(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024060877
(43)【公開日】2024-05-07
(54)【発明の名称】核酸抽出方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/10 20060101AFI20240425BHJP
C12Q 1/37 20060101ALI20240425BHJP
C12Q 1/04 20060101ALI20240425BHJP
C12Q 1/6806 20180101ALI20240425BHJP
【ＦＩ】
C12N15/10 100Z
C12N15/10 112Z
C12Q1/37
C12Q1/04
C12Q1/6806 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】8
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022168438
(22)【出願日】2022-10-20
(71)【出願人】
【識別番号】000006507
【氏名又は名称】横河電機株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110002147
【氏名又は名称】弁理士法人酒井国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】前村 知佳
(72)【発明者】
【氏名】宮内 祐樹
(72)【発明者】
【氏名】蓼沼 崇
(72)【発明者】
【氏名】田口 朋之
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ06
4B063QQ16
4B063QQ36
4B063QQ54
4B063QR16
4B063QR35
4B063QR39
4B063QR75
4B063QS14
4B063QS17
4B063QS25
4B063QS34
4B063QS39
4B063QS40
4B063QX02
(57)【要約】
【課題】試料に含まれる核酸を効率よく抽出すること。
【解決手段】核酸抽出方法は、細胞を含む試料に細胞の溶解を促進する酵素としてアクロモペプチダーゼを添加し、アクロモペプチダーゼを添加した試料を所定温度で保温し、所定時間保温された試料に細胞の溶解を促進する溶解補助剤を添加し、溶解補助剤を添加した試料を所定温度まで加熱し、所定時間加熱した試料を核酸を吸着する吸着担体としてシリカおよび炭化ケイ素を有するカラムに注入し、核酸を精製する。
【選択図】図１
【解決手段】核酸抽出方法は、細胞を含む試料に細胞の溶解を促進する酵素としてアクロモペプチダーゼを添加し、アクロモペプチダーゼを添加した試料を所定温度で保温し、所定時間保温された試料に細胞の溶解を促進する溶解補助剤を添加し、溶解補助剤を添加した試料を所定温度まで加熱し、所定時間加熱した試料を核酸を吸着する吸着担体としてシリカおよび炭化ケイ素を有するカラムに注入し、核酸を精製する。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞から核酸を抽出する核酸抽出方法であって、
前記細胞を含む試料に、前記細胞の溶解を促進する酵素としてアクロモペプチダーゼを添加し、前記アクロモペプチダーゼが添加された前記試料を所定温度で保温する保温工程と、
前記保温工程において所定時間保温された前記試料に、前記細胞の溶解を促進する溶解補助剤を添加し、前記溶解補助剤が添加された前記試料を所定温度まで加熱する加熱工程と、
を含む核酸抽出方法。
前記細胞を含む試料に、前記細胞の溶解を促進する酵素としてアクロモペプチダーゼを添加し、前記アクロモペプチダーゼが添加された前記試料を所定温度で保温する保温工程と、
前記保温工程において所定時間保温された前記試料に、前記細胞の溶解を促進する溶解補助剤を添加し、前記溶解補助剤が添加された前記試料を所定温度まで加熱する加熱工程と、
を含む核酸抽出方法。
【請求項2】
細胞から核酸を抽出する核酸抽出方法であって、
前記細胞を含む試料に、前記細胞の溶解を促進する溶解補助剤を添加し、前記溶解補助剤が添加された前記試料を所定温度まで加熱する加熱工程と、
前記加熱工程において所定時間加熱された前記試料を、前記核酸を吸着する吸着担体としてシリカおよび炭化ケイ素を有するカラムに注入し、前記核酸を精製する精製工程と、
を含む核酸抽出方法。
前記細胞を含む試料に、前記細胞の溶解を促進する溶解補助剤を添加し、前記溶解補助剤が添加された前記試料を所定温度まで加熱する加熱工程と、
前記加熱工程において所定時間加熱された前記試料を、前記核酸を吸着する吸着担体としてシリカおよび炭化ケイ素を有するカラムに注入し、前記核酸を精製する精製工程と、
を含む核酸抽出方法。
【請求項3】
前記核酸は、リボ核酸である、
請求項１または２に記載の核酸抽出方法。
請求項１または２に記載の核酸抽出方法。
【請求項4】
前記細胞は、グラム陽性菌が有する細胞である、
請求項１または２に記載の核酸抽出方法。
請求項１または２に記載の核酸抽出方法。
【請求項5】
前記溶解補助剤は、界面活性剤としてドデシル硫酸ナトリウムを含む、
請求項１または２に記載の核酸抽出方法。
請求項１または２に記載の核酸抽出方法。
【請求項6】
前記保温工程は、
前記細胞を含む試料に、キレート剤としてエチレンジアミン四酢酸をさらに添加する、
請求項１に記載の核酸抽出方法。
前記細胞を含む試料に、キレート剤としてエチレンジアミン四酢酸をさらに添加する、
請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項7】
前記保温工程は、
前記細胞を含む試料に、前記酵素としてリゾスタフィンをさらに添加する、
請求項１に記載の核酸抽出方法。
前記細胞を含む試料に、前記酵素としてリゾスタフィンをさらに添加する、
請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項8】
前記保温工程は、
前記アクロモペプチダーゼが添加された前記試料を１０分以上保温する、
請求項１に記載の核酸抽出方法。
前記アクロモペプチダーゼが添加された前記試料を１０分以上保温する、
請求項１に記載の核酸抽出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、核酸抽出方法に関する。
【背景技術】
【0002】
従来、菌体培養液を採取し、溶解補助剤を添加し、高温高圧処理を行うことによって、菌体の細胞から核酸を抽出する技術がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】特許第５６２４４８７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
しかしながら、従来技術では、試料に含まれる核酸を効率よく抽出することが難しい。例えば、従来技術では、グラム陽性菌等の細胞表層が強固な菌体からの核酸の回収量が少ないので、核酸の抽出に長い時間を必要とする。
【0005】
本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、試料に含まれる核酸を効率よく抽出することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明は、細胞から核酸を抽出する核酸抽出方法であって、前記細胞を含む試料に、前記細胞の溶解を促進する酵素としてアクロモペプチダーゼ（登録商標）を添加し、前記アクロモペプチダーゼが添加された前記試料を所定温度で保温する保温工程と、前記保温工程において所定時間保温された前記試料に、前記細胞の溶解を促進する溶解補助剤を添加し、前記溶解補助剤が添加された前記試料を所定温度まで加熱する加熱工程と、を含む核酸抽出方法を提供する。
【0007】
また、本発明は、細胞から核酸を抽出する核酸抽出方法であって、前記細胞を含む試料に、前記細胞の溶解を促進する溶解補助剤を添加し、前記溶解補助剤が添加された前記試料を所定温度まで加熱する加熱工程と、前記加熱工程において所定時間加熱された前記試料を、前記核酸を吸着する吸着担体としてシリカおよび炭化ケイ素を有するカラムに注入し、前記核酸を精製する精製工程と、を含む核酸抽出方法を提供する。
【発明の効果】
【0008】
本発明によれば、試料に含まれる核酸を効率よく抽出することができるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】実施形態に係る核酸抽出システムの構成例を示す図である。
【図2】実施形態に係る実験結果１を説明するための図である。
【図3】実施形態に係る実験結果２を説明するための図である。
【図4】実施形態に係る実験結果３を説明するための図である。
【図5】実施形態に係る実験結果４を説明するための図である。
【図6】実施形態に係る実験結果５を説明するための図である。
【図7】実施形態に係る核酸抽出工程の流れの一例を示すフローチャートである。
【図8】実施形態に係る採取工程の流れの一例を示すフローチャートである。
【図9】実施形態に係る保温工程の流れの一例を示すフローチャートである。
【図10】実施形態に係る封入工程の流れの一例を示すフローチャートである。
【図11】実施形態に係る加熱工程の流れの一例を示すフローチャートである。
【図12】実施形態に係る精製工程の流れの一例を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【0010】
以下に、本発明の一実施形態に係る核酸抽出方法を、図面を参照して詳細に説明する。なお、本発明は、以下に説明する実施形態により限定されるものではない。
【0011】
〔実施形態〕
以下に、実施形態に係る核酸抽出システムの構成、各工程の詳細、各工程の流れを順に説明し、最後に実施形態の効果を説明する。
以下に、実施形態に係る核酸抽出システムの構成、各工程の詳細、各工程の流れを順に説明し、最後に実施形態の効果を説明する。
【0012】
〔１．核酸抽出システム１００の構成〕
図１を用いて、実施形態に係る核酸抽出システム１００の構成を説明する。図１は、実施形態に係る核酸抽出システム１００の構成例を示す図である。以下では、核酸抽出システム１００全体の構成例、核酸抽出システム１００の各工程、核酸抽出システム１００の効果の順に説明する。
図１を用いて、実施形態に係る核酸抽出システム１００の構成を説明する。図１は、実施形態に係る核酸抽出システム１００の構成例を示す図である。以下では、核酸抽出システム１００全体の構成例、核酸抽出システム１００の各工程、核酸抽出システム１００の効果の順に説明する。
【0013】
（１－１．核酸抽出システム１００全体の構成例）
核酸抽出システム１００は、菌体培養容器１０、保温容器２０、封入容器３０、加熱装置４０および精製容器５０を有する。以下では、菌体培養容器１０、保温容器２０、封入容器３０、加熱装置４０、精製容器５０の順に説明する。
核酸抽出システム１００は、菌体培養容器１０、保温容器２０、封入容器３０、加熱装置４０および精製容器５０を有する。以下では、菌体培養容器１０、保温容器２０、封入容器３０、加熱装置４０、精製容器５０の順に説明する。
【0014】
（１－１－１．菌体培養容器１０）
菌体培養容器１０は、菌体培養液Ｓを収容する容器である。菌体培養液Ｓは、細胞Ｃを有する微生物を培養する溶液である。図１の例では、菌体培養容器１０は、栓の付いた三角フラスコであるが、菌体培養容器１０の形状や材質は限定されない。
菌体培養容器１０は、菌体培養液Ｓを収容する容器である。菌体培養液Ｓは、細胞Ｃを有する微生物を培養する溶液である。図１の例では、菌体培養容器１０は、栓の付いた三角フラスコであるが、菌体培養容器１０の形状や材質は限定されない。
【0015】
（１－１－２．保温容器２０）
保温容器２０は、前処理溶液Ｉを保温（インキュベート）する容器である。前処理溶液Ｉは、菌体培養液Ｓに酵素Ｅを添加した溶液である。図１の例では、保温容器２０は、栓の付いたガラスチューブであるが、保温容器２０の形状や材質は限定されない。
保温容器２０は、前処理溶液Ｉを保温（インキュベート）する容器である。前処理溶液Ｉは、菌体培養液Ｓに酵素Ｅを添加した溶液である。図１の例では、保温容器２０は、栓の付いたガラスチューブであるが、保温容器２０の形状や材質は限定されない。
【0016】
（１－１－３．封入容器３０）
封入容器３０は、加熱用溶液Ｈを封入する容器である。加熱用溶液Ｈは、前処理溶液Ｉに溶解補助剤Ｄを添加した溶液である。図１の例では、封入容器３０は、栓の付いたガラスチューブであるが、封入容器３０の形状や材質は限定されない。
封入容器３０は、加熱用溶液Ｈを封入する容器である。加熱用溶液Ｈは、前処理溶液Ｉに溶解補助剤Ｄを添加した溶液である。図１の例では、封入容器３０は、栓の付いたガラスチューブであるが、封入容器３０の形状や材質は限定されない。
【0017】
（１－１－４．加熱装置４０）
加熱装置４０は、加熱用溶液Ｈを加熱する容器である。図１の例では、加熱装置４０は、ヒートブロックであるが、加熱装置４０の形状や材質は限定されない。
加熱装置４０は、加熱用溶液Ｈを加熱する容器である。図１の例では、加熱装置４０は、ヒートブロックであるが、加熱装置４０の形状や材質は限定されない。
【0018】
（１－１－５．精製容器５０）
精製容器５０は、精製用溶液Ｐを精製する容器である。精製用溶液Ｐは、精製される対象として核酸Ｎを含む溶液である。図１の例では、加熱装置４０は、コックの付いたカラムであるが、精製容器５０の形状や材質は限定されない。
精製容器５０は、精製用溶液Ｐを精製する容器である。精製用溶液Ｐは、精製される対象として核酸Ｎを含む溶液である。図１の例では、加熱装置４０は、コックの付いたカラムであるが、精製容器５０の形状や材質は限定されない。
【0019】
（１－１－６．その他）
図１に示した核酸抽出システム１００には、複数の菌体培養容器１０、複数の保温容器２０、複数の封入容器３０、複数台の加熱装置４０または複数の精製容器５０が含まれてもよい。また、核酸抽出システム１００において、菌体培養容器１０、保温容器２０および封入容器３０のうち２以上の容器が統合された構成であってもよい。
図１に示した核酸抽出システム１００には、複数の菌体培養容器１０、複数の保温容器２０、複数の封入容器３０、複数台の加熱装置４０または複数の精製容器５０が含まれてもよい。また、核酸抽出システム１００において、菌体培養容器１０、保温容器２０および封入容器３０のうち２以上の容器が統合された構成であってもよい。
【0020】
（１－２．核酸抽出システム１００の工程）
上記の核酸抽出システム１００の工程について説明する。以下では、採取工程、保温工程、封入工程、加熱工程、精製工程の順に説明する。なお、各工程のうち、省略される工程があってもよい。
上記の核酸抽出システム１００の工程について説明する。以下では、採取工程、保温工程、封入工程、加熱工程、精製工程の順に説明する。なお、各工程のうち、省略される工程があってもよい。
【0021】
（１－２－１．採取工程）
図１（１）に示す採取工程について説明する。第１に、採取工程では、菌体培養容器１０に収容される菌体培養液Ｓにおいて、菌体を培養する菌体培養工程を実施する。例えば、菌体培養工程では、菌体として、大腸菌（Escherichia coli：E.coli）や黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus：S.aureus）を使用し、ＳＣＤ（Soybean Casein Digest）液体培地において３７℃で一晩培養する。第２に、採取工程では、菌体培養容器１０に収容される菌体培養液Ｓの一部を保温容器２０に採取する菌体培養液採取工程を実施する。ここで、菌体培養液採取工程は、ターゲットを効率よく回収できるので、培養工程における培養が難しい細胞Ｃであっても、培養することなく対象から直接採取された試料に適用できる。また、菌体培養液採取工程は、少ない細胞数であっても適用できるので、検出に必要な微生物培養時間の短縮効果がある。
図１（１）に示す採取工程について説明する。第１に、採取工程では、菌体培養容器１０に収容される菌体培養液Ｓにおいて、菌体を培養する菌体培養工程を実施する。例えば、菌体培養工程では、菌体として、大腸菌（Escherichia coli：E.coli）や黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus：S.aureus）を使用し、ＳＣＤ（Soybean Casein Digest）液体培地において３７℃で一晩培養する。第２に、採取工程では、菌体培養容器１０に収容される菌体培養液Ｓの一部を保温容器２０に採取する菌体培養液採取工程を実施する。ここで、菌体培養液採取工程は、ターゲットを効率よく回収できるので、培養工程における培養が難しい細胞Ｃであっても、培養することなく対象から直接採取された試料に適用できる。また、菌体培養液採取工程は、少ない細胞数であっても適用できるので、検出に必要な微生物培養時間の短縮効果がある。
【0022】
（１－２－２．保温工程）
図１（２）に示す保温工程について説明する。第１に、保温工程では、保温容器２０に採取された菌体培養液Ｓに細胞Ｃの溶解を促進する酵素Ｅを添加する酵素添加工程を実施する。このとき、酵素添加工程では、酵素Ｅとして、アクロモペプチダーゼ（Achromopeptidase）およびリゾスタフィン（Lysostaphin）を添加する。第２に、保温工程では、酵素Ｅを含む菌体培養液Ｓである前処理溶液Ｉを調製する前処理溶液調製工程を実施する。このとき、前処理溶液調製工程では、緩衝剤としてトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）を添加し、キレート剤としてエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ：Ethylenediaminetetraacetic Acid）を添加し、各成分の濃度やｐＨを調整する。第３に、保温工程では、前処理溶液Ｉを収容した保温容器２０を保温する前処理溶液保温工程を実施する。例えば、前処理溶液保温工程では、前処理溶液Ｉを収容した保温容器２０を３７℃、１０分間保温するが、保温する温度および時間は細胞Ｃの溶解を促進可能な範囲であればよく、特に限定されない。
図１（２）に示す保温工程について説明する。第１に、保温工程では、保温容器２０に採取された菌体培養液Ｓに細胞Ｃの溶解を促進する酵素Ｅを添加する酵素添加工程を実施する。このとき、酵素添加工程では、酵素Ｅとして、アクロモペプチダーゼ（Achromopeptidase）およびリゾスタフィン（Lysostaphin）を添加する。第２に、保温工程では、酵素Ｅを含む菌体培養液Ｓである前処理溶液Ｉを調製する前処理溶液調製工程を実施する。このとき、前処理溶液調製工程では、緩衝剤としてトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）を添加し、キレート剤としてエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ：Ethylenediaminetetraacetic Acid）を添加し、各成分の濃度やｐＨを調整する。第３に、保温工程では、前処理溶液Ｉを収容した保温容器２０を保温する前処理溶液保温工程を実施する。例えば、前処理溶液保温工程では、前処理溶液Ｉを収容した保温容器２０を３７℃、１０分間保温するが、保温する温度および時間は細胞Ｃの溶解を促進可能な範囲であればよく、特に限定されない。
【0023】
（１－２－３．封入工程）
図１（３）に示す封入工程について説明する。第１に、封入工程では、一定時間保温後の前処理溶液Ｉに細胞Ｃの溶解を促進する溶解補助剤Ｄを添加する溶解補助剤添加工程を実施する。例えば、溶解補助剤添加工程では、界面活性剤としてドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ：Sodium Dodecyl Sulfate）を添加する。第２に、封入工程では、溶解補助剤Ｄを含む菌体培養液Ｓである加熱用溶液Ｈを調製する加熱用溶液調製工程を実施する。このとき、加熱用溶液調製工程では、各成分の濃度やｐＨを調整する。第３に、封入工程では、調製された加熱用溶液Ｈを封入容器３０に封入する加熱用溶液封入工程を実施する。例えば、加熱用溶液封入工程では、封入容器３０として、ガラスチューブに加熱用溶液Ｈを封入し、栓をすることによって密閉する。
図１（３）に示す封入工程について説明する。第１に、封入工程では、一定時間保温後の前処理溶液Ｉに細胞Ｃの溶解を促進する溶解補助剤Ｄを添加する溶解補助剤添加工程を実施する。例えば、溶解補助剤添加工程では、界面活性剤としてドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ：Sodium Dodecyl Sulfate）を添加する。第２に、封入工程では、溶解補助剤Ｄを含む菌体培養液Ｓである加熱用溶液Ｈを調製する加熱用溶液調製工程を実施する。このとき、加熱用溶液調製工程では、各成分の濃度やｐＨを調整する。第３に、封入工程では、調製された加熱用溶液Ｈを封入容器３０に封入する加熱用溶液封入工程を実施する。例えば、加熱用溶液封入工程では、封入容器３０として、ガラスチューブに加熱用溶液Ｈを封入し、栓をすることによって密閉する。
【0024】
（１－２－４．加熱工程）
図１（４）に示す加熱工程について説明する。第１に、加熱工程では、加熱装置４０を設定温度まで予熱する加熱装置予熱工程を実施する。例えば、加熱装置予熱工程では、設定温度である１４０℃まで予熱するが、予熱する温度は核酸Ｎを抽出可能な範囲であればよく、特に限定されない。第２に、加熱工程では、加熱用溶液Ｈが封入された封入容器３０を加熱装置４０に収容する封入容器設置工程を実施する。例えば、封入容器設置工程では、封入容器３０であるガラスチューブをヒートブロックに挿入することによって設置する。第３に、加熱工程では、設置された封入容器３０を加熱する封入容器加熱工程を実施する。例えば、封入容器加熱工程では、加熱用溶液Ｈを封入した封入容器３０を１４０℃、４５秒間加熱するが、加熱する温度および時間は核酸Ｎを抽出可能な範囲であればよく、特に限定されない。
図１（４）に示す加熱工程について説明する。第１に、加熱工程では、加熱装置４０を設定温度まで予熱する加熱装置予熱工程を実施する。例えば、加熱装置予熱工程では、設定温度である１４０℃まで予熱するが、予熱する温度は核酸Ｎを抽出可能な範囲であればよく、特に限定されない。第２に、加熱工程では、加熱用溶液Ｈが封入された封入容器３０を加熱装置４０に収容する封入容器設置工程を実施する。例えば、封入容器設置工程では、封入容器３０であるガラスチューブをヒートブロックに挿入することによって設置する。第３に、加熱工程では、設置された封入容器３０を加熱する封入容器加熱工程を実施する。例えば、封入容器加熱工程では、加熱用溶液Ｈを封入した封入容器３０を１４０℃、４５秒間加熱するが、加熱する温度および時間は核酸Ｎを抽出可能な範囲であればよく、特に限定されない。
【0025】
（１－２－５．精製工程）
図１（５）に示す精製工程について説明する。第１に、精製工程では、加熱工程後の加熱用溶液Ｈであって細胞Ｃの核酸Ｎを含む精製用溶液Ｐを、吸着担体が充填された精製容器５０に注入する精製用溶液注入工程を実施する。このとき、精製用溶液注入工程では、吸着担体としてシリカおよび炭化ケイ素の複合素材を有する精製容器５０に精製用溶液Ｐを注入する。第２に、精製工程では、精製用溶液Ｐを注入した精製容器５０に溶出液を注入し、核酸Ｎを抽出する溶出液注入工程を実施する。例えば、溶出液注入工程では、１６Ｓ リボソームリボ核酸（ｒＲＮＡ：ribosome Ribonucleic Acid）を抽出する。第３に、精製工程では、精製された核酸Ｎのコピー数を算出するコピー数算出工程を実施する。例えば、コピー数算出工程では、１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数をリアルタイムＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法によって算出する。
図１（５）に示す精製工程について説明する。第１に、精製工程では、加熱工程後の加熱用溶液Ｈであって細胞Ｃの核酸Ｎを含む精製用溶液Ｐを、吸着担体が充填された精製容器５０に注入する精製用溶液注入工程を実施する。このとき、精製用溶液注入工程では、吸着担体としてシリカおよび炭化ケイ素の複合素材を有する精製容器５０に精製用溶液Ｐを注入する。第２に、精製工程では、精製用溶液Ｐを注入した精製容器５０に溶出液を注入し、核酸Ｎを抽出する溶出液注入工程を実施する。例えば、溶出液注入工程では、１６Ｓ リボソームリボ核酸（ｒＲＮＡ：ribosome Ribonucleic Acid）を抽出する。第３に、精製工程では、精製された核酸Ｎのコピー数を算出するコピー数算出工程を実施する。例えば、コピー数算出工程では、１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数をリアルタイムＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法によって算出する。
【0026】
（１－３．核酸抽出システム１００の効果）
以下では、参考技術として、核酸抽出技術の背景、核酸抽出技術であるトライゾール法および高温高圧法の概要、参考技術の改善点を順に説明した上で、核酸抽出システム１００の効果について説明する。
以下では、参考技術として、核酸抽出技術の背景、核酸抽出技術であるトライゾール法および高温高圧法の概要、参考技術の改善点を順に説明した上で、核酸抽出システム１００の効果について説明する。
【0027】
（１－３－１．参考技術の背景）
近年、食品製造現場の微生物検査では、迅速かつ簡便な検査手法が望まれている。ここで、遺伝子検査法は、従来培養法と比較して、迅速な検査手法である。特に、遺伝子検査法は、１６Ｓ ｒＲＮＡを対象とした解析は、汚染度や菌種判別等に有用である。
近年、食品製造現場の微生物検査では、迅速かつ簡便な検査手法が望まれている。ここで、遺伝子検査法は、従来培養法と比較して、迅速な検査手法である。特に、遺伝子検査法は、１６Ｓ ｒＲＮＡを対象とした解析は、汚染度や菌種判別等に有用である。
【0028】
（１－３－２．トライゾール法の概要）
トライゾール法は、以下の手順によって核酸を抽出する技術である。トライゾール法では、菌体培養液を調製し、ライセート調製を実施し、トライゾール処理を実施し、ＲＮＡ精製を実施し、トータルＲＮＡ量を定量する。このとき、トライゾール法では、トライゾール処理として、ライセート調製後の試料について、トライゾールを添加し、６５℃で２０分間静置し、室温で５分間静置し、クロロホルムを添加し、室温で３分間静置し、４℃で１５分間遠心分離を実施し、水層を回収し、回収した水層にイソプロピルアルコールを添加し、室温で１０分間インキュベートし、４℃で１０分間遠心分離し、チューブの側面および底部のＲＮＡを回収する。
トライゾール法は、以下の手順によって核酸を抽出する技術である。トライゾール法では、菌体培養液を調製し、ライセート調製を実施し、トライゾール処理を実施し、ＲＮＡ精製を実施し、トータルＲＮＡ量を定量する。このとき、トライゾール法では、トライゾール処理として、ライセート調製後の試料について、トライゾールを添加し、６５℃で２０分間静置し、室温で５分間静置し、クロロホルムを添加し、室温で３分間静置し、４℃で１５分間遠心分離を実施し、水層を回収し、回収した水層にイソプロピルアルコールを添加し、室温で１０分間インキュベートし、４℃で１０分間遠心分離し、チューブの側面および底部のＲＮＡを回収する。
【0029】
（１－３－３．高温高圧法の概要）
高温高圧法は、特許文献１に記載された核酸抽出技術であって、以下の手順によって核酸を抽出する簡便で迅速な核酸抽出技術である。高温高圧法では、菌体培養液を調製し、加熱用溶液の調製を実施し、高温高圧処理を実施し、ＲＮＡ精製を実施し、トータルＲＮＡ量を定量する。このとき、高温高圧法では、高温高圧処理として、加熱用溶液の調製後の試料をガラスチューブに封入し、１４０℃で４５秒間加熱する。
高温高圧法は、特許文献１に記載された核酸抽出技術であって、以下の手順によって核酸を抽出する簡便で迅速な核酸抽出技術である。高温高圧法では、菌体培養液を調製し、加熱用溶液の調製を実施し、高温高圧処理を実施し、ＲＮＡ精製を実施し、トータルＲＮＡ量を定量する。このとき、高温高圧法では、高温高圧処理として、加熱用溶液の調製後の試料をガラスチューブに封入し、１４０℃で４５秒間加熱する。
【0030】
（１－３－４．参考技術の改善点）
上述した遺伝子検査法による解析を行うためには十分な核酸を用意する必要があるが、参考技術に係る核酸抽出技術においては、グラム陽性菌等の細胞表層が強固な菌体からのＲＮＡ等の核酸の回収量が少ない。そのため、参考技術に係る核酸抽出技術では、上記解析のために、多量の菌体を集菌する必要があるとともに、多量の菌体からの核酸の抽出が必要になるので、核酸抽出に長時間を要する。
上述した遺伝子検査法による解析を行うためには十分な核酸を用意する必要があるが、参考技術に係る核酸抽出技術においては、グラム陽性菌等の細胞表層が強固な菌体からのＲＮＡ等の核酸の回収量が少ない。そのため、参考技術に係る核酸抽出技術では、上記解析のために、多量の菌体を集菌する必要があるとともに、多量の菌体からの核酸の抽出が必要になるので、核酸抽出に長時間を要する。
【0031】
（１－３－５．核酸抽出システム１００の概要）
核酸抽出システム１００では、細胞Ｃを含む菌体培養液Ｓに、細胞Ｃの溶解を促進する酵素Ｅとしてアクロモペプチダーゼを添加し、アクロモペプチダーゼが添加された菌体培養液Ｓを所定温度で保温し、所定時間保温した菌体培養液Ｓに細胞Ｃの溶解を促進する溶解補助剤Ｄを添加し、溶解補助剤Ｄを添加した菌体培養液Ｓを所定温度まで加熱することによって、核酸Ｎを抽出する。
核酸抽出システム１００では、細胞Ｃを含む菌体培養液Ｓに、細胞Ｃの溶解を促進する酵素Ｅとしてアクロモペプチダーゼを添加し、アクロモペプチダーゼが添加された菌体培養液Ｓを所定温度で保温し、所定時間保温した菌体培養液Ｓに細胞Ｃの溶解を促進する溶解補助剤Ｄを添加し、溶解補助剤Ｄを添加した菌体培養液Ｓを所定温度まで加熱することによって、核酸Ｎを抽出する。
【0032】
また、核酸抽出システム１００では、細胞Ｃを含む菌体培養液Ｓに、細胞Ｃの溶解を促進する溶解補助剤Ｄを添加し、溶解補助剤Ｄを添加した菌体培養液Ｓを所定温度まで加熱し、所定時間加熱した菌体培養液Ｓを核酸Ｎを吸着する吸着担体としてシリカおよび炭化ケイ素を有するカラムに注入することによって、核酸Ｎを精製する。
【0033】
（１－３－６．核酸抽出システム１００の効果）
核酸抽出システム１００は、以下のような効果が期待できる。第１に、核酸抽出システム１００では、参考技術に係る核酸抽出技術と比較し、複数菌種で多量のＲＮＡ調製（核酸抽出）が可能となる。第２に、核酸抽出システム１００では、低濃度菌体試料からのＲＮＡ回収量の底上げが可能となる。第３に、核酸抽出システム１００では、遺伝子検査法の高感度化や増菌工程の短縮化が可能となる。第４に、核酸抽出システム１００では、菌体培養液ＳからのＲＮＡの調製を３０分以内に完了することが可能となる。第５に、核酸抽出システム１００では、特に迅速性を必要とする遺伝子検査法における核酸抽出にも用いることが可能となる。
核酸抽出システム１００は、以下のような効果が期待できる。第１に、核酸抽出システム１００では、参考技術に係る核酸抽出技術と比較し、複数菌種で多量のＲＮＡ調製（核酸抽出）が可能となる。第２に、核酸抽出システム１００では、低濃度菌体試料からのＲＮＡ回収量の底上げが可能となる。第３に、核酸抽出システム１００では、遺伝子検査法の高感度化や増菌工程の短縮化が可能となる。第４に、核酸抽出システム１００では、菌体培養液ＳからのＲＮＡの調製を３０分以内に完了することが可能となる。第５に、核酸抽出システム１００では、特に迅速性を必要とする遺伝子検査法における核酸抽出にも用いることが可能となる。
【0034】
〔２．核酸抽出システム１００の各工程の詳細〕
図１に示した核酸抽出システム１００の各工程の詳細について説明する。以下では、実施形態に係る各工程について、採取工程、保温工程、封入工程、加熱工程、精製工程の順に説明する。
図１に示した核酸抽出システム１００の各工程の詳細について説明する。以下では、実施形態に係る各工程について、採取工程、保温工程、封入工程、加熱工程、精製工程の順に説明する。
【0035】
（２－１．採取工程）
以下では、核酸抽出システム１００の採取工程の詳細について、菌体培養工程、菌体培養液採取工程の順に説明する。
以下では、核酸抽出システム１００の採取工程の詳細について、菌体培養工程、菌体培養液採取工程の順に説明する。
【0036】
（２－１－１．菌体培養工程）
第１に、核酸抽出システム１００の採取工程では、菌体培養工程を実施する。例えば、菌体培養工程では、菌体培養容器１０に収容される菌体培養液Ｓにおいて、菌体を培養する。培養に使用する器具の一例について説明すると、菌体培養工程では、菌体培養容器１０として滅菌したガラス製の栓付き三角フラスコを使用し、菌体を培養する。培養する菌体の一例について説明すると、菌体培養工程では、大腸菌や黄色ブドウ球菌を培養する。培養する条件の一例について説明すると、菌体培養工程では、ＳＣＤ液体培地において３７℃で一晩培養する。
第１に、核酸抽出システム１００の採取工程では、菌体培養工程を実施する。例えば、菌体培養工程では、菌体培養容器１０に収容される菌体培養液Ｓにおいて、菌体を培養する。培養に使用する器具の一例について説明すると、菌体培養工程では、菌体培養容器１０として滅菌したガラス製の栓付き三角フラスコを使用し、菌体を培養する。培養する菌体の一例について説明すると、菌体培養工程では、大腸菌や黄色ブドウ球菌を培養する。培養する条件の一例について説明すると、菌体培養工程では、ＳＣＤ液体培地において３７℃で一晩培養する。
【0037】
（２－１－１－１．菌体培養液Ｓの培養方法）
上記の菌体培養工程で使用される菌体培養液Ｓは、核酸Ｎを有する試料を培養することにより得られる。試料の培養方法は、特に限定されず、例えば、試料を捕集したフィルターを直接固体培地上に置き、フィルターを介して試料を培養する方法（固相培養）が挙げられる。また、試料の別の培養方法としては、例えば、液体培地または固体培地を水に溶解させた溶液の存在下で試料を培養する方法（液相培養）が挙げられる。使用する液体培地または固体培地の種類は、培養する試料の種類や生理的条件によって選択される。
上記の菌体培養工程で使用される菌体培養液Ｓは、核酸Ｎを有する試料を培養することにより得られる。試料の培養方法は、特に限定されず、例えば、試料を捕集したフィルターを直接固体培地上に置き、フィルターを介して試料を培養する方法（固相培養）が挙げられる。また、試料の別の培養方法としては、例えば、液体培地または固体培地を水に溶解させた溶液の存在下で試料を培養する方法（液相培養）が挙げられる。使用する液体培地または固体培地の種類は、培養する試料の種類や生理的条件によって選択される。
【0038】
（２－１－１－２．菌体培養液Ｓの試料）
上記の菌体培養工程において、処理対象である試料としては、グラム陽性菌等の細胞表層が強固な菌体について特に有効であるが、限定されない。例えば、処理対象である試料としては、微生物、微生物以外の動物細胞（例えば、昆虫細胞等）、植物細胞、マイコプラズマ、ウィルス等であってもよい。
上記の菌体培養工程において、処理対象である試料としては、グラム陽性菌等の細胞表層が強固な菌体について特に有効であるが、限定されない。例えば、処理対象である試料としては、微生物、微生物以外の動物細胞（例えば、昆虫細胞等）、植物細胞、マイコプラズマ、ウィルス等であってもよい。
【0039】
上記微生物としては、例えば、アシネトバクター（Acinetobacter）種、アクチノミセス（Actinomyces）種、アエロコッカス（Aerococcus）種、アエロモナス（Aeromonas）種、アルカリゲネス（Alcaligenes）種、バチルス（Bacillus）種、バクテリオデス（Bacteriodes）種、ボルデテラ（Bordetella）種、ブランハメラ（Branhamella）種、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）種、カンピロバクター（Campylobacter）種、カンジダ（Candida）種、カプノシトファギア（Capnocytophagia）種、クロモバクテリウム（Chromobacterium）種、クロストリジウム（Clostridium）種、コリネバクテリウム（Corynebacterium）種、クリプトコッカス（Cryptococcus）種、デイノコッカス（Deinococcus）種、エンテロコッカス（Enterococcus）種、エリジペロスリックス（Erysipelothrix）種、エシェリシア（Escherichia）種、フラボバクテリウム（Flavobacterium）種、ゲメラ（Gemella）種、ヘモフィルス（Haemophilus）種、クレブシエラ（Klebsiella）種、ラクトバチルス（Lactobacillus）種、ラクトコッカス（Lactococcus）種、レジオネラ（Legionella）種、ロイコノストック（Leuconostoc）種、リステリア（Listeria）種、ミクロコッカス（Micrococcus）種、マイコバクテリウム（Mycobacterium）種、ナイセリア（Neisseria）種、クリプトスポリジウム（Cryptosporidium）種、ノカルディア（Nocardia）種、オエルスコビア（Oerskovia）種、パラコッカス（Paracoccus）種、ペディオコッカス（Pediococcus）種、ペプトストレプトコッカス（Peptostreptococcus）種、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）種、プロテウス（Proteus）種、シュードモナス（Pseudomonas）種、ラーネラ（Rahnella）種、ロドコッカス（Rhodococcus）種、ロドスピリルム（Rhodospirillum）種、スタフィロコッカス（Staphylococcus）種、ストレプトミセス（Streptomyces）種、ストレプトコッカス（Streptococcus）種、ビブリオ（Vibrio）種、およびイェルシニア（Yersinia）種からなる群より選ばれる少なくとも１種である。
【0040】
上述した微生物の中には、生育状態によって芽胞や胞子といった形態をとる微生物が存在する。核酸抽出システム１００の核酸抽出工程において、処理対象である試料の形態は、特に限定されない。また、核酸抽出システム１００の核酸抽出工程において、処理対象である試料は、１種類であってもよく、２種類以上であってもよい。
【0041】
（２－１－２．菌体培養液採取工程）
第２に、核酸抽出システム１００の採取工程では、菌体培養液採取工程を実施する。例えば、菌体培養液採取工程では、菌体培養容器１０に収容される菌体培養液Ｓの一部を保温容器２０に採取する。採取に使用する器具の一例について説明すると、菌体培養液採取工程では、採取する器具として滅菌したガラス製のピペットを使用し、保温容器２０として滅菌した栓の付いたガラスチューブを使用し、菌体培養液Ｓを採取する。採取する菌体の細胞数の一例について説明すると、菌体培養液採取工程では、保温容器２０に含まれる菌体の細胞数が１．０×１０４程度になるように菌体培養液Ｓを採取する。
第２に、核酸抽出システム１００の採取工程では、菌体培養液採取工程を実施する。例えば、菌体培養液採取工程では、菌体培養容器１０に収容される菌体培養液Ｓの一部を保温容器２０に採取する。採取に使用する器具の一例について説明すると、菌体培養液採取工程では、採取する器具として滅菌したガラス製のピペットを使用し、保温容器２０として滅菌した栓の付いたガラスチューブを使用し、菌体培養液Ｓを採取する。採取する菌体の細胞数の一例について説明すると、菌体培養液採取工程では、保温容器２０に含まれる菌体の細胞数が１．０×１０４程度になるように菌体培養液Ｓを採取する。
【0042】
（２－２．保温工程）
以下では、核酸抽出システム１００の保温工程の詳細について、酵素添加工程、前処理溶液調製工程、前処理溶液保温工程の順に説明する。
以下では、核酸抽出システム１００の保温工程の詳細について、酵素添加工程、前処理溶液調製工程、前処理溶液保温工程の順に説明する。
【0043】
（２－２－１．酵素添加工程）
第１に、核酸抽出システム１００の保温工程では、酵素添加工程を実施する。例えば、酵素添加工程では、保温容器２０に採取された菌体培養液Ｓに細胞Ｃの溶解を促進する酵素Ｅを添加する。添加に使用する器具の一例について説明すると、酵素添加工程では、添加する器具として滅菌したガラス製のピペットを使用し、酵素Ｅを含む溶液を菌体培養液Ｓに添加する。添加する酵素の一例について説明すると、酵素添加工程では、細胞Ｃを含む試料である菌体培養液Ｓに、細胞Ｃの溶解を促進する酵素Ｅとしてアクロモペプチダーゼを添加する。また、酵素添加工程では、酵素Ｅとしてアクロモペプチダーゼのみならずリゾスタフィンをさらに添加してもよい。
第１に、核酸抽出システム１００の保温工程では、酵素添加工程を実施する。例えば、酵素添加工程では、保温容器２０に採取された菌体培養液Ｓに細胞Ｃの溶解を促進する酵素Ｅを添加する。添加に使用する器具の一例について説明すると、酵素添加工程では、添加する器具として滅菌したガラス製のピペットを使用し、酵素Ｅを含む溶液を菌体培養液Ｓに添加する。添加する酵素の一例について説明すると、酵素添加工程では、細胞Ｃを含む試料である菌体培養液Ｓに、細胞Ｃの溶解を促進する酵素Ｅとしてアクロモペプチダーゼを添加する。また、酵素添加工程では、酵素Ｅとしてアクロモペプチダーゼのみならずリゾスタフィンをさらに添加してもよい。
【0044】
（２－２－１－１．酵素）
上記の酵素添加工程において、添加する酵素Ｅとしては、アクロモペプチダーゼ、またはアクロモペプチダーゼとリゾスタフィンとの双方が特に有効であるが、限定されない。例えば、添加する酵素Ｅとしては、プロテイナーゼＫ（Proteinase Ｋ）等のタンパク質分解酵素や、キチナーゼ（Chitinase）、リゾチーム（Lysozyme）、ザイモリエイス（Zymolyase）（登録商標）、ラビアーゼ（Labiase）等の多糖分解酵素であってもよい。
上記の酵素添加工程において、添加する酵素Ｅとしては、アクロモペプチダーゼ、またはアクロモペプチダーゼとリゾスタフィンとの双方が特に有効であるが、限定されない。例えば、添加する酵素Ｅとしては、プロテイナーゼＫ（Proteinase Ｋ）等のタンパク質分解酵素や、キチナーゼ（Chitinase）、リゾチーム（Lysozyme）、ザイモリエイス（Zymolyase）（登録商標）、ラビアーゼ（Labiase）等の多糖分解酵素であってもよい。
【0045】
（２－２－２．前処理溶液調製工程）
第２に、核酸抽出システム１００の保温工程では、前処理溶液調製工程を実施する。例えば、前処理溶液調製工程では、酵素Ｅを含む菌体培養液Ｓである前処理溶液Ｉを調製する。調製する前処理溶液Ｉの各成分の終濃度の一例について説明すると、前処理溶液調製工程では、緩衝剤であるＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を１０ｍＭで調製し、キレート剤であるＥＤＴＡを０．１ｍＭで調製し、酵素Ｅであるアクロモペプチダーゼを４００ｍｇ／ｍＬ、酵素Ｅであるリゾスタフィンを２０μｇ/ｍＬで調製するが、各成分の終濃度は特に限定されない。
第２に、核酸抽出システム１００の保温工程では、前処理溶液調製工程を実施する。例えば、前処理溶液調製工程では、酵素Ｅを含む菌体培養液Ｓである前処理溶液Ｉを調製する。調製する前処理溶液Ｉの各成分の終濃度の一例について説明すると、前処理溶液調製工程では、緩衝剤であるＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を１０ｍＭで調製し、キレート剤であるＥＤＴＡを０．１ｍＭで調製し、酵素Ｅであるアクロモペプチダーゼを４００ｍｇ／ｍＬ、酵素Ｅであるリゾスタフィンを２０μｇ/ｍＬで調製するが、各成分の終濃度は特に限定されない。
【0046】
（２－２－３．前処理溶液保温工程）
第３に、核酸抽出システム１００の保温工程では、前処理溶液保温工程を実施する。例えば、前処理溶液保温工程では、前処理溶液Ｉを収容した保温容器２０を保温する。保温に使用する機器の一例について説明すると、前処理溶液保温工程では、保温容器２０を保温する機器として恒温槽を使用し、前処理溶液Ｉを収容した保温容器２０を一定温度に保温する。保温する条件の一例について説明すると、前処理溶液保温工程では、前処理溶液Ｉを収容した保温容器２０を３７℃で１０分間保温するが、保温する温度および時間は細胞Ｃの溶解を促進可能な範囲であればよく、特に限定されない。このとき、前処理溶液保温工程では、アクロモペプチダーゼが添加された試料である前処理溶液Ｉを１０分以上保温してもよい。
第３に、核酸抽出システム１００の保温工程では、前処理溶液保温工程を実施する。例えば、前処理溶液保温工程では、前処理溶液Ｉを収容した保温容器２０を保温する。保温に使用する機器の一例について説明すると、前処理溶液保温工程では、保温容器２０を保温する機器として恒温槽を使用し、前処理溶液Ｉを収容した保温容器２０を一定温度に保温する。保温する条件の一例について説明すると、前処理溶液保温工程では、前処理溶液Ｉを収容した保温容器２０を３７℃で１０分間保温するが、保温する温度および時間は細胞Ｃの溶解を促進可能な範囲であればよく、特に限定されない。このとき、前処理溶液保温工程では、アクロモペプチダーゼが添加された試料である前処理溶液Ｉを１０分以上保温してもよい。
【0047】
（２－３．封入工程）
以下では、核酸抽出システム１００の封入工程の詳細について、溶解補助剤添加工程、加熱用溶液調製工程、加熱用溶液封入工程の順に説明する。
以下では、核酸抽出システム１００の封入工程の詳細について、溶解補助剤添加工程、加熱用溶液調製工程、加熱用溶液封入工程の順に説明する。
【0048】
（２－３－１．溶解補助剤添加工程）
第１に、核酸抽出システム１００の封入工程では、溶解補助剤添加工程を実施する。例えば、溶解補助剤添加工程では、保温工程において所定時間保温された試料である前処理溶液Ｉに細胞Ｃの溶解を促進する溶解補助剤Ｄを添加する。添加に使用する器具の一例について説明すると、溶解補助剤添加工程では、添加する器具として滅菌したガラス製のピペットを使用し、溶解補助剤Ｄを含む溶液を前処理溶液Ｉに添加する。添加する溶解補助剤Ｄの一例について説明すると、溶解補助剤添加工程では、界面活性剤としてＳＤＳを含む溶解補助剤Ｄを添加する。
第１に、核酸抽出システム１００の封入工程では、溶解補助剤添加工程を実施する。例えば、溶解補助剤添加工程では、保温工程において所定時間保温された試料である前処理溶液Ｉに細胞Ｃの溶解を促進する溶解補助剤Ｄを添加する。添加に使用する器具の一例について説明すると、溶解補助剤添加工程では、添加する器具として滅菌したガラス製のピペットを使用し、溶解補助剤Ｄを含む溶液を前処理溶液Ｉに添加する。添加する溶解補助剤Ｄの一例について説明すると、溶解補助剤添加工程では、界面活性剤としてＳＤＳを含む溶解補助剤Ｄを添加する。
【0049】
（２－３－２．加熱用溶液調製工程）
第２に、核酸抽出システム１００の封入工程では、加熱用溶液調製工程を実施する。例えば、加熱用溶液調製工程では、溶解補助剤Ｄを含む菌体培養液Ｓである加熱用溶液Ｈを調製する。調製する加熱用溶液Ｈの各成分の終濃度の一例について説明すると、加熱用溶液調製工程では、界面活性剤であるＳＤＳを質量百分率１％、緩衝剤であるＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を０．０５Ｍで調製するが、各成分の終濃度は特に限定されない。
第２に、核酸抽出システム１００の封入工程では、加熱用溶液調製工程を実施する。例えば、加熱用溶液調製工程では、溶解補助剤Ｄを含む菌体培養液Ｓである加熱用溶液Ｈを調製する。調製する加熱用溶液Ｈの各成分の終濃度の一例について説明すると、加熱用溶液調製工程では、界面活性剤であるＳＤＳを質量百分率１％、緩衝剤であるＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を０．０５Ｍで調製するが、各成分の終濃度は特に限定されない。
【0050】
（２－３－２－１．加熱用溶液Ｈの種類）
以下では、加熱用溶液Ｈの種類について説明する。核酸抽出システム１００の加熱用溶液Ｈは、水のみでも上記効果を発揮するが、試料から核酸Ｎをより効率的に抽出する目的で、水以外に、界面活性剤、アルカリ、酸、酸化還元剤およびタンパク質変性剤からなる群から選ばれる少なくとも１種の溶解補助剤Ｄを含むことが好ましい。
以下では、加熱用溶液Ｈの種類について説明する。核酸抽出システム１００の加熱用溶液Ｈは、水のみでも上記効果を発揮するが、試料から核酸Ｎをより効率的に抽出する目的で、水以外に、界面活性剤、アルカリ、酸、酸化還元剤およびタンパク質変性剤からなる群から選ばれる少なくとも１種の溶解補助剤Ｄを含むことが好ましい。
【0051】
（２－３－２－２．溶解補助剤Ｄの種類）
以下では、溶解補助剤Ｄの種類について説明する。溶解補助剤Ｄは、試料の膜構造を溶解させる能力を有する。溶解補助剤Ｄが試料の膜構造に作用することで、試料を破壊しやすくなり、試料から核酸Ｎをより効率的に抽出することができる。
以下では、溶解補助剤Ｄの種類について説明する。溶解補助剤Ｄは、試料の膜構造を溶解させる能力を有する。溶解補助剤Ｄが試料の膜構造に作用することで、試料を破壊しやすくなり、試料から核酸Ｎをより効率的に抽出することができる。
【0052】
（界面活性剤）
溶解補助剤Ｄとして使用する界面活性剤は、例えばイオン性であってもよく、非イオン性であってもよい。非イオン性の界面活性剤としては、例えばオクチルフェノールエトキシレート（Ｃ１４Ｈ２２Ｏ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ）等が挙げられる。核酸抽出システム１００の核酸抽出工程では、市販品のオクチルフェノールエトキシレートを用いることができ、例えばＳＩＧＭＡ社製のＴｒｉｔｏｎＸ－１００（Ｃ１４Ｈ２２Ｏ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ，ｎ＝１００）等が挙げられる。
溶解補助剤Ｄとして使用する界面活性剤は、例えばイオン性であってもよく、非イオン性であってもよい。非イオン性の界面活性剤としては、例えばオクチルフェノールエトキシレート（Ｃ１４Ｈ２２Ｏ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ）等が挙げられる。核酸抽出システム１００の核酸抽出工程では、市販品のオクチルフェノールエトキシレートを用いることができ、例えばＳＩＧＭＡ社製のＴｒｉｔｏｎＸ－１００（Ｃ１４Ｈ２２Ｏ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ，ｎ＝１００）等が挙げられる。
【0053】
また、イオン性の界面活性剤は、陰イオン性であってもよく、陽イオン性であってもよく、両イオン性であってもよい。陰イオン性の界面活性剤としては、例えば上述したＳＤＳ等が挙げられる。陽イオン性の界面活性剤としては、例えば臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ：Cetyltrimethylammonium Bromide）等が挙げられる。両イオン性の界面活性剤としては、例えばベタイン等が挙げられる。ここで、「ベタイン」とは、正電荷と負電荷とを同一分子内の隣り合わない位置に持ち、正電荷をもつ原子には解離しうる水素原子が結合しておらず、分子全体としては電荷を持たない化合物の総称のことである。ベタインの代表例としては、トリメチルグリシンが挙げられる。
【0054】
（アルカリ）
溶解補助剤Ｄとして使用するアルカリとしては、例えば水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、または水酸化カリウム（ＫＯＨ）等が挙げられる。
溶解補助剤Ｄとして使用するアルカリとしては、例えば水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、または水酸化カリウム（ＫＯＨ）等が挙げられる。
【0055】
（酸）
溶解補助剤Ｄとして使用する酸としては、例えば塩酸（ＨＣｌ）、または硫酸（Ｈ２ＳＯ４）等が挙げられる。
溶解補助剤Ｄとして使用する酸としては、例えば塩酸（ＨＣｌ）、または硫酸（Ｈ２ＳＯ４）等が挙げられる。
【0056】
（酸化還元剤）
溶解補助剤Ｄとして使用する酸化還元剤としては、例えば過酸化水素水、β－メルカプトエタノール、ジチオトレイトール等が挙げられる。
溶解補助剤Ｄとして使用する酸化還元剤としては、例えば過酸化水素水、β－メルカプトエタノール、ジチオトレイトール等が挙げられる。
【0057】
（タンパク質変性剤）
溶解補助剤Ｄとして使用するタンパク質変性剤としては、例えばグアニジン塩酸塩、尿素等が挙げられる。
溶解補助剤Ｄとして使用するタンパク質変性剤としては、例えばグアニジン塩酸塩、尿素等が挙げられる。
【0058】
（その他）
溶解補助剤Ｄの成分として、キレート剤を使用してもよい。溶解補助剤Ｄとして使用するキレート剤としては、例えば上述したＥＤＴＡ等が挙げられる。
溶解補助剤Ｄの成分として、キレート剤を使用してもよい。溶解補助剤Ｄとして使用するキレート剤としては、例えば上述したＥＤＴＡ等が挙げられる。
【0059】
また、上述した溶解補助剤Ｄの中でも、核酸抽出システム１００の溶解補助剤Ｄは、界面活性剤を含むことが好ましく、ＳＤＳと、オクチルフェノールエトキシレートとのいずれか一方または両方を含むことがより好ましい。
【0060】
例えば、核酸抽出システム１００の核酸抽出工程で抽出した核酸を高感度で検出したい場合にはＳＤＳを用いるとよい。これに対し、核酸抽出システム１００の核酸抽出工程で抽出した核酸Ｎを、ＳＤＳによって阻害される酵素反応に用いる場合には、試料の膜構造に対してＳＤＳよりも温和に作用するオクチルフェノールエトキシレートを用いるとよい。
【0061】
核酸抽出システム１００の溶解補助剤Ｄは、必要に応じて緩衝剤を含んでもよい。緩衝剤としては、例えば上述したＴｒｉｓ－ＨＣｌ等が挙げられる。
【0062】
（２－３－３．加熱用溶液封入工程）
第３に、核酸抽出システム１００の封入工程では、加熱用溶液封入工程を実施する。例えば、加熱用溶液封入工程では、調製された加熱用溶液Ｈを封入容器３０に封入する。封入に使用する器具の一例について説明すると、加熱用溶液封入工程では、加熱用溶液Ｈを採取する器具として滅菌したガラス製のピペットを使用し、封入容器３０として滅菌したガラスチューブを使用し、加熱用溶液Ｈを採取する。このとき、加熱用溶液封入工程では、複数の封入容器３０に加熱用溶液Ｈを一定量ずつ採取する。そして、加熱用溶液封入工程では、加熱用溶液Ｈを一定量採取した後、ガラスチューブの栓をすることによって密閉する。
第３に、核酸抽出システム１００の封入工程では、加熱用溶液封入工程を実施する。例えば、加熱用溶液封入工程では、調製された加熱用溶液Ｈを封入容器３０に封入する。封入に使用する器具の一例について説明すると、加熱用溶液封入工程では、加熱用溶液Ｈを採取する器具として滅菌したガラス製のピペットを使用し、封入容器３０として滅菌したガラスチューブを使用し、加熱用溶液Ｈを採取する。このとき、加熱用溶液封入工程では、複数の封入容器３０に加熱用溶液Ｈを一定量ずつ採取する。そして、加熱用溶液封入工程では、加熱用溶液Ｈを一定量採取した後、ガラスチューブの栓をすることによって密閉する。
【0063】
（２－４．加熱工程）
以下では、核酸抽出システム１００の加熱工程の詳細について、加熱装置予熱工程、封入容器設置工程、封入容器加熱工程の順に説明する。
以下では、核酸抽出システム１００の加熱工程の詳細について、加熱装置予熱工程、封入容器設置工程、封入容器加熱工程の順に説明する。
【0064】
（２－４－１．加熱装置予熱工程）
第１に、核酸抽出システム１００の加熱工程では、加熱装置予熱工程を実施する。例えば、加熱装置予熱工程では、加熱装置４０を設定温度まで予熱する。加熱装置４０の一例について説明すると、加熱装置予熱工程では、加熱装置４０として、ヒートブロック、オイルバス等を使用する。予熱する温度の一例について説明すると、加熱装置予熱工程では、設定温度である１４０℃まで予熱するが、予熱する温度は核酸Ｎを抽出可能な範囲であればよく、特に限定されない。
第１に、核酸抽出システム１００の加熱工程では、加熱装置予熱工程を実施する。例えば、加熱装置予熱工程では、加熱装置４０を設定温度まで予熱する。加熱装置４０の一例について説明すると、加熱装置予熱工程では、加熱装置４０として、ヒートブロック、オイルバス等を使用する。予熱する温度の一例について説明すると、加熱装置予熱工程では、設定温度である１４０℃まで予熱するが、予熱する温度は核酸Ｎを抽出可能な範囲であればよく、特に限定されない。
【0065】
（２－４－２．封入容器設置工程）
第２に、核酸抽出システム１００の加熱工程では、封入容器設置工程を実施する。例えば、封入容器設置工程では、加熱用溶液Ｈが封入された封入容器３０を加熱装置４０に収容する。このとき、封入容器設置工程では、複数の封入容器３０をヒートブロックに挿入することによって設置する。
第２に、核酸抽出システム１００の加熱工程では、封入容器設置工程を実施する。例えば、封入容器設置工程では、加熱用溶液Ｈが封入された封入容器３０を加熱装置４０に収容する。このとき、封入容器設置工程では、複数の封入容器３０をヒートブロックに挿入することによって設置する。
【0066】
（２－４－３．封入容器加熱工程）
第３に、核酸抽出システム１００の加熱工程では、封入容器加熱工程を実施する。例えば、封入容器加熱工程では、設置された封入容器３０を加熱装置４０によって加熱し、加熱用溶液Ｈに核酸Ｎを抽出する。加熱する条件の一例について説明すると、封入容器加熱工程では、加熱用溶液Ｈを封入した封入容器３０を１４０℃、４５秒間加熱するが、加熱する温度および時間は核酸Ｎを抽出可能な範囲であればよく、特に限定されない。
第３に、核酸抽出システム１００の加熱工程では、封入容器加熱工程を実施する。例えば、封入容器加熱工程では、設置された封入容器３０を加熱装置４０によって加熱し、加熱用溶液Ｈに核酸Ｎを抽出する。加熱する条件の一例について説明すると、封入容器加熱工程では、加熱用溶液Ｈを封入した封入容器３０を１４０℃、４５秒間加熱するが、加熱する温度および時間は核酸Ｎを抽出可能な範囲であればよく、特に限定されない。
【0067】
（２－４－３－１．核酸Ｎの種類）
上記の封入容器加熱工程において、封入容器３０に収容された加熱用溶液Ｈに抽出される核酸Ｎとしては、１６Ｓ ｒＲＮＡ等のＲＮＡが特に有効であるが、限定されない。例えば、抽出される核酸Ｎとしては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ：Deoxyribonucleic Acid）であるゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ等であってもよい。
上記の封入容器加熱工程において、封入容器３０に収容された加熱用溶液Ｈに抽出される核酸Ｎとしては、１６Ｓ ｒＲＮＡ等のＲＮＡが特に有効であるが、限定されない。例えば、抽出される核酸Ｎとしては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ：Deoxyribonucleic Acid）であるゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ等であってもよい。
【0068】
（２－５．精製工程）
以下では、核酸抽出システム１００の精製工程の詳細について、精製用溶液注入工程、溶出液注入工程、コピー数算出工程の順に説明する。
以下では、核酸抽出システム１００の精製工程の詳細について、精製用溶液注入工程、溶出液注入工程、コピー数算出工程の順に説明する。
【0069】
（２－５－１．精製用溶液工程）
第１に、核酸抽出システム１００の精製工程では、精製用溶液注入工程を実施する。例えば、精製用溶液注入工程では、加熱工程後の加熱用溶液Ｈであって細胞Ｃの核酸Ｎを含む精製用溶液Ｐを、吸着担体が充填された精製容器５０に注入する。このとき、精製用溶液注入工程では、加熱工程において所定時間加熱された試料である精製用溶液Ｐを、核酸Ｎを吸着する吸着担体としてシリカおよび炭化ケイ素を有するカラムに注入する。具体的な例を挙げて説明すると、精製用溶液注入工程では、ＮＯＲＧＥＮ社製のＲＮＡ精製キット（Single Cell RNA Purification Kit）のシリカおよび炭化ケイ素との複合カラムを使用する。
第１に、核酸抽出システム１００の精製工程では、精製用溶液注入工程を実施する。例えば、精製用溶液注入工程では、加熱工程後の加熱用溶液Ｈであって細胞Ｃの核酸Ｎを含む精製用溶液Ｐを、吸着担体が充填された精製容器５０に注入する。このとき、精製用溶液注入工程では、加熱工程において所定時間加熱された試料である精製用溶液Ｐを、核酸Ｎを吸着する吸着担体としてシリカおよび炭化ケイ素を有するカラムに注入する。具体的な例を挙げて説明すると、精製用溶液注入工程では、ＮＯＲＧＥＮ社製のＲＮＡ精製キット（Single Cell RNA Purification Kit）のシリカおよび炭化ケイ素との複合カラムを使用する。
【0070】
（２－５－２．溶出液注入工程）
第２に、核酸抽出システム１００の精製工程では、溶出液注入工程を実施する。例えば、精製用溶液注入工程では、精製用溶液Ｐを注入した精製容器５０に溶出液を注入し、核酸Ｎを精製する。このとき、溶出液注入工程では、精製用溶液注入工程においてカラムに吸着された１６Ｓ ｒＲＮＡを溶出液に溶解させることによって抽出する。具体的な例を挙げて説明すると、溶出液注入工程では、上述したＲＮＡ精製キットに付属する溶出液を使用する。
第２に、核酸抽出システム１００の精製工程では、溶出液注入工程を実施する。例えば、精製用溶液注入工程では、精製用溶液Ｐを注入した精製容器５０に溶出液を注入し、核酸Ｎを精製する。このとき、溶出液注入工程では、精製用溶液注入工程においてカラムに吸着された１６Ｓ ｒＲＮＡを溶出液に溶解させることによって抽出する。具体的な例を挙げて説明すると、溶出液注入工程では、上述したＲＮＡ精製キットに付属する溶出液を使用する。
【0071】
（２－５－２－１．核酸Ｎの種類）
上記の溶出液注入工程において、溶出液に抽出される核酸Ｎとしては、１６Ｓ ｒＲＮＡ等のＲＮＡが特に有効であるが、限定されない。例えば、抽出される核酸Ｎとしては、ＤＮＡであるゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ等であってもよい。
上記の溶出液注入工程において、溶出液に抽出される核酸Ｎとしては、１６Ｓ ｒＲＮＡ等のＲＮＡが特に有効であるが、限定されない。例えば、抽出される核酸Ｎとしては、ＤＮＡであるゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ等であってもよい。
【0072】
（２－５－３．コピー数算出工程）
第３に、核酸抽出システム１００の精製工程では、コピー数算出工程を実施する。例えば、コピー数算出工程では、精製された核酸Ｎのコピー数を算出する。このとき、コピー数算出工程では、１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数をリアルタイムＰＣＲ法によって算出する。
第３に、核酸抽出システム１００の精製工程では、コピー数算出工程を実施する。例えば、コピー数算出工程では、精製された核酸Ｎのコピー数を算出する。このとき、コピー数算出工程では、１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数をリアルタイムＰＣＲ法によって算出する。
【0073】
【0074】
（３－１．実験結果１）
図２を用いて、核酸抽出システム１００による１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数の一例を示す実験結果１について説明する。図２は、実施形態に係る実験結果１を説明するための図である。実験結果１では、グラム陰性菌である大腸菌（E.coli）およびグラム陽性菌である黄色ブドウ球菌（S.aureus）における核酸抽出技術ごとの１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数を比較することができる。
図２を用いて、核酸抽出システム１００による１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数の一例を示す実験結果１について説明する。図２は、実施形態に係る実験結果１を説明するための図である。実験結果１では、グラム陰性菌である大腸菌（E.coli）およびグラム陽性菌である黄色ブドウ球菌（S.aureus）における核酸抽出技術ごとの１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数を比較することができる。
【0075】
（３－１－１．大腸菌）
図２の「E.coli」に示す棒グラフは、上述した参考技術であるトライゾール法を用いて大腸菌から抽出した１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数（図２（１－１）参照）、上述した参考技術である高温高圧法を用いて大腸菌から抽出した１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数（図２（１－２）参照）、核酸抽出システム１００を用いて大腸菌から抽出した１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数（図２（１－３）参照）を示す。図２（１－１）～（１－３）に示すように、核酸抽出システム１００では、参考技術に係る核酸抽出技術と比較して、２５倍程度のコピー数の１６Ｓ ｒＲＮＡが抽出できる。
図２の「E.coli」に示す棒グラフは、上述した参考技術であるトライゾール法を用いて大腸菌から抽出した１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数（図２（１－１）参照）、上述した参考技術である高温高圧法を用いて大腸菌から抽出した１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数（図２（１－２）参照）、核酸抽出システム１００を用いて大腸菌から抽出した１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数（図２（１－３）参照）を示す。図２（１－１）～（１－３）に示すように、核酸抽出システム１００では、参考技術に係る核酸抽出技術と比較して、２５倍程度のコピー数の１６Ｓ ｒＲＮＡが抽出できる。
【0076】
（３－１－２．黄色ブドウ球菌）
図２の「S.aureus」に示す棒グラフは、上述した参考技術であるトライゾール法を用いて黄色ブドウ球菌から抽出した１６ｓ ｒＲＮＡのコピー数（図２（２－１）参照）、上述した参考技術である高温高圧法を用いて黄色ブドウ球菌から抽出した１６ｓ ｒＲＮＡのコピー数（図２（２－２）参照）、核酸抽出システム１００を用いて黄色ブドウ球菌から抽出した１６ｓ ｒＲＮＡのコピー数（図２（２－３）参照）を示す。図２（２－１）～（２－３）に示すように、核酸抽出システム１００では、参考技術に係る核酸抽出技術と比較して、５００～７００倍程度のコピー数の１６Ｓ ｒＲＮＡが抽出できる。
図２の「S.aureus」に示す棒グラフは、上述した参考技術であるトライゾール法を用いて黄色ブドウ球菌から抽出した１６ｓ ｒＲＮＡのコピー数（図２（２－１）参照）、上述した参考技術である高温高圧法を用いて黄色ブドウ球菌から抽出した１６ｓ ｒＲＮＡのコピー数（図２（２－２）参照）、核酸抽出システム１００を用いて黄色ブドウ球菌から抽出した１６ｓ ｒＲＮＡのコピー数（図２（２－３）参照）を示す。図２（２－１）～（２－３）に示すように、核酸抽出システム１００では、参考技術に係る核酸抽出技術と比較して、５００～７００倍程度のコピー数の１６Ｓ ｒＲＮＡが抽出できる。
【0077】
（３－１－３．実験結果１の考察）
図２の実験結果１より、核酸抽出システム１００では、参考技術に係る核酸抽出技術と比較して、グラム陰性菌である大腸菌およびグラム陽性菌である黄色ブドウ球菌ともに、効果的に１６Ｓ ｒＲＮＡが抽出できる。また、核酸抽出システム１００では、参考技術に係る核酸抽出技術と比較して、特にグラム陽性菌である黄色ブドウ球菌について、効果的に１６Ｓ ｒＲＮＡが抽出できる。
図２の実験結果１より、核酸抽出システム１００では、参考技術に係る核酸抽出技術と比較して、グラム陰性菌である大腸菌およびグラム陽性菌である黄色ブドウ球菌ともに、効果的に１６Ｓ ｒＲＮＡが抽出できる。また、核酸抽出システム１００では、参考技術に係る核酸抽出技術と比較して、特にグラム陽性菌である黄色ブドウ球菌について、効果的に１６Ｓ ｒＲＮＡが抽出できる。
【0078】
（３－２．実験結果２）
図３を用いて、核酸抽出システム１００による酵素ごとの１６ｓ ｒＲＮＡのコピー数の一例を示す実験結果２について説明する。図３は、実施形態に係る実験結果２を説明するための図である。実験結果２では、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌における酵素ごとの１６ｓ ｒＲＮＡのコピー数を比較することができる。なお、図３の棒グラフのデータラベルは、後述する（３－２－１．酵素不添加）によって抽出された１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数を基準とした際の倍率を示す。また、後述する（３－２－１．酵素不添加）、（３－２－２．リゾチーム）、（３－２－３．アクロモペプチダーゼ）、（３－２－４．ラビアーゼ）において、酵素Ｅとして２０μｇ／ｍＬのリゾスタフィンが添加されている。
図３を用いて、核酸抽出システム１００による酵素ごとの１６ｓ ｒＲＮＡのコピー数の一例を示す実験結果２について説明する。図３は、実施形態に係る実験結果２を説明するための図である。実験結果２では、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌における酵素ごとの１６ｓ ｒＲＮＡのコピー数を比較することができる。なお、図３の棒グラフのデータラベルは、後述する（３－２－１．酵素不添加）によって抽出された１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数を基準とした際の倍率を示す。また、後述する（３－２－１．酵素不添加）、（３－２－２．リゾチーム）、（３－２－３．アクロモペプチダーゼ）、（３－２－４．ラビアーゼ）において、酵素Ｅとして２０μｇ／ｍＬのリゾスタフィンが添加されている。
【0079】
（３－２－１．酵素不添加）
図３（１）に示す棒グラフは、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌を細胞数１．０×１０４含む菌体培養液Ｓを使用し、上述した核酸抽出システム１００の保温工程においてリゾスタフィン以外の酵素Ｅを添加しない前処理溶液Ｉから抽出した１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数を示す。
図３（１）に示す棒グラフは、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌を細胞数１．０×１０４含む菌体培養液Ｓを使用し、上述した核酸抽出システム１００の保温工程においてリゾスタフィン以外の酵素Ｅを添加しない前処理溶液Ｉから抽出した１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数を示す。
【0080】
（３－２－２．リゾチーム）
図３（２）に示す棒グラフは、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌を細胞数１．０×１０４含む菌体培養液Ｓを使用し、上述した核酸抽出システム１００の保温工程においてリゾスタフィン以外の酵素Ｅとしてリゾチームを、１０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ添加した前処理溶液Ｉから抽出した１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数を示す。図３（２）に示すように、酵素Ｅとしてリゾチームを添加した核酸抽出システム１００では、図３（１）に示すリゾスタフィン以外の酵素Ｅを添加しない工程と比較して、１０ｍｇ／ｍＬでは５．３倍、２０ｍｇ／ｍＬでは２．７倍、８０ｍｇ／ｍＬでは０．０倍のコピー数の１６Ｓ ｒＲＮＡが抽出できる。ここで、酵素Ｅの濃度が増加するにつれてコピー数が減少しているのは、酵素Ｅの製品中に含まれるヌクレアーゼ活性によるＲＮＡ分解が起こるためである。
図３（２）に示す棒グラフは、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌を細胞数１．０×１０４含む菌体培養液Ｓを使用し、上述した核酸抽出システム１００の保温工程においてリゾスタフィン以外の酵素Ｅとしてリゾチームを、１０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ添加した前処理溶液Ｉから抽出した１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数を示す。図３（２）に示すように、酵素Ｅとしてリゾチームを添加した核酸抽出システム１００では、図３（１）に示すリゾスタフィン以外の酵素Ｅを添加しない工程と比較して、１０ｍｇ／ｍＬでは５．３倍、２０ｍｇ／ｍＬでは２．７倍、８０ｍｇ／ｍＬでは０．０倍のコピー数の１６Ｓ ｒＲＮＡが抽出できる。ここで、酵素Ｅの濃度が増加するにつれてコピー数が減少しているのは、酵素Ｅの製品中に含まれるヌクレアーゼ活性によるＲＮＡ分解が起こるためである。
【0081】
（３－２－３．アクロモペプチダーゼ）
図３（３）に示す棒グラフは、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌を細胞数１．０×１０４含む菌体培養液Ｓを使用し、上述した核酸抽出システム１００の保温工程においてリゾスタフィン以外の酵素Ｅとしてアクロモペプチダーゼを、１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬ添加した前処理溶液Ｉから抽出した１６ｓ ｒＲＮＡのコピー数を示す。図３（３）に示すように、酵素Ｅとしてアクロモペプチダーゼを添加した核酸抽出システム１００では、図３（１）に示すリゾスタフィン以外の酵素Ｅを添加しない工程と比較して、１０μｇ／ｍＬでは８．３倍、２０μｇ／ｍＬでは８．５倍、１００μｇ／ｍＬでは９．１倍、４００μｇ／ｍＬでは０．９倍のコピー数の１６Ｓ ｒＲＮＡが抽出できる。ここで、酵素Ｅの濃度が増加するにつれてコピー数が減少しているのは、酵素Ｅの製品中に含まれるヌクレアーゼ活性によるＲＮＡ分解が起こるためである。
図３（３）に示す棒グラフは、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌を細胞数１．０×１０４含む菌体培養液Ｓを使用し、上述した核酸抽出システム１００の保温工程においてリゾスタフィン以外の酵素Ｅとしてアクロモペプチダーゼを、１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬ添加した前処理溶液Ｉから抽出した１６ｓ ｒＲＮＡのコピー数を示す。図３（３）に示すように、酵素Ｅとしてアクロモペプチダーゼを添加した核酸抽出システム１００では、図３（１）に示すリゾスタフィン以外の酵素Ｅを添加しない工程と比較して、１０μｇ／ｍＬでは８．３倍、２０μｇ／ｍＬでは８．５倍、１００μｇ／ｍＬでは９．１倍、４００μｇ／ｍＬでは０．９倍のコピー数の１６Ｓ ｒＲＮＡが抽出できる。ここで、酵素Ｅの濃度が増加するにつれてコピー数が減少しているのは、酵素Ｅの製品中に含まれるヌクレアーゼ活性によるＲＮＡ分解が起こるためである。
【0082】
（３－２－４．ラビアーゼ）
図３（４）に示す棒グラフは、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌を細胞数１．０×１０４含む菌体培養液Ｓに対応する試料を使用し、上述した核酸抽出システム１００の保温工程においてリゾスタフィン以外の酵素Ｅとしてラビアーゼを１０ｍｇ／ｍＬ添加した前処理溶液Ｉから抽出した１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数を示す。図３（４）に示すように、酵素Ｅとしてラビアーゼを添加した核酸抽出システム１００では、図３（１）に示すリゾスタフィン以外の酵素Ｅを添加しない工程と比較して、１０ｍｇ／ｍＬでは１．３倍のコピー数の１６Ｓ ｒＲＮＡが抽出できる。
図３（４）に示す棒グラフは、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌を細胞数１．０×１０４含む菌体培養液Ｓに対応する試料を使用し、上述した核酸抽出システム１００の保温工程においてリゾスタフィン以外の酵素Ｅとしてラビアーゼを１０ｍｇ／ｍＬ添加した前処理溶液Ｉから抽出した１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数を示す。図３（４）に示すように、酵素Ｅとしてラビアーゼを添加した核酸抽出システム１００では、図３（１）に示すリゾスタフィン以外の酵素Ｅを添加しない工程と比較して、１０ｍｇ／ｍＬでは１．３倍のコピー数の１６Ｓ ｒＲＮＡが抽出できる。
【0083】
（３－２－５．実験結果２の考察）
図３の実験結果２より、核酸抽出システム１００では、リゾスタフィン以外の酵素Ｅを添加しない工程と比較して、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌に対して、酵素Ｅを過剰に添加しない場合には効果的に１６Ｓ ｒＲＮＡが抽出できる。特に、核酸抽出システム１００では、酵素Ｅとしてアクロモペプチダーゼを適量に添加した場合には、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌について、より効果的に１６Ｓ ｒＲＮＡが抽出できる。
図３の実験結果２より、核酸抽出システム１００では、リゾスタフィン以外の酵素Ｅを添加しない工程と比較して、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌に対して、酵素Ｅを過剰に添加しない場合には効果的に１６Ｓ ｒＲＮＡが抽出できる。特に、核酸抽出システム１００では、酵素Ｅとしてアクロモペプチダーゼを適量に添加した場合には、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌について、より効果的に１６Ｓ ｒＲＮＡが抽出できる。
【0084】
（３－３．実験結果３）
図４を用いて、核酸抽出システム１００による酵素ごとの１６Ｓ ｒＲＮＡの保存率の一例を示す実験結果３について説明する。図４は、実施形態に係る実験結果３を説明するための図である。実験結果３では、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌における酵素ごとの１６Ｓ ｒＲＮＡの保存率を比較し、酵素Ｅの製品に含まれるヌクレアーゼ活性によるＲＮＡ分解のトレードオフを確認することができる。なお、後述する（３－３－１．酵素不添加）、（３－３－２．リゾチーム）、（３－３－３．アクロモペプチダーゼ）、（３－３－４．ラビアーゼ）において、酵素Ｅとして２０μｇ／ｍＬのリゾスタフィンが添加されている。
図４を用いて、核酸抽出システム１００による酵素ごとの１６Ｓ ｒＲＮＡの保存率の一例を示す実験結果３について説明する。図４は、実施形態に係る実験結果３を説明するための図である。実験結果３では、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌における酵素ごとの１６Ｓ ｒＲＮＡの保存率を比較し、酵素Ｅの製品に含まれるヌクレアーゼ活性によるＲＮＡ分解のトレードオフを確認することができる。なお、後述する（３－３－１．酵素不添加）、（３－３－２．リゾチーム）、（３－３－３．アクロモペプチダーゼ）、（３－３－４．ラビアーゼ）において、酵素Ｅとして２０μｇ／ｍＬのリゾスタフィンが添加されている。
【0085】
（３－３－１．酵素不添加）
図４（１）に示す棒グラフは、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌から抽出された細胞数１．０×１０５に対応する精製済みのＲＮＡを使用し、当該ＲＮＡに対してリゾスタフィン以外の酵素Ｅを添加しない場合のＲＮＡの保存率を示す。図４（１）に示すように、リゾスタフィン以外の酵素Ｅを添加しない場合には、１６Ｓ ｒＲＮＡの保存率が１００％となる。
図４（１）に示す棒グラフは、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌から抽出された細胞数１．０×１０５に対応する精製済みのＲＮＡを使用し、当該ＲＮＡに対してリゾスタフィン以外の酵素Ｅを添加しない場合のＲＮＡの保存率を示す。図４（１）に示すように、リゾスタフィン以外の酵素Ｅを添加しない場合には、１６Ｓ ｒＲＮＡの保存率が１００％となる。
【0086】
（３－３－２．リゾチーム）
図４（２）に示す棒グラフは、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌から抽出された細胞数１．０×１０５に対応する精製済みのＲＮＡを使用し、当該ＲＮＡに対してリゾスタフィン以外の酵素Ｅとしてリゾチームを、１０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ添加した場合のＲＮＡの保存率を示す。図４（２）に示すように、酵素Ｅとしてリゾチームを添加した核酸抽出システム１００では、１０ｍｇ／ｍＬでは１６Ｓ ｒＲＮＡの保存率が微減し、２０ｍｇ／ｍＬおよび８０ｍｇ／ｍＬでは１６Ｓ ｒＲＮＡの保存率がほぼ０％となる。
図４（２）に示す棒グラフは、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌から抽出された細胞数１．０×１０５に対応する精製済みのＲＮＡを使用し、当該ＲＮＡに対してリゾスタフィン以外の酵素Ｅとしてリゾチームを、１０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ添加した場合のＲＮＡの保存率を示す。図４（２）に示すように、酵素Ｅとしてリゾチームを添加した核酸抽出システム１００では、１０ｍｇ／ｍＬでは１６Ｓ ｒＲＮＡの保存率が微減し、２０ｍｇ／ｍＬおよび８０ｍｇ／ｍＬでは１６Ｓ ｒＲＮＡの保存率がほぼ０％となる。
【0087】
（３－３－３．アクロモペプチダーゼ）
図４（３）に示す棒グラフは、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌から抽出された細胞数１．０×１０５に対応する精製済みのＲＮＡを使用し、当該ＲＮＡに対してリゾスタフィン以外の酵素Ｅとしてアクロモペプチダーゼを、１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬ添加した場合のＲＮＡの保存率を示す。図４（３）に示すように、酵素Ｅとしてアクロモペプチダーゼを添加した核酸抽出システム１００では、１０μｇ／ｍＬおよび２０μｇ／ｍＬでは１６Ｓ ｒＲＮＡの保存率がほぼ１００％であり、１００μｇ／ｍＬでは１６Ｓ ｒＲＮＡの保存率が微減し、４００μｇ／ｍＬでは１６Ｓ ｒＲＮＡの保存率がほぼ０％となる。
図４（３）に示す棒グラフは、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌から抽出された細胞数１．０×１０５に対応する精製済みのＲＮＡを使用し、当該ＲＮＡに対してリゾスタフィン以外の酵素Ｅとしてアクロモペプチダーゼを、１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬ添加した場合のＲＮＡの保存率を示す。図４（３）に示すように、酵素Ｅとしてアクロモペプチダーゼを添加した核酸抽出システム１００では、１０μｇ／ｍＬおよび２０μｇ／ｍＬでは１６Ｓ ｒＲＮＡの保存率がほぼ１００％であり、１００μｇ／ｍＬでは１６Ｓ ｒＲＮＡの保存率が微減し、４００μｇ／ｍＬでは１６Ｓ ｒＲＮＡの保存率がほぼ０％となる。
【0088】
（３－３－４．ラビアーゼ）
図４（４）に示す棒グラフは、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌から抽出された細胞数１．０×１０５に対応する精製済みのＲＮＡを使用し、当該ＲＮＡに対してリゾスタフィン以外の酵素Ｅとしてラビアーゼを、１０ｍｇ／ｍＬ添加した場合のＲＮＡの保存率を示す。図４（４）に示すように、酵素Ｅとしてラビアーゼを添加した核酸抽出システム１００では、１０ｍｇ／ｍＬでは１６Ｓ ｒＲＮＡの保存率が１０％以下となる。
図４（４）に示す棒グラフは、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌から抽出された細胞数１．０×１０５に対応する精製済みのＲＮＡを使用し、当該ＲＮＡに対してリゾスタフィン以外の酵素Ｅとしてラビアーゼを、１０ｍｇ／ｍＬ添加した場合のＲＮＡの保存率を示す。図４（４）に示すように、酵素Ｅとしてラビアーゼを添加した核酸抽出システム１００では、１０ｍｇ／ｍＬでは１６Ｓ ｒＲＮＡの保存率が１０％以下となる。
【0089】
（３－３－５．実験結果３の考察）
図４の実験結果３より、核酸抽出システム１００における酵素Ｅのヌクレアーゼ活性によるＲＮＡ分解の影響が少ない条件が確認できる。すなわち、核酸抽出システム１００において、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌に対して、リゾスタフィン以外の酵素Ｅとしてアクロモペプチダーゼを１０ｍｇ／ｍＬ～２０ｍｇ／ｍＬ添加する場合には、特に効果的に１６Ｓ ｒＲＮＡが抽出できる。
図４の実験結果３より、核酸抽出システム１００における酵素Ｅのヌクレアーゼ活性によるＲＮＡ分解の影響が少ない条件が確認できる。すなわち、核酸抽出システム１００において、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌に対して、リゾスタフィン以外の酵素Ｅとしてアクロモペプチダーゼを１０ｍｇ／ｍＬ～２０ｍｇ／ｍＬ添加する場合には、特に効果的に１６Ｓ ｒＲＮＡが抽出できる。
【0090】
（３－４．実験結果４）
図５を用いて、核酸抽出システム１００によるＲＮＡの残存量の一例を示す実験結果４について説明する。図５は、実施形態に係る実験結果４を説明するための図である。実験結果４では、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌について酵素Ｅとしてアクロモペプチダーゼを使用し、アクロモペプチダーゼの濃度ごとの１６Ｓ ｒＲＮＡの保存量を、ＥＤＴＡの添加の有無の条件ごとに比較し、酵素Ｅの製品に含まれるヌクレアーゼ活性によるＲＮＡ分解とＥＤＴＡとの関係を確認することができる。なお、図５のグラフにおける「ＲＮＡ残存量（％）」は、アクロモペプチダーゼを添加しない場合のＲＮＡ残存量を１００％としたものである。
図５を用いて、核酸抽出システム１００によるＲＮＡの残存量の一例を示す実験結果４について説明する。図５は、実施形態に係る実験結果４を説明するための図である。実験結果４では、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌について酵素Ｅとしてアクロモペプチダーゼを使用し、アクロモペプチダーゼの濃度ごとの１６Ｓ ｒＲＮＡの保存量を、ＥＤＴＡの添加の有無の条件ごとに比較し、酵素Ｅの製品に含まれるヌクレアーゼ活性によるＲＮＡ分解とＥＤＴＡとの関係を確認することができる。なお、図５のグラフにおける「ＲＮＡ残存量（％）」は、アクロモペプチダーゼを添加しない場合のＲＮＡ残存量を１００％としたものである。
【0091】
（３－４－１．ＥＤＴＡ不添加）
図５に示す白地の棒グラフは、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌から抽出された精製済みのＲＮＡを使用し、当該ＲＮＡに対してリゾスタフィン以外の酵素Ｅとしてアクロモペプチダーゼを添加し、かつキレート剤であるＥＤＴＡを添加しない場合のＲＮＡの保存量を示す。図５に示すように、ＥＤＴＡを添加しない場合には、アクロモペプチダーゼの濃度が１０μｇ／ｍＬ～４０μｇ／ｍＬでは１６Ｓ ｒＲＮＡの保存量が増加し、１００μｇ／ｍＬ以上では１６Ｓ ｒＲＮＡの保存量が減少し、４００μｇ／ｍＬ以上では１６Ｓ ｒＲＮＡの保存量がほぼ０％となる。
図５に示す白地の棒グラフは、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌から抽出された精製済みのＲＮＡを使用し、当該ＲＮＡに対してリゾスタフィン以外の酵素Ｅとしてアクロモペプチダーゼを添加し、かつキレート剤であるＥＤＴＡを添加しない場合のＲＮＡの保存量を示す。図５に示すように、ＥＤＴＡを添加しない場合には、アクロモペプチダーゼの濃度が１０μｇ／ｍＬ～４０μｇ／ｍＬでは１６Ｓ ｒＲＮＡの保存量が増加し、１００μｇ／ｍＬ以上では１６Ｓ ｒＲＮＡの保存量が減少し、４００μｇ／ｍＬ以上では１６Ｓ ｒＲＮＡの保存量がほぼ０％となる。
【0092】
（３－４－２．ＥＤＴＡ添加）
図５に示す斜線の棒グラフは、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌から抽出された精製済みのＲＮＡを使用し、当該ＲＮＡに対してリゾスタフィン以外の酵素Ｅとしてアクロモペプチダーゼを添加し、かつキレート剤であるＥＤＴＡを５ｍＭ添加した場合のＲＮＡの保存量を示す。図５に示すように、ＥＤＴＡを添加した場合には、アクロモペプチダーゼの濃度が４００μｇ／ｍＬ以上であっても１６Ｓ ｒＲＮＡの保存量が１００％以上となる。
図５に示す斜線の棒グラフは、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌から抽出された精製済みのＲＮＡを使用し、当該ＲＮＡに対してリゾスタフィン以外の酵素Ｅとしてアクロモペプチダーゼを添加し、かつキレート剤であるＥＤＴＡを５ｍＭ添加した場合のＲＮＡの保存量を示す。図５に示すように、ＥＤＴＡを添加した場合には、アクロモペプチダーゼの濃度が４００μｇ／ｍＬ以上であっても１６Ｓ ｒＲＮＡの保存量が１００％以上となる。
【0093】
（３－４－３．実験結果４の考察）
図５の実験結果４より、核酸抽出システム１００における酵素Ｅとしてアクロモペプチダーゼを添加した場合であっても、キレート剤であるＥＤＴＡを添加することによってヌクレアーゼ活性によるＲＮＡ分解を防止し、核酸抽出システム１００における酵素Ｅを使用した工程の効果的な条件を確認することができる。
図５の実験結果４より、核酸抽出システム１００における酵素Ｅとしてアクロモペプチダーゼを添加した場合であっても、キレート剤であるＥＤＴＡを添加することによってヌクレアーゼ活性によるＲＮＡ分解を防止し、核酸抽出システム１００における酵素Ｅを使用した工程の効果的な条件を確認することができる。
【0094】
（３－５．実験結果５）
図６を用いて、核酸抽出システム１００によるＲＮＡの回収率の一例を示す実験結果５について説明する。図６は、実施形態に係る実験結果５を説明するための図である。実験結果５では、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌から抽出された精製済みのＲＮＡを使用し、当該ＲＮＡに対するカラムの素材ごとのＲＮＡの回収率を示す。図６に示すように、供試した、すなわちカラムに注入したＲＮＡのコピー数に対して、カラムから回収した、すなわち抽出したＲＮＡのコピー数が「ＲＮＡ回収率（％）」となる。
図６を用いて、核酸抽出システム１００によるＲＮＡの回収率の一例を示す実験結果５について説明する。図６は、実施形態に係る実験結果５を説明するための図である。実験結果５では、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌から抽出された精製済みのＲＮＡを使用し、当該ＲＮＡに対するカラムの素材ごとのＲＮＡの回収率を示す。図６に示すように、供試した、すなわちカラムに注入したＲＮＡのコピー数に対して、カラムから回収した、すなわち抽出したＲＮＡのコピー数が「ＲＮＡ回収率（％）」となる。
【0095】
（３－５－１．シリカカラム）
図６に示す破線の折れ線グラフは、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌から抽出された精製済みのＲＮＡを使用し、シリカが充填されたシリカカラムに当該ＲＮＡを含む溶液を注入することによって吸着させ、当該カラムに溶出液を注入することによって当該ＲＮＡを抽出した場合のＲＮＡの回収率を示す。図６に示すように、シリカカラムを使用する場合には、供試ＲＮＡのコピー数が低濃度の１．０×１０６～１．０×１０９において、回収率が５％～２０％程度である。
図６に示す破線の折れ線グラフは、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌から抽出された精製済みのＲＮＡを使用し、シリカが充填されたシリカカラムに当該ＲＮＡを含む溶液を注入することによって吸着させ、当該カラムに溶出液を注入することによって当該ＲＮＡを抽出した場合のＲＮＡの回収率を示す。図６に示すように、シリカカラムを使用する場合には、供試ＲＮＡのコピー数が低濃度の１．０×１０６～１．０×１０９において、回収率が５％～２０％程度である。
【0096】
（３－５－２．複合カラム）
図６に示す実線の折れ線グラフは、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌から抽出された精製済みのＲＮＡを使用し、シリカおよび炭化ケイ素の複合素材が充填された複合カラムに当該ＲＮＡを含む溶液を注入することによって吸着させ、当該カラムに溶出液を注入することによって当該ＲＮＡを抽出した場合のＲＮＡの回収率を示す。図６に示すように、複合カラムを使用する場合には、供試ＲＮＡのコピー数が低濃度の１．０×１０５～１．０×１０１０において、回収率が５０％～７０％程度である。
図６に示す実線の折れ線グラフは、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌から抽出された精製済みのＲＮＡを使用し、シリカおよび炭化ケイ素の複合素材が充填された複合カラムに当該ＲＮＡを含む溶液を注入することによって吸着させ、当該カラムに溶出液を注入することによって当該ＲＮＡを抽出した場合のＲＮＡの回収率を示す。図６に示すように、複合カラムを使用する場合には、供試ＲＮＡのコピー数が低濃度の１．０×１０５～１．０×１０１０において、回収率が５０％～７０％程度である。
【0097】
（３－５－３．実験結果５の考察）
図６の実験結果５より、核酸抽出システム１００において、カラムとしてシリカおよび炭化ケイ素の複合素材が充填された複合カラムを使用した場合には、シリカカラムと比較して、低濃度であっても６倍程度のコピー数の１６Ｓ ｒＲＮＡが抽出できる。
図６の実験結果５より、核酸抽出システム１００において、カラムとしてシリカおよび炭化ケイ素の複合素材が充填された複合カラムを使用した場合には、シリカカラムと比較して、低濃度であっても６倍程度のコピー数の１６Ｓ ｒＲＮＡが抽出できる。
【0098】
〔４．核酸抽出システム１００の処理の流れ〕
図７～図１２を用いて、実施形態に係る核酸抽出システム１００の処理の流れについて説明する。以下では、核酸抽出システム１００の工程全体である核酸抽出工程の流れを説明した上で、採取工程の流れ、保温工程の流れ、封入工程の流れ、加熱工程の流れ、精製工程の流れの順に説明する。
図７～図１２を用いて、実施形態に係る核酸抽出システム１００の処理の流れについて説明する。以下では、核酸抽出システム１００の工程全体である核酸抽出工程の流れを説明した上で、採取工程の流れ、保温工程の流れ、封入工程の流れ、加熱工程の流れ、精製工程の流れの順に説明する。
【0099】
（４－１．核酸抽出工程の流れ）
図７を用いて、核酸抽出システム１００の工程全体である核酸抽出工程の流れについて説明する。図７は、実施形態に係る核酸抽出工程の流れの一例を示すフローチャートである。なお、下記のステップＳ１０１～Ｓ１０５は、異なる順序で実行することもできる。また、下記のステップＳ１０１～Ｓ１０５のうち、省略される工程があってもよい。
図７を用いて、核酸抽出システム１００の工程全体である核酸抽出工程の流れについて説明する。図７は、実施形態に係る核酸抽出工程の流れの一例を示すフローチャートである。なお、下記のステップＳ１０１～Ｓ１０５は、異なる順序で実行することもできる。また、下記のステップＳ１０１～Ｓ１０５のうち、省略される工程があってもよい。
【0100】
第１に、核酸抽出システム１００では、採取工程を実施する（ステップＳ１０１）。第２に、核酸抽出システム１００では、保温工程を実施する（ステップＳ１０２）。第３に、核酸抽出システム１００では、封入工程を実施する（ステップＳ１０３）。第４に、核酸抽出システム１００では、加熱工程を実施する（ステップＳ１０４）。第５に、核酸抽出システム１００では、精製工程を実施し（ステップＳ１０５）、核酸抽出工程を終了する。
【0101】
（４－２．採取工程の流れ）
図８を用いて、核酸抽出システム１００の採取工程の流れについて説明する。図８は、実施形態に係る採取工程の流れの一例を示すフローチャートである。なお、下記のステップＳ２０１～Ｓ２０２は、異なる順序で実行することもできる。また、下記のステップＳ２０１～Ｓ２０２のうち、省略される工程があってもよい。
図８を用いて、核酸抽出システム１００の採取工程の流れについて説明する。図８は、実施形態に係る採取工程の流れの一例を示すフローチャートである。なお、下記のステップＳ２０１～Ｓ２０２は、異なる順序で実行することもできる。また、下記のステップＳ２０１～Ｓ２０２のうち、省略される工程があってもよい。
【0102】
第１に、核酸抽出システム１００の採取工程では、菌体培養工程を実施する（ステップＳ２０１）。第２に、核酸抽出システム１００の採取工程では、菌体培養液採取工程を実施し（ステップＳ２０２）、採取工程を終了する。
【0103】
（４－３．保温工程の流れ）
図９を用いて、核酸抽出システム１００の保温工程の流れについて説明する。図９は、実施形態に係る保温工程の流れの一例を示すフローチャートである。なお、下記のステップＳ３０１～Ｓ３０３は、異なる順序で実行することもできる。また、下記のステップＳ３０１～Ｓ３０３のうち、省略される工程があってもよい。
図９を用いて、核酸抽出システム１００の保温工程の流れについて説明する。図９は、実施形態に係る保温工程の流れの一例を示すフローチャートである。なお、下記のステップＳ３０１～Ｓ３０３は、異なる順序で実行することもできる。また、下記のステップＳ３０１～Ｓ３０３のうち、省略される工程があってもよい。
【0104】
第１に、核酸抽出システム１００の保温工程では、酵素添加工程を実施する（ステップＳ３０１）。第２に、核酸抽出システム１００の保温工程では、前処理溶液調製工程を実施する（ステップＳ３０２）。第３に、核酸抽出システム１００の保温工程では、前処理溶液保温工程を実施し（ステップＳ３０３）、保温工程を終了する。
【0105】
（４－４．封入工程の流れ）
図１０を用いて、核酸抽出システム１００の封入工程の流れについて説明する。図１０は、実施形態に係る封入工程の流れの一例を示すフローチャートである。なお、下記のステップＳ４０１～Ｓ４０３は、異なる順序で実行することもできる。また、下記のステップＳ４０１～Ｓ４０３のうち、省略される工程があってもよい。
図１０を用いて、核酸抽出システム１００の封入工程の流れについて説明する。図１０は、実施形態に係る封入工程の流れの一例を示すフローチャートである。なお、下記のステップＳ４０１～Ｓ４０３は、異なる順序で実行することもできる。また、下記のステップＳ４０１～Ｓ４０３のうち、省略される工程があってもよい。
【0106】
第１に、核酸抽出システム１００の封入工程では、溶解補助剤添加工程を実施する（ステップＳ４０１）。第２に、核酸抽出システム１００の封入工程では、加熱用溶液調製工程を実施する（ステップＳ４０２）。第３に、核酸抽出システム１００の封入工程では、加熱用溶液封入工程を実施し（ステップＳ４０３）、封入工程を終了する。
【0107】
（４－５．加熱工程の流れ）
図１１を用いて、核酸抽出システム１００の加熱工程の流れについて説明する。図１１は、実施形態に係る加熱工程の流れの一例を示すフローチャートである。なお、下記のステップＳ５０１～Ｓ５０３は、異なる順序で実行することもできる。また、下記のステップＳ５０１～Ｓ５０３のうち、省略される工程があってもよい。
図１１を用いて、核酸抽出システム１００の加熱工程の流れについて説明する。図１１は、実施形態に係る加熱工程の流れの一例を示すフローチャートである。なお、下記のステップＳ５０１～Ｓ５０３は、異なる順序で実行することもできる。また、下記のステップＳ５０１～Ｓ５０３のうち、省略される工程があってもよい。
【0108】
第１に、核酸抽出システム１００の加熱工程では、加熱装置予熱工程を実施する（ステップＳ５０１）。第２に、核酸抽出システム１００の加熱工程では、封入容器設置工程を実施する（ステップＳ５０２）。第３に、核酸抽出システム１００の加熱工程では、封入容器加熱工程を実施し（ステップＳ５０３）、加熱工程を終了する。
【0109】
（４－６．精製工程の流れ）
図１２を用いて、核酸抽出システム１００の精製工程の流れについて説明する。図１２は、実施形態に係る精製工程の流れの一例を示すフローチャートである。なお、下記のステップＳ６０１～Ｓ６０３は、異なる順序で実行することもできる。また、下記のステップＳ６０１～Ｓ６０３のうち、省略される工程があってもよい。
図１２を用いて、核酸抽出システム１００の精製工程の流れについて説明する。図１２は、実施形態に係る精製工程の流れの一例を示すフローチャートである。なお、下記のステップＳ６０１～Ｓ６０３は、異なる順序で実行することもできる。また、下記のステップＳ６０１～Ｓ６０３のうち、省略される工程があってもよい。
【0110】
第１に、核酸抽出システム１００の精製工程では、精製用溶液調製工程を実施する（ステップＳ６０１）。第２に、核酸抽出システム１００の精製工程では、溶出液注入工程を実施する（ステップＳ６０２）。第３に、核酸抽出システム１００の精製工程では、コピー数算出工程を実施し（ステップＳ６０３）、精製工程を終了する。
【0111】
〔５．実施形態の効果〕
最後に、実施形態の効果について説明する。以下では、実施形態に係る工程に対応する効果１～８について説明する。
最後に、実施形態の効果について説明する。以下では、実施形態に係る工程に対応する効果１～８について説明する。
【0112】
（５－１．効果１）
第１に、上述した実施形態に係る工程では、細胞Ｃを含む試料に細胞Ｃの溶解を促進する酵素Ｅとしてアクロモペプチダーゼを添加し、アクロモペプチダーゼを添加した試料を所定温度で保温し、所定時間保温した試料に細胞Ｃの溶解を促進する溶解補助剤Ｄを添加し、溶解補助剤Ｄが添加された試料を所定温度まで加熱することによって、細胞Ｃから核酸Ｎを抽出する。このため、実施形態に係る工程では、効果的に細胞Ｃの溶解を促進することによって、試料に含まれる核酸Ｎを効率よく抽出することができる。
第１に、上述した実施形態に係る工程では、細胞Ｃを含む試料に細胞Ｃの溶解を促進する酵素Ｅとしてアクロモペプチダーゼを添加し、アクロモペプチダーゼを添加した試料を所定温度で保温し、所定時間保温した試料に細胞Ｃの溶解を促進する溶解補助剤Ｄを添加し、溶解補助剤Ｄが添加された試料を所定温度まで加熱することによって、細胞Ｃから核酸Ｎを抽出する。このため、実施形態に係る工程では、効果的に細胞Ｃの溶解を促進することによって、試料に含まれる核酸Ｎを効率よく抽出することができる。
【0113】
（５－２．効果２）
第２に、上述した実施形態に係る工程では、細胞Ｃを含む試料に細胞Ｃの溶解を促進する溶解補助剤Ｄを添加し、溶解補助剤Ｄが添加した試料を所定温度まで加熱し、所定時間加熱した試料を核酸Ｎを吸着する吸着担体としてシリカおよび炭化ケイ素を有するカラムに注入し、核酸Ｎを精製することによって、細胞Ｃから核酸Ｎを抽出する。このため、実施形態に係る工程では、効果的に核酸Ｎをカラムに吸着させることによって、試料に含まれる核酸Ｎを効率よく抽出することができる。
第２に、上述した実施形態に係る工程では、細胞Ｃを含む試料に細胞Ｃの溶解を促進する溶解補助剤Ｄを添加し、溶解補助剤Ｄが添加した試料を所定温度まで加熱し、所定時間加熱した試料を核酸Ｎを吸着する吸着担体としてシリカおよび炭化ケイ素を有するカラムに注入し、核酸Ｎを精製することによって、細胞Ｃから核酸Ｎを抽出する。このため、実施形態に係る工程では、効果的に核酸Ｎをカラムに吸着させることによって、試料に含まれる核酸Ｎを効率よく抽出することができる。
【0114】
（５－３．効果３）
第３に、上述した実施形態に係る工程では、核酸Ｎは、ＲＮＡである。このため、実施形態に係る工程では、試料に含まれる核酸ＮとしてＲＮＡを効率よく抽出することができる。
第３に、上述した実施形態に係る工程では、核酸Ｎは、ＲＮＡである。このため、実施形態に係る工程では、試料に含まれる核酸ＮとしてＲＮＡを効率よく抽出することができる。
【0115】
（５－４．効果４）
第４に、上述した実施形態に係る工程では、細胞Ｃは、グラム陽性菌が有する細胞Ｃである。このため、実施形態に係る工程では、効果的にグラム陽性菌の細胞Ｃの溶解を促進することによって、試料に含まれる核酸Ｎを効率よく抽出することができる。
第４に、上述した実施形態に係る工程では、細胞Ｃは、グラム陽性菌が有する細胞Ｃである。このため、実施形態に係る工程では、効果的にグラム陽性菌の細胞Ｃの溶解を促進することによって、試料に含まれる核酸Ｎを効率よく抽出することができる。
【0116】
（５－５．効果５）
第５に、上述した実施形態に係る工程では、溶解補助剤Ｄは、界面活性剤としてＳＤＳを含む。このため、実施形態に係る工程では、高温高圧処理に際して効果的に細胞Ｃの溶解を促進することによって、試料に含まれる核酸Ｎを効率よく抽出することができる。
第５に、上述した実施形態に係る工程では、溶解補助剤Ｄは、界面活性剤としてＳＤＳを含む。このため、実施形態に係る工程では、高温高圧処理に際して効果的に細胞Ｃの溶解を促進することによって、試料に含まれる核酸Ｎを効率よく抽出することができる。
【0117】
（５－６．効果６）
第６に、上述した実施形態に係る工程では、細胞Ｃを含む試料に、キレート剤としてＥＤＴＡをさらに添加する。このため、実施形態に係る工程では、細胞Ｃの溶解を促進する酵素Ｅが高濃度であっても、試料に含まれる核酸Ｎを効率よく抽出することができる。
第６に、上述した実施形態に係る工程では、細胞Ｃを含む試料に、キレート剤としてＥＤＴＡをさらに添加する。このため、実施形態に係る工程では、細胞Ｃの溶解を促進する酵素Ｅが高濃度であっても、試料に含まれる核酸Ｎを効率よく抽出することができる。
【0118】
（５－７．効果７）
第７に、上述した実施形態に係る工程では、細胞Ｃを含む試料に、酵素Ｅとしてリゾスタフィンをさらに添加する。このため、実施形態に係る工程では、より効果的な酵素Ｅを使用して細胞Ｃの溶解を促進することによって、試料に含まれる核酸Ｎを効率よく抽出することができる。
第７に、上述した実施形態に係る工程では、細胞Ｃを含む試料に、酵素Ｅとしてリゾスタフィンをさらに添加する。このため、実施形態に係る工程では、より効果的な酵素Ｅを使用して細胞Ｃの溶解を促進することによって、試料に含まれる核酸Ｎを効率よく抽出することができる。
【0119】
（５－８．効果８）
第８に、上述した実施形態に係る工程では、アクロモペプチダーゼが添加された試料を１０分以上保温する。このため、実施形態に係る工程では、より効果的な時間を保温して細胞Ｃの溶解を促進することによって、試料に含まれる核酸Ｎを効率よく抽出することができる。
第８に、上述した実施形態に係る工程では、アクロモペプチダーゼが添加された試料を１０分以上保温する。このため、実施形態に係る工程では、より効果的な時間を保温して細胞Ｃの溶解を促進することによって、試料に含まれる核酸Ｎを効率よく抽出することができる。
【0120】
〔システム〕
上記文書中や図面中で示した処理手順、制御手順、具体的名称、各種のデータやパラメータを含む情報については、特記する場合を除いて任意に変更することができる。
上記文書中や図面中で示した処理手順、制御手順、具体的名称、各種のデータやパラメータを含む情報については、特記する場合を除いて任意に変更することができる。
【0121】
また、図示した各装置の各構成要素は機能概念的なものであり、必ずしも物理的に図示の如く構成されていることを要しない。すなわち、各装置の分散や統合の具体的形態は図示のものに限られない。つまり、その全部または一部を、各種の負荷や使用状況などに応じて、任意の単位で機能的または物理的に分散・統合して構成することができる。
【0122】
〔その他〕
開示される技術特徴の組合せのいくつかの例を以下に記載する。
開示される技術特徴の組合せのいくつかの例を以下に記載する。
【0123】
（１）細胞から核酸を抽出する核酸抽出方法であって、前記細胞を含む試料に、前記細胞の溶解を促進する酵素としてアクロモペプチダーゼを添加し、前記アクロモペプチダーゼが添加された前記試料を所定温度で保温する保温工程と、前記保温工程において所定時間保温された前記試料に、前記細胞の溶解を促進する溶解補助剤を添加し、前記溶解補助剤が添加された前記試料を所定温度まで加熱する加熱工程と、を含む核酸抽出方法。
【0124】
（２）細胞から核酸を抽出する核酸抽出方法であって、前記細胞を含む試料に、前記細胞の溶解を促進する溶解補助剤を添加し、前記溶解補助剤が添加された前記試料を所定温度まで加熱する加熱工程と、前記加熱工程において所定時間加熱された前記試料を、前記核酸を吸着する吸着担体としてシリカおよび炭化ケイ素を有するカラムに注入し、前記核酸を精製する精製工程と、を含む核酸抽出方法。
【0125】
（３）前記核酸は、リボ核酸である、（１）または（２）に記載の核酸抽出方法。
【0126】
（４）前記細胞は、グラム陽性菌が有する細胞である、（１）～（３）のいずれか１つに記載の核酸抽出方法。
【0127】
（５）前記溶解補助剤は、界面活性剤としてドデシル硫酸ナトリウムを含む、（１）～（４）のいずれか１つに記載の核酸抽出方法。
【0128】
（６）前記保温工程は、前記細胞を含む試料に、キレート剤としてエチレンジアミン四酢酸をさらに添加する、（１）に記載の核酸抽出方法。
【0129】
（７）前記保温工程は、前記細胞を含む試料に、前記酵素としてリゾスタフィンをさらに添加する、（１）に記載の核酸抽出方法。
【0130】
（８）前記保温工程は、前記アクロモペプチダーゼが添加された前記試料を１０分以上保温する、（１）に記載の核酸抽出方法。
【符号の説明】
【0131】
１０ 菌体培養容器
２０ 保温容器
３０ 封入容器
４０ 加熱装置
５０ 精製容器
１００ 核酸抽出システム
２０ 保温容器
３０ 封入容器
４０ 加熱装置
５０ 精製容器
１００ 核酸抽出システム
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】