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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024059743
(43)【公開日】2024-05-01
(54)【発明の名称】相乗的な肝保護組成物
(51)【国際特許分類】
A23L 33/105 20160101AFI20240423BHJP
A61K 9/14 20060101ALI20240423BHJP
A61K 31/047 20060101ALI20240423BHJP
A61K 31/121 20060101ALI20240423BHJP
A61K 36/28 20060101ALI20240423BHJP
A61K 36/9066 20060101ALI20240423BHJP
A61K 47/36 20060101ALI20240423BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20240423BHJP
A61P 39/06 20060101ALI20240423BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240423BHJP
A61P 3/06 20060101ALI20240423BHJP
【ＦＩ】
A23L33/105
A61K9/14
A61K31/047
A61K31/121
A61K36/28
A61K36/9066
A61K47/36
A61P1/16
A61P39/06
A61P43/00 111
A61P43/00 121
A61P3/06
【審査請求】有
【請求項の数】11
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024022830
(22)【出願日】2024-02-19
(62)【分割の表示】P 2021529538の分割
【原出願日】2019-04-18
(31)【優先権主張番号】201841010068
(32)【優先日】2018-04-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】IN
(71)【出願人】
【識別番号】521045302
【氏名又は名称】エフエフエフ バイオワークス エルエルピー
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】ジェイコブ，エー．ティー．
(72)【発明者】
【氏名】バラティ，ジャヤラマン
(72)【発明者】
【氏名】ジェイコブ，トーマス エー
(57)【要約】 （修正有）
【課題】正常な肝機能を保護するのに有効な、植物化学物質とカロチノイドとの新規な組み合わせを有する相乗的肝保護用組成物、およびその製造方法を提供する。
【解決手段】一態様として、クルクミノイドおよびルテインを２：１～６：１の範囲の比率で含む、肝保護用組成物であって、該組成物の粒径は、Ｄ５０－０．３６μｍから５μｍの範囲、およびＤ９０が０．６０μｍから１０μｍの範囲にあり、該肝保護用組成物のクルクミノイドおよびルテインが相乗的活性を示し、クルクミノイドおよびルテインがそれらの精製形態で存在し、クルクミノイドの純度が８０～９５％の範囲であり、ルテインの純度が７０～８５％の範囲である、肝保護用組成物である。
【選択図】なし
【解決手段】一態様として、クルクミノイドおよびルテインを２：１～６：１の範囲の比率で含む、肝保護用組成物であって、該組成物の粒径は、Ｄ５０－０．３６μｍから５μｍの範囲、およびＤ９０が０．６０μｍから１０μｍの範囲にあり、該肝保護用組成物のクルクミノイドおよびルテインが相乗的活性を示し、クルクミノイドおよびルテインがそれらの精製形態で存在し、クルクミノイドの純度が８０～９５％の範囲であり、ルテインの純度が７０～８５％の範囲である、肝保護用組成物である。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
クルクミノイドおよびルテインを２：１～６：１の範囲の比率で含む、肝保護用組成物であって、
前記組成物の粒径は、Ｄ５０－０．３６μｍから５μｍの範囲、およびＤ９０が０．６０μｍから１０μｍの範囲にあり、
前記肝保護用組成物のクルクミノイドおよびルテインが相乗的活性を示す、肝保護用組成物。
前記組成物の粒径は、Ｄ５０－０．３６μｍから５μｍの範囲、およびＤ９０が０．６０μｍから１０μｍの範囲にあり、
前記肝保護用組成物のクルクミノイドおよびルテインが相乗的活性を示す、肝保護用組成物。
【請求項2】
クルクミノイドおよびルテインが４：１～６：１の範囲の比率で存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
クルクミノイドおよびルテインがそれらの精製形態で存在し、クルクミノイドの純度が８０～９５％の範囲であり、ルテインの純度が７０～８５％の範囲である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項4】
前記組成物は、不健康な食事パターン、多量のアルコールの摂取、多量の過酸化多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）含有量を含有する食品の摂取、または特定の薬物の消費などの様々な要因によって引き起こされ得る、肝臓損傷または肝毒性から肝臓を保護するのに有効である、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項5】
前記組成物は、以下に示す保護の少なくとも１つに有効である、請求項４に記載の組成物：
－細胞に引き起こされる酸化ストレス損傷を抑制することによって肝毒性から肝臓を保護する；
－影響を受けた細胞におけるチオバルビツール酸反応種（ＴＢＡＲＳ）マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）の産生を減少させることによる、肝臓過酸化に対する保護；
－影響を受けた細胞における非酵素的抗酸化剤グルタチオンレダクターゼ（ＧＳＨ）およびスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）のレベルを増加させることによって、肝毒性から肝臓を保護する；
－影響を受けた細胞における活性酸素種（ＲＯＳ）生成を防ぐことによって、肝毒性から肝臓を保護する；
－影響を受けた細胞において、核アポトーシス、細胞の核断片化を防ぎ、細胞のミトコンドリア膜の脱分極を防ぐことによって、肝毒性から肝臓を保護する。
－細胞に引き起こされる酸化ストレス損傷を抑制することによって肝毒性から肝臓を保護する；
－影響を受けた細胞におけるチオバルビツール酸反応種（ＴＢＡＲＳ）マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）の産生を減少させることによる、肝臓過酸化に対する保護；
－影響を受けた細胞における非酵素的抗酸化剤グルタチオンレダクターゼ（ＧＳＨ）およびスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）のレベルを増加させることによって、肝毒性から肝臓を保護する；
－影響を受けた細胞における活性酸素種（ＲＯＳ）生成を防ぐことによって、肝毒性から肝臓を保護する；
－影響を受けた細胞において、核アポトーシス、細胞の核断片化を防ぎ、細胞のミトコンドリア膜の脱分極を防ぐことによって、肝毒性から肝臓を保護する。
【請求項6】
前記組成物は、脂質プロファイルを正常化および維持し、健康なコレステロールレベルおよび健康なＬＤＬ／ＨＤＬ比率を維持するのに有効である、請求項１または４に記載の組成物。
【請求項7】
前記組成物は、不健康な食事パターンによって引き起こされ得るアルコール性および非アルコール性脂肪性肝疾患に起因する肝臓の炎症反応の減少に有益である、炎症性サイトカイン（ＴＮＦ－α、ＩＬ－６およびＩＬ－１）レベルの減少、に有効である、請求項４に記載の組成物。
【請求項8】
前記組成物が、サプリメントとして定期的に、または脂肪食品、薬物および／またはアルコールの摂取の前、間、または後に、摂取／服用され得る、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項9】
請求項１～３のいずれか１項に記載のクルクミノイドおよびルテインを含む肝保護用組成物を製造する方法であって、
ａ）クルクミノイドとルテインを所定の比率で混合して乾燥ブレンドを形成する；
ｂ）適切な乳化剤およびマルトデキストリンを前記乾燥ブレンドに添加する；
ｃ）前記乾燥ブレンドに精製水を加えて懸濁液を作る；
ｄ）前記懸濁液を液体コロイドミルに通して均一な懸濁液を形成させる；
ｅ）前記懸濁液をホモジナイザーまたは高せん断粒子湿式ミルに通すなどのさらなる処理にかけて、微粉化エマルジョンを製造する；
ｆ）２５ｒｐｍの速度で８～１２時間、前記微粉化エマルジョンをさらに撹拌して、集団の温度を２５℃～４０℃、好ましくは２５℃～３０℃の温度にする；
ｇ）前記微粉化エマルジョンを濃縮および／または乾燥などのさらなる処理にかけて、肝保護用組成物を得る；ことを含み、
均一な最終生成物を得るために、得られた前記肝保護用組成物は適切な粒子篩にさらに通され、
前記肝保護用組成物は、クルクミノイドおよびルテインを２：１～６：１の範囲の比率で含み、前記組成物の粒径は、Ｄ５０－０．３６μｍから５μｍの範囲、およびＤ９０が０．６０μｍから１０μｍの範囲にある、方法。
ａ）クルクミノイドとルテインを所定の比率で混合して乾燥ブレンドを形成する；
ｂ）適切な乳化剤およびマルトデキストリンを前記乾燥ブレンドに添加する；
ｃ）前記乾燥ブレンドに精製水を加えて懸濁液を作る；
ｄ）前記懸濁液を液体コロイドミルに通して均一な懸濁液を形成させる；
ｅ）前記懸濁液をホモジナイザーまたは高せん断粒子湿式ミルに通すなどのさらなる処理にかけて、微粉化エマルジョンを製造する；
ｆ）２５ｒｐｍの速度で８～１２時間、前記微粉化エマルジョンをさらに撹拌して、集団の温度を２５℃～４０℃、好ましくは２５℃～３０℃の温度にする；
ｇ）前記微粉化エマルジョンを濃縮および／または乾燥などのさらなる処理にかけて、肝保護用組成物を得る；ことを含み、
均一な最終生成物を得るために、得られた前記肝保護用組成物は適切な粒子篩にさらに通され、
前記肝保護用組成物は、クルクミノイドおよびルテインを２：１～６：１の範囲の比率で含み、前記組成物の粒径は、Ｄ５０－０．３６μｍから５μｍの範囲、およびＤ９０が０．６０μｍから１０μｍの範囲にある、方法。
【請求項10】
クルクミノイドが植物Ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａから得られ／抽出され、そして精製され得、ルテインがマリーゴールド植物Ｔａｇｅｔｅｓ ｅｒｅｃｔａまたは任意の他の適切な植物源から得られ／抽出され、そして精製され得る、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記組成物が、様々な食品および飲料製品茶、煎じ薬、フルーツジュース、飲料、ミルクおよびミルク製品、シリアルベースの製品、アルコール飲料および加工食品などにおいて、栄養補助食品、医薬品、食事／栄養補助食品、または治療／健康成分に製剤され、使用される、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は相乗的肝保護組成物に関し、特に、植物化学物質、すなわちクルクミノイドとルテインなどのカロチノイドとの新規な組み合わせを有する相乗的肝保護組成物に関する。相乗的肝保護組成物は健康を促進するのに、より詳細には正常な肝機能を保護するのに有効である。また、そのような組成物を製造する新規な方法、ならびに食品、アルコール飲料を含む飲料におけるその使用、ならびに栄養補給食品、栄養補助食品および医薬品としてのその使用も提供される。
【背景技術】
【0002】
植物化学物質は、食品および医薬に使用される、植物中に存在する生物学的に活性な化合物である。クルクミノイドおよびカロチノイドなどの植物化学物質は、それらの健康増進特性が知られている。
【0003】
ウコン（Ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａ）はよく知られているインドのスパイスであり、根茎のために広範囲に栽培されるショウガ科（Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｃｅａｅ）の一員である。クルクミノイドはウコン根茎中のポリフェノール化合物であり、ウコンの黄色の原因である。ウコンの非常に多様な薬理活性も報告されている。クルクミンはウコンの主要クルクミノイドである。他の２つのクルクミノイドは、デメトキシクルクミンおよびビス－デメトキシクルクミンである。クルクミンは、種々の生物学的作用に関与するウコンの主要成分の１つである。クルクミンの生物学的効果は抗酸化、抗炎症から血管新生の阻害まで及び、特異的な抗腫瘍活性を有することも示されている。クルクミンはカドミウムおよび鉛などの重金属と結合することができ、それによって、これらの重金属の毒性を低下させる。クルクミンのこの特性は、脳に対するその保護作用を説明する。ウコンはシリマリンに類似した肝保護特性を有することがわかっている。ウコンの肝保護作用は、主にその抗酸化特性のほか、炎症性サイトカインの形成を低下させる能力の結果である（１）。
【0004】
ルテインは一般に、その異性体ゼアキサンチン、ならびにβ－カロチンおよびクリプトキサンチンのような微量の他のカロチンと共にカロチノイドと呼ばれる植物色素の大きなクラスに属する。ヒト組織におけるその存在は完全に植物源の摂取によるものであり、動物組織によって合成されるものではない。ルテインは多種多様な果物および野菜中に存在し（２）、トウモロコシなどの、ルテインが見出される植物に黄色を付与する。その濃度は、ホウレンソウ、コラードおよびケールのような葉緑野菜において特に高い（２）。それはまた、動物によって食べられる植物生成物に起因して、卵黄などのいくつかの動物生成物にも存在する（３）。ルテインは、高齢者に最もよくみられる２つの眼疾患、すなわち白内障および黄斑変性の発症リスクを低下させる可能性があることが、様々な研究で示唆されている。強力な光曝露と網膜での酸化的代謝率の高さから、眼では酸化ストレスが高い。ルテインの抗酸化特性は、酸化的損傷がこれらの疾患を促進する程度を減少させ得るか、または酸素が膜に浸透する程度を制限することによって、酸化的ストレスによる損傷を最小限にし得る（４、５）。さらに、血清中または食事中のルテイン濃度が最も高い人と、冠動脈性心疾患（６）または脳卒中（７）の低い割合との間に関連性が認められている。２件の疫学研究では、ルテイン＋ゼアキサンチンの血清中濃度が最も高かった人は、頸動脈内厚さで測定した冠動脈心疾患のリスクが有意に低下していた（８，９）。ルテインおよびゼアキサンチンは、大部分が高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）によって血漿中に輸送される（１０）。
【0005】
肝臓は、種々の内因性および外因性有害物質の代謝および解毒において重要な役割を果たす重要な臓器である。肝疾患の主な要因は、毒性化学物質、アルコールの過剰摂取、感染症および自己免疫疾患である。薬物の構造変化が起こり、生物学的に活性または不活性な代謝産物（これらのいくつかは毒性である）を生じさせるところが肝臓である。したがって、肝臓は、様々な化学物質および薬物による損傷の脆弱な標的である。
【0006】
酸化ストレスは、肝損傷の開始および進行の主要な寄与因子と考えられている。アルコールや薬物などの様々な危険因子が酸化ストレスを誘発し、脂肪性肝疾患などの慢性疾患につながる可能性があることが知られている。脂肪肝にはアルコール性肝疾患（ＡＬＤ）および非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の両方が含まれる。増加する証拠は、ＡＬＤおよびＮＡＦＬＤの進行における活性酸素種（ＲＯＳ）の生成によって引き起こされる酸化ストレスの重要な役割を示唆する。酸化ストレスは、ＲＯＳおよび酸化剤の生成と、抗酸化剤の対抗活動との間の不均衡を指す（１１）。ＲＯＳの過剰生成は細胞機能において悪影響を与え、最終的に脂肪性肝疾患の要因となる。ミトコンドリアでは、ＲＯＳ生成の増加はｍｔＤＮＡ枯渇を引き起こし、生体分子（すなわち、タンパク質、炭水化物および脂質）を攻撃し、ミトコンドリア膜を損傷する可能性がある。ミトコンドリアが、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を含有するリン脂質の十分な濃度を有することは注目に値する。ＰＵＦＡはその化学構造における二重結合のために、より酸化的損傷を受けやすく、これは脂質過酸化をもたらす。ＰＵＦＡ過酸化はＡｐｏＢの小胞体後分泌前タンパク質分解を増強し、それによりＶＬＤＬ分泌を低下させる（１２）；これはさらに肝臓におけるトリグリセリド（ＴＧ）蓄積の一因となる可能性がある。さらに、ＰＵＦＡ過酸化によって形成されるアルデヒドは、これらの分子がヌクレオチドおよびタンパク質合成に影響を及ぼし、肝臓グルタチオン含量を減少させ、炎症性サイトカインＴＮＦ－αの産生を増加させるので、細胞のホメオスタシスを損なう（１３）。これらの影響は、肝細胞の死および壊死、炎症、ならびに肝線維症につながる。
【0007】
肝臓はアルコール代謝の主要部位である。肝障害または肝毒性は、いくつかの相互に関連した経路を介して起こる。エタノール代謝の主要経路はデヒドロゲナーゼ系である。アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）およびアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）のＮＡＤＨ（ＮＡＤの還元型）への還元を引き起こす。ＮＡＤ／ＮＡＤＨの変化した比率は、糖新生および脂肪酸酸化の阻害を介して脂肪肝を促進する（１４）。また、慢性的なアルコール曝露は肝マクロファージを活性化し、それが腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦ－α）を産生する（１５）。ＴＮＦ‐αはミトコンドリアを誘導して活性酸素種（ＲＯＳ）の産生を増加させる。この酸化ストレスは肝細胞壊死およびアポトーシスを促進する。
【0008】
さらに、上記のように、クルクミノイドおよびルテインは抗酸化剤であることが証明されており、酸化ストレスによって引き起こされる疾患を予防するのに有用である。したがって、過酸化ポリ不飽和脂肪酸によって引き起こされる損傷を含む任意の酸化的損傷から肝臓を保護することによる、肝臓の健康に潜在的に有益な作用を有するクルクミノイドおよびルテインを含む組成物を調製することが有益であろう。
【0009】
したがって、本発明の目的は両成分の非常に低い投与量で相乗効果を示し、同時に高いバイオアベイラビリティを有し、それによって肝臓の健康を効果的に促進する、クルクミノイドおよびルテインを含む相乗的肝保護組成物を提供することである。
【発明の概要】
【0010】
本発明は相乗的肝保護組成物に関し、特に、植物化学物質、すなわちクルクミノイドとルテインなどのカロチノイドとの新規な組み合わせを有する相乗的肝保護組成物に関する。相乗的肝保護組成物は健康を促進するのに、より詳細には正常な肝臓の健康を保護するのに有効である。また、このような組成物を製造する新規な方法、ならびに食品、アルコール飲料を含む飲料における使用、ならびに栄養補給食品、栄養補助食品および医薬品としての使用も提供される。
【0011】
本発明の一実施形態によれば、クルクミノイドおよびルテインを含む相乗的肝保護組成物が提供される。
【0012】
本発明の一実施形態によれば、相乗的肝保護組成物はクルクミノイドおよびルテインを含み、クルクミノイドおよびルテインは、２：１：～６：１の範囲の比率で存在する。
【0013】
本発明の別の実施形態によれば、クルクミノイドとルテインとの比率は、相乗的肝保護組成物において４：１～６：１の範囲である。
【0014】
本発明の別の実施形態によれば、相乗的肝保護組成物はＲＯＳの形成を減弱させ、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ比をバランスさせ、炎症経路をダウンレギュレートし、脂肪肝形成を制御することによって、肝障害または肝毒性から肝臓を保護するのに有効である。
【0015】
本発明の別の実施形態によれば、相乗的肝保護組成物は、不健康な食事パターン、多量のアルコールの摂取、多量の過酸化多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）含有量を含有する食品の摂取、または特定の薬物の消費などの様々な要因によって引き起こされ得る肝障害または肝毒性から肝臓を保護するのに有効である。さらに、本発明の肝保護組成物は、不健康な食事パターンによって引き起こされる非アルコール性脂肪性肝疾患に対して肝臓を保護するのにも有効である。
【0016】
本発明の別の実施形態によれば、相乗的肝保護組成物は、細胞における酸化ストレス損傷を抑制することによって、肝毒性から肝臓を保護するのに有効である。
【0017】
本発明の別の実施形態によれば、相乗的肝保護組成物の有効性を研究するために本発明者らによってｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ研究を通して調査されているように、相乗的肝保護組成物は肝臓過酸化から肝臓を保護するのに有効である。
【0018】
本発明のさらに別の実施形態によれば、相乗的肝保護組成物は脂質プロファイルを正常化し、維持するのに有効である。また、コレステロール値を健康に保ち、ＬＤＬ／ＨＤＬ比率を健康に保つ効果がある。
【0019】
本発明のさらに別の実施形態によれば、相乗的肝保護組成物は、おそらく脂質低下および肝保護活性を介して、エタノール誘発性の毒性から肝臓を保護するのに有効である。
【0020】
本発明の別の実施形態によれば、相乗的肝保護組成物はサプリメントとして定期的に、または脂肪食品、薬物、および／またはアルコールの摂取の前、間、または後に、摂取／服用され得る。
【0021】
本発明の別の実施形態によれば、クルクミノイドおよびルテインを含む相乗的肝保護組成物を製造する、以下を含む新規な方法が提供される：
ａ）クルクミノイドとルテインを所定の比率で混合して乾燥ブレンドを形成し；未処理の乾燥ブレンドの粒径は、Ｄ５０－２０μｍ～５０μｍおよびＤ９０－１００μｍ～２００μｍであり得る；
ｂ）適切な乳化剤およびマルトデキストリンを乾燥ブレンドに添加する；
ｃ）乾燥ブレンドに精製水を加えて懸濁液を作る；
ｄ）懸濁液を液体コロイドミルに通して均一な懸濁液を形成させる；
ｅ）懸濁液をホモジナイザーまたは高せん断粒子湿式ミルに通すなどのさらなる処理にかけて、微粉化エマルジョンを製造する；
ｆ）２５ｒｐｍの速度で８～１２時間、微粉化したエマルジョンをさらに撹拌して、集団の温度を２５℃～４０℃、好ましくは２５℃～３０℃の温度にする；
ｇ）微粉化エマルジョンを濃縮および／または乾燥などのさらなる処理にかけて、相乗的肝保護組成物を得る。
ａ）クルクミノイドとルテインを所定の比率で混合して乾燥ブレンドを形成し；未処理の乾燥ブレンドの粒径は、Ｄ５０－２０μｍ～５０μｍおよびＤ９０－１００μｍ～２００μｍであり得る；
ｂ）適切な乳化剤およびマルトデキストリンを乾燥ブレンドに添加する；
ｃ）乾燥ブレンドに精製水を加えて懸濁液を作る；
ｄ）懸濁液を液体コロイドミルに通して均一な懸濁液を形成させる；
ｅ）懸濁液をホモジナイザーまたは高せん断粒子湿式ミルに通すなどのさらなる処理にかけて、微粉化エマルジョンを製造する；
ｆ）２５ｒｐｍの速度で８～１２時間、微粉化したエマルジョンをさらに撹拌して、集団の温度を２５℃～４０℃、好ましくは２５℃～３０℃の温度にする；
ｇ）微粉化エマルジョンを濃縮および／または乾燥などのさらなる処理にかけて、相乗的肝保護組成物を得る。
【0022】
この方法はさらに、乾燥された相乗的肝保護組成物を適切な粒子篩に通して、均一な最終生成物を得ることを含む。このような加工された組成物の粒径はＤ５０－０．３６μｍから５μｍの範囲、およびＤ９０が０．６０μｍから１０μｍの範囲にあり得る。このような粒径の減少は、相乗的肝保護組成物が高いバイオアベイラビリティを有するのを助ける。
【0023】
本発明の一実施形態によれば、クルクミノイドとルテインとの所定の比は、２：１～６：１の範囲であってもよい。
【0024】
本発明の別の実施形態によれば、クルクミノイドとルテインとの所定の比は、４：１～６：１の範囲であってもよい。
【0025】
本発明の別の実施形態によれば、相乗的肝保護組成物は、食品および／または飲料製品に添加されてもよく、または栄養補助食品に製剤されてもよい。
【0026】
本発明の別の実施形態によれば、相乗的肝保護組成物は、食事／栄養補給剤として、または様々な食品および飲料製品における治療／健康成分として使用することができる。相乗的肝保護組成物が健康成分として使用され得る食品および飲料のいくつかの実施例としては茶、煎じ薬、フルーツジュース、飲料、乳および乳製品、シリアルベースの製品、アルコール飲料および加工食品などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0027】
本発明の別の実施形態によれば、相乗的肝保護組成物はまた、粉末、ペースト、錠剤、シロップおよび／またはカプセルなどを含む群から選択される適切な投薬形態に製剤され得る。
【0028】
本発明の別の実施形態によれば、相乗的肝保護組成物中のクルクミノイドおよびルテインは、推奨される１日必要量よりもはるかに少ない量で存在し、相乗的活性を示す。
【0029】
本発明の上記および他の特徴および局面は、完全な明細書においてより明確に記載される。
【0030】
図面の簡単な説明
本発明は、以下の図面によって説明することができる。
本発明は、以下の図面によって説明することができる。
【図面の簡単な説明】
【0031】
【発明を実施するための形態】
【0032】
以下に、本発明のいくつかの代表的な実施形態について説明する。本発明は、その広範な態様において、特定の詳細および代表的な方法に限定されない。例示的な実施例は、提供される実施形態および方法に関連して、このセクションで説明される。その様々な態様による本発明は、本明細書を考慮して読まれる添付の特許請求の範囲において特に指摘され、明確に請求される。
【0033】
なお、本明細書及び添付の特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は文脈上明確に別段の指示がない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「化合物」（a compound）を含有する組成物への言及は、２つ以上の化合物の混合物を含む。また、用語「又は」はその内容が別段の指示を明確にしていない限り、一般に「及び／又は」を含む意味で使用されることに留意すべきである。
【0034】
「％」による種々の量の表現は特に明記しない限り、全溶液または全成分の重量％を意味する。
【0035】
全ての引用された参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いかなる参照の引用も、特許請求される本発明の先行技術としてのその利用可能性に関するいかなる決定について自認するものではない。
【0036】
本明細書で使用される技術用語および科学用語は別段の定義がない限り、本発明が関係する当業者によって一般に理解される意味を有する。本明細書では、当業者に知られている様々な方法論および材料を参照する。
【0037】
当業者に公知の任意の適切な材料および／または方法が、本発明を実施する際に利用され得る。しかしながら、好ましい材料および方法が記載されている。以下の説明および実施例において参照される材料、および試薬などは、特に断らない限り、商業的供給元から入手可能である。
【0038】
本発明は、その製品および処理の態様において、以下に詳細に記載される。
【0039】
本発明は相乗的肝保護組成物に関し、特に、植物化学物質、すなわちクルクミノイドとルテインなどのカロチノイドとの新規な組み合わせを有する相乗的肝保護組成物に関する。相乗的肝保護組成物は健康を促進するのに、より詳細には肝機能を保護するのに有効である。また、そのような組成物を製造する方法、ならびにアルコール飲料および栄養補給食品を含む、食品、飲料における使用、ならびに／または栄養補助食品としての使用も提供される。
【0040】
本発明の一実施形態によれば、クルクミノイドおよびルテインを含む相乗的肝保護組成物が提供される。
【0041】
本発明の一実施形態によれば、相乗的肝保護組成物は、２：１：～６：１の範囲の比率でクルクミノイドおよびルテインを含む。
【0042】
本発明の一実施形態によれば、クルクミノイドとルテインとの比率は、相乗的肝保護組成物において４：１～６：１の範囲である。
【0043】
本発明の一実施形態によれば、クルクミノイドおよびルテインは、相乗的肝保護組成物中にそれらの精製された形態で存在する。クルクミノイドの純度は８０～９５％の範囲であり得、ルテインの純度は７０～８５％の範囲であり得る。
【0044】
本発明の一実施形態によれば、クルクミノイドは植物Ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａから得られ／抽出され、精製されてもよく、ルテインはマリーゴールド植物Ｔａｇｅｔｅｓ ｅｒｅｃｔａまたは任意の他の適切な植物源から得られ／抽出され、精製されてもよい。
【0045】
本発明の別の実施形態によれば、相乗的肝保護組成物は、肝障害または肝毒性から肝臓を保護するのに有効である。肝障害または肝毒性の原因因子のいくつかは、不健康な食事パターン、多量のアルコールの摂取、ある種の薬物の摂取、または食事における多量の過酸化多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を含有する食品の摂取であり得る。さらに、本発明の相乗的肝保護組成物は、不健康な食事パターンによって引き起こされる非アルコール性脂肪性肝疾患から肝臓を保護するのにも有効である。
【0046】
本発明の別の実施形態によれば、相乗的肝保護組成物は、細胞における酸化ストレス損傷に対する抑制作用によって肝毒性から肝臓を保護するのに有効である。
【0047】
本発明の別の実施形態によれば、相乗的肝保護組成物は、アルコール摂取、薬物摂取、または食事中の大量の過酸化ＰＵＦＡの摂取を含む不健康な食事パターンなどの様々な要因によって引き起こされ得る肝細胞における酸化ストレス損傷から肝臓を保護するのに有効である。
【0048】
本発明の別の実施形態によれば、相乗的肝保護組成物は、アルコール摂取、薬物摂取、または食事中の大量の過酸化ＰＵＦＡの摂取を含む不健康な食事パターンなどの因子によって誘発される肝臓過酸化から肝臓を保護するのに有効である。
【0049】
本発明の別の実施形態によれば、インビトロ研究で示されるように、相乗的肝保護組成物は、影響を受けた細胞におけるチオバルビツール酸反応種（ＴＢＡＲＳ）マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）の産生を減少させることによって、肝臓過酸化から肝臓を保護するのに有効である。
【0050】
本発明の別の実施形態によれば、相乗的肝保護組成物は、影響を受けた細胞における非酵素的抗酸化剤グルタチオンレダクターゼ（ＧＳＨ）およびスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）のレベルを増加させることによって、肝毒性から肝臓を保護するのに有効である。非酵素的抗酸化剤の減少は、アルコール摂取、薬物摂取または食事中の大量の過酸化ＰＵＦＡの摂取を含む不健康な食事パターンなどの様々な因子によって引き起こされる可能性がある。
【0051】
本発明の別の実施形態によれば、相乗的肝保護組成物はＲＯＳの形成を減弱させ、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ比をバランスさせ、炎症経路をダウンレギュレートし、脂肪肝形成を制御することによって、肝障害または肝毒性から肝臓を保護するのに有効である。
【0052】
本発明のさらに別の実施形態によれば、本発明の相乗的肝保護組成物は影響を受けた細胞における活性酸素種（ＲＯＳ）生成を防ぐことによって肝臓を肝毒性から保護し、それによって、引き続いて、影響を受けた細胞における炎症のさらなる変性経路を弱めるのに有効である。ＲＯＳ生成の増加は、アルコール摂取、薬物摂取または食事中の大量の過酸化ＰＵＦＡの摂取を含む不健康な食事パターンなどの様々な因子によって引き起こされる可能性がある。相乗的肝保護組成物はまた、影響を受けた細胞のミトコンドリア膜の脱分極を防ぐことによって、アルコール、薬物および不健康な食事パターンのような因子によって誘発される肝毒性に対して肝臓を効果的に保護する。
【0053】
本発明の一実施形態では、インビトロ研究によって確立されているように、本発明の相乗的肝保護組成物は、影響を受けた細胞における細胞の核アポトーシスおよび核断片化を防ぐことによって、アルコール、薬物、および不健康な食事パターンなどの因子によって誘発される肝毒性から肝臓を効果的に保護する。
【0054】
本発明のさらに別の実施形態では、前臨床研究によって確立されているように、本発明の相乗的肝保護組成物は、血清酵素、すなわちアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）およびガンマグルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）の増加したレベルを抑制するのに有効である。
【0055】
本発明の別の実施形態によれば、相乗的肝保護組成物の有効性を研究するために本発明者らによってｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ研究を通して調査されているように、相乗的肝保護組成物は肝臓過酸化から肝臓を保護するのに有効である。
【0056】
本発明のさらに別の実施形態によれば、相乗的肝保護組成物は脂質プロファイルを正常化し、維持するのに有効である。また、コレステロール値を健康に保ち、ＬＤＬ／ＨＤＬ比率を健康に保つのに有効である。
【0057】
本発明のさらに別の実施形態によれば、相乗的肝保護組成物は、おそらく脂質低下および肝保護活性を介して、アルコール、薬物、および不健康な食事パターンなどの因子によって誘発される肝毒性から肝臓を保護するのに有効である。
【0058】
本発明の別の実施形態によれば、クルクミノイドおよびルテインは、副作用がないことが知られている天然源から得られる。
【0059】
本発明の別の実施形態によれば、相乗的肝保護組成物はサプリメントとして定期的に、または脂肪食品、薬物および／またはアルコールの摂取の前、間、または後に、摂取／服用され得る。
【0060】
本発明はまた、ルテインおよびクルクミノイドを含む相乗的肝保護組成物を製造する、以下のステップを含む方法を提供する：
ａ）クルクミノイドおよびルテインを所定の比率で混合して乾燥ブレンドを形成し；未処理の乾燥ブレンドの粒径は、Ｄ５０－２０μｍ～５０μｍおよびＤ９０－１００μｍ～２００μｍとすることができる；
ｂ）適切な乳化剤およびマルトデキストリンを乾燥ブレンドに添加する；
ｃ）乾燥ブレンドに精製水を加えて懸濁液を作る；
ｄ）懸濁液を液体コロイドミルに通して均一な懸濁液を形成させる；
ｅ）懸濁液をホモジナイザーまたは高せん断粒子湿式ミルに通すなどのさらなる処理にかけて、微粉化エマルジョンを製造する；
ｆ）２５ｒｐｍの速度で８～１２時間、微粉化エマルジョンをさらに撹拌して、集団の温度を２５℃～４０℃、好ましくは２５℃～３０℃の温度にする；
ｇ）微粉化エマルジョンを濃縮および／または乾燥などのさらなる処理にかけて、相乗的肝保護組成物を得る。
ａ）クルクミノイドおよびルテインを所定の比率で混合して乾燥ブレンドを形成し；未処理の乾燥ブレンドの粒径は、Ｄ５０－２０μｍ～５０μｍおよびＤ９０－１００μｍ～２００μｍとすることができる；
ｂ）適切な乳化剤およびマルトデキストリンを乾燥ブレンドに添加する；
ｃ）乾燥ブレンドに精製水を加えて懸濁液を作る；
ｄ）懸濁液を液体コロイドミルに通して均一な懸濁液を形成させる；
ｅ）懸濁液をホモジナイザーまたは高せん断粒子湿式ミルに通すなどのさらなる処理にかけて、微粉化エマルジョンを製造する；
ｆ）２５ｒｐｍの速度で８～１２時間、微粉化エマルジョンをさらに撹拌して、集団の温度を２５℃～４０℃、好ましくは２５℃～３０℃の温度にする；
ｇ）微粉化エマルジョンを濃縮および／または乾燥などのさらなる処理にかけて、相乗的肝保護組成物を得る。
【0061】
上記の方法において、相乗的肝保護組成物の調製のために取り込まれるクルクミノイドは８０～９５％の純度であり得、ルテインの純度は７０～８５％の範囲であり得る。さらに、使用され得る乳化剤のいくつかの例としては修飾デンプン、ガムガッチ、アラビアゴム、ガムアカシア、メチルセルロースおよびスクロース脂肪酸エステルなどであるが、これらに限定されない。
【0062】
この方法はさらに、乾燥した肝保護組成物を適切な粒子篩に通して、均一な最終生成物を得ることを含む。処理された組成物の粒径はＤ５０－０．３６μｍから５μｍの範囲にあり、Ｄ９０は０．６０μｍから１０μｍの範囲にあり得る。このような粒径の減少は、相乗的肝保護組成物が高いバイオアベイラビリティを有するのを助ける。
【0063】
本発明の一実施形態によれば、クルクミノイドとルテインとの所定の比は、２：１～６：１の範囲であってもよい。
【0064】
本発明の別の実施形態によれば、クルクミノイドとルテインとの所定の比は、４：１～６：１の範囲であってもよい。
【0065】
本発明の別の実施形態によれば、相乗的肝保護組成物は、食品および／または飲料製品に添加され、栄養補助食品、栄養補助食品および／または医薬品に処方されてもよい。
【0066】
本発明の別の実施形態によれば、相乗的肝保護組成物は、栄養補助食品、医薬品、食事／栄養補助食品として、または様々な食品および飲料製品における治療／健康成分として使用することができる。相乗的肝保護組成物が健康成分として使用され得る食品および飲料のいくつかの実施例としては茶、輸液、フルーツジュース、飲料、乳および乳製品、シリアルベースの製品、アルコール飲料および加工食品などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0067】
本発明の別の実施形態によれば、相乗的肝保護組成物はまた、粉末、ペースト、錠剤、シロップ、点滴および／またはカプセルなどを含む群から選択される適切な投薬形態に処方され得る。
【0068】
本発明の別の実施形態によれば、相乗的肝保護組成物のクルクミノイドおよびルテインは推奨される１日必要量よりもはるかに少ない量で存在し、相乗活性を示す。
【0069】
本発明の一実施形態では、相乗的肝保護組成物はまた、人によって消費されている間のアルコールの悪影響に対抗するために、任意のアルコール飲料に添加されてもよい。
【0070】
以下の実施例は本発明の特定の好ましい実施形態をさらに説明することを意図しており、本質的に限定するものではない。当業者は、日常的な実験のみを用いて、本明細書中に記載される特定の物質および手順に対する多数の等価物を認識するか、または確認することができる。
【実施例0071】
〔実施例１〕
この実施例では、異なる重量比でクルクミノイドおよびルテインを含む本発明の代表的な相乗的肝保護組成物を記載する。表１は、異なる比率のクルクミノイドおよびルテインを有する相乗的肝保護組成物において使用される構成要素およびそれらの量を示す。
この実施例では、異なる重量比でクルクミノイドおよびルテインを含む本発明の代表的な相乗的肝保護組成物を記載する。表１は、異なる比率のクルクミノイドおよびルテインを有する相乗的肝保護組成物において使用される構成要素およびそれらの量を示す。
【0072】
【表1】
【0073】
〔実施例２〕
実施例１で詳述したような相乗的肝保護組成物を、以下に記載する方法によって製造した：
クルクミノイド（純度９５％）およびルテイン（純度８０％）を、修飾デンプン乳化剤およびマルトデキストリンと所定量混合して、乾燥ブレンド（１００ｇ）を調製した。乾燥ブレンドの粒度はＤ５０‐２０μｍ、Ｄ９０‐１００μｍであった。次いで、この乾燥ブレンドをＲＯ精製水３３３．４ｍＬで戻して懸濁液を作製し、懸濁液中に塊が存在しなくなるまでさらに撹拌した。次いで、懸濁液を、液体コロイドミルまたは液体湿式ミル中で予備乳化して、均一なエマルジョンを形成した。このようにして得られたプレエマルジョンを、高圧ホモジナイザー／高せん断粒子湿式ミルに通して、サブミクロンサイズのエマルジョン液滴を生成した。微粉化したエマルジョンを、２５ｒｐｍまでの速度で８～１２時間さらに撹拌して、質量温度を２５℃～４０℃、好ましくは２５℃～３０℃にした。この微粉化されたエマルジョンを、１１０℃以下のチャンバー温度でさらに噴霧乾燥した。次に、噴霧乾燥した粗い粉末を収集し、マイクロパルバライザーまたは空気支援高せん断乾燥粉砕のいずれかを使用して乾燥粉砕に供した。粉砕した粒子を集め、適当な粒子篩に通し、混合して最終生成物を得た。最終的な粉末の粒度はＤ５０‐０．３６０μｍ、Ｄ９０‐０．６０μｍであった。
実施例１で詳述したような相乗的肝保護組成物を、以下に記載する方法によって製造した：
クルクミノイド（純度９５％）およびルテイン（純度８０％）を、修飾デンプン乳化剤およびマルトデキストリンと所定量混合して、乾燥ブレンド（１００ｇ）を調製した。乾燥ブレンドの粒度はＤ５０‐２０μｍ、Ｄ９０‐１００μｍであった。次いで、この乾燥ブレンドをＲＯ精製水３３３．４ｍＬで戻して懸濁液を作製し、懸濁液中に塊が存在しなくなるまでさらに撹拌した。次いで、懸濁液を、液体コロイドミルまたは液体湿式ミル中で予備乳化して、均一なエマルジョンを形成した。このようにして得られたプレエマルジョンを、高圧ホモジナイザー／高せん断粒子湿式ミルに通して、サブミクロンサイズのエマルジョン液滴を生成した。微粉化したエマルジョンを、２５ｒｐｍまでの速度で８～１２時間さらに撹拌して、質量温度を２５℃～４０℃、好ましくは２５℃～３０℃にした。この微粉化されたエマルジョンを、１１０℃以下のチャンバー温度でさらに噴霧乾燥した。次に、噴霧乾燥した粗い粉末を収集し、マイクロパルバライザーまたは空気支援高せん断乾燥粉砕のいずれかを使用して乾燥粉砕に供した。粉砕した粒子を集め、適当な粒子篩に通し、混合して最終生成物を得た。最終的な粉末の粒度はＤ５０‐０．３６０μｍ、Ｄ９０‐０．６０μｍであった。
【0074】
〔実施例３〕
実施例１で詳述したような相乗的肝保護組成物を、以下に記載する方法によって製造した：
クルクミノイド（純度９０％）およびルテイン（純度７５％）を、修飾デンプン乳化剤およびマルトデキストリンと所定量混合して、乾燥ブレンド（１００ｇ）を調製した。乾燥ブレンドの粒度はＤ５０‐４０μｍ、Ｄ９０‐１５５μｍであった。次いで、この乾燥ブレンドをＲＯ精製水３３３．４ｍＬで戻して懸濁液を作製し、懸濁液中に塊が存在しなくなるまでさらに撹拌した。次いで、懸濁液を、液体コロイドミルまたは液体湿式ミル中で予備乳化して、均一なエマルジョンを形成した。このようにして得られたプレエマルジョンを、高圧ホモジナイザー／高せん断粒子湿式ミルに通して、サブミクロンサイズのエマルジョン液滴を生成した。微粉化したエマルジョンを、２５ｒｐｍまでの速度で８～１２時間さらに撹拌して、質量温度を２５℃～４０℃、好ましくは２５℃～３０℃にした。この微粉化されたエマルジョンを、１１０℃以下のチャンバー温度でさらに噴霧乾燥した。次に、噴霧乾燥した粗い粉末を収集し、マイクロパルバライザーまたは空気支援高せん断乾燥粉砕のいずれかを使用して乾燥粉砕に供した。粉砕した粒子を集め、適当な粒子篩に通し、混合して最終生成物を得た。最終的な粉末の粒度はＤ５０‐２．７６μｍ、Ｄ９０‐５．４４μｍであった。
実施例１で詳述したような相乗的肝保護組成物を、以下に記載する方法によって製造した：
クルクミノイド（純度９０％）およびルテイン（純度７５％）を、修飾デンプン乳化剤およびマルトデキストリンと所定量混合して、乾燥ブレンド（１００ｇ）を調製した。乾燥ブレンドの粒度はＤ５０‐４０μｍ、Ｄ９０‐１５５μｍであった。次いで、この乾燥ブレンドをＲＯ精製水３３３．４ｍＬで戻して懸濁液を作製し、懸濁液中に塊が存在しなくなるまでさらに撹拌した。次いで、懸濁液を、液体コロイドミルまたは液体湿式ミル中で予備乳化して、均一なエマルジョンを形成した。このようにして得られたプレエマルジョンを、高圧ホモジナイザー／高せん断粒子湿式ミルに通して、サブミクロンサイズのエマルジョン液滴を生成した。微粉化したエマルジョンを、２５ｒｐｍまでの速度で８～１２時間さらに撹拌して、質量温度を２５℃～４０℃、好ましくは２５℃～３０℃にした。この微粉化されたエマルジョンを、１１０℃以下のチャンバー温度でさらに噴霧乾燥した。次に、噴霧乾燥した粗い粉末を収集し、マイクロパルバライザーまたは空気支援高せん断乾燥粉砕のいずれかを使用して乾燥粉砕に供した。粉砕した粒子を集め、適当な粒子篩に通し、混合して最終生成物を得た。最終的な粉末の粒度はＤ５０‐２．７６μｍ、Ｄ９０‐５．４４μｍであった。
【0075】
〔実施例４〕
実施例１で詳述したような相乗的肝保護組成物を、以下に記載する方法によって製造した：
クルクミノイド（純度８５％）およびルテイン（純度７０％）を、修飾デンプン乳化剤およびマルトデキストリンと所定量混合して、乾燥ブレンド（１００ｇ）を調製した。乾燥ブレンドの粒度はＤ５０‐５０μｍ，Ｄ９０‐２００μｍであった。次いで、この乾燥ブレンドをＲＯ精製水３３３．４ｍＬで戻して懸濁液を作製し、懸濁液中に塊が存在しなくなるまでさらに撹拌した。次いで、懸濁液を、液体コロイドミルまたは液体湿式ミル中で予備乳化して、均一なエマルジョンを形成した。このようにして得られたプレエマルジョンを、高圧ホモジナイザー／高せん断粒子湿式ミルに通して、サブミクロンサイズのエマルジョン液滴を生成した。微粉化したエマルジョンを、２５ｒｐｍまでの速度で８～１２時間さらに撹拌して、質量温度を２５℃～４０℃、好ましくは２５℃～３０℃にした。この微粉化されたエマルジョンを、１１０℃以下のチャンバー温度でさらに噴霧乾燥した。次に、噴霧乾燥した粗い粉末を収集し、マイクロパルバライザーまたは空気支援高せん断乾燥粉砕のいずれかを使用して乾燥粉砕に供した。粉砕した粒子を集め、適当な粒子篩に通し、混合して最終生成物を得た。最終的な粉末の粒度は、Ｄ５０‐５μｍ、Ｄ９０‐１０μｍであった。
実施例１で詳述したような相乗的肝保護組成物を、以下に記載する方法によって製造した：
クルクミノイド（純度８５％）およびルテイン（純度７０％）を、修飾デンプン乳化剤およびマルトデキストリンと所定量混合して、乾燥ブレンド（１００ｇ）を調製した。乾燥ブレンドの粒度はＤ５０‐５０μｍ，Ｄ９０‐２００μｍであった。次いで、この乾燥ブレンドをＲＯ精製水３３３．４ｍＬで戻して懸濁液を作製し、懸濁液中に塊が存在しなくなるまでさらに撹拌した。次いで、懸濁液を、液体コロイドミルまたは液体湿式ミル中で予備乳化して、均一なエマルジョンを形成した。このようにして得られたプレエマルジョンを、高圧ホモジナイザー／高せん断粒子湿式ミルに通して、サブミクロンサイズのエマルジョン液滴を生成した。微粉化したエマルジョンを、２５ｒｐｍまでの速度で８～１２時間さらに撹拌して、質量温度を２５℃～４０℃、好ましくは２５℃～３０℃にした。この微粉化されたエマルジョンを、１１０℃以下のチャンバー温度でさらに噴霧乾燥した。次に、噴霧乾燥した粗い粉末を収集し、マイクロパルバライザーまたは空気支援高せん断乾燥粉砕のいずれかを使用して乾燥粉砕に供した。粉砕した粒子を集め、適当な粒子篩に通し、混合して最終生成物を得た。最終的な粉末の粒度は、Ｄ５０‐５μｍ、Ｄ９０‐１０μｍであった。
【0076】
〔実施例５〕
エタノール誘発性の肝毒性および薬物誘発性の肝毒性に対する、相乗的肝保護組成物の肝保護効果を評価するためのＩｎ ｖｉｔｒｏ試験
目的：
本研究の主な目的は、ＨｅｐＧ２細胞株における酸化ストレス損傷を抑制することによるエタノールおよびアセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）誘発性の肝毒性に対する、本発明の相乗的肝保護組成物の効果と、シリマリンの効果とについて調査することであった。シリマリンは広く使用されている肝保護剤であるので、本発明の新規な相乗的肝保護組成物の効果を比較するために用いた。
エタノール誘発性の肝毒性および薬物誘発性の肝毒性に対する、相乗的肝保護組成物の肝保護効果を評価するためのＩｎ ｖｉｔｒｏ試験
目的：
本研究の主な目的は、ＨｅｐＧ２細胞株における酸化ストレス損傷を抑制することによるエタノールおよびアセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）誘発性の肝毒性に対する、本発明の相乗的肝保護組成物の効果と、シリマリンの効果とについて調査することであった。シリマリンは広く使用されている肝保護剤であるので、本発明の新規な相乗的肝保護組成物の効果を比較するために用いた。
【0077】
細胞株および培地：
本実験はヒト肝臓癌（ＨｅｐＧ２）細胞において行われた。ＨｅｐＧ２細胞は、インド共和国プーナのNational Centre for Cell Scienceから入手した。細胞は、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下において、１０％ＦＢＳ、１％グルタミンおよび１００Ｕペニシリン－ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地中で管理した。ストックをＴ－７５ｃｍ２組織培養フラスコ中で管理した。
本実験はヒト肝臓癌（ＨｅｐＧ２）細胞において行われた。ＨｅｐＧ２細胞は、インド共和国プーナのNational Centre for Cell Scienceから入手した。細胞は、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下において、１０％ＦＢＳ、１％グルタミンおよび１００Ｕペニシリン－ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地中で管理した。ストックをＴ－７５ｃｍ２組織培養フラスコ中で管理した。
【0078】
実験
細胞毒性試験
未処理クルクミノイド（Ｕ１）、未処理ルテイン（Ｕ２）、未処理相乗的肝保護組成物（Ｕ３）、および処理クルクミノイド（Ｐ１）、処理ルテイン（Ｐ２）および処理相乗的肝保護組成物（Ｐ３）、シリマリンの非毒性濃度、ならびにエタノールおよびアセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）誘発性の細胞毒性に対するその予防効果を、ＭＴＴアッセイによって評価した。
細胞毒性試験
未処理クルクミノイド（Ｕ１）、未処理ルテイン（Ｕ２）、未処理相乗的肝保護組成物（Ｕ３）、および処理クルクミノイド（Ｐ１）、処理ルテイン（Ｐ２）および処理相乗的肝保護組成物（Ｐ３）、シリマリンの非毒性濃度、ならびにエタノールおよびアセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）誘発性の細胞毒性に対するその予防効果を、ＭＴＴアッセイによって評価した。
【0079】
試料の調製：
１．未処理クルクミノイド（Ｕ１）試料は、精製クルクミノイドを取り、それを乾燥含有物、すなわち乳化剤およびマルトデキストリンと所定量で混合することによって調製した
２．未処理ルテイン（Ｕ２）試料は、精製ルテインを取り、それを乾燥含有物、すなわち乳化剤およびマルトデキストリンと所定量で混合することによって調製した
３．未処理の相乗的肝保護組成物（Ｕ３）試料は、クルクミノイドおよびルテインを所定の比率で混合し、さらに乳化剤およびマルトデキストリンと所定量で乾式混合することによって調製した
３．加工クルクミノイド（Ｐ１）試料は、精製クルクミノイドを取り、それを乾燥含有物、すなわち乳化剤およびマルトデキストリンと混合することによって調製した。次いで、この乾燥ブレンドを、前述の実施例２～４のいずれかにおける相乗的肝保護組成物について記載した処理と同様の処理に供した
４．処理ルテイン（Ｐ２）試料は、精製ルテインを取り、それを乾燥含有物、すなわち乳化剤およびマルトデキストリンと混合することによって調製した。次いで、この乾燥ブレンドを、前述の実施例２～４のいずれかにおける相乗的肝保護組成物について記載した処理と同様の処理に供した
５．処理相乗的組成物試料（Ｐ３）は、前述の実施例２～４のいずれかの記載と同様に調製した。
１．未処理クルクミノイド（Ｕ１）試料は、精製クルクミノイドを取り、それを乾燥含有物、すなわち乳化剤およびマルトデキストリンと所定量で混合することによって調製した
２．未処理ルテイン（Ｕ２）試料は、精製ルテインを取り、それを乾燥含有物、すなわち乳化剤およびマルトデキストリンと所定量で混合することによって調製した
３．未処理の相乗的肝保護組成物（Ｕ３）試料は、クルクミノイドおよびルテインを所定の比率で混合し、さらに乳化剤およびマルトデキストリンと所定量で乾式混合することによって調製した
３．加工クルクミノイド（Ｐ１）試料は、精製クルクミノイドを取り、それを乾燥含有物、すなわち乳化剤およびマルトデキストリンと混合することによって調製した。次いで、この乾燥ブレンドを、前述の実施例２～４のいずれかにおける相乗的肝保護組成物について記載した処理と同様の処理に供した
４．処理ルテイン（Ｐ２）試料は、精製ルテインを取り、それを乾燥含有物、すなわち乳化剤およびマルトデキストリンと混合することによって調製した。次いで、この乾燥ブレンドを、前述の実施例２～４のいずれかにおける相乗的肝保護組成物について記載した処理と同様の処理に供した
５．処理相乗的組成物試料（Ｐ３）は、前述の実施例２～４のいずれかの記載と同様に調製した。
【0080】
ＨｅｐＧ２細胞を収集し、９６ウェルプレートに、濃度（１×１０５細胞／ウェル）で播種した。Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３（１．９５、３．９０、７．８１、１５．６２、３１．２５、６２．５０、１２５、２５０、５００および１０００μｇ／ｍＬ）の毒性を２４時間測定するために、ＭＴＴアッセイを実施した。エタノールおよびＡＰＡＰに対するＵ１、Ｕ２、Ｕ３、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３の治療効果を評価するために、エタノール（１００ｍＭ）およびアセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）（２０ｍＭ）に曝露する１時間前に、異なる濃度のＵ１、Ｕ２、Ｕ３、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３（３．９０、７．８１、１５．６２、３１．２５、６２．５０および１２５μｇ／ｍＬ）およびシリマリン（３．１２～２００μｇ）で細胞を前処理した。次いで、ＭＴＴ溶液（ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍＬ）１００μＬを添加し、インキュベーションをさらに４時間延長した。次いで、ＤＭＳＯ１００μＬを添加し、５７０ｎｍでマルチモードプレートリーダーを使用して吸光度を測定した。
【0081】
脂質過酸化および抗酸化酵素活性アッセイ
キット法（ＨｉｍｅｄｉａおよびＳｉｇｍａ）に従って測定したチオバルビツール酸反応種（ＴＢＡＲＳ）産生、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）活性およびグルタチオンレダクターゼ（ＧＳＨ）に基づいて、脂質過酸化の指標であるマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）の濃度を決定した。試料は、標準的な分光光度法によって測定した。
キット法（ＨｉｍｅｄｉａおよびＳｉｇｍａ）に従って測定したチオバルビツール酸反応種（ＴＢＡＲＳ）産生、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）活性およびグルタチオンレダクターゼ（ＧＳＨ）に基づいて、脂質過酸化の指標であるマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）の濃度を決定した。試料は、標準的な分光光度法によって測定した。
【0082】
細胞を、エタノール（１００ｍＭ）Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３、Ｐ１、Ｐ２およびＰ３ならびにシリマリンと共に２４時間インキュベートした。肝保護組成物中の総ＧＳＨ含量、ＳＯＤ活性および脂質過酸化を測定した。
【0083】
細胞をＡＰＡＰ（２０ｍＭ）およびＰ３、シリマリンと共に２４時間インキュベートした。肝保護組成物中の総ＧＳＨ含量、ＳＯＤ活性および脂質過酸化を測定した。
【0084】
細胞内ＲＯＳの測定
ＲＯＳは、細胞の細胞内マトリックスに浸透することができる非蛍光プローブ、２，７－ジアセチルジクロロフルオレセイン（ＤＣＦＨ－ＤＨ）を使用して測定され、そこでＲＯＳによって蛍光ジクロロフルオレセイン（ＤＣＦ）に酸化された。簡単に述べると、単離細胞のアリコート（８×１０６細胞／ｍＬ）を、通常のリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中で最終容量２ｍＬまで作製し、細胞アリコート１ｍＬを採取し、そこにＤＣＦＨ－ＤＡ（１ｍｇ／ｍＬ）１μＬを加え、暗条件下で３７℃で３０分間インキュベートした。画像は、デジタルカメラ（ニコン（日本）のクールピクス４５００）を備えたエピ蛍光顕微鏡（ニコン（日本）のエクリプスＴＳ１００）で撮影した。
ＲＯＳは、細胞の細胞内マトリックスに浸透することができる非蛍光プローブ、２，７－ジアセチルジクロロフルオレセイン（ＤＣＦＨ－ＤＨ）を使用して測定され、そこでＲＯＳによって蛍光ジクロロフルオレセイン（ＤＣＦ）に酸化された。簡単に述べると、単離細胞のアリコート（８×１０６細胞／ｍＬ）を、通常のリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中で最終容量２ｍＬまで作製し、細胞アリコート１ｍＬを採取し、そこにＤＣＦＨ－ＤＡ（１ｍｇ／ｍＬ）１μＬを加え、暗条件下で３７℃で３０分間インキュベートした。画像は、デジタルカメラ（ニコン（日本）のクールピクス４５００）を備えたエピ蛍光顕微鏡（ニコン（日本）のエクリプスＴＳ１００）で撮影した。
【0085】
ＨｅｐＧ２細胞を、６２．５０μｇのＵ１、Ｕ２、Ｕ３、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３および５０μｇのシリマリンで１時間処理し、次いで１００ｍＭエタノールで２４時間処理した。細胞内ＲＯＳ蓄積を、蛍光プローブＤＣＦ－ＤＡを用いて測定した。
【0086】
ミトコンドリア膜電位の測定
ＭＭＰの低下は初期アポトーシスの徴候である。本研究では、蛍光色素ローダミン１２３（Ｒｈ１２３）によってＭＭＰの差が検出された。ＨｅｐＧ２細胞を６ウェルプレート（１×１０６）中で培養し、上述の治療の後に収集した。試験化合物およびエタノールまたはＡＰＡＰと共に２４時間インキュベートした後、細胞をＲｈ１２３（５ｍｍｏｌ／ｍＬ）と共に１５分間インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳでリンスし、蛍光を、青色フィルター（４５０～４９０ｎｍ）を使用した蛍光顕微鏡下で観察した。
ＭＭＰの低下は初期アポトーシスの徴候である。本研究では、蛍光色素ローダミン１２３（Ｒｈ１２３）によってＭＭＰの差が検出された。ＨｅｐＧ２細胞を６ウェルプレート（１×１０６）中で培養し、上述の治療の後に収集した。試験化合物およびエタノールまたはＡＰＡＰと共に２４時間インキュベートした後、細胞をＲｈ１２３（５ｍｍｏｌ／ｍＬ）と共に１５分間インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳでリンスし、蛍光を、青色フィルター（４５０～４９０ｎｍ）を使用した蛍光顕微鏡下で観察した。
【0087】
ＨｅｐＧ２細胞の二重蛍光およびＤＡＰＩ染色
ＨｅｐＧ２細胞を３５ｍｍ細胞培養プレート中で増殖させ、各候補化合物Ｐ３（６２．５０μｇ）、シリマリン（５０μｇ）および１００ｍＭエタノールまたはＡＰＡＰ（２０ｍＭ）で２４時間処理し、ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）で洗浄した。アクリジンオレンジ／臭化エチジウム（ＡＯ／ＥＢ）蛍光染色を用いて、エタノールまたはＡＰＡＰ誘発性の肝毒性に関連する形態学的変化を検出した。臭化エチジウム（１００ｍｇ／ｍＬ）およびアクリジンオレンジ（１００ｍｇ／ｍＬ）を１：１で混合し、ＤＡＰＩ １００ｍｇ ｍＬを細胞に添加し、続いて蛍光顕微鏡法により形態学的特徴を評価した。
ＨｅｐＧ２細胞を３５ｍｍ細胞培養プレート中で増殖させ、各候補化合物Ｐ３（６２．５０μｇ）、シリマリン（５０μｇ）および１００ｍＭエタノールまたはＡＰＡＰ（２０ｍＭ）で２４時間処理し、ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）で洗浄した。アクリジンオレンジ／臭化エチジウム（ＡＯ／ＥＢ）蛍光染色を用いて、エタノールまたはＡＰＡＰ誘発性の肝毒性に関連する形態学的変化を検出した。臭化エチジウム（１００ｍｇ／ｍＬ）およびアクリジンオレンジ（１００ｍｇ／ｍＬ）を１：１で混合し、ＤＡＰＩ １００ｍｇ ｍＬを細胞に添加し、続いて蛍光顕微鏡法により形態学的特徴を評価した。
【0088】
結果：
Ａ． 未処理、および処理された、成分および相乗的肝保護組成物の、ＨｅｐＧ２細胞における効果
図１（ａ、ｂ、ｃ）は、ＨｅｐＧ２細胞における異なる濃度の未処理成分および相乗的肝保護組成物の細胞毒性効果を示す。図１（ｄ、ｅおよびｆ）は、ＨｅｐＧ２細胞における異なる濃度の処理された成分および相乗的肝保護組成物の細胞毒性効果を示す。
Ａ． 未処理、および処理された、成分および相乗的肝保護組成物の、ＨｅｐＧ２細胞における効果
図１（ａ、ｂ、ｃ）は、ＨｅｐＧ２細胞における異なる濃度の未処理成分および相乗的肝保護組成物の細胞毒性効果を示す。図１（ｄ、ｅおよびｆ）は、ＨｅｐＧ２細胞における異なる濃度の処理された成分および相乗的肝保護組成物の細胞毒性効果を示す。
【0089】
図２（ａ、ｂ、ｃ）は、エタノール誘導ＨｅｐＧ２細胞における異なる濃度の加工成分および相乗的肝保護組成物の細胞毒性効果を示す。一方、図２（ｄ、ｅ、ｆ）は、エタノール誘導ＨｅｐＧ２細胞における異なる濃度の処理された成分および相乗的肝保護組成物の細胞毒性効果を示す。
【0090】
ＭＴＴアッセイは、細胞生存率がＨｅｐＧ２細胞において低濃度１．９５～６２．５０μｇ／ｍＬで変化しないことを示した。さらに、３．９～６２．５０μｇ／ｍＬのＵ１、Ｕ２、Ｕ３、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３の他に、エタノールと比較して細胞生存率の大きな増加をもたらした。細胞の最大生存率は、６２．５０μｇ／ｍＬに暴露したときに観察された（図２（ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆ））。
【0091】
従って、６２．５０μｇ／ｍＬ濃度のＵ１、Ｕ２、Ｕ３、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３を、全てのさらなる研究のための最適な保護濃度として選択した。
【0092】
Ｂ． 未処理、および処理された、成分および相乗的肝保護組成物の、エタノール誘導ＨｅｐＧ２細胞における抗酸化酵素活性に対する肝保護効果
ＴＢＡＲＳアッセイを行って、ＨｅｐＧ２細胞におけるエタノール誘導される脂質の過酸化を変化させるＵ１、Ｕ２、Ｕ３、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３およびシリマリンの能力を研究した（図３ａ）。結果は、対照細胞と比較して、エタノール刺激群においてより高いＴＢＡＲＳ形成を示した。しかし、ＴＢＡＲＳ形成は、処理された細胞によってそれぞれ減少した。
ＴＢＡＲＳアッセイを行って、ＨｅｐＧ２細胞におけるエタノール誘導される脂質の過酸化を変化させるＵ１、Ｕ２、Ｕ３、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３およびシリマリンの能力を研究した（図３ａ）。結果は、対照細胞と比較して、エタノール刺激群においてより高いＴＢＡＲＳ形成を示した。しかし、ＴＢＡＲＳ形成は、処理された細胞によってそれぞれ減少した。
【0093】
ＳＯＤおよびＧＳＨレベルのエタノール誘導される活性に対するＵ１、Ｕ２、Ｕ３、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３およびシリマリンの効果を、図３（ｂ）および３（ｃ）に示す。エタノール刺激は、対照細胞と比較して、ＨｅｐＧ２細胞における非酵素的な抗酸化物質ＧＳＨのレベルおよびＳＯＤの活性を大きく低下させた。興味深いことに、ＳＯＤおよびＧＳＨは、エタノール刺激群と比較して、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３ならびにシリマリン処理された細胞で増加した。
【0094】
さらに、処理された相乗的肝保護組成物（Ｐ３）の効果は、シリマリンおよび対照群の効果に匹敵した。さらに、Ｐ３によって示される効果は、未処理組成物によって示される効果、ならびに個々の成分であるクルクミノイド（Ｕ１、Ｐ１）およびルテイン（Ｕ２、Ｐ２）の効果よりも良好であった。
【0095】
従って、これらの結果から、本発明の組成物の処理された形態（Ｐ３）は、個々の成分（すなわちクルクミノイドおよびルテイン）の相乗活性を示すことが推測された。
【0096】
Ｃ． アセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）で処理したＨｅｐＧ２細胞における、処理された相乗的肝保護組成物 対 シリマリンの細胞毒性効果
図４（ａ）および４（ｂ）は、ＡＰＡＰで処理したＨｅｐＧ２細胞における、処理された相乗的肝保護組成物（Ｐ３） 対 シリマリンの細胞毒性効果の比較を示す。
図４（ａ）および４（ｂ）は、ＡＰＡＰで処理したＨｅｐＧ２細胞における、処理された相乗的肝保護組成物（Ｐ３） 対 シリマリンの細胞毒性効果の比較を示す。
【0097】
本研究では、ＡＰＡＰ曝露はＨｅｐＧ２細胞において顕著な細胞毒性を引き起こした。一方、処理された相乗的肝保護組成物（Ｐ３）（６２．５０μｇ）の前処理は、ＨｅｐＧ２細胞におけるＡＰＡＰ誘発性の細胞毒性を大幅に抑えた；結果は、シリマリン（５０μｇ）の結果に匹敵した。
【0098】
Ｄ． アセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）誘導ＨｅｐＧ２細胞に関する抗酸化酵素活性に対する、処理された相乗的肝保護組成物 対 シリマリンの肝保護効果
図５（ａ）から、ＴＢＡＲＳのレベルは、対照処理と比較したとき、ＡＰＡＰ誘導ＨｅｐＧ２細胞において増加したことが推測され得る。さらに、６２．５０μｇの処理された相乗的肝保護組成物（Ｐ３）による、ＡＰＡＰ誘導前の処理は、ＡＰＡＰ媒介ＴＢＡＲＳレベルを大幅に抑えた。これらの結果は、シリマリン（５０μｇ）によって示される効果に匹敵した。
図５（ａ）から、ＴＢＡＲＳのレベルは、対照処理と比較したとき、ＡＰＡＰ誘導ＨｅｐＧ２細胞において増加したことが推測され得る。さらに、６２．５０μｇの処理された相乗的肝保護組成物（Ｐ３）による、ＡＰＡＰ誘導前の処理は、ＡＰＡＰ媒介ＴＢＡＲＳレベルを大幅に抑えた。これらの結果は、シリマリン（５０μｇ）によって示される効果に匹敵した。
【0099】
抗酸化剤は、フリーラジカルに対する一次防御として作用する。ＡＰＡＰ誘導ＨｅｐＧ２細胞は、細胞性の抗酸化状態を、過剰なＲＯＳ生成により大きく減退させた。逆に、ＡＰＡＰを誘導する前に与えられた６２．５０μｇの処理された相乗的肝保護組成物（Ｐ３）および５０μｇのシリマリン濃度による処理は、図５（ｂ）および（ｃ）に見られるように、ＨｅｐＧ２細胞におけるＡＰＡＰ誘導される抗酸化状態の喪失（ＳＯＤおよびＧＳＨレベル）を大幅に抑えた。
【0100】
Ｅ． 未処理、および処理された相乗的肝保護組成物 対 シリマリンの、エタノール誘導細胞におけるＲＯＳ生成に対する影響
図６から、ＲＯＳレベルは、未処理の対照群と比較して、エタノール単独によって刺激されたＨｅｐＧ２細胞において増加したことが推測され得る。逆に、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３（６２．５０μｇ／ｍＬ）およびシリマリン（５０μｇ／ｍＬ）は、ＨｅｐＧ２細胞におけるエタノール誘導されたＲＯＳ生成を大幅に抑えた。６２．５０μｇ／ｍＬの処理された相乗的肝保護組成物（Ｐ３）を用いた処理によるＲＯＳ生成の減少は、５０μｇ／ｍＬのシリマリン処理のそれに匹敵した。
図６から、ＲＯＳレベルは、未処理の対照群と比較して、エタノール単独によって刺激されたＨｅｐＧ２細胞において増加したことが推測され得る。逆に、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３（６２．５０μｇ／ｍＬ）およびシリマリン（５０μｇ／ｍＬ）は、ＨｅｐＧ２細胞におけるエタノール誘導されたＲＯＳ生成を大幅に抑えた。６２．５０μｇ／ｍＬの処理された相乗的肝保護組成物（Ｐ３）を用いた処理によるＲＯＳ生成の減少は、５０μｇ／ｍＬのシリマリン処理のそれに匹敵した。
【0101】
Ｆ． 未処理、および処理された相乗的肝保護組成物対シリマリンの、エタノール媒介性のＭＭＰ減少に対する効果
図７は、ミトコンドリア膜電位が１００ｍＭエタノールに２４時間曝露された細胞において、対照と比較して大きく低下したことを示す。外膜の損傷により誘導されたミトコンドリア膜電位の脱分極は、対照と比較してミトコンドリアからの色素の消失および細胞内蛍光の低下をもたらした。逆に、６２．５０μｇ／ｍＬにおけるＵ１、Ｕ２、Ｕ３、Ｐ１、Ｐ２およびＰ３、ならびに５０μｇ／ｍＬシリマリンによる２４時間の前処理は、蛍光強度の増加によって明らかにされている、エタノール誘導されるミトコンドリア膜の脱分極を弱めた。
図７は、ミトコンドリア膜電位が１００ｍＭエタノールに２４時間曝露された細胞において、対照と比較して大きく低下したことを示す。外膜の損傷により誘導されたミトコンドリア膜電位の脱分極は、対照と比較してミトコンドリアからの色素の消失および細胞内蛍光の低下をもたらした。逆に、６２．５０μｇ／ｍＬにおけるＵ１、Ｕ２、Ｕ３、Ｐ１、Ｐ２およびＰ３、ならびに５０μｇ／ｍＬシリマリンによる２４時間の前処理は、蛍光強度の増加によって明らかにされている、エタノール誘導されるミトコンドリア膜の脱分極を弱めた。
【0102】
結果は、処理された相乗的肝保護組成物（Ｐ３）が細胞内蛍光を大きく増加させることができ、それによって細胞のミトコンドリア膜電位の脱分極の防止における正の効果を示すことを示し、これらの結果は、既知の肝保護剤シリマリンの効果に匹敵した。
【0103】
Ｇ． 未処理、および処理された相乗的肝保護組成物対シリマリンの、エタノール誘導される核アポトーシスに対する効果
図８は、ＡＯ／ＥｔＢｒで染色した後の対照細胞およびエタノール誘導ＨｅｐＧ２細胞における蛍光顕微鏡形態学的変化を示す。図は、ＨｅｐＧ２細胞における１００ｍＭエタノールに誘導されるアポトーシス性の形態変化に対する、処理された相乗的肝保護組成物（Ｐ３）６２．５０μｇおよびシリマリン５０μｇの効果を示す顕微鏡写真を表している。処理された相乗的肝保護組成物（Ｐ３）は、ＨｅｐＧ２細胞におけるＡＯ／ＥｔＢｒ染色によって染色されている通り、アポトーシスを阻害し、これは、シリマリンによって示された効果に匹敵したことが分かる。
図８は、ＡＯ／ＥｔＢｒで染色した後の対照細胞およびエタノール誘導ＨｅｐＧ２細胞における蛍光顕微鏡形態学的変化を示す。図は、ＨｅｐＧ２細胞における１００ｍＭエタノールに誘導されるアポトーシス性の形態変化に対する、処理された相乗的肝保護組成物（Ｐ３）６２．５０μｇおよびシリマリン５０μｇの効果を示す顕微鏡写真を表している。処理された相乗的肝保護組成物（Ｐ３）は、ＨｅｐＧ２細胞におけるＡＯ／ＥｔＢｒ染色によって染色されている通り、アポトーシスを阻害し、これは、シリマリンによって示された効果に匹敵したことが分かる。
【0104】
Ｈ． 未処理、および処理された相乗的肝保護組成物 対 シリマリンの、エタノール誘導核断片化に対する効果
１００ｍＭエタノールで処理したＨｅｐＧ２細胞は、図９に示すように核のｓ収縮および断片化を引き起こした。エタノール曝露前の、処理された相乗的な肝保護組成物（Ｐ３）およびシリマリン処理の両方が、それらのラジカルを捕集する強い特性に起因し得る核の収縮および断片化を低減させたことが分かる。
１００ｍＭエタノールで処理したＨｅｐＧ２細胞は、図９に示すように核のｓ収縮および断片化を引き起こした。エタノール曝露前の、処理された相乗的な肝保護組成物（Ｐ３）およびシリマリン処理の両方が、それらのラジカルを捕集する強い特性に起因し得る核の収縮および断片化を低減させたことが分かる。
【0105】
Ｉ． 処理された相乗的肝保護組成物 対 シリマリンの、ＡＰＡＰ誘導された細胞内ＲＯＳ生成に対する影響
２０ｍＭ ＡＰＡＰで処理したＨｅｐＧ２細胞は、ＤＣＦ蛍光の増加を引き起こした。処理された相乗的肝保護組成物（Ｐ３）６２．５０μｇ／ｍＬによる細胞の前処理はＤＣＦ蛍光を減少させ、それはＡＰＡＰ単独で処理された群と比較して、ＡＰＡＰ誘導される遊離ラジカルの放出を大きく減少させたことを示す（図１０）。
２０ｍＭ ＡＰＡＰで処理したＨｅｐＧ２細胞は、ＤＣＦ蛍光の増加を引き起こした。処理された相乗的肝保護組成物（Ｐ３）６２．５０μｇ／ｍＬによる細胞の前処理はＤＣＦ蛍光を減少させ、それはＡＰＡＰ単独で処理された群と比較して、ＡＰＡＰ誘導される遊離ラジカルの放出を大きく減少させたことを示す（図１０）。
【0106】
Ｊ． 処理された相乗的肝保護組成物 対 シリマリンの、アセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）に媒介されるＭＭＰ低下に対する効果
図１１に示すように、Ｒｈ－１２３処理後の緑色蛍光比を測定することにより、ミトコンドリア膜電位（ΔΓｍ）を測定した。ＡＰＡＰ処理細胞は、対照と比較して低下した緑色蛍光をともなって、分極され、大きなΔΓｍを示した。処理された相乗的肝保護組成物（Ｐ３）による細胞の前処理は、ＡＰＡＰ単独で処理された細胞と比較して、ミトコンドリア膜の脱分極状態を示す緑色蛍光を増加させた。さらに、処理された相乗的肝保護組成物（Ｐ３）およびシリマリンは、それぞれ同様の効果を示した。
図１１に示すように、Ｒｈ－１２３処理後の緑色蛍光比を測定することにより、ミトコンドリア膜電位（ΔΓｍ）を測定した。ＡＰＡＰ処理細胞は、対照と比較して低下した緑色蛍光をともなって、分極され、大きなΔΓｍを示した。処理された相乗的肝保護組成物（Ｐ３）による細胞の前処理は、ＡＰＡＰ単独で処理された細胞と比較して、ミトコンドリア膜の脱分極状態を示す緑色蛍光を増加させた。さらに、処理された相乗的肝保護組成物（Ｐ３）およびシリマリンは、それぞれ同様の効果を示した。
【0107】
Ｋ． 処理された相乗的肝保護組成物 対 シリマリンの、ＡＰＡＰ誘導された核アポトーシスに対する効果
図１２は、６２．５０μｇにおける処理された相乗的肝保護組成物（Ｐ３）およびシリマリン５０μｇの、ＨｅｐＧ２細胞における２０ｍＭ ＡＰＡＰ誘導されたアポトーシス性の形態変化に対する効果を示す顕微鏡写真を示す。図１２から、プロセシングされた相乗的肝保護組成物（Ｐ３）は、ＨｅｐＧ２細胞におけるＡＯ／ＥｔＢｒ染色によって染色される通り、アポトーシスを抑制し、その結果は、シリマリンによって示される効果に匹敵したことが推測され得る。
図１２は、６２．５０μｇにおける処理された相乗的肝保護組成物（Ｐ３）およびシリマリン５０μｇの、ＨｅｐＧ２細胞における２０ｍＭ ＡＰＡＰ誘導されたアポトーシス性の形態変化に対する効果を示す顕微鏡写真を示す。図１２から、プロセシングされた相乗的肝保護組成物（Ｐ３）は、ＨｅｐＧ２細胞におけるＡＯ／ＥｔＢｒ染色によって染色される通り、アポトーシスを抑制し、その結果は、シリマリンによって示される効果に匹敵したことが推測され得る。
【0108】
Ｌ． 処理された相乗的肝保護組成物 対 シリマリンの、ＡＰＡＰ誘導された核断片化に対する効果
２０ｍＭ ＡＰＡＰで処理したＨｅｐＧ２細胞は、図１３に見られるように、核の収縮および断片化を引き起こし、形態変化が細胞において観察された。ＡＰＡＰ曝露前の処理された相乗的肝保護組成物（Ｐ３）およびシリマリンによる前処理は、ＡＰＡＰ単独で処理された細胞と比較して、核の収縮および断片化を抑制した。
２０ｍＭ ＡＰＡＰで処理したＨｅｐＧ２細胞は、図１３に見られるように、核の収縮および断片化を引き起こし、形態変化が細胞において観察された。ＡＰＡＰ曝露前の処理された相乗的肝保護組成物（Ｐ３）およびシリマリンによる前処理は、ＡＰＡＰ単独で処理された細胞と比較して、核の収縮および断片化を抑制した。
【0109】
実施例６－Ｉｎ Ｖｉｖｏ試験
ウイスターラットにおけるアルコール誘発性の肝損傷に対する相乗的肝保護組成物の肝保護効果
試験の目的：
１． 実験ラットの初期および最終体重におけるアルコール誘発性の肝損傷変化に対する相乗的肝保護組成物（Ｐ３）の効果をモニターすること
２． 脂質プロファイルレベルＴＧ、ＴＣＨ、ＬＤＬおよびＨＤＬを評価することにより、アルコール誘発性の肝毒性に対する異なる用量における相乗的肝保護組成物（Ｐ３）の効果を評価すること
３． 肝マーカー酵素ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＡＤＨおよびＧＧＴの活性を測定すること
４． 脂質過酸化マーカーＭＤＡおよび４－ＨＮＥを評価することにより、アルコール誘発性の肝毒性に対する異なる用量におけるＳｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ Ｈｅｐａｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ（Ｐ３）の効果を評価すること
５． ラットにおけるアルコール誘発性の肝毒性の間における、炎症性（ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐６およびＩＬ‐１）マーカーをアセスする（asess）こと。
ウイスターラットにおけるアルコール誘発性の肝損傷に対する相乗的肝保護組成物の肝保護効果
試験の目的：
１． 実験ラットの初期および最終体重におけるアルコール誘発性の肝損傷変化に対する相乗的肝保護組成物（Ｐ３）の効果をモニターすること
２． 脂質プロファイルレベルＴＧ、ＴＣＨ、ＬＤＬおよびＨＤＬを評価することにより、アルコール誘発性の肝毒性に対する異なる用量における相乗的肝保護組成物（Ｐ３）の効果を評価すること
３． 肝マーカー酵素ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＡＤＨおよびＧＧＴの活性を測定すること
４． 脂質過酸化マーカーＭＤＡおよび４－ＨＮＥを評価することにより、アルコール誘発性の肝毒性に対する異なる用量におけるＳｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ Ｈｅｐａｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ（Ｐ３）の効果を評価すること
５． ラットにおけるアルコール誘発性の肝毒性の間における、炎症性（ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐６およびＩＬ‐１）マーカーをアセスする（asess）こと。
【0110】
材料および方法：
動物－
Ｂｉｏｇｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（インド）から入手した、体重１３０～１５０ｇのオスのウイスターラット。動物を、２５±２ｏ℃で、１２時間の明：暗周期で、通常の飼育器で順応させた。動物には、標準ラット固形飼料および水を自由に与えた。実験の１８～２４時間前に食物を回収した。動物実験に関するＧｏｏｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅに関するＣｏｕｎｃｉｌ Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ ＣＰＣＳＥＡ、Ｉｎｄｉａ（ＭＣＡＳ／ＩＡＥＣ／２０１９／６／９／２／２０１９）のガイドラインに従って、実験動物の世話および利用を実施した。
動物－
Ｂｉｏｇｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（インド）から入手した、体重１３０～１５０ｇのオスのウイスターラット。動物を、２５±２ｏ℃で、１２時間の明：暗周期で、通常の飼育器で順応させた。動物には、標準ラット固形飼料および水を自由に与えた。実験の１８～２４時間前に食物を回収した。動物実験に関するＧｏｏｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅに関するＣｏｕｎｃｉｌ Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ ＣＰＣＳＥＡ、Ｉｎｄｉａ（ＭＣＡＳ／ＩＡＥＣ／２０１９／６／９／２／２０１９）のガイドラインに従って、実験動物の世話および利用を実施した。
【0111】
実験計画デザイおよび処理予定：
実験用のオスのウイスターラットを、各群が６匹の動物を含む６群に分け、２８の合計の実験期間にわたって分析し、エタノール、シリマリンおよび処理された相乗的肝保護組成物Ｐ３の投与量は以下の通りであった：
群１： 対照（ビヒクル）
群２： ０．９％生理食塩水中のエタノール（ＥｔＯＨ）（２．４ｍｇ／ｋｇ体重）
群３： ＥｔＯＨ ＋シリマリン（２００ｍｇ／ｋｇ体重）
群４： ＥｔＯＨ ＋ Ｐ３－２：１（２００ｍｇ／ｋｇ／体重）
群５： ＥｔＯＨ ＋ Ｐ３－４：１（２００ｍｇ／ｋｇ体重）
群６： ＥｔＯＨ ＋ Ｐ３－６：１（２００ｍｇ／ｋｇ／体重）。
実験用のオスのウイスターラットを、各群が６匹の動物を含む６群に分け、２８の合計の実験期間にわたって分析し、エタノール、シリマリンおよび処理された相乗的肝保護組成物Ｐ３の投与量は以下の通りであった：
群１： 対照（ビヒクル）
群２： ０．９％生理食塩水中のエタノール（ＥｔＯＨ）（２．４ｍｇ／ｋｇ体重）
群３： ＥｔＯＨ ＋シリマリン（２００ｍｇ／ｋｇ体重）
群４： ＥｔＯＨ ＋ Ｐ３－２：１（２００ｍｇ／ｋｇ／体重）
群５： ＥｔＯＨ ＋ Ｐ３－４：１（２００ｍｇ／ｋｇ体重）
群６： ＥｔＯＨ ＋ Ｐ３－６：１（２００ｍｇ／ｋｇ／体重）。
【0112】
対照群およびエタノール群には、それぞれ０．９％生理食塩水を２８日間強制経口投与した。薬物処理の肝保護特性を試験するために、ラットに、エタノール投与の３０分前に、２８日間にわたってシリマリンおよび相乗的肝保護組成物（Ｐ３）を投与した。
【0113】
動物飼料の組成：
タンパク質－１７．７％、脂肪－４．２％、炭水化物－５０．５％、繊維質－３．４％、ミネラル－６．７％、およびビタミン－１．７％。
タンパク質－１７．７％、脂肪－４．２％、炭水化物－５０．５％、繊維質－３．４％、ミネラル－６．７％、およびビタミン－１．７％。
【0114】
試験の２８日目に、全ての動物をクロロホルムを用いて麻酔し、血液サンプルを、対照ラットおよび実験ラットから静脈を通して採取した。血液サンプルを３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、血清サンプルを分析まで－２０ｏ℃のフリーザー中に保持した。屠殺した動物の肝臓も直ちに摘出し、氷冷した生理食塩水中で適切にリンスし、ブロット乾燥し、計量して、器官重量を記録した。次いで、肝臓組織の一部を、さらなる組織病理学的研究のために、適切な固定液に直ちに浸漬した。肝臓の残部を、生化学的アッセイのために残しておいた。
【0115】
体重に対する肝重量の測定
処理期間の最後に全動物の体重を、屠殺日の肝重量とともに記録して、決定し、屠殺日の肝重量を測定して、各群における動物の最終体重に対する肝重量を決定した。
処理期間の最後に全動物の体重を、屠殺日の肝重量とともに記録して、決定し、屠殺日の肝重量を測定して、各群における動物の最終体重に対する肝重量を決定した。
【0116】
組織ホモジネートの調製
１０％ｗ／ｖの肝臓組織ホモジネートを、組織ホモジナイザーを用いて、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）を含む氷冷したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で調製した。次いで、ホモジネートを１０，０００ｒｐｍで３０分間、４℃で遠心分離した。このようにして得られた上清を、続く組織酸化ストレスマーカーの生化学的アッセイのためにさらに使用した。
１０％ｗ／ｖの肝臓組織ホモジネートを、組織ホモジナイザーを用いて、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）を含む氷冷したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で調製した。次いで、ホモジネートを１０，０００ｒｐｍで３０分間、４℃で遠心分離した。このようにして得られた上清を、続く組織酸化ストレスマーカーの生化学的アッセイのためにさらに使用した。
【0117】
生化学的分析
タンパク質含量を、Ｌｏｗｒｙ（１９５１）の方法によって見積もった。市販の診断キット（Ｍｉｃｒｏ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｌａｂ、Ｔａｍｉｌ Ｎａｄｕ）を用いることによるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、ガンマ‐グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、トリグリセリド（ＴＧ）、総コレステロール（ＴＣＨ）、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ‐Ｃ）、高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ‐Ｃ）、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）および４‐ヒドロキシノネナール（４‐ＨＮＥ）分析。
タンパク質含量を、Ｌｏｗｒｙ（１９５１）の方法によって見積もった。市販の診断キット（Ｍｉｃｒｏ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｌａｂ、Ｔａｍｉｌ Ｎａｄｕ）を用いることによるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、ガンマ‐グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、トリグリセリド（ＴＧ）、総コレステロール（ＴＣＨ）、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ‐Ｃ）、高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ‐Ｃ）、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）および４‐ヒドロキシノネナール（４‐ＨＮＥ）分析。
【0118】
肝臓のＡＤＨ活性
アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）活性を、Ｂｏｎｎｉｃｈｓｅｎ ａｎｄ Ｂｒｉｎｋ（１９５５）の方法によって決定した。簡潔には、ＡＤＨ活性を、５０ｍＭグリシン（ｐＨ９．６）、０．８ｍＭ ＮＡＤ、３ｍＭエタノールおよび５０μＬの細胞質画分中で、１ｍＬの最終体積において測定した。酵素活性を３４０ｎｍで測定し、活性を、６．２２×１０６ Ｍ－１ ｃｍ－１のモル吸光係数を用いて、形成されたＮＡＤＨののｎｍｏｌ／分／タンパク質のｍｇとして算出した。
アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）活性を、Ｂｏｎｎｉｃｈｓｅｎ ａｎｄ Ｂｒｉｎｋ（１９５５）の方法によって決定した。簡潔には、ＡＤＨ活性を、５０ｍＭグリシン（ｐＨ９．６）、０．８ｍＭ ＮＡＤ、３ｍＭエタノールおよび５０μＬの細胞質画分中で、１ｍＬの最終体積において測定した。酵素活性を３４０ｎｍで測定し、活性を、６．２２×１０６ Ｍ－１ ｃｍ－１のモル吸光係数を用いて、形成されたＮＡＤＨののｎｍｏｌ／分／タンパク質のｍｇとして算出した。
【0119】
サイトカイン評価
炎症誘発性サイトカイン、すなわち腫瘍壊死性因子α（ＴＮＦ－α）およびインターロイキン６（ＩＬ－６）およびインターロイキン１（ＩＬ－１）の評価も、市販のＥＬＩＳＡキットを使用して実施し、ピコグラム／ミリリットル（ｐｇ／ｍＬ）で表した（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ、Ｍｉｌｐｉｔａｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）。
炎症誘発性サイトカイン、すなわち腫瘍壊死性因子α（ＴＮＦ－α）およびインターロイキン６（ＩＬ－６）およびインターロイキン１（ＩＬ－１）の評価も、市販のＥＬＩＳＡキットを使用して実施し、ピコグラム／ミリリットル（ｐｇ／ｍＬ）で表した（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ、Ｍｉｌｐｉｔａｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）。
【0120】
組織病理学的研究
対照動物および処理動物からのラット肝臓組織の一部を１０％ホルマリンバッファーにおいて直接に固定し、生理食塩水による通常の洗浄、および脱水の後にパラフィンに包埋した。それから、全工程の後に、ミクロトームを用いて組織ブロックから厚さ３～５μｍの切片を調製した。それから、組織切片をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。組織切片を顕微鏡下で観察し、対応する画像を、顕微鏡に取り付けられているデジタルカメラを使用して得た。
対照動物および処理動物からのラット肝臓組織の一部を１０％ホルマリンバッファーにおいて直接に固定し、生理食塩水による通常の洗浄、および脱水の後にパラフィンに包埋した。それから、全工程の後に、ミクロトームを用いて組織ブロックから厚さ３～５μｍの切片を調製した。それから、組織切片をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。組織切片を顕微鏡下で観察し、対応する画像を、顕微鏡に取り付けられているデジタルカメラを使用して得た。
【0121】
統計分析
各実験を少なくとも３回繰り返した。データは、平均±Ｓ．Ｅ．として示す。処理群間の種々の変数の平均値の有意さを、処理群間の分散の均一性を確認した後に、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）のｐｏｓｔ ｈｏｃ検定（Ｔｕｋｅｙ’ｓ ＨＳＤ検定）を用いて分析した。統計試験を、ＳＰＳＳソフトウェアバージョン２０．０を用いて行った。ｐ＜０．０５の値を統計学的に有意であるとみなした。
各実験を少なくとも３回繰り返した。データは、平均±Ｓ．Ｅ．として示す。処理群間の種々の変数の平均値の有意さを、処理群間の分散の均一性を確認した後に、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）のｐｏｓｔ ｈｏｃ検定（Ｔｕｋｅｙ’ｓ ＨＳＤ検定）を用いて分析した。統計試験を、ＳＰＳＳソフトウェアバージョン２０．０を用いて行った。ｐ＜０．０５の値を統計学的に有意であるとみなした。
【0122】
結果：
Ａ． 通常の観察体重に対する処理された相乗的肝保護組成物の効果
表２は、対照ラットおよび実験ラットにおける水および食物のレベルの摂取を示す。試験の全期間中、対照ラットおよび実験ラットの群の間で、食物および水の消費量に差はなかった。
Ａ． 通常の観察体重に対する処理された相乗的肝保護組成物の効果
表２は、対照ラットおよび実験ラットにおける水および食物のレベルの摂取を示す。試験の全期間中、対照ラットおよび実験ラットの群の間で、食物および水の消費量に差はなかった。
【0123】
表３および３ａは、それぞれ、対照群および実験群のラットにおける体重、体重増加および増加率ならびに肝臓重量に対する、エタノールおよび本発明の処理された相乗的肝保護組成物（Ｐ３）の効果を示す。エタノールによって誘導されたラットにおいて、未処理の対照（群１）ラットより、体重は減少し、肝臓重量は、有意に増加した（Ｐ＜０．０５）。群２ラットと比べたとき、相乗的肝保護組成物（Ｐ３）によって処理したラット（群４～６）では、肝臓重量は正常に近いように見えるからである。群２のラットでは、グループ１のラットと比べて、体重、体重増加および増加率が有意に減少した（ｐ＜０．０５）。クルクミノイドおよびルテインを異なる比率で有する本発明の相乗的肝保護組成物（Ｐ３）による処理はまた、エタノール処理ラットによって誘導された体重の減少に対する保護を示し、シリマリンによって示された効果に匹敵した。
【0124】
【表2】
【0125】
【表3】
【0126】
Ｂ． 肝機能マーカー酵素の変化に対する、本発明の処理された相乗的肝保護組成物の効果
表４は、対照ラットおよび実験ラットにおける肝臓マーカー酵素の活性の変化を示す。エタノールの投与は、ＡＳＴ、ＡＬＴおよびＧＧＴレベルをそれぞれ有意に増加させた（ｐ＜０．０５）。最終的に、クルクミノイドおよびルテインを４：１および６：１の比率で有する、２００ｍｇ／Ｋｇの用量の本発明の処理された相乗的肝保護組成物（Ｐ３）による共処理（群５および６）は、エタノール処理ラットと比較して、ＡＳＴ、ＡＬＴおよびＧＧＴの上昇したレベルを、有意に低下させた（ｐ＜０．０５）。さらに、クルクミノイドおよびルテインを４：１および６：１の比率で有する本発明の処理された相乗的肝保護組成物（Ｐ３）によって示される結果は、シリマリンの結果に匹敵した。
表４は、対照ラットおよび実験ラットにおける肝臓マーカー酵素の活性の変化を示す。エタノールの投与は、ＡＳＴ、ＡＬＴおよびＧＧＴレベルをそれぞれ有意に増加させた（ｐ＜０．０５）。最終的に、クルクミノイドおよびルテインを４：１および６：１の比率で有する、２００ｍｇ／Ｋｇの用量の本発明の処理された相乗的肝保護組成物（Ｐ３）による共処理（群５および６）は、エタノール処理ラットと比較して、ＡＳＴ、ＡＬＴおよびＧＧＴの上昇したレベルを、有意に低下させた（ｐ＜０．０５）。さらに、クルクミノイドおよびルテインを４：１および６：１の比率で有する本発明の処理された相乗的肝保護組成物（Ｐ３）によって示される結果は、シリマリンの結果に匹敵した。
【0127】
【表4】
【0128】
エタノールの摂取は、ミトコンドリアにおける脂肪酸のβ酸化の破壊を引き起こす、
肝細胞における
肝細胞における
【0129】
【化1】
【0130】
の比率を高め、脂肪症の原因になる。また、アルコールは小腸から肝臓への脂質輸送を増加させ、肝臓に取り込まれている脂肪組織からの脂肪酸の動員を促す（１６）。これは、肝細胞の細胞膜に対する損傷を起こし、トランスアミナーゼ（アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ））の血中濃度の上昇の原因になる。ガンマグルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）は、酸化ダメージから細胞を保護する酸化ストレスの細胞内ホメオスタシスを維持する重要な役割を有する。それは、細胞膜に存在し、細胞膜が損傷をうけると循環中に遊離する。
【0131】
本知見は、エタノール投与が対照群と比べて血清ＡＳＴ、ＡＬＴおよびＧＧＴ酵素活性の大きな上昇を引き起こすことを明らかにした。これらの上昇はアルコール中毒によって誘発された肝損傷に起因し得る。その構成要素（クルクミノイドおよびルテイン）の異なる比率を有する本発明の処理された相乗的肝保護組成物（Ｐ３）の投与は、アルコール摂取によって引き起こされる血中の上昇した酵素濃度を効果的に和らげ、その後の正常化に向かうリカバリーにつながり、対照群に匹敵する正常化への続く回復に導いた。
【0132】
Ｃ． エタノール誘導脂質プロファイルの変化に対する、本発明の処理された相乗的肝保護組成物の効果
表５は、対照ラットおよび実験ラットにおける脂質プロファイル（ＴＧ、ＴＣＨ、ＬＤＬ－ＣおよびＨＤＬ－Ｃレベルのレベル）を評価することによる、その構成成分（クルクミノイドおよびルテイン）を異なる比率で有する処理された相乗的肝保護組成物（Ｐ３）の効果の、エタノール誘発性の肝毒性に対する比較を示す。
表５は、対照ラットおよび実験ラットにおける脂質プロファイル（ＴＧ、ＴＣＨ、ＬＤＬ－ＣおよびＨＤＬ－Ｃレベルのレベル）を評価することによる、その構成成分（クルクミノイドおよびルテイン）を異なる比率で有する処理された相乗的肝保護組成物（Ｐ３）の効果の、エタノール誘発性の肝毒性に対する比較を示す。
【0133】
表５から、エタノールによる処理はまた、体内の脂質プロファイルの恒常性を破壊し、ＴＧ、ＴＣＨ、ＬＤＬ－Ｃレベルをそれぞれ上昇させ、同時にＨＤＬ－Ｃレベルを低下させる（ｐ＜０．０５）ことが推測され得る。本発明の処理された相乗的肝保護組成物（Ｐ３）による共処理は、以上の変化をほぼ正常値に有意に逆転させた（ｐ＜０．０５）。エタノール代謝の間に、大量の還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）が産生され、このようにしてＫｒｅｂｓ回路および脂肪酸の酸化を阻害し、肝脂肪症および血清高脂血症を支持する（１７）。
【0134】
さらに、エタノール群はまた、ＴＣＨ、ＴＧ、ＬＤＬレベルの増加を、ＨＤＬレベルの同時の減少とともに示す。しかしながら、処理された相乗的肝保護組成物（Ｐ３）による処理は、脂質プロファイルレベルの上述の変化を減弱させた。したがって、本発明の相乗的肝保護組成物（Ｐ３）は、脂質プロファイルを維持するのに有効である。また、健全なコレステロール値および健全なＬＤＬ／ＨＤＬ比率を維持することに有効である。
【0135】
処理された相乗的肝保護組成（Ｐ３）によって処理された動物の、低コレステロール性の活性は、上昇した血清ＨＤＬレベルを介したコレステロールの肝クリアランスの増加、またはコレステロール生合成酵素（ＨＭＧ‐ＣｏＡレダクターゼ）の下方制御に寄与し得る（１８）。
【0136】
【表5】
【0137】
Ｄ． 肝臓ＡＤＨ、ＭＤＡおよび４－ＨＮＥにおけるエタノール誘発性の変化に対する本発明の処理された相乗的肝保護組成物の効果
表６は、異なる比率のその構成要素（２：１、４：１および６：１比率におけるクルクミノイドおよびルテイン）における本発明の処理された相乗的肝保護組成物（Ｐ３）の、ＡＤＨ、ＭＤＡおよび４－ＨＮＥレベルによる肝臓のエタノール誘発性の変化に対する効果の比較を示す。エタノール処理群（群２）は、対照群と比較して、ＡＤＨ、ＭＤＡおよび４－ＨＮＥレベルの大きな上昇を示した。エタノール対照群におけるＡＤＨ、ＭＤＡおよび４－ＨＮＥの上昇したレベルは、エタノールの有毒な作用に起因する肝細胞の脂質プロファイルの存在を示した。
表６は、異なる比率のその構成要素（２：１、４：１および６：１比率におけるクルクミノイドおよびルテイン）における本発明の処理された相乗的肝保護組成物（Ｐ３）の、ＡＤＨ、ＭＤＡおよび４－ＨＮＥレベルによる肝臓のエタノール誘発性の変化に対する効果の比較を示す。エタノール処理群（群２）は、対照群と比較して、ＡＤＨ、ＭＤＡおよび４－ＨＮＥレベルの大きな上昇を示した。エタノール対照群におけるＡＤＨ、ＭＤＡおよび４－ＨＮＥの上昇したレベルは、エタノールの有毒な作用に起因する肝細胞の脂質プロファイルの存在を示した。
【0138】
クルクミノイドおよびルテインを４：１および６：１の比率において有する処理された本発明（Ｐ３）の相乗的肝保護組成物による、２００ｍｇ／Ｋｇの用量における共処理は、エタノール処理ラットと比較して、ＡＤＨ、ＭＤＡおよび４－ＨＮＥの上昇したレベルを、有意に低下させた（ｐ＜０．０５）。
【0139】
【表6】
【0140】
Ｅ． 本発明の処理された相乗的肝保護組成物の、サイトカインレベルのエタノール誘発性の変化に対する効果
表７は、サイトカインレベルのエタノール誘発性の変化に対する、本発明の処理された相乗的肝保護組成物（Ｐ３）の効果を示す。エタノールの投与が、対照群１と比較して、血清ＴＮＦ－α、ＩＬ－６およびＩＬ－１レベルの有意な増加をもたらす（ｐ＜０．００１）ことは、明らかである。表７は、エタノール処理群２において、血清ＴＮＦ－α、ＩＬ－６およびＩＬ－１レベルがそれぞれ増加したことを示す。処理された相乗的肝保護組成物（Ｐ３）による共処理は、群４～６の結果に見られるように、血清ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐６およびＩＬ‐１レベルの顕著な減少を引き起こした。
表７は、サイトカインレベルのエタノール誘発性の変化に対する、本発明の処理された相乗的肝保護組成物（Ｐ３）の効果を示す。エタノールの投与が、対照群１と比較して、血清ＴＮＦ－α、ＩＬ－６およびＩＬ－１レベルの有意な増加をもたらす（ｐ＜０．００１）ことは、明らかである。表７は、エタノール処理群２において、血清ＴＮＦ－α、ＩＬ－６およびＩＬ－１レベルがそれぞれ増加したことを示す。処理された相乗的肝保護組成物（Ｐ３）による共処理は、群４～６の結果に見られるように、血清ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐６およびＩＬ‐１レベルの顕著な減少を引き起こした。
【0141】
【表7】
【0142】
Ｆ． 肝臓組織の組織病理学的分析
図１４に示された組織学的特徴は、対照ラットにおける肝臓の正常な肝小葉構造および細胞構造を示す。健康な対照の肝には病理学的変化は認められなかった。エタノール誘導ラット（すなわち群２）において、２ｇｍ／ｋｇ体重のエタノール摂取を４週間継続した後、組織学的分析により肝損傷の程度を評価した。例えば、肝静脈洞の拡張、索状物の押出および萎縮が小葉中心性肝細胞に認められ、おそらく肝細胞再生を示唆した；単核細胞のわずかな浸潤および壊死細胞が中心静脈に認められた。小葉中心部に空胞性変化およびおそらく脂肪変性が認められた。まとめると肝細胞の腫脹、水腫性変性、および空胞化が、小葉中心領域において顕著になり、これはアルコール性肝傷害に起因する初期の生化学的および病理学的な変化を反映していた。
図１４に示された組織学的特徴は、対照ラットにおける肝臓の正常な肝小葉構造および細胞構造を示す。健康な対照の肝には病理学的変化は認められなかった。エタノール誘導ラット（すなわち群２）において、２ｇｍ／ｋｇ体重のエタノール摂取を４週間継続した後、組織学的分析により肝損傷の程度を評価した。例えば、肝静脈洞の拡張、索状物の押出および萎縮が小葉中心性肝細胞に認められ、おそらく肝細胞再生を示唆した；単核細胞のわずかな浸潤および壊死細胞が中心静脈に認められた。小葉中心部に空胞性変化およびおそらく脂肪変性が認められた。まとめると肝細胞の腫脹、水腫性変性、および空胞化が、小葉中心領域において顕著になり、これはアルコール性肝傷害に起因する初期の生化学的および病理学的な変化を反映していた。
【0143】
エタノール処理された群２のラットは、空胞変性と壊死を伴う中心静脈周囲の炎症反応を示した。群３、群４および群５では、より小さい肝組織の空胞変性、より小さい炎症反応を中心静脈周囲に示した。群６の肝臓組織はほぼ正常な構造を示した。したがって、エタノールによって誘発された組織病理学的変化は、本発明の処理された相乗的組成物（Ｐ３）によって（特に、４：１および６：１の比率でクルクミノイドおよびルテインを有する本発明の組成物（Ｐ３）において）顕著に改善され（群５および６）、これは、肝臓における脂肪症を顕著に寛解させ、エタノール処理群と比較して明らかな改善を示した。
【0144】
試験の結論
結論として、インビボ研究は、本発明の処理された相乗的肝保護組成物（Ｐ３）が脂質プロファイルを正常化および維持するのに有効であることを実証する。また、それは、健全なコレステロール値および健全なＬＤＬ／ＨＤＬ比率の維持に有効である。さらに、本発明の相乗的肝保護組成物は、血中酵素（すなわちＡＳＴ、ＡＬＴ、ＡＤＨおよびＧＧＴ）のレベルを正常化し、維持するのに有効である。脂質過酸化マーカーＭＤＡおよび４‐ＨＮＥの評価に関する研究はまた、相乗的肝保護組成物が、不健康な食事パターン、ＰＵＦＡの高消費およびアルコール消費などの様々な因子によって引き起こされ得る脂質の過酸化の減少に有効であることを示した。さらに、本発明の相乗的肝保護組成物は、肝臓の炎症反応のマーカーである炎症誘発性サイトカイン（ＴＮＦ－α、ＩＬ－６およびＩＬ－１）の血中レベルの低下に有効であると分かった。これらの血清炎症誘発性サイトカイン（ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐６およびＩＬ‐１）は、非アルコール性およびアルコール性脂肪性肝疾患のｓ患者において非常に増大すると考えられている。
結論として、インビボ研究は、本発明の処理された相乗的肝保護組成物（Ｐ３）が脂質プロファイルを正常化および維持するのに有効であることを実証する。また、それは、健全なコレステロール値および健全なＬＤＬ／ＨＤＬ比率の維持に有効である。さらに、本発明の相乗的肝保護組成物は、血中酵素（すなわちＡＳＴ、ＡＬＴ、ＡＤＨおよびＧＧＴ）のレベルを正常化し、維持するのに有効である。脂質過酸化マーカーＭＤＡおよび４‐ＨＮＥの評価に関する研究はまた、相乗的肝保護組成物が、不健康な食事パターン、ＰＵＦＡの高消費およびアルコール消費などの様々な因子によって引き起こされ得る脂質の過酸化の減少に有効であることを示した。さらに、本発明の相乗的肝保護組成物は、肝臓の炎症反応のマーカーである炎症誘発性サイトカイン（ＴＮＦ－α、ＩＬ－６およびＩＬ－１）の血中レベルの低下に有効であると分かった。これらの血清炎症誘発性サイトカイン（ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐６およびＩＬ‐１）は、非アルコール性およびアルコール性脂肪性肝疾患のｓ患者において非常に増大すると考えられている。
【0145】
この結果から、本発明の相乗的肝保護組成物は、脂質低下および肝保護活動活性をおそらく介してエタノール誘発毒性から肝臓を保護するのに有用であることも推測される。さらに、上記組成物は、肝臓の抗酸化状態に関して肝臓の状態を維持すること、脂質プロファイルのレベル、肝臓酵素マーカーのレベルの低下、および抗炎症活性によって、ならびに慢性アルコール暴露に対して、エタノール誘発性の肝毒性を有益に改善した。
【0146】
肝臓組織の組織病理学的分析は、エタノールによって誘発された変化が、特にクルクミノイドおよびルテインを４：１および６：１の比率で有する本発明の組成物（Ｐ３）において、本発明の処理された相乗的組成物（Ｐ３）によって顕著に改善されたことを示した。
【0147】
本発明の相乗的肝保護組成物の特定の実施形態を例示し、説明したが、本発明の精神および範囲から逸脱する範囲で、様々な他の変更および修正をなし得ることは当業者には明らかであろう。そのような変更および修正を、添付の特許請求の範囲において網羅していることが、意図されている。
【0148】
参考文献：
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【図1(a)】
【図1(b)】
【図1(c)】
【図1(d)】
【図1(e)】
【図1(f)】
【図2(a)】
【図2(b)】
【図2(c)】
【図2(d)】
【図2(e)】
【図2(f)】
【図3(a)】
【図3(b)】
【図3(c)】
【図4(a)】
【図4(b)】
【図5(a)】
【図5(b)】
【図5(c)】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】