特開 2024-59797 新規抗微生物融合タンパク質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024059797

(43)【公開日】2024-05-01

(54)【発明の名称】新規抗微生物融合タンパク質

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20240423BHJP

   C12N 15/34 20060101ALI20240423BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240423BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240423BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240423BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240423BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240423BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240423BHJP

   C07K 14/01 20060101ALI20240423BHJP

   C07K 14/46 20060101ALI20240423BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240423BHJP

   C07K 7/08 20060101ALI20240423BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20240423BHJP

   A61K 38/08 20190101ALI20240423BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20240423BHJP

   A61P 43/00 20060101ALN20240423BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z

C12N15/34 ZNA

C12N15/12

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C07K14/01

C07K14/46

C07K19/00

C07K7/08

A61P31/04

A61K38/08

A61K38/16

A61P43/00 121

【審査請求】有

【請求項の数】14

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2024025390

(22)【出願日】2024-02-22

(62)【分割の表示】P 2020565937の分割

【原出願日】2019-05-29

(31)【優先権主張番号】18175064.7

(32)【優先日】2018-05-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(71)【出願人】

【識別番号】519120329

【氏名又は名称】ライサンド アーゲー

(74)【代理人】

【識別番号】110003063

【氏名又は名称】弁理士法人牛木国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ビーブル，マンフレッド

(72)【発明者】

【氏名】グリースル，マーティン

(57)【要約】      （修正有）

【課題】抗菌活性を示し、ＥＤＴＡまたは他の外膜透過化物質の併存に依存しない、新しい抗微生物剤を提供する。
【解決手段】本発明は、グラム陰性エンドリシンと、抗微生物ペプチド、両親媒性ペプチド、カチオン性ペプチド、スシペプチド、またはデフェンシンからなる群から選択されるペプチドと、を含むポリペプチドであって、前記エンドリシンは、特定の配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、からなる群から選択されることを特徴とするポリペプチドに関する。本発明はまた、これに関連する核酸、ベクター、バクテリオファージ、宿主細胞、組成物およびキット、キットの使用に関する。本発明に係るポリペプチド、核酸、ベクター、バクテリオファージ、宿主細胞、組成物およびキットはまた、例えば食品または飼料中、化粧品中の抗菌剤として、または消毒剤として使用することが出来る。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

グラム陰性エンドリシンと、抗微生物ペプチド、両親媒性ペプチド、カチオン性ペプチド、スシペプチド、またはデフェンシンからなる群から選択されるペプチドと、を含むポリペプチドであって、前記エンドリシンはさらに配列番号2に記載の配列を含むエンドリシンであり、但し下記の条件：
ａ）前記ポリペプチドは配列番号３、配列番号４、および配列番号５に記載の配列を何れも含まず、
ｂ）前記エンドリシンは腸内細菌ファージＪＳ９８のＥｐＪＳ９８＿ｇｐ１１６ではなく、
ｃ）前記ポリペプチドが配列番号６に記載の配列を含んでいる場合には、前記ペプチドが、抗微生物ペプチド、両親媒性ペプチド、スシペプチド、またはデフェンシンからなる群から選択され、
ｄ）前記エンドリシンが下記の配列：

【表E】

からなる群から選択される配列、またはこれらに対応した配列であって、単にＮ末端メチオニンをさらに欠失している配列、を含む場合には、前記ポリペプチドは、ｉ）モジュール型グラム陰性エンドリシン、またはｉｉ）バクテリオファージ尾部／基盤タンパク質、の細胞壁結合ドメインを含まず、
ｅ）前記エンドリシンが下記のアミノ酸２－１６４に記載の配列：

【表F】

を含む場合には、前記ポリペプチドは、ｉ）モジュール型グラム陰性エンドリシン、またはｉｉ）バクテリオファージ尾部／基盤タンパク質、の細胞壁結合ドメインを含まず、
ｆ）前記エンドリシンが下記のアミノ酸２－１６１に記載の配列：

【表G】

を有する場合には、前記ポリペプチドは、ｉ）モジュール型グラム陰性エンドリシン、またはｉｉ）バクテリオファージ尾部／基盤タンパク質、の細胞壁結合ドメインを含まない、
が課されていることを特徴とするポリペプチド。

【請求項2】

前記エンドリシンが配列番号7に記載の配列を含むエンドリシンであることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項3】

前記エンドリシンが配列番号６、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、ならびに配列番号６、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、および／または配列番号３６に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、からなる群から選択されることを特徴とする請求項１または２に記載のポリペプチド。

【請求項4】

前記エンドリシンに配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１からなる群から選択される配列が含まれることを特徴とする請求項２または３に記載のポリペプチド。

【請求項5】

前記ペプチドが抗微生物ペプチドまたは両親媒性ペプチドであることを特徴とする請求項１～４の何れか一項に記載のポリペプチド。

【請求項6】

前記ペプチドにＫＲＫおよび配列番号３７～１３６からなる群から選択される配列が含まれ、特に前記ペプチドに配列番号６３または配列番号１３２に記載の配列が含まれることを特徴とする請求項１～５の何れか一項に記載のポリペプチド。

【請求項7】

前記ポリペプチドに配列番号１４０に記載のアミノ酸配列、または配列番号１４１に記載のアミノ酸配列、または配列番号１４０および／もしくは配列番号１４１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、が含まれることを特徴とする請求項１～６の何れか一項に記載のポリペプチド。

【請求項8】

配列番号１０７、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５および配列番号１３６からなる群から選択されるペプチドに係る配列と、壁溶解酵素の配列と、を含むポリペプチド。

【請求項9】

前記ポリペプチドが少なくとも１つのグラム陰性菌種のペプチドグリカンを分解し、特に前記ポリペプチドが、大腸菌（E. coli）および／または緑膿菌（P. aeruginosa）のペプチドグリカンを分解することを特徴とする請求項１～８の何れか一項に記載のポリペプチド。

【請求項10】

前記ポリペプチドが他に外膜透過化剤のない状態で少なくとも１つのグラム陰性菌種のペプチドグリカンを分解し、特に前記ポリペプチドが外膜透過化剤のない状態で、大腸菌（E. coli）および/または緑膿菌（P. aeruginosa）のペプチドグリカンを分解することを特徴とする請求項９に記載のポリペプチド。

【請求項11】

前記ポリペプチドが外膜透過化剤のない状態で大腸菌（E.coli）株ＲＫＩ０６－０８４１０に対して２０μｇ／ｍｌ以下の最小阻止濃度（ＭＩＣ）を示すことを特徴とする請求項９に記載のポリペプチド。

【請求項12】

請求項１～１１の何れか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸。

【請求項13】

請求項１２に記載の核酸を含む、ベクター。

【請求項14】

請求項１～１１の何れか一項に記載のポリペプチド、請求項１２に記載の核酸、および／または請求項１３に記載のベクター、を含む宿主細胞。

【請求項15】

手術もしくは治療によりヒトもしくは動物を処置するための方法に使用するため、又はヒトもしくは動物の身体に実施される診断方法に使用するためのポリペプチドであって、
前記ポリペプチドが追加で外膜透過化剤を添加することなく投与されることを特徴とする請求項１～１１の何れか一項に記載のポリペプチド。

【請求項16】

前記ポリペプチドが追加で外膜透過化剤を添加することなく投与されることを特徴とする、請求項１～１１の何れか一項に記載のポリペプチドの、非治療的な消毒剤としての使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、グラム陰性エンドリシンと、抗微生物ペプチド、両親媒性ペプチド、カチオン性ペプチド、疎水性ペプチド、スシペプチド、またはデフェンシンからなる群から選択されるペプチドと、を含むポリペプチドであって、前記エンドリシンが配列番号１または配列番号２に係る配列を含むことを特徴とするポリペプチドに関する。本発明はまた、これらに対応する核酸、ベクター、バクテリオファージ、宿主細胞、組成物およびキットに関する。本発明はまた、人体もしくは動物体を手術もしくは治療により手当する方法、または人体もしくは動物体に施される診断方法における、前記ポリペプチド、核酸、ベクター、バクテリオファージ、宿主細胞、組成物およびキットの使用に関する。本発明に係るポリペプチド、核酸、ベクター、バクテリオファージ、宿主細胞、組成物およびキットはまた、例えば食品または飼料の抗微生物剤として、化粧品の抗微生物剤として、または殺菌剤として使用することができる。

【背景技術】

【0002】

通常の抗生物質に対する耐性が、人類にとって高まりつつある健康リスクとなっている。新たな抗生物質耐性機構が現れており、世界的に急速に広まっている。このため、ありふれた感染症を治療するための機能が、近い将来、ますます困難になってゆく可能性がある。この危険性は当分野で既に認識されており、細菌感染症と闘う新たな手法が探索されている。

【0003】

このような新たなアプローチの１つは、エンドリシンを種々のペプチドと組み合わせた融合タンパク質の創出である。エンドリシンはバクテリオファージ（つまり細菌ウイルス）によりコードされる壁溶解酵素（特にペプチドグリカン加水分解酵素）である。それらは、ファージ増殖の溶菌サイクルにおいて後期遺伝子発現の間に合成され、細菌ペプチドグリカンの分解を通して感染した細胞からの子孫ウイルス粒子の放出を媒介する。酵素活性については、これらは通常、β(１、４)-グリコシラーゼ（リゾチーム）、トランスグリコシラーゼ、アミダーゼ、またはエンドペプチダーゼのいずれかである。エンドリシンの抗微生物適用は、既に１９９１年に示唆されていた。エンドリシンの殺傷能力は長らく知られていたが、これらの酵素の抗菌薬としての使用は、抗生物質の成功と支配により無視されていた。多剤抗生物質耐性細菌の出現後に初めて、エンドリシンを用いてヒト病原体と戦うというこの単純な概念が注目を浴びた。全く新たなタイプの抗細菌剤を開発するという切実な需要が生じ、「酵素」および「抗生物質」の混成用語である「エンザイビオティクス（enzybiotics）」として使用されるエンドリシンが、この需要を完璧に満たした。２００１年に、フィセッティ（Fischetti）および共同研究者は、Ａ群連鎖球菌（streptococcus）に対するバクテリオファージＣ１エンドリシンの治療的可能性を初めて実証した。それ以来、多くの刊行物によって、特にグラム陽性細菌による細菌感染症を制御するための魅力的かつ相補的な代替物としてのエンドリシンが確立されている。続いて、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcuspneumoniae）、バチルス・アントラシス（Bacillusanthracis）、Ｓ．アガラクチエ（S.agalactiae）、およびスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcusaureus）などの他のグラム陽性病原体に対する様々なエンドリシンが、エンザイビオティクスとしてのそれらの効力を実証した。それ以来長らく、エンドリシン治療における最も重要な課題は、エンドリシンの外因性作用に対するグラム陰性菌の耐性にあるが、これはペプチドグリカンからのエンドリシンのアクセスを外膜が保護するからである。

【0004】

グラム陰性菌は、顕著な特徴として特徴的な非対称二重層を有する外膜を有する。外膜二重層は、リン脂質（主としてホスファチジルエタノールアミン）を含む内側の単層および、主に単一の糖脂質であるリポ多糖（ＬＰＳ）で構成される外側の単層からなる。細菌界には限りなく多様なＬＰＳ構造が存在し、かつそのＬＰＳ構造は環境条件の克服に応じて改変されうる。ＬＰＳ層の安定性および異なるＬＰＳ分子間の相互作用は、主に、二価イオン（Ｍｇ^２＋、Ｃａ^２＋）とＬＰＳ分子のアニオン構成要素（リピドＡおよび内部コアにおけるリン酸基ならびにＫＤＯのカルボキシル基）との静電相互作用によって達成される。さらにまた、リピドＡの疎水性部分の高密度で規則正しいパッキングは、不飽和脂肪酸が存在しないことに助けられて、高い粘度を有する堅い構造を形成する。このことにより、親油性分子の透過性が低くなり、外膜（ＯＭ）にさらなる安定性が付与される。

【0005】

外膜の遮蔽効果を克服するため、グラム陰性菌のエンドリシンはこれまで、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、疎水性ペプチド、または抗微生物ペプチドなどと、上手く融合されてきた。このような融合タンパク質は、外部から添加するとグラム陰性菌を除去することができる（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、あるいは特許文献５を参照のこと）。しかし、改善した抗菌活性を得るために、前記融合タンパク質が少量のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）と組み合わされることがよくある。ＥＤＴＡはキレート剤であって公知の外膜透過化剤である（非特許文献１；本明細書に参照により取り込まれる）。結合サイトから二価カチオンを取り除くことにより、外膜が破壊され、これにより通常は上記融合タンパク質の抗菌作用が改善される。（例えば、特許文献１の表６および表８を参照のこと）。

【0006】

ＥＤＴＡの使用に何の支障もない様々な利用分野（例えば、殺菌剤など）が存在するが、ＥＤＴＡの併用や他の透過化剤が最適ではなく、場合によっては望ましくないような別の分野（例えば、飼料、食品安全性、医療機器の分野、および医薬品分野全般など）も存在し、これはＥＤＴＡが細菌膜だけでなく、あらゆる種類のカチオンと非特異的に錯体を形成するためである。

【0007】

したがってこの種の抗菌融合タンパク質の設計をさらに改善するような分野、特にＥＤＴＡを併用しないような応用分野にまだ需要が存在する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】国際公開第２０１０／０２３２０７号

【特許文献2】国際公開第２０１０／１４９７９２号

【特許文献3】国際公開第２０１１／１３４９９８号

【特許文献4】国際公開第２０１２／１４６７３８号

【特許文献5】国際公開第２０１５／１２１４４３号

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Vaara, M. Microbiol. Rev. 1992 Sep; 56 (3):395-411

【非特許文献2】Briers, et al.（J.Biochem.BiophysMethods;2007;70:531-533）

【非特許文献3】Donovan, et al.（J.FEMS Microbiol Lett.2006 Dec;265(1)

【非特許文献4】Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215, 403-410

【非特許文献5】Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res, 25:3389-3402

【非特許文献6】Pearson (1990), Methods Enzymol. 83, 63-98; Pearson and Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 85, 2444-2448.

【非特許文献7】Devereux et al, 1984, Nucleic Acids Res., 387-395

【非特許文献8】Smith and Waterman (1981), J. Mol. Biol. 147, 195-197

【非特許文献9】“The Sushi peptides: structural characterization and mode of action against Gram-negative bacteria.“Ding JL, Li P, Ho B Cell Mol Life Sci.2008 Apr;65(7-8): 1202-19

【非特許文献10】Tan et al,., FASEB J. 2000 Sep;14(12):1801-13).

【非特許文献11】Schleifer& Kandler 1972

【非特許文献12】Schmelcher et al., Bacteriophage endolysins as novel antimicrobials.Schmelcher M, Donovan DM, Loessner MJ. Future Microbiol. 2012 Oct;7(10):1147-7

【非特許文献13】Pirnay et al., Environmental Microbiology, 2002, p. 898-911

【非特許文献14】Sambrook et al. 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual

【発明の概要】

【0010】

したがって、本発明によって解決されるべき課題は、（特に生理学的条件下で）抗菌活性を示し、ＥＤＴＡまたは他の外膜透過化物質の併存にあまり依存しない、上記タイプの新しい抗微生物剤を提供することにある。

【0011】

この課題は、添付の特許請求の範囲および以下の詳細な説明に記載されている権利保護内容によって解決される。

【0012】

本発明の発明者は、驚くべきことに、特定の配列モチーフ（それぞれ配列番号１または配列番号２）を示すエンドリシンが、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または抗菌性ペプチドと融合された場合に、特に有用であることを発見した。得られた融合タンパク質は、外部から大腸菌（E. coli）などのグラム陰性菌に添加されると著しい抗菌活性を示し、また同時に、このような他の抗菌融合タンパク質と比較して、グラム陰性菌の外膜の透過化剤としてのＥＤＴＡの併存の依存度が低い。この驚くべき性質により、これらのペプチドはＥＤＴＡの使用に敏感な分野での利用に、特に適するものとなる。

【0013】

本明細書において使用される「ポリペプチド」という用語は、特に、特定の配列においてペプチド結合によって結合されたアミノ酸残基からなるポリマーを指す。ポリペプチドのアミノ酸残基は、例えば、炭水化物およびリン酸などの種々の基の共有結合性付加によって、修飾されてもよい。ヘムまたは脂質など、他の物質がより緩やかにポリペプチドと会合してもよく、本明細書において使用される「ポリペプチド」という用語にまた含まれる複合ポリペプチドを生じさせる。本明細書に用いられる当該用語にはタンパク質も含まれる。したがって、「ポリペプチド」の用語は、例えば２以上のアミノ酸ポリマー鎖からなる錯体も含まれている。「ポリペプチド」との用語には、当技術分野で通常用いられる任意選択的な修飾、例えば、ビオチン化、アセチル化、ＰＥＧ化、または、アミノ基、ＳＨ基、またはカルボキシル基（保護基など）、等の化学変化を呈する、ポリペプチドに係る実施形態も含まれている。以下の詳細な説明で明らかになるように、本発明に係るポリペプチドは、人工的に産出されたポリペプチドであって、天然にはこの形態で存在しない。このようなポリペプチドは例えば、天然由来のポリペプチドに対して人工的な変異を呈するか、あるいは異種配列を有するか、あるいは天然では生じないような形態の天然由来ポリペプチドの断片とすることができる。さらに、本発明によるポリペプチドはまた、融合タンパク質、すなわち、天然ではこの組み合わせで生じない少なくとも２つのアミノ酸配列の連結を表す。本明細書で使用される「ペプチド」という用語は、特定の長さを有するアミノ酸ポリマー鎖に限定されない。普通は、必ずしも必要なわけではないが、本発明に係る通常のポリペプチドは、長さが約１０００アミノ酸を超えない。本発明のポリペプチドは、例えば、アミノ酸の長さが長くても約７５０を超えず、長くても約５００を超えず、または長くても約３００を超えない。本発明のポリペプチドに想定されるアミノ酸長の範囲は、これに制限されるわけではないが、例えば、１６から１０００アミノ酸、１６から約５０アミノ酸、約２００から約７５０アミノ酸、または約２２５から約６００アミノ酸、または約２５０から約３５０アミノ酸である。

【0014】

本明細書で使用される「壁溶解酵素」との用語は当該分野で一般的に知られている通りである。これはグラム陰性菌などの細菌のペプチドグリカンを加水分解することのできるあらゆるペプチドの事を指すものである。当該用語は特定の酵素切断機構に限定されるものではない。酵素切断機構については、壁溶解酵素は例えば、エンドペプチダーゼ、キチナーゼ、Ｔ４様ムラミニダーゼ、λ様ムラミニダーゼ、Ｎ－アセチルムラモイル－Ｌ－アラニン－アミダーゼ（アミダーゼ）、ムラモイル－Ｌ－アラニン－アミダーゼ、ムラミダーゼ、溶解性トランスグリコシラーゼ（Ｃ）、溶解性トランスグリコシラーゼ（Ｍ）、Ｎ－アセチル－ムラミダーゼ（リゾチーム）、Ｎ－アセチル－グルコサミニダーゼ、または、トランスグリコシラーゼとすることができる。さらに当該用語は、真核生物由来、原核生物由来、またはウイルス（特にバクテリオファージ）由来の壁溶解酵素（例えばペプチドグリカン加水分解酵素など）など、天然由来の壁溶解酵素を包含するものである。当該用語は例えば脊椎動物型リゾチーム（ニワトリ卵白リゾチームおよびヒトリゾチーム）、エンドリシン（例えば、ＫＺ１４４エンドリシンまたはＬｙｓ３９４エンドリシン）、ビリオン関連ペプチドグリカン加水分解酵素（ＶＡＰＧＨ）、バクテリオシン（例えば、リゾスタフィン）、ならびにオートリシンが包含される。「壁溶解酵素」はまた細菌のペプチドグリカンを切断することのできる合成または人工的に改変されたポリペプチドとすることができる。例えば、２種以上のエンドリシンのドメインが入れ替え／交換された、酵素活性を有するシャッフリング型エンドリシンは、「壁溶解酵素」として認定され、酵素活性ドメインのみが残存する短縮型エンドリシンも同様である。特にエンドリシンの活性は、例えば、非特許文献２または非特許文献３（何れも本明細書に参照として組み込まれる）および類似の刊行物に記載されている、例えば、抗菌アッセイのような、当技術分野において当業者に周知のアッセイによって測定され得る。

【0015】

「エンドリシン」という用語は、本明細書中で使用されるように、細菌細胞壁の（特に加水分解による）切断に触媒作用を及ぼすのに好適なバクテリオファージ由来酵素をさす。好ましくは、エンドリシンは、ファージ増殖の溶菌サイクルにおいて後期遺伝子発現の間に合成され、かつ子孫ウイルス粒子の放出を媒介するバクテリオファージ由来酵素である。「エンドリシン」は通常、以下の活性のうち少なくとも１つの活性を示す：エンドペプチダーゼ、キチナーゼ、Ｔ４様ムラミニダーゼ、λ様ムラミニダーゼ、Ｎ－アセチル－ムラモイル－Ｌ－アラニン－アミダーゼ（アミダーゼ）、ムラモイル－Ｌ－アラニン－アミダーゼ、ムラミダーゼ、溶解性トランスグリコシラーゼ（Ｃ）、溶解性トランスグリコシラーゼ（Ｍ）、Ｎ－アセチル－ムラミダーゼ（リゾチーム）、Ｎ－アセチル－グルコサミニダーゼ（リゾチーム）または例えばＫＺ１４４エンドリシンなどのトランスグリコシラーゼ。エンドリシンによっては、この活性は個々の「酵素的に活性のあるドメイン」（ＥＡＤ）の中に現れる。加えて、エンドリシンにはまた、酵素的に不活性な領域であって、宿主細菌の細胞壁に結合する、いわゆるＣＢＤ（細胞壁結合ドメイン）を含むことができる。「エンドリシン」という用語にはまた、天然由来のエンドリシンに修飾、および／または、改変が加わる酵素も含まれる。このような改変および／または修飾には、欠失、挿入および付加などの変異、これらの置換もしくは組み合わせ、および／または、アミノ酸残基の化学的変化が含まれる場合がある。特に好ましい化学的変化は、ビオチン化、アセチル化、ペグ化などの化学的変化、アミノ基、ＳＨ基、もしくはカルボキシル基の化学的変化である。上記エンドリシンは、一般的なレベルでそれぞれの野生型エンドリシンの溶解活性を呈する。しかしながら、この活性は、それぞれの野生型エンドリシンの活性と同一であるか、より高いか、またはより低い場合がある。この活性は、例えば、それぞれの野生型エンドリシンの活性の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、または少なくとも約２００％、またはさらにそれ以上であり得る。当該活性は当技術分野で当業者に周知であるアッセイ、例えば、非特許文献２または非特許文献３（何れも本明細書に参照により取り込まれる）または同様の刊行物に記載されている、例えばプレート溶解アッセイまたは液体溶解アッセイなどを用いて測定することができる。

【0016】

「グラム陰性エンドリシン」との用語は、グラム陰性細菌をターゲットとするバクテリオファージに由来するエンドリシンを指す。これらエンドリシンは、それぞれの（宿主）細菌のペプチドグリカンを分解することができる。

【0017】

本明細書で使用される「モジュール型」エンドリシンは、少なくとも２つの異なる機能的ドメイン、具体的には少なくとも１つの「酵素学的活性ドメイン」（ＥＡＤ）および少なくとも１つの細胞壁結合ドメイン（ＣＢＤ）、を示すエンドリシンである。前者が実際の酵素活性を提供するのに対して、後者は標的結合を提供する。ドメインの性質に応じて、これら２つの活性を互いに分けることができる。明確なＣＢＤのないエンドリシンは「モジュール型エンドリシン」の用語に含まれない。

【0018】

「バクテリオファージ尾部／基盤タンパク質」は当業者に一般的に理解されている通りである。尾部タンパク質および基盤タンパク質は、バクテリオファージのタンパク質である。バクテリオファージの尾繊維および／または基盤に位置する結合構造は、ファージゲノムを宿主細胞に注入することを助ける上で重要な役割を果たす。尾繊維タンパク質は尾部の先端に位置しており、潜在的な宿主細菌を認識し、その表面に取りつくことによって、細胞表面に結合するための機能を有する。基盤タンパク質は遺伝物質の移動を調節しており、また結合機能を有する場合もある。特にグラム陰性菌のミオウイルス（Ｔ４ファージやＰ２ファージなど）については、ＬｙｓＭのようなペプチドグリカン結合ドメインに相同性を示す様々なモチーフが現れている。また別の例としては、ＩＣＰ１ビブリオファージのｇｐ５およびMethylobactersp.などの様々な種に注入するファージのゲノムにエンコードされている関連タンパク質である。これらはペプチドグリカン結合ドメインと、宿主菌のムレイン層を分解できる酵素活性ドメインとから構成される。

【0019】

本明細書において使用される「抗微生物ペプチド」（ＡＭＰ）という用語は好ましくは、例えば、細菌、ウイルス、真菌、酵母、マイコプラズマ、および原生動物に対して殺微生物活性および／または静微生物（microbistatic）活性を有する、あらゆるペプチドを指す。実施形態によっては、本ペプチドは天然由来である。別の実施形態では、本ペプチドは天然由来でない人工ペプチドである。例えば、抗微生物パプチドは天然由来のペプチドが変異したものとすることができる。本明細書において使用される「抗微生物ペプチド」という用語は、とりわけ、抗細菌、抗真菌、抗糸状菌、抗寄生生物、抗原生動物、抗ウイルス、抗感染性、抗伝染性、および／または殺菌、殺藻、殺アメーバ、殺微生物、殺細菌、殺真菌、殺寄生生物、殺原生動物、殺原虫特性を有するあらゆるペプチドを指す。抗細菌ペプチドが、好ましい。抗微生物ペプチドは、ＲＮアーゼＡスーパーファミリーのメンバー、デフェンシン、カテリシジン、グラニュライシン、ヒスタチン、ソリアシン（psoriasin）、ダームシジン、またはヘプシジンであり得る。抗微生物ペプチドは、昆虫、魚、植物、クモ形類動物、脊椎動物、または哺乳動物に天然に存在し得る。好ましくは、抗微生物ペプチドは、ラディッシュ、カイコガ、コモリグモ、カエル、好ましくはアフリカツメガエル（Xenopus laevis）、アカガエル属のカエル、より好ましくはウシガエル（Rana catesbeiana）、ヒキガエル、好ましくはアジアヒキガエル（Bufo gargarizans）、ハエ、好ましくはショウジョウバエ属（Drosophila）、より好ましくはキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）、ネッタイシマカ（Aedes aegypti）、ミツバチ、マルハナバチ（bumblebee）、好ましくはマルハナバチ（Bombus pascuorum）、ニクバエ、好ましくはセンチニクバエ（Sarcophaga peregrine）、サソリ、カブトガニ、ナマズ（catfish）、好ましくはマナマズ（Parasilurus asotus）、雌牛、豚（pig）、ヒツジ、ブタ（porcine）、ウシ、サル、およびヒトに天然に存在し得る。本明細書では、「抗微生物ペプチド」（ＡＭＰ）は、とりわけ、カチオン性ペプチド、ポリカチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、スシペプチド、デフェンシン、および疎水性ペプチドではないものの抗微生物活性を示すペプチドとすることもできる。抗微生物ペプチドの例は、ネブラスカ大学メディカルセンター（米国ネブラスカ州オマハ；http:// aps.unmc.edu/AP/main.php）の「抗微生物ペプチドデータベース（Antimicrobial Peptide Database）」で検索可能である。

【0020】

本明細書において使用される「両親媒性ペプチド」という用語は、親水性官能基および疎水性官能基の両方を有する合成ペプチドを指す。好ましくは、本明細書において使用される「両親媒性ペプチド」という用語は、親水性基および疎水性基の規定された配置を有するペプチドを指す。

【0021】

本明細書で使用される「カチオン性ペプチド」という用語は、正に荷電したアミノ酸残基を有するペプチドを指す。好ましくは、カチオン性ペプチドは、９．０またはそれより大きいｐＫａ値を有する。通常は、カチオン性ペプチドのアミノ酸残基のうちの少なくとも４個が、正に荷電することができ、例えば、リシンまたはアルギニンであり得る。「正に荷電した」とは、アミノ酸残基の側鎖がほぼ生理学的条件で正味の正電荷を有することを指す。本明細書において使用される「カチオン性ペプチド」という用語はまた、ポリカチオン性ペプチドも指すが、例えば、２０％未満、好ましくは１０％未満の正に荷電したアミノ酸残基を含むカチオン性ペプチドもまた含む。

【0022】

本明細書において使用される「ポリカチオン性ペプチド」という用語は、大部分が正に荷電したアミノ酸残基、とりわけリシンおよび／またはアルギニン残基で構成されているペプチドを指す。アミノ酸残基の少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または約１００％が、正に荷電したアミノ酸残基、とりわけリシンおよび／またはアルギニン残基である場合に、ペプチドは、大部分が正に荷電したアミノ酸残基で構成されている。正に荷電したアミノ酸残基ではないアミノ酸残基は、中性の電荷のアミノ酸残基、および／または負に荷電したアミノ酸残基、および／または疎水性アミノ酸残基であり得る。好ましくは、正に荷電したアミノ酸残基ではないアミノ酸残基は、中性の電荷のアミノ酸残基、とりわけセリンおよび／またはグリシンである。

【0023】

本明細書において使用される「スシペプチド」という用語は、短いコンセンサスリピートを有する補体制御タンパク質（ＣＣＰ）を指す。スシペプチドのスシモジュールは、多くの異なるタンパク質においてタンパク質－タンパク質相互作用ドメインとして機能する。スシドメインを含有するペプチドは、抗微生物活性を有することが示されている。好ましくは、スシペプチドは、天然に存在するペプチドである。

【0024】

本明細書において使用される「デフェンシン」という用語は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト内に存在するペプチドを指し、デフェンシンは、感染性細菌および／または感染性ウイルスおよび／または真菌などの、外来性物質の破壊システムとしての自然宿主防御系において役割を果たす。デフェンシンは、抗体でない殺微生物、および／または、殺腫瘍性のタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドである。「デフェンシン」の例は、「哺乳動物デフェンシン」、α－デフェンシン、β－デフェンシン、インドリシジン、およびマガイニンである。本明細書において使用される「デフェンシン」という用語は、動物細胞から単離された形態、または合成的に産生された形態の両方を指し、かつまた、それらの親タンパク質の細胞傷害活性を実質的に保持するが、その配列が１つまたは複数のアミノ酸残基の挿入または欠失によって変更されている変異体も指す。

【0025】

本明細書で「タグ」という用語は、当技術分野において典型的に、ａ）アミノ酸配列もしくはポリペプチド全体の発現を改善する、ｂ）アミノ酸配列もしくはポリペプチド全体の精製を容易にする、ｃ）アミノ酸配列もしくはポリペプチド全体の固定化を容易にする、および／またはｄ）アミノ酸配列もしくはポリペプチド全体の検出を容易にするために、別のアミノ酸配列に融合されるかまたはそれに含まれる、アミノ酸配列を指す。タグの例は、Ｈｉｓ５－タグ、Ｈｉｓ６－タグ、Ｈｉｓ７－タグ、Ｈｉｓ８－タグ、Ｈｉｓ９－タグ、Ｈｉｓ１０－タグ、Ｈｉｓ１１－タグ、Ｈｉｓ１２－タグ、Ｈｉｓ１６－タグ、およびＨｉｓ２０－タグなどのＨｉｓタグ、Ｓｔｒｅｐ－タグ、Ａｖｉ－タグ、Ｍｙｃ－タグ、ＧＳＴ－タグ、ＪＳ－タグ、システイン－タグ、ＦＬＡＧ－タグ、ＨＡ－タグ、チオレドキシン、またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ＣＡＴ、ＧＦＰ、ＹＦＰなどである。当業者は、様々な技術的応用に適する莫大な数のタグを知っているであろう。タグは、例えば、そのようなタグ付加されたポリペプチドを、例えば、様々なＥＬＩＳＡアッセイ形式における抗体結合または他の技術的応用に適するようにさせることができる。

【0026】

本明細書において、「～％の配列同一性」とは以下の通りに理解される。つまり、比較される２つの配列を並べて、配列同士に最大の相関関係が得られるようにする。これには一方または両方の配列に「ギャップ」を挿入することで、アライメントの大きさを高めることが含まれる場合がある。配列同一性％はその後、比較される配列の各々の全長にわたって決定（グローバルアラインメントと呼ばれる）してもよく、これは同じ又は類似する長さの配列に対して特に好適であり、あるいは短い所定の長さにわたって決定（ローカルアラインメントと呼ばれる）することができて、これは長さが異なる配列に対してより好適である。この意味で、クエリーアミノ酸配列に対して例えば少なくとも９５％の「配列同一性」を有するアミノ酸配列は、クエリーアミノ酸配列に含まれる１００個のアミノ酸に対して、対象となるアミノ酸配列に最大で５回のアミノ酸改変が含まれていることを除いて、対象となるアミノ酸配列の配列がクエリー配列と同一であることを意図している。言い換えると、クエリーアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する配列を持つアミノ酸配列を得るためには、対象となる配列に最大で５％（１００のうち５）のアミノ酸残基を挿入するか、他のアミノ酸で置換するか、または欠失させることができる。２以上の配列の同一性および相同性を比較する方法は、当技術分野で周知の通りである。２つの配列の同一性の割合は、数学的アルゴリズムなどを利用することで判断可能である。限定されわけではないが、利用可能な好ましい数学的アルゴリズムの例としては、カーリン（Kerlin）らのアルゴリズム（（１９９３)、PNASUSA、９０:５８７３-５８７７）がある。このようなアルゴリズムはＢＬＡＳＴファミリーのプログラム、例えばＢＬＡＳＴまたはＮＢＬＡＳＴのプログラムに組み込まれており（非特許文献４または非特許文献５を参照のこと）、ＮＣＢＬのホームページ（ワールド・ワイド・ウェブサイト「ncbi.nlm.nih.gov」）からアクセス可能であって、またＦＡＳＴＡ（非特許文献６）にも組み込まれている。他の配列に対してある程度の同一性を有する配列は、これらのプログラムを用いて同定することができる。さらに、ウィスコンシン配列分析パッケージ（Wisconsin Sequence Analysis Package）のバージョン９．１で利用可能なプログラム（非特許文献７）、例えばＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰのプログラムを利用することで２つのポリペプチド配列の同一性％を判断することができる。ＢＥＳＴＦＩＴは非特許文献８の「局所ホモロジー」アルゴリズムを利用し、２つの配列の中で最も類似する単一領域を見出す。本明細書において、参照配列と特定の長さの配列同一性を共有するアミノ酸配列について言及される場合、配列における上記の違いは、好ましくは保存的アミノ酸置換から生じるものである。好ましくは、そのような配列は、例えば、たとえより遅い速度であたっとしても、参照配列の活性を保持している。さらに本明細書において一定割合の配列同一性を「少なくとも」有する配列について言及されている場合には、１００％の配列同一性は、好ましくは含まれない。

【0027】

本明細書において使用される「含む」という用語は、「からなる」（すなわち、追加的な他のものの存在を排除する）の意味に限定されると解釈されることはない。むしろ、「含む」とは、任意で追加的なものが存在し得ることを暗示する。「含む」という用語は、その範囲内に入る特に構想される態様として、「からなる」（すなわち、追加的な他のものの存在を排除する）および「含むがそれからならない」（すなわち、追加的な他のものの存在を必要とする）を包含し、前者がより好ましい。

【0028】

本明細書で使用される場合、単語「a」又は「an」の使用は「１つ」を意味する場合があるが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」及び「１または１より大きい」の意味ともまた一致する。

【0029】

本発明は、一態様において、グラム陰性エンドリシンと、抗微生物ペプチド、両親媒性ペプチド、カチオン性ペプチド、疎水性ペプチド、スシペプチド、またはデフェンシンからなる群から選択されるペプチドと、を含むポリペプチドに関し、前記エンドリシンはさらに、配列番号１に係る配列を含むことを特徴とし、ただし好ましくはさらに、
ａ）前記ポリペプチドは配列番号３、配列番号４、および配列番号５の配列を何れも含まず、
ｂ）前記エンドリシンは、エロモナスファージＡｅｈ１のＡｅｈ１ｐ３３９（例えば、ＮＰ＿９４４２１７．１）でも、腸内細菌（Enterobacteria）ファージＪＳ９８のＥｐＪＳ９８＿ｇｐ１１６（例えば、ＹＰ＿００１５９５２４５．１））でもなく、
ｃ）前記ポリペプチドが配列番号６の配列を含んでいる場合には、前記ペプチドが、抗微生物ペプチド、両親媒性ペプチド、スシペプチド、またはデフェンシンからなる群から選択され、
ｄ）前記エンドリシンが下記の配列：

【表A】

からなる群から選択される配列、またはこれらに対応した配列であって、単にＮ末端メチオニンをさらに欠失している配列、を有する場合には、前記ポリペプチドは、ｉ）モジュール型グラム陰性エンドリシン、またはｉｉ）バクテリオファージ尾部／基盤タンパク質、の細胞壁結合ドメインを含まず、
ｅ）前記エンドリシンが下記のアミノ酸２－１６４に係る配列：

【表B】

を有する場合には、前記ポリペプチドは、ｉ）モジュール型グラム陰性エンドリシン、またはｉｉ）バクテリオファージ尾部／基盤タンパク質、の細胞壁結合ドメインを含まず、
ｆ）前記エンドリシンが下記のアミノ酸２－１６５に係る配列：

【表C】

を有する場合には、前記ポリペプチドは、ｉ）モジュール型グラム陰性エンドリシン、またはｉｉ）バクテリオファージ尾部／基盤タンパク質、の細胞壁結合ドメインを含まず、
ｇ）前記エンドリシンが下記のアミノ酸２－１６１に係る配列：

【表D】

を有する場合には、前記ポリペプチドは、ｉ）モジュール型グラム陰性エンドリシン、またはｉｉ）バクテリオファージ尾部／基盤タンパク質、の細胞壁結合ドメインを含まない。

【0030】

第２の態様において、本発明は、グラム陰性エンドリシンと、抗微生物ペプチド、両親媒性ペプチド、カチオン性ペプチド、疎水性ペプチド、スシペプチド、またはデフェンシンからなる群から選択されるペプチドと、を含むポリペプチドに関し、前記エンドリシンは配列番号２に係る配列を含み（特に配列番号７に係る配列を含む）、ただし好ましくはさらに、
ａ）前記ポリペプチドは配列番号３、配列番号４、および配列番号５の配列を何れも含まず、
ｂ）前記エンドリシンは腸内細菌（Enterobacteria）ファージＪＳ９８のＥｐＪＳ９８＿ｇｐ１１６（例えば、ＹＰ＿００１５９５２４５．１）ではなく、
ｃ）前記ポリペプチドが配列番号６の配列を含んでいる場合には、前記ペプチドが、抗微生物ペプチド、両親媒性ペプチド、スシペプチド、またはデフェンシンからなる群から選択され、
ｄ）前記エンドリシンが下記の配列からなる群から選択される配列：

【表E】

またはこれらに対応した配列であって、単にＮ末端メチオニンをさらに欠失している配列、を有する場合には、前記ポリペプチドは、ｉ）モジュール型グラム陰性エンドリシン、またはｉｉ）バクテリオファージ尾部／基盤タンパク質、の細胞壁結合ドメインを含まず、
ｅ）前記エンドリシンが下記のアミノ酸２－１６４に係る配列：

【表F】

を有する場合には、前記ポリペプチドは、ｉ）モジュール型グラム陰性エンドリシン、またはｉｉ）バクテリオファージ尾部／基盤タンパク質、の細胞壁結合ドメインを含まず、

ｆ）前記エンドリシンが下記のアミノ酸２－１６１に係る配列：

【表G】

を有する場合には、前記ポリペプチドは、ｉ）モジュール型グラム陰性エンドリシン、またはｉｉ）バクテリオファージ尾部／基盤タンパク質、の細胞壁結合ドメインを含まない、
ことを特徴とする。

【0031】

第３の態様において、本発明は、グラム陰性エンドリシンと、抗微生物ペプチド、両親媒性ペプチド、カチオン性ペプチド、疎水性ペプチド、スシペプチド、またはデフェンシンからなる群から選択されるペプチドと、を含むポリペプチドに関し、前記エンドリシンは配列番号１に係る配列を含み、前記エンドリシンは配列の中にヒスチジンを一切含まず、ただし好ましくはさらに、
ａ）前記エンドリシンはエロモナスファージＡｅｈ１のＡｅｈ１ｐ３３９ではなく、
ｂ）前記エンドリシンが下記の配列：

【表H】

からなる群から選択される配列、またはこれらに対応した配列であって、単にＮ末端メチオニンをさらに欠失している配列、を有する場合には、前記ポリペプチドは、ｉ）モジュール型グラム陰性エンドリシン、またはｉｉ）バクテリオファージ尾部／基盤タンパク質、の細胞壁結合ドメインを含まず、
ｃ）前記エンドリシンが下記のアミノ酸２－１６５に係る配列：

【表I】

を有する場合には、前記ポリペプチドは、ｉ）モジュール型グラム陰性エンドリシン、またはｉｉ）バクテリオファージ尾部／基盤タンパク質、の細胞壁結合ドメインを含まないことを特徴とする。

【0032】

エンドリシン配列にシステイン残基が一切存在しないことは、野生型のエンドリシンにこの種のシステイン残基が含まれていなかったか、または野生型の配列に存在する何らかのシステイン残基が、例えば安定性を向上させて凝集を低減させるために、人工的に修飾／変異されている（例えば、Ｃ→Ｓ、またはＣ→ＡまたはＣ→Ｇ、好ましくはＣ→Ｓ）ためである可能性がある。

【0033】

第４の態様において、本発明は、グラム陰性エンドリシンと、抗微生物ペプチド、両親媒性ペプチド、カチオン性ペプチド、疎水性ペプチド、スシペプチド、またはデフェンシンからなる群から選択されるペプチドと、を含むポリペプチドに関し、前記エンドリシンはさらに配列番号２に係る配列を含むエンドリシン（特に配列番号７に係る配列を含む）であって、前記エンドリシンは配列の中にヒスチジンを一切含まず、ただし好ましくはさらに、
前記エンドリシンが下記の配列からなる群から選択される配列、またはこれらに対応した配列であって、単にＮ末端メチオニンをさらに欠失している配列、を有する場合には、前記ポリペプチドは、ｉ）モジュール型グラム陰性エンドリシン、またはｉｉ）バクテリオファージ尾部／基盤タンパク質、の細胞壁結合ドメインを含まないことを特徴とする。

【表J】

【0034】

エンドリシン配列にシステイン残基が一切存在しないことは、この場合においても、野生型のエンドリシンにこの種のシステイン残基が含まれていなかったか、または野生型の配列に存在するシステイン残基が、例えば安定性を向上させて凝集を低減させるために、人工的に修飾／変異されている（例えば、Ｃ→Ｓ、またはＣ→ＡまたはＣ→Ｇ、好ましくはＣ→Ｓ）ためである。

【0035】

第５の態様において、本発明は、グラム陰性エンドリシンと、抗微生物ペプチド、両親媒性ペプチド、カチオン性ペプチド、スシペプチド、またはデフェンシンからなる群から選択されるペプチドと、を含むポリペプチドに関し、前記エンドリシンがさらに配列番号１に係る配列を含むエンドリシンであって、前記ペプチドは前記ポリペプチドの中でエンドリシンのＮ末端側に配置されており（例えば、エンドリシンがポリペプチドの最もＣ末端側の成分を構成している実施形態において）、また好ましくは、ただし前記ポリペプチドは配列番号４に係る配列も配列番号５に係る配列も含まないことを特徴とする。

【0036】

第６の態様において、本発明は、グラム陰性エンドリシンと、抗微生物ペプチド、両親媒性ペプチド、カチオン性ペプチド、スシペプチド、またはデフェンシンからなる群から選択されるペプチドと、を含むポリペプチドに関し、前記エンドリシンがさらに配列番号２に係る配列を含む（特に配列番号７に係る配列を含む）エンドリシンであって、前記ペプチドは前記ポリペプチドの中でエンドリシンのＮ末端側に配置されており（例えば、エンドリシンがポリペプチドの最もＣ末端側の成分を構成している実施形態において）、好ましくはただし、前記ポリペプチドは配列番号４に係る配列も配列番号５に係る配列も含まないことを特徴とする。

【0037】

以下、本発明に係るポリペプチドをより詳細に説明する（これは当面、本発明の第１、第２、第３、第４、第５、および第６の態様とは関係ない）。特に明記しないかぎり、以下に記載事項は上記６つの態様に平等に当てはまるものと理解される。

【0038】

本発明のポリペプチドのエンドリシン成分には、配列番号１または配列番号２に係る配列が含まれる（特に配列番号７に係る配列を含む）。
配列番号１は１３アミノ酸長で配列Ｘ_１ＮＲＡＸ_２ＲＶＸ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８を有しており、但し、Ｘ_１はＰまたはＴである場合があり、Ｘ_２はＫ、Ｍ、ＮまたはＱである場合があり、Ｘ_３はＡ、ＩまたはＴである場合があり、Ｘ_４はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｑ、Ｓ、またはＴである場合があり、Ｘ_５はＴまたはＶである場合があり、Ｘ_６はＦ、Ｉ、ＬまたはＶである場合があり、Ｘ_７はＥ、Ｋ、ＬまたはＲである場合があり、Ｘ_８はＬまたはＴである場合がある。配列番号７もまた１３アミノ酸長で、配列Ｘ_１ＮＲＡＫＲＶＸ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７を有しており、ここでＸ_１はＰまたはＴである場合があり、Ｘ_２はＡ、ＩまたはＴである場合があり、Ｘ_３はＡ、Ｄ、Ｅ、またはＳである場合があり、Ｘ_４はＴまたはＶである場合があり、Ｘ_５はＦ、Ｉ、またはＬである場合があり、Ｘ_６はＥ、ＫまたはＲである場合があり、Ｘ_７はＬまたはＴである場合がある。エンドリシンは配列の中に配列要素が自然に表れる天然由来のエンドリシンであるか、または修飾された（つまり天然由来ではない）エンドリシンがこの配列に表れるもの（例えば、天然由来のエンドリシンから得られたエンドリシンであるが、例えば、活性、安定性、発現性を高めるため、クローニングの理由、等から変異、トランケーション、等により修飾されたエンドリシンなど）とすることができる。いずれにせよ、配列番号１に係る配列（または配列番号２もしくは配列番号７）は、エンドリシンの不可欠な部分である。これに対して、「配列番号１（またはそれぞれ配列番号２もしくは配列番号７）に係る配列を含むエンドリシン」は、好ましくは、配列番号１（またはそれぞれ配列番号２もしくは配列番号７）を含む配列要素が他の全く関係のないエンドリシンまたはＥＡＤに人工的に融合する、という状況を網羅したものを意図したものではない。言い換えると、配列番号１（またはそれぞれ配列番号２もしくは配列番号７）に係る配列は実際のエンドリシンにとって、異種のものではない。配列番号１（配列番号７も同様）は変化可能な位置を表すコンセンサス配列である。通常は、配列番号１（または配列番号７）は、エンドリシン配列のＣ末端部に見出され、例えばエンドリシン配列のＣ末端部における最後の４０アミノ酸、最後の３０アミノ酸、または最後の２５アミノ酸の範囲内に見出される。配列番号１に係るコンセンサス配列の好ましい形態は配列番号８である。より好ましい形態は配列番号９である。同様に、特に好ましい配列番号１の形態は、配列番号１０および配列番号１１である。配列番号１は配列番号１２、配列番号１３または配列番号１４の形態をとることもできる。しかし、好ましい実施形態において、本ポリペプチドに、配列番号１２、配列番号１３、および／または配列番号１４は含まれない。配列番号１および配列番号７の特に好ましい例としては、それぞれ、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０が挙げられる。グラム陰性菌に感染しているファージから得られるエンドリシンは、即ちグラム陰性エンドリシンである。配列番号１（またはそれぞれ配列番号２もしくは配列番号７）に係る配列を含むエンドリシンの例としては、例えば、シトロバクター・コセリファージＣｋＰ１（配列番号２１）、腸内細菌ファージＣＣ３１（配列番号２２）、セラチアファージＣＨＩ１４（配列番号２３）、エロモナスファージＡｈ１（配列番号２４）、セラチアファージＰＳ２（配列番号２５）、およびエロモナスファージＡＳ－ｓｚｗ（配列番号２６）、に関するエンドリシン；もしくは、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、および配列番号２６に対して、それぞれ、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９６％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９７％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むエンドリシンが挙げられる。特に好ましいものは、配列番号２１および／または配列番号２２に対して、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９６％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９７％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列である。本発明のポリペプチドに使用される他の好適なエンドリシンは、Ｔ４エンドリシンの誘導体であって、例えば配列番号２７に係る配列、または配列番号２７に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９６％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９７％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列である（配列番号３に関する上記の条件が課される）。例えば、これらエンドリシンが改変されたものとして、システインがセリン等で置換されたもの（例えばそれぞれＣ５４ＳまたはＣ１２２Ｓ）、および／または、Ｎ末端メチオニンが欠失しているものは、本発明のポリペプチドの成分として使用されるエンドリシンの好ましい形態である（例えば、上記ディスクレーマーが適応された配列番号６、ならびに配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、および配列番号３６が参照され、これらは特に好ましい実施形態である。）特に好ましいエンドリシン配列はしたがって、配列番号６（上記条件が適応される）、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、および配列番号３６であるか、あるいは、配列番号６（上記条件が適応される）、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、および／または、配列番号３６に対して、特に配列番号２８、および／または配列番号３０に対して、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９６％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９７％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列である。

【0039】

好適なエンドリシン成分の他の例（特に、本発明の第１、第３および第５の態様に関するものであって、常に上記の条件が課されるが、これらに限られるものではない）を下記の表１に列挙した。

【表1】

【0040】

表１のエンドリシンの配列は、例えばアメリカ国立生物工学情報センター(NCBI：インターネット：ＵＲＬ：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)のタンパク質データベースからアクセスすることができる。表１に列挙されたエンドリシンの配列は、修飾されている場合があり、例えば、対応する核酸配列におけるさらなる開始コドンを回避するために、Ｎ末端メチオニンを欠く場合があることが理解される。そのような僅かに修飾された配列を使用することも本発明の範囲内であり、本明細書で表１のエンドリシンを参照すると、そのような修飾エンドリシンも前記定義に含まれることが理解される。さらに本発明者らはまた、表１の配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９６％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９７％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示すエンドリシンもまた、本発明を実施するために使用することができると考えている。

【0041】

本明細書で、例えば、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２７、配列番号２８または配列番号３０に対して、それぞれ一定レベルの配列同一性を有すると記載されている全ての配列は、配列番号１（または配列番号２もしくは配列番号７）に係る配列を保持している必要があり、つまり配列の変異は配列番号１（またはそれぞれ配列番号２もしくは配列番号７）の外側にあり、配列番号１（またはそれぞれ配列番号２もしくは配列番号７）のモチーフに対応する配列の中にはない。

【0042】

上記の通り、約１０年の間に、エンドリシンが抗微生物ペプチド、両親媒製ペプチド、またはカチオン性ペプチド、等と融合すると、外部から添加した場合でも、それぞれのグラム陰性エンドリシンを用いてグラム陰性菌を死滅させることができることが実証された。（例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、または特許文献５を参照のこと。これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。）以下、本発明のポリペプチド中のこのペプチドのことを「ペプチド成分」とも呼ぶこととする。本明細書において、このペプチド成分は慣習的なタグではないことと理解され、Ｈｉｓ５－タグ、Ｈｉｓ６－タグ、Ｈｉｓ７－タグ、Ｈｉｓ８－タグ、Ｈｉｓ９－タグ、Ｈｉｓ１０－タグ、Ｈｉｓ１１－タグ、Ｈｉｓ１２－タグ、Ｈｉｓ１６－タグ、およびＨｉｓ２０－タグなどのＨｉｓ－タグ、Ｓｔｒｅｐ－タグ、Ａｖｉ－タグ、Ｍｙｃ－タグ、Ｇｓｔ－タグ、ＪＳ－タグ、システイン－タグ、ＦＬＡＧ－タグ、もしくは当技術分野において公知である他のタグ、チオレドキシン、またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）のような慣習的なタグではない。

【0043】

好ましいカチオン性および／またはポリカチオン性ペプチドは、配列番号３７（ＫＲＫＫＲＫ）による少なくとも１つのモチーフを含んでいる。特に少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６または１７個の、配列番号３７（ＫＲＫＫＲＫ）のモチーフを含むカチオン性アミノ酸配列ストレッチが特に好ましい。より好ましくは、少なくとも１つのＫＲＫモチーフ（ｌｙｓ－ａｒｇ－ｌｙｓ）、好ましくは少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個または３３個のＫＲＫモチーフを含むカチオン性ペプチドストレッチである。

【0044】

本発明の別の好ましい実施形態では、カチオン性ペプチドは、正に荷電したアミノ酸残基、特にリジン及び／又はアルギニン残基、中性に荷電したアミノ酸残基、特にグリシン及び／又はセリン残基をそばに含む。好ましくは約７０％～約１００％、又は約８０％～約９５％、又は約８５％～約９０％の正に荷電したアミノ酸残基、特にリジン、アルギニン及び／又はヒスチジン残基、より好ましくはリジン及び／又はアルギニン残基から構成されるカチオン性アミノ酸配列ストレッチであり、また約０％～約３０％、又は約５％～約２０％、又は約１０％～約２０％の中性に荷電したアミノ酸残基、特にグリシン及び／又はセリン残基である。好ましくは約４％～約８％のセリン残基、約３３％～約３６％のアルギニン残基、及び約５６％～約６３％のリジン残基から構成されるアミノ酸配列ストレッチである。特に好ましくは、少なくとも１つの配列番号３８（ＫＲＸＫＲ）のモチーフを含むアミノ酸配列ストレッチであり、式中、Ｘはリジン、アルギニン及びヒスチジン以外の任意のアミノ酸である。特に好ましくは、少なくとも１つの配列番号３９（ＫＲＳＫＲ）のモチーフを含むポリペプチドストレッチである。より好ましくは、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９個又は少なくとも約２０個の配列番号３８（ＫＲＸＫＲ）又は配列番号３９（ＫＲＳＫＲ）のモチーフを含むカチオン性ストレッチである。

【0045】

また、好ましくは約９～約１６％のグリシン残基、約４～約１１％のセリン残基、約２６～約３２％のアルギニン残基、及び約４７～約５５％のリジン残基から構成されるアミノ酸配列ストレッチである。特に好ましくは、少なくとも１つの配列番号４０（ＫＲＧＳＧ）のモチーフを含むアミノ酸配列ストレッチである。より好ましくは、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９個又は少なくとも約２０個の配列番号４０（ＫＲＧＳＧ）のモチーフを含むカチオン性ストレッチである。

【0046】

本発明の別の好ましい実施形態では、そのようなカチオン性アミノ酸配列ストレッチは、正に荷電したアミノ酸残基、特にリジン及び／又はアルギニン残基、疎水性アミノ酸残基、特にバリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、アラニン、チロシン、プロリン及びグリシン残基、より好ましくはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン及び／又はトリプトファン残基をそばに含む。好ましいものは、約７０％～約１００％、又は約８０％～約９５％、又は約８５％～約９０％の正に荷電したアミノ酸残基、特にリジン及び／又はアルギニン残基、及び約０％～約３０％、又は約５％～約２０％、又は約１０％～約２０％の疎水性アミノ酸残基、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、アラニン、チロシン、プロリン及びグリシン残基、より好ましくはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン及び／又はトリプトファン残基、から構成されるカチオン性アミノ酸配列ストレッチである。カチオン性及びポリカチオン性アミノ酸配列ストレッチの例が次の表にリストされる。

【表2】

【0047】

発明のさらなる態様において、ペプチドは抗菌ペプチドであって、正の正味電荷と約５０％の疎水性アミノ酸を含む。当該抗菌ペプチドは両親媒性であって、長さが約１２～約５０のアミノ酸残基を有する。抗微生物ペプチドは、昆虫、魚、植物、クモ形類動物、脊椎動物、または哺乳動物に天然に存在し得る。好ましくは、抗菌ペプチドは、昆虫、魚、植物、クモ類、脊椎動物又は哺乳動物に天然に存在するものである場合がある。好ましくは、抗菌ペプチドは、ラディッシュ、カイコ蛾、コモリクモ、カエル好ましくはアフリカツメガエル、ラナカエルより好ましくはラナ・カテスビーアナ、ヒキガエル好ましくはアジアのヒキガエル・ブフォ・ブフォ・ガルガリザンス、ハエ好ましくはショウジョウバエより好ましくはキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）、ネッタイシマカ、ミツバチ、マルハナバチ好ましくはボンバスパスキュラム、ニクバエ好ましくはサルコガガペレグリン、サソリ、カブトガニ、ナマズ、好ましくはマナマズ、ウシ（cow）、ブタ（pig）、ヒツジ、ブタ（porcine）、ウシ（bovine）、サル及びヒトにおいて天然に存在する場合がある。

【0048】

本発明の別の好ましい実施形態では、抗菌性アミノ酸配列ストレッチは、約１０％～約３５％、又は約１５％～約４５％、又は約２０％～約４５％の正に荷電したアミノ酸残基、特にリジン及び／又はアルギニン残基、及び約５０％～約８０％、又は約６０％～約８０％、又は約５５％～約７５％、又は約７０％～約９０％の疎水性アミノ酸残基、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、アラニン、チロシン、プロリン及びグリシン残基、より好ましくはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン及び／又はトリプトファン残基、から構成される。

【0049】

本発明の別の好ましい実施形態では、抗微生物ペプチドは、約４％～約５８％の正に荷電したアミノ酸残基、特にリジン及び／又はアルギニン残基、及び約３３％～約８９％の疎水性アミノ酸残基、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、アラニン、チロシン、プロリン及びグリシン残基、より好ましくはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン及び／又はトリプトファン残基から構成される。

【0050】

本発明を実施する際に使用することができる抗菌性アミノ酸配列の例が以下の表にリストされる。

【表3-1】

【表3-2】

【0051】

本発明のポリペプチドに使用される特に好ましい抗微生物ペプチドはＳＭＡＰ－２９（配列番号６３）である。

【0052】

さらに殊更好ましい抗微生物ペプチドは配列番号９６および配列番号１０７に係るペプチドである。

【0053】

本発明のさらなる実施形態において、本発明のポリペプチドのポリペプチドは非特許文献９に記載されたスシペプチドである場合がある。特に好ましいのは、配列番号１０８に示されるスシ１ペプチドである。好ましいスシペプチドは、スシペプチドＳ１およびスシペプチドＳ３、ならびにその多数体（multiple）である（非特許文献１０）。

【0054】

本発明のさらなる態様において、ペプチド成分は、リジン、アルギニン及び／又はヒスチジンからなる１つ以上の正に荷電したアミノ酸残基に、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、アラニン、チロシン、プロリン及び／又はグリシンからなる１つ以上の疎水性アミノ酸残基が結合された両親媒性ペプチドである。アミノ酸残基の側鎖は、陽イオン性表面と疎水性表面がペプチドの反対側に集まっているように配向する。好ましくは、前記ペプチド中のアミノ酸の約３０、４０、５０、６０又は７０％超が正に荷電したアミノ酸である。好ましくは、前記ペプチド中のアミノ酸残基の約３０、４０、５０、６０又は７０％超が疎水性アミノ酸残基である。有利には、両親媒性ペプチドは、本発明のポリペプチドのＮ末端（最も好ましい）又はＣ末端に存在する。

【0055】

本発明の別の実施形態では、両親媒性ペプチドは、少なくとも５個、より好ましくは少なくとも６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、又は少なくとも５０個のアミノ酸残基から構成される。好ましい実施形態では、両親媒性ペプチドにおける前記アミノ酸残基の少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０又は７０％がアルギニン又はリジン残基であり、及び／又は前記両親媒性ペプチドのアミノ酸残基の少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０又は７０％は疎水性アミノ酸、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、アラニン、チロシン、プロリン及び／又はグリシン、である。

【0056】

本発明の別の好ましい実施形態では、両親媒性ペプチドストレッチは、正に帯電したアミノ酸残基、特にリジン及び／又はアルギニン残基、疎水性アミノ酸残基、特にバリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、アラニン、チロシン、プロリン及びグリシン残基、より好ましくはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン及び／又はトリプトファン残基を含む。好ましくは、約１０％～約５０％、又は約２０％～約５０％、又は約３０％～約４５％又は約５％～約３０％の正荷電アミノ酸残基、特にリジン及び／又はアルギニン残基、及び約５０％～約８５％、又は約５０％～約９０％、又は約５５％～約９０％、又は約６０％～約９０％、又は約６５％～約９０％の疎水性アミノ酸残基、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、アラニン、チロシン、プロリン及びグリシン残基、より好ましくはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン及び／又はトリプトファン残基、から構成される両親媒性ペプチドストレッチである。別の好ましい実施形態では、両親媒性ペプチドストレッチは、１２％～約５０％の正に荷電したアミノ酸残基、特にリジン及び／又はアルギニン残基、及び約５０％～約８５％の疎水性アミノ酸残基、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、アラニン、チロシン、プロリン及びグリシン残基、より好ましくはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン及び／又はトリプトファン残基、から構成される。

【0057】

好ましい両親媒性ペプチドは、配列番号１０９のアミノ酸配列のＷＬＢＵ２－変異体、及び配列番号１１０のワルマー２（Walmagh ２）である。

【0058】

本発明の特に好ましい実施形態において、（本発明に係るポリペプチド内の）ペプチドには配列モチーフが含まれ、
ｉ）前記配列モチーフは１６アミノ酸長、１７アミノ酸長、１８アミノ酸長、１９アミノ酸長または２０アミノ酸長であって、
ｉｉ）前記配列モチーフは、リシン、アルギニン、ヒスチジンからなる第１のアミノ酸群から選択されるアミノ酸を少なくとも４０％かつ多くとも６０％含み、
各アミノ酸は前記第１のアミノ酸群より独立に選択され、前記第１のアミノ酸群から選択された各アミノ酸は、前記モチーフ内に、単独で配置されるか、前記第１のアミノ酸群から選択された別のアミノ酸と対で一緒に配置されるか、または前記第１のアミノ酸群から選択された別の２つのアミノ酸とのブロックで配置されるが、前記第１のアミノ酸群から選択された３個以上のアミノ酸とのブロックでは生じず、
前記第１のアミノ酸群より選択される少なくとも２対のアミノ酸が、前記配列モチーフ内に存在し、前記第１のアミノ酸群より選択されるアミノ酸の３個を連続して含むブロックが、多くとも１個、前記配列モチーフ内に存在するが、但しさらなる条件として、第１のアミノ酸群の３個のアミノ酸を含むそのようなブロックが前記配列モチーフ内に存在する場合、前記３個のアミノ酸のブロックの最初のアミノ酸に対して、－１２位、－１１位、－８位、－５位、－４位、＋６位、＋７位、＋１０位、＋１３位、および＋１４位のアミノ酸は、それぞれの位置が前記配列モチーフ内に見出され得るならば、前記第１のアミノ酸群より選択されず、
ｉｉｉ）前記配列モチーフが、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる第２のアミノ酸群より選択されるアミノ酸を、少なくとも４０％かつ多くとも６０％含み、
各アミノ酸が第２のアミノ酸群より独立に選択され、
第１のアミノ酸群より選択されるアミノ酸および第２のアミノ酸群より選択されるアミノ酸の合計が前記配列モチーフの１００％となる場合、好ましくは少なくとも３個の異なるアミノ酸がこの第２のアミノ酸群より選択され、
前記配列モチーフが少なくとも２個の単一の非隣接フェニルアラニン残基を含有しており、かつこれらのフェニルアラニン残基のうちの少なくとも１個の直前にリジン残基が存在する場合、前記配列モチーフが配列ＡＦＶを含まず、
前記配列モチーフが少なくとも３個の非隣接ヒスチジン残基を含有する場合、前記配列モチーフが好ましくは配列ＡＡＬＴＨ（配列番号１１１）を含まず、
ｉｖ）前記配列モチーフの残りのアミノ酸は、モチーフ内に存在する場合、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、メチオニン、またはシステインからなる第３のアミノ酸群より選択され、各アミノ酸が前記第３のアミノ酸群より独立に選択され、グルタミンが好ましくは１回のみ選択され得、選択がグルタミンおよびグルタミン酸の組み合わせをさらに含み得ない、ことを特徴とする。

【0059】

前記の（ｉ）～（ｉｖ）において定義された配列モチーフは、本発明のポリペプチドの配列の一部のみを表していてもよく、即ち、本発明のポリペプチドのペプチド成分は、配列モチーフより長くてもよい。あるいは、配列モチーフは、ペプチド成分の配列であってもよく、即ち、本発明のポリペプチドにおけるペプチド成分の配列は、配列モチーフの配列と同一であってもよい。さらに、図２に提供される例から明白であるように、本発明のポリペプチドは、１個または複数個のそのような配列モチーフを含むことが可能である。例えば、２０残基長モチーフは、前記の基準に適合する１６残基長モチーフを本質的に含み得る。従って、本発明のポリペプチドが前記定義の「ある（ａ）」配列モチーフを含むという事実は、本発明のポリペプチドが、「１」個の配列モチーフのみを含み、前記の制限に適合するさらなる（例えば、オーバーラップする）配列モチーフを含み得ないと理解されてはならない。

【0060】

本発明のポリペプチドの配列モチーフは、１６アミノ酸長、１７アミノ酸長、１８アミノ酸長、１９アミノ酸長、または２０アミノ酸長であり得る。好ましくは、配列モチーフは、１７アミノ酸長、１８アミノ酸長、または１９アミノ酸長、さらに好ましくは、１７アミノ酸長または１８アミノ酸長である。

【0061】

本発明のポリペプチドのペプチド成分の配列モチーフは、第１のアミノ酸群より選択されるアミノ酸を、少なくとも４０％かつ多くとも６０％、含む。前記第１のアミノ酸群は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなる。配列モチーフが１６アミノ酸長である場合、それは、この第１のアミノ酸群より選択されるアミノ酸を、少なくとも７個、多くとも９個、示すであろう。配列モチーフが１７アミノ酸長である場合、それは、この第１のアミノ酸群より選択されるアミノ酸を、少なくとも７個、多くとも１０個、示すであろう。配列モチーフが１８アミノ酸長である場合、それは、この第１のアミノ酸群より選択されるアミノ酸を、少なくとも８個、多くとも１０個、示すであろう。配列モチーフが１９アミノ酸長である場合、それは、この第１のアミノ酸群より選択されるアミノ酸を、少なくとも８個、多くとも１１個、示すであろう。配列モチーフが２０アミノ酸長である場合、それは、この第１のアミノ酸群より選択されるアミノ酸を、少なくとも８個、多くとも１２個、示すであろう。

【0062】

この第１のアミノ酸群の中で選択される好ましいアミノ酸は、リジンおよびアルギニンである。好ましくは、配列モチーフは、５０％を超えるヒスチジン残基を含まない。さらに好ましくは、配列モチーフは、２５％を超えるヒスチジン残基を含まない。本発明のいくつかの実施形態において、配列モチーフは、ヒスチジン残基を１個のみ含むか、またはさらには全く含まない。

【0063】

第１のアミノ酸群より選択されるアミノ酸は、独立に選択される。これは、例えば、所定の配列モチーフが、例えば、第１のアミノ酸群より選択されるアミノ酸を８個含む場合、これらの８個のアミノ酸残基の各々が、第１のアミノ酸群からの前または後の選択とは独立に選択され得ることを意味する。従って、選択されたアミノ酸は、３種のアミノ酸（リジン、アルギニン、およびヒスチジン）の全てを含んでいてもよいし、同一（例えば、それぞれ、８個のリジン残基もしくは８個のアルギニン残基）であってもよいし、または３種のアミノ酸のうちの２種のみ（例えば、リジンおよびアルギニン）を含んでいてもよい。同様に、独立の選択は、個々に選択されたアミノ酸の間の特定の比を規定しない。例えば、以下に限定されるわけではないが、この第１のアミノ酸群より選択される８個のアミノ酸は、８個のリジン残基であってもよいし、７個のアルギニン残基および１個のヒスチジン残基であってもよいし、または３個のアルギニン残基、４個のリジン残基、および１個のヒスチジン残基であってもよい。

【0064】

第１のアミノ酸群より選択されるアミノ酸残基の配列モチーフ内の配置は、ある種の制限に従う。この第１のアミノ酸群より選択される各アミノ酸は、単独で、または第１のアミノ酸群より選択されるさらなるアミノ酸と対で、または第１のアミノ酸群より選択される２個のさらなるアミノ酸とのブロックでの、いずれかで、配列モチーフ内に配置され得る。

【0065】

「単独で」とは、第１のアミノ酸群より選択されるアミノ酸、例えばリジン（Ｋ）に、Ｎ末端側においても、Ｃ末端側においても、第１のアミノ酸群からの別のアミノ酸が隣接していないことを意味する。隣接アミノ酸残基は、第２のアミノ酸群、場合によっては、第３のアミノ酸群より選択され得る（例えば、ＬＫＥ、Ｎ－ＫＥ（モチーフのＮ末端）、ＬＫ－Ｃ（モチーフのＣ末端））。注目すべきことに、本発明のポリペプチド内にあるが、配列モチーフ外にある、可能性のあるさらなるアミノ酸は、この位置決定のために考慮されない。従って、配列モチーフの２個の末端のうちの１個にある、第１のアミノ酸群からのアミノ酸は、配列モチーフ外の前（Ｎ末端側）または後（Ｃ末端側）のアミノ酸残基が、偶然、アルギニン残基、ヒスチジン残基、またはリジン残基である場合ですら、単独で配置されていると見なされる。

【0066】

「第１のアミノ酸群より選択されるさらなるアミノ酸と対で」とは、配列モチーフ内で、第１のアミノ酸群より選択されるアミノ酸が、第１のアミノ酸群より選択される別のアミノ酸と直接隣接していることを意味する。従って、この２個のアミノ酸は、第１のアミノ酸群より選択されるアミノ酸の対を形成する。この対は、したがって、第２のアミノ酸群、場合によっては、第３のアミノ酸群からのアミノ酸で、Ｃ末端側およびＮ末端側が、隣接している（例えば、ＬＫＲＥ（配列番号１１２）、Ｎ－ＫＲＥ（モチーフのＮ末端）、ＬＫＲ－Ｃ（モチーフのＣ末端））。本発明のポリペプチド内にあるが、配列モチーフ外にある、可能性のあるさらなるアミノ酸は、この場合にも、この配置決定のために考慮されない。

【0067】

「第１のアミノ酸群より選択される２個のさらなるアミノ酸とのブロックで」とは、第１のアミノ酸群より選択される３個のアミノ酸が相互に直接隣接していることを意味する。そのブロック（またはトリプレット）には、Ｃ末端側およびＮ末端側において、第２のアミノ酸群、場合によっては、第３のアミノ酸群からのアミノ酸が隣接している（例えば、ＬＫＲＫＥ（配列番号１１３）、Ｎ－ＫＲＫＥ（モチーフのＮ末端；配列番号１１４）、ＬＫＲＫ－Ｃ（モチーフのＣ末端；配列番号１１５））。本発明のポリペプチド内にあるが、配列モチーフ外にある、可能性のあるさらなるアミノ酸は、この場合にも、この位置決定のために考慮されない。このように配置されたアミノ酸（トリプレット；第１のアミノ酸群の３個のアミノ酸を含むブロック）については、付加的な位置要件が満たされなければならず、即ち、前記３個のアミノ酸のブロックの最初のアミノ酸に対して、－１２位、－１１位、－８位、－５位、－４位、＋６位、＋７位、＋１０位、＋１３位、および＋１４位のアミノ酸は、それぞれの位置が配列モチーフ内に見出される場合、第１のアミノ酸群より選択されるアミノ酸であってはならない。負の値は、トリプレットの最初のアミノ酸よりＮ末端側の位置を示し；正の値は、トリプレットの最初のアミノ酸よりＣ末端側の位置をさす。位置計算のための基礎は、トリプレットの最初（Ｎ末端側）のアミノ酸である（例えば、トリプレットよりも直接Ｎ末端側のアミノ酸は、－１であり、トリプレットよりも直接Ｃ末端側のアミノ酸は、＋３であろう）。従ってこの制限は、ＲＲＲＧＬＲＨ（配列番号１１６）のような配列を排除するが、＋６位（Ｈ）が第１のアミノ酸群のアミノ酸であるためである。それぞれの位置（－１２、－１１、－８、－５、－４、＋６、＋７、＋１０、＋１３、および＋１４）が配列モチーフ内に存在するか否かは、配列モチーフ内のトリプレットの位置および配列モチーフの長さに依るであろう。例えば、トリプレットが、配列モチーフのＮ末端に位置している場合、負の値は、全て、使用されない（即ち、考慮される必要がない）。トリプレットが配列モチーフのＣ末端に位置している場合、正の値についても同様である。しかしながら、好ましい態様において、配列モチーフは、第１のアミノ酸群からなるアミノ酸のトリプレッットのブロックを全く含まず、即ち、第１のアミノ酸群より選択される３個のアミノ酸からなるブロックを含まない。

【0068】

単独の場合の位置要件、第１のアミノ酸群より選択されるさらなるアミノ酸との対の場合の位置要件、および第１のアミノ酸群より選択される２個のさらなるアミノ酸とのブロックの場合の位置要件は、オーバーラップせず、これらの用語は、相互に排他的である（例えば、トリプレットは、「単独で」および／または「との対で」に当てはまらない、等）ことが理解される。

【0069】

第１のアミノ酸群より選択されるアミノ酸についてのさらなる位置要件は、配列モチーフが、第１のアミノ酸群より選択されるアミノ酸の対を、少なくとも２個、含まなければならないことである。しかしながら、第１のアミノ酸群より選択される全てのアミノ酸が配列モチーフ内に対で配置されるのではないことが好ましい。

【0070】

本発明のポリペプチドの配列モチーフは、第１のアミノ酸群より選択される４個（カルテット）またはそれ以上（クインテット、セクステット）のアミノ酸のブロックを含まない（即ち、第１のアミノ酸群のアミノ酸は、第１のアミノ酸群より選択される３個以上のアミノ酸とのブロックでは生じない）。従って、配列モチーフは、例えば、「ＫＲＫＫ」（配列番号１１７）または「ＲＲＲＲ」（配列番号１１８）のような配列を含み得ない。

【0071】

第１のアミノ酸群からなるアミノ酸は、配列モチーフの４０％～６０％のみを構成するため、残りのアミノ酸は、他のアミノ酸残基より選択される必要がある。前述のように、配列モチーフは、第２のアミノ酸群より選択されるアミノ酸も、少なくとも４０％かつ多くとも６０％、含む。前記第２のアミノ酸群は、アミノ酸残基－アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン－からなる。前記の第１のアミノ酸群と同様に、第２のアミノ酸群のアミノ酸の各々は、原則として、独立に選択され、即ち、各アミノ酸は、第２のアミノ酸群からの前または後の選択とは独立に選択される。

【0072】

しかしながら、第２のアミノ酸群については、この一般的な独立選択の原理に、いくつかの制約が存在する。第１のアミノ酸群より選択されるアミノ酸および第２のアミノ酸群より選択されるアミノ酸の合計が配列モチーフのアミノ酸の１００％となる（即ち、第３のアミノ酸群からのアミノ酸が配列モチーフ内に存在しない）場合、第１の制約が適用される。このようなシナリオにおいては、少なくとも３個の異なるアミノ酸が、第２のアミノ酸群より選択されなければならない。そのようなシナリオにおいては、第２のアミノ酸群のアミノ酸は、例えば好ましくは、バリン残基およびトリプトファン残基のみに制約され得ない。

【0073】

さらなる（位置）制約は、配列モチーフが少なくとも２個の単一の非隣接フェニルアラニン残基を含有しており、かつこれらのフェニルアラニン残基のうちの少なくとも１個の直前（Ｎ末端側）にリジン残基（即ち、ＫＦ）が存在する場合、配列モチーフは、トリプレット配列ＡＦＶ（アラニン、フェニルアラニン、バリン）を含み得ないというものである。非隣接フェニルアラニン残基とは、配列内に連続して存在せず、１個または複数個の他のアミノ酸によって隔てられているフェニルアラニン残基である。単一のフェニルアラニン残基とは、フェニルアラニン残基の対または数個のフェニルアラニン残基のブロックの一部ではなく、配列モチーフ内に単独で位置付けられていることを意味する。

【0074】

次の好ましい制約は、配列モチーフが、少なくとも３個の単一の非隣接ヒスチジン残基を含有している場合、配列モチーフは、配列ＡＡＬＴＨ（即ち、アラニン、アラニン、リジン、トレオニン、ヒスチジン）を含まないというものである。非隣接ヒスチジン残基とは、配列内に連続して存在せず、１個または複数個の他のアミノ酸によって隔てられているヒスチジン残基である。単一のヒスチジン残基とは、ヒスチジン残基の対または数個のヒスチジン残基のブロックの一部ではなく、配列モチーフ内に単独で位置付けられていることを意味する。

【0075】

好ましい実施形態において、５個未満（例えば、４個、３個、２個、１個、または０個）のイソロイシン残基が、第２のアミノ酸群より選択される。

【0076】

本発明のポリペプチドのペプチド成分の配列モチーフは、第１のアミノ酸群および第２のアミノ酸群より選択されるアミノ酸から排他的に構成されていない（即ち、共に１００％未満を表す）ことも可能である。このようなシナリオにおいて、配列モチーフの残りのアミノ酸は、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、メチオニン、およびシステインからなる第３のアミノ酸群より選択される。前記の第１のアミノ酸群および第２のアミノ酸群と同様に、第３のアミノ酸群のアミノ酸の各々は、原則として、独立に選択され、即ち、各アミノ酸は、第３のアミノ酸群からの前または後の選択と独立に選択される。しかしながら、前記の第２のアミノ酸群と同様に、第３のアミノ酸群からのアミノ酸の選択にも、いくつかの制約が存在する：即ち、グルタミンは１回のみ選択され得、グルタミンおよびグルタミン酸を同時に選択することもまたできない、即ち、グルタミンが配列モチーフ内に存在する場合には、グルタミン酸は存在し得ず、その逆も同様である。好ましくは、第３のアミノ酸群より選択されるアミノ酸は、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、およびグルタミン酸に限定される、即ち、選択される第３のアミノ酸群のアミノ酸には、メチオニン残基またはシステイン残基が含まれない。

【0077】

好ましい実施形態において、配列モチーフは、第３のアミノ酸群からのアミノ酸残基を１個のみ含むか、または、さらに好ましくは、全く含まない。

【0078】

本発明の好ましい実施形態において、配列モチーフ内の選択されたアミノ酸の配置は、図２に示された可能な配列モチーフ選択肢のうちの一つにおいて示された要件に適合する。図２は、所定の１６残基長、１７残基長、１８残基長、１９残基長、または２０残基長について、特定の位置に、第１のアミノ酸群より選択されるアミノ酸が存在し得ないことを明示している。これらの位置には、第２のアミノ酸群および／または第３のアミノ酸群（存在する場合）より選択されるアミノ酸のみが存在し得る。好ましくは、第２のアミノ酸群のアミノ酸が、それらの位置に存在する。第１のアミノ酸群のアミノ酸は、配列モチーフの残りの位置のいずれかにのみ存在し得る。これは、これらの残りの位置に、第１のアミノ酸群のアミノ酸のみが見出され得ることを意味しない。第１のアミノ酸群および第２のアミノ酸群についての全体百分率要件が満たされる限り、第２のアミノ酸群のアミノ酸、場合によっては、第３のアミノ酸群のアミノ酸も、これらの残りの位置に見出され得る。

【0079】

好ましくは、ペプチド成分の配列モチーフは、ヘリックス構造を有する。

【0080】

ペプチド成分の好ましい配列モチーフは、第１のアミノ酸群、第２のアミノ酸群、または第３のアミノ酸群に含まれると定義されたアミノ酸以外のアミノ酸残基を含まない。具体的には、ペプチド成分の好ましい配列モチーフは、プロリン残基を一切含まず、第３のアミノ酸群がアスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、およびグルタミン酸に限定される場合には、メチオニンおよびシステインも同様に含まない。

【0081】

しかしながら、プロリン残基が本発明のペプチド成分（または本発明のポリペプチド）内のどこかに存在することは十分にあり得る。例えば、プロリン残基が配列モチーフよりＮ末端側またはＣ末端側の１～１０アミノ酸残基内、好ましくは、１～５アミノ酸残基内に位置する場合が好ましく、後者が好ましい。そのようなプロリン残基が、エンドリシンの配列と配列モチーフとの間に見出される場合はさらに好ましい。好ましくは、配列モチーフは、エンドリシンの配列のＮ末端側にあり、プロリン残基は、その間の何処か、通常は、配列モチーフの近くに位置付けられる。

【0082】

上記好ましい配列モチーフを示すペプチド成分の例としては、配列番号６３、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５および配列番号１３６の配列を含むペプチドが挙げられる。上記配列モチーフを示す特に好ましいペプチド成分は配列番号１３２である。

【0083】

本発明のポリペプチドにおけるペプチド（成分）は、好ましくは少なくとも５個、より好ましくは少なくとも６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、または少なくとも１００個のアミノ酸残基からなる。特に好ましいペプチドは、約５個～約１００個のアミノ酸残、約５個～約５０個のアミノ酸残基、または約５個～約３０個のアミノ酸残基からなる。より好ましくは、約６個～約４２個のアミノ酸残基、約６個～約３９個のアミノ酸残基、約６個～約３８個のアミノ酸残基、約６個～約３１個のアミノ酸残基、約６個～約２５個のアミノ酸残基、約６個～約２４個のアミノ酸残基、約６個～約２２個のアミノ酸残基、約６個～約２１個のアミノ酸残基、約６個～約２０個のアミノ酸残基、約６個～約１９個のアミノ酸残基、約６個～約１６個のアミノ酸残基、約６個～約１４個のアミノ酸残基、約６個～約１２個のアミノ酸残基、約６個～約１０個のアミノ酸残基または約６個～約９個のアミノ酸残基からなるペプチドストレッチである。

【0084】

好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＫＲＫおよび配列番号３７～１３６からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列が含まれる。

【0085】

本発明に係るポリペプチドのペプチド成分は、追加のアミノ酸残基を介在させることにより、エンドリシンに連結させることができる（例えばクローニングの理由による）。場合によっては、ペプチド成分は、リンカー配列を介在させることなくエンドリシン配列に直接連結させることができる。

【0086】

好ましくは、介在されている追加のアミノ酸残基は、プロテアーゼによって認識され得ず、かつ／または切断され得ない。好ましくは、前記追加のアミノ酸配列は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の追加の介在アミノ酸残基によって互いに及び／又は酵素に連結される。

【0087】

好ましい実施形態では、本ペプチドは、追加の介在アミノ酸残基－グリシン、セリン及びセリン（Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ）、グリシン、アラニン、グリシン及びアラニン（Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ａｌａ；配列番号１３７）、グリシン、アラニン、グリシン、アラニン、グリシン、アラニン、グリシン及びアラニン（Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ａｌａ；配列番号１３８）又はグリシン、アラニン、グリシン、アラニン、グリシン、アラニン、グリシン、アラニン、グリシン、アラニン、グリシン及びアラニン（Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ａｌａ；配列番号１３９）－によって、好ましくは本発明のポリペプチドのＮ末端又はＣ末端で、本発明のポリペプチドの残りの部分に連結される。

【0088】

好ましくは、ペプチド成分は本発明のポリペプチドのうちエンドリシンのＮ末端に位置する。このような場合（特に、限定されるわけではないが、本発明のポリペプチドの第５～６の態様について）、エンドリシンがポリペプチドのうち最もＣ末端側の成分を構成し、つまりエンドリシン配列よりもＣ末端側にはもう機能要素が存在しない。好ましくは、本発明のポリペプチドのエンドリシン配列のＣ末端側に、１０以下のアミノ酸が存在し、より好ましくは５以下のアミノ酸が存在し、より好ましくは４以下のアミノ酸が存在し、より好ましくは３以下のアミノ酸が存在し、より好ましくは２以下のアミノ酸が存在し、より好ましくは１のみのアミノ酸が存在し、最も好ましくはアミノ酸は存在しない。

【0089】

本発明に係るポリペプチドの例としては、例えば、配列番号２８または配列番号３０（またはこれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列）のエンドリシンに加えて、配列番号６３または配列番号１３２のペプチド成分を含む、ポリペプチドである。本発明において特に好ましいポリペプチドは、配列番号１４０または配列番号１４１を含むポリペプチド、ならびに配列番号１４０および／または配列番号１４１と、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９６％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９７％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチドである。

【0090】

本発明に係るポリペプチドの他の例としては、エンドリシン成分として例えば配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、または配列番号３６（またはこれらの何れかについて少なくとも８０％の配列同一性を有する）に係る配列を含み、またペプチド成分として配列番号９６、配列番号１０７、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５または配列番号１３６からなる群から選択されるペプチド成分を含むポリペプチドである。本発明のこのようなポリペプチドの例は、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１および配列番号１５２として提供され、またこれらの配列の何れかに対して、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９６％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９７％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するポチペプチドである。

【0091】

配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１５１および配列番号１５２はＮ末端に（例えば、メチオニン残基ではなく）アラニン残基を示す。前記アラニン残基は重要なものではなく、Ｎ末端でＨｉｓタグのタンパク質分解除去の後に単に残るものである。配列番号１１５については、Ｎ末端部のＨｉｓタグのタンパク質分解除去により、余計なアミノ酸が残らず、つまり本ポリペプチドは配列番号１０６のペプチドから直接開始されるものとなる。

【0092】

本明細書で定められるエンドリシンとペプチドの他に、本発明のポリペプチドは当然に他のアミノ酸配列要素、例えば１つ以上のタグ、例えばＨｉｓタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、Ａｖｉタグ、Ｍｙｃタグ、Ｇｓｔタグ、ＪＳタグ、システインタグ、ＦＬＡＧタグ又はチオレドキシン、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）などの当技術分野で知られている他のタグ、をまた含むことができる。

【0093】

これに関連して本発明のポリペプチドに、例えば精製のためのタグがさらに含まれる場合がある。好ましいものはＨｉｓ６タグ（配列番号１５３）であって、好ましくは本発明のポリペプチドのＣ末端及び／又はＮ末端にある。前記タグは、追加のアミノ酸残基よってポリペプチドに結合することができる（例えばクローニングのため）。好ましくは、前記タグは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の追加のアミノ酸残基によってタンパク質に連結することができる。好ましくは、前記追加のアミノ酸残基は、プロテアーゼによって認識及び／又は切断することができる。好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドはＮ末端にＨｉｓ６－タグを含む。

【0094】

第７の態様において、本発明は配列番号１０７、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５および配列番号１３６からなる群から選択されるペプチドの配列を含み、任意選択的に、壁溶解酵素の配列を含むポリペプチドに関する。本発明の第７の態様に係るポリペプチドの壁溶解酵素は、細菌のペプチドグリカンを分解することのできるあらゆる壁溶解酵素（特にペプチドグリカン加水分解酵素）とすることができる。このような壁溶解酵素は、酵素活性の観点から例えば、エンドペプチダーゼ、Ｎ－アセチルムラモイル－Ｌ－アラニンアミダーゼ（アミダーゼ）、Ｎ－アセチル－ムラミダーゼ、Ｎ－アセチル－グルコサミニダーゼ、または溶解性トランスグリコシラーゼとすることができ、このため細菌細胞膜のペプチドグリカンを分解させるのに適するものである。好ましくは、壁溶解酵素は、大腸菌（E.coli）又は緑膿菌（P.aeruginosa）などのグラム陰性菌のペプチドグリカンを分解する。細菌細胞壁のペプチドグリカン構造は、概して修飾が小さくして多くが保たれている（非特許文献１１）。細菌種は、異なるアミノ酸からなるインターペプチド架橋を有しているが、インターペプチド架橋がなくとも構わない。インターペプチド架橋のないペプチドグリカン構造では、ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）またはｍｅｓｏ－ジアミノピメリン酸（ｍＤＡＰ）（リシンのε－カルボキシ誘導体を表すアミノ酸であって、ペプチドグリカンの典型的な成分である）がＬ－リシンに置き換わり、反対側のペプチド鎖の末端アミノ酸Ｄ－Ａｌａに直接架橋する。したがって、壁溶解酵素を用いて切断（例えば、ペプチドグリカン加水分解酵素を用いて加水分解）することのできる利用可能な化学結合の種類には限りがある。壁溶解酵素は、上記リストの酵素活性を有する少なくとも１つの酵素ドメインを示す。加えて壁溶解酵素は、場合によっては、ペプチドグリカンに結合し、壁溶解酵素の酵素活性をサポートするために適した少なくとも１つのドメインを含んでいる。結合ドメインは通常、細胞壁結合ドメイン（ＣＢＤ）と呼ばれる。壁溶解酵素の例として、脊椎動物リゾチーム（例えば、ヒトリゾチームまたはニワトリ卵白リゾチーム）、エンドリシン（ＫＺ１４４エンドリシンまたはＬｙｓ３９４エンドリシン）、ビリオン関連ペプチドグリカン加水分解酵素（ＶＡＰＧＨ）、バクテリオシン（例えば、リゾスタフィン）、ならびにオートリシンを挙げることができる。最も好ましくは、壁溶解酵素はエンドリシンである。特に好ましいエンドリシン配列は、本発明の上記第１～第６の態様に記載した配列であって、例えば、配列番号６、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、および配列番号３６、あるいは配列番号６、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、および／または配列番号３６に対して、特に配列番号２８および／または配列番号３０に対して、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９６％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９７％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列である。一般に、（本発明の第１から第６の態様に係る）本発明のポリペプチドについて上に述べたことは、本発明の第７の態様による本発明のポリペプチドにも同様に（適用可能な範囲で）適用される。

【0095】

本発明のポリペプチドには、グラム陰性エンドリシンが含まれるか、或いはグラム陰性エンドリシンを含むことができる。本発明のポリペプチドは、好ましくは少なくともグラム陰性菌のペプチドグリカン、通常は対応する親ファージの宿主種のペプチドグリカンを分解することができる。好ましくは、本発明のポリペプチドは、大腸菌（E. coli）および／又は緑膿菌（P. aeruginosa）のペプチドグリカンを分解することができる。最も好ましくは、本発明のポリペプチドは、大腸菌（E. coli）株RKI０６－０８４１０(ロベルトコッホ研究所、ベルリン，ドイツより取得)のペプチドグリカンを分解することができる。

【0096】

グラム陰性菌に対するペプチドグリカン分解活性は、当技術分野で周知のアッセイ、例えばグラム陰性菌の外膜を透過化又は除去して（例えば、クロロホルムで）、推定酵素がペプチドグリカン層にアクセスできるようにするムラリティックアッセイ（muralytic assay）によって測定することができる。酵素が活性である場合、ペプチドグリカン層の分解は濁度の低下をもたらし、これは測光法で測定することができる（例えば、非特許文献２、または非特許文献１２を参照のこと）（何れも本明細書に参照として組み込まれる）。

【0097】

本発明に係るポリペプチドは、ペプチドグリカン分解酵素の活性を示すだけではなく、グラム陰性菌ペプチドグリカンを分解することができる。好ましくは、本発明に係るポリペプチドは、ＥＤＴＡ（または外膜の透過性を高める他のあらゆる補助物質）が存在しなくとも、グラム陰性菌（例えば大腸菌（E. coli）および／または緑膿菌（P. aeruginosa））のペプチドグリカンを分解することができる。より好ましくは、本発明のポリペプチドは、他に外膜透過化剤が存在しなくとも、最小阻止濃度（ＭＩＣ）が、４０μｇ／ｍｌ以下を示し、好ましくは３０μｇ／ｍｌ以下、さらにより好ましくは２５μｇ／ｍｌ以下、これよりさらにより好ましくは２０μｇ／ｍｌ以下、最も好ましくは１５μｇ／ｍｌ以下を示す。最も好ましくは、本ポリペプチドは、他に外膜透過化剤が存在しなくとも、最小阻止濃度（MIC）が４０μｇ／ｍｌ以下で、大腸菌（E. coli）株ＲＫＩ０６-０８４１０のペプチドグリカンを分解し、最小阻止濃度（MIC）は好ましくは３０μｇ／ｍｌ以下、さらにより好ましくは２５μｇ／ｍｌ以下、これよりさらにより好ましくは２０μｇ／ｍｌ以下、最も好ましくは１５μｇ／ｍｌ以下である。対応する好適な試験は実施例１に記載した。緑膿菌（P. aeruginosa）については、好適な試験は実施例２に記載しており、対応する試験株は好ましくはＰＡＯ１（非特許文献１３)である。

【0098】

本発明のポリペプチドは、当技術分野で公知の標準的な手段、例えば、適切な宿主細胞において、それぞれのポリペプチドをコードする核酸を組み換え発現することより生産される。本発明のポリペプチドが、例えば追加のアミノ酸配列ストレッチ又はタグなどをさらに含む場合、そのような融合タンパク質は、必要な個々の核酸配列を、一般的なクローニング技術、例えば非特許文献１４に記載の技術を用いて結合することにより生産することができる。そのようなポリペプチドは、当技術分野で公知の方法、例えば組換えＤＮＡ発現系により同様にして生産することができる。

【0099】

本発明は、本発明の１つ以上の本発明のポリペプチドをコードする核酸にも関する。本発明の核酸は、核酸について考えられるすべての形態を取ることができる。特に、本発明の核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はそれらのハイブリッドとすることができる。それらは一本鎖又は二本鎖である場合がある。小さい転写産物のサイズ、又はバクテリオファージゲノムなどのゲノム全体のサイズを持っている場合がある。本明細書で使用される場合、本発明の１つ以上の本発明のポリペプチドをコードする核酸は、センス鎖を反映する核酸である場合がある。同様に、アンチセンス鎖も包含される。核酸は、本発明のポリペプチドの発現のための異種プロモーターを包含する場合がある。

【0100】

さらなる態様において、本発明は、本発明の核酸を含むベクターに関する。そのようなベクターは、例えば、本発明のポリペプチドの発現を可能にする発現ベクターである場合がある。前記発現は、構成的又は誘導的である場合がある。ベクターは、また、クローニング目的のために本発明の核酸配列を含むクローニングベクターである場合がある。

【0101】

本発明はまた、本発明の核酸を含む、特に本発明の融合タンパク質をコードする本発明の核酸を含む、バクテリオファージに関する。

【0102】

本発明はまた、本発明のポリペプチド、核酸、ベクター、又はバクテリオファージを含む（単離された）宿主細胞にも関する。宿主細胞は、特に細菌細胞及び酵母細胞からなる群から選択することができる。場合に応じて、他の適切な宿主細胞を不死化細胞株、例えば哺乳類（特にヒト）起源のものとすることができる。

【0103】

さらなる態様において、本発明は、本発明のポリペプチド、本発明の核酸、本発明のベクター、本発明のバクテリオファージ及び／又は宿主細胞を含む組成物に関する。本発明の組成物は、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤又は担体を含む医薬組成物である場合がある。特に好ましくは、本発明に係るポリペプチドを含むがＥＤＴＡを含まない組成物である。好ましくは、本発明に係る組成物は、他に外膜透過化剤が一切存在しない。

【0104】

さらなる態様において、本発明の組成物は化粧品組成物である。いくつかの細菌種は、皮膚など、患者の体の外部に露出した表面に炎症を引き起こす場合がある。そのような炎症を防ぐため、又は前記細菌性病原体の軽微な兆候を除去するために、面皰改善作用を得るに十分な量の本発明のポリペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞及び／又は組成物を含む、特別な化粧品が使用される場合がある。好ましくは、本発明のポリペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞又は組成物は、この文脈上、他に外膜透過化剤を一切使うことなく使用される。

【0105】

さらなる態様において、本発明は、本発明に係るポリペプチド、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係るバクテリオファージ、および／または、本発明に係る宿主細胞、ならびに、例えば本発明に係る追加ポリペプチド、抗生物質、または追加ポリペプチドなどの、少なくとも１つの追加抗微生物剤、を含んだキットに関する。

【0106】

さらなる態様では、本発明は、手術若しくは治療によるヒト若しくは動物の身体の処置方法、又はヒト若しくは動物の身体に実施される診断方法に使用するための、本発明のポリペプチド、本発明の核酸、本発明のベクター、本発明のバクテリオファージ、本発明の宿主細胞、本発明の組成物に関する。そのような状況では、本発明のポリペプチドの抗菌活性を活用することができる。

【0107】

係る方法は、典型的には、有効量の本発明のポリペプチド、核酸、ベクター、バクテリオファージ、宿主細胞又は組成物を、対象に投与することを含む。好ましくは、ポリペプチド、核酸、ベクター、バクテリオファージ、宿主細胞又は組成物は、ＥＤＴＡなどの外膜透過化剤を追加することなく投与される。対象は、例えば、ヒト若しくは動物である場合があり、ヒトの対象がより好ましい。特に、本発明のポリペプチド、本発明の核酸、本発明のベクター、本発明のバクテリオファージ、本発明の宿主細胞及び／又は本発明の組成物は、グラム陰性菌感染症などの細菌感染症の処置又は予防のための方法で使用される場合がある。限定されるわけではないが、処置の方法には、皮膚、軟部組織、呼吸器系、肺、消化管、目、耳、歯、鼻咽頭、口、骨、膣に関する感染症の処置および／または予防、菌血症および/または心内膜炎の創傷に関する感染症の処置および／または予防を含む場合がある。

【0108】

本発明の処置（又は予防）方法で使用される投与量及び投与経路は、治療される特定の疾患／感染部位に依存する。投与経路は、例えば、経口、局所、鼻咽頭、非経口、静脈内、直腸又は他の投与経路である場合がある。

【0109】

本発明のポリペプチド、核酸、ベクター、バクテリオファージ、宿主細胞又は組成物の感染部位（又は感染の危険にさらされる部位）への適用のために、感染部位に到達するまでに、プロテアーゼ、酸化、免疫応答などの環境の影響から、活性化合物を保護する製剤が使用される場合がある。従って、当該製剤は、カプセル、糖衣錠、丸薬、坐薬、注射液、又は他の医学的に妥当なガレヌス製剤である場合がある。好ましくは、ガレヌス製剤は、適切な担体、安定剤、香味料、緩衝液又は他の適切な試薬を含む場合がある。例えば、局所適用の場合、製剤はローション又は湿布薬である場合があり、鼻咽頭適用の場合、製剤は鼻にスプレーにより適用される生理食塩水溶液である場合がある。好ましくは、製剤には（本発明に係るポリペプチド以外の）他の外膜透過化剤は一切含まれない。

【0110】

好ましくは、本発明のポリペプチド、核酸、ベクター、バクテリオファージ、宿主細胞又は組成物は、ランチバイオティクス、バクテリオシン又はエンドリシンなどの、他の従来の抗菌剤と組み合わせて使用される。従来の抗菌剤の投与は、本発明のポリペプチド（例えば融合タンパク質）、核酸、ベクター、バクテリオファージ、宿主細胞又は組成物の投与の、前、同時又は後に行うことができる。

【0111】

さらなる態様において、本発明は、医療診断、食物診断、飼料診断又は環境診断における診断手段として使用するための、特に細菌感染、特にグラム陰性菌、によって引き起こされるこれらの診断手段として使用するための、本発明のポリペプチド、核酸、ベクター、バクテリオファージ、宿主細胞又は組成物に関する。これに関して、本発明のポリペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞又は組成物は、グラム陰性病原性細菌のペプチドグリカンを特異的に分解するためのツールとして使用される場合がある。ＰＣＲ、核酸ハイブリダイゼーション又はＮＡＳＢＡ（核酸配列ベースの増幅）などの核酸ベースの方法、ＩＭＳ、免疫蛍光又はＥＬＩＳＡ技術などの免疫学的方法、異なる細菌群又は種に特異的なタンパク質（例えば腸内細菌のβ－ガラクトシダーゼ、コアグラーゼ陽性株のコアグラーゼ）を使用した酵素アッセイなど細菌細胞の細胞含有量に依存するその他の方法、を使用した細菌のその後の特異的検出において、特定の細胞分解は初期ステップとして必要である。好ましくは、本発明のポリペプチド、核酸、ベクター、バクテリオファージ、宿主細胞または組成物は、この文脈上、他に外膜透過化剤を一切使うことなく使用される。

【0112】

さらなる態様において、本発明は、本発明のポリペプチド、本発明の核酸、本発明のベクター、本発明のバクテリオファージ、本発明の宿主細胞及び／又は本発明の組成物の、食品、飼料、若しくは化粧品における使用、又は（例えば、治療目的でない）消毒剤としての使用に関する。本発明のポリペプチドは、食料、食料加工設備、食品加工工場、食料と接触する（無生物）表面（棚や食品置き場など）、飼料、飼料加工設備、飼料加工工場、飼料と接触する（無生物）表面（棚や飼料貯蔵所など）、医療機器、又は病院、診療所、その他医療施設における（無生物）表面、に関するグラム陰性菌汚染の処置又は予防に使用することができる。好ましくは、本発明のポリペプチド、核酸、ベクター、バクテリオファージ、宿主細胞または組成物は、この文脈上、他に外膜透過化剤を一切使うことなく使用される。

【図面の簡単な説明】

【0113】

以下に、添付の図面の簡単な簡単を行う。この図面は、本発明の一態様をより詳細に説明することを意図している。しかし、本発明の保護主題をそのような主題のみに限定することを意図するものではない。

【図1】図１は、本発明のポリペプチドの好ましいエンドリシン成分に見出される、つまりシトロバクター・コセリファージＣｋＰ１（配列番号２１）のエンドリシン、腸内細菌ファージＣＣ３１（配列番号２２）のエンドリシン、セラチアファージＣＨＩ１４（配列番号２３）のエンドリシン、エロモナスファージＡｈ１（配列番号２４）のエンドリシン、セラチアファージＰＳ２（配列番号２５）のエンドリシン、およびエロモナスファージＡＳ－ｓｚｗ（配列番号２６）のエンドリシン、に見出され、配列番号７のコンセンサス配列を生じさせる、配列番号２のジョイントモチーフ（ボックスで囲まれている）を表している。

【図2】図２は、本発明のポリペプチドの選択されたペプチド成分に係る好ましい配列モチーフの位置要件を表している。

【発明を実施するための形態】

【0114】

表は、１６アミノ酸長（白）～２０アミノ酸長（ダークグレー）の配列モチーフについて、第１のアミノ酸群より選択されるアミノ酸が存在し得ない位置を示している（それぞれの位置に「Ｘ」と表示されている）。これらの位置（即ち、「Ｘ」と表示されたもの）には、第２のアミノ酸群、場合によっては、第３のアミノ酸群より選択されるアミノ酸のみが存在し得る。より好ましくは、第２のアミノ酸群より選択されるアミノ酸のみが、これらの位置に存在する。配列モチーフの第１のアミノ酸群より選択されるアミノ酸は、「Ｘ」と表示されていない位置にのみ存在し得る。しかしながら、この表示されていない位置には、第２のアミノ酸群、場合によっては、第３のアミノ酸群のアミノ酸も存在し得る。１６アミノ酸長、１７アミノ酸長、１８アミノ酸長、１９アミノ酸長、または２０アミノ酸長について、各々、全部で１８の選択肢が提供されている。表は、第１のアミノ酸群のトリプレットアミノ酸が潜在的に存在する位置（「Ｘ」のない３個の連続する位置）も、明白に明示している。選択肢１について、これは、８～１０位であろう。本発明のポリペプチドのペプチド成分の配列モチーフについて必要とされるように、３個のアミノ酸のブロックの最初のアミノ酸（即ち、位置番号８）に対して－５位（即ち、位置番号３）、－４位（即ち、位置番号４）、＋６位（即ち、位置番号１４）、＋７位（即ち、位置番号１５）、および＋１０位（即ち、位置番号１８）のアミノ酸は、第１のアミノ酸群より選択されない。相対的な－１２位、－１１位、－８位、＋１３位、および＋１４位は、第１の選択肢において見出され得ず、従って、考慮されない。

【実施例0115】

以下に、本発明の様々な態様および局面を例示する具体的な実施例が提示される。しかしながら、本発明は、本明細書中に記載された具体的な態様によってその範囲を限定されない。実際、本明細書中に記載されたものに加えて、本発明の様々な変形例が、前述の説明、付随する図面、および以下の実施例から、当業者に容易に明白になるであろう。そのような変形例は、全て、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれる。

【実施例0116】

実施例１：ＥＤＴＡの存在下および非存在下における複数の抗菌ポリペプチドの大腸菌（E. coli）に対する最小発育阻止濃度
ＥＤＴＡの存在下および非存在下における下記の各融合タンパク質の大腸菌（E. coli）に対する抗菌活性を分析した：
・配列番号１５４：セクロピンＡ（ネッタイシマカ（A aegyptii））ペプチド（配列番号６９）の、ビブリオファージＶｖＡＷ１（ＹＰ＿００７５１８３６１．１）のエンドリシンとの融合物、
・配列番号１５５：セクロピンＡ（ネッタイシマカ（A aegyptii））ペプチドの、モジュール型ＫＺ１４４エンドリシンおよびＬｙｓ６８エンドリシンの変異細胞壁結合ドメインとの融合物、
・配列番号１５６：ペプチド成分の好ましい配列モチーフに従う改変ペプチド（配列番号１３１）とシュードモナスファージｖＢ＿ＰｓｙＭ＿ＫＩＬ１（ＹＰ＿００９２７６００９．１を参照のこと）のエンドリシンの融合物、
・配列番号１４０：ＳＭＡＰ－２９ペプチド（配列番号６３）と、シトロバクター・コセリファージＣｋＰ１の融合物であって、凝集を減少させるためにＣ５４Ｓ変異に追加で人工的な改変がなされている（配列番号２８）、
・配列番号１４１：ペプチド成分（配列番号１３２）の好ましい配列モチーフを含むペプチドと、腸内細菌ファージＣＣ３１のエンドリシンの融合物であって、凝集を減少させるためにＣ５４Ｓ変異に追加で人工的な改変がなされている（配列番号３０）、
・配列番号１４２：配列番号１３３に係るペプチドと、シトロバクター・コセリファージＣｋＰ１のエンドリシンの融合物であって、凝集を減少させるためにＣ５４Ｓ変異に追加で人工的な改変がなされている（配列番号２８）、
・配列番号１４３：配列番号１３４に係る好ましい配列を含むペプチドと、腸内細菌ファージＣＣ３１のエンドリシンの融合物であって、この場合もまた、凝集を減少させるためにＣ５４Ｓ変異に追加で人工的な改変がなされている（配列番号３０）、
・配列番号１４５：配列番号１０７に係る好ましい配列を含むペプチドと、セラチアファージＣＨＩ１４のエンドリシンの融合物であって、この場合もまた、凝集を減少させるためにＣ５４Ｓ変異に追加で人工的な改変がなされている（配列番号３２）、および
・配列番号１４６：配列番号１３２に係る好ましい配列を含むペプチドと、エロモナスファージＡｈ１のエンドリシンの融合物であって、この場合もまた、凝集を減少させるために、位置１２２にシステイン残基に追加で人工的な改変がなされている（配列番号３４）。
・配列番号１４７：配列番号１０７に係る好ましい配列を含むペプチドと、エロモナスファージＡｈ１のエンドリシンの融合物であって、この場合にも、凝集を減少させるために、野生型エンドリシン配列の位置１２２に、システイン残基に追加で人工的な改変がなされている（配列番号３４）、
・配列番号１４８：配列番号１３２に係る好ましい配列を含むペプチドと、セラチアファージPS2 (配列番号25)のエンドリシンの融合物である、
・配列番号１４９：配列番号９６に係る好ましい配列を含むペプチドと、セラチアファージPS2 (配列番号25)のエンドリシンの融合物である、
・配列番号１５０：配列番号１３５に係る好ましい配列を含むペプチドと、シトロバクター・コセリファージＣｋＰ１のエンドリシンの融合物であって、凝集を減少させるためにＣ５４Ｓ変異に追加で人工的な改変がなされている（配列番号２８）、
・配列番号１５２：配列番号１３２に係る好ましい配列を含むペプチドと、エロモナスファージＡＳ－ｓｚｗ（配列番号３６）のエンドリシンの融合物。

【0117】

配列番号１４０のポリペプチドのエンドリシン成分と配列番号１４１のポリペプチドのエンドリシン成分（配列番号２８および配列番号３０を参照のこと）は、顕著なレベルの配列同一性（８０％）を有する。注目すべきことに、両方のエンドロシンに、Ｃ末端に比較的良好に保存されたヘリックスモチーフが含まれており、これは試験された他の融合タンパク質の何れにも存在しない。

【0118】

大腸菌（E. coli）（E. coli株ＲＫＩ０６－０８４１０；ロベルトコッホ研究所，ベルリン，ドイツより取得）を（Luria-Bertani）培地で増殖させ、ミューラーヒントン培地で１：１０に希釈した。約０．６のＯＤ６００の光学密度の細菌は、同じ培地で１：１０に希釈され、その後１：５００に希釈された。タンパク質緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）及びタンパク質を９６ウェルプレートにピペットで注入し、様々な濃度のタンパク質を最終分量２０μｌで使用したが、最終濃度５００μＭのＥＤＴＡを使用する場合と使用しない場合があった。１８０μｌの細菌細胞懸濁液または培地（ミューラー・ヒントン）をコントロールとして９６ウェルプレートに与え、混合した。当該プレートを３７℃で１８～２２時間培養し、ウェルのＯＤ６００値を測定して細菌増殖を測定した。細菌なしのコントロールと同じＯＤ６００を示すウェル内のタンパク質濃度である、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を決定した。

【0119】

最小発育阻止濃度（μｇ／ｍｌで表したＭＩＣ）の結果を以下の表４に示した。

【表4】

【0120】

「≦」とは（例えば、≦５、≦３．３など）、試験を行った最初の濃度で（例えば、それぞれ５μｇ／ｍｌおよび３．３μｇ／ｍｌで）既に抗菌活性が観察されたことを意味する。ＭＩＣはしたがって、少なくとも最初に試験を行った濃度（例えば、それぞれ５μｇ／ｍｌおよび３．３μｇ／ｍｌ）であって、また場合によってはこれよりも小さい。「＞５０」とは、濃度が５０μｇ／ｍｌとなるまで、抗菌活性を観察することができなかったことを意味する。

【0121】

試験したすべてのポリペプチドは、外膜透過化剤ＥＤＴＡの存在下で、大腸菌（E. coli）に対する良好な抗菌活性を示した。しかし、ＥＤＴＡが存在しないと、３つの慣習的な融合タンパク質の抗菌活性が著しく落ちた。対して、本発明に係るポリペプチドは、ＥＤＴＡがなくても顕著なレベルの抗菌活性を保持していた。