測定される。結果を電気的能力（ｎＣ）対時間としてプロットし、ピークをインテグレートする。内部標準のパーセント（％ＩＳＴＤ）を、Ｎｅｕ５Ａｃ又はＮｅｕ５Ｇｃピーク面積を内部標準３－デオキシ－Ｄ－グリセロ－Ｄ－ガラクト－２－ノヌロソン酸（ＫＤＮ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の面積で除して１００を掛けることにより計算し、標準％ＩＳＴＤ対標準濃度の検量線と比較することにより定量化する。サンプル濃度は、サンプル％ＩＳＴＤを検量線から内挿することにより判定する。Ｎｅｕ５Ａｃ及びＮｅｕ５Ｇｃシアル酸の混合物をアッセイ標準として用い、この方法で両種を定量化することができた。ナノモルの１単量体あたりのナノモルのＮｅｕ５Ａｃにおいて結果を報告する。Ｎｅｕ５Ｇｃは、アッセイのＬＯＱを超える量で存在することが予想されないが、数量化できるＮｅｕ５Ｇｃを示すサンプルは、通常の実験で記録される。
【0158】
各サンプルにおけるタンパク質に対するシアル酸のモル比は、回収されたシアル酸のナノモル量を、濃縮を用いることにより加水分解されたタンパク質（即ちアスホターゼアルファ）のナノモル量で除することにより計算する（２８０ｎｍでのサンプルの吸光度により測定し、モル吸光係数及び分子量によって調節した）。
【0159】
アスホターゼアルファの作製方法のいくつかの実施形態についてのさらなる詳細は、国際公開第２０１７／０３１１１４号パンフレット及び国際公開第２０１７／２１４１３０号パンフレットに見出すことができ、それらの開示は、それらの全体が参照により援用される。
【0160】
実施例２：ＴＳＡＣに対するＵＦＤＦ保持時間、温度及びタンパク質濃度の評価
（一般に実施例１に記載のような）アスホターゼアルファの大規模作製中、プロテインＡプールに対する収集細胞培養液（ＨＣＣＦ）からのＴＳＡＣにおける減少が認められた。この差は、主に収集後の濃縮／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ１）保持ステップに起因することが予想された。プロテインＡプールに対するＨＣＣＦから認められたＴＳＡＣにおける平均減少が約１．１モル／モルであり、標準偏差が０．２モル／モルであり、範囲が０．９モル／モル～１．３モル／モルであった。
（一般に実施例１に記載のような）アスホターゼアルファの大規模作製中、プロテインＡプールに対する収集細胞培養液（ＨＣＣＦ）からのＴＳＡＣにおける減少が認められた。この差は、主に収集後の濃縮／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ１）保持ステップに起因することが予想された。プロテインＡプールに対するＨＣＣＦから認められたＴＳＡＣにおける平均減少が約１．１モル／モルであり、標準偏差が０．２モル／モルであり、範囲が０．９モル／モル～１．３モル／モルであった。
【0161】
図２は、培養物が少なくとも約２．５×１０６個の生細胞の細胞密度に達するとき、様々な栄養補充剤の添加により増殖した細胞の相対的なタンパク質のシアリル化を、約３７℃～約３０℃の温度変化の存在下及び不在下で１４日にわたり図示する。Ｂｒｘ－１＝温度変化を伴う制御プロセス；Ｂｒｘ－２＝温度変化を伴う制御プロセス；Ｂｒｘ－３＝温度変化を伴うＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ ２＋５；Ｂｒｘ－４＝温度変化を伴うＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ ２＋５；Ｂｒｘ５＝温度変化を伴うＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ ６；Ｂｒｘ－６＝温度変化を伴わないＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ ６；Ｂｒｘ－７＝温度変化を伴うＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ ７ａ＋７ｂ；Ｂｒｘ－８＝温度変化を伴わないＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ ７ａ＋７ｂ。
【0162】
図３は、ＴＳＡＣの減少と、タンパク質濃度（パネルＡ）と、保持温度（パネルＢ）との間の相関を図示する。
【0163】
ＵＦ／ＤＦ１保持中のＴＳＡＣに対するＵＦ／ＤＦ１保持時間、温度及びタンパク質濃度の影響を評価し、特徴づけるため、小規模特徴づけ試験を実施した。
【0164】
実施例２．１：ＵＦ／ＤＦ１の操作及び保持
図４は、３つの１０Ｌの清澄化収集ロットの各々について実施された小規模なＵＦ／ＤＦ１の操作及び保持時間の概略を示す。表１及び表２は、収集後のＵＦ／ＤＦ１ステップについての目標のプロセス条件及びプロセスパラメータを列挙する。
図４は、３つの１０Ｌの清澄化収集ロットの各々について実施された小規模なＵＦ／ＤＦ１の操作及び保持時間の概略を示す。表１及び表２は、収集後のＵＦ／ＤＦ１ステップについての目標のプロセス条件及びプロセスパラメータを列挙する。
【0165】
【表1】
【0166】
【表2】
【0167】
ＵＦ１の終了時及びＤＦの終了時のインプロセスサンプルを精製及びＴＳＡＣ分析のために採取した。高濃度でのサンプル生成は、移動範囲を超える濃縮因子（≦２５倍）をもたらす最終濃縮ステップ（ＵＦ１’）が要求され、各個別ロットの推定上の回収タイターに支配された。最低濃度は、ＤＦ緩衝液での希釈により達成された。ＵＦ／ＤＦ１の完了直後、プールを試験設計に応じて希釈し（図４）、一定分量に分割し、保持試験のために用いた。次に、ＵＦ／ＤＦ１プールを１５ｍＬのコニカルチューブに分割し、制御された水槽内、特定の目標温度±１℃（１５、１９又は２５℃）でさらなる処理前の０、１２、２４、３６、４８及び６０時間にわたって保持した。すべての保持は、保持目標の±２時間実施し、その時点に達すると、一定分量をプロテインＡ精製まで冷凍した（－８０℃）。
【0168】
この試験におけるＴ＝０を、ダイアフィルトレーション（ＤＦ）ステップの終了時、１０分の再循環が完了する時点と定義した。製造操作中、保持時間の開始は、ここで、ＵＦ／ＤＦ１生成物の濾過及び移動後のバッグ充填の終了と定義する。移動は、ＵＦ／ＤＦ１プールにおける保持時間以外にダイアフィルトレーションの終了から平均で約５時間かかる。
【0169】
実施例２．２：ハイスループットＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅプロテインＡクロマトグラフィー
溶剤／洗剤ウイルス不活性化（Ｓ／Ｄ ＶＩ）ステップを伴わないＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅプレパックＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎを通してＵＦ／ＤＦ１保持サンプルを処理した。Ｓ／Ｄ ＶＩステップの除去は、ＴＳＡＣの結果に影響せず、ハイスループットＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎの方法（ＤＶＬ １６ ０１２８）における処理時間を改善する。表３は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎアフィニティークロマトグラフィーステップを提示する。操作は、プレパックＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎ及びＴｅｃａｎ Ｆｒｅｅｄｏｍ Ｅｖｏ液体処理システムを用いて実施した。サンプルは、最大８サンプル／バッチでのバッチ内で精製した。各サンプルバッチの精製前にサンプルを水槽（１８～２５℃）で１時間以内に解凍した。
溶剤／洗剤ウイルス不活性化（Ｓ／Ｄ ＶＩ）ステップを伴わないＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅプレパックＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎを通してＵＦ／ＤＦ１保持サンプルを処理した。Ｓ／Ｄ ＶＩステップの除去は、ＴＳＡＣの結果に影響せず、ハイスループットＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎの方法（ＤＶＬ １６ ０１２８）における処理時間を改善する。表３は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎアフィニティークロマトグラフィーステップを提示する。操作は、プレパックＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎ及びＴｅｃａｎ Ｆｒｅｅｄｏｍ Ｅｖｏ液体処理システムを用いて実施した。サンプルは、最大８サンプル／バッチでのバッチ内で精製した。各サンプルバッチの精製前にサンプルを水槽（１８～２５℃）で１時間以内に解凍した。
【0170】
各ＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎ精製からの溶出物を４つの９６ウェルプレートに収集し（約２００μｌ／ウェル）、各ウェルについて吸光度（Ａ２８０）を測定した。各カラムにおいて、生成物を含有する溶出ウェルを、表３に定義した収集基準に基づき、マイクロピペッティングによりプールし、プールを滅菌濾過した（０．２２μｍ）。ＰｒｏＡプールは、ｐＨ調節又は希釈しなかった。
【0171】
【表3】
【0172】
実施例２．３：結果－ＨＣＣＦ／インプロセスサンプルでのＴＳＡＣ
表４は、３つすべての収集ロットを通して作成したＵＦ／ＤＦ１インプロセスのＴＳＡＣデータを列挙する。ＵＦ１ステップで得られ、次にＵＦ／ＤＦ１操作の残り全体を通して維持される、生成物とシアリダーゼとの両方のより高度な濃縮に起因し、ＨＣＣＦからＵＦ／ＤＦ１保持の開始（Ｔ＝０）までのＴＳＡＣにおける減少が予想される。しかし、このＴＳＡＣの減少は、処理時間が全ＵＦ／ＤＦ１プールの保持時間に対して極めて少ないと仮定すると、ＨＣＣＦからプロテインＡにかけてのＴＳＡＣの総減少のわずかな割合に過ぎないと予想される。この減少を評価するため、各収集ＵＦ／ＤＦ１バッチにおけるすべてのＴ＝０サンプルからのＴＳＡＣの結果を平均化し、次にバッチのＨＣＣＦでの最初のＴＳＡＣから差し引いた。ＵＦ／ＤＦ１操作の終了からの持続時間及びＴ＝０でのサンプリング（保持開始時間の２時間以内に希釈及び冷凍した）を仮定すると、タンパク質濃度の変動にもかかわらず、Ｔ＝０サンプルを通して、最小の変動性（±１０％以内のアッセイ変動性）が予想される。したがって、Ｔ＝０サンプルからの結果を平均化することにより、Ｔ＝０の結果における一層の信頼性が得られ、アッセイ変動性の影響が最小化される。
表４は、３つすべての収集ロットを通して作成したＵＦ／ＤＦ１インプロセスのＴＳＡＣデータを列挙する。ＵＦ１ステップで得られ、次にＵＦ／ＤＦ１操作の残り全体を通して維持される、生成物とシアリダーゼとの両方のより高度な濃縮に起因し、ＨＣＣＦからＵＦ／ＤＦ１保持の開始（Ｔ＝０）までのＴＳＡＣにおける減少が予想される。しかし、このＴＳＡＣの減少は、処理時間が全ＵＦ／ＤＦ１プールの保持時間に対して極めて少ないと仮定すると、ＨＣＣＦからプロテインＡにかけてのＴＳＡＣの総減少のわずかな割合に過ぎないと予想される。この減少を評価するため、各収集ＵＦ／ＤＦ１バッチにおけるすべてのＴ＝０サンプルからのＴＳＡＣの結果を平均化し、次にバッチのＨＣＣＦでの最初のＴＳＡＣから差し引いた。ＵＦ／ＤＦ１操作の終了からの持続時間及びＴ＝０でのサンプリング（保持開始時間の２時間以内に希釈及び冷凍した）を仮定すると、タンパク質濃度の変動にもかかわらず、Ｔ＝０サンプルを通して、最小の変動性（±１０％以内のアッセイ変動性）が予想される。したがって、Ｔ＝０サンプルからの結果を平均化することにより、Ｔ＝０の結果における一層の信頼性が得られ、アッセイ変動性の影響が最小化される。
【0173】
表４に示す通り、収集バッチ＃ＢにおけるＨＣＣＦで報告されたＴＳＡＣは、３．６モル／モルであり、Ｔ＝０サンプルにおける平均ＴＳＡＣの結果は、２．５モル／モルである。したがって、このロットにおけるＵＦ／ＤＦ１操作中、ＴＳＡＣにおける０．９モル／モルの減少が算出される。ＴＳＡＣのこの減少範囲は、より典型的にはＵＦ／ＤＦ１保持（１４～４８時間）が完了してから認められ、このロットにおけるＴＳＡＣの結果の１つが異常値であった可能性が示唆される。バッチ＃Ｂにおけるプロセス結果がさらに小規模であったことは、Ｔ＝０での平均ＴＳＡＣが以下に示すプロセス結果におけるＵＦ／ＤＦ１（最終ＵＦ１、最終ＤＦ）と十分に整合することから、ＨＣＣＦにおけるＴＳＡＣ値が異常値のアッセイ結果であることの証拠をもたらした。加えて、この製造バッチのＣＣＦにおいて測定したＴＳＡＣ値は、２．７モル／モルであり、このバッチにおけるＣＣＦ及びＨＣＣＦでのＴＳＡＣの結果間の差は、プロセスの期待値に不一致であった。
【0174】
【表4】
【0175】
ＨＣＣＦの結果での正確なＴＳＡＣは、ＨＣＣＦからプロテインＡプールにかけてのＴＳＡＣの減少（ＴＳＡＣの減少＝ＨＣＣＦでのＴＳＡＣ－ＰｒｏＡプールでのＴＳＡＣ）を分析するために必要である。収集バッチ＃ＢにおけるＨＣＣＦでのＴＳＡＣについての潜在的に異常な結果のその後の分析に対する影響を最小限にするため、ＨＣＣＦからＴ＝０にかけてのインプロセスの結果を用いて、平均ＴＳＡＣ値を算出した。平均には、３．６モル／モルのＨＣＣＦ結果での初期ＴＳＡＣ、ＵＦ１の終了時のＴＳＡＣ（２．４モル／モル）、ＤＦの終了時のＴＳＡＣ（２．２モル／モル）及びＴ＝０でのＴＳＡＣ値を含める。この場合、最低の保持温度及び最低のＵＦ／ＤＦ１タンパク質濃度からの結果を最終的にデータセットから除外したことから、この計算では３つのＴ＝０値の中の２つのみを用いた（図５を参照されたい）。表５に示す通り、２．７モル／モルのＨＣＣＦ値での平均ＴＳＡＣを収集バッチ＃Ｂにおける小規模特徴づけデータ分析において用いることになる。２．７モル／モルがこのロットにおけるＨＣＣＦでのＴＳＡＣの適切な推定値であるという仮定は、予測モデルの統計分析及び検証の一部として評価することになる。
【0176】
【表5】
【0177】
実施例２．４：プロテインＡでのＴＳＡＣ
図５～図７は、Ｔ＝１２時点のサンプルからの、様々なタンパク質濃度及び保持温度でのＵＦ／ＤＦ１保持中のＴＳＡＣの減少を示すためのデータをプロットする。全体として、組み合わせデータセットから、ＵＦ／ＤＦ１保持時間中の予想された線形的減少が確認される。さらに、ＵＦ／ＤＦ１プールのタンパク質濃度増加とともに、ＴＳＡＣ減少の勾配における一貫した増加が認められる。しかし、ＴＳＡＣの減少とＵＦ／ＤＦ１保持温度との間に明確な傾向が認められない。３つすべてのデータセットを通して、ＴＳＡＣの減少における同様の傾向が認められ、この試験で用いられる３つの収集ロットにおける一貫したＴＳＡＣの振る舞いが示される。
図５～図７は、Ｔ＝１２時点のサンプルからの、様々なタンパク質濃度及び保持温度でのＵＦ／ＤＦ１保持中のＴＳＡＣの減少を示すためのデータをプロットする。全体として、組み合わせデータセットから、ＵＦ／ＤＦ１保持時間中の予想された線形的減少が確認される。さらに、ＵＦ／ＤＦ１プールのタンパク質濃度増加とともに、ＴＳＡＣ減少の勾配における一貫した増加が認められる。しかし、ＴＳＡＣの減少とＵＦ／ＤＦ１保持温度との間に明確な傾向が認められない。３つすべてのデータセットを通して、ＴＳＡＣの減少における同様の傾向が認められ、この試験で用いられる３つの収集ロットにおける一貫したＴＳＡＣの振る舞いが示される。
【0178】
実施例３：プロテインＡクロマトグラフィー及びバルク充填後のＴＳＡＣの測定
総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）は、アスホターゼアルファのための製造プロセスの２ステップ時、即ちプロテインＡクロマトグラフィー（プロテインＡ又はＰｒｏＡプールとも称される）及びバルク充填（バルク原薬又はＢＤＳの放出とも称される）後に測定した（図１を参照されたい）。図８に示す通り、ＰｒｏＡプール及びＢＤＳの放出からのＴＳＡＣデータを５１の製造バッチに対してレビューした。ＢＤＳ ＴＳＡＣ結果は、１．３～２．６モル／モルの範囲であるとともに、平均が１．９モル／モルであり、且つ標準偏差が０．３モル／モル（ＲＳＤ＝１７．５％）である。図８に示す通り、ＢＤＳ ＴＳＡＣデータ及びＰｒｏＡ ＴＳＡＣデータは、バッチ＃５２４７５９以外の各バッチにおいて傾向が類似する。本実施例からのデータは、プロテインＡプールステップ下流の単位操作がＴＳＡＣ変動性に有意に寄与することがないことを示す。
総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）は、アスホターゼアルファのための製造プロセスの２ステップ時、即ちプロテインＡクロマトグラフィー（プロテインＡ又はＰｒｏＡプールとも称される）及びバルク充填（バルク原薬又はＢＤＳの放出とも称される）後に測定した（図１を参照されたい）。図８に示す通り、ＰｒｏＡプール及びＢＤＳの放出からのＴＳＡＣデータを５１の製造バッチに対してレビューした。ＢＤＳ ＴＳＡＣ結果は、１．３～２．６モル／モルの範囲であるとともに、平均が１．９モル／モルであり、且つ標準偏差が０．３モル／モル（ＲＳＤ＝１７．５％）である。図８に示す通り、ＢＤＳ ＴＳＡＣデータ及びＰｒｏＡ ＴＳＡＣデータは、バッチ＃５２４７５９以外の各バッチにおいて傾向が類似する。本実施例からのデータは、プロテインＡプールステップ下流の単位操作がＴＳＡＣ変動性に有意に寄与することがないことを示す。
【0179】
実施例４：収集前及び収集後のＴＳＡＣの測定
細胞培養液（ＣＣＦ）及び収集清澄化培養液（ＨＣＣＦ）において、総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）を測定した（図１を参照されたい）。図９に示す通り、ＣＣＦからのＴＳＡＣデータを３９の製造バッチについて測定した。ＣＣＦサンプルは、産生バイオリアクターの実行終了時に採取し、濾過し、細胞及び細胞片を除去し、次に小規模プロテインＡ精製及びＴＳＡＣ分析に先立ち、適切な条件で貯蔵した。ＣＣＦでのＴＳＡＣの測定結果は、１．９～２．９モル／モルの範囲であるとともに、平均が２．４モル／モルであり、且つ標準偏差が０．３モル／モル（ＲＳＤ＝１０．４％）である。収集（ＨＣＣＦ）でのＴＳＡＣデータは、３９のうちの３５のバッチにおいて測定した。ＨＣＣＦ ＴＳＡＣの結果は、２．２～３．４モル／モルの範囲であり、平均が２．７モル／モルであり、且つ標準偏差が０．３モル／モル（ＲＳＤ＝１０．７％）であった。図９に示す通り、データがＣＣＦとＨＣＣＦとの両方で利用可能である場合のバッチにおいて、ＨＣＣＦ ＴＳＡＣは、ＣＣＦ ＴＳＡＣと傾向が類似し、（バッチ＃Ｂを例外として）平均に対して約０．２モル／モル増加する。このバッチにおけるＰｒｏＡ及びＢＤＳのＴＳＡＣの結果は、ＣＣＦ ＴＳＡＣの結果と整合し、ＨＣＣＦの結果は、異常値と考えられる。本実施例からのデータは、収集プロセスがＴＳＡＣに変動性を加えないことを示す。
細胞培養液（ＣＣＦ）及び収集清澄化培養液（ＨＣＣＦ）において、総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）を測定した（図１を参照されたい）。図９に示す通り、ＣＣＦからのＴＳＡＣデータを３９の製造バッチについて測定した。ＣＣＦサンプルは、産生バイオリアクターの実行終了時に採取し、濾過し、細胞及び細胞片を除去し、次に小規模プロテインＡ精製及びＴＳＡＣ分析に先立ち、適切な条件で貯蔵した。ＣＣＦでのＴＳＡＣの測定結果は、１．９～２．９モル／モルの範囲であるとともに、平均が２．４モル／モルであり、且つ標準偏差が０．３モル／モル（ＲＳＤ＝１０．４％）である。収集（ＨＣＣＦ）でのＴＳＡＣデータは、３９のうちの３５のバッチにおいて測定した。ＨＣＣＦ ＴＳＡＣの結果は、２．２～３．４モル／モルの範囲であり、平均が２．７モル／モルであり、且つ標準偏差が０．３モル／モル（ＲＳＤ＝１０．７％）であった。図９に示す通り、データがＣＣＦとＨＣＣＦとの両方で利用可能である場合のバッチにおいて、ＨＣＣＦ ＴＳＡＣは、ＣＣＦ ＴＳＡＣと傾向が類似し、（バッチ＃Ｂを例外として）平均に対して約０．２モル／モル増加する。このバッチにおけるＰｒｏＡ及びＢＤＳのＴＳＡＣの結果は、ＣＣＦ ＴＳＡＣの結果と整合し、ＨＣＣＦの結果は、異常値と考えられる。本実施例からのデータは、収集プロセスがＴＳＡＣに変動性を加えないことを示す。
【0180】
細胞培養液に対して実施した追加的な多変量分析により、ＣＣＦ ＴＳＡＣに対する産生バイオリアクターの接種時の細胞世代数（３２～５１世代）からの統計学的に有意な影響が同定されなかった（データは示さず）。その後の分析により、試験範囲での世代数とＣＣＦ又はＨＣＣＦでのＴＳＡＣとの間に統計学的に有意な相関が全く確認されなかった。
【0181】
実施例５：収集前及び収集後のＴＳＡＣの測定
製造プロセスにおける様々なポイントで収集したＴＳＡＣ測定のレビューによると、ＨＣＣＦとプロテインＡプールとの間でのＴＳＡＣにおける減少がＵＦ／ＤＦ１後の保持（ＵＦ１保持としても知られる；図１を参照されたい）にわたって生じることが示される。図１０に示す通り、ＴＳＡＣは、ＵＦ１保持中、特定のデータ点が異常値として除外されたバッチ＃５８３３８９を除くすべてのバッチにおいて有意に減少する。このバッチに対応するＢＤＳの結果によると、他のバッチに類似したＴＳＡＣの結果における減少がこのバッチにおけるＵＦ１保持中に認められたことが確認される。ＵＦ１保持の持続時間にわたるＴＳＡＣの結果における平均減少が約１．０モル／モルであり、標準偏差が０．３モル／モル（ＲＳＤ＝２６．３％）であり、範囲が０．５モル／モル～１．４モル／モルであった。
製造プロセスにおける様々なポイントで収集したＴＳＡＣ測定のレビューによると、ＨＣＣＦとプロテインＡプールとの間でのＴＳＡＣにおける減少がＵＦ／ＤＦ１後の保持（ＵＦ１保持としても知られる；図１を参照されたい）にわたって生じることが示される。図１０に示す通り、ＴＳＡＣは、ＵＦ１保持中、特定のデータ点が異常値として除外されたバッチ＃５８３３８９を除くすべてのバッチにおいて有意に減少する。このバッチに対応するＢＤＳの結果によると、他のバッチに類似したＴＳＡＣの結果における減少がこのバッチにおけるＵＦ１保持中に認められたことが確認される。ＵＦ１保持の持続時間にわたるＴＳＡＣの結果における平均減少が約１．０モル／モルであり、標準偏差が０．３モル／モル（ＲＳＤ＝２６．３％）であり、範囲が０．５モル／モル～１．４モル／モルであった。
【0182】
以前の分析では、ＵＦＤＦ１の保持時間とＢＤＳでのＴＳＡＣの変動性との間の相関が同定された。ＴＳＡＣの減少に対するＵＦＤＦ１保持時間、温度及びタンパク質濃度の影響への理解が十分でなかったことから、追加的な温度及びタンパク質濃度依存性データを小規模に収集し、ＵＦ１保持中のＴＳＡＣの減少に対する影響を理解した。ＵＦＤＦ１保持中の３つの要素の多変量評価を、各要素における範囲を評価する、十分な要因実験研究の設計を用いて行った（表６）。この小規模特徴づけ試験の設計は、３つのバッチ（Ａ、Ｂ及びＣ）からの収集物を用いて実施した。各収集物に対する小規模ＵＦＤＦ１の操作後、ＵＦＤＦ１プールを、様々な保持時間、温度及びタンパク質濃度で保持した（表６）。ＴＳＡＣ分析のため、小規模プロテインＡカラムを用いてサンプルを精製した。プロテインＡプールでのＴＳＡＣを各収集物におけるＨＣＣＦでのＴＳＡＣ値と比較し、ＨＣＣＦからのＴＳＡＣにおける全体減少（ＴＳＡＣの減少）を各ＵＦ１保持条件について計算した。
【0183】
【表6】
【0184】
実験結果に従い、ＵＦＤＦ１保持中、ＴＳＡＣの減少に対するフィットモデル分析を実施することにより、ＪＭＰモデルを作出した。各要素（保持時間、温度及びタンパク質濃度）を、段階的回帰を用いる要因分析に含めた。モデル出力は、予測プロット（図１１）、選別パラメータ推定値、予測式及び予測プロファイラー（図１２）による実出力を含んだ。予測式は、パラメータ推定値から誘導し、予測プロファイラーにおいてプロットした。
【0185】
小規模ＵＦＤＦ１モデル及びこれらのデータから作出したＪＭＰモデルが大規模プロセスを代表することを確認するため、ＨＣＣＦ ＴＳＡＣ及びＵＦＤＦ１保持データ（平均保持時間、タンパク質濃度及び平均保持温度）が両方とも利用可能である場合、予測モデルを、３５の製造バッチにおけるＢＤＳ ＴＳＡＣを予測するその能力について検証した。各製造バッチにおいて、予測されたＴＳＡＣの減少を測定したＨＣＣＦ ＴＳＡＣから差し引き、予測されたＰｒｏＡ ＴＳＡＣを得た。ＰｒｏＡからＢＤＳへの平均で０．２モル／モルのＴＳＡＣの増加に基づき、予測されたＢＤＳ ＴＳＡＣを算出した。ＢＤＳ ＴＳＡＣは、バッチ＃Ｂを例外とするすべての製造バッチにおいて、アッセイ変動性内（±２０％）で予測可能であった。
【0186】
特徴づけ試験によると、ＵＦＤＦ１タンパク質濃度が、ＵＦＤＦ１保持中、ＴＳＡＣの減少に対して統計学的に有意な（Ｐ値＜０．０００１）影響を有することが示された。ＵＦ１保持中のＴＳＡＣの減少は、哺乳動物細胞培養収集物中に存在することが知られるシアリダーゼ酵素の存在に起因して生じると考えられる（Ｇｒａｍｅｒ ａｎｄ Ｇｏｏｃｈｅｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．９：３６６－３７３（１９９３）、参照により本明細書中に具体的に援用される）。アスホターゼアルファのタンパク質濃度は、ＵＦＤＦ１保持中のシアリダーゼ酵素の濃度に代わるものと考えられる。しかし、この特性は、原薬製造プロセスにおけるＴＳＡＣ対照として定義しなかった。
【0187】
結論として、データは、ＵＦＤＦの保持時間の範囲が１４～４８時間から１４～４２時間に減少することを示唆する。加えて、データは、２．０～４．３ｇ／Ｌの範囲の、ＵＦＤＦ保持ステップでのタンパク質濃度に新しい性能特性が加わることを示唆した。
【0188】
上の本明細書に記述されるすべての刊行物、特許及び特許出願は、あたかもそれぞれの個別の刊行物、特許又は特許出願が、その全体が詳細且つ個別に参照により援用されるように示されるのと同程度に参照により本明細書に援用される。本開示の上記の方法の様々な修正形態及び変更形態、医薬組成物及びキットは、特許請求される本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく当業者に明白になるであろう。本開示は、具体的な実施形態と関連して記載されているが、さらなる修正形態が可能であり、特許請求される本発明がかかる具体的な実施形態に不当に限定されるべきでないことが理解されるであろう。
【0189】
【図1】
【図2】
【図3A-3B】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【手続補正書】
【提出日】2024-03-01
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
組換えアルカリホスファターゼを作製する方法であって、
ａ．組換えアルカリホスファターゼを発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を培地に接種することと；
ｂ．前記ＣＨＯ細胞を培地中で培養することと；
ｃ．約２．１モル／モル～約４．３モル／モルの総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）を有する収集清澄化培養液（ＨＣＣＦ）を形成するために、前記組換えアルカリホスファターゼを（ｃ）の細胞培養物から少なくとも１つの精製ステップによって単離することと；
ｄ．濾過プール（ＵＦＤＦ）を形成するために少なくとも１つの追加的なタンパク質精製ステップを実施することであって、前記ＵＦＤＦは、約１３℃～約２７℃の温度で約１時間～約６０時間にわたって且つ約１．７ｇ／Ｌ～約５．３ｇ／Ｌのタンパク質濃度で保持される、実施することと；
ｅ．部分精製組換えアルカリホスファターゼを得るために前記ＵＦＤＦに少なくとも１つのクロマトグラフィーステップを施すことであって、前記組換えアルカリホスファターゼは、約０．７モル／モル～約３．５モル／モルのＴＳＡＣを有する、施すことと
を含む方法。
ａ．組換えアルカリホスファターゼを発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を培地に接種することと；
ｂ．前記ＣＨＯ細胞を培地中で培養することと；
ｃ．約２．１モル／モル～約４．３モル／モルの総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）を有する収集清澄化培養液（ＨＣＣＦ）を形成するために、前記組換えアルカリホスファターゼを（ｃ）の細胞培養物から少なくとも１つの精製ステップによって単離することと；
ｄ．濾過プール（ＵＦＤＦ）を形成するために少なくとも１つの追加的なタンパク質精製ステップを実施することであって、前記ＵＦＤＦは、約１３℃～約２７℃の温度で約１時間～約６０時間にわたって且つ約１．７ｇ／Ｌ～約５．３ｇ／Ｌのタンパク質濃度で保持される、実施することと；
ｅ．部分精製組換えアルカリホスファターゼを得るために前記ＵＦＤＦに少なくとも１つのクロマトグラフィーステップを施すことであって、前記組換えアルカリホスファターゼは、約０．７モル／モル～約３．５モル／モルのＴＳＡＣを有する、施すことと
を含む方法。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0188】
以下、本発明の実施形態を示す。
［１］組換えアルカリホスファターゼを作製する方法であって、
ａ．組換えアルカリホスファターゼを発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を培地に接種することと；
ｂ．前記ＣＨＯ細胞を培地中で培養することと；
ｃ．約２．１モル／モル～約４．３モル／モルの総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）を有する収集清澄化培養液（ＨＣＣＦ）を形成するために、前記組換えアルカリホスファターゼを（ｃ）の細胞培養物から少なくとも１つの精製ステップによって単離することと；
ｄ．濾過プール（ＵＦＤＦ）を形成するために少なくとも１つの追加的なタンパク質精製ステップを実施することであって、前記ＵＦＤＦは、約１３℃～約２７℃の温度で約１時間～約６０時間にわたって且つ約１．７ｇ／Ｌ～約５．３ｇ／Ｌのタンパク質濃度で保持される、実施することと；
ｅ．部分精製組換えアルカリホスファターゼを得るために前記ＵＦＤＦに少なくとも１つのクロマトグラフィーステップを施すことであって、前記組換えアルカリホスファターゼは、約０．７モル／モル～約３．５モル／モルのＴＳＡＣを有する、施すことと
を含む方法。
［２］組換えアルカリホスファターゼを作製する方法であって、
ａ．組換えアルカリホスファターゼを発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を培地に接種することと；
ｂ．前記ＣＨＯ細胞を培地中で培養することと；
ｃ．栄養補充剤を（ｂ）の細胞培養物に添加することと；
ｄ．濾過プール（ＵＦＤＦ）を形成するために、前記組換えアルカリホスファターゼを（ｃ）の前記細胞培養物から少なくとも１つの精製ステップによって単離することと；
ｅ．前記組換えアルカリホスファターゼを前記ＵＦＤＦから回収することであって、前記ＵＦＤＦ中の前記組換えアルカリホスファターゼは、前記回収を施されるとき、約２．１モル／モル～約４．３モル／モルの総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）を有する、回収することと
を含む方法。
［３］シアリダーゼは、前記細胞培養物、前記ＨＣＣＦ及び／又は前記ＵＦＤＦから選択的に除去される、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］外因性シアリルトランスフェラーゼは、前記細胞培養物、前記ＨＣＣＦ及び／又は前記ＵＦＤＦに添加される、［１］又は［２］に記載の方法。
［５］前記培地中での前記ＣＨＯ細胞の前記培養は、約３６℃～約３８℃の温度におけるものである、［１］～［４］のいずれか一に記載の方法。
［６］前記培地中での前記ＣＨＯ細胞の前記培養は、約３７℃の温度におけるものである、［１］～［５］のいずれか一に記載の方法。
［７］前記栄養補充剤は、ＣＨＯ細胞の前記培地への接種の少なくとも１日後に前記細胞培養物に添加される、［１］～［６］のいずれか一に記載の方法。
［８］前記栄養補充剤は、３つ以上の異なる時点で添加される、［１］～［７］のいずれか一に記載の方法。
［９］前記培地は、ＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）３０２無血清培地；ＣＤ ＤＧ４４培地；ＢＤ Ｓｅｌｅｃｔ（商標）培地；ＳＦＭ４ＣＨＯ培地；及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、［１］～［８］のいずれか一に記載の方法。
［１０］前記ＣＨＯ細胞の前記培養は、０．２５Ｌ～２５，０００Ｌのバイオリアクター内におけるものである、［１］～［９］のいずれか一に記載の方法。
［１１］前記ＣＨＯ細胞の前記培養は、１００Ｌ～２５，０００Ｌのバイオリアクター内におけるものである、［１］～［１０］のいずれか一に記載の方法。
［１２］前記ＣＨＯ細胞の前記培養は、２０００Ｌ～２０，０００Ｌのバイオリアクター内におけるものである、［１］～［１１］のいずれか一に記載の方法。
［１３］前記細胞培養物の温度は、前記接種の約８０時間～約１２０時間後に減少される、［１］～［１２］のいずれか一に記載の方法。
［１４］（ｄ）は、接種の約１０～約１４日後に行われる、［１］～［１３］のいずれか一に記載の方法。
［１５］前記ＨＣＣＦの前記ＴＳＡＣは、約２．２モル／モル～約３．６モル／モルである、［１］～［１４］のいずれか一に記載の方法。
［１６］前記ＨＣＣＦの前記ＴＳＡＣは、約２．２モル／モル～約３．４モル／モルである、［１］～［１５］のいずれか一に記載の方法。
［１７］前記少なくとも１つの追加的な精製ステップは、収集清澄化、濾過、限外濾過、ダイアフィルトレーション、ウイルス不活性化、親和性捕捉及びそれらの組み合わせの少なくとも１つを含む、［１］～［１６］のいずれか一に記載の方法。
［１８］前記少なくとも１つの追加的な精製ステップは、限外濾過及び／又はダイアフィルトレーションを含む、［１］～［１７］のいずれか一に記載の方法。
［１９］前記ＵＦＤＦは、約１４℃～約２６℃の温度で保持される、［１］～［１８］のいずれか一に記載の方法。
［２０］前記ＵＦＤＦは、約１５℃～約２６℃の温度で保持される、［１］～［１９］のいずれか一に記載の方法。
［２１］前記ＵＦＤＦは、約１５℃～約２５℃の温度で保持される、［１］～［２０］のいずれか一に記載の方法。
［２２］前記ＵＦＤＦは、約１９℃～約２５℃の温度で保持される、［１］～［２１］のいずれか一に記載の方法。
［２３］前記ＵＦＤＦは、約１０時間～約５０時間にわたって保持される、［１］～［２２］のいずれか一に記載の方法。
［２４］前記ＵＦＤＦは、約１２時間～約４８時間にわたって保持される、［１］～［２３］のいずれか一に記載の方法。
［２５］前記ＵＦＤＦは、約１４時間～約４２時間にわたって保持される、［１］～［２４］のいずれか一に記載の方法。
［２６］前記ＵＦＤＦは、約１７時間～約３４時間にわたって保持される、［１］～［２５］のいずれか一に記載の方法。
［２７］前記ＵＦＤＦは、約１９時間～約３３時間にわたって保持される、［１］～［２６］のいずれか一に記載の方法。
［２８］前記ＵＦＤＦは、約２５時間～約３８時間にわたって保持される、［１］～［２７］のいずれか一に記載の方法。
［２９］前記ＵＦＤＦは、約２９時間～約３５時間にわたって保持される、［１］～［２８］のいずれか一に記載の方法。
［３０］前記ＵＦＤＦは、約２．０ｇ／Ｌ～約４．３ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する、［１］～［２９］のいずれか一に記載の方法。
［３１］前記ＵＦＤＦは、約２．４ｇ／Ｌ～約３．７ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する、［１］～［３０］のいずれか一に記載の方法。
［３２］前記ＵＦＤＦは、約３．１ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する、［１］～［３１］のいずれか一に記載の方法。
［３３］前記ＵＦＤＦは、約３．０ｇ／Ｌ～約４．５ｇ／Ｌのアルカリホスファターゼ濃度を有する、［１］～［３２］のいずれか一に記載の方法。
［３４］前記ＵＦＤＦは、約３．３ｇ／Ｌ～約４．１ｇ／Ｌのアルカリホスファターゼ濃度を有する、［１］～［３３］のいずれか一に記載の方法。
［３５］前記少なくとも１つのクロマトグラフィーステップは、タンパク質アフィニティークロマトグラフィーである、［１］～［３４］のいずれか一に記載の方法。
［３６］前記少なくとも１つのクロマトグラフィーステップは、プロテインＡクロマトグラフィーである、［１］～［３５］のいずれか一に記載の方法。
［３７］ステップ（ｄ）は、ウイルス不活性化ステップをさらに含む、［１］～［３６］のいずれか一に記載の方法。
［３８］ステップ（ｅ）は、少なくとも１つの追加的なクロマトグラフィー及び／又は精製ステップをさらに含む、［１］～［３７］のいずれか一に記載の方法。
［３９］前記少なくとも１つの追加的なクロマトグラフィーステップは、カラムクロマトグラフィーを含む、［１］～［３８］のいずれか一に記載の方法。
［４０］前記カラムクロマトグラフィーは、疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む、［１］～［３９］のいずれか一に記載の方法。
［４１］前記少なくとも１つの追加的な精製ステップは、追加的なダイアフィルトレーションを含む、［１］～［４０］のいずれか一に記載の方法。
［４２］前記少なくとも１つの追加的なクロマトグラフィー及び／又は精製ステップは、疎水性相互作用クロマトグラフィー及び／又は少なくとも１つの追加的なダイアフィルトレーションステップを含む、［１］～［４１］のいずれか一に記載の方法。
［４３］前記少なくとも１つの追加的なクロマトグラフィー及び／又は精製ステップは、約０．９モル／モル～約３．９モル／モルのＴＳＡＣを有する組換えアルカリホスファターゼを得るために実施される、［１］～［４２］のいずれか一に記載の方法。
［４４］前記少なくとも１つの追加的なクロマトグラフィー及び／又は精製ステップは、約１．１モル／モル～約３．２モル／モルのＴＳＡＣを有する組換えアルカリホスファターゼを得るために実施される、［１］～［４３］のいずれか一に記載の方法。
［４５］前記少なくとも１つの追加的なクロマトグラフィー及び／又は精製ステップは、約１．４モル／モル～約２．６モル／モルのＴＳＡＣを有する組換えアルカリホスファターゼを得るために実施される、［１］～［４４］のいずれか一に記載の方法。
［４６］前記少なくとも１つの追加的なクロマトグラフィー及び／又は精製ステップは、約１．２モル／モル～約３．０モル／モルのＴＳＡＣを有する組換えアルカリホスファターゼを得るために実施される、［１］～［４５］のいずれか一に記載の方法。
［４７］前記組換えアルカリホスファターゼは、Ｗ－ｓＡＬＰ－Ｘ－Ｆｃ－Ｙ－Ｄ ｎ －Ｚ（式中、
Ｗは、不在であるか、又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり；
Ｘは、不在であるか、又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり；
Ｙは、不在であるか、又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり；
Ｚは、不在であるか、又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり；
Ｆｃは、結晶化可能領域断片であり；
Ｄ ｎ は、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸塩又はそれらの組み合わせであり、ここで、ｎ＝１０又は１６であり；及び
ｓＡＬＰは、可溶性アルカリホスファターゼである）
の構造を含む、［１］～［４６］のいずれか一に記載の方法。
［４８］前記組換えアルカリホスファターゼは、アスホターゼアルファ（配列番号１）を含む、［１］～［４７］のいずれか一に記載の方法。
［４９］前記タンパク質アフィニティークロマトグラフィーから得られる前記組換えアルカリホスファターゼは、約２℃～約８℃で貯蔵される、［１］～［４８］のいずれか一に記載の方法。
［５０］接種後、栄養補充剤を（ｂ）の前記細胞培養物に添加することをさらに含む、［１］～［４９］のいずれか一に記載の方法。
［５１］ＵＦＤＦ中の前記組換えアルカリホスファターゼは、前記回収を施されるとき、約２．２モル／モル～約３．６モル／モルの総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）を有する、［１］～［５０］のいずれか一に記載の方法。
［５２］前記ＵＦＤＦ中の前記組換えアルカリホスファターゼは、前記回収を施されるとき、約２．２モル／モル～約３．４モル／モルの総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）を有する、［１］～［５１］のいずれか一に記載の方法。
［５３］組換えアルカリホスファターゼ活性を測定することをさらに含む、［１］～［５２］のいずれか一に記載の方法。
［５４］哺乳動物細胞培養物中に生成される組換えアルカリホスファターゼであって、前記細胞培養物から生成された収集清澄化培養液（ＨＣＣＦ）中の前記組換えアルカリホスファターゼは、常に約１．２モル／モル以上の総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）を有し、前記哺乳動物細胞培養物は、約１００Ｌ～約２５，０００Ｌである、組換えアルカリホスファターゼ。
［５５］組換えアルカリホスファターゼを含む濾過プール（ＵＦＤＦ）であって、約１００Ｌ～約２５，０００Ｌの細胞培養物から生成され、約２．０～約４．３ｇ／Ｌのタンパク質濃度において約１９℃～約２５℃で約１４～約４２時間にわたって保持される、濾過プール（ＵＦＤＦ）。
［５６］［１］～［５３］のいずれか一に記載の方法によって生成される組換えアルカリホスファターゼ。
［５７］［５６］に記載の組換えアルカリホスファターゼ及び少なくとも１つの薬学的に許容できる担体、希釈剤、賦形剤又はそれらの組み合わせを含む医薬製剤。
［５８］対象における無機ピロリン酸塩（ＰＰｉ）の切断を増強するために、［５６］に記載の組換えアルカリホスファターゼを使用する方法。
［５９］アルカリホスファターゼ欠損に関連する病態を患っている対象を治療する方法であって、治療有効量の、［５６］に記載の組換えアルカリホスファターゼを前記対象に投与することを含む方法。
［６０］総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）を、ＴＳＡＣを含有する組換えタンパク質において制御する方法であって、前記組換えタンパク質を哺乳動物細胞培養物中で培養することと、ＵＦＤＦを提供するために少なくとも１つの精製ステップを実施することとを含み、温度、タンパク質濃度及び／又は保持時間は、前記ＵＦＤＦ中で制御される、方法。
［６１］前記組換えタンパク質は、組換え糖タンパク質である、［６０］に記載の方法。［６２］前記組換えタンパク質は、アルカリホスファターゼタンパク質である、［６０］又は［６１］に記載の方法。
［６３］前記組換えタンパク質は、アスホターゼアルファである、［６０］～［６２］のいずれか一に記載の方法。
［６４］前記少なくとも１つの精製ステップは、限外濾過及び／又はダイアフィルトレーションを含む、［６０］～［６３］のいずれか一に記載の方法。
［６５］前記少なくとも１つの精製ステップは、プロテインＡクロマトグラフィーを含む、［６０］～［６４］のいずれか一に記載の方法。
［６６］哺乳動物細胞培養物中のグリコシダーゼ活性を制御する方法であって、組換えタンパク質を哺乳動物細胞培養物中で培養することと、ＵＦＤＦを提供するために少なくとも１つの精製ステップを実施することとを含み、温度、タンパク質濃度及び／又は保持時間は、前記グリコシダーゼ活性を制御するために前記ＵＦＤＦ中で制御される、方法。
［６７］前記組換えタンパク質は、組換え糖タンパク質である、［６６］に記載の方法。［６８］前記組換えタンパク質は、アルカリホスファターゼタンパク質である、［６６］又は［６７］に記載の方法。
［６９］前記組換えタンパク質は、アスホターゼアルファである、［６６］～［６８］のいずれか一に記載の方法。
［７０］前記少なくとも１つの精製ステップは、限外濾過及び／又はダイアフィルトレーションを含む、［６６］～［６９］のいずれか一に記載の方法。
［７１］前記少なくとも１つの精製ステップは、プロテインＡクロマトグラフィーを含む、［６６］～［７０］のいずれか一に記載の方法。
上の本明細書に記述されるすべての刊行物、特許及び特許出願は、あたかもそれぞれの個別の刊行物、特許又は特許出願が、その全体が詳細且つ個別に参照により援用されるように示されるのと同程度に参照により本明細書に援用される。本開示の上記の方法の様々な修正形態及び変更形態、医薬組成物及びキットは、特許請求される本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく当業者に明白になるであろう。本開示は、具体的な実施形態と関連して記載されているが、さらなる修正形態が可能であり、特許請求される本発明がかかる具体的な実施形態に不当に限定されるべきでないことが理解されるであろう。
［１］組換えアルカリホスファターゼを作製する方法であって、
ａ．組換えアルカリホスファターゼを発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を培地に接種することと；
ｂ．前記ＣＨＯ細胞を培地中で培養することと；
ｃ．約２．１モル／モル～約４．３モル／モルの総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）を有する収集清澄化培養液（ＨＣＣＦ）を形成するために、前記組換えアルカリホスファターゼを（ｃ）の細胞培養物から少なくとも１つの精製ステップによって単離することと；
ｄ．濾過プール（ＵＦＤＦ）を形成するために少なくとも１つの追加的なタンパク質精製ステップを実施することであって、前記ＵＦＤＦは、約１３℃～約２７℃の温度で約１時間～約６０時間にわたって且つ約１．７ｇ／Ｌ～約５．３ｇ／Ｌのタンパク質濃度で保持される、実施することと；
ｅ．部分精製組換えアルカリホスファターゼを得るために前記ＵＦＤＦに少なくとも１つのクロマトグラフィーステップを施すことであって、前記組換えアルカリホスファターゼは、約０．７モル／モル～約３．５モル／モルのＴＳＡＣを有する、施すことと
を含む方法。
［２］組換えアルカリホスファターゼを作製する方法であって、
ａ．組換えアルカリホスファターゼを発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を培地に接種することと；
ｂ．前記ＣＨＯ細胞を培地中で培養することと；
ｃ．栄養補充剤を（ｂ）の細胞培養物に添加することと；
ｄ．濾過プール（ＵＦＤＦ）を形成するために、前記組換えアルカリホスファターゼを（ｃ）の前記細胞培養物から少なくとも１つの精製ステップによって単離することと；
ｅ．前記組換えアルカリホスファターゼを前記ＵＦＤＦから回収することであって、前記ＵＦＤＦ中の前記組換えアルカリホスファターゼは、前記回収を施されるとき、約２．１モル／モル～約４．３モル／モルの総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）を有する、回収することと
を含む方法。
［３］シアリダーゼは、前記細胞培養物、前記ＨＣＣＦ及び／又は前記ＵＦＤＦから選択的に除去される、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］外因性シアリルトランスフェラーゼは、前記細胞培養物、前記ＨＣＣＦ及び／又は前記ＵＦＤＦに添加される、［１］又は［２］に記載の方法。
［５］前記培地中での前記ＣＨＯ細胞の前記培養は、約３６℃～約３８℃の温度におけるものである、［１］～［４］のいずれか一に記載の方法。
［６］前記培地中での前記ＣＨＯ細胞の前記培養は、約３７℃の温度におけるものである、［１］～［５］のいずれか一に記載の方法。
［７］前記栄養補充剤は、ＣＨＯ細胞の前記培地への接種の少なくとも１日後に前記細胞培養物に添加される、［１］～［６］のいずれか一に記載の方法。
［８］前記栄養補充剤は、３つ以上の異なる時点で添加される、［１］～［７］のいずれか一に記載の方法。
［９］前記培地は、ＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）３０２無血清培地；ＣＤ ＤＧ４４培地；ＢＤ Ｓｅｌｅｃｔ（商標）培地；ＳＦＭ４ＣＨＯ培地；及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、［１］～［８］のいずれか一に記載の方法。
［１０］前記ＣＨＯ細胞の前記培養は、０．２５Ｌ～２５，０００Ｌのバイオリアクター内におけるものである、［１］～［９］のいずれか一に記載の方法。
［１１］前記ＣＨＯ細胞の前記培養は、１００Ｌ～２５，０００Ｌのバイオリアクター内におけるものである、［１］～［１０］のいずれか一に記載の方法。
［１２］前記ＣＨＯ細胞の前記培養は、２０００Ｌ～２０，０００Ｌのバイオリアクター内におけるものである、［１］～［１１］のいずれか一に記載の方法。
［１３］前記細胞培養物の温度は、前記接種の約８０時間～約１２０時間後に減少される、［１］～［１２］のいずれか一に記載の方法。
［１４］（ｄ）は、接種の約１０～約１４日後に行われる、［１］～［１３］のいずれか一に記載の方法。
［１５］前記ＨＣＣＦの前記ＴＳＡＣは、約２．２モル／モル～約３．６モル／モルである、［１］～［１４］のいずれか一に記載の方法。
［１６］前記ＨＣＣＦの前記ＴＳＡＣは、約２．２モル／モル～約３．４モル／モルである、［１］～［１５］のいずれか一に記載の方法。
［１７］前記少なくとも１つの追加的な精製ステップは、収集清澄化、濾過、限外濾過、ダイアフィルトレーション、ウイルス不活性化、親和性捕捉及びそれらの組み合わせの少なくとも１つを含む、［１］～［１６］のいずれか一に記載の方法。
［１８］前記少なくとも１つの追加的な精製ステップは、限外濾過及び／又はダイアフィルトレーションを含む、［１］～［１７］のいずれか一に記載の方法。
［１９］前記ＵＦＤＦは、約１４℃～約２６℃の温度で保持される、［１］～［１８］のいずれか一に記載の方法。
［２０］前記ＵＦＤＦは、約１５℃～約２６℃の温度で保持される、［１］～［１９］のいずれか一に記載の方法。
［２１］前記ＵＦＤＦは、約１５℃～約２５℃の温度で保持される、［１］～［２０］のいずれか一に記載の方法。
［２２］前記ＵＦＤＦは、約１９℃～約２５℃の温度で保持される、［１］～［２１］のいずれか一に記載の方法。
［２３］前記ＵＦＤＦは、約１０時間～約５０時間にわたって保持される、［１］～［２２］のいずれか一に記載の方法。
［２４］前記ＵＦＤＦは、約１２時間～約４８時間にわたって保持される、［１］～［２３］のいずれか一に記載の方法。
［２５］前記ＵＦＤＦは、約１４時間～約４２時間にわたって保持される、［１］～［２４］のいずれか一に記載の方法。
［２６］前記ＵＦＤＦは、約１７時間～約３４時間にわたって保持される、［１］～［２５］のいずれか一に記載の方法。
［２７］前記ＵＦＤＦは、約１９時間～約３３時間にわたって保持される、［１］～［２６］のいずれか一に記載の方法。
［２８］前記ＵＦＤＦは、約２５時間～約３８時間にわたって保持される、［１］～［２７］のいずれか一に記載の方法。
［２９］前記ＵＦＤＦは、約２９時間～約３５時間にわたって保持される、［１］～［２８］のいずれか一に記載の方法。
［３０］前記ＵＦＤＦは、約２．０ｇ／Ｌ～約４．３ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する、［１］～［２９］のいずれか一に記載の方法。
［３１］前記ＵＦＤＦは、約２．４ｇ／Ｌ～約３．７ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する、［１］～［３０］のいずれか一に記載の方法。
［３２］前記ＵＦＤＦは、約３．１ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する、［１］～［３１］のいずれか一に記載の方法。
［３３］前記ＵＦＤＦは、約３．０ｇ／Ｌ～約４．５ｇ／Ｌのアルカリホスファターゼ濃度を有する、［１］～［３２］のいずれか一に記載の方法。
［３４］前記ＵＦＤＦは、約３．３ｇ／Ｌ～約４．１ｇ／Ｌのアルカリホスファターゼ濃度を有する、［１］～［３３］のいずれか一に記載の方法。
［３５］前記少なくとも１つのクロマトグラフィーステップは、タンパク質アフィニティークロマトグラフィーである、［１］～［３４］のいずれか一に記載の方法。
［３６］前記少なくとも１つのクロマトグラフィーステップは、プロテインＡクロマトグラフィーである、［１］～［３５］のいずれか一に記載の方法。
［３７］ステップ（ｄ）は、ウイルス不活性化ステップをさらに含む、［１］～［３６］のいずれか一に記載の方法。
［３８］ステップ（ｅ）は、少なくとも１つの追加的なクロマトグラフィー及び／又は精製ステップをさらに含む、［１］～［３７］のいずれか一に記載の方法。
［３９］前記少なくとも１つの追加的なクロマトグラフィーステップは、カラムクロマトグラフィーを含む、［１］～［３８］のいずれか一に記載の方法。
［４０］前記カラムクロマトグラフィーは、疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む、［１］～［３９］のいずれか一に記載の方法。
［４１］前記少なくとも１つの追加的な精製ステップは、追加的なダイアフィルトレーションを含む、［１］～［４０］のいずれか一に記載の方法。
［４２］前記少なくとも１つの追加的なクロマトグラフィー及び／又は精製ステップは、疎水性相互作用クロマトグラフィー及び／又は少なくとも１つの追加的なダイアフィルトレーションステップを含む、［１］～［４１］のいずれか一に記載の方法。
［４３］前記少なくとも１つの追加的なクロマトグラフィー及び／又は精製ステップは、約０．９モル／モル～約３．９モル／モルのＴＳＡＣを有する組換えアルカリホスファターゼを得るために実施される、［１］～［４２］のいずれか一に記載の方法。
［４４］前記少なくとも１つの追加的なクロマトグラフィー及び／又は精製ステップは、約１．１モル／モル～約３．２モル／モルのＴＳＡＣを有する組換えアルカリホスファターゼを得るために実施される、［１］～［４３］のいずれか一に記載の方法。
［４５］前記少なくとも１つの追加的なクロマトグラフィー及び／又は精製ステップは、約１．４モル／モル～約２．６モル／モルのＴＳＡＣを有する組換えアルカリホスファターゼを得るために実施される、［１］～［４４］のいずれか一に記載の方法。
［４６］前記少なくとも１つの追加的なクロマトグラフィー及び／又は精製ステップは、約１．２モル／モル～約３．０モル／モルのＴＳＡＣを有する組換えアルカリホスファターゼを得るために実施される、［１］～［４５］のいずれか一に記載の方法。
［４７］前記組換えアルカリホスファターゼは、Ｗ－ｓＡＬＰ－Ｘ－Ｆｃ－Ｙ－Ｄ ｎ －Ｚ（式中、
Ｗは、不在であるか、又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり；
Ｘは、不在であるか、又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり；
Ｙは、不在であるか、又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり；
Ｚは、不在であるか、又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり；
Ｆｃは、結晶化可能領域断片であり；
Ｄ ｎ は、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸塩又はそれらの組み合わせであり、ここで、ｎ＝１０又は１６であり；及び
ｓＡＬＰは、可溶性アルカリホスファターゼである）
の構造を含む、［１］～［４６］のいずれか一に記載の方法。
［４８］前記組換えアルカリホスファターゼは、アスホターゼアルファ（配列番号１）を含む、［１］～［４７］のいずれか一に記載の方法。
［４９］前記タンパク質アフィニティークロマトグラフィーから得られる前記組換えアルカリホスファターゼは、約２℃～約８℃で貯蔵される、［１］～［４８］のいずれか一に記載の方法。
［５０］接種後、栄養補充剤を（ｂ）の前記細胞培養物に添加することをさらに含む、［１］～［４９］のいずれか一に記載の方法。
［５１］ＵＦＤＦ中の前記組換えアルカリホスファターゼは、前記回収を施されるとき、約２．２モル／モル～約３．６モル／モルの総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）を有する、［１］～［５０］のいずれか一に記載の方法。
［５２］前記ＵＦＤＦ中の前記組換えアルカリホスファターゼは、前記回収を施されるとき、約２．２モル／モル～約３．４モル／モルの総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）を有する、［１］～［５１］のいずれか一に記載の方法。
［５３］組換えアルカリホスファターゼ活性を測定することをさらに含む、［１］～［５２］のいずれか一に記載の方法。
［５４］哺乳動物細胞培養物中に生成される組換えアルカリホスファターゼであって、前記細胞培養物から生成された収集清澄化培養液（ＨＣＣＦ）中の前記組換えアルカリホスファターゼは、常に約１．２モル／モル以上の総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）を有し、前記哺乳動物細胞培養物は、約１００Ｌ～約２５，０００Ｌである、組換えアルカリホスファターゼ。
［５５］組換えアルカリホスファターゼを含む濾過プール（ＵＦＤＦ）であって、約１００Ｌ～約２５，０００Ｌの細胞培養物から生成され、約２．０～約４．３ｇ／Ｌのタンパク質濃度において約１９℃～約２５℃で約１４～約４２時間にわたって保持される、濾過プール（ＵＦＤＦ）。
［５６］［１］～［５３］のいずれか一に記載の方法によって生成される組換えアルカリホスファターゼ。
［５７］［５６］に記載の組換えアルカリホスファターゼ及び少なくとも１つの薬学的に許容できる担体、希釈剤、賦形剤又はそれらの組み合わせを含む医薬製剤。
［５８］対象における無機ピロリン酸塩（ＰＰｉ）の切断を増強するために、［５６］に記載の組換えアルカリホスファターゼを使用する方法。
［５９］アルカリホスファターゼ欠損に関連する病態を患っている対象を治療する方法であって、治療有効量の、［５６］に記載の組換えアルカリホスファターゼを前記対象に投与することを含む方法。
［６０］総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）を、ＴＳＡＣを含有する組換えタンパク質において制御する方法であって、前記組換えタンパク質を哺乳動物細胞培養物中で培養することと、ＵＦＤＦを提供するために少なくとも１つの精製ステップを実施することとを含み、温度、タンパク質濃度及び／又は保持時間は、前記ＵＦＤＦ中で制御される、方法。
［６１］前記組換えタンパク質は、組換え糖タンパク質である、［６０］に記載の方法。［６２］前記組換えタンパク質は、アルカリホスファターゼタンパク質である、［６０］又は［６１］に記載の方法。
［６３］前記組換えタンパク質は、アスホターゼアルファである、［６０］～［６２］のいずれか一に記載の方法。
［６４］前記少なくとも１つの精製ステップは、限外濾過及び／又はダイアフィルトレーションを含む、［６０］～［６３］のいずれか一に記載の方法。
［６５］前記少なくとも１つの精製ステップは、プロテインＡクロマトグラフィーを含む、［６０］～［６４］のいずれか一に記載の方法。
［６６］哺乳動物細胞培養物中のグリコシダーゼ活性を制御する方法であって、組換えタンパク質を哺乳動物細胞培養物中で培養することと、ＵＦＤＦを提供するために少なくとも１つの精製ステップを実施することとを含み、温度、タンパク質濃度及び／又は保持時間は、前記グリコシダーゼ活性を制御するために前記ＵＦＤＦ中で制御される、方法。
［６７］前記組換えタンパク質は、組換え糖タンパク質である、［６６］に記載の方法。［６８］前記組換えタンパク質は、アルカリホスファターゼタンパク質である、［６６］又は［６７］に記載の方法。
［６９］前記組換えタンパク質は、アスホターゼアルファである、［６６］～［６８］のいずれか一に記載の方法。
［７０］前記少なくとも１つの精製ステップは、限外濾過及び／又はダイアフィルトレーションを含む、［６６］～［６９］のいずれか一に記載の方法。
［７１］前記少なくとも１つの精製ステップは、プロテインＡクロマトグラフィーを含む、［６６］～［７０］のいずれか一に記載の方法。
上の本明細書に記述されるすべての刊行物、特許及び特許出願は、あたかもそれぞれの個別の刊行物、特許又は特許出願が、その全体が詳細且つ個別に参照により援用されるように示されるのと同程度に参照により本明細書に援用される。本開示の上記の方法の様々な修正形態及び変更形態、医薬組成物及びキットは、特許請求される本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく当業者に明白になるであろう。本開示は、具体的な実施形態と関連して記載されているが、さらなる修正形態が可能であり、特許請求される本発明がかかる具体的な実施形態に不当に限定されるべきでないことが理解されるであろう。
【手続補正書】
【提出日】2024-03-05
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【外国語明細書】