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▶ ザ・キュレーターズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ミズーリの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024059790
(43)【公開日】2024-05-01
(54)【発明の名称】改変ＣＤ１６３遺伝子を有する病原体抵抗性動物
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20240423BHJP
A01K 67/0275 20240101ALN20240423BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20240423BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 100
A01K67/0275 ZNA
C12N5/10
【審査請求】有
【請求項の数】12
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024025140
(22)【出願日】2024-02-22
(62)【分割の表示】P 2021184502の分割
【原出願日】2016-07-22
(31)【優先権主張番号】62/202,145
(32)【優先日】2015-08-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】501305844
【氏名又は名称】ザ・キュレーターズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ミズーリ
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＣＵＲＡＴＯＲＳ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＭＩＳＳＯＵＲＩ
(74)【代理人】
【識別番号】100101454
【弁理士】
【氏名又は名称】山田 卓二
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100157956
【弁理士】
【氏名又は名称】稲井 史生
(72)【発明者】
【氏名】ランドール・エス・プラサー
(72)【発明者】
【氏名】ケビン・ディ・ウェルズ
(72)【発明者】
【氏名】クリスティン・エム・ウィットワース
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ブタ動物、子孫、または細胞においてブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス抵抗性を増加させる方法を提供する。
【解決手段】ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス抵抗性を増加させる方法は、ブタ動物、子孫、または細胞においてＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つの染色体配列を改変させることを含み、該改変は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン７における改変、ここで、改変はエクソン７におけるインフレーム欠失を含む改変、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン８における改変、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン７またはエクソン８と近接するイントロンにおける改変、およびそれらの組み合わせ、からなる群より選択される、方法である。
【選択図】図１５
【解決手段】ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス抵抗性を増加させる方法は、ブタ動物、子孫、または細胞においてＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つの染色体配列を改変させることを含み、該改変は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン７における改変、ここで、改変はエクソン７におけるインフレーム欠失を含む改変、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン８における改変、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン７またはエクソン８と近接するイントロンにおける改変、およびそれらの組み合わせ、からなる群より選択される、方法である。
【選択図】図１５
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子において少なくとも１つの改変染色体配列を含む、非ヒト動物またはその子孫または動物細胞。
【請求項2】
前記改変は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子において改変染色体配列を含まない動物、子孫、または細胞の病原体による感染に対する感受性と比べて、前記動物、子孫、または細胞の、病原体による感染に対する感受性を低減させる、請求項１に記載の動物、子孫、または細胞。
【請求項3】
前記病原体はウイルスを含む、請求項２に記載の動物、子孫、または細胞。
【請求項4】
前記ウイルスはブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）を含む、請求項３に記載の動物、子孫、または細胞。
【請求項5】
前記改変は、前記動物、子孫、または細胞の１型ＰＲＲＳＶウイルス、２型ＰＲＲＳＶ、または１型および２型ＰＲＲＳＶウイルスの両方に対する感受性を低減させる、請求項４に記載の動物、子孫、または細胞。
【請求項6】
前記改変は前記動物、子孫または細胞の、ＮＶＳＬ９７－７８９５、ＫＳ０６－７２１０９、Ｐ１２９、ＶＲ２３３２、ＣＯ９０、ＡＺ２５、ＭＬＶ－ＲｅｓＰＲＲＳ、ＫＳ６２－０６２７４、ＫＳ４８３（ＳＤ２３９８３）、ＣＯ８４、ＳＤ１３－１５、Ｌｅｌｙｓｔａｄ、０３－１０５９、０３－１０６０、ＳＤ０１－０８、４３５３ＰＺ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるＰＲＲＳＶ分離株に対する感受性を低減させる、請求項５に記載の動物、子孫、または細胞。
【請求項7】
前記動物または子孫は胚、幼若体、または成体であり、または前記細胞は胚細胞、幼若動物由来の細胞、または成体動物由来の細胞を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の動物、子孫、または細胞。
【請求項8】
前記動物または子孫は、飼育動物を含み、または前記細胞は、飼育動物由来の細胞を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の動物、子孫、または細胞。
【請求項9】
前記飼育動物は家畜動物を含む、請求項８に記載の動物、子孫、または細胞。
【請求項10】
前記家畜動物はブタ動物、ウシ動物、ヒツジ動物、ヤギ動物、ウマ動物、水牛、ラクダ、またはトリ動物からなる群より選択される、請求項９に記載の動物、子孫、または細胞。
【請求項11】
前記ウシ動物は、肉牛または乳牛を含む、請求項１０に記載の動物、子孫、または細胞。
【請求項12】
前記トリ動物は、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ホロホロ鳥、またはひな鳥を含む、請求項１０に記載の動物、子孫、または細胞。
【請求項13】
前記ウマ動物は、ウマまたはロバを含む、請求項１０に記載の動物、子孫、または細胞。
【請求項14】
前記家畜動物はウシまたはブタ動物である、請求項１０に記載の動物、子孫、または細胞。
【請求項15】
前記家畜動物はブタ動物である、請求項１４に記載の動物、子孫、または細胞。
【請求項16】
前記動物または子孫は、遺伝学的に編集された動物または子孫を含み、前記細胞は、遺伝学的に編集された細胞を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の動物、子孫、または細胞。
【請求項17】
前記動物または細胞はホーミングエンドヌクレアーゼを用いて遺伝学的に編集されている、請求項１６に記載の動物、子孫、または細胞。
【請求項18】
前記ホーミングエンドヌクレアーゼは設計されたホーミングエンドヌクレアーゼを含む、請求項１７に記載の動物、子孫、または細胞。
【請求項19】
前記ホーミングエンドヌクレアーゼは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９システム、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、リコンビナーゼ融合タンパク質、メガヌクレアーゼ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１７または１８に記載の動物、子孫、または細胞。
【請求項20】
前記動物または細胞はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて遺伝学的に編集されている、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の動物、子孫、または細胞。
【請求項21】
前記編集動物、子孫、または細胞は非編集動物と比べて、ＰＲＲＳＶに対して増加した抵抗性を呈する、請求項１６～２０のいずれか一項に記載の動物、子孫、または細胞。
【請求項22】
前記動物、子孫、または細胞は、前記改変染色体配列についてヘテロ接合性である、請求項１～２１のいずれか一項に記載の動物、子孫、または細胞。
【請求項23】
前記動物、子孫、または細胞は、前記改変染色体配列についてホモ接合性である、請求項１～２１のいずれか一項に記載の動物、子孫、または細胞。
【請求項24】
前記改変染色体配列は、前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子における挿入、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子における欠失、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の動物、子孫、または細胞。
【請求項25】
前記改変染色体配列は、前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子における欠失を含む、請求項２４に記載の動物、子孫、または細胞。
【請求項26】
前記欠失はインフレーム欠失を含む、請求項２４または２５に記載の動物、子孫、または細胞。
【請求項27】
前記改変染色体配列は、前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子における挿入を含む、請求項２４～２６のいずれか一項に記載の動物、子孫、または細胞。
【請求項28】
前記改変染色体配列は、前記改変染色体配列を欠く動物、子孫、または細胞におけるＣＤ１６３タンパク質産生または活性と比べて、ＣＤ１６３タンパク質産生または活性の低減を引き起こす、請求項１～２７のいずれか一項に記載の動物、子孫、または細胞。
【請求項29】
前記改変染色体配列により、前記動物、子孫、または細胞による実質的に機能的でないＣＤ１６３タンパク質の産生が得られる、請求項１～２８のいずれか一項に記載の動物、子孫、または細胞。
【請求項30】
前記改変染色体配列は、前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン７、前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン８、前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン７またはエクソン８と近接するイントロン、またはそれらの組み合わせにおける改変を含む、請求項１５～２９のいずれか一項に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項31】
前記改変染色体配列は、前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン７における改変を含む、請求項３０に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項32】
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン７における前記改変は欠失を含む、請求項３１に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項33】
前記欠失はエクソン７におけるインフレーム欠失を含む、請求項３２に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項34】
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン７における前記改変は挿入を含む、請求項３１～３３のいずれか一項に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項35】
前記改変染色体配列は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８；または
（ｂ）下記からなる群より選択される改変：
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の２塩基対挿入、かつ、同じアレル上での、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０２４からヌクレオチド３，１４７までの１２４塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０２４からヌクレオチド３，１４６までの１２３塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４７と３，１４８の間の１塩基対挿入；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０３０からヌクレオチド３，１５９までの１３０塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０３０からヌクレオチド３，１６１までの１３２塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド１，５２５からヌクレオチド３，０３０までの１５０６塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９の間の７塩基対挿入；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，８１８からヌクレオチド４，０９７までの１２８０塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，７２４からヌクレオチド４，０９６までの１３７３塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，４３１からヌクレオチド３，８９７までの１４６７塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの１９３０塩基対欠失であって、前記欠失配列は、ヌクレオチド４８８で始まる１２塩基対挿入で置き換えられ、ならびに、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのエクソン７におけるさらなる１２９塩基対欠失が存在する、欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド３，１７２までの２８塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド４，５３１までの１３８７塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの１３８２塩基対欠失であって、前記欠失配列は、ヌクレオチド３，１１３で始まる１１塩基対挿入で置き換えられる、欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，４４０からヌクレオチド４，１６０までの１７２０塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０１５からヌクレオチド３，４６６までの４５２塩基対欠失；
およびそれらの組み合わせ、
を含む、請求項３０～３４のいずれか一項に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８；または
（ｂ）下記からなる群より選択される改変：
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の２塩基対挿入、かつ、同じアレル上での、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０２４からヌクレオチド３，１４７までの１２４塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０２４からヌクレオチド３，１４６までの１２３塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４７と３，１４８の間の１塩基対挿入；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０３０からヌクレオチド３，１５９までの１３０塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０３０からヌクレオチド３，１６１までの１３２塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド１，５２５からヌクレオチド３，０３０までの１５０６塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９の間の７塩基対挿入；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，８１８からヌクレオチド４，０９７までの１２８０塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，７２４からヌクレオチド４，０９６までの１３７３塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，４３１からヌクレオチド３，８９７までの１４６７塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの１９３０塩基対欠失であって、前記欠失配列は、ヌクレオチド４８８で始まる１２塩基対挿入で置き換えられ、ならびに、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのエクソン７におけるさらなる１２９塩基対欠失が存在する、欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド３，１７２までの２８塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド４，５３１までの１３８７塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの１３８２塩基対欠失であって、前記欠失配列は、ヌクレオチド３，１１３で始まる１１塩基対挿入で置き換えられる、欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，４４０からヌクレオチド４，１６０までの１７２０塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０１５からヌクレオチド３，４６６までの４５２塩基対欠失；
およびそれらの組み合わせ、
を含む、請求項３０～３４のいずれか一項に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項36】
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の前記２塩基対挿入は、ジヌクレオチドＡＧの挿入を含む、請求項３５に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項37】
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４７と３，１４８の間の前記１塩基対挿入は、単一アデニン残基の挿入を含む、請求項３５に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項38】
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９の間の前記７塩基対挿入は配列ＴＡＣＴＡＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５）を含む、請求項３５に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項39】
前記動物、子孫、または細胞は、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの前記１９３０塩基対欠失を含み、前記欠失配列は、ヌクレオチド４８８で始まる１２塩基対挿入で置き換えられ、ならびに、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのエクソン７におけるさらなる１２９塩基対欠失が存在し、前記１２塩基対挿入は配列ＴＧＴＧＧＡＧＡＡＴＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６）を含む、請求項３５に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項40】
前記動物、子孫、または細胞は参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの前記１３８２塩基対欠失を含み、前記欠失配列は、ヌクレオチド３，１１３で始まる１１塩基対挿入で置き換えられ、前記１１塩基対挿入は配列ＡＧＣＣＡＧＣＧＴＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７）を含む、請求項３５に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項41】
前記欠失は、
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド１，５２５からヌクレオチド３，０３０までの前記１５０６塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの前記１９３０塩基対欠失であって、前記欠失配列は、ヌクレオチド４８８で始まる１２塩基対挿入で置き換えられ、ならびに、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのエクソン７におけるさらなる１２９塩基対欠失が存在する、欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，７２４からヌクレオチド４，０９６までの前記１３７３塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０２４からヌクレオチド３，１４６までの前記１２３塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，４３１からヌクレオチド３，８９７までの前記１４６７塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド４，５３１までの前記１３８７塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの前記１３８２塩基対欠失であって、前記欠失配列は、ヌクレオチド３，１１３で始まる１１塩基対挿入で置き換えられる、欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，４４０からヌクレオチド４，１６０までの前記１７２０塩基対欠失；
およびそれらの組み合わせ、
からなる群より選択される、エクソン７におけるインフレーム欠失を含む、請求項３５に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド１，５２５からヌクレオチド３，０３０までの前記１５０６塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの前記１９３０塩基対欠失であって、前記欠失配列は、ヌクレオチド４８８で始まる１２塩基対挿入で置き換えられ、ならびに、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのエクソン７におけるさらなる１２９塩基対欠失が存在する、欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，７２４からヌクレオチド４，０９６までの前記１３７３塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０２４からヌクレオチド３，１４６までの前記１２３塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，４３１からヌクレオチド３，８９７までの前記１４６７塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド４，５３１までの前記１３８７塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの前記１３８２塩基対欠失であって、前記欠失配列は、ヌクレオチド３，１１３で始まる１１塩基対挿入で置き換えられる、欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，４４０からヌクレオチド４，１６０までの前記１７２０塩基対欠失；
およびそれらの組み合わせ、
からなる群より選択される、エクソン７におけるインフレーム欠失を含む、請求項３５に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項42】
前記挿入または欠失は、
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の前記２塩基対挿入、かつ、同じアレルでの、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの前記３７７塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド３，１７２までの前記２８塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０１５からヌクレオチド３，４６６までの前記４５２塩基対欠失；
およびそれらの組み合わせ
からなる群より選択される、請求項３５または３６に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の前記２塩基対挿入、かつ、同じアレルでの、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの前記３７７塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド３，１７２までの前記２８塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０１５からヌクレオチド３，４６６までの前記４５２塩基対欠失；
およびそれらの組み合わせ
からなる群より選択される、請求項３５または３６に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項43】
前記動物、子孫、または細胞は、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の前記２塩基対挿入、かつ、同じアレルでの、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの前記３７７塩基対欠失を含む、請求項４２に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項44】
前記動物、子孫、または細胞は、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド３，１７２までの前記２８塩基対欠失を含む、請求項４２に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項45】
前記動物、子孫、または細胞は、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０１５からヌクレオチド３，４６６までの前記４５２塩基対欠失を含む、請求項４２に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項46】
前記動物、子孫、または細胞は、
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９の間の前記７塩基対挿入；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの前記１１塩基対欠失
を含む、請求項３５または３８に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９の間の前記７塩基対挿入；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの前記１１塩基対欠失
を含む、請求項３５または３８に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項47】
前記動物、子孫、または細胞は、
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９の間の前記７塩基対挿入；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの前記１３８２塩基対欠失であって、前記欠失配列は、ヌクレオチド３，１１３で始まる１１塩基対挿入で置き換えられる、欠失
を含む、請求項３５、３８、４０、および４１のいずれか一項に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９の間の前記７塩基対挿入；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの前記１３８２塩基対欠失であって、前記欠失配列は、ヌクレオチド３，１１３で始まる１１塩基対挿入で置き換えられる、欠失
を含む、請求項３５、３８、４０、および４１のいずれか一項に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項48】
前記動物、子孫、または細胞は、
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの前記１１塩基対欠失
を含む、請求項３５に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの前記１１塩基対欠失
を含む、請求項３５に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項49】
前記動物、子孫、または細胞は、
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の前記２塩基対挿入、かつ、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの前記３７７塩基対欠失
を含む、請求項３５、３６、４２、および４３のいずれか一項に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の前記２塩基対挿入、かつ、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの前記３７７塩基対欠失
を含む、請求項３５、３６、４２、および４３のいずれか一項に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項50】
前記動物、子孫、または細胞は、
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，８１８からヌクレオチド４，０９７までの前記１２８０塩基対欠失；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの前記１１塩基対欠失
を含む、請求項３５に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，８１８からヌクレオチド４，０９７までの前記１２８０塩基対欠失；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの前記１１塩基対欠失
を含む、請求項３５に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項51】
前記動物、子孫、または細胞は、
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，８１８からヌクレオチド４，０９７までの前記１２８０塩基対欠失；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の前記２塩基対挿入、かつ、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの前記３７７塩基対欠失
を含む、請求項３５、３６、４２、および４３のいずれか一項に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，８１８からヌクレオチド４，０９７までの前記１２８０塩基対欠失；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の前記２塩基対挿入、かつ、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの前記３７７塩基対欠失
を含む、請求項３５、３６、４２、および４３のいずれか一項に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項52】
前記動物、子孫、または細胞は、
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの前記１９３０塩基対欠失であって、前記欠失配列は、ヌクレオチド４８８で始まる１２塩基対挿入で置き換えられ、ならびに、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのエクソン７におけるさらなる１２９塩基対欠失が存在する、欠失；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の前記２塩基対挿入、かつ、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの前記３７７塩基対欠失
を含む、請求項３５、３６、３９、４１、４２、および４３のいずれか一項に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの前記１９３０塩基対欠失であって、前記欠失配列は、ヌクレオチド４８８で始まる１２塩基対挿入で置き換えられ、ならびに、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのエクソン７におけるさらなる１２９塩基対欠失が存在する、欠失；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の前記２塩基対挿入、かつ、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの前記３７７塩基対欠失
を含む、請求項３５、３６、３９、４１、４２、および４３のいずれか一項に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項53】
前記動物、子孫、または細胞は、
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの前記１９３０塩基対欠失であって、前記欠失配列は、ヌクレオチド４８８で始まる１２塩基対挿入で置き換えられ、ならびに、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのエクソン７におけるさらなる１２９塩基対欠失が存在する、欠失
を含む、請求項３５、３９、および４１のいずれか一項に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの前記１９３０塩基対欠失であって、前記欠失配列は、ヌクレオチド４８８で始まる１２塩基対挿入で置き換えられ、ならびに、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのエクソン７におけるさらなる１２９塩基対欠失が存在する、欠失
を含む、請求項３５、３９、および４１のいずれか一項に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項54】
前記動物、子孫、または細胞は、
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの前記１９３０塩基対欠失であって、前記欠失配列は、ヌクレオチド４８８で始まる１２塩基対挿入で置き換えられ、ならびに、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのエクソン７におけるさらなる１２９塩基対欠失が存在する、欠失；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの前記１１塩基対欠失
を含む、請求項３５、３９、および４１のいずれか一項に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの前記１９３０塩基対欠失であって、前記欠失配列は、ヌクレオチド４８８で始まる１２塩基対挿入で置き換えられ、ならびに、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのエクソン７におけるさらなる１２９塩基対欠失が存在する、欠失；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの前記１１塩基対欠失
を含む、請求項３５、３９、および４１のいずれか一項に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項55】
前記動物、子孫、または細胞は、
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，４３１からヌクレオチド３，８９７までの前記１４６７塩基対欠失；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の前記２塩基対挿入、かつ、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの前記３７７塩基対欠失
を含む、請求項３５、３６、および４１～４３のいずれか一項に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，４３１からヌクレオチド３，８９７までの前記１４６７塩基対欠失；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の前記２塩基対挿入、かつ、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの前記３７７塩基対欠失
を含む、請求項３５、３６、および４１～４３のいずれか一項に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項56】
前記動物、子孫、または細胞は、
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，４３１からヌクレオチド３，８９７までの前記１４６７塩基対欠失；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの前記１１塩基対欠失
を含む、請求項３５または４１に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，４３１からヌクレオチド３，８９７までの前記１４６７塩基対欠失；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの前記１１塩基対欠失
を含む、請求項３５または４１に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項57】
前記動物、子孫、または細胞は、前記挿入または欠失の外側の前記染色体配列の領域において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に対して少なくとも８０％配列同一性を有する染色体配列を含む、請求項３５～５６のいずれか一項に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項58】
前記動物、子孫、または細胞は、前記挿入または欠失の外側の前記染色体配列の領域において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に対して少なくとも８５％配列同一性を有する染色体配列を含む、請求項５７に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項59】
前記動物、子孫、または細胞は、前記挿入または欠失の外側の前記染色体配列の領域において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に対して少なくとも９０％配列同一性を有する染色体配列を含む、請求項５７に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項60】
前記動物、子孫、または細胞は、前記挿入または欠失の外側の前記染色体配列の領域において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に対して少なくとも９５％配列同一性を有する染色体配列を含む、請求項５７に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項61】
前記動物、子孫、または細胞は、前記挿入または欠失の外側の前記染色体配列の領域において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に対して少なくとも９８％配列同一性を有する染色体配列を含む、請求項５７に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項62】
前記動物、子孫、または細胞は、前記挿入または欠失の外側の前記染色体配列の領域において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に対して少なくとも９９％配列同一性を有する染色体配列を含む、請求項５７に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項63】
前記動物、子孫、または細胞は、前記挿入または欠失の外側の前記染色体配列の領域において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に対して少なくとも９９．９％配列同一性を有する染色体配列を含む、請求項５７に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項64】
前記動物、子孫、または細胞は、前記挿入または欠失の外側の前記染色体配列の領域において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に対して１００％配列同一性を有する染色体配列を含む、請求項５７に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項65】
前記動物、子孫、または細胞はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１８、または１１９を含む染色体配列を含む、請求項３５～６４のいずれか一項に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項66】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８、１０１、１０５、１０９、１１０、１１２、１１３、または１１４を含む染色体配列を含む、請求項６５に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項67】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３、１１１、または１１９を含む染色体配列を含む、請求項６５に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項68】
前記動物、子孫、または細胞は、
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、前記１１塩基対欠失；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、前記２塩基対挿入かつ前記３７７塩基対欠失
を含む、請求項３５、３６、４２、４３、５７～６５、および６７のいずれか一項に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、前記１１塩基対欠失；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、前記２塩基対挿入かつ前記３７７塩基対欠失
を含む、請求項３５、３６、４２、４３、５７～６５、および６７のいずれか一項に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項69】
前記動物、子孫、または細胞は、
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて前記１２４塩基対欠失；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて前記１２３塩基対欠失
を含む、請求項３５、４１、および５７～６６のいずれか一項に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて前記１２４塩基対欠失；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて前記１２３塩基対欠失
を含む、請求項３５、４１、および５７～６６のいずれか一項に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項70】
前記動物、子孫、または細胞は前記１塩基対挿入を含む、請求項３５、３７、および５７～６５のいずれか一項に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項71】
前記動物、子孫、または細胞は、
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて前記１３０塩基対欠失；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて前記１３２塩基対欠失
を含む、請求項３５および５７～６５のいずれか一項に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて前記１３０塩基対欠失；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて前記１３２塩基対欠失
を含む、請求項３５および５７～６５のいずれか一項に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項72】
前記動物、子孫、または細胞は前記１５０６塩基対欠失を含む、請求項３５、４１、および５７～６６のいずれか一項に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項73】
前記動物、子孫、または細胞は、前記７塩基対挿入を含む、請求項３５、３８、および５７～６５のいずれか一項に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項74】
前記動物、子孫、または細胞は、
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて前記１２８０塩基対欠失；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて前記１３７３塩基対欠失
を含む、請求項３５、４１、および５７～６６のいずれか一項に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて前記１２８０塩基対欠失；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて前記１３７３塩基対欠失
を含む、請求項３５、４１、および５７～６６のいずれか一項に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項75】
前記動物、子孫、または細胞は、前記１４６７塩基対欠失を含む、請求項３５、４１、および５７～６６のいずれか一項に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項76】
前記動物、子孫、または細胞は、ヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの１９３０塩基対イントロン６欠失、かつ、エクソン７におけるヌクレオチド４，４８８での１２塩基対挿入および追加の１２９塩基対欠失を含む、請求項３５、３９、４１、および５７～６６のいずれか一項に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項77】
前記動物、子孫、または細胞は、
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて前記２８塩基対欠失；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて前記１３８７塩基対欠失
を含む、請求項３５、４１、４２、４４、および５７～６６のいずれか一項に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて前記２８塩基対欠失；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて前記１３８７塩基対欠失
を含む、請求項３５、４１、４２、４４、および５７～６６のいずれか一項に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項78】
前記動物、子孫、または細胞は、
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、前記１３８２塩基対欠失かつ前記１１塩基対挿入；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、前記１７２０塩基対欠失
を含む、請求項３５、４０、４１、および５７～６６のいずれか一項に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、前記１３８２塩基対欠失かつ前記１１塩基対挿入；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、前記１７２０塩基対欠失
を含む、請求項３５、４０、４１、および５７～６６のいずれか一項に記載のブタ動物、子孫、または細胞。
【請求項79】
請求項１～７８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項80】
請求項１～７８のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項81】
請求項１～７８のいずれか一項に記載の子孫。
【請求項82】
前記細胞は精細胞である、請求項１～７９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項83】
前記細胞は卵細胞である、請求項１～７９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項84】
前記卵細胞は受精卵である、請求項８３に記載の細胞。
【請求項85】
前記細胞は体細胞である、請求項１～７９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項86】
前記体細胞は線維芽細胞を含む、請求項８５に記載の細胞。
【請求項87】
前記線維芽細胞は胎仔線維芽細胞を含む、請求項８６に記載の細胞。
【請求項88】
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子における改変染色体配列を卵母細胞および精細胞の少なくとも１つに導入するように、卵母細胞または精細胞を遺伝子改変させ、前記卵母細胞を前記精細胞と受精させ、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子における前記改変染色体配列を含む受精卵を作製すること；または
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子における改変染色体配列を前記受精卵に導入するように、受精卵を遺伝子改変させること；
前記受精卵を代理雌動物に移植することであって、妊娠および正期産により子孫動物が産生されること；
前記子孫動物を病原体に対する感受性についてスクリーニングすること；および
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子において改変染色体配列を含まない動物と比べて、前記病原体に対する感受性が低減した子孫動物を選択すること
を含む、病原体による感染に対する感受性が低減した動物または系統を作製するための繁殖方法。
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子における改変染色体配列を前記受精卵に導入するように、受精卵を遺伝子改変させること；
前記受精卵を代理雌動物に移植することであって、妊娠および正期産により子孫動物が産生されること；
前記子孫動物を病原体に対する感受性についてスクリーニングすること；および
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子において改変染色体配列を含まない動物と比べて、前記病原体に対する感受性が低減した子孫動物を選択すること
を含む、病原体による感染に対する感受性が低減した動物または系統を作製するための繁殖方法。
【請求項89】
前記病原体はウイルスを含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項90】
前記ウイルスはＰＲＲＳＶを含む、請求項８９に記載の方法。
【請求項91】
前記改変は１型ＰＲＲＳＶウイルス、２型ＰＲＲＳＶ、または１型および２型ＰＲＲＳＶウイルスの両方に対する感受性を低減させる、請求項９０に記載の方法。
【請求項92】
前記改変はＮＶＳＬ９７－７８９５、ＫＳ０６－７２１０９、Ｐ１２９、ＶＲ２３３２、ＣＯ９０、ＡＺ２５、ＭＬＶ－ＲｅｓＰＲＲＳ、ＫＳ６２－０６２７４、ＫＳ４８３（ＳＤ２３９８３）、ＣＯ８４、ＳＤ１３－１５、Ｌｅｌｙｓｔａｄ、０３－１０５９、０３－１０６０、ＳＤ０１－０８、４３５３ＰＺ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるＰＲＲＳＶ分離株に対する感受性を低減させる、請求項９１に記載の方法。
【請求項93】
前記動物は胚、幼若体、または成体である、請求項８８～９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項94】
前記動物は、飼育動物を含む、請求項８８～９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項95】
前記飼育動物は、家畜動物を含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項96】
前記家畜動物はブタ動物、ウシ動物、ヒツジ動物、ヤギ動物、ウマ動物、水牛、ラクダ、またはトリ動物からなる群より選択される、請求項９５に記載の方法。
【請求項97】
前記ウシ動物は、肉牛または乳牛を含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項98】
前記トリ動物は、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ホロホロ鳥、またはひな鳥を含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項99】
前記ウマ動物は、ウマまたはロバを含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項100】
前記家畜動物はウシまたはブタ動物である、請求項９６に記載の方法。
【請求項101】
前記家畜動物はブタ動物である、請求項１００に記載の方法。
【請求項102】
前記卵母細胞、精細胞、または受精卵を遺伝子改変させる工程は、前記卵母細胞、精細胞、または受精卵の遺伝的編集を含む、請求項８８～１０１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項103】
前記遺伝的編集はホーミングエンドヌクレアーゼの使用を含む、請求項１０２に記載の方法。
【請求項104】
前記ホーミングエンドヌクレアーゼは設計されたホーミングエンドヌクレアーゼを含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項105】
前記ホーミングエンドヌクレアーゼは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９システム、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、リコンビナーゼ融合タンパク質、メガヌクレアーゼ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１０３または１０４に記載の方法。
【請求項106】
前記遺伝的編集はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの使用を含む、請求項１０２～１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項107】
前記卵母細胞、精細胞、または受精卵は前記改変染色体配列についてヘテロ接合性である、請求項８８～１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項108】
前記卵母細胞、精細胞、または受精卵は前記改変染色体配列についてホモ接合性である、請求項８８～１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項109】
前記改変染色体配列は、前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子における挿入、前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子における欠失、またはそれらの組み合わせを含む、請求項８８～１０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項110】
前記改変染色体配列は、前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子における欠失を含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項111】
前記欠失はインフレーム欠失を含む、請求項１０９または１１０に記載の方法。
【請求項112】
前記改変染色体配列は、前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子における挿入を含む、請求項１０９～１１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項113】
前記改変染色体配列は、前記改変染色体配列を欠く動物におけるＣＤ１６３タンパク質産生または活性と比べて、ＣＤ１６３タンパク質産生または活性の低減を引き起こす、請求項８８～１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項114】
前記改変染色体配列により、前記動物による実質的に機能的でないＣＤ１６３タンパク質の産生という結果になる、請求項８８～１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項115】
前記改変染色体配列は、前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン７、前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン８、前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン７またはエクソン８と近接するイントロン、またはそれらの組み合わせにおける改変を含む、請求項１０１～１１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項116】
前記改変染色体配列は、前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン７における改変を含む、請求項１１５に記載の方法。
【請求項117】
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン７における前記改変は欠失を含む、請求項１１６に記載の方法。
【請求項118】
前記欠失はエクソン７におけるインフレーム欠失を含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項119】
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン７における前記改変は挿入を含む、請求項１１６～１１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項120】
前記改変染色体配列は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８；または
（ｂ）下記からなる群より選択される改変：
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の２塩基対挿入、かつ、同じアレル上での、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べてヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０２４からヌクレオチド３，１４７までの１２４塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０２４からヌクレオチド３，１４６までの１２３塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４７と３，１４８の間の１塩基対挿入；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０３０からヌクレオチド３，１５９までの１３０塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０３０からヌクレオチド３，１６１までの１３２塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド１，５２５からヌクレオチド３，０３０までの１５０６塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９の間の７塩基対挿入；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，８１８からヌクレオチド４，０９７までの１２８０塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，７２４からヌクレオチド４，０９６までの１３７３塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，４３１からヌクレオチド３，８９７までの１４６７塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの１９３０塩基対欠失であって、前記欠失配列は、ヌクレオチド４８８で始まる１２塩基対挿入で置き換えられ、ならびに、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのエクソン７におけるさらなる１２９塩基対欠失が存在する、欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド３，１７２までの２８塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド４，５３１までの１３８７塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの１３８２塩基対欠失であって、前記欠失配列は、ヌクレオチド３，１１３で始まる１１塩基対挿入で置き換えられる、欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，４４０からヌクレオチド４，１６０までの１７２０塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０１５からヌクレオチド３，４６６までの４５２塩基対欠失；
およびそれらの組み合わせ
を含む、請求項１１５～１１９のいずれか一項に記載の方法。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８；または
（ｂ）下記からなる群より選択される改変：
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の２塩基対挿入、かつ、同じアレル上での、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べてヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０２４からヌクレオチド３，１４７までの１２４塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０２４からヌクレオチド３，１４６までの１２３塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４７と３，１４８の間の１塩基対挿入；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０３０からヌクレオチド３，１５９までの１３０塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０３０からヌクレオチド３，１６１までの１３２塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド１，５２５からヌクレオチド３，０３０までの１５０６塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９の間の７塩基対挿入；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，８１８からヌクレオチド４，０９７までの１２８０塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，７２４からヌクレオチド４，０９６までの１３７３塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，４３１からヌクレオチド３，８９７までの１４６７塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの１９３０塩基対欠失であって、前記欠失配列は、ヌクレオチド４８８で始まる１２塩基対挿入で置き換えられ、ならびに、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのエクソン７におけるさらなる１２９塩基対欠失が存在する、欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド３，１７２までの２８塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド４，５３１までの１３８７塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの１３８２塩基対欠失であって、前記欠失配列は、ヌクレオチド３，１１３で始まる１１塩基対挿入で置き換えられる、欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，４４０からヌクレオチド４，１６０までの１７２０塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０１５からヌクレオチド３，４６６までの４５２塩基対欠失；
およびそれらの組み合わせ
を含む、請求項１１５～１１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項121】
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の前記２塩基対挿入は、ジヌクレオチドＡＧの挿入を含む、請求項１２０に記載の方法。
【請求項122】
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４７と３，１４８の間の前記１塩基対挿入は、単一アデニン残基の挿入を含む、請求項１２０に記載の方法。
【請求項123】
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９の間の前記７塩基対挿入は、配列ＴＡＣＴＡＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５）を含む、請求項１２０に記載の方法。
【請求項124】
前記改変染色体配列は、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの前記１９３０塩基対欠失を含み、前記欠失配列は、ヌクレオチド４８８で始まる１２塩基対挿入で置き換えられ、ならびに、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのエクソン７におけるさらなる１２９塩基対欠失が存在し、前記１２塩基対挿入は配列ＴＧＴＧＧＡＧＡＡＴＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６）を含む、請求項１２０に記載の方法。
【請求項125】
前記改変染色体配列は、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの前記１３８２塩基対欠失を含み、前記欠失配列は、ヌクレオチド３，１１３で始まる１１塩基対挿入で置き換えられ、前記１１塩基対挿入は配列ＡＧＣＣＡＧＣＧＴＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７）を含む、請求項１２０に記載の方法。
【請求項126】
前記欠失は、
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド１，５２５からヌクレオチド３，０３０までの前記１５０６塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの前記１９３０塩基対欠失であって、前記欠失配列は、ヌクレオチド４８８で始まる１２塩基対挿入で置き換えられ、ならびに、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのエクソン７におけるさらなる１２９塩基対欠失が存在する、欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，７２４からヌクレオチド４，０９６までの前記１３７３塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０２４からヌクレオチド３，１４６までの前記１２３塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，４３１からヌクレオチド３，８９７までの前記１４６７塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド４，５３１までの前記１３８７塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの前記１３８２塩基対欠失であって、前記欠失配列は、ヌクレオチド３，１１３で始まる１１塩基対挿入で置き換えられる、欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，４４０からヌクレオチド４，１６０までの前記１７２０塩基対欠失；
およびそれらの組み合わせ
からなる群より選択される、エクソン７におけるインフレーム欠失を含む、請求項１２０に記載の方法。
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド１，５２５からヌクレオチド３，０３０までの前記１５０６塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの前記１９３０塩基対欠失であって、前記欠失配列は、ヌクレオチド４８８で始まる１２塩基対挿入で置き換えられ、ならびに、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのエクソン７におけるさらなる１２９塩基対欠失が存在する、欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，７２４からヌクレオチド４，０９６までの前記１３７３塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０２４からヌクレオチド３，１４６までの前記１２３塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，４３１からヌクレオチド３，８９７までの前記１４６７塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド４，５３１までの前記１３８７塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの前記１３８２塩基対欠失であって、前記欠失配列は、ヌクレオチド３，１１３で始まる１１塩基対挿入で置き換えられる、欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，４４０からヌクレオチド４，１６０までの前記１７２０塩基対欠失；
およびそれらの組み合わせ
からなる群より選択される、エクソン７におけるインフレーム欠失を含む、請求項１２０に記載の方法。
【請求項127】
前記挿入または欠失は、
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の前記２塩基対挿入、かつ、同じアレルでの、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの前記３７７塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド３，１７２までの前記２８塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０１５からヌクレオチド３，４６６までの前記４５２塩基対欠失；
およびそれらの組み合わせ
からなる群より選択される、請求項１２０または１２１に記載の方法。
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の前記２塩基対挿入、かつ、同じアレルでの、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの前記３７７塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド３，１７２までの前記２８塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０１５からヌクレオチド３，４６６までの前記４５２塩基対欠失；
およびそれらの組み合わせ
からなる群より選択される、請求項１２０または１２１に記載の方法。
【請求項128】
前記改変染色体配列は、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の前記２塩基対挿入、かつ、同じアレルでの、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの前記３７７塩基対欠失を含む、請求項１２７に記載の方法。
【請求項129】
前記改変染色体配列は、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド３，１７２までの前記２８塩基対欠失を含む、請求項１２７に記載の方法。
【請求項130】
前記改変染色体配列は、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０１５からヌクレオチド３，４６６までの前記４５２塩基対欠失を含む、請求項１２７に記載の方法。
【請求項131】
前記改変染色体配列は、
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９の間の前記７塩基対挿入；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの前記１１塩基対欠失
を含む、請求項１２０または１２３に記載の方法。
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９の間の前記７塩基対挿入；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの前記１１塩基対欠失
を含む、請求項１２０または１２３に記載の方法。
【請求項132】
前記改変染色体配列は、
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９の間の前記７塩基対挿入；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの前記１３８２塩基対欠失であって、前記欠失配列は、ヌクレオチド３，１１３で始まる１１塩基対挿入で置き換えられる、欠失
を含む、請求項１２０、１２３、１２５、および１２６のいずれか一項に記載の方法。
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９の間の前記７塩基対挿入；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの前記１３８２塩基対欠失であって、前記欠失配列は、ヌクレオチド３，１１３で始まる１１塩基対挿入で置き換えられる、欠失
を含む、請求項１２０、１２３、１２５、および１２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項133】
前記改変染色体配列は、
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの前記１１塩基対欠失
を含む、請求項１２０に記載の方法。
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの前記１１塩基対欠失
を含む、請求項１２０に記載の方法。
【請求項134】
前記改変染色体配列は、
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の前記２塩基対挿入、かつ、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの前記３７７塩基対欠失
を含む、請求項１２０、１２１、１２７、および１２８のいずれか一項に記載の方法。
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の前記２塩基対挿入、かつ、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの前記３７７塩基対欠失
を含む、請求項１２０、１２１、１２７、および１２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項135】
前記改変染色体配列は、
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，８１８からヌクレオチド４，０９７までの前記１２８０塩基対欠失；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの前記１１塩基対欠失
を含む、請求項１２０に記載の方法。
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，８１８からヌクレオチド４，０９７までの前記１２８０塩基対欠失；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの前記１１塩基対欠失
を含む、請求項１２０に記載の方法。
【請求項136】
前記改変染色体配列は、
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，８１８からヌクレオチド４，０９７までの前記１２８０塩基対欠失；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の前記２塩基対挿入、かつ、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの前記３７７塩基対欠失
を含む、請求項１２０、１２１、１２７、および１２８のいずれか一項に記載の方法。
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，８１８からヌクレオチド４，０９７までの前記１２８０塩基対欠失；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の前記２塩基対挿入、かつ、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの前記３７７塩基対欠失
を含む、請求項１２０、１２１、１２７、および１２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項137】
前記改変染色体配列は、
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの前記１９３０塩基対欠失であって、前記欠失配列は、ヌクレオチド４８８で始まる１２塩基対挿入で置き換えられ、ならびに、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのエクソン７におけるさらなる１２９塩基対欠失が存在する、欠失；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の前記２塩基対挿入、かつ、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの前記３７７塩基対欠失
を含む、請求項１２０、１２１、１２４、および１２６～１２８のいずれか一項に記載の方法。
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの前記１９３０塩基対欠失であって、前記欠失配列は、ヌクレオチド４８８で始まる１２塩基対挿入で置き換えられ、ならびに、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのエクソン７におけるさらなる１２９塩基対欠失が存在する、欠失；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の前記２塩基対挿入、かつ、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの前記３７７塩基対欠失
を含む、請求項１２０、１２１、１２４、および１２６～１２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項138】
前記改変染色体配列は、
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの前記１９３０塩基対欠失であって、前記欠失配列は、ヌクレオチド４８８で始まる１２塩基対挿入で置き換えられ、ならびに、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのエクソン７におけるさらなる１２９塩基対欠失が存在する、欠失
を含む、請求項１２０、１２４、および１２６のいずれか一項に記載の方法。
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの前記１９３０塩基対欠失であって、前記欠失配列は、ヌクレオチド４８８で始まる１２塩基対挿入で置き換えられ、ならびに、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのエクソン７におけるさらなる１２９塩基対欠失が存在する、欠失
を含む、請求項１２０、１２４、および１２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項139】
前記改変染色体配列は、
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの前記１９３０塩基対欠失であって、前記欠失配列は、ヌクレオチド４８８で始まる１２塩基対挿入で置き換えられ、ならびに、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのエクソン７におけるさらなる１２９塩基対欠失が存在する、欠失；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの前記１１塩基対欠失
を含む、請求項１２０、１２４、および１２６のいずれか一項に記載の方法。
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの前記１９３０塩基対欠失であって、前記欠失配列は、ヌクレオチド４８８で始まる１２塩基対挿入で置き換えられ、ならびに、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのエクソン７におけるさらなる１２９塩基対欠失が存在する、欠失；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの前記１１塩基対欠失
を含む、請求項１２０、１２４、および１２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項140】
前記改変染色体配列は、
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，４３１からヌクレオチド３，８９７までの前記１４６７塩基対欠失；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の前記２塩基対挿入、かつ、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの前記３７７塩基対欠失
を含む、請求項１２０、１２１、および１２６～１２８のいずれか一項に記載の方法。
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，４３１からヌクレオチド３，８９７までの前記１４６７塩基対欠失；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の前記２塩基対挿入、かつ、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの前記３７７塩基対欠失
を含む、請求項１２０、１２１、および１２６～１２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項141】
前記改変染色体配列は、
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，４３１からヌクレオチド３，８９７までの前記１４６７塩基対欠失；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの前記１１塩基対欠失
を含む、請求項１２０または１２６に記載の方法。
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，４３１からヌクレオチド３，８９７までの前記１４６７塩基対欠失；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの前記１１塩基対欠失
を含む、請求項１２０または１２６に記載の方法。
【請求項142】
前記改変染色体配列は、前記挿入または欠失の外側の前記染色体配列の領域において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に対して少なくとも８０％配列同一性を有する染色体配列を含む、請求項１２０～１４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項143】
前記改変染色体配列は、前記挿入または欠失の外側の前記染色体配列の領域において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に対して少なくとも８５％配列同一性を有する染色体配列を含む、請求項１４２に記載の方法。
【請求項144】
前記改変染色体配列は、前記挿入または欠失の外側の前記染色体配列の領域において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に対して少なくとも９０％配列同一性を有する染色体配列を含む、請求項１４２に記載の方法。
【請求項145】
前記改変染色体配列は、前記挿入または欠失の外側の前記染色体配列の領域において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に対して少なくとも９５％配列同一性を有する染色体配列を含む、請求項１４２に記載の方法。
【請求項146】
前記改変染色体配列は、前記挿入または欠失の外側の前記染色体配列の領域において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に対して少なくとも９８％配列同一性を有する染色体配列を含む、請求項１４２に記載の方法。
【請求項147】
前記改変染色体配列は、前記挿入または欠失の外側の前記染色体配列の領域において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に対して少なくとも９９％配列同一性を有する染色体配列を含む、請求項１４２に記載の方法。
【請求項148】
前記改変染色体配列は、前記挿入または欠失の外側の前記染色体配列の領域において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に対して少なくとも９９．９％配列同一性を有する染色体配列を含む、請求項１４２に記載の方法。
【請求項149】
前記改変染色体配列は、前記挿入または欠失の外側の前記染色体配列の領域において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に対して１００％配列同一性を有する染色体配列を含む、請求項１４２に記載の方法。
【請求項150】
前記改変染色体配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１８、または１１９を含む染色体配列を含む、請求項１２０～１４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項151】
前記改変染色体配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８、１０１、１０５、１０９、１１０、１１２、１１３、または１１４を含む染色体配列を含む、請求項１５０に記載の方法。
【請求項152】
前記改変染色体配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３、１１１、または１１９を含む染色体配列を含む、請求項１５０に記載の方法。
【請求項153】
前記改変染色体配列は、
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて前記１１塩基対欠失；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて前記２塩基対挿入かつ前記３７７塩基対欠失
を含む、請求項１２０、１２１、１２７、１２８、１４２～１５０、および１５２のいずれか一項に記載の方法。
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて前記１１塩基対欠失；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて前記２塩基対挿入かつ前記３７７塩基対欠失
を含む、請求項１２０、１２１、１２７、１２８、１４２～１５０、および１５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項154】
前記改変染色体配列は、
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて前記１２４塩基対欠失；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて前記１２３塩基対欠失
を含む、請求項１２０、１２６、および１４２～１５１のいずれか一項に記載の方法。
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて前記１２４塩基対欠失；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて前記１２３塩基対欠失
を含む、請求項１２０、１２６、および１４２～１５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項155】
前記改変染色体配列は、前記１塩基対挿入を含む、請求項１２０、１２２、および１４２～１５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項156】
前記改変染色体配列は、
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて前記１３０塩基対欠失；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて前記１３２塩基対欠失
を含む、請求項１２０および１４２～１５０のいずれか一項に記載の方法。
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて前記１３０塩基対欠失；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて前記１３２塩基対欠失
を含む、請求項１２０および１４２～１５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項157】
前記改変染色体配列は、前記１５０６塩基対欠失を含む、請求項１２０、１２６、および１４２～１５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項158】
前記改変染色体配列は、前記７塩基対挿入を含む、請求項１２０、１２３、および１４２～１５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項159】
前記改変染色体配列は、
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて前記１２８０塩基対欠失；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて前記１３７３塩基対欠失
を含む、請求項１２０、１２６、および１４２～１５１のいずれか一項に記載の方法。
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて前記１２８０塩基対欠失；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて前記１３７３塩基対欠失
を含む、請求項１２０、１２６、および１４２～１５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項160】
前記改変染色体配列は、前記１４６７塩基対欠失を含む、請求項１２０、１２６、および１４２～１５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項161】
前記改変染色体配列は、ヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの前記１９３０塩基対イントロン６欠失、かつ、エクソン７におけるヌクレオチド４，４８８での１２塩基対挿入および追加の１２９塩基対欠失を含む、請求項１２０、１２４、１２６、および１４２～１５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項162】
前記改変染色体配列は、
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて前記２８塩基対欠失；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて前記１３８７塩基対欠失
を含む、請求項１２０、１２６、１２７、１２９、および１４２～１５１のいずれか一項に記載の方法。
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて前記２８塩基対欠失；および
前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて前記１３８７塩基対欠失
を含む、請求項１２０、１２６、１２７、１２９、および１４２～１５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項163】
前記改変染色体配列は、前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて前記１３８２塩基対欠失、かつ前記１１塩基対挿入、および前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて前記１７２０塩基対欠失を含む、請求項１２０、１２５、１２６、および１４２～１５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項164】
前記選択された動物はファウンダー動物として使用される、請求項８８～１６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項165】
前記受精は人工授精を含む、請求項８８～１６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項166】
請求項８８～１６５のいずれか一項に記載の方法により作製された動物の集団。
【請求項167】
前記動物の集団は病原体による感染に抵抗性である、請求項１６６に記載の集団。
【請求項168】
前記病原体はウイルスを含む、請求項１６７に記載の集団。
【請求項169】
前記ウイルスはＰＲＲＳＶを含む、請求項１６８に記載の集団。
【請求項170】
前記ウイルスは１型ＰＲＲＳＶウイルス、２型ＰＲＲＳＶ、または１型および２型ＰＲＲＳＶウイルスの両方を含む、請求項１６９に記載の集団。
【請求項171】
前記ウイルスはＮＶＳＬ９７－７８９５、ＫＳ０６－７２１０９、Ｐ１２９、ＶＲ２３３２、ＣＯ９０、ＡＺ２５、ＭＬＶ－ＲｅｓＰＲＲＳ、ＫＳ６２－０６２７４、ＫＳ４８３（ＳＤ２３９８３）、ＣＯ８４、ＳＤ１３－１５、Ｌｅｌｙｓｔａｄ、０３－１０５９、０３－１０６０、ＳＤ０１－０８、４３５３ＰＺ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるＰＲＲＳＶ分離株を含む、請求項１７０に記載の集団。
【請求項172】
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子由来の少なくとも１つの染色体配列を遺伝学的に編集し、よって、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子において編集染色体配列を含まない家畜動物におけるＣＤ６３タンパク質産生または活性と比べて、ＣＤ１６３タンパク質産生または活性が低減されるようにすることを含む、家畜動物の病原体の感染に対する抵抗性を増加させる方法。
【請求項173】
前記家畜動物は実質的に機能的でないＣＤ１６３タンパク質を産生する、請求項１７２に記載の方法。
【請求項174】
前記方法は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする少なくとも１つの染色体配列を遺伝学的に編集し、インフレーム欠失を導入することを含む、請求項１７２に記載の方法。
【請求項175】
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７を含むヌクレオチド配列；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７の配列に対して少なくとも８０％配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、前記ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に対して少なくとも１つの置換、挿入、または欠失を含む、配列；および
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のｃＤＮＡ配列
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子。
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７の配列に対して少なくとも８０％配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、前記ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に対して少なくとも１つの置換、挿入、または欠失を含む、配列；および
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のｃＤＮＡ配列
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項176】
前記核酸分子は単離核酸分子である、請求項１７５に記載の核酸分子。
【請求項177】
前記核酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７を含むヌクレオチド配列を含む、請求項１７５または１７６に記載の核酸。
【請求項178】
前記核酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７の配列に対して少なくとも８０％配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に対して少なくとも１つの置換、挿入、または欠失を含む、請求項１７５または１７６に記載の核酸。
【請求項179】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７の配列に対して少なくとも８５％配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に対して少なくとも１つの置換、挿入、または欠失を含む、請求項１７８に記載の核酸。
【請求項180】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７の配列に対して少なくとも８７．５％配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に対して少なくとも１つの置換、挿入、または欠失を含む、請求項１７８に記載の核酸。
【請求項181】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７の配列に対して少なくとも９０％配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に対して少なくとも１つの置換、挿入、または欠失を含む、請求項１７８に記載の核酸。
【請求項182】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７の配列に対して少なくとも９５％配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に対して少なくとも１つの置換、挿入、または欠失を含む、請求項１７８に記載の核酸。
【請求項183】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７の配列に対して少なくとも９８％配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に対して少なくとも１つの置換、挿入、または欠失を含む、請求項１７８に記載の核酸。
【請求項184】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７の配列に対して少なくとも９９％配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に対して少なくとも１つの置換、挿入、または欠失を含む、請求項１７８に記載の核酸。
【請求項185】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７の配列に対して少なくとも９９．９％配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に対して少なくとも１つの置換、挿入、または欠失を含む、請求項１７８に記載の核酸。
【請求項186】
前記置換、挿入、または欠失は、前記置換、挿入、または欠失を含まない核酸と比べて、ＣＤ１６３タンパク質産生または活性を低減させ、または排除する、請求項１７５、１７６、および１７８～１８５のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項187】
前記核酸はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１８、または１１９を含む、請求項１７５、１７６、１７８、または１８６に記載の核酸。
【請求項188】
前記核酸はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８、１０１、１０５、１０９、１１０、１１２、１１３、または１１４を含む、請求項１８７に記載の核酸。
【請求項189】
前記核酸はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３、１１１、１１９を含む、請求項１８７に記載の核酸。
【請求項190】
前記核酸はｃＤＮＡを含む、請求項１７５または１７６に記載の単離核酸。
【請求項191】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１８、１１９を含む核酸。
【請求項192】
前記核酸は単離核酸である、請求項１９１に記載の核酸。
【請求項193】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８、１０１、１０５、１０９、１１０、１１２、１１３、または１１４を含む、請求項１９１または１９２に記載の単離核酸。
【請求項194】
前記核酸はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３、１１１、または１１９を含む、請求項１９１または１９２に記載の単離核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子において少なくとも１つの改変染色体配列を含む非ヒト動物およびその子孫に関する。発明はさらに、そのような改変染色体配列を含む動物細胞に関する。動物および細胞は、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）を含む病原体に対して増加した抵抗性を有する。動物および子孫はＣＤ１６３遺伝子の染色体改変を有し、そのため、ＰＲＲＳＶ侵入および複製が阻害され、得られた動物は、ウイルスにより引き起こされる疾患および症候群に対する抵抗性を呈する。発明はさらに、病原体抵抗性動物を作製する繁殖方法およびそのような方法を用いて作製した動物の集団に関する。発明はまた、胚の直接注入を含むＣＤ１６３の遺伝子編集のための方法およびＰＲＲＳＶなどの病原体に対して抵抗性である動物、ファウンダー動物および系統の開発に関する。
【背景技術】
【0002】
ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）は哺乳類アルテリウイルスの群（それらはまた、マウス乳酸脱水素酵素ウイルス、サル出血熱ウイルスおよびウマ動脈炎ウイルスを含む）に属する。アルテリウイルスはウイルス病原性と関連する重要な特性を共有し、それにはマクロファージ指向性および重篤な疾患および持続性感染を引き起こす能力が挙げられる。ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）の感染により引き起こされる臨床疾患症候群は米国において１９８７年に始めて報告され（Ｋｅｆｆａｂｅｒ， １９８９）、後に欧州において１９９０年に報告された（Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ ｅｔ ａｌ．， １９９１）。ＰＲＲＳＶの感染により、呼吸器疾患、例えば咳および発熱、妊娠後期中の生殖障害、および成長能力の低減という結果となる。ウイルスはまた、一生無症候性感染を維持しながら、様々な多微生物性疾患症候群相互作用に関与する（Ｒｏｗｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．， ２０１２）。
【0003】
その出現以降、ＰＲＲＳは、北米、欧州およびアジアにおいて商業ブタの最も重要な疾患となっており、オーストラリア大陸および南極大陸のみが疾患を有さない。北米だけで、ＰＲＲＳＶに伴う損失は、生産者に毎年＄６６４Ｍの負担をかけると推定される（Ｈｏｌｔｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）。２００６年には、高病原性ＰＲＲＳ（ＨＰ－ＰＲＲＳ）として知られている疾患のより重篤な形態は、中国全土でブタ集団を殺した。遺伝的多様性が、疾患を効果的に制御し、排除するのに必要とされるワクチンの開発を制限した。自然抵抗性に対する遺伝子選択が選択肢となり得るが、結果は今日まで制限されている（Ｂｏｄｄｉｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）。
【0004】
北米ウイルスと欧州ウイルスの間の分子比較により、全てのＰＲＲＳＶ分離株は２つの遺伝子型、２型または１型の１つに分類される。２つの遺伝子型はヌクレオチドレベルで約７０％同一性しか有さないが（Ｎｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９）、どちらもＣＤ１６３陽性細胞指向性を共有し、長期感染を確立し、同様の臨床徴候を生じさせる。
【0005】
ＣＤ１６３は９つのスカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）ドメインからなる１３０ｋＤａ１型膜タンパク質である（Ｆａｂｒｉｅｋ ｅｔ ａｌ．， ２００５）。ブタＣＤ１６３は、ペプチドシグナル配列をコードする１７のエクソン、続いて、９つのＳＲＣＲドメイン、２つのリンカードメイン（プロリンセリンスレオニン（ＰＳＴ）ドメインとも呼ばれ、ＳＲＣＲ６およびＳＲＣＲ９後に位置する）、および細胞質ドメイン、続いて短い細胞質側末端を含む。ＣＤ１６３の表面発現は、単球－マクロファージ系統の細胞に制限される。タンパク質は最初に、そのヘモグロビン－ハプトグロビン（ＨｂＨｐ）複合体に結合する能力のためにヒト組織において同定された（Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００１）。ＨｂＨｐ捕捉がＣＤ１６３の主機能であり、ＳＲＣＲ３に位置する（Ｍａｄｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。ＨｂＨｐ分解後にマクロファージにより放出される代謝産物は、ビリルビン、ＣＯ、および遊離鉄を含む。ＣＤ１６３の１つの重要な機能は、遊離ヘモグロビンに起因する酸化的毒性の防止である（Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００１； Ｓｏａｒｅｓ ｅｔ ａｌ．， ２００９）。
【0006】
ＣＤ１６３は、ＰＲＲＳＶに対する受容体として、Ｃａｌｖｅｒｔ ｅｔ． ａｌ． （２００７）により始めて説明された。非許容細胞株をサル、ヒト、イヌ、およびマウスを含む様々な種由来のＣＤ１６３ ｃＤＮＡでトランスフェクションすると、細胞がＰＲＲＳＶ感染に対して許容的になり得る（Ｃａｌｖｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， ２００７）。ＣＤ１６３に加えて、第２の受容体タンパク質であるＣＤ１６９（シアロアドヘシンまたはＳＩＧＬＥＣ１としても知られている）が、ビリオンの表面上の主タンパク質であるＧＰ５－マトリクス（Ｍ）ヘテロ二量体との初期相互作用の形成に関与する主ＰＲＲＳＶ受容体であると同定された（Ｄｅｌｐｕｔｔｅ ｅｔ ａｌ．， ２００２）。このモデルでは、エンドソームコンパートメント内でのＣＤ１６３とＧＰ２、３、４ヘテロ三量体の間のその後の相互作用が脱コートおよびウイルスゲノムの細胞質中への放出を媒介する（Ｖａｎ Ｂｒｅｅｄａｍ ｅｔ ａｌ．， ２０１０， Ａｌｌｅｎｄｅ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。肺胞マクロファージのＰＲＲＳＶ感染を説明する前のモデルは、ＳＩＧＬＥＣ１（ＣＤ１６９）をマクロファージの表面上の主ウイルス受容体として同定した；しかしながら、ＳＩＧＬＥＣ１－／－ブタを使用する前の研究は、野生型ブタと比べてウイルス複製において差がないことを示した（Ｐｒａｔｈｅｒ ｅｔ ａ．， ２０１３）。これらの結果は、表面ＣＤ１６９およびＣＤ１６３を欠くＰＲＲＳＶ抵抗性細胞株は、ＣＤ１６３プラスミドのトランスフェクション後にウイルス複製をサポートしたことを示す以前のインビトロ研究を支持した（Ｗｅｌｃｈ ｅｔ ａｌ．， ２０１０）。
【0007】
ＰＲＲＳＶ病原性（とりわけ、分子レベルでの）および動物流行病学の両方の多くの特性の理解は不十分であり、よって、制御努力は困難なものとなっている。現在のところ、生産者はしばしば、ブタに改変－生弱毒株または不活化ウイルスワクチンを用いてＰＲＲＳＶのワクチン接種をし、しかしながら、現在のワクチンはしばしば、満足のいく保護を提供しない。これは、株変動および免疫系の不十分な刺激の両方によるものである。入手可能なＰＲＲＳＶワクチンの効力についての懸念に加えて、現在のところ使用される改変－生ワクチンは個々のブタおよびブタの群れにおいて存続することができ、ブタの実験感染後の病原性フィールド分離株で証明されるように（Ｒｏｗｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ２５９：２６２－２６６ （１９９９））、突然変異が累積され得る強力な証拠が存在する（Ｍｅｎｇｅｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｖｅｔ． Ｒｅｓ， ６０（３）： ３３４-３４０ （１９９９））。さらに、ワクチンウイルスはワクチン接種された雄豚の精液中に排出されることが示されている（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ－Ｈｅｎｎｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｖｅｔ． Ｒｅｓ， ５８（１）： ４０－４５ （１９９７））。ワクチン接種の代わりとして、専門家の中には、繁殖群における「試験および除去」戦略を提唱するものもいる（Ｄｅｅ ａｎｄ Ｍｏｌｉｔｏｒ， Ｖｅｔ． Ｒｅｃ．， １４３：４７４－４７６ （１９９８））。この戦略の使用の成功は、急性的にまたは持続的にＰＲＲＳＶに感染した全てのブタの除去、続いて、ウイルスの再導入を防止するための厳密な制御に依存する。この戦略に関連する困難、および費用の多くは、持続性ＰＲＲＳＶ感染の病態形成についてわかっていることがほとんどなく、よって、持続感染ブタを同定するための信頼できる技術がないことである。
【0008】
以上のように、動物に対してＰＲＲＳＶ抵抗性を誘導する戦略の開発に対する要求が当技術分野において存在する。
【発明の概要】
【0009】
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子において少なくとも１つの改変染色体配列を含む非ヒト動物、その子孫、および動物細胞が提供される。
【0010】
病原体による感染に対する感受性が低減した動物または系統を作製するための繁殖方法もまた、提供される。方法は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子における改変染色体配列を卵母細胞および精細胞の少なくとも１つに導入するように、卵母細胞または精細胞を遺伝子改変させること、ならびに卵母細胞を精細胞と受精させ、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子において改変染色体配列を含む受精卵を作製することを含む。あるいは、方法は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子における改変染色体配列を受精卵に導入するように、受精卵を遺伝子改変させることを含む。方法は、受精卵を代理雌動物に移植すること（ここで、妊娠および正期産により子孫動物が産生される）、病原体に対する感受性について子孫動物をスクリーニングすること、ならびにＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子において改変染色体配列を含まない動物と比べて、病原体に対する感受性が低減した子孫動物を選択することをさらに含む。
【0011】
前記繁殖方法により作製された動物の集団もまた、提供される。
【0012】
家畜動物の病原体の感染に対する抵抗性を増加させる方法がさらに提供される。方法は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子由来の少なくとも１つの染色体配列を遺伝学的に編集することを含み、よって、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子において編集染色体配列を含まない家畜動物におけるＣＤ６３タンパク質産生または活性と比べて、ＣＤ１６３タンパク質産生または活性が低減される。
【0013】
本明細書で提供される、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子における染色体配列の改変は、動物、子孫、細胞、または集団（例えば、ブタ動物、子孫、細胞または集団）の病原体（例えば、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）などのウイルス）に対する感受性を低減させる。
【0014】
本明細書で提供される動物、子孫、細胞、集団、および方法のいずれにおいても、改変染色体配列により、動物、子孫、細胞、または集団による実質的に機能的でないＣＤ１６３タンパク質の産生が得られ得る。
【0015】
本明細書で提供される動物、子孫、細胞、集団、および方法のいずれにおいても、改変染色体配列は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子におけるインフレーム欠失を含むことができる。
【0016】
本明細書で提供されるブタ動物、子孫、細胞、集団、および方法のいずれにおいても、改変染色体配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８を含むことができる。あるいは、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子における染色体配列の改変は下記を含むことができる：参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の２塩基対挿入、かつ、同じアレル上での、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べてヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０２４からヌクレオチド３，１４７までの１２４塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０２４からヌクレオチド３，１４６までの１２３塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４７とヌクレオチド３，１４８の間の１塩基対挿入；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０３０からヌクレオチド３，１５９までの１３０塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０３０からヌクレオチド３，１６１までの１３２塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド１，５２５からヌクレオチド３，０３０までの１５０６塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９の間の７塩基対挿入；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，８１８からヌクレオチド４，０９７までの１２８０塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，７２４からヌクレオチド４，０９６までの１３７３塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，４３１からヌクレオチド３，８９７までの１４６７塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの１９３０塩基対欠失、ここで、欠失配列は、ヌクレオチド４８８で始まる１２塩基対挿入で置き換えられ、ならびに、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのエクソン７におけるさらなる１２９塩基対欠失が存在する；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド３，１７２までの２８塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド４，５３１までの１３８７塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの１３８２塩基対欠失、ここで、欠失配列は、ヌクレオチド３，１１３で始まる１１塩基対挿入で置き換えられる；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，４４０からヌクレオチド４，１６０までの１７２０塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０１５からヌクレオチド３，４６６までの４５２塩基対欠失；またはそれらの任意の組み合わせ。
【0017】
核酸もまた、提供される。核酸分子は、下記からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む：（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７を含むヌクレオチド配列；（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７の配列に対して少なくとも８０％配列同一性を有するヌクレオチド配列、ここで、前記ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に対して少なくとも１つの置換、挿入、または欠失を含む；および（ｃ）（ａ）または（ｂ）のｃＤＮＡ配列。
【0018】
例えば、核酸分子は、下記を含むことができる：（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７の配列に対して少なくとも８７．５％配列同一性を有するヌクレオチド配列、ここで、前記ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に対して少なくとも１つの置換、挿入、または欠失を含む；または、（ｂ）（ａ）のｃＤＮＡ配列。
【0019】
さらなる核酸もまた、提供される。核酸はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１８、または１１９を含むことができる。
【0020】
核酸分子のいずれも単離核酸分子とすることができる。
【0021】
他の目的および特徴は、以下で、一部明らかになり、一部指摘されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図1】ＣＤ１６３を改変するために使用されるターゲティングベクターおよびＣＲＩＳＰＲを示す。パネルＡは、ＣＲＩＳＰＲを用いる改変のために標的とされたＣＤ１６３遺伝子の野生型エクソン７、８および９を示す。パネルＢは、ブタエクソン７（ＣＤ１６３のブタドメインＳＲＣＲ５）を、ＣＤ１６３ＬのヒトＳＲＣＲ８をコードするＤＮＡで置き換えるように設計されたターゲティングベクターを示す。このターゲティングベクターをＧ４１８による薬物選択と共にトランスフェクションにおいて使用した。ロングレンジ左腕および右腕アッセイのためのＰＣＲプライマーは、１２３０、３７５２、８７９１、７７６５および７７７５のための矢印で標識される。パネルＣは、パネルＢで示されるものと同一であるが、Ｎｅｏカセットが除去されたターゲティングベクターを示す。このターゲティングベクターは、すでにネオマイシン耐性である細胞内のＣＤ１６３を標的にするために使用された。小欠失アッセイにおいて使用されるプライマーは矢印で示され、ＧＣＤ１６３ＦおよびＧＣＤ１６３Ｒで標識される。パネルＤは、ＣＲＩＳＰＲにより標的にされるエクソンを強調する。ＣＲＩＳＰＲ１０、１３１、２５６および２８２の位置は、エクソン７上の下向き矢印により表される。ＣＲＩＳＰＲ番号はイントロン６およびエクソン７のイントロン－エクソンジャンクションからの塩基対の番号を表す。
【図2】ＣＤ１Ｄを改変するために使用されるターゲティングベクターおよびＣＲＩＳＰＲを示す。パネルＡは、ＣＲＩＳＰＲによる改変のために標的とされたＣＤ１Ｄ遺伝子の野生型エクソン３、４、５、６および７を示す。パネルＢは、エクソン３を選択可能なマーカーＮｅｏと置き換えるように設計されたターゲティングベクターを示す。このターゲティングベクターをＣＲＩＳＰＲと組み合わせて使用して、ＣＤ１Ｄを改変した。ロングレンジ左腕および右腕アッセイのためのＰＣＲプライマーは、３９９１、４３６３、７３７３および１２８０６のための矢印で標識される。パネルＣは、ＣＲＩＳＰＲにより標的にされるエクソンを示す。ＣＲＩＳＰＲ４８００、５３５０、５６２０および５６２６の位置は、エクソン３の下向き矢印により表される。小欠失アッセイにおいて使用されるプライマーは矢印で示され、ＧＣＤ１ＤＦおよびＧＣＤ１ＤＲで標識される。
【図3】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびＳＣＮＴによるＣＤ１６３およびＣＤ１Ｄノックアウトブタの作製を示す。Ａ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびドナーＤＮＡのトランスフェクション後の体細胞におけるＣＤ１６３の標的欠失。野生型（ＷＴ）遺伝子型では６５４５塩基対（ｂｐ）バンドが得られる。レーン１－６はＣＲＩＳＰＲ１０とＣａｓ９およびＮｅｏを含むドナーＤＮＡによる単一トランスフェクションからの６つの異なるコロニーを表す。レーン１、４、および５は１５００－２０００ｂｐの大きなホモ接合型欠失を示す。レーン２はより小さなホモ接合型欠失を表す。レーン３および６はＷＴアレルおよび小欠失または両方のアレルの両アレル改変のいずれかを表す。各コロニーの正確な改変は、ＳＣＮＴのために使用されたコロニーについての配列決定によってのみ決定された。レーンのいくつかにおけるかすかなＷＴバンドは、隣接ＷＴコロニーからの胎仔線維芽細胞の相互汚染を表し得る。ＮＴＣ＝ノーテンプレートコントロール。Ｂ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびドナーＤＮＡのトランスフェクション後の体細胞におけるＣＤ１Ｄの標的欠失。ＷＴ遺伝子型では８７２９ｂｐバンドが得られる。レーン１－４は、ＣＤ１Ｄの５００－２０００ｂｐ欠失を有するコロニーを表す。レーン４はＷＴコロニーであるように見える。ＮＴＣ＝ノーテンプレートコントロール。Ｃ）研究中にＳＣＮＴにより生成されたＣＤ１６３ノックアウトブタの画像。この雄子ブタはＣＤ１６３のホモ接合性１５０６ｂｐ欠失を含む。Ｄ）研究中に生成されたＣＤ１Ｄブタの画像。これらの子ブタはＣＤ１Ｄの１６５３ｂｐ欠失を含む。Ｅ）ＣＤ１６３の１５０６ｂｐ欠失を含む２つのＳＣＮＴ同腹仔の遺伝子型。レーン１－３（同腹仔６３）およびレーン１－４（同腹仔６４）は、各同腹仔由来の各子ブタについての遺伝子型を表す。雌ブタはＳＣＮＴ胚のレシピエント雌を示し、ＷＴはＷＴ対照を表す。ＮＴＣ＝ノーテンプレートコントロール。Ｆ）ＣＤ１Ｄの１６５３ｂｐ欠失を含む２つのＳＣＮＴ同腹仔の遺伝子型。レーン１－７（同腹仔１５８）およびレーン１－４（同腹仔１５９）は各子ブタについての遺伝子型を表す。
【図4】ブタ胚におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの効果を示す。Ａ）異なる濃度のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの接合体への注入後の胚盤胞形成の頻度。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの毒性は１０ｎｇ／μｌで最も低かった。Ｂ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、接合体に導入されると、胚盤胞でのｅＧＦＰの発現をうまく妨害することができる。元の倍率Ｘ４。Ｃ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて作製したｅＧＦＰ上の突然変異の型：ＷＴ遺伝子型（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）、＃１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、＃２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）、および＃３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）。
【図5】ブタ胚においてＣＤ１６３を標的にする際のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの効果を示す。Ａ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによりＣＤ１６３上で作製された突然変異の例：ＷＴ遺伝子型（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）、＃１－１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）、＃１－４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）、および＃２－２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）。ＤＮＡ配列決定により検査された胚は全て、ＣＤ１６３上で突然変異を示した（１８／１８）。ＣＲＩＳＰＲ１３１は太字で強調される。Ｂ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムにより引き起こされるホモ接合型欠失の配列読み取りデータ。画像はＣＤ１６３の２ｂｐ欠失を運搬するパネルＡからの＃１－４を表す。
【図6】２つの型のＣＲＩＳＰＲを導入した時のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの効果を示す。Ａ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を接合体として注入した胚盤胞におけるＣＤ１６３のＰＣＲ増幅。レーン１、３、６、および１２は２つの異なるＣＲＩＳＰＲ間の設計された欠失を示す。Ｂ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を接合体として注入した胚盤胞におけるＣＤ１ＤのＰＣＲ増幅。ＣＤ１Ｄはゲル電気泳動により決定すると、ＣＤ１６３と比較して（３／２３）、より低い欠失頻度を有した；レーン１、８、および１５はＣＤ１Ｄにおいて明らかな欠失を示す。Ｃ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、システムにＣＤ１６３およびｅＧＦＰを標的にする２つのＣＲＩＳＰＲが提供された場合、うまく２遺伝子を標的にした。ＣＤ１６３およびｅＧＦＰの改変が示される：ＣＤ１６３ＷＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）、ＣＤ１６３＃１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）、ＣＤ１６３＃２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）、ＣＤ１６３＃３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）、ｅＧＦＰＷＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）、ｅＧＦＰ＃１－１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）、ｅＧＦＰ＃１－２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）、ｅＧＦＰ＃２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）、およびｅＧＦＰ＃３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）。
【図7】接合体に注入されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムにより作製されたＣＤ１６３ノックアウトブタを示す。Ａ）ノックアウトブタからのＣＤ１６３のＰＣＲ増幅；同腹仔６７－２および６７－４において欠失の明らかな兆しが検出された。Ｂ）代理母と一緒のＣＤ１６３ノックアウトブタの画像。動物は全て健康であり、異常の徴候を示さない。Ｃ）ＣＤ１６３ノックアウトブタの遺伝子型。野生型（ＷＴ）配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３として示される。２匹の動物（同腹仔６７－１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）および６７－３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）から）はＣＤ１６３においてホモ接合型欠失または挿入を保有している。他の２匹の動物（同腹仔６７－２および６７－４から）はＣＤ１６３の両アレル改変を保有している：＃６７－２Ａ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）、＃６７－２Ａ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）、＃６７－４Ａ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）、および＃６７－４ａ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）。欠失は２つの異なるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを導入することにより引き起こされた。ＣＤ１６３のための接合体注入由来の動物はモザイク遺伝子型を示さなかった。
【図8】接合体に注入されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムにより作製されたＣＤ１Ｄノックアウトブタを示す。Ａ）ノックアウトブタ由来のＣＤ１ＤのＰＣＲ増幅；１６６－１はＣＤ１Ｄについてのモザイク遺伝子型を示す。１６６－２、１６６－３、および１６６－４はアンプリコンについてサイズの変化を示さないが、アンプリコンの配列決定は改変を明らかにした。ＷＴ ＦＦ＝野生型胎仔線維芽細胞。Ｂ）ロングレンジアッセイのＰＣＲ増幅は子ブタ１６６－１および１６６－２における１つのアレルの明確な欠失を示した。Ｃ）代理母と一緒のＣＤ１Ｄノックアウトブタの画像。Ｄ）ＣＤ１Ｄノックアウトブタの配列データ；ＷＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）、＃１６６－１．１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）、＃１６６－１．２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）、＃１６６－２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）、＃１６６－３．１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）、＃１６６－３．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５）、および＃１６６－４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）。エクソン３中のａｔｇ開始コドンが太字で、かつ小文字で示される。
【図9】急性ＰＲＲＳＶ感染中の臨床徴候を示す。ＣＤ１６３＋／＋（ｎ＝６）およびＣＤ１６３－／－（ｎ＝３）に対する呼吸徴候および発熱の存在についての毎日の評価に関する結果。
【図10】急性ＰＲＲＳＶ感染中の肺病理組織診断を示す。野生型およびノックアウトブタ由来の、ＨおよびＥ染色組織の代表的な顕微鏡写真。左パネルは単核細胞の浮腫および浸潤を示す。ノックアウトブタ由来の右パネルは、正常肺の肺構造を示す。
【図11】様々な遺伝子型のウイルス血症を示す。ＣＤ１６３－／－子ブタデータはＸ軸に沿って存在することに注意されたい。
【図12】ヌル、野生型および特徴づけられていないアレルブタにおける抗体産生を示す。
【図13-1】個々のブタにおけるＣＤ１６３の細胞表面発現を示す。特徴づけられていないＡ、特徴づけられていないＢ、およびＣＤ１６３＋／＋パネルにおいて右に向かって現れるラインはＣＤ１６３抗体を表し、一方、これらのパネルの左手側に向かって現れるラインは無抗体対照（バックグラウンド）である。ＣＤ１６３－／－動物では、ＣＤ１６３染色はバックグラウンド対照と重なり、特徴づけられていないアレルにおけるＣＤ１６３染色はＷＴレベルとバックグラウンドの間の大体中間であることに注意されたい（これは対数スケールであり、よって約１０％未満であることにも注意されたい）。
【図13-2】個々のブタにおけるＣＤ１６３の細胞表面発現を示す。特徴づけられていないＡ、特徴づけられていないＢ、およびＣＤ１６３＋／＋パネルにおいて右に向かって現れるラインはＣＤ１６３抗体を表し、一方、これらのパネルの左手側に向かって現れるラインは無抗体対照（バックグラウンド）である。ＣＤ１６３－／－動物では、ＣＤ１６３染色はバックグラウンド対照と重なり、特徴づけられていないアレルにおけるＣＤ１６３染色はＷＴレベルとバックグラウンドの間の大体中間であることに注意されたい（これは対数スケールであり、よって約１０％未満であることにも注意されたい）。
【図13-3】個々のブタにおけるＣＤ１６３の細胞表面発現を示す。特徴づけられていないＡ、特徴づけられていないＢ、およびＣＤ１６３＋／＋パネルにおいて右に向かって現れるラインはＣＤ１６３抗体を表し、一方、これらのパネルの左手側に向かって現れるラインは無抗体対照（バックグラウンド）である。ＣＤ１６３－／－動物では、ＣＤ１６３染色はバックグラウンド対照と重なり、特徴づけられていないアレルにおけるＣＤ１６３染色はＷＴレベルとバックグラウンドの間の大体中間であることに注意されたい（これは対数スケールであり、よって約１０％未満であることにも注意されたい）。
【図13-4】個々のブタにおけるＣＤ１６３の細胞表面発現を示す。特徴づけられていないＡ、特徴づけられていないＢ、およびＣＤ１６３＋／＋パネルにおいて右に向かって現れるラインはＣＤ１６３抗体を表し、一方、これらのパネルの左手側に向かって現れるラインは無抗体対照（バックグラウンド）である。ＣＤ１６３－／－動物では、ＣＤ１６３染色はバックグラウンド対照と重なり、特徴づけられていないアレルにおけるＣＤ１６３染色はＷＴレベルとバックグラウンドの間の大体中間であることに注意されたい（これは対数スケールであり、よって約１０％未満であることにも注意されたい）。
【図14】３匹の代表的なブタおよび無抗体対照由来の肺胞マクロファージ上のＣＤ１６９のレベルを示す（ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ１６９）。
【図15】様々な遺伝子型のウイルス血症を示す。Δ４３アミノ酸子ブタデータはＸ軸に沿って存在することに注意されたい。
【図16-1】参照配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）として使用される野生型ＣＤ１６３エクソン７－１０のゲノム配列を示す。配列はエクソン７の３０００ｂｐ上流からエクソン１０の最終塩基までを含む。下線領域は、それぞれ、エクソン７、８、９、および１０の位置を示す。
【図16-2】参照配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）として使用される野生型ＣＤ１６３エクソン７－１０のゲノム配列を示す。配列はエクソン７の３０００ｂｐ上流からエクソン１０の最終塩基までを含む。下線領域は、それぞれ、エクソン７、８、９、および１０の位置を示す。
【図17】いくつかのＣＤ１６３遺伝子改変、各改変についての予測タンパク質生成物、および、ブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）上の表面ＣＤ１６３のレベルにより測定される、各改変についての相対マクロファージ発現を示すＣＤ１６３遺伝子改変の図である。黒色領域は、イントロンを示し、白色領域は、エクソンを示す。斜線領域は、ｈＣＤ１６３Ｌ１エクソン１１模倣物、ブタエクソン７のホモログを示す。灰色領域は、ＰＧＫ Ｎｅｏコンストラクトを有する合成イントロンを示す。
【図18】ブタＣＤ１６３タンパク質および遺伝子配列の図を示す。Ａ）対応する遺伝子エクソンと共に示した、ＣＤ１６３タンパク質ＳＲＣＲ（楕円）およびＰＳＴ（四角）ドメイン。Ｂ）ブタＣＤ１６３ ＳＲＣＲ５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２０）のヒトＣＤ１６３Ｌ１ ＳＲＣＲ８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１）ホモログとの比較。
【図19-1】野生型およびＣＤ１６３改変ブタ由来のＰＡＭ上のＣＤ１６３およびＣＤ１６９の表面発現についての代表的な結果を示す。パネルＡ-Ｅは、図１７で示されるＣＤ１６３遺伝子改変についての結果を示す。ｄ７（１４６７）およびｄ７（１２８０）についてのプールデータが、パネルＤで示される。
【図19-2】野生型およびＣＤ１６３改変ブタ由来のＰＡＭ上のＣＤ１６３およびＣＤ１６９の表面発現についての代表的な結果を示す。パネルＡ-Ｅは、図１７で示されるＣＤ１６３遺伝子改変についての結果を示す。ｄ７（１４６７）およびｄ７（１２８０）についてのプールデータが、パネルＤで示される。
【図20】野生型およびＣＤ１６３改変ブタにおける血清ハプトグロビンレベルを示す。
【図21】２型ＰＲＲＳＶ分離株の感染に対する野生型およびＨＬ１１ｍ ＰＡＭの相対寛容性を示す。
【図22】ＣＤ１６３改変ブタの１型および２型ＰＲＲＳＶ分離株の感染を示す。
【図23】２型ウイルス感染させたＷＴおよびＣＤ１６３改変ブタについてのウイルス量を示す。
【発明を実施するための形態】
【0023】
ＣＤ１６３遺伝子の改変を有し、ＰＲＲＳＶおよび他の関連する呼吸器ウイルス感染に対して抵抗性である動物および遺伝子編集された動物を作製するための方法が本明細書で提供される。動物は、ＣＤ１６３遺伝子活性を不活性化する、または別様に調節する染色体改変（挿入または欠失）を有する。ＣＤ１６３は細胞中へのＰＲＲＳＶ侵入およびウイルス複製のために必要とされる。よって、ヌルＣＤ１６３動物は、曝露されると、ＰＲＲＳＶ感染に対する抵抗性を呈する。これらの動物は、遺伝子編集を利用する多くのプロトコルのいずれかを用いて作製することができる。
【0024】
遺伝子編集方法、例えばクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓシステム、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、リコンビナーゼ融合タンパク質、またはメガヌクレアーゼを使用して、細胞の染色体標的部位に特異的に結合し、二本鎖ＤＮＡ切断を引き起こし、または別様に、その中のＣＤ１６３遺伝子またはタンパク質を不活性化し、またはその活性を低減させる作用物質を、ブタ動物細胞またはブタ胚に導入することを含む、ブタ動物を作製するための方法もまた本明細書で提供される。
【0025】
ＣＤ１６３座位内の特定核酸配列の切断および／または組込みを実施することができるポリペプチドと協力しての、１つ以上の特定のＣＤ１６３座位の使用もまた、本明細書で記載される。ＣＤ１６３座位の切断および／または組込みを実施することができるポリペプチドまたはＲＮＡと協力しての、ＣＤ１６３座位の使用の例としては、ジンクフィンガータンパク質、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬドメイン、ＴＡＬＥＮ、ＲＮＡガイドＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓリコンビナーゼ、ロイシンジッパー、および当業者に知られている他のものからなる群より選択されるポリペプチドが挙げられる。特定例としては、部位特異的なＤＮＡ結合ドメインポリペプチドおよび切断ドメインポリペプチド（例えば、ヌクレアーゼ）を含むキメラ（「融合」）タンパク質、例えばジンクフィンガーポリペプチドおよびＦｏｋＩヌクレアーゼポリペプチドを含むＺＦＮタンパク質が挙げられる。ＣＤ１６３遺伝子に特異的に結合するＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドが本明細書で記載される。そのようなポリペプチドはまた、ヌクレアーゼ（切断）ドメインまたはハーフドメイン（例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼ、例えば、改変ＤＮＡ結合ドメインを有するホーミングエンドヌクレアーゼ）、および／またはリガーゼドメインを含むことができ、そのため、ポリペプチドは標的二本鎖切断を誘導し、および／または切断部位での対象となる核酸の組換えを促進することができる。ＣＤ１６３座位を標的にするＤＮＡ結合ドメインは、ＤＮＡ－切断機能ドメインとすることができる。前記ポリペプチドは、外因性核酸を宿主生物（例えば、ある動物種）のゲノム中に、１つ以上のＣＤ１６３座位で導入するために使用することができる。ＤＮＡ結合ドメインは１つ以上のジンクフィンガー（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９またはそれ以上のジンクフィンガー）を有するジンクフィンガータンパク質を含むことができ、これはＣＤ１６３遺伝子内の任意の配列に結合するように操作されている（非天然由来）。本明細書で記載されるジンクフィンガータンパク質のいずれも、標的遺伝子のコード配列内または隣接配列内（例えば、プロモーターまたは他の発現エレメント）の標的部位に結合することができる。ジンクフィンガータンパク質は、ＣＤ１６３遺伝子中の標的部位に結合することができる。
【0026】
定義
単位、接頭辞、および記号はそれらのＳＩ承認形態で表示され得る。別記されない限り、核酸は左から右へ５’から３’の向きで書かれており、アミノ酸配列は左から右へアミノからカルボキシの向きで書かれている。明細書内で列挙された数値範囲は、範囲を規定する数字を含み、規定された範囲内の各整数を含む。アミノ酸は、本明細書では、それらの一般に知られている３つの文字記号またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名委員会に推奨される１文字記号のいずれかにより、言及され得る。ヌクレオチドは、同様に、それらの一般に認められた単一文字コードにより言及され得る。別段の定めがない限り、本明細書で使用されるソフトウェア、電気、およびエレクトロニクス用語はＴｈｅ Ｎｅｗ ＩＥＥＥ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｔｅｒｍ（第５版、１９９３）において規定されると通りである。下記で規定される用語は明細書を全体として参照することによりより詳しく規定される。
単位、接頭辞、および記号はそれらのＳＩ承認形態で表示され得る。別記されない限り、核酸は左から右へ５’から３’の向きで書かれており、アミノ酸配列は左から右へアミノからカルボキシの向きで書かれている。明細書内で列挙された数値範囲は、範囲を規定する数字を含み、規定された範囲内の各整数を含む。アミノ酸は、本明細書では、それらの一般に知られている３つの文字記号またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名委員会に推奨される１文字記号のいずれかにより、言及され得る。ヌクレオチドは、同様に、それらの一般に認められた単一文字コードにより言及され得る。別段の定めがない限り、本明細書で使用されるソフトウェア、電気、およびエレクトロニクス用語はＴｈｅ Ｎｅｗ ＩＥＥＥ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｔｅｒｍ（第５版、１９９３）において規定されると通りである。下記で規定される用語は明細書を全体として参照することによりより詳しく規定される。
【0027】
当業者により理解されるように、任意の、および全ての目的のために、特に書面による明細を提供する観点から、本明細書で列挙される全ての範囲はまた、任意の、および全ての可能な部分範囲およびその部分範囲の組み合わせ、ならびにその範囲を構成する個々の値、特に整数値を包含する。列挙された範囲は、その範囲内の各特定値、整数、小数、または恒等性を含む。任意の列挙された範囲は、同じ範囲を少なくとも等しい２分の１、３分の１、４分の１、５分の１または１０分の１に分解させることを十分に記載し、可能にするものとして、容易に認識することができる。非限定的例として、本明細書で記載される各範囲は、下位３分の１、中位３分の１および上位３分の１、などに容易に分解することができる。
【0028】
本発明またはその好ましい実施形態（複数可）の要素を導入する場合、冠詞「１つの（ａ、ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」および「前記」は、１つ以上のその要素が存在することを意味することが意図される。「含む」、「含有する」および「有する」という用語は、包括的であり、列挙された要素以外の追加の要素が存在し得ることを意味することが意図される。
【0029】
「および／または」という用語はアイテムのいずれか一つ、アイテムの任意の組み合わせ、またはこの用語が関連するアイテムの全てを意味する。「１つ以上の」という句は、特にその使用の文脈で読まれると、当業者により容易に理解される。
【0030】
「結合タンパク質」は別の分子に結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合、これは、それ自体に結合することができ（ホモ二量体、ホモ三量体、などを形成する）、および／または、異なる１つまたは複数のタンパク質の１つ以上の分子に結合することができる。結合タンパク質は１を超える型の結合活性を有することができる。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合およびタンパク質結合活性を有する。
【0031】
「保存的修飾バリアント」という用語は、アミノ酸および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列については、「保存的修飾バリアント」は、アミノ酸配列の同一または保存的修飾バリアントをコードする核酸を示す。遺伝コードの縮重のために、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは全てアミノ酸アラニンをコードする。よって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、コドンは、コードされるポリペプチドを変化させずに、記載される対応するコドンのいずれかに変化させることができる。そのような核酸変異は「サイレント変異」であり、保存的修飾変異の１つの種を表す。ポリペプチドをコードする、本明細書の全ての核酸配列はまた、遺伝コードを参照することにより、核酸の全ての可能なサイレント変異を記載する。
【0032】
当業者であれば、核酸中の各コドン（下記以外：ＡＵＧ（これは通常、メチオニンに対する唯一のコドンである）；およびＵＧＧ（これは通常、トリプトファンに対する唯一のコドンである））は機能的に同一な分子を得るように改変することができることを認識するであろう。したがって、本発明のポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、各記載されるポリペプチド配列において暗黙であり、本発明の範囲内である。
【0033】
アミノ酸配列については、当業者であれば、コードされる配列において単一アミノ酸またはわずかなアミノ酸を変更する、付加する、または欠失させる、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列への個々の置換、欠失または付加は、その変更が、アミノ酸の化学的に同様のアミノ酸による置換となる場合「保存的修飾バリアント」であることを認識するであろう。よって、例えば、１～１５からなる整数の群から選択される任意の数のアミノ酸残基がそのように変更され得る。よって、例えば、１、２、３、４、５、７、または１０の変更が可能である。
【0034】
保存的修飾バリアントは典型的には、それらが由来する未改変ポリペプチド配列と同様の生物活性を提供する。例えば、基質特異性、酵素活性、またはリガンド／受容体結合は、一般に、その天然基質に対して、天然タンパク質の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％である。機能的に同様のアミノ酸を提供する保存的置換表は当技術分野でよく知られている。
【0035】
下記６つの群は各々、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：［１］アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；［２］アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；［３］アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；［４］アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；［５］イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および［６］フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ （１９８４） Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙもまた、参照されたい。
【0036】
「ＣＲＩＳＰＲ」という用語は、「クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート」を表す。「Ｃａｓ９」という用語は、「ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９」を示す。「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９」または「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム」という用語は、遺伝子操作のためのプログラム可能なヌクレアーゼシステムを示し、これは、Ｃａｓ９タンパク質、またはその誘導体、およびＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の機能を提供することができる１つ以上のノンコーディングＲＮＡおよびＣａｓ９のためのトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、個々に使用することができ、または組み合わせて「ガイドＲＮＡ」（ｇＲＮＡ）を生成することができる。ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡはゲノム標的に相補的である配列を提供する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムはさらに以下で記載される。
【0037】
ヌクレオチドｘからヌクレオチドｙまでのヌクレオチド配列における欠失への本明細書での言及は、ｘおよびｙを含むその範囲内のヌクレオチド全てが欠失されたことを意味する。よって、例えば、「ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対欠失」という句は、ヌクレオチド３，３１７および３，１４７を含む、ヌクレオチド３，３１７から３，１４７までの各々が欠失されたことを意味する。
【0038】
「耐病性」は、動物の特徴であり、この場合、動物は動物－病原体相互作用、例えばブタ動物とＰＲＲＳＶの間の相互作用の結果である疾患症状を回避する。すなわち、病原体は動物疾患および関連する疾患症状を引き起こさないように防止され、またはその代わりに、臨床徴候の発生率および／または重症度の低減または臨床症状の低減となる。当業者であれば、本明細書で開示される組成物および方法は、動物を病原体攻撃から保護するために当技術分野で使用可能な他の組成物および方法と共に使用することができることが認識されるであろう。
【0039】
特定核酸についての「コードする」または「コードされた」により、特定タンパク質への翻訳のための情報を含むことが意味される。タンパク質をコードする核酸は、核酸の翻訳領域内に介在配列（例えば、イントロン）を含む場合があり、または、そのような介在非翻訳配列を欠く場合がある（例えば、ｃＤＮＡなどの場合）。タンパク質をコードする情報は、コドンの使用により特定される。典型的には、アミノ酸配列は、「普遍的」遺伝コードを用いて核酸によりコードされる。核酸が合成的に調製され、または変更される場合、核酸が発現される意図された宿主の公知のコドン選択が利用できる。
【0040】
本明細書では、「遺伝子編集」、「遺伝子編集された」「遺伝学的に編集された」および「遺伝子編集エフェクター」は、天然由来または人工的に操作されたヌクレアーゼ（「分子バサミ」、「ホーミングエンドヌクレアーゼ」、または「ターゲティングエンドヌクレアーゼ」とも呼ばれる）を用いたホーミング技術の使用を示す。ヌクレアーゼはゲノム内の所望の位置で特定の二本鎖染色体切断（ＤＳＢ）を生成し、これは、場合によっては、細胞の内在性メカニズムを利用して、誘導された切断を相同組換え（ＨＲ）および／または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の天然プロセスにより修復する。遺伝子編集エフェクターとしては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート／ＣＡＳ９（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）システム、およびメガヌクレアーゼ（例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼとして再設計されたメガヌクレアーゼ）が挙げられる。それらの用語はまた遺伝子導入手順および技術の使用を含み、例えば、変更が欠失またはかなり小さな挿入（典型的には２０ｎｔ未満）である、および／または外来種からのＤＮＡを導入しない場合が挙げられる。その用語はまた子孫動物、例えば最初の遺伝子編集された動物からの性的交配または無性繁殖により作製されたものを包含する。
【0041】
本明細書では、核酸に関する「異種性」は、外来種を起源とする、または、同じ種由来の場合、計画的ヒト介入による、組成および／またはゲノム座位においてその天然形態から実質的に改変されている核酸である。例えば、異種性構造遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターは、構造遺伝子が由来するものとは異なる種由来であり、または、同じ種由来の場合、１つまたは両方が、それらの元の形態から実質的に改変されている。異種タンパク質は外来種を起源としてもよく、または、同じ種由来の場合、計画的ヒト介入により、その元の形態から実質的に改変されている。
【0042】
本明細書では「ホーミングＤＮＡ技術」、「ホーミング技術」および「ホーミングエンドヌクレアーゼ」は特定分子を特定ＤＮＡ配列に標的させる任意のメカニズムを包含し、ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、メガヌクレアーゼ、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムが挙げられる。
【0043】
「抵抗性の増加」および「感受性の低減」という用語は本明細書では、病原体による感染と関連する臨床徴候または臨床症状の発生率および／または重症度の統計的に有意な低減を意味するが、これに限定されない。例えば、「抵抗性の増加」または「感受性の低減」は、未改変染色体配列を有する対照動物と比べて、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子において少なくとも１つの改変染色体配列を含む動物における、ＰＲＲＳＶによる感染と関連する臨床徴候または臨床症状の発生率および／または重症度の統計的に有意な低減を示すことができる。「臨床症状の統計的に有意な低減」という用語は、被験体の編集群における少なくとも１つの臨床症状の発生頻度が、感染病原体による曝露後の非編集対照群よりも、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、さらにいっそう好ましくは少なくとも５０％、およびさらにいっそう好ましくは少なくとも７０％低いことを意味するが、これに限定されない。
【0044】
本明細書では、「ノックイン」という用語は、内在性遺伝子の導入遺伝子または１つまたはいくらかの構造改変を有する同じ内在性遺伝子による置き換えを意味するが、内在性遺伝子の転写制御は保持される。
【0045】
「ノックアウト」は遺伝子の構造または調節メカニズムの破壊を意味する。ノックアウトは、ターゲティングベクター、置換ベクターまたはヒットアンドランベクターの相同組換えまたはジーントラップベクターのランダム挿入により作製され得、遺伝子機能の完全、部分または条件的損失という結果となる。
【0046】
「動物」という用語は、任意の非ヒト動物、例えば、飼育動物（例えば、家畜動物）を含む。「家畜動物」という用語は、畜産農業において伝統的に飼育される任意の動物、例えばブタ動物、ウシ動物（例えば、肉牛または乳牛）、ヒツジ動物、ヤギ動物、ウマ動物（例えば、ウマまたはロバ）、水牛、ラクダ、またはトリ動物（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ホロホロ鳥、またはひな鳥）を含む。「家畜動物」という用語は、ラット、マウス、または他の齧歯類を含まない。
【0047】
本明細書では、「突然変異」という用語は、野生型配列と比較した、ポリヌクレオチド、例えば、例として遺伝子またはコードＤＮＡ配列（ＣＤＳ）のヌクレオチド配列の変更を含む。この用語は、限定はされないが、置換、挿入、フレームシフト、欠失、逆位、転座、重複、スプライスドナー部位突然変異、点突然変異などを含む。
【0048】
本明細書では「作動可能に連結された」は、２つの核酸配列、例えば、プロモーター配列と第２の配列の間の機能的連結への言及を含み、ここで、プロモーター配列は、第２の配列に対応するＤＮＡ配列の転写を開始させ、媒介する。一般に、作動可能に連結されたは、連結された核酸配列が近接しており、必要ならば、２つのタンパク質コード領域を近接して、および同じ読み枠で連結させることを意味する。
【0049】
本明細書では、「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボポリヌクレオチド、リボポリヌクレオチド、または保存的修飾バリアントへの言及を含み；この用語はまた、それらが、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、天然由来ヌクレオチドと実質的に同じヌクレオチド配列にハイブリダイズし、および／または天然由来ヌクレオチド（複数可）と同じアミノ酸（複数可）への翻訳を可能にするという点で、天然リボヌクレオチドの本質的性質を有するその類似体を示し得る。ポリヌクレオチドは天然または異種構造または調節遺伝子の全長または部分配列とすることができる。別記されない限り、その用語は、特定配列ならびにその相補的配列への言及を含む。よって、安定性または他の理由のためにバックボーン改変を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、その用語が本明細書で意図されるように「ポリヌクレオチド」である。その上、ちょうど２例挙げると、異常塩基、例えばイノシン、または修飾塩基、例えばトリチル化塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、その用語が本明細書で使用されるようにポリヌクレオチドである。当業者に知られている多くの有用な目的を果たす非常に様々な改変がＤＮＡおよびＲＮＡになされていることが認識されるであろう。
【0050】
本明細書で使用されるポリヌクレオチドという用語は、ポリヌクレオチドのそのような化学的に、酵素的にまたは代謝的に改変された形態、ならびにウイルスおよび細胞、例えば、とりわけ、単純型および複雑型細胞特有のＤＮＡおよびＲＮＡの化学形態を包含する。
【0051】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書では同じ意味で使用され、アミノ酸残基のポリマーを示す。この用語は保存的修飾バリアントおよびアミノ酸ポリマーにも適用され得、この場合、１つ以上のアミノ酸残基は、対応する天然由来アミノ酸、ならびに天然由来アミノ酸ポリマーの人工化学類似体である。天然由来アミノ酸のそのような類似体の本質的性質は、タンパク質に組み込まれると、タンパク質は、完全に天然由来アミノ酸から構成されることを以外同じタンパク質に対して誘発された抗体に特異的に反応することである。
【0052】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語もまた、修飾を含み、グリコシル化、脂質付着、硫酸化、グルタミン酸残基のγ－カルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ－リボシル化が挙げられるが、それらに限定されない。よく知られているように、および上述のように、ポリペプチドは必ずしも、完全に直線状とは限らないことが認識されるであろう。例えば、ポリペプチドはユビキチン化の結果として分枝されてもよく、それらは、一般に、天然プロセシングイベントおよび自然には起こらないヒト操作により引き起こされるイベントを含む翻訳後イベントの結果として、分枝ありまたはなしで、円形であってもよい。円形、分枝および分枝円形ポリペプチドは、その上、非翻訳天然プロセスにより、および完全合成方法により、合成され得る。さらに、この発明は、発明のタンパク質のメチオニン含有およびメチオニンなしアミノ末端バリアントの両方を企図する。
【0053】
本明細書では、「臨床徴候の発生率および／または重症度の低減」または「臨床症状の低減」は、野生型感染と比べた、一群内の感染被験体の数の低減、感染の臨床徴候を示す被験体の数の低減または排除、または１以上の被験体において存在する任意の臨床徴候の重症度の低減を意味するが、これに限定されない。例えば、これらの用語は、感染の任意の臨床徴候、肺病理、ウイルス血症、抗体産生、病原体負荷の低減、病原体排出、病原体伝播の低減、またはＰＲＲＳＶの症状である任意の臨床徴候の低減を包含する。好ましくは、これらの臨床徴候は、ＣＤ１６３遺伝子において改変を有さず、感染された被験体と比べて、発明の１つ以上の動物において、少なくとも１０％だけ低減される。より好ましくは、臨床徴候は発明の被験体において、少なくとも２０％だけ、好ましくは少なくとも３０％だけ、より好ましくは少なくとも４０％だけ、さらにいっそう好ましくは少なくとも５０％だけ低減される。
【0054】
「残基」または「アミノ酸残基」または「アミノ酸」という用語は、本明細書では同じ意味で使用され、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド（集合的に「タンパク質」）に組み込まれるアミノ酸を示す。アミノ酸は天然由来アミノ酸であってもよく、別に限定されない限り、天然由来アミノ酸と同様に機能することができる天然アミノ酸の非天然類似体を包含し得る。
【0055】
「選択的にハイブリダイズする」という用語は、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下での、一核酸配列の別の核酸配列または他の生物製剤へのハイブリダイゼーションへの言及を含む。ハイブリダイゼーションに基づく検出システムを使用する場合、参照核酸配列に相補的な核酸プローブが選択され、その後、適切な条件の選択により、プローブおよび参照配列が選択的に、互いにハイブリダイズ、または結合し、二本鎖分子が形成される。
【0056】
「ストリンジェント条件」または「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」という用語は、プローブがその標的配列に、他の配列よりも検出できるほどに大きな程度まで（例えば、バックグラウンドに対して少なくとも２倍）ハイブリダイズする条件への言及を含む。ストリンジェント条件は配列依存性であり、状況が違えば異なるであろう。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件のストリンジェンシーを制御することにより、プローブに１００％相補的な標的配列を同定することができる（相同プロービング）。
【0057】
あるいは、ストリンジェンシー条件は、配列においていくらかのミスマッチを与えるように調節することができ、そのため、より低い程度の類似性が検出される（異種プロービング）。一般に、プローブは約１０００ヌクレオチド未満の長さ、任意で５００ヌクレオチド未満の長さである。
【0058】
典型的には、ストリンジェント条件は、塩濃度はｐＨ７．０～８．３で、約１．５Ｍ未満のＮａイオン、典型的には約０．０１～１．０ＭのＮａイオン濃度（または他の塩）であり、温度はショートプローブ（例えば、１０～５０ヌクレオチド）では少なくとも約３０℃であり、ロングプローブ（例えば、５０ヌクレオチド超）では少なくとも約６０℃であるものである。ストリンジェント条件はまた、不安定化剤、例えばホルムアミドの添加により達成され得る。特異性は、典型的には、ハイブリダイゼーション後洗浄の関数であり、重要因子は、最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドでは、熱融点（Ｔｍ）は、Ｍｅｉｎｋｏｔｈ ａｎｄ Ｗａｈｌ， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １３８： ２６７－２８４ （１９８４）の式から近似させることができ：Ｔｍ［℃］＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）－０．６１（％ｆｏｒｍ）－５００／Ｌ；ここで、Ｍは一価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣは、ＤＮＡ中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドのパーセンテージであり、％ｆｏｒｍはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージであり、Ｌは塩基対で表したハイブリッドの長さである。Ｔｍは、相補的標的配列の５０％が、完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする温度である（規定されたイオン強度およびｐＨ下）。Ｔｍは各１％のミスマッチについて約１℃だけ低減され；よって、Ｔｍ、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件は、所望の同一性の配列にハイブリダイズするように調節することができる。例えば、＞９０％同一性を有する配列が求められる場合、Ｔｍは１０℃減少させることができる。一般に、ストリンジェント条件は、規定されたイオン強度およびｐＨで特定配列およびその相補体に対するＴｍより約５℃低いものとなるように選択される。しかしながら、著しいストリンジェント条件は、Ｔｍより１～４℃低いところでのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を使用することができ；中程度ストリンジェント条件はＴｍより６～１０℃低いところでのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を使用することができ；低ストリンジェンシー条件は、Ｔｍより１１～２０℃低いところでのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を使用することができる。式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成物、ならびに所望のＴｍを使用して、当業者は、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄溶液のストリンジェンシーのバリエーションが本質的に説明されることを理解するであろう。核酸のハイブリダイゼーションへの広範なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ， Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｐａｒｔ Ｉ， Ｃｈａｐｔｅｒ ２ “Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ”， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９３）；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｈａｐｔｅｒ ２， Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｄｓ．， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９５）において見出される。
【0059】
「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１つ以上のＴＡＬＥ反復ドメイン／単位を含むポリペプチドである。反復ドメインはＴＡＬＥのその同族標的ＤＮＡ配列への結合に関与する。単一「反復単位」（「リピート」とも呼ばれる）は、典型的には３３～３５アミノ酸の長さであり、天然由来ＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥ反復配列と少なくともいくらかの配列相同性を示す。ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥ結合ドメインは、例えば、天然由来ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質の認識ヘリックス領域の操作（１つ以上のアミノ酸の変更）により、あらかじめ決められたヌクレオチド配列に結合するように「操作され」得る。よって、操作ＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ）は非天然由来のタンパク質である。ＤＮＡ結合タンパク質を操作するための方法の非限定的な例は設計と選択である。設計されたＤＮＡ結合タンパク質は自然には生じないタンパク質であり、その設計／組成は、主に合理的判断基準に起因する。設計のための合理的判断基準は、置換規則および、既存のＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥ設計および結合データの情報を保存するデータベースにおける情報を処理するためのコンピュータ化アルゴリズムの適用を含む。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号；６，４５３，２４２号；および６，５３４，２６１号を参照されたい；ＷＯ９８／５３０５８号；ＷＯ９８／５３０５９号；ＷＯ９８／５３０６０号；ＷＯ０２／０１６５３６号およびＷＯ０３／０１６４９６号および米国特許公開第２０１１０３０１０７３もまた、参照されたい。
【0060】
本明細書では、「ベクター」は、宿主細胞のトランスフェクションにおいて使用することができ、ポリヌクレオチドが挿入され得る核酸への言及を含む。ベクターはしばしばレプリコンである。発現ベクターはその中に挿入された核酸の転写を可能にする。
【0061】
「野生型」は、遺伝学的に編集されておらず、または別様に遺伝子改変されていない動物およびこれに由来する胚盤胞、胚または細胞を意味し、通常、天然由来種から開発された近交系および非近交系種である。
【0062】
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、ＤＮＡに配列特異的様式で、１つ以上のジンクフィンガー（その構造が亜鉛イオンの配位により安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である）を介して結合するタンパク質、またはより大きなタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語はしばしば、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰとして省略される。
【0063】
「選択された」ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは自然には見出されないタンパク質であり、その生成は、主として、経験的プロセス、例えばファージディスプレイ、相互作用トラップまたはハイブリッド選択に起因する。例えば、米国特許第５，７８９，５３８号；米国特許第５，９２５，５２３号；米国特許第６，００７，９８８号；米国特許第６，０１３，４５３号；米国特許第６，２００，７５９号；ＷＯ９５／１９４３１号；ＷＯ９６／０６１６６号；ＷＯ９８／５３０５７号；ＷＯ９８／５４３１１号；ＷＯ００／２７８７８号；ＷＯ０１／６０９７０号ＷＯ０１／８８１９７号、ＷＯ０２／０９９０８４号および米国特許公開第２０１１０３０１０７３号を参照されたい。
【0064】
下記用語は、本発明のポリヌクレオチド／ポリペプチドと参照ポリヌクレオチド／ポリペプチドの間の配列関係を説明するために使用される：（ａ）「参照配列」、（ｂ）「比較ウィンドウ」、（ｃ）「配列同一性」、および（ｄ）「配列同一性のパーセンテージ」。
【0065】
（ａ）本明細書では、「参照配列」は本発明のポリヌクレオチド／ポリペプチドとの配列比較のための基礎として使用される規定された配列である。参照配列は特定配列のサブセットまたは全体であってもよく；例えば、全長ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列のセグメント、または完全ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列としてであってもよい。
【0066】
（ｂ）本明細書では、「比較ウィンドウ」は、ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列の近接する特定セグメントへの言及を含み、ここで、ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列は参照配列と比較され得、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド／ポリペプチド配列の一部は、２つの配列の最適アライメントのために、参照配列（付加または欠失を含まない）と比べて付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。一般に、比較ウィンドウは少なくとも２０の近接ヌクレオチド／アミノ酸残基の長さであり、任意で３０、４０、５０、１００、またはそれ以上とすることができる。当業者は、ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列中にギャップを含めたことによる参照配列への高い類似性を回避するために、ギャップペナルティが典型的に導入され、マッチ数から減算されることを理解する。
【0067】
比較のための配列のアライメントの方法は当技術分野でよく知られている。比較のための配列の最適アライメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム、Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２： ４８２（１９８１）；ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの相同性アライメントアルゴリズム、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４３ （１９７０）；ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似性探索方法、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８５： ２４４４ （１９８８）；およびこれらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行により実行され得、下記が挙げられるが、それらに限定されない：Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣａｌｉｆｏｒｎｉａによるＰＣ／ＧｅｎｅプログラムにおけるＣＬＵＳＴＡＬ；ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、ならびにＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０における関連プログラム（Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．， ９６８５ Ｓｃｒａｎｔｏｎ Ｒｏａｄ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， ＵＳＡから入手可能）。ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ， Ｇｅｎｅ ７３： ２３７－２４４ （１９８８）； Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ， ＣＡＢＩＯＳ ５： １５１－１５３ （１９８９）； Ｃｏｒｐｅｔ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６： １０８８１－９０ （１９８８）； Ｈｕａｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ８ ： １５５－６５ （１９９２）、およびＰｅａｒｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４： ３０７－３３１ （１９９４）により、十分に記載される。
【0068】
データベース類似性探索のために使用することができるプログラムのＢＬＡＳＴファミリーとしては下記が挙げられる：ヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチド問い合わせ配列のためのＢＬＡＳＴＮ；タンパク質データベース配列に対するヌクレオチド問い合わせ配列のためのＢＬＡＳＴＸ；タンパク質データベース配列に対するタンパク質問い合わせ配列のためのＢＬＡＳＴＰ；ヌクレオチドデータベース配列に対するタンパク質問い合わせ配列のためのＴＢＬＡＳＴＮ；およびヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチド問い合わせ配列のためのＴＢＬＡＳＴＸ。Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｈａｐｔｅｒ １９， Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｄｓ．， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９５）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２１５： ４０３－４１０ （１９９０）；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５： ３３８９－３４０２ （１９９７）を参照されたい。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、例えば、国立バイオテクノロジー情報センター（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を介して公的に入手可能である。このアルゴリズムは多くの刊行物において完全に説明されている。例えば、下記を参照されたい：Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ ｅｔ ａｌ．， Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：新世代のタンパク質データベースサーチプログラム、２５ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ． ３３８９ （１９９７）；国立バイオテクノロジー情報センター、ＴＨＥ ＮＣＢＩ ＨＡＮＤＢＯＯＫ ［ＩＮＴＥＲＮＥＴ］， ＣＨＡＰＴＥＲ １６：Ｔｈｅ ＢＬＡＳＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌ （ＭｃＥｎｔｙｒｅ Ｊ， Ｏｓｔｅｌｌ Ｊ， ｅｄｓ．， ２００２）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｏｏｋｓ／ＮＢＫ２１０９７／ｐｄｆ／ｃｈ１６．ｐｄｆで入手可能。アミノ酸配列のためのＢＬＡＳＴＰプログラムもまた完全に説明されている（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０９１５を参照されたい）。
【0069】
パーセント配列同一性を計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計解析を実行する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： ５８７３－５８７７ （１９９３）を参照されたい）。多くの低複雑性フィルタプログラムが、そのような低複雑性アライメントを低減させるために使用され得る。例えば、ＳＥＧ（Ｗｏｏｔｅｎ ａｎｄ Ｆｅｄｅｒｈｅｎ， Ｃｏｍｐｕｔ． Ｃｈｅｍ．， １７： １４９－１６３ （１９９３））およびＸＮＵ（Ｃｌａｖｅｒｉｅ ａｎｄ Ｓｔａｔｅｓ， Ｃｏｍｐｕｔ． Ｃｈｅｍ．， １７： １９１－２０１ （１９９３））低複雑度フィルタは単独で、または組み合わせて使用することができる。
【0070】
別記されない限り、本明細書で提供されるヌクレオチドおよびタンパク質同一性／類似性値は、デフォルト値でＧＡＰ（ＧＣＧバージョン１０）を用いて計算される。ＧＡＰ（Ｇｌｏｂａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ）はまた、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを参照配列と比較するために使用することができる。ＧＡＰは、マッチ数を最大にし、ギャップ数を最小に抑える２つの全配列のアライメントを見出すために、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４３－４５３， １９７０）を使用する。ＧＡＰは最良アライメントのファミリーの１つのメンバーを表す。このファミリーの多くのメンバーが存在し得るが、他のメンバーはより良好な特性を有さない。ＧＡＰはアライメントについての長所の４つの形態を呈する：特性、比率、同一性、および類似性。特性は配列を整列させるために最大化される計量である。比率は、より短いセグメント中の塩基の数で割った特性である。パーセント同一性は、実際にマッチする記号のパーセントである。パーセント類似性は類似する記号のパーセントである。ギャップの真向かいにある記号は無視される。一対の記号に対するスコアリング行列値が０．５０の類似性閾値以上である場合、類似性がスコア化される。Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅのバージョン１０において使用されるスコアリング行列はＢＬＯＳＵＭ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： １０９１５を参照されたい）。
【0071】
配列のマルチプルアライメントは、アライメントのＣＬＵＳＴＡＬ法（Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ （１９８９） ＣＡＢＩＯＳ． ５： １５１－１５３）を使用して、デフォルトパラメータ（ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長さペナルティ＝１０）を用いて実行することができる。ＣＬＵＳＴＡＬ法を使用するペアワイズアライメントのためのデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ１、ギャップペナルティ＝３、ウィンドウ＝５および保存対角＝５を含む。
【0072】
（ｃ）本明細書では、２つの核酸またはポリペプチド配列との関連での「配列同一性」または「同一性」は、特定比較ウィンドウにわたって最大対応のために整列させた場合に同じである２つの配列内の残基への言及を含む。配列同一性のパーセンテージが、タンパク質に関して使用される場合、同一でない残基位置はしばしば、保存的アミノ酸置換によって異なり、この場合、アミノ酸残基は、同様の化学特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換され、よって、分子の機能特性は変化しないことが認識される。配列が保存的置換で異なる場合、パーセント配列同一性は置換の保存的性質を補正するために、上方に調整され得る。そのような保存的置換により異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言われる。この調整を行うための手段は当業者によく知られている。典型的には、これは保存的置換を全ミスマッチではなく、部分ミスマッチとしてスコア化することを含み、これにより、パーセンテージ配列同一性が増加する。よって、例えば、同一アミノ酸に１のスコアが与えられ、非保存的置換にゼロのスコアが与えられる場合、保存的置換には、ゼロと１の間のスコアが与えられる。保存的置換のスコアリングはＭｅｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒのアルゴリズム、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｓｃｉ．， ４： １１－１７ （１９８８）により計算され得、例えばプログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， ＵＳＡ）において実行される。
【0073】
（ｄ）本明細書では、「配列同一性のパーセンテージ」は２つの最適に整列された配列を比較ウィンドウにわたって比較することにより決定される値を意味し、ここで、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列の一部は２つの配列の最適アライメントのために、参照配列（付加または欠失を含まない）と比べて付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列において起こる位置の数を決定し、マッチした位置の数を得、マッチした位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、結果に１００をかけることにより計算され、配列同一性のパーセンテージが得られる。
【0074】
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子において改変染色体配列を有する動物および細胞
ＣＤ１６３は１７のエクソンを有し、タンパク質は９つのスカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）ドメインを有する細胞外領域、膜貫通セグメント、および短い細胞質側末端から構成される。いくつかの異なるバリアントは単一遺伝子の差次的スプライシングに起因する（Ｒｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９９ａ； Ｒｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９９ｂ）。このバリエーションの多くは細胞質側末端の長さにより説明される。
ＣＤ１６３は１７のエクソンを有し、タンパク質は９つのスカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）ドメインを有する細胞外領域、膜貫通セグメント、および短い細胞質側末端から構成される。いくつかの異なるバリアントは単一遺伝子の差次的スプライシングに起因する（Ｒｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９９ａ； Ｒｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９９ｂ）。このバリエーションの多くは細胞質側末端の長さにより説明される。
【0075】
ＣＤ１６３は多くの重要な機能を有し、ハプトグロビン－ヘモグロビンスカベンジャー受容体としての作用が含まれる。ヘム基は非常に毒性となり得るので、血液中の遊離ヘモグロビンの排除がＣＤ１６３の重要な機能である（Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ． ２００１）。ＣＤ１６３は、エンドサイトーシスを促進する細胞質側末端を有する。この末端の突然変異により、ハプトグロビン－ヘモグロビン複合体取込みが減少する（Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ． ２００６）。Ｃ１６３の他の機能としては、赤芽球接着（ＳＲＣＲ２）、ＴＷＥＡＫ受容体（ＳＲＣＲ１－４＆６－９）、細菌受容体（ＳＲＣＲ５）、アフリカブタウイルス受容体（Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｔｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ． ２００３）であること、および免疫－モジュレーターとしての潜在的な役割（Ｖａｎ Ｇｏｒｐ ｅｔ ａｌ． ２０１０ａにおいて記載）が挙げられる。これらの重要な機能を考慮すると、ＣＤ１６３の完全ノックアウトにより、生存可能ではなくなり、または重度に易感染性となる動物が得られるであろうと以前は考えられていた（例えば、ＰＣＴ公開第２０１２／１５８８２８号を参照されたい）。
【0076】
ＣＤ１６３はスカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）スーパーファミリーの一メンバーであり、細胞内ドメインおよび９つの細胞外ＳＲＣＲドメインから構成される。ヒトでは、ＳＲＣＲ３を介するＣＤ１６３媒介ヘモグロビン－ヘム取込みのエンドサイトーシスは、細胞を酸化ストレスから保護する（Ｓｃｈａｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００６ａ； Ｓｃｈａｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００６ｂ； Ｓｃｈａｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００６ｃ）。ＣＤ１６３はまた、アポトーシスの腫瘍壊死因子様弱誘導因子のための受容体（ＴＷＥＡＫ：ＳＲＣＲ１－４＆６－９）、病原体受容体（アフリカブタコレラウイルス；細菌：ＳＲＣＲ２）、および赤芽球結合のための受容体（ＳＲＣＲ２）として機能する。
【0077】
ＣＤ１６３は多くの異なる病原体による感染において役割を果たし、そのため、発明は、ＰＲＲＳＶ感染に対する感受性が低減した動物に限定されず、細胞中への感染または細胞におけるその後の複製および／または持続のいずれかについてＣＤ１６３に依存する、任意の病原体に対する感受性が低減した動物を含む。ＰＲＲＳＶの感染プロセスは肺胞マクロファージの表面上のヘパラン硫酸への初期結合から開始する。２０１３年以前には、その後シアロアドヘシン（ＳＩＧＬＥＣ１、ＣＤ１６９またはＳＮとも呼ばれる）への確実な結合が起こると考えられていた。ウイルスはその後、クラスリン（ｃｌａｔｈｅｒｉｎ）－媒介エンドサイトーシスによりインターナライズされる。別の分子、ＣＤ１６３がその後、エンドソームにおいてウイルスの脱コートを促進する（Ｖａｎ Ｂｒｅｅｄａｍ ｅｔ ａｌ． ２０１０ａ）。ウイルスゲノムが放出され、細胞が感染される。
【0078】
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子における少なくとも１つの改変染色体配列、例えば、挿入または欠失（「ＩＮＤＥＬ」）（動物への病原体（例えば、ＰＲＲＳＶ）による感染に対する改善された、または完全な抵抗性を与える）を含む動物およびその子孫および細胞が本明細書で記載される。出願人は、ＣＤ１６３はＰＲＲＳＶ感染における決定的遺伝子であり、ファウンダー抵抗性動物および系統を作製したことを証明した。
【0079】
本開示は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子において少なくとも１つの改変染色体配列を含む遺伝子改変動物、その子孫、または動物細胞を提供する。この発明はＳＩＧＬＥＣ１（ＣＤ１６９）遺伝子（以前、ＰＲＲＳＶ抵抗性に重大であるとみなされていた）の不活性化または編集を含まない。
【0080】
編集染色体配列は、（１）不活性化され、（２）改変され、または（３）ヌル変異となる組込み配列を含んでもよい。不活性化染色体配列は、ＰＲＲＳＶ感染に関連する時のＣＤ１６３タンパク質機能が損なわれ、低減されまたは排除されるように変更される。よって、不活性化染色体配列を含む遺伝学的に編集された動物は、「ノックアウト」または「コンディショナルノックアウト」と呼ばれ得る。同様に、組込み配列を含む遺伝学的に編集された動物は、「ノックイン」または「コンディショナルノックイン」と呼ばれ得る。さらに、改変染色体配列を含む遺伝学的に編集された動物は標的点変異（複数可）または他の改変を含むことができ、そのため、変更されたタンパク質生成物が産生される。簡単に言うと、プロセスは、胚または細胞中に、標的ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする少なくとも１つのＲＮＡ分子および、任意で、少なくとも１つのアクセサリーポリヌクレオチドを導入することを含むことができる。方法は胚または細胞をインキュベートし、ジンクフィンガーヌクレアーゼを発現させることをさらに含み、ジンクフィンガーヌクレアーゼにより標的染色体配列に導入された二本鎖切断は誤りがち非相同末端結合ＤＮＡ修復プロセスまたは相同組換えＤＮＡ修復プロセスにより修復される。標的ジンクフィンガーヌクレアーゼ技術を使用して、生殖系列発生と関連するタンパク質をコードする染色体配列を編集する方法は迅速で、正確で、かつ高効率である。
【0081】
あるいは、プロセスは、ゲノム配列を改変するためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用することを含むことができる。ゲノム配列を改変するためにＣａｓ９を使用するためには、タンパク質を細胞に直接送達させることができる。あるいは、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡを細胞に送達させることができ、またはＣａｓ９をコードするｍＲＮＡの発現を提供する遺伝子を細胞に送達させることができる。加えて、標的特異的ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを細胞に直接送達させることができ、または標的特異的ｇＲＮＡ（複数可）を細胞に送達させることができる（これらのＲＮＡは、その代わりに、これらのＲＮＡを発現するように構築された遺伝子により生成され得る）。ｃｒＲＮＡ／ｇＲＮＡの設計された標的部位の選択は当技術分野でよく知られている。ｇＲＮＡの構築およびクローニングの論考は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ｏｒｇ／ｃｒｉｓｐｒ／ｗｐ－ｃｏｎｔｅｎｔ／ｕｐｌｏａｄｓ／２０１４／０５／ＣＲＩＳＰＲ－Ｒｅａｇｅｎｔ－Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－Ｒｅｖ２０１４０５０９．ｐｄｆにおいて見出すことができる。
【0082】
少なくとも１つのＣＤ１６３座位は、部位特異的編集のための標的部位として使用することができる。部位特異的編集は、外因性核酸（例えば、対象となるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸）の挿入または核酸の座位からの欠失を含むことができる。例えば、外因性核酸の組込みおよび／またはゲノム核酸の一部の欠失は、破壊された（すなわち、ＣＤ１６３タンパク質の活性が低減された）ＣＤ１６３遺伝子が生成されるように、座位を改変することができる。
【0083】
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子において少なくとも１つの改変染色体配列を含む非ヒト動物、前記動物の子孫、および動物細胞が本明細書で提供される。
【0084】
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子において少なくとも１つの改変染色体配列を含む非ヒト動物またはその子孫または動物細胞が提供される。改変染色体配列により、動物、子孫、または細胞により実質的に機能的でないＣＤ１６３タンパク質が産生される。
【0085】
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子において少なくとも１つの改変染色体配列を含む別の非ヒト動物またはその子孫または動物細胞が提供される。改変染色体配列はＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子におけるインフレーム欠失を含む。
【0086】
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子において少なくとも１つの改変染色体配列を含むブタ動物またはその子孫またはブタ細胞が提供される。改変染色体配列は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８；または（ｂ）下記からなる群より選択される改変を含む：参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の２塩基対挿入、かつ、同じアレル上での、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べてヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０２４からヌクレオチド３，１４７までの１２４塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０２４からヌクレオチド３，１４６までの１２３塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４７とヌクレオチド３，１４８の間の１塩基対挿入；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０３０からヌクレオチド３，１５９までの１３０塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０３０からヌクレオチド３，１６１までの１３２塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド１，５２５からヌクレオチド３，０３０までの１５０６塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９の間の７塩基対挿入；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，８１８からヌクレオチド４，０９７までの１２８０塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，７２４からヌクレオチド４，０９６までの１３７３塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，４３１からヌクレオチド３，８９７までの１４６７塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの１９３０塩基対欠失、ここで、欠失配列は、ヌクレオチド４８８で始まる１２塩基対挿入で置き換えられ、ならびに、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのエクソン７におけるさらなる１２９塩基対欠失が存在する；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド３，１７２までの２８塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド４，５３１までの１３８７塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの１３８２塩基対欠失、ここで、欠失配列は、ヌクレオチド３，１１３で始まる１１塩基対挿入で置き換えられる；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，４４０からヌクレオチド４，１６０までの１７２０塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０１５からヌクレオチド３，４６６までの４５２塩基対欠失；およびそれらの組み合わせ。
【0087】
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子における染色体配列の改変により、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子において改変染色体配列を含まない動物、子孫、または細胞の病原体による感染に対する感受性と比べて、動物、子孫、または細胞の病原体（例えば、ＰＲＲＳＶなどのウイルス）による感染に対する感受性が低減する。
【0088】
例えば、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子における染色体配列の改変により、動物、子孫、または細胞の１型ＰＲＲＳＶウイルス、２型ＰＲＲＳＶ、または１型および２型ＰＲＲＳＶウイルスの両方に対する感受性が低減され得る。
【0089】
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子における染色体配列の改変により、動物、子孫または細胞の、ＮＶＳＬ９７－７８９５、ＫＳ０６－７２１０９、Ｐ１２９、ＶＲ２３３２、ＣＯ９０、ＡＺ２５、ＭＬＶ－ＲｅｓＰＲＲＳ、ＫＳ６２－０６２７４、ＫＳ４８３（ＳＤ２３９８３）、ＣＯ８４、ＳＤ１３－１５、Ｌｅｌｙｓｔａｄ、０３－１０５９、０３－１０６０、ＳＤ０１－０８、４３５３ＰＺ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるＰＲＲＳＶ分離株に対する感受性が低減され得る。
【0090】
動物または子孫は胚、幼若体、または成体とすることができる。同様に、細胞は胚細胞、幼若動物由来の細胞、または成体動物由来の細胞を含むことができる。
【0091】
動物または子孫は飼育動物を含むことができる。同様に、細胞は飼育動物由来の細胞を含むことができる。飼育動物は、家畜動物、例えばブタ動物、ウシ動物（例えば、肉牛または乳牛）、ヒツジ動物、ヤギ動物、ウマ動物（例えば、ウマまたはロバ）、水牛、ラクダ、またはトリ動物（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ホロホロ鳥、またはひな鳥）を含むことができる。家畜動物は好ましくはウシまたはブタ動物であり、最も好ましくはブタ動物である。
【0092】
動物または子孫は遺伝学的に編集された動物を含むことができる。細胞は遺伝学的に編集された細胞を含むことができる。
【0093】
動物または細胞は、ホーミングエンドヌクレアーゼを使用して遺伝学的に編集することができる。ホーミングエンドヌクレアーゼは天然由来エンドヌクレアーゼとすることができるが、好ましくは合理的に設計された、非天然由来ホーミングエンドヌクレアーゼであり、これは、エンドヌクレアーゼがＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子における染色体配列を標的にするように設計されたＤＮＡ認識配列を有する。よって、ホーミングエンドヌクレアーゼは設計されたホーミングエンドヌクレアーゼとすることができる。ホーミングエンドヌクレアーゼは、例えば、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９システム、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、リコンビナーゼ融合タンパク質、メガヌクレアーゼ、またはそれらの組み合わせを含むことができる。動物または細胞は好ましくは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて遺伝学的に編集された動物または細胞である。
【0094】
遺伝学的に編集された動物、その子孫、または遺伝学的に編集された細胞は好ましくは、非編集動物と比べて増加した、病原体（例えば、ＰＲＲＳＶなどのウイルス）に対する抵抗性を呈する。
【0095】
例えば、遺伝学的に編集された動物は、１型ＰＲＲＳＶウイルス、２型ＰＲＲＳＶ、または１型および２型ＰＲＲＳＶウイルスの両方に対する増加した抵抗性を呈することができる。
【0096】
遺伝学的に編集された動物は、ＮＶＳＬ９７－７８９５、ＫＳ０６－７２１０９、Ｐ１２９、ＶＲ２３３２、ＣＯ９０、ＡＺ２５、ＭＬＶ－ＲｅｓＰＲＲＳ、ＫＳ６２－０６２７４、ＫＳ４８３（ＳＤ２３９８３）、ＣＯ８４、ＳＤ１３－１５、Ｌｅｌｙｓｔａｄ、０３－１０５９、０３－１０６０、ＳＤ０１－０８、４３５３ＰＺ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるＰＲＲＳＶ分離株に対する増加した抵抗性を呈することができる。
【0097】
動物、子孫、または細胞は改変染色体配列についてヘテロ接合性とすることができる。あるいは、動物、子孫、または細胞は改変染色体配列についてホモ接合性とすることができる。
【0098】
動物、子孫、または細胞のいずれにおいても、改変染色体配列は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子における挿入、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子における欠失、またはそれらの組み合わせを含むことができる。例えば、改変染色体配列は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子における欠失（例えば、インフレーム欠失）を含むことができる。あるいは、改変染色体配列はＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子における挿入を含むことができる。
【0099】
挿入または欠失は、挿入または欠失を欠く動物、子孫、または細胞におけるＣＤ１６３タンパク質産生または活性と比べて、ＣＤ１６３タンパク質産生または活性を低減させることができる。
【0100】
挿入または欠失により、動物、子孫、または細胞による実質的に機能的でないＣＤ１６３タンパク質の産生という結果になり得る。「実質的に機能的でないＣＤ１６３タンパク質」により、動物、子孫、または細胞におけるＣＤ１６３タンパク質のレベルが検出不能である、または検出可能である場合、挿入または欠失を含まない動物、子孫、または細胞において観察されるレベルより少なくとも約９０％低いことが意味される。
【0101】
動物、子孫、または細胞がブタ動物、子孫、または細胞を含む場合、改変染色体配列は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン７、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン８、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン７またはエクソン８と近接するイントロン、またはそれらの組み合わせにおける改変を含むことができる。改変染色体配列は好適に、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン７における改変を含む。
【0102】
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン７における改変は、欠失（例えば、エクソン７におけるインフレーム欠失）を含むことができる。あるいは、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン７における改変は挿入を含むことができる。
【0103】
ブタ動物、子孫、または細胞のいずれにおいても、改変染色体配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８を含むことができる。あるいは、改変染色体配列は下記からなる群より選択される改変を含むことができる：参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の２塩基対挿入、かつ、同じアレル上での、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べてヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０２４からヌクレオチド３，１４７までの１２４塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０２４からヌクレオチド３，１４６までの１２３塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４７とヌクレオチド３，１４８の間の１塩基対挿入；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０３０からヌクレオチド３，１５９までの１３０塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０３０からヌクレオチド３，１６１までの１３２塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド１，５２５からヌクレオチド３，０３０までの１５０６塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９の間の７塩基対挿入；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，８１８からヌクレオチド４，０９７までの１２８０塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，７２４からヌクレオチド４，０９６までの１３７３塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，４３１からヌクレオチド３，８９７までの１４６７塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの１９３０塩基対欠失、ここで、欠失配列は、ヌクレオチド４８８で始まる１２塩基対挿入で置き換えられ、ならびに、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのエクソン７におけるさらなる１２９塩基対欠失が存在する；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド３，１７２までの２８塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド４，５３１までの１３８７塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの１３８２塩基対欠失、ここで、欠失配列は、ヌクレオチド３，１１３で始まる１１塩基対挿入で置き換えられる；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，４４０からヌクレオチド４，１６０までの１７２０塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０１５からヌクレオチド３，４６６までの４５２塩基対欠失；またはそれらの組み合わせ。
【0104】
例えば、改変は、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対欠失を含むことができる。
【0105】
改変は、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の２塩基対挿入、かつ、同じアレルでの、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対欠失を含むことができる。
【0106】
改変は、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０２４からヌクレオチド３，１４７までの１２４塩基対欠失を含むことができる。
【0107】
改変は、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０２４からヌクレオチド３，１４６までの１２３塩基対欠失を含むことができる。
【0108】
改変は、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４７と３，１４８の間の１塩基対挿入を含むことができる。
【0109】
改変は、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０３０からヌクレオチド３，１５９までの１３０塩基対欠失を含むことができる。
【0110】
改変は、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０３０からヌクレオチド３，１６１までの１３２塩基対欠失を含むことができる。
【0111】
改変は、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド１，５２５からヌクレオチド３，０３０までの１５０６塩基対欠失を含むことができる。
【0112】
改変は、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９の間の７塩基対挿入を含むことができる。
【0113】
改変は、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，８１８からヌクレオチド４，０９７までの１２８０塩基対欠失を含むことができる。
【0114】
改変は、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，７２４からヌクレオチド４，０９６までの１３７３塩基対欠失を含むことができる。
【0115】
改変は、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，４３１からヌクレオチド３，８９７までの１４６７塩基対欠失を含むことができる。
【0116】
改変は、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの１９３０塩基対欠失を含むことができ、ここで、欠失配列は、ヌクレオチド４８８で始まる１２塩基対挿入で置き換えられ、ならびに、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのエクソン７におけるさらなる１２９塩基対欠失が存在する。
【0117】
改変は、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド３，１７２までの２８塩基対欠失を含むことができる。
【0118】
改変は、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド４，５３１までの１３８７塩基対欠失を含むことができる。
【0119】
改変は、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの１３８２塩基対欠失を含むことができ、ここで、欠失配列は、ヌクレオチド３，１１３で始まる１１塩基対挿入で置き換えられる。
【0120】
改変は、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，４４０からヌクレオチド４，１６０までの１７２０塩基対欠失を含むことができる。
【0121】
改変は、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０１５からヌクレオチド３，４６６までの４５２塩基対欠失を含むことができる。
【0122】
ブタ動物、子孫、または細胞は、上記挿入および欠失の任意の組み合わせを含むことができる。
【0123】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７は野生型ブタＣＤ１６３遺伝子のエクソン７の３０００塩基対（ｂｐ）上流から開始して、この遺伝子のエクソン１０の最終塩基までの領域に対するヌクレオチド配列を提供する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７は本明細書における参照配列として使用され、図１６に示される。
【0124】
ブタ動物、子孫、または細胞が、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の２塩基対挿入を含む場合、２塩基対挿入はジヌクレオチドＡＧの挿入を含むことができる。
【0125】
ブタ動物、子孫、または細胞が、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４７と３，１４８の間の１塩基対挿入を含む場合、１塩基対挿入は、単一アデニン残基の挿入を含むことができる。
【0126】
ブタ動物、子孫、または細胞が参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９の間の７塩基対挿入を含む場合、７塩基対挿入は配列ＴＡＣＴＡＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５）を含むことができる。
【0127】
ブタ動物、子孫、または細胞が参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの１９３０塩基対欠失を含み、ここで、欠失配列は、ヌクレオチド４８８で始まる１２塩基対挿入で置き換えられ、ならびに、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのエクソン７におけるさらなる１２９塩基対欠失が存在する場合、１２塩基対挿入は配列ＴＧＴＧＧＡＧＡＡＴＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６）を含むことができる。
【0128】
ブタ動物、子孫、または細胞が参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの１３８２塩基対欠失を含み、ここで、欠失配列は、ヌクレオチド３，１１３で始まる１１塩基対挿入で置き換えられる場合、１１塩基対挿入は、配列ＡＧＣＣＡＧＣＧＴＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７）を含むことができる。
【0129】
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子における改変染色体配列が欠失を含む場合、欠失は好ましくはインフレーム欠失を含む。インフレーム欠失は、トリプレット読み枠におけるシフトを引き起こさず、よって、１つ以上のアミノ酸の内部欠失を有するが、トランケートされていないタンパク質生成物が得られる欠失である。スプライシングが正しく起こると仮定すると、エクソン内の３塩基対または複数の３塩基対の欠失により、インフレーム突然変異が得られる。
【0130】
ブタ動物および細胞について本明細書で記載される下記ＩＮＤＥＬは、インフレーム欠失となると予測され、というのも、ブタＣＤ１６３遺伝子のエクソン７内の欠失は３の倍数であるからである：参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド１，５２５からヌクレオチド３，０３０までの１５０６塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの１９３０塩基対欠失、ここで、欠失配列は、ヌクレオチド４８８で始まる１２塩基対挿入で置き換えられ、ならびに、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのエクソン７におけるさらなる１２９塩基対欠失が存在する；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，７２４からヌクレオチド４，０９６までの１３７３塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０２４からヌクレオチド３，１４６までの１２３塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，４３１からヌクレオチド３，８９７までの１４６７塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド４，５３１までの１３８７塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの１３８２塩基対欠失、ここで、欠失配列は、ヌクレオチド３，１１３で始まる１１塩基対挿入で置き換えられる；および、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，４４０からヌクレオチド４，１６０までの１７２０塩基対欠失。
【0131】
したがって、ブタ動物、子孫、および細胞において、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子における挿入または欠失は、下記からなる群より選択されるエクソン７におけるインフレーム欠失を含むことができる：参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド１，５２５からヌクレオチド３，０３０までの１５０６塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの１９３０塩基対欠失、ここで、欠失配列は、ヌクレオチド４８８で始まる１２塩基対挿入で置き換えられ、ならびに、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのエクソン７におけるさらなる１２９塩基対欠失が存在する；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，７２４からヌクレオチド４，０９６までの１３７３塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０２４からヌクレオチド３，１４６までの１２３塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，４３１からヌクレオチド３，８９７までの１４６７塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド４，５３１までの１３８７塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの１３８２塩基対欠失、ここで、欠失配列は、ヌクレオチド３，１１３で始まる１１塩基対挿入で置き換えられる；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，４４０からヌクレオチド４，１６０までの１７２０塩基対欠失；およびそれらの組み合わせ。
【0132】
ブタ動物、子孫、または細胞は、下記からなる群より選択される挿入または欠失を含むことができる：参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の２塩基対挿入、かつ、同じアレルでの、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド３，１７２までの２８塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０１５からヌクレオチド３，４６６までの４５２塩基対欠失；およびそれらの組み合わせ。
【0133】
例えば、ブタ動物、子孫、または細胞は、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の２塩基対挿入、かつ、同じアレルでの、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対欠失を含むことができる。
【0134】
ブタ動物、子孫、または細胞は、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド３，１７２までの２８塩基対欠失を含むことができる。
【0135】
ブタ動物、子孫、または細胞は、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０１５からヌクレオチド３，４６６までの４５２塩基対欠失を含むことができる。
【0136】
ブタ動物、子孫、または細胞は、本明細書で記載される改変染色体配列の任意の組み合わせを含むことができる。
【0137】
例えば、ブタ動物、子孫、または細胞は、下記を含むことができる：ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９の間の７塩基対挿入；および、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対欠失。
【0138】
ブタ動物、子孫、または細胞は、下記を含むことができる：ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９の間の７塩基対挿入；および、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの１３８２塩基対欠失、ここで、欠失配列は、ヌクレオチド３，１１３で始まる１１塩基対挿入で置き換えられる。
【0139】
ブタ動物、子孫、または細胞は、下記を含むことができる：ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８；および、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対欠失。
【0140】
ブタ動物、子孫、または細胞は、下記を含むことができる：ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８；および、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の２塩基対挿入、かつ、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対欠失。
【0141】
ブタ動物、子孫、または細胞は、下記を含むことができる：ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，８１８からヌクレオチド４，０９７までの１２８０塩基対欠失；および、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対欠失。
【0142】
ブタ動物、子孫、または細胞は、下記を含むことができる：ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，８１８からヌクレオチド４，０９７までの１２８０塩基対欠失；およびＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の２塩基対挿入、かつ、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対欠失。
【0143】
ブタ動物、子孫、または細胞は、下記を含むことができる：ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの１９３０塩基対欠失、ここで、欠失配列は、ヌクレオチド４８８で始まる１２塩基対挿入で置き換えられ、ならびに、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのエクソン７におけるさらなる１２９塩基対欠失が存在する；およびＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の２塩基対挿入、かつ、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対欠失。
【0144】
ブタ動物、子孫、または細胞は、下記を含むことができる：ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８；および、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの１９３０塩基対欠失、ここで、欠失配列は、ヌクレオチド４８８で始まる１２塩基対挿入で置き換えられ、ならびに、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのエクソン７におけるさらなる１２９塩基対欠失が存在する。
【0145】
ブタ動物、子孫、または細胞は、下記を含むことができる：ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの１９３０塩基対欠失、ここで、欠失配列は、ヌクレオチド４８８で始まる１２塩基対挿入で置き換えられ、ならびに、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのエクソン７におけるさらなる１２９塩基対欠失が存在する；および、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対欠失。
【0146】
ブタ動物、子孫、または細胞は、下記を含むことができる：ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，４３１からヌクレオチド３，８９７までの１４６７塩基対欠失；およびＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の２塩基対挿入、かつ、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対欠失。
【0147】
ブタ動物、子孫、または細胞は、下記を含むことができる：ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，４３１からヌクレオチド３，８９７までの１４６７塩基対欠失；および、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対欠失。
【0148】
以上で記載される挿入または欠失のいずれかを含むブタ動物、子孫、または細胞は、挿入または欠失の外側で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に対して高度の配列同一性を有する染色体配列を含むことができる。よって、例えば、ブタ動物、子孫、または細胞は、挿入または欠失の外側の染色体配列の領域において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．９％、または１００％配列同一性を有する染色体配列を含むことができる。
【0149】
ブタ動物、子孫、または細胞は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１８、または１１９を含む染色体配列を含むことができる。以下の実施例においてさらに記載されるように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９８～１１４、および１１９は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７で提供される野生型ブタＣＤ１６３の領域に対応する領域のためのヌクレオチド配列を提供し、本明細書で記載されるブタＣＤ１６３染色体配列における挿入または欠失を含む。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７により提供される野生型ブタＣＤ１６３の領域に対応する領域のための配列を提供し、ここで、エクソン７は、ヒトＣＤ１６３様１タンパク質（ｈＣＤ１６３Ｌ１）のＳＲＣＲ８のホモログをコードする合成エクソンで置き換えられている。
【0150】
例えば、ブタ、子孫、動物または細胞は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８、１０１、１０５、１０９、１１０、１１２、１１３、または１１４を含む染色体配列を含むことができる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８、１０１、１０５、１０９、１１０、１１２、１１３、および１１４はブタＣＤ１６３染色体配列のエクソン７におけるインフレーム欠失のためのヌクレオチド配列を提供する。
【0151】
別の例として、ブタ動物、子孫、または細胞は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３、１１１、または１１９を含む染色体配列を含むことができる。
【0152】
ブタ動物、子孫、または細胞は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて１１塩基対欠失およびＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて２塩基対挿入かつ３７７塩基対欠失を含むことができる。
【0153】
ブタ動物、子孫、または細胞は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて１２４塩基対欠失およびＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて１２３塩基対欠失を含むことができる。
【0154】
ブタ動物、子孫、または細胞は、１塩基対挿入を含むことができる。
【0155】
ブタ動物、子孫、または細胞は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて１３０塩基対欠失およびＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて１３２塩基対欠失を含むことができる。
【0156】
ブタ動物、子孫、または細胞は、１５０６塩基対欠失を含むことができる。
【0157】
ブタ動物、子孫、または細胞は、７塩基対挿入を含むことができる。
【0158】
ブタ動物、子孫、または細胞は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて１２８０塩基対欠失およびＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて１３７３塩基対欠失を含むことができる。
【0159】
ブタ動物、子孫、または細胞は、１４６７塩基対欠失を含むことができる。
【0160】
ブタ動物、子孫、または細胞は、ヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの１９３０塩基対イントロン６欠失、かつ、エクソン７におけるヌクレオチド４，４８８での１２塩基対挿入および追加の１２９塩基対欠失を含むことができる。
【0161】
ブタ動物、子孫、または細胞は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて２８塩基対欠失およびＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて１３８７塩基対欠失を含むことができる。
【0162】
ブタ動物、子孫、または細胞は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、１３８２塩基対欠失、かつ１１塩基対挿入、およびＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて１７２０塩基対欠失を含むことができる。
【0163】
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子において少なくとも１つの改変染色体配列を含む細胞のいずれも、精細胞を含むことができる。あるいは、これらの細胞のいずれも、卵細胞（例えば、受精卵）を含むことができる。
【0164】
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子において少なくとも１つの改変染色体配列を含む細胞のいずれも、体細胞を含むことができる。例えば、その細胞のいずれも、線維芽細胞（例えば、胎仔線維芽細胞）を含むことができる。
【0165】
ＣＤ１６３座位での核酸の標的組込み
ＣＤ１６３座位での外因性核酸の部位特異的な組込みは、当業者に知られている任意の技術により達成され得る。例えば、ＣＤ１６３座位での外因性核酸の組込みは、細胞（例えば、単離細胞または組織もしくは生物中の細胞）を、外因性核酸を含む核酸分子と接触させることを含むことができる。そのような核酸分子は、核酸分子と少なくとも１つのＣＤ１６３座位の間の相同組換えを促進する、外因性核酸に隣接しているヌクレオチド配列を含むことができる。相同組換えを促進する、外因性核酸に隣接しているヌクレオチド配列は、ＣＤ１６３座位の内在性ヌクレオチドに相補的とすることができる。あるいは、相同組換えを促進する、外因性核酸に隣接しているヌクレオチド配列は、前に組み込んだ外因性ヌクレオチドに相補的とすることができる。複数の外因性核酸は、１つのＣＤ１６３座位で、例えば遺伝子スタッキングで組み込むことができる。
ＣＤ１６３座位での外因性核酸の部位特異的な組込みは、当業者に知られている任意の技術により達成され得る。例えば、ＣＤ１６３座位での外因性核酸の組込みは、細胞（例えば、単離細胞または組織もしくは生物中の細胞）を、外因性核酸を含む核酸分子と接触させることを含むことができる。そのような核酸分子は、核酸分子と少なくとも１つのＣＤ１６３座位の間の相同組換えを促進する、外因性核酸に隣接しているヌクレオチド配列を含むことができる。相同組換えを促進する、外因性核酸に隣接しているヌクレオチド配列は、ＣＤ１６３座位の内在性ヌクレオチドに相補的とすることができる。あるいは、相同組換えを促進する、外因性核酸に隣接しているヌクレオチド配列は、前に組み込んだ外因性ヌクレオチドに相補的とすることができる。複数の外因性核酸は、１つのＣＤ１６３座位で、例えば遺伝子スタッキングで組み込むことができる。
【0166】
ＣＤ１６３座位での核酸の組込みは、宿主細胞の内在性細胞機構、例えば、例として、限定はされないが、内在性ＤＮＡおよび内在性リコンビナーゼ酵素により促進され（例えば、触媒され）得る。あるいは、ＣＤ１６３座位での核酸の組込みは、宿主細胞に提供される１つ以上の因子（例えば、ポリペプチド）により促進され得る。例えば、ヌクレアーゼ（複数可）、リコンビナーゼ（複数可）、および／またはリガーゼポリペプチドは、ポリペプチドを宿主細胞と接触させることにより、またはポリペプチドを宿主細胞内で発現させることにより、（独立して、またはキメラポリペプチドの一部として）提供され得る。したがって、少なくとも１つのヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、および／またはリガーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、ＣＤ１６３座位で部位特異的に組み込まれる核酸と同時に、または連続して宿主細胞に導入され得、ここで、少なくとも１つのヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、および／またはリガーゼポリペプチドは、宿主細胞内でそのヌクレオチド配列から発現される。
【0167】
ＤＮＡ結合ポリペプチド
部位特異的組込みは、例えば、宿主生物のゲノムにおける特定のヌクレオチド配列を認識し、これに結合することができる因子を使用することにより、達成することができる。例えば、多くのタンパク質は、部位特異的様式で、ＤＮＡを認識し、これに結合することができるポリペプチドドメインを含む。ＤＮＡ結合ポリペプチドにより認識されるＤＮＡ配列は「標的」配列と呼ばれ得る。部位特異的様式で、ＤＮＡを認識し、これに結合することができるポリペプチドドメインは一般に、そのドメインが元々単離されたタンパク質以外のポリペプチドにおいて発現された場合であっても、正確に折り畳み、部位特異的様式でＤＮＡに結合するように独立して機能する。同様に、ＤＮＡ結合ポリペプチドによる認識および結合のための標的配列は、一般に、大きなＤＮＡ構造中に存在する場合であっても（例えば、染色体）、特に標的配列が位置する部位が可溶性細胞タンパク質に到達できることが知られているものである場合（例えば、遺伝子）、そのようなポリペプチドに認識され、結合され得る。
部位特異的組込みは、例えば、宿主生物のゲノムにおける特定のヌクレオチド配列を認識し、これに結合することができる因子を使用することにより、達成することができる。例えば、多くのタンパク質は、部位特異的様式で、ＤＮＡを認識し、これに結合することができるポリペプチドドメインを含む。ＤＮＡ結合ポリペプチドにより認識されるＤＮＡ配列は「標的」配列と呼ばれ得る。部位特異的様式で、ＤＮＡを認識し、これに結合することができるポリペプチドドメインは一般に、そのドメインが元々単離されたタンパク質以外のポリペプチドにおいて発現された場合であっても、正確に折り畳み、部位特異的様式でＤＮＡに結合するように独立して機能する。同様に、ＤＮＡ結合ポリペプチドによる認識および結合のための標的配列は、一般に、大きなＤＮＡ構造中に存在する場合であっても（例えば、染色体）、特に標的配列が位置する部位が可溶性細胞タンパク質に到達できることが知られているものである場合（例えば、遺伝子）、そのようなポリペプチドに認識され、結合され得る。
【0168】
天然に存在するタンパク質から同定されたＤＮＡ結合ポリペプチドは典型的には別々のヌクレオチド配列またはモチーフ（例えば、コンセンサス認識配列）に結合するが、異なるヌクレオチド配列またはモチーフを認識するように、多くのそのようなＤＮＡ結合ポリペプチドを改変するための方法が存在し、当技術分野で知られている。ＤＮＡ結合ポリペプチドとしては、例えば、限定はされないが下記が挙げられる：ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン；ロイシンジッパー；ＵＰＡ ＤＮＡ結合ドメイン；ＧＡＬ４；ＴＡＬ；ＬｅｘＡ；Ｔｅｔリプレッサー；ＬａｃＩ；およびステロイドホルモン受容体。
【0169】
例えば、ＤＮＡ結合ポリペプチドはジンクフィンガーとすることができる。個々のジンクフィンガーモチーフは、広範なＤＮＡ部位のいずれかを標的にし、これに特異的に結合するように設計させることができる。標準Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２（ならびに非標準Ｃｙｓ３Ｈｉｓ）ジンクフィンガーポリペプチドは、α－ヘリックスを標的ＤＮＡ二重らせんの主溝に挿入することにより、ＤＮＡに結合する。ジンクフィンガーによるＤＮＡの認識はモジュール式であり；各フィンガーが主として、標的内の３連続塩基対と接触し、ポリペプチド内の２、３の主要残基が認識を媒介する。ターゲティングエンドヌクレアーゼ中に複数のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含めることにより、ターゲティングエンドヌクレアーゼのＤＮＡ－結合特異性がさらに増加され得る（および、よって、これにより付与される任意の遺伝子制御効果の特異性もまた、増加され得る）。例えば、Ｕｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｎａｔｕｒｅ ４３５：６４６－５１を参照されたい。よって、１つ以上のジンクフィンガーＤＮＡ－結合ポリペプチドは、宿主細胞に導入されたターゲティングエンドヌクレアーゼが、宿主細胞のゲノム内で独特であるＤＮＡ配列と相互作用するように操作され、使用され得る。
【0170】
好ましくは、ジンクフィンガータンパク質は、選択標的部位に結合するように操作されているという点で、非天然由来である。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０：１３５－１４１； Ｐａｂｏ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７０：３１３－３４０； Ｉｓａｌａｎ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １９：６５６－６６０； Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １２：６３２－６３７； Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． １０：４１１－４１６；米国特許第６，４５３，２４２号；６，５３４，２６１号；６，５９９，６９２号；６，５０３，７１７号；６，６８９，５５８号；７，０３０，２１５号；６，７９４，１３６号；７，０６７，３１７号；７，２６２，０５４号；７，０７０，９３４号；７，３６１，６３５号；７，２５３，２７３号；および米国特許公開第２００５／００６４４７４号；２００７／０２１８５２８号；２００５／０２６７０６１号を参照されたい。
【0171】
操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然由来ジンクフィンガータンパク質と比べて、新規結合特異性を有することができる。操作方法としては、合理的設計および様々な型の選択が挙げられるが、それらに限定されない。合理的設計としては、例えば、トリプレット（またはクアドルプレット）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースの使用が挙げられ、この場合、各トリプレットまたはクアドルプレットヌクレオチド配列は特定のトリプレットまたはクアドルプレット配列に結合するジンクフィンガーの１つ以上のアミノ酸配列と関連する。例えば、米国特許第６，４５３，２４２号および６，５３４，２６１号を参照されたい。
【0172】
例示的な選択方法、例えばファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステムは、米国特許第５，７８９，５３８号；５，９２５，５２３号；６，００７，９８８号；６，０１３，４５３号；６，４１０，２４８号；６，１４０，４６６号；６，２００，７５９号；および６，２４２，５６８号；ならびにＷＯ９８／３７１８６号；ＷＯ９８／５３０５７号；ＷＯ００／２７８７８号；ＷＯ０１／８８１９７号およびＧＢ２，３３８，２３７号に開示される。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強が、例えば、ＷＯ０２／０７７２２７号において記載されている。
【0173】
加えて、これらのおよび他の参考文献において開示されているように、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガージンクフィンガータンパク質は、任意の好適なリンカー配列（例えば、５以上のアミノ酸の長さのリンカーを含む）を用いて一緒に連結され得る。６以上のアミノ酸の長さの例示的なリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号；６，９０３，１８５号；および７，１５３，９４９号もまた参照されたい。本明細書で記載されるタンパク質はタンパク質の個々のジンクフィンガーの間に好適なリンカーの任意の組み合わせを含み得る。
【0174】
標的部位の選択：ＺＦＰおよび融合タンパク質（およびこれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のための方法は当業者に知られており、下記において詳細に記載される：米国特許第６，１４０，０８１５；７８９，５３８号；６，４５３，２４２号；６，５３４，２６１号；５，９２５，５２３号；６，００７，９８８号；６，０１３，４５３号；６，２００，７５９号；ＷＯ９５／１９４３１号；ＷＯ９６／０６１６６号；ＷＯ９８／５３０５７号；ＷＯ９８／５４３１１号；ＷＯ００／２７８７８号；ＷＯ０１／６０９７０号ＷＯ０１／８８１９７号；ＷＯ０２／０９９０８４号；ＷＯ９８／５３０５８号；ＷＯ９８／５３０５９号；ＷＯ９８／５３０６０号；ＷＯ０２／０１６５３６号およびＷＯ０３／０１６４９６号。
【0175】
加えて、これらのおよび他の参考文献において開示されているように、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガージンクフィンガータンパク質は、好適なリンカー配列（例えば、５以上のアミノ酸の長さのリンカーを含む）を用いて一緒に連結され得る。６以上のアミノ酸の長さの例示的なリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号；６，９０３，１８５号；および７，１５３，９４９号もまた参照されたい。本明細書で記載されるタンパク質はタンパク質の個々のジンクフィンガーの間に好適なリンカーの任意の組み合わせを含み得る。
【0176】
あるいは、ＤＮＡ結合ポリペプチドはＧＡＬ４由来のＤＮＡ結合ドメインである。ＧＡＬ４はサッカロマイセス・セレビシエにおけるモジュール式トランス活性化因子であるが、これはまた、多くの他の生物においても、トランス活性化因子として動作する。例えば、Ｓａｄｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３５：５６３－４を参照されたい。この制御システムでは、Ｓ．セレビシエにおけるガラクトース代謝経路の酵素をコードする遺伝子の発現は、入手可能な炭素源により厳密に制御される。Ｊｏｈｎｓｔｏｎ （１９８７） Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． ５１：４５８－７６。これらの代謝酵素の転写制御は、正の調節タンパク質、ＧＡＬ４とＧＡＬ４が特異的に結合する１７ｂｐ対称的ＤＮＡ配列（上流活性化配列（ＵＡＳ））の間の相互作用により媒介される。
【0177】
天然ＧＡＬ４は８８１アミノ酸残基から構成され、分子量は９９ｋＤａである。ＧＡＬ４は機能的に自立したドメインを含み、それらの活性の組み合わせが、インビボでのＧＡＬ４の活性を担う。Ｍａ ａｎｄ Ｐｔａｓｈｎｅ （１９８７） Ｃｅｌｌ ４８：８４７－５３）；Ｂｒｅｎｔ ａｎｄ Ｐｔａｓｈｎｅ （１９８５） Ｃｅｌｌ ４３（３ Ｐｔ ２）：７２９－３６。ＧＡＬ４のＮ末端６５アミノ酸はＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインを含む。Ｋｅｅｇａｎ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３１：６９９－７０４； Ｊｏｈｎｓｔｏｎ （１９８７） Ｎａｔｕｒｅ ３２８：３５３－５。配列特異的結合は、ＤＮＡ結合ドメイン中に存在する６つのＣｙｓ残基により配位された二価カチオンの存在を必要とする。配位されたカチオンを含むドメインは、ＤＮＡヘリックスの主溝との直接接触により、１７ｂｐＵＡＳの各端の保存されたＣＣＧトリプレットと相互作用し、これを認識する。Ｍａｒｍｏｒｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｎａｔｕｒｅ ３５６：４０８－１４。タンパク質のＤＮＡ－結合機能は、Ｃ末端転写活性ドメインをプロモーターの近くに配置させ、よって、活性化ドメインは転写を指向させることができる。
【0178】
使用することができる追加のＤＮＡ結合ポリペプチドとしては、例えば、限定はされないが、下記が挙げられる：ＡＶＲＢＳ３－誘導性遺伝子由来の結合配列；ＡＶＲＢＳ３－誘導性遺伝子由来のコンセンサス結合配列またはこれから操作された合成結合配列（例えば、ＵＰＡ ＤＮＡ結合ドメイン）；ＴＡＬ；ＬｅｘＡ（例えば、Ｂｒｅｎｔ＆Ｐｔａｓｈｎｅ（１９８５）、上記を参照されたい）；ＬａｃＲ（例えば、Ｌａｂｏｗ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １０：３３４３－５６； Ｂａｉｍ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８（１２）：５０７２－６を参照されたい）；ステロイドホルモン受容体（Ｅｌｌｌｉｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５：１１５１７－１２１）；Ｔｅｔリプレッサー（米国特許第６，２７１，３４１号）およびテトラサイクリン（Ｔｃ）が存在する場合、ｔｅｔオペレーター配列に結合するが、存在しない場合、結合しない変異Ｔｅｔリプレッサー；ＮＦ－κＢのＤＮＡ結合ドメイン；およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１（１７）：８１８０－４において記載される制御システムの構成要素（それは、ＧＡＬ４、ホルモン受容体、およびＶＰ１６の融合を使用する）。
【0179】
本明細書で記載される方法および組成物において使用されるヌクレアーゼの１つ以上のＤＮＡ結合ドメインは、天然由来または操作された（非天然由来）ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを含むことができる。例えば、米国特許公開第２０１１／０３０１０７３号を参照されたい。
【0180】
あるいは、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含むことができる。そのようなシステムは、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）座位（システムのＲＮＡ成分をコードする）、およびＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）座位（タンパク質をコードする）を含む（Ｊａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００２． Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４３： １５６５－１５７５； Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．， ２００２． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３０： ４８２－４９６； Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．， ２００６． Ｂｉｏｌ． Ｄｉｒｅｃｔ １： ７； Ｈａｆｔ ｅｔ ａｌ．， ２００５． ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ． Ｂｉｏｌ． １： ｅ６０）。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ座位は、Ｃａｓ遺伝子ならびにＣＲＩＳＰＲ媒介核酸切断の特異性をプログラムすることができるノンコーディングＲＮＡ要素を含む。
【0181】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは、最もよく特徴付けられたシステムの１つであり、標的ＤＮＡ二本鎖切断を本質的に４連続工程で実施する。最初に、２つのノンコーディングＲＮＡ、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡがＣＲＩＳＰＲ座位から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡはｐｒｅ－ｃｒＲＮＡのリピート領域にハイブリダイズし、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡの個々のスペーサ配列を含む成熟ｃｒＲＮＡへのプロセシングを媒介する。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体は、Ｃａｓ９を標的ＤＮＡに、ｃｒＲＮＡ上のスペーサと標的認識のための追加の必要条件であるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣の標的ＤＮＡ上のプロトスペーサーの間のＷａｓｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対形成により指向させる。最後に、Ｃａｓ９は、標的ＤＮＡの切断を媒介し、プロトスペーサー内での二本鎖切断を生成させる。
【0182】
標的挿入および欠失を作製するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの使用では、２つのノンコーディングＲＮＡ（ｃｒＲＮＡおよびＴｒａｃｒＲＮＡ）は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と呼ばれる単一ＲＮＡにより置き換えられ得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの活性は３つの工程を含む：（ｉ）「適応」と呼ばれるプロセスにおける、将来の攻撃を防止するための、外因性ＤＮＡ配列のＣＲＩＳＰＲアレイ中への挿入、（ｉｉ）関連タンパク質の発現、ならびにアレイの発現およびプロセシング、続いて（ｉｉｉ）外来核酸のＲＮＡ媒介干渉。細菌細胞では、いくつかのＣａｓタンパク質がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの天然機能と関わり、例えば外来ＤＮＡの挿入などの機能において役割を果たす。
【0183】
Ｃａｓタンパク質は、天然由来Ｃａｓタンパク質の「機能誘導体」とすることができる。天然配列ポリペプチドの「機能誘導体」は、天然配列ポリペプチドと共通の質的生物学的特性を有する化合物である。「機能誘導体」としては、天然配列の断片ならびに天然配列ポリペプチドおよびその断片の誘導体が挙げられるが、それらに限定されず、ただし、それらが対応する天然配列ポリペプチドと共通の生物活性を有することを条件とする。本明細書で企図される生物活性は機能誘導体の、ＤＮＡ基質を断片に加水分解する能力である。「誘導体」という用語はポリペプチドのアミノ酸配列バリアント、共有結合的修飾、およびそれらの融合物の両方を包含する。Ｃａｓポリペプチドまたはその断片の好適な誘導体としてはＣａｓタンパク質またはその断片の変異体、融合物、共有結合的修飾が挙げられるが、それらに限定されない。Ｃａｓタンパク質（Ｃａｓタンパク質またはその断片を含む）、ならびにＣａｓタンパク質またはその断片の誘導体は、細胞から入手可能であり、または、化学的にもしくはこれらの２つの手順の組み合わせにより合成され得る。細胞は、自然にＣａｓタンパク質を産生する細胞、または自然にＣａｓタンパク質を産生し、内在性Ｃａｓタンパク質をより高い発現レベルで産生するまたは外因的に導入された核酸（その核酸は、内在性Ｃａｓと同じか異なるＣａｓをコードする）からＣａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作されている細胞であってもよい。場合によっては、細胞は自然にＣａｓタンパク質を産生せず、Ｃａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作される。
【0184】
ＤＮＡ結合ポリペプチドは、宿主生物のゲノム核酸内に含まれる標的ヌクレオチド配列を特異的に認識し、これに結合することができる。いくつかの例において、標的ヌクレオチド配列のいくつもの別々の場合が宿主ゲノムにおいて見出され得る。標的ヌクレオチド配列は生物のゲノム内でまれであってもよい（例えば、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、約２、または約１より少ない標的配列のコピー（複数可）がゲノム内に存在し得る）。例えば、標的ヌクレオチド配列は、生物のゲノム内の特有部位に位置し得る。標的ヌクレオチド配列は、例えば、限定はされないが、ゲノムを通して、互いに関してランダムに分散されてもよく；ゲノム内の異なる連鎖群中に位置してもよく；同じ連鎖群に位置してもよく；異なる染色体上に位置してもよく；同じ染色体上に位置してもよく；生物内で同様の条件下（例えば、同じ、または実質的に機能的に同一な、制御因子の制御下）で発現される部位のゲノム中に位置してもよく；および、ゲノム内で互いに近接して位置してもよい（例えば、標的配列は、ゲノム座位でコンカテマーとして組み込まれた核酸内に含まれ得る）。
【0185】
ターゲティングエンドヌクレアーゼ
標的ヌクレオチド配列を特異的に認識し、これに結合するＤＮＡ結合ポリペプチドは、キメラポリペプチドで、標的配列への特異的結合を与えるように、キメラポリペプチド内に含ませることができる。例では、そのようなキメラポリペプチドは、例えば、限定はされないが、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、および／またはリガーゼポリペプチドを含むことができる。これらのポリペプチドは以上で説明されている。ＤＮＡ結合ポリペプチドおよびヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、および／またはリガーゼポリペプチドを含むキメラポリペプチドはまた、他の機能性ポリペプチドモチーフおよび／またはドメイン、例えば、例として、限定はされないが、下記を含み得る：キメラタンパク質内の機能性ポリペプチド間に配置されたスペーサ配列；リーダーペプチド；融合タンパク質を小器官（例えば、核）に標的させるペプチド；細胞酵素により切断されるポリペプチド；ペプチドタグ（例えば、Ｍｙｃ、Ｈｉｓ、など）；およびキメラポリペプチドの機能を妨害しない他のアミノ酸配列。
標的ヌクレオチド配列を特異的に認識し、これに結合するＤＮＡ結合ポリペプチドは、キメラポリペプチドで、標的配列への特異的結合を与えるように、キメラポリペプチド内に含ませることができる。例では、そのようなキメラポリペプチドは、例えば、限定はされないが、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、および／またはリガーゼポリペプチドを含むことができる。これらのポリペプチドは以上で説明されている。ＤＮＡ結合ポリペプチドおよびヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、および／またはリガーゼポリペプチドを含むキメラポリペプチドはまた、他の機能性ポリペプチドモチーフおよび／またはドメイン、例えば、例として、限定はされないが、下記を含み得る：キメラタンパク質内の機能性ポリペプチド間に配置されたスペーサ配列；リーダーペプチド；融合タンパク質を小器官（例えば、核）に標的させるペプチド；細胞酵素により切断されるポリペプチド；ペプチドタグ（例えば、Ｍｙｃ、Ｈｉｓ、など）；およびキメラポリペプチドの機能を妨害しない他のアミノ酸配列。
【0186】
キメラポリペプチド内の機能性ポリペプチド（例えば、ＤＮＡ結合ポリペプチドおよびヌクレアーゼポリペプチド）は動作的に連結され得る。キメラポリペプチドの機能性ポリペプチドは、キメラタンパク質をコードするキメラ遺伝子を作製させるように、少なくとも、インフレームで互いに連結された機能性ポリペプチドをコードする単一ポリヌクレオチドからのそれらの発現により動作的に連結させることができる。あるいは、キメラポリペプチドの機能性ポリペプチドは、他の手段、例えば、独立して発現されるポリペプチドの架橋により、動作的に連結させることができる。
【0187】
標的ヌクレオチド配列を特異的に認識し、これに結合するＤＮＡ結合ポリペプチド、またはガイドＲＮＡは天然単離タンパク質（またはその変異体）内に含ませることができ、ここで、天然単離タンパク質またはその変異体はまた、ヌクレアーゼポリペプチドを含む（および、リコンビナーゼおよび／またはリガーゼポリペプチドをも含み得る）。そのような単離タンパク質の例としては、ＴＡＬＥＮ、リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅ、Ｈｉｎ、Ｔｒｅ、およびＦＬＰリコンビナーゼ）、ＲＮＡガイドＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、およびメガヌクレアーゼが挙げられる。
【0188】
本明細書では、「ターゲティングエンドヌクレアーゼ」という用語は、ＤＮＡ結合ポリペプチドまたはガイドＲＮＡおよびヌクレアーゼポリペプチドを含む天然または操作された単離タンパク質およびその変異体、ならびにＤＮＡ結合ポリペプチドまたはガイドＲＮＡおよびヌクレアーゼを含むキメラポリペプチドを示す。ＣＤ１６３座位内に含まれる標的ヌクレオチド配列を特異的に認識し、これに結合するＤＮＡ結合ポリペプチドまたはガイドＲＮＡを含む任意のターゲティングエンドヌクレアーゼ（例えば、標的配列が座位の天然配列に含まれるため、または標的配列が、例えば、組換えにより座位に導入されているため）は使用することができる。
【0189】
好適なキメラポリペプチドのいくつかの例としては、限定はされないが、下記ポリペプチドの組み合わせが挙げられる：ジンクフィンガーＤＮＡ結合ポリペプチド；ＦｏｋＩヌクレアーゼポリペプチド；ＴＡＬＥドメイン；ロイシンジッパー；転写因子ＤＮＡ－結合モチーフ；および、例えば、限定はされないが、ＴＡＬＥＮ、リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅ、Ｈｉｎ、ＲｅｃＡ、Ｔｒｅ、およびＦＬＰリコンビナーゼ）、ＲＮＡガイドＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、メガヌクレアーゼから単離されたＤＮＡ認識および／または切断ドメイン；および当業者に知られている他のもの。特定例としては、部位特異的なＤＮＡ結合ポリペプチドおよびヌクレアーゼポリペプチドを含むキメラタンパク質が挙げられる。キメラポリペプチドは、キメラポリペプチドを対象となる特定のヌクレオチド配列に標的させるように、キメラポリペプチド内に含まれるＤＮＡ結合ポリペプチドの認識配列を変化させる当業者に知られた方法により操作され得る。
【0190】
キメラポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガー、ＴＡＬ－エフェクタードメイン、など）およびヌクレアーゼ（切断）ドメインを含むことができる。切断ドメインは、ＤＮＡ結合ドメイン、例えばジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼ由来の切断ドメインまたはＴＡＬＥＮ ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメイン、またはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインおよび異なるヌクレアーゼ由来の切断ドメインに対して異種性であってもよい。異種性切断ドメインは任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインを由来させることができる例示的なエンドヌクレアーゼとしては、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるが、それらに限定されない。例えば、２００２－２００３ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， Ｍａｓｓ．；およびＢｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３７９－３３８８を参照されたい。ＤＮＡを切断する追加の酵素が知られている（例えば、５１ヌクレアーゼ；リョクトウヌクレアーゼ；膵臓ＤＮＡｓｅ Ｉ；小球菌ヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ；Ｌｉｎｎ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．） Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９９３もまた、参照されたい）。これらの酵素（またはその機能的断片）の１つ以上は、切断ドメインおよび切断ハーフドメイン源として使用することができる。
【0191】
同様に、切断ハーフドメインは以上で明記される任意のヌクレアーゼまたはその一部由来とすることができ、切断活性のために二量体化が必要とされる。一般に、融合タンパク質が切断ハーフドメインを含む場合、２つの融合タンパク質が切断のために必要とされる。あるいは、２つの切断ハーフドメインを含む単一タンパク質が使用され得る。２つの切断ハーフドメインは同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）由来とすることができ、または各切断ハーフドメインは、異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）由来とすることができる。加えて、２つの融合タンパク質のための標的部位は、好ましくは、互いに関して、２つの融合タンパク質の、それらの個々の標的部位への結合により、切断ハーフドメインが、互いに空間定位で置かれるように配置され、これにより、切断ハーフドメインは、例えば、二量体化により機能的切断ドメインを形成することができる。よって、標的部位の近端は５－８ヌクレオチドまたは１５－１８ヌクレオチドだけ分離させることができる。しかしながら、任意の整数のヌクレオチド、またはヌクレオチド対が２つの標的部位の間に（例えば、２～５０ヌクレオチド対以上）介在することができる。一般に、切断部位は標的部位間に存在する。
【0192】
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は多くの種において存在し、ＤＮＡ（認識部位で）に配列特異的結合し、結合部位で、またはその近くでＤＮＡを切断することができ、例えば、それによって、１つ以上の外因性配列（ドナー／導入遺伝子）が結合（標的）部位で、またはその近くで組み込まれる。ある一定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、ＤＮＡを認識部位から引き離された部位で切断し、分離可能な結合および切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩは、１つの鎖ではその認識部位から９ヌクレオチドで、もう一方ではその認識部位から１３ヌクレオチドで、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号；５，４３６，１５０号および５，４８７，９９４号；ならびにＬｉ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：４２７５－４２７９； Ｌｉ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：２７６４－２７６８； Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． （１９９４ａ） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：８８３－８８７； Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． （１９９４ｂ） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：３１，９７８－３１，９８２を参照されたい。よって、融合タンパク質は、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素由来の切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）および１つ以上のジンクフィンガー結合ドメイン（操作されても、されなくてもよい）を含むことができる。
【0193】
例示的なＩＩＳ型制限酵素（その切断ドメインは結合ドメインとは分離可能である）はＦｏｋＩである。この特定の酵素は二量体として活性である。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５： １０，５７０－１０，５７５。したがって、本開示の目的のために、開示された融合タンパク質において使用されるＦｏｋＩ酵素の一部は切断ハーフドメインであると考えられる。よって、ジンクフィンガー－ＦｏｋＩ融合物を用いた細胞配列の標的二本鎖切断および／または標的置き換えでは、２つの融合タンパク質（各々、ＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含む）は、触媒的に活性な切断ドメインを再構成するために使用することができる。あるいは、ＤＮＡ結合ドメインおよび２つのＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含む単一ポリペプチド分子もまた使用することができる。
【0194】
切断ドメインまたは切断ハーフドメインは、切断活性を保持する、または多量体化（例えば、二量体化）して、機能的切断ドメインを形成する能力を保持するタンパク質の任意の部分とすることができる。
【0195】
例示的なＩＩＳ型制限酵素は、米国特許公開第２００７／０１３４７９６号において記載される。追加の制限酵素もまた、分離可能な結合および切断ドメインを含み、これらは本開示により企図される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３１：４１８－４２０を参照されたい。
【0196】
切断ドメインは、ホモ二量体化を最小に抑えるまたは防止する、１つ以上の操作された切断ハーフドメイン（二量体化ドメイン変異体とも呼ばれる）を含むことができ、例えば、米国特許公開第２００５／００６４４７４号；２００６／０１８８９８７号および２００８／０１３１９６２号に記載される。
【0197】
あるいは、ヌクレアーゼは、インビボで、核酸標的部位でいわゆる「開裂酵素」技術を使用して構築され得る（例えば米国特許公開第２００９００６８１６４号を参照されたい）。そのような開裂酵素の構成要素は別々の発現コンストラクト上で発現され得、または、１つのオープンリーディングフレーム中で連結させることができ、この場合、個々の構成要素は、例えば、自己開裂２ＡペプチドまたはＩＲＥＳ配列により分離される。構成要素は、個々のジンクフィンガー結合ドメインまたはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであってもよい。
【0198】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ
キメラポリペプチドは、標的とされる部位特異的な二本鎖ＤＮＡ切断（そこには、外因性核酸、またはドナーＤＮＡが組み込まれ得る）を送達させるように設計され得る特注設計のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含むことができる（ＵＳ特許公開２０１０／０２５７６３８号を参照されたい）。ＺＦＮは、制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）由来の非特異的切断ドメインおよびジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインポリペプチドを含むキメラポリペプチドである。例えば、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ． １５：４８１－９； Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． （１９９７ａ） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：３６１６－２０； Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１１５６－６０； Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：８８３－７； Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． （１９９７ｂ） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：１２８７５－９； Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． （１９９７ｃ） Ｇｅｎｅ ２０３：４３－９； Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ３７９：４８９－９５； Ｎａｈｏｎ ａｎｄ Ｒａｖｅｈ （１９９８） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２６：１２３３－９； Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２７：６７４－８１を参照されたい。ＺＦＮは、非標準ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含むことができる（ＵＳ特許公開２００８／０１８２３３２号を参照されたい）。ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡを切断し、二本鎖切断を導入するために、ヌクレアーゼドメインを介して二量体化しなければならない。その結果として、そのようなエンドヌクレアーゼ由来のヌクレアーゼドメインを含むＺＦＮはまた、標的ＤＮＡを切断するために、ヌクレアーゼドメインの二量体化を必要とする。Ｍａｎｉ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ３３４：１１９１－７； Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２８：３３６１－９。ＺＦＮの二量体化は、２つの隣接する、逆向きのＤＮＡ－結合部位により促進され得る。同上。
キメラポリペプチドは、標的とされる部位特異的な二本鎖ＤＮＡ切断（そこには、外因性核酸、またはドナーＤＮＡが組み込まれ得る）を送達させるように設計され得る特注設計のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含むことができる（ＵＳ特許公開２０１０／０２５７６３８号を参照されたい）。ＺＦＮは、制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）由来の非特異的切断ドメインおよびジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインポリペプチドを含むキメラポリペプチドである。例えば、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ． １５：４８１－９； Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． （１９９７ａ） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：３６１６－２０； Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１１５６－６０； Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：８８３－７； Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． （１９９７ｂ） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：１２８７５－９； Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． （１９９７ｃ） Ｇｅｎｅ ２０３：４３－９； Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ３７９：４８９－９５； Ｎａｈｏｎ ａｎｄ Ｒａｖｅｈ （１９９８） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２６：１２３３－９； Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２７：６７４－８１を参照されたい。ＺＦＮは、非標準ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含むことができる（ＵＳ特許公開２００８／０１８２３３２号を参照されたい）。ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡを切断し、二本鎖切断を導入するために、ヌクレアーゼドメインを介して二量体化しなければならない。その結果として、そのようなエンドヌクレアーゼ由来のヌクレアーゼドメインを含むＺＦＮはまた、標的ＤＮＡを切断するために、ヌクレアーゼドメインの二量体化を必要とする。Ｍａｎｉ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ３３４：１１９１－７； Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２８：３３６１－９。ＺＦＮの二量体化は、２つの隣接する、逆向きのＤＮＡ－結合部位により促進され得る。同上。
【0199】
外因性核酸の宿主の少なくとも１つのＣＤ１６３座位中への部位特異的組込みのための方法は、宿主の細胞にＺＦＮを導入することを含むことができ、ここで、ＺＦＮは標的ヌクレオチド配列を認識し、これに結合し、ここで、標的ヌクレオチド配列は宿主の少なくとも１つのＣＤ１６３座位内に含まれる。ある例では、標的ヌクレオチド配列は、宿主のゲノム内に、少なくとも１つのＣＤ１６３座位以外の任意の位置で含まれていない。例えば、ＺＦＮのＤＮＡ結合ポリペプチドは、少なくとも１つのＣＤ１６３座位内で同定された（例えば、ＣＤ１６３座位を配列決定することにより）、標的ヌクレオチド配列を認識し、これに結合するように操作され得る。宿主の細胞中にＺＦＮを導入することを含む、外因性核酸の、宿主の少なくとも１つのＣＤ１６３性能座位への部位特異的組込みのための方法はまた、細胞に外因性核酸を導入することを含むことができ、ここで、少なくとも１つのＣＤ１６３座位を含む宿主の核酸中への外因性核酸の組換えは、ＺＦＮの標的配列の部位特異的な認識およびこれへの結合（およびＣＤ１６３座位を含む核酸のその後の切断）により促進されされる。
【0200】
ＣＤ１６３座位での組込みのための任意的な外因性核酸
ＣＤ１６３座位での組込みのための外因性核酸は下記を含む：少なくとも１つのＣＤ１６３座位における部位特異的組込みのための外因性核酸、例えば、限定はされないが、ＯＲＦ；ターゲティングエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸；および前記のいずれかまたは両方の少なくとも１つを含むベクター。よって、特定の核酸は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、構造ヌクレオチド配列、および／またはＤＮＡ結合ポリペプチド認識および結合部位を含む。
ＣＤ１６３座位での組込みのための外因性核酸は下記を含む：少なくとも１つのＣＤ１６３座位における部位特異的組込みのための外因性核酸、例えば、限定はされないが、ＯＲＦ；ターゲティングエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸；および前記のいずれかまたは両方の少なくとも１つを含むベクター。よって、特定の核酸は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、構造ヌクレオチド配列、および／またはＤＮＡ結合ポリペプチド認識および結合部位を含む。
【0201】
部位特異的組込みのための任意的な外因性核酸分子
上述のように、外因性配列（「ドナー配列」または「ドナー」または「導入遺伝子」とも呼ばれる）の挿入が、例えば、ポリペプチドの発現、変異遺伝子の修正または野生型遺伝子の発現の増加のために提供される。ドナー配列は、典型的には、それが配置された場所のゲノム配列と同一ではないことが容易に明らかになるであろう。ドナー配列は２つの相同領域と隣接している非相同配列を含むことができ、対象となる位置での効率的な相同組換え修復（ＨＤＲ）が可能になる。加えて、ドナー配列は、細胞クロマチン内の対象となる領域と相同ではない配列を含むベクター分子を含むことができる。ドナー分子はいくつかの、不連続な細胞クロマチン相同領域を含むことができる。例えば、対象となる領域中に普通存在していない配列の標的挿入では、前記配列は、ドナー核酸分子中に存在し、対象となる領域中の配列と相同な領域と隣接することができる。
上述のように、外因性配列（「ドナー配列」または「ドナー」または「導入遺伝子」とも呼ばれる）の挿入が、例えば、ポリペプチドの発現、変異遺伝子の修正または野生型遺伝子の発現の増加のために提供される。ドナー配列は、典型的には、それが配置された場所のゲノム配列と同一ではないことが容易に明らかになるであろう。ドナー配列は２つの相同領域と隣接している非相同配列を含むことができ、対象となる位置での効率的な相同組換え修復（ＨＤＲ）が可能になる。加えて、ドナー配列は、細胞クロマチン内の対象となる領域と相同ではない配列を含むベクター分子を含むことができる。ドナー分子はいくつかの、不連続な細胞クロマチン相同領域を含むことができる。例えば、対象となる領域中に普通存在していない配列の標的挿入では、前記配列は、ドナー核酸分子中に存在し、対象となる領域中の配列と相同な領域と隣接することができる。
【0202】
ドナーポリヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡ、一本鎖または二本鎖とすることができ、細胞中に直鎖または円形形態で導入することができる。例えば、米国特許公開第２０１０／００４７８０５号、２０１１／０２８１３６１号、２０１１／０２０７２２１号、および２０１３／０３２６６４５号を参照されたい。直鎖形態で導入される場合、ドナー配列端部は、（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）当業者に知られた方法により保護することができる。例えば、１つ以上のジデオキシヌクレオチド残基が直鎖分子の３’末端に付加され、および／または自己相補的オリゴヌクレオチドが一端または両端に連結される。例えば、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：４９５９－４９６３； Ｎｅｈｌｓ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：８８６－８８９を参照されたい。外因性ポリヌクレオチドを分解から保護するための追加の方法としては、末端アミノ基（複数可）の付加および改変ヌクレオチド間結合、例えば、例として、ホスホロチオエート、ホスホラミデート、およびＯ－メチルリボースまたはデオキシリボース残基の使用が挙げられるが、それらに限定されない。
【0203】
ポリヌクレオチドは、細胞に、追加の配列、例えば、例として、複製開始点、プロモーターおよび抗生物質耐性をコードする遺伝子を有するベクター分子の一部として導入させることができる。その上、ドナーポリヌクレオチドは、ネイキッド核酸として、リポソームまたはポロクサマーなどの作用物質と複合体化された核酸として導入させることができ、またはウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスおよびインテグラーゼ欠損型レンチウイルス（ＩＤＬＶ））により送達させることができる。
【0204】
ドナーは、一般に、その発現が組込み部位の内在性プロモーター、すなわちドナーが組み込まれる内在性遺伝子（例えば、ＣＤ１６３）の発現を駆動するプロモーターにより駆動されるように組み込まれる。しかしながら、ドナーはプロモーターおよび／またはエンハンサー、例えば構成的プロモーターまたは誘導性もしくは組織特異的プロモーターを含み得ることは明らかであろう。
【0205】
さらに、発現には必要とされないが、外因性配列はまた、転写または翻訳調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、配列内リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列および／またはポリアデニル化シグナルを含み得る。
【0206】
ＣＤ１６３座位を改変するために、部位特異的様式で少なくとも１つのＣＤ１６３座位に組み込まれ得る外因性核酸としては、例えば、限定はされないが、対象となるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸；農学遺伝子を含む核酸；ＲＮＡｉ分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸；またはＣＤ１６３遺伝子を破壊する核酸が挙げられる。
【0207】
外因性核酸は、ＣＤ１６３座位を改変するように、ＣＤ１６３座位で組み込ませることができ、ここで、核酸は対象となるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、そのため、ヌクレオチド配列が宿主においてＣＤ１６３座位から発現される。いくつかの例において、対象となるポリペプチド（例えば、外来タンパク質）は、対象となるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列から、商業的量で発現される。そのような例では、対象となるポリペプチドは、宿主細胞、組織、またはバイオマスから抽出され得る。
【0208】
ターゲティングエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子
ターゲティングエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、ターゲティングエンドヌクレアーゼ内に含まれるポリペプチドをコードする天然ヌクレオチド配列の操作（例えば、ライゲーション）により操作することができる。例えば、ＤＮＡ結合ポリペプチドを含むタンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、ＤＮＡ結合ポリペプチドに対応する遺伝子のヌクレオチド配列を同定するために検査され得、そのヌクレオチド配列は、ＤＮＡ結合ポリペプチドを含むターゲティングエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の要素として使用され得る。あるいは、ターゲティングエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列は、例えば、遺伝コードの縮重に従い、ターゲティングエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を推定するために使用され得る。
ターゲティングエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、ターゲティングエンドヌクレアーゼ内に含まれるポリペプチドをコードする天然ヌクレオチド配列の操作（例えば、ライゲーション）により操作することができる。例えば、ＤＮＡ結合ポリペプチドを含むタンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、ＤＮＡ結合ポリペプチドに対応する遺伝子のヌクレオチド配列を同定するために検査され得、そのヌクレオチド配列は、ＤＮＡ結合ポリペプチドを含むターゲティングエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の要素として使用され得る。あるいは、ターゲティングエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列は、例えば、遺伝コードの縮重に従い、ターゲティングエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を推定するために使用され得る。
【0209】
ターゲティングエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む例示的な核酸分子では、ヌクレアーゼポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド配列の最後のコドン、およびＤＮＡ結合ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド配列の最初のコドンは、任意の数のヌクレオチドトリプレットにより、例えば、イントロンまたは「ＳＴＯＰ」をコードすることなく分離され得る。同様に、ＤＮＡ結合ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド配列をコードするヌクレオチド配列の最後のコドン、およびヌクレアーゼポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド配列の最初のコドンは、任意の数のヌクレオチドトリプレットにより分離され得る。ヌクレアーゼポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド配列の最後のコドン（すなわち、核酸配列における最も３’側）、およびＤＮＡ結合ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、これに直接近接し、またはわずか短ペプチド配列、例えば合成ヌクレオチドリンカー（例えば、融合を達成するために使用され得るヌクレオチドリンカー）によりコードされるものによりそこから分離された、さらなるポリヌクレオチドコード配列の最初のコドンと、相一致で（フェイズレジスターで：ｉｎ ｐｈａｓｅ－ｒｅｇｉｓｔｅｒ）融合させることができる。そのようなさらなるポリヌクレオチド配列の例としては、例えば、限定はされないが、タグ、ターゲティングペプチド、および酵素切断部位が挙げられる。同様に、第１および第２のポリヌクレオチド配列の最も５’側（核酸配列における）の最初のコドンは、これに直接近接し、またはわずか短ペプチド配列によりそこから分離された、さらなるポリヌクレオチドコード配列の最後のコドンと、相一致で融合され得る。
【0210】
ターゲティングエンドヌクレアーゼ内の機能性ポリペプチド（例えば、ＤＮＡ結合ポリペプチドおよびヌクレアーゼポリペプチド）をコードするポリヌクレオチド配列を分離する配列は、例えば、任意の配列から構成することができ、そのため、コードされたアミノ酸配列は、ターゲティングエンドヌクレアーゼの翻訳を著しく変更させる可能性は低い。公知のヌクレアーゼポリペプチドおよび公知のＤＮＡ結合ポリペプチドの自立した性質のために、介在配列はこれらの構造の個々の機能を妨害しないであろう。
【0211】
他のノックアウト方法
当技術分野で知られている様々な他の技術を使用して、遺伝子を不活性化し、ノックアウト動物を作製することおよび／または核酸コンストラクトを動物に導入し、ファウンダー動物を作製し、動物系統を生成させることができ、ここで、ノックアウトまたは核酸コンストラクトはゲノムに組み込まれる。そのような技術としては、限定はされないが、前核マイクロインジェクション（米国特許第４，８７３，１９１号）、生殖系列へのレトロウイルス媒介遺伝子導入（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２， ６１４８－１６５２）、胚性幹細胞への遺伝子ターゲティング（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｃｅｌｌ ５６， ３１３－３２１）、胚の電気穿孔（Ｌｏ （１９８３） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ３， １８０３－１８１４）、精子－媒介遺伝子導入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９９， １４２３０－１４２３５； Ｌａｖｉｔｒａｎｏ ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｒｅｐｒｏｄ． Ｆｅｒｔ． Ｄｅｖｅｌｏｐ． １８， １９－２３）、および体細胞、例えば卵丘または乳房細胞、または成体、胎仔、もしくは胚性幹細胞のインビトロ形質転換、続いて核移植（Ｗｉｌｍｕｔ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ ３８５， ８１０－８１３；およびＷａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｎａｔｕｒｅ ３９４， ３６９－３７４）が挙げられる。前核マイクロインジェクション、精子媒介遺伝子導入、および体細胞核移植は特に有用な技術である。ゲノム的に改変された動物は、その生殖系列細胞を含むその細胞のすべてが遺伝子改変を有する動物である。その遺伝子改変においてモザイクである動物を作製する方法が使用される場合、動物は近交系であってもよく、ゲノム的に改変された後代が選択され得る。その細胞が胚盤胞状態で改変される場合、例えば、クローニングを使用して、モザイク動物を作製してもよく、または単一細胞が改変される場合、ゲノム改変が起こり得る。性的に成熟しないように改変された動物は、使用される特定のアプローチによって、改変についてホモ接合性またはヘテロ接合性とすることができる。特定の遺伝子がノックアウト改変により不活性化される場合、ホモ接合性が普通要求されるであろう。特定の遺伝子がＲＮＡ干渉またはドミナントネガティブ戦略により不活性化される場合、そうすると、ヘテロ接合性がしばしば十分である。
当技術分野で知られている様々な他の技術を使用して、遺伝子を不活性化し、ノックアウト動物を作製することおよび／または核酸コンストラクトを動物に導入し、ファウンダー動物を作製し、動物系統を生成させることができ、ここで、ノックアウトまたは核酸コンストラクトはゲノムに組み込まれる。そのような技術としては、限定はされないが、前核マイクロインジェクション（米国特許第４，８７３，１９１号）、生殖系列へのレトロウイルス媒介遺伝子導入（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２， ６１４８－１６５２）、胚性幹細胞への遺伝子ターゲティング（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｃｅｌｌ ５６， ３１３－３２１）、胚の電気穿孔（Ｌｏ （１９８３） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ３， １８０３－１８１４）、精子－媒介遺伝子導入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９９， １４２３０－１４２３５； Ｌａｖｉｔｒａｎｏ ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｒｅｐｒｏｄ． Ｆｅｒｔ． Ｄｅｖｅｌｏｐ． １８， １９－２３）、および体細胞、例えば卵丘または乳房細胞、または成体、胎仔、もしくは胚性幹細胞のインビトロ形質転換、続いて核移植（Ｗｉｌｍｕｔ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ ３８５， ８１０－８１３；およびＷａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｎａｔｕｒｅ ３９４， ３６９－３７４）が挙げられる。前核マイクロインジェクション、精子媒介遺伝子導入、および体細胞核移植は特に有用な技術である。ゲノム的に改変された動物は、その生殖系列細胞を含むその細胞のすべてが遺伝子改変を有する動物である。その遺伝子改変においてモザイクである動物を作製する方法が使用される場合、動物は近交系であってもよく、ゲノム的に改変された後代が選択され得る。その細胞が胚盤胞状態で改変される場合、例えば、クローニングを使用して、モザイク動物を作製してもよく、または単一細胞が改変される場合、ゲノム改変が起こり得る。性的に成熟しないように改変された動物は、使用される特定のアプローチによって、改変についてホモ接合性またはヘテロ接合性とすることができる。特定の遺伝子がノックアウト改変により不活性化される場合、ホモ接合性が普通要求されるであろう。特定の遺伝子がＲＮＡ干渉またはドミナントネガティブ戦略により不活性化される場合、そうすると、ヘテロ接合性がしばしば十分である。
【0212】
典型的には、胚／接合体マイクロインジェクションでは、核酸コンストラクトまたはｍＲＮＡが、受精卵に導入される；１または２細胞受精卵が、原形質内で視認可能な、精子頭部および卵由来の遺伝子材料を含む核構造として使用される。前核段階の受精卵は、インビトロまたはインビボで入手可能である（すなわち、ドナー動物の卵管から外科的に回収される）。体外受精卵は下記の通りに作製することができる。例えば、ブタ卵巣は、屠殺場で収集し、輸送中、２２～２８℃で維持することができる。卵巣は、卵胞吸引のために洗浄し、単離することができ、４～８ｍｍの範囲の卵胞を、５０ｍＬ円錐遠心管中に、１８ゲージ針を用いて、真空下で吸引することができる。卵胞液および吸引された卵母細胞はプリフィルタを通して市販のＴＬ－ＨＥＰＥＳ（Ｍｉｎｉｔｕｂｅ， Ｖｅｒｏｎａ， Ｗｉｓ．）でリンスすることができる。緻密な卵丘塊に囲まれた卵母細胞を選択し、０．１ｍｇ／ｍＬシステイン、１０ｎｇ／ｍＬ上皮成長因子、１０％ブタ卵胞液、５０μＭの２－メルカプトエタノール、０．５ｍｇ／ｍｌのｃＡＭＰ、１０ＩＵ／ｍＬの妊馬血清性ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）およびヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の各々が補充されたＴＣＭ－１９９卵母細胞成熟培地（Ｍｉｎｉｔｕｂｅ， Ｖｅｒｏｎａ， Ｗｉｓ．）中におよそ２２時間の間、加湿空気中３８．７℃および５％ＣＯ２で入れることができる。その後、卵母細胞は新鮮ＴＣＭ－１９９成熟培地（ｃＡＭＰ、ＰＭＳＧまたはｈＣＧを含まない）に移動させ、さらに２２時間の間インキュベートさせることができる。成熟卵母細胞は、０．１％ヒアルロニダーゼ中で１分間ボルテックスさせることにより、それらの卵丘細胞を取り除くことができる。
【0213】
ブタでは、成熟卵母細胞は、Ｍｉｎｉｔｕｂｅ５ウェル受精ディッシュにおける５００μｌ Ｍｉｎｉｔｕｂｅ ＰＯＲＣＰＲＯ ＩＶＦ培地系（Ｍｉｎｉｔｕｂｅ， Ｖｅｒｏｎａ， Ｗｉｓ．）中で受精させることができる。体外受精（ＩＶＦ）に備えて、新たに収集した、または凍結した雄豚精液は、洗浄し、ＰＯＲＣＰＲＯ ＩＶＦ培地中に４００，０００精子まで再懸濁させることができる。精子濃度はコンピュータ支援精液分析（ＳＰＥＲＭＶＩＳＩＯＮ， Ｍｉｎｉｔｕｂｅ， Ｖｅｒｏｎａ， Ｗｉｓ．）により分析することができる。最終インビトロ精子注入は１０μｌ体積中、雄豚によって、およそ４０の運動精子／卵母細胞の最終濃度で実行することができる。全ての受精卵母細胞は、３８．７℃で５．０％ＣＯ２雰囲気において、６時間の間インキュベートすることができる。精子注入後６時間に、予定接合体は、２回ＮＣＳＵ－２３中で洗浄し、０．５ｍＬの同じ培地に移動させることができる。このシステムは、２０～３０％の胚盤胞をルーチン的にほとんどの雄豚にわたって、１０～３０％の多精受精精子注入率で作製することができる。
【0214】
直線化核酸コンストラクトまたはｍＲＮＡは前核の１つまたは細胞質中に注入することができる。その後、注入された卵は、雌レシピエント（例えば、雌レシピエントの卵管中）に移植することができ、雌レシピエント中で発育させることができ、トランスジェニックまたは遺伝子編集動物が作製される。特に、体外受精された胚は１５，０００×ｇで５分間遠心分離し、脂質を沈降させることができ、前核の可視化が可能になる。胚はＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ＦＥＭＴＯＪＥＴインジェクターを用いて注入することができ、胚盤胞形成まで培養することができる。胚卵割および胚盤胞形成の速度および特性は記録することができる。
【0215】
胚は、非同期性レシピエントの子宮に、外科的に移植することができる。典型的には、１００～２００（例えば、１５０～２００）の胚は卵管の膨大部－峡部接合部に５．５インチＴＯＭＣＡＴ（登録商標）カテーテルを用いて置くことができる。外科手術後、妊娠のリアルタイム超音波検査を実行することができる。
【0216】
体細胞核移植では、上記核酸コンストラクトを含むトランスジェニックまたは遺伝子編集細胞、例えば胚割球、胎仔線維芽細胞、成体耳線維芽細胞、または顆粒膜細胞は、除核卵母細胞に導入させることができ、複合細胞が確立される。卵母細胞は極体近くで透明帯部分切開し、その後、細胞質を切開エリアで押し出すことにより除核することができる。典型的には、鋭い斜角先端を有するインジェクションピペットが使用され、トランスジェニックまたは遺伝子編集細胞が減数分裂２期で停止された除核卵母細胞に注入される。いくつかの会議では、減数分裂２期で停止された卵母細胞は卵と呼ばれる。ブタまたはウシ胚を作製した後（例えば、卵母細胞を融合させ、活性化させることにより）、胚は雌レシピエントの卵管に活性化後約２０～２４時間に移植される。例えば、Ｃｉｂｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８０， １２５６－１２５８および米国特許第６，５４８，７４１号、７，５４７，８１６号、７，９８９，６５７号、または６，２１１，４２９号を参照されたい。ブタでは、雌レシピエントは、胚の移植後およそ２０～２１日に、妊娠についてチェックすることができる。
【0217】
標準繁殖技術を使用して、最初のヘテロ接合性ファウンダー動物由来の不活性化遺伝子についてホモ接合性である動物を作製することができる。しかしながら、ホモ接合性は必要とされない可能性がある。本明細書で記載される遺伝子編集ブタは、対象となる他のブタと共に繁殖させることができる。
【0218】
遺伝子編集動物が作製されるとすぐに、内在性核酸の不活性化が標準技術を用いて評価され得る。初期スクリーニングは、サザンブロット解析により達成することができ、不活性化が起きたかどうかが決定される。サザン解析の説明については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ；Ｎ．Ｙ．のセクション９．３７－９．５２を参照されたい。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術もまた、初期スクリーニングにおいて使用することができる。ＰＣＲは、標的核酸が増幅される手順または技術を示す。一般に、対象となる領域の端からの、またはこれを超える配列情報が、増幅されるテンプレートの逆ストランドと配列が同一または同様であるオリゴヌクレオチドプライマーを設計するために使用される。ＰＣＲは、ＤＮＡならびにＲＮＡ由来の特定配列（全ゲノムＤＮＡまたは全細胞ＲＮＡ由来の配列を含む）を増幅するために使用することができる。プライマーは典型的には１４～４０ヌクレオチドの長さであるが、１０ヌクレオチド～何百ものヌクレオチドの長さの範囲とすることができる。ＰＣＲは、例えば、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ｅｄ． Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ ａｎｄ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９９５において記載される。核酸はまた、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、自家持続配列複製、または核酸配列ベース増幅により増幅させることができる。例えば、Ｌｅｗｉｓ （１９９２） Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｎｅｗｓ １２，１； Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：１８７４；およびＷｅｉｓｓ （１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１２９２を参照されたい。胚盤胞期では、胚は、ＰＣＲ、サザンハイブリダイゼーションおよびｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅ ＰＣＲにより、分析のために個々に処理することができる（例えば、Ｄｕｐｕｙ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ （２００２） ９９：４４９５を参照されたい）。
【0219】
干渉ＲＮＡ
様々な干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）システムが知られている。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、相同遺伝子転写物の配列特異的分解を誘導する。ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）はｄｓＲＮＡを、小さな２１～２３ヌクレオチド低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に代謝する。ＲＩＳＣは二本鎖ＲＮＡｓｅ（ｄｓＲＮＡｓｅ、例えば、ダイサー）およびｓｓＲＮＡｓｅ（例えば、アルゴノート２またはＡｇｏ２）を含む。ＲＩＳＣはアンチセンス鎖を、切断可能な標的を見出すガイドとして利用する。ｓｉＲＮＡおよびｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）はどちらも知られている。遺伝学的に編集される動物において遺伝子を不活性化する方法は、標的遺伝子および／または核酸の発現が低減されるように、標的遺伝子および／または核酸に対するＲＮＡ干渉を誘導することを含む。
様々な干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）システムが知られている。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、相同遺伝子転写物の配列特異的分解を誘導する。ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）はｄｓＲＮＡを、小さな２１～２３ヌクレオチド低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に代謝する。ＲＩＳＣは二本鎖ＲＮＡｓｅ（ｄｓＲＮＡｓｅ、例えば、ダイサー）およびｓｓＲＮＡｓｅ（例えば、アルゴノート２またはＡｇｏ２）を含む。ＲＩＳＣはアンチセンス鎖を、切断可能な標的を見出すガイドとして利用する。ｓｉＲＮＡおよびｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）はどちらも知られている。遺伝学的に編集される動物において遺伝子を不活性化する方法は、標的遺伝子および／または核酸の発現が低減されるように、標的遺伝子および／または核酸に対するＲＮＡ干渉を誘導することを含む。
【0220】
例えば、外因性核酸配列は、ポリペプチドをコードする核酸に対するＲＮＡ干渉を誘導することができる。例えば、標的ＤＮＡに相同な二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を使用して、そのＤＮＡの発現を低減させることができる。ｓｉＲＮＡのためのコンストラクトは、例えば、Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｎａｔｕｒｅ ３９１：８０６； Ｒｏｍａｎｏ ａｎｄ Ｍａｓｉｎｏ （１９９２） Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６：３３４３； Ｃｏｇｏｎｉ ｅｔ ａｌ． （１９９６） ＥＭＢＯ Ｊ． １５：３１５３； Ｃｏｇｏｎｉ ａｎｄ Ｍａｓｉｎｏ （１９９９） Ｎａｔｕｒｅ ３９９：１６６； Ｍｉｓｑｕｉｔｔａ ａｎｄ Ｐａｔｅｒｓｏｎ （１９９９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：１４５１；およびＫｅｎｎｅｒｄｅｌｌ ａｎｄ Ｃａｒｔｈｅｗ （１９９８） Ｃｅｌｌ ９５：１０１７において記載されるように作製することができる。ｓｈＲＮＡのためのコンストラクトは、ＭｃＩｎｔｙｒｅ ａｎｄ Ｆａｎｎｉｎｇ （２００６） ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１により記載されるように作製することができる。一般に、ｓｈＲＮＡは相補領域を含む一本鎖ＲＮＡ分子として転写され、これは、アニールし、低分子ヘアピンを形成することができる。
【0221】
特定遺伝子に配向される単一の、個々の機能性ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを見出す確率は高い。ｓｉＲＮＡの特定配列の予測性は、例えば、約５０％であるが、多くの干渉ＲＮＡが、それらの少なくとも１つが有効であるという良好な確実性で作製され得る。
【0222】
ＣＤ１６３をコードする遺伝子に向けられるＲＮＡｉを発現するインビトロ細胞、インビボ細胞、または遺伝学的に編集された動物、例えば家畜動物が使用され得る。ＲＮＡｉは、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ＲＩＳＣおよびｍｉＲＮＡからなる群より選択され得る。
【0223】
誘導システム
ＣＤ１６３遺伝子を不活性化するために、誘導システムが使用され得る。遺伝子の不活性化の空間的および時間的な制御を可能にする様々な誘導システムが知られている。いくつかが、ブタ動物においてインビボで機能的であることが証明されている。
ＣＤ１６３遺伝子を不活性化するために、誘導システムが使用され得る。遺伝子の不活性化の空間的および時間的な制御を可能にする様々な誘導システムが知られている。いくつかが、ブタ動物においてインビボで機能的であることが証明されている。
【0224】
誘導システムの一例はテトラサイクリン（ｔｅｔ）－ｏｎプロモーターシステムであり、これは核酸の転写を調節するために使用することができる。このシステムでは、変異Ｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）が、単純ヘルペスウイルスＶＰ１６トランス活性化因子タンパク質の活性化ドメインに融合され、テトラサイクリン制御転写活性化因子（ｔＴＡ）が作製され、これはｔｅｔまたはドキシサイクリン（ｄｏｘ）により調節される。抗生物質がない場合、転写は最小となり、一方、ｔｅｔまたはｄｏｘの存在下では、転写が誘導される。別の誘導システムとしては、エクジソンまたはラパマイシンシステムが挙げられる。エクジソンは昆虫脱皮ホルモンであり、その産生はエクジソン受容体およびウルトラスピラクル遺伝子（ＵＳＰ）の産物のヘテロ二量体により制御される。発現は、エクジソンまたはエクジソンの類似体、例えばムリステロンＡによる処理により誘導される。誘導システムを始動させるために動物に投与される作用物質は誘導剤と呼ばれる。
【0225】
テトラサイクリン誘導システムおよびＣｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステム（恒常的または誘導性）はより一般的に使用される誘導システムの１つである。テトラサイクリン誘導システムはテトラサイクリン制御トランス活性化因子（ｔＴＡ）／リバースｔＴＡ（ｒｔＴＡ）を含む。これらのシステムをインビボで使用するための方法は２系統の遺伝学的に編集された動物を作製することを含む。１つの動物系統は、選択されたプロモーターの制御下で活性化因子（ｔＴＡ、ｒｔＴＡ、またはＣｒｅリコンビナーゼ）を発現する。別の系統の動物は、受容体を発現し、この場合、対象となる遺伝子（または改変される遺伝子）の発現はｔＴＡ／ｒｔＴＡトランス活性化因子のための標的配列の制御下にある（またはｌｏｘＰ配列と隣接している）。動物の２つを交配させると、遺伝子発現の制御が提供される。
【0226】
テトラサイクリン依存性制御システム（ｔｅｔシステム）は、２つの成分、すなわち、テトラサイクリン制御トランス活性化因子（ｔＴＡまたはｒｔＴＡ）および、テトラサイクリン依存性様式で、下流ｃＤＮＡの発現を制御するｔＴＡ／ｒｔＴＡ依存性プロモーターに依存する。テトラサイクリンまたはその誘導体（例えば、ドキシサイクリン）がない場合、ｔＴＡはｔｅｔＯ配列に結合し、ｔＴＡ依存性プロモーターの転写活性化を可能にする。しかしながら、ドキシサイクリンの存在下では、ｔＴＡはその標的と相互作用することができず、転写はおこらない。ｔＴＡを使用するｔｅｔシステムは、ｔｅｔ－ＯＦＦと呼ばれ、というのも、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンは転写の下方制御を可能にするからである。テトラサイクリンまたはその誘導体の投与はインビボでの導入遺伝子発現の時間的制御を可能にする。ｒｔＴＡは、ドキシサイクリンがないと機能的ではないが、トランス活性化のためのリガンドの存在を必要とするｔＴＡのバリアントである。そのため、このｔｅｔシステムはｔｅｔ－ＯＮと呼ばれる。ｔｅｔシステムは、例えば、レポーター遺伝子、発癌遺伝子、またはシグナル伝達カスケードに関与するタンパク質をコードするいくつかの導入遺伝子の誘導発現のためにインビボで使用されている。
【0227】
Ｃｒｅ／ｌｏｘシステムはＣｒｅリコンビナーゼを使用し、これは２つの遠いＣｒｅ認識配列、すなわち、ｌｏｘＰ部位間のクロスオーバーによる部位特異的な組換えを触媒する。２つのｌｏｘＰ配列間に導入されるＤＮＡ配列（ｆｌｏｘｅｄ ＤＮＡと呼ばれる）はＣｒｅ媒介組換えにより切り取られる。空間的制御（組織または細胞特異的プロモーターによる）、または時間的制御（誘導システムによる）のいずれかを用いた、トランスジェニックおよび／または遺伝子編集動物におけるＣｒｅ発現の制御により、２つのｌｏｘＰ部位間のＤＮＡ切り取りの制御が得られる。１つの適用はコンディショナル遺伝子不活性化（コンディショナルノックアウト）のためである。別の適用はタンパク質過剰発現のためであり、ここで、ｆｌｏｘｅｄ終止コドンは、プロモーター配列と対象となるＤＮＡの間に挿入される。遺伝学的に編集された動物は、Ｃｒｅが発現され、ｆｌｏｘｅｄ終止コドンの切り取りに至るまで導入遺伝子を発現しない。このシステムは組織特異的発癌に適用され、Ｂリンパ球におけるアンチジーン受容体発現を制御してきた。誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼもまた開発された。誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼは外因性リガンドの投与によってのみ活性化される。誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼは元のＣｒｅリコンビナーゼおよび特異的リガンド結合ドメインを含む融合タンパク質である。Ｃｒｅリコンビナーゼの機能活性は、融合タンパク質内のこの特異ドメインに結合することができる外部リガンドに依存する。
【0228】
誘導システムの制御下でＣＤ１６３遺伝子を含む、インビトロ細胞、インビボ細胞、または遺伝学的に編集された動物、例えば家畜動物が使用され得る。動物の遺伝子改変は、ゲノムでもモザイクでもよい。誘導システムは、例えば、Ｔｅｔ－Ｏｎ、Ｔｅｔ－Ｏｆｆ、Ｃｒｅ－ｌｏｘ、およびＨｉｆ１αからなる群より選択され得る。
【0229】
ベクターおよび核酸
様々な核酸が、細胞ノックアウト目的のために、遺伝子の不活性化のために、遺伝子の発現を得るために、または他の目的のために導入され得る。本明細書では、核酸という用語はＤＮＡ、ＲＮＡ、および核酸類似体、および二本鎖または一本鎖（すなわち、センスまたはアンチセンス一本鎖）である核酸を含む。核酸類似体は、例えば、核酸の安定性、ハイブリダイゼーション、または溶解度を改善させるために、塩基部分、糖部分、またはリン酸バックボーンで改変することができる。塩基部分での改変としては、デオキシチミジンに対するデオキシウリジン、ならびにデオキシシチジンに対する５－メチル－２’－デオキシシチジンおよび５－ブロモ－２’－デオキシシチジンが挙げられる。糖部分の改変としては、２’－Ｏ－メチルまたは２’－Ｏ－アリル糖を形成するためのリボース糖の２’ヒドロキシルの改変が挙げられる。デオキシリボースリン酸バックボーンは、モルホリノ核酸（この場合、各塩基部分は６員、モルホリノ環に連結される）、またはペプチド核酸（この場合、デオキシリン酸バックボーンは疑似ペプチドバックボーンにより置き換えられ、４つの塩基は保持される）を生成させるように改変することができる。Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｗｅｌｌｅｒ （１９９７） Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ． ７（３）：１８７；およびＨｙｒｕｐ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｂｉｏｏｒｇａｎ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ４：５を参照されたい。加えて、デオキシリン酸バックボーンは、例えば、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートバックボーン、ホスホロアミダイト、またはアルキルホスホトリエステルバックボーンで置き換えることができる。
様々な核酸が、細胞ノックアウト目的のために、遺伝子の不活性化のために、遺伝子の発現を得るために、または他の目的のために導入され得る。本明細書では、核酸という用語はＤＮＡ、ＲＮＡ、および核酸類似体、および二本鎖または一本鎖（すなわち、センスまたはアンチセンス一本鎖）である核酸を含む。核酸類似体は、例えば、核酸の安定性、ハイブリダイゼーション、または溶解度を改善させるために、塩基部分、糖部分、またはリン酸バックボーンで改変することができる。塩基部分での改変としては、デオキシチミジンに対するデオキシウリジン、ならびにデオキシシチジンに対する５－メチル－２’－デオキシシチジンおよび５－ブロモ－２’－デオキシシチジンが挙げられる。糖部分の改変としては、２’－Ｏ－メチルまたは２’－Ｏ－アリル糖を形成するためのリボース糖の２’ヒドロキシルの改変が挙げられる。デオキシリボースリン酸バックボーンは、モルホリノ核酸（この場合、各塩基部分は６員、モルホリノ環に連結される）、またはペプチド核酸（この場合、デオキシリン酸バックボーンは疑似ペプチドバックボーンにより置き換えられ、４つの塩基は保持される）を生成させるように改変することができる。Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｗｅｌｌｅｒ （１９９７） Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ． ７（３）：１８７；およびＨｙｒｕｐ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｂｉｏｏｒｇａｎ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ４：５を参照されたい。加えて、デオキシリン酸バックボーンは、例えば、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートバックボーン、ホスホロアミダイト、またはアルキルホスホトリエステルバックボーンで置き換えることができる。
【0230】
標的核酸配列はプロモーターなどの調節領域に作動可能に連結させることができる。調節領域はブタ調節領域とすることができ、または他の種由来とすることができる。本明細書では、作動可能に連結されたとは、標的核酸の転写を可能にする、または促進するような、核酸配列に対する調節領域の配置を示す。
【0231】
任意の型のプロモーターを、標的核酸配列に作動可能に連結させることができる。プロモーターの例としては、限定はされないが、組織特異的プロモーター、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、および特定の刺激に対して応答性または無応答性のプロモーターが挙げられる。好適な組織特異的プロモーターは、β細胞における核酸転写物の優先的発現という結果を与えることができ、例えば、ヒトインスリンプロモーターが挙げられる。他の組織特異的プロモーターは、例えば、肝細胞または心臓組織における優先的発現という結果を与えることができ、それぞれ、アルブミンまたはα－ミオシン重鎖プロモーターが挙げられる。著しい組織または時間特異性なしで、核酸分子の発現を促進するプロモーターが（すなわち、構成的プロモーター）使用され得る。例えば、βアクチンプロモーター、例えばニワトリβアクチン遺伝子プロモーター、ユビキチンプロモーター、ｍｉｎｉＣＡＧｓプロモーター、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター、または３－ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ならびにウイルスプロモーター、例えば単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターが使用され得る。例えば、ニワトリβアクチン遺伝子プロモーターとＣＭＶエンハンサーの融合物が、プロモーターとして使用され得る。例えば、Ｘｕ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １２：５６３；およびＫｉｗａｋｉ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：８２１を参照されたい。
【0232】
核酸コンストラクトで有用となり得る追加の調節領域としては、ポリアデニル化配列、翻訳制御配列（例えば、配列内リボソーム進入セグメント、ＩＲＥＳ）、エンハンサー、誘導要素、またはイントロンが挙げられるが、それらに限定されない。そのような調節領域は必須ではないかもしれないが、それらは、転写、ｍＲＮＡの安定性、翻訳効率、などに影響することにより、発現を増加させることができる。そのような調節領域は、要望通り、細胞（複数可）において核酸の最適発現を得るために、核酸コンストラクトに含めることができる。しかしながら、十分な発現は、時として、そのような追加の要素なしで得ることができる。
【0233】
シグナルペプチドまたは選択可能なマーカーをコードする核酸コンストラクトが使用され得る。シグナルペプチドは、コードされたポリペプチドが特定の細胞位置（例えば、細胞表面）に指向されるように使用することができる。選択可能なマーカーの非限定的な例としては、ピューロマイシン、ガンシクロビル、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ、Ｇ４１８、ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン－Ｂ－ホスホトランスフェラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、およびキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）が挙げられる。そのようなマーカーは、培養下の安定な形質転換体を選択するのに有用である。他の選択可能なマーカーとしては蛍光ポリペプチド、例えば緑色蛍光タンパク質または黄色蛍光タンパク質が挙げられる。
【0234】
選択可能なマーカーをコードする配列は、例えば、ＣｒｅまたはＦｌｐなどのリコンビナーゼに対する認識配列と隣接することができる。例えば、選択可能なマーカーは、ｌｏｘＰ認識部位（Ｃｒｅリコンビナーゼにより認識される３４ｂｐ認識部位）またはＦＲＴ認識部位と隣接することができ、そのため、選択可能なマーカーはコンストラクトから切り取ることができる。Ｃｒｅ／ｌｏｘ技術の再調査のためには、Ｏｒｂａｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （１９９２） ８９：６８６１およびＢｒａｎｄ ａｎｄ Ｄｙｍｅｃｋｉ， Ｄｅｖ． Ｃｅｌｌ （２００４） ６：７を参照されたい。選択可能なマーカー遺伝子により中断されたＣｒｅ－またはＦｌｐ－活性化可能導入遺伝子を含むトランスポゾンもまた、導入遺伝子のコンディショナル発現を有する動物を得るために使用することができる。例えば、マーカー／導入遺伝子の発現を駆動するプロモーターは、遍在性または組織特異的のいずれかとすることができ、これにより、Ｆ０動物（例えば、ブタ）におけるマーカーの遍在性または組織特異的発現が得られるであろう。導入遺伝子の組織特異的活性化は、例えば、マーカー中断導入遺伝子を遍在的に発現するブタを、ＣｒｅまたはＦｌｐを組織特異的様式で発現するブタに交配させることにより、またはマーカー中断導入遺伝子を組織特異的様式で発現するブタを、ＣｒｅまたはＦｌｐリコンビナーゼを遍在的に発現するブタに交配させることにより達成することができる。導入遺伝子の制御発現またはマーカーの制御された切り取りは、導入遺伝子の発現を可能にする。
【0235】
外因性核酸は、ポリペプチドをコードすることができる。ポリペプチドをコードする核酸配列は、コードされたポリペプチドのその後の操作を促進する（例えば、局在化または検出を促進する）ように設計された「ｔａｇ」をコードするｔａｇ配列を含むことができる。ｔａｇ配列は、コードされたｔａｇがポリペプチドのカルボキシルまたはアミノ末端のいずれかに配置されるように、ポリペプチドをコードする核酸配列に挿入することができる。コードされたタグの非限定的な例としては、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）およびＦＬＡＧ（商標）ｔａｇ（Ｋｏｄａｋ， Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ， Ｃｏｎｎ．）が挙げられる。
【0236】
核酸コンストラクトはＳｓｓＩ ＣｐＧメチラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｐｓｗｉｃｈ， Ｍａｓｓ．）を用いてメチル化することができる。一般に、核酸コンストラクトは、Ｓ－アデノシルメチオニンおよびＳｓｓＩ ＣｐＧ－メチラーゼと共に緩衝液中、３７℃でインキュベートすることができる。過剰メチル化は、コンストラクトを１単位のＨｉｎＰ１Ｉエンドヌクレアーゼと１時間の間３７℃でインキュベートし、アガロースゲル電気泳動によりアッセイすることにより確認することができる。
【0237】
核酸コンストラクトは、任意の型の胚性、胎仔、成体動物細胞、例えば、例として、生殖細胞、例えば卵母細胞または卵、前駆細胞、成体もしくは胚性幹細胞、始原生殖細胞、腎細胞、例えばＰＫ－１５細胞、島細胞、β細胞、肝細胞、または線維芽細胞、例えば、皮膚線維芽細胞に、様々な技術を用いて導入させることができる。技術の非限定的な例としては、トランスポゾンシステム、細胞に感染することができる組換えウイルス、またはリポソームまたは他の非ウイルス方法、例えば電気穿孔、マイクロインジェクション、またはリン酸カルシウム沈殿が挙げられ、それらは、核酸を細胞に送達させることができる。
【0238】
トランスポゾンシステムでは、核酸コンストラクトの転写ユニット、すなわち、外因性核酸配列に作動可能に連結された調節領域は、トランスポゾンの逆方向反復と隣接している。いくつかのトランスポゾンシステム、例えば、例として、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（米国特許第６，６１３，７５２号および米国特許公開第２００５／０００３５４２号を参照されたい）；Ｆｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅ（Ｍｉｓｋｅｙ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３１：６８７３）；Ｔｏｌ２（Ｋａｗａｋａｍｉ （２００７） Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ７；Ｍｉｎｏｓ（Ｐａｖｌｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ． （２００７） Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ２）；Ｈｓｍａｒ１（Ｍｉｓｋｅｙ ｅｔ ａｌ． （２００７）） Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２７：４５８９）；およびＰａｓｓｐｏｒｔが、核酸をマウス、ヒト、およびブタ細胞を含む細胞に導入するために開発されている。Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンは特に有用である。トランスポサーゼは外因性核酸と同じ核酸コンストラクト上でコードされたタンパク質として送達させることができ、別々の核酸コンストラクト上で導入させることができ、またはｍＲＮＡ（例えば、インビトロ転写およびキャップｍＲＮＡ）として提供することができる。
【0239】
インスレーター要素もまた、外因性核酸の発現を維持するため、および宿主遺伝子の望まれない転写を阻止するために、核酸コンストラクトに含ませることができる。例えば、米国特許公開第２００４／０２０３１５８号を参照されたい。典型的には、インスレーター配列は転写ユニットの両側に隣接し、トランスポゾンの逆方向反復の内部である。インスレーター配列の非限定的な例としては、マトリックス付着領域－（ＭＡＲ）型インスレーター配列および境界型インスレーター配列が挙げられる。例えば、米国特許第６，３９５，５４９号、５，７３１，１７８号、６，１００，４４８号、および５，６１０，０５３号、および米国特許公開第２００４／０２０３１５８号を参照されたい。
【0240】
核酸は、ベクターに組み込むことができる。ベクターは広義語であり、キャリアから標的ＤＮＡ中に移動するように設計された任意の特異的ＤＮＡセグメントを含む。ベクターは発現ベクター、またはベクターシステムと呼ばれてもよく、エピソーム、プラスミド、または実にウイルス／ファージＤＮＡセグメントなどの、ゲノムまたは他の標的ＤＮＡ配列へのＤＮＡ挿入を起こすの必要とされる１組の構成要素である。動物における遺伝子送達のために使用されるベクターシステム、例えばウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルスおよび組込みファージウイルス）、および非ウイルスベクター（例えば、トランスポゾン）は、２つの基本構成要素を有する：１）ＤＮＡ（またはｃＤＮＡに逆転写されるＲＮＡ）から構成されるベクターおよび２）トランスポサーゼ、リコンビナーゼ、またはベクターおよびＤＮＡ標的配列の両方を認識し、ベクターを標的ＤＮＡ配列中に挿入する他のインテグラーゼ酵素。ベクターは、ほとんどの場合、１つ以上の発現カセットを含み、これは１つ以上の発現制御配列を含み、ここで、発現制御配列は、それぞれ、別のＤＮＡ配列、またはｍＲＮＡの転写および／または翻訳を制御し、調節するＤＮＡ配列である。
【0241】
多くの異なる型のベクターが知られている。例えば、プラスミドおよびウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターが知られている。哺乳類発現プラスミドは典型的には複製開始点、好適なプロモーターおよび任意的なエンハンサー、必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終止配列、および５’隣接非転写配列を有する。ベクターの例としては下記が挙げられる：プラスミド（これはまた、別の型のベクターのキャリアであってもよい）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス（例えば、改変ＨＩＶ－１、ＳＩＶまたはＦＩＶ）、レトロウイルス（例えば、ＡＳＶ、ＡＬＶまたはＭｏＭＬＶ）、およびトランスポゾン（例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ、Ｐ－エレメント、Ｔｏｌ－２、Ｆｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅ、ｐｉｇｇｙＢａｃ）。
【0242】
本明細書では、核酸という用語は、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方を示し、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成（例えば、化学合成された）ＤＮＡ、ならびに天然由来および化学的に改変された核酸、例えば、合成塩基または別のバックボーンが挙げられる。核酸分子は二本鎖または一本鎖（すなわち、センスまたはアンチセンス一本鎖）とすることができる。
【0243】
ファウンダー動物、動物系統、形質、および繁殖
ファウンダー動物は、クローニングおよび本明細書で記載される他の方法により作製され得る。ファウンダーは、接合体または初代細胞がホモ接合性改変を受ける場合のように、遺伝子改変についてホモ接合性とすることができる。同様に、ヘテロ接合性であるファウンダーもまた、作製することができる。ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子において少なくとも１つの改変染色体配列を含む動物の場合、ファウンダーは好ましくはヘテロ接合性である。ファウンダーはゲノム的に改変されてもよく、細胞の全てがそれらのゲノムにおいて改変を受けていることを意味する。ファウンダーは、ベクターが胚内の複数の細胞の１つに、典型的には胚盤胞期に導入される場合に起こり得るように、改変についてモザイクとすることができる。モザイク動物の後代は、ゲノム的に改変されている後代を同定するために試験され得る。性的に、または生殖補助技術により繁殖させることができ、ヘテロまたはホモ接合性後代が一貫して改変を発現する動物のプールが作製された時に、動物系統が確立される。
ファウンダー動物は、クローニングおよび本明細書で記載される他の方法により作製され得る。ファウンダーは、接合体または初代細胞がホモ接合性改変を受ける場合のように、遺伝子改変についてホモ接合性とすることができる。同様に、ヘテロ接合性であるファウンダーもまた、作製することができる。ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子において少なくとも１つの改変染色体配列を含む動物の場合、ファウンダーは好ましくはヘテロ接合性である。ファウンダーはゲノム的に改変されてもよく、細胞の全てがそれらのゲノムにおいて改変を受けていることを意味する。ファウンダーは、ベクターが胚内の複数の細胞の１つに、典型的には胚盤胞期に導入される場合に起こり得るように、改変についてモザイクとすることができる。モザイク動物の後代は、ゲノム的に改変されている後代を同定するために試験され得る。性的に、または生殖補助技術により繁殖させることができ、ヘテロまたはホモ接合性後代が一貫して改変を発現する動物のプールが作製された時に、動物系統が確立される。
【0244】
家畜では、多くのアレルが様々な形質、例えば生産形質、体型形質、加工性形質、および他の機能的形質に関連することが知られている。当業者はこれらの形質のモニタリングおよび定量に慣れている、例えば、Ｖｉｓｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ４０ （１９９４） １２３－１３７、米国特許第７，７０９，２０６号、ＵＳ２００１／００１６３１５号、ＵＳ２０１１／００２３１４０号、およびＵＳ２００５／０１５３３１７号。動物系統は生産形質、体型形質、加工性形質、受精能形質、母形質、および耐病性形質からなる群における形質から選択される形質を含み得る。さらなる形質は組換え遺伝子産物の発現を含む。
【0245】
所望の１つまたは複数の形質を有する動物は、それらの性成熟を防止するように改変され得る。動物は成熟するまで繁殖不能であるので、動物の播種を制御する手段として、性的成熟を調節することができる。１つ以上の形質を有するように繁殖または改変された動物はこのように、レシピエントが動物を繁殖させ、形質の価値を占有するリスクが低減されたレシピエントに提供することができる。例えば、動物のゲノムは遺伝子改変させることができ、ここで、改変は性成熟遺伝子の不活性化を含み、ここで野生型動物における性成熟遺伝子は、性成熟に対して選択性の因子を発現する。動物は、動物において性成熟を誘導する遺伝子の発現の損失により引き起こされる欠乏を治療する化合物を投与することにより処置することができる。
【0246】
性的成熟を誘導するために化合物の投与を必要とする動物の繁殖は、便宜的に、処置施設で達成され得る。処置施設はコントロール良好の系統で標準化プロトコルを実行することができ、効率的に一貫した動物が作製される。動物後代は、飼育される複数の場所に分配され得る。農場および農夫（牧場および牧場主を含む用語）は、よって、特定範囲の年齢および／または体重および／または形質を有する所望の数の後代を注文し、所望の時間におよび／または場所で配達させることができる。レシピエント、例えば、農夫はその後、動物を飼育し、それらを、彼等が望む通り市場に配達することができる。
【0247】
不活性化性成熟遺伝子を有する遺伝子改変家畜動物は（例えば、１つ以上の場所、複数の農場）に配達することができる。動物は約１日～約１８０日の歳を有することができる。動物は１つ以上の形質（例えば、所望の形質または高値形質または新規形質または組換え形質を発現するもの）を有することができる。
【0248】
繁殖方法および感染に対する動物の抵抗性を増加させるための方法および動物の集団
病原体による感染に対する感受性が低減した動物または系統を作製するための繁殖方法が本明細書で提供される。方法は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子における改変染色体配列を卵母細胞および精細胞の少なくとも１つに導入するように、卵母細胞または精細胞を遺伝子改変させること、ならびに卵母細胞を精細胞と受精させ、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子において改変染色体配列を含む受精卵を作製することを含む。あるいは、方法は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子における改変染色体配列を受精卵に導入するように、受精卵を遺伝子改変させることを含む。方法は、受精卵を代理雌動物に移植すること（ここで、妊娠および正期産により子孫動物が産生される）；前記子孫動物を病原体に対する感受性についてスクリーニングすること；ならびにＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子において改変染色体配列を含まない動物と比べて、病原体に対する感受性が低減した子孫動物を選択することをさらに含む。
病原体による感染に対する感受性が低減した動物または系統を作製するための繁殖方法が本明細書で提供される。方法は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子における改変染色体配列を卵母細胞および精細胞の少なくとも１つに導入するように、卵母細胞または精細胞を遺伝子改変させること、ならびに卵母細胞を精細胞と受精させ、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子において改変染色体配列を含む受精卵を作製することを含む。あるいは、方法は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子における改変染色体配列を受精卵に導入するように、受精卵を遺伝子改変させることを含む。方法は、受精卵を代理雌動物に移植すること（ここで、妊娠および正期産により子孫動物が産生される）；前記子孫動物を病原体に対する感受性についてスクリーニングすること；ならびにＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子において改変染色体配列を含まない動物と比べて、病原体に対する感受性が低減した子孫動物を選択することをさらに含む。
【0249】
病原体による感染に対する感受性が低減した動物または系統を作製するための別の繁殖方法が提供される。方法は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子における改変染色体配列を卵母細胞および精細胞の少なくとも１つに導入するように、卵母細胞または精細胞を遺伝子改変させること、ならびに卵母細胞を精細胞と受精させ、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子において改変染色体配列を含む受精卵を作製することを含む。あるいは、方法は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子における改変染色体配列を受精卵に導入するように、受精卵を遺伝子改変させることを含む。方法は、受精卵を代理雌動物に移植すること（ここで、妊娠および正期産により子孫動物が産生される）；前記子孫動物を病原体に対する感受性についてスクリーニングすること；ならびにＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子において改変染色体配列を含まない動物と比べて、病原体に対する感受性が低減した子孫動物を選択することをさらに含む。改変染色体配列により、子孫動物による実質的に機能的でないＣＤ１６３タンパク質の産生が得られる。
【0250】
病原体による感染に対する感受性が低減した動物または系統を作製するためのさらに別の繁殖方法が提供される。方法は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子における改変染色体配列を卵母細胞および精細胞の少なくとも１つに導入するように、卵母細胞または精細胞を遺伝子改変させること、ならびに卵母細胞を精細胞と受精させ、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子において改変染色体配列を含む受精卵を作製することを含む。あるいは、方法は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子における改変染色体配列を受精卵に導入するように、受精卵を遺伝子改変させることを含む。方法は、受精卵を代理雌動物に移植すること（ここで、妊娠および正期産により子孫動物が産生される）；前記子孫動物を病原体に対する感受性についてスクリーニングすること；ならびにＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子において改変染色体配列を含まない動物と比べて、病原体に対する感受性が低減した子孫動物を選択することをさらに含む。改変染色体配列はＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子におけるインフレーム欠失を含む。
【0251】
病原体は好ましくはウイルス、例えば、ＰＲＲＳＶを含む。
【0252】
例えば、改変により、１型ＰＲＲＳＶウイルス、２型ＰＲＲＳＶ、または１型および２型ＰＲＲＳＶウイルスの両方に対する感受性が低減され得る。
【0253】
改変により、ＮＶＳＬ９７－７８９５、ＫＳ０６－７２１０９、Ｐ１２９、ＶＲ２３３２、ＣＯ９０、ＡＺ２５、ＭＬＶ－ＲｅｓＰＲＲＳ、ＫＳ６２－０６２７４、ＫＳ４８３（ＳＤ２３９８３）、ＣＯ８４、ＳＤ１３－１５、Ｌｅｌｙｓｔａｄ、０３－１０５９、０３－１０６０、ＳＤ０１－０８、４３５３ＰＺ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるＰＲＲＳＶ分離株に対する感受性が低減され得る。
【0254】
動物は胚、幼若体、または成体とすることができる。
【0255】
動物は、飼育動物を含むことができる。飼育動物は、家畜動物、例えばブタ動物、ウシ動物（例えば、肉牛または乳牛）、ヒツジ動物、ヤギ動物、ウマ動物（例えば、ウマまたはロバ）、水牛、ラクダ、またはトリ動物（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ホロホロ鳥、またはひな鳥）を含むことができる。家畜動物は好ましくはウシまたはブタ動物であり、最も好ましくはブタ動物である。
【0256】
卵母細胞、精細胞、または受精卵を遺伝子改変させる工程は、卵母細胞、精細胞、または受精卵の遺伝的編集を含むことができる。遺伝的編集は、ホーミングエンドヌクレアーゼの使用を含むことができる。ホーミングエンドヌクレアーゼは天然由来エンドヌクレアーゼであるが、好ましくは、エンドヌクレアーゼがＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子における染色体配列を標的にするように設計されたＤＮＡ認識配列を有する、合理的に設計された、非天然由来ホーミングエンドヌクレアーゼである。よって、ホーミングエンドヌクレアーゼは設計されたホーミングエンドヌクレアーゼとすることができる。ホーミングエンドヌクレアーゼは、例えば、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９システム、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、リコンビナーゼ融合タンパク質、メガヌクレアーゼ、またはそれらの組み合わせ）を含むことができる。遺伝的編集は好ましくは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの使用を含む。
【0257】
卵母細胞、精細胞、または受精卵は改変染色体配列についてヘテロ接合性とすることができる。あるいは、卵母細胞、精細胞、または受精卵は改変染色体配列についてホモ接合性とすることができる。
【0258】
改変染色体配列は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子における挿入、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子における欠失、またはそれらの組み合わせを含むことができる。例えば、改変染色体配列はＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子における欠失（例えば、インフレーム欠失）を含む。あるいは、改変染色体配列は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子における挿入を含むことができる。
【0259】
挿入または欠失は、ＣＤ１６３タンパク質産生または活性を、挿入または欠失を欠く動物におけるＣＤ１６３タンパク質産生または活性と比べて低減させることができる。
【0260】
挿入または欠失により、動物による実質的に機能的でないＣＤ１６３タンパク質の産生が得られ得る。「実質的に機能的でないＣＤ１６３タンパク質」により、動物、子孫、または細胞におけるＣＤ１６３タンパク質のレベルが検出不能である、または検出可能である場合、挿入または欠失を含まない動物、子孫、または細胞において観察されるレベルより少なくとも約９０％低いことが意味される。
【0261】
動物がブタ動物である場合、改変染色体配列は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン７、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン８、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン７またはエクソン８と近接するイントロン、またはそれらの組み合わせにおける改変を含むことができる。改変染色体配列は好適には、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン７における改変を含む。
【0262】
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン７における改変は、欠失（例えば、エクソン７におけるインフレーム欠失）を含むことができる。あるいは、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン７における改変は挿入を含むことができる。
【0263】
動物がブタ動物である場合、改変染色体配列は、下記を含むことができる：（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８；または（ｂ）下記からなる群より選択される改変：参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の２塩基対挿入、かつ、同じアレル上での、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べてヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０２４からヌクレオチド３，１４７までの１２４塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０２４からヌクレオチド３，１４６までの１２３塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４７とヌクレオチド３，１４８の間の１塩基対挿入；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０３０からヌクレオチド３，１５９までの１３０塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０３０からヌクレオチド３，１６１までの１３２塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド１，５２５からヌクレオチド３，０３０までの１５０６塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９の間の７塩基対挿入；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，８１８からヌクレオチド４，０９７までの１２８０塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，７２４からヌクレオチド４，０９６までの１３７３塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，４３１からヌクレオチド３，８９７までの１４６７塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの１９３０塩基対欠失、ここで、欠失配列は、ヌクレオチド４８８で始まる１２塩基対挿入で置き換えられ、ならびに、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのエクソン７におけるさらなる１２９塩基対欠失が存在する；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド３，１７２までの２８塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド４，５３１までの１３８７塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの１３８２塩基対欠失、ここで、欠失配列は、ヌクレオチド３，１１３で始まる１１塩基対挿入で置き換えられる；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，４４０からヌクレオチド４，１６０までの１７２０塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０１５からヌクレオチド３，４６６までの４５２塩基対欠失；またはそれらの組み合わせ。
【0264】
ブタ動物が、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の２塩基対挿入を含む場合、２塩基対挿入は、ジヌクレオチドＡＧの挿入を含むことができる。
【0265】
ブタ動物が、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４７と３，１４８の間の１塩基対挿入を含む場合、１塩基対挿入は、単一アデニン残基の挿入を含むことができる。
【0266】
ブタ動物が参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９の間の７塩基対挿入を含む場合、７塩基対挿入は、配列ＴＡＣＴＡＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５）を含むことができる。
【0267】
ブタ動物が、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの１９３０塩基対欠失を含み、ここで、欠失配列は、ヌクレオチド４８８で始まる１２塩基対挿入で置き換えられ、ならびに、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのエクソン７におけるさらなる１２９塩基対欠失が存在する場合、１２塩基対挿入は、配列ＴＧＴＧＧＡＧＡＡＴＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６）を含むことができる。
【0268】
ブタ動物が参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの１３８２塩基対欠失を含み、ここで、欠失配列は、ヌクレオチド３，１１３で始まる１１塩基対挿入で置き換えられる場合、１１塩基対挿入は、配列ＡＧＣＣＡＧＣＧＴＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７）を含むことができる。
【0269】
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子における改変染色体配列が欠失を含む場合、欠失は好ましくはインフレーム欠失を含む。したがって、動物がブタ動物である場合、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子における挿入または欠失は、下記からなる群より選択される、エクソン７におけるインフレーム欠失を含むことができる：参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド１，５２５からヌクレオチド３，０３０までの１５０６塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの１９３０塩基対欠失、ここで、欠失配列は、ヌクレオチド４８８で始まる１２塩基対挿入で置き換えられ、ならびに、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのエクソン７におけるさらなる１２９塩基対欠失が存在する；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，７２４からヌクレオチド４，０９６までの１３７３塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０２４からヌクレオチド３，１４６までの１２３塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，４３１からヌクレオチド３，８９７までの１４６７塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド４，５３１までの１３８７塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの１３８２塩基対欠失、ここで、欠失配列は、ヌクレオチド３，１１３で始まる１１塩基対挿入で置き換えられる；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，４４０からヌクレオチド４，１６０までの１７２０塩基対欠失；およびそれらの組み合わせ。
【0270】
動物がブタ動物である場合、挿入または欠失は、下記からなる群より選択することができる：参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の２塩基対挿入、かつ、同じアレルでの、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド３，１７２までの２８塩基対欠失；参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０１５からヌクレオチド３，４６６までの４５２塩基対欠失；およびそれらの組み合わせ。
【0271】
例えば、改変染色体配列は、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の２塩基対挿入、かつ、同じアレルでの、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対欠失を含むことができる。
【0272】
改変染色体配列は、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド３，１７２までの２８塩基対欠失を含むことができる。
【0273】
改変染色体配列は、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０１５からヌクレオチド３，４６６までの４５２塩基対欠失含むことができる。
【0274】
改変染色体配列は、本明細書で記載される改変染色体配列の任意の組み合わせを含むことができる。
【0275】
例えば、改変染色体配列は、下記を含むことができる：ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９の間の７塩基対挿入；および、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対欠失。
【0276】
改変染色体配列は、下記を含むことができる：ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９の間の７塩基対挿入；および、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの１３８２塩基対欠失、ここで、欠失配列は、ヌクレオチド３，１１３で始まる１１塩基対挿入で置き換えられる。
【0277】
改変染色体配列は、下記を含むことができる：ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８；および、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対欠失。
【0278】
改変染色体配列は、下記を含むことができる：ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８；および、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の２塩基対挿入、かつ、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対欠失。
【0279】
改変染色体配列は、下記を含むことができる：ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，８１８からヌクレオチド４，０９７までの１２８０塩基対欠失；および、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対欠失。
【0280】
改変染色体配列は、下記を含むことができる：ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，８１８からヌクレオチド４，０９７までの１２８０塩基対欠失；およびＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の２塩基対挿入、かつ、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対欠失。
【0281】
改変染色体配列は、下記を含むことができる：ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの１９３０塩基対欠失、ここで、欠失配列は、ヌクレオチド４８８で始まる１２塩基対挿入で置き換えられ、ならびに、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのエクソン７におけるさらなる１２９塩基対欠失が存在する；およびＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の２塩基対挿入、かつ、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対欠失。
【0282】
改変染色体配列は、下記を含むことができる：ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８；および、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの１９３０塩基対欠失、ここで、欠失配列は、ヌクレオチド４８８で始まる１２塩基対挿入で置き換えられ、ならびに、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのエクソン７におけるさらなる１２９塩基対欠失が存在する。
【0283】
改変染色体配列は、下記を含むことができる：ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの１９３０塩基対欠失、ここで、欠失配列は、ヌクレオチド４８８で始まる１２塩基対挿入で置き換えられ、ならびに、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのエクソン７におけるさらなる１２９塩基対欠失が存在する；および、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対欠失。
【0284】
改変染色体配列は、下記を含むことができる：ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，４３１からヌクレオチド３，８９７までの１４６７塩基対欠失；およびＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の２塩基対挿入、かつ、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対欠失。
【0285】
改変染色体配列は、下記を含むことができる：ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，４３１からヌクレオチド３，８９７までの１４６７塩基対欠失；および、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対欠失。
【0286】
以上で記載される挿入または欠失のいずれかを含む改変染色体配列は、挿入または欠失の外側で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に対して高度の配列同一性を有する染色体配列を含むことができる。よって、例えば、卵母細胞、精細胞、または受精卵は、挿入または欠失の外側の染色体配列の領域において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．９％、または１００％配列同一性を有する染色体配列を含むことができる。
【0287】
改変染色体配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１８、または１１９を含む染色体配列を含むことができる。以下の実施例においてさらに記載されるように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９８－１１４、および１１９は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７で提供される野生型ブタＣＤ１６３の領域に対応する領域のためのヌクレオチド配列を提供し、本明細書で記載されるブタＣＤ１６３染色体配列における挿入または欠失を含む。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７により提供される野生型ブタＣＤ１６３の領域に対応する領域のための配列を提供し、ここで、エクソン７は、ヒトＣＤ１６３様１タンパク質（ｈＣＤ１６３Ｌ１）のＳＲＣＲ８のホモログをコードする合成エクソンで置き換えられている。
【0288】
例えば、改変染色体配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８、１０１、１０５、１０９、１１０、１１２、１１３、または１１４を含む染色体配列を含むことができる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８、１０１、１０５、１０９、１１０、１１２、１１３、または１１４はブタＣＤ１６３染色体配列のエクソン７におけるインフレーム欠失に対するヌクレオチド配列を提供する。
【0289】
別の例として、改変染色体配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３、１１１、または１１９を含む染色体配列を含むことができる。
【0290】
改変染色体配列は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて１１塩基対欠失およびＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて２塩基対挿入かつ３７７塩基対欠失を含むことができる。
【0291】
改変染色体配列は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて１２４塩基対欠失およびＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて１２３塩基対欠失を含むことができる。
【0292】
改変染色体配列は、１塩基対挿入を含むことができる。
【0293】
改変染色体配列は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて１３０塩基対欠失およびＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて１３２塩基対欠失を含むことができる。
【0294】
改変染色体配列は、１５０６塩基対欠失を含むことができる。
【0295】
改変染色体配列は、７塩基対挿入を含むことができる。
【0296】
改変染色体配列は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて１２８０塩基対欠失およびＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて１３７３塩基対欠失を含むことができる。
【0297】
改変染色体配列は、１４６７塩基対欠失を含むことができる。
【0298】
改変染色体配列は、ヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの１９３０塩基対イントロン６欠失、かつ、エクソン７におけるヌクレオチド４，４８８での１２塩基対挿入および追加の１２９塩基対欠失を含むことができる。
【0299】
改変染色体配列は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて２８塩基対欠失およびＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて１３８７塩基対欠失を含むことができる。
【0300】
改変染色体配列は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の１つのアレルにおいて、１３８２塩基対欠失、かつ１１塩基対挿入、およびＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他のアレルにおいて１７２０塩基対欠失を含むことができる。
【0301】
繁殖方法のいずれかにおいて、選択された動物は、ファウンダー動物として使用することができる。
【0302】
繁殖方法のいずれかにおいて、受精は、人工授精を含むことができる。
【0303】
繁殖方法のいずれかにより作製された動物の集団もまた、提供される。動物の集団は好ましくは、病原体、例えばＰＲＲＳＶなどのウイルスによる感染に抵抗性である。例えば、集団は、１型ＰＲＲＳＶウイルス、２型ＰＲＲＳＶ、または１型および２型ＰＲＲＳＶウイルスの両方による感染に抵抗性とすることができる。集団は、ＮＶＳＬ９７－７８９５、ＫＳ０６－７２１０９、Ｐ１２９、ＶＲ２３３２、ＣＯ９０、ＡＺ２５、ＭＬＶ－ＲｅｓＰＲＲＳ、ＫＳ６２－０６２７４、ＫＳ４８３（ＳＤ２３９８３）、ＣＯ８４、ＳＤ１３－１５、Ｌｅｌｙｓｔａｄ、０３－１０５９、０３－１０６０、ＳＤ０１－０８、４３５３ＰＺ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるＰＲＲＳＶ分離株による感染に抵抗性とすることができる。
【0304】
家畜動物の病原体の感染に対する抵抗性を増加させるための方法もまた、提供される。方法は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子由来の少なくとも１つの染色体配列を遺伝学的に編集することを含み、よって、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子において編集染色体配列を含まない家畜動物におけるＣＤ６３タンパク質産生または活性と比べて、ＣＤ１６３タンパク質産生または活性が低減される。病原体は、好ましくはウイルス（例えば、ＰＲＲＳＶ）を含む。
【0305】
家畜動物の病原体の感染に対する抵抗性を増加させる別の方法が提供される。方法は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子由来の少なくとも１つの染色体配列を遺伝学的に編集することを含み、よって、家畜動物は実質的に機能的でないＣＤ１６３タンパク質を産生する。
【0306】
家畜動物の病原体の感染に対する抵抗性を増加させるさらに別の方法が提供される。方法は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子由来の少なくとも１つの染色体配列を遺伝学的に編集し、インフレーム欠失を導入することを含み、ここで、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子において編集染色体配列を含まない家畜動物におけるＣＤ６３タンパク質産生または活性と比べて、家畜動物におけるＣＤ１６３タンパク質産生または活性が低減される。インフレーム欠失は、例えば、本明細書で記載されるインフレーム欠失のいずれかとすることができる。
【0307】
核酸
核酸が提供される。核酸分子は、下記からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むことができる：（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７を含むヌクレオチド配列；（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７の配列に対して少なくとも８０％配列同一性を有するヌクレオチド配列、ここで、前記ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に対して少なくとも１つの置換、挿入、または欠失を含む；および（ｃ）（ａ）または（ｂ）のｃＤＮＡ配列。
核酸が提供される。核酸分子は、下記からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むことができる：（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７を含むヌクレオチド配列；（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７の配列に対して少なくとも８０％配列同一性を有するヌクレオチド配列、ここで、前記ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に対して少なくとも１つの置換、挿入、または欠失を含む；および（ｃ）（ａ）または（ｂ）のｃＤＮＡ配列。
【0308】
あるいは、核酸は、下記を含むことができる：（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７の配列に対して少なくとも８７．５％配列同一性を有するヌクレオチド配列、ここで、前記ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に対して少なくとも１つの置換、挿入、または欠失を含む；および（ｂ）（ａ）のｃＤＮＡ配列。
【0309】
本明細書で記載される核酸分子のいずれも単離核酸分子とすることができる。
【0310】
例えば、単離核酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７を含むヌクレオチド配列を含むことができる。
【0311】
あるいは、核酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７の配列に対して少なくとも８０％配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができ、ここで、前記ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に対して少なくとも１つの置換、挿入、または欠失を含む。核酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７の配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができ、ここで、前記ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に対して少なくとも１つの置換、挿入、または欠失を含む。
【0312】
核酸分子は好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７の配列に対して少なくとも８７．５％配列同一性を有し、ここで、ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に対して少なくとも１つの置換、挿入、または欠失を含む。
【0313】
置換、挿入、または欠失は好ましくは、置換、挿入、または欠失を含まない核酸と比べて、ＣＤ１６３タンパク質産生または活性を低減させ、または排除する。
【0314】
核酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１８、または１１９を含むことができる。
【0315】
例えば、核酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８、１０１、１０５、１０９、１１０、１１２、１１３、または１１４を含むことができる。
【0316】
例えば、核酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３、１１１、または１１９を含むことができる。
【0317】
核酸は、ｃＤＮＡを含むことができる。
【0318】
さらなる核酸が提供される。核酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１８、または１１９を含むことができる。例えば、核酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８、１０１、１０５、１０９、１１０、１１２、１１３、または１１４を含むことができる。別の例として、核酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３、１１１、または１１９を含むことができる。
【0319】
発明を詳細に説明してきたが、改変および変更が添付の特許請求の範囲で規定された発明の範囲から逸脱せずに可能であることは明らかであろう
【0320】
実施例
下記非限定的な実施例は、本発明をさらに説明するために提供される。
下記非限定的な実施例は、本発明をさらに説明するために提供される。
【0321】
実施例１：インビトロ由来卵母細胞および胚から遺伝子操作されたブタを作製するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの使用
ホーミングエンドヌクレアーゼ、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ９）システムにおける構成要素を記載する最近の報告により、ブタにおける遺伝子操作（ＧＥ）が現在、より効率的であることが示唆される。標的ホーミングエンドヌクレアーゼはゲノム内の特異的な位置で二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導し、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）またはドナーＤＮＡが提供される場合相同組換え（ＨＲ）の刺激のいずれかによるランダム突然変異を引き起こすことができる。ＨＲによるゲノムの標的改変は、ドナーＤＮＡが標的ヌクレアーゼと共に提供される場合、ホーミングエンドヌクレアーゼにより達成することができる。体細胞において特異的改変を導入した後、これらの細胞を使用して、様々な目的のためにＳＣＮＴにより、ＧＥブタを作製した。よって、ホーミングエンドヌクレアーゼは、ＧＥブタの作製に有用なツールである。異なるホーミングエンドヌクレアーゼの中で、それが防御機構として使用される原核生物から適合されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムが、有効なアプローチであると考えられる。自然では、Ｃａｓ９システムは３つの構成要素を必要とし、標的配列に相補的な領域を含むＲＮＡ（約２０塩基）（ｃｉｓ抑制ＲＮＡ［ｃｒＲＮＡ］）、ｃｒＲＮＡに相補的な領域を含むＲＮＡ（トランス活性化ｃｒＲＮＡ［ｔｒａｃｒＲＮＡ］）、およびこの複合体における酵素タンパク質成分であるＣａｓ９である。単一ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が、塩基対形成されたｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの役割を果たすように構築され得る。ｇＲＮＡ／タンパク質複合体は、ゲノムを走査し、ｃｒＲＮＡ／ｇＲＮＡに相補的な領域で、ＤＳＢを触媒することができる。他の設計されたヌクレアーゼとは異なり、短いオリゴマーのみが、対象となる遺伝子を標的にするのに必要とされる試薬を構築するように設計される必要があり、一方、一連のクローニング工程が、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮを組み立てるために必要とされる。
ホーミングエンドヌクレアーゼ、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ９）システムにおける構成要素を記載する最近の報告により、ブタにおける遺伝子操作（ＧＥ）が現在、より効率的であることが示唆される。標的ホーミングエンドヌクレアーゼはゲノム内の特異的な位置で二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導し、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）またはドナーＤＮＡが提供される場合相同組換え（ＨＲ）の刺激のいずれかによるランダム突然変異を引き起こすことができる。ＨＲによるゲノムの標的改変は、ドナーＤＮＡが標的ヌクレアーゼと共に提供される場合、ホーミングエンドヌクレアーゼにより達成することができる。体細胞において特異的改変を導入した後、これらの細胞を使用して、様々な目的のためにＳＣＮＴにより、ＧＥブタを作製した。よって、ホーミングエンドヌクレアーゼは、ＧＥブタの作製に有用なツールである。異なるホーミングエンドヌクレアーゼの中で、それが防御機構として使用される原核生物から適合されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムが、有効なアプローチであると考えられる。自然では、Ｃａｓ９システムは３つの構成要素を必要とし、標的配列に相補的な領域を含むＲＮＡ（約２０塩基）（ｃｉｓ抑制ＲＮＡ［ｃｒＲＮＡ］）、ｃｒＲＮＡに相補的な領域を含むＲＮＡ（トランス活性化ｃｒＲＮＡ［ｔｒａｃｒＲＮＡ］）、およびこの複合体における酵素タンパク質成分であるＣａｓ９である。単一ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が、塩基対形成されたｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの役割を果たすように構築され得る。ｇＲＮＡ／タンパク質複合体は、ゲノムを走査し、ｃｒＲＮＡ／ｇＲＮＡに相補的な領域で、ＤＳＢを触媒することができる。他の設計されたヌクレアーゼとは異なり、短いオリゴマーのみが、対象となる遺伝子を標的にするのに必要とされる試薬を構築するように設計される必要があり、一方、一連のクローニング工程が、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮを組み立てるために必要とされる。
【0322】
遺伝子破壊のための現在の標準方法とは異なり、設計されたヌクレアーゼの使用は、接合体をＧＥのための開始材料として使用する機会を提供する。家畜における遺伝子破壊のための標準方法は、培養細胞におけるＨＲおよびその後の、体細胞核移植（ＳＣＮＴ）による胚の再建を含む。ＳＣＮＴにより作製されたクローン動物は時として、発育障害の徴候を示すので、ＳＣＮＴ／ＧＥファウンダーの後代は、典型的には、ファウンダー動物が実験のために使用される場合起こり得る交絡ＳＣＮＴ異常および表現型を回避するための研究のために使用される。齧歯類と比べてブタのより長い妊娠期間およびより高いハウジングコストを考慮すると、繁殖の必要性の低減には、時間およびコストの利点がある。最近の報告により、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮのブタ接合体への直接注入は、内在性遺伝子を破壊し、所望の突然変異を有する子ブタを生成させることができることが証明された。しかしながら、約１０％の子ブタのみが、標的遺伝子の両アレル改変を示し、一部はモザイク遺伝子型を示した。最近の論文では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは発生中の胚において突然変異を誘導し、ＧＥブタを、ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮより高い効率で作製することができることが証明された。しかしながら、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムから作製されたＧＥブタはまた、モザイク遺伝子型を持っていた。加えて、上記研究は全て、実験のためにインビボで誘導させた接合体を使用し、この場合、十分な数の接合体を得るためには集中的な労働および多くの雌ブタが必要とされる。
【0323】
本実施例は、インビトロで誘導した接合体の注入および体細胞の改変、その後にＳＣＮＴの両方による、ＧＥブタの作製においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用する効率的なアプローチを記載する。２つの内在性遺伝子（ＣＤ１６３およびＣＤ１Ｄ）および１つの導入遺伝子（ｅＧＦＰ）を標的にさせ、インビトロで誘導した卵母細胞または接合体のみを、それぞれ、ＳＣＮＴまたはＲＮＡ注入のために使用した。ＣＤ１６３は、ブタ産業に著しい経済的損失を引き起こすことが知られているウイルスであるブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルスによる増殖性感染に必要とされると考えられる。ＣＤ１Ｄは非古典的主要組織適合複合体タンパク質であると考えられ、インバリアントナチュラルキラーＴ細胞への脂質抗原の提示に関与する。これらの遺伝子が欠損したブタを、農業および生物医学のためのモデルとなるように設計した。ｅＧＦＰ導入遺伝子を予備概念実証実験および方法の最適化のための標的として使用した。
【0324】
材料および方法
化学薬品および試薬
別記されない限り、この研究で使用される化学薬品は全て、Ｓｉｇｍａから購入した。
化学薬品および試薬
別記されない限り、この研究で使用される化学薬品は全て、Ｓｉｇｍａから購入した。
【0325】
特異的ＣＲＩＳＰＲを構築するためのｇＲＮＡの設計
ガイドＲＮＡを、野生型ＣＤ１６３に特有であり、ドメインスワップターゲティングベクター（以下に記載）中に存在しない、ＣＤ１６３のエクソン７内の領域に対して設計し、そのため、ＣＲＩＳＰＲにより、ドメインスワップターゲティングベクターではなく野生型ＣＤ１６３内でのＤＳＢが得られるであろう。ターゲティングベクターがＳ．ピオゲネス（Ｓｐｙ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を変化させる単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）を導入する４つの位置しか存在しなかった。下記を含む４つ全ての標的を選択した：
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）ＧＧＡＡＡＣＣＣＡＧＧＣＴＧＧＴＴＧＧＡｇＧＧ（ＣＲＩＳＰＲ１０），
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）ＧＧＡＡＣＴＡＣＡＧＴＧＣＧＧＣＡＣＴＧｔＧＧ（ＣＲＩＳＰＲ１３１）、
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）ＣＡＧＴＡＧＣＡＣＣＣＣＧＣＣＣＴＧＡＣｇＧＧ（ＣＲＩＳＰＲ２５６）および
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）ＴＧＴＡＧＣＣＡＣＡＧＣＡＧＧＧＡＣＧＴｃＧＧ（ＣＲＩＳＰＲ２８２）。ＰＡＭは各ｇＲＮＡにおける太字体により同定することができる。
ガイドＲＮＡを、野生型ＣＤ１６３に特有であり、ドメインスワップターゲティングベクター（以下に記載）中に存在しない、ＣＤ１６３のエクソン７内の領域に対して設計し、そのため、ＣＲＩＳＰＲにより、ドメインスワップターゲティングベクターではなく野生型ＣＤ１６３内でのＤＳＢが得られるであろう。ターゲティングベクターがＳ．ピオゲネス（Ｓｐｙ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を変化させる単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）を導入する４つの位置しか存在しなかった。下記を含む４つ全ての標的を選択した：
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）ＧＧＡＡＡＣＣＣＡＧＧＣＴＧＧＴＴＧＧＡｇＧＧ（ＣＲＩＳＰＲ１０），
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）ＧＧＡＡＣＴＡＣＡＧＴＧＣＧＧＣＡＣＴＧｔＧＧ（ＣＲＩＳＰＲ１３１）、
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）ＣＡＧＴＡＧＣＡＣＣＣＣＧＣＣＣＴＧＡＣｇＧＧ（ＣＲＩＳＰＲ２５６）および
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）ＴＧＴＡＧＣＣＡＣＡＧＣＡＧＧＧＡＣＧＴｃＧＧ（ＣＲＩＳＰＲ２８２）。ＰＡＭは各ｇＲＮＡにおける太字体により同定することができる。
【0326】
ＣＤ１Ｄ突然変異では、ＣＲＩＳＰＲ標的の探索が、恣意的に、一次転写産物の最初の１０００ｂｐ内のコード鎖に制限された。しかしながら、ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ［２６］（「ブタ」反復ライブラリ）は一次転写産物の塩基９４３で開始する反復エレメントを同定した。ＣＲＩＳＰＲ標的の探索は、その後、一次転写産物の最初の９４２ｂｐに制限された。探索はさらに、一次転写産物の最初の８７３ｂｐに、制限された。というのも、最後のＳｐｙ ＰＡＭが塩基８７３に位置するからである。第１の標的（ＣＲＩＳＰＲ４８００）が選択された。というのも、これは一次転写産物中の塩基４２に位置する開始コドンと重なったからである（ＣＣＡＧＣＣＴＣＧＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴｇＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５））。２つの追加の標的（ＣＲＩＳＰＲ５６２０および５６２６）が選択された。というのも、恣意的に選択された領域内の第１の選択から最も遠位であったからであった（ＣＴＴＴＣＡＴＴＴＡＴＣＴＧＡＡＣＴＣＡｇＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）およびＴＴＡＴＣＴＧＡＡＣＴＣＡＧＧＧＴＣＣＣｃＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７））。これらの標的は重なる。開始コドンとの関連で、最も近位のＳｐｙ ＰＡＭは、視覚判定により決定される高ホモポリマー配列を含む単純配列中に位置した。第４の標的（ＣＲＩＳＰＲ５３５０）は、第１の標的選択に関連して、高ホモポリマー領域を含まなかった最も近位の標的であったので選択された（ＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＴＡＴＡＴＴＴＡＡｇＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８））。設計されたｃｒＲＮＡの特異性を、ＧｅｎＢａｎｋにおいて同様のブタ配列を検索することにより確認した。オリゴヌクレオチド（表１）をアニールし、２つの発現カセット、ヒトコドン最適化Ｓ．ピオゲネス（ｈＳｐｙ）Ｃａｓ９およびキメラガイドＲＮＡを含む、ｐ３３０Ｘベクターにクローンさせた。Ｐ３３０Ｘを、Ｚｈａｎｇ研究室プロトコル（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｃｒｉｓｐｒ／ｚｈａｎｇ／）に従い、ＢｂｓＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により消化させた。
【0327】
ｅＧＦＰに標的させるために、ｅＧＦＰコード配列を標的にする２つの特異的ｇＲＮＡをｅＧＦＰ開始コドンの最初の６０ｂｐ内で設計させた。ｅＧＦＰ１およびｅＧＦＰ２ ｇＲＮＡはどちらもアンチセンス鎖上にあり、およびｅＧＦＰ１は直接、開始コドンを標的にした。ｅＧＦＰ１ ｇＲＮＡ配列はＣＴＣＣＴＣＧＣＣＣＴＴＧＣＴＣＡＣＣＡｔＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）であり、ｅＧＦＰ２ ｇＲＮＡ配列はＧＡＣＣＡＧＧＡＴＧＧＧＣＡＣＣＡＣＣＣｃＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）であった。
【表1】
【0328】
ＣＤ１６３およびＣＤ１Ｄ遺伝子のためのドナーＤＮＡの合成
ブタＣＤ１６３およびＣＤ１Ｄの両方を、ＰＣＲにより胎仔線維芽細胞から単離されたＤＮＡから増幅させ、これを、ターゲティングベクターとトランスフェクトされた細胞株の間のアイソジェニックマッチを確保するために後のトランスフェクションのために使用した。簡単に言うと、フォワードプライマーＣＴＣＴＣＣＣＴＣＡＣＴＣＴＡＡＣＣＴＡＣＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、およびリバースプライマーＴＡＴＴＴＣＴＣＴＣＡＣＡＴＧＧＣＣＡＧＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）を使用するＬＡ ｔａｑ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、ＣＤ１６３の９５３８ｂｐ断片を増幅させた。断片はドメイン－スワップターゲティングベクターを構築するために、確認され、使用されたＤＮＡ配列であった（図１）。このベクターは、エクソン７内で３３の点変異を含み、そのため、エクソン１１由来のヒトＣＤ１６３Ｌと同じアミノ酸配列をコードするであろう。置き換えエクソンは３１５ｂｐであった。加えて、その後のイントロンは、Ｃｒｅリコンビナーゼ（Ｃｒｅ）により除去することができる選択可能なマーカー遺伝子を有する改変ミオスタチンイントロンＢで置き換えられ、保持されたｌｏｘＰ部位を有すると、正常スプライシングが以前証明された（Ｗｅｌｌｓ、未発表結果）。コンストラクトの長腕は３４６９ｂｐであり、ドメインスワップＤＳエクソンを含んだ。短腕は１５７８ｂｐであり、エクソン７および８を含んだ（図１、パネルＢ）。このプラスミドを使用して、最初のトランスフェクション実験においてエクソン７のコード領域を置き換えることを試み、選択可能なマーカー（Ｇ４１８）によるターゲティングイベントの選択が可能になった。ターゲティングが起こる場合、マーカーはＣｒｅリコンビナーゼにより削除することができる。ＣＤ１６３ＤＳターゲティングベクターをその後、Ｃｒｅ削除できなかったＮｅｏで破壊されたＳＩＧＬＥＣ１遺伝子をすでに含んだ細胞株と共に使用するために改変させた。このターゲティングベクターでは、Ｎｅｏカセット、ｌｏｘＰおよびミオスタチンイントロンＢが除去され、ＤＳエクソンのみがＷＴ長および短腕と共に残った（図１、パネルＣ）。
ブタＣＤ１６３およびＣＤ１Ｄの両方を、ＰＣＲにより胎仔線維芽細胞から単離されたＤＮＡから増幅させ、これを、ターゲティングベクターとトランスフェクトされた細胞株の間のアイソジェニックマッチを確保するために後のトランスフェクションのために使用した。簡単に言うと、フォワードプライマーＣＴＣＴＣＣＣＴＣＡＣＴＣＴＡＡＣＣＴＡＣＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、およびリバースプライマーＴＡＴＴＴＣＴＣＴＣＡＣＡＴＧＧＣＣＡＧＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）を使用するＬＡ ｔａｑ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、ＣＤ１６３の９５３８ｂｐ断片を増幅させた。断片はドメイン－スワップターゲティングベクターを構築するために、確認され、使用されたＤＮＡ配列であった（図１）。このベクターは、エクソン７内で３３の点変異を含み、そのため、エクソン１１由来のヒトＣＤ１６３Ｌと同じアミノ酸配列をコードするであろう。置き換えエクソンは３１５ｂｐであった。加えて、その後のイントロンは、Ｃｒｅリコンビナーゼ（Ｃｒｅ）により除去することができる選択可能なマーカー遺伝子を有する改変ミオスタチンイントロンＢで置き換えられ、保持されたｌｏｘＰ部位を有すると、正常スプライシングが以前証明された（Ｗｅｌｌｓ、未発表結果）。コンストラクトの長腕は３４６９ｂｐであり、ドメインスワップＤＳエクソンを含んだ。短腕は１５７８ｂｐであり、エクソン７および８を含んだ（図１、パネルＢ）。このプラスミドを使用して、最初のトランスフェクション実験においてエクソン７のコード領域を置き換えることを試み、選択可能なマーカー（Ｇ４１８）によるターゲティングイベントの選択が可能になった。ターゲティングが起こる場合、マーカーはＣｒｅリコンビナーゼにより削除することができる。ＣＤ１６３ＤＳターゲティングベクターをその後、Ｃｒｅ削除できなかったＮｅｏで破壊されたＳＩＧＬＥＣ１遺伝子をすでに含んだ細胞株と共に使用するために改変させた。このターゲティングベクターでは、Ｎｅｏカセット、ｌｏｘＰおよびミオスタチンイントロンＢが除去され、ＤＳエクソンのみがＷＴ長および短腕と共に残った（図１、パネルＣ）。
【0329】
ブタＣＤ１Ｄのためのゲノム配列をＬＡ ｔａｑにより、フォワードプライマーＣＴＣＴＣＣＣＴＣＡＣＴＣＴＡＡＣＣＴＡＣＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）およびリバースプライマーＧＡＣＴＧＧＣＣＡＴＧＴＧＡＧＡＧＡＡＡＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）を用いて増幅させ、８７２９ｂｐ断片を得た。断片はＤＮＡ配列であり、これを使用して、図２に示されるターゲティングベクターを構築した。Ｎｅｏカセットはホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターの制御下にあり、ｌｏｘＰ配列（選択のために導入された）に隣接した。コンストラクトの長腕は４８３２ｂｐであり、短腕は３５６３ｂｐであり、エクソン６および７を含んだ。成功したＨＲが起きた場合、エクソン３、４、および５は除去され、Ｎｅｏカセットで置き換えられる。ＮＨＥＪ修復が不正確に起きた場合、そうすると、エクソン３は破壊されるであろう。
【0330】
胎仔線維芽細胞収集
ブタ胎仔組織を、妊娠第３５日に収集し、細胞株を作製した。２つの野生型（ＷＴ）雄および雌胎仔線維芽細胞株を大きな白色国内交雑種から確立した。前にＮｅｏカセット（ＳＩＧＬＥＣ１－／－遺伝学）を含むように改変させた雄および雌胎仔線維芽細胞もまた、これらの研究において使用した。わずかな改変を有する胎仔線維芽細胞を記載されるように収集し；各胎仔由来の組織をミンチにし、２０ｍｌの消化培地（Ｌ－グルタミンおよび１ｇ／ＬのＤ－グルコース［Ｃｅｌｌｇｒｏ］を含み、２００単位／ｍｌコラゲナーゼおよび２５クニッツ単位／ｍｌのＤＮＡｓｅＩが補充されたダルベッコ変法イーグル培地［ＤＭＥＭ］）中で５時間の間、３８．５℃で消化させた。消化後、胎仔線維芽細胞を洗浄し、ＤＭＥＭ、１５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、および４０μｇ／ｍｌゲンタマイシンと共に培養した。一晩の培養後、細胞をトリプシン処理し（ｔｙｐｓｉｎｉｚｅｄ）、－８０℃で、アリコートにして、１０％ジメチルスルホキシドを有するＦＢＳ中で凍結させ、液体窒素中で保存した。
ブタ胎仔組織を、妊娠第３５日に収集し、細胞株を作製した。２つの野生型（ＷＴ）雄および雌胎仔線維芽細胞株を大きな白色国内交雑種から確立した。前にＮｅｏカセット（ＳＩＧＬＥＣ１－／－遺伝学）を含むように改変させた雄および雌胎仔線維芽細胞もまた、これらの研究において使用した。わずかな改変を有する胎仔線維芽細胞を記載されるように収集し；各胎仔由来の組織をミンチにし、２０ｍｌの消化培地（Ｌ－グルタミンおよび１ｇ／ＬのＤ－グルコース［Ｃｅｌｌｇｒｏ］を含み、２００単位／ｍｌコラゲナーゼおよび２５クニッツ単位／ｍｌのＤＮＡｓｅＩが補充されたダルベッコ変法イーグル培地［ＤＭＥＭ］）中で５時間の間、３８．５℃で消化させた。消化後、胎仔線維芽細胞を洗浄し、ＤＭＥＭ、１５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、および４０μｇ／ｍｌゲンタマイシンと共に培養した。一晩の培養後、細胞をトリプシン処理し（ｔｙｐｓｉｎｉｚｅｄ）、－８０℃で、アリコートにして、１０％ジメチルスルホキシドを有するＦＢＳ中で凍結させ、液体窒素中で保存した。
【0331】
細胞トランスフェクションおよび遺伝子型判定
トランスフェクション条件は、本質的に前に報告された通りとした。ドナーＤＮＡは常に１μｇの一定量で、様々な量のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミド（下記に列挙）と共に使用した。ドナーＤＮＡをトランスフェクション前に、ＭＬＵＩ（ＣＤ１６３）（ＮＥＢ）またはＡＦＬＩＩ（ＣＤ１Ｄ）（ＮＥＢ）と共に直線化した。確立した細胞株の性別を、トランスフェクション前に、前に記載されるようにＰＣＲにより決定した。雄および雌細胞株の両方をトランスフェクトさせ、ゲノム改変データを一緒にトランスフェクション間で解析した。同様の継代数（２～４）の胎仔線維芽細胞株を２日間、Ｌ－グルタミンおよび１ｇ／ＬのＤ－グルコース（Ｃｅｌｌｇｒｏ）を含み、１５％ＦＢＳ、２．５ｎｇ／ｍｌ塩基性線維芽細胞増殖因子、および１０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシンが補充されたＤＭＥＭ中で、培養し、７５％～８５％集密度まで増殖させた。線維芽細胞を、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で洗浄し、トリプシン処理した。細胞が剥離するとすぐに、細胞を電気穿孔培地（７５％細胞塩（ｃｙｔｏｓａｌｔｓ）［１２０ｍＭ ＫＣｌ、０．１５ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．６、５Ｍｍ ＭｇＣｌ２］）および２５％Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ですすいだ。細胞濃度を血球計数器を用いて定量した。細胞を６００×ｇで５分間ペレット化し、電気穿孔培地中１×１０６の濃度で再懸濁させた。各電気穿孔では、２ｍｍギャップキュベット中で２００μｌの細胞を使用し、３（１ｍｓｅｃ）方形波パルスをＢＴＸ ＥＣＭ２００１により２５０Ｖで投与した。電気穿孔後、細胞を上記ＤＭＥＭ中に再懸濁させた。選択のために、６００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をトランスフェクション後２４時間に添加し、培地を第７日に交換した。コロニーをトランスフェクション後、第１４日に採取した。胎仔線維芽細胞を、Ｇ４１８選択を使用する場合１０，０００細胞／プレートで、Ｇ４１８選択を使用しない場合５０細胞／プレートで蒔いた。胎仔線維芽細胞コロニーを、オートクレーブ処理済み真空グリースにより各コロニーの周囲で密閉した１０ｍｍオートクレーブ処理済みクローニングシリンダを適用することにより収集した。コロニーをＰＢＳですすぎ、トリプシンにより回収し；その後、ＤＭＥＭ培地中に再懸濁させた。再懸濁させたコロニーの一部（１／３）を、９６ウェルＰＣＲプレートに移し、残りの（２／３）細胞を２４ウェルプレートの一ウェルで培養した。細胞ペレットを６μｌの溶解バッファー（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．９、０．９％トリトンＸ－１００、０．４ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ［ＮＥＢ］）に再懸濁させ、６５℃で３０分間細胞溶解のためにインキュベートし、続いてプロテイナーゼＫを不活性化するために８５℃で１０分間インキュベートした。
トランスフェクション条件は、本質的に前に報告された通りとした。ドナーＤＮＡは常に１μｇの一定量で、様々な量のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミド（下記に列挙）と共に使用した。ドナーＤＮＡをトランスフェクション前に、ＭＬＵＩ（ＣＤ１６３）（ＮＥＢ）またはＡＦＬＩＩ（ＣＤ１Ｄ）（ＮＥＢ）と共に直線化した。確立した細胞株の性別を、トランスフェクション前に、前に記載されるようにＰＣＲにより決定した。雄および雌細胞株の両方をトランスフェクトさせ、ゲノム改変データを一緒にトランスフェクション間で解析した。同様の継代数（２～４）の胎仔線維芽細胞株を２日間、Ｌ－グルタミンおよび１ｇ／ＬのＤ－グルコース（Ｃｅｌｌｇｒｏ）を含み、１５％ＦＢＳ、２．５ｎｇ／ｍｌ塩基性線維芽細胞増殖因子、および１０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシンが補充されたＤＭＥＭ中で、培養し、７５％～８５％集密度まで増殖させた。線維芽細胞を、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で洗浄し、トリプシン処理した。細胞が剥離するとすぐに、細胞を電気穿孔培地（７５％細胞塩（ｃｙｔｏｓａｌｔｓ）［１２０ｍＭ ＫＣｌ、０．１５ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．６、５Ｍｍ ＭｇＣｌ２］）および２５％Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ですすいだ。細胞濃度を血球計数器を用いて定量した。細胞を６００×ｇで５分間ペレット化し、電気穿孔培地中１×１０６の濃度で再懸濁させた。各電気穿孔では、２ｍｍギャップキュベット中で２００μｌの細胞を使用し、３（１ｍｓｅｃ）方形波パルスをＢＴＸ ＥＣＭ２００１により２５０Ｖで投与した。電気穿孔後、細胞を上記ＤＭＥＭ中に再懸濁させた。選択のために、６００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をトランスフェクション後２４時間に添加し、培地を第７日に交換した。コロニーをトランスフェクション後、第１４日に採取した。胎仔線維芽細胞を、Ｇ４１８選択を使用する場合１０，０００細胞／プレートで、Ｇ４１８選択を使用しない場合５０細胞／プレートで蒔いた。胎仔線維芽細胞コロニーを、オートクレーブ処理済み真空グリースにより各コロニーの周囲で密閉した１０ｍｍオートクレーブ処理済みクローニングシリンダを適用することにより収集した。コロニーをＰＢＳですすぎ、トリプシンにより回収し；その後、ＤＭＥＭ培地中に再懸濁させた。再懸濁させたコロニーの一部（１／３）を、９６ウェルＰＣＲプレートに移し、残りの（２／３）細胞を２４ウェルプレートの一ウェルで培養した。細胞ペレットを６μｌの溶解バッファー（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．９、０．９％トリトンＸ－１００、０．４ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ［ＮＥＢ］）に再懸濁させ、６５℃で３０分間細胞溶解のためにインキュベートし、続いてプロテイナーゼＫを不活性化するために８５℃で１０分間インキュベートした。
【0332】
ＤＳおよび大および小欠失のためのＰＣＲスクリーニング
ＨＲ修復の検出．ロングレンジＰＣＲを使用して、ＣＤ１６３またはＣＤ１Ｄのいずれか上の突然変異を同定した。３つの異なるＰＣＲアッセイを使用して、ＨＲイベントを同定した：右または左側のいずれかでのドナーＤＮＡにおけるＣＤ１６３またはＣＤ１Ｄ配列から内在性ＣＤ１６３またはＣＤ１Ｄ配列までに及ぶ領域のＰＣＲ増幅および設計されたドナーＤＮＡを包含するＣＤ１６３またはＣＤ１Ｄの大きな領域を増幅したロングレンジＰＣＲ。外因性Ｎｅｏ配列の付加により生じる、ＰＣＲ産物のサイズの増加、１．８ｋｂ（ＣＤ１Ｄ）または３．５ｋｂ（ＣＤ１６３）のいずれかは、遺伝子のＨＲ修復の証拠と考えられた。ＰＣＲ条件は全て、９５℃２分間の初期変性、続いて９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、および６８℃で７－１０分の３３サイクルとした。製造者の推奨に従い、全てのアッセイのためにＬＡ ｔａｑを使用した。プライマーを表２に示す。
ＨＲ修復の検出．ロングレンジＰＣＲを使用して、ＣＤ１６３またはＣＤ１Ｄのいずれか上の突然変異を同定した。３つの異なるＰＣＲアッセイを使用して、ＨＲイベントを同定した：右または左側のいずれかでのドナーＤＮＡにおけるＣＤ１６３またはＣＤ１Ｄ配列から内在性ＣＤ１６３またはＣＤ１Ｄ配列までに及ぶ領域のＰＣＲ増幅および設計されたドナーＤＮＡを包含するＣＤ１６３またはＣＤ１Ｄの大きな領域を増幅したロングレンジＰＣＲ。外因性Ｎｅｏ配列の付加により生じる、ＰＣＲ産物のサイズの増加、１．８ｋｂ（ＣＤ１Ｄ）または３．５ｋｂ（ＣＤ１６３）のいずれかは、遺伝子のＨＲ修復の証拠と考えられた。ＰＣＲ条件は全て、９５℃２分間の初期変性、続いて９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、および６８℃で７－１０分の３３サイクルとした。製造者の推奨に従い、全てのアッセイのためにＬＡ ｔａｑを使用した。プライマーを表２に示す。
【表2】
【0333】
小欠失アッセイ（ＮＨＥＪ）．小欠失を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムにより導入された突出したカッティング部位に隣接しているＣＤ１６３またはＣＤ１ＤのＰＣＲ増幅により決定した。アンプリコンのサイズは、ＣＤ１６３およびＣＤ１Ｄについて、それぞれ、４３５ｂｐおよび１２４４ｂｐであった。胚および胎仔線維芽細胞由来のライセートを、ＬＡ ｔａｑを用いてＰＣＲ増幅させた。アッセイのＰＣＲ条件は、９５℃２分間の初期変性、続いて９４℃で３０秒、５６℃で３０秒、および７２℃で１分の３３サイクルとした。トランスフェクトされた細胞の遺伝子型判定では、挿入および欠失（ＩＮＤＥＬ）を、ＰＣＲアンプリコンをアガロースゲル電気泳動により分離することにより同定した。胚遺伝子型判定では、得られたＰＣＲ産物を、その後ＤＮＡ配列決定し、ＰＣＲで使用されるフォワードプライマーを使用して小欠失を同定した。プライマー情報を表３に示す。
【表3】
【0334】
体細胞核移植（ＳＣＮＴ）
ＳＣＮＴ胚を作製するために、現地屠殺場からの、雌ブタ由来卵母細胞（ＡＲＴ， Ｉｎｃ．）または若雌ブタ由来卵母細胞のいずれかを使用した。雌ブタ由来卵母細胞を一晩、成熟培地（２．９ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、５μｇ／ｍｌインスリン、１０ｎｇ／ｍｌ上皮成長因子［ＥＧＦ］、０．５μｇ／ｍｌブタ卵胞刺激ホルモン［ｐ－ＦＳＨ］、０．９１ｍＭ ピルビン酸、０．５ｍＭシステイン、１０％ブタ卵胞液、および２５ｎｇ／ｍｌゲンタマイシンを有するＴＣＭ－１９９）中で輸送し、２４時間後に新鮮培地に移した。４０－４２時間の成熟後、卵丘細胞を、０．１％ヒアルロニダーゼの存在下でボルテックスすることにより卵母細胞から除去した。若雌ブタ由来卵母細胞を、体外受精（ＩＶＦ）のために以下に記載されるように成熟させた。操作中、卵母細胞を、７．０μｇ／ｍｌのサイトカラシンＢが補充された操作培地（０．６ｍＭ ＮａＨＣＯ３、２．９ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、３０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｎｇ／ｍｌゲンタマイシン、および３ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを有し、３０５ｍＯｓｍのモル浸透圧濃度を有するＴＣＭ－１９９［Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ］）に入れた。極体を隣接する細胞質の一部（おそらく中期ＩＩプレートを含む）と共に除去し、ドナー細胞を囲卵腔に、薄ガラスキャピラリを用いて入れた。再構築した胚をその後、融合培地（０．３Ｍマンニトール、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１ｍＭ ＭｇＣｌ２、および０．５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ）中、２ＤＣパルス（１秒間隔）を１．２ｋＶ／ｃｍで３０ｌｓｅｃ間を用い、ＢＴＸ Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を使用して融合させた。融合後、融合胚を、２００μＭチメロサールを用いて１０分間暗闇で、および８ｍＭジチオトレイトールを用いて３０分間、完全に活性化させた。胚をその後、前に記載されるように、改変ブタ接合体培地ＰＺＭ３－ＭＵ１中で、０．５μＭ Ｓｃｒｉｐｔａｉｄ（Ｓ７８１７；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤と共に１４～１６時間の間、インキュベートした。
ＳＣＮＴ胚を作製するために、現地屠殺場からの、雌ブタ由来卵母細胞（ＡＲＴ， Ｉｎｃ．）または若雌ブタ由来卵母細胞のいずれかを使用した。雌ブタ由来卵母細胞を一晩、成熟培地（２．９ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、５μｇ／ｍｌインスリン、１０ｎｇ／ｍｌ上皮成長因子［ＥＧＦ］、０．５μｇ／ｍｌブタ卵胞刺激ホルモン［ｐ－ＦＳＨ］、０．９１ｍＭ ピルビン酸、０．５ｍＭシステイン、１０％ブタ卵胞液、および２５ｎｇ／ｍｌゲンタマイシンを有するＴＣＭ－１９９）中で輸送し、２４時間後に新鮮培地に移した。４０－４２時間の成熟後、卵丘細胞を、０．１％ヒアルロニダーゼの存在下でボルテックスすることにより卵母細胞から除去した。若雌ブタ由来卵母細胞を、体外受精（ＩＶＦ）のために以下に記載されるように成熟させた。操作中、卵母細胞を、７．０μｇ／ｍｌのサイトカラシンＢが補充された操作培地（０．６ｍＭ ＮａＨＣＯ３、２．９ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、３０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｎｇ／ｍｌゲンタマイシン、および３ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを有し、３０５ｍＯｓｍのモル浸透圧濃度を有するＴＣＭ－１９９［Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ］）に入れた。極体を隣接する細胞質の一部（おそらく中期ＩＩプレートを含む）と共に除去し、ドナー細胞を囲卵腔に、薄ガラスキャピラリを用いて入れた。再構築した胚をその後、融合培地（０．３Ｍマンニトール、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１ｍＭ ＭｇＣｌ２、および０．５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ）中、２ＤＣパルス（１秒間隔）を１．２ｋＶ／ｃｍで３０ｌｓｅｃ間を用い、ＢＴＸ Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を使用して融合させた。融合後、融合胚を、２００μＭチメロサールを用いて１０分間暗闇で、および８ｍＭジチオトレイトールを用いて３０分間、完全に活性化させた。胚をその後、前に記載されるように、改変ブタ接合体培地ＰＺＭ３－ＭＵ１中で、０．５μＭ Ｓｃｒｉｐｔａｉｄ（Ｓ７８１７；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤と共に１４～１６時間の間、インキュベートした。
【0335】
体外受精（ＩＶＦ）
ＩＶＦでは、思春期前若雌ブタ由来の卵巣を屠殺場（Ｆａｒｍｌａｎｄ Ｆｏｏｄｓ Ｉｎｃ．）から入手した。未熟卵母細胞を中サイズの（３～６ｍｍ）卵胞から、１０ｍｌシリンジに取り付けられた１８ゲージ皮下針を用いて吸引した。均一に濃い細胞質を有する卵母細胞および無傷の周囲の卵丘細胞をその後、成熟のために選択した。およそ５０の卵丘卵母細胞複合体を、３．０５ｍＭグルコース、０．９１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．５７ｍＭシステイン、１０ｎｇ／ｍｌＥＧＦ、０．５μｇ／ｍｌ黄体ホルモン（ＬＨ）、０．５μｇ／ｍｌＦＳＨ、１０ｎｇ／ｍｌゲンタマイシン（ＡＰＰ Ｐｈａｒｍ）、および０．１％ポリビニルアルコールを有する５００μｌの成熟培地、ＴＣＭ－１９９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むウェルに４２～４４時間の間３８．５℃、５％ＣＯ２で、加湿空気中にて、置いた。成熟の終わりに、周囲の卵丘細胞を３分間０．１％ヒアルロニダーゼの存在下でボルテックスすることにより、卵母細胞から除去した。その後、インビトロで成熟させた卵母細胞を５０μｌ滴のＩＶＦ培地（１１３．１ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ、７．５ｍＭ ＣａＣｌ２、１１ｍＭグルコース、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２ｍＭカフェイン、５ｍＭピルビン酸ナトリウム、および２ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン［ＢＳＡ］を含む改変Ｔｒｉｓ緩衝培地）に、２５～３０の卵母細胞の群で入れた。１つの１００μｌ凍結精液ペレットを、０．１％ＢＳＡが補充された３ｍｌのダルベッコＰＢＳ中で解凍させた。凍結ＷＴまたは新鮮ｅＧＦＰ精液のいずれかを、６０％パーコール中で２０分間６５０ ３ｇで、改変Ｔｒｉｓ緩衝培地中で１０分間、遠心分離により洗浄した。場合によっては、前に記載されたｅＧＦＰ導入遺伝子についてヘテロ接合性の新たに収集した精液を３回ＰＢＳ中で洗浄した。精液ペレットをその後、ＩＶＦ培地を用いて、０．５×１０６細胞／ｍｌまで再懸濁させた。５０マイクロリットルの精液懸濁液を、卵母細胞を有する小滴中に導入した。配偶子を５時間の間、３８．５℃で、５％ＣＯ２を含む空気の雰囲気においてコインキュベートした。受精後、胚をＰＺＭ３－ＭＵ１中、３８．５℃および５％ＣＯ２を含む空気中でインキュベートした。
ＩＶＦでは、思春期前若雌ブタ由来の卵巣を屠殺場（Ｆａｒｍｌａｎｄ Ｆｏｏｄｓ Ｉｎｃ．）から入手した。未熟卵母細胞を中サイズの（３～６ｍｍ）卵胞から、１０ｍｌシリンジに取り付けられた１８ゲージ皮下針を用いて吸引した。均一に濃い細胞質を有する卵母細胞および無傷の周囲の卵丘細胞をその後、成熟のために選択した。およそ５０の卵丘卵母細胞複合体を、３．０５ｍＭグルコース、０．９１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．５７ｍＭシステイン、１０ｎｇ／ｍｌＥＧＦ、０．５μｇ／ｍｌ黄体ホルモン（ＬＨ）、０．５μｇ／ｍｌＦＳＨ、１０ｎｇ／ｍｌゲンタマイシン（ＡＰＰ Ｐｈａｒｍ）、および０．１％ポリビニルアルコールを有する５００μｌの成熟培地、ＴＣＭ－１９９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むウェルに４２～４４時間の間３８．５℃、５％ＣＯ２で、加湿空気中にて、置いた。成熟の終わりに、周囲の卵丘細胞を３分間０．１％ヒアルロニダーゼの存在下でボルテックスすることにより、卵母細胞から除去した。その後、インビトロで成熟させた卵母細胞を５０μｌ滴のＩＶＦ培地（１１３．１ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ、７．５ｍＭ ＣａＣｌ２、１１ｍＭグルコース、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２ｍＭカフェイン、５ｍＭピルビン酸ナトリウム、および２ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン［ＢＳＡ］を含む改変Ｔｒｉｓ緩衝培地）に、２５～３０の卵母細胞の群で入れた。１つの１００μｌ凍結精液ペレットを、０．１％ＢＳＡが補充された３ｍｌのダルベッコＰＢＳ中で解凍させた。凍結ＷＴまたは新鮮ｅＧＦＰ精液のいずれかを、６０％パーコール中で２０分間６５０ ３ｇで、改変Ｔｒｉｓ緩衝培地中で１０分間、遠心分離により洗浄した。場合によっては、前に記載されたｅＧＦＰ導入遺伝子についてヘテロ接合性の新たに収集した精液を３回ＰＢＳ中で洗浄した。精液ペレットをその後、ＩＶＦ培地を用いて、０．５×１０６細胞／ｍｌまで再懸濁させた。５０マイクロリットルの精液懸濁液を、卵母細胞を有する小滴中に導入した。配偶子を５時間の間、３８．５℃で、５％ＣＯ２を含む空気の雰囲気においてコインキュベートした。受精後、胚をＰＺＭ３－ＭＵ１中、３８．５℃および５％ＣＯ２を含む空気中でインキュベートした。
【0336】
胚移植
ＧＥ ＣＤ１６３またはＣＤ１Ｄブタを生成するために作製した胚を、最初の雄許容後第１日（ＳＣＮＴ）または第６日（接合体注入）のいずれかに、代理母に移植した。第６日移植では、接合体をさらに５日間、ＰＺＭ３－ＭＵ１中、１０ｎｇ／ｍｌ ｐｓ４８（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ， Ｉｎｃ．）の存在下で培養した。胚を外科的に代理母の卵管の膨大部－峡部接合部に移植した。
ＧＥ ＣＤ１６３またはＣＤ１Ｄブタを生成するために作製した胚を、最初の雄許容後第１日（ＳＣＮＴ）または第６日（接合体注入）のいずれかに、代理母に移植した。第６日移植では、接合体をさらに５日間、ＰＺＭ３－ＭＵ１中、１０ｎｇ／ｍｌ ｐｓ４８（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ， Ｉｎｃ．）の存在下で培養した。胚を外科的に代理母の卵管の膨大部－峡部接合部に移植した。
【0337】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのためのＲＮＡのインビトロ合成
インビトロ転写のための鋳型ＤＮＡを、ＰＣＲを使用して増幅させた（表４）。細胞トランスフェクション実験のために使用したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミドがＰＣＲのためのテンプレートとして機能した。接合体においてＣａｓ９を発現させるために、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ Ｕｌｔｒａ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、Ｃａｓ９のｍＲＮＡを作製した。その後、ポリＡシグナルを、Ｐｏｌｙ （Ａ）テーリングキット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用してＣａｓ９ ｍＲＮＡに付加した。ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡをＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ（Ａｍｂｉｏｎ）により作製した。合成ＲＮＡの特性を１．５％アガロースゲル上で視覚化し、その後、１０ｎｇ／μｌの最終濃度まで希釈し（ｇＲＮＡおよびＣａｓ９の両方）、３μｌアリコートに分配した。
インビトロ転写のための鋳型ＤＮＡを、ＰＣＲを使用して増幅させた（表４）。細胞トランスフェクション実験のために使用したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミドがＰＣＲのためのテンプレートとして機能した。接合体においてＣａｓ９を発現させるために、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ Ｕｌｔｒａ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、Ｃａｓ９のｍＲＮＡを作製した。その後、ポリＡシグナルを、Ｐｏｌｙ （Ａ）テーリングキット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用してＣａｓ９ ｍＲＮＡに付加した。ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡをＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ（Ａｍｂｉｏｎ）により作製した。合成ＲＮＡの特性を１．５％アガロースゲル上で視覚化し、その後、１０ｎｇ／μｌの最終濃度まで希釈し（ｇＲＮＡおよびＣａｓ９の両方）、３μｌアリコートに分配した。
【表4】
【0338】
設計されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの接合体におけるマイクロインジェクション
Ｃａｓ９をコードするメッセンジャーＲＮＡおよびｇＲＮＡを、ＦｅｍｔｏＪｅｔ微量注入器（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を使用して、受精後１４時間に受精卵母細胞の細胞質に導入した（予定接合体）。マイクロインジェクションを操作培地中、Ｎｉｋｏｎ倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；東京、日本）の加温ステージ上で実施した。注入された接合体を、さらなる使用まで１０ｎｇ／ｍｌ ｐｓ４８を有するＰＺＭ３－ＭＵ１中に移した。
Ｃａｓ９をコードするメッセンジャーＲＮＡおよびｇＲＮＡを、ＦｅｍｔｏＪｅｔ微量注入器（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を使用して、受精後１４時間に受精卵母細胞の細胞質に導入した（予定接合体）。マイクロインジェクションを操作培地中、Ｎｉｋｏｎ倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；東京、日本）の加温ステージ上で実施した。注入された接合体を、さらなる使用まで１０ｎｇ／ｍｌ ｐｓ４８を有するＰＺＭ３－ＭＵ１中に移した。
【0339】
統計解析
改変ゲノムを有するコロニーの番号を１と分類し、ゲノムの改変を有さないコロニー０と分類した。差を、ＰＲＯＣ ＧＬＭ（ＳＡＳ）を使用することにより決定し、０．０５のＰ値を有意と考えた。平均を最小二乗平均として計算した。データは数平均±ＳＥＭとして表す。
改変ゲノムを有するコロニーの番号を１と分類し、ゲノムの改変を有さないコロニー０と分類した。差を、ＰＲＯＣ ＧＬＭ（ＳＡＳ）を使用することにより決定し、０．０５のＰ値を有意と考えた。平均を最小二乗平均として計算した。データは数平均±ＳＥＭとして表す。
【0340】
結果
体細胞におけるＣＤ１６３およびＣＤ１ＤのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ノックアウト
ＣＤ１６３を標的にする４つの異なるＣＲＩＳＰＲプラスミド（ガイド１０、１３１、２５６、および２８２）の効率を、２μｇ／μｌのドナーＤＮＡの量で試験した（表５）。ＣＲＩＳＰＲ２８２では、ＣＲＩＳＰＲ１０および２５６処理よりも有意に多くの平均コロニー形成が得られた（Ｐ＜０．０５）。以上で記載されるロングレンジＰＣＲアッセイから、元々意図されたＨＲによるＤＳの代わりに、５０３ｂｐから１５０６ｂｐもの範囲の大きな欠失が見い出された（図３、パネルＡ）。これは予測されていなかった。というのも、他のＤＮＡ編集システムを用いた前の報告では、ブタにおけるＺＦＮを用いた６～３３３ｂｐのずっと小さな欠失が示されていたからである。ＣＲＩＳＰＲ１０および４つ全てのＣＲＩＳＰＲの混合物では、ＣＲＩＳＰＲ２５６および２８２よりも、より高い数の、改変ゲノムを有するコロニーが得られた（表５、Ｐ＜０．００２）。ＣＲＩＳＰＲ１０およびＮｅｏを含むがＣＤ１６３に相同性ではないプラスミドのトランスフェクションでは、大きな欠失を提示するコロニーは得られなかった。興味深いことに、ドナーＤＮＡがＣＲＩＳＰＲなしで導入された時、１つの単一アレル欠失がまた検出された。このアッセイはおそらく突然変異率の過小評価を表す。というのも、トランスフェクトされた体細胞において、アガロースゲル上で検出できなかった配列決定による任意の可能性のある小欠失はスクリーニングされなかったからである。
＊４の混合物＋ドナーＤＮＡは、０．５μｇの各ＣＲＩＳＰＲの均等混合と１μｇのドナーＤＮＡを表す。ドナーＤＮＡ処理はＣＲＩＳＰＲなし対照として機能し、１０＋Ｎｅｏ処理は、ＣＲＩＳＰＲ処理で観察された大きな欠失はＣＤ１６３ドナーＤＮＡもまた存在した時にのみ存在したことを示す。
†ＣＲＩＳＰＲ毒性を推定するためにコロニーの平均数／プレートを比較して、および改変ゲノムを有するコロニーパーセントについて、ＡＮＯＶＡを実施した。Ｐ値は、それぞれ、０．０２５および０．０００２であった。ｎ／ａ＝この処理については複製はなく、そのため、統計解析を実施しなかった。
‡ＨＲを有する１つのコロニーは部分ＨＲイベントを表す。
ａ-ｃ上付き文字は、コロニーの平均数／プレートおよび改変ゲノムを有するコロニーパーセントの両方について、処理間で有意差を示す（Ｐ＜０．０５）。
体細胞におけるＣＤ１６３およびＣＤ１ＤのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ノックアウト
ＣＤ１６３を標的にする４つの異なるＣＲＩＳＰＲプラスミド（ガイド１０、１３１、２５６、および２８２）の効率を、２μｇ／μｌのドナーＤＮＡの量で試験した（表５）。ＣＲＩＳＰＲ２８２では、ＣＲＩＳＰＲ１０および２５６処理よりも有意に多くの平均コロニー形成が得られた（Ｐ＜０．０５）。以上で記載されるロングレンジＰＣＲアッセイから、元々意図されたＨＲによるＤＳの代わりに、５０３ｂｐから１５０６ｂｐもの範囲の大きな欠失が見い出された（図３、パネルＡ）。これは予測されていなかった。というのも、他のＤＮＡ編集システムを用いた前の報告では、ブタにおけるＺＦＮを用いた６～３３３ｂｐのずっと小さな欠失が示されていたからである。ＣＲＩＳＰＲ１０および４つ全てのＣＲＩＳＰＲの混合物では、ＣＲＩＳＰＲ２５６および２８２よりも、より高い数の、改変ゲノムを有するコロニーが得られた（表５、Ｐ＜０．００２）。ＣＲＩＳＰＲ１０およびＮｅｏを含むがＣＤ１６３に相同性ではないプラスミドのトランスフェクションでは、大きな欠失を提示するコロニーは得られなかった。興味深いことに、ドナーＤＮＡがＣＲＩＳＰＲなしで導入された時、１つの単一アレル欠失がまた検出された。このアッセイはおそらく突然変異率の過小評価を表す。というのも、トランスフェクトされた体細胞において、アガロースゲル上で検出できなかった配列決定による任意の可能性のある小欠失はスクリーニングされなかったからである。
【表5】
†ＣＲＩＳＰＲ毒性を推定するためにコロニーの平均数／プレートを比較して、および改変ゲノムを有するコロニーパーセントについて、ＡＮＯＶＡを実施した。Ｐ値は、それぞれ、０．０２５および０．０００２であった。ｎ／ａ＝この処理については複製はなく、そのため、統計解析を実施しなかった。
‡ＨＲを有する１つのコロニーは部分ＨＲイベントを表す。
ａ-ｃ上付き文字は、コロニーの平均数／プレートおよび改変ゲノムを有するコロニーパーセントの両方について、処理間で有意差を示す（Ｐ＜０．０５）。
【0341】
初期目標はＣＤ１６３についてＨＲによるドメインスワップ（ＤＳ）－ターゲティングイベントを得ることであったが、ＣＲＩＳＰＲは、ＣＤ１６３を標的にする効率を増加させなかった。このターゲティングベクターの様々な組み合わせが、ＨＲにより、伝統的なトランスフェクションによってＣＤ１６３を改変するために使用されており、３３９９コロニーのスクリーニング後、０ターゲティングイベントという結果となったことに注意すべきである（Ｗｈｉｔｗｏｒｔｈ ａｎｄ Ｐｒａｔｈｅｒ、未発表結果）。ＣＲＩＳＰＲ１０およびドナーＤＮＡとしてのＤＳターゲティングベクターを用いたトランスフェクションにより導入されることが試みられた３３全ての突然変異を含むＨＲから得られた完全ＤＳを有する２匹のブタを得た。
【0342】
次に、薬物選択なしでのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９誘導突然変異の効率を試験した；この研究で使用される胎仔線維芽細胞株はすでに、Ｎｅｏ耐性カセットの組込みおよびＳＩＧＬＥＣ１のノックアウトを有した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびドナーＤＮＡの比がゲノム改変を増加させる、または高濃度で毒性効果を与えるかどうかも試験した。ＣＲＩＳＰＲ１３１をこの試行のために選択した。というのも、前の実験で、高い総コロニー数および改変ゲノムを有するコロニーのパーセンテージ増加が得られたからである。ＣＲＩＳＰＲ１３１ＤＮＡの量を３：１～２０：１まで増加させても、胎仔線維芽細胞生存性には有意の効果を有さなかった。ＮＨＥＪによるゲノム改変を有するコロニーのパーセントは、様々なＣＲＩＳＰＲ濃度間で有意に異ならなかったが、１０：１比で最高数のＮＨＥＪを有した（表６、Ｐ＝０．３３）。ＣＲＩＳＰＲ ＤＮＡ対ドナーＤＮＡ（２０：１）の最高比であっても、ＨＲは観察されなかった。
ａＮＨＥＪ修復を有するコロニーパーセントについては処理間で有意差（Ｐ＞０．０５）。
ｂＣＲＩＳＰＲの濃度の増加に伴う、ゲノム改変コロニーの数には有意差はなかった（Ｐ＞０．３３）。
【表6】
ｂＣＲＩＳＰＲの濃度の増加に伴う、ゲノム改変コロニーの数には有意差はなかった（Ｐ＞０．３３）。
【0343】
この経験に基づき、体細胞におけるＣＤ１Ｄの標的破壊を試みた。４つの異なるＣＲＩＳＰＲを設計し、雄および雌細胞の両方で試験した。ＣＤ１Ｄの改変は、適用したＣＲＩＳＰＲの３つから検出できたが、ＣＲＩＳＰＲ５３５０の使用では、アガロースゲル電気泳動により検出されるのに十分大きな欠失を有するＣＤ１Ｄの改変は得られなかった（表７）。興味深いことに、ドナーＤＮＡを提供したが、ＨＲによる遺伝子改変は得られなかった。しかしながら、ＣＤ１６３ノックアウト実験と同様の大きな欠失が観察された（図３、パネルＢ）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をドナーＤＮＡと共に使用しなかった場合、大きな欠失を有するＣＤ１Ｄの標的改変は検出されなかった。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドターゲティングからのＣＤ１Ｄの改変は、それぞれ、細胞の雄および雌コロニーにおいて４／１２１および３／２８であった。アガロースゲル電気泳動により検出可能なＩＮＤＥＬのみをトランスフェクションデータに含めた。
【表7】
【0344】
ＧＥ細胞を用いたＳＣＮＴによるＣＤ１６３およびＣＤ１Ｄブタの作製
ＣＤ１６３またはＣＤ１Ｄの改変を提示する細胞をＳＣＮＴのために使用し、ＣＤ１６３およびＣＤ１Ｄノックアウトブタを作製させた（図３）。レシピエント若雌ブタへの７つの胚移植（ＣＤ１６３ 表８）、６つの胚移植（ＣＤ１６３－Ｎｅｏなし）、および５つの胚移植（ＣＤ１Ｄ）を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムがトランスフェクトされた雄および雌胎仔線維芽細胞由来のＳＣＮＴ胚を用いて実施した。レシピエント若雌ブタの６匹（ＣＤ１６３）、２匹（ＣＤ１６３－Ｎｅｏなし）、および４匹（ＣＤ１Ｄ）（表９）が、出産まで妊娠を維持し、それぞれ、８５．７％、３３．３％、および８０％の妊娠率が得られた。ＣＤ１６３レシピエントのうち、５匹が帝王切開により健康な子ブタを出産した。１匹（Ｏ０４４）が自然に産んだ。産仔数は１～８の範囲であった。４匹のブタを、出生後の成長障害のために安楽死させた。１匹の子ブタを、重篤な口蓋裂のために安楽死させた。残りの子ブタは全て健康に見える（図３、パネルＣ）。図３、パネルＢで記載される、ＣＲＩＳＰＲ１０およびドナーＤＮＡがトランスフェクトされた胎仔線維芽細胞から得られた雄子ブタの２匹の同腹仔は、ＣＲＩＳＰＲ１０に隣接するエクソン７において３０ｂｐ欠失および前のイントロンの追加の１４７６ｂｐ欠失を有し、よって、ＣＤ１６３のイントロン６／エクソン７ジャンクションが除去されていた（図３、パネルＥ）。遺伝子型および予測される翻訳を表１０にまとめて示す。１匹の雄子ブタおよび１雌同腹仔（４匹の子ブタ）を、事前に改変したＳＩＧＬＥＣ１細胞のＣＤ１６３－Ｎｅｏなしトランスフェクションから得た。５匹の子ブタ全てが、ＳＩＧＬＥＣ１およびＣＤ１６３についてダブルノックアウトであった。雄子ブタは、ＣＤ１６３の両アレル改変を有し、１つのアレル上でエクソン７における２８ｂｐ欠失およびエクソン７の部分欠失ならびにエクソン８および前のイントロンの完全欠失を含む他のアレル上の１３８７ｂｐ欠失を有し、よってイントロンエクソンジャンクションが除去された。雌子ブタは、ＣＤ１６３の両アレル突然変異を有し、１つのアレル上の１３８２ｂｐ欠失かつ１１ｂｐ挿入および他のアレル上のＣＤ１６３の１７２０ｂｐ欠失を含んだ。ＣＤ１６３改変および予測される翻訳の概略は、表１０において見出すことができる。ＣＲＩＳＰＲ改変によるＣＤ１Ｄ改変および予測される翻訳の概略は表１１において見出すことができる。簡単に言うと、１雌および２雄同腹仔が生まれ、１３匹の子ブタが得られた。１匹の子ブタは、出生の直後に死亡した。１３匹の子ブタのうち１２匹が、ＣＤ１Ｄの両アレルまたはホモ接合型欠失を含んだ（図３、パネルＦ）。１匹の子ブタはＷＴであった。
＊ＣＤ１６３ ＣＲＩＳＰＲ ＮＴ系統はトランスフェクションにより改変させた胎仔線維芽細胞系統を用いたＮＴにより作製した胚を表す。ＣＲＩＳＰＲ注入胚は１細胞期にＣＤ１６３ガイドＲＮＡをＣＡＳ９ＲＮＡと共に注入したＩＶＦ胚であった。ＣＤ１６３ ＣＲＩＳＰＲ ＮＴ－Ｎｅｏなし胎仔系統はＮＴにより、すでに、選択可能なマーカーの使用なしで、トランスフェクションにより改変させたＮｅｏ耐性系統であった前に改変させた胎仔線維芽細胞を用いて作製された胚を表す。
†ＭＵは、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ大学で、材料および方法のＩＶＦセクションにおいて記載されるように、吸引され、成熟された若雌ブタ卵母細胞を示す。ＡＲＴは、材料および方法のＳＣＮＴセクションにおいて記載されるように、購入され、成熟された雌ブタ卵母細胞を示す。
＊ＣＤ１Ｄ ＣＲＩＳＰＲ ＮＴ系統は、ＮＴにより、トランスフェクションにより改変させた胎仔線維芽細胞系統を用いて作製された胚を表す。ＣＲＩＳＰＲ注入胚は、１細胞期に、ＣＤ１ＤガイドＲＮＡをＣＡＳ９ＲＮＡと共に注入したＩＶＦ胚であった。
†ＭＵは、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ大学で、材料および方法のＩＶＦセクションにおいて記載されるように、吸引され、成熟された若雌ブタ卵母細胞を示す。ＡＲＴは、材料および方法のＳＣＮＴセクションにおいて記載されるように、購入され、成熟された雌ブタ卵母細胞を示す。
＊ＫＯ、ノックアウト
＊＊子ブタは安楽死させたので含めなかった。
†この列におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に対して、ＩＮＤＥＬを示す配列についてのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．を示す。
ａ挿入された配列は、ＴＡＣＴＡＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５）であった
ｂ挿入された配列は、ＡＧであった。
ｃ挿入された配列は、単一アデニン（Ａ）残基であった。
ｄ挿入された配列は、ＴＧＴＧＧＡＧＡＡＴＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６）であった。
ｅ挿入された配列は、ＡＧＣＣＡＧＣＧＴＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７）であった。
＊ＫＯ、ノックアウト
ＣＤ１６３またはＣＤ１Ｄの改変を提示する細胞をＳＣＮＴのために使用し、ＣＤ１６３およびＣＤ１Ｄノックアウトブタを作製させた（図３）。レシピエント若雌ブタへの７つの胚移植（ＣＤ１６３ 表８）、６つの胚移植（ＣＤ１６３－Ｎｅｏなし）、および５つの胚移植（ＣＤ１Ｄ）を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムがトランスフェクトされた雄および雌胎仔線維芽細胞由来のＳＣＮＴ胚を用いて実施した。レシピエント若雌ブタの６匹（ＣＤ１６３）、２匹（ＣＤ１６３－Ｎｅｏなし）、および４匹（ＣＤ１Ｄ）（表９）が、出産まで妊娠を維持し、それぞれ、８５．７％、３３．３％、および８０％の妊娠率が得られた。ＣＤ１６３レシピエントのうち、５匹が帝王切開により健康な子ブタを出産した。１匹（Ｏ０４４）が自然に産んだ。産仔数は１～８の範囲であった。４匹のブタを、出生後の成長障害のために安楽死させた。１匹の子ブタを、重篤な口蓋裂のために安楽死させた。残りの子ブタは全て健康に見える（図３、パネルＣ）。図３、パネルＢで記載される、ＣＲＩＳＰＲ１０およびドナーＤＮＡがトランスフェクトされた胎仔線維芽細胞から得られた雄子ブタの２匹の同腹仔は、ＣＲＩＳＰＲ１０に隣接するエクソン７において３０ｂｐ欠失および前のイントロンの追加の１４７６ｂｐ欠失を有し、よって、ＣＤ１６３のイントロン６／エクソン７ジャンクションが除去されていた（図３、パネルＥ）。遺伝子型および予測される翻訳を表１０にまとめて示す。１匹の雄子ブタおよび１雌同腹仔（４匹の子ブタ）を、事前に改変したＳＩＧＬＥＣ１細胞のＣＤ１６３－Ｎｅｏなしトランスフェクションから得た。５匹の子ブタ全てが、ＳＩＧＬＥＣ１およびＣＤ１６３についてダブルノックアウトであった。雄子ブタは、ＣＤ１６３の両アレル改変を有し、１つのアレル上でエクソン７における２８ｂｐ欠失およびエクソン７の部分欠失ならびにエクソン８および前のイントロンの完全欠失を含む他のアレル上の１３８７ｂｐ欠失を有し、よってイントロンエクソンジャンクションが除去された。雌子ブタは、ＣＤ１６３の両アレル突然変異を有し、１つのアレル上の１３８２ｂｐ欠失かつ１１ｂｐ挿入および他のアレル上のＣＤ１６３の１７２０ｂｐ欠失を含んだ。ＣＤ１６３改変および予測される翻訳の概略は、表１０において見出すことができる。ＣＲＩＳＰＲ改変によるＣＤ１Ｄ改変および予測される翻訳の概略は表１１において見出すことができる。簡単に言うと、１雌および２雄同腹仔が生まれ、１３匹の子ブタが得られた。１匹の子ブタは、出生の直後に死亡した。１３匹の子ブタのうち１２匹が、ＣＤ１Ｄの両アレルまたはホモ接合型欠失を含んだ（図３、パネルＦ）。１匹の子ブタはＷＴであった。
【表8】
†ＭＵは、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ大学で、材料および方法のＩＶＦセクションにおいて記載されるように、吸引され、成熟された若雌ブタ卵母細胞を示す。ＡＲＴは、材料および方法のＳＣＮＴセクションにおいて記載されるように、購入され、成熟された雌ブタ卵母細胞を示す。
【表9】
†ＭＵは、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ大学で、材料および方法のＩＶＦセクションにおいて記載されるように、吸引され、成熟された若雌ブタ卵母細胞を示す。ＡＲＴは、材料および方法のＳＣＮＴセクションにおいて記載されるように、購入され、成熟された雌ブタ卵母細胞を示す。
【表10】
＊＊子ブタは安楽死させたので含めなかった。
†この列におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に対して、ＩＮＤＥＬを示す配列についてのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．を示す。
ａ挿入された配列は、ＴＡＣＴＡＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５）であった
ｂ挿入された配列は、ＡＧであった。
ｃ挿入された配列は、単一アデニン（Ａ）残基であった。
ｄ挿入された配列は、ＴＧＴＧＧＡＧＡＡＴＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６）であった。
ｅ挿入された配列は、ＡＧＣＣＡＧＣＧＴＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７）であった。
【表11】
【0345】
ブタ接合体におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの効率
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用した体細胞におけるＣＤ１６３およびＣＤ１Ｄの標的破壊に基づき、このアプローチを、ブタ胚形成に適用した。最初に、発生中の胚におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの有効性を試験した。ｅＧＦＰを標的にするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを、ｅＧＦＰ導入遺伝子に対してヘテロ接合性の雄豚由来の精液と受精させた接合体に導入した。注入後、ｅＧＦＰを発現するその後の胚をモニタした。様々な濃度のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを試験し、送達させたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの細胞毒性を観察した（図４、パネルＡ）；ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９注入後の胚発生は対照と比べて低かった。しかしながら、検査したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の濃度全てがｅＧＦＰの改変を生成させるのに有効であった。というのも、ｅＧＦＰ発現を有する胚がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９注入群において見出されなかったからである（図４、パネルＢ）；未注入対照胚のうち６７．７％が緑色となり、ｅＧＦＰの発現を示した。個々の胚盤胞を遺伝子型決定すると、ＣＲＩＳＰＲ結合部位付近の小さな突然変異を同定することが可能であった（図４、パネルＣ）。毒性および有効性に基づき、１０ｎｇ／μｌのｇＲＮＡおよびＣａｓ９ｍＲＮＡを下記実験のために使用した。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用した体細胞におけるＣＤ１６３およびＣＤ１Ｄの標的破壊に基づき、このアプローチを、ブタ胚形成に適用した。最初に、発生中の胚におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの有効性を試験した。ｅＧＦＰを標的にするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを、ｅＧＦＰ導入遺伝子に対してヘテロ接合性の雄豚由来の精液と受精させた接合体に導入した。注入後、ｅＧＦＰを発現するその後の胚をモニタした。様々な濃度のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを試験し、送達させたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの細胞毒性を観察した（図４、パネルＡ）；ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９注入後の胚発生は対照と比べて低かった。しかしながら、検査したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の濃度全てがｅＧＦＰの改変を生成させるのに有効であった。というのも、ｅＧＦＰ発現を有する胚がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９注入群において見出されなかったからである（図４、パネルＢ）；未注入対照胚のうち６７．７％が緑色となり、ｅＧＦＰの発現を示した。個々の胚盤胞を遺伝子型決定すると、ＣＲＩＳＰＲ結合部位付近の小さな突然変異を同定することが可能であった（図４、パネルＣ）。毒性および有効性に基づき、１０ｎｇ／μｌのｇＲＮＡおよびＣａｓ９ｍＲＮＡを下記実験のために使用した。
【0346】
ＣＤ１６３を標的にするように設計されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素を、予定接合体に導入すると、その後の胚盤胞において遺伝子の標的改変が観察された。個々の胚盤胞をＣＤ１６３の突然変異について遺伝子型決定すると、特異的突然変異が全ての胚において見出された（１００％ＧＥ効率）。より重要なことには、ホモ接合性または両アレル改変を有する胚を見出すことができたが（それぞれ、８／１８および３／１８）（図５）、モザイク（単一アレル改変）遺伝子型もまた検出された（４／１８胚）。そのプール由来のいくつかの胚（８／１０）に２ｎｇ／μｌのＣａｓ９および１０ｎｇ／μｌのＣＲＩＳＰＲを注入し、変異誘発の効率に差は見られなかった。次に、インビトロ結果に基づき、異なるｇＲＮＡを表す２つのＣＲＩＳＰＲを導入し、胚形成中にＣＤ１６３またはＣＤ１Ｄを破壊し、標的遺伝子の特異的欠失を誘導した。その結果、２つのガイドを導入することによりＣＤ１６３およびＣＤ１Ｄの設計された欠失をうまく導入することが可能であった。設計された欠失は、導入された２つのガイド間のゲノム配列を除去する欠失として規定される。ＣＤ１６３を標的にする２つのＣＲＩＳＰＲを受け取った胚の中で、１つを除く全ての胚でＣＤ１６３の標的改変が得られた。加えて、５／１３胚は、ＣＤ１６３上に設計された欠失を有することが見出され（図６、パネルＡ）、１０／１３胚は、ホモ接合性または両アレル様式のいずれかでＣＤ１６３の改変を有するように見えた。２つのＣＲＩＳＰＲでＣＤ１Ｄを標的にさせることもまた有効であった。というのも、全ての胚（２３／２３）が、ＣＤ１Ｄの改変を示したからである。しかしながら、ＣＤ１Ｄの設計された欠失は２つの胚において見出すことができたにすぎなかった（２／２３）（図６、パネルＢ）。２３の胚のうち、モザイク遺伝子型を有する５つもまた見出されたが、胚の残りは、ＣＤ１Ｄのホモ接合性かまたは両アレル改変のいずれかを有した。最後に、複数の遺伝子を同じ胚内でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムにより標的にさせることができるかどうかを試験した。このために、ＣＤ１６３およびｅＧＦＰの両方のターゲティングを、ヘテロ接合性ｅＧＦＰ精液と受精させた接合体において実施した。注入胚由来の胚盤胞をＣＤ１６３およびｅＧＦＰについて遺伝子型決定すると、ＣＤ１６３およびｅＧＦＰが胚形成中にうまく標的されたことが見出された。配列決定結果により、複数の遺伝子は、複数のＣＲＩＳＰＲをＣａｓ９と共に導入することにより標的させることができることが証明された（図６、パネルＣ）。
【0347】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９注入接合体からのＣＤ１６３およびＣＤ１Ｄ変異体の作製
前のインビトロ研究の成功に基づき、いくつかのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９注入接合体を作製し、１レシピエントあたり４６～５５胚盤胞を移植した（この数はインビトロで誘導した胚からブタを作製するのに有効であることが示されているからである）。４つの胚移植を実施し、ＣＤ１６３およびＣＤ１Ｄに対して各々２つとして、各改変について妊娠を得た。ＣＤ１６３上に改変を保有している４匹の健康な子ブタが生成された（表８）。レシピエント雌ブタＩＤＯ０８３からの全ての子ブタ、同腹仔６７は、ＣＤ１６３のホモ接合性または両アレル改変を示した（図７）。２匹の子ブタは、送達された２つのＣＲＩＳＰＲによるＣＤ１６３の設計された欠失を示した。子ブタは全て健康であった。ＣＤ１Ｄでは、１回の妊娠でまた、４匹の子ブタが生成し（レシピエント雌ブタ識別番号Ｏ１６５から同腹仔１６６）：１匹が雌、３匹が雄であった（表９）。１匹の子ブタ（１６６－１）はＣＤ１Ｄのモザイク突然変異を保有し、開始コドンを含むエクソン３を完全に除去した３６２ｂｐ欠失が含まれる（図８）。１匹の子ブタは６ｂｐ挿入を含み、１つのアレル上に２ｂｐミスマッチを有し、他のアレル上に大きな欠失を有した。２匹の追加の子ブタは両アレル単一ｂｐ挿入を有した。ＣＤ１６３について、モザイク突然変異は検出されなかった。
前のインビトロ研究の成功に基づき、いくつかのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９注入接合体を作製し、１レシピエントあたり４６～５５胚盤胞を移植した（この数はインビトロで誘導した胚からブタを作製するのに有効であることが示されているからである）。４つの胚移植を実施し、ＣＤ１６３およびＣＤ１Ｄに対して各々２つとして、各改変について妊娠を得た。ＣＤ１６３上に改変を保有している４匹の健康な子ブタが生成された（表８）。レシピエント雌ブタＩＤＯ０８３からの全ての子ブタ、同腹仔６７は、ＣＤ１６３のホモ接合性または両アレル改変を示した（図７）。２匹の子ブタは、送達された２つのＣＲＩＳＰＲによるＣＤ１６３の設計された欠失を示した。子ブタは全て健康であった。ＣＤ１Ｄでは、１回の妊娠でまた、４匹の子ブタが生成し（レシピエント雌ブタ識別番号Ｏ１６５から同腹仔１６６）：１匹が雌、３匹が雄であった（表９）。１匹の子ブタ（１６６－１）はＣＤ１Ｄのモザイク突然変異を保有し、開始コドンを含むエクソン３を完全に除去した３６２ｂｐ欠失が含まれる（図８）。１匹の子ブタは６ｂｐ挿入を含み、１つのアレル上に２ｂｐミスマッチを有し、他のアレル上に大きな欠失を有した。２匹の追加の子ブタは両アレル単一ｂｐ挿入を有した。ＣＤ１６３について、モザイク突然変異は検出されなかった。
【0348】
論考
ＧＥブタ生成の効率の増加は、農業および生物医学のためにより多くのＧＥブタを提供することにより、広く影響を与えることができる。以上で記載されるデータにより、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用することにより、特定の突然変異を有するＧＥブタを高効率で生成させることができることが示される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは体細胞および着床前胚の両方において遺伝子を改変するためにうまく適用された。
ＧＥブタ生成の効率の増加は、農業および生物医学のためにより多くのＧＥブタを提供することにより、広く影響を与えることができる。以上で記載されるデータにより、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用することにより、特定の突然変異を有するＧＥブタを高効率で生成させることができることが示される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは体細胞および着床前胚の両方において遺伝子を改変するためにうまく適用された。
【0349】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを体細胞に導入した場合、これはＮＨＥＪによる標的遺伝子の標的破壊をうまく誘導したが、ＨＲによる標的能力は増加させなかった。体細胞における個々のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のターゲティング効率は変化し、これにより、ガイドの設計がターゲティング効率に影響し得ることが示された。特定的には、ＣＲＩＳＰＲ５３５０およびＣａｓ９を、体細胞に導入した場合、ＣＤ１Ｄの標的改変を見出すことはできなかった。これにより、複数のｇＲＮＡを設計し、それらの効率をブタを生成させる前に検証することが有益となり得ることが示唆される。ドナーＤＮＡの存在によるＨＲ修復の欠如の理由は依然として不明確である。ＣＲＩＳＰＲおよびドナーＤＮＡがトランスフェクトされた８８６のコロニーをスクリーニングした後（ＣＤ１６３およびＣＤ１Ｄの両方）、１つのコロニーのみが、部分ＨＲイベントの証拠を有した。結果により、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは導入されたドナーＤＮＡと共に働き、標的遺伝子上で予想外の大きな欠失を引き起こしたが、これらの２つの特定のターゲティングベクターについてはＨＲ効率を増加させなかったことが証明された。しかしながら、大きな欠失観察に対する特異的メカニズムはわかっていない。我々のグループからの前の報告により、ドナーＤＮＡは、ＨＲ修復を誘導するために、ＺＦＮと共に効果的に使用することができることが示唆された。同様に、ドナーＤＮＡをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムと共に使用した場合にターゲティング効率の増加が見られたが、完全ＨＲ修復は観察されなかった。ＺＦＮを使用した前の研究では、標的改変はＨＲおよびＮＨＥＪの組み合わせにより起こり得ることが観察された。というのも、ＺＦＮにより誘発されたＤＳＢ後、導入されたドナーＤＮＡの部分組換えが見られたからである。１つの説明は、ＨＲおよびＮＨＥＪ経路は独立していないが、一緒に作用することができ、ホーミングエンドヌクレアーゼにより誘発されたＤＳＢ後の修復プロセスを完了することができるというものである。ＣＲＩＳＰＲ濃度が高いほど、体細胞におけるターゲティング効率は改善されるが、これらの実験結果においては、統計学的差異は見られなかった。これにより、ＣＲＩＳＰＲはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムにおける制限因子であることが示唆されるが、さらなる検証が必要とされる。標的細胞をうまく使用して、ＧＥブタをＳＣＮＴにより生成させた。これにより、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の適用は、細胞がクローニングされる能力に影響しないことが示される。２、３匹の子ブタを健康問題のために安楽死させた；しかしながら、これはＳＣＮＴ由来子ブタではまれである。
【0350】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムが発生中の胚中に接合体注入により導入された場合、ほぼ１００％の胚およびブタが標的遺伝子においてＩＮＤＥＬを含み、技術は胚形成中に非常に有効であることが証明される。この研究中に観察された効率は、胚形成中にホーミングエンドヌクレアーゼを使用する他の研究において報告された頻度を上回る。胚盤胞期に到達した胚の数の減少により、この研究で導入されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の濃度は胚にとって毒性となり得ることが示唆された。送達系のさらなる最適化により、胚の生存性が増加し、よって、プロセスの全体効率が改善され得る。ここで観察されたほぼ１００％の変異誘発率は、ブタにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ノックアウトにおける前の報告とは異なっていた；しかしながら、研究間の効率の差は、選択されたガイドと標的の組み合わせとすることができる。本研究では、より低い濃度のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（各々１０ｎｇ／μｌ）は発生中の胚において突然変異を作製し、ＧＥブタを生成させるのに有効であった。濃度はブタ接合体で前に報告されたもの（１２５ｎｇ／μｌのＣａｓ９および１２．５ｎｇ／μｌのＣＲＩＳＰＲ）より低い。より低い濃度のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素が、発生中の胚に有益になり得る。というのも、過剰の核酸を発生中の胚中に導入するのは毒性となり得るからである。いくらかのモザイク遺伝子型が、インビトロアッセイからのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９注入胚において見られた；しかしながら、そのアプローチにより生成された１匹の子ブタのみがモザイク遺伝子型を有した。潜在的に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素の注入は、他のホーミングエンドヌクレアーゼの導入より有効となり得る。というのも、モザイク遺伝子型は、接合体においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用する主なハードルとなると考えられるからであった。本結果により証明されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用する別の利点は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムが注入されたＩＶＦ誘導接合体から生成されたＣＤ１６３ノックアウトブタは失われなかったが、一方、ＳＣＮＴから得られた２、３匹の子ブタは数日後に安楽死させた。これにより、その技術はノックアウトブタを作製するのにＳＣＮＴが必要とされることを回避することができただけでなく、ＳＣＮＴと関連するよく見られる健康上の問題を克服することができたことが示唆される。今やＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｍＲＮＡの接合体への注入は最適化されたからには、さらなる実験は、同様に、ドナーＤＮＡの同時注入を含むであろう。
【0351】
本研究では、２つのＣＲＩＳＰＲをＣａｓ９と共に接合体に導入すると、発生中の胚において染色体の欠失を誘導することができ、意図された欠失、すなわち、２つのＣＲＩＳＰＲガイド間の特異的欠失を有するブタが生成されることが証明される。この設計された欠失は、有益となり得る。というのも、ＮＨＥＪにより引き起こされるランダムイベントに頼るのではなく、欠失のサイズを特定することが可能だからである。特定的には、ホーミングエンドヌクレアーゼにより引き起こされる３の倍数のヌクレオチドの挿入／欠失が存在する場合、突然変異では、むしろ、低形質突然変異という結果となり得る。というのも、フレームシフトが起こらないからである。しかしながら、２つのＣＲＩＳＰＲを導入することにより、より大きな欠失を引き起こすことが可能になり、これにより、非機能性タンパク質を作製する可能性がより高くなるであろう。興味深いことに、ＣＤ１６３よりもゲノムにおいてより大きなエリアにわたるＣＤ１Ｄ ＣＲＩＳＰＲが設計され；ＣＤ１６３ ＣＲＩＳＰＲ１０と１３１の間は１２４ｂｐの距離であったが、ＣＤ１ＤについてはＣＲＩＳＰＲ４８００と５３５０の間では５５０ｂｐの距離となった。ＣＲＩＳＰＲ間のより長い距離は、この研究で示されるように、欠失を作製するにはあまり有効ではなかった。しかしながら、本研究では制限された観察しか含まれておらず、個々のＣＲＩＳＰＲの効力（ここでは対処されていない）を考慮する必要があるので、ＣＲＩＳＰＲ間の距離と意図された欠失を引き起こす確率の間の関係を検証するために、さらなる研究が必要である。
【0352】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムはまた、同じ胚内で２つの遺伝子を同時に標的にするのに有効であり、唯一の余分な工程は１つの追加のＣＲＩＳＰＲとｃｒＲＮＡの導入であった。これにより、他のホーミングエンドヌクレアーゼと比べて複数の遺伝子を破壊する容易さが示される。これらの結果により、この技術は、補償効果を有する可能性があり、よって、全ての遺伝子が破壊されない限り、個々の遺伝子の役割を決定することが困難であることが証明されている遺伝子群または遺伝子ファミリーを標的にするために使用され得ることが示唆される。結果から、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術は、体細胞における遺伝子ターゲティングの効率を増加させることにより、および直接接合体注入により、ＧＥブタを作製するのに適用することができることが証明される。
【0353】
実施例２：ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子における改変染色体配列を有するブタにおけるＰＲＲＳＶに対する増加した抵抗性
ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）は１世紀の第四半期にわたってブタ産業を破壊した。ウイルス侵入様式についての推測はＳＩＧＬＥＣ１およびＣＤ１６３の両方を含んだ。ＳＩＧＬＥＣ１のノックアウトはウイルス曝露への応答に影響しなかったが、本実施例では、ＣＤ１６３ヌル動物は、全てＰＲＲＳＶ感染の特徴である、感染の臨床徴候、肺病理、ウイルス血症または抗体産生を示さないことが示されている。ＰＲＲＳＶ侵入メディエーターが確認されるだけでなく；同様に作製された動物が、食物供給への参加を許された場合、著しい経済的損失および動物罹患を防止する戦略が記載される。
ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）は１世紀の第四半期にわたってブタ産業を破壊した。ウイルス侵入様式についての推測はＳＩＧＬＥＣ１およびＣＤ１６３の両方を含んだ。ＳＩＧＬＥＣ１のノックアウトはウイルス曝露への応答に影響しなかったが、本実施例では、ＣＤ１６３ヌル動物は、全てＰＲＲＳＶ感染の特徴である、感染の臨床徴候、肺病理、ウイルス血症または抗体産生を示さないことが示されている。ＰＲＲＳＶ侵入メディエーターが確認されるだけでなく；同様に作製された動物が、食物供給への参加を許された場合、著しい経済的損失および動物罹患を防止する戦略が記載される。
【0354】
材料および方法
遺伝子型判定
遺伝子型判定は、ＤＮＡ配列決定およびｍＲＮＡ配列決定の両方に基づいた。雄親の遺伝子型は、１つのアレルにおいて１１ｂｐ欠失を有し、これは翻訳されると、ドメイン５への４５アミノ酸が予測され、アミノ酸６４での未成熟終止コドンが得られた。他のアレルでは、エクソン７における２ｂｐ付加およびエクソン７前のイントロンでの３７７ｂｐ欠失が存在し、これは翻訳されるとドメイン５の最初の４９アミノ酸が予測され、アミノ酸８５での未成熟終止コードが得られた。１匹の雌ブタは１つのアレルにおいて７ｂｐ付加を有し、これは翻訳されると、ドメイン５の最初の４８アミノ酸が予測され、アミノ酸７０での未成熟終止コドンが得られた。他のアレルは特徴づけられておらず（Ａ）、というのも、ＰＣＲまたはロングレンジ６．３ｋｂＰＣＲのいずれによっても、エクソン７由来のバンドがなかったからであった。他の３匹の雌ブタはクローンであり、エクソン７における１２９ｂｐ欠失を有し、これは、ドメイン５由来の４３アミノ酸の欠失ということによると予測される。他のアレルは特徴づけられていなかった（Ｂ）。
遺伝子型判定
遺伝子型判定は、ＤＮＡ配列決定およびｍＲＮＡ配列決定の両方に基づいた。雄親の遺伝子型は、１つのアレルにおいて１１ｂｐ欠失を有し、これは翻訳されると、ドメイン５への４５アミノ酸が予測され、アミノ酸６４での未成熟終止コドンが得られた。他のアレルでは、エクソン７における２ｂｐ付加およびエクソン７前のイントロンでの３７７ｂｐ欠失が存在し、これは翻訳されるとドメイン５の最初の４９アミノ酸が予測され、アミノ酸８５での未成熟終止コードが得られた。１匹の雌ブタは１つのアレルにおいて７ｂｐ付加を有し、これは翻訳されると、ドメイン５の最初の４８アミノ酸が予測され、アミノ酸７０での未成熟終止コドンが得られた。他のアレルは特徴づけられておらず（Ａ）、というのも、ＰＣＲまたはロングレンジ６．３ｋｂＰＣＲのいずれによっても、エクソン７由来のバンドがなかったからであった。他の３匹の雌ブタはクローンであり、エクソン７における１２９ｂｐ欠失を有し、これは、ドメイン５由来の４３アミノ酸の欠失ということによると予測される。他のアレルは特徴づけられていなかった（Ｂ）。
【0355】
培養下のＰＲＲＳＶの増殖およびブタの感染のためのウイルス接種材料の生成は認可されたＩＢＣ適用９７３に含められる
ＰＲＲＳＶの基準株、分離株ＮＶＳＬ９７－７８９５（ＧｅｎＢａｎｋ ＃ ＡＦ３２５６９１ ２００１－０２－１１）を認可されたＩＢＣプロトコル９７３において記載されるように増殖させた。この研究室分離株は実験研究において約２０年間使用されてきた（Ｌａｄｉｎｉｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）。第２の分離株を、前に記載されるように（Ｐｒａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）、第２試行、ＫＳ０６－７２１０９のために使用した。
ＰＲＲＳＶの基準株、分離株ＮＶＳＬ９７－７８９５（ＧｅｎＢａｎｋ ＃ ＡＦ３２５６９１ ２００１－０２－１１）を認可されたＩＢＣプロトコル９７３において記載されるように増殖させた。この研究室分離株は実験研究において約２０年間使用されてきた（Ｌａｄｉｎｉｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）。第２の分離株を、前に記載されるように（Ｐｒａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）、第２試行、ＫＳ０６－７２１０９のために使用した。
【0356】
ＰＲＲＳＶによるブタの感染
ＰＲＲＳＶのための標準化感染プロトコルをブタの感染のために使用した。３週齢の子ブタに、およそ１０４ ＴＣＩＤ５０のＰＲＲＳウイルス（筋肉内（ＩＭ）および鼻腔内（ＩＮ）経路により投与した）を接種した。ブタを毎日モニタし、疾病の症状を示すものをＣＭＧ獣医師の推奨に従い、処置した。重篤な窮迫を示し、感染に屈する危険にあるブタは人道的に安楽死させ、試料を収集した。スタッフおよび獣医師は、評価または処置における偏りを排除するために、ブタの遺伝的状態について知らされていなかった。ＰＲＲＳＶは感染中体液中に存在し；そのため、血液試料を収集し、各ブタにおいてウイルス血症の量または程度を決定するために測定するまで－８０℃で保存した。実験の終わりに、ブタの体重測定を実施し、人道的に安楽死させ、組織を収集し、１０％緩衝ホルマリン中で固定し、パラフィンに包埋し、委員会認定病理学者による病理組織診断のために処理した。
ＰＲＲＳＶのための標準化感染プロトコルをブタの感染のために使用した。３週齢の子ブタに、およそ１０４ ＴＣＩＤ５０のＰＲＲＳウイルス（筋肉内（ＩＭ）および鼻腔内（ＩＮ）経路により投与した）を接種した。ブタを毎日モニタし、疾病の症状を示すものをＣＭＧ獣医師の推奨に従い、処置した。重篤な窮迫を示し、感染に屈する危険にあるブタは人道的に安楽死させ、試料を収集した。スタッフおよび獣医師は、評価または処置における偏りを排除するために、ブタの遺伝的状態について知らされていなかった。ＰＲＲＳＶは感染中体液中に存在し；そのため、血液試料を収集し、各ブタにおいてウイルス血症の量または程度を決定するために測定するまで－８０℃で保存した。実験の終わりに、ブタの体重測定を実施し、人道的に安楽死させ、組織を収集し、１０％緩衝ホルマリン中で固定し、パラフィンに包埋し、委員会認定病理学者による病理組織診断のために処理した。
【0357】
曝露させたブタの表現型スコアリング
ブタの表現型を、毎日下記の通り盲検的にスコア化した：ブタの態度はどれ？態度スコア：０：ＢＡＲ、１：ＱＡＲ、２：わずかに抑うつ、３：抑うつ、４：瀕死。ブタの体調はどれ？体調スコア：１：異常なほどやせ衰えた、２：やせた、３：理想、４：太った、５：過剰脂肪／肥満。ブタの直腸温度は何？正常体温１０１．６～１０３．６°Ｆ（発熱と考えられる＞１０４°Ｆ）。跛行があるか（グレード）？どの肢？関節腫脹および蹄病変について肢を評価（蹄の底面および側面のチェック）。跛行スコア：１：跛行なし、２：歩くときわずかに不均等、いくつか関節で拘縮が見られるが跛行なし、３：軽度の跛行、歩く間のわずかな足の引きずり、４：中度の跛行、つま先接触する足の不自由さを含む明らかな足の引きずり、５：重篤な跛行、肢への体重負荷なし、立つ／歩くために激励が必要である。呼吸困難があるか（グレード）？口を開けた呼吸があるか？鼻汁があるか（鼻汁の色、鼻汁の量：軽度／中度／重度）？動物咳嗽に気付いたか？眼漏があるか？呼吸スコア：０：正常、１：ストレスを受けた時（取扱を受けた時）軽度呼吸困難および／または頻呼吸、２：安静時に軽度呼吸困難および／または頻呼吸、３：ストレスを受けた時（取扱を受けた時）中度呼吸困難および／または頻呼吸、４：安静時に中度呼吸困難および／または頻呼吸、５：ストレスを受けた時（取扱を受けた時）重度呼吸困難および／または頻呼吸、６：安静時に重度呼吸困難および／または頻呼吸。下痢（グレード）または嘔吐のエビデンスがあるか？血液または粘液があるか？下痢スコア：０：気付ける糞便なし、１：正常便、２：軟便だが形あり（ソフトクリームヨーグルト稠度、牛糞形成）、３：微粒子糞便物質を有する褐色／黄褐色の色の液体下痢、４：微粒子糞便物質のない褐色／黄褐色の色の液体下痢、５：水と同様に見える液体下痢。
ブタの表現型を、毎日下記の通り盲検的にスコア化した：ブタの態度はどれ？態度スコア：０：ＢＡＲ、１：ＱＡＲ、２：わずかに抑うつ、３：抑うつ、４：瀕死。ブタの体調はどれ？体調スコア：１：異常なほどやせ衰えた、２：やせた、３：理想、４：太った、５：過剰脂肪／肥満。ブタの直腸温度は何？正常体温１０１．６～１０３．６°Ｆ（発熱と考えられる＞１０４°Ｆ）。跛行があるか（グレード）？どの肢？関節腫脹および蹄病変について肢を評価（蹄の底面および側面のチェック）。跛行スコア：１：跛行なし、２：歩くときわずかに不均等、いくつか関節で拘縮が見られるが跛行なし、３：軽度の跛行、歩く間のわずかな足の引きずり、４：中度の跛行、つま先接触する足の不自由さを含む明らかな足の引きずり、５：重篤な跛行、肢への体重負荷なし、立つ／歩くために激励が必要である。呼吸困難があるか（グレード）？口を開けた呼吸があるか？鼻汁があるか（鼻汁の色、鼻汁の量：軽度／中度／重度）？動物咳嗽に気付いたか？眼漏があるか？呼吸スコア：０：正常、１：ストレスを受けた時（取扱を受けた時）軽度呼吸困難および／または頻呼吸、２：安静時に軽度呼吸困難および／または頻呼吸、３：ストレスを受けた時（取扱を受けた時）中度呼吸困難および／または頻呼吸、４：安静時に中度呼吸困難および／または頻呼吸、５：ストレスを受けた時（取扱を受けた時）重度呼吸困難および／または頻呼吸、６：安静時に重度呼吸困難および／または頻呼吸。下痢（グレード）または嘔吐のエビデンスがあるか？血液または粘液があるか？下痢スコア：０：気付ける糞便なし、１：正常便、２：軟便だが形あり（ソフトクリームヨーグルト稠度、牛糞形成）、３：微粒子糞便物質を有する褐色／黄褐色の色の液体下痢、４：微粒子糞便物質のない褐色／黄褐色の色の液体下痢、５：水と同様に見える液体下痢。
【0358】
このスコアリングシステムはＤｒ． Ｍｅｇａｎ ＮｉｅｄｅｒｗｅｒｄｅｒによりＫＳＵで開発され、下記刊行物に基づく（Ｈａｌｂｕｒ ｅｔ ａｌ．， １９９５； Ｍｅｒｃｋ； Ｍｉａｏ ｅｔ ａｌ．， ２００９； Ｐａｔｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｈａｃｋｅｒ， １９８９； Ｗｉｎｃｋｌｅｒ ａｎｄ Ｗｉｌｌｅｎ， ２００１）。スコアおよび温度を、処理として遺伝子型に基づき分離したＡＮＯＶＡを用いることにより分析した。
【0359】
ＰＲＲＳＶウイルス血症の測定
ウイルス血症を２つのアプローチにより決定した。ウイルス滴定を、１：１０段階希釈の血清を９６ウェルプレート中のコンフルエントＭＡＲＣ－１４５細胞に添加することにより実施した。血清を、前に記載されるように、８％ウシ胎仔血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびアンホテリシンＢが補充されたイーグル最小必須培地中で希釈した（Ｐｒａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）。細胞を、４日のインキュベーション後に、細胞変性効果の存在について、顕微鏡を使用することにより検査した。細胞変性効果を示す最高希釈を滴定終点としてスコア化した。全ＲＮＡをウイルス核酸を測定するために、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＭａｇＭＡＸ－９６ウイルスＲＮＡ単離キットを使用することにより、血清から単離した。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を、Ｔｅｔｒａｃｏｒｅ製のＥＺ－ＰＲＲＳＶ ＭＰＸ ４．０キットを使用することにより、ＣＦＸ－９６リアルタイムＰＣＲシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上で、製造者の指示に従い実施した。各反応物（２５μｌ）は５．８μｌの血清由来のＲＮＡを含んだ。検量線をキット（Ｔｅｔｒａｃｏｒｅ）で供給したＲＮＡ対照の段階希釈を調製することにより構築した。ＰＣＲあたりのテンプレートの数を報告する。
ウイルス血症を２つのアプローチにより決定した。ウイルス滴定を、１：１０段階希釈の血清を９６ウェルプレート中のコンフルエントＭＡＲＣ－１４５細胞に添加することにより実施した。血清を、前に記載されるように、８％ウシ胎仔血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびアンホテリシンＢが補充されたイーグル最小必須培地中で希釈した（Ｐｒａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）。細胞を、４日のインキュベーション後に、細胞変性効果の存在について、顕微鏡を使用することにより検査した。細胞変性効果を示す最高希釈を滴定終点としてスコア化した。全ＲＮＡをウイルス核酸を測定するために、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＭａｇＭＡＸ－９６ウイルスＲＮＡ単離キットを使用することにより、血清から単離した。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を、Ｔｅｔｒａｃｏｒｅ製のＥＺ－ＰＲＲＳＶ ＭＰＸ ４．０キットを使用することにより、ＣＦＸ－９６リアルタイムＰＣＲシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上で、製造者の指示に従い実施した。各反応物（２５μｌ）は５．８μｌの血清由来のＲＮＡを含んだ。検量線をキット（Ｔｅｔｒａｃｏｒｅ）で供給したＲＮＡ対照の段階希釈を調製することにより構築した。ＰＣＲあたりのテンプレートの数を報告する。
【0360】
ＰＡＭ細胞のＳＩＧＬＥＣ１およびＣＤ１６３染色
肺を切除し、約１００ｍｌの冷リン酸緩衝生理食塩水で満たすことにより、ブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）を収集した。リン酸緩衝生理食塩水洗浄液を回収した後、細胞をペレット化し、５ｍｌ冷リン酸緩衝生理食塩水中に再懸濁させ、氷上で保存した。およそ１０７のＰＡＭを、５ｍｌの様々な抗体（抗ブタＣＤ１６９（クローン３Ｂ１１／１１；ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）；抗ブタＣＤ１６３（クローン２Ａ１０／１１；ＡｂＤＳｅｒｏｔｅｃ））が希釈されたリン酸緩衝生理食塩水中で５％ウシ胎仔血清および０．１％ナトリウムアジドと共に、３０分間氷上でインキュベートした。細胞を洗浄し、１／１００希釈の、染色バッファー中で希釈させたフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に再懸濁させ、３０分間氷上でインキュベートした。少なくとも１０４の細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターおよびＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いることにより分析した。
肺を切除し、約１００ｍｌの冷リン酸緩衝生理食塩水で満たすことにより、ブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）を収集した。リン酸緩衝生理食塩水洗浄液を回収した後、細胞をペレット化し、５ｍｌ冷リン酸緩衝生理食塩水中に再懸濁させ、氷上で保存した。およそ１０７のＰＡＭを、５ｍｌの様々な抗体（抗ブタＣＤ１６９（クローン３Ｂ１１／１１；ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）；抗ブタＣＤ１６３（クローン２Ａ１０／１１；ＡｂＤＳｅｒｏｔｅｃ））が希釈されたリン酸緩衝生理食塩水中で５％ウシ胎仔血清および０．１％ナトリウムアジドと共に、３０分間氷上でインキュベートした。細胞を洗浄し、１／１００希釈の、染色バッファー中で希釈させたフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に再懸濁させ、３０分間氷上でインキュベートした。少なくとも１０４の細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターおよびＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いることにより分析した。
【0361】
ＰＲＲＳＶ特異的Ｉｇの測定
ＰＲＲＳＶ特異的Ｉｇを測定するために、組換えＰＲＲＳＶ Ｎタンパク質を細菌中で発現させ（Ｔｒｉｂｌｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１２）、磁性Ｌｕｍｉｎｅｘビーズにキット（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用することによりコンジュゲートさせた。Ｎタンパク質結合ビーズを、１０％ヤギ血清を含むリン酸緩衝生理食塩水中で２，５００ビーズ／５０μｌまで希釈し、９６ウェル丸底ポリスチレンプレートのウェルに入れた。血清を、１０％ヤギ血清を含むリン酸緩衝生理食塩水中１：４００で希釈し、５０μｌを２連のウェルに添加し、３０分間穏やかに振盪しながら、室温でインキュベートした。次に、プレートを１０％ヤギ血清を含むリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し（３×）、５０μｌのビオチン－ＳＰコンジュゲートアフィニティ精製ヤギ抗ブタ二次抗体（ＩｇＧ、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）またはビオチン標識アフィニティ精製ヤギ抗ブタＩｇＭ（ＫＰＬ）（１０％ヤギ血清を含むリン酸緩衝生理食塩水中２μｇ／ｍｌまで希釈されている）を添加した。３０分のインキュベーション後、プレートを洗浄し（３×）、その後、５０μｌのストレプトアビジン－コンジュゲートフィコエリトリン（１０％ヤギ血清を含むリン酸緩衝生理食塩水中、２μｇ／ｍｌ（Ｍｏｓｓ， Ｉｎｃ．））を添加した。プレートを３０分後に洗浄し、ミクロスフェアを１００μｌの１０％ヤギ血清を含むリン酸緩衝生理食塩水中に再懸濁させ、ＭＡＧＰＩＸおよびＬｕｍｉｎｅｘ ｘＰＯＮＥＮＴ４．２ソフトウェアを使用することにより分析した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を報告する。
ＰＲＲＳＶ特異的Ｉｇを測定するために、組換えＰＲＲＳＶ Ｎタンパク質を細菌中で発現させ（Ｔｒｉｂｌｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１２）、磁性Ｌｕｍｉｎｅｘビーズにキット（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用することによりコンジュゲートさせた。Ｎタンパク質結合ビーズを、１０％ヤギ血清を含むリン酸緩衝生理食塩水中で２，５００ビーズ／５０μｌまで希釈し、９６ウェル丸底ポリスチレンプレートのウェルに入れた。血清を、１０％ヤギ血清を含むリン酸緩衝生理食塩水中１：４００で希釈し、５０μｌを２連のウェルに添加し、３０分間穏やかに振盪しながら、室温でインキュベートした。次に、プレートを１０％ヤギ血清を含むリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し（３×）、５０μｌのビオチン－ＳＰコンジュゲートアフィニティ精製ヤギ抗ブタ二次抗体（ＩｇＧ、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）またはビオチン標識アフィニティ精製ヤギ抗ブタＩｇＭ（ＫＰＬ）（１０％ヤギ血清を含むリン酸緩衝生理食塩水中２μｇ／ｍｌまで希釈されている）を添加した。３０分のインキュベーション後、プレートを洗浄し（３×）、その後、５０μｌのストレプトアビジン－コンジュゲートフィコエリトリン（１０％ヤギ血清を含むリン酸緩衝生理食塩水中、２μｇ／ｍｌ（Ｍｏｓｓ， Ｉｎｃ．））を添加した。プレートを３０分後に洗浄し、ミクロスフェアを１００μｌの１０％ヤギ血清を含むリン酸緩衝生理食塩水中に再懸濁させ、ＭＡＧＰＩＸおよびＬｕｍｉｎｅｘ ｘＰＯＮＥＮＴ４．２ソフトウェアを使用することにより分析した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を報告する。
【0362】
結果
ＣＤ１６３における突然変異をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用して、実施例１において以上で記載される通りに作製した。いくらかのファウンダー動物を接合体注入および体細胞核移植から生成させた。これらのファウンダーのいくらかを交配させ、研究のための子孫を生成させた。単一のファウンダー雄を２つの遺伝子型を有する雌と交配させた。ファウンダー雄（６７－１）は、１つのアレル上のエクソン７における１１ｂｐ欠失および他のアレルのエクソン７における２ｂｐ付加（および前のイントロンにおける３７７ｂｐ欠失）を有し、ヌル動物（ＣＤ１６３－／－）であることが予測された。１匹のファウンダー雌（６５－１）は１つのアレルにおけるエクソン７における７ｂｐ付加および特徴づけられていない対応するアレルを有し、よって、ノックアウトについてヘテロ接合性であることが予測された（ＣＤ１６３－／？）。第２のファウンダー雌遺伝子型（クローンである３匹の動物）は、まだ特徴づけられていないアレルおよびエクソン７における１２９ｂｐ欠失を有するアレルを含んだ。この欠失は、ドメイン５における４３アミノ酸の欠失となると予測される。これらの動物間の交配により、全ての子ブタが雄豚由来のヌルアレルおよび雌ブタ由来の４３アミノ酸欠失または特徴づけられていないアレルの１つのいずれか受け継ぐと言う結果となった。ウイルス曝露についての陽性対照として機能した野生型子ブタに加えて、これにより４つの追加の遺伝子型が生成された（表８）。
ＣＤ１６３における突然変異をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用して、実施例１において以上で記載される通りに作製した。いくらかのファウンダー動物を接合体注入および体細胞核移植から生成させた。これらのファウンダーのいくらかを交配させ、研究のための子孫を生成させた。単一のファウンダー雄を２つの遺伝子型を有する雌と交配させた。ファウンダー雄（６７－１）は、１つのアレル上のエクソン７における１１ｂｐ欠失および他のアレルのエクソン７における２ｂｐ付加（および前のイントロンにおける３７７ｂｐ欠失）を有し、ヌル動物（ＣＤ１６３－／－）であることが予測された。１匹のファウンダー雌（６５－１）は１つのアレルにおけるエクソン７における７ｂｐ付加および特徴づけられていない対応するアレルを有し、よって、ノックアウトについてヘテロ接合性であることが予測された（ＣＤ１６３－／？）。第２のファウンダー雌遺伝子型（クローンである３匹の動物）は、まだ特徴づけられていないアレルおよびエクソン７における１２９ｂｐ欠失を有するアレルを含んだ。この欠失は、ドメイン５における４３アミノ酸の欠失となると予測される。これらの動物間の交配により、全ての子ブタが雄豚由来のヌルアレルおよび雌ブタ由来の４３アミノ酸欠失または特徴づけられていないアレルの１つのいずれか受け継ぐと言う結果となった。ウイルス曝露についての陽性対照として機能した野生型子ブタに加えて、これにより４つの追加の遺伝子型が生成された（表８）。
【表12】
【0363】
離乳時に、遺伝子編集された子ブタおよび野生型同年齢子ブタを、ＰＲＲＳＶ曝露のためにＫａｎｓａｓ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙに輸送した。ＰＲＲＳＶ曝露を前に記載されるように実施した（Ｐｒａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）。子ブタを３週齢で曝露施設に持ち込み、単一群として維持した。全ての実験を施設動物使用およびバイオセイフティー委員会の認可後に開始した。順化後、ブタを、ＭＡＲＣ－１４５細胞上で増殖させた（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， １９９３）、ＰＲＲＳＶ分離株、ＮＶＳＬ９７－７８９５（Ｌａｄｉｎｉｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）に曝露させた。ブタをおよそ１０５ ＴＣＩＤ５０のウイルスに曝露させた。接種材料の２分の１を筋肉内に送達させ、残りを鼻腔内に送達させた。感染ブタを全て単一群として維持し、これにより、同じおりの感染した個体からのウイルスの連続曝露が可能になった。血液試料を、感染後３５日までの様々な日および終了、第３５日に収集した。ブタを剖検し、組織を１０％緩衝ホルマリン中で固定し、パラフィンに包埋し、病理組織診断のために処理した。感染過程中に記録したＰＲＲＳＶ関連臨床徴候は、呼吸促迫、食欲不振、嗜眠および発熱を含んだ。研究期間にわたる臨床徴候についての結果を図９にまとめて示す。予想通りに、野生型Ｗｉｌｄ Ｔｙｐｅ（ＣＤ１６３＋／＋）ブタは、ＰＲＲＳＶ感染の初期徴候を示し、これは、第５日と第１４日の間でピークとなり、研究の残りの間、群内で存続した。発熱ブタのパーセンテージは約第１０日にピークとなった。対照的に、ヌル（ＣＤ１６３－／－）子ブタは全研究期間にわたって臨床徴候のエビデンスを示さなかった。急性ＰＲＲＳＶ感染中の呼吸徴候は肺における著しい病理組織学的な変化において反映される（表９）。野生型ブタの感染は、ＰＲＲＳと一致する病理組織診断を示し、単核細胞の浸潤を有する間質性浮腫が挙げられる（図１０）。対照的に、ヌル（ＣＤ１６３－／－）ブタでは、肺変化についてのエビデンスはなかった。様々な遺伝子型についての試料サイズは小さく；それにもかかわらず、平均スコアは、野生型では３．８５（ｎ＝７）、特徴づけられていないＡでは１．７５（ｎ＝４）、特徴づけられていないＢでは１．３３（ｎ＝３）、ヌル（ＣＤ１６３－／－）では０（ｎ＝３）であった。
【表13】
【0364】
ピーク臨床徴候は血液中のＰＲＲＳＶのレベルと相関した。ウイルス核酸の測定を、血清からの全ＲＮＡの単離、続いて市販の逆転写酵素リアルタイムＰＲＲＳＶ ＰＣＲ試験（Ｔｅｔｒａｃｏｒｅ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）を使用することによるＰＲＲＳＶ ＲＮＡの増幅により実施した。検量線をＲＴ－ＰＣＲキットにおいて供給されるＰＲＲＳＶ ＲＮＡ対照の段階希釈を調製することにより作製し、結果をテンプレート数／５０μｌＰＣＲ反応として標準化した。ＰＲＲＳＶ分離株は野生型ＣＤ１６３＋／＋ブタにおいて、ＰＲＲＳＶウイルス血症についての過程に従った（図１１）。ウイルス血症は第４日に明らかになり、第１１日にピークに達し、研究の終わりまで減少した。対照的にウイルスＲＮＡはＣＤ１６３－／－ブタにおいて、研究期間中のどの時点でも検出されなかった。ウイルス血症と一致して、ヌルおよび特徴づけられていないアレルブタによる抗体産生は１４まで検出可能であり、第２８日まで増加した。ヌル動物においては、抗体産生はなかった（図１２）。総合して、これらのデータにより、野生型ブタはＰＲＲＳＶ複製をサポートし、ＰＲＲＳと一致する臨床徴候が生成したことが示される。対照的に、ノックアウトブタは、たとえ、ブタが接種され、同じおりの感染した個体に絶えず曝露されても、ウイルス血症および臨床徴候を生成しなかった。
【0365】
研究の終わりに、ブタ肺胞マクロファージを肺洗浄により除去し、前に記載されるように、ＳＩＧＬＥＣ１（ＣＤ１６９、クローン３Ｂ１１／１１）およびＣＤ１６３（クローン２Ａ１０／１１）の表面発現のために染色した（Ｐｒａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）。相対的に高いレベルのＣＤ１６３発現がＣＤ１６３＋／＋野生型動物上で検出された（図１３）。対照的に、ＣＤ１６３－／－ブタは、バックグラウンドレベルの抗ＣＤ１６３染色を示したにすぎず、よって、ノックアウト表現型が確認された。別のマクロファージマーカーＣＤ１６９についての発現レベルは野生型およびノックアウトブタの両方について同様であった（図１４）。他のマクロファージ表面マーカー、例えば、ＭＨＣＩＩおよびＣＤ１７２は両方の遺伝子型について同じであった（データ示さず）。
【0366】
試料サイズは小さかったが、他の３つの遺伝子型のブタ（特徴づけられていないＡ １．３２ｋｇ±０．１７、ｎ＝４；特徴づけられていないＢ １．２０ｋｇ±０．１６、ｎ＝３；ヌル１．２１ｋｇ±０．１６、ｎ＝３）に対して、野生型ブタは実験の過程にわたって体重が増えにくい傾向にあった（１日当たりの平均体重増加０．８１ｋｇ±０．３３、ｎ＝７）。
【0367】
第２の試行では６匹の野生型、６匹のΔ４３アミノ酸、および６匹の、特徴づけられていないアレル（Ｂ）を有するブタを、ＫＳ０６－７２１０９を使用して、子ブタに接種することを除き、以上で記載される通りに曝露させた。ＮＶＳＬデータと同様、野生型および特徴づけられていないＢ子ブタはウイルス血症を発症した。しかしながら、Δ４３アミノ酸ブタでは、ＫＳ０６では、ウイルス血症という結果にならなかった（図１５；表７）。
【0368】
意味と結論
ブタ産業に最も臨床的に関連する疾患はＰＲＲＳである。ワクチン接種プログラムがほとんどのブタ病原体を防止または寛解するのに成功しているが、ＰＲＲＳＶはより挑戦的であることがわかっている。ここでは、ＣＤ１６３がこのウイルス株に対する侵入メディエーターとして同定されている。ファウンダー雄豚がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の接合体への注入により作製され（Ｗｈｉｔｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）、よって、導入遺伝子はない。加えて、雌ブタ（これもＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いることにより作製）由来のアレルの１つは導入遺伝子を含まない。よって、子ブタ＃４０は１つのアレルにおいて７ｂｐ付加および他のアレルにおいて１１ｂｐ欠失を保有するが、導入遺伝子を保有しない。ＣＤ１６３のこれらのウイルス抵抗性アレルは、ブタゲノムは約２８億ｂｐ（Ｇｒｏｅｎｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１２）であることを考えると小さなゲノム編集を表す。同様に作製された動物が、食物供給に導入されると、著しい経済的損失が防止できるであろう。
ブタ産業に最も臨床的に関連する疾患はＰＲＲＳである。ワクチン接種プログラムがほとんどのブタ病原体を防止または寛解するのに成功しているが、ＰＲＲＳＶはより挑戦的であることがわかっている。ここでは、ＣＤ１６３がこのウイルス株に対する侵入メディエーターとして同定されている。ファウンダー雄豚がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の接合体への注入により作製され（Ｗｈｉｔｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）、よって、導入遺伝子はない。加えて、雌ブタ（これもＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いることにより作製）由来のアレルの１つは導入遺伝子を含まない。よって、子ブタ＃４０は１つのアレルにおいて７ｂｐ付加および他のアレルにおいて１１ｂｐ欠失を保有するが、導入遺伝子を保有しない。ＣＤ１６３のこれらのウイルス抵抗性アレルは、ブタゲノムは約２８億ｂｐ（Ｇｒｏｅｎｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１２）であることを考えると小さなゲノム編集を表す。同様に作製された動物が、食物供給に導入されると、著しい経済的損失が防止できるであろう。
【0369】
実施例３：ヒトＣＤ１６３様相同性ＳＲＣＲドメイン８と置き換えられたＣＤ１６３ ＳＲＣＲドメイン５を有するブタにおける遺伝子型１ブタ繁殖・ＰＲＲＳウイルスに対する増加した抵抗性
ＣＤ１６３はブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に対する主要受容体であると考えられる。この研究では、ブタを下記遺伝子型の１つを有するように遺伝子改変（ＧＭ）した：ＣＤ１６３の完全ノックアウト（ＫＯ）、ＣＤ１６３スカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）ドメイン５内欠失、またはＳＲＣＲドメイン５の、ヒトＣＤ１６３様（ｈＣＤ１６３Ｌ１）ＳＲＣＲ８ドメインのホモログをコードする合成エクソンによる置き換え（ドメインスワップ）。ブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）の免疫表現型検査により、ＫＯまたはＳＲＣＲドメイン５欠失を有するブタはＣＤ１６３を発現せず、ＰＡＭはＰＲＲＳＶ感染をサポートしなかったことが示された。ｈＣＤ１６３Ｌ１ドメイン８ホモログを有するブタ由来のＰＡＭはＣＤ１６３を発現し、２型の複製をサポートしたが、１型遺伝子型ウイルスをサポートしなかった。代表的な１型および２型ウイルスによるＣＤ１６３改変ブタの感染でも同様の結果が得られた。１型および２型ウイルスは、受容体としてのＣＤ１６３を必要とすることを含み、いくつかのレベルでは、遺伝学的におよび表現型的に同様であると考えられるとしても、結果から、ＣＤ１６３分子の認識においてＰＲＲＳＶ遺伝子型の間には明確な差があることが示される。
ＣＤ１６３はブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に対する主要受容体であると考えられる。この研究では、ブタを下記遺伝子型の１つを有するように遺伝子改変（ＧＭ）した：ＣＤ１６３の完全ノックアウト（ＫＯ）、ＣＤ１６３スカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）ドメイン５内欠失、またはＳＲＣＲドメイン５の、ヒトＣＤ１６３様（ｈＣＤ１６３Ｌ１）ＳＲＣＲ８ドメインのホモログをコードする合成エクソンによる置き換え（ドメインスワップ）。ブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）の免疫表現型検査により、ＫＯまたはＳＲＣＲドメイン５欠失を有するブタはＣＤ１６３を発現せず、ＰＡＭはＰＲＲＳＶ感染をサポートしなかったことが示された。ｈＣＤ１６３Ｌ１ドメイン８ホモログを有するブタ由来のＰＡＭはＣＤ１６３を発現し、２型の複製をサポートしたが、１型遺伝子型ウイルスをサポートしなかった。代表的な１型および２型ウイルスによるＣＤ１６３改変ブタの感染でも同様の結果が得られた。１型および２型ウイルスは、受容体としてのＣＤ１６３を必要とすることを含み、いくつかのレベルでは、遺伝学的におよび表現型的に同様であると考えられるとしても、結果から、ＣＤ１６３分子の認識においてＰＲＲＳＶ遺伝子型の間には明確な差があることが示される。
【0370】
材料および方法
ブタＣＤ１６３遺伝子のゲノム改変
動物およびウイルスが関与する実験を、動物科学協会連盟 研究および教育における農業動物のケアと使用のためのガイド（Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｅａｃｈｉｎｇ）、ＵＳＤＡ動物福祉法および動物福祉規則にしたがい実施し、Ｋａｎｓａｓ Ｓｔａｔｅ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙおよびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｓｓｏｕｒｉ施設内実験動物委員会および施設内バイオセイフティー委員会の認可を受けた。この研究で使用されるＣＤ１６３における突然変異を、前の実施例において上記で記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を用いて作製した。突然変異を、図１７に図示する。図１７に示される、図示されたゲノム領域は、ブタＣＤ１６３遺伝子のイントロン６からイントロン８の配列に及ぶ。図１７に図示されるイントロンおよびエクソンは縮尺通りに描かれていない。予測されるタンパク質生成物は、各ゲノム構造の右に示される。ＰＡＭ上の表面ＣＤ１６３のレベルにより測定される相対マクロファージ発現は、図１７の右端に示される。黒色領域はイントロンを示し（ｉｎｄｉｃｔ）；白色領域は、エクソンを示し；斜線領域は、ｈＣＤ１６３Ｌ１エクソン１１模倣物、ブタエクソン７のホモログを示し；灰色領域は、図１７に示されるようにＰＧＫ Ｎｅｏコンストラクトを有する合成イントロンを示す。
ブタＣＤ１６３遺伝子のゲノム改変
動物およびウイルスが関与する実験を、動物科学協会連盟 研究および教育における農業動物のケアと使用のためのガイド（Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｅａｃｈｉｎｇ）、ＵＳＤＡ動物福祉法および動物福祉規則にしたがい実施し、Ｋａｎｓａｓ Ｓｔａｔｅ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙおよびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｓｓｏｕｒｉ施設内実験動物委員会および施設内バイオセイフティー委員会の認可を受けた。この研究で使用されるＣＤ１６３における突然変異を、前の実施例において上記で記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を用いて作製した。突然変異を、図１７に図示する。図１７に示される、図示されたゲノム領域は、ブタＣＤ１６３遺伝子のイントロン６からイントロン８の配列に及ぶ。図１７に図示されるイントロンおよびエクソンは縮尺通りに描かれていない。予測されるタンパク質生成物は、各ゲノム構造の右に示される。ＰＡＭ上の表面ＣＤ１６３のレベルにより測定される相対マクロファージ発現は、図１７の右端に示される。黒色領域はイントロンを示し（ｉｎｄｉｃｔ）；白色領域は、エクソンを示し；斜線領域は、ｈＣＤ１６３Ｌ１エクソン１１模倣物、ブタエクソン７のホモログを示し；灰色領域は、図１７に示されるようにＰＧＫ Ｎｅｏコンストラクトを有する合成イントロンを示す。
【0371】
図１７に示されるＣＤ１６３遺伝子コンストラクトＫＯ－ｄ７（１１）は、エクソン７においてヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対欠失を有する。ＣＤ１６３遺伝子コンストラクトＫＯ－ｉ７（２）は、エクソン７においてヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の２塩基対挿入、ならびにエクソン７の上流のイントロンにおいて、ヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対欠失を有する。これらの編集はフレームシフト突然変異および未成熟終止コドンを引き起こすと予測され、ＳＲＣＲ５の部分翻訳のみおよびＫＯ表現型という結果となる。３つの他の突然変異は、エクソン７における欠失を生成させた。まず、ｄ７（１２９）はエクソン７において、ヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までの１２９塩基対欠失を有する。ｄ７（１２９）コンストラクトはまた、エクソン６においてヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの欠失を有し、ここで欠失配列は、１２ｂｐ挿入で置き換えられる。他の２つの欠失コンストラクト、ｄ７（１４６７）およびｄ７（１２８０）は、図１７で示されるようにエクソン７および８の完全欠失を有する。ｄ７（１４６７）は、ヌクレオチド２，４３１からヌクレオチド３，８９７までの１４６７塩基対欠失を有し、ｄ７（１２８０）は、ヌクレオチド２，８１８からヌクレオチド４，０９７までの１２８０塩基対欠失を有する。これらの欠失コンストラクトでは、他のＣＤ１６３エクソンは無傷のままであった。
【0372】
図１７に示される最後のコンストラクト、ＨＬ１１ｍを、エクソン７を欠失させ、これを、ヒトＣＤ１６３様１タンパク質のＳＲＣＲ８のホモログをコードする合成エクソンで置き換えるターゲティングイベントを用いて生成させた（ｈＣＤ１６３Ｌ１ドメイン８はｈＣＤ１６３Ｌ１エクソン１１によりコードされる）。ＳＲＣＲ８ペプチド配列を、ブタエクソン７配列において３３ヌクレオチドを変化させることにより作製した。ネオマイシンカセットを、改変のためのスクリーニングを可能にするために合成エクソンに含めた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８は参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７における同じ領域に対応する領域においてＨＬ１１ｍコンストラクトのためのヌクレオチド配列を提供する。
【0373】
ブタＣＤ１６３タンパク質および遺伝子の図が図１８に提供される。ＣＤ１６３タンパク質ＳＣＲＣ（楕円）およびＰＳＴ（四角）ドメインが対応する遺伝子エクソンと共に、図１８のパネルＡで示される。ブタＣＤ１６３ ＳＲＣＲ５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２０）およびヒトＣＤ１６３ ＳＲＣＲ８ホモログ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１）についてのペプチド配列比較が図１８のパネルＢで示される。図はＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＪ３１１７１６（ブタＣＤ１６３）およびＧＱ３９７４８２（ｈＣＤ１６３－Ｌ１）に基づく。
【0374】
ウイルス
この実施例において使用されるウイルスのパネルが表１４に列挙される。分離株をＭＡＲＣ－１４５細胞上で増殖させ、滴定した（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， １９９３）。滴定のために、各ウイルスを、７％ＦＢＳ、Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ（それぞれ、８０単位／ｍｌおよび８０μｇ／ｍｌ）、３μｇ／ｍｌ ＦＵＮＧＩＺＯＮＥ（アンホテリシンＢ）、および２５ｍＭ ＨＥＰＥＳが補充されたＭＥＭ中にて、１：１０で段階希釈した。希釈試料を４連で、９６ウェルプレートにおいてコンフルエントＭＡＲＣ－１４５細胞に、２００μｌ／ウェルの最終体積まで添加し、４日間３７℃で５％ＣＯ２においてインキュベートした。滴定終点を細胞変性効果（ＣＰＥ）を有する最後のウェルとして同定した。５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）を前に記載される方法を使用して計算した（Ｒｅｅｄ ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈ １９３８）。
＊ＮＡ、入手不可能
この実施例において使用されるウイルスのパネルが表１４に列挙される。分離株をＭＡＲＣ－１４５細胞上で増殖させ、滴定した（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， １９９３）。滴定のために、各ウイルスを、７％ＦＢＳ、Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ（それぞれ、８０単位／ｍｌおよび８０μｇ／ｍｌ）、３μｇ／ｍｌ ＦＵＮＧＩＺＯＮＥ（アンホテリシンＢ）、および２５ｍＭ ＨＥＰＥＳが補充されたＭＥＭ中にて、１：１０で段階希釈した。希釈試料を４連で、９６ウェルプレートにおいてコンフルエントＭＡＲＣ－１４５細胞に、２００μｌ／ウェルの最終体積まで添加し、４日間３７℃で５％ＣＯ２においてインキュベートした。滴定終点を細胞変性効果（ＣＰＥ）を有する最後のウェルとして同定した。５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）を前に記載される方法を使用して計算した（Ｒｅｅｄ ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈ １９３８）。
【表14】
【0375】
肺胞マクロファージの感染
マクロファージの調製および感染を前に記載されるように実施した（Ｇａｕｄｒｅａｕｌｔ， ｅｔ ａｌ．， ２００９ ａｎｄ Ｐａｔｔｏｎ， ｅｔ ａｌ．， ２００８）。肺を安楽死させたブタから取り出し、１００ｍｌの冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を気管中に注ぎ込むことにより洗浄した。気管をクランプし、肺を穏やかにマッサージした。肺胞内容物を５０ｍｌ遠心管に注ぎ入れ、氷上で保存した。ブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）を１２００×ｇでの１０分間、４℃での遠心分離により沈降させた。ペレットを冷滅菌ＰＢＳ中に再懸濁させ、１回洗浄した。細胞ペレットを、４５％ＲＰＭＩ１６４０、４５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、および１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む凍結培地中に再懸濁させ、液体窒素中で使用まで保存した。凍結細胞を氷上で解凍させ、カウントし、培地（１０％ＦＢＳ、ＰｅｎＳｔｒｅｐ、およびＦＵＮＧＩＺＯＮＥが補充されたＲＰＭＩ１６４０；ＲＰＭＩ－ＦＢＳ）中５×１０５細胞／ｍｌに調整した。およそ１０３ＰＡＭ／ウェルを、９６ウェルプレートに添加し、一晩、３７℃で５％ＣＯ２においてインキュベートした。細胞を優しく洗浄し、非付着細胞を除去した。ウイルスの１：１０段階希釈物を、３連ウェルに添加した。一晩のインキュベーション後、細胞を、ＰＢＳで洗浄し、１０分間８０％アセトンで固定した。乾燥後、ウェルを、１％魚ゼラチンを含むＰＢＳ（ＰＢＳ－ＦＧ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）中１：１０００で希釈したＰＲＲＳＶ Ｎ－タンパク質特異的ＳＤＯＷ－１７ｍＡｂ（Ｒｕｒａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）で染色した。３７℃での３０分のインキュベーション後、細胞を、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ－ＦＧ中１：２００で希釈したＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ４８８標識抗マウスＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色した。プレート３０分間、暗闇で３７℃にてインキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、蛍光顕微鏡下で観察した。５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）／ｍｌを前に記載される方法に従い計算した（Ｒｅｅｄ ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈ １９３８）。
マクロファージの調製および感染を前に記載されるように実施した（Ｇａｕｄｒｅａｕｌｔ， ｅｔ ａｌ．， ２００９ ａｎｄ Ｐａｔｔｏｎ， ｅｔ ａｌ．， ２００８）。肺を安楽死させたブタから取り出し、１００ｍｌの冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を気管中に注ぎ込むことにより洗浄した。気管をクランプし、肺を穏やかにマッサージした。肺胞内容物を５０ｍｌ遠心管に注ぎ入れ、氷上で保存した。ブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）を１２００×ｇでの１０分間、４℃での遠心分離により沈降させた。ペレットを冷滅菌ＰＢＳ中に再懸濁させ、１回洗浄した。細胞ペレットを、４５％ＲＰＭＩ１６４０、４５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、および１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む凍結培地中に再懸濁させ、液体窒素中で使用まで保存した。凍結細胞を氷上で解凍させ、カウントし、培地（１０％ＦＢＳ、ＰｅｎＳｔｒｅｐ、およびＦＵＮＧＩＺＯＮＥが補充されたＲＰＭＩ１６４０；ＲＰＭＩ－ＦＢＳ）中５×１０５細胞／ｍｌに調整した。およそ１０３ＰＡＭ／ウェルを、９６ウェルプレートに添加し、一晩、３７℃で５％ＣＯ２においてインキュベートした。細胞を優しく洗浄し、非付着細胞を除去した。ウイルスの１：１０段階希釈物を、３連ウェルに添加した。一晩のインキュベーション後、細胞を、ＰＢＳで洗浄し、１０分間８０％アセトンで固定した。乾燥後、ウェルを、１％魚ゼラチンを含むＰＢＳ（ＰＢＳ－ＦＧ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）中１：１０００で希釈したＰＲＲＳＶ Ｎ－タンパク質特異的ＳＤＯＷ－１７ｍＡｂ（Ｒｕｒａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）で染色した。３７℃での３０分のインキュベーション後、細胞を、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ－ＦＧ中１：２００で希釈したＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ４８８標識抗マウスＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色した。プレート３０分間、暗闇で３７℃にてインキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、蛍光顕微鏡下で観察した。５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）／ｍｌを前に記載される方法に従い計算した（Ｒｅｅｄ ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈ １９３８）。
【0376】
ＰＡＭ上のＣＤ１６９およびＣＤ１６３表面発現の測定
ＣＤ１６９およびＣＤ１６３の表面発現のための染色を前に記載されるように実施した（Ｐｒａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）。およそ１×１０６のＰＡＭを１２ｍｍ×７５ｍｍポリスチレンフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）管にいれ、Ｆｃ受容体をブロックするために１０％正常マウス血清を有する、１ｍｌのＰＢＳ中で、１５分間室温で、インキュベートした。細胞を遠心分離によりペレット化し、５μｌのＦＩＴＣコンジュゲートマウス抗ブタＣＤ１６９ｍＡｂ（クローン３Ｂ１１／１１；ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）および５μｌのＰＥコンジュゲートマウス抗ブタＣＤ１６３ｍＡｂ（クローン：２Ａ１０／１１、ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）中に再懸濁させた。３０分のインキュベーション後、細胞を２回、１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳで洗浄し（ＢＳＡ Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ；Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ５ソフトウェア（Ｄｅ Ｎｏｖｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いてすぐに分析した。各試料について、最低１０，０００の細胞を分析した。
ＣＤ１６９およびＣＤ１６３の表面発現のための染色を前に記載されるように実施した（Ｐｒａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）。およそ１×１０６のＰＡＭを１２ｍｍ×７５ｍｍポリスチレンフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）管にいれ、Ｆｃ受容体をブロックするために１０％正常マウス血清を有する、１ｍｌのＰＢＳ中で、１５分間室温で、インキュベートした。細胞を遠心分離によりペレット化し、５μｌのＦＩＴＣコンジュゲートマウス抗ブタＣＤ１６９ｍＡｂ（クローン３Ｂ１１／１１；ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）および５μｌのＰＥコンジュゲートマウス抗ブタＣＤ１６３ｍＡｂ（クローン：２Ａ１０／１１、ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）中に再懸濁させた。３０分のインキュベーション後、細胞を２回、１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳで洗浄し（ＢＳＡ Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ；Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ５ソフトウェア（Ｄｅ Ｎｏｖｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いてすぐに分析した。各試料について、最低１０，０００の細胞を分析した。
【0377】
ＰＲＲＳウイルス血症の測定
ＲＮＡを５０μｌの血清から、Ａｍｂｉｏｎ ＭａｇＭＡＸ９６ウイルス単離キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、製造者の指示に従い単離した。ＰＲＲＳＶ ＲＮＡを、製造者の指示に従い実施される、ＥＺ－ＰＲＲＳＶ ＭＰＸ４．０Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ標的特異的試薬（Ｔｅｔｒａｃｏｒｅ）を用いて定量した。各プレートはＲＴ－ＰＣＲ試薬と共に使用するために設計されＴｅｔｒａｃｏｒｅ定量化標準および対照セットを含んだ。ＰＣＲをＣＦＸ９６Ｔｏｕｃｈ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上で、９６ウェルフォーマットで、推奨されるサイクリングパラメータを使用して実施した。ＰＣＲアッセイ結果を、ｌｏｇ１０ＰＲＲＳＶ ＲＮＡコピー数／５０μｌ反応体積として報告し、これは、コピー数／ｍｌの血清に近似する。時間に伴うウイルス血症のための曲線下面積（ＡＵＣ）をＷｉｎｄｏｗｓ用のＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン６．００を使用して計算した。
ＲＮＡを５０μｌの血清から、Ａｍｂｉｏｎ ＭａｇＭＡＸ９６ウイルス単離キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、製造者の指示に従い単離した。ＰＲＲＳＶ ＲＮＡを、製造者の指示に従い実施される、ＥＺ－ＰＲＲＳＶ ＭＰＸ４．０Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ標的特異的試薬（Ｔｅｔｒａｃｏｒｅ）を用いて定量した。各プレートはＲＴ－ＰＣＲ試薬と共に使用するために設計されＴｅｔｒａｃｏｒｅ定量化標準および対照セットを含んだ。ＰＣＲをＣＦＸ９６Ｔｏｕｃｈ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上で、９６ウェルフォーマットで、推奨されるサイクリングパラメータを使用して実施した。ＰＣＲアッセイ結果を、ｌｏｇ１０ＰＲＲＳＶ ＲＮＡコピー数／５０μｌ反応体積として報告し、これは、コピー数／ｍｌの血清に近似する。時間に伴うウイルス血症のための曲線下面積（ＡＵＣ）をＷｉｎｄｏｗｓ用のＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン６．００を使用して計算した。
【0378】
ＰＲＲＳＶ抗体の測定
ＰＲＲＳＶヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質に対する抗体の検出のためのミクロスフェア蛍光イムノアッセイ（ＦＭＩＡ）を前に記載されるように実施した（Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）。組換えＰＲＲＳＶ Ｎタンパク質をカルボキシル化Ｌｕｍｉｎｅｘ ＭＡＧＰＬＥＸポリスチレンミクロスフェアビーズに、製造者の指示に従い結合させた。ＦＭＩＡでは、１０％ヤギ血清を有する５０μＬ ＰＢＳ（ＰＢＳ－ＧＳ）中に懸濁させたおよそ２５００の抗原コートビーズを９６ウェルポリスチレン丸底プレートの各ウェルに入れた。血清をＰＢＳ－ＧＳ中１：４００で希釈し、５０μｌを各ウェルに添加した。プレートを箔で包み、３０分間、室温で穏やかに振盪させながらインキュベートした。プレートを磁石上に起き、ビーズを３回、１９０μｌのＰＢＳ－ＧＳで洗浄した。ＩｇＧの検出のために、５０μｌのビオチン－ＳＰコンジュゲートアフィニティ精製ヤギ抗ブタ二次抗体（ＩｇＧ、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）をＰＢＳ－ＧＳ中２μｇ／ｍｌまで希釈し、１００μｌを各ウェルに添加した。プレートを室温で３０分間インキュベートし、３回洗浄し、続いて、５０μｌのストレプトアビジンコンジュゲートフィコエリトリン（ＰＢＳ－ＧＳ中２μｇ／ｍｌ；ＳＡＰＥ）を添加した。３０分後、ミクロスフェアを洗浄し、１００μｌのＰＢＳ－ＧＳ中に再懸濁させ、ＭＡＧＰＩＸ機器（ＬＵＭＩＮＥＸ）およびＬＵＭＩＮＥＸ ｘＰＯＮＥＮＴ４．２ソフトウェアを用いて分析した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を最低１００のミクロスフェアビーズで計算した。
ＰＲＲＳＶヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質に対する抗体の検出のためのミクロスフェア蛍光イムノアッセイ（ＦＭＩＡ）を前に記載されるように実施した（Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）。組換えＰＲＲＳＶ Ｎタンパク質をカルボキシル化Ｌｕｍｉｎｅｘ ＭＡＧＰＬＥＸポリスチレンミクロスフェアビーズに、製造者の指示に従い結合させた。ＦＭＩＡでは、１０％ヤギ血清を有する５０μＬ ＰＢＳ（ＰＢＳ－ＧＳ）中に懸濁させたおよそ２５００の抗原コートビーズを９６ウェルポリスチレン丸底プレートの各ウェルに入れた。血清をＰＢＳ－ＧＳ中１：４００で希釈し、５０μｌを各ウェルに添加した。プレートを箔で包み、３０分間、室温で穏やかに振盪させながらインキュベートした。プレートを磁石上に起き、ビーズを３回、１９０μｌのＰＢＳ－ＧＳで洗浄した。ＩｇＧの検出のために、５０μｌのビオチン－ＳＰコンジュゲートアフィニティ精製ヤギ抗ブタ二次抗体（ＩｇＧ、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）をＰＢＳ－ＧＳ中２μｇ／ｍｌまで希釈し、１００μｌを各ウェルに添加した。プレートを室温で３０分間インキュベートし、３回洗浄し、続いて、５０μｌのストレプトアビジンコンジュゲートフィコエリトリン（ＰＢＳ－ＧＳ中２μｇ／ｍｌ；ＳＡＰＥ）を添加した。３０分後、ミクロスフェアを洗浄し、１００μｌのＰＢＳ－ＧＳ中に再懸濁させ、ＭＡＧＰＩＸ機器（ＬＵＭＩＮＥＸ）およびＬＵＭＩＮＥＸ ｘＰＯＮＥＮＴ４．２ソフトウェアを用いて分析した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を最低１００のミクロスフェアビーズで計算した。
【0379】
ハプトグロビン（ＨＰ）の測定
血清中のＨｐの量をブタ特異的Ｈｐ ＥＬＩＳＡキット（Ｇｅｎｗａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）を用いて測定し、工程は製造者の指示に従い実施した。血清試料を、１Ｘ希釈剤溶液中１：１０，０００で希釈し、プレコート抗ブタＨｐ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート上２連でピペット操作し、室温で１５分間インキュベートし、その後、３回洗浄した。抗Ｈｐ－ＨＲＰコンジュゲートを各ウェルに添加し、暗闇で室温にて１５分間インキュベートした。プレートを洗浄し、１００μｌ発色基質溶液を各ウェルに添加した。暗闇で１０分間インキュベートした後、１００μｌの停止液を各ウェルに添加した。プレートを、Ｆｌｕｏｓｔａｒ Ｏｍｅｇａフィルターベースマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）上で４５０ｎｍにて読み取った。
血清中のＨｐの量をブタ特異的Ｈｐ ＥＬＩＳＡキット（Ｇｅｎｗａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）を用いて測定し、工程は製造者の指示に従い実施した。血清試料を、１Ｘ希釈剤溶液中１：１０，０００で希釈し、プレコート抗ブタＨｐ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート上２連でピペット操作し、室温で１５分間インキュベートし、その後、３回洗浄した。抗Ｈｐ－ＨＲＰコンジュゲートを各ウェルに添加し、暗闇で室温にて１５分間インキュベートした。プレートを洗浄し、１００μｌ発色基質溶液を各ウェルに添加した。暗闇で１０分間インキュベートした後、１００μｌの停止液を各ウェルに添加した。プレートを、Ｆｌｕｏｓｔａｒ Ｏｍｅｇａフィルターベースマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）上で４５０ｎｍにて読み取った。
【0380】
結果
ＣＤ１６３遺伝子－改変ブタ由来のＰＡＭの表現型特性
肺洗浄材料における細胞の前方および側方散乱光特性を使用して、細胞の単核亜集団についてゲートした。図１７に示される異なる遺伝子改変についての代表的なＣＤ１６９およびＣＤ１６３染色結果が図１９で提示される。図１９のパネルＡで提示される代表例では、ＷＴブタ由来の９１％超のＰＡＭが、ＣＤ１６９およびＣＤ１６３の両方に対して陽性であった。この研究で使用された１２匹のＷＴブタに対する結果は、平均８５＋／－８％の二重陽性細胞を示した。図１９のパネルＢに示されるように、ＣＤ１６３ ＫＯブタ由来のＰＡＭはＣＤ１６３のエビデンスを示さなかったが、正常表面レベルのＣＤ１６９を保持した。ｄ７（１４６７）およびｄ７（１２８０）欠失遺伝子型に由来するＣＤ１６３ポリペプチドはＰＡＭ表面に固定された改変ＣＤ１６３ポリペプチドを生成させることが予測されたが、免疫染色結果は、ＣＤ１６３の表面発現を示さなかった（図１９、パネルＤを参照されたい）。Ｍａｂ ２Ａ１０は、最初の３つのＳＲＣＲドメイン中に位置するエピトープを認識するので、検出なしは、免疫反応性エピトープの欠失の結果ではなかった。ｄ７（１２９）遺伝子型は、ＳＲＣＲ５において４３アミノ酸欠失を有すると予測された（図１７を参照されたい）。図１９のパネルＣにおいて提示される実施例では、２．４％の細胞のみが二重陽性象限に含まれた。この研究で使用された９匹のｄ７（１２９）ブタ由来のＰＡＭの分析は、０％～３．６％（平均＝０．９％）の範囲の二重陽性細胞のパーセンテージを示した。ＣＤ１６９の表面発現は、ＷＴ ＰＡＭと同様のままであった。この研究の目的のために、ＫＯ、ｄ７（１４６７）、ｄ７（１２８０）、およびｄ７（１２９）遺伝子型を有するブタを全て、ＣＤ１６３－ヌル表現型を有するとして分類した。
ＣＤ１６３遺伝子－改変ブタ由来のＰＡＭの表現型特性
肺洗浄材料における細胞の前方および側方散乱光特性を使用して、細胞の単核亜集団についてゲートした。図１７に示される異なる遺伝子改変についての代表的なＣＤ１６９およびＣＤ１６３染色結果が図１９で提示される。図１９のパネルＡで提示される代表例では、ＷＴブタ由来の９１％超のＰＡＭが、ＣＤ１６９およびＣＤ１６３の両方に対して陽性であった。この研究で使用された１２匹のＷＴブタに対する結果は、平均８５＋／－８％の二重陽性細胞を示した。図１９のパネルＢに示されるように、ＣＤ１６３ ＫＯブタ由来のＰＡＭはＣＤ１６３のエビデンスを示さなかったが、正常表面レベルのＣＤ１６９を保持した。ｄ７（１４６７）およびｄ７（１２８０）欠失遺伝子型に由来するＣＤ１６３ポリペプチドはＰＡＭ表面に固定された改変ＣＤ１６３ポリペプチドを生成させることが予測されたが、免疫染色結果は、ＣＤ１６３の表面発現を示さなかった（図１９、パネルＤを参照されたい）。Ｍａｂ ２Ａ１０は、最初の３つのＳＲＣＲドメイン中に位置するエピトープを認識するので、検出なしは、免疫反応性エピトープの欠失の結果ではなかった。ｄ７（１２９）遺伝子型は、ＳＲＣＲ５において４３アミノ酸欠失を有すると予測された（図１７を参照されたい）。図１９のパネルＣにおいて提示される実施例では、２．４％の細胞のみが二重陽性象限に含まれた。この研究で使用された９匹のｄ７（１２９）ブタ由来のＰＡＭの分析は、０％～３．６％（平均＝０．９％）の範囲の二重陽性細胞のパーセンテージを示した。ＣＤ１６９の表面発現は、ＷＴ ＰＡＭと同様のままであった。この研究の目的のために、ＫＯ、ｄ７（１４６７）、ｄ７（１２８０）、およびｄ７（１２９）遺伝子型を有するブタを全て、ＣＤ１６３－ヌル表現型を有するとして分類した。
【0381】
ｈＣＤ１６３Ｌ１ドメイン８ペプチド配列ＨＬ１１ｍを含むＣＤ１６３改変は、ＰＡＭ上でＣＤ１６３＋およびＣＤ１６９＋の二重発現を示した（図１９のパネルＥ）。しかしながら、この研究で分析したＨＬ１１ｍブタの全てにおいて、ＣＤ１６３の表面発現はＷＴ ＰＡＭと比べて著しく低減された。ＣＤ１６３のレベルは、連続する発現上に位置し、検出不能ＣＤ１６３から中レベルのＣＤ１６３を有するブタまでの範囲となった。図１９のパネルＥで示した例では、およそ６０％の細胞が二重陽性象限にあり、４０％の細胞は、ＣＤ１６９についてのみ染色された。合計２４匹のＨＬ１１ｍブタ由来のＰＡＭの分析により、３８＋／－１２％のＰＡＭ細胞は、ＣＤ１６９についてのみ陽性であり、５４＋／－１４％は二重陽性（ＣＤ１６９＋ＣＤ１６３＋）であったことが示された。
【0382】
ＷＴおよびＣＤ１６３－改変ブタにおける循環ハプトグロビンレベル
捕捉分子として、ＣＤ１６３は、ＨｂＨｐ複合体を血液から除去する責任がある（Ｆａｂｒｉｅｋ， ｅｔ ａｌ．， ２００５； Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００１；およびＭａｄｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。血清中のＨｐのレベルは、ＣＤ１６３発現マクロファージの全機能特性を決定するための好都合な方法を提供する。ＷＴ、ＨＬ１１ｍおよびＣＤ１６３－ヌルブタ由来の血清中のＨｐレベルを３～４週齢で、ＰＲＲＳＶの感染直前に測定した。図２０に提示される結果から、ＷＴブタ由来の血清は最低量のＨｂを有したことが示された（平均Ａ４５０＝２３＋／－０．１８、ｎ＝１０）。各群に対する平均および標準偏差はＷＴ、０．２３＋／－０．１８、ｎ＝１０；ＨＬ１１ｍ、１．６３＋／－０．８、ｎ＝１１；および２．０６＋／－０．５７、ｎ＝９、ヌル群であった。ヌル群は、ＣＤ１６３を発現しなかった遺伝子型から構成された（ＣＤ１６３ヌル表現型ブタ）。Ｈｐ測定を単一ＥＬＩＳＡプレート上で実施した。同じ文字を有する群では有意な差はなかった（ｐ＞０．０５、クラスカル・ワリス一元配置ＡＮＯＶＡ、かつ、ダネット事後検定）。ＷＴブタに対する平均Ａ４５０値はＨＬ１１ｍおよびＣＤ１６３－ヌルブタのものとは有意に異なった（ｐ＜０．０５）。平均Ａ４５０値はＨＬ１１ｍ群では、ＣＤ１６３ヌル群と比べて低かったが（Ａ４５０＝１．６＋／－０．８対２．１＋／－０．６）、差は統計的に有意ではなかった。ＨｂＨｐとＣＤ１６３の間の相互作用はＳＲＣＲ３を介して起こるので（Ｍａｄｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００４）、ＷＴブタと比べてＨＬ１１ｍブタでの増加した循環Ｈｐは、Ｈｂ／Ｈｐに対するＣＤ１６３の親和性の低減の結果である可能性は低いが、ＣＤ１６３＋マクロファージの数の低減、ならびに、残りのマクロファージ上のＣＤ１６３発現の低減という結果の帰結であった（図１９のパネルＥを参照されたい）。
捕捉分子として、ＣＤ１６３は、ＨｂＨｐ複合体を血液から除去する責任がある（Ｆａｂｒｉｅｋ， ｅｔ ａｌ．， ２００５； Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００１；およびＭａｄｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。血清中のＨｐのレベルは、ＣＤ１６３発現マクロファージの全機能特性を決定するための好都合な方法を提供する。ＷＴ、ＨＬ１１ｍおよびＣＤ１６３－ヌルブタ由来の血清中のＨｐレベルを３～４週齢で、ＰＲＲＳＶの感染直前に測定した。図２０に提示される結果から、ＷＴブタ由来の血清は最低量のＨｂを有したことが示された（平均Ａ４５０＝２３＋／－０．１８、ｎ＝１０）。各群に対する平均および標準偏差はＷＴ、０．２３＋／－０．１８、ｎ＝１０；ＨＬ１１ｍ、１．６３＋／－０．８、ｎ＝１１；および２．０６＋／－０．５７、ｎ＝９、ヌル群であった。ヌル群は、ＣＤ１６３を発現しなかった遺伝子型から構成された（ＣＤ１６３ヌル表現型ブタ）。Ｈｐ測定を単一ＥＬＩＳＡプレート上で実施した。同じ文字を有する群では有意な差はなかった（ｐ＞０．０５、クラスカル・ワリス一元配置ＡＮＯＶＡ、かつ、ダネット事後検定）。ＷＴブタに対する平均Ａ４５０値はＨＬ１１ｍおよびＣＤ１６３－ヌルブタのものとは有意に異なった（ｐ＜０．０５）。平均Ａ４５０値はＨＬ１１ｍ群では、ＣＤ１６３ヌル群と比べて低かったが（Ａ４５０＝１．６＋／－０．８対２．１＋／－０．６）、差は統計的に有意ではなかった。ＨｂＨｐとＣＤ１６３の間の相互作用はＳＲＣＲ３を介して起こるので（Ｍａｄｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００４）、ＷＴブタと比べてＨＬ１１ｍブタでの増加した循環Ｈｐは、Ｈｂ／Ｈｐに対するＣＤ１６３の親和性の低減の結果である可能性は低いが、ＣＤ１６３＋マクロファージの数の低減、ならびに、残りのマクロファージ上のＣＤ１６３発現の低減という結果の帰結であった（図１９のパネルＥを参照されたい）。
【0383】
１型および２型ウイルスによるＰＡＭの感染
ＰＲＲＳＶについてのＣＤ１６３改変ブタの寛容性を最初に、ＰＡＭ細胞をインビトロで６の１型および９の２型ＰＲＲＳＶ分離株の一団に感染させることにより評価した（ウイルスのリストについて表１４を参照されたい）。一団内のウイルスは異なる遺伝子型、ならびにヌクレオチドおよびペプチド配列、病態形成、および単離の年における違いを表す。表１５に提示されるデータは各ＣＤ１６３遺伝子型群について３匹のブタ由来のＰＡＭを使用する実験からの結果を示す。列挙されるウイルスは、表１４に列挙されるＰＲＲＳＶ分離株に対応する。結果は感染したＰＡＭのパーセントの平均＋／－標準偏差として示される。ＣＤ１６３ヌルＰＡＭは、ｄ７（１２９）アレルを発現するブタ由来とした（ＣＤ１６３遺伝子コンストラクトおよびＰＡＭ上でのＣＤ１６３発現については、それぞれ、図１７および１９を参照されたい）。
ＰＲＲＳＶについてのＣＤ１６３改変ブタの寛容性を最初に、ＰＡＭ細胞をインビトロで６の１型および９の２型ＰＲＲＳＶ分離株の一団に感染させることにより評価した（ウイルスのリストについて表１４を参照されたい）。一団内のウイルスは異なる遺伝子型、ならびにヌクレオチドおよびペプチド配列、病態形成、および単離の年における違いを表す。表１５に提示されるデータは各ＣＤ１６３遺伝子型群について３匹のブタ由来のＰＡＭを使用する実験からの結果を示す。列挙されるウイルスは、表１４に列挙されるＰＲＲＳＶ分離株に対応する。結果は感染したＰＡＭのパーセントの平均＋／－標準偏差として示される。ＣＤ１６３ヌルＰＡＭは、ｄ７（１２９）アレルを発現するブタ由来とした（ＣＤ１６３遺伝子コンストラクトおよびＰＡＭ上でのＣＤ１６３発現については、それぞれ、図１７および１９を参照されたい）。
【表15】
【0384】
予想通りに、ＷＴ ＰＡＭは全てのウイルスに感染した。対照的に、ＣＤ１６３ヌル表現型ブタは、全てのウイルスによる感染に対して陰性であった。ＨＬ１１ｍブタ由来のＰＡＭの応答において著しい違いを観察した。１型ウイルスはＨＬ１１ｍ ＰＡＭに感染することができなかったが；一方、２型の一団の全てのウイルスがＨＬ１１ｍ ＰＡＭに感染し、にもかかわらず、ＷＴ ＰＡＭと比べてずっと低いパーセンテージであった。
【0385】
寛容性もまた、同じ２型ウイルスについて、ＷＴとＨＬ１１ｍ ＰＡＭの間のウイルス滴定終点を比較することにより評価した。結果が２匹のＷＴおよび２匹のＨＬ１１ｍブタについて示される（図２１）。ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０値を、マクロファージ培養物の同じウイルス試料による感染に基づき計算した。感染結果は各遺伝子型由来の２匹の異なるブタを表す。感染のために使用したウイルスは、表１４に列挙される。ＨＬ１１ｍブタ由来のＰＡＭについてのｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０値は、同じウイルスに感染したＷＴ ＰＡＭと比べて１－３ｌｏｇ低かった。唯一の例外は改変－生ウイルスワクチン株の感染であった。まとめると、結果から、ＨＬ１１ｍブタ由来のＰＡＭは、２型ウイルスの感染に対し低減した感受性または寛容性を有することが示唆される。
【0386】
ＣＤ１６３改変ブタの１型および２型ウイルスによる感染
ＷＴ（丸）、ＨＬ１１ｍ（四角）、およびＣＤ１６３ヌル（三角）ブタを、代表的な１型（ＳＤ１３－１５）（図２２、パネルＡ、左グラフ）および２型（ＮＶＳＬ９７－７８９５）（図２２、パネルＡ、右グラフ）ウイルスにより感染させた。ヌル表現型ブタはＫＯおよびｄ（１５６７）アレル由来とした（図１７を参照されたい）。同じウイルスを接種された３つの遺伝子型由来のブタを１つのおり内で混じり合わせ、これにより、ＣＤ１６３改変ブタを、同じおりのＷＴ個体から排出されたウイルスへの連続曝露が可能になった。代表的な１型ウイルスに感染したブタの数は下記であり：ＷＴ（ｎ＝４）、ＨＬ１１ｍ（ｎ＝５）、およびヌル（ｎ＝３）；ならびに２型ウイルスでは下記となった：ＷＴ（ｎ＝４）、ＨＬ１１ｍ（ｎ＝４）、およびヌル（ｎ＝３）。図２２に示されるように、１型または２型ウイルスのいずれかに感染したＣＤ１６３ヌルブタは、全ての時間点でウイルス血症に対して陰性であり、抗体陽転しなかった。予想通りに、ＷＴブタは増殖性感染され、両方のウイルスについて感染後７日に１０６テンプレート／５０μｌＰＣＲ反応に到達する平均ウイルス血症レベルを有した。１４日までに、ＷＴブタは全て抗体陽転した（図２２、パネルＢを参照されたい）。ＰＡＭ感染結果と一致して（表１５）、１型ウイルスに感染した５匹のＨＬ１１ｍブタはウイルス血症またはＰＲＲＳＶ抗体のエビデンスを示さなかった。２型分離株、ＮＶＳＬに感染した全てのＨＬ１１ｍブタは、感染をサポートし、抗体陽転した（図２２、パネルＢ）。ＨＬ１１ｍブタの低減された寛容性の存在は不明確であった。４匹のＨＬ１１ｍブタのうちの３匹についての平均ウイルス血症はＷＴブタと同様であった。しかしながら、１匹のＨＬ１１ｍブタ、＃１０１（図２２、パネルＡ右グラフの白四角）については、ウイルス血症はＨＬ１１ｍ遺伝子型群における他のブタと比べて、著しく低減された。ブタ＃１０１についてのウイルス血症の３～４ｌｏｇ低減についての説明は明らかにならなかったが、いくらかのＨＬ１１ｍブタはＰＲＲＳＶに対してより寛容でなくなる可能性があることが示唆され、インビトロＰＡＭ感染結果をサポートする観察となった（表１５）。全てのブタに、同じ量のウイルスを接種し、ＷＴブタと混じり合わせままとしたので、ブタ＃１０１におけるより低いウイルス血症はより低い量のウイルスを受けた、またはウイルスへのより低い曝露の結果ではなかった。マクロファージのフローサイトメトリーにより、ブタ＃１０１についてのＣＤ１６３発現は他のＨＬ１１ｍブタに匹敵したことが示された（データ示さず）。エクソン１１模倣配列の配列に差はなかった。
ＷＴ（丸）、ＨＬ１１ｍ（四角）、およびＣＤ１６３ヌル（三角）ブタを、代表的な１型（ＳＤ１３－１５）（図２２、パネルＡ、左グラフ）および２型（ＮＶＳＬ９７－７８９５）（図２２、パネルＡ、右グラフ）ウイルスにより感染させた。ヌル表現型ブタはＫＯおよびｄ（１５６７）アレル由来とした（図１７を参照されたい）。同じウイルスを接種された３つの遺伝子型由来のブタを１つのおり内で混じり合わせ、これにより、ＣＤ１６３改変ブタを、同じおりのＷＴ個体から排出されたウイルスへの連続曝露が可能になった。代表的な１型ウイルスに感染したブタの数は下記であり：ＷＴ（ｎ＝４）、ＨＬ１１ｍ（ｎ＝５）、およびヌル（ｎ＝３）；ならびに２型ウイルスでは下記となった：ＷＴ（ｎ＝４）、ＨＬ１１ｍ（ｎ＝４）、およびヌル（ｎ＝３）。図２２に示されるように、１型または２型ウイルスのいずれかに感染したＣＤ１６３ヌルブタは、全ての時間点でウイルス血症に対して陰性であり、抗体陽転しなかった。予想通りに、ＷＴブタは増殖性感染され、両方のウイルスについて感染後７日に１０６テンプレート／５０μｌＰＣＲ反応に到達する平均ウイルス血症レベルを有した。１４日までに、ＷＴブタは全て抗体陽転した（図２２、パネルＢを参照されたい）。ＰＡＭ感染結果と一致して（表１５）、１型ウイルスに感染した５匹のＨＬ１１ｍブタはウイルス血症またはＰＲＲＳＶ抗体のエビデンスを示さなかった。２型分離株、ＮＶＳＬに感染した全てのＨＬ１１ｍブタは、感染をサポートし、抗体陽転した（図２２、パネルＢ）。ＨＬ１１ｍブタの低減された寛容性の存在は不明確であった。４匹のＨＬ１１ｍブタのうちの３匹についての平均ウイルス血症はＷＴブタと同様であった。しかしながら、１匹のＨＬ１１ｍブタ、＃１０１（図２２、パネルＡ右グラフの白四角）については、ウイルス血症はＨＬ１１ｍ遺伝子型群における他のブタと比べて、著しく低減された。ブタ＃１０１についてのウイルス血症の３～４ｌｏｇ低減についての説明は明らかにならなかったが、いくらかのＨＬ１１ｍブタはＰＲＲＳＶに対してより寛容でなくなる可能性があることが示唆され、インビトロＰＡＭ感染結果をサポートする観察となった（表１５）。全てのブタに、同じ量のウイルスを接種し、ＷＴブタと混じり合わせままとしたので、ブタ＃１０１におけるより低いウイルス血症はより低い量のウイルスを受けた、またはウイルスへのより低い曝露の結果ではなかった。マクロファージのフローサイトメトリーにより、ブタ＃１０１についてのＣＤ１６３発現は他のＨＬ１１ｍブタに匹敵したことが示された（データ示さず）。エクソン１１模倣配列の配列に差はなかった。
【0387】
追加のウイルス感染試験を２つのウイルス、ＮＶＳＬ９７－７８９５およびＫＳ０６－７２１０９を使用して実施した。結果が、図２３で示される。ブタを感染後３５日間追跡し、データを、感染後３、７、１１、１４、２１、２８および３５日にとったウイルス血症測定に対する曲線下面積（ＡＵＣ）として報告した。図２３に示されるように、ＮＶＳＬでは、ＮＶＳＬに感染した７匹のＷＴブタについての平均ＡＵＣ値は１６８＋／－８であり、対して、７匹のＨＬ１１ｍブタでは１６５＋／－１５であった。ＫＳ０６では、６匹のＷＴおよび６匹のＨＬ１１ｍブタに対する平均ＡＵＣ値は、それぞれ、１５６＋／－９および１６３＋／－１３であった。両方のウイルスについて、ＷＴとＨＬ１１ｍブタの間で統計的に有意な差はなかった（ｐ＞０．０５）。まとめると、結果により、ＨＬ１１ｍブタは１型ＰＲＲＳＶの感染をサポートすることができなかったが、２型ウイルスの感染に対する寛容性を保持したことが示された。インビトロで２型分離株に感染させたＨＬ１１ｍブタ由来のＰＡＭのＰＲＲＳＶ寛容性の低減が存在したとしても、この差はブタにつながらなかった。図２３に示される結果では、ウイルス量を、３５日の感染期間にわたって各ブタに対する曲線下面積（ＡＵＣ）を計算することにより決定した。ＡＵＣ計算を、感染後０、４、７、１０、１４、２１、２８および３５日にとったｌｏｇ１０ＰＣＲウイルス血症測定を使用して実施した。水平線は平均および標準偏差を示す。記号：ＷＴ＝野生型ブタ、ＨＬ１１＝ＨＬ１１ｍ遺伝子型ブタ；Ｎｕｌｌ＝ＣＤ１６３ヌル遺伝子型。
【0388】
論考
ＣＤ１６３は血液から過剰なＨｂを捕捉し、組織ダメージに応じて炎症を調節するのに重要なマクロファージ表面タンパク質である。これはまた、ウイルス受容体として機能する。ＣＤ１６３は炎症促進反応および抗炎症反応の両方に関与する（Ｖａｎ Ｇｏｒｐ ｅｔ ａｌ．， ２０１０）。ＣＤ１６３陽性マクロファージは、選択的活性化Ｍ２群のマクロファージ（高い食作用性および抗炎症を有するものと一般に説明される）内に入れられる。Ｍ２マクロファージは、機械的組織ダメージまたは感染後の浄化および修復に関与する（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９２）。抗炎症能力において、ＣＤ１６３発現は抗炎症タンパク質、例えばＩＬ－１０により上方制御される（Ｓｕｌａｈｉａｎ， ｅｔ ａｌ．， ２００２）。炎症中、ＣＤ１６３は血液からの循環ヘムの除去により酸化を低減させることにより炎症を減少させる。ヘム分解生成物、例えばビリベルジン（ｂｉｌｖｅｒｄｉｎ）、ビリルビン、および一酸化炭素は強力な抗炎症分子である（Ｓｏａｒｅｓ ａｎｄ Ｂａｃｈ， ２００９およびＪｅｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， ２００２）。炎症促進性能力では、マクロファージ表面上のＣＤ１６３の抗ＣＤ１６３抗体または細菌による架橋により、炎症性サイトカイン、例えばＩＬ－６、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦαおよびＩＬ－１βの局所放出が起こる（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｅｕｖｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９９およびＦａｂｒｉｅｋ ｅｔ ａｌ．， ２００９）。
ＣＤ１６３は血液から過剰なＨｂを捕捉し、組織ダメージに応じて炎症を調節するのに重要なマクロファージ表面タンパク質である。これはまた、ウイルス受容体として機能する。ＣＤ１６３は炎症促進反応および抗炎症反応の両方に関与する（Ｖａｎ Ｇｏｒｐ ｅｔ ａｌ．， ２０１０）。ＣＤ１６３陽性マクロファージは、選択的活性化Ｍ２群のマクロファージ（高い食作用性および抗炎症を有するものと一般に説明される）内に入れられる。Ｍ２マクロファージは、機械的組織ダメージまたは感染後の浄化および修復に関与する（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９２）。抗炎症能力において、ＣＤ１６３発現は抗炎症タンパク質、例えばＩＬ－１０により上方制御される（Ｓｕｌａｈｉａｎ， ｅｔ ａｌ．， ２００２）。炎症中、ＣＤ１６３は血液からの循環ヘムの除去により酸化を低減させることにより炎症を減少させる。ヘム分解生成物、例えばビリベルジン（ｂｉｌｖｅｒｄｉｎ）、ビリルビン、および一酸化炭素は強力な抗炎症分子である（Ｓｏａｒｅｓ ａｎｄ Ｂａｃｈ， ２００９およびＪｅｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， ２００２）。炎症促進性能力では、マクロファージ表面上のＣＤ１６３の抗ＣＤ１６３抗体または細菌による架橋により、炎症性サイトカイン、例えばＩＬ－６、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦαおよびＩＬ－１βの局所放出が起こる（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｅｕｖｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９９およびＦａｂｒｉｅｋ ｅｔ ａｌ．， ２００９）。
【0389】
ＣＤ１６３を欠くＧＭブタは、２型ＰＲＲＳＶ分離株の複製をサポートできない（Ｗｈｉｔｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．， ２０１６）。この研究では、インビトロ感染試験により、ＣＤ１６３ヌル表現型マクロファージの１型および２型ＰＲＲＳＶ分離株の広範な一団への抵抗性が証明され、さらに、潜在的に、全てのＰＲＲＳＶ分離株を含むように抵抗性が拡大される（表１５）。ＣＤ１６３ヌル表現型マクロファージの１型および２型ウイルスに対する抵抗性がインビボで確認された（図２２および図２３）。これらの結果に基づき、文献において前に記載された他のＰＲＲＳＶ受容体の寄与（Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｙｏｏ， ２０１５）は、除外することができる。例えば、Ｓｈａｎｍｕｋｈａｐｐａ ｅｔ ａｌ． （２００７）により、ＣＤ１５１プラスミドがトランスフェクトされた非許容ＢＨＫ細胞はＰＲＲＳＶ複製をサポートする能力を獲得したことが示され、ポリクローナル抗ＣＤ１５１抗体とのインキュベーションは、ＭＡＲＣ－１４５細胞の感染を著しく低減させることが示された。加えて、ブタインフルエンザウイルスを増殖させる際に使用するために元々開発されたサル細胞株、ＳＪＰＬは前に、ＰＲＲＳＶ複製をサポートすることが示された（Ｐｒｏｖｏｓｔ， ｅｔ ａｌ．， ２０１２）。ＳＪＰＬ細胞株の重要な特性はＣＤ１５１の存在ならびにシアロアドヘシンおよびＣＤ１６３の欠如を含んだ。統合すると、これらのデータは、ＰＲＲＳＶ複製をサポートするにはＣＤ１５１のみの存在で十分であるという確かなエビデンスを提供した。ＣＤ１６３ヌル表現型を有するマクロファージおよびブタにおけるＰＲＲＳＶ感染の欠如を示すこの研究からの結果は、ＰＲＲＳＶに対する別の受容体としてのＣＤ１５１は生物学的に関連しないことを示す。
【0390】
ウイルスタンパク質ＧＰ２ａおよびＧＰ４（ＰＲＲＳＶ表面上でＧＰ２ａ、ＧＰ３、ＧＰ４ヘテロ三量体複合体の一部を形成する）は、プルダウンアッセイにおいて、ＧＰ２およびＧＰ４がプラスミドトランスフェクトされた細胞からＣＤ１６３と共に共沈させることができる（Ｄａｓ， ｅｔ ａｌ．， ２００９）。おそらく、ＧＰ２およびＧＰ４は１つ以上のＣＤ１６３ ＳＲＣＲドメインと相互作用する。ブタＳＲＣＲ５とｈＣＤ１６３－Ｌ１ ＳＲＣＲ８由来のホモログの間のドメインスワップを含むブタＣＤ１６３ ｃＤＮＡバックボーンを組み入れたインビトロ感染性アッセイはさらに、１型ウイルスに使用される領域をＳＲＣＲ５に限局させた（Ｖａｎ Ｇｏｒｐ， ｅｔ ａｌ．， ２０１０）。ＧＰ２／ＧＰ４とＣＤ１６３の間の安定な相互作用はＳＲＣＲ５を介して起こると推測することは興味深い。追加のウイルス糖タンパク質、例えばＧＰ３およびＧＰ５はウイルス－受容体複合体をさらに安定化させることができ、または共受容体分子として機能することができる。ＳＲＣＲ５に対する要求を、この研究ではＨＬ１１ｍアレル（ブタエクソン７において３３ｂｐ置換を作製することによりＣＤ１６３Ｌ１ ＳＲＣＲ８ドメインスワップを再構築した）を有するマクロファージおよびブタに感染させることにより調査した。ＨＬ１１ｍアレルはまた、遺伝子改変に対して陽性である細胞の選択のためにネオマイシンカセットを含んだ（図１７）。ＷＴ ＰＡＭと比べて低減されたレベルではあったが、ＨＬ１１ｍブタはＰＡＭ上でＣＤ１６３を発現した（図１９、パネルＡおよびＥを比較されたい）。低減された発現は、おそらくネオマイシンカセットの存在のためであり、それは、エクソン１１模倣物と続くイントロンの間に位置した。ＨＬ１１ｍブタは１型ウイルスの感染に対して寛容ではなく、ＳＲＣＲ５の重要性が確認された。しかしながら、ＨＬ１１ｍマクロファージおよびＨＬ１１ｍブタは２型ウイルスの感染をサポートしなかった。ウイルス滴定およびパーセント感染結果に基づき、ＨＬ１１ｍブタ由来のＰＡＭは、ＷＴマクロファージと比べて、ウイルスに対する寛容性において全体的な減少を示した（表１５および図１７）。寛容性の減少は、改変ＣＤ１６３タンパク質に対するウイルスの親和性の低減と共に、ＨＬ１１ｍマクロファージ上のＣＤ１６３のレベルの低減のためである可能性がある。２型ウイルスは、ＳＲＣＲ５の必要性を有する、およびＬ１ ＳＲＣＲ８は好適な置換物として機能することができると仮定すると、より低い親和性は、ヒトＳＲＣＲ８とブタＳＲＣＲ５の間のペプチド配列の差により説明され得る（図１８、パネルＢを参照されたい）。しかしながら、ＰＡＭの低減された寛容性はブタには移らなかった。ＨＬ１１ｍブタについての平均ウイルス血症は、ＷＴブタと比べて、有意には異ならなかった（図２３）。ＰＡＭに加えて、血管内、中隔およびリンパ組織マクロファージのＰＲＲＳＶ感染はウイルス血症の一因となる（Ｌａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７およびＭｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）。ＨＬ１１ｍブタにおける全体的なウイルス量を維持する際のこれらのおよび他のＣＤ１６３陽性細胞集団の潜在的寄与はさらなる研究の価値がある。
【0391】
ＳＲＣＲドメインの欠失を有するＣＤ１６３プラスミドがＨＥＫ細胞において安定に発現されるとしても（Ｖａｎ Ｇｏｒｐ ｅｔ ａｌ．， ２０１０）、ｄ７（１４６７）およびｄ７（１２８０）におけるエクソン７および８の欠失は、ＣＤ１６３の検出可能な表面発現の欠如という結果になった（図１９、パネルＤ）。フローサイトメトリーのために使用される２Ａ１０ ｍＡＢは、３つのＮ末端ＳＲＣＲドメインを認識するので（Ｖａｎ Ｇｏｒｐ ｅｔ ａｌ．， ２０１０）、かつ、おそらく第７および第８番目のドメインを認識するので（Ｓａｎｃｈｅｚ， ｅｔ ａｌ．， １９９９）、検出がないのは、変異タンパク質における２Ａ１０エピトープの除去のためではなかった。少量のＣＤ１６３発現が一部のｄ７（１２９）ブタ由来のＰＡＭ上で検出できたが（図１９、パネルＣを参照されたい）、発現されたタンパク質の量は、ＰＡＭまたはブタにおいてＰＲＲＳＶ感染をサポートするには十分ではなかった。エクソン７および８欠失変異体においてＣＤ１６３発現がないことは完全には理解されていないが、おそらく、ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質分解の結果である。
【0392】
２００３年に、ＣＤ１６３はアフリカブタコレラウイルスの受容体として同定された（ＡＳＦＶ；Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｔｏｒｒｅｓ ｅｔ ａｌ．， ２００３）。この結論は、感染マクロファージは、成熟ＣＤ１６３陽性表現型を有し、および抗ＣＤ１６３抗体、例えば２Ａ１０は、マクロファージのＡＳＦＶ感染をインビトロでブロックするという観察結果に基づいた。ＣＤ１６３ヌルブタがＡＳＦＶ感染に対して抵抗性であるかどうかは決定されていない。
【0393】
ＰＲＲＳＶ受容体への改変を組み込んだ細胞培養モデルは、ＰＲＲＳＶ侵入、複製および病態形成のメカニズムについての貴重な洞察を提供した。この研究の１つの独自の観点は、受容体改変ブタを使用するインビボでの並列実験の実施であった。この研究は、世界的なブタ産業が常に直面する最も重篤な疾患の１つに対する予防的療法を開発する可能性に重要な影響を有する。
【0394】
本明細書で開示される実施例は、例示として提供され、本発明の範囲を制限することは意図されない。
【0395】
以上を考慮すると、発明のいくつかの目的が達成され、他の有利な結果が得られることがわかるであろう。
【0396】
発明の範囲から逸脱せずに、様々な変更が上記生成物および方法において可能であるので、上記説明に含まれ、添付図面［複数可］で示される全ての事柄は、例示すぎず、制限するものではないと解釈されるべきであることが意図される。
参考文献
Allende R, et al., 1999. North American and European porcine reproductive and respiratory syndrome viruses differ in non-structural protein coding regions. J. Gen. Virol. 80: 307-315.
Bauer BK, et al., Arginine supplementation in vitro increases porcine embryo development and affects mRNA transcript expression. Reprod Fertil Dev 2011; 23:107.
Beaton BP, et al., Compound transgenics: recombinase- mediated gene stacking. In: Pinkert CA (ed.). Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, 3rd ed. Waltham, MA: Elsevier; 2014:565-578.
Benfield DA, et al., 1992. Characterization of swine infertility and respiratory syndrome (SIRS) virus (Isolate ATCC VR-2332). J Vet Diag Invest 4:127-133.
Boddicker, et al., 2014. Genome-wide association and genomic prediction for host response to porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection. Genetics, selection, evolution : GSE 46, 18.
Borg NA, et al., CD1d-lipid- antigen recognition by the semi-invariant NKT T-cell receptor. Nature 2007; 448:44-49.
Brinster RL, et al., Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc Natl Acad Sci U S A 1985; 82:4438-4442.
Calvert JG, et al., 2007. CD163 expression confers susceptibility to porcine reproductive and respiratory syndrome viruses. J Virol. 81:7371-7379.
Carter DB, et al., Phenotyping of transgenic cloned piglets. Cloning Stem Cells 2002; 4:131-145.
Cong L, et al., Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 2013; 339:819-823.
Dai Y, et al., Targeted disruption of the alpha1,3-galactosyltransferase gene in cloned pigs. Nat Biotechnol 2002; 20:251-255.
Das PB, et al., 2009. The minor envelope glycoproteins GP2a and GP4 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus interact with the receptor CD163. J Virol. 84:1731-40.
Delputte PL, et al., 2002. Involvement of the matrix protein in attachment of porcine reproductive and respiratory syndrome virus to a heparin-like receptor on porcine alveolar macrophages. J Virol. 76:4312-4320.
Etzerodt, A., et al., 2013. Plasma clearance of hemoglobin and haptoglobin in mice and effect of CD163 gene targeting disruption. Antioxidants & redox signaling 18, 2254-2263.
Etzerodt, A., et al., 2013. CD163 and inflammation: biological, diagnostic, and therapeutic aspects. Antioxidants & redox signaling 18, 2352-2363.
Fabriek BO, et al., 2005. The macrophage scavenger receptor CD163. Immunobiology. 210:153-160.
Fabriek BO, et al., 2009. The macrophage scavenger receptor CD163 functions as an innate immune sensor for bacteria. Blood. 113:887-892.
Gaj T, et al., ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas- based methods for genome engineering. Trends Biotechnol 2013; 31: 397-405.
Gaudreault N, et al., 2009. Factors affecting the permissiveness of porcine alveolar macrophages for porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Archiv Virol. 154:133-136.
Graversen, J.H., et al., 2012. Targeting the hemoglobin scavenger receptor CD163 in macrophages highly increases the anti-inflammatory potency of dexamethasone. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy 20, 1550-1558.
Groenen, M.A., et al., 2012. Analyses of pig genomes provide insight into porcine demography and evolution. Nature 491, 393-398.
Hai T, et al., One-step generation of knockout pigs by zygote injection of CRISPR/Cas system. Cell Res 2014; 24: 372-375.
Halbur, P.G., et al., 1995. Comparison of the pathogenicity of two US porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates with that of the Lelystad virus. Veterinary pathology 32, 648-660.
Hammer RE, et al., Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection. Nature 1985; 315:680-683.
Hauschild J, et al., Efficient generation of a biallelic knockout in pigs using zinc-finger nucleases. Proc Natl Acad Sci U S A 2011; 108:12013-12017.
Holtkamp, D.J., et al., 2013. Assessment of the economic impact of porcine reprodutive and respiratory syndrome virus on United States pork producers. Journal of Swine Health and Production 21, 72-84.
Hwang WY, et al., Efficient genome editing in zebrafish using a knockout pigs via zinc-finger nucleases and nuclear transfer cloning. Cell Res 2011; 21:979-982.
Hwang WY, et al., Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol 2013; 31:227-229.
Jeney V, et al., 2002. Pro-oxidant and cytotoxic effects of circulating heme. Blood. 100:879-887.
Keffaber, K.K., 1989. Reproductive failure of unknown etiology. American Association of Swine Practitioners Newsletter 1, 1-10.
Kim, H.S., et al.,1993. Enhanced replication of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus in a homogeneous subpopulation of MA-104 cell line. Arch Virol 133, 477-483.
Kristiansen M, et al., 2001. Identification of the haemoglobin scavenger receptor. Nature. 409:198-201.
Kwon DN, et al., Production of biallelic CMP-Neu5Ac hydroxylase knock-out pigs. Sci Rep 2013; 3:1981.
Ladinig, A., et al., 2015. Pathogenicity of three type 2 porcine reproductive and respiratory syndrome virus strains in experimentally inoculated pregnant gilts. Virus Res 203, 24-35.
Lai L, et al., Production of alpha-1,3-galactosyltransferase knockout pigs by nuclear transfer cloning. Science 2002; 295:1089-1092.
Lai L, et al., Creating genetically modified pigs by using nuclear transfer. Reprod Biol Endocrinol 2003; 1:82.
Lai L, et al., Production of cloned pigs by using somatic cells as donors. Cloning Stem Cells 2003; 5:233-241.
Lawson SR, et al.,1997. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection of gnotobiotic pigs: sites of virus replication and co-localization with MAC-387 staining at 21 days post-infection. Virus Res. 51:105-113.
Lee K, et al., Engraftment of human iPS cells and allogeneic porcine cells into pigs with inactivated RAG2 and accompanying severe combined immunodeficiency. Proc Natl Acad Sci U S A 2014; 111:7260-7265.
Lee K, et al., Piglets produced from cloned blastocysts cultured in vitro with GM-CSF. Mol Reprod Dev 2013; 80: 145-154.
Li D, et al., Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol 2013; 31:681-683.
Lillico SG, et al., Live pigs produced from genome edited zygotes. Sci Rep 2013; 3:2847.
Machaty Z, et al., Complete activation of porcine oocytes induced by the sulfhydryl reagent, thimerosal. Biol Reprod 1997; 57:1123-1127.
Madsen M, et al., 2004. Molecular characterization of the haptoglobin-hemoglobin receptor CD163. Ligand binding properties of the scavenger receptor cysteine-rich domain region. J Biol Chem. 279:51561-51567.
Merck, The Merck Veterinary Manual. http://www.merckmanuals.com/vet/appendixes/reference_guides/normal_rectal_temperature_ranges.html.
Miao, Y.L., et al., 2009. Centrosome abnormalities during porcine oocyte aging. Environmental and molecular mutagenesis 50, 666-671.
Morgan SB, et al., 2014. Pathology and Virus Distribution in the Lung and Lymphoid Tissues of Pigs Experimentally Inoculated with Three Distinct Type 1 PRRS Virus Isolates of Varying Pathogenicity. Transbound Emerg Dis. Nov 10. pp 1-11.
Nelsen CJ, et al., 1999. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus comparison: divergent evolution on two continents. J. Virol. 73, 270-280.
Neumann EJ, et al., Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome on swine production in the United States. J Am Vet Med Assoc 2005; 227:385-392.
Niu Y, et al., Generation of gene-modified Cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell 2014; 156:836-843.
Patience, J.F., et al.,1989. Swine Nutrition Guide, in: Center, P.S. (Ed.), University of Saskatchewan, Saskatoon, CA, pp. 149-171.
Patton JP, et al., 2008. Modulation of CD163 receptor expression and replication of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in porcine macrophages. Virus Res. 140: 161-171.
Prather RS, et al., An intact sialoadhesin (Sn/SIGLEC1/CD169) is not required for attachment/ internalization of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus. J Virol 2013; 87:9538-9546.
Prather, R.S., et al., 2013. An intact sialoadhesin (Sn/SIGLEC1/CD169) is not required for attachment/internalization of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus. J Virol 87, 9538-9546.
Provost C, et al., 2012. Identification of a new cell line permissive to porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection and replication which is phenotypically distinct from MARC-145 cell line. Virol J. 9:267.
Reed JL, et al., 1938. A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene 27:493-497.
Ross JW, et al., Optimization of square-wave electroporation for transfection of porcine fetal fibroblasts. Transgenic Res 2010; 19:611-620.
Rowland, R.R., et al., 2012. Control of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) through genetic improvements in disease resistance and tolerance. Frontiers in genetics 3, 260.
Sanchez C, et al., 1999. The porcine 2A10 antigen is homologous to human CD163 and related to macrophage differentiation. Journal of Immunology 162:5230-5237.
Sanchez-Torres C, et al., 2003. Expression of porcine CD163 on monocytes/macrophages correlates with permissiveness to African swine fever infection. Arch Virol. 148:2307-2323.
Schaer, C.A., et al., 2006a. Constitutive endocytosis of CD163 mediates hemoglobin-heme uptake and determines the noninflammatory and protective transcriptional response of macrophages to hemoglobin. Circulation research 99, 943-950.
Schaer, D.J., et al., 2006b. CD163 is the macrophage scavenger receptor for native and chemically modified hemoglobins in the absence of haptoglobin. Blood 107, 373-380.
Schaer, D.J., et al., 2006c. Hemophagocytic macrophages constitute a major compartment of heme oxygenase expression in sepsis. European journal of haematology 77, 432-436.
Shanmukhappa, K, et al., 2007. Role of CD151, A tetraspanin, in porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection. Virol J. 4:62.
Shimozawa N, et al., Abnormalities in cloned mice are not transmitted to the progeny. Genesis 2002; 34:203-207.
Smit, AFA, et al., RepeatMasker Open-3.0. 1996-2010. Current Version: open-4.0.5 (RMLib: 20140131 and Dfam: 1.2). http:// www.repeatmasker.org>. CD163: accessed July 25, 2014; CD1D: accessed August 27, 2013.
Soares MP, et al., 2009. Heme oxygenase-1: from biology to therapeutic potential. Trends Mol Med. 15:50-58.
Stein M, et al.,1992. Interleukin 4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity: a marker of alternative immunologic macrophage activation. J Exp Med. 176:287-292.
Stephenson R, et al., 2015. Multiplex serology for common viral infections in feral pigs in Hawaii between 2007 and 2010. Accepted for publication. J Wildlife Dis 51:239-2343.
Sulahian TH1, et al., 2002. 2002. Human monocytes express CD163, which is upregulated by IL-10 and identical to p155. Cytokine. 2000 12:1312-1321.
Terns MP, et al., CRISPR-based adaptive immune systems. Curr Opin Microbiol 2011; 14:321-327.
Trible, B.R., et al., 2012. Recognition of the different structural forms of the capsid protein determines the outcome following infection with porcine circovirus type 2. J Virol 86, 13508-13514.
U.S. Department of Agriculture and U.S. Department of Health and Human Services. Dietary Guidelines for Americans, 2010. 7th Edition,
Van Breedam W, et al., Porcine reproductive and respiratory syndrome virus entry into the porcine macrophage. J Gen Virol 2010; 91:1659-1667.
Van Breedam, W., et al., 2010. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus entry into the porcine macrophage. J Gen Virol 91, 1659-1667.
Van den Heuvel MM, et al., 1999. Regulation of CD 163 on human macrophages: cross-linking of CD163 induces signaling and activation. J Leukoc Biol. 66:858-866.
van den Hoff MJ, et al., Electroporation in ‘intracellular’ buffer increases cell survival. Nucleic Acids Res 1992; 20:2902.
Van Gorp, H., et al., 2010. Scavenger receptor CD163, a Jack-of-all-trades and potential target for cell-directed therapy. Mol Immunol 47, 1650-1660.
Van Gorp H, et al., 2010. Identification of the CD163 protein domains involved in infection of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus. J Virol. 84:3101-3105.
Walters EM, et al., Advancing swine models for human health and diseases. Mo Med 2013; 110:212-215.
Wang H, et al., One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell 2013; 153: 910-918.
Welch SK, et al., 2010. A brief review of CD163 and its role in PRRSV infection. Virus Res. 154:98-103.
Wells, K.D., et al., 2014. Use of the CRISPR/Cas9 system to produce genetically engineered pigs from in vitro-derived oocytes and embryos. Biol Reprod 91, 78.
Wensvoort, G., et al., 1991. Mystery swine disease in The Netherlands: the isolation of Lelystad virus. Veterinary Quarterly 13, 121-130.
Whitworth KM, et al., 2016. CD163 facilitates both entry and replication of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Nature Biotech. 34:20-22.
Whitworth KM, et al., Method of oocyte activation affects cloning efficiency in pigs. Mol Reprod Dev 2009;76:490-500.
Whitworth KM, et al., Activation method does not alter abnormal placental gene expression and development in cloned pigs. Mol Reprod Dev 2010; 77:1016-1030.
Whitworth KM, et al., Scriptaid corrects gene expression of a few aberrantly reprogrammed transcripts in nuclear transfer pig blastocyst stage embryos. Cell Reprogram 2011; 13:191-204.
Whitworth, K.M., et al., 2014. Use of the CRISPR/Cas9 system to produce genetically engineered pigs from in vitro-derived oocytes and embryos. Biol Reprod 91, 78.
Whyte JJ, et al., Genetic modifications of pigs for medicine and agriculture. Mol Reprod Dev 2011; 78:879-891.
Whyte JJ, et al., Gene targeting with zinc finger nucleases to produce cloned eGFP knockout pigs. Mol Reprod Dev 2011; 78:2.
Wiedenheft B, et al., RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea. Nature 2012; 482:331-338.
Winckler, C., et al., 2001. The reliability and repeatability of a lameness scoring system for use as an indicator of welfare in dairy cattle. Acta Agricultura Scandinavica Section A. Animal Science, 103-107.
Yang D, et al., Generation of PPARgamma mono-allelic knockout pigs via zinc-finger nucleases and nuclear transfer cloning. Cell Res 2011; 21:979-982.
Yoshioka K, et al., Birth of piglets derived from porcine zygotes cultured in a chemically defined medium. Biol Reprod 2002; 66:112-119.
Zhang Q, et al., 2015. PRRS virus receptors and their role for pathogenesis. Vet Microbiol. 177:229-241.
Zhao J, et al., Histone deacetylase inhibitors improve in vitro and in vivo developmental competence of somatic cell nuclear transfer porcine embryos. Cell Reprogram 2010; 12:75-83.
Zhao J, et al., Significant improvement in cloning efficiency of an inbred miniature pig by histone deacetylase inhibitor treatment after somatic cell nuclear transfer. Biol Reprod 2009; 81:525-530.
参考文献
Allende R, et al., 1999. North American and European porcine reproductive and respiratory syndrome viruses differ in non-structural protein coding regions. J. Gen. Virol. 80: 307-315.
Bauer BK, et al., Arginine supplementation in vitro increases porcine embryo development and affects mRNA transcript expression. Reprod Fertil Dev 2011; 23:107.
Beaton BP, et al., Compound transgenics: recombinase- mediated gene stacking. In: Pinkert CA (ed.). Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, 3rd ed. Waltham, MA: Elsevier; 2014:565-578.
Benfield DA, et al., 1992. Characterization of swine infertility and respiratory syndrome (SIRS) virus (Isolate ATCC VR-2332). J Vet Diag Invest 4:127-133.
Boddicker, et al., 2014. Genome-wide association and genomic prediction for host response to porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection. Genetics, selection, evolution : GSE 46, 18.
Borg NA, et al., CD1d-lipid- antigen recognition by the semi-invariant NKT T-cell receptor. Nature 2007; 448:44-49.
Brinster RL, et al., Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc Natl Acad Sci U S A 1985; 82:4438-4442.
Calvert JG, et al., 2007. CD163 expression confers susceptibility to porcine reproductive and respiratory syndrome viruses. J Virol. 81:7371-7379.
Carter DB, et al., Phenotyping of transgenic cloned piglets. Cloning Stem Cells 2002; 4:131-145.
Cong L, et al., Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 2013; 339:819-823.
Dai Y, et al., Targeted disruption of the alpha1,3-galactosyltransferase gene in cloned pigs. Nat Biotechnol 2002; 20:251-255.
Das PB, et al., 2009. The minor envelope glycoproteins GP2a and GP4 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus interact with the receptor CD163. J Virol. 84:1731-40.
Delputte PL, et al., 2002. Involvement of the matrix protein in attachment of porcine reproductive and respiratory syndrome virus to a heparin-like receptor on porcine alveolar macrophages. J Virol. 76:4312-4320.
Etzerodt, A., et al., 2013. Plasma clearance of hemoglobin and haptoglobin in mice and effect of CD163 gene targeting disruption. Antioxidants & redox signaling 18, 2254-2263.
Etzerodt, A., et al., 2013. CD163 and inflammation: biological, diagnostic, and therapeutic aspects. Antioxidants & redox signaling 18, 2352-2363.
Fabriek BO, et al., 2005. The macrophage scavenger receptor CD163. Immunobiology. 210:153-160.
Fabriek BO, et al., 2009. The macrophage scavenger receptor CD163 functions as an innate immune sensor for bacteria. Blood. 113:887-892.
Gaj T, et al., ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas- based methods for genome engineering. Trends Biotechnol 2013; 31: 397-405.
Gaudreault N, et al., 2009. Factors affecting the permissiveness of porcine alveolar macrophages for porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Archiv Virol. 154:133-136.
Graversen, J.H., et al., 2012. Targeting the hemoglobin scavenger receptor CD163 in macrophages highly increases the anti-inflammatory potency of dexamethasone. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy 20, 1550-1558.
Groenen, M.A., et al., 2012. Analyses of pig genomes provide insight into porcine demography and evolution. Nature 491, 393-398.
Hai T, et al., One-step generation of knockout pigs by zygote injection of CRISPR/Cas system. Cell Res 2014; 24: 372-375.
Halbur, P.G., et al., 1995. Comparison of the pathogenicity of two US porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates with that of the Lelystad virus. Veterinary pathology 32, 648-660.
Hammer RE, et al., Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection. Nature 1985; 315:680-683.
Hauschild J, et al., Efficient generation of a biallelic knockout in pigs using zinc-finger nucleases. Proc Natl Acad Sci U S A 2011; 108:12013-12017.
Holtkamp, D.J., et al., 2013. Assessment of the economic impact of porcine reprodutive and respiratory syndrome virus on United States pork producers. Journal of Swine Health and Production 21, 72-84.
Hwang WY, et al., Efficient genome editing in zebrafish using a knockout pigs via zinc-finger nucleases and nuclear transfer cloning. Cell Res 2011; 21:979-982.
Hwang WY, et al., Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol 2013; 31:227-229.
Jeney V, et al., 2002. Pro-oxidant and cytotoxic effects of circulating heme. Blood. 100:879-887.
Keffaber, K.K., 1989. Reproductive failure of unknown etiology. American Association of Swine Practitioners Newsletter 1, 1-10.
Kim, H.S., et al.,1993. Enhanced replication of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus in a homogeneous subpopulation of MA-104 cell line. Arch Virol 133, 477-483.
Kristiansen M, et al., 2001. Identification of the haemoglobin scavenger receptor. Nature. 409:198-201.
Kwon DN, et al., Production of biallelic CMP-Neu5Ac hydroxylase knock-out pigs. Sci Rep 2013; 3:1981.
Ladinig, A., et al., 2015. Pathogenicity of three type 2 porcine reproductive and respiratory syndrome virus strains in experimentally inoculated pregnant gilts. Virus Res 203, 24-35.
Lai L, et al., Production of alpha-1,3-galactosyltransferase knockout pigs by nuclear transfer cloning. Science 2002; 295:1089-1092.
Lai L, et al., Creating genetically modified pigs by using nuclear transfer. Reprod Biol Endocrinol 2003; 1:82.
Lai L, et al., Production of cloned pigs by using somatic cells as donors. Cloning Stem Cells 2003; 5:233-241.
Lawson SR, et al.,1997. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection of gnotobiotic pigs: sites of virus replication and co-localization with MAC-387 staining at 21 days post-infection. Virus Res. 51:105-113.
Lee K, et al., Engraftment of human iPS cells and allogeneic porcine cells into pigs with inactivated RAG2 and accompanying severe combined immunodeficiency. Proc Natl Acad Sci U S A 2014; 111:7260-7265.
Lee K, et al., Piglets produced from cloned blastocysts cultured in vitro with GM-CSF. Mol Reprod Dev 2013; 80: 145-154.
Li D, et al., Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol 2013; 31:681-683.
Lillico SG, et al., Live pigs produced from genome edited zygotes. Sci Rep 2013; 3:2847.
Machaty Z, et al., Complete activation of porcine oocytes induced by the sulfhydryl reagent, thimerosal. Biol Reprod 1997; 57:1123-1127.
Madsen M, et al., 2004. Molecular characterization of the haptoglobin-hemoglobin receptor CD163. Ligand binding properties of the scavenger receptor cysteine-rich domain region. J Biol Chem. 279:51561-51567.
Merck, The Merck Veterinary Manual. http://www.merckmanuals.com/vet/appendixes/reference_guides/normal_rectal_temperature_ranges.html.
Miao, Y.L., et al., 2009. Centrosome abnormalities during porcine oocyte aging. Environmental and molecular mutagenesis 50, 666-671.
Morgan SB, et al., 2014. Pathology and Virus Distribution in the Lung and Lymphoid Tissues of Pigs Experimentally Inoculated with Three Distinct Type 1 PRRS Virus Isolates of Varying Pathogenicity. Transbound Emerg Dis. Nov 10. pp 1-11.
Nelsen CJ, et al., 1999. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus comparison: divergent evolution on two continents. J. Virol. 73, 270-280.
Neumann EJ, et al., Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome on swine production in the United States. J Am Vet Med Assoc 2005; 227:385-392.
Niu Y, et al., Generation of gene-modified Cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell 2014; 156:836-843.
Patience, J.F., et al.,1989. Swine Nutrition Guide, in: Center, P.S. (Ed.), University of Saskatchewan, Saskatoon, CA, pp. 149-171.
Patton JP, et al., 2008. Modulation of CD163 receptor expression and replication of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in porcine macrophages. Virus Res. 140: 161-171.
Prather RS, et al., An intact sialoadhesin (Sn/SIGLEC1/CD169) is not required for attachment/ internalization of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus. J Virol 2013; 87:9538-9546.
Prather, R.S., et al., 2013. An intact sialoadhesin (Sn/SIGLEC1/CD169) is not required for attachment/internalization of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus. J Virol 87, 9538-9546.
Provost C, et al., 2012. Identification of a new cell line permissive to porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection and replication which is phenotypically distinct from MARC-145 cell line. Virol J. 9:267.
Reed JL, et al., 1938. A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene 27:493-497.
Ross JW, et al., Optimization of square-wave electroporation for transfection of porcine fetal fibroblasts. Transgenic Res 2010; 19:611-620.
Rowland, R.R., et al., 2012. Control of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) through genetic improvements in disease resistance and tolerance. Frontiers in genetics 3, 260.
Sanchez C, et al., 1999. The porcine 2A10 antigen is homologous to human CD163 and related to macrophage differentiation. Journal of Immunology 162:5230-5237.
Sanchez-Torres C, et al., 2003. Expression of porcine CD163 on monocytes/macrophages correlates with permissiveness to African swine fever infection. Arch Virol. 148:2307-2323.
Schaer, C.A., et al., 2006a. Constitutive endocytosis of CD163 mediates hemoglobin-heme uptake and determines the noninflammatory and protective transcriptional response of macrophages to hemoglobin. Circulation research 99, 943-950.
Schaer, D.J., et al., 2006b. CD163 is the macrophage scavenger receptor for native and chemically modified hemoglobins in the absence of haptoglobin. Blood 107, 373-380.
Schaer, D.J., et al., 2006c. Hemophagocytic macrophages constitute a major compartment of heme oxygenase expression in sepsis. European journal of haematology 77, 432-436.
Shanmukhappa, K, et al., 2007. Role of CD151, A tetraspanin, in porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection. Virol J. 4:62.
Shimozawa N, et al., Abnormalities in cloned mice are not transmitted to the progeny. Genesis 2002; 34:203-207.
Smit, AFA, et al., RepeatMasker Open-3.0. 1996-2010. Current Version: open-4.0.5 (RMLib: 20140131 and Dfam: 1.2). http:// www.repeatmasker.org>. CD163: accessed July 25, 2014; CD1D: accessed August 27, 2013.
Soares MP, et al., 2009. Heme oxygenase-1: from biology to therapeutic potential. Trends Mol Med. 15:50-58.
Stein M, et al.,1992. Interleukin 4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity: a marker of alternative immunologic macrophage activation. J Exp Med. 176:287-292.
Stephenson R, et al., 2015. Multiplex serology for common viral infections in feral pigs in Hawaii between 2007 and 2010. Accepted for publication. J Wildlife Dis 51:239-2343.
Sulahian TH1, et al., 2002. 2002. Human monocytes express CD163, which is upregulated by IL-10 and identical to p155. Cytokine. 2000 12:1312-1321.
Terns MP, et al., CRISPR-based adaptive immune systems. Curr Opin Microbiol 2011; 14:321-327.
Trible, B.R., et al., 2012. Recognition of the different structural forms of the capsid protein determines the outcome following infection with porcine circovirus type 2. J Virol 86, 13508-13514.
U.S. Department of Agriculture and U.S. Department of Health and Human Services. Dietary Guidelines for Americans, 2010. 7th Edition,
Van Breedam W, et al., Porcine reproductive and respiratory syndrome virus entry into the porcine macrophage. J Gen Virol 2010; 91:1659-1667.
Van Breedam, W., et al., 2010. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus entry into the porcine macrophage. J Gen Virol 91, 1659-1667.
Van den Heuvel MM, et al., 1999. Regulation of CD 163 on human macrophages: cross-linking of CD163 induces signaling and activation. J Leukoc Biol. 66:858-866.
van den Hoff MJ, et al., Electroporation in ‘intracellular’ buffer increases cell survival. Nucleic Acids Res 1992; 20:2902.
Van Gorp, H., et al., 2010. Scavenger receptor CD163, a Jack-of-all-trades and potential target for cell-directed therapy. Mol Immunol 47, 1650-1660.
Van Gorp H, et al., 2010. Identification of the CD163 protein domains involved in infection of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus. J Virol. 84:3101-3105.
Walters EM, et al., Advancing swine models for human health and diseases. Mo Med 2013; 110:212-215.
Wang H, et al., One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell 2013; 153: 910-918.
Welch SK, et al., 2010. A brief review of CD163 and its role in PRRSV infection. Virus Res. 154:98-103.
Wells, K.D., et al., 2014. Use of the CRISPR/Cas9 system to produce genetically engineered pigs from in vitro-derived oocytes and embryos. Biol Reprod 91, 78.
Wensvoort, G., et al., 1991. Mystery swine disease in The Netherlands: the isolation of Lelystad virus. Veterinary Quarterly 13, 121-130.
Whitworth KM, et al., 2016. CD163 facilitates both entry and replication of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Nature Biotech. 34:20-22.
Whitworth KM, et al., Method of oocyte activation affects cloning efficiency in pigs. Mol Reprod Dev 2009;76:490-500.
Whitworth KM, et al., Activation method does not alter abnormal placental gene expression and development in cloned pigs. Mol Reprod Dev 2010; 77:1016-1030.
Whitworth KM, et al., Scriptaid corrects gene expression of a few aberrantly reprogrammed transcripts in nuclear transfer pig blastocyst stage embryos. Cell Reprogram 2011; 13:191-204.
Whitworth, K.M., et al., 2014. Use of the CRISPR/Cas9 system to produce genetically engineered pigs from in vitro-derived oocytes and embryos. Biol Reprod 91, 78.
Whyte JJ, et al., Genetic modifications of pigs for medicine and agriculture. Mol Reprod Dev 2011; 78:879-891.
Whyte JJ, et al., Gene targeting with zinc finger nucleases to produce cloned eGFP knockout pigs. Mol Reprod Dev 2011; 78:2.
Wiedenheft B, et al., RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea. Nature 2012; 482:331-338.
Winckler, C., et al., 2001. The reliability and repeatability of a lameness scoring system for use as an indicator of welfare in dairy cattle. Acta Agricultura Scandinavica Section A. Animal Science, 103-107.
Yang D, et al., Generation of PPARgamma mono-allelic knockout pigs via zinc-finger nucleases and nuclear transfer cloning. Cell Res 2011; 21:979-982.
Yoshioka K, et al., Birth of piglets derived from porcine zygotes cultured in a chemically defined medium. Biol Reprod 2002; 66:112-119.
Zhang Q, et al., 2015. PRRS virus receptors and their role for pathogenesis. Vet Microbiol. 177:229-241.
Zhao J, et al., Histone deacetylase inhibitors improve in vitro and in vivo developmental competence of somatic cell nuclear transfer porcine embryos. Cell Reprogram 2010; 12:75-83.
Zhao J, et al., Significant improvement in cloning efficiency of an inbred miniature pig by histone deacetylase inhibitor treatment after somatic cell nuclear transfer. Biol Reprod 2009; 81:525-530.
【表16】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13-1】
【図13-2】
【図13-3】
【図13-4】
【図14】
【図15】
【図16-1】
【図16-2】
【図17】
【図18】
【図19-1】
【図19-2】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-02-22
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
野生型ブタ動物、子孫、または細胞に対して、ブタ動物、子孫、または細胞においてブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）抵抗性を増加させる方法であって、
前記方法は、ブタ動物、子孫、または細胞においてＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つの染色体配列を改変させることを含み、
前記改変は、
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン７における改変、ここで、改変はエクソン７におけるインフレーム欠失を含む、改変、
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン８における改変、
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン７またはエクソン８と近接するイントロンにおける改変、
およびそれらの組み合わせ、
からなる群より選択される、
方法。
前記方法は、ブタ動物、子孫、または細胞においてＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つの染色体配列を改変させることを含み、
前記改変は、
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン７における改変、ここで、改変はエクソン７におけるインフレーム欠失を含む、改変、
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン８における改変、
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン７またはエクソン８と近接するイントロンにおける改変、
およびそれらの組み合わせ、
からなる群より選択される、
方法。
【請求項2】
改変が、
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３３３７からヌクレオチド３３４７までの１１ｂｐ欠失；
同じアレル上での、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３１４９とヌクレオチド３１５０の間に２ｂｐ付加を有する、ヌクレオチド２５７３からヌクレオチド２９４９までの３７７ｂｐ欠失；
同じアレル上での、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの１９３０塩基対欠失であって、欠失配列は、ヌクレオチド４８８で始まる１２塩基対挿入で置き換えられた欠失、および、ヌクレオチド３０４４からヌクレオチド３１７２までの１２９塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，４３１からヌクレオチド３，８９７までの１４６７ｂｐ欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２８１８からヌクレオチド４０９７までの１２８０ｂｐ欠失、
およびそれらの組み合わせ、
からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３３３７からヌクレオチド３３４７までの１１ｂｐ欠失；
同じアレル上での、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド３１４９とヌクレオチド３１５０の間に２ｂｐ付加を有する、ヌクレオチド２５７３からヌクレオチド２９４９までの３７７ｂｐ欠失；
同じアレル上での、参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの１９３０塩基対欠失であって、欠失配列は、ヌクレオチド４８８で始まる１２塩基対挿入で置き換えられた欠失、および、ヌクレオチド３０４４からヌクレオチド３１７２までの１２９塩基対欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２，４３１からヌクレオチド３，８９７までの１４６７ｂｐ欠失；
参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７と比べて、ヌクレオチド２８１８からヌクレオチド４０９７までの１２８０ｂｐ欠失、
およびそれらの組み合わせ、
からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ブタ動物、子孫、または細胞が、前記ＣＤ１６３遺伝子変更についてヘテロ接合性である、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記ブタ動物、子孫、または細胞が、前記ＣＤ１６３遺伝子変更についてホモ接合性である、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
改変が、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮまたはＺＦＮヌクレアーゼの作用により生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
野生型ブタ動物に対して増加したブタ繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）抵抗性を有するブタ動物を作製する方法であって、方法は、
卵母細胞を除核すること、
前記卵母細胞をドナー体細胞と融合することであって、体細胞のゲノムがＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つの染色体配列における改変を含み、前記改変は、
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン７における改変、ここで、改変はエクソン７におけるインフレーム欠失を含む、改変、
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン８における改変、
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン７またはエクソン８と近接するイントロンにおける改変、
およびそれらの組み合わせ、
からなる群より選択される、融合すること、
および、前記卵母細胞を活性化させ、胚を作製すること、
を含む、方法。
卵母細胞を除核すること、
前記卵母細胞をドナー体細胞と融合することであって、体細胞のゲノムがＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つの染色体配列における改変を含み、前記改変は、
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン７における改変、ここで、改変はエクソン７におけるインフレーム欠失を含む、改変、
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン８における改変、
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン７またはエクソン８と近接するイントロンにおける改変、
およびそれらの組み合わせ、
からなる群より選択される、融合すること、
および、前記卵母細胞を活性化させ、胚を作製すること、
を含む、方法。
【請求項7】
胚を代理ブタ動物の生殖管に移植することをさらに含む、請求項６に記載の方法であって、前記代理ブタ動物は、発情を開始しているが、排卵をまだ完了しておらず、そして、妊娠および正期産は、ゲノムがＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つの染色体配列における改変を含む遺伝子変更されたブタ動物を作製し、ここで、前記改変は、
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン７における改変、ここで、改変はエクソン７におけるインフレーム欠失を含む、改変、
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン８における改変、
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン７またはエクソン８と近接するイントロンにおける改変、
およびそれらの組み合わせ、
からなる群より選択される、
方法。
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン７における改変、ここで、改変はエクソン７におけるインフレーム欠失を含む、改変、
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン８における改変、
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のエクソン７またはエクソン８と近接するイントロンにおける改変、
およびそれらの組み合わせ、
からなる群より選択される、
方法。
【請求項8】
体細胞が線維芽細胞を含む、請求項６または７に記載の方法。
【請求項9】
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つの染色体配列における改変を含む遺伝子変更されたブタ動物を作製するための方法であって、前記ブタ動物は、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に対して増加した抵抗性を示し、前記方法は、
請求項６または７に記載の方法により作製された遺伝子変更された雌ブタ動物を請求項６または７に記載の方法により作製された遺伝子変更された雄ブタ動物と交配させ、Ｆ１子孫を作製すること；および
Ｆ１子孫をスクリーニングし、ＣＤ１６３遺伝子の両方のアレルが不活性化されている遺伝子変更されたブタ動物を同定すること、
を含む、方法。
請求項６または７に記載の方法により作製された遺伝子変更された雌ブタ動物を請求項６または７に記載の方法により作製された遺伝子変更された雄ブタ動物と交配させ、Ｆ１子孫を作製すること；および
Ｆ１子孫をスクリーニングし、ＣＤ１６３遺伝子の両方のアレルが不活性化されている遺伝子変更されたブタ動物を同定すること、
を含む、方法。
【請求項10】
不活性化する突然変異が、挿入、欠失、フレームシフト突然変異、ナンセンス突然変異、ミスセンス突然変異、点突然変異、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項６または７に記載の方法。
【請求項11】
ブタ動物が、ＣＤ１６３の発現または活性を変更する突然変異を含む、請求項６または７に記載の方法。
【請求項12】
ＣＤ１６３アレルの不活性化が、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）の細胞取込みを低減させ、または排除するＣＤ１６３タンパク質をもたらす、請求項６または７に記載の方法。
【外国語明細書】