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特開2024-59784マイボーム腺再生を促進するためのＰＥＤＦ由来ペプチドおよびその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024059784
(43)【公開日】2024-05-01
(54)【発明の名称】マイボーム腺再生を促進するためのＰＥＤＦ由来ペプチドおよびその使用
(51)【国際特許分類】
A61K 38/10 20060101AFI20240423BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20240423BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20240423BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240423BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20240423BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240423BHJP
【ＦＩ】
A61K38/10
A61K38/17 ZNA
A61P27/02
A61P43/00 111
C07K14/47
C12N15/12
【審査請求】有
【請求項の数】4
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024025017
(22)【出願日】2024-02-21
(62)【分割の表示】P 2020561713の分割
【原出願日】2019-05-04
(31)【優先権主張番号】62/667,415
(32)【優先日】2018-05-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】519124338
【氏名又は名称】ブリム バイオテクノロジー インク
【氏名又は名称原語表記】ＢＲＩＭ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ， ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】８Ｆ， Ｎｏ．１， Ａｌｌｅｙ ３０， Ｌａｎｅ ３５８ Ｒｕｉｇｕａｎｇ Ｒｄ．， Ｎｅｉｈｕ Ｄｉｓｔ． Ｔａｉｐｅｉ， １１４９２ （ＴＷ）
(74)【代理人】
【識別番号】100116850
【弁理士】
【氏名又は名称】廣瀬 隆行
(74)【代理人】
【識別番号】100165847
【弁理士】
【氏名又は名称】関 大祐
(72)【発明者】
【氏名】ファン ナイ－ウェン
(72)【発明者】
【氏名】ホ ツォン－チュアン
(72)【発明者】
【氏名】ツァオ ヨウ－ピン
(72)【発明者】
【氏名】リー フランク ウェン－チー
(57)【要約】 （修正有）
【課題】マイボーム腺再生を促進するための、またはドライアイ症候群を治療／予防するための医薬組成物または方法を提供する。
【解決手段】それを必要とする対象に、ＰＥＤＦ由来短鎖ペプチド（ＰＤＳＰ）、またはＰＤＳＰの変異体を含む医薬組成物を投与する工程を含み、ＰＤＳＰは、ヒト色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）の残基９３～１０６を含む。
【選択図】なし
【解決手段】それを必要とする対象に、ＰＥＤＦ由来短鎖ペプチド（ＰＤＳＰ）、またはＰＤＳＰの変異体を含む医薬組成物を投与する工程を含み、ＰＤＳＰは、ヒト色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）の残基９３～１０６を含む。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
１４～２９アミノ酸長を有するＰＥＤＦ由来短鎖ペプチド（ＰＤＳＰ）、または前記ＰＤＳＰの変異体を含む、マイボーム腺再生の促進、またはマイボーム腺機能不全を原因とするドライアイの治療および／または予防に使用するための医薬組成物であって、
前記ＰＤＳＰが、ＳＬＧＡＥＱＲＴＥＳＩＩＨＲ（配列番号２）又はＳＬＧＡＥＱＲＴＥＳＩＩＨＲＡＬＹＹＤＬＩＳＳＰＤＩＨＧＴ（配列番号１）の配列からなり、前記ＰＤＳＰの変異体が、配列番号６～７５のいずれか１つの配列の配列からなる医薬組成物。
前記ＰＤＳＰが、ＳＬＧＡＥＱＲＴＥＳＩＩＨＲ（配列番号２）又はＳＬＧＡＥＱＲＴＥＳＩＩＨＲＡＬＹＹＤＬＩＳＳＰＤＩＨＧＴ（配列番号１）の配列からなり、前記ＰＤＳＰの変異体が、配列番号６～７５のいずれか１つの配列の配列からなる医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＰＥＤＦ由来ペプチド、およびマイボーム腺再生、またはドライアイの治療におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
マイボーム腺機能不全（ＭＧＤ）は、マイボーム腺分泌物の量的および／または質的変化の減少、涙液層脂質層の不安定性、および眼刺激の症状を特徴とする１～３。ＭＧＤはドライアイ疾患（ＤＥＤ）を有する全症例の３分の２を占めるため、特に高齢者では、増大しつつある公的問題と考えられている１、２。ただし、外用薬、マイボーム腺（ＭＧ）発現、Ｌｉｐｉｆｌｏｗおよびインテンスパルスライト（ＩＰＬ）治療を含む現在の臨床的ＭＧＤ治療法は、それらが多くの場合、ＤＥＤの症状緩和、それ以上のＭＧ萎縮の予防を主に目的とし、ＭＧＤの根底にある病因を改善することを直接目的としていないため、ほとんどが対症療法的である１、２、４。
【0003】
ＭＧＤには、分泌増加型ＭＧＤ、分泌減少型ＭＧＤおよび閉塞性ＭＧＤの３つの形態がある５。閉塞性ＭＧＤは最も一般的と考えられ、導管開口部の過角化に関与し、導管閉塞および後続の腺房萎縮を引き起こすと考えられている３、５。しかし、ＭＧＤ患者の粘膜皮膚移行部の前方変位、およびマウスＭＧの開口部での非角化導管上皮細胞の所見は、ＭＧＤの一次機構としての過角化の従来の理論を裏付けない５、６。加齢性ＭＧＤでは、細胞増殖の減少を伴う腺萎縮が、ヒトおよびマウスのマイボーム腺の両方に観察された７、８。腺房組織の萎縮は、脂質と導管細胞との間の不均衡、または開口部の栓に寄与する脂質／タンパク質比の変化をもたらす主要な病因である可能性がある５、９。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
マイボーム腺機能不全（ＭＧＤ）は多くの患者に発症するが、現在の治療法はほとんどが対症療法的である。したがって、ＭＧＤのさらに効果的な治療法が必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明の実施形態は、マイボーム腺再生を促進するための方法、および色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）に由来する短鎖ペプチドを使用してドライアイを治療するための方法に関する。
【0006】
本発明の一態様は、マイボーム腺再生を促進するための方法に関する。本発明の一実施形態による方法は、それを必要とする対象に、ＰＥＤＦ由来短鎖ペプチド（ＰＤＳＰ）、またはＰＤＳＰの変異体を含む医薬組成物を投与する工程を含み、ＰＤＳＰは、ヒト色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）の残基９３～１０６を含む。
【0007】
本発明の一態様は、ドライアイ症候群を治療するための方法に関する。本発明の一実施形態による方法は、それを必要とする対象に、ＰＥＤＦ由来短鎖ペプチド（ＰＤＳＰ）、またはＰＤＳＰの変異体を含む医薬組成物を投与する工程を含み、ＰＤＳＰは、ヒト色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）の残基９３～１０６を含む。
【0008】
本発明の他の態様は、以下の詳細な説明および添付の特許請求の範囲によって明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】老齢マウスのＭＧ萎縮と涙液層の不安定性とを示す。パネル（Ａ）は、Ｏｉｌ－Ｒｅｄ－Ｏ（ＯＲＯ）によって染色された若齢マウスおよび老齢マウスから採取された上眼瞼および下眼瞼を示す。マイバム（赤）は、主導管（矢印）および腺房（矢頭）に認められた。代表的な画像は、老齢マウスの７つの眼瞼および若齢マウスの６つの眼瞼から得られたものである。パネル（Ｂ）は、計算され、萎縮領域の割合に基づいてＭＧスコアに変換されたマイボーム腺萎縮の類別を示す。パネル（Ｃ）は、ＯＲＯによって染色された老齢マウスおよび若齢マウスの上眼瞼の凍結切片を示す。パネル（Ｄ）は、若齢マウス８匹の１６の眼および老齢マウス６匹の１２の眼から評価された涙液層破壊時間を示す。データは平均±ＳＥとして報告されている。＊Ｐ＜０．０５対若齢マウス。＊＊Ｐ＜０．００１対若齢マウス。
【0010】
【図2】若齢マウスおよび老齢マウスの上眼瞼におけるＰＥＤＦ発現を示す。代表的なＰＥＤＦ染色断面は、若齢マウス（Ａ）および老齢マウス（Ｂ）の腺房を示した。二次抗体のみによる免疫染色は、陰性対照として使用した（Ｃ）。低倍率画像（上部パネル）内のボックスは、高倍率画像（下部パネル）の位置を示し、高倍率画像（下部パネル）は、ＰＥＤＦが前駆細胞の核内に主に発現することを示す（黒い矢印；（Ｄ）および（Ｅ））。ＰＥＤＦ発現は、腺房全体に認められ、腺房基底（ａｃｉｎａｒ ｂａｓｅ）の細胞質ではさらに強力であった。（Ｆ）ＰＥＤＦの組織病理学的スコアは、染色強度、腺房基底の細胞質の強度、およびＰＥＤＦ陽性細胞核の割合に基づいて計算した。分析のために、３つの無作為化された画像を各眼瞼から取得した。代表的な画像は、各群の６匹の異なるマウスの６つの眼瞼から得られたものである（元の倍率：Ｘ４００）。＊Ｐ＜０．０５対若齢群。スケールバー、５０μｍ。
【0011】
【図3】２９量体が、老齢マウスの腺房前駆細胞の増殖を促進することを示す。ＤＮＡ合成を検出するために、２９量体処置直後にＢｒｄＵを腹腔内注射し、２４時間の時点で眼瞼を採取した。通常条件下（処置なし）では、老齢マウス（Ａ）は、若齢マウス（Ｄ）よりも少ないＢｒｄＵ陽性細胞を示した。２９量体は、老齢マウス（Ｃ）および若齢マウス（Ｆ）の腺房基底でＢｒｄＵ陽性細胞を増加させたが、ＤＭＳＯは効果を示さなかった（ＢおよびＥ）。赤い破線の円は中心導管を示した。黒い矢印はＢｒｄＵ陽性前駆細胞を示した。（Ｇ）ＰＥＤＦ治療効果は、腺房基底内のＢｒｄＵ陽性細胞に基づいて計算した。分析のために、３つの無作為化された画像を各眼瞼から取得した。代表的な画像は、各群の６匹の異なるマウスの６つの眼瞼から得られたものである（元の倍率：Ｘ４００）。代表的な画像は、各群の３匹の異なるマウスの３つの眼瞼から得られたものである（元の倍率：Ｘ４００）。＃Ｐ＜０．０５対若齢マウスの通常条件、＊Ｐ＜０．０５対ＤＭＳＯまたは１８量体によって処置された老齢マウス。＊＊Ｐ＜０．０５対若齢マウスの通常条件、またはビヒクルＤＭＳＯによって処置された若齢マウス。スケールバー、５０μｍ。
【0012】
【図4】処置５日後の上眼瞼での細胞増殖を示す。単回の結膜下注射の後、０日目および３日目にＢｒｄＵを腹腔内注射した。その後、５日目に眼瞼を採取した。（Ａ）および（Ｃ）は、それぞれ老齢マウスおよび若齢マウスに対するＤＭＳＯ処置による対照を示している。（Ｃ）および（Ｄ）は、それぞれ老齢マウスおよび若齢マウスに対するＰＤＳＰ処置を示している。ＢｒｄＵ陽性細胞は主に腺房前駆細胞（黒い矢印）であり、少数のマイボーム腺上皮細胞（ｍｅｉｂｏｃｙｔｅ）がＢｒｄＵ染色に陽性であった（Ｄ、赤い矢印）。（Ｅ）ＰＥＤＦ治療効果は、腺房基底内のＢｒｄＵ陽性細胞に基づいて計算した。分析のために、３つの無作為化された画像を各眼瞼から取得した。代表的な画像は、各群の３匹の異なるマウスの３つの眼瞼から得られたものである（元の倍率：Ｘ４００）。＊Ｐ＜０．００１対ＤＭＳＯによって処置された老齢マウス。スケールバー、５０μｍ。
【0013】
【図5】単回処置の５日後の上眼瞼における幹細胞マーカーｐ６３発現の免疫組織化学分析を示す。（Ａ）および（Ｂ）は、それぞれ老齢マウスおよび若齢マウスにおけるベースラインｐ６３発現を示している。（Ｃ）および（Ｄ）は、それぞれ老齢マウスにおけるＤＭＳＯおよびＰＤＳＰ処置を示している。赤い破線の円は中心導管を示した。（Ｅ）１腺房当たりのｐ６３陽性細胞の数を評価した。代表的な画像は、各群の３匹の異なるマウスの３つの眼瞼から得られたものである（元の倍率：Ｘ４００）。分析のために、３つの無作為化された画像を各眼瞼から取得した。＊Ｐ＜０．００１対若齢マウス、＊＊Ｐ＜０．００１対ＤＭＳＯによって処置された老齢マウス。スケールバー、５０μｍ。
【0014】
【図6】２９量体が老齢マウスの涙液層の安定性を高めることを示す。２９量体注射後の１、２、３、４および８週間について、涙液破壊時間（ＴＢＵＴ）（Ａ）および涙液量分泌（Ｂ）のレベルを示す。値は平均±ＳＥとして表されている。データは、各群の６匹の異なるマウスの６つの眼瞼から得られたものである。１つの眼瞼から得られた涙液層破壊時間の３つの測定値を記録した。＊Ｐ＜０．０５対同じ時点でのビヒクル群。
【0015】
【図7】２９量体が老齢マウスの腺房サイズを増加させることを示す。（Ａ）左、上眼瞼に対する全組織標本ＯＲＯ染色。右、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ７．０の面積計算ツールを使用してＭＧ面積を分析した。（Ｂ）は、ピクセル単位で表された、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐによって測定された上眼瞼のＭＧサイズのヒストグラムを示す。上眼瞼の凍結切片をＯＲＯによって染色した。Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ７．０によって測定された腺房サイズのヒストグラムをピクセル単位で表した。全組織標本の代表的な画像は、各群の７匹の異なるマウスの７つの眼瞼から得られたものである。凍結切片の代表的な画像は、各群の３匹の異なるマウスの３つの眼瞼から得られたものである。＊Ｐ＜０．０５対ビヒクル群。
【発明を実施するための形態】
【0016】
本発明の実施形態は、ＰＥＤＦ由来短鎖ペプチド（ＰＤＳＰ）を使用してマイボーム腺再生を促進するための方法に関する。マイボーム腺は、全分泌型の外分泌腺である。マイボーム腺は、瞼板内の眼瞼の縁に位置し、眼の涙液層の蒸発を防ぐ油性物質であるマイバムの供給を担う。マイボーム腺機能不全（ＭＧＤ）は、ドライアイ症候群（またはドライアイ疾患）の最も一般的な原因である。ＭＧＤは、特に縁に沿って、眼瞼炎と呼ばれる眼瞼の炎症を引き起こす場合がある。
【0017】
正常なＭＧホメオスタシスでは、ＭＧ腺房内のマイボーム腺上皮細胞は、腺房周辺の基底細胞層内の幹細胞から連続的に分化する４。本明細書では、本発明者らは、ＰＥＤＦタンパク質が、腺房基底細胞（前駆細胞）の核と腺房基底の細胞質とに主に発現することを初めて見出した。加齢の変化に伴い、ＰＥＤＦタンパク質の発現は大幅に減少した。
【0018】
ヒト色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）は、４１８個のアミノ酸を含み、分子量が約５０ｋＤａの分泌糖タンパク質である。ＰＥＤＦは、培養ヒト胎児網膜色素上皮細胞の培養上清から初めて同定され、単離された多機能タンパク質である１０～１２。ＰＥＤＦは、肝臓、脂肪組織、眼、心臓、膵臓に広く発現し、成体組織の器官形成および恒常性維持に基本的な役割を果たしている１２～１４。
【0019】
ＰＥＤＦの異なるモチーフは、異なる生物学的活性を発揮する。例えば、４４量体モチーフ（アミノ酸位置Ｖａｌ７８～Ｔｈｒ１２１）は、ＰＥＤＦの神経栄養活性および細胞分裂活性を決定する１２、１５。一方、３４量体断片（ＰＥＤＦの残基４４～７７）は、抗血管新生活性を有することが特定されている。本発明者らは、４４量体（Ｖａｌ７８～Ｔｈｒ１２１）がウサギの角膜輪部で幹細胞の増殖および再生を誘導することができることを発見した１６～１８。さらに、それよりも短いペプチド２９量体（残基Ｓｅｒ９３～Ｔｈｒ１２１）が、筋原性幹細胞およびＣ２Ｃ１２筋芽細胞の増殖を誘導することが見出された１５。本発明は、ＭＧ腺房内のＰＥＤＦタンパク質発現が加齢とともに減少するという発見に基づくものであった。
【0020】
本発明の発明者らは、特定のＰＥＤＦ由来短鎖ペプチド（ＰＤＳＰ）が、腺房前駆細胞の増殖、ならびに腺房サイズ、および涙液層の安定性をインビボで増加させることができることを予期せず発見した。これらのＰＤＳＰは、マイボーム腺再生を促進することができ、ドライアイ疾患の治療または予防に使用することができる。
【0021】
本発明のＰＤＳＰは、ヒトＰＥＤＦ残基９３～１２１（９３ＳＬＧＡＥＱＲＴＥＳＩＩＨＲＡＬＹＹＤＬＩＳＳＰＤＩＨＧＴ１２１；配列番号１）に対応するペプチド領域に基づく。本発明者らは、この２９量体に基づいて、セリン－９３、アラニン－９６、グルタミン－９８、イソロイシン－１０３、イソロイシン－１０４およびアルギニン－１０６が、これらの残基をアラニンにより（またはアラニン－９６をグリシンに）個別に置換した場合に活性が顕著に失われることから証明されるように、活性にとって重要であることを特定した。対照的に、２９量体内の他の残基のアラニン（またはグリシン）置換は活性をはっきりと変化させなかったことから、これらの他の残基（すなわち、残基９４、９５、９７、９９～１０２、１０５および１０７～１２１）にアミノ酸置換（特に、相同なアミノ酸置換）を有するＰＤＳＰ変異体も変形性関節症を予防および／または治療するのに、または軟骨形成を誘導するのに使用することができることが示唆された。
【0022】
これらの結果は、抗侵害受容効果を含むコアペプチドが、残基９３～１０６（９３ＳＬＧＡＥＱＲＴＥＳＩＩＨＲ１０６；配列番号２）を含む領域にあることを示している。したがって、抗侵害受容活性を有する最も短いＰＤＳＰペプチドは、１４量体であり得る。当業者であれば、Ｃ末端および／またはＮ末端でのこのコアペプチドに対する追加のアミノ酸の付加が、この活性に影響を与えないことを理解するであろう。すなわち、本発明のＰＤＳＰは、ヒトＰＥＤＦの残基９３～１０６を含む任意のペプチドであり得る。したがって、本発明のＰＤＳＰペプチドは、実験で使用された２９量体を含めて、１４量体、１５量体、１６量体などであり得る。
【0023】
さらに、上記のように、これらの短鎖ペプチド内の置換は、重要な残基（セリン－９３、アラニン－９６、グルタミン－９８、イソロイシン－１０３、イソロイシン－１０４およびアルギニン－１０６）が保存されている限り、活性を保持することができる。さらに、マウス変異体（ヒトの配列と比較して、ヒスチジン－９８およびバリン－１０３の２つの置換を有する）も活性である。対応するマウス配列は、ｍｏ－２９量体（ＳＬＧＡＥＨＲＴＥＳＶＩＨＲＡＬＹＹＤＬＩＴＮＰＤＩＨＳＴ、配列番号３）およびｍｏ－１４量体（ＳＬＧＡＥＨＲＴＥＳＶＩＨＲ、配列番号４）である。したがって、活性コアの一般的な配列は（９３Ｓ－Ｘ－Ｘ－Ａ－Ｘ－Ｑ／Ｈ－Ｘ－Ｘ－Ｘ－Ｘ－Ｉ／Ｖ－Ｉ－Ｘ－Ｒ１０６（Ｘは任意のアミノ酸残基を表す）；配列番号５）である。本発明の実施形態とともに使用され得るＰＤＳＰ配列のいくつかの例を以下の表に示す（位置の番号付けは１４量体の位置に基づく）。これらの例は、限定することを意図したものではない。
【表1】
【0024】
本発明のＰＤＳＰペプチドは、タンパク質／ペプチド発現系を使用して化学的に合成または発現され得る。これらのＰＤＳＰペプチドは、変形性関節症の予防および／または治療のための医薬組成物に使用され得る。医薬組成物は、任意の薬学的に許容される賦形剤を含み得、医薬組成物は、局所投与、経口投与、注射などの投与に適した形態で製剤化され得る。そのような用途のための様々な製剤は、当技術分野で知られており、本発明の実施形態とともに使用することができる。
【0025】
本発明のＰＥＤＦ誘導体、例えば、長さ２９アミノ酸のＰＤＳＰ ２９量体は、腺房前駆細胞の増殖と脂質生成とを刺激し、これは、未処置のマウスと比較して、ＰＤＳＰ処置老齢マウスの方が、ｐ６３陽性基底細胞数が多く、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ（ＯＲＯ）によって全組織標本および凍結切片標本が良好に染色されたことによって証明された。２９量体はまた、老齢マウスの涙液層の安定性を改善した。
【0026】
本発明に記載された結果は、ＰＥＤＦが、分化したマイボーム腺上皮細胞よりも、腺房の未分化の前駆細胞内で数多く発現することを示している。老齢マウスでは、ＭＧ内のＰＥＤＦタンパク質の発現が減少し、細胞周期と腺房前駆細胞のｐ６３標識とが大幅に低下した。他の結果は、脈絡膜／ＲＰＥ複合体および皮膚では、ＰＥＤＦ発現のレベルが加齢とともに減少したことを示している。通常の加齢プロセスでの様々な組織内のＰＥＤＦタンパク質の減少が、加齢性疾患にとって重要である可能性がある。
【0027】
本発明者らの試験の結果はまた、ＰＤＳＰ（例えば、２９量体）を若齢マウスおよび老齢マウスに直接注射すると、２４時間の時点で基底腺房細胞（ｂａｓａｌ ａｃｉｎａｒ ｃｅｌｌ）が増殖したことを示している。５日目に、老齢マウスでは２９量体注射とＤＭＳＯ注射との間で細胞増殖の有意差が示されたが、若齢マウスではそうではなかった。若齢マウスでは、内因性のＰＥＤＦレベルが老齢マウスよりも高く、２９量体を追加すると、定常状態のＰＥＤＦ濃度と受容体占有率とに達する可能性がある。したがって、若齢マウスでは有意な増加は検出されなかった。
【0028】
マイボーム腺は、全分泌分化を伴う改変された皮脂腺である。脂腺細胞の分化は、細胞内の脂質の合成および蓄積の増強と強く関連している。本発明者らの試験は、ＰＤＳＰが腺房前駆細胞に対してプロミトティック（ｐｒｏｍｉｔｏｔｉｃ）効果を及ぼすだけでなく、腺房分化を増強することも明らかにした。ＰＥＤＦを介した脂質生成のシグナル伝達経路には、ＰＰＡＲγシグナル伝達が関与している可能性がある。したがって、ＰＥＤＦは、ＰＰＡＲγを調節することにより腺房分化を促進する可能性がある。
【0029】
ＭＧＤは、眼表面の炎症性サイトカインＩＬ－１αおよび成熟ＩＬ－１βと関連することが示されている３７。ＰＥＤＦは、その抗炎症活性で知られている１２。ＰＥＤＦは、ヒト肝細胞内で炎症メディエーターｃ－Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼの活性化を抑制することによってＩＬ－１βを遮断することが示されている４０。したがって、ＰＥＤＦは、眼表面で炎症タンパク質を改善することによって、ＭＧＤ患者の症状を改善する可能性がある。本明細書に提示した結果は、２９量体は涙液分泌に影響を及ぼさないが、ＴＢＵＴの増加によって証明されるように、脂質の生成を増加させ、涙液層の安定性を増加させることができることを示している。
【0030】
要約すると、本明細書で報告された結果は、ＰＥＤＦペプチド誘導体が腺房前駆細胞の増殖を促進することができることを示している。腺房前駆細胞の増殖の直接刺激、およびインビボでの脂質生成と涙液層の安定性との改善は、ＭＧＤの潜在的な治療法としてのＰＥＤＦペプチド誘導体を示唆している。
【0031】
本発明の実施形態は、以下の特定の実施例により説明される。特定の実施例では、２９量体（配列番号１）が使用される。ただし、他のＰＤＳＰ（例えば、１４量体、配列番号２または配列番号３など）もまた、同じ結果を達成するために使用することができる。当業者であれば、これらの実施例は例示のみを目的としており、本発明の範囲から逸脱することなく、変更および修正が可能であることを理解するであろう。
【0032】
化学物質および抗体
この試験に使用した抗体は、抗ＰＥＤＦ抗体（ｓｃ－２５５９４、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＡ）、ＢｒｄＵ（ＧＴＸ４２６４１、ＧｅｎｅＴｅｘ、Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ，ＴＸ）およびｐ６３（ｍａｂ４１３５、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）であった。２９量体（Ｓｅｒ９３～Ｔｈｒ１２１）および１８量体（Ｇｌｕ９７～Ｓｅｒ１１４；対照ペプチド）を合成し、安定性のためにＮＨ２末端のアセチル化とＣＯＯＨ末端のアミド化とによって修飾し、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）での質量分析（純度＞９０％）によって特性評価した。
この試験に使用した抗体は、抗ＰＥＤＦ抗体（ｓｃ－２５５９４、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＡ）、ＢｒｄＵ（ＧＴＸ４２６４１、ＧｅｎｅＴｅｘ、Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ，ＴＸ）およびｐ６３（ｍａｂ４１３５、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）であった。２９量体（Ｓｅｒ９３～Ｔｈｒ１２１）および１８量体（Ｇｌｕ９７～Ｓｅｒ１１４；対照ペプチド）を合成し、安定性のためにＮＨ２末端のアセチル化とＣＯＯＨ末端のアミド化とによって修飾し、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）での質量分析（純度＞９０％）によって特性評価した。
【0033】
動物および処置
１２～１５カ月齢のＣ５７ＢＬ／６マウスおよび４～８カ月齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを使用した。これらのマウスを２４℃±１℃、相対湿度６０％±１０％で、病原体のない標準的な環境に置いた。手順はいずれも、動物調査についてＭａｃｋａｙ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄにより承認され、ＡＲＶＯ ｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ａｎｄ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈに準拠して実施した。ゾレチル（６ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（３ｍｇ／ｋｇ）との混合物の腹腔内注射によりマウスを麻酔した。あらゆる眼科手術の前に、０．５％塩酸プロパラカイン（Ａｌｃａｉｎｅ；Ａｌｃｏｎ、Ｆｏｒｔ Ｗｏｒｔｈ，ＴＸ，ＵＳＡ）を１滴投与した。
１２～１５カ月齢のＣ５７ＢＬ／６マウスおよび４～８カ月齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを使用した。これらのマウスを２４℃±１℃、相対湿度６０％±１０％で、病原体のない標準的な環境に置いた。手順はいずれも、動物調査についてＭａｃｋａｙ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄにより承認され、ＡＲＶＯ ｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ａｎｄ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈに準拠して実施した。ゾレチル（６ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（３ｍｇ／ｋｇ）との混合物の腹腔内注射によりマウスを麻酔した。あらゆる眼科手術の前に、０．５％塩酸プロパラカイン（Ａｌｃａｉｎｅ；Ａｌｃｏｎ、Ｆｏｒｔ Ｗｏｒｔｈ，ＴＸ，ＵＳＡ）を１滴投与した。
【0034】
最終濃度１００μＭになるようにＤＭＳＯ中で２９量体を再構成した。上部および下部結膜円蓋に、９０μｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）と混合した１０μｌの２９量体（１００μＭ）の別個の用量を注射した。９０μｌのＰＢＳと混合した１０μｌのＤＭＳＯを対照として使用した。老齢マウスの涙液層破壊時間（ＴＢＵＴ）および涙液分泌に対する２９量体の効果を評価するために、２９量体の結膜下注射を１カ月まで毎週導入し、その後２カ月間追跡した。
【0035】
１カ月の時点で、全組織標本Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ（ＯＲＯ）染色に上眼瞼を供した。全組織標本内のＭＧ組織のサイズを、コンピュータ支援画像分析器（Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ７．０）を備えた色範囲選択およびヒストグラムツールを使用して定量し、ピクセル単位で計算した。
【0036】
涙液層破壊時間
長期間の麻酔下でまばたきがないことに起因する脂質分泌の低下を回避するために、マウスを麻酔した直後に涙液破壊時間（ＴＢＵＴ）１９、２０を行った。１．５μＬの０．１％局所フルオレセイン（Ｆｌｕｏｒ－Ｉ－Ｓｔｒｉｐ；Ａｙｅｒｓｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，ＵＳＡ）を眼表面に滴下した。強制的に３回まばたきさせた後、ブルーフリーバリアフィルターを備えたスリットランプ下で、ミリ秒単位でＴＢＵＴを記録した。各眼から３回の測定値を得た。処置群に対して盲検化された１名の眼科医により、標準的な環境で、その日の同様の時点（午後２～３時）にＴＢＵＴを取得した。
長期間の麻酔下でまばたきがないことに起因する脂質分泌の低下を回避するために、マウスを麻酔した直後に涙液破壊時間（ＴＢＵＴ）１９、２０を行った。１．５μＬの０．１％局所フルオレセイン（Ｆｌｕｏｒ－Ｉ－Ｓｔｒｉｐ；Ａｙｅｒｓｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，ＵＳＡ）を眼表面に滴下した。強制的に３回まばたきさせた後、ブルーフリーバリアフィルターを備えたスリットランプ下で、ミリ秒単位でＴＢＵＴを記録した。各眼から３回の測定値を得た。処置群に対して盲検化された１名の眼科医により、標準的な環境で、その日の同様の時点（午後２～３時）にＴＢＵＴを取得した。
【0037】
眼瞼全組織標本
体毛を除去した後、新鮮なマウス眼瞼を採取し、直ちに４％パラホルムアルデヒドを用いて一晩固定し、ＰＢＳでリンスした４。原液（３００ｍｇのＯＲＯ粉末の１００ｍｌの９９％イソプロパノール溶液）を混合することによってＯｉｌ－Ｒｅｄ－Ｏ（ＯＲＯ）溶液を調製し、濾過した。眼瞼を６０％ ２－プロパノール中に１５分間入れ、ＯＲＯ溶液により３０分間染色し、次いで６０％ ２－プロパノールを用いて１５～２０分間脱染して、最適な脂質染色を達成した４。次いで、眼瞼をマウントし、顕微鏡を使用して撮影した。
体毛を除去した後、新鮮なマウス眼瞼を採取し、直ちに４％パラホルムアルデヒドを用いて一晩固定し、ＰＢＳでリンスした４。原液（３００ｍｇのＯＲＯ粉末の１００ｍｌの９９％イソプロパノール溶液）を混合することによってＯｉｌ－Ｒｅｄ－Ｏ（ＯＲＯ）溶液を調製し、濾過した。眼瞼を６０％ ２－プロパノール中に１５分間入れ、ＯＲＯ溶液により３０分間染色し、次いで６０％ ２－プロパノールを用いて１５～２０分間脱染して、最適な脂質染色を達成した４。次いで、眼瞼をマウントし、顕微鏡を使用して撮影した。
【0038】
マイボスケール（Ｍｅｉｂｏｓｃａｌｅ）
マイボグラフィー画像に対するマイボスケールに従って、若齢マウスおよび老齢マウスのＭＧを類別した２１。要約すると、欠損領域がない場合にグレード０、欠損領域が＜２５％の場合にグレード１、欠損領域が２５％～５０％の場合にグレード２、欠損領域が５１％～７５％の場合にグレード３、欠損領域が７５％の場合にグレード４としてＭＧ萎縮を示した。以下の通りにＭＧのスコアを分析した。グレード０、５；グレード１、４；グレード２、３；グレード３、２；グレード４、１。
マイボグラフィー画像に対するマイボスケールに従って、若齢マウスおよび老齢マウスのＭＧを類別した２１。要約すると、欠損領域がない場合にグレード０、欠損領域が＜２５％の場合にグレード１、欠損領域が２５％～５０％の場合にグレード２、欠損領域が５１％～７５％の場合にグレード３、欠損領域が７５％の場合にグレード４としてＭＧ萎縮を示した。以下の通りにＭＧのスコアを分析した。グレード０、５；グレード１、４；グレード２、３；グレード３、２；グレード４、１。
【0039】
脂質に対するＯｉｌ ｒｅｄ Ｏ
眼瞼組織をＯＣＴに包埋し、厚さ８μｍで切断した。凍結切片を６０％ ２－プロパノールに１分間入れ、濾過したＯＲＯ溶液を用いて１５分間染色し、ＰＢＳでリンスし、ヘマトキシリンを用いて対比染色した４。
眼瞼組織をＯＣＴに包埋し、厚さ８μｍで切断した。凍結切片を６０％ ２－プロパノールに１分間入れ、濾過したＯＲＯ溶液を用いて１５分間染色し、ＰＢＳでリンスし、ヘマトキシリンを用いて対比染色した４。
【0040】
５－ブロモ－２’－デオキシウリジン取り込みアッセイ
２９量体またはＤＭＳＯの結膜下注射後、５－ブロモ－２’デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）０．１ｍｇ／ｇ体重を腹腔内注射した。腺房前駆細胞の増殖を評価するために、２４時間の時点で上眼瞼を採取した。細胞の有糸分裂を試験するために、マウスにＢｒｄＵを３日間連日腹腔内注射し、５日目に上眼瞼を採取した。ＢｒｄＵの免疫組織化学的検査を行う前に、１Ｎ ＨＣＬを用いてスライドを９５℃で２０分間処理した。
２９量体またはＤＭＳＯの結膜下注射後、５－ブロモ－２’デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）０．１ｍｇ／ｇ体重を腹腔内注射した。腺房前駆細胞の増殖を評価するために、２４時間の時点で上眼瞼を採取した。細胞の有糸分裂を試験するために、マウスにＢｒｄＵを３日間連日腹腔内注射し、５日目に上眼瞼を採取した。ＢｒｄＵの免疫組織化学的検査を行う前に、１Ｎ ＨＣＬを用いてスライドを９５℃で２０分間処理した。
【0041】
涙液量の測定
ＺＯＮＥ－ＱＵＩＣＫ綿糸（Ｙｏｋｏｔａ、Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用したフェノールレッド綿糸涙液試験により、涙液量を測定した１９、２０。全身麻酔後、下眼瞼をわずかに引き下げ、外側眼角から１／３の距離の眼瞼結膜上に綿糸の１ｍｍ部分を置いた。目を開いた状態で１分間にわたり、各眼を試験した。綿糸の赤い部分をミリメートル単位で測定する。
ＺＯＮＥ－ＱＵＩＣＫ綿糸（Ｙｏｋｏｔａ、Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用したフェノールレッド綿糸涙液試験により、涙液量を測定した１９、２０。全身麻酔後、下眼瞼をわずかに引き下げ、外側眼角から１／３の距離の眼瞼結膜上に綿糸の１ｍｍ部分を置いた。目を開いた状態で１分間にわたり、各眼を試験した。綿糸の赤い部分をミリメートル単位で測定する。
【0042】
免疫組織化学的検査
免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）を前述のように行い、改変した２２。ホルマリン固定パラフィン包埋マウス標本をキシレン中で脱パラフィンし、段階的な一連のエタノール濃度で再水和した。１０％ヤギ血清を用いてスライドを６０分間ブロックした後、ＢｒｄＵ（１：８００希釈）、ＰＥＤＦ（１：５０）またはｐ６３（１：２００）に対する一次抗体と４℃で一晩インキュベートした。続いて、スライドを適切なペルオキシダーゼ標識ヤギ免疫グロブリン（１：５００希釈；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）と２０分間インキュベートし、次いで、色素原基質（３，３－ジアミノベンジジン）と２分間インキュベートした後、ヘマトキシリンを用いて対比染色した。Ｐａｎｎｏｒａｍｉｃデジタルスライドスキャナ（３Ｄｈｉｓｔｅｃｈ Ｌｔｄ．Ｂｕｄａｐｅｓｔ，Ｈｕｎｇａｒｙ）を使用して取得された高品質画像に基づいて、定量を推定した。
免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）を前述のように行い、改変した２２。ホルマリン固定パラフィン包埋マウス標本をキシレン中で脱パラフィンし、段階的な一連のエタノール濃度で再水和した。１０％ヤギ血清を用いてスライドを６０分間ブロックした後、ＢｒｄＵ（１：８００希釈）、ＰＥＤＦ（１：５０）またはｐ６３（１：２００）に対する一次抗体と４℃で一晩インキュベートした。続いて、スライドを適切なペルオキシダーゼ標識ヤギ免疫グロブリン（１：５００希釈；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）と２０分間インキュベートし、次いで、色素原基質（３，３－ジアミノベンジジン）と２分間インキュベートした後、ヘマトキシリンを用いて対比染色した。Ｐａｎｎｏｒａｍｉｃデジタルスライドスキャナ（３Ｄｈｉｓｔｅｃｈ Ｌｔｄ．Ｂｕｄａｐｅｓｔ，Ｈｕｎｇａｒｙ）を使用して取得された高品質画像に基づいて、定量を推定した。
【0043】
ＰＥＤＦ染色類別
以下に従ってＰＥＤＦ発現を類別した：（Ａ）、腺房全体の弱い染色：０；腺房全体の強い染色：１；（Ｂ）、基底細胞質では同じ腺房の他の領域よりも強い染色の傾向はない：０；基底腺房細胞質（ｂａｓａｌ ａｃｉｎａｒ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ）の染色は弱いが、他の領域よりも強い：１；基底腺房細胞質の染色は中程度であり、他の領域よりも強い：２；基底腺房細胞質の染色は強く、他の領域よりも強い：３；（Ｃ）、基底細胞核内に発現せず：０、＜５０％の基底細胞核がＰＥＤＦに対して陽性に染色された：１；＞５０％の基底細胞核がＰＥＤＦに対して陽性に染色された：２。（Ａ）＋（Ｂ）＋（Ｃ）スコアを合計し、合計スコアは０から６の範囲であり得る。
以下に従ってＰＥＤＦ発現を類別した：（Ａ）、腺房全体の弱い染色：０；腺房全体の強い染色：１；（Ｂ）、基底細胞質では同じ腺房の他の領域よりも強い染色の傾向はない：０；基底腺房細胞質（ｂａｓａｌ ａｃｉｎａｒ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ）の染色は弱いが、他の領域よりも強い：１；基底腺房細胞質の染色は中程度であり、他の領域よりも強い：２；基底腺房細胞質の染色は強く、他の領域よりも強い：３；（Ｃ）、基底細胞核内に発現せず：０、＜５０％の基底細胞核がＰＥＤＦに対して陽性に染色された：１；＞５０％の基底細胞核がＰＥＤＦに対して陽性に染色された：２。（Ａ）＋（Ｂ）＋（Ｃ）スコアを合計し、合計スコアは０から６の範囲であり得る。
【0044】
統計分析
平均±ＳＤとして結果を表した。統計分析には、ＳＰＳＳバージョン１８．０（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ＵＳＡ）を使用した。統計的比較にはマンホイットニー検定を使用した。Ｐ＜０．０５の値が統計的に有意であると考えられた。
平均±ＳＤとして結果を表した。統計分析には、ＳＰＳＳバージョン１８．０（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ＵＳＡ）を使用した。統計的比較にはマンホイットニー検定を使用した。Ｐ＜０．０５の値が統計的に有意であると考えられた。
【0045】
老齢マウスのＭＧ萎縮
老齢マウスでは、全組織標本のＯＲＯ染色でＭＧ腺房サイズの縮小が認められた（図１Ａ）。若齢マウスおよび老齢マウスの上眼瞼のＭＧのスコアは、それぞれ４±０．８２、２．５±０．６３（Ｐ＝０．０１５）であった。若齢マウスおよび老齢マウスの下眼瞼のＭＧのスコアは、それぞれ２．５±０．８４、１．８±０．８４（Ｐ＝０．００６）であった（図１Ｂ）。ＯＲＯにより染色された眼瞼の断面の所見は、全組織標本によって検出された形態学的変化と相関していた（図１Ｃ）。老齢マウスでは、ＯＲＯによって染色された凍結切片内に中心導管周囲の腺房サイズの縮小が認められた。老齢マウスの涙液破壊時間（ＴＢＵＴ）は３１７．３６±１１９．７６であり、若齢マウスの３８９．０４±４９．１８よりも有意に短かった（Ｐ＜０．００１）（図１Ｄ）。これらの結果は、老齢マウスが重大なＭＧ萎縮と涙液層の不安定性とを有することを示している。
老齢マウスでは、全組織標本のＯＲＯ染色でＭＧ腺房サイズの縮小が認められた（図１Ａ）。若齢マウスおよび老齢マウスの上眼瞼のＭＧのスコアは、それぞれ４±０．８２、２．５±０．６３（Ｐ＝０．０１５）であった。若齢マウスおよび老齢マウスの下眼瞼のＭＧのスコアは、それぞれ２．５±０．８４、１．８±０．８４（Ｐ＝０．００６）であった（図１Ｂ）。ＯＲＯにより染色された眼瞼の断面の所見は、全組織標本によって検出された形態学的変化と相関していた（図１Ｃ）。老齢マウスでは、ＯＲＯによって染色された凍結切片内に中心導管周囲の腺房サイズの縮小が認められた。老齢マウスの涙液破壊時間（ＴＢＵＴ）は３１７．３６±１１９．７６であり、若齢マウスの３８９．０４±４９．１８よりも有意に短かった（Ｐ＜０．００１）（図１Ｄ）。これらの結果は、老齢マウスが重大なＭＧ萎縮と涙液層の不安定性とを有することを示している。
【0046】
老齢マウスのＭＧ腺房内のＰＥＤＦタンパク質発現の低下
腺房全体におけるＰＥＤＦタンパク質の分布を観察するために、上眼瞼の腺房の断面４をＩＨＣによって試験した。結果は、ＰＥＤＦが前駆細胞の核に、または前駆細胞近くの初期分化したマイボーム腺上皮細胞に発現したことを示した（図２Ａ、Ｂ、ＤおよびＥ）。さらに、ＰＥＤＦ発現の強度は、腺房基底の細胞質では、導管組織近くの近位端よりも強かった（図２Ｄ）。腺房基底細胞質（ａｃｉｎａｒ ｂａｓａｌ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ）内の方がＰＥＤＦタンパク質が高く発現する傾向は、老齢マウスではそれほど顕著ではなかった（図２Ｅ）。老齢マウスでは、前駆細胞の核を含む腺房組織内のＰＥＤＦ発現の強度は、若齢マウスと比較して有意に減少した。図２Ｆに示すＰＥＤＦタンパク質発現の全体的なスコアは、老齢マウスでは若齢マウスと比較して減少した（３．１７±０．８３対４．７２±１．０４、Ｐ＜０．００１）。
腺房全体におけるＰＥＤＦタンパク質の分布を観察するために、上眼瞼の腺房の断面４をＩＨＣによって試験した。結果は、ＰＥＤＦが前駆細胞の核に、または前駆細胞近くの初期分化したマイボーム腺上皮細胞に発現したことを示した（図２Ａ、Ｂ、ＤおよびＥ）。さらに、ＰＥＤＦ発現の強度は、腺房基底の細胞質では、導管組織近くの近位端よりも強かった（図２Ｄ）。腺房基底細胞質（ａｃｉｎａｒ ｂａｓａｌ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ）内の方がＰＥＤＦタンパク質が高く発現する傾向は、老齢マウスではそれほど顕著ではなかった（図２Ｅ）。老齢マウスでは、前駆細胞の核を含む腺房組織内のＰＥＤＦ発現の強度は、若齢マウスと比較して有意に減少した。図２Ｆに示すＰＥＤＦタンパク質発現の全体的なスコアは、老齢マウスでは若齢マウスと比較して減少した（３．１７±０．８３対４．７２±１．０４、Ｐ＜０．００１）。
【0047】
ＰＥＤＦペプチドは腺房前駆細胞の増殖を促進する
老齢マウスでは、ＭＧ腺房の細胞周期の低下が認められた７。ＭＧ腺房サイズに対するＰＤＳＰのプロミトティック効果を評価するために、マウスにＢｒｄＵを腹腔内注射し、処置後２４時間の時点で安楽死させた。２４時間の時点で、ＢｒｄＵ陽性細胞はいずれも腺房前駆細胞であり、腺房の基部に位置していることが分かった。処置しなかった場合、若齢マウスの方が、老齢マウスと比較して、１腺房当たりのＢｒｄＵ陽性細胞が多かった（図３ＡおよびＢ、１．４４±０．４０対０．７３±０．２１、Ｐ＝０．００１）。無処置群の増殖率は、若齢マウスまたは老齢マウスにおけるＤＭＳＯ処置群の増殖率と類似していた（図３Ａ、Ｂ、ＤおよびＥ）。２９量体ペプチドは、ＤＭＳＯと比較して、若齢マウスの増殖細胞の数を増加させることができた（図３Ｆ、２．３５±０．７３対１．６８±０．７１、Ｐ＝０．０４１）。また、ＰＤＳＰ処置した老齢マウスでは、ＤＭＳＯ群と比較して、ＢｒｄＵ陽性細胞の数が増加した（図３Ｃ、１．６７±０．５８対０．７４±０．３４細胞／１腺房当たり、Ｐ＝０．００２）。対照ペプチド１８量体は、老齢マウスの細胞増殖に対して影響を示さなかった（図３Ｇ、１．００±０．３９、ＤＭＳＯと比較してｐ＝０．１５６）。
老齢マウスでは、ＭＧ腺房の細胞周期の低下が認められた７。ＭＧ腺房サイズに対するＰＤＳＰのプロミトティック効果を評価するために、マウスにＢｒｄＵを腹腔内注射し、処置後２４時間の時点で安楽死させた。２４時間の時点で、ＢｒｄＵ陽性細胞はいずれも腺房前駆細胞であり、腺房の基部に位置していることが分かった。処置しなかった場合、若齢マウスの方が、老齢マウスと比較して、１腺房当たりのＢｒｄＵ陽性細胞が多かった（図３ＡおよびＢ、１．４４±０．４０対０．７３±０．２１、Ｐ＝０．００１）。無処置群の増殖率は、若齢マウスまたは老齢マウスにおけるＤＭＳＯ処置群の増殖率と類似していた（図３Ａ、Ｂ、ＤおよびＥ）。２９量体ペプチドは、ＤＭＳＯと比較して、若齢マウスの増殖細胞の数を増加させることができた（図３Ｆ、２．３５±０．７３対１．６８±０．７１、Ｐ＝０．０４１）。また、ＰＤＳＰ処置した老齢マウスでは、ＤＭＳＯ群と比較して、ＢｒｄＵ陽性細胞の数が増加した（図３Ｃ、１．６７±０．５８対０．７４±０．３４細胞／１腺房当たり、Ｐ＝０．００２）。対照ペプチド１８量体は、老齢マウスの細胞増殖に対して影響を示さなかった（図３Ｇ、１．００±０．３９、ＤＭＳＯと比較してｐ＝０．１５６）。
【0048】
ＭＧホメオスタシスに対する影響を評価するために、マウスにＢｒｄＵを３日間腹腔内注射し、５日目に安楽死させた。ＢｒｄＵパルス標識アッセイは、２４時間から５日目まで細胞増殖が継続的に増加することを示し、ＰＤＳＰ処置した老齢マウスは、ＤＳＭＯ処置した老齢マウスよりも高い増殖を示した（図４Ａ、ＢおよびＥ、４．２９±１．１９対２．２４±０．５０、Ｐ＜０．００１）。対照的に、５日目では、ＰＤＳＰ処置した若齢マウスとＤＭＳＯ処置した若齢マウスとの間で細胞増殖に差はなかった（図４ＣおよびＤ、６．７０±１．３５対５．７８±１．８４、Ｐ＝０．２３３）。注目すべきことに、５日目では、一部のマイボーム腺上皮細胞がＢｒｄＵ染色に陽性であった（図４Ｄ）。上記の結果は、腺房前駆細胞の増殖を促進した２９量体が、マイボーム腺上皮細胞の分化を完全に遮断することを示した。
【0049】
さらに、本発明者らは、ｐ６３をマーカーとして使用して腺房前駆細胞の数を検討する４。ｐ６３発現細胞の数は、老齢マウスでは若齢マウスと比較して有意に減少した（図５ＡおよびＢ、６．５１±１．４８対１０．２１±０．９８、Ｐ＜０．００１）。２９量体は、老齢マウスのｐ６３発現細胞の数を若齢マウスと同等のレベルまで増加させた（図５Ｄ、１０．９８±２．７５）。さらに、ＤＭＳＯは、腺房前駆細胞の増大に対して効果を示さなかった（図５Ｃ、７．０６±１．９、２９量体と比較してＰ＜０．００１）。
【0050】
ＰＥＤＦペプチドはＴＢＵＴおよび脂質生成を改善する
脂質（マイバム）形成に対する２９量体の効果を評価するために、２９量体の結膜下注射を４週間まで毎週導入した。１、２、３、４および８週間の時点で、ＴＢＵＴおよびフェノールレッド綿糸涙液分泌試験を行った（図６Ａ）。２９量体により処置したマウスのＴＢＵＴは、１週目から４週目まで対照群よりも有意に長かった。差は８週間まで統計的に有意であった。涙液分泌試験は２つの群間で不変であった（図６Ｂ）。これらの結果は、ＴＢＵＴの増加が脂質層の改善によるものであったことを示唆している。
脂質（マイバム）形成に対する２９量体の効果を評価するために、２９量体の結膜下注射を４週間まで毎週導入した。１、２、３、４および８週間の時点で、ＴＢＵＴおよびフェノールレッド綿糸涙液分泌試験を行った（図６Ａ）。２９量体により処置したマウスのＴＢＵＴは、１週目から４週目まで対照群よりも有意に長かった。差は８週間まで統計的に有意であった。涙液分泌試験は２つの群間で不変であった（図６Ｂ）。これらの結果は、ＴＢＵＴの増加が脂質層の改善によるものであったことを示唆している。
【0051】
さらに、ＭＧによって分泌される脂質を検討した。ＯＲＯにより染色された眼瞼全組織標本によって、上眼瞼内のＭＧによる脂質（マイバム）生成を評価した。２９量体処置後に、ＤＭＳＯと比較して、ＭＧ腺房サイズの増加が認められた（図７Ａ、２３４７５３０±３４９８６．４対１９２１６８９±２９９３４７．１ピクセル／眼瞼、Ｐ＝０．０４８）。ＰＤＳＰ処置マウスでは、ＯＲＯにより染色された眼瞼の断面が、分化中のマイボーム腺上皮細胞の細胞質内の比較的全体的なＯＲＯ染色を示した（図７Ｂ）。
【0052】
上記の実施例は、本発明の実施形態を説明するために２９量体を使用しているが、活性を有するコアペプチドは、１４量体である。上記のように、アラニンスキャンでは１４量体内の必須残基が特定され、非必須残基では置換が許容される。ＰＤＳＰのこれらの他の変異体はまた、本発明の実施形態とともに使用され得る。
【0053】
本発明の実施形態は、限られた数の例を用いて説明されている。当業者であれば、本発明の範囲から逸脱することなく、変更および修正が可能であることを理解するであろう。したがって、本発明の範囲は、付随する特許請求の範囲によってのみ限定されるべきである。
【0054】
引用文献
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41.Cavaliere RM, Ghirardi F, Tirindelli R. Lacrimal gland removal impairs sexual behavior in mice. Front Neuroanat 2014;8:101.
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-03-21
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
１４～２９アミノ酸長を有するＰＥＤＦ由来短鎖ペプチド（ＰＤＳＰ）、または前記ＰＤＳＰの変異体を含む、マイボーム腺再生の促進、またはマイボーム腺機能不全を原因とするドライアイの治療および／または予防に使用するための医薬組成物であって、
前記ＰＤＳＰまたは前記ＰＤＳＰの変異体が、Ｓ－Ｘ－Ｘ－Ａ－Ｘ－Ｑ／Ｈ－Ｘ－Ｘ－Ｘ－Ｘ－Ｉ／Ｖ－Ｉ－Ｘ－Ｒ（配列番号５）の配列を含む
医薬組成物。
前記ＰＤＳＰまたは前記ＰＤＳＰの変異体が、Ｓ－Ｘ－Ｘ－Ａ－Ｘ－Ｑ／Ｈ－Ｘ－Ｘ－Ｘ－Ｘ－Ｉ／Ｖ－Ｉ－Ｘ－Ｒ（配列番号５）の配列を含む
医薬組成物。
【請求項2】
前記ＰＤＳＰが、ＳＬＧＡＥＱＲＴＥＳＩＩＨＲ（配列番号２）の配列を含む
請求項１に記載の医薬組成物。
請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
前記ＰＤＳＰが、ＳＬＧＡＥＱＲＴＥＳＩＩＨＲＡＬＹＹＤＬＩＳＳＰＤＩＨＧＴ（配列番号１）の配列を含む
請求項１に記載の医薬組成物。
請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項4】
前記ＰＤＳＰの変異体が、配列番号６～７５のいずれか１つの配列の配列を含む
請求項１に記載の医薬組成物。
請求項１に記載の医薬組成物。