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特開2024-61652アシネトバクター・ベネチアヌスＰＦＺＲ－１及びその有機汚染物分解における使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024061652
(43)【公開日】2024-05-07
(54)【発明の名称】アシネトバクター・ベネチアヌスＰＦＺＲ－１及びその有機汚染物分解における使用
(51)【国際特許分類】
C12N 1/20 20060101AFI20240425BHJP
C12R 1/01 20060101ALN20240425BHJP
【ＦＩ】
C12N1/20 A ZNA
C12N1/20 F
C12N1/20 D
C12R1:01
【審査請求】有
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023178549
(22)【出願日】2023-10-17
(31)【優先権主張番号】202211294292.5
(32)【優先日】2022-10-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(71)【出願人】
【識別番号】515126422
【氏名又は名称】浙江工▲業▼大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000659
【氏名又は名称】弁理士法人広江アソシエイツ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】成卓▲韋▼
(72)【発明者】
【氏名】▲陳▼建孟
(72)【発明者】
【氏名】王家徳
(72)【発明者】
【氏名】於建明
(72)【発明者】
【氏名】▲陳▼▲東▼之
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA04X
4B065AC20
4B065BA23
4B065CA46
4B065CA55
4B065CA56
(57)【要約】 （修正有）
【課題】アシネトバクター・ベネチアヌスＰＦＺＲ－１及びその有機汚染物の分解における応用を提供する。
【解決手段】アシネトバクター・ベネチアヌス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ Ｖｅｎｅｔｉａｎｕｓ）ＰＦＺＲ－１を提供する。該菌は新型のシクロヘキサン高効率分解菌であり、かつ環境適応性に優れていると同時に、他の有機汚染物を有効に分解することもできる。前記有機汚染物が、シクロヘキサン、トルエン、メタノール、リモネン、酢酸エチル、シクロヘキサノール、またはシクロヘキサノンを含む。
【選択図】なし
【解決手段】アシネトバクター・ベネチアヌス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ Ｖｅｎｅｔｉａｎｕｓ）ＰＦＺＲ－１を提供する。該菌は新型のシクロヘキサン高効率分解菌であり、かつ環境適応性に優れていると同時に、他の有機汚染物を有効に分解することもできる。前記有機汚染物が、シクロヘキサン、トルエン、メタノール、リモネン、酢酸エチル、シクロヘキサノール、またはシクロヘキサノンを含む。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
中国典型培養物寄託センターに寄託され、寄託番号がＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ ２０２２７１９、寄託日が２０２２年５月２５日、住所が中国、武漢、武漢大学、４３００７２である、アシネトバクター・ベネチアヌス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ Ｖｅｎｅｔｉａｎｕｓ）ＰＦＺＲ－１。
【請求項2】
請求項１に記載のアシネトバクター・ベネチアヌスＰＦＺＲ－１の、微生物による有機汚染物の分解における使用。
【請求項3】
前記有機汚染物が、シクロヘキサン、トルエン、メタノール、リモネン、酢酸エチル、シクロヘキサノール、またはシクロヘキサノンを含む、請求項２に記載の使用。
【請求項4】
アシネトバクター・ベネチアヌスＰＦＺＲ－１を、有機汚染物を含む無機塩培地に接種し、ｐＨ＝５～１０、２０～４０℃、１００～２００ｒｐｍの条件下で分解反応を行わせ、有機汚染物に対する分解を実現する、請求項３に記載の使用。
【請求項5】
前記有機汚染物の無機塩培地中の初期濃度が６３．３～３１６．４ｍｇ／Ｌ、前記無機塩培養液中の静止細胞投入量が菌体濃度ＯＤ６００値で０．０１～０．１である、請求項３に記載の使用。
【請求項6】
前記無機塩培養液の組成は、Ｋ２ＨＰＯ４が０．９４２ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４が０．２３４ｇ／Ｌ、ＮａＮＯ３が１．７ｇ／Ｌ、ＮＨ４Ｃｌが０．９８ｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏが０．２０３３ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏが０．０１１１ｇ／Ｌ、ＦｅＣｌ３が０．０１６２ｇ／Ｌ、微量元素が５ｍｌ／Ｌで、溶媒は脱イオン水、ｐＨ＝５～１０であり、前記微量元素の組成は、ＺｎＣｌ２が０．０８８ｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏが０．０６０ｇ／Ｌ、ＫＩが０．０１ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏが０．１ｇ／Ｌ、Ｈ３ＢＯ３が０．０５ｇ／Ｌで、溶媒は脱イオン水である、請求項３に記載の使用。
【請求項7】
前記アシネトバクター・ベネチアヌスＰＦＺＲ－１を接種する前に、まず活性化及び拡大培養を行い、拡大培養した静止細胞を無機塩培地に接種し、前記静止細胞が、
（１）斜面培養：
アシネトバクター・ベネチアヌスＰＦＺＲ－１をＬＢ固体培地に接種し、３０℃の培養箱で培養して斜面菌体を得、ＬＢ固体培地の組成は、酵母エキスが５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌが１０ｇ／Ｌ、ペプトンが１０ｇ／Ｌ、寒天が１５～２０ｇ／Ｌで、ｐＨには手を加えず、溶媒は脱イオン水であるステップ、
（２）拡大培養：
ステップ（１）の斜面菌体をＬＢ液体培地に接種し、３０℃、１６０ｒｐｍで２４時間培養して拡大培養液を取得し、遠心分離し、湿菌体を収集し、無機塩培養液で洗浄してアシネトバクター・ベネチアヌスＰＦＺＲ－１静止細胞を取得し、ＬＢ液体培地の組成は、酵母エキスが５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌが１０ｇ／Ｌ、ペプトンが１０ｇ／Ｌであり、ｐＨには手を加えず、溶媒は脱イオン水であるステップ、
で調製される、請求項３に記載の使用。
（１）斜面培養：
アシネトバクター・ベネチアヌスＰＦＺＲ－１をＬＢ固体培地に接種し、３０℃の培養箱で培養して斜面菌体を得、ＬＢ固体培地の組成は、酵母エキスが５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌが１０ｇ／Ｌ、ペプトンが１０ｇ／Ｌ、寒天が１５～２０ｇ／Ｌで、ｐＨには手を加えず、溶媒は脱イオン水であるステップ、
（２）拡大培養：
ステップ（１）の斜面菌体をＬＢ液体培地に接種し、３０℃、１６０ｒｐｍで２４時間培養して拡大培養液を取得し、遠心分離し、湿菌体を収集し、無機塩培養液で洗浄してアシネトバクター・ベネチアヌスＰＦＺＲ－１静止細胞を取得し、ＬＢ液体培地の組成は、酵母エキスが５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌが１０ｇ／Ｌ、ペプトンが１０ｇ／Ｌであり、ｐＨには手を加えず、溶媒は脱イオン水であるステップ、
で調製される、請求項３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アシネトバクター・ベネチアヌスＰＦＺＲ－１及びその有機汚染物分解における使用に関する。
【背景技術】
【0002】
炭化水素は、炭素と水素という２種類の元素からなる有機化合物であり、いずれも水には溶けないが、有機溶媒には溶けやすく、密度は水より小さいため、水中では油状不溶物として存在する。シクロヘキサン（Ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ、Ｃ６Ｈ６）は無色で刺激臭のある液体であり、揮発しやすいシクロアルカンである。シクロヘキサンは用途が広く、シクロヘキサノール、シクロヘキサノン、アジピン酸などの製品を生産する原料として用いることができ、溶媒としてはクロマトグラフ分析及び有機合成プロセスに用いることができ、接着剤として樹脂、塗料などの生産に応用することもできる。そのため、シクロヘキサンは、工業生産や分析応用、輸送漏れなどの過程に関連する環境の中に広く存在している。シクロヘキサンは低毒性物質に属しているが、目と気道に対して軽度の刺激作用があり、皮膚接触により痒みを引き起こし、吸入中毒により眩暈、吐き気、いらいらなどの麻酔症状を引き起こすことがある。
【0003】
シクロヘキサンには一定の粘度があるため、土壌、地表水、海洋などの環境の吸着質に付着しやすく、除去しにくいことが多い。微生物も環境の中に広範に存在しており、微生物による汚染物の処理は、コストが低く、操作が簡単で、技術的にクリーンで無害であるといった利点から広く注目されており、現時点で報告されている高効率で汚染物を分解する菌属の種類は非常に多く、シュードモナス属、フラボバクテリウム属、コリネバクテリウム属、アクモバクター属、アルスロバクター属、ペディオコッカス属、ビブリオ属などがよく見られる。シクロヘキサンを唯一の炭素源として成長する微生物は自然界にほとんど存在していないが、実験室での馴致選別分離培養により、シクロヘキサンを唯一の炭素源とする微生物が数多く報告されるようになった。１９１９年、ＴａｕｓｚとＰｅｔｅが、シクロヘキサンを分解する炭化水素液化桿菌（Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｌｉｐｈａｔｉｃｕｍｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ）を初めて分離した。１９４８年、Ｉｍｅｌｉｋはシクロヘキサンを分解できる緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を分離し、かつその代謝産物を研究した。１９９９年には、国内の李大年らが、シクロヘキサン、シクロペンタノンを唯一の炭素源とすることができる分解菌株を分離した。その後も、ますます多くのシクロヘキサンに関する分解菌が報告されている。アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）は、ディーゼル油を分解する重要な微生物の一つとしてすでに広く報告されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明では、シクロヘキサンを唯一の炭素源とする新たなタイプのアシネトバクター・ベネチアヌス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ Ｖｅｎｅｔｉａｎｕｓ）を環境から選別し、該汚染物を含む土壌、排ガス、廃水の微生物浄化プロセスの応用のために有力なサポートを提供する。
【0005】
本発明の目的は、アシネトバクター・ベネチアヌス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ Ｖｅｎｅｔｉａｎｕｓ）ＰＦＺＲ－１を提供することにあり、該菌は新型のシクロヘキサン高効率分解菌であり、かつ環境適応性に優れていると同時に、他の有機汚染物を有効に分解することもできる。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明で採用する技術手法は次の通りである。
【0007】
本発明では、シクロヘキサンを分解する新しい菌株－アシネトバクター・ベネチアヌス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ Ｖｅｎｅｔｉａｎｕｓ）ＰＦＺＲ－１を提供しており、中国典型培養物寄託センターに寄託され、寄託番号はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ ２０２２７１９、寄託日は２０２２年５月２５日、住所は中国、武漢、武漢大学、４３００７２である。
【0008】
本発明のアシネトバクター・ベネチアヌスＰＦＺＲ－１の基本的な特徴としては、コロニーは白色で、好気性であり、滑らかで湿っており、楕円形を呈している。
【0009】
本発明は、上記のアシネトバクター・ベネチアヌスＰＦＺＲ－１の、微生物による有機汚染物の分解における使用にも関わり、上記の応用とは、アシネトバクター・ベネチアヌスＰＦＺＲ－１を、有機汚染物を含む無機塩培地に接種し、ｐＨ＝５～１０（好適にはｐＨ＝６～８）、２０～４０℃、１００～２００ｒｐｍの条件で分解反応を行わせ、有機汚染物に対する分解を実現するというものであり、上記有機汚染物には、シクロヘキサン、トルエン、メタノール、リモネン、酢酸エチル、シクロヘキサノールまたはシクロヘキサノンが含まれており、好適にはシクロヘキサンである。
【0010】
好適には、上記分解反応条件は３０℃、１６０ｒｐｍである。
【0011】
好適には、上記有機汚染物の無機塩培地での初期濃度は６３．３～３１６．４ｍｇ／Ｌ（好適には６３．３～１５８．２ｍｇ／Ｌ）である。上記アシネトバクター・ベネチアヌスＰＦＺＲ－１の無機塩培養液中の投入量は、菌体濃度ＯＤ６００値で計算して０．０１～０．１、好適には０．０２である。
【0012】
上記無機塩培養液の組成は、Ｋ２ＨＰＯ４が０．９４２ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４が０．２３４ｇ／Ｌ、ＮａＮＯ３が１．７ｇ／Ｌ、ＮＨ４Ｃｌが０．９８ｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏが０．２０３３ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏが０．０１１１ｇ／Ｌ、ＦｅＣｌ３が０．０１６２ｇ／Ｌ、微量元素が５ｍｌ／Ｌで、溶媒は脱イオン水、ｐＨ＝５～１０である。上記微量元素の組成は、ＺｎＣｌ２ ０．０８８ｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ ０．０６０ｇ／Ｌ、ＫＩ ０．０１ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．１ｇ／Ｌ、Ｈ３ＢＯ３ ０．０５ｇ／Ｌで、溶媒は脱イオン水である。
【0013】
本発明の上記アシネトバクター・ベネチアヌスＰＦＺＲ－１を接種する前に、まず活性化及び拡大培養を行い、拡大培養した静止細胞を無機塩培地に接種する。上記の静止細胞は、以下のステップによって調製する。
【0014】
（１）斜面培養：
アシネトバクター・ベネチアヌスＰＦＺＲ－１をＬＢ固体培地に接種し、３０℃の培養箱で培養して斜面菌体を得る。ＬＢ固体培地の組成は、酵母エキスが５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌが１０ｇ／Ｌ、ペプトンが１０ｇ／Ｌ、寒天が１５～２０ｇ／Ｌで、ｐＨには手を加えず、溶媒は脱イオン水である。
アシネトバクター・ベネチアヌスＰＦＺＲ－１をＬＢ固体培地に接種し、３０℃の培養箱で培養して斜面菌体を得る。ＬＢ固体培地の組成は、酵母エキスが５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌが１０ｇ／Ｌ、ペプトンが１０ｇ／Ｌ、寒天が１５～２０ｇ／Ｌで、ｐＨには手を加えず、溶媒は脱イオン水である。
【0015】
（２）拡大培養：
ステップ（１）の斜面菌体をＬＢ液体培地に接種し、３０℃、１６０ｒｐｍで２４時間培養して拡大培養液を取得し、遠心分離し、湿菌体を収集し、無機塩培養液で洗浄し、アシネトバクター・ベネチアヌスＰＦＺＲ－１の静止細胞を得る。ＬＢ液体培地の組成は、酵母エキスが５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌが１０ｇ／Ｌ、ペプトンが１０ｇ／Ｌで、ｐＨには手を加えず、溶媒は脱イオン水である。
ステップ（１）の斜面菌体をＬＢ液体培地に接種し、３０℃、１６０ｒｐｍで２４時間培養して拡大培養液を取得し、遠心分離し、湿菌体を収集し、無機塩培養液で洗浄し、アシネトバクター・ベネチアヌスＰＦＺＲ－１の静止細胞を得る。ＬＢ液体培地の組成は、酵母エキスが５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌが１０ｇ／Ｌ、ペプトンが１０ｇ／Ｌで、ｐＨには手を加えず、溶媒は脱イオン水である。
【0016】
従来の技術と比較すると、本発明の有益な効果は主に以下の通りである。
【0017】
本発明は、有機汚染物、特にシクロヘキサンの高効率分解菌－アシネトバクター・ベネチアヌスＰＦＺＲ－１を提供しており、該菌は汚水処理場の汚泥の中から得られ、シクロヘキサンを唯一の炭素源及びエネルギー源として成長することができ、分解濃度は３１６．４ｍｇ／Ｌに達し、かつ該菌の成長に適するｐＨ範囲はかなり広く、ｐＨが６．０～８．０であればシクロヘキサンを比較的よく分解することができ、分解率はいずれも９０％以上に達することができる。しかも、アシネトバクター・ベネチアヌスＰＦＺＲ－１は、シクロヘキサンに対する分解効率が高く、コストが低く、操作が簡単で、二次汚染が発生せず、従来の吸着及び光触媒による分解に比べると、さらに優位性がある。既存のシクロヘキサン分解菌と比較して、ＰＦＺＲ－１菌株の分解濃度範囲は広く（６３．３～３１６．４ｍｇ／Ｌ）、適応性が強く（ｐＨ：６．０～８．０）、その他の様々な汚染物に対しても一定の分解作用を有している（トルエン、メタノール、リモネン、酢酸エチル、シクロヘキサノール及びシクロヘキサノン）。つまり、該汚染物を含む土壌、排ガス、廃水の微生物浄化プロセスの応用のために有力な技術的サポートを提供しているのである。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】菌株ＰＦＺＲ－１のＬＢ培地でのコロニー形態の写真である。
【図2】菌株ＰＦＺＲ－１の透過型電子顕微鏡写真である。
【図3】菌株ＰＦＺＲ－１の系統発生樹である。
【図4】４８時間以内における、異なる濃度のシクロヘキサンに対する菌株ＰＦＺＲ－１の分解曲線である。
【図5】４８時間での異なるｐＨにおける菌株ＰＦＺＲ－１のシクロヘキサンに対する分解曲線である。
【発明を実施するための形態】
【0019】
発明の詳細な説明
以下では、具体的実施例と結び付けて本発明についてさらに説明するが、本発明の保護範囲がこれに限定されるわけではない。
以下では、具体的実施例と結び付けて本発明についてさらに説明するが、本発明の保護範囲がこれに限定されるわけではない。
【0020】
以下の実施例及び図面は例示的な説明に用いるものであり、本発明に対する限定と理解することはできない。特に説明のない限り、下記の実施例で使用される試薬原料は、一般的な市販または商業ルートにより得られる生化学試薬原料であり、使用される実験器具は、特に説明のない限り、いずれも実験室で通常使われている器具であり、以下の実施例中で使用される方法及び設備は、同分野で通常使用されている方法及び設備である。
【0021】
本発明の実施例に用いる培地の組成は以下の通りである。
【0022】
無機塩培養液の組成は、Ｋ２ＨＰＯ４が０．９４２ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４が０．２３４ｇ／Ｌ、ＮａＮＯ３が１．７ｇ／Ｌ、ＮＨ４Ｃｌが０．９８ｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏが０．２０３３ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏが０．０１１１ｇ／Ｌ、ＦｅＣｌ３が０．０１６２ｇ／Ｌ、微量元素が５ｍｌ／Ｌで、溶媒は脱イオン水、ｐＨ＝５～１０である。上記微量元素の組成は、ＺｎＣｌ２が０．０８８ｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏが０．０６０ｇ／Ｌ、ＫＩが０．０１ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏが０．１ｇ／Ｌ、Ｈ３ＢＯ３が０．０５ｇ／Ｌで、溶媒は脱イオン水である。
【0023】
ＬＢ固体培地の組成：酵母エキス５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ１０ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、寒天１５～２０ｇ／Ｌ、ｐＨには手を加えず、溶媒は脱イオン水である。
【0024】
ＬＢ液体培地の組成：酵母エキス５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ１０ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、ｐＨには手を加えず、溶媒は脱イオン水である。
【実施例0025】
実施例１：アシネトバクター・ベネチアヌス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ Ｖｅｎｅｔｉａｎｕｓ）ＰＦＺＲ－１の分離、精製及びその同定
【0026】
１、サンプルの採取及び馴致
（１）一次選別：何らかの生活汚水処理プールの活性汚泥を現場で採取し、静置して２時間沈降させた後、脱離液と懸濁不純物を除去すると、粒子の細かい汚泥が残るので、静置後の下層汚泥と無機塩培地を取って１：１（ｖ／ｖ）で混合して混合培地とし、汚泥馴致タンクに投入する。総体積は４Ｌで、シクロヘキサンを基質とし、それを唯一の炭素源及びエネルギーとし、（３０±１℃）の恒温で汚泥を馴致する。馴致実験期間中は馴致タンクに対して安定的に曝気を行い、馴致タンクのｐＨ値を７．０に維持し、一日の中で基質濃度が３０ｍｇ／Ｌ以下まで下がった時に、基質を１回加えて投入後の基質濃度を１００ｍｇ／Ｌに到達させ（基質投入前にサンプリングし、残存基質濃度を測定する）、５日間隔で混合培地を交換すると、約２ヶ月後、馴致された汚泥が１日当たり１５０ｍｇ／Ｌのシクロヘキサンを安定的に分解することができるようになり、このサンプルを振盪フラスコに入れてさらに濃縮することにより、馴致サンプルを得る。
（１）一次選別：何らかの生活汚水処理プールの活性汚泥を現場で採取し、静置して２時間沈降させた後、脱離液と懸濁不純物を除去すると、粒子の細かい汚泥が残るので、静置後の下層汚泥と無機塩培地を取って１：１（ｖ／ｖ）で混合して混合培地とし、汚泥馴致タンクに投入する。総体積は４Ｌで、シクロヘキサンを基質とし、それを唯一の炭素源及びエネルギーとし、（３０±１℃）の恒温で汚泥を馴致する。馴致実験期間中は馴致タンクに対して安定的に曝気を行い、馴致タンクのｐＨ値を７．０に維持し、一日の中で基質濃度が３０ｍｇ／Ｌ以下まで下がった時に、基質を１回加えて投入後の基質濃度を１００ｍｇ／Ｌに到達させ（基質投入前にサンプリングし、残存基質濃度を測定する）、５日間隔で混合培地を交換すると、約２ヶ月後、馴致された汚泥が１日当たり１５０ｍｇ／Ｌのシクロヘキサンを安定的に分解することができるようになり、このサンプルを振盪フラスコに入れてさらに濃縮することにより、馴致サンプルを得る。
【0027】
上記の馴致されたサンプルを、体積濃度１０％の投入量で５０ｍＬの無機塩培地に接種し、シクロヘキサンを基質とし、初期濃度を６３．３ｍｇ／Ｌとして、３０℃、１６０ｒ／分で、振盪器上で培養し、実施例３に記載のガスクロマトグラフィーを用いて４８時間内の残存基質濃度を測定し、基質の分解率が８０％前後に達した後、培養液を体積濃度１０％の投入量で同等濃度（６３．３ｍｇ／Ｌ）のシクロヘキサンを含む新鮮な無機塩培地に移し、継代濃縮を行い、その後、徐々にシクロヘキサンの初期濃度（６３．３～３１６．４ｍｇ／Ｌ）を増やして継代濃縮を数回行い、シクロヘキサン投入濃度が３１６．４ｍｇ／Ｌの培養液を集めて一次選別サンプルとする。
【0028】
（２）再選別：一次選別したサンプルを希釈して６３．３ｍｇ／Ｌのシクロヘキサンを含む無機塩固体培地に塗布し、プレート倒置法を用いて３０℃で２４時間成長させ、単コロニーをピックアップする。単コロニーは、ＬＢ固体培地の中で画線分離を数回行った後、再びシクロヘキサン（初期濃度：６３．３ｍｇ／Ｌ）を唯一の炭素源及びエネルギー源とする無機塩培地中に接種し、３０℃で４８時間培養し、実施例３に記載のガスクロマトグラフィーを用いて残存基質濃度を測定し、分解活性を計算する。
【0029】
シクロヘキサン分解能力を有する単コロニーを選択し、再選別のステップを繰り返して分離精製をさらに進め、分解が８０％以上に達すると、シクロヘキサン分解活性を有する菌株が得られるので、これを菌株ＰＦＺＲ－１とする。
【0030】
２、菌株ＰＦＺＲ－１の同定
（１）菌株ＰＦＺＲ－１の特徴：
菌株ＰＦＺＲ－１をＬＢ培地に接種し、３０℃で２４時間培養する。コロニーは白色で、好気性であり、滑らかで湿っており、楕円状を呈している。コロニー形態は図１の通りであり、透過型電子顕微鏡写真は図２の通りである。
（１）菌株ＰＦＺＲ－１の特徴：
菌株ＰＦＺＲ－１をＬＢ培地に接種し、３０℃で２４時間培養する。コロニーは白色で、好気性であり、滑らかで湿っており、楕円状を呈している。コロニー形態は図１の通りであり、透過型電子顕微鏡写真は図２の通りである。
【0031】
（２）１６Ｓ ｒＲＮＡ配列解析
Ｐｒｅｐ Ｍａｎ Ｕｌｔｒａ Ｋｉｔｓ核酸抽出剤を用いて菌株ＰＦＺＲ－１のＤＮＡを抽出し、４℃で保存した。細菌ユニバーサルプライマ（フォワードプライマ：５’－ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ－３’；リバースプライマ：５’－ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ－３’）を用いて、ＡＢＩ社のＰＣＲ増幅装置で増幅を行った。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３５００遺伝子分析装置を用いてＰＣＲ精製後の産物に対して核酸シーケンシングを行った。シーケンシング作業は、浙江天科高新技術発展有限公司が完成させた。菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列は以下の通りである（Ｇｅｎｅｂａｎｋ登録番号はＯＮ６９２９１３）。
Ｐｒｅｐ Ｍａｎ Ｕｌｔｒａ Ｋｉｔｓ核酸抽出剤を用いて菌株ＰＦＺＲ－１のＤＮＡを抽出し、４℃で保存した。細菌ユニバーサルプライマ（フォワードプライマ：５’－ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ－３’；リバースプライマ：５’－ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ－３’）を用いて、ＡＢＩ社のＰＣＲ増幅装置で増幅を行った。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３５００遺伝子分析装置を用いてＰＣＲ精製後の産物に対して核酸シーケンシングを行った。シーケンシング作業は、浙江天科高新技術発展有限公司が完成させた。菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列は以下の通りである（Ｇｅｎｅｂａｎｋ登録番号はＯＮ６９２９１３）。
【0032】
配列番号１：
ＣＣＴＡＣＴＴＣＴＧＧＴＧＣＡＣＡＡＡＣＴＣＣＣＡＴＧＧＴＧＴＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣＡＡＧＧＣＣＣＧＧＧＡＡＣＧＴＡＴＴＣＡＣＣＧＣＧＧＣＡＴＴＣＴＧＡＴＣＣＧＣＧＡＴＴＡＣＴＡＧＣＧＡＴＴＣＣＧＡＣＴＴＣＡＴＧＧＡＧＴＣＧＡＧＴＴＧＣＡＧＡＣＴＣＣＡＡＴＣＣＧＧＡＣＴＡＣＧＡＴＣＧＧＣＴＴＴＴＴＧＡＧＡＴＴＡＧＣＡＴＣＣＴＡＴＣＧＣＴＡＧＧＴＡＧＣＡＡＣＣＣＴＴＴＧＴＡＣＣＧＡＣＣＡＴＴＧＴＡＧＣＡＣＧＴＧＴＧＴＡＧＣＣＣＴＧＧＣＣＧＴＡＡＧＧＧＣＣＡＴＧＡＴＧＡＣＴＴＧＡＣＧＴＣＧＴＣＣＣＣＧＣＣＴＴＣＣＴＣＣＡＧＴＴＴＧＴＣＡＣＴＧＧＣＡＧＴＡＴＣＣＴＴＡＡＡＧＴＴＣＣＣＡＴＣＣＧＡＡＡＴＧＣＴＧＧＣＡＡＧＴＡＡＧＧＡＡＡＡＧＧＧＴＴＧＣＧＣＴＣＧＴＴＧＣＧＧＧＡＣＴＴＡＡＣＣＣＡＡＣＡＴＣＴＣＡＣＧＡＣＡＣＧＡＧＣＴＧＡＣＧＡＣＡＧＣＣＡＴＧＣＡＧＣＡＣＣＴＧＴＡＴＣＴＡＧＡＴＴＣＣＣＧＡＡＧＧＣＡＣＣＡＡＴＣＣＡＴＣＴＣＴＧＧＡＡＡＧＴＴＴＣＴＡＧＴＡＴＧＴＣＡＡＧＧＣＣＡＧＧＴＡＡＧＧＴＴＣＴＴＣＧＣＧＴＴＧＣＡＴＣＧＡＡＴＴＡＡＡＣＣＡＣＡＴＧＣＴＣＣＡＣＣＧＣＴＴＧＴＧＣＧＧＧＣＣＣＣＣＧＴＣＡＡＴＴＣＡＴＴＴＧＡＧＴＴＴＴＡＧＴＣＴＴＧＣＧＡＣＣＧＴＡＣＴＣＣＣＣＡＧＧＣＧＧＴＣＴＡＣＴＴＡＴＣＧＣＧＴＴＡＧＣＴＧＣＧＣＣＡＣＴＡＡＡＧＣＣＴＣＡＡＡＧＧＣＣＣＣＡＡＣＧＧＣＴＡＧＴＡＧＡＣＡＴＣＧＴＴＴＡＣＧＧＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣＴＧＴＴＴＧＣＴＣＣＣＣＡＴＧＣＴＴＴＣＧＴＡＣＣＴＣＡＧＣＧＴＣＡＧＴＡＴＴＡＧＧＣＣＡＧＡＴＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＧＣＣＡＴＣＧＧＴＡＴＴＣＣＴＣＣＡＧＡＴＣＴＣＴＡＣＧＣＡＴＴＴＣＡＣＣＧＣＴＡＣＡＣＣＴＧＧＡＡＴＴＣＴＡＣＣＡＴＣＣＴＣＴＣＣＣＡＴＡＣＴＣＴＡＧＣＣＡＴＣＣＡＧＴＡＴＣＧＡＡＴＧＣＡＡＴＴＣＣＣＡＡＧＴＴＡＡＧＣＴＣＧＧＧＧＡＴＴＴＣＡＣＡＴＴＴＧＡＣＴＴＡＡＡＴＧＧＣＣＧＣＣＴＡＣＧＣＡＣＧＣＴＴＴＡＣＧＣＣＣＡＧＴＡＡＡＴＣＣＧＡＴＴＡＡＣＧＣＴＣＧＣＡＣＣＣＴＣＴＧＴＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣＡＣＡＧＡＧＴＴＡＧＣＣＧＧＴＧＣＴＴＡＴＴＣＴＧＣＧＡＧＴＡＡＣＧＴＣＣＡＣＴＡＴＣＣＡＧＴＡＧＴＡＴＴＡＡＴＡＣＴＡＧＴＡＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＧＣＴＴＡＡＡＧＴＧＣＴＴＴＡＣＡＡＣＣＡＴＡＡＧＧＣＣＴＴＣＴＴＣＡＣＡＣＡＣＧＣＧＧＣＡＴＧＧＣＴＧＧＡＴＣＡＧＧＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＴＴＧＴＣＣＡＡＴＡＴＴＣＣＣＣＡＣＴＧＣＴＧＣＣＴＣＣＣＧＴＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＣＣＧＴＧＴＣＴＣＡＧＴＣＣＣＡＧＴＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＡＴＣＣＴＣＴＣＡＧＡＣＣＣＧＣＴＡＣＡＧＡＴＣＧＴＣＧＣＣＴＴＧＧＴＡＧＧＣＣＴＴＴＡＣＣＣＣＡＣＣＡＡＣＴＡＧＣＴＡＡＴＣＣＧＡＣＴＴＡＧＧＣＴＣＡＴＣＴＡＴＴＡＧＣＧＣＡＡＧＧＣＣＣＧＡＡＧＧＴＣＣＣＣＴＧＣＴＴＴＣＴＣＣＣＧＴＡＧＧＡＣＧＴＡＴＧＣＧＧＴＡＴＴＡＧＣＡＴＴＣＣＴＴＴＣＧＧＡＡＴＧＴＴＧＴＣＣＣＣＣＡＣＴＡＡＴＡＧＧＣＡＧＡＴＴＣＣＴＡＡＧＣＡＴＴＡＣＴＣＡＣＣＣＧＴＣＣＧＣＣＧＣＴＡＧＧＴＣＣＡＧＴＡＧＣＡＡＧＣＴＡＣＣ
ＣＣＴＡＣＴＴＣＴＧＧＴＧＣＡＣＡＡＡＣＴＣＣＣＡＴＧＧＴＧＴＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣＡＡＧＧＣＣＣＧＧＧＡＡＣＧＴＡＴＴＣＡＣＣＧＣＧＧＣＡＴＴＣＴＧＡＴＣＣＧＣＧＡＴＴＡＣＴＡＧＣＧＡＴＴＣＣＧＡＣＴＴＣＡＴＧＧＡＧＴＣＧＡＧＴＴＧＣＡＧＡＣＴＣＣＡＡＴＣＣＧＧＡＣＴＡＣＧＡＴＣＧＧＣＴＴＴＴＴＧＡＧＡＴＴＡＧＣＡＴＣＣＴＡＴＣＧＣＴＡＧＧＴＡＧＣＡＡＣＣＣＴＴＴＧＴＡＣＣＧＡＣＣＡＴＴＧＴＡＧＣＡＣＧＴＧＴＧＴＡＧＣＣＣＴＧＧＣＣＧＴＡＡＧＧＧＣＣＡＴＧＡＴＧＡＣＴＴＧＡＣＧＴＣＧＴＣＣＣＣＧＣＣＴＴＣＣＴＣＣＡＧＴＴＴＧＴＣＡＣＴＧＧＣＡＧＴＡＴＣＣＴＴＡＡＡＧＴＴＣＣＣＡＴＣＣＧＡＡＡＴＧＣＴＧＧＣＡＡＧＴＡＡＧＧＡＡＡＡＧＧＧＴＴＧＣＧＣＴＣＧＴＴＧＣＧＧＧＡＣＴＴＡＡＣＣＣＡＡＣＡＴＣＴＣＡＣＧＡＣＡＣＧＡＧＣＴＧＡＣＧＡＣＡＧＣＣＡＴＧＣＡＧＣＡＣＣＴＧＴＡＴＣＴＡＧＡＴＴＣＣＣＧＡＡＧＧＣＡＣＣＡＡＴＣＣＡＴＣＴＣＴＧＧＡＡＡＧＴＴＴＣＴＡＧＴＡＴＧＴＣＡＡＧＧＣＣＡＧＧＴＡＡＧＧＴＴＣＴＴＣＧＣＧＴＴＧＣＡＴＣＧＡＡＴＴＡＡＡＣＣＡＣＡＴＧＣＴＣＣＡＣＣＧＣＴＴＧＴＧＣＧＧＧＣＣＣＣＣＧＴＣＡＡＴＴＣＡＴＴＴＧＡＧＴＴＴＴＡＧＴＣＴＴＧＣＧＡＣＣＧＴＡＣＴＣＣＣＣＡＧＧＣＧＧＴＣＴＡＣＴＴＡＴＣＧＣＧＴＴＡＧＣＴＧＣＧＣＣＡＣＴＡＡＡＧＣＣＴＣＡＡＡＧＧＣＣＣＣＡＡＣＧＧＣＴＡＧＴＡＧＡＣＡＴＣＧＴＴＴＡＣＧＧＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣＴＧＴＴＴＧＣＴＣＣＣＣＡＴＧＣＴＴＴＣＧＴＡＣＣＴＣＡＧＣＧＴＣＡＧＴＡＴＴＡＧＧＣＣＡＧＡＴＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＧＣＣＡＴＣＧＧＴＡＴＴＣＣＴＣＣＡＧＡＴＣＴＣＴＡＣＧＣＡＴＴＴＣＡＣＣＧＣＴＡＣＡＣＣＴＧＧＡＡＴＴＣＴＡＣＣＡＴＣＣＴＣＴＣＣＣＡＴＡＣＴＣＴＡＧＣＣＡＴＣＣＡＧＴＡＴＣＧＡＡＴＧＣＡＡＴＴＣＣＣＡＡＧＴＴＡＡＧＣＴＣＧＧＧＧＡＴＴＴＣＡＣＡＴＴＴＧＡＣＴＴＡＡＡＴＧＧＣＣＧＣＣＴＡＣＧＣＡＣＧＣＴＴＴＡＣＧＣＣＣＡＧＴＡＡＡＴＣＣＧＡＴＴＡＡＣＧＣＴＣＧＣＡＣＣＣＴＣＴＧＴＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣＡＣＡＧＡＧＴＴＡＧＣＣＧＧＴＧＣＴＴＡＴＴＣＴＧＣＧＡＧＴＡＡＣＧＴＣＣＡＣＴＡＴＣＣＡＧＴＡＧＴＡＴＴＡＡＴＡＣＴＡＧＴＡＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＧＣＴＴＡＡＡＧＴＧＣＴＴＴＡＣＡＡＣＣＡＴＡＡＧＧＣＣＴＴＣＴＴＣＡＣＡＣＡＣＧＣＧＧＣＡＴＧＧＣＴＧＧＡＴＣＡＧＧＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＴＴＧＴＣＣＡＡＴＡＴＴＣＣＣＣＡＣＴＧＣＴＧＣＣＴＣＣＣＧＴＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＣＣＧＴＧＴＣＴＣＡＧＴＣＣＣＡＧＴＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＡＴＣＣＴＣＴＣＡＧＡＣＣＣＧＣＴＡＣＡＧＡＴＣＧＴＣＧＣＣＴＴＧＧＴＡＧＧＣＣＴＴＴＡＣＣＣＣＡＣＣＡＡＣＴＡＧＣＴＡＡＴＣＣＧＡＣＴＴＡＧＧＣＴＣＡＴＣＴＡＴＴＡＧＣＧＣＡＡＧＧＣＣＣＧＡＡＧＧＴＣＣＣＣＴＧＣＴＴＴＣＴＣＣＣＧＴＡＧＧＡＣＧＴＡＴＧＣＧＧＴＡＴＴＡＧＣＡＴＴＣＣＴＴＴＣＧＧＡＡＴＧＴＴＧＴＣＣＣＣＣＡＣＴＡＡＴＡＧＧＣＡＧＡＴＴＣＣＴＡＡＧＣＡＴＴＡＣＴＣＡＣＣＣＧＴＣＣＧＣＣＧＣＴＡＧＧＴＣＣＡＧＴＡＧＣＡＡＧＣＴＡＣＣ
【0033】
（３）生理生化学実験
菌株ＺＲＰＦ－１の、メリューＣＢＣカード上の４６種類の炭素源に対する利用能力：メリュー全自動同定装置を利用して、４６中の異なる炭素源に対する菌株の代謝情況を考察した（浙江天科高新技術発展有限会社（旧浙江省微生物研究所）に委託）。同定結果は表１の通りである。メリュー全自動同定装置ＶＩＴＥＫの生化学反応を経て、菌株ＺＲＰＦ－１は１５種類の炭素源を比較的よく利用することができ、他の３１種類の炭素源は利用できないことがわかった。
菌株ＺＲＰＦ－１の、メリューＣＢＣカード上の４６種類の炭素源に対する利用能力：メリュー全自動同定装置を利用して、４６中の異なる炭素源に対する菌株の代謝情況を考察した（浙江天科高新技術発展有限会社（旧浙江省微生物研究所）に委託）。同定結果は表１の通りである。メリュー全自動同定装置ＶＩＴＥＫの生化学反応を経て、菌株ＺＲＰＦ－１は１５種類の炭素源を比較的よく利用することができ、他の３１種類の炭素源は利用できないことがわかった。
【0034】
【表1】
【0035】
菌株ＰＦＺＲ－１の形態特徴及び生理生化学特徴に対して研究及び分析を行うと同時に、該菌株配列をＮＣＢＩデータベース中の遺伝子配列とブラスト比較し、１６ｓ ＲＮＡの相同性分析と結び付けて系統発生樹（図３）を構築し、それにより該菌株ＰＦＺＲ－１をＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ Ｖｅｎｅｔｉａｎｕｓと確定し、アシネトバクター・ベネチアヌス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ Ｖｅｎｅｔｉａｎｕｓ）ＰＦＺＲ－１と命名して、中国典型培養物寄託センターに寄託した。寄託番号はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ ２０２２７１９、寄託日は２０２２年５月２５日、住所は中国、武漢、武漢大学、４３００７２である。
【0036】
実施例２：アシネトバクター・ベネチアヌスＰＦＺＲ－１の静止細胞の取得
（１）斜面培養：
アシネトバクター・ベネチアヌスＰＦＺＲ－１をＬＢ液体培地に接種し、３０℃、１６０ｒｐｍで４８時間培養した後、活性化した細菌をＬＢ固体プレートに画線し、３０℃の培養箱で２４時間培養し、単コロニーを取って引き続きプレートに画線して細菌の純度を測定し、ＬＢ試験管の斜面で通常（４℃）保存する。
（１）斜面培養：
アシネトバクター・ベネチアヌスＰＦＺＲ－１をＬＢ液体培地に接種し、３０℃、１６０ｒｐｍで４８時間培養した後、活性化した細菌をＬＢ固体プレートに画線し、３０℃の培養箱で２４時間培養し、単コロニーを取って引き続きプレートに画線して細菌の純度を測定し、ＬＢ試験管の斜面で通常（４℃）保存する。
【0037】
（２）拡大培養：
ステップ（１）の斜面菌体をＬＢ液体培地に接種し、３０℃、１６０ｒｐｍで２４時間培養して拡大培養液を取得し、遠心分離し、湿菌体を収集し、無機塩培養液で洗浄し、アシネトバクター・ベネチアヌスＰＦＺＲ－１静止細胞を得る。
ステップ（１）の斜面菌体をＬＢ液体培地に接種し、３０℃、１６０ｒｐｍで２４時間培養して拡大培養液を取得し、遠心分離し、湿菌体を収集し、無機塩培養液で洗浄し、アシネトバクター・ベネチアヌスＰＦＺＲ－１静止細胞を得る。
【0038】
実施例３：アシネトバクター・ベネチアヌスＰＦＺＲ－１の、異なる濃度のシクロヘキサンに対する分解性能測定。
【0039】
比較的適切な培養条件下（ｐＨ７．０、温度３０℃）で、異なる濃度のシクロヘキサンに対するアシネトバクター・ベネチアヌスＰＦＺＲ－１の分解を研究した。具体的には以下の通りである。
【0040】
５０ｍＬの新鮮な無機塩培地に濃度の異なる基質シクロヘキサンを加え、基質の初期濃度をそれぞれ６３．３、９４．９、１２６．６、１５８．２、１８９．８、２５３．１２、３１６．４ｍｇ／Ｌとし、実施例２の方法で調製したアシネトバクター・ベネチアヌスＰＦＺＲ－１の静止細胞をそれぞれ接種し、各並列サンプル中の初期菌体濃度を０．０２（ＯＤ６００で計算）とした。３０℃、回転数１６０ｒ／分の振盪器内で培養し、定時にサンプリングし、ガスクロマトグラフィーを用いてシクロヘキサン濃度を測定し、アシネトバクター・ベネチアヌスＰＦＺＲ－１のシクロヘキサン分解速度を計算した。実験過程では、１つの並列サンプル及び１つの菌株不接種のブランク対照群を設定した。結果は図４に示す通りであり、アシネトバクター・ベネチアヌスＰＦＺＲ－１は、かなり高い濃度（３１６．４ｍｇ／Ｌ）でもシクロヘキサンを完全に分解することができるが、シクロヘキサンの濃度が３１６．４ｍｇ／Ｌを超えて３９５．５ｍｇ／Ｌに到達した後は、６０時間内にそれを完全に分解することはできなかった。
【0041】
福立９７９０ＩＩガスクロマトグラフを用いて気相中のシクロヘキサンの濃度を測定した。クロマトカラムはＫＢ－５（３０ｍ×０．３２ｍｍ×０．５μｍ）である。サンプル入口、検出器（ＦＩＤ）、カラムの温度はそれぞれ１２０℃、２００℃、８０℃で、補助炉の温度は１００℃、分流比は１００：１である。水素流量は３０ｍＬ／分、気流は３００ｍＬ／分、キャリアガスの窒素流量は３０ｍＬ／分、ガス注入量は１ｍＬである。
【0042】
実施例４：アシネトバクター・ベネチアヌスＰＦＺＲ－１の、異なるｐＨ下でのシクロヘキサンに対する分解性能測定。
ｐＨがそれぞれ５、６、７、８、９、１０の無機塩培養液５０ｍＬを、体積がいずれも３３０ｍＬの振盪フラスコに分けて入れ、各フラスコを５０ｍＬ、１１０℃で４０分滅菌した。滅菌終了後、室温で２日間放置し、雑菌の成長がないことを確認した。シクロヘキサンをアシネトバクター・ベネチアヌスＰＦＺＲ－１の唯一の炭素源とし、無機塩培地に接種した。基質の初期濃度は６３．３ｍｇ／Ｌで、実施例２の方法で調製したアシネトバクター・ベネチアヌスＰＦＺＲ－１の静止細胞を接種し、初期菌体濃度を０．０２（ＯＤ６００で計算）、温度を３０℃、回転数を１６０ｒ／分として培養し、かつ細菌を加えないブランク対照を作った。実施例３と同じ方法で振盪フラスコ中の残留シクロヘキサン濃度を定時測定し、異なるｐＨ下での４８時間内における菌株のシクロヘキサンに対する除去率曲線を作成した。結果は図５の通りであり、アシネトバクター・ベネチアヌスＰＦＺＲ－１によるシクロヘキサンの分解に最適なｐＨは７であることがわかった。
ｐＨがそれぞれ５、６、７、８、９、１０の無機塩培養液５０ｍＬを、体積がいずれも３３０ｍＬの振盪フラスコに分けて入れ、各フラスコを５０ｍＬ、１１０℃で４０分滅菌した。滅菌終了後、室温で２日間放置し、雑菌の成長がないことを確認した。シクロヘキサンをアシネトバクター・ベネチアヌスＰＦＺＲ－１の唯一の炭素源とし、無機塩培地に接種した。基質の初期濃度は６３．３ｍｇ／Ｌで、実施例２の方法で調製したアシネトバクター・ベネチアヌスＰＦＺＲ－１の静止細胞を接種し、初期菌体濃度を０．０２（ＯＤ６００で計算）、温度を３０℃、回転数を１６０ｒ／分として培養し、かつ細菌を加えないブランク対照を作った。実施例３と同じ方法で振盪フラスコ中の残留シクロヘキサン濃度を定時測定し、異なるｐＨ下での４８時間内における菌株のシクロヘキサンに対する除去率曲線を作成した。結果は図５の通りであり、アシネトバクター・ベネチアヌスＰＦＺＲ－１によるシクロヘキサンの分解に最適なｐＨは７であることがわかった。
【0043】
実施例５：アシネトバクター・ベネチアヌスＰＦＺＲ－１の基質分解の広域スペクトル性
実際の使用では、シクロヘキサンという有機汚染物が存在するだけでなく、工業排ガス中には一般に様々な揮発性有機排ガスが含まれている。そのため、他の基質に対するアシネトバクター・ベネチアヌスＰＦＺＲ－１の分解効果を検討する必要性は非常に高く、実施例３と同様に、炭素源を初期濃度が５０ｍｇ／Ｌのトルエン、メタノール、リモネン、クロロホルム、酢酸エチル、シクロヘキサノール、シクロヘキサノンに変更し、その他の操作を実施例３と同様に行った。分解効果は表２に示す通りである。
実際の使用では、シクロヘキサンという有機汚染物が存在するだけでなく、工業排ガス中には一般に様々な揮発性有機排ガスが含まれている。そのため、他の基質に対するアシネトバクター・ベネチアヌスＰＦＺＲ－１の分解効果を検討する必要性は非常に高く、実施例３と同様に、炭素源を初期濃度が５０ｍｇ／Ｌのトルエン、メタノール、リモネン、クロロホルム、酢酸エチル、シクロヘキサノール、シクロヘキサノンに変更し、その他の操作を実施例３と同様に行った。分解効果は表２に示す通りである。
【0044】
【表2】
【0045】
表２に示すように、アシネトバクター・ベネチアヌスＰＦＺＲ－１は、クロロホルムに対する分解効果がないことを除き、他の選択された汚染物に対しては、すべて異なる度合いで分解効果を有している。その理由としては、クロロホルムは分解しにくいハロゲン化炭化水素化合物であるため、分解効果がよくない。
【0046】
本発明は、実施例によって上記のように開示されているが、それは本発明の範囲を限定するものではなく、当業者が本発明の構想及び範囲から逸脱することなく行った変更及び修飾は、いずれも本発明の保護範囲に属するものとする。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】