ホーム > 特許ランキング > キッコーマン株式会社
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024006086
(43)【公開日】2024-01-17
(54)【発明の名称】Ｌ－ピログルタミン酸開環酵素
(51)【国際特許分類】
C12N 15/57 20060101AFI20240110BHJP
C12N 9/48 20060101ALI20240110BHJP
C12P 13/14 20060101ALI20240110BHJP
A23L 33/175 20160101ALI20240110BHJP
【ＦＩ】
C12N15/57 ZNA
C12N9/48
C12P13/14 Z
A23L33/175
【審査請求】未請求
【請求項の数】18
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022106652
(22)【出願日】2022-06-30
(71)【出願人】
【識別番号】000004477
【氏名又は名称】キッコーマン株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100166165
【弁理士】
【氏名又は名称】津田 英直
(72)【発明者】
【氏名】伊藤 考太郎
(72)【発明者】
【氏名】夏目 亮
(72)【発明者】
【氏名】河合 広洋
(72)【発明者】
【氏名】加藤 雄己
(72)【発明者】
【氏名】玉井 海地
(72)【発明者】
【氏名】小笠原 大輔
(72)【発明者】
【氏名】川崎 寿
【テーマコード（参考）】
4B018
4B050
4B064
【Ｆターム（参考）】
4B018LB03
4B018LB08
4B018LB09
4B018MD19
4B018ME14
4B050CC01
4B050DD02
4B050FF11E
4B050LL02
4B064AE19
4B064CA21
4B064CB05
4B064DA10
(57)【要約】
【課題】調味料や保存食品の製造において使用可能な、ＡＴＰ非依存性のＬ－ピログルタミン酸開環酵素の提供を目的とする。
【解決手段】以下の特性：至適ｐＨ：６．０～６．５、至適温度：４５～６５℃、温度安定性：５０℃以下、分子量：５８～６２ｋＤａを有する、新規Ｌ－ピログルタミン酸開環酵素を提供する。さらにかかる新規Ｌ－ピログルタミン酸開環酵素は、配列番号３のアミノ酸配列、配列番号３のアミノ酸配列に、少なくとも９０％同一性を有する配列、又は配列番号３のアミノ酸配列に、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加された配列からなるアミノ酸配列を有することを特徴とする。
【選択図】 図１５
【解決手段】以下の特性：至適ｐＨ：６．０～６．５、至適温度：４５～６５℃、温度安定性：５０℃以下、分子量：５８～６２ｋＤａを有する、新規Ｌ－ピログルタミン酸開環酵素を提供する。さらにかかる新規Ｌ－ピログルタミン酸開環酵素は、配列番号３のアミノ酸配列、配列番号３のアミノ酸配列に、少なくとも９０％同一性を有する配列、又は配列番号３のアミノ酸配列に、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加された配列からなるアミノ酸配列を有することを特徴とする。
【選択図】 図１５
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＡＴＰ非依存性のＬ－ピログルタミン酸開環酵素であって、以下の特徴：
至適ｐＨ：６．０～６．５
至適温度：４５～６５℃
温度安定性：５０℃以下で１０分間で８０％以上の残存活性を有する
分子量：５８～６２ｋＤａ
を有する、Ｌ－ピログルタミン酸開環酵素。
至適ｐＨ：６．０～６．５
至適温度：４５～６５℃
温度安定性：５０℃以下で１０分間で８０％以上の残存活性を有する
分子量：５８～６２ｋＤａ
を有する、Ｌ－ピログルタミン酸開環酵素。
【請求項2】
前記Ｌ－ピログルタミン酸開環酵素が、バチルス属又はプリエスチア属由来である、請求項１に記載のＬ－ピログルタミン酸開環酵素。
【請求項3】
前記プリエスチア属細菌が、プリエスチア・メガテリウム（Priestia megaterium）又はプリエスチア・アリャバハッタイ（Priestia aryabhattai）からなる群から選ばれる、請求項２に記載のＬ－ピログルタミン酸開環酵素。
【請求項4】
亜鉛要求性を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載のＬ－ピログルタミン酸開環酵素。
【請求項5】
アミドヒドロラーゼ２のモチーフを有さない、請求項１～４のいずれか一項に記載のL-ピログルタミン酸開環酵素。
【請求項6】
前記Ｌ－ピログルタミン酸開環酵素が、カルボキシルペプチターゼモチーフを有する、請求項１～５のいずれか一項に記載のＬ－ピログルタミン酸開環酵素。
【請求項7】
カルボキシペプチダーゼモチーフが、ヒスチジン、グルタミン酸、及びヒスチジンから構成される活性中心を有する、請求項６に記載のＬ－ピログルタミン酸開環酵素。
【請求項8】
亜鉛イオンが、前記活性中心のヒスチジン、グルタミン酸、及びヒスチジンにより配位される、請求項７に記載のＬ－ピログルタミン酸開環酵素。
【請求項9】
亜鉛イオンが、Ｈｉｓ２０４、Ｇｌｕ１２１、及びＨｉｓ１１８により配位される、請求項８に記載のＬ－ピログルタミン酸開環酵素。
【請求項10】
さらにＧｌｕ３０５、Ｔｙｒ２６７、及びＡｒｇ１６５が配位に関与する、請求項９に記載のＬ－ピログルタミン酸開環酵素。
【請求項11】
以下の：
配列番号３のアミノ酸配列、
配列番号３のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一性を有する配列、又は
配列番号３のアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加された配列
からなり、ＡＴＰ非依存性のＬ－ピログルタミン酸開環活性を有する、Ｌ－ピログルタミン酸開環酵素。
配列番号３のアミノ酸配列、
配列番号３のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一性を有する配列、又は
配列番号３のアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加された配列
からなり、ＡＴＰ非依存性のＬ－ピログルタミン酸開環活性を有する、Ｌ－ピログルタミン酸開環酵素。
【請求項12】
Ｈｉｓ２０４、Ｇｌｕ１２１、Ｈｉｓ １１８、Ｔｙｒ２６７、及びＡｒｇ１６５モチーフを含み、かつ配列番号３のアミノ酸配列に対し、少なくとも７０％同一性を有する配列からなり、ＡＴＰ非依存性のＬ－ピログルタミン酸開環活性を有する、Ｌ－ピログルタミン酸開環酵素。
【請求項13】
以下の：
（１）配列番号３のアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（２）配列番号２の塩基配列、
（３）（１）又は（２）に記載の塩基配列に、少なくとも９０％同一性を有する配列、
からなり、Ｌ－ピログルタミン酸開環酵素をコードするＤＮＡ。
（１）配列番号３のアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（２）配列番号２の塩基配列、
（３）（１）又は（２）に記載の塩基配列に、少なくとも９０％同一性を有する配列、
からなり、Ｌ－ピログルタミン酸開環酵素をコードするＤＮＡ。
【請求項14】
請求項１～１２のいずれか一項に記載のＬ－ピログルタミン酸開環酵素をＬ－ピログルタミン酸含有溶液に適用し、Ｌ－グルタミン酸濃度を増加させる方法。
【請求項15】
請求項１～１２のいずれか一項に記載のＬ－ピログルタミン酸開環酵素をＬ－ピログルタミン酸含有食品に適用し、Ｌ－グルタミン酸濃度を増加させた食品を製造する方法。
【請求項16】
前記Ｌ－ピログルタミン酸含有食品が、トマト加工物又は醤油である、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
Ｌ－ピログルタミン酸開環酵素が、ｐＨ４～１０、１５～６５℃でＬ－ピログルタミン酸含有食品に適用される、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項18】
請求項１５～１７のいずれか一項に記載の方法により製造された食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、Ｌ－ピログルタミン酸をＬ－グルタミン酸へと開環する酵素、および当該酵素をコードする遺伝子、並びに当該酵素の利用方法に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｌ－ピログルタミン酸は、飲食品の製造及び保存過程で、Ｌ－グルタミン酸又はＬ－グルタミンの非酵素的な閉環反応により生じる無味の物質である。加熱処理や長期の保存により、飲食品中のＬ－ピログルタミン酸の含有量が増加する。飲食品の製造及び保存過程で無味であるＬ－ピログルタミン酸が生成すると、Ｌ－グルタミン酸含有量が低下し、本来Ｌ－グルタミン酸が呈するうま味が失われてしまう。長期の発酵過程を経る発酵飲食品の製造過程では、ペプチドの分解によりＬ－グルタミン酸が生成し、またペプチド分解により生じたＬ－グルタミンがさらにグルタミナーゼの作用を受けることによりＬ－グルタミン酸が生成する。こうして生成したＬ－グルタミン酸は、発酵飲食品のうま味を構成する。したがって、発酵過程においてＬ－ピログルタミン酸の生成を抑制することが必要になる。醤油の製造過程では、Ｌ－ピログルタミン酸開環酵素を適用させることにより、Ｌ－ピログルタミン酸をＬ－グルタミン酸へと変換することで、うま味に富んだ醤油を製造することが検討されている（特許文献１：ＷＯ２０１４／１２６１８６）。
【0003】
５－オキソプロリナーゼは、国際生化学連合の酵素委員会による分類基準においてＥＣ３．５．２．９に分類され、ピログルタマーゼ、Ｌ－ピログルタミン酸加水分解酵素とも称される酵素である。これまでにいくつかの生物種から、５－オキソプロリナーゼ活性が確認されている。ラット（非特許文献１：Scand. J. Clin. Lab. Invest.32, 233-237, 1973；非特許文献２：Proc. Nat. Acad. Sci USA 68, 2982-2985, 1971）、シュードモナス属（非特許文献３：Biochem. Biophys. Res. Commun. 56, 90-96, 1974）、アルカリゲネス属（非特許文献４：Plant Physiol. 62, 798-801, 1978）、酵母（特許文献２：特開平８－２５２０７５号公報）、及びアスペルギルス属（特許文献１：ＷＯ２０１４／１２６１８６）由来の５－オキソプロリナーゼが知られている。これらの５－オキソプロリナーゼは、Ｍｇ2+やＫ+等の金属イオン要求性であり、またＡＴＰ依存性である。ＡＴＰ依存性の酵素は、ＡＴＰ再生に関する問題があり、飲食品の製造課程において生成したＬ－ピログルタミン酸を開環するのに適さない。
【0004】
また、５－オキソプロリナーゼ以外のＬ－ピログルタミン酸開環酵素として、アルカリゲネス・フェイカリス（Alcaligenes Faecalis）属由来の約４万７千Ｄａのタンパク質及び当該タンパク質をコードする遺伝子が特定されている（特許文献３及び４：特開平９－２５０号公報及び特開平１１‐２２１０７８号公報）。かかる酵素はＡＴＰ非依存性ではあるが、至適ｐＨが中性～アルカリ性にあるため、発酵飲食品、特に醤油中に生成したＬ－ピログルタミン酸の開環には適していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】国際公開第２０１４／１２６１８６号
【特許文献2】特開平８－２５２０７５号公報
【特許文献3】特開平９－２５０号公報
【特許文献4】特開平１１‐２２１０７８号公報
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Scand. J. Clin. Lab. Invest. (1973) 32, 233-237
【非特許文献2】Proc. Nat. Acad. Sci USA （1971）68, 2982-2985
【非特許文献3】Biochem. Biophys. Res. Commun. (1974) 56, 90-96
【非特許文献4】Plant Physiol. （1978）62, 798-801
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
調味料や保存食品の製造において使用可能な、ＡＴＰ非依存性のＬ－ピログルタミン酸開環酵素の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、Ｌ－ピログルタミン酸開環活性を有する新規酵素を取得すべく鋭意研究を行ったところ、プリエスチア属の細菌がＬ－ピログルタミン酸開環活性を発揮することを見出した。次いで本発明者らは、このプリエスチア属の細菌から新規Ｌ－ピログルタミン酸開環酵素を単離し、特性解析をするとともに、そのアミノ酸配列及び遺伝子配列を特定し、本発明に至った。そこで、本発明は以下に関する：
【0009】
［１］ ＡＴＰ非依存性のＬ－ピログルタミン酸開環酵素であって、以下の特徴：
至適ｐＨ：６．０～６．５
至適温度：４５～６５℃
温度安定性：５０℃以下で１０分間で８０％以上の残存活性を有する
分子量：５８～６２ｋＤａ
を有する、Ｌ－ピログルタミン酸開環酵素。
［２］ 前記Ｌ－ピログルタミン酸開環酵素が、バチルス属又はプリエスチア属由来である、項目１に記載のＬ－ピログルタミン酸開環酵素。
［３］ 前記プリエスチア属細菌が、プリエスチア・メガテリウム（Priestia megaterium）又はプリエスチア・アリャバハッタイ（Priestia aryabhattai）からなる群から選ばれる、項目２に記載のＬ－ピログルタミン酸開環酵素。
［４］ 亜鉛要求性を有する、項目１～３のいずれか一項に記載のＬ－ピログルタミン酸開環酵素。
［５］ アミドヒドロラーゼ２のモチーフを有さない、項目１～４のいずれか一項に記載のL-ピログルタミン酸開環酵素。
［６］ 前記Ｌ－ピログルタミン酸開環酵素が、カルボキシルペプチターゼモチーフを有する、項目１～５のいずれか一項に記載のＬ－ピログルタミン酸開環酵素。
［７］ カルボキシペプチダーゼモチーフが、ヒスチジン、グルタミン酸、及びヒスチジンから構成される活性中心を有する、項目６に記載のＬ－ピログルタミン酸開環酵素。
［８］ 亜鉛イオンが、前記活性中心のヒスチジン、グルタミン酸、及びヒスチジンにより配位される、項目７に記載のＬ－ピログルタミン酸開環酵素。
［９］ 亜鉛イオンが、Ｈｉｓ２０４、Ｇｌｕ１２１、及びＨｉｓ１１８により配位される、項目８に記載のＬ－ピログルタミン酸開環酵素。
［１０］ さらにＧｌｕ３０５、Ｔｙｒ２６７、及びＡｒｇ１６５が配位に関与する、項目９に記載のＬ－ピログルタミン酸開環酵素。
［１１］ 以下の：
配列番号３のアミノ酸配列、
配列番号３のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一性を有する配列、又は
配列番号３のアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加された配列
からなり、ＡＴＰ非依存性のＬ－ピログルタミン酸開環活性を有する、Ｌ－ピログルタミン酸開環酵素。
［１２］ Ｈｉｓ２０４、Ｇｌｕ１２１、Ｈｉｓ １１８、Ｔｙｒ２６７、及びＡｒｇ１６５モチーフを含み、かつ配列番号３のアミノ酸配列に対し、少なくとも７０％同一性を有する配列からなり、ＡＴＰ非依存性のＬ－ピログルタミン酸開環活性を有する、Ｌ－ピログルタミン酸開環酵素。
［１３］ 以下の：
（１）配列番号３のアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（２）配列番号２の塩基配列、
（３）（１）又は（２）に記載の塩基配列に、少なくとも９０％同一性を有する配列、
からなり、Ｌ－ピログルタミン酸開環酵素をコードするＤＮＡ。
［１４］ 項目１～１２のいずれか一項に記載のＬ－ピログルタミン酸開環酵素をＬ－ピログルタミン酸含有溶液に適用し、Ｌ－グルタミン酸濃度を増加させる方法。
［１５］ 項目１～１２のいずれか一項に記載のＬ－ピログルタミン酸開環酵素をＬ－ピログルタミン酸含有食品に適用し、Ｌ－グルタミン酸濃度を増加させた食品を製造する方法。
［１６］ 前記Ｌ－ピログルタミン酸含有食品が、トマト加工物又は醤油である、項目１５に記載の方法。
［１７］ Ｌ－ピログルタミン酸開環酵素が、ｐＨ４～１０、１５～６５℃でＬ－ピログルタミン酸含有食品に適用される、項目１５又は１６に記載の方法。
［１８］ 項目１５～１７のいずれか一項に記載の方法により製造された食品。
至適ｐＨ：６．０～６．５
至適温度：４５～６５℃
温度安定性：５０℃以下で１０分間で８０％以上の残存活性を有する
分子量：５８～６２ｋＤａ
を有する、Ｌ－ピログルタミン酸開環酵素。
［２］ 前記Ｌ－ピログルタミン酸開環酵素が、バチルス属又はプリエスチア属由来である、項目１に記載のＬ－ピログルタミン酸開環酵素。
［３］ 前記プリエスチア属細菌が、プリエスチア・メガテリウム（Priestia megaterium）又はプリエスチア・アリャバハッタイ（Priestia aryabhattai）からなる群から選ばれる、項目２に記載のＬ－ピログルタミン酸開環酵素。
［４］ 亜鉛要求性を有する、項目１～３のいずれか一項に記載のＬ－ピログルタミン酸開環酵素。
［５］ アミドヒドロラーゼ２のモチーフを有さない、項目１～４のいずれか一項に記載のL-ピログルタミン酸開環酵素。
［６］ 前記Ｌ－ピログルタミン酸開環酵素が、カルボキシルペプチターゼモチーフを有する、項目１～５のいずれか一項に記載のＬ－ピログルタミン酸開環酵素。
［７］ カルボキシペプチダーゼモチーフが、ヒスチジン、グルタミン酸、及びヒスチジンから構成される活性中心を有する、項目６に記載のＬ－ピログルタミン酸開環酵素。
［８］ 亜鉛イオンが、前記活性中心のヒスチジン、グルタミン酸、及びヒスチジンにより配位される、項目７に記載のＬ－ピログルタミン酸開環酵素。
［９］ 亜鉛イオンが、Ｈｉｓ２０４、Ｇｌｕ１２１、及びＨｉｓ１１８により配位される、項目８に記載のＬ－ピログルタミン酸開環酵素。
［１０］ さらにＧｌｕ３０５、Ｔｙｒ２６７、及びＡｒｇ１６５が配位に関与する、項目９に記載のＬ－ピログルタミン酸開環酵素。
［１１］ 以下の：
配列番号３のアミノ酸配列、
配列番号３のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一性を有する配列、又は
配列番号３のアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加された配列
からなり、ＡＴＰ非依存性のＬ－ピログルタミン酸開環活性を有する、Ｌ－ピログルタミン酸開環酵素。
［１２］ Ｈｉｓ２０４、Ｇｌｕ１２１、Ｈｉｓ １１８、Ｔｙｒ２６７、及びＡｒｇ１６５モチーフを含み、かつ配列番号３のアミノ酸配列に対し、少なくとも７０％同一性を有する配列からなり、ＡＴＰ非依存性のＬ－ピログルタミン酸開環活性を有する、Ｌ－ピログルタミン酸開環酵素。
［１３］ 以下の：
（１）配列番号３のアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（２）配列番号２の塩基配列、
（３）（１）又は（２）に記載の塩基配列に、少なくとも９０％同一性を有する配列、
からなり、Ｌ－ピログルタミン酸開環酵素をコードするＤＮＡ。
［１４］ 項目１～１２のいずれか一項に記載のＬ－ピログルタミン酸開環酵素をＬ－ピログルタミン酸含有溶液に適用し、Ｌ－グルタミン酸濃度を増加させる方法。
［１５］ 項目１～１２のいずれか一項に記載のＬ－ピログルタミン酸開環酵素をＬ－ピログルタミン酸含有食品に適用し、Ｌ－グルタミン酸濃度を増加させた食品を製造する方法。
［１６］ 前記Ｌ－ピログルタミン酸含有食品が、トマト加工物又は醤油である、項目１５に記載の方法。
［１７］ Ｌ－ピログルタミン酸開環酵素が、ｐＨ４～１０、１５～６５℃でＬ－ピログルタミン酸含有食品に適用される、項目１５又は１６に記載の方法。
［１８］ 項目１５～１７のいずれか一項に記載の方法により製造された食品。
【発明の効果】
【0010】
本発明において単離されたＬ－ピログルタミン酸開環活性を有する酵素は、ＡＴＰ非依存性で作動し、かつ低いｐＨにおいて活性を有した。これにより、低ｐＨとなる食品又は調味料に用いることが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【発明を実施するための形態】
【0012】
＜Ｌ－ピログルタミン酸開環酵素＞
本発明は、新規Ｌ－ピログルタミン酸開環酵素に関する。本発明のＬ－ピログルタミン酸開環酵素は、ＡＴＰ非依存的にＬ－ピログルタミン酸と水とから、Ｌ－グルタミン酸を生成する加水分解反応又はその逆反応を触媒する酵素である。本発明に係るＬ－ピログルタミン酸開環酵素は、下記の性質のいずれか１つ又はその任意の組み合わせにより特徴づけられる。下記の性質は、本技術分野に周知の方法により決定することができる。
本発明は、新規Ｌ－ピログルタミン酸開環酵素に関する。本発明のＬ－ピログルタミン酸開環酵素は、ＡＴＰ非依存的にＬ－ピログルタミン酸と水とから、Ｌ－グルタミン酸を生成する加水分解反応又はその逆反応を触媒する酵素である。本発明に係るＬ－ピログルタミン酸開環酵素は、下記の性質のいずれか１つ又はその任意の組み合わせにより特徴づけられる。下記の性質は、本技術分野に周知の方法により決定することができる。
【0013】
（１）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲
本発明に係るＬ－ピログルタミン酸開環酵素の至適ｐＨは、６．０～６．５である。本発明に係るＬ－ピログルタミン酸開環酵素はｐＨ４．０～１０．５で安定である。
本発明に係るＬ－ピログルタミン酸開環酵素の至適ｐＨは、６．０～６．５である。本発明に係るＬ－ピログルタミン酸開環酵素はｐＨ４．０～１０．５で安定である。
【0014】
（２）至適温度及び安定温度範囲
本発明に係るＬ－ピログルタミン酸開環酵素の至適温度は、５５℃である。本発明に係るＬ－ピログルタミン酸開環酵素は５０℃以下で安定である。
本発明に係るＬ－ピログルタミン酸開環酵素の至適温度は、５５℃である。本発明に係るＬ－ピログルタミン酸開環酵素は５０℃以下で安定である。
【0015】
（３）金属要求性
本発明に係るＬ－ピログルタミン酸開環酵素は、２価の金属イオン、特に亜鉛イオンを必要とする酵素である。
本発明に係るＬ－ピログルタミン酸開環酵素は、２価の金属イオン、特に亜鉛イオンを必要とする酵素である。
【0016】
（４）カルボキシペプチダーゼ活性
本発明に係るＬ－ピログルタミン酸開環酵素は、カルボキシペプチダーゼ活性を有する。カルボキシペプチダーゼ活性の比活性は、０．２Ｕ／ｍｇ以上であり、好ましくは０．３Ｕ／ｍｇ以上である。
本発明に係るＬ－ピログルタミン酸開環酵素は、カルボキシペプチダーゼ活性を有する。カルボキシペプチダーゼ活性の比活性は、０．２Ｕ／ｍｇ以上であり、好ましくは０．３Ｕ／ｍｇ以上である。
【0017】
（５）γ-ポリグルタミン酸分解活性
本発明に係るＬ－ピログルタミン酸開環酵素はγ-ポリグルタミン酸分解活性を有する。γ-ポリグルタミン酸は分解することで、L-グルタミン酸を生成する。
本発明に係るＬ－ピログルタミン酸開環酵素はγ-ポリグルタミン酸分解活性を有する。γ-ポリグルタミン酸は分解することで、L-グルタミン酸を生成する。
【0018】
（６）分子量
分子量は、アミノ酸配列からの推測値で６０２００Ｄａである。由来元に応じて分子量は変動してもよく、５０～７０ｋＤａである。分子量は、５５ｋＤａ以上が好ましく、５８ｋＤａ以上がより好ましく、６５ｋＤａ以下が好ましく、６２ｋＤａ以下がより好ましい。本発明のＬ－ピログルタミン酸開環酵素は、シグナルペプチドを含んでおり、シグナルペプチドを除去されてもよい。
分子量は、アミノ酸配列からの推測値で６０２００Ｄａである。由来元に応じて分子量は変動してもよく、５０～７０ｋＤａである。分子量は、５５ｋＤａ以上が好ましく、５８ｋＤａ以上がより好ましく、６５ｋＤａ以下が好ましく、６２ｋＤａ以下がより好ましい。本発明のＬ－ピログルタミン酸開環酵素は、シグナルペプチドを含んでおり、シグナルペプチドを除去されてもよい。
【0019】
（７）由来元
本発明に係るＬ－ピログルタミン酸開環酵素は、プリエスチア（Priestia）属、バチルス（Bacillus）属、メタバチルス（Metabacillus）属、サイトバチルス（Cytobacillus）属、ペリバチルス（Peribacillus）属、パエニバチルス（Paenibatillus）属、スポロサルシナ（Sporosarcina）属、グロビスポラ（globispora）属、とベビバクテリウム（Brevibacterium）属、フリゴリトレランス（frigoritolerans）属からなる群から選ばれる少なくとも１の属に属する微生物に由来する。なかでも、ＢＬＡＳＴ解析により多くの種が挙げられたことから、プリエスチア属及びバチルス属が好ましい。より具体的に、プリエスチア・メガテリウム（Priestia megaterium）又はプリエスチア・アリャバハッタイ（Priestia aryabhattai）が当該酵素を発現しうる。
本発明に係るＬ－ピログルタミン酸開環酵素は、プリエスチア（Priestia）属、バチルス（Bacillus）属、メタバチルス（Metabacillus）属、サイトバチルス（Cytobacillus）属、ペリバチルス（Peribacillus）属、パエニバチルス（Paenibatillus）属、スポロサルシナ（Sporosarcina）属、グロビスポラ（globispora）属、とベビバクテリウム（Brevibacterium）属、フリゴリトレランス（frigoritolerans）属からなる群から選ばれる少なくとも１の属に属する微生物に由来する。なかでも、ＢＬＡＳＴ解析により多くの種が挙げられたことから、プリエスチア属及びバチルス属が好ましい。より具体的に、プリエスチア・メガテリウム（Priestia megaterium）又はプリエスチア・アリャバハッタイ（Priestia aryabhattai）が当該酵素を発現しうる。
【0020】
（８）モチーフ
本発明に係るＬ－ピログルタミン酸開環酵素は、カルボキシルペプチターゼモチーフを有する。さらに、本発明に係るＬ－ピログルタミン酸開環酵素は、アミドヒドロラーゼ２のモチーフを有さないことを特徴とする。カルボキシペプチターゼモチーフとは、ヒスチジン、グルタミン酸、及びヒスチジンから構成される活性中心を構成する保存されたモチーフである。好ましくは、かかる活性中心には亜鉛イオンが配位されうる。かかるカルボキシペプチターゼモチーフは、一例としてＨｉｓ２０４、Ｇｌｕ１２１、及びＨｉｓ１１８により配位される。さらにＧｌｕ３０５、Ｔｙｒ２６７、及びＡｒｇ１６５からなる群から選択される少なくとも１のアミノ酸残基が配位に関与してもよい。これらのカルボキシペプチダーゼのアミノ酸位置は例示であり、亜鉛イオンを配位する限りにおいて変動してもよい。
本発明に係るＬ－ピログルタミン酸開環酵素は、カルボキシルペプチターゼモチーフを有する。さらに、本発明に係るＬ－ピログルタミン酸開環酵素は、アミドヒドロラーゼ２のモチーフを有さないことを特徴とする。カルボキシペプチターゼモチーフとは、ヒスチジン、グルタミン酸、及びヒスチジンから構成される活性中心を構成する保存されたモチーフである。好ましくは、かかる活性中心には亜鉛イオンが配位されうる。かかるカルボキシペプチターゼモチーフは、一例としてＨｉｓ２０４、Ｇｌｕ１２１、及びＨｉｓ１１８により配位される。さらにＧｌｕ３０５、Ｔｙｒ２６７、及びＡｒｇ１６５からなる群から選択される少なくとも１のアミノ酸残基が配位に関与してもよい。これらのカルボキシペプチダーゼのアミノ酸位置は例示であり、亜鉛イオンを配位する限りにおいて変動してもよい。
【0021】
（９）アミノ酸配列
本発明に係るピログルタミン酸開環酵素は、以下の：
配列番号３のアミノ酸配列、
配列番号３のアミノ酸配列に少なくとも７０％同一性を有する配列、又は
配列番号３のアミノ酸配列に１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加された配列
からなり、ＡＴＰ非依存性のＬ－ピログルタミン酸開環活性を有する。配列同一性は、一例として、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性であってもよい。アミノ酸の置換、欠失又は付加は、一例として数個、例えば１～９の任意の数のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されうる。置換される場合には、任意のアミノ酸に置換されてもよいが、保存的置換であることが好ましい。さらに、別の態様では、Ｈｉｓ２０４、Ｇｌｕ１２１、Ｈｉｓ１１８、Ｇｌｕ３０５、Ｔｙｒ２６７、及びＡｒｇ１６５からなるカルボキシペプチダーゼモチーフを含むことが好ましい。
本発明に係るピログルタミン酸開環酵素は、以下の：
配列番号３のアミノ酸配列、
配列番号３のアミノ酸配列に少なくとも７０％同一性を有する配列、又は
配列番号３のアミノ酸配列に１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加された配列
からなり、ＡＴＰ非依存性のＬ－ピログルタミン酸開環活性を有する。配列同一性は、一例として、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性であってもよい。アミノ酸の置換、欠失又は付加は、一例として数個、例えば１～９の任意の数のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されうる。置換される場合には、任意のアミノ酸に置換されてもよいが、保存的置換であることが好ましい。さらに、別の態様では、Ｈｉｓ２０４、Ｇｌｕ１２１、Ｈｉｓ１１８、Ｇｌｕ３０５、Ｔｙｒ２６７、及びＡｒｇ１６５からなるカルボキシペプチダーゼモチーフを含むことが好ましい。
【0022】
（１０）塩基配列
本発明に係るＬ－ピログルタミン酸開環酵素は、以下の：
（１）配列番号３のアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（２）配列番号２の塩基配列、
（３）（１）又は（２）に記載の塩基配列に、少なくとも７０％同一性を有する配列、
からなるＤＮＡによりコードされることを特徴とする。配列同一性は、一例として、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性であってもよい。本発明の別の態様では、本発明は、かかる塩基配列からなり、発現されたときにＬ－ピログルタミン酸開環活性を有する核酸、例えばＤＮＡに関していてもよい。
本発明に係るＬ－ピログルタミン酸開環酵素は、以下の：
（１）配列番号３のアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（２）配列番号２の塩基配列、
（３）（１）又は（２）に記載の塩基配列に、少なくとも７０％同一性を有する配列、
からなるＤＮＡによりコードされることを特徴とする。配列同一性は、一例として、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性であってもよい。本発明の別の態様では、本発明は、かかる塩基配列からなり、発現されたときにＬ－ピログルタミン酸開環活性を有する核酸、例えばＤＮＡに関していてもよい。
【0023】
本発明に係るＬ－ピログルタミン酸開環活性を有する酵素をコードするＤＮＡは、ベクターに組み込まれていてもよいし、ベクターに組み込まれて、宿主細胞、例えば大腸菌等に形質転換されていてもよい。本発明に係るＬ－ピログルタミン酸開環酵素をコードするＤＮＡを含むベクターを用いて宿主細胞に形質転換し、かかる宿主細胞を培養することで取得することができるが、かかる手法に限定されるものではない。プリエスチア属やバチルス属の細菌、例えばプリエスチア・メガテリウムを大量培養し、精製により取得してもよい。精製を容易にする観点から、タグ、例えばＨｉｓタグを付加して発現させてもよい。精製は、硫安分画、透析、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを単独又は組み合わせて行うことができる。
【0024】
＜Ｌ－ピログルタミン酸開環活性の測定方法＞
Ｌ－ピログルタミン酸開環活性の測定方法は、ピログルタミン酸含有試料に対し、Ｌ－ピログルタミン酸開環酵素を適用し、適用前後の溶液中のピログルタミン酸量及び／又はＬ－ピログルタミン酸量を測定することで開環活性を測定することができる。測定系が確立している観点から、Ｌ－グルタミン酸量に基づいて、開環活性を決定することが好ましい。
Ｌ－ピログルタミン酸開環活性の測定方法は、ピログルタミン酸含有試料に対し、Ｌ－ピログルタミン酸開環酵素を適用し、適用前後の溶液中のピログルタミン酸量及び／又はＬ－ピログルタミン酸量を測定することで開環活性を測定することができる。測定系が確立している観点から、Ｌ－グルタミン酸量に基づいて、開環活性を決定することが好ましい。
【0025】
＜Ｌ－グルタミン酸濃度を増加させる方法＞
本発明の別の態様では、本発明に係るＬ－ピログルタミン酸開環酵素をＬ－ピログルタミン酸含有溶液に適用し、Ｌ－グルタミン酸濃度を増加させる方法に関する。本発明のさらに別の態様では、本発明に係るＬ－ピログルタミン酸開環酵素をＬ－ピログルタミン酸含有飲食品に適用し、Ｌ－グルタミン酸が富化された飲食品を製造する方法に関する。Ｌ－グルタミン酸を含む飲食品は、製造課程又は長期保存中にＬ－グルタミン酸が環化し、無味のＬ－ピログルタミン酸を精製することがある。このような環化反応は、加熱や長期保存により、非酵素的な反応として生じうる。このような場合に、Ｌ－ピログルタミン酸を本発明のＬ－ピログルタミン酸開環酵素により開環することで、うま味を回復又は増強することができる。この方法は、Ｌ－ピログルタミン酸開環酵素を食品に添加することにより行われる。Ｌ－グルタミン酸濃度を富化した後に、Ｌ－ピログルタミン酸開環酵素を失活させてもよいし、そのまま製品に含ませてもよい。
本発明の別の態様では、本発明に係るＬ－ピログルタミン酸開環酵素をＬ－ピログルタミン酸含有溶液に適用し、Ｌ－グルタミン酸濃度を増加させる方法に関する。本発明のさらに別の態様では、本発明に係るＬ－ピログルタミン酸開環酵素をＬ－ピログルタミン酸含有飲食品に適用し、Ｌ－グルタミン酸が富化された飲食品を製造する方法に関する。Ｌ－グルタミン酸を含む飲食品は、製造課程又は長期保存中にＬ－グルタミン酸が環化し、無味のＬ－ピログルタミン酸を精製することがある。このような環化反応は、加熱や長期保存により、非酵素的な反応として生じうる。このような場合に、Ｌ－ピログルタミン酸を本発明のＬ－ピログルタミン酸開環酵素により開環することで、うま味を回復又は増強することができる。この方法は、Ｌ－ピログルタミン酸開環酵素を食品に添加することにより行われる。Ｌ－グルタミン酸濃度を富化した後に、Ｌ－ピログルタミン酸開環酵素を失活させてもよいし、そのまま製品に含ませてもよい。
【0026】
Ｌ－グルタミン酸及び／又はＬ－ピログルタミン酸含有飲食品の例としては、調味料、茶飲料、酒飲料、又は保存食品が挙げられる。調味料の中でも、特にＬ－グルタミン酸を豊富に含む調味料、例えば発酵調味料が好ましい。調味料の一例として、醤油、味噌、魚醤、日本酒、オイスターソース、みりん、つゆ、白だし、トマトケチャップなどが挙げられる。特に発酵調味料、例えば醤油、味噌、魚醤、みりん等は、発酵過程において、Ｌ－ピログルタミン酸を蓄積しうる。茶飲料としては、緑茶、紅茶など挙げられる。茶飲料では、茶葉を熱湯で抽出する際に、うまみ成分のＬ－グルタミン酸がＬ－ピログルタミン酸に環化しうるし、缶やペットボトル入りの茶飲料の場合保存中にＬ－ピログルタミン酸が蓄積しうる。酒飲料のなかでも、特に長期熟成がされた酒、例えば焼酎、日本酒、ウイスキー等ではＬ－ピログルタミン酸が増加しうる。保存食品としては、缶詰、瓶詰、レトルトパウチ食品が挙げられる。食品の中でも特に、トマト製品は、Ｌ－グルタミン酸及び／又はＬ－ピログルタミン酸含量が高いことが知られており、一例としてトマト缶、トマトピューレ、トマトペースト、トマトケチャップなどが挙げられる。これらのＬ－グルタミン酸及び／又はＬ－ピログルタミン酸含有飲食品の製造にあたり、Ｌ－ピログルタミン酸開環酵素を添加する工程が含まれうる。
【0027】
本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
【0028】
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
【実施例0029】
実施例１：Ｌ－ピログルタミン酸開環酵素の遺伝子クローニング
土壌中から採取され、Ｌ－ピログルタミン酸開環活性を有する菌株を単離し、この菌株を全ゲノム解析に供した。ゲノム解析の結果、本菌株は、プリエスチア・メガテリウム（Priestia Megaterium）であることを示す結果が得られた。なお、プリエスチア・メガテリウムは、従前はバチルス・メガテリウム（Bacillus Megaterium）に分類されており、近年の再分類により変更された。
この菌株を終濃度１０ｍＭのビオチン添加ＰＥ培地（ピログルタメート１６ｇ／Ｌ、Ｎａ2ＨＰＯ4 ６ｇ／Ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 ３ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ０．５ｇ／Ｌ、ビタミンＢ１ ０．２ｍｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ４００ｍｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １０ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １０ｍｇ／Ｌ（ｐＨ６．０））に播種し、１３５ｒｐｍ、２４時間、３１．５℃で振盪培養した。培養液を、８，０００ｒｐｍ、１０分間遠心して菌を除去し、得らえた７．２Ｌの培養上清より酵素精製を試みた。具体的に、培養上清７．２Ｌに対して２４０ｍＬの強陰イオン交換樹脂（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＳｕｐｅｒＱ－６５０Ｍ ５０％ Ｓｌｕｒｒｙ）を混合し、４℃で１時間攪拌して、レジンに吸着させた。吸着したレジンはバッチ式で、５％グリセロール含有２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶液（ｐＨ８．０）１０００ｍＬで洗浄した。続いて、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび５％グリセロール含有２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶液（ｐＨ８．０）、１０００ｍＬで洗浄後、１．０Ｍ ＮａＣｌおよび５％グリセロール含有２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶液（ｐＨ８．０）５００ｍＬで溶出した。得られた溶出液は、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａｌ ５ ＭＷＣＯ：１０Ｋで１５０ｍＬまで濃縮した後、緩衝液Ａ液（５％グリセロール含有２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶液（ｐＨ８．０））に対して４℃で８時間透析した。回収した試料は、同緩衝液で平衡化したｐＨ弱陰イオン交換カラム（ＣａｐｔｏＤＥＡＥ ＨＰ ５ｍＬ）に供し、ステップワイズ溶出で精製した。すなわち、まず１５％緩衝液Ｂ液（１ＭＮａＣｌおよび５％グリセロール含有２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶液（ｐＨ８．０）で溶出させた後に１００％緩衝液Ｂ液で溶出した。１５％緩衝液Ｂ液で溶出した活性画分４０ｍＬを回収し、緩衝液Ａ液に対して、４℃で８時間透析した。回収した試料は、同緩衝液で平衡化した強陰イオン交換カラム（ＣａｐｔｏＱ ＨＰ ５ｍＬ）に供し、ステップワイズ溶出で精製した。すなわち、まず４０％緩衝液Ｂ液で溶出させた後に１００％緩衝液Ｂ液で溶出した。４０％緩衝液Ｂ液で溶出した活性画分３０ｍＬを回収し、緩衝液Ａ液に対して４℃で８時間透析した。回収した試料は、同緩衝液で平衡化した強陰イオン交換カラム（ＲｅｓｏｕｒｃｅＱ ６ ｍＬ）に供し、緩衝液Ｂ液の０－１００％のグラジエント溶出で酵素を精製し、大量のＬ－ピログルタミン酸開環活性画分を得た。
土壌中から採取され、Ｌ－ピログルタミン酸開環活性を有する菌株を単離し、この菌株を全ゲノム解析に供した。ゲノム解析の結果、本菌株は、プリエスチア・メガテリウム（Priestia Megaterium）であることを示す結果が得られた。なお、プリエスチア・メガテリウムは、従前はバチルス・メガテリウム（Bacillus Megaterium）に分類されており、近年の再分類により変更された。
この菌株を終濃度１０ｍＭのビオチン添加ＰＥ培地（ピログルタメート１６ｇ／Ｌ、Ｎａ2ＨＰＯ4 ６ｇ／Ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 ３ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ０．５ｇ／Ｌ、ビタミンＢ１ ０．２ｍｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ４００ｍｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １０ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １０ｍｇ／Ｌ（ｐＨ６．０））に播種し、１３５ｒｐｍ、２４時間、３１．５℃で振盪培養した。培養液を、８，０００ｒｐｍ、１０分間遠心して菌を除去し、得らえた７．２Ｌの培養上清より酵素精製を試みた。具体的に、培養上清７．２Ｌに対して２４０ｍＬの強陰イオン交換樹脂（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＳｕｐｅｒＱ－６５０Ｍ ５０％ Ｓｌｕｒｒｙ）を混合し、４℃で１時間攪拌して、レジンに吸着させた。吸着したレジンはバッチ式で、５％グリセロール含有２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶液（ｐＨ８．０）１０００ｍＬで洗浄した。続いて、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび５％グリセロール含有２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶液（ｐＨ８．０）、１０００ｍＬで洗浄後、１．０Ｍ ＮａＣｌおよび５％グリセロール含有２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶液（ｐＨ８．０）５００ｍＬで溶出した。得られた溶出液は、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａｌ ５ ＭＷＣＯ：１０Ｋで１５０ｍＬまで濃縮した後、緩衝液Ａ液（５％グリセロール含有２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶液（ｐＨ８．０））に対して４℃で８時間透析した。回収した試料は、同緩衝液で平衡化したｐＨ弱陰イオン交換カラム（ＣａｐｔｏＤＥＡＥ ＨＰ ５ｍＬ）に供し、ステップワイズ溶出で精製した。すなわち、まず１５％緩衝液Ｂ液（１ＭＮａＣｌおよび５％グリセロール含有２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶液（ｐＨ８．０）で溶出させた後に１００％緩衝液Ｂ液で溶出した。１５％緩衝液Ｂ液で溶出した活性画分４０ｍＬを回収し、緩衝液Ａ液に対して、４℃で８時間透析した。回収した試料は、同緩衝液で平衡化した強陰イオン交換カラム（ＣａｐｔｏＱ ＨＰ ５ｍＬ）に供し、ステップワイズ溶出で精製した。すなわち、まず４０％緩衝液Ｂ液で溶出させた後に１００％緩衝液Ｂ液で溶出した。４０％緩衝液Ｂ液で溶出した活性画分３０ｍＬを回収し、緩衝液Ａ液に対して４℃で８時間透析した。回収した試料は、同緩衝液で平衡化した強陰イオン交換カラム（ＲｅｓｏｕｒｃｅＱ ６ ｍＬ）に供し、緩衝液Ｂ液の０－１００％のグラジエント溶出で酵素を精製し、大量のＬ－ピログルタミン酸開環活性画分を得た。
【0030】
こうして得られたＬ－ピログルタミン酸開環活性を有する画分を取得し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離後、ＰＶＤＦ膜に転写し、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色によって検出した。Ｌ－ピログルタミン酸開環活性を有する候補タンパク質のバンド領域（６５ｋＤａ付近）の膜を切り出して、膜切片に含まれるタンパク質のＮ末端アミノ酸配列解析をアプロサイエンス社に依頼した。バンドに含まれるタンパク質のＮ末端のアミノ酸配列の１１アミノ酸残基は、ＥＶＰＹＧＫＤＹＳＱＰ（配列番号１）であった。
【0031】
決定された１１残基分のアミノ酸配列をコードするＯＲＦを、同株の全５４４６個のＯＲＦ中から１つ見出した。こうして決定された候補タンパク質のＯＲＦの配列は、１６５３塩基対からなり、残基数５５１のタンパク質をコードしていた。具体的に、配列番号２の塩基配列であり、ＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列は、配列番号３のアミノ酸配列であった（図１Ａ及びＢ）。全アミノ酸配列を分泌シグナル配列解析サイトＳｉｇｎａｌＰで解析したところ、Ｎ末端２７残基の配列が分泌シグナル配列として検出された。また、ＥＭＢＩ－ＥＢＩのデーターベースを基にドメインを検索したところ、Ｎ末端側にＺｎ2+要求性タンパク質のドメインがあることがわかった（図１Ｃ）。かかる候補タンパク質をＢｍＥ１と呼ぶものとする。全長ＢｍＥ１は、５５１残基で、６１５０９ Ｄａの分子量を有するタンパク質である一方、分泌型ＢｍＥ１は５２４残基で、５８７０８Ｄａのタンパク質である。
【0032】
菌株より抽出／精製したゲノムＤＮＡを鋳型として、以下のエントリークローン構築用プライマーペアを用いたＰＣＲでＢｍＥ１遺伝子断片を増幅した。
増幅したＤＮＡ断片をリコンビナーゼ反応を用いてｐＵＣ１８ＶｅｃｔｏｒのＢａｍＨＩ－ＥｃｏＲＩサイトに組み込んでエントリープラスミドｐＵＣ１８－ＢｍＥ１を構築した（図２Ａ）。ｐＵＣ１８－ＢｍＥ１には、Ｎ末端分泌シグナル配列コード領域を含んだＢｍＥ１全長遺伝子領域をクローニングしてある。次に、ｐＵＣ１８－ＢｍＥ１を鋳型として、以下の発現プラスミド構築用プライマーペアを用いたＰＣＲで、ＢｍＥ１遺伝子全長領域の ５’末端に存在する８１塩基の分泌シグナル配列コード領域を除いた遺伝子領域を増幅した。
増幅したＤＮＡ断片をリコンビナーゼ反応を用いてｐＣｏｌｄ ＩのＮｄｅＩ－ＢａｍＨＩサイトに組み込み、Ｎ末端Ｈｉｓ－ｔａｇ融合型ＢｍＥ１発現プラスミドｐＣｏｌｄＩ－Ｈｉｓ－ＢｍＥ１を構築した（図２Ｂ）。ｐＣｏｌｄＩ－Ｈｉｓ－ＢｍＥ１にクローニングされている塩基配列（配列番号８）を図３Ａに示し、またｐＣｏｌｄＩ－Ｈｉｓ－ＢｍＥ１により発現される遺伝子の全長配列（配列番号９）を図３Ｂ、並びに発現されるタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１０）を図３Ｃに示す。全長アミノ酸配列からの推測分子量は、６０２００Ｄａであった。
【表1】
【表2】
【0033】
（１）Ｂｌａｓｔ解析
ＢｍＥ１と類似した配列を探す為に、ＮＣＢＩ（National Center Biotechnology Information）のBLAST（Basic Local Alignment Search Tool）を用いて実施した。検索パラメータはデフォルトを使用した。実施例１で明らかにされたＢｍＥ１の遺伝子及び／又はタンパク質の配列（配列番号２／配列番号３）をＢｌａｓｔ解析に供したところ、バチルス・メガテリウム（Bacillus Megaterium）以外にもプリエスチア（Priestia）属、メタバチルス（Metabacillus）属、サイトバチルス（Cytobacillus）属、ペリバチルス（Peribacillus）属、パエニバチルス（Paenibatillus）属、スポロサルシナ（Sporosarcina）属、グロビスポラ（globispora）属、ベビバクテリウム（Brevibacterium）属、及びフリゴリトレランス（frigoritolerans）属にもＢｍＥ１遺伝子の相同遺伝子が存在することがわかった。
ＢｍＥ１と類似した配列を探す為に、ＮＣＢＩ（National Center Biotechnology Information）のBLAST（Basic Local Alignment Search Tool）を用いて実施した。検索パラメータはデフォルトを使用した。実施例１で明らかにされたＢｍＥ１の遺伝子及び／又はタンパク質の配列（配列番号２／配列番号３）をＢｌａｓｔ解析に供したところ、バチルス・メガテリウム（Bacillus Megaterium）以外にもプリエスチア（Priestia）属、メタバチルス（Metabacillus）属、サイトバチルス（Cytobacillus）属、ペリバチルス（Peribacillus）属、パエニバチルス（Paenibatillus）属、スポロサルシナ（Sporosarcina）属、グロビスポラ（globispora）属、ベビバクテリウム（Brevibacterium）属、及びフリゴリトレランス（frigoritolerans）属にもＢｍＥ１遺伝子の相同遺伝子が存在することがわかった。
【0034】
（２）モチーフ解析
ＥＭＢＬ＿ＥＢＩのＰｆａｍ３５．０を用いてモチーフ検索を行った。検索パラメータはデフォルトを使用した。その結果、ペプチダーゼ１４ファミリーのＺｉｎｃ Ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅのモチーフをもつことが明らかになった。
ＥＭＢＬ＿ＥＢＩのＰｆａｍ３５．０を用いてモチーフ検索を行った。検索パラメータはデフォルトを使用した。その結果、ペプチダーゼ１４ファミリーのＺｉｎｃ Ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅのモチーフをもつことが明らかになった。
【0035】
実施例２：ＢｍＥ１の発現と精製
実施例１で調製された発現プラスミドｐＣｏｌｄ１－Ｈｉｓ－ＢｍＥ１を大腸菌ＢＬ２１株に形質転換した。形質転換された菌株を、３７℃で１８時間培養し、次いでコールドショック（氷冷３０分）後に、ＩＰＴＧ（終濃度０．２ｍＭ）及びＺｎＳＯ4（終濃度１．０ｍＭ）を添加し、候補タンパク質を発現させて１５℃で２２時間培養した。菌体を回収し、破砕後に、Ｎｉ－Ａｆｆｉｎｉｔｙ精製（カラム：Ｈｉｓ－ｔｒａｐ ＨＰ５ｍｌ）及びゲル濾過クロマトグラフィー精製（カラム：Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ １０／３００ＧＬ）により、精製タンパク質を調製した（図４）。尚、Ｎｉ－Ａｆｆｉｎｉｔｙ精製には、緩衝液Ａ（５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、４０ｍＭイミダゾール含有５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０））緩衝液Ｂ（５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、３００ｍＭイミダゾール含有５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０））を用いて、緩衝液Ｂの０％から１００％のステップワイズ溶出で精製し、緩衝液Ｂの１００％溶出画分を回収した。ゲルろ過クロマトグラフィー精製には１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有２０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いて、各フラクションのタンパク質をＰｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ試薬で検出し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥできれいな溶出画分を回収した。
実施例１で調製された発現プラスミドｐＣｏｌｄ１－Ｈｉｓ－ＢｍＥ１を大腸菌ＢＬ２１株に形質転換した。形質転換された菌株を、３７℃で１８時間培養し、次いでコールドショック（氷冷３０分）後に、ＩＰＴＧ（終濃度０．２ｍＭ）及びＺｎＳＯ4（終濃度１．０ｍＭ）を添加し、候補タンパク質を発現させて１５℃で２２時間培養した。菌体を回収し、破砕後に、Ｎｉ－Ａｆｆｉｎｉｔｙ精製（カラム：Ｈｉｓ－ｔｒａｐ ＨＰ５ｍｌ）及びゲル濾過クロマトグラフィー精製（カラム：Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ １０／３００ＧＬ）により、精製タンパク質を調製した（図４）。尚、Ｎｉ－Ａｆｆｉｎｉｔｙ精製には、緩衝液Ａ（５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、４０ｍＭイミダゾール含有５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０））緩衝液Ｂ（５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、３００ｍＭイミダゾール含有５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０））を用いて、緩衝液Ｂの０％から１００％のステップワイズ溶出で精製し、緩衝液Ｂの１００％溶出画分を回収した。ゲルろ過クロマトグラフィー精製には１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有２０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いて、各フラクションのタンパク質をＰｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ試薬で検出し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥできれいな溶出画分を回収した。
【0036】
実施例３：Ｈｉｓ－ＢｍＥ１の特性解析
こうして調製された精製タンパク質について、生化学的実験を行い、下記の特性を調べた。標準的な酵素反応は、以下の通りに行った。酵素溶液５０μＬ、０．５Ｍ ＭＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．０） ２００μＬ、１．０、２．０、３．０、５．０、１０ｍｇ／ｍｌピログルタミン酸（ｐＨ６．０） ６００μＬ、０．１ＭＺｎＳＯ4 １０μＬ、ＭｉｌｌｉＱ水１３０μＬを混合し、４５℃で１０分間反応させた。その後、０．５Ｍ ＥＤＴＡを１０μＬ添加後、９５℃、１０分間で酵素を失活させた。得られた反応液 ５０μＬを用いてＬ－グルタミン酸測定キット（ヤマサ）を用いて生成したグルタミン酸量を測定し、反応速度を測定した。
１分間に１μｍｏｌのピログルタミン酸を開環してグルタミン酸にする酵素活性を１Ｕとして、各条件で比活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。
こうして調製された精製タンパク質について、生化学的実験を行い、下記の特性を調べた。標準的な酵素反応は、以下の通りに行った。酵素溶液５０μＬ、０．５Ｍ ＭＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．０） ２００μＬ、１．０、２．０、３．０、５．０、１０ｍｇ／ｍｌピログルタミン酸（ｐＨ６．０） ６００μＬ、０．１ＭＺｎＳＯ4 １０μＬ、ＭｉｌｌｉＱ水１３０μＬを混合し、４５℃で１０分間反応させた。その後、０．５Ｍ ＥＤＴＡを１０μＬ添加後、９５℃、１０分間で酵素を失活させた。得られた反応液 ５０μＬを用いてＬ－グルタミン酸測定キット（ヤマサ）を用いて生成したグルタミン酸量を測定し、反応速度を測定した。
【表3】
【表4】
【0037】
（１）至適ｐＨとｐＨ安定性
標準的な酵素反応を用いて、至適ｐＨを調べた（図５）。使用した緩衝液を以下に示す。酢酸緩衝液：ｐＨ３．５～６．０、ＭＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液：ｐＨ５．５～６．５、ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液：ｐＨ６．５～８．０、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液：ｐＨ８．０～９．５、ホウ酸緩衝液：ｐＨ９．５～１０．５。反応に用いた基質のｐＨは各緩衝液のｐＨに調整して行った。
その結果、反応至適ｐＨは、６．０～６．５であった。
各緩衝液の終濃度が０．１Ｍとなるように酵素液に添加後、４℃、１８時間静置した後に、標準的な測定法に準じてｐＨ安定性を調べた（図６）。その結果、ｐＨ４．０～１０．５で安定性を示した。
標準的な酵素反応を用いて、至適ｐＨを調べた（図５）。使用した緩衝液を以下に示す。酢酸緩衝液：ｐＨ３．５～６．０、ＭＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液：ｐＨ５．５～６．５、ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液：ｐＨ６．５～８．０、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液：ｐＨ８．０～９．５、ホウ酸緩衝液：ｐＨ９．５～１０．５。反応に用いた基質のｐＨは各緩衝液のｐＨに調整して行った。
その結果、反応至適ｐＨは、６．０～６．５であった。
各緩衝液の終濃度が０．１Ｍとなるように酵素液に添加後、４℃、１８時間静置した後に、標準的な測定法に準じてｐＨ安定性を調べた（図６）。その結果、ｐＨ４．０～１０．５で安定性を示した。
【0038】
（２）至適温度及び安定性
標準的な活性測定法に基づき、反応温度のみ３０～８０℃の範囲で測定し、至適温度を調べた（図７）。反応至適温度は、約５５℃であった。
標準的な活性測定法に基づき、反応温度のみ３０～８０℃の範囲で測定し、至適温度を調べた（図７）。反応至適温度は、約５５℃であった。
【0039】
酵素溶液のみを３０～８０℃の範囲で１０分間インキュベートした後に、残存する酵素活性値を標準法で調べた。その結果、５０℃以下で８０％以上の残存活性を示し、安定性を保つことが分かった（図８）。
【0040】
（３）金属要求性
標準的な酵素反応条件下で、０．５Ｍ ＥＤＴＡを１０μＬ添加して反応させた。その結果、著しく反応は阻害された。また、アフィニティー精製したＢｍＥ１に終濃度５ｍＭとなるようにＥＤＴＡを添加し、氷上で３０分制した後に、ＥＤＴＡを含まない緩衝液で４℃、１８時間透析した。透析した酵素溶液を用いて、亜鉛の添加の有無で酵素活性を測定した結果、亜鉛を添加すると比活性が向上したことから、亜鉛要求性であることが示された（図８）。
標準的な酵素反応条件下で、０．５Ｍ ＥＤＴＡを１０μＬ添加して反応させた。その結果、著しく反応は阻害された。また、アフィニティー精製したＢｍＥ１に終濃度５ｍＭとなるようにＥＤＴＡを添加し、氷上で３０分制した後に、ＥＤＴＡを含まない緩衝液で４℃、１８時間透析した。透析した酵素溶液を用いて、亜鉛の添加の有無で酵素活性を測定した結果、亜鉛を添加すると比活性が向上したことから、亜鉛要求性であることが示された（図８）。
【0041】
（４）カルボキシペプチダーゼ活性
酸性カルボキシペプチダーゼ測定キット（キッコーマンバイオケミファ社製）を用いて、カルボキシペプチダーゼ活性を測定した。０．３３２ｍｇ／ｍＬのＨｉｓ－ＢｍＥ１２５μＬを用いて、反応温度のみ５５℃として、測定キットの手順通りに測定した。その結果、比活性は０．３１８Ｕ／ｍｇであり、カルボキシペプチダーゼ活性を有すると考えられる。
酸性カルボキシペプチダーゼ測定キット（キッコーマンバイオケミファ社製）を用いて、カルボキシペプチダーゼ活性を測定した。０．３３２ｍｇ／ｍＬのＨｉｓ－ＢｍＥ１２５μＬを用いて、反応温度のみ５５℃として、測定キットの手順通りに測定した。その結果、比活性は０．３１８Ｕ／ｍｇであり、カルボキシペプチダーゼ活性を有すると考えられる。
【0042】
（５）γ-ポリグルタミン酸分解活性
実施例２で調製されたＢｍＥ１をポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ）含有試料に添加して、試料に含まれるγ－ＰＧＡに作用させることで、検出されるＬ－Ｇｌｕ濃度が変化するか分析した。２０ｍｇ／ｍｌ γ－ＰＧＡ、ＭＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ６．０） ２００μＬ、試料６００μＬ、ＺｎＳＯ4 １０μＬ（終濃度１．０ｍＭ）、滅菌水１３０μＬ、０．０３３２ｍｇ／ｍＬのＢｍＥ１ ５０μＬを混合し、５５℃で、５分、１０分、２０分、３０分間、反応させた。０．５Ｍ ＥＤＴＡ１０μｌ添加して、８５℃５分間インキュベートすることで、酵素を失活させた。得られた反応液 ５０μＬを用いてＬ－グルタミン酸測定キット（ヤマサ）を用いて生成したグルタミン酸量を測定した（図１０）。
実施例２で調製されたＢｍＥ１をポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ）含有試料に添加して、試料に含まれるγ－ＰＧＡに作用させることで、検出されるＬ－Ｇｌｕ濃度が変化するか分析した。２０ｍｇ／ｍｌ γ－ＰＧＡ、ＭＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ６．０） ２００μＬ、試料６００μＬ、ＺｎＳＯ4 １０μＬ（終濃度１．０ｍＭ）、滅菌水１３０μＬ、０．０３３２ｍｇ／ｍＬのＢｍＥ１ ５０μＬを混合し、５５℃で、５分、１０分、２０分、３０分間、反応させた。０．５Ｍ ＥＤＴＡ１０μｌ添加して、８５℃５分間インキュベートすることで、酵素を失活させた。得られた反応液 ５０μＬを用いてＬ－グルタミン酸測定キット（ヤマサ）を用いて生成したグルタミン酸量を測定した（図１０）。
【表5】
【0043】
実施例４：Ｈｉｓ－ＢｍＥ１の構造解析
結晶化条件のスクリーニング
実施例２で精製されたＨｉｓ－ＢｍＥ１についての結晶化条件を、Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｃｒｅｅｎ ＨＲ２－１１０及びＣｒｙｓｔａｌ Ｓｃｒｅｅｎ ＨＲ２－１１２（Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を用いてスクリーニングし、結晶化条件として、Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｃｒｅｅｎ ＨＲ２－１１０の条件２２を選択した。選択された結晶化条件を元に塩や沈殿剤の濃度、ＢｕｆｆｅｒのｐＨを変化させてより優れた結晶化条件を選択した。沈殿剤として、２０００～８０００でＰＥＧ分子量を変化させることで、ＰＥＧ４０００を用いることで優れた結晶化条件となった。こうして得られた結晶について高エネルギー加速器研究機構（ＫＥＫ）のPhoton Factory供し、約２．０Åの回折データが得られた。
結晶化条件のスクリーニング
実施例２で精製されたＨｉｓ－ＢｍＥ１についての結晶化条件を、Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｃｒｅｅｎ ＨＲ２－１１０及びＣｒｙｓｔａｌ Ｓｃｒｅｅｎ ＨＲ２－１１２（Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を用いてスクリーニングし、結晶化条件として、Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｃｒｅｅｎ ＨＲ２－１１０の条件２２を選択した。選択された結晶化条件を元に塩や沈殿剤の濃度、ＢｕｆｆｅｒのｐＨを変化させてより優れた結晶化条件を選択した。沈殿剤として、２０００～８０００でＰＥＧ分子量を変化させることで、ＰＥＧ４０００を用いることで優れた結晶化条件となった。こうして得られた結晶について高エネルギー加速器研究機構（ＫＥＫ）のPhoton Factory供し、約２．０Åの回折データが得られた。
【0044】
セレノメチオニン置換Ｈｉｓ－ＢｍＥ１結晶を用いたＸ線結晶構造解析
Ｈｉｓ－ＢｍＥ１プラスミドを導入された大腸菌ＢＬ２１株を用い、ＬｅＭａｓｔｅｒ培地を用いて生育させ、ＩＰＴＧにより遺伝子発現を誘導することで、セレノメチオニン置換Ｈｉｓ－ＢｍＥ１（Ｓｅ－Ｈｉｓ－ＢｍＥ１）を発現させた。Ｎｉ－Ａｆｆｉｎｉｔｙ及びゲル濾過クロマトグラフィーを行い、Ｓｅ－Ｈｉｓ－ＢｍＥ１を精製した。上述の結晶化条件を参考にして、調整することでＳｅ－Ｈｉｓ－ＢｍＥ１結晶が得られた。結晶を、高エネルギー加速器研究機構（ＫＥＫ）で回折データを取得した。
Ｈｉｓ－ＢｍＥ１プラスミドを導入された大腸菌ＢＬ２１株を用い、ＬｅＭａｓｔｅｒ培地を用いて生育させ、ＩＰＴＧにより遺伝子発現を誘導することで、セレノメチオニン置換Ｈｉｓ－ＢｍＥ１（Ｓｅ－Ｈｉｓ－ＢｍＥ１）を発現させた。Ｎｉ－Ａｆｆｉｎｉｔｙ及びゲル濾過クロマトグラフィーを行い、Ｓｅ－Ｈｉｓ－ＢｍＥ１を精製した。上述の結晶化条件を参考にして、調整することでＳｅ－Ｈｉｓ－ＢｍＥ１結晶が得られた。結晶を、高エネルギー加速器研究機構（ＫＥＫ）で回折データを取得した。
【0045】
ＳＡＤ法による解析を進め、Ｓｅ－Ｈｉｓ－ＢｍＥ１結晶及びＨｉｓ－ＢｍＥ１結晶の両方の結晶構造モデルを精密化し、最大分解能を約１．７Åに設定し、精密化された３次元構造を取得した（図１１（Ａ））。亜鉛が配位すると考えられる箇所の拡大図を図１１（Ｂ）に示す。また、ヒト由来カルボキシペプチダーゼ（ＰＤＢＩＤ：５ＯＭ９）の活性中心と、亜鉛が配位すると考えられる箇所を重ね合わせて比較した図を図１２に示す。Ｈｉｓ－ＢｍＥ１とＳｅ－Ｈｉｓ－ＢｍＥ１結晶の結晶化条件を及び結晶学的統計値を下記に示す：
【表6】
【0046】
配列解析からＮ末端側にＺｎ2+要求性タンパク質ドメインの存在が示唆されたが、かかる示唆に即し、亜鉛に基づくと考えられるＤｅｎｓｉｔｙが確認された。亜鉛が配位している周辺のアミノ酸残基には、Ｈｉｓ２０４、Ｇｌｕ１２１、Ｇｌｕ３０５、Ｈｉｓ１１８、Ｔｙｒ２６７、及びＡｒｇ１６５が存在しており、かかるモチーフは、カルボキシペプチダーゼモチーフであり、カルボキシペプチダーゼ活性を有することが推測された。
【0047】
Ｈｉｓ－ＢｍＥ１の立体構造において、基質結合部位と推測されるＡｒｇ１６５、Ｔｙｒ２６７、Ｇｌｕ３０５をアラニンに置換したｐＣｏｌｄ１－ＢｍＥ１－Ｒ１６５Ａ， Ｙ２６７Ａ， Ｅ３０５Ａの発現プラスミドを構築し、それらを用いて大腸菌ＢＬ２１株を形質転換し、実施例２と同様に培養、精製を行った。各変異株の比活性を実施例３の標準的な酵素活性測定法で比較した（図１３）
【0048】
Ｅ３０５Ａは、Ｈｉｓ－ＢｍＥ１と比べて、ピログルタミン酸開環反応が著しく低下し、基質認識に関わると推測された。
３０５Ａの酵素活性が著しく低かったことから、反応時間を２０分、３０分と延ばして酵素活性が見られるか比較した（図１４）
Ｈｉｓ－ＢｍＥ１や他の変異体においては、時間経過と共に活性が上昇されたが、Ｅ３０５Ａは、酵素時間を長くしてもＬ－Ｇｌｕへ変換されなかった。
３０５Ａの酵素活性が著しく低かったことから、反応時間を２０分、３０分と延ばして酵素活性が見られるか比較した（図１４）
Ｈｉｓ－ＢｍＥ１や他の変異体においては、時間経過と共に活性が上昇されたが、Ｅ３０５Ａは、酵素時間を長くしてもＬ－Ｇｌｕへ変換されなかった。
【0049】
実施例５：食品製造工程における、Ｌ－ピログルタミン酸開環酵素の適用
（１）トマト缶試料を基質とした酵素反応
トマト缶試料に対して実施例２で調製されたＢｍＥ１を添加して試料に含まれるＰＥに作用させることで、検出されるＬ－Ｇｌｕ濃度が変化するか分析した。完熟ホールトマト（日本デルモンテ製）をフードプロセッサーで細かく粉砕し、６０００ｒｐｍ、１０分間、遠心して上清を試料とした。ＭＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ６．０） ２００μＬ、試料６００μＬ、ＺｎＳＯ4 １０μＬ（終濃度１．０ｍＭ）、滅菌水１３０μＬ、０．０３３２ｍｇ／ｍＬのＢｍＥ１ ５０μＬを混合し、５５℃で、５分から３０分間、反応させた。Ｌ－ピログルタミン酸含有水溶液（ＰＥ：終濃度１５ｍｇ／ｍｌ）、トマト缶試料（Ｄｅｌｍｏｎｔｅ）を用いた。結果を下記に示す：
（１）トマト缶試料を基質とした酵素反応
トマト缶試料に対して実施例２で調製されたＢｍＥ１を添加して試料に含まれるＰＥに作用させることで、検出されるＬ－Ｇｌｕ濃度が変化するか分析した。完熟ホールトマト（日本デルモンテ製）をフードプロセッサーで細かく粉砕し、６０００ｒｐｍ、１０分間、遠心して上清を試料とした。ＭＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ６．０） ２００μＬ、試料６００μＬ、ＺｎＳＯ4 １０μＬ（終濃度１．０ｍＭ）、滅菌水１３０μＬ、０．０３３２ｍｇ／ｍＬのＢｍＥ１ ５０μＬを混合し、５５℃で、５分から３０分間、反応させた。Ｌ－ピログルタミン酸含有水溶液（ＰＥ：終濃度１５ｍｇ／ｍｌ）、トマト缶試料（Ｄｅｌｍｏｎｔｅ）を用いた。結果を下記に示す：
【表7】
【0050】
いずれの反応時間においても、ＢｍＥ１を添加することで、Ｂｌａｎｋに対しＬ－Ｇｌｕ濃度が増加し、酵素処理時間が長くなるほど増加量が多くなった（図１５）。
【0051】
（２）Iしょうゆ試料を基質とした酵素反応
しょうゆ試料には、超減塩しょうゆ（食塩分６６％カット）としぼりたて生しょうゆ（共にキッコーマン社製）を用いた。しょうゆ６００μＬにＺｎＳＯ4を１０μＬ（終濃度１．０ｍＭ）、滅菌水１３０μＬ、０．０３３２ｍｇ／ｍＬのＢｍＥ１ ５０μＬを混合し、５５℃で、１０分間反応させた。Ｂｌａｎｋは、酵素の代わりに１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いた。反応後、０．５Ｍ ＥＤＴＡを添加して氷中に静置して反応を停止した。その後、反応液をＭｉｌｌｉＱ水で２５倍希釈して、得られた反応液についてＬ－グルタミン酸測定キット（ヤマサ）を用いて生成したグルタミン酸量を測定した。
しょうゆ試料には、超減塩しょうゆ（食塩分６６％カット）としぼりたて生しょうゆ（共にキッコーマン社製）を用いた。しょうゆ６００μＬにＺｎＳＯ4を１０μＬ（終濃度１．０ｍＭ）、滅菌水１３０μＬ、０．０３３２ｍｇ／ｍＬのＢｍＥ１ ５０μＬを混合し、５５℃で、１０分間反応させた。Ｂｌａｎｋは、酵素の代わりに１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いた。反応後、０．５Ｍ ＥＤＴＡを添加して氷中に静置して反応を停止した。その後、反応液をＭｉｌｌｉＱ水で２５倍希釈して、得られた反応液についてＬ－グルタミン酸測定キット（ヤマサ）を用いて生成したグルタミン酸量を測定した。
【表8】
【0052】
いずれの試料においても、ＢｍＥ１を添加することで、Ｂｌａｎｋに対しＬ－Ｇｌｕ濃度が増加した（図１６）。
【図1A-B】
【図1C】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【配列表】