特開2024-6278魚類レンサ球菌の抽出物を含む、前記魚類レンサ球菌または前記抽出物に対する特異的免疫を誘導することに用いるための組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024006278
(43)【公開日】2024-01-17
(54)【発明の名称】魚類レンサ球菌の抽出物を含む、前記魚類レンサ球菌または前記抽出物に対する特異的免疫を誘導することに用いるための組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 39/09 20060101AFI20240110BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20240110BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240110BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20240110BHJP
C12N 1/20 20060101ALI20240110BHJP
【ＦＩ】
A61K39/09
A61P31/04 171
A61P37/04
A61K39/00 D
C12N1/20 A
C12N1/20 C
【審査請求】未請求
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022107010
(22)【出願日】2022-07-01
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＢＲＩＪ
(71)【出願人】
【識別番号】300012664
【氏名又は名称】バイオ科学株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100173185
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 裕
(72)【発明者】
【氏名】金井 欣也
(72)【発明者】
【氏名】奥谷 飛
(72)【発明者】
【氏名】首藤 公宏
(72)【発明者】
【氏名】辻倉 正和
【テーマコード（参考）】
4B065
4C085
【Ｆターム（参考）】
4B065AA49X
4B065AA49Y
4B065AC14
4B065BD03
4B065BD08
4B065BD16
4B065CA43
4C085AA03
4C085BA08
4C085BA14
4C085BB12
4C085CC07
4C085DD51
4C085DD90
4C085EE01
4C085GG06
(57)【要約】 （修正有）
【課題】魚類レンサ球菌に対し特異的な免疫を誘導することができる組成物を提供する。
【解決手段】魚類において魚類レンサ球菌に対する免疫を誘導するための、魚類レンサ球菌の糖鎖成分を含む組成物。前記魚類レンサ球菌はＩ型、ＩＩ型又はＩＩＩ型のラクトコッカス・ガルビエ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｇａｒｖｉｅａｅ）等のα溶血性レンサ球菌であることが好ましく、前記糖鎖成分は前記魚類レンサ球菌の菌体を熱処理又は塩酸等による酸処理に供することによって得ることが好ましい。
【選択図】なし
【解決手段】魚類において魚類レンサ球菌に対する免疫を誘導するための、魚類レンサ球菌の糖鎖成分を含む組成物。前記魚類レンサ球菌はＩ型、ＩＩ型又はＩＩＩ型のラクトコッカス・ガルビエ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｇａｒｖｉｅａｅ）等のα溶血性レンサ球菌であることが好ましく、前記糖鎖成分は前記魚類レンサ球菌の菌体を熱処理又は塩酸等による酸処理に供することによって得ることが好ましい。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
糖鎖成分を含む組成物であって、当該糖鎖成分は、魚類レンサ球菌の糖鎖成分を含み、
魚類対象に投与することにより、当該対象において前記糖鎖成分または前記魚類レンサ球
菌に対する免疫を誘導することができる、組成物。
魚類対象に投与することにより、当該対象において前記糖鎖成分または前記魚類レンサ球
菌に対する免疫を誘導することができる、組成物。
【請求項2】
前記糖鎖成分が、前記菌体の糖鎖抽出処理により前記菌体から抽出される糖鎖成分であ
る、請求項１に記載の組成物。
る、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記糖鎖成分が、前記菌体の熱処理により前記菌体から抽出される糖鎖成分である、請
求項１に記載の組成物。
求項１に記載の組成物。
【請求項4】
前記糖鎖成分が、前記菌体の酸処理により前記菌体から抽出される糖鎖成分である、請
求項１に記載の組成物。
求項１に記載の組成物。
【請求項5】
前記酸処理が、塩酸による酸処理である、請求項４に記載の組成物。
【請求項6】
前記魚類レンサ球菌が、α溶血性レンサ球菌である、請求項１～５のいずれか一項に記
載の組成物。
載の組成物。
【請求項7】
前記魚類レンサ球菌が、Ｉ型ラクトコッカス・ガルビエ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇ
ａｒｖｉｅａｅ）、ＩＩ型ラクトコッカス・ガルビエ、およびＩＩＩ型ラクトコッカス・
ガルビエからなる群から選択される１以上のラクトコッカス・ガルビエである、請求項１
～６のいずれか一項に記載の組成物。
ａｒｖｉｅａｅ）、ＩＩ型ラクトコッカス・ガルビエ、およびＩＩＩ型ラクトコッカス・
ガルビエからなる群から選択される１以上のラクトコッカス・ガルビエである、請求項１
～６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項8】
魚類において魚類レンサ球菌に対する免疫を誘導することに用いるための、請求項１～
７のいずれか一項に記載の組成物。
７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項9】
魚類において魚類レンサ球菌に対する免疫を誘導する方法であって、
当該魚類に請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
当該魚類に請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項10】
請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物を製造する方法であって、
莢膜を有するＩＩ型魚類レンサ球菌を水溶液中で酸処理または熱処理に供することと、
前記水溶液中に遊離する糖鎖成分を回収することと、
回収された糖鎖成分を含む組成物を得ることと、
を含む、方法。
莢膜を有するＩＩ型魚類レンサ球菌を水溶液中で酸処理または熱処理に供することと、
前記水溶液中に遊離する糖鎖成分を回収することと、
回収された糖鎖成分を含む組成物を得ることと、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、魚類レンサ球菌の抽出物を含む、前記魚類レンサ球菌または前記抽出物に対
する特異的免疫を誘導することに用いるための組成物に関する。
する特異的免疫を誘導することに用いるための組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
魚類レンサ球菌は、養殖魚に感染し、養殖漁業に深刻な被害をもたらす（非特許文献１
）。非特許文献１では、ブリ、カンパチ、ヒラマサ、シマアジ、マアジ、マサバ、スマ、
およびクロマグロなどのすずき目の魚、ヒラメなどのかれい目の魚、ならびに、トラフグ
、カワハギ、およびウマヅラハギなどのふぐ目の魚において、ラクトコッカス・ガルビエ
が魚類レンサ球菌症を示すことが示されている。マリジェンナー レンサ１、マリンジェ
ンナー カワハギαβなどのラクトコッカス・ガルビエ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａ
ｒｖｉｅａｅ）の不活化菌が開発されている。
）。非特許文献１では、ブリ、カンパチ、ヒラマサ、シマアジ、マアジ、マサバ、スマ、
およびクロマグロなどのすずき目の魚、ヒラメなどのかれい目の魚、ならびに、トラフグ
、カワハギ、およびウマヅラハギなどのふぐ目の魚において、ラクトコッカス・ガルビエ
が魚類レンサ球菌症を示すことが示されている。マリジェンナー レンサ１、マリンジェ
ンナー カワハギαβなどのラクトコッカス・ガルビエ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａ
ｒｖｉｅａｅ）の不活化菌が開発されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0003】
【非特許文献1】「平成２９年度養殖場における病魚由来細菌の薬剤耐性モニタリング結果」、農林水産省消費・安全局畜水産安全管理課、農林水産省動物医薬品検査所発行、２０１９年１２月１０日発表
【発明の概要】
【0004】
本開示は、魚類レンサ球菌の抽出物を含む、前記魚類レンサ球菌または前記抽出物に対
する特異的免疫を誘導することに用いるための組成物を提供する。
する特異的免疫を誘導することに用いるための組成物を提供する。
【0005】
本開示によれば、以下の発明が提供され得る。
（１）糖鎖成分を含む組成物であって、当該糖鎖成分は、魚類レンサ球菌の糖鎖成分を含
み、魚類対象に投与することにより、当該対象において前記糖鎖成分または前記魚類レン
サ球菌に対する免疫（特に特異的免疫）を誘導することができる、組成物。
（２）前記糖鎖成分が、前記菌体の熱処理または酸処理などの糖鎖抽出処理により前記菌
体から抽出される糖鎖成分である、上記（１）に記載の組成物。
（３）前記糖鎖成分が、前記菌体の熱処理により前記菌体から抽出される糖鎖成分である
、上記（１）に記載の組成物。
（４）前記糖鎖成分が、前記菌体の酸処理により前記菌体から抽出される糖鎖成分である
、上記（１）に記載の組成物。
（５）前記酸処理が、塩酸による酸処理である、上記（４）に記載の組成物。
（６）前記魚類レンサ球菌が、α溶血性レンサ球菌である、例えば、非ＫＧ＋かつ非ＫＧ
－のα溶血性レンサ球菌である、上記（１）～（５）のいずれかに記載の組成物。
（７）前記魚類レンサ球菌が、Ｉ型ラクトコッカス・ガルビエ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｇａｒｖｉｅａｅ）、ＩＩ型ラクトコッカス・ガルビエ、およびＩＩＩ型ラクトコッカ
ス・ガルビエからなる群から選択される１以上のラクトコッカス・ガルビエである、上記
（１）～（６）のいずれかに記載の組成物。
（８）魚類において魚類レンサ球菌に対する免疫を誘導することに用いるための、上記（
１）～（７）のいずれかに記載の組成物。
（９）魚類において魚類レンサ球菌に対する免疫を誘導する方法であって、
当該魚類に上記（１）～（７）のいずれかに記載の組成物を投与することを含む、方法
。
（１０）上記（１）～（７）のいずれかに記載の組成物を製造する方法であって、
莢膜を有するＩＩ型魚類レンサ球菌を水溶液中で酸処理または熱処理に供することと、
前記水溶液中に遊離する糖鎖成分を回収することと、
回収された糖鎖成分を含む組成物を得ることと、
を含む、方法。
（１）糖鎖成分を含む組成物であって、当該糖鎖成分は、魚類レンサ球菌の糖鎖成分を含
み、魚類対象に投与することにより、当該対象において前記糖鎖成分または前記魚類レン
サ球菌に対する免疫（特に特異的免疫）を誘導することができる、組成物。
（２）前記糖鎖成分が、前記菌体の熱処理または酸処理などの糖鎖抽出処理により前記菌
体から抽出される糖鎖成分である、上記（１）に記載の組成物。
（３）前記糖鎖成分が、前記菌体の熱処理により前記菌体から抽出される糖鎖成分である
、上記（１）に記載の組成物。
（４）前記糖鎖成分が、前記菌体の酸処理により前記菌体から抽出される糖鎖成分である
、上記（１）に記載の組成物。
（５）前記酸処理が、塩酸による酸処理である、上記（４）に記載の組成物。
（６）前記魚類レンサ球菌が、α溶血性レンサ球菌である、例えば、非ＫＧ＋かつ非ＫＧ
－のα溶血性レンサ球菌である、上記（１）～（５）のいずれかに記載の組成物。
（７）前記魚類レンサ球菌が、Ｉ型ラクトコッカス・ガルビエ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｇａｒｖｉｅａｅ）、ＩＩ型ラクトコッカス・ガルビエ、およびＩＩＩ型ラクトコッカ
ス・ガルビエからなる群から選択される１以上のラクトコッカス・ガルビエである、上記
（１）～（６）のいずれかに記載の組成物。
（８）魚類において魚類レンサ球菌に対する免疫を誘導することに用いるための、上記（
１）～（７）のいずれかに記載の組成物。
（９）魚類において魚類レンサ球菌に対する免疫を誘導する方法であって、
当該魚類に上記（１）～（７）のいずれかに記載の組成物を投与することを含む、方法
。
（１０）上記（１）～（７）のいずれかに記載の組成物を製造する方法であって、
莢膜を有するＩＩ型魚類レンサ球菌を水溶液中で酸処理または熱処理に供することと、
前記水溶液中に遊離する糖鎖成分を回収することと、
回収された糖鎖成分を含む組成物を得ることと、
を含む、方法。
【0006】
（１１）魚類対象が、すずき目、かれい目、およびふぐ目からなる群から選択される魚で
ある、上記いずれかの組成物。
（１２）魚類対象が、ブリ、カンパチ、ヒラマサ、シマアジ、マアジ、マサバ、スマ、お
よびクロマグロなどのすずき目の魚類、ヒラメなどのかれい目の魚類、カワハギおよびウ
マヅラハギなどのふぐ目の魚類からなる群から選択されるいずれかの魚である、上記いず
れかの組成物。
（１３）魚類対象が、ブリ、カンパチまたはシマアジである、上記いずれかの組成物。
ある、上記いずれかの組成物。
（１２）魚類対象が、ブリ、カンパチ、ヒラマサ、シマアジ、マアジ、マサバ、スマ、お
よびクロマグロなどのすずき目の魚類、ヒラメなどのかれい目の魚類、カワハギおよびウ
マヅラハギなどのふぐ目の魚類からなる群から選択されるいずれかの魚である、上記いず
れかの組成物。
（１３）魚類対象が、ブリ、カンパチまたはシマアジである、上記いずれかの組成物。
【0007】
（２１）ワクチンである、上記いずれかの組成物。
（２２）魚類において魚類レンサ球菌の糖鎖成分に対する免疫を誘導する方法であって、
当該魚類に上記（１）～（６）のいずれかに記載の組成物を投与することを含む、方法
。
（２３）上記いずれかの方法において用いるための、組成物であって、糖鎖成分（例えば
、単離された糖鎖成分または当該糖鎖成分を含む糖タンパク質または糖脂質などの複合体
）を含み、当該糖鎖成分は、魚類レンサ球菌の糖鎖成分を含み、魚類対象に投与すること
により、当該対象において前記糖鎖成分または前記魚類レンサ球菌に対する免疫（特に特
異的免疫）を誘導することができる、組成物。
（２２）魚類において魚類レンサ球菌の糖鎖成分に対する免疫を誘導する方法であって、
当該魚類に上記（１）～（６）のいずれかに記載の組成物を投与することを含む、方法
。
（２３）上記いずれかの方法において用いるための、組成物であって、糖鎖成分（例えば
、単離された糖鎖成分または当該糖鎖成分を含む糖タンパク質または糖脂質などの複合体
）を含み、当該糖鎖成分は、魚類レンサ球菌の糖鎖成分を含み、魚類対象に投与すること
により、当該対象において前記糖鎖成分または前記魚類レンサ球菌に対する免疫（特に特
異的免疫）を誘導することができる、組成物。
【0008】
（３１）魚類レンサ球菌が、莢膜を有する魚類レンサ球菌である、上記いずれかに記載の
組成物、または方法。
（３２）魚類レンサ球菌が、莢膜を有する魚類レンサ球菌であり、かつ、糖鎖成分が、莢
膜に由来する糖鎖成分である、上記いずれかに記載の組成物、または方法。
（３３）ワクチンである、上記いずれかに記載の組成物。
（３４）魚類対象において、抗原特異的免疫を誘導することに用いるための上記いずれか
に記載の組成物。
組成物、または方法。
（３２）魚類レンサ球菌が、莢膜を有する魚類レンサ球菌であり、かつ、糖鎖成分が、莢
膜に由来する糖鎖成分である、上記いずれかに記載の組成物、または方法。
（３３）ワクチンである、上記いずれかに記載の組成物。
（３４）魚類対象において、抗原特異的免疫を誘導することに用いるための上記いずれか
に記載の組成物。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1A】酸による糖鎖抗原の抽出の結果を示す。塩酸抽出物及び蒸留水処理物をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離後アルシアンブルーおよび銀染色で染色した。レーン １： Ｐｒｅ－Ｓｔａｉｎｅｄ Ｍａｒｋｅｒ （Ｂｒｏａｄ）、レーン ２： １２１９４１－Ｂ２４ 株の塩酸抽出物、レーン ３： １２１９４１－Ｂ２４ 株の蒸留水抽出物、レーン ４： １２１９４１ 株の塩酸抽出物、レーン ５： １２１９４１ 株の蒸留水抽出物、レーン ６： ＢＳＬＧ１８２００１ 株の塩酸抽出物、レーン ７： ＢＳＬＧ１８２００１ 株の蒸留水抽出物、レーン ８： １５２６６３－２－２ 株の塩酸抽出物、レーン ９： １５２６６３－２－２ 株の蒸留水抽出物、レーン １０： ＢＳＬＧ１７２１０１ 株の塩酸抽出物、レーン １１： ＢＳＬＧ１７２１０１ 株の蒸留水抽出物、レーン １２： Ｐｒｅ－Ｓｔａｉｎｅｄ Ｍａｒｋｅｒ （Ｂｒｏａｄ）、レーン １３： Ｎｓ１５Ｋｉｔａ６ 株の塩酸抽出物、レーン １４： Ｎｓ１５Ｋｉｔａ６ 株の蒸留水抽出物、レーン １５： ＢＳＬＧ１６２００３ 株の塩酸抽出物、レーン １６： ＢＳＬＧ１６２００３ 株の蒸留水抽出物、レーン １７： Ｎｓ１７Ｋａｍｉ１４ 株の塩酸抽出物、レーン １８： Ｎｓ１７Ｋａｍｉ１４ 株の蒸留水抽出物、レーン １９： ＫＧ９５０２ 株の塩酸抽出物、レーン ２０： ＫＧ９５０２ 株の蒸留水抽出物、レーン ２１： ＮＵＦ６６８ 株の塩酸抽出物、レーン ２２： ＮＵＦ６６８ 株の蒸留水抽出物。
【図1B】１２１９４１－Ｂ２４－１株と１２１９４１－Ｂ２４－５６株の透過電子顕微鏡像を示す。図中の２つの白い矢印は莢膜と他の領域との境界をそれぞれ示す。
【図2】酸抽出物タンパク質の検出の結果を示す。塩酸抽出物及び蒸留水処理物をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離後ＣＢＢおよび銀染色で染色した。レーン１： Ｐｒｅ－Ｓｔａｉｎｅｄ Ｍａｒｋｅｒ、レーン２： １２１９４１－Ｂ２４株生菌の塩酸抽出物、レーン３： １２１９４１－Ｂ２４株生菌の蒸留水抽出物、レーン４： １２１９４１－Ｂ２４株ＦＫＣの塩酸抽出物、レーン５： １２１９４１－Ｂ２４株ＦＫＣの蒸留水抽出物、レーン６： １２１９４１－Ｂ２４－１株生菌の塩酸抽出物、レーン７： １２１９４１－Ｂ２４－１株生菌の蒸留水抽出物、レーン８： １２１９４１－Ｂ２４－５６株生菌の塩酸抽出物、レーン９： １２１９４１－Ｂ２４－５６株生菌の蒸留水抽出物。
【図3】１２１９４１－Ｂ２４－１株不活化菌体のワクチン効果を示す。１２１９４１－Ｂ２４－１株及び１２１９４１－Ｂ２４－５６株のホルマリン不活化菌液を作成し、ワクチン効果を評価した。
【図4】１２１９４１－Ｂ２４株不活化菌体のワクチン効果を示す。１２１９４１－Ｂ２４株のホルマリン不活化菌液を作成し、ワクチン効果を評価した。
【図5A】ヒートショックによる糖鎖抗原の抽出の結果を示す。ヒートショック抽出物をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離後アルシアンブルーおよび銀染色で染色した。レーン１： Ｐｒｅ－Ｓｔａｉｎｅｄ Ｍａｒｋｅｒ、レーン２： １２１９４１－Ｂ２４株生理食塩水 （６０ ℃）、レーン３： １２１９４１－Ｂ２４株生理食塩水（８０℃）、レーン４： １２１９４１－Ｂ２４株生理食塩水（１００℃）、レーン５： １２１９４１－Ｂ２４ ５６株生理食塩水（６０℃）、レーン６： １２１９４１－Ｂ２４ ５６株生理食塩水（８０℃）、レーン７： １２１９４１－Ｂ２４ ５６株生理食塩水（１００℃）、レーン８： １２１９４１－Ｂ２４株１０％ＳＤＳ含有生理食塩水（６０℃）、レーン９： １２１９４１－Ｂ２４株１０％ＳＤＳ含有生理食塩水（８０℃）、レーン１０： １２１９４１－Ｂ２４株１０％ＳＤＳ含有生理食塩水（１００℃）、レーン１１： １２１９４１－Ｂ２４ ５６株１０％ＳＤＳ含有生理食塩水（６０℃）、レーン１２： １２１９４１－Ｂ２４ ５６株１０％ＳＤＳ含有生理食塩水（８０℃）、レーン１３： １２１９４１－Ｂ２４ ５６株１０％ＳＤＳ含有生理食塩水（１００℃）。
【図5B】ヒートショックによる糖鎖抗原の抽出の結果を示す。ヒートショック抽出物をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離後アルシアンブルーおよび銀染色で染色した。レーン１： Ｐｒｅ－Ｓｔａｉｎｅｄ Ｍａｒｋｅｒ （Ｂｒｏａｄ）、レーン２： １２１９４１－Ｂ２４ Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ 抽出物、レーン３： ＢＳＬＧ１８２００１ Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ 抽出物、レーン４： １５２６６３－２－２ Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ 抽出物、レーン５： ＢＳＬＧ１７２１０１ Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ 抽出物、レーン６： Ｎｓ１５Ｋｉｔａ６ Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ 抽出物、レーン７： ＢＳＬＧ１６２００３ Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ 抽出物、レーン８： １２１９４１ Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ 抽出物。
【図6】１２１９４１－Ｂ２４株由来酸抽出物の免疫原性を示す。１２１９４１－Ｂ２４ 株の塩酸抽出物を作成し免疫効果を評価した。
【図7】１２１９４１－Ｂ２４株由来ヒートショック抽出物の免疫原性を示す。１２１９４１－Ｂ２４株のヒートショック抽出物を作成し、ワクチン効果を評価した。
【発明の具体的説明】
【0010】
本明細書では、「魚類」とは、脊椎動物亜門のうち、非四肢動物である動物群であり、
一般的には魚と呼ばれ、通常は水中で生活し、えら呼吸を行う動物である。脊椎動物亜門
条鰭綱新鰭亜綱棘鰭上目の魚としては、すずき目、かさご目、かれい目、ふぐ目、および
さけ目が挙げられる。すずき目の魚としては、例えば、ブリ類（またはハマチ）、カンパ
チ、ヒラマサ、シマアジ、マダイ、マアジ、マサバ、クロマグロ、イサキ、マハタ、およ
びサラサハタが挙げられる。かさご目の魚としては、カサゴ、メバル、オニオコゼ、ホウ
ボウ、コチ、およびアインは目などが上げられる。かれい目の魚としては、例えば、カレ
イ、ヒラメ、およびウシノシタが挙げられる。ふぐ目の魚としては、カワハギ、フグ、ハ
リセンボン、およびマンボウが挙げられる。さけ目の魚としては、サケ、ギンザケ、ニジ
マス、イワナ、タイセイヨウサケ、ベニザケ、ギンザケ、およびキングサーモンが挙げら
れる。
一般的には魚と呼ばれ、通常は水中で生活し、えら呼吸を行う動物である。脊椎動物亜門
条鰭綱新鰭亜綱棘鰭上目の魚としては、すずき目、かさご目、かれい目、ふぐ目、および
さけ目が挙げられる。すずき目の魚としては、例えば、ブリ類（またはハマチ）、カンパ
チ、ヒラマサ、シマアジ、マダイ、マアジ、マサバ、クロマグロ、イサキ、マハタ、およ
びサラサハタが挙げられる。かさご目の魚としては、カサゴ、メバル、オニオコゼ、ホウ
ボウ、コチ、およびアインは目などが上げられる。かれい目の魚としては、例えば、カレ
イ、ヒラメ、およびウシノシタが挙げられる。ふぐ目の魚としては、カワハギ、フグ、ハ
リセンボン、およびマンボウが挙げられる。さけ目の魚としては、サケ、ギンザケ、ニジ
マス、イワナ、タイセイヨウサケ、ベニザケ、ギンザケ、およびキングサーモンが挙げら
れる。
【0011】
本明細書では、「魚類レンサ球菌」は、魚類における伝染性疾病の原因となる細菌であ
る。養殖魚に関しては、生産額の多い順に、ブリ属魚類、マダイ、トラフグ、ヒラメ、ギ
ンザケ、シマアジ、およびマアジが知られており、大きな養殖魚市場を形成している。ブ
リ属魚類等の魚類におけるレンサ球菌症の原因となるレンサ球菌症、例えば、α溶血性レ
ンサ球菌（例えば、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｒｖｉａｅ；ラクトコッカス・ガルビ
エ）によるレンサ球菌症は、もっとも重要な疾病の一つである。ラクトコッカス・ガルビ
エは、魚類レンサ球菌症を発症したブリ、カンパチ、ヒラマサ、シマアジ、マアジ、マサ
バ、スマ、およびクロマグロなどのすずき目の魚類、ヒラメなどのかれい目の魚類、カワ
ハギおよびウマヅラハギなどのふぐ目の魚類から分離されている。また、ＩＩ型ラクトコ
ッカス・ガルビエは、主に、魚類レンサ球菌症を発症したブリ、カンパチおよびシマアジ
から分離されている。
る。養殖魚に関しては、生産額の多い順に、ブリ属魚類、マダイ、トラフグ、ヒラメ、ギ
ンザケ、シマアジ、およびマアジが知られており、大きな養殖魚市場を形成している。ブ
リ属魚類等の魚類におけるレンサ球菌症の原因となるレンサ球菌症、例えば、α溶血性レ
ンサ球菌（例えば、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｒｖｉａｅ；ラクトコッカス・ガルビ
エ）によるレンサ球菌症は、もっとも重要な疾病の一つである。ラクトコッカス・ガルビ
エは、魚類レンサ球菌症を発症したブリ、カンパチ、ヒラマサ、シマアジ、マアジ、マサ
バ、スマ、およびクロマグロなどのすずき目の魚類、ヒラメなどのかれい目の魚類、カワ
ハギおよびウマヅラハギなどのふぐ目の魚類から分離されている。また、ＩＩ型ラクトコ
ッカス・ガルビエは、主に、魚類レンサ球菌症を発症したブリ、カンパチおよびシマアジ
から分離されている。
【0012】
本明細書では、「ラクトコッカス・ガルビエ」は、α溶血性レンサ球菌の一種である。
α溶血性レンサ球菌は、魚類に感染すると、通常、眼球の白濁、出血、および突出；鰓蓋
内側の発赤、および膿瘍；ならびに心外膜炎、狂奔遊泳、および体系の歪曲などの症状を
引き起こし得る。Ｉ型ラクトコッカス・ガルビエは、抗Ｉａ型ウサギ血清に凝集するラク
トコッカス・ガルビエである。ＩＩ型ラクトコッカス・ガルビエは、抗ＩＩ型ウサギ血清
に凝集するラクトコッカス・ガルビエであり、非ＫＧ＋かつ非ＫＧ－であることを特徴と
する。近年、ＩＩ型ラクトコッカス・ガルビエは、ラクトコッカス・ホルモセンシス（Ｌ
． ｆｏｒｍｏｓｅｎｓｉｓ）として再分類されている。ＩＩＩ型ラクトコッカス・ガル
ビエは、上記いずれの血清でも凝集を生じないラクトコッカス・ガルビエである。
α溶血性レンサ球菌は、魚類に感染すると、通常、眼球の白濁、出血、および突出；鰓蓋
内側の発赤、および膿瘍；ならびに心外膜炎、狂奔遊泳、および体系の歪曲などの症状を
引き起こし得る。Ｉ型ラクトコッカス・ガルビエは、抗Ｉａ型ウサギ血清に凝集するラク
トコッカス・ガルビエである。ＩＩ型ラクトコッカス・ガルビエは、抗ＩＩ型ウサギ血清
に凝集するラクトコッカス・ガルビエであり、非ＫＧ＋かつ非ＫＧ－であることを特徴と
する。近年、ＩＩ型ラクトコッカス・ガルビエは、ラクトコッカス・ホルモセンシス（Ｌ
． ｆｏｒｍｏｓｅｎｓｉｓ）として再分類されている。ＩＩＩ型ラクトコッカス・ガル
ビエは、上記いずれの血清でも凝集を生じないラクトコッカス・ガルビエである。
【0013】
本明細書では、「莢膜」とは、一部の細菌が保有し、細胞壁のさらに外側に存在する層
である。莢膜は、細胞が分泌する成分からなり、宿主の免疫細胞から菌体本体を守る防御
壁としての役割を果たすと考えられている。莢膜保有株では、ギムザ染色に供した場合に
、菌体の周囲が染色されない像が観察される。
である。莢膜は、細胞が分泌する成分からなり、宿主の免疫細胞から菌体本体を守る防御
壁としての役割を果たすと考えられている。莢膜保有株では、ギムザ染色に供した場合に
、菌体の周囲が染色されない像が観察される。
【0014】
本明細書では、「糖鎖」とは、糖がグリコシド結合により連結した化合物をいう。糖鎖
は、多くの場合、脂質またはタンパク質などの生体分子を修飾している。細胞の表面には
、糖鎖が表出している。糖鎖は、細胞表面に発現し、水分を含有して細胞や当該細胞を含
む組織を保護したり、細胞間の情報伝達において重要な役割を果たしている。
は、多くの場合、脂質またはタンパク質などの生体分子を修飾している。細胞の表面には
、糖鎖が表出している。糖鎖は、細胞表面に発現し、水分を含有して細胞や当該細胞を含
む組織を保護したり、細胞間の情報伝達において重要な役割を果たしている。
【0015】
「魚類レンサ球菌の菌体から得られる糖鎖成分」とは、当該菌体を構成する糖鎖成分の
うち、当該菌体から分離できる糖鎖成分を意味する。菌体から分離できる糖鎖成分には、
菌体の細胞表面に表出している糖鎖成分が含まれる。このような糖鎖成分は、特に限定さ
れないが、菌体により合成され、細胞膜に輸送されて、細胞表面に表出していると考えら
れる。
うち、当該菌体から分離できる糖鎖成分を意味する。菌体から分離できる糖鎖成分には、
菌体の細胞表面に表出している糖鎖成分が含まれる。このような糖鎖成分は、特に限定さ
れないが、菌体により合成され、細胞膜に輸送されて、細胞表面に表出していると考えら
れる。
【0016】
本明細書では、「免疫」とは、非自己（主に、病原体などの侵入物である）に対する生
体防御機構である。免疫は、自然免疫と獲得免疫が挙げられる。自然免疫は、非自己に対
する非特異的な免疫であると考えられており、パターン認識などの仕組みを活用するマク
ロファージ、顆粒球、およびＮＫ細胞などの免疫細胞によりになわれる。獲得免疫は、非
自己に対する特異的な免疫であると考えられており、Ｔ細胞やＢ細胞などのリンパ球によ
り担われている。魚類では、病原体に対して抗血清が生じることから、獲得免疫が誘導さ
れるものと考えられている。獲得免疫細胞の中には、過去の病原体の情報を記憶する細胞
が存在し、免疫記憶を担っている。
体防御機構である。免疫は、自然免疫と獲得免疫が挙げられる。自然免疫は、非自己に対
する非特異的な免疫であると考えられており、パターン認識などの仕組みを活用するマク
ロファージ、顆粒球、およびＮＫ細胞などの免疫細胞によりになわれる。獲得免疫は、非
自己に対する特異的な免疫であると考えられており、Ｔ細胞やＢ細胞などのリンパ球によ
り担われている。魚類では、病原体に対して抗血清が生じることから、獲得免疫が誘導さ
れるものと考えられている。獲得免疫細胞の中には、過去の病原体の情報を記憶する細胞
が存在し、免疫記憶を担っている。
【0017】
本明細書では、「ワクチン」とは、個体に対して投与することにより、当該個体におい
て病原体およびその類縁体に対する免疫を誘導することに用いるための組成物である。ワ
クチンには、生ワクチン、および不活化ワクチンなどがある。生ワクチンとしては、一般
的に、ウイルスや細菌などの病原体の毒性、または発病力を低減した弱毒株が用いられる
。不活化ワクチンは、病原体またはその株に対して、物理的処理、および／または化学的
処理などを行うことにより、病原体を不活化することにより作製されうる。物理的処理と
しては、例えば、熱処理、超音波処理、または、紫外線の照射、Ｘ線およびγ線などの放
射線の照射が挙げられる。化学処理としては、例えば、ホルマリンおよびクロロホルムな
どの有機溶媒処理、酢酸などの酸（例えば、弱酸）による酸処理、アルコール処理、塩素
処理、または水銀処理が挙げられる。その他、ワクチンには、組換えタンパク質ワクチン
が挙げられる。ワクチンには、アジュバントが添加されていてもよい。
て病原体およびその類縁体に対する免疫を誘導することに用いるための組成物である。ワ
クチンには、生ワクチン、および不活化ワクチンなどがある。生ワクチンとしては、一般
的に、ウイルスや細菌などの病原体の毒性、または発病力を低減した弱毒株が用いられる
。不活化ワクチンは、病原体またはその株に対して、物理的処理、および／または化学的
処理などを行うことにより、病原体を不活化することにより作製されうる。物理的処理と
しては、例えば、熱処理、超音波処理、または、紫外線の照射、Ｘ線およびγ線などの放
射線の照射が挙げられる。化学処理としては、例えば、ホルマリンおよびクロロホルムな
どの有機溶媒処理、酢酸などの酸（例えば、弱酸）による酸処理、アルコール処理、塩素
処理、または水銀処理が挙げられる。その他、ワクチンには、組換えタンパク質ワクチン
が挙げられる。ワクチンには、アジュバントが添加されていてもよい。
【0018】
本明細書では、「単離」とは、天然の環境において共存していた少なくとも１以上の成
分から分離することを意味する。ある成分の菌体からの単離は、菌体から分離し、その後
、菌体または菌体の他の成分を除去して、または当該ある成分を濃縮もしくは相対濃度を
高めることにより実施できる。
分から分離することを意味する。ある成分の菌体からの単離は、菌体から分離し、その後
、菌体または菌体の他の成分を除去して、または当該ある成分を濃縮もしくは相対濃度を
高めることにより実施できる。
【0019】
本開示によれば、魚類レンサ球菌の糖鎖成分および当該糖鎖成分を含む組成物が提供さ
れる。ある好ましい態様では、糖鎖成分は、魚類レンサ球菌の菌体表面の糖鎖成分を含む
。糖鎖成分は、莢膜保有株から有利に抽出できる。したがって、ある好ましい態様では、
糖鎖成分は、魚類レンサ球菌の莢膜の構成成分である糖鎖成分を含む。したがって、好ま
しくは、魚類レンサ球菌は、莢膜を有するものである。本開示では、糖鎖成分は単離され
た糖鎖成分であり得る。本開示では、糖鎖成分は、当該糖鎖成分と他の成分（例えば、タ
ンパク質、脂質など）との複合体（例えば、単離された糖タンパク質および単離された糖
脂質などの単離された複合体）中に含まれていてもよい。単離は、糖鎖成分が産生された
環境（例えば、菌体）からの単離である。糖鎖の単離は、周知の様々な方法により行われ
得る。糖鎖成分は、菌体から他の１以上の成分と分離することにより単離され得る。糖鎖
はまた、被修飾体（例えば、菌体、または菌体のタンパク質もしくは脂質）から遊離させ
ることにより単離することができる。糖鎖の被修飾体からの遊離は、化学的処理および／
または物理的処理によりなされ得る。糖鎖の被修飾体からの遊離は、特に限定されないが
、熱処理および／または酸処理（好ましくは塩酸処理）によりなされ得る。糖鎖の被修飾
体からの遊離は、好ましくは熱処理によりなされ得る。酸処理および熱処理は、糖鎖成分
の抽出に適した条件下で、特に、糖鎖が破壊されてその抗原性が完全に消失しない程度の
強度で行えばよく、当業者であれば、糖鎖の被修飾体からの遊離に適した条件を設定する
ことができる。魚類レンサ球菌は好ましくはα溶血性レンサ球菌であり、より好ましくは
ラクトコッカス・ガルビエ（例えば、Ｉ型、ＩＩ型、もしくはＩＩＩ型、または上記以外
の型）であり、さらに好ましくはＩＩ型ラクトコッカス・ガルビエである。酸処理は、弱
酸によりなされ得る。酸処理は、例えば、１ｍＭ～１００ｍＭ、１０～２０ｍＭ、または
５ｍＭ～１５ｍＭ塩酸水溶液中でなされ得る。酸処理は、環境温度下（例えば、約２５℃
）で、１０～３０分程度なされ得る。熱処理は、例えば、６０℃～１００℃のいずれかの
温度条件下でなされ得る。熱処理は、特に限定されないが例えば、水溶液中でなされ得る
。水溶液は、界面活性剤を含んでいてもよい。加熱は、特に限定されないが例えば、数分
、例えば、１～１０分、２～７分、３～５分、または２～４分程度なされ得る。界面活性
剤は、例えば、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、両性界面活性剤、および
非イオン性界面活性剤であり得る。界面活性剤としては、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１
００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４、ＮＰ－４０、Ｂｒｉｊ－３５、Ｂｒｉｊ－５８、ポリ
ソルベート－２０、ポリソルベート－８０、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシ
ド、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、３－［（３－コラミドプロピル）－ジメチルア
ンモニオ］－１－プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、および３－［（３－コラミドプ
ロピル）ジメチルアンモニオ］－２－ヒドロキシプロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）
からなる群から選択される１以上を用いることができる。水溶液は、例えば、緩衝液また
は生理食塩水であり得る。
れる。ある好ましい態様では、糖鎖成分は、魚類レンサ球菌の菌体表面の糖鎖成分を含む
。糖鎖成分は、莢膜保有株から有利に抽出できる。したがって、ある好ましい態様では、
糖鎖成分は、魚類レンサ球菌の莢膜の構成成分である糖鎖成分を含む。したがって、好ま
しくは、魚類レンサ球菌は、莢膜を有するものである。本開示では、糖鎖成分は単離され
た糖鎖成分であり得る。本開示では、糖鎖成分は、当該糖鎖成分と他の成分（例えば、タ
ンパク質、脂質など）との複合体（例えば、単離された糖タンパク質および単離された糖
脂質などの単離された複合体）中に含まれていてもよい。単離は、糖鎖成分が産生された
環境（例えば、菌体）からの単離である。糖鎖の単離は、周知の様々な方法により行われ
得る。糖鎖成分は、菌体から他の１以上の成分と分離することにより単離され得る。糖鎖
はまた、被修飾体（例えば、菌体、または菌体のタンパク質もしくは脂質）から遊離させ
ることにより単離することができる。糖鎖の被修飾体からの遊離は、化学的処理および／
または物理的処理によりなされ得る。糖鎖の被修飾体からの遊離は、特に限定されないが
、熱処理および／または酸処理（好ましくは塩酸処理）によりなされ得る。糖鎖の被修飾
体からの遊離は、好ましくは熱処理によりなされ得る。酸処理および熱処理は、糖鎖成分
の抽出に適した条件下で、特に、糖鎖が破壊されてその抗原性が完全に消失しない程度の
強度で行えばよく、当業者であれば、糖鎖の被修飾体からの遊離に適した条件を設定する
ことができる。魚類レンサ球菌は好ましくはα溶血性レンサ球菌であり、より好ましくは
ラクトコッカス・ガルビエ（例えば、Ｉ型、ＩＩ型、もしくはＩＩＩ型、または上記以外
の型）であり、さらに好ましくはＩＩ型ラクトコッカス・ガルビエである。酸処理は、弱
酸によりなされ得る。酸処理は、例えば、１ｍＭ～１００ｍＭ、１０～２０ｍＭ、または
５ｍＭ～１５ｍＭ塩酸水溶液中でなされ得る。酸処理は、環境温度下（例えば、約２５℃
）で、１０～３０分程度なされ得る。熱処理は、例えば、６０℃～１００℃のいずれかの
温度条件下でなされ得る。熱処理は、特に限定されないが例えば、水溶液中でなされ得る
。水溶液は、界面活性剤を含んでいてもよい。加熱は、特に限定されないが例えば、数分
、例えば、１～１０分、２～７分、３～５分、または２～４分程度なされ得る。界面活性
剤は、例えば、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、両性界面活性剤、および
非イオン性界面活性剤であり得る。界面活性剤としては、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１
００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４、ＮＰ－４０、Ｂｒｉｊ－３５、Ｂｒｉｊ－５８、ポリ
ソルベート－２０、ポリソルベート－８０、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシ
ド、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、３－［（３－コラミドプロピル）－ジメチルア
ンモニオ］－１－プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、および３－［（３－コラミドプ
ロピル）ジメチルアンモニオ］－２－ヒドロキシプロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）
からなる群から選択される１以上を用いることができる。水溶液は、例えば、緩衝液また
は生理食塩水であり得る。
【0020】
本開示によれば、魚類レンサ球菌の糖鎖成分は、魚類対象に投与することにより、当該
対象において前記魚類レンサ球菌に対する免疫を誘導し得る。したがって、魚類レンサ球
菌の糖鎖成分または当該糖鎖成分を含む組成物は、魚類対象に投与することにより、当該
対象において前記魚類レンサ球菌に対する免疫を誘導することができる。そのため、魚類
レンサ球菌の糖鎖成分または当該糖鎖成分を含む組成物は、魚類対象に投与することによ
り、当該対象において前記魚類レンサ球菌に対する免疫を誘導することに用いることがで
きる。誘導される免疫は、自然免疫および／または獲得免疫であり得、好ましくは獲得免
疫である。魚類レンサ球菌は好ましくはα溶血性レンサ球菌であり、より好ましくはラク
トコッカス・ガルビエ（例えば、Ｉ型、ＩＩ型、もしくはＩＩＩ型、または上記以外の型
）であり、さらに好ましくはＩＩ型ラクトコッカス・ガルビエである。
対象において前記魚類レンサ球菌に対する免疫を誘導し得る。したがって、魚類レンサ球
菌の糖鎖成分または当該糖鎖成分を含む組成物は、魚類対象に投与することにより、当該
対象において前記魚類レンサ球菌に対する免疫を誘導することができる。そのため、魚類
レンサ球菌の糖鎖成分または当該糖鎖成分を含む組成物は、魚類対象に投与することによ
り、当該対象において前記魚類レンサ球菌に対する免疫を誘導することに用いることがで
きる。誘導される免疫は、自然免疫および／または獲得免疫であり得、好ましくは獲得免
疫である。魚類レンサ球菌は好ましくはα溶血性レンサ球菌であり、より好ましくはラク
トコッカス・ガルビエ（例えば、Ｉ型、ＩＩ型、もしくはＩＩＩ型、または上記以外の型
）であり、さらに好ましくはＩＩ型ラクトコッカス・ガルビエである。
【0021】
本開示によれば、魚類レンサ球菌の糖鎖成分は、タンパク質または脂質と共有結合して
いる必要は無い。ある態様では、魚類レンサ球菌の糖鎖成分を含む組成物は、タンパク質
または脂質を実質的に含まない。タンパク質または脂質を実質的に含まない組成物とは、
糖鎖成分の調製過程で、除去できない程度または検出限界以下のタンパク質または脂質を
含んでいてもよい。上記組成物において、タンパク質は、タンパク質分解酵素により分解
されることにより、除去されていてもよい。糖鎖成分は、好ましくは精製されている。精
製により糖鎖成分の純度を高めることができる。
いる必要は無い。ある態様では、魚類レンサ球菌の糖鎖成分を含む組成物は、タンパク質
または脂質を実質的に含まない。タンパク質または脂質を実質的に含まない組成物とは、
糖鎖成分の調製過程で、除去できない程度または検出限界以下のタンパク質または脂質を
含んでいてもよい。上記組成物において、タンパク質は、タンパク質分解酵素により分解
されることにより、除去されていてもよい。糖鎖成分は、好ましくは精製されている。精
製により糖鎖成分の純度を高めることができる。
【0022】
本開示によれば、魚類対象を処置する方法が提供される。本開示の方法は、魚類対象に
、単離された魚類レンサ球菌の糖鎖成分または当該単離された糖鎖成分を含む組成物の有
効量を投与することを含む。本開示によれば、魚類対象において免疫を誘導する方法であ
って、魚類対象に、単離された魚類レンサ球菌の糖鎖成分または当該単離された糖鎖成分
を含む組成物の有効量を投与することを含む。ここで、免疫は抗原特異的免疫であり得る
。
、単離された魚類レンサ球菌の糖鎖成分または当該単離された糖鎖成分を含む組成物の有
効量を投与することを含む。本開示によれば、魚類対象において免疫を誘導する方法であ
って、魚類対象に、単離された魚類レンサ球菌の糖鎖成分または当該単離された糖鎖成分
を含む組成物の有効量を投与することを含む。ここで、免疫は抗原特異的免疫であり得る
。
【0023】
本開示によれば、本開示の方法において用いるための、単離された魚類レンサ球菌の糖
鎖成分または当該単離された糖鎖成分を含む組成物が提供される。
本開示によれば、魚類対象に投与する組成物の製造における、単離された魚類レンサ球
菌の糖鎖成分または当該単離された糖鎖成分を含む組成物の使用が提供される。
本開示によれば、魚類対象において免疫を誘導することに用いるための組成物の製造に
おける、単離された魚類レンサ球菌の糖鎖成分または当該単離された糖鎖成分を含む組成
物の使用が提供される。
鎖成分または当該単離された糖鎖成分を含む組成物が提供される。
本開示によれば、魚類対象に投与する組成物の製造における、単離された魚類レンサ球
菌の糖鎖成分または当該単離された糖鎖成分を含む組成物の使用が提供される。
本開示によれば、魚類対象において免疫を誘導することに用いるための組成物の製造に
おける、単離された魚類レンサ球菌の糖鎖成分または当該単離された糖鎖成分を含む組成
物の使用が提供される。
【0024】
本開示によれば、魚類レンサ球菌の糖鎖成分を含むワクチンが提供される。
【0025】
本開示によれば、魚類レンサ球菌の糖鎖成分を含む組成物（またはワクチン）を製造す
る方法が提供される。この方法は、
莢膜を有する魚類レンサ球菌（例えば、ＩＩ型魚類レンサ球菌）を水溶液中で酸処理ま
たは熱処理に供すること、
を含む。ある好ましい態様では、この方法は、前記水溶液中に遊離する糖鎖成分を回収す
る（他の成分から分離する）ことをさらに含む。ある好ましい態様では、この方法は、回
収された糖鎖成分を含む組成物（またはワクチン）を得ることをさらに含む。ワクチンは
、有効量の糖鎖成分を含む。ワクチンは、有効量の糖鎖成分に加えて、水、等張剤、ｐＨ
調整剤、塩などの添加剤を含んでいてもよい。
る方法が提供される。この方法は、
莢膜を有する魚類レンサ球菌（例えば、ＩＩ型魚類レンサ球菌）を水溶液中で酸処理ま
たは熱処理に供すること、
を含む。ある好ましい態様では、この方法は、前記水溶液中に遊離する糖鎖成分を回収す
る（他の成分から分離する）ことをさらに含む。ある好ましい態様では、この方法は、回
収された糖鎖成分を含む組成物（またはワクチン）を得ることをさらに含む。ワクチンは
、有効量の糖鎖成分を含む。ワクチンは、有効量の糖鎖成分に加えて、水、等張剤、ｐＨ
調整剤、塩などの添加剤を含んでいてもよい。
【0026】
本開示の組成物およびワクチンは、魚類対象において、当該糖鎖成分または当該糖鎖成
分が由来する魚類レンサ球菌またはその変種に対する抗原特異的な免疫を誘導することが
できる。本開示の組成物およびワクチンは、魚類対象において、糖鎖成分が由来する魚類
レンサ球菌またはその変種に起因する魚類レンサ球菌症を予防および／または治療するこ
とに用いられ得る。
分が由来する魚類レンサ球菌またはその変種に対する抗原特異的な免疫を誘導することが
できる。本開示の組成物およびワクチンは、魚類対象において、糖鎖成分が由来する魚類
レンサ球菌またはその変種に起因する魚類レンサ球菌症を予防および／または治療するこ
とに用いられ得る。
【0027】
魚類レンサ球菌は好ましくはα溶血性レンサ球菌であり、より好ましくはラクトコッカ
ス・ガルビエであり、さらに好ましくはＩＩ型ラクトコッカス・ガルビエである。ある好
ましい態様では、魚類レンサ球菌は、好ましくは、莢膜を有するα溶血性レンサ球菌であ
り、より好ましくは莢膜を有するラクトコッカス・ガルビエであり、さらに好ましくは莢
膜を有するＩＩ型ラクトコッカス・ガルビエである。
ス・ガルビエであり、さらに好ましくはＩＩ型ラクトコッカス・ガルビエである。ある好
ましい態様では、魚類レンサ球菌は、好ましくは、莢膜を有するα溶血性レンサ球菌であ
り、より好ましくは莢膜を有するラクトコッカス・ガルビエであり、さらに好ましくは莢
膜を有するＩＩ型ラクトコッカス・ガルビエである。
【0028】
ある態様では、魚類対象は、ブリ、カンパチ、ヒラマサ、シマアジ、マアジ、マサバ、
スマ、およびクロマグロなどのすずき目の魚類、ヒラメなどのかれい目の魚類、カワハギ
およびウマヅラハギなどのふぐ目の魚類からなる群から選択されるいずれかの魚である。
ある態様では、魚類対象は、ブリ、カンパチ、またはシマアジであり得る。ある態様では
、魚類対象は、養殖魚であり得る。
スマ、およびクロマグロなどのすずき目の魚類、ヒラメなどのかれい目の魚類、カワハギ
およびウマヅラハギなどのふぐ目の魚類からなる群から選択されるいずれかの魚である。
ある態様では、魚類対象は、ブリ、カンパチ、またはシマアジであり得る。ある態様では
、魚類対象は、養殖魚であり得る。
【実施例0029】
材料および方法
使用菌株
下記表１に示される菌株を使用した。１２１９４１－Ｂ２４株、１２１９４１－Ｂ２４
－１株及び１２１９４１－Ｂ２４－５６株は、２０１２年に大分県で死亡したブリ未成魚
から分離された後に液体窒素中で凍結保存した１２１９４１株を原株としてクローニング
して樹立された株である。これらの３株はいずれも抗ＩＩ型血清に凝集することからＩＩ
型Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｒｖｉｅａｅ （Ｌ． ｇａｒｖｉｅａｅ）に分類され
る。
使用菌株
下記表１に示される菌株を使用した。１２１９４１－Ｂ２４株、１２１９４１－Ｂ２４
－１株及び１２１９４１－Ｂ２４－５６株は、２０１２年に大分県で死亡したブリ未成魚
から分離された後に液体窒素中で凍結保存した１２１９４１株を原株としてクローニング
して樹立された株である。これらの３株はいずれも抗ＩＩ型血清に凝集することからＩＩ
型Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｒｖｉｅａｅ （Ｌ． ｇａｒｖｉｅａｅ）に分類され
る。
【0030】
【表1】
【0031】
ＢＳＬＧ１５２０３－３－４－４株は２０１５年に鹿児島県で死亡したブリ未成魚から
分離された後に液体窒素中で保存したＢＳＬＧ１５２０３株を３回生体通過したのちにブ
リに対して高病原性を示すクローンを選抜して樹立された株である。ＢＳＬＧ１５２０３
－３－４－４株は抗ＩＩ型血清に凝集するＩＩ型Ｌ． ｇａｒｖｉｅａｅである。これら
の菌株はＳｏｙ－ｂｅａｎ Ｃａｓｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔ培地を用いて２０～２４時間培
養し、使用時まで－８０℃又は液体窒素中で保存した。なお、攻撃に使用する場合にはＴ
ｏｄｄ Ｈｅｗｉｔｔ培地を用いて２４時間培養した。
分離された後に液体窒素中で保存したＢＳＬＧ１５２０３株を３回生体通過したのちにブ
リに対して高病原性を示すクローンを選抜して樹立された株である。ＢＳＬＧ１５２０３
－３－４－４株は抗ＩＩ型血清に凝集するＩＩ型Ｌ． ｇａｒｖｉｅａｅである。これら
の菌株はＳｏｙ－ｂｅａｎ Ｃａｓｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔ培地を用いて２０～２４時間培
養し、使用時まで－８０℃又は液体窒素中で保存した。なお、攻撃に使用する場合にはＴ
ｏｄｄ Ｈｅｗｉｔｔ培地を用いて２４時間培養した。
【0032】
塩酸による抽出物の調整
培養した上記菌株の培養液並びに１２１９４１－Ｂ２４株ホルマリン不活化菌液（ＦＫ
Ｃ）それぞれの溶液成分を０．０１Ｍ塩酸に置換し、２０分間２５℃で処理した。塩酸処
理後、８，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を回収して塩酸抽出物とした。なお、
それぞれの菌株を蒸留水中で同様に処理したものを対照とした。
培養した上記菌株の培養液並びに１２１９４１－Ｂ２４株ホルマリン不活化菌液（ＦＫ
Ｃ）それぞれの溶液成分を０．０１Ｍ塩酸に置換し、２０分間２５℃で処理した。塩酸処
理後、８，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を回収して塩酸抽出物とした。なお、
それぞれの菌株を蒸留水中で同様に処理したものを対照とした。
【0033】
ヒートショック（Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ）による抽出物の調整
培養した１２１９４１－Ｂ２４株又は１２１９４１－Ｂ２４－５６株培養液それぞれの
培地を生理食塩水又は１０％ＳＤＳ含有生理食塩水に置換し、４℃で温度を平衡化させた
のち、６０℃、８０℃又は１００℃（煮沸）下で３分間加温した。各処理が終了後、氷中
で急冷したものを、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を回収してヒートシ
ョック抽出物とした（図５Ａ）。また、培養した各菌株の培養液の培地を生理食塩水に置
換し、４℃で温度を平衡化させたのち、１００℃（煮沸）下で３分間加温した。各処理が
終了後、氷中で急冷したものを、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を回収
してヒートショック抽出物とした（図５Ｂ）。
培養した１２１９４１－Ｂ２４株又は１２１９４１－Ｂ２４－５６株培養液それぞれの
培地を生理食塩水又は１０％ＳＤＳ含有生理食塩水に置換し、４℃で温度を平衡化させた
のち、６０℃、８０℃又は１００℃（煮沸）下で３分間加温した。各処理が終了後、氷中
で急冷したものを、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を回収してヒートシ
ョック抽出物とした（図５Ａ）。また、培養した各菌株の培養液の培地を生理食塩水に置
換し、４℃で温度を平衡化させたのち、１００℃（煮沸）下で３分間加温した。各処理が
終了後、氷中で急冷したものを、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を回収
してヒートショック抽出物とした（図５Ｂ）。
【0034】
ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる糖鎖抗原の検出
各抽出物サンプルを等量の２×サンプルバッファー（０．１２５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ
、１０％メルカプトエタノール、４％ＳＤＳ、１０％スクロース、０．０４ｍｇ／ｍＬブ
ロモフェノールブルー）と混合後、３分間煮沸して、１２．５％ポリアクリルアミドゲル
上で１５ｍＡ／ゲル下で泳動した。分子量マーカーはＰｒｅ－Ｓｔａｉｎｅｄ Ｍａｒｋ
ｅｒ（Ｂｒｏａｄ； Ｉｎｔｅｇｒａｌｅ）を使用した。電気泳動終了後、アルシアンブ
ルーで染色した。固定液（１０％酢酸、２５％エタノール）中で２時間固定後、０．１２
５％アルシアンブルー液中で１時間染色した。染色後固定液で洗浄し、次いで洗浄液（５
％酢酸、１０％エタノール）で洗浄した。洗浄後、５％グルタールアルデヒド液中で１５
分間増感し、洗浄液に次いで蒸留水で洗浄後銀染色を行った（１，２）。銀染色はＳｉｌ
ｖｅｒ Ｓｔａｉｎ ２ Ｋｉｔ Ｗａｋｏ （和光純薬工業）をマニュアルに準じて使
用して行った。同時にＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ（ＣＢＢ）染
色による検出も行った。電気泳動終了後、ＣＢＢ染色液（０．２５％ＣＢＢ－Ｒ２５０、
５％エタノール、７．５％酢酸）中で３０分間染色した。染色後、脱色液（２５％エタノ
ール、７．５％酢酸）中で脱色し、蒸留水で洗浄後銀染色を行った。銀染色はＳｉｌｖｅ
ｒ Ｓｔａｉｎ ２ Ｋｉｔ Ｗａｋｏ（和光純薬工業）をマニュアルに準じて使用して
行った。
各抽出物サンプルを等量の２×サンプルバッファー（０．１２５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ
、１０％メルカプトエタノール、４％ＳＤＳ、１０％スクロース、０．０４ｍｇ／ｍＬブ
ロモフェノールブルー）と混合後、３分間煮沸して、１２．５％ポリアクリルアミドゲル
上で１５ｍＡ／ゲル下で泳動した。分子量マーカーはＰｒｅ－Ｓｔａｉｎｅｄ Ｍａｒｋ
ｅｒ（Ｂｒｏａｄ； Ｉｎｔｅｇｒａｌｅ）を使用した。電気泳動終了後、アルシアンブ
ルーで染色した。固定液（１０％酢酸、２５％エタノール）中で２時間固定後、０．１２
５％アルシアンブルー液中で１時間染色した。染色後固定液で洗浄し、次いで洗浄液（５
％酢酸、１０％エタノール）で洗浄した。洗浄後、５％グルタールアルデヒド液中で１５
分間増感し、洗浄液に次いで蒸留水で洗浄後銀染色を行った（１，２）。銀染色はＳｉｌ
ｖｅｒ Ｓｔａｉｎ ２ Ｋｉｔ Ｗａｋｏ （和光純薬工業）をマニュアルに準じて使
用して行った。同時にＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ（ＣＢＢ）染
色による検出も行った。電気泳動終了後、ＣＢＢ染色液（０．２５％ＣＢＢ－Ｒ２５０、
５％エタノール、７．５％酢酸）中で３０分間染色した。染色後、脱色液（２５％エタノ
ール、７．５％酢酸）中で脱色し、蒸留水で洗浄後銀染色を行った。銀染色はＳｉｌｖｅ
ｒ Ｓｔａｉｎ ２ Ｋｉｔ Ｗａｋｏ（和光純薬工業）をマニュアルに準じて使用して
行った。
【0035】
糖鎖抗原保有株（１２１９４１－Ｂ２４－１株及び１２１９４１－Ｂ２４－５６株）不活
化菌体の免疫原性の比較
１２１９４１－Ｂ２４－１株及び１２１９４１－Ｂ２４－５６株の不活化菌体をブリ稚
魚（平均：１２９．２±２２．０ｇ）それぞれ１５尾ずつの腹腔内に投与し、２週間飼育
した。免疫後２週目にＢＳＬＧ１５２０３－３－４－４株で攻撃し（２．６×１０7ＣＦ
Ｕ／尾）、２週間の死亡の推移を毎日確認した。なお、ＰＢＳを投与した群を対照とした
。
化菌体の免疫原性の比較
１２１９４１－Ｂ２４－１株及び１２１９４１－Ｂ２４－５６株の不活化菌体をブリ稚
魚（平均：１２９．２±２２．０ｇ）それぞれ１５尾ずつの腹腔内に投与し、２週間飼育
した。免疫後２週目にＢＳＬＧ１５２０３－３－４－４株で攻撃し（２．６×１０7ＣＦ
Ｕ／尾）、２週間の死亡の推移を毎日確認した。なお、ＰＢＳを投与した群を対照とした
。
【0036】
塩酸抽出物のＩＩ型Ｌ． ｇａｒｖｉｅａｅに対する免疫効果の検討
１２１９４１－Ｂ２４株由来の塩酸抽出物をブリ稚魚（平均：２２．５±２．６ｇ）１
５尾の腹腔内に投与し、２週間飼育した。免疫後２週目にＢＳＬＧ１５２０３－３－４－
４株で攻撃し（２．６×１０6ＣＦＵ／尾）、２週間の死亡の推移を毎日確認した。なお
、ＰＢＳを投与した群を対照とした。
１２１９４１－Ｂ２４株由来の塩酸抽出物をブリ稚魚（平均：２２．５±２．６ｇ）１
５尾の腹腔内に投与し、２週間飼育した。免疫後２週目にＢＳＬＧ１５２０３－３－４－
４株で攻撃し（２．６×１０6ＣＦＵ／尾）、２週間の死亡の推移を毎日確認した。なお
、ＰＢＳを投与した群を対照とした。
【0037】
ヒートショック抽出物のＩＩ型Ｌ． ｇａｒｖｉｅａｅに対する免疫効果の検討
１２１９４１－Ｂ２４株由来のヒートショック抽出物をブリ稚魚（平均：２１．９±３
．６ｇ）２０尾の腹腔内に投与し、２週間飼育した。免疫後２週目にＢＳＬＧ１５２０３
－３－４－４株で攻撃し（１．５×１０6ＣＦＵ／尾）、２週間の死亡の推移を毎日確認
した。
なお、ＰＢＳを投与した群を対照とした。
１２１９４１－Ｂ２４株由来のヒートショック抽出物をブリ稚魚（平均：２１．９±３
．６ｇ）２０尾の腹腔内に投与し、２週間飼育した。免疫後２週目にＢＳＬＧ１５２０３
－３－４－４株で攻撃し（１．５×１０6ＣＦＵ／尾）、２週間の死亡の推移を毎日確認
した。
なお、ＰＢＳを投与した群を対照とした。
【0038】
結果及び考察
本開示によれば、Ｌ． ｇａｒｖｉｅａｅから種々の方法により抽出できる糖鎖成分が
ワクチン効果を奏することが明らかとなった。具体的には以下の通りである。
本開示によれば、Ｌ． ｇａｒｖｉｅａｅから種々の方法により抽出できる糖鎖成分が
ワクチン効果を奏することが明らかとなった。具体的には以下の通りである。
【0039】
ＩＩ型Ｌ． ｇａｒｖｉｅａｅの酸処理による抗原の抽出
ＩＩ型Ｌ． ｇａｒｖｉｅａｅである１２１９４１－Ｂ２４株（生菌及びＦＫＣ）、１
２１９４１－Ｂ２４－１株及び１２１９４１－Ｂ２４－５６株を含む表１記載の菌株それ
ぞれから０．０１Ｍの塩酸及び蒸留水を用いた処理後に得られる酸抽出物の上清をＳＤＳ
－ＰＡＧＥで分離した。ＢＳＬＧ１８２００１株、１５２６６３－２－２株、ＢＳＬＧ１
７２１０１株、Ｎｓ１５Ｋｉｔａ６株、ＢＳＬＧ１６２００３株、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で
１２１９４１－Ｂ２４株及び１２１９４１－Ｂ２４－１株からの酸抽出物中に＜４０ｋＤ
ａのスメアが検出された（図１）。このスメアは、アルシアンブルーで染色されたことか
らこの抽出物は多糖類に関連する因子であることが示唆された。一方でこの因子は蒸留水
では抽出できず、ホルマリン不活化菌体からも抽出できないことが示された（図１Ａ参照
）。興味深いことに、１２１９４１－Ｂ２４株及び１２１９４１－Ｂ２４－１株と由来を
同一とするにもかかわらず、１２１９４１－Ｂ２４－５６株ではこの抗原は検出されなか
った。このことからＩＩ型Ｌ． ｇａｒｖｉｅａｅであっても株ごとによって抗原（糖鎖
）にバリエーションが生じていること、および１２１９４１株が複数の種類の株（より具
体的には莢膜を有する株と莢膜を有していない株を含む）の混合物である可能性が疑われ
た。このことから、ある単離株が、複数種類の株の混合物である可能性がある場合には、
限外希釈法等により、さらにクローニングを行って、単一クローンを分離することが有用
であると示唆される。また、単一クローンを、莢膜の有無、または酸もしくは熱抽出によ
る糖鎖成分の抽出成否に基づいて選択し、糖鎖成分を抽出できるクローンを選択すること
が重要であり得ることも示唆された。
ＩＩ型Ｌ． ｇａｒｖｉｅａｅである１２１９４１－Ｂ２４株（生菌及びＦＫＣ）、１
２１９４１－Ｂ２４－１株及び１２１９４１－Ｂ２４－５６株を含む表１記載の菌株それ
ぞれから０．０１Ｍの塩酸及び蒸留水を用いた処理後に得られる酸抽出物の上清をＳＤＳ
－ＰＡＧＥで分離した。ＢＳＬＧ１８２００１株、１５２６６３－２－２株、ＢＳＬＧ１
７２１０１株、Ｎｓ１５Ｋｉｔａ６株、ＢＳＬＧ１６２００３株、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で
１２１９４１－Ｂ２４株及び１２１９４１－Ｂ２４－１株からの酸抽出物中に＜４０ｋＤ
ａのスメアが検出された（図１）。このスメアは、アルシアンブルーで染色されたことか
らこの抽出物は多糖類に関連する因子であることが示唆された。一方でこの因子は蒸留水
では抽出できず、ホルマリン不活化菌体からも抽出できないことが示された（図１Ａ参照
）。興味深いことに、１２１９４１－Ｂ２４株及び１２１９４１－Ｂ２４－１株と由来を
同一とするにもかかわらず、１２１９４１－Ｂ２４－５６株ではこの抗原は検出されなか
った。このことからＩＩ型Ｌ． ｇａｒｖｉｅａｅであっても株ごとによって抗原（糖鎖
）にバリエーションが生じていること、および１２１９４１株が複数の種類の株（より具
体的には莢膜を有する株と莢膜を有していない株を含む）の混合物である可能性が疑われ
た。このことから、ある単離株が、複数種類の株の混合物である可能性がある場合には、
限外希釈法等により、さらにクローニングを行って、単一クローンを分離することが有用
であると示唆される。また、単一クローンを、莢膜の有無、または酸もしくは熱抽出によ
る糖鎖成分の抽出成否に基づいて選択し、糖鎖成分を抽出できるクローンを選択すること
が重要であり得ることも示唆された。
【0040】
糖鎖抗原が抽出される株（１２１９４１－Ｂ２４－１）と抽出されない株（１２１９４
１－Ｂ２４－５６）を透過電子顕微鏡で観察した。具体的には、寒天培養菌を0.15％ルテ
ニウムレッド加5％グルタールアルデヒドで室温2時間固定した。遠心により固定した菌を
集め、集めた菌を4％アガロースに包埋して包埋ブロックを作製し、包埋ブロックを細切
し、0.05％ルテニウムレッド加カコジル酸緩衝液で5回洗浄した。常法により、2％四酸化
オスミウムで後固定し、その後、洗浄、脱水、樹脂包埋、薄切して、常法によるウランお
よび鉛による2重染色に供した。結果は、図１Ｂに示される通りであった。図１Ｂに示さ
れるように、糖鎖抗原が抽出される株（１２１９４１－Ｂ２４－１）は菌体の最外層（矢
印で挟まれた領域）に莢膜と考えられる層が存在するのに対して、糖鎖抗原が抽出されな
い株（１２１９４１－Ｂ２４－５６）は、莢膜を有しないことが示唆された。この結果か
ら、糖鎖抗原は莢膜に由来することが示唆された。
１－Ｂ２４－５６）を透過電子顕微鏡で観察した。具体的には、寒天培養菌を0.15％ルテ
ニウムレッド加5％グルタールアルデヒドで室温2時間固定した。遠心により固定した菌を
集め、集めた菌を4％アガロースに包埋して包埋ブロックを作製し、包埋ブロックを細切
し、0.05％ルテニウムレッド加カコジル酸緩衝液で5回洗浄した。常法により、2％四酸化
オスミウムで後固定し、その後、洗浄、脱水、樹脂包埋、薄切して、常法によるウランお
よび鉛による2重染色に供した。結果は、図１Ｂに示される通りであった。図１Ｂに示さ
れるように、糖鎖抗原が抽出される株（１２１９４１－Ｂ２４－１）は菌体の最外層（矢
印で挟まれた領域）に莢膜と考えられる層が存在するのに対して、糖鎖抗原が抽出されな
い株（１２１９４１－Ｂ２４－５６）は、莢膜を有しないことが示唆された。この結果か
ら、糖鎖抗原は莢膜に由来することが示唆された。
【0041】
同様の方法により得られた酸抽出物にタンパク質成分が含まれるかを確認するため、得
られた酸抽出物をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離後、ＣＢＢで染色したところ、アルシアン
ブルーで検出された前記抗原を検出することができなかった（図２）。この結果から、少
なくとも酸で抽出した抗原は、タンパク質成分を含まない可能性が高く、すなわち、糖タ
ンパク質ではなく、糖鎖として存在している可能性が示された。
られた酸抽出物をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離後、ＣＢＢで染色したところ、アルシアン
ブルーで検出された前記抗原を検出することができなかった（図２）。この結果から、少
なくとも酸で抽出した抗原は、タンパク質成分を含まない可能性が高く、すなわち、糖タ
ンパク質ではなく、糖鎖として存在している可能性が示された。
【0042】
ＩＩ型Ｌ． ｇａｒｖｉｅａｅのヒートショックによる抗原の抽出
次に抗原が酸処理以外の方法でも菌体から抽出されるかを検討した。ここではヒートシ
ョックによる菌体からの抗原の抽出方法を検討した。１２１９４１－Ｂ２４株及び１２１
９４１－Ｂ２４－５６株それぞれを生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）又は１０％ドデシル
硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）含有生理食塩水中に懸濁し６０℃～１００℃で３分間加熱後急
冷した。その上清を回収し、菌体の熱処理抽出物を得た。得られた熱処理抽出物をＳＤＳ
－ＰＡＧＥで分離したところ、１２１９４１－Ｂ２４株由来の抽出液で＜１１４ｋＤａの
スメアが検出された（図５Ａ、表２）。
次に抗原が酸処理以外の方法でも菌体から抽出されるかを検討した。ここではヒートシ
ョックによる菌体からの抗原の抽出方法を検討した。１２１９４１－Ｂ２４株及び１２１
９４１－Ｂ２４－５６株それぞれを生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）又は１０％ドデシル
硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）含有生理食塩水中に懸濁し６０℃～１００℃で３分間加熱後急
冷した。その上清を回収し、菌体の熱処理抽出物を得た。得られた熱処理抽出物をＳＤＳ
－ＰＡＧＥで分離したところ、１２１９４１－Ｂ２４株由来の抽出液で＜１１４ｋＤａの
スメアが検出された（図５Ａ、表２）。
【0043】
【表2】
【0044】
また、図５Ｂによると、１２１９４１株由来のヒートショック抽出物からもスメアが検
出された。
出された。
【0045】
このスメアを形成した抗原はアルシアンブルー染色で検出されていることから糖鎖であ
り、抽出が可能な温度は生理食塩水で８０℃～１００℃、１０％ＳＤＳ含有生理食塩水で
６０℃～１００℃であった。ＳＤＳの有無にかかわらず糖鎖の抽出が可能であったが、Ｓ
ＤＳ存在下の方がより低温でも抽出が可能である。この現象は界面活性剤が菌体表層に働
きかけることにより糖鎖抗原の遊離を促すためであると推察された。また、１２１９４１
－Ｂ２４－５６株では検出されず、１２１９４１－Ｂ２４株で検出されていることから、
免疫抗原である可能性が期待される。なお、ヒートショックでは抽出された抗原の分子量
が塩酸抽出の場合と比較して大きいものが含まれている。このことから、酸抽出した抗原
は低分子量の断片に分解されている一方で、ヒートショックで抽出したものが無傷に近い
状態で抽出されたためと推察される。
り、抽出が可能な温度は生理食塩水で８０℃～１００℃、１０％ＳＤＳ含有生理食塩水で
６０℃～１００℃であった。ＳＤＳの有無にかかわらず糖鎖の抽出が可能であったが、Ｓ
ＤＳ存在下の方がより低温でも抽出が可能である。この現象は界面活性剤が菌体表層に働
きかけることにより糖鎖抗原の遊離を促すためであると推察された。また、１２１９４１
－Ｂ２４－５６株では検出されず、１２１９４１－Ｂ２４株で検出されていることから、
免疫抗原である可能性が期待される。なお、ヒートショックでは抽出された抗原の分子量
が塩酸抽出の場合と比較して大きいものが含まれている。このことから、酸抽出した抗原
は低分子量の断片に分解されている一方で、ヒートショックで抽出したものが無傷に近い
状態で抽出されたためと推察される。
【0046】
糖鎖抗原保有株及び非保有株の免疫原性
糖鎖抗原を有する１２１９４１－Ｂ２４－１株及び糖鎖抗原を有しない１２１９４１－
Ｂ２４－５６株の不活化菌体を用いた免疫原性の評価を行った（図３）。その結果、攻撃
後のＰＢＳ投与対照群で生存率が０．０％であった一方で、糖鎖抗原が抽出できた１２１
９４１－Ｂ２４－１株不活性化菌体投与群では９３．３％と有意に高く、１２１９４１－
Ｂ２４－５６株不活性化菌体投与群では０．０％とＰＢＳ投与対照群と有意な差は認めら
れなかった。１２１９４１－Ｂ２４株から取得した１２１９４１－Ｂ２４－１株の不活化
菌体及び１２１９４１－Ｂ２４－５６株の不活化菌体の有効率を比較すると、１２１９４
１－Ｂ２４－１株不活性化菌体投与群では９３．３％、１２１９４１－Ｂ２４－５６株不
活性化菌体投与群では０．０％とその有効性に明確な違いが認められた。なお、生存率は
両菌株間で有意な差が認められている。この免疫原性の違いは酸又はヒートショックによ
り抽出された糖鎖の有無と一致しており、抽出された糖鎖がＩＩ型レンサ球菌の免疫原性
と関連することが示唆された。
糖鎖抗原を有する１２１９４１－Ｂ２４－１株及び糖鎖抗原を有しない１２１９４１－
Ｂ２４－５６株の不活化菌体を用いた免疫原性の評価を行った（図３）。その結果、攻撃
後のＰＢＳ投与対照群で生存率が０．０％であった一方で、糖鎖抗原が抽出できた１２１
９４１－Ｂ２４－１株不活性化菌体投与群では９３．３％と有意に高く、１２１９４１－
Ｂ２４－５６株不活性化菌体投与群では０．０％とＰＢＳ投与対照群と有意な差は認めら
れなかった。１２１９４１－Ｂ２４株から取得した１２１９４１－Ｂ２４－１株の不活化
菌体及び１２１９４１－Ｂ２４－５６株の不活化菌体の有効率を比較すると、１２１９４
１－Ｂ２４－１株不活性化菌体投与群では９３．３％、１２１９４１－Ｂ２４－５６株不
活性化菌体投与群では０．０％とその有効性に明確な違いが認められた。なお、生存率は
両菌株間で有意な差が認められている。この免疫原性の違いは酸又はヒートショックによ
り抽出された糖鎖の有無と一致しており、抽出された糖鎖がＩＩ型レンサ球菌の免疫原性
と関連することが示唆された。
【0047】
抽出された糖鎖がＩＩ型レンサ球菌の抗原となることは１２１９４１－Ｂ２４株が抗原
性を保有することからも支持される。１２１９４１－Ｂ２４株不活化菌体を用いてその免
疫効果を評価すると１２１９４１－Ｂ２４－１株と同様に高い免疫効果を保有することが
示された（図４）。ＰＢＳ投与対照群で生存率が０．０％であった一方で、１２１９４１
－Ｂ２４株不活化菌体投与群では生存率が９３．３％（有効率：９３．３％）と有意に高
い値を示した。この結果は糖鎖抗原が１２１９４１－Ｂ２４株からも抽出されたことと一
致する。以上の結果より、抽出された糖鎖抗原の有無がＩＩ型レンサ球菌の免疫原性の有
無に関連していることが示された。
性を保有することからも支持される。１２１９４１－Ｂ２４株不活化菌体を用いてその免
疫効果を評価すると１２１９４１－Ｂ２４－１株と同様に高い免疫効果を保有することが
示された（図４）。ＰＢＳ投与対照群で生存率が０．０％であった一方で、１２１９４１
－Ｂ２４株不活化菌体投与群では生存率が９３．３％（有効率：９３．３％）と有意に高
い値を示した。この結果は糖鎖抗原が１２１９４１－Ｂ２４株からも抽出されたことと一
致する。以上の結果より、抽出された糖鎖抗原の有無がＩＩ型レンサ球菌の免疫原性の有
無に関連していることが示された。
【0048】
糖鎖抗原の免疫効果
酸抽出物及びヒートショック抽出物の免疫効果を確認するため、酸抽出物又はヒートシ
ョック抽出物を投与した後ＩＩ型レンサ球菌に対する免疫効果を評価した（図６、図７）
。図６に示されるように、ＰＢＳ投与対照群の生存率は０．０％であった一方で、酸抽出
物投与群の生存率は３３．３％（有効率：３３．３％）であり、ＰＢＳ投与対照群よりも
有意に高い値を示した。さらに、図７に示されるように、ＰＢＳ投与対照群で５．０％の
生存率であった一方で、ヒートショック抽出物では４７．４％（有効率：４４．６％）と
ＰＢＳ投与対照群と比較して有意に高かった。以上の結果より、本実施例において抽出さ
れた糖鎖抗原はＩＩ型レンサ球菌の免疫抗原であり、菌体から遊離させてもなお高い免疫
効果を保持していることが示された。
酸抽出物及びヒートショック抽出物の免疫効果を確認するため、酸抽出物又はヒートシ
ョック抽出物を投与した後ＩＩ型レンサ球菌に対する免疫効果を評価した（図６、図７）
。図６に示されるように、ＰＢＳ投与対照群の生存率は０．０％であった一方で、酸抽出
物投与群の生存率は３３．３％（有効率：３３．３％）であり、ＰＢＳ投与対照群よりも
有意に高い値を示した。さらに、図７に示されるように、ＰＢＳ投与対照群で５．０％の
生存率であった一方で、ヒートショック抽出物では４７．４％（有効率：４４．６％）と
ＰＢＳ投与対照群と比較して有意に高かった。以上の結果より、本実施例において抽出さ
れた糖鎖抗原はＩＩ型レンサ球菌の免疫抗原であり、菌体から遊離させてもなお高い免疫
効果を保持していることが示された。
【0049】
結論
ＩＩ型レンサ球菌の免疫抗原についてはいまだ解明された報告はなく、その本体につい
ての知見は全く知られていない。本実施例ではＩＩ型レンサ球菌の抗原を抽出し、抽出物
に含まれる免疫原性を示す抗原の本体が糖鎖あるいは糖鎖に関連する因子であること及び
糖鎖が抽出後もなお高い免疫誘導能を保有することについて記述した。ＩＩ型レンサ球菌
の抗原を免疫誘導能を有する状態で抽出した報告はこれまでになされていない。
ＩＩ型レンサ球菌の免疫抗原についてはいまだ解明された報告はなく、その本体につい
ての知見は全く知られていない。本実施例ではＩＩ型レンサ球菌の抗原を抽出し、抽出物
に含まれる免疫原性を示す抗原の本体が糖鎖あるいは糖鎖に関連する因子であること及び
糖鎖が抽出後もなお高い免疫誘導能を保有することについて記述した。ＩＩ型レンサ球菌
の抗原を免疫誘導能を有する状態で抽出した報告はこれまでになされていない。
【0050】
参考文献
1. Moller, H. J., D. Heinegard, and J. H. Poulsen. 1993. Combined Alcian Blue an
d Silver Staining of Subnanogram Quantities of Proteoglycans and Glycosaminoglyc
ans in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gels. Analytical Biochemistry 209:
169-175.
2. Nakajima, T., R. Fujisawa, and Y. Kuboki. 1999. Sensitive Staining of Acidic
Dentin Proteins with Electrophoresis. Japanese Journal of Oral Biology 41: 137-1
41.
3. Oinaka, D., N. Yoshimura, Y. Fukuda, A. Yamashita, S. Urasaki, Y. Wada, and T
. Yoshida. 2015. Isolation of Lactococcus garvieae Showing No Agglutination with
Anti-KG- Phenotype Rabbit Serum. Fish Pathology 50: 37-43.
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d Silver Staining of Subnanogram Quantities of Proteoglycans and Glycosaminoglyc
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【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7】
