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特開2024-62909ＣａＭＫ２γタンパク質活性の阻害における化合物又はその薬用誘導体の使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024062909
(43)【公開日】2024-05-10
(54)【発明の名称】ＣａＭＫ２γタンパク質活性の阻害における化合物又はその薬用誘導体の使用
(51)【国際特許分類】
A61K 31/55 20060101AFI20240501BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240501BHJP
A61P 17/06 20060101ALI20240501BHJP
【ＦＩ】
A61K31/55
A61P43/00 111
A61P17/06
【審査請求】有
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022203696
(22)【出願日】2022-12-20
(31)【優先権主張番号】202211316391.9
(32)【優先日】2022-10-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(71)【出願人】
【識別番号】521557687
【氏名又は名称】孫 良丹
【氏名又は名称原語表記】ＳＵＮ Ｌｉａｎｇｄａｎ
【住所又は居所原語表記】２１８ Ｊｉｘｉ Ｒｏａｄ， Ｓｈｕｓｈａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｈｅｆｅｉ Ｃｉｔｙ， Ａｎｈｕｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ ２３００２２， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110002262
【氏名又は名称】ＴＲＹ国際弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】甄 ▲ち▼
(72)【発明者】
【氏名】陳 微微
(72)【発明者】
【氏名】王 義睿
(72)【発明者】
【氏名】李 卓
(72)【発明者】
【氏名】孫 良丹
【テーマコード（参考）】
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086CB11
4C086MA01
4C086MA02
4C086MA04
4C086MA05
4C086MA13
4C086MA27
4C086MA35
4C086MA37
4C086MA38
4C086MA52
4C086MA60
4C086MA66
4C086NA14
4C086ZA89
4C086ZC41
(57)【要約】 （修正有）
【課題】本発明は、タンパク質阻害薬の技術分野に属し、具体的には、ＣａＭＫ２γタンパク質活性の阻害における化合物又はその薬用誘導体の使用を提供する。
【解決手段】式Ｉで表される、化合物の使用を提供する。
【効果】本化合物は、従来の広域スペクトル免疫調節剤に比べてより強い標的化作用を有し、より正確、快速、有効、安全、安定的であり、ＣａＭＫ２γヒトタンパク質及びマウスタンパク質との結合力は非常に高く、従来の生物学的阻害剤に比べて保存されやすく、活性が安定し、分子量が小さく、生産コストが低く、吸収されやすい。
【選択図】図１３
【解決手段】式Ｉで表される、化合物の使用を提供する。
【効果】本化合物は、従来の広域スペクトル免疫調節剤に比べてより強い標的化作用を有し、より正確、快速、有効、安全、安定的であり、ＣａＭＫ２γヒトタンパク質及びマウスタンパク質との結合力は非常に高く、従来の生物学的阻害剤に比べて保存されやすく、活性が安定し、分子量が小さく、生産コストが低く、吸収されやすい。
【選択図】図１３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＣａＭＫ２γタンパク質活性の阻害における化合物又はその薬用誘導体の使用であって、前記化合物は、下式Ｉで表されることを特徴とする、使用。
【請求項2】
前記化合物は、薬学的に許容される塩の形態であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項3】
前記化合物は、薬学的に許容される酸付加塩の形態であることを特徴とする、請求項２に記載の使用。
【請求項4】
ＣａＭＫ２γタンパク質活性を阻害するための薬物における化合物又はその薬用誘導体の使用であって、前記化合物は、下式Ｉで表されることを特徴とする、使用。
【請求項5】
前記ＣａＭＫ２γタンパク質活性を阻害するための薬物は、乾癬病変組織のＣａＭＫ２γタンパク質活性を阻害する薬物であることを特徴とする、請求項４に記載の使用。
【請求項6】
前記化合物は、薬学的に許容される塩の形態であることを特徴とする、請求項４又は５に記載の使用。
【請求項7】
前記化合物は、薬学的に許容される酸付加塩の形態であることを特徴とする、請求項６に記載の使用。
【請求項8】
前記ＣａＭＫ２γタンパク質活性を阻害する薬物の剤形は、カプセル剤、錠剤、経口剤、マイクロカプセル剤、注射剤、坐剤、噴霧剤又は軟膏剤であることを特徴とする、請求項４，５，７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項9】
前記ＣａＭＫ２γタンパク質活性を阻害する薬物の剤形は、カプセル剤、錠剤、経口剤、マイクロカプセル剤、注射剤、坐剤、噴霧剤又は軟膏剤であることを特徴とする、請求項６に記載の使用。
【請求項10】
下式Ｉで表される化合物；並びに／或いは薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤を含む乾癬を治療するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、タンパク質阻害薬の技術分野に属し、具体的には、ＣａＭＫ２γタンパク質活性の阻害における化合物又はその薬用誘導体の使用に関する。
【背景技術】
【0002】
乾癬は、世界的に難治で罹患率の高い炎症性免疫疾患であり、現在の医療水準では完全に治すことはできない。臨床的には乾癬の治療方法が多く、ほとんどは免疫系に対する広範な阻害（例えば、ホルモンや免疫阻害剤の使用、いくつかの物理療法及び漢方薬の使用）を通じて症状を緩和している。しかし、これらの治療法では、広域スペクトルの対症療法は効果がないことが多く、病気の再発や他のシステムの損傷を容易に引き起こす恐れがある。近年、乾癬に対する高精度医療の開発により、従来の治療法の欠点がある程度補われた。多くの生物学的製剤の開発は、乾癬炎症経路の下流にあるエフェクター分子（例えば、ＩＬ－１７、ＴＮＦ－α及びＩＬ－２３など）を標的として乾癬の表現型を除去することに焦点を合わせている。
【0003】
従来の治療法と比較して、生物学的薬剤は、一定期間にわたって、乾癬患者の治癒率を様々な程度に高め、投与間隔が長く、服薬コンプライアンスが改善されるが、従来の治療法と同じ欠点がある。現在市場に出回っている乾癬に対する生物学的製剤はすべて、基本的に下流のエフェクター分子の効力を遮断することによって表現型を弱める対症療法であり、生物学的製剤の使用を半年以上中止すると、乾癬再発のリスクが大幅に高くなる問題がある。また、生物学的製剤は、高価であり、長期間服用する必要があり、途中で効果が弱まると、複数の生物学的製剤を併用する必要があるため、患者の経済的負担が大きくなる。
【0004】
つまり、現在の乾癬治療薬は、主に広域スペクトル免疫調節薬と標的薬の２種類に大別される。広域スペクトルの従来の免疫調節剤は、長期的な効果が理想的ではない一方、生物学的薬剤に代表される標的薬は、従来薬剤の有効性の欠如をある程度補ったが、生物学的薬剤は高価であり、適用基準が比較的高い。市販されている乾癬に対する他の標的薬（天然低分子または人工化合物）は種類が少なく、ほとんど乾癬の発症過程における下流エフェクター経路を標的としており、発症に重要なサイトカインＩＬ－１７及びその上流の起始経路に対する影響が小さい。その結果、このような対症療法は、乾癬の炎症経路の上流因子を妨害する療法と比較して、長期的な効果が不十分である可能性がある。
【0005】
そのため、従来の治療法及び生物学的薬剤と優位性が相互補完する新薬の開発は必要とされている。上記の薬物の欠如を補いつつも、薬物の有効性、標的化性、経済性、安全性、服薬コンプライアンスおよびその他の側面も考慮する必要がある。
【発明の概要】
【0006】
上記の問題に対して、本発明の目的は、ＣａＭＫ２γタンパク質活性の阻害における化合物又はその薬用誘導体の使用を提供することにある。この化合物は、ＣａＭＫ２γタンパク質の活性を阻害することにより、Ｉｌ－７Ａ、ＩＬ－１７Ｆ、ＴＮＦａ、ＩＬ２３Ａの生成が顕著に阻害され、ＩＭＱマウスの真皮γδＴ細胞中のＩＬ１７Ａ陽性細胞比が低下し、ＩＭＱマウスの炎症性表現型が顕著に改善される（乾癬症状が軽減される）。つまり、本発明の化合物は、乾癬の治療薬としてＩＭＱ誘導性乾癬様皮膚損傷を軽減する（ＰＡＳＩスコアを減少させる）ことができる。
【0007】
上記の目的を達成するために、本発明は、以下の技術的手段を採用する。
本発明の一態様では、ＣａＭＫ２γタンパク質活性の阻害における前記化合物又はその薬用誘導体の使用が提供される。この化合物の構造は、下式Ｉで表される。その分子式はＣ１９Ｈ２１Ｎ３Ｏ、分子量は３０７．３９である。
本発明の一態様では、ＣａＭＫ２γタンパク質活性の阻害における前記化合物又はその薬用誘導体の使用が提供される。この化合物の構造は、下式Ｉで表される。その分子式はＣ１９Ｈ２１Ｎ３Ｏ、分子量は３０７．３９である。
【0008】
本発明の別の態様では、ＣａＭＫ２γタンパク質活性を阻害するための薬物の製造における前記化合物又はその薬用誘導体の使用が提供される。
【0009】
本発明の別の態様では、乾癬を治療するための医薬組成物が提供される。前記医薬組成物は、少なくとも式Ｉで表される化合物；並びに／或いは薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤を含む。
【0010】
本発明の有益な効果は以下の通りである。
（１）本発明の化合物Ｉ（Ａｌｃａｆｔａｄｉｎｅ（アルカフタジン）；化合物ライブラリー番号：Ｔ２５３３）は、ＣａＭＫ２γタンパク質を標的とする活性低分子であり、それ又はそれを用いて製造された薬物は、乾癬の治療に使用され、従来の広域スペクトル免疫調節剤に比べてより強い標的化作用を有し、より正確、快速、有効、安全、安定的であり、ＣａＭＫ２γヒトタンパク質及びマウスタンパク質との結合力は非常に高く、結合定数がそれぞれ２．５４×１０－５Ｍ及び６．８４×１０－５Ｍと高い。
（２）本発明の化合物及びそれを用いて製造された薬物は、乾癬における結合阻害の標的部位がＣａＭＫ２γ経路の上流に位置し、従来の生物学的阻害剤（生物学的阻害剤は、いずれも乾癬免疫炎症経路の中下流に作用し、対症治療に属し、治療効果の維持が不安定で、ほとんど全ての生物学的製剤は、半年断薬後に再発率が大幅に増加する）に比べて炎症性サイトカインに対する遮断レベルがより高く、生物学的製剤に比べてより良い長期的な効果を有する。また、従来の生物学的製剤は、ほとんど全身注射薬物であり、他のシステムに影響を与える可能性が高いのに対し、本発明の化合物は、外用で吸収されやすく、全身投与による多くの副作用を回避することができ、安全性が高く、適用集団が広く、投薬が容易で、服薬コンプライアンスが良好である。
（３）本発明の化合物は、白色結晶低分子であり、液体形態である場合又は無色溶剤に溶解した場合、無色透明状態となるため、製剤化後の皮膚への外用の適用性と美観を高めることができる。
（１）本発明の化合物Ｉ（Ａｌｃａｆｔａｄｉｎｅ（アルカフタジン）；化合物ライブラリー番号：Ｔ２５３３）は、ＣａＭＫ２γタンパク質を標的とする活性低分子であり、それ又はそれを用いて製造された薬物は、乾癬の治療に使用され、従来の広域スペクトル免疫調節剤に比べてより強い標的化作用を有し、より正確、快速、有効、安全、安定的であり、ＣａＭＫ２γヒトタンパク質及びマウスタンパク質との結合力は非常に高く、結合定数がそれぞれ２．５４×１０－５Ｍ及び６．８４×１０－５Ｍと高い。
（２）本発明の化合物及びそれを用いて製造された薬物は、乾癬における結合阻害の標的部位がＣａＭＫ２γ経路の上流に位置し、従来の生物学的阻害剤（生物学的阻害剤は、いずれも乾癬免疫炎症経路の中下流に作用し、対症治療に属し、治療効果の維持が不安定で、ほとんど全ての生物学的製剤は、半年断薬後に再発率が大幅に増加する）に比べて炎症性サイトカインに対する遮断レベルがより高く、生物学的製剤に比べてより良い長期的な効果を有する。また、従来の生物学的製剤は、ほとんど全身注射薬物であり、他のシステムに影響を与える可能性が高いのに対し、本発明の化合物は、外用で吸収されやすく、全身投与による多くの副作用を回避することができ、安全性が高く、適用集団が広く、投薬が容易で、服薬コンプライアンスが良好である。
（３）本発明の化合物は、白色結晶低分子であり、液体形態である場合又は無色溶剤に溶解した場合、無色透明状態となるため、製剤化後の皮膚への外用の適用性と美観を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】ＣａＭＫ２γの結晶構造の模式図である。
【図2】バーチャルスクリーニングの作業プロセスの模式図である。
【図3a】ＣａＭＫ２γキナーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｖ９２０１）を用いてＣａＭＫ２γ低分子阻害剤を一次スクリーニングした検出結果ａである。
【図3b】ＣａＭＫ２γキナーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｖ９２０１）を用いてＣａＭＫ２γ低分子阻害剤を一次スクリーニングした検出結果ｂである。
【図3c】ＣａＭＫ２γキナーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｖ９２０１）を用いてＣａＭＫ２γ低分子阻害剤を一次スクリーニングした検出結果ｃである。
【図3d】ＣａＭＫ２γキナーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｖ９２０１）を用いてＣａＭＫ２γ低分子阻害剤を一次スクリーニングした検出結果ｄである。
【図3e】ＣａＭＫ２γキナーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｖ９２０１）を用いてＣａＭＫ２γ低分子阻害剤を一次スクリーニングした検出結果ｅである。
【図3f】ＣａＭＫ２γキナーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｖ９２０１）を用いてＣａＭＫ２γ低分子阻害剤を一次スクリーニングした検出結果ｆである。
【図3g】ＣａＭＫ２γキナーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｖ９２０１）を用いてＣａＭＫ２γ低分子阻害剤を一次スクリーニングした検出結果ｇである。
【図3h】ＣａＭＫ２γキナーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｖ９２０１）を用いてＣａＭＫ２γ低分子阻害剤を一次スクリーニングした検出結果ｈである。
【図3i】ＣａＭＫ２γキナーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｖ９２０１）を用いてＣａＭＫ２γ低分子阻害剤を一次スクリーニングした検出結果ｉである。
【図3j】ＣａＭＫ２γキナーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｖ９２０１）を用いてＣａＭＫ２γ低分子阻害剤を一次スクリーニングした検出結果ｊである。
【図3k】ＣａＭＫ２γキナーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｖ９２０１）を用いてＣａＭＫ２γ低分子阻害剤を一次スクリーニングした検出結果ｋである。
【図3l】ＣａＭＫ２γキナーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｖ９２０１）を用いてＣａＭＫ２γ低分子阻害剤を一次スクリーニングした検出結果ｌである。
【図3m】ＣａＭＫ２γキナーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｖ９２０１）を用いてＣａＭＫ２γ低分子阻害剤を一次スクリーニングした検出結果ｍである。
【図3n】ＣａＭＫ２γキナーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｖ９２０１）を用いてＣａＭＫ２γ低分子阻害剤を一次スクリーニングした検出結果ｎである。
【図4】Ｔ２５３３の核磁気共鳴スペクトルである。
【図5】Ｔ２５３３のＨＰＬＣスペクトルである。
【図6】Ｔ２５３３とＣａＭＫ２γタンパク質の相互作用の模式図である。
【図7】Ｔ２５３３とＣａＭＫ２γヒトタンパク質との親和力の検出状況である。
【図8】Ｔ２５３３とＣａＭＫ２γマウスタンパク質との親和力の検出状況である。
【図9】各処理群マウスのＰＡＳＩスコアである。
【図10】各処理群マウスの紅斑程度の統計状況である。
【図11】各処理群マウスの鱗屑程度の統計状況である。
【図12】各処理群マウスの皮膚厚さの統計状況である。
【図13】Ｔ２５３３を各処理群マウスに塗布した後のＩＭＱマウス表現型である。
【図14】各処理群マウスの皮膚病理の表現型である。
【図15】各処理群マウスの皮膚のフローサイトメトリー検出結果である。
【発明を実施するための形態】
【0012】
挙げられる実施例は、本発明をより良く説明するためのものであり、本発明の内容は挙げられる実施例に限定されない。したがって、当業者が上記の発明の概要に基づいて実施形態に加える非本質的な改良及び調整は、本発明の保護範囲に含まれる。
【0013】
本明細書で使用される用語は、特定の実施例を説明するためのものに過ぎず、本発明を制限するものではない。文脈が明らかに異なる意味を有しない限り、単数形の表現は複数形の表現を含む。本明細書で使用される「含む」、「有する」、「包含」などの用語は、特徴、数字、操作、部材、部品、素子、材料又はそれらの組み合わせの存在を示すことを意図している。本明細書に本発明の用語が開示され、他の特徴、数字、操作、部材、部品、素子、材料若しくはそれらの組み合わせが存在するか又は１つ若しくは複数追加できる可能性を排除することを意図していない。例えば、本明細書で使用される「／」は、状況に応じて「及び」又は「又は」と解釈することができる。
【0014】
本発明の実施例は、ＣａＭＫ２γタンパク質活性の阻害における前記化合物又はその薬用誘導体の使用が提供される。この化合物は、乾癬の治療薬として使用することができ、ＩＭＱマウス皮膚損傷における真皮γδＴにおけるＩＬ１７Ａ＋細胞を顕著に減少でき、ＩＭＱマウスの炎症性表現型を顕著に改善することができる。この化合物の構造は下式Ｉで示される。その分子式はＣ１９Ｈ２１Ｎ３Ｏ、分子量は３０７．３９である。
【0015】
なお、乾癬患者及びイミキモド誘導性乾癬マウスの単細胞トランスクリプトームシーケンシング、ＡＴＡＣシーケンシング、トランスクリプトミクス、遺伝学、ゲノミクスなどの研究により、遺伝学をもとに、様々な機能学技術を採用してタンパク質、細胞動物モデル及び組織サンプルレベルで感受性遺伝子ＣａＭＫ２γを解析した結果、皮膚中のＣａＭＫ２γは主に交感神経中で発現され、ＣａＭＫ２γは皮膚交感神経－ＮＥ－γδＴ－ＡＤＲＢ２－ｐ３８軸索によりγδＴ細胞でのＩＬ－１７の産生を促進し、乾癬炎症反応を悪化させることが分かった。ＣａＭＫ２γ経路は、乾癬の発生及び悪化において重要な役割を果たすことが実証されており、ＣａＭＫ２γ経路の活性を調節することによりイミキモドマウスモデルの乾癬様炎症性表現型を制御することができる。ＣａＭＫ２γは経路上流の起動者であり、乾癬においてＣａＭＫ２γタンパク質の下流タンパク質活性化能力を遮断することにより、経路の効果を効果的に遮断することができ、原則的には実行因子ＩＬ－１７のみを除去するよりも効果が強力で持続的である。従来の全身生物学的療法において、上流分子を遮断すると、関連経路が影響する他のシステムの異常を引き起こす可能性がある。
【0016】
本発明は、バーチャルスクリーニング及び実験検証方法に基づいて１５０万個の化合物を含むＣｈｅｍｄｉｖ及びＴａｒｇｅｔＭｏｌデータベースからスクリーニングして阻害活性を有する阻害剤Ｔ２５３３を得た。１５０万個の低分子化合物に対して複数のコンフォメーションを生成し、これらの化合物コンフォメーションとヒトＣａＭＫ２γタンパク質との親和力、ドラッガビリティスコア、構造多様性などの属性を測定し、最終的に実験検証によりＴ２５３３（上記式Ｉで表される化合物）はヒトＣａＭＫ２γタンパク質の阻害剤であることを確定した。
【0017】
また、上記化合物の薬用誘導体とは、母核構造を保留し、母核構造のもとに化合物構造を改変して得られた化合物を指す。構造を改変して得られた化合物は、ＣａＭＫ２γタンパク質活性を阻害する効果、又は化合物の活性を向上させ、薬物動態特性を改善するなどの効果を維持することができる。
【0018】
いくつかの具体的な実施例において、上記の使用では、化合物は、薬学的に許容される塩の形態である。なお、実際の投薬では、投薬の便利及び保存の便利を保証するために、化合物を薬学的に許容される塩の形態に製造することができる。
【0019】
いくつかの具体的な実施例において、上記の使用では、上記化合物は、薬学的に許容される酸付加塩の形式である。なお、上記化合物を薬学的に許容される塩の形態、好ましくは薬学的に許容される酸付加塩の形態に製造することにより、製造は素早く、便利である。もちろん、他の塩形成形態は除外されない。
【0020】
本発明の別の実施例では、ＣａＭＫ２γタンパク質活性を阻害するための薬物の製造における上記化合物又はその薬用誘導体の使用が提供される。
【0021】
いくつかの具体的な実施例において、上記の使用では、ＣａＭＫ２γタンパク質活性を阻害するための上記薬物は、乾癬病変組織のＣａＭＫ２γタンパク質活性を阻害する薬物である。具体的には、上記のように、遺伝学のもとに、様々な機能学技術によりタンパク質、細胞動物モデル及び組織サンプルのレベルで感受性遺伝子ＣａＭＫ２γを解析した実験により、皮膚中のＣａＭＫ２γは主に交感神経中で発現され、ＣａＭＫ２γは皮膚交感神経－ＮＥ－γδＴ－ＡＤＲＢ２－ｐ３８軸索によりγδＴ細胞でのＩＬ－１７の産生を促進し、乾癬炎症反応を悪化させることが分かった。上記化合物は、乾癬に対する特異性が高く、もたらす副作用が小さいことを示している。
【0022】
いくつかの具体的な実施例において、上記の使用では、上記化合物は、薬学的に許容される塩の形態である。上記のように、投薬の便利及び保存の便利を保証するために、化合物を薬学的に許容される塩の形態、好ましくは、薬学的に許容される酸付加塩の形態に製造することができる。
【0023】
いくつかの具体的な実施例において、上記の使用では、ＣａＭＫ２γタンパク質活性を阻害する上記薬物の剤形は、カプセル剤、錠剤、経口剤、マイクロカプセル剤、注射剤、坐剤、噴霧剤又は軟膏剤である。具体的には、当業者は投与経路及び投与対象などに応じて適切な剤形を選択することができる。
【0024】
本発明の別の実施例では、少なくとも式Ｉで表される化合物、並びに／或いは薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤を含む乾癬を治療するための医薬組成物が提供される。
【0025】
いくつかの具体的な実施例において、上記医薬組成物において、上記薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤は、溶液剤形、コロイド溶液剤形、乳剤剤形、懸濁剤形、気体分散剤形、微粒子分散剤形、固体分散剤形のうちのいずれか１種に適用される。
【0026】
なお、上記式Ｉで表される化合物は、より良好な治療効果を達成するために、乾癬を治療するための他の薬物と併用することができる。例えば、下流分子ＩＬ－１７又はＩＬ－２３を標的とする生物学的製剤と併用して投与することができる。このような併用投与により、生物学的製剤の最小有効用量を減少させ、他のシステムに対する生物学的製剤の影響をある程度軽減することができ、生物学的製剤の単独使用と比較して効果がより安定的で安全である。いくつかの具体的な実施例において、乾癬を治療するための上記薬物における化合物の有効成分の使用量は５ｍｇ／ｋｇであることが好ましい。
【0027】
本発明において、分子ドッキングスコアに基づいて、Ｃｈｅｍｄｉｖ及びＴａｒｇｅｔＭｏｌデータベースから４３０８３個の化合物のドッキング結果を保留した。そのうち、親和力が－１６ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満な化合物は１９個ある（ｃｈｅｍｄｉｖ）。低分子化合物の属性（例えば、７．４ｐＨ値での水溶性（ｌｏｇＳ）、脂質－水分配係数（ｌｏｇＰ）、分子量、分子の柔軟性、水素結合属性、アクセス可能な表面積（ＴＰＳＡ）、ＣＹＰ２Ｃ９酵素分解レベル、ｈＥＲＧ阻害率指標、経口投与利用率（ＨＩＡ）、薬物相互作用のリスク（２Ｄ６）などの指標、経口中枢神経系薬剤スコア関数（ＣＮＳ ＤｒｕｇＳｃｏｒｅ）、リピンスキーの法則（Ｌｉｐｉｎｓｋｉ Ｓｃｏｒｅ））を計算及び分析することにより、これらの化合物を評価、スコアリング、スクリーニングした。これらの化合物のうちの１０７２６個の化合物は、血液脳関門を通過することができ、そのＣＮＳドラッガビリティスコアは、ほとんど０．４未満であり、ドラッガビリティ属性は最適化される余地があることを示している。
【0028】
次に、親和力が－１１．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満で天然物ライブラリー及び薬剤ライブラリーに由来の化合物、並びに親和力が－１４ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満でＣｈｅｍＤｉｖライブラリーに由来の化合物を選択した。これらの化合物は、リピンスキーの法則スコアが０．５より大きく、ＣＮＳスコアが０．１より大きく、ＢＢＢスコアが－１より大きかった。最終的に６７８個の化合物を得た。６７８個の化合物からさらにドラッガビリティが良くない化合物（例えば、極性表面積（ＴＰＳＡ＞７０）、小腸吸収率が低い化合物（ＨＩＡ Ｃａｔｅｇｏｒｙ－）、代謝酵素により加水分解されやすい化合物（２Ｄ６値＝非常に高い）、及び心毒性の可能性があり（ｈＥＲＧ＞７）、分子量が５００より大きい化合物）を除去し、最終的に５７０個の化合物を保留した。構造類似性（閾値＝０．７）に基づいて得られた５７０個の化合物を合計７０群に分類した。各群の化合物から親和力が比較的高い化合物を選択して高親和で多様性を有する化合物（合計２９３個の化合物）を形成した。
【0029】
上記の化合物は、本項目でスクリーニングされた最終化合物であり、それらの多くの指標がドラッガビリティの要求を満たした。可能な活性化合物をさらに確定するために、スコアリング関数ｔｏｐ１００（ＣｈｅｍＤｉｖデータベース）及びｔｏｐ３０（ＴａｒｇｅｔＭｏｌデータベース）の化合物について活性試験を行った。親和力の大きさに応じて並べ替えて１３０個の（ＴＯＰ３０、ＴＯＰ１００）ＣａＭＫ２γの低分子阻害剤をスクリーニングした。最後に、ＣａＭＫ２γキナーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｖ９２０１）により阻害効果及びより安全な化合物をスクリーニングした。具体的には、以下のステップを含む。
【0030】
（１）ＣａＭＫ２γタンパク質の結晶構造を選択する具体的な過程
ＣａＭＫ２γの結晶構造を解析（２Ｖ７Ｏ，２ＵＸ０）することにより、タンパク質の触媒ドメインの３Ｄコンフォメーション及び十四量体及び生理学的十二量体状態でのＣａＭＫ２γの構造を明らかにした（図１）。２ＵＸ０によりＣａＭＫ２γのＲ３９５－Ａ５２１断片の六量体構造を解析した結果、この断片には欠失も変異もなかった。２Ｖ７ＯによりＣａＭＫ２γのＡ５－Ｇ３０２断片の３Ｄ構造を解析した結果、この構造には１つの変異部位Ｓ３６Ｐがあり、かつＡ２４部位の空間的な位置が不明であった。結晶構造の解析により一部の断片の３Ｄ構造のみを解析したため、ＡｌｐｈａＦｏｌｄによりヒトＣａＭＫ２γの全長構造モデルを構築した。このモデルの構造は、結晶構造と高度に一致する（ＲＭＳＤ：０．４５ ｔｏ ２ＵＸ０；ＲＭＳＭ：１．５８７ ｔｏ ２Ｖ７Ｏ）。そのため、後の阻害剤スクリーニング作業において、ＡｌｐｈａＦｏｌｄモデルをＣａＭＫ２γの３Ｄ構造モデルとして使用し、構造最適化及びプロトン化した後、その構造をスクリーニングのレセプターファイルとした。
ＣａＭＫ２γの結晶構造を解析（２Ｖ７Ｏ，２ＵＸ０）することにより、タンパク質の触媒ドメインの３Ｄコンフォメーション及び十四量体及び生理学的十二量体状態でのＣａＭＫ２γの構造を明らかにした（図１）。２ＵＸ０によりＣａＭＫ２γのＲ３９５－Ａ５２１断片の六量体構造を解析した結果、この断片には欠失も変異もなかった。２Ｖ７ＯによりＣａＭＫ２γのＡ５－Ｇ３０２断片の３Ｄ構造を解析した結果、この構造には１つの変異部位Ｓ３６Ｐがあり、かつＡ２４部位の空間的な位置が不明であった。結晶構造の解析により一部の断片の３Ｄ構造のみを解析したため、ＡｌｐｈａＦｏｌｄによりヒトＣａＭＫ２γの全長構造モデルを構築した。このモデルの構造は、結晶構造と高度に一致する（ＲＭＳＤ：０．４５ ｔｏ ２ＵＸ０；ＲＭＳＭ：１．５８７ ｔｏ ２Ｖ７Ｏ）。そのため、後の阻害剤スクリーニング作業において、ＡｌｐｈａＦｏｌｄモデルをＣａＭＫ２γの３Ｄ構造モデルとして使用し、構造最適化及びプロトン化した後、その構造をスクリーニングのレセプターファイルとした。
【0031】
（２）結合部位を選択する具体的な過程
ＭＯＥ－ｓｉｔｅ ｆｉｎｄｅｒを用いてこの標的部位上のｐｏｃｋｅｔ１を本バーチャルスクリーニングのドッキング領域として確定した。この領域の体積は４３１個の原子サイズの空間であり、１１０個の疎水性が比較的高い原子を含み、この領域は、ＡＴＰ結合部位Ｋ４３及び活性部位Ｄ１３６をさらに含む。Ｏｐｅｎｅｙｅ （Ｒｅｌｅａｓｅ ３．２．０．２）のａｐｏｐｄｂ２ｒｅｃｅｐｔｏｒツールを用いてバーチャルスクリーニングのレセプターファイルを処理及び生成し、分子のドッキング領域を定義した。この領域の長さ、幅及び高さは、それぞれ３２Ａ（オングストローム）ｘ２８．６７Ａｘ２１．６７Ａであり、体積は１９８７５Ａ３であり、そのｉｎｎｅｒ ｃｏｎｔｏｕｒの体積は１６４８Ａ３であった。
ＭＯＥ－ｓｉｔｅ ｆｉｎｄｅｒを用いてこの標的部位上のｐｏｃｋｅｔ１を本バーチャルスクリーニングのドッキング領域として確定した。この領域の体積は４３１個の原子サイズの空間であり、１１０個の疎水性が比較的高い原子を含み、この領域は、ＡＴＰ結合部位Ｋ４３及び活性部位Ｄ１３６をさらに含む。Ｏｐｅｎｅｙｅ （Ｒｅｌｅａｓｅ ３．２．０．２）のａｐｏｐｄｂ２ｒｅｃｅｐｔｏｒツールを用いてバーチャルスクリーニングのレセプターファイルを処理及び生成し、分子のドッキング領域を定義した。この領域の長さ、幅及び高さは、それぞれ３２Ａ（オングストローム）ｘ２８．６７Ａｘ２１．６７Ａであり、体積は１９８７５Ａ３であり、そのｉｎｎｅｒ ｃｏｎｔｏｕｒの体積は１６４８Ａ３であった。
【0032】
（３）コンピュータバーチャルスクリーニングのプロセス（図２）、低分子化合物ライブラリの確定、標的タンパク質を選択及び準備する具体的な過程
バーチャルスクリーニングのプロセス
ハードウェアは、Ｄｅｌｌ Ｔ７９１０ワークステーション、Ｕｂｕｎｔｕ ｋｙｌｉｎ１５．１０オペレーティングシステム、４０コアＣＰＵ、６４Ｇメモリ、５１２ＧのＳＳＤおよび４Ｔのストレージスペースである。ソフトウェアは、ＦＲＥＤ（Ｖｅｒ３．２．０．２）（親和力スクリーニング用のソフトウェア）である。レセプターファイルは、ＡＦモデルに基づくＣａＭＫ２γの３Ｄ構造及び確定されたスクリーニング領域である。化合物ライブラリは、処理した後のＣｈｅｍＤｉｖ、ＴａｒｇｅｔＭｏｌの天然物ライブラリー及び市販薬剤ライブラリーＬ１０００である。実行パラメータは、－ｓａｖｅ＿ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ＿ｓｃｏｒｅｓであり、ｔｒｕｅを選択し、－ｈｉｔｌｉｓｔ＿ｓｉｚｅを３０，０００に設定し、－ｄｏｃｋｅｄ＿ｍｏｌｅｃｕｌｅ＿ｆｉｌｅはｓｄｆ形式を選択し、他のパラメータはデフォルトパラメータである。
バーチャルスクリーニングのプロセス
ハードウェアは、Ｄｅｌｌ Ｔ７９１０ワークステーション、Ｕｂｕｎｔｕ ｋｙｌｉｎ１５．１０オペレーティングシステム、４０コアＣＰＵ、６４Ｇメモリ、５１２ＧのＳＳＤおよび４Ｔのストレージスペースである。ソフトウェアは、ＦＲＥＤ（Ｖｅｒ３．２．０．２）（親和力スクリーニング用のソフトウェア）である。レセプターファイルは、ＡＦモデルに基づくＣａＭＫ２γの３Ｄ構造及び確定されたスクリーニング領域である。化合物ライブラリは、処理した後のＣｈｅｍＤｉｖ、ＴａｒｇｅｔＭｏｌの天然物ライブラリー及び市販薬剤ライブラリーＬ１０００である。実行パラメータは、－ｓａｖｅ＿ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ＿ｓｃｏｒｅｓであり、ｔｒｕｅを選択し、－ｈｉｔｌｉｓｔ＿ｓｉｚｅを３０，０００に設定し、－ｄｏｃｋｅｄ＿ｍｏｌｅｃｕｌｅ＿ｆｉｌｅはｓｄｆ形式を選択し、他のパラメータはデフォルトパラメータである。
【0033】
ＣｈｅｍＤｉｖ、ＴａｒｇｅｔＭｏｌの天然物ライブラリー及び市販薬剤ライブラリーＬ１０００を本バーチャルスクリーニングのデータベースとした。ＣｈｅｍＤｉｖデータベースは、１５３５４７８個の化合物を含み、天然物ライブラリーは、１９７４６個の化合物を含み、市販薬剤ライブラリーは、２０４０個の化合物を含む。Ｏｐｅｎｅｙｅソフトウェアにおけるプラグインｏｍｅｇａ２（Ｖｅｒ３．０．１．２）は、化合物ライブラリーにおける各低分子化合物の複数のコンフォメーション構造を生成するために使用され、各低分子は、平均約５０個のコンフォメーションを産生する。
【0034】
標的タンパク質の準備
ＡｌｐｈａＦｏｌｄに基づいて構築されたヒトＣａＭＫ２Ｇの３Ｄモデルをプロトン化処理及び構造最適化によりレセプターファイルを作成し、ＭＯＥ－ｓｉｔｅ ｆｉｎｄｅｒによりこの標的部位上のＡＴＰ結合部位及び活性部位を含むｐｏｃｋｅｔ１領域を本バーチャルスクリーニングのドッキング領域として確定した。Ｏｐｅｎｅｙｅ（Ｒｅｌｅａｓｅ３．２．０．２）のａｐｏｐｄｂ２ｒｅｃｅｐｔｏｒツールは、バーチャルスクリーニングのレセプターファイルを処理して生成するために使用された。このファイルは、バーチャルスクリーニングのタンパク質構造ファイルとして使用された。
ＡｌｐｈａＦｏｌｄに基づいて構築されたヒトＣａＭＫ２Ｇの３Ｄモデルをプロトン化処理及び構造最適化によりレセプターファイルを作成し、ＭＯＥ－ｓｉｔｅ ｆｉｎｄｅｒによりこの標的部位上のＡＴＰ結合部位及び活性部位を含むｐｏｃｋｅｔ１領域を本バーチャルスクリーニングのドッキング領域として確定した。Ｏｐｅｎｅｙｅ（Ｒｅｌｅａｓｅ３．２．０．２）のａｐｏｐｄｂ２ｒｅｃｅｐｔｏｒツールは、バーチャルスクリーニングのレセプターファイルを処理して生成するために使用された。このファイルは、バーチャルスクリーニングのタンパク質構造ファイルとして使用された。
【0035】
（４）バーチャルスクリーニング計算の具体的な過程
（ａ）親和力計算及びバーチャルスクリーニングソフトウェアＦＲＥＤ（Ｖｅｒ３．２．０．２）を親和力スクリーニングのソフトウェアとして使用した。このソフトウェアは、各化合物の異なるコンフォメーションとＣａＭＫ２γとの親和力を計算するために使用された。リジッドドッキングアルゴリズムにより各コンフォメーションとＣａＭＫ２γのドッキング領域との相互作用を計算し、Ｃｈｅｍｇａｕｓｓ４を親和力を計算する力場とした。分子ドッキングスコアに基づいてＣｈｅｍｄｉｖ及びＴａｒｇｅｔＭｏｌデータベースから４３０８３個の化合物のドッキング結果を保留した。そのうち、親和力が－１６ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満な化合物は、１９個あった（ｃｈｅｍｄｉｖ）。
（ｂ）低分子化合物のドラッガビリティ属性の計算及びスクリーニング
化合物的水溶性（ｌｏｇＳ）、脂質－水分配係数（ｌｏｇＰ）、分子量、分子の柔軟性、水素結合属性、アクセス可能な表面積（ＴＰＳＡ）、ＣＹＰ２Ｃ９酵素分解レベル、ｈＥＲＧ阻害率指標、経口利用率（ＨＩＡ）、薬物相互作用のリスク（２Ｄ６）など、経口中枢神経系薬剤スコア関数（ＣＮＳ ＤｒｕｇＳｃｏｒｅ）、リピンスキーの法則（Ｌｉｐｉｎｓｋｉ Ｓｃｏｒｅ）を計算した。血液脳関門を通過可能な化合物を合計１０７２６個保留し、そのＣＮＳ ＤｒｕｇＳｃｏｒｅスコアは、ほとんど０．４未満であった。さらに、親和力が－１１．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満で天然物ライブラリー及び薬剤ライブラリーに由来の化合物、並びに親和力が－１４ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満でＣｈｅｍＤｉｖライブラリーに由来の化合物を選択した。これらの化合物は、リピンスキーの法則スコアが０．５より大きく、ＣＮＳスコアが０．１より大きく、ＢＢＢスコアが－１より大きかった。最終的に６７８個の化合物を得た。６７８個の化合物からさらにドラッガビリティが良くない化合物（例えば、極性表面積（ＴＰＳＡ＞７０）、小腸吸収率が低い化合物（ＨＩＡ Ｃａｔｅｇｏｒｙ－）、代謝酵素により加水分解されやすい化合物（２Ｄ６値＝非常に高い）、及び心毒性の可能性があり（ｈＥＲＧ＞７）、分子量が５００より大きい化合物）を除去し、最終的に５７０個の化合物を保留した。
（ｃ）構造類似性に基づいて化合物を分類して分析した。その構造類似性の閾値は０．７であった。得られた５７０個の化合物を合計７０群に分類した。各群の化合物から親和力が比較的高い化合物を選択して高親和で多様性を有する化合物（合計２９３個の化合物）を形成した。
（ａ）親和力計算及びバーチャルスクリーニングソフトウェアＦＲＥＤ（Ｖｅｒ３．２．０．２）を親和力スクリーニングのソフトウェアとして使用した。このソフトウェアは、各化合物の異なるコンフォメーションとＣａＭＫ２γとの親和力を計算するために使用された。リジッドドッキングアルゴリズムにより各コンフォメーションとＣａＭＫ２γのドッキング領域との相互作用を計算し、Ｃｈｅｍｇａｕｓｓ４を親和力を計算する力場とした。分子ドッキングスコアに基づいてＣｈｅｍｄｉｖ及びＴａｒｇｅｔＭｏｌデータベースから４３０８３個の化合物のドッキング結果を保留した。そのうち、親和力が－１６ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満な化合物は、１９個あった（ｃｈｅｍｄｉｖ）。
（ｂ）低分子化合物のドラッガビリティ属性の計算及びスクリーニング
化合物的水溶性（ｌｏｇＳ）、脂質－水分配係数（ｌｏｇＰ）、分子量、分子の柔軟性、水素結合属性、アクセス可能な表面積（ＴＰＳＡ）、ＣＹＰ２Ｃ９酵素分解レベル、ｈＥＲＧ阻害率指標、経口利用率（ＨＩＡ）、薬物相互作用のリスク（２Ｄ６）など、経口中枢神経系薬剤スコア関数（ＣＮＳ ＤｒｕｇＳｃｏｒｅ）、リピンスキーの法則（Ｌｉｐｉｎｓｋｉ Ｓｃｏｒｅ）を計算した。血液脳関門を通過可能な化合物を合計１０７２６個保留し、そのＣＮＳ ＤｒｕｇＳｃｏｒｅスコアは、ほとんど０．４未満であった。さらに、親和力が－１１．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満で天然物ライブラリー及び薬剤ライブラリーに由来の化合物、並びに親和力が－１４ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満でＣｈｅｍＤｉｖライブラリーに由来の化合物を選択した。これらの化合物は、リピンスキーの法則スコアが０．５より大きく、ＣＮＳスコアが０．１より大きく、ＢＢＢスコアが－１より大きかった。最終的に６７８個の化合物を得た。６７８個の化合物からさらにドラッガビリティが良くない化合物（例えば、極性表面積（ＴＰＳＡ＞７０）、小腸吸収率が低い化合物（ＨＩＡ Ｃａｔｅｇｏｒｙ－）、代謝酵素により加水分解されやすい化合物（２Ｄ６値＝非常に高い）、及び心毒性の可能性があり（ｈＥＲＧ＞７）、分子量が５００より大きい化合物）を除去し、最終的に５７０個の化合物を保留した。
（ｃ）構造類似性に基づいて化合物を分類して分析した。その構造類似性の閾値は０．７であった。得られた５７０個の化合物を合計７０群に分類した。各群の化合物から親和力が比較的高い化合物を選択して高親和で多様性を有する化合物（合計２９３個の化合物）を形成した。
【0036】
上記の化合物は、本項目でスクリーニングされた最終化合物であり、それらの多くの指標がドラッガビリティの要求を満たした。可能な活性化合物をさらに確定するために、ＣｈｅｍＤｉｖライブラリーから１００個の化合物を潜在的なＣａＭＫ２γ阻害剤として選択した（表１）。
【0037】
表１：１００個の潜在的なＣａＭＫ２γ阻害剤
【0038】
その後、ＴａｒｇｅｔＭｏｌデータベースから３０個の化合物を潜在的なＣａＭＫ２γ阻害剤として選択した（表２）。
【0039】
表２：３０個の潜在的なＣａＭＫ２γ阻害剤
【0040】
（５）ＣａＭＫ２γキナーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｖ９２０１）により阻害効果を有する化合物をスクリーニングした。
スクリーニングされた１３０個の化合物についてＣａＭＫ２γキナーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｖ９２０１）によりキナーゼ活性（％）を検出した。評価基準としてキナーゼ活性（％）を陽性対照（ＰＣ）と比較して、１３０個の低分子阻害剤から阻害効果が最も顕著（ｐ＜０．０００１）な低分子を理想的な候補阻害剤（即ち、本発明で使用される化合物Ｉ（Ｔ２５３３とも呼ばれる））として選択した。
スクリーニングされた１３０個の化合物についてＣａＭＫ２γキナーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｖ９２０１）によりキナーゼ活性（％）を検出した。評価基準としてキナーゼ活性（％）を陽性対照（ＰＣ）と比較して、１３０個の低分子阻害剤から阻害効果が最も顕著（ｐ＜０．０００１）な低分子を理想的な候補阻害剤（即ち、本発明で使用される化合物Ｉ（Ｔ２５３３とも呼ばれる））として選択した。
【0041】
上記方法により検出した後、各ウェルのキナーゼ活性（％）を計算し、１３０個の低分子阻害剤から阻害効果が最も顕著（ｐ＜０．０００１）な低分子を理想的な候補阻害剤として選択した。結果を図３ａ－図３ｎに示す。
【0042】
上記方法によりスクリーニングされた低分子化合物Ｉ（Ｔ２５３３とも呼ばれる）は、名称がＡｌｃａｆｔａｄｉｎｅ（アルカフタジン）、分子量が３０７．３９であり、構造式が式Ｉで表される。
【0043】
スクリーニングされた上記低分子化合物Ｉを特徴付けた。
（１）低分子化合物ＩをＮＭＲにより特徴付けた。結果は、図４に示すように、化合物構造と一致し、化合物構造が正しい。
（２）低分子化合物ＩをＨＰＬＣにより検出した。結果は、図５、表３（２５４ｎｍ）及び表４（２２０ｎｍ）に示すように、目的化合物の特性に一致する。
（１）低分子化合物ＩをＮＭＲにより特徴付けた。結果は、図４に示すように、化合物構造と一致し、化合物構造が正しい。
（２）低分子化合物ＩをＨＰＬＣにより検出した。結果は、図５、表３（２５４ｎｍ）及び表４（２２０ｎｍ）に示すように、目的化合物の特性に一致する。
【0044】
表３：２５４ｎｍ検出波長におけるＨＰＬＣ検出の検出結果
【0045】
表４：２２０ｎｍ検出波長におけるＨＰＬＣ検出の検出結果
【0046】
スクリーニングされた上記低分子化合物Ｉの合成経路は以下の通りである。
【0047】
以下の実施例において、データの統計分析方法は以下の通りである。ＳＰＳＳ２３．０及びＲＶｅｒｓｉｏｎ４．０．２バージョンのソフトウェア件を用いてデータ処理及び分析を行い、全ての検定は両側検定を使用し、Ｐ値が０．０５未満である場合、統計的有意性があると考えられる。
【0048】
本発明をより良く理解するために、以下、具体的な実施例により本発明の内容をさらに説明するが、本発明の内容は以下の実施例に限定されない。
【0049】
実施例１：Ｔ２５３３とＣａＭＫ２γタンパク質との相互作用パターン
本発明の実施例において、Ｔ２５３３とＣａＭＫ２γタンパク質が結合した後の構造を模擬した。まず、Ｓｙｂｙｌ－Ｘ２．１ソフトウェアのＳｕｒｆｌｅｘモジュールにより結合シミュレーションを２ラウンド回実行し、そして、ＣａＭＫ２γ上のＡｒｇ２４、Ｌｅｕ７２、Ａｓｎ７３などの複数のアミノ酸と複数の水素結合相互作用を形成し、手動スクリーニングとレビューを実行した。結果を図６に示す。Ｔ２５３３は、複数の疎水性アミノ酸（例えば、Ａｒｇ２４（側鎖の疎水性部分）、Ｌｙｓ２６（側鎖の疎水性部分）、Ｐｈｅ２７、Ｐｈｅ２８、Ｌｅｕ４０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ７１（側鎖の疎水性部分）及びＬｅｕ７２）と強い疎水性相互作用を形成した。また、化合物Ｔ２５３３と、Ｐｈｅ２７及びＰｈｅ２８とはπ－πスタッキング相互作用を形成した。疎水性π－πスタッキングなどの相互作用は、化合物Ｔ２５３３とタンパク質ＣＡＭＫ２γとの結合を共同で維持したことを示している。
本発明の実施例において、Ｔ２５３３とＣａＭＫ２γタンパク質が結合した後の構造を模擬した。まず、Ｓｙｂｙｌ－Ｘ２．１ソフトウェアのＳｕｒｆｌｅｘモジュールにより結合シミュレーションを２ラウンド回実行し、そして、ＣａＭＫ２γ上のＡｒｇ２４、Ｌｅｕ７２、Ａｓｎ７３などの複数のアミノ酸と複数の水素結合相互作用を形成し、手動スクリーニングとレビューを実行した。結果を図６に示す。Ｔ２５３３は、複数の疎水性アミノ酸（例えば、Ａｒｇ２４（側鎖の疎水性部分）、Ｌｙｓ２６（側鎖の疎水性部分）、Ｐｈｅ２７、Ｐｈｅ２８、Ｌｅｕ４０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ７１（側鎖の疎水性部分）及びＬｅｕ７２）と強い疎水性相互作用を形成した。また、化合物Ｔ２５３３と、Ｐｈｅ２７及びＰｈｅ２８とはπ－πスタッキング相互作用を形成した。疎水性π－πスタッキングなどの相互作用は、化合物Ｔ２５３３とタンパク質ＣＡＭＫ２γとの結合を共同で維持したことを示している。
【0050】
実施例２：Ｔ２５３３とＣａＭＫ２γヒトタンパク質は強い親和力を有する試験
本発明の実施例において、Ｔ２５３３とＣａＭＫ２γヒトタンパク質の親和力を検出した。まず、ｐＥＴ２８Ａベクターを用いてそれぞれヒト全長ＣａＭＫ２γタンパク質を発現して精製し、次に、Ｂｉａｃｏｒｅの表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ－ｐｌａｓｍｏｎｒｅｓｏｎａｎｃｅ，ＳＰＲ）法によりＣＭ５チップアミンカップリング法を用いて親和力を測定した。検出結果を図７に示す。結果は、Ｔ２５３３がヒトＣａＭＫ２γタンパク質に特異的に結合し、結合定数が２．５４×１０－５Ｍであり、結合能力が非常に強いことを示している。
本発明の実施例において、Ｔ２５３３とＣａＭＫ２γヒトタンパク質の親和力を検出した。まず、ｐＥＴ２８Ａベクターを用いてそれぞれヒト全長ＣａＭＫ２γタンパク質を発現して精製し、次に、Ｂｉａｃｏｒｅの表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ－ｐｌａｓｍｏｎｒｅｓｏｎａｎｃｅ，ＳＰＲ）法によりＣＭ５チップアミンカップリング法を用いて親和力を測定した。検出結果を図７に示す。結果は、Ｔ２５３３がヒトＣａＭＫ２γタンパク質に特異的に結合し、結合定数が２．５４×１０－５Ｍであり、結合能力が非常に強いことを示している。
【0051】
実施例３：Ｔ２５３３とＣａＭＫ２γマウスタンパク質は強い親和力を有する試験
本発明の実施例において、Ｔ２５３３とＣａＭＫ２γマウスタンパク質の親和力を検出した。まず、ｐＥＴ２８Ａベクターｗ用いてそれぞれマウス全長ＣａＭＫ２γタンパク質を発現して精製し、次にＢｉａｃｏｒｅの表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ－ｐｌａｓｍｏｎｒｅｓｏｎａｎｃｅ，ＳＰＲ）法によりＣＭ５チップアミンカップリング法を用いて親和能力を測定した。検出結果を図８に示す。結果は、Ｔ２５３３がマウスＣａＭＫ２γタンパク質に特異的に結合し、結合定数が６．８４×１０－５Ｍであり、結合能力が非常に強いことを示している。
本発明の実施例において、Ｔ２５３３とＣａＭＫ２γマウスタンパク質の親和力を検出した。まず、ｐＥＴ２８Ａベクターｗ用いてそれぞれマウス全長ＣａＭＫ２γタンパク質を発現して精製し、次にＢｉａｃｏｒｅの表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ－ｐｌａｓｍｏｎｒｅｓｏｎａｎｃｅ，ＳＰＲ）法によりＣＭ５チップアミンカップリング法を用いて親和能力を測定した。検出結果を図８に示す。結果は、Ｔ２５３３がマウスＣａＭＫ２γタンパク質に特異的に結合し、結合定数が６．８４×１０－５Ｍであり、結合能力が非常に強いことを示している。
【0052】
実施例４：Ｔ２５３３がＣａＭＫ２γタンパク質活性を効果的に阻害する試験
本発明の実施例において、ＣａＭＫ２γキナーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｖ９２０１）によりＣａＭＫ２γタンパク質活性に対するＴ２５３３の阻害状況を検出した。具体的な実験手順は、以下の通りである。
（１）ウェル配置：２つのブランクウェル、２つの正常反応ウェル、２つのＤＭＳＯ対照ウェル、４０個の阻害剤ウェル（各阻害剤について２つのウェルを用意する。２０個の阻害剤）、合計４６個のウェル。
本発明の実施例において、ＣａＭＫ２γキナーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｖ９２０１）によりＣａＭＫ２γタンパク質活性に対するＴ２５３３の阻害状況を検出した。具体的な実験手順は、以下の通りである。
（１）ウェル配置：２つのブランクウェル、２つの正常反応ウェル、２つのＤＭＳＯ対照ウェル、４０個の阻害剤ウェル（各阻害剤について２つのウェルを用意する。２０個の阻害剤）、合計４６個のウェル。
【0053】
（２）キナーゼ反応試薬の調製
（ａ）２００μｌの４Ｘキナーゼ緩衝液を調製し、１回あたりの実験は、２．５×２０＋６２．５＋６２．５＝１７５μｌが必要であり、残りは１Ｘキナーゼ緩衝液を調製してブランクウェルとして使用した（表５）。
（ａ）２００μｌの４Ｘキナーゼ緩衝液を調製し、１回あたりの実験は、２．５×２０＋６２．５＋６２．５＝１７５μｌが必要であり、残りは１Ｘキナーゼ緩衝液を調製してブランクウェルとして使用した（表５）。
【0054】
表５：キナーゼ緩衝液試薬
【0055】
（ｂ）１０μｌの５Ｘ阻害剤溶液（最終濃度１０μＭ）を調製した（２．５μｌ／ウェル）。阻害剤は１０ｍＭであり、ＤＭＳＯを用いて１：９の比率で１ｍＭに希釈した。ＤＭＳＯの調製方法は阻害剤と同じであった。ＤＭＳＯを対照ウェルとした（表６）。
【0056】
表６：阻害剤溶液試薬
【0057】
（ｃ）２５０μｌの２．５Ｘ ＡＴＰ／Ａｕｔｏｃａｍｔｉｄｅ－２（最終濃度２５μＭ ＡＴＰ，０．２μｇ／μｌ Ａｕｔｏｃａｍｔｉｄｅ－２）を調製した（５μｌ／ウェル）を調製した。ＡＴＰは１０ｍＭであり、水を用いて１：３９の比率で２５０μＭに希釈した。Ａｕｔｏｃａｍｔｉｄｅ－２を最初に解凍した後、チューブあたり２７０μｌに分注し、２回利用可能であった（表７）。
【0058】
表７：ＡＴＰ／Ａｕｔｏｃａｍｔｉｄｅ－２試薬
【0059】
（ｄ）２５０μｌの２．５Ｘ ＣａＭＫ２γ／Ｃａ２＋／カルモジュリン溶液（Calmodulin solution）ＩＩ（５ｎｇ ＣａＭＫ２γ／１２．５μｌ）に調製した（５μｌ／ウェル）。ＣａＭＫ２γを最初に解凍した後、チューブあたり２７０μｌに分注し、２回利用可能であった（表８）。
【0060】
表８：ＣａＭＫ２γ／Ｃａ２＋／カルモジュリン溶液ＩＩ試薬
【0061】
（２）以下の手順に従ってキナーゼ反応を行った。（ａ）下記のように試薬を試薬ウェルに添加した。ブランクウェル：７．５μｌの１Ｘキナーゼ緩衝液、正常反応ウェル：２．５μｌの１Ｘキナーゼ緩衝液＋５μｌの２．５Ｘ ＣａＭＫ２γ／Ｃａ２＋／カルモジュリン溶液ＩＩ、ＤＭＳＯ対照ウェル：２．５μｌの５Ｘ ＤＭＳＯ＋５μｌの２．５Ｘ ＣａＭＫ２γ／Ｃａ２＋／カルモジュリン溶液Ｉ、阻害剤ウェル：２．５μｌの５Ｘ阻害剤溶液＋５μｌの２．５Ｘ ＣａＭＫ２γ４／Ｃａ２＋／カルモジュリン溶液ＩＩ。（ｂ）ピペッティングして均一に混合し、室温で１０ｍｉｎインキュベートした。（ｃ）各ウェルに５μｌの２．５Ｘ ＡＴＰ／Ａｕｔｏｃａｍｔｉｄｅ－２を加えた。（ｄ）ピペッティングして均一に混合し、室温で６０ｍｉｎインキュベートした。（ｅ）ＡＤＰ－Ｇｌｏ反応：各ウェルに１２．５μｌのＡＤＰ－Ｇｌｏ試薬（ＡＤＰ－Ｇｌｏ試薬を最初に解凍した後、チューブあたり１２５０μｌに分注し、２回利用可能）を加えた。（ｆ）ピペッティングして均一に混合し、室温で４０ｍｉｎインキュベートした。（ｇ）各ウェルに２５μｌのキナーゼ検出試薬（キナーゼ検出試薬を最初に解凍した後、チューブあたり２５００μｌに分注し、２回利用可能）を加えた。（ｈ）ピペッティングして均一に混合し、室温で３０ｍｉｎインキュベートした。（ｉ）化学発光検出、積分時間：０．５－１ｓｅｃ。
【0062】
上記の手順に従って関連実験操作を完成し、検出装置で検出した後、各ウェルのキナーゼ活性（％）を分析して計算した結果、この化合物（Ｔ２５３３）はＣａＭＫ２γタンパク質の発現を効果的に低下させたことを見出した。
【0063】
実施例５：乾癬動物モデルにおいてＴ２５３３がＣａＭＫ２γタンパク質活性を効果的に阻害する試験
ＤＭＳＯでＴ２５３３粉末を溶解し、異なる使用量に応じて粉末を秤量し、次にβ－シクロデキストリンで希釈し、ＤＭＳＯの最終濃度は５％以下であった。設定されたＴ２５３３の用量勾配は、それぞれ０ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇであった。各マウスの体重を２０ｇとすると、各マウスに毎日０ｍｇ、０．０５ｍｇ、０．１ｍｇ、０．２ｍｇ投与する必要であった。
ＤＭＳＯでＴ２５３３粉末を溶解し、異なる使用量に応じて粉末を秤量し、次にβ－シクロデキストリンで希釈し、ＤＭＳＯの最終濃度は５％以下であった。設定されたＴ２５３３の用量勾配は、それぞれ０ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇであった。各マウスの体重を２０ｇとすると、各マウスに毎日０ｍｇ、０．０５ｍｇ、０．１ｍｇ、０．２ｍｇ投与する必要であった。
【0064】
７週齢のＣ５７／ＢＬ６マウスを選択し、飼育及びモデル構造は、いずれもＳＰＦグレードの環境行われた。実験グループは、以下の通りである。（１）イミキモド（ＩＭＱ）及び０ｍｇ／ｋｇのＴ２５３３を皮膚に塗布した。（２）ＩＭＱ及び２．５ｍｇ／ｋｇのＴ２５３３を皮膚に塗布した。（３）ＩＭＱ及び５ｍｇ／ｋｇのＴ２５３３を皮膚に塗布した。（４）ＩＭＱ及び１０ｍｇ／ｋｇのＴ２５３３を皮膚に塗布した。（５）ワセリン及び０ｍｇ／ｋｇのＴ２５３３を皮膚に塗布した。（６）ワセリン及び２．５ｍｇ／ｋｇのＴ２５３３を皮膚に塗布した。（７）ワセリン及び５ｍｇ／ｋｇのＴ２５３３を皮膚に塗布した。（８）ワセリン及び１０ｍｇ／ｋｇのＴ２５３３を皮膚に塗布した。
【0065】
上記の各群に６匹のマウスがあり、４ｃｍ２の皮膚が露出するようにマウス背部の毛を剃った。実験開始日をＤａｙ－２、終了日をＤａｙ４に設定した。Ｄａｙ２－Ｄａｙ３：毎日の朝晩にそれぞれ２００μｌの薬液をマウス皮膚に均一に塗布して吸収させた。Ｄａｙ０－Ｄａｙ３：毎日の正午に各マウスにＴ２５３３及び６２．５ｍｇのＩＭＱを塗布した。毎日マウス皮膚についてスコアリングし、Ｄａｙ４にマウスを安楽死させ、皮膚組織を取って一連の検出を行った。
【0066】
上記のＩＭＱモデルマウスのＰＡＳＩスコア結果及び紅斑、鱗屑、皮膚厚さの対応スコア結果をそれぞれ図９、図１０、図１１及び図１２に示す。皮膚表現型及び皮膚病理表現型をそれぞれ図１３及び図１４に示す。２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇの３つの用量のＴ２５３３は、異なる程度ＩＭＱマウスの炎症性表現型を軽減させ、そのうち、５ｍｇ／ｋｇ用量の軽減効果は最も顕著であり、２．５ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ用量の効果はそれほどではなかったが、全体的な効果には顕著な違いがなかった。
【0067】
次いで、上記各群マウスの皮膚リンパ球（マウス皮膚のリンパ球におけるＩＬ１７Ａ＋ｃｅｌｌ ｉｎ Ｄｅｒｍａｌ γδＴの比率；このような細胞は、乾癬におけるＣａＭＫ２γ経路に媒介される主なエフェクター細胞であり、大量のＩＬ－１７サイトカインを分泌して乾癬を悪化させることができる）を分離し、フローサイトメトリーにより検出した。結果を図１５に示す。Ｔ２５３３を使用しないＩＭＱマウスに比べ、５ｍｇ／ｋｇのＴ２５３３で処理したＩＭＱマウスは、ＩＬ１７Ａ＋ｃｅｌｌ ｉｎ Ｄｅｒｍａｌ γδＴの比率が顕著に低下した。既知の乾癬に密接に関連した炎症促進遺伝子（Ｉｌ１７ａ、Ｉｌ１７ｆ、Ｉｌ２２、Ｔｎｆａ及びＩｌ２３ａ）を定量ＰＣＲした。結果を図１６に示す。５ｍｇ／ｋｇのＴ２５３３で処理したマウス皮膚におけるＩｌ１７ａ、Ｉｌ１７ｆ、Ｔｎｆａ及びＩｌ２３ａの発現は顕著に低下し、Ｉｌ２２の発現は変化せず、２．５ｍｇ／ｋｇのＴ２５３３で処理したマウス皮膚におけるＩｌ１７ａ、Ｉｌ１７ｆの発現は顕著に低下し、Ｉｌ２２、Ｔｎｆａ及びＩｌ２３ａの発現は変化しなかった。
【0068】
以上の実施例は、本発明の技術的手段を説明するためのものに過ぎず、本発明を制限するものではない。好ましい実施例により本発明を詳しく説明したが、当業者が本発明の趣旨及び範囲から逸脱することがなく、本発明の技術的手段を修正又は同等置換することができる。これらの修正及び置換は、本発明の特許請求の範囲に含まれるべきである。
【図1】
【図2】
【図3a】
【図3b】
【図3c】
【図3d】
【図3e】
【図3f】
【図3g】
【図3h】
【図3i】
【図3j】
【図3k】
【図3l】
【図3m】
【図3n】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【手続補正書】
【提出日】2024-02-01
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＣａＭＫ２γタンパク質活性を阻害するための薬物の製造のための化合物の使用であって、前記化合物は、下式Ｉで表されることを特徴とする、使用。
【請求項2】
前記ＣａＭＫ２γタンパク質活性を阻害するための薬物は、乾癬病変組織のＣａＭＫ２γタンパク質活性を阻害する薬物であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項3】
前記化合物は、薬学的に許容される塩の形態であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項4】
前記化合物は、薬学的に許容される塩の形態であることを特徴とする、請求項２に記載の使用。
【請求項5】
前記化合物は、薬学的に許容される酸付加塩の形態であることを特徴とする、請求項３に記載の使用。
【請求項6】
前記化合物は、薬学的に許容される酸付加塩の形態であることを特徴とする、請求項４に記載の使用。
【請求項7】
前記ＣａＭＫ２γタンパク質活性を阻害する薬物の剤形は、カプセル剤、錠剤、経口剤、マイクロカプセル剤、注射剤、坐剤、噴霧剤又は軟膏剤であることを特徴とする、請求項１－６のいずれか１項に記載の使用。