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特開2024-60562ヘパロサン生産微生物、ヘパロサンの製造方法及びヘパロサン由来化合物の製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024060562
(43)【公開日】2024-05-02
(54)【発明の名称】ヘパロサン生産微生物、ヘパロサンの製造方法及びヘパロサン由来化合物の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/21 20060101AFI20240424BHJP
C12P 19/04 20060101ALI20240424BHJP
C12N 15/31 20060101ALN20240424BHJP
C12N 15/63 20060101ALN20240424BHJP
【ＦＩ】
C12N1/21 ZNA
C12P19/04 C
C12N15/31
C12N15/63 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
【公開請求】
(21)【出願番号】P 2023090358
(22)【出願日】2023-05-31
(71)【出願人】
【識別番号】522388154
【氏名又は名称】キリンバイオマテリアル株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】000149435
【氏名又は名称】株式会社大塚製薬工場
(71)【出願人】
【識別番号】599161672
【氏名又は名称】レンセレイアー ポリテクニック インスティテュート
(74)【代理人】
【識別番号】110002000
【氏名又は名称】弁理士法人栄光事務所
(72)【発明者】
【氏名】福田 幸美
(72)【発明者】
【氏名】山田 佳歩
(72)【発明者】
【氏名】氏原 哲朗
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AF22
4B064AF47
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE10
4B064DA16
4B065AA01X
4B065AA26X
4B065AB01
4B065BA02
(57)【要約】
【課題】本発明は、ヘパロサンを製造するための非病原性の組換え微生物を提供すること、及び該組換え微生物を用いてヘパロサンおよびヘパロサン由来化合物を製造する方法を提供することを目的とする。
【解決手段】以下の（ａ）の遺伝子改変を有し、かつ（ｂ）の特徴を有する、ヘパロサン生産微生物。（ａ）ｋｆｉＡ遺伝子およびｋｆｉＣ遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変、（ｂ）炭素源からＵＤＰ－グルクロン酸およびＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミンを供給する能力を有する微生物
【選択図】なし
【解決手段】以下の（ａ）の遺伝子改変を有し、かつ（ｂ）の特徴を有する、ヘパロサン生産微生物。（ａ）ｋｆｉＡ遺伝子およびｋｆｉＣ遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変、（ｂ）炭素源からＵＤＰ－グルクロン酸およびＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミンを供給する能力を有する微生物
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の（ａ）の遺伝子改変を有し、かつ（ｂ）の特徴を有する、ヘパロサン生産微生物。
（ａ）ｋｆｉＡ遺伝子およびｋｆｉＣ遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変
（ｂ）炭素源からＵＤＰ－グルクロン酸およびＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミンを供給する能力を有する微生物
（ａ）ｋｆｉＡ遺伝子およびｋｆｉＣ遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変
（ｂ）炭素源からＵＤＰ－グルクロン酸およびＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミンを供給する能力を有する微生物
【請求項2】
前記（ａ）の遺伝子改変が、ｋｆｉＣ遺伝子にトリガーファクターをコードする遺伝子を連結することを含む、請求項１に記載のヘパロサン生産微生物。
【請求項3】
さらに以下の（ｃ）の遺伝子改変を有する、請求項１または２に記載のヘパロサン生産微生物。
（ｃ）ｋｆｉＤ遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変
（ｃ）ｋｆｉＤ遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変
【請求項4】
さらに以下の（ｄ）の遺伝子改変を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載のヘパロサン生産微生物。
（ｄ）ｇｌｍＳ遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変
（ｄ）ｇｌｍＳ遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変
【請求項5】
前記（ｄ）の遺伝子改変が、ｇｌｍＳ遺伝子の発現調節領域の改変および前記ｇｌｍＳ遺伝子のコピー数を高めることの少なくとも一方である、請求項４に記載のヘパロサン生産微生物。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか１項に記載のヘパロサン生産微生物を培地で培養することを含む、ヘパロサンの製造方法。
【請求項7】
請求項１～５のいずれか１項に記載のヘパロサン生産微生物を培地で培養することを含む、ヘパロサン由来化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ヘパロサン生産微生物、ヘパロサンの製造方法及びヘパロサン由来化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
硫酸化された多糖であるヘパリンは抗凝固薬の１つであり、血栓閉塞症、播種性血管内凝固症候群の治療や人工透析、体外循環での凝固防止などに用いられる。工業的には主に豚の腸粘膜から抽出、精製されたヘパリンが利用されている。
【0003】
２００８年に豚由来ヘパリンへの不純物混入を原因とする死亡事故が発生したことから、製造および品質が管理された非動物由来のヘパリンの生産が求められている（非特許文献１）。具体例として、微生物の莢膜多糖であるＮ－アセチルヘパロサン（以下「ヘパロサン」と記載する）を化学的手法および酵素的手法により脱アセチル化および硫酸化することで、豚由来品と同等の構造、抗凝固活性を有するヘパリンを生産する方法が報告されている（特許文献１、２）。
【0004】
上記のヘパリン生産方法において原料となるヘパロサンは、グルクロン酸（ＧｌｃＡ）とＮ－アセチルＤ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の二糖繰り返し構造で構成される多糖である。ヘパロサンを生産する微生物としてはエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） Ｋ５株やパスツレラ－ムルトシダ Ｄ型（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ ｔｙｐｅＤ）などが知られている（特許文献３、非特許文献２、３、４）。
【0005】
ヘパロサンはＧｒｏｕｐ２莢膜多糖に分類される。エシェリヒア・コリ Ｋ５株でのヘパロサンの合成、輸送にはゲノム上でクラスターを形成しているＲｅｇｉｏｎ Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩの遺伝子群が関わっていることが知られている（非特許文献５）。
【0006】
これらの遺伝子群にコードされる蛋白質は以下のようにしてヘパロサンを合成する。まず、β－ＫｄｏトランスフェラーゼであるＫｐｓＳ、ＫｐｓＣにより内膜のホスファチジルグリセロールに複数の３－ｄｅｏｘｙ－Ｄ－ｍａｎｎｏ－ｏｃｔ－２－ｕｌｏｓｏｎｉｃ ａｃｉｄ（Ｋｄｏ）残基が転移されてβ－Ｋｄｏリンカーが形成され（非特許文献６）、さらに糖転移酵素ＫｆｉＡ、ＫｆｉＣにより前駆体糖ヌクレオチドが付加されることでヘパロサンの合成が進行するとされている（非特許文献５）。
【0007】
ところで、前述のヘパロサン生産能を持つ微生物であるエシェリヒア・コリ Ｋ５株及びパスツレラ－ムルトシダ Ｄ型は両者ともに病原性が知られており、ヘパロサンの大量生産には不向きである。ヘパロサンの安全な生産のためには既知の安全性の高い菌株にヘパロサン合成に関わる遺伝子を導入して作らせるという方法がある。例えば安全な実験室株であるエシェリヒア・コリ Ｋ－１２株に、エシェリヒア・コリ Ｋ５株由来のヘパロサン合成に関わる遺伝子を導入してヘパロサンを作らせたという報告がある（非特許文献４）。また別の安全な実験室株であるエシェリヒア・コリ ＢＬ２１株に、エシェリヒア・コリ Ｋ５株由来のヘパロサン合成に関わる遺伝子を導入してヘパロサンを作らせたという報告がある（非特許文献７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】米国特許第８，７７１，９９５号明細書
【特許文献2】国際公開第２０１８／０４８９７３号
【特許文献3】国際公開第２０１１／０２８６６８号
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Natural Product Reports, 2009, 26, 313-321
【非特許文献2】Biotechnology and Bioengineering, 2010, 107, 964-973
【非特許文献3】Applied Microbiology and Biotechnology, 2019, 103, 6771-6782
【非特許文献4】Carbohydrate Research, 2012, 360, 19-24
【非特許文献5】Annual Review of Biochemistry, 2006, 75, 39-68
【非特許文献6】Proceedings of the National Academy of Sciences of USA, 2013, 110, 20753-20758
【非特許文献7】Applied Microbiology and Biotechnology, 2016, 100, 10355-10361
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
しかしながら、上述の方法によるヘパロサンの生産性は十分でなく、また病原性微生物由来の遺伝子を必要としている。
【0011】
上記したように、安全な菌株でヘパロサンを生産することの重要性が認識されているが、生産性および遺伝子源の面で満足のいくものはない。
そのため、本発明は、ヘパロサンを製造するための非病原性の組換え微生物を提供すること、及び該組換え微生物を用いてヘパロサンおよびヘパロサン由来化合物を製造する方法を提供することを目的とする。
そのため、本発明は、ヘパロサンを製造するための非病原性の組換え微生物を提供すること、及び該組換え微生物を用いてヘパロサンおよびヘパロサン由来化合物を製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、非病原性の微生物を宿主に用いて、該微生物にヘパロサン生産に関わる遺伝子を導入することでヘパロサンの製造ができることを見出し、本発明を完成させた。
【0013】
すなわち、本発明は以下に関する。
［１］
以下の（ａ）の遺伝子改変を有し、かつ（ｂ）の特徴を有する、ヘパロサン生産微生物。
（ａ）ｋｆｉＡ遺伝子およびｋｆｉＣ遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変
（ｂ）炭素源からＵＤＰ－グルクロン酸およびＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミンを供給する能力を有する微生物
［２］
前記（ａ）の遺伝子改変が、ｋｆｉＣ遺伝子にトリガーファクターをコードする遺伝子を連結することを含む、上記［１］に記載のヘパロサン生産微生物。
［３］
さらに以下の（ｃ）の遺伝子改変を有する、上記［１］または［２］に記載のヘパロサン生産微生物。
（ｃ）ｋｆｉＤ遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変
［４］
さらに以下の（ｄ）の遺伝子改変を有する、上記［１］～［３］のいずれか１つに記載のヘパロサン生産微生物。
（ｄ）ｇｌｍＳ遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変
［５］
前記（ｄ）の遺伝子改変が、ｇｌｍＳ遺伝子の発現調節領域の改変および前記ｇｌｍＳ遺伝子のコピー数を高めることの少なくとも一方である、上記［４］に記載のヘパロサン生産微生物。
［６］
上記［１］～［５］のいずれか１項に記載のヘパロサン生産微生物を培地で培養することを含む、ヘパロサンの製造方法。
［７］
上記［１］～［５］のいずれか１項に記載のヘパロサン生産微生物を培地で培養することを含む、ヘパロサン由来化合物の製造方法。
［１］
以下の（ａ）の遺伝子改変を有し、かつ（ｂ）の特徴を有する、ヘパロサン生産微生物。
（ａ）ｋｆｉＡ遺伝子およびｋｆｉＣ遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変
（ｂ）炭素源からＵＤＰ－グルクロン酸およびＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミンを供給する能力を有する微生物
［２］
前記（ａ）の遺伝子改変が、ｋｆｉＣ遺伝子にトリガーファクターをコードする遺伝子を連結することを含む、上記［１］に記載のヘパロサン生産微生物。
［３］
さらに以下の（ｃ）の遺伝子改変を有する、上記［１］または［２］に記載のヘパロサン生産微生物。
（ｃ）ｋｆｉＤ遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変
［４］
さらに以下の（ｄ）の遺伝子改変を有する、上記［１］～［３］のいずれか１つに記載のヘパロサン生産微生物。
（ｄ）ｇｌｍＳ遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変
［５］
前記（ｄ）の遺伝子改変が、ｇｌｍＳ遺伝子の発現調節領域の改変および前記ｇｌｍＳ遺伝子のコピー数を高めることの少なくとも一方である、上記［４］に記載のヘパロサン生産微生物。
［６］
上記［１］～［５］のいずれか１項に記載のヘパロサン生産微生物を培地で培養することを含む、ヘパロサンの製造方法。
［７］
上記［１］～［５］のいずれか１項に記載のヘパロサン生産微生物を培地で培養することを含む、ヘパロサン由来化合物の製造方法。
【発明の効果】
【0014】
本発明では、非病原性の微生物を宿主に用いて、該微生物にヘパロサン生産に関わる遺伝子を導入することで、ヘパロサンを生産しうる。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【発明を実施するための形態】
【0016】
以下、本発明について詳細に説明するが、これらは望ましい実施態様の一例を示すものであり、これらの内容に特定されるものではない。
数値範囲の「～」は、その前後の数値を含む範囲であり、例えば、「０質量％～１００質量％」は、０質量％以上であり、かつ、１００質量％以下である範囲を意味する。
数値範囲の「～」は、その前後の数値を含む範囲であり、例えば、「０質量％～１００質量％」は、０質量％以上であり、かつ、１００質量％以下である範囲を意味する。
【0017】
［ヘパロサン生産微生物］
本発明の一態様のヘパロサン生産微生物は、以下の（ａ）の遺伝子改変を有し、かつ（ｂ）の特徴を有する。
（ａ）ｋｆｉＡ遺伝子およびｋｆｉＣ遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変
（ｂ）炭素源からＵＤＰ－グルクロン酸およびＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミンを供給する能力を有する微生物
本発明の一態様のヘパロサン生産微生物は、以下の（ａ）の遺伝子改変を有し、かつ（ｂ）の特徴を有する。
（ａ）ｋｆｉＡ遺伝子およびｋｆｉＣ遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変
（ｂ）炭素源からＵＤＰ－グルクロン酸およびＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミンを供給する能力を有する微生物
【0018】
本発明の一態様のヘパロサン生産微生物は、ＫｆｉＡおよびＫｆｉＣの働きにより、ＵＤＰ－グルクロン酸およびＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミンを用いて、ヘパロサンを生産する。
【0019】
（（ａ）ｋｆｉＡ遺伝子およびｋｆｉＣ遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変）
ｋｆｉＡ又はｋｆｉＣ遺伝子としては、エシェリヒア属由来のｋｆｉＡ又はｋｆｉＣ遺伝子が好ましい。具体的には例えば、エシェリヒア・コリ Ｎｉｓｓｌｅ株のｋｆｉＡ又はｋｆｉＣ遺伝子が挙げられる。エシェリヒア・コリ Ｎｉｓｓｌｅ株のｋｆｉＡ又はｋｆｉＣ遺伝子の塩基配列及び該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、公用のデータベースから取得できる。ｋｆｉＡはＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＣＡＥ５５８２５．１；ｋｆｉＣはＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＣＡＥ５５８２１．１として登録されている。
ｋｆｉＡ又はｋｆｉＣ遺伝子としては、エシェリヒア属由来のｋｆｉＡ又はｋｆｉＣ遺伝子が好ましい。具体的には例えば、エシェリヒア・コリ Ｎｉｓｓｌｅ株のｋｆｉＡ又はｋｆｉＣ遺伝子が挙げられる。エシェリヒア・コリ Ｎｉｓｓｌｅ株のｋｆｉＡ又はｋｆｉＣ遺伝子の塩基配列及び該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、公用のデータベースから取得できる。ｋｆｉＡはＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＣＡＥ５５８２５．１；ｋｆｉＣはＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＣＡＥ５５８２１．１として登録されている。
【0020】
ｋｆｉＡ遺伝子としては、配列番号１８に示す塩基配列を含むＤＮＡまたは、配列番号１８に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつＫｆｉＣ共存下でヘパロサン合成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。ＫｆｉＣ共存下でヘパロサン合成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであることは、例えばＫｆｉＡを発現せずＫｆｉＣを発現する微生物および炭素源からＵＤＰ－グルクロン酸およびＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミンを供給する能力を有する微生物との特徴を有する微生物において、該ＤＮＡを導入した際に同微生物がヘパロサン生産能を有することによって確認できる。
【0021】
ｋｆｉＣ遺伝子としては、配列番号１９に示す塩基配列を含むＤＮＡまたは、配列番号１９に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつＫｆｉＡ共存下でヘパロサン合成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。ＫｆｉＡ共存下でヘパロサン合成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであることは、例えばＫｆｉＣを発現せずＫｆｉＡを発現する微生物および炭素源からＵＤＰ－グルクロン酸およびＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミンを供給する能力を有する微生物との特徴を有する微生物において、該ＤＮＡを導入した際に同微生物がヘパロサン生産能を有することによって確認できる。
【0022】
（（遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変））
本明細書において、「遺伝子の発現の増大」とは、非改変株と比較して該遺伝子の発現が上昇することをいう。遺伝子の発現の増大の一態様としては、例えば、非改変株と比較して、該遺伝子の発現が好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上に上昇していることが挙げられる。
本明細書において、「遺伝子の発現の増大」とは、非改変株と比較して該遺伝子の発現が上昇することをいう。遺伝子の発現の増大の一態様としては、例えば、非改変株と比較して、該遺伝子の発現が好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上に上昇していることが挙げられる。
【0023】
また、「遺伝子の発現が増大する」とは、もともと標的の遺伝子が発現している菌株において同遺伝子の発現量を上昇させることだけでなく、もともと標的の遺伝子が発現していない菌株において、同遺伝子を発現させることを含む。すなわち、「遺伝子の発現が増大する」とは、例えば、標的の遺伝子を保持しない菌株に同遺伝子を導入し、同遺伝子を発現させることを含む。なお、「遺伝子の発現が増大する」ことを、「遺伝子の発現が増強される」、「遺伝子の発現が上昇する」ともいう。
【0024】
遺伝子の発現の増大は、例えば、遺伝子のコピー数を増加させることにより達成できる。遺伝子のコピー数の増加は、宿主の染色体へ同遺伝子を導入することにより達成できる。染色体への遺伝子の導入は、例えば、相同組み換えを利用して行うことができる（Miller I, J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory）。遺伝子は、１コピーのみ導入されてもよく、２コピーまたはそれ以上導入されてもよい。
【0025】
例えば、染色体上に多数のコピーが存在する配列を標的として相同組み換えを行うことで、染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入することができる。染色体上に多数のコピーが存在する配列としては、反復ＤＮＡ配列（ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ＤＮＡ）、トランスポゾンの両端に存在するインバーテッド・リピートが挙げられる。
【0026】
また、目的物質の生産に不要な遺伝子等の染色体上の適当な配列を標的として相同組み換えを行ってもよい。相同組み換えは、例えば、直鎖状ＤＮＡを用いる方法、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法、またはファージを用いたｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ法により行うことができる。また、遺伝子は、トランスポゾンやＭｉｎｉ－Ｍｕを用いて染色体上にランダムに導入することもできる（特開平２－１０９９８５号公報）。
【0027】
染色体上に標的遺伝子が導入されたことの確認は、同遺伝子の全部又は一部と相補的な配列を持つプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション、又は同遺伝子の配列に基づいて作成したプライマーを用いたＰＣＲ等によって確認できる。
【0028】
また、遺伝子のコピー数の増加は、同遺伝子を含むベクターを宿主に導入することによっても達成できる。例えば、標的遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主で機能するベクターと連結して同遺伝子の発現ベクターを構築し、当該発現ベクターで宿主を形質転換することにより、同遺伝子のコピー数を増加させることができる。標的遺伝子を含むＤＮＡ断片は、例えば、標的遺伝子を有する微生物のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより取得できる。形質転換の方法は特に限定されず、従来公知の方法を使用できる。
【0029】
ベクターとしては、宿主の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、マルチコピーベクターであることが好ましい。また、形質転換体を選択するために、ベクターは抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを有することが好ましい。また、ベクターは、挿入された遺伝子を発現するためのプロモーターやターミネーターを備えていてもよい。ベクターとしては、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、コスミド、またはファージミド等が挙げられる。
【0030】
エシェリヒア・コリ等の腸内細菌科の細菌において自律複製可能なベクターとしては、具体的には例えば、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ｐＢＲ３２２、ｐＳＴＶ２９（いずれもタカラバイオ社）、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ１１９（いずれもニッポンジーン社）、ｐＴｒｃ９９Ａ（ファルマシア社）、ｐＰＲＯＫ系ベクター（クロンテック社）、ｐＫＫ２３３－２（クロンテック社）、ｐＥＴ系ベクター（ノバジェン社）、ｐＱＥ系ベクター（キアゲン社）、広宿主域ベクターＲＳＦ１０１０が挙げられる。
【0031】
遺伝子を導入する場合、遺伝子は、本発明における遺伝子改変を有する細菌に保持されていればよい。具体的には、遺伝子は、本発明の細菌で機能するプロモーター配列による制御を受けて発現するように導入されていればよい。プロモーターは、宿主由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、導入する遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。プロモーターとしては、例えば、後述するような、より強力なプロモーターを利用してもよい。
【0032】
遺伝子の下流には、転写終結用のターミネーターを配置することができる。ターミネーターは、本発明の細菌において機能するものであれば特に制限されない。ターミネーターは、宿主由来のターミネーターであってもよく、異種由来のターミネーターであってもよい。ターミネーターは、導入する遺伝子の固有のターミネーターであってもよく、他の遺伝子のターミネーターであってもよい。ターミネーターとしては、具体的には例えば、Ｔ７ターミネーター、Ｔ４ターミネーター、ｆｄファージターミネーター、ｔｅｔターミネーター、およびｔｒｐＡターミネーターが挙げられる。
【0033】
各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターに関しては、例えば「微生物学基礎講座８ 遺伝子工学、共立出版、１９８７年」に詳細に記載されており、それらを利用することが可能である。
【0034】
また、２以上の遺伝子を導入する場合、各遺伝子が、発現可能に本発明の細菌に保持されていればよい。例えば、各遺伝子は、全てが単一の発現ベクター上に保持されていてもよく、全てが染色体上に保持されていてもよい。また、各遺伝子は、複数の発現ベクター上に別々に保持されていてもよく、単一または複数の発現ベクター上と染色体上とに別々に保持されていてもよい。また、２以上の遺伝子でオペロンを構成して導入してもよい。「２以上の遺伝子を導入する場合」としては、例えば、２またはそれ以上の酵素をそれぞれコードする遺伝子を導入する場合、単一の酵素を構成する２またはそれ以上のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を導入する場合、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【0035】
導入される遺伝子は、宿主で機能するタンパク質をコードするものであれば特に制限されない。導入される遺伝子は、宿主由来の遺伝子であってもよく、異種由来の遺伝子であってもよい。導入される遺伝子は、例えば、同遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用い、同遺伝子を有する生物のゲノムＤＮＡや同遺伝子を搭載するプラスミド等を鋳型として、ＰＣＲにより取得することができる。また、導入される遺伝子は、例えば、同遺伝子の塩基配列に基づいて全合成してもよい［Gene, 60(1), 115-127 (1987)］。
【0036】
また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の転写効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の転写効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することにより達成できる。「より強力なプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも向上するプロモーターを意味する。
【0037】
「より強力なプロモーター」としては、例えば、公知の高発現プロモーターであるｕｓｐＡプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｈｒプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ａｒａＢＡＤプロモーター、ｒｐｏＨプロモーター、ＰＲプロモーター、およびＰＬプロモーターが挙げられる。
【0038】
また、より強力なプロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得してもよい。例えば、プロモーター領域内の－３５、－１０領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（国際公開第２０００／１８９３５号）。
【0039】
高活性型プロモーターとしては、各種ｔａｃ様プロモーター（Katashkina JI et al. Russian Federation Patent application 2006134574）やｐｎｌｐ８プロモーター（国際公開第２０１０／０２７０４５号）が挙げられる。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、公知の文献［Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)等］に記載されている。
【0040】
また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の翻訳効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のシャインダルガノ（ＳＤ）配列［リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう］をより強力なＳＤ配列に置換することにより達成できる。
【0041】
「より強力なＳＤ配列」とは、ｍＲＮＡの翻訳が、もともと存在している野生型のＳＤ配列よりも向上するＳＤ配列を意味する。より強力なＳＤ配列としては、例えば、ファージＴ７由来の遺伝子１０のＲＢＳが挙げられる（Olins P. O. et al, Gene, 1988, 73, 227-235）。さらに、ＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域、特に開始コドンのすぐ上流の配列（５’－ＵＴＲ）における数個のヌクレオチドの置換、あるいは挿入、あるいは欠失がｍＲＮＡの安定性および翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することによっても遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。
【0042】
本発明においては、プロモーター、ＳＤ配列、およびＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域等の遺伝子の発現に影響する部位を総称して「発現調節領域」ともいう。発現調節領域は、プロモーター検索ベクターやＧＥＮＥＴＹＸ等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することができる。これら発現調節領域の改変は、例えば、温度感受性ベクターを用いた方法や、Ｒｅｄドリブンインテグレーション法（国際公開第２００５／０１０１７５号）により行うことができる。
【0043】
遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、コドンの改変によっても達成できる。具体的には例えば、遺伝子の異種発現を行う場合等には、遺伝子中に存在するレアコドンを、より高頻度で利用される同義コドンに置き換えることにより、遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。
【0044】
コドンの置換は、例えば、ＤＮＡの目的の部位に目的の変異を導入する部位特異的変異法により行うことができる。部位特異的変異法としては、ＰＣＲを用いる方法［Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)］や、ファージを用いる方法［Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)］が挙げられる。また、コドンが置換された遺伝子断片を全合成してもよい。種々の生物におけるコドンの使用頻度は、「コドン使用データベース」［http://www.kazusa.or.jp/codon; Nakamura, Y. et al, Nucl. Acids Res., 28, 292 (2000)］に開示されている。
【0045】
また、遺伝子の発現の増大は、遺伝子の発現を増大させるようなレギュレーターを増幅すること、または、遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成できる。上記のような遺伝子の発現を増大させる手法は、単独で用いてもよく、任意の組み合わせで用いてもよい。
【0046】
遺伝子の発現が増大したことは、例えば、該遺伝子の転写量が上昇したことを確認することや、該遺伝子から発現するタンパク質の量が上昇したことを確認することにより確認できる。また、遺伝子の発現が増大したことは、例えば、該遺伝子から発現するタンパク質の活性が増大したことを確認することにより確認できる。
【0047】
遺伝子の転写量が上昇したことの確認は、該遺伝子から転写されるｍＲＮＡの量を野生株または親株等の非改変株と比較することによって行うことができる。ｍＲＮＡの量を評価する方法としてはノーザンハイブリダイゼーション、ＲＴ－ＰＣＲ等が挙げられる［Sambrook, J., et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition, Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001］。ｍＲＮＡの量の上昇としては、非改変株と比較して、例えば、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上に上昇することが挙げられる。
【0048】
タンパク質の量が上昇したことは、例えば、抗体を用いてウエスタンブロットによって確認できる。タンパク質の量の上昇としては、非改変株と比較して、例えば、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上に上昇することが挙げられる。
【0049】
タンパク質の活性が増大したことは、例えば、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。タンパク質の活性の増大としては、タンパク質の活性が、非改変株と比較して、例えば、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上に上昇することが挙げられる。
【0050】
上記した遺伝子の発現を増大させる手法は、上記した（ａ）並びに後述の（ｃ）及び（ｄ）の各遺伝子の発現を増大させる手法として利用できる。
【0051】
ｋｆｉＡ及びｋｆｉＣ遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変としては、ｋｆｉＡ及びｋｆｉＣ遺伝子の発現調節領域の改変及び該遺伝子のコピー数を高めることの少なくとも一方であることが好ましい。ｋｆｉＡ及びｋｆｉＣ遺伝子はオペロンを構成しており、ｋｆｉＡ及びｋｆｉＣ遺伝子により構成されるオペロン全体を強化する遺伝子改変が好ましく、ｋｆｉＡ及びｋｆｉＣ遺伝子の発現調節領域の改変がより好ましい。
【0052】
（（トリガーファクターをコードする遺伝子の連結））
ｋｆｉＡ遺伝子およびｋｆｉＣ遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変は、ｋｆｉＣ遺伝子にトリガーファクターをコードする遺伝子を連結することを含むことが好ましい。ｋｆｉＣ遺伝子にトリガーファクターをコードする遺伝子を連結することで、後述のように、ＫｆｉＣが安定化する。ｋｆｉＡ遺伝子およびｋｆｉＣ遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変は、さらに、ｋｆｉＣ遺伝子の上流に配列番号２１で表される塩基配列または配列番号２３で表される塩基配列によってトリガーファクターをコードする遺伝子を連結することを含むことが好ましく、ｋｆｉＣ遺伝子の上流に配列番号２３で表される塩基配列によってトリガーファクターをコードする遺伝子を連結することを含むことが最も好ましい。
ｋｆｉＡ遺伝子およびｋｆｉＣ遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変は、ｋｆｉＣ遺伝子にトリガーファクターをコードする遺伝子を連結することを含むことが好ましい。ｋｆｉＣ遺伝子にトリガーファクターをコードする遺伝子を連結することで、後述のように、ＫｆｉＣが安定化する。ｋｆｉＡ遺伝子およびｋｆｉＣ遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変は、さらに、ｋｆｉＣ遺伝子の上流に配列番号２１で表される塩基配列または配列番号２３で表される塩基配列によってトリガーファクターをコードする遺伝子を連結することを含むことが好ましく、ｋｆｉＣ遺伝子の上流に配列番号２３で表される塩基配列によってトリガーファクターをコードする遺伝子を連結することを含むことが最も好ましい。
【0053】
本明細書において、トリガーファクターとは、イン・ビトロでの大腸菌外膜タンパク質のＯｍｐＡの前駆体であるｐｒｏＯｍｐＡの膜への輸送に必要な細胞質因子として発見された因子をいう（Crooke, E. and Wickner, W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84,5216-5220 (1987)）。トリガーファクターはＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）ドメインを有し、ＦＫ５０６との結合活性とペプチジル－プロリルイソメラーゼ（ＰＰＩａｓｅ）活性の発現に必要なすべてのアミノ酸が保存されていることが明らかにされている（Callebaut, I. and Mornon, J. -P., FEBS Lett., 374, 211-21 (1995)）。トリガーファクターは、シャペロンとしてタンパク質のフォールディングを促進するものであり、トリガーファクターとＫｆｉＣを融合させると、ＫｆｉＣが安定化することが明らかにされている（Sugiura N et al. J Biol Chem (2010)285:1597-1606）。
【0054】
トリガーファクターをコードする遺伝子（以下、「ｔｉｇ遺伝子」とも称する。）は、エシェリヒア属由来のｔｉｇ遺伝子が好ましい。具体的には例えば、エシェリヒア・コリＫ－１２株のｔｉｇ遺伝子が挙げられる。エシェリヒア・コリＫ－１２株のｔｉｇ遺伝子の塩基配列及び該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、公用のデータベースから取得できる。エシェリヒア・コリＫ－１２株の一種であるＷ３１１０株のｔｉｇのアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＢＡＥ７６２１６．１で登録されており、このアミノ酸配列をコードする遺伝子配列はＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＡＰ００９０４８．１の４５４３５７番目の塩基から４５５６５５番目の塩基の部分に示されている。
【0055】
ｔｉｇ遺伝子は、配列番号２０に表される塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。配列番号２０に表される塩基配列からなる遺伝子をコードするＤＮＡは、例えば、アメリカタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）にＡＴＣＣ２７３２５として寄託されているエシェリヒア・コリＫ－１２株の一種であるＷ３１１０株から常法によりゲノム抽出することにより得ることができる。
【0056】
また、本発明において、ｔｉｇ遺伝子は、ｋｆｉＣ遺伝子と連結し、融合タンパクとして発現させることにより、ＫｆｉＣを可溶化した状態で、かつ正常な立体構造を保持した状態で発現させうる因子をコードする遺伝子であれば、前記配列番号２０に示される塩基配列において、１個以上の塩基に置換、欠失、付加もしくは挿入などの変異が導入された配列からなる遺伝子をも包含する。
【0057】
さらに、本発明において、ｔｉｇ遺伝子は、ｋｆｉＣ遺伝子と連結し、融合タンパクとして発現させることにより、ＫｆｉＣを可溶化した状態で、かつ正常な立体構造を保持した状態で発現させうる因子をコードする遺伝子であれば、前記配列番号：２０に示される塩基配列からなるＤＮＡまたは前記配列番号：２０に示される塩基配列において、１個以上の塩基に置換、欠失、付加もしくは挿入などの変異が導入された配列を有するＤＮＡのいずれかのＤＮＡにストリンジェントな条件下にハイブリダイズするＤＮＡからなる遺伝子をも包含する。
【0058】
なお、ハイブリダイゼーションの条件は、例えば、モレキュラークローニング：ア ラボラトリーマニュアル第２版〔Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， （１９８９） 〕に記載の条件などが挙げられる。
【0059】
（（親株））
本明細書において、親株とは、遺伝子改変および形質転換等の対象となる元株のことをいう。ＤＮＡの導入による形質転換の対象となる元株を宿主株という。
本明細書において、親株とは、遺伝子改変および形質転換等の対象となる元株のことをいう。ＤＮＡの導入による形質転換の対象となる元株を宿主株という。
【0060】
親株としては、原核生物または酵母菌株が好ましく、より好ましくはエシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、若しくはシュードモナス属等に属する原核生物、またはサッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピチア属、若しくはキャンディダ属等に属する酵母菌株であり、これらの中でもエシェリヒア属に属する原核生物（大腸菌）が好ましく、特に大腸菌Ｋ－１２株および大腸菌Ｗ株が好ましい。
【0061】
親株として、具体的には例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ｃｏｄｏｎ ｐｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２－Ｂｌｕｅ（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（メルクミリポア社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８ Ｐｒｅｍｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０４ ｄａｍ－／ｄｃｍ－、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＣＪ２３６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＭＨ７１－１８ ｍｕｔＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＶ１１８４、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴＨ２（いずれもタカラバイオ社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ（ＡＴＣＣ９６３７）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＰ３４７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１５３５４、若しくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｄ－０１１０等の原核生物、又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、若しくはＣａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ等の酵母菌株が挙げられる。
【0062】
（（ｂ）炭素源からＵＤＰ－グルクロン酸およびＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミンを供給する能力を有する微生物）
炭素源は、本発明の細菌が資化してヘパロサンを生成し得るものであれば、特に限定されない。炭素源としては、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、廃糖蜜、澱粉加水分解物、バイオマスの加水分解物等の糖類、酢酸、フマル酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸等の有機酸類、グリセロール、粗グリセロール、エタノール等のアルコール類、脂肪酸類が挙げられる。炭素源としては、１種の炭素源を用いてもよく、２種以上の炭素源を組み合わせてもよい。
炭素源は、本発明の細菌が資化してヘパロサンを生成し得るものであれば、特に限定されない。炭素源としては、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、廃糖蜜、澱粉加水分解物、バイオマスの加水分解物等の糖類、酢酸、フマル酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸等の有機酸類、グリセロール、粗グリセロール、エタノール等のアルコール類、脂肪酸類が挙げられる。炭素源としては、１種の炭素源を用いてもよく、２種以上の炭素源を組み合わせてもよい。
【0063】
炭素源からＵＤＰ－グルクロン酸およびＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミンを供給する能力を有する微生物としては、炭素源からＵＤＰ－グルクロン酸およびＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミンを供給する能力を元来有する微生物であることが好ましい。炭素源からＵＤＰ－グルクロン酸およびＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミンを供給する能力を有する微生物としては、炭素源からＵＤＰ－グルクロン酸およびＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミンの少なくとも一方を供給する能力を元来有しない微生物であって、炭素源からＵＤＰ－グルクロン酸およびＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミンを供給するための遺伝子改変を有する微生物であってもよい。
【0064】
（（ｃ）ｋｆｉＤ遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変）
本発明の一態様のヘパロサン生産微生物は、さらに以下の（ｃ）の遺伝子改変を有することが好ましい。
（ｃ）ｋｆｉＤ遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変
本発明の一態様のヘパロサン生産微生物は、さらに以下の（ｃ）の遺伝子改変を有することが好ましい。
（ｃ）ｋｆｉＤ遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変
【0065】
ＫｆｉＤは、ＵＤＰ－グルクロン酸の合成にかかわる酵素である。ヘパロサン生産微生物において、ｋｆｉＤ遺伝子の発現を増大させることで、ＵＤＰ－グルクロン酸を供給する能力を向上しうる。
【0066】
ｋｆｉＤ遺伝子としては、エシェリヒア属由来のｋｆｉＤ遺伝子が好ましい。具体的には例えば、エシェリヒア・コリ Ｎｉｓｓｌｅ株のｋｆｉＤ遺伝子が挙げられる。エシェリヒア・コリ Ｎｉｓｓｌｅ株のｋｆｉＤ遺伝子の塩基配列及び該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、公用のデータベースから取得できる。ｋｆｉＤはＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＣＡＥ５５８２０．１として登録されている。
【0067】
ｋｆｉＤ遺伝子としては、配列番号２５に示す塩基配列を含むＤＮＡまたは、配列番号２５に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつＵＤＰ－グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。ＵＤＰ－グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであることは、例えばＵＤＰ－グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有さない微生物に該ＤＮＡを導入し、該微生物から調製した粗酵素液を用いて、ＵＤＰ－グルコースを基質としてＵＤＰ－グルクロン酸を生成できることを確認することにより確認できる。
【0068】
ｋｆｉＤ遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変としては、ｋｆｉＤ遺伝子の発現調節領域の改変及び該遺伝子のコピー数を高めることの少なくとも一方であることが好ましい。ｋｆｉＤ遺伝子はオペロンを構成しており、ｋｆｉＤ遺伝子により構成されるオペロン全体を強化する遺伝子改変が好ましく、ｋｆｉＤ遺伝子の発現調節領域の改変がより好ましい。
【0069】
（（ｄ）ｇｌｍＳ遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変）
本発明の一態様のヘパロサン生産微生物は、さらに以下の（ｄ）の遺伝子改変を有することが好ましい。
（ｄ）ｇｌｍＳ遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変
本発明の一態様のヘパロサン生産微生物は、さらに以下の（ｄ）の遺伝子改変を有することが好ましい。
（ｄ）ｇｌｍＳ遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変
【0070】
ＧｌｍＳは、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン供給経路の第１酵素であり、フルクトース－６－リン酸からグルコサミン－６－リン酸への反応を触媒する酵素（Ｌ－グルタミン：Ｄ－フルクトース６リン酸アミノトランスフェラーゼ）である。
【0071】
ｇｌｍＳ遺伝子は、エシェリヒア属由来のｇｌｍＳ遺伝子が好ましい。具体的には例えば、エシェリヒア・コリ Ｗ株のｇｌｍＳ遺伝子が挙げられる。エシェリヒア・コリ Ｗ株のｇｌｍＳ遺伝子の塩基配列及び該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、公用のデータベースからＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号 ＡＤＴ７７３６６．１として登録されている。ｇｌｍＳ遺伝子はＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号 ＣＰ００２１８５．１の４１３９２７１番目の塩基から４１４１１００番目の塩基の部分に示されている。
【0072】
ｇｌｍＳ遺伝子としては、配列番号２６に示す塩基配列を含むＤＮＡまたは、配列番号２６に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含みかつＬ－グルタミン：Ｄ－フルクトース６リン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。Ｌ－グルタミン：Ｄ－フルクトース６リン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであることは、Ｌ－グルタミン：Ｄ－フルクトース６リン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有さない微生物に該ＤＮＡを導入し、該微生物から調製した粗酵素液を用いて、Ｌ－グルタミンおよびＤ－フルクトース６リン酸を基質としてＤ－グルコサミン６リン酸を生成できることを確認することにより、確認できる。
【0073】
ｇｌｍＳ遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変としては、（イ）ｇｌｍＳ遺伝子の発現調節領域の改変および前記遺伝子のコピー数を高めることの少なくとも一方、並びに（ロ）ｙｈｂＪ遺伝子の機能を欠損させる遺伝子改変、のうち、少なくとも一方を含むことが好ましく、特に（イ）を含むことが好ましい。
【0074】
ＹｈｂＪは、ＧｌｍＳをネガティブに制御する酵素である。
ｙｈｂＪ遺伝子としては、エシェリヒア属由来のｙｈｂＪ遺伝子が好ましい。具体的には例えば、エシェリヒア・コリ Ｋ－１２株のｙｈｂＪ遺伝子が挙げられる。エシェリヒア・コリ Ｋ－１２株のｙｈｂＪ遺伝子の塩基配列及び該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、公用のデータベースから取得できる。エシェリヒア・コリ Ｋ－１２株のｙｈｂＪ遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＢＡＥ７７２４９．１として登録されている。
ｙｈｂＪ遺伝子としては、エシェリヒア属由来のｙｈｂＪ遺伝子が好ましい。具体的には例えば、エシェリヒア・コリ Ｋ－１２株のｙｈｂＪ遺伝子が挙げられる。エシェリヒア・コリ Ｋ－１２株のｙｈｂＪ遺伝子の塩基配列及び該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、公用のデータベースから取得できる。エシェリヒア・コリ Ｋ－１２株のｙｈｂＪ遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＢＡＥ７７２４９．１として登録されている。
【0075】
ｙｈｂＪ遺伝子としては、配列番号２７に示す塩基配列を含むＤＮＡまたは、配列番号２７に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含みかつヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌においてｙｈｂＪ遺伝子の機能を欠損させる遺伝子改変をした際にｇｌｍＳ遺伝子の発現を増大させるＤＮＡが挙げられる。
【0076】
ｙｈｂＪ遺伝子の活性は、ＧｌｍＳの発現量をノーザンブロット法、ウエスタンブロット法などで調べることにより確認できる[Kalamorz F. et al, (2007) “Feedback control of glucosamine-6-phosphate synthase GlmS expression depends on the small RNA GlmZ and involves the novel protein YhbJ in Escherichia coli.” Mol Microbiol. 65(6):1518-33]。
【0077】
（（遺伝子の機能を欠損させる遺伝子改変））
本明細書において、標的の遺伝子の機能を欠損させる遺伝子改変としては、宿主の細菌のゲノムＤＮＡのうち標的の遺伝子に相当する部分をコードするＤＮＡに改変を加えることにより、標的の遺伝子の機能を欠損させ、標的の遺伝子に相当する部分がコードするタンパク質の機能を低減若しくは完全に停止させることが挙げられる。
本明細書において、標的の遺伝子の機能を欠損させる遺伝子改変としては、宿主の細菌のゲノムＤＮＡのうち標的の遺伝子に相当する部分をコードするＤＮＡに改変を加えることにより、標的の遺伝子の機能を欠損させ、標的の遺伝子に相当する部分がコードするタンパク質の機能を低減若しくは完全に停止させることが挙げられる。
【0078】
本発明の方法において、標的の遺伝子に相当する部分をコードするＤＮＡに加える改変の形態は、標的の遺伝子に相当する部分がコードするタンパク質の機能を低減若しくは完全に停止させるような形態であれば特に限定されず、公知の方法を適宜用いることができる。
【0079】
標的の遺伝子に相当する部分がコードするタンパク質の機能を低減若しくは完全に停止させるような形態としては、例えば、次の（Ｉ）から（ＩＩＩ）のいずれか１の改変が例示できる。
（Ｉ）標的の遺伝子に相当する部分をコードするＤＮＡの全部または一部を除去する。
（ＩＩ）標的の遺伝子に相当する部分をコードするＤＮＡに、１または数個の塩基を置換、欠失もしくは付加する。
（ＩＩＩ）標的の遺伝子に相当する部分をコードするＤＮＡを、改変前のＤＮＡ配列との同一性が８０％未満であるＤＮＡ配列と置き換える。
（Ｉ）標的の遺伝子に相当する部分をコードするＤＮＡの全部または一部を除去する。
（ＩＩ）標的の遺伝子に相当する部分をコードするＤＮＡに、１または数個の塩基を置換、欠失もしくは付加する。
（ＩＩＩ）標的の遺伝子に相当する部分をコードするＤＮＡを、改変前のＤＮＡ配列との同一性が８０％未満であるＤＮＡ配列と置き換える。
【0080】
標的の遺伝子の機能の欠損としては、例えば、非改変株と比較して、標的の遺伝子の活性が好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下であることが挙げられる。
【0081】
［ヘパロサンの製造方法］
本発明の一態様のヘパロサンの製造方法は、上述の本発明の一態様のヘパロサン生産微生物を培地で培養することを含む。
本発明の一態様のヘパロサンの製造方法は、上述の本発明の一態様のヘパロサン生産微生物を培地で培養することを含む。
【0082】
使用する培地は、本発明の一態様のヘパロサン生産微生物が増殖でき、ヘパロサンが生成蓄積される限り、特に制限されない。本明細書において、培地としては、例えば、細菌の培養に用いられる通常の培地を用いることができる。培地として、例えば、ＬＢ培地（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ培地）、ミネラル培地（Carbohydrate Research, 2012, 360, 19-24）が挙げられるが、これらに限定されない。培地としては、例えば、炭素源、窒素源、リン酸源、硫黄源、その他の各種有機成分や無機成分から選択される成分を必要に応じて含有する培地を用いることができる。培地成分の種類や濃度は、当業者が適宜設定してよい。
【0083】
本明細書において、炭素源は、本発明の細菌が資化してヘパロサンを生成し得るものであれば、特に限定されない。炭素源としては、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、廃糖蜜、澱粉加水分解物、バイオマスの加水分解物等の糖類、酢酸、フマル酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸等の有機酸類、グリセロール、粗グリセロール、エタノール等のアルコール類、脂肪酸類が挙げられる。炭素源としては、１種の炭素源を用いてもよく、２種以上の炭素源を組み合わせてもよい。
【0084】
本明細書において、窒素源としては、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆タンパク質分解物等の有機窒素源、アンモニア、ウレアが挙げられる。窒素源としては、１種の窒素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の窒素源を組み合わせてもよい。
【0085】
本明細書において、リン酸源としては、例えば、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム等のリン酸塩、ピロリン酸等のリン酸ポリマーが挙げられる。リン酸源としては、１種のリン酸源を用いてもよく、２種またはそれ以上のリン酸源を組み合わせてもよい。
【0086】
本明細書において、硫黄源としては、例えば、硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩等の無機硫黄化合物、システイン、シスチン、グルタチオン等の含硫アミノ酸が挙げられる。硫黄源としては、１種の硫黄源を用いてもよく、２種またはそれ以上の硫黄源を組み合わせてもよい。
【0087】
本明細書において、その他の各種有機成分や無機成分として、具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類；鉄、マンガン、マグネシウム、カルシウム等の微量金属類；ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビタミンＢ１２等のビタミン類；アミノ酸類；核酸類；これらを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆タンパク質分解物等の有機成分が挙げられる。その他の各種有機成分や無機成分としては、１種の成分を用いてもよく、２種またはそれ以上の成分を組み合わせて用いてもよい。
【0088】
また、本明細書において、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には、培地に要求される栄養素を補添することが好ましい。また、抗生物質耐性遺伝子を搭載するベクターを用いて遺伝子を導入した際は、培地に対応する抗生物質を添加するのが好ましい。
【0089】
本明細書において、培養条件は、本発明の細菌が増殖でき、ヘパロサンが生成蓄積される限り、特に制限されない。培養は、例えば、細菌の培養に用いられる通常の条件で実施できる。培養条件は、当業者が適宜設定してよい。
【0090】
本明細書において、培養は、例えば、液体培地を用いて、通気培養または振盪培養により、好気的に実施できる。培養温度は、例えば、３０～３７℃であってよい。培養期間は、例えば、１６～７２時間であってよい。培養は、回分培養（ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、流加培養（Ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、連続培養（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅ）、またはそれらの組み合わせにより実施できる。また、培養は、前培養と本培養とに分けてもよい。前培養は、例えば、平板培地や液体培地を用いて行ってよい。
【0091】
本明細書において、培養中の液体培地のｐＨは、例えば、ｐＨ４．０～９．０が好ましく、ｐＨ５．０～８．０がより好ましく、ｐＨ６．０～７．５が最も好ましい。特にｐＨ６．０～７．５に保って培養を行うことにより、重量平均分子量（Ｍｗ）２５００００～５０００００のヘパロサンが得られ、このようなヘパロサンは、ヘパロサン由来化合物の製造に好ましい。
【0092】
上記のようにして本発明の一態様のヘパロサン生産微生物を培養することにより、該微生物内及び培地中の少なくとも一方にヘパロサンが蓄積する。
【0093】
培養液からヘパロサンを回収する方法は、ヘパロサンが回収されうる限り、特に制限されない。培養液からヘパロサンを回収する方法としては、例えば、実施例に記載する方法が挙げられる。具体的には、例えば、培養後の微生物を含む培養液を破砕後、培養液から培養上清を分離し、次いで、プロパノールまたはエタノール沈殿によって上清中のヘパロサンを沈降できる。添加するプロパノールまたはエタノールの量は、例えば、上清液量の２．５～３．５倍量であってよい。ヘパロサンの沈降には、プロパノールまたはエタノールに限られず、水と任意に混和する有機溶媒を使用できる。
【0094】
前記有機溶媒としては、プロパノールおよびエタノールに加えて、メタノール、イソプロパノール、ｎ－ブタノール、ｔ－ブタノール、ｓｅｃ－ブタノール、プロピレングリコール、アセトニトリル、アセトン、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、Ｎ－メチルピロリドン、ピリジン、１，２－ジメトキシエタン、１，４－ジオキサン、ＴＨＦが挙げられる。
【0095】
沈殿したヘパロサンは、例えば、元の上清液量の２倍量の水に溶解できる。回収されるヘパロサンは、ヘパロサン以外に、細菌菌体、培地成分、水分、及び細菌の代謝副産物等の成分を含んでいてもよい。ヘパロサンは、所望の程度に精製されていてよい。ヘパロサンの純度は、例えば、３０％（ｗ／ｗ）以上、５０％（ｗ／ｗ）以上、７０％（ｗ／ｗ）以上、８０％（ｗ／ｗ）以上、９０％（ｗ／ｗ）以上、または９５％（ｗ／ｗ）以上であってよい。
【0096】
ヘパロサンの検出および定量は、公知の方法により実施できる。具体的には例えば、実施例で後述するように、ＨＰＬＣ分析によって培養液中のヘパロサン濃度を測定できる。
【0097】
本発明の一態様のヘパロサンの製造方法により得られるヘパロサンの重量平均分子量（Ｍｗ）は、好ましくは１０００００～７０００００、より好ましくは２０００００～６０００００、最も好ましくは２５００００～５０００００である。ヘパロサンの重量平均分子量の測定は、公知の方法により実施できる（国際公開第２０１７／１１５６７４号）。
【0098】
［ヘパロサン由来化合物の製造方法］
本発明の一態様のヘパロサン由来化合物の製造方法は、上述の本発明の一態様のヘパロサン生産微生物を培地で培養することを含む。
本発明の一態様のヘパロサン由来化合物の製造方法は、上述の本発明の一態様のヘパロサン生産微生物を培地で培養することを含む。
【0099】
製造されるヘパロサン由来化合物としては、Ｎ－脱アセチル化ヘパロサン、Ｎ－硫酸化ヘパロサン、Ｎ－硫酸化エピメリ化ヘパロサン、Ｎ－硫酸化低分子化ヘパロサン、Ｎ－硫酸化エピメリ化低分子化ヘパロサン、Ｎ－硫酸化６－Ｏ－硫酸化ヘパロサン、Ｎ－硫酸化６－Ｏ－硫酸化エピメリ化ヘパロサン、Ｎ－硫酸化２－Ｏ－硫酸化６－Ｏ－硫酸化ヘパロサン、Ｎ－硫酸化２－Ｏ－硫酸化６－Ｏ－硫酸化エピメリ化低分子化ヘパロサン、Ｎ－硫酸化６－Ｏ－硫酸化低分子化ヘパロサン、Ｎ－硫酸化６－Ｏ－硫酸化エピメリ化低分子化ヘパロサン、Ｎ－硫酸化２－Ｏ－硫酸化６－Ｏ－硫酸化低分子化ヘパロサン、Ｎ－硫酸化２－Ｏ－硫酸化６－Ｏ－硫酸化エピメリ化低分子化ヘパロサン、ヘパラン硫酸、低分子量ヘパリン又はヘパリンが好ましく、Ｎ－脱アセチル化ヘパロサン又はヘパリンがより好ましく、ヘパリンが最も好ましい。
【0100】
「Ｎ－脱アセチル化」とは、ヘパロサンのＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン残基のＮ－アセチル基が脱アセチル化されていることを意味する。
「Ｎ－硫酸化」とは、Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンのアミノ基が硫酸化されていることを意味する。
「エピメリ化」とは、ヘパロサンのβ－Ｄ－グルクロン酸残基がα－Ｌ－イズロン酸残基に変換されていることを意味する。
「低分子化」（ｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）とは、分子量が小さくなるように処理されることを意味する。例えば、「低分子化」ヘパロサン化合物は、プルランを標準としてＧＰＣにより測定される値として、１０００～１５００００、好ましくは、８０００～６００００の数平均分子量（Ｍｎ）、および２０００～３０００００、好ましくは、１００００～１０００００の重量平均分子量（Ｍｗ）を有する。
「６－Ｏ－硫酸化」とは、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン残基の６位の水酸基が硫酸化されていることを意味する。
「２－Ｏ－硫酸化」とは、ヘキスロン酸残基（好ましくはα－Ｌ－イズロン酸残基）の２位の水酸基が硫酸化されていることを意味する。
「Ｎ－硫酸化」とは、Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンのアミノ基が硫酸化されていることを意味する。
「エピメリ化」とは、ヘパロサンのβ－Ｄ－グルクロン酸残基がα－Ｌ－イズロン酸残基に変換されていることを意味する。
「低分子化」（ｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）とは、分子量が小さくなるように処理されることを意味する。例えば、「低分子化」ヘパロサン化合物は、プルランを標準としてＧＰＣにより測定される値として、１０００～１５００００、好ましくは、８０００～６００００の数平均分子量（Ｍｎ）、および２０００～３０００００、好ましくは、１００００～１０００００の重量平均分子量（Ｍｗ）を有する。
「６－Ｏ－硫酸化」とは、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン残基の６位の水酸基が硫酸化されていることを意味する。
「２－Ｏ－硫酸化」とは、ヘキスロン酸残基（好ましくはα－Ｌ－イズロン酸残基）の２位の水酸基が硫酸化されていることを意味する。
【0101】
本発明のヘパロサン由来化合物の製造方法の一態様は、上述の本発明の一態様のヘパロサン生産微生物を培地で培養する工程に加えて、以下の工程の少なくとも１つを有していてもよい。以下の工程は、ヘパロサンからヘパリンを製造する際の工程の例である（国際公開第２０１７／１１５６７４号、国際公開第２０１７／１１５６７５号、国際公開第２０１８／０４８９７３号、国際公開第２０２１／２０１２８２号）。
・ヘパロサンを部分的にＮ－脱アセチル化する工程
・Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンのアミノ基を硫酸化する工程
・ヘパロサンを分解して、より低分子量のヘパロサンを生成する工程
・ヘパロサン中のβ－Ｄ－グルクロン酸残基を、エピマーであるα－Ｌ－イズロン酸（ＩｄｏＡ）残基に異性化する工程
・ヘパロサン中のヘキスロン酸残基（好ましくはα－Ｌ－イズロン酸残基）中の２位の水酸基を硫酸化する工程
・ヘパロサン中のα－Ｄ－グルコサミン残基の６位の水酸基を硫酸化する工程
・ヘパロサン中のα－Ｄ－グルコサミン残基の３位の水酸基を硫酸化する工程
・ヘパリンを分解して、低分子量ヘパリンを生成する工程
・ヘパロサンを部分的にＮ－脱アセチル化する工程
・Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンのアミノ基を硫酸化する工程
・ヘパロサンを分解して、より低分子量のヘパロサンを生成する工程
・ヘパロサン中のβ－Ｄ－グルクロン酸残基を、エピマーであるα－Ｌ－イズロン酸（ＩｄｏＡ）残基に異性化する工程
・ヘパロサン中のヘキスロン酸残基（好ましくはα－Ｌ－イズロン酸残基）中の２位の水酸基を硫酸化する工程
・ヘパロサン中のα－Ｄ－グルコサミン残基の６位の水酸基を硫酸化する工程
・ヘパロサン中のα－Ｄ－グルコサミン残基の３位の水酸基を硫酸化する工程
・ヘパリンを分解して、低分子量ヘパリンを生成する工程
【0102】
上記の工程により、培養物中または反応液中にヘパロサン由来化合物を生成させることにより、ヘパロサン由来化合物を製造できる。培養物中及び反応液中のヘパロサン由来化合物の定量は、カルバゾール法(Bitter and Muir, Anal Biochem, 1962, 4: 330-334)を用いて実施できる。
【0103】
該培養物中または該反応液中からのヘパロサン由来化合物の採取は、通常、イオン交換樹脂法、沈殿法、その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。採取したヘパロサン由来化合物の定量、分析としては、紫外可視吸光度検出器（ＵＶ）および示差屈折率検出器（ＲＩ）を使用した水系サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（ＳＥＣ－ＲＩ／ＵＶ法）、ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ、ＮＭＲが挙げられる。これらの手法は、単独で、あるいは適宜組み合わせて用いることができる。
【実施例0104】
以下に、実施例をあげて本発明を具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り以下の実施例に限定されるものではない。
【0105】
［分析例］
実施例において、ヘパロサンの濃度（ｇ／Ｌ）の測定は以下に示す手順で行った。
培養後の微生物を含む培養液をビーズショッカーにて破砕後、遠心分離し上清を回収した。該上清に１０Ｎ水酸化ナトリウムを６％（ｖ／ｖ）、濃塩酸を１０％（ｖ／ｖ）添加し、イソプロパノール沈殿によりヘパロサンを回収した。回収したヘパロサンを蒸留水に溶解したものをヘパロサンサンプルとした。下記の条件でＨＰＬＣ分析を行った。
実施例において、ヘパロサンの濃度（ｇ／Ｌ）の測定は以下に示す手順で行った。
培養後の微生物を含む培養液をビーズショッカーにて破砕後、遠心分離し上清を回収した。該上清に１０Ｎ水酸化ナトリウムを６％（ｖ／ｖ）、濃塩酸を１０％（ｖ／ｖ）添加し、イソプロパノール沈殿によりヘパロサンを回収した。回収したヘパロサンを蒸留水に溶解したものをヘパロサンサンプルとした。下記の条件でＨＰＬＣ分析を行った。
【0106】
［ＨＰＬＣ分析条件］
カラム：ＴＳＫ Ｇｅｌ Ｇ６０００ ＰＷ
カラム温度：３０℃
遊離液組成：１００ｍＭ 酢酸アンモニウム水溶液
流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎ
検出器；ＲＩＤ－１０Ａ（株式会社島津製作所製）
カラム：ＴＳＫ Ｇｅｌ Ｇ６０００ ＰＷ
カラム温度：３０℃
遊離液組成：１００ｍＭ 酢酸アンモニウム水溶液
流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎ
検出器；ＲＩＤ－１０Ａ（株式会社島津製作所製）
【0107】
標準試薬としてヘパリン（Ｃｅｌｓｕｓ社製）を用いた。標準試薬を５ｇ／Ｌとなるよう蒸留水に溶解させ、ＨＰＬＣ分析を行った。得られたエリア値からヘパロサンサンプルの濃度を相対的に定量した。
【0108】
［実施例１］ヘパロサンの製造に用いる微生物の造成
（１）ヘパロサン生産遺伝子発現用プラスミドの造成
大腸菌 Ｎｉｓｓｌｅ １９１７株のヘパロサン合成遺伝子ｋｆｉＡ、ｋｆｉＣおよびｋｆｉＤを発現させるプラスミドを、２種類のリンカー配列を使用して以下の手順で作成した。
大腸菌 Ｎｉｓｓｌｅ １９１７株および大腸菌 Ｋ株を周知の培養方法により培養し、微生物のゲノムＤＮＡを単離精製した。トリガーファクター断片とｋｆｉＣＤ断片間のリンカー配列がリンカー１（配列番号２１、２２）となるよう設計した表１に示すプライマーセットを用いて、表１の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各増幅ＤＮＡ断片を得た。
（１）ヘパロサン生産遺伝子発現用プラスミドの造成
大腸菌 Ｎｉｓｓｌｅ １９１７株のヘパロサン合成遺伝子ｋｆｉＡ、ｋｆｉＣおよびｋｆｉＤを発現させるプラスミドを、２種類のリンカー配列を使用して以下の手順で作成した。
大腸菌 Ｎｉｓｓｌｅ １９１７株および大腸菌 Ｋ株を周知の培養方法により培養し、微生物のゲノムＤＮＡを単離精製した。トリガーファクター断片とｋｆｉＣＤ断片間のリンカー配列がリンカー１（配列番号２１、２２）となるよう設計した表１に示すプライマーセットを用いて、表１の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各増幅ＤＮＡ断片を得た。
【0109】
【表1】
【0110】
上記で得られたｋｆｉＡ断片、ｋｆｉＣＤ断片及びトリガーファクター断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号１および配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲを実施し、ｋｆｉＡ断片、トリガーファクター断片およびｋｆｉＣＤ断片を連結させた約５．３ＫＢのＤＮＡ断片（以下、ｋｆｉＡ－ＴＦリンカー１－ｋｆｉＣＤ断片という）を得た。
ｋｆｉＡ－ＴＦリンカー１－ｋｆｉＣＤ断片と発現ベクターｐＱＥ８０Ｌ（Ｑｉａｇｅｎ社製）をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結することにより、発現プラスミドｐＱＥ８０Ｌ－ｋｆｉＡ－ＴＦリンカー１－ｋｆｉＣＤ（以下、ｐＫｆｉＡＣＤ１という）を得た。
ｋｆｉＡ－ＴＦリンカー１－ｋｆｉＣＤ断片と発現ベクターｐＱＥ８０Ｌ（Ｑｉａｇｅｎ社製）をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結することにより、発現プラスミドｐＱＥ８０Ｌ－ｋｆｉＡ－ＴＦリンカー１－ｋｆｉＣＤ（以下、ｐＫｆｉＡＣＤ１という）を得た。
【0111】
またトリガーファクター断片とｋｆｉＣＤ断片間のリンカー配列がリンカー２（配列番号２３、２４）となるよう設計した表２に示すプライマーセットを用いて、表２の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各増幅ＤＮＡ断片を得た。
【0112】
【表2】
【0113】
上記で得られたｋｆｉＡ－トリガーファクター断片、ｋｆｉＣＤ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号１および９で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲを実施し、ｋｆｉＡ－トリガーファクター断片およびｋｆｉＣＤ断片を結合させた約５．３ｋｂのＤＮＡ断片（以下、ｋｆｉＡ－ＴＦリンカー２－ｋｆｉＣＤ断片という）を得た。
ｋｆｉＡ－ＴＦリンカー２－ｋｆｉＣＤ断片と発現ベクターｐＱＥ８０ＬをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて連結することにより、発現プラスミドｐＱＥ８０Ｌ－ｋｆｉＡ－ＴＦリンカー２－ｋｆｉＣＤ（以下、ｐＫｆｉＡＣＤ２という）を得た。
ｋｆｉＡ－ＴＦリンカー２－ｋｆｉＣＤ断片と発現ベクターｐＱＥ８０ＬをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて連結することにより、発現プラスミドｐＱＥ８０Ｌ－ｋｆｉＡ－ＴＦリンカー２－ｋｆｉＣＤ（以下、ｐＫｆｉＡＣＤ２という）を得た。
【0114】
（２）前駆体であるＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ生産強化株の造成
ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ生合成に関わるＬ－グルタミン－Ｄ－フルクトース６リン酸アミノトランスフェラーゼをコードするｇｌｍＳ遺伝子の発現プラスミドを導入した大腸菌株および、ｇｌｍＳ遺伝子の活性を負に制御する転写制御因子をコードするｙｈｂＪ遺伝子を破壊した大腸菌株を以下の手順で作成した。
ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ生合成に関わるＬ－グルタミン－Ｄ－フルクトース６リン酸アミノトランスフェラーゼをコードするｇｌｍＳ遺伝子の発現プラスミドを導入した大腸菌株および、ｇｌｍＳ遺伝子の活性を負に制御する転写制御因子をコードするｙｈｂＪ遺伝子を破壊した大腸菌株を以下の手順で作成した。
【0115】
１：ｇｌｍＳ発現プラスミド導入株の造成
ｇｌｍＳ遺伝子を発現させるプラスミドを以下の手順で作製した。
大腸菌 Ｗ株を周知の培養方法により培養し、微生物のゲノムＤＮＡを単離精製した。表３に示すプライマーセットを用いて、表３の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各増幅ＤＮＡ断片を得た。
ｇｌｍＳ遺伝子を発現させるプラスミドを以下の手順で作製した。
大腸菌 Ｗ株を周知の培養方法により培養し、微生物のゲノムＤＮＡを単離精製した。表３に示すプライマーセットを用いて、表３の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各増幅ＤＮＡ断片を得た。
【0116】
【表3】
【0117】
上記で得られたｇｌｍＳ断片およびトリプトファンプロモーター断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号１２および１１で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲを実施し、トリプトファンプロモーター断片とｇｌｍＳ断片を連結させた約２．２ｋｂのＤＮＡ断片（以下、トリプトファンプロモーター－ｇｌｍＳ断片という）を得た。
トリプトファンプロモーター－ｇｌｍＳ断片と発現ベクターｐＭＷ２１９（ニッポンジーン社製）をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて連結することにより、発現プラスミドｐＭＷ２１９―ｇｌｍＳを得た。
ｐＭＷ２１９―ｇｌｍＳをＢＷ２５１１３株（Ｋｅｉｏ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｓｉｎｇｌｅ－ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２））に形質転換した。形質転換にあたっては、カナマイシン硫酸塩５０ｍｇ／Ｌを含む寒天培地で選抜した。この形質転換によって得られた菌株をＢＷ２５１１３／ｐＭＷ２１９－ｇｌｍＳ株とした。
トリプトファンプロモーター－ｇｌｍＳ断片と発現ベクターｐＭＷ２１９（ニッポンジーン社製）をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて連結することにより、発現プラスミドｐＭＷ２１９―ｇｌｍＳを得た。
ｐＭＷ２１９―ｇｌｍＳをＢＷ２５１１３株（Ｋｅｉｏ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｓｉｎｇｌｅ－ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２））に形質転換した。形質転換にあたっては、カナマイシン硫酸塩５０ｍｇ／Ｌを含む寒天培地で選抜した。この形質転換によって得られた菌株をＢＷ２５１１３／ｐＭＷ２１９－ｇｌｍＳ株とした。
【0118】
２：ｙｈｂＪ破壊株の造成
ＢＷ２５１１３株を宿主として用い、Ｂａｂａら［Baba T. et al. (2006) Mol systems Biol］と同様の方法により、ｙｈｂＪ遺伝子を完全に欠損させたＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪ株を得た。
なお、遺伝子破壊の際にマーカーとして用いるＤＮＡ断片の取得は以下の方法で行った。まず、Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８株のゲノムＤＮＡを定法により調製した。表４の「プライマーセット」に表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、表４の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各増幅ＤＮＡ断片を得た。
ＢＷ２５１１３株を宿主として用い、Ｂａｂａら［Baba T. et al. (2006) Mol systems Biol］と同様の方法により、ｙｈｂＪ遺伝子を完全に欠損させたＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪ株を得た。
なお、遺伝子破壊の際にマーカーとして用いるＤＮＡ断片の取得は以下の方法で行った。まず、Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８株のゲノムＤＮＡを定法により調製した。表４の「プライマーセット」に表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、表４の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各増幅ＤＮＡ断片を得た。
【0119】
【表4】
【0120】
次に、増幅ＤＮＡ断片のｃａｔおよびｓａｃＢを等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号１４および１７で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、ｃａｔ遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。これをｙｈｂＪ破壊の際にマーカーとして用いた。
【0121】
（３）ヘパロサン生産用プラスミドを有する微生物の造成
上記（２）で得られたＢＷ２５１１３／ｐＭＷ２１９－ｇｌｍＳ株およびＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪ株に、上記（１）で得られたｐＫｆｉＡＣＤ１またはｐＫｆｉＡＣＤ２プラスミドを形質転換した。形質転換にあたっては、ＢＷ２５１１３／ｐＭＷ２１９－ｇｌｍＳ株の場合はアンピシリンナトリウム５０ｍｇ／Ｌ、カナマイシン硫酸塩５０ｍｇ／Ｌを含む寒天培地で、ＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪ株の場合はアンピシリンナトリウム５０ｍｇ／Ｌを含む寒天培地で選抜した。形質転換により取得した株をそれぞれ、ＢＷ２５１１３／ｐＭＷ２１９－ｇｌｍＳ、ｐＫｆｉＡＣＤ１株、ＢＷ２５１１２／ｐＭＷ２１９－ｇｌｍＳ、ｐＫｆｉＡＣＤ２株、ＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪ／ｐＫｆｉＡＣＤ１株、ＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪ／ｐＫｆｉＡＣＤ２株と命名した。
上記（２）で得られたＢＷ２５１１３／ｐＭＷ２１９－ｇｌｍＳ株およびＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪ株に、上記（１）で得られたｐＫｆｉＡＣＤ１またはｐＫｆｉＡＣＤ２プラスミドを形質転換した。形質転換にあたっては、ＢＷ２５１１３／ｐＭＷ２１９－ｇｌｍＳ株の場合はアンピシリンナトリウム５０ｍｇ／Ｌ、カナマイシン硫酸塩５０ｍｇ／Ｌを含む寒天培地で、ＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪ株の場合はアンピシリンナトリウム５０ｍｇ／Ｌを含む寒天培地で選抜した。形質転換により取得した株をそれぞれ、ＢＷ２５１１３／ｐＭＷ２１９－ｇｌｍＳ、ｐＫｆｉＡＣＤ１株、ＢＷ２５１１２／ｐＭＷ２１９－ｇｌｍＳ、ｐＫｆｉＡＣＤ２株、ＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪ／ｐＫｆｉＡＣＤ１株、ＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪ／ｐＫｆｉＡＣＤ２株と命名した。
【0122】
［実施例２］発酵法によるヘパロサンの製造
実施例１で得られたＢＷ２５１１３／ｐＭＷ２１９－ｇｌｍＳ、ｐＫｆｉＡＣＤ１株、ＢＷ２５１１２／ｐＭＷ２１９－ｇｌｍＳ、ｐＫｆｉＡＣＤ２株、ＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪ／ｐＫｆｉＡＣＤ１株、ＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪ／ｐＫｆｉＡＣＤ２株を下記の手順で培養し、ヘパロサンの生産試験を行った。なお、各菌株について３サンプルずつ培養及び培養液の分析を行い、測定結果は３サンプルの平均値で示した。
まず、各菌株をＬＢプレート上で３０℃にて終夜培養した後、ＬＢ培地５ｍｌが入った太型試験管に植菌して、３０℃で１７時間培養した。
次に該培養液を生産培地［グルコース ２０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水和物 １．０ｇ／Ｌ、リン酸１カリウム １３．５ｇ／Ｌ、リン酸アンモニウム ４ｇ／Ｌ、クエン酸 １．７ｇ／Ｌ、ビタミンＢ１ １０ｍｇ／Ｌ、硫酸鉄７水和物 １００ｍｇ／Ｌ、塩化カルシウム １０ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛７水和物 ２２ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン４水和物 ５ｍｇ／Ｌ、硫酸銅５水和物 １０ｍｇ／Ｌ、モリブデン酸アンモニウム４水和物 １ｍｇ／Ｌ、ホウ酸ナトリウム１０水和物 ０．２ｍｇ／Ｌ（水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ６．８に調整した後オートクレーブした）（硫酸鉄７水和物、塩化カルシウム、硫酸亜鉛７水和物、硫酸マンガン４水和物、硫酸銅５水和物、モリブデン酸アンモニウム４水和物およびホウ酸ナトリウム１０水和物は塩酸に溶解させ別途調整し、オートクレーブ前に混合した）（グルコースおよび硫酸マグネシウム７水和物は別途調整してオートクレーブし、冷却後に混合した）］が５ｍｌ入った太型試験管に１％植菌後、３０℃で振盪培養した。６時間後に誘導剤であるＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるよう添加しさらに２４時間振盪培養した。なお、ＢＷ２５１１３／ｐＭＷ２１９－ｇｌｍＳ、ｐＫｆｉＡＣＤ１株、ＢＷ２５１１２／ｐＭＷ２１９－ｇｌｍＳ、ｐＫｆｉＡＣＤ２株の培養には上記の各培地にアンピシリンナトリウム５０ｍｇ／Ｌおよびカナマイシン硫酸塩５０ｍｇ／Ｌを、ＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪ／ｐＫｆｉＡＣＤ１株、ＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪ／ｐＫｆｉＡＣＤ２株の培養にはアンピシリンナトリウム５０ｍｇ／Ｌをそれぞれ添加した培地を使用した。
実施例１で得られたＢＷ２５１１３／ｐＭＷ２１９－ｇｌｍＳ、ｐＫｆｉＡＣＤ１株、ＢＷ２５１１２／ｐＭＷ２１９－ｇｌｍＳ、ｐＫｆｉＡＣＤ２株、ＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪ／ｐＫｆｉＡＣＤ１株、ＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪ／ｐＫｆｉＡＣＤ２株を下記の手順で培養し、ヘパロサンの生産試験を行った。なお、各菌株について３サンプルずつ培養及び培養液の分析を行い、測定結果は３サンプルの平均値で示した。
まず、各菌株をＬＢプレート上で３０℃にて終夜培養した後、ＬＢ培地５ｍｌが入った太型試験管に植菌して、３０℃で１７時間培養した。
次に該培養液を生産培地［グルコース ２０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水和物 １．０ｇ／Ｌ、リン酸１カリウム １３．５ｇ／Ｌ、リン酸アンモニウム ４ｇ／Ｌ、クエン酸 １．７ｇ／Ｌ、ビタミンＢ１ １０ｍｇ／Ｌ、硫酸鉄７水和物 １００ｍｇ／Ｌ、塩化カルシウム １０ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛７水和物 ２２ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン４水和物 ５ｍｇ／Ｌ、硫酸銅５水和物 １０ｍｇ／Ｌ、モリブデン酸アンモニウム４水和物 １ｍｇ／Ｌ、ホウ酸ナトリウム１０水和物 ０．２ｍｇ／Ｌ（水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ６．８に調整した後オートクレーブした）（硫酸鉄７水和物、塩化カルシウム、硫酸亜鉛７水和物、硫酸マンガン４水和物、硫酸銅５水和物、モリブデン酸アンモニウム４水和物およびホウ酸ナトリウム１０水和物は塩酸に溶解させ別途調整し、オートクレーブ前に混合した）（グルコースおよび硫酸マグネシウム７水和物は別途調整してオートクレーブし、冷却後に混合した）］が５ｍｌ入った太型試験管に１％植菌後、３０℃で振盪培養した。６時間後に誘導剤であるＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるよう添加しさらに２４時間振盪培養した。なお、ＢＷ２５１１３／ｐＭＷ２１９－ｇｌｍＳ、ｐＫｆｉＡＣＤ１株、ＢＷ２５１１２／ｐＭＷ２１９－ｇｌｍＳ、ｐＫｆｉＡＣＤ２株の培養には上記の各培地にアンピシリンナトリウム５０ｍｇ／Ｌおよびカナマイシン硫酸塩５０ｍｇ／Ｌを、ＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪ／ｐＫｆｉＡＣＤ１株、ＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪ／ｐＫｆｉＡＣＤ２株の培養にはアンピシリンナトリウム５０ｍｇ／Ｌをそれぞれ添加した培地を使用した。
【0123】
また、培養液を分析例に記載の方法で前処理し、ＨＰＬＣ分析によって培養液中のヘパロサン濃度を測定した。結果を表５に示す。
【0124】
【表5】
【0125】
表５の結果から、大腸菌Ｋ株にヘパロサン生産に関与するｋｆｉＡおよびｋｆｉＣ遺伝子を導入することにより、ヘパロサンの生産が可能となることが分かった。また、Ｌ－グルタミン－Ｄ－フルクトース６リン酸アミノトランスフェラーゼの発現強化に関しては、ｙｈｂＪ遺伝子の機能を欠損させる遺伝子改変を導入した株と比較して、ｇｌｍＳ遺伝子のコピー数を高める遺伝子改変を導入した株において培養液中のヘパロサン濃度が高かった。
【配列表フリーテキスト】
【0126】
配列番号１：大腸菌 Ｎｉｓｓｌｅ １９１７株由来ｋｆｉＡ遺伝子増幅用プライマーＦの塩基配列
配列番号２：大腸菌 Ｎｉｓｓｌｅ １９１７株由来ｋｆｉＡ遺伝子増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号３：大腸菌 Ｎｉｓｓｌｅ １９１７株由来ｋｆｉＣＤ遺伝子増幅用プライマーＦの塩基配列
配列番号４：大腸菌 Ｎｉｓｓｌｅ １９１７株由来ｋｆｉＣＤ遺伝子増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号５：大腸菌 Ｋ株由来ｔｉｇ遺伝子増幅用プライマーＦの塩基配列
配列番号６：大腸菌 Ｋ株由来ｔｉｇ遺伝子増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号７：大腸菌 Ｋ株由来ｔｉｇ遺伝子増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号８：大腸菌 Ｎｉｓｓｌｅ １９１７株由来ｋｆｉＣＤ遺伝子増幅用プライマーＦの塩基配列
配列番号９：大腸菌 Ｎｉｓｓｌｅ １９１７株由来ｋｆｉＣＤ遺伝子増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号１０：大腸菌 Ｗ株由来ｇｌｍＳ遺伝子増幅用プライマーＦの塩基配列
配列番号１１：大腸菌 Ｗ株由来ｇｌｍＳ遺伝子増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号１２：大腸菌 Ｗ株由来トリプトファンプロモーター遺伝子増幅用プライマーＦの塩基配列
配列番号１３：大腸菌 Ｗ株由来トリプトファンプロモーター遺伝子増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号１４：ｐＨＳＧ３９６のｃａｔ遺伝子増幅用プライマーＦの塩基配列
配列番号１５：ｐＨＳＧ３９６のｃａｔ遺伝子増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号１６：Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８株由来ｓａｃＢ遺伝子増幅用プライマーＦの塩基配列
配列番号１７：Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８株由来ｓａｃＢ遺伝子増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号１８：大腸菌 Ｎｉｓｓｌｅ株由来ｋｆｉＡ遺伝子の塩基配列
配列番号１９：大腸菌 Ｎｉｓｓｌｅ株由来ｋｆｉＣ遺伝子の塩基配列
配列番号２０：大腸菌 Ｋ－１２株由来ｔｉｇ遺伝子の塩基配列
配列番号２１：リンカー１の塩基配列
配列番号２２：リンカー１のアミノ酸配列
配列番号２３：リンカー２の塩基配列
配列番号２４：リンカー２のアミノ酸配列
配列番号２５：大腸菌 Ｎｉｓｓｌｅ株由来ｋｆｉＤ遺伝子の塩基配列
配列番号２６：大腸菌 Ｗ株由来ｇｌｍＳ遺伝子の塩基配列
配列番号２７：大腸菌 Ｋ－１２株由来ｙｈｂＪ遺伝子の塩基配列
配列番号２：大腸菌 Ｎｉｓｓｌｅ １９１７株由来ｋｆｉＡ遺伝子増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号３：大腸菌 Ｎｉｓｓｌｅ １９１７株由来ｋｆｉＣＤ遺伝子増幅用プライマーＦの塩基配列
配列番号４：大腸菌 Ｎｉｓｓｌｅ １９１７株由来ｋｆｉＣＤ遺伝子増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号５：大腸菌 Ｋ株由来ｔｉｇ遺伝子増幅用プライマーＦの塩基配列
配列番号６：大腸菌 Ｋ株由来ｔｉｇ遺伝子増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号７：大腸菌 Ｋ株由来ｔｉｇ遺伝子増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号８：大腸菌 Ｎｉｓｓｌｅ １９１７株由来ｋｆｉＣＤ遺伝子増幅用プライマーＦの塩基配列
配列番号９：大腸菌 Ｎｉｓｓｌｅ １９１７株由来ｋｆｉＣＤ遺伝子増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号１０：大腸菌 Ｗ株由来ｇｌｍＳ遺伝子増幅用プライマーＦの塩基配列
配列番号１１：大腸菌 Ｗ株由来ｇｌｍＳ遺伝子増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号１２：大腸菌 Ｗ株由来トリプトファンプロモーター遺伝子増幅用プライマーＦの塩基配列
配列番号１３：大腸菌 Ｗ株由来トリプトファンプロモーター遺伝子増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号１４：ｐＨＳＧ３９６のｃａｔ遺伝子増幅用プライマーＦの塩基配列
配列番号１５：ｐＨＳＧ３９６のｃａｔ遺伝子増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号１６：Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８株由来ｓａｃＢ遺伝子増幅用プライマーＦの塩基配列
配列番号１７：Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８株由来ｓａｃＢ遺伝子増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号１８：大腸菌 Ｎｉｓｓｌｅ株由来ｋｆｉＡ遺伝子の塩基配列
配列番号１９：大腸菌 Ｎｉｓｓｌｅ株由来ｋｆｉＣ遺伝子の塩基配列
配列番号２０：大腸菌 Ｋ－１２株由来ｔｉｇ遺伝子の塩基配列
配列番号２１：リンカー１の塩基配列
配列番号２２：リンカー１のアミノ酸配列
配列番号２３：リンカー２の塩基配列
配列番号２４：リンカー２のアミノ酸配列
配列番号２５：大腸菌 Ｎｉｓｓｌｅ株由来ｋｆｉＤ遺伝子の塩基配列
配列番号２６：大腸菌 Ｗ株由来ｇｌｍＳ遺伝子の塩基配列
配列番号２７：大腸菌 Ｋ－１２株由来ｙｈｂＪ遺伝子の塩基配列
【図1】
【配列表】