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特開2024-63774７－ＡＤＣＡ製造のためのデアセトキシセファロスポリンＣの高濃度および高純度生産菌株およびこれを利用した製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024063774
(43)【公開日】2024-05-13
(54)【発明の名称】７－ＡＤＣＡ製造のためのデアセトキシセファロスポリンＣの高濃度および高純度生産菌株およびこれを利用した製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/31 20060101AFI20240502BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20240502BHJP
C07K 14/35 20060101ALI20240502BHJP
C07K 14/195 20060101ALI20240502BHJP
C12P 1/04 20060101ALI20240502BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240502BHJP
C12N 1/14 20060101ALI20240502BHJP
C12N 1/15 20060101ALN20240502BHJP
【ＦＩ】
C12N15/31
C12P21/02 C ZNA
C07K14/35
C07K14/195
C12P1/04 Z
C12N15/63 Z
C12N1/14 A
C12N1/15
【審査請求】有
【請求項の数】18
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2023182972
(22)【出願日】2023-10-25
(31)【優先権主張番号】10-2022-0139497
(32)【優先日】2022-10-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(71)【出願人】
【識別番号】517167247
【氏名又は名称】アミコージェン・インコーポレイテッド
【住所又は居所原語表記】１４－１０ ＷＯＲＡＳＡＮ－ＲＯ ９５０ ＢＥＯＮ－ＧＩＬ， ＭＵＮＳＡＮ－ＥＵＰ， ＪＩＮＪＵ－ＳＩ， ＧＹＥＯＮＧＳＡＮＧＮＡＭ－ＤＯ， ５２８４０， ＲＥＰＵＢＬＩＣ ＯＦ ＫＯＲＥＡ
(74)【代理人】
【識別番号】110001818
【氏名又は名称】弁理士法人Ｒ＆Ｃ
(72)【発明者】
【氏名】朴 哲
(72)【発明者】
【氏名】尹 榮晟
(72)【発明者】
【氏名】李 ▲ヒョン▼抒
(72)【発明者】
【氏名】崔 宴僖
(72)【発明者】
【氏名】姜 美淑
(72)【発明者】
【氏名】朴 雪梅
(72)【発明者】
【氏名】金 有美
(72)【発明者】
【氏名】李 智秀
(72)【発明者】
【氏名】李 紅仙
(72)【発明者】
【氏名】徐 東一
(72)【発明者】
【氏名】鄭 棟元
(72)【発明者】
【氏名】金 承基
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE20
4B064DA02
4B065AA50Y
4B065AA57X
4B065AA57Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA34
4B065CA44
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA11
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA15
(57)【要約】
【課題】デアセトキシセファロスポリンＣ（Ｄｅａｃｅｔｏｘｙ ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ Ｃ；ＤＡＯＣ）生産性を高め、副産物の生産性を低めることで、目的物質であるＤＡＯＣの純度が高い生産菌株の開発。
【解決手段】デアセトキシセファロスポリンＣ（Ｄｅａｃｅｔｏｘｙ ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ Ｃ；ＤＡＯＣ）生産能に優れた菌株およびその用途に関するものであって、改善されたＤＡＯＣ生産能を有する変異菌株およびその７－ＡＤＣＡ（７－Ａｍｉｎｏ ｄｅａｃｅｔｏｘｙ ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒａｎｉｃ ａｃｉｄ）の製造のための用途が提供される。
【選択図】図４
【解決手段】デアセトキシセファロスポリンＣ（Ｄｅａｃｅｔｏｘｙ ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ Ｃ；ＤＡＯＣ）生産能に優れた菌株およびその用途に関するものであって、改善されたＤＡＯＣ生産能を有する変異菌株およびその７－ＡＤＣＡ（７－Ａｍｉｎｏ ｄｅａｃｅｔｏｘｙ ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒａｎｉｃ ａｃｉｄ）の製造のための用途が提供される。
【選択図】図４
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（１）ストレプトマイセス・クラブリゲルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）のＣｅｆＤ蛋白質および
（２）アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）のＣｅｆＤ１蛋白質のＣ－末端の連続する８乃至１２個のアミノ酸を含むＣ－末端断片、
を含むポリペプチドまたはそれをコードする遺伝子を含むアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）変異菌株であって、
前記ＣｅｆＤ１蛋白質のＣ－末端断片は、ペルオキシソームターゲッティングシグナル１（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ １；ＰＴＳ１）を含み、前記ＣｅｆＤ蛋白質のＣ－末端に連結されたものである、
アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）変異菌株。
（２）アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）のＣｅｆＤ１蛋白質のＣ－末端の連続する８乃至１２個のアミノ酸を含むＣ－末端断片、
を含むポリペプチドまたはそれをコードする遺伝子を含むアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）変異菌株であって、
前記ＣｅｆＤ１蛋白質のＣ－末端断片は、ペルオキシソームターゲッティングシグナル１（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ １；ＰＴＳ１）を含み、前記ＣｅｆＤ蛋白質のＣ－末端に連結されたものである、
アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）変異菌株。
【請求項2】
前記ＣｅｆＤ蛋白質は、配列番号１で表されるものである、請求項１に記載のアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）変異菌株。
【請求項3】
前記ＣｅｆＤ１蛋白質のＣ－末端断片は、配列番号２で表されるものである、請求項１に記載のアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）変異菌株。
【請求項4】
前記ポリペプチドは、配列番号３で表されるものである、請求項１に記載のアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）変異菌株。
【請求項5】
前記ポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番号４で表されるものである、請求項１に記載のアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）変異菌株。
【請求項6】
下記から選択された一つ以上の変異を追加的に含む、請求項１に記載のアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）変異菌株：
ＣｅｆＥＦ遺伝子、ＣｅｆＧ遺伝子、またはこれら全ての欠損；および
外来のＣｅｆＥ遺伝子導入。
ＣｅｆＥＦ遺伝子、ＣｅｆＧ遺伝子、またはこれら全ての欠損；および
外来のＣｅｆＥ遺伝子導入。
【請求項7】
前記外来のＣｅｆＥ遺伝子は、マイコバクテリウム・アブセサス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｂｓｃｅｓｓｕｓ）、スフィンゴモナス・ドクドネンシス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｄｏｋｄｏｎｅｎｓｉｓ）、アミコラトプシス・ラクタムデュランス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓ）、ゴルドニア・ルブリペルティンクタ（Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｒｕｂｒｉｐｅｒｔｉｎｃｔａ）、マイクロバクテリウム・ハイドロカルボノキシダンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｏｘｙｄａｎｓ）、ナンノシスティス・エクセレンス（Ｎａｎｎｏｃｙｓｔｉｓ ｅｘｅｄｅｎｓ）、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｎｒｉｎｇａｅ）、およびストレプトマイセス・クラブリゲルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）からなる群より選択された１種以上のＣｅｆＥ遺伝子である、請求項６に記載のアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）変異菌株。
【請求項8】
受託番号ＫＣＴＣ１４９８９ＢＰである、請求項１に記載のアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）変異菌株。
【請求項9】
下記から選択された一つ以上の特徴を有する、請求項１～８のいずれか一項に記載のアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）変異菌株：
非改変菌株と比較して、デアセトキシセファロスポリンＣ（Ｄｅａｃｅｔｏｘｙ ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ Ｃ；ＤＡＯＣ）生産増加、
非改変菌株と比較して、デアセチルセファロスポリンＣ（Ｄｅａｃｅｔｙｌ ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ Ｃ；ＤＡＣ）生産減少、および
非改変菌株と比較して、ＤＡＣ／ＤＡＯＣ比率（％）減少。
非改変菌株と比較して、デアセトキシセファロスポリンＣ（Ｄｅａｃｅｔｏｘｙ ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ Ｃ；ＤＡＯＣ）生産増加、
非改変菌株と比較して、デアセチルセファロスポリンＣ（Ｄｅａｃｅｔｙｌ ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ Ｃ；ＤＡＣ）生産減少、および
非改変菌株と比較して、ＤＡＣ／ＤＡＯＣ比率（％）減少。
【請求項10】
請求項１～８のいずれか一項に記載のアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）変異菌株を含む、デアセトキシセファロスポリンＣ（Ｄｅａｃｅｔｏｘｙ ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ Ｃ；ＤＡＯＣ）生産用組成物。
【請求項11】
請求項１～８のいずれか一項に記載のアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）変異菌株を培養する段階を含む、デアセトキシセファロスポリンＣ（Ｄｅａｃｅｔｏｘｙ ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ Ｃ；ＤＡＯＣ）生産方法。
【請求項12】
請求項１～８のいずれか一項に記載のアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）変異菌株、前記変異菌株の培養物、前記培養物の培養培地、および前記培養物または培養培地から分離されたＤＡＯＣからなる群より選択された１種以上を含む、７－ＡＤＣＡ（７－Ａｍｉｎｏ ｄｅａｃｅｔｏｘｙ ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒａｎｉｃ ａｃｉｄ）生産用組成物。
【請求項13】
請求項１～８のいずれか一項に記載のアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）変異菌株の培養物、前記培養物の培養培地、または前記培養物または培養培地から分離されたＤＡＯＣにＣＰＣ（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ Ｃ）アシラーゼを処理する段階を含む、７－ＡＤＣＡ（７－Ａｍｉｎｏ ｄｅａｃｅｔｏｘｙ ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒａｎｉｃ ａｃｉｄ）生産方法。
【請求項14】
配列番号３で表される、ポリペプチド。
【請求項15】
請求項１４に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項16】
配列番号４で表される、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項17】
配列番号３で表されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項18】
配列番号３で表されるポリペプチド、
前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および
前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター
からなる群より選択された１種以上を含む、改善されたＤＡＯＣ生産能を有する菌株製造用組成物。
前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および
前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター
からなる群より選択された１種以上を含む、改善されたＤＡＯＣ生産能を有する菌株製造用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、デアセトキシセファロスポリンＣ（Ｄｅａｃｅｔｏｘｙ ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ Ｃ；ＤＡＯＣ）生産能に優れた菌株およびその用途に関するものであって、改善されたＤＡＯＣ生産能を有する変異菌株およびその７－ＡＤＣＡ（７－Ａｍｉｎｏ ｄｅａｃｅｔｏｘｙ ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒａｎｉｃ ａｃｉｄ）の製造のための用途に関するものである。
【背景技術】
【0002】
セファロスポリンＣ（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ Ｃ、以下、「ＣＰＣ」）は、ベータ－ラクタム（ｂｅｔａ－ｌａｃｔａｍ）系抗生物質として、糸状菌カビであるアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）のような一部の微生物により生産される。ＣＰＣは、グラム陰性細菌に対して細胞壁合成阻害を通じて抗生活性を示すが、その程度が非常に微弱であるため、主に半合成セファロスポリン系抗生剤（ｓｅｍｉ－ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、以下、「セファロスポリン系抗生剤」）の原料物質を製造することに利用されている。
【0003】
セファロスポリン系抗生剤の原料物質は、主に７－アミノセファロスポラン酸（７－ａｍｉｎｏ ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒａｎｉｃ ａｃｉｄ、以下、「７－ＡＣＡ」と略称する）、デアセチル７－アミノセファロスポラン酸（Ｄｅａｃｅｔｙｌ ７－ａｍｉｎｏ ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒａｎｉｃ ａｃｉｄ、以下、「Ｄ－７－ＡＣＡ」と略称する）、７－アミノデアセトキシセファロスポラン酸（７－Ａｍｉｎｏ ｄｅａｃｅｔｏｘｙ ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒａｎｉｃ ａｃｉｄ、以下、「７－ＡＤＣＡ」と略称する）などに区分することができる。
【0004】
現在、７－ＡＤＣＡを生産するための産業的生産法としてペニシリンのベータラクタム環であるペナム（ｐｅｎａｍ）環をセファロスポリン系のセフェム（ｃｅｐｈｅｍ）環に拡張させる化学転換法が使用される。特に、７－ＡＤＣＡの製造において、前記セフェム環への拡張に関与する化学転換法にトルエンなどの有機溶媒が使用されて多量の有毒廃棄物が発生して環境汚染および廃水処理費用が増加するという大きい短所があった。
【0005】
既存のＤＡＯＣを高濃度で生産する組換え菌株の場合、ＤＡＯＣ生産中に生成される副産物であるデアセチルセファロスポリンＣ（Ｄｅａｃｅｔｙｌ ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ Ｃ；ＤＡＣ）により純度が落ちるという短所があった。
【0006】
したがって、ＤＡＯＣ生産性を高め、副産物の生産性を低めることで、目的物質であるＤＡＯＣの純度が高い生産菌株の開発が要求される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】大韓民国登録特許第１０－２１９４７４０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本出願では、デアセトキシセファロスポリンＣ（Ｄｅａｃｅｔｏｘｙ ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ Ｃ；ＤＡＯＣ）生産能に優れた菌株およびその用途が提供される。
【0009】
一例は、新規なＤＡＯＣ生産菌株を提供する。一例で前記ＤＡＯＣ生産菌株は、ストレプトマイセス・クラブリゲルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）由来のアミノトランスフェラーゼが導入されたアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）変異菌株でありうる。前記アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）変異菌株は、ＤＡＯＣ生産能を有するものでありうる。
【0010】
他の例は、アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）菌株にストレプトマイセス・クラブリゲルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子を導入する段階を含む、ＤＡＯＣ生産能が改善されたアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）菌株の製造方法および／またはアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）菌株のＤＡＯＣ生産能改善方法を提供する。
【0011】
他の例は、前記アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）変異菌株を培養する段階を含む、ＤＡＯＣ生産方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本出願では、改善されたデアセトキシセファロスポリンＣ（Ｄｅａｃｅｔｏｘｙ ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ Ｃ；ＤＡＯＣ）生産能を有する変異菌株およびその用途が提供される。前記変異菌株は、ＤＡＯＣ生産能が高いだけでなく、副産物（例えば、デアセチルセファロスポリンＣ（Ｄｅａｃｅｔｙｌ ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ Ｃ；ＤＡＣ）など）の生産量が少なくてＤＡＯＣの純度が高いことを特徴とするものでありうる。
【0013】
用語の定義
本明細書において、ポリヌクレオチド（「遺伝子または核酸分子」と互換可能に使用される）またはポリペプチド（「蛋白質または酵素」と互換可能に使用される）が「特定の核酸配列またはアミノ酸配列を含む」または「特定の核酸配列またはアミノ酸配列から（必須で）なる」または「特定の核酸配列またはアミノ酸配列で表示される」とは、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが前記特定の核酸配列またはアミノ酸配列を必須で有することを意味し得、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの本来の機能および／または目的とする機能を維持する範囲で前記特定の核酸配列またはアミノ酸配列に変異（欠失、置換、改変、および／または付加）が加えられた「実質的に同等な配列」を含むもの（または前記変異を排除しないもの）と解釈され得る。
本明細書において、ポリヌクレオチド（「遺伝子または核酸分子」と互換可能に使用される）またはポリペプチド（「蛋白質または酵素」と互換可能に使用される）が「特定の核酸配列またはアミノ酸配列を含む」または「特定の核酸配列またはアミノ酸配列から（必須で）なる」または「特定の核酸配列またはアミノ酸配列で表示される」とは、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが前記特定の核酸配列またはアミノ酸配列を必須で有することを意味し得、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの本来の機能および／または目的とする機能を維持する範囲で前記特定の核酸配列またはアミノ酸配列に変異（欠失、置換、改変、および／または付加）が加えられた「実質的に同等な配列」を含むもの（または前記変異を排除しないもの）と解釈され得る。
【0014】
一例において、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが「特定の核酸配列またはアミノ酸配列を含む」または「特定の核酸配列またはアミノ酸配列から（必須で）なるまたは表示される」とは、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが
（ｉ）前記特定の核酸配列またはアミノ酸配列を必須で含むか、または
（ｉｉ）前記特定の核酸配列またはアミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、または９９．９％以上（場合により１００％が除外され得る）の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有するアミノ酸配列からなるかまたはこれを必須で含み、前記特定の配列の元来の機能および／または目的とする機能を維持することを意味し得る。一例において、目的とする機能は、宿主細胞にＤＡＯＣ生産能を付与したり宿主細胞のＤＡＯＣ生産能を増加させるもの、および／またはＤＡＯＣ生産時の副産物を減少させるものでありうる。
（ｉ）前記特定の核酸配列またはアミノ酸配列を必須で含むか、または
（ｉｉ）前記特定の核酸配列またはアミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、または９９．９％以上（場合により１００％が除外され得る）の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有するアミノ酸配列からなるかまたはこれを必須で含み、前記特定の配列の元来の機能および／または目的とする機能を維持することを意味し得る。一例において、目的とする機能は、宿主細胞にＤＡＯＣ生産能を付与したり宿主細胞のＤＡＯＣ生産能を増加させるもの、および／またはＤＡＯＣ生産時の副産物を減少させるものでありうる。
【0015】
本明細書において、用語「配列同一性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、与えられた核酸配列またはアミノ酸配列と一致する程度を意味し、百分率（％）で表示され得る。核酸配列に対する同一性の場合、例えば、文献によるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（参照：ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ， Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０， ５８７３， １９９３）またはＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（参照：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １８３， ６３， １９９０）などを使用して決定することができる。このようなアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（参照：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）。
【0016】
本明細書において、 用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、後に出る数値と同等または類似の範囲の数値を全て含むための表現であり、後に出る数値を基準に、±１０、±９、±８、±７、±６、±５、±４、±３、±２、±１、±０．５、±０．４、±０．３、±０．２、±０．１、±０．０５、または±０．０１の範囲を含むものと解釈され得るが、これに制限されるのではない。
【0017】
アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）は、セファロスポリン合成経路を有しており、最終産物はＣＰＣ（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ Ｃ）である。ＣＰＣは、前駆体である Ｌ－２－アミノアジピン（Ｌ－２－ａｍｉｎｏａｄｉｐａｔｅ）、Ｌ－システイン（Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、Ｌ－バリン（Ｌ－ｖａｌｉｎｅ）からＮ－［（５Ｓ）－５－アミノ－５－カルボキシルペンタノイル］－Ｌ－システイニル－Ｄ－バリン（Ｎ－［（５Ｓ）－５－ａｍｉｎｏ－５－ｃａｒｂｏｘｙｌｐｅｎｔａｎｏｙｌ］－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｙｌ－Ｄ－ｖａｌｉｎｅ）を経てイソペニシリンＮ（ｉｓｏｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ Ｎ）、ペニシリンＮ（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ Ｎ）に転換され、その後、ＣｅｆＥＦ遺伝子がコードする拡張酵素（エキスパンダーゼ（ｅｘｐａｎｄａｓｅ）、またはＤＡＯＣシンターゼ（ｓｙｎｔｈａｓｅ））の触媒を受けてペナム（ｐｅｎａｍ）環がセフェム（ｃｅｐｈｅｍ）環に変換されてセファロスポリン系前駆体であるＤＡＯＣとなる。
【0018】
デアセトキシセファロスポリンＣ（Ｄｅａｃｅｔｏｘｙ ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ Ｃ；ＤＡＯＣ）は、次の化学式１で表され得、セファロスポリン系抗生剤の中間体である７－ＡＤＣＡ（７－Ａｍｉｎｏ ｄｅａｃｅｔｏｘｙ ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒａｎｉｃ ａｃｉｄ；化学式２）の前駆物質である。
【化1】
【化2】
【0019】
本明細書において、用語「ＤＡＯＣ」は、ＤＡＯＣ（Ｄｅａｃｅｔｏｘｙ ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ Ｃ）および／またはその薬学的に許容可能な塩を意味するものと解釈され得る。また、用語「ＡＤＣＡ」は、ＡＤＣＡ（７－Ａｍｉｎｏ ｄｅａｃｅｔｏｘｙ ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒａｎｉｃ ａｃｉｄ）および／またはその薬学的に許容可能な塩を意味するものと解釈される。
【0020】
本明細書において、改善されたＤＡＯＣ生産能は、ＤＡＯＣ生産増加、ＤＡＯＣ生産中に生成される副産物であるデアセチルセファロスポリンＣ（Ｄｅａｃｅｔｙｌ ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ Ｃ；ＤＡＣ）生産減少、ＤＡＣ／ＤＡＯＣ比率（％）減少などからなる群より選択された一つ以上を意味するものでありうる。
【0021】
本明細書において、「微生物の培養物」という表現は、微生物を培地で培養して得られるものを意味し得る。培養物の状態には制限がない。例えば、培養物は、液体培養物および／または固体培養物でありうるが、これに制限されない。
【0022】
本明細書において、「培養培地（ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）」は、微生物の培養物から得るか、微生物を培地で培養した後に得ることができる。前記培養培地は、培養された微生物により生産および／または分泌される物質を含むことができる。一具体例で、前記培養培地は、培養物から微生物が除去された無細胞培養物を含むことができるが、これに制限されない。
【0023】
以下、本発明をより詳しく説明する。
【0024】
一例は、新規なデアセトキシセファロスポリンＣ（Ｄｅａｃｅｔｏｘｙ ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ Ｃ；ＤＡＯＣ）生産菌株を提供する。
【0025】
一例において、前記ＤＡＯＣ生産菌株は、ストレプトマイセス・クラブリゲルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）由来のアミノトランスフェラーゼまたはそれをコードする遺伝子を含むアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）変異菌株でありうる。前記ＤＡＯＣ生産菌株は、非改変菌株と比較して改善されたＤＡＯＣ生産能を有するものでありうる。本明細書で「改善されたまたは優れたＤＡＯＣ生産能」は、高いＤＡＯＣ生産量および／または高いＤＡＯＣ純度（低い副産物生産量）を意味するものでありうる。したがって、前記ＤＡＯＣ生産菌株は、非改変菌株と比較して、ＤＡＯＣ生産量が多いおよび／またはＤＡＣのような副産物の生産量が少ないため、ＤＡＯＣの純度が高いことを特徴とするものでありうる。
【0026】
一具体例で、前記ストレプトマイセス・クラブリゲルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）由来のアミノトランスフェラーゼは、ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｃｌａｓｓ Ｖ－ｆｏｌｄ ＰＬＰ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｚｙｍｅ（ＣｅｆＤ；ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＷＰ＿００３９５２４９４．１；３９８ａａ；配列番号１）でありうるが、これに制限されるのではない。
【0027】
他の例で、前記ストレプトマイセス・クラブリゲルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）由来のアミノトランスフェラーゼは、宿主細胞であるアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）でイソペニシリンＮ（ｉｓｏｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ Ｎ）をペニシリンＮ（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ Ｎ）に変換する酵素、例えば、イソペニシリンＮ－ＣｏＡ－シンセターゼ（ｉｓｏｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ Ｎ－ＣｏＡ－ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ；ＣｅｆＤ１；ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＣＡＤ４５６２５．１；６０９ａａ）のＣ－末端断片を追加的に含むことができる。前記Ｃ－末端断片は、アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）のイソペニシリンＮ－ＣｏＡ－シンセターゼのＣ－末端の３乃至３０個、３乃至２０個、３乃至１５個、３乃至１２個、３乃至１０個、５乃至３０個、５乃至２０個、５乃至１５個、５乃至１２個、５乃至１０個、８乃至３０個、８乃至２０個、８乃至１５個、８乃至１２個、または８乃至１０個の連続するアミノ酸を含むものであり得、前記連続するアミノ酸は、ペルオキシソームターゲッティングシグナル１（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ １；ＰＴＳ１）である３個のアミノ酸（Ｃ末端の３個のアミノ酸；ＰＲＬ）を含むものでありうる。一具体例で、前記ＰＴＳ１を含むＣ－末端断片は、配列番号２（ＳＧＱＳＡＡＲＰＲＬ）を含むものでありうるが、これに制限されるのではない。前記ＰＴＳ１を含むＣ－末端断片は、前記ストレプトマイセス・クラブリゲルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）由来のアミノトランスフェラーゼのＣ－末端に連結されたものでありうる。
【0028】
前記ストレプトマイセス・クラブリゲルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）由来のアミノトランスフェラーゼおよびＰＴＳ１を含むＣ－末端断片を含むポリペプチドは、配列番号３で表され得るが、これに制限されるのではない。
【0029】
一具体例で、前記アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）変異菌株は、宿主細胞としてのアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）にストレプトマイセス・クラブリゲルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）由来のアミノトランスフェラーゼおよびＰＴＳ１を含むＣ－末端断片を含むポリペプチド（例えば、配列番号３のアミノ酸配列）をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを導入させた形質転換体でありうる。前記形質転換体において、前記導入されたポリヌクレオチドの存在形態には特別な制限がない。例えば、前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞のゲノムまたは染色体内に挿入（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）されるか、ゲノムおよび／または染色体外部で独自に複製および／または発現されるものでありうるが、これに制限されるのではない。前記核酸配列は、アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）に最適化したコドンを含むものであり得、一具体例において配列番号４で表され得るが、これに制限されるのではない。前記組換えベクターは、アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）内で発現可能な発現ベクターでありうる。
【0030】
前記宿主細胞としてのアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）は、セファロスポリン系抗生剤の原料物質のうちの一つである７－ＡＤＣＡの前駆体であるデアセトキシセファロスポリンＣ（Ｄｅａｃｅｔｏｘｙ ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ Ｃ；ＤＡＯＣ）生産能を有する微生物であり、野生型菌株または変異型菌株でありうる。前記宿主細胞としての変異型菌株は、ＤＡＯＣ生産能を増加させるための変異が導入されたアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）菌株でありうる。
【0031】
一例において、前記ＤＡＯＣ生産能を増加させるための変異は、下記から選択された一つ以上でありうるが、これに制限されるのではない：
ＣｅｆＥＦおよび／またはＣｅｆＧ遺伝子の欠損；および
外来のＣｅｆＥ遺伝子導入。
ＣｅｆＥＦおよび／またはＣｅｆＧ遺伝子の欠損；および
外来のＣｅｆＥ遺伝子導入。
【0032】
前記外来のＣｅｆＥ遺伝子は、アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）以外の多様な微生物由来のＣｅｆＥ遺伝子を意味するものであり、例えば、アミコラトプシス・ラクタムデュランス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓ）、ゴルドニア・ルブリペルティンクタ（Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｒｕｂｒｉｐｅｒｔｉｎｃｔａ）、マイコバクテリウム・アブセサス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｂｓｃｅｓｓｕｓ）、マイクロバクテリウム・ハイドロカルボノキシダンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｏｘｙｄａｎｓ）、ナンノシスティス・エクセレンス（Ｎａｎｎｏｃｙｓｔｉｓ ｅｘｅｄｅｎｓ）、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｎｒｉｎｇａｅ）、ストレプトマイセス・クラブリゲルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）、スフィンゴモナス・ドクドネンシス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｄｏｋｄｏｎｅｎｓｉｓ）などからなる群より選択された１種以上（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、または９種）の微生物のＣｅｆＥ遺伝子でありうるが、これに制限されるのではない。
【0033】
一例において、前記アミコラトプシス・ラクタムデュランス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓ）由来のＣｅｆＥ遺伝子はＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＩＤ Ｚ１３９７４．１、ゴルドニア・ルブリペルティンクタ（Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｒｕｂｒｉｐｅｒｔｉｎｃｔａ）由来のＣｅｆＥ遺伝子はＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＩＤ ＣＰ０２２５８０．１、マイコバクテリウム・アブセサス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｂｓｃｅｓｓｕｓ）由来のＣｅｆＥ遺伝子はＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＩＤ ＦＶＰＭ０１００００２６．１、マイクロバクテリウム・ハイドロカルボノキシダンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｏｘｙｄａｎｓ）由来のＣｅｆＥ遺伝子はＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＩＤ ＪＹＪＢ０１００００１０．１、ナンノシスティス・エクセレンス（Ｎａｎｎｏｃｙｓｔｉｓ ｅｘｅｄｅｎｓ）由来のＣｅｆＥ遺伝子はＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＩＤ ＦＯＭＸ０１００００１８．１、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｎｒｉｎｇａｅ）由来の遺伝子はＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＩＤ ＡＯＪＴ０１００１４６９．１、ストレプトマイセス・クラブリゲルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）由来の遺伝子はＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＩＤ ＤＳ５７０６２４．１、スフィンゴモナス・ドクドネンシス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｄｏｋｄｏｎｅｎｓｉｓ）由来のＣｅｆＥ遺伝子はＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＩＤ ＮＢＢＩ０１０００００５．１の核酸配列を含むものでありうるが、これに制限されるのではない。
【0034】
一具体例で、前記外来のＣｅｆＥ遺伝子は、マイコバクテリウム・アブセサス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｂｓｃｅｓｓｕｓ）のＣｅｆＥ遺伝子（配列番号５）、スフィンゴモナス・ドクドネンシス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｄｏｋｄｏｎｅｎｓｉｓ）のＣｅｆＥ遺伝子（配列番号６）、またはこれらの組み合わせでありうるが、これに制限されるのではない。
【0035】
他の例で、本明細書で提供されるアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）変異菌株は、前述したように配列番号３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターの導入による変異に加えて、下記から選択された一つ以上の変異を追加的に含むものでありうる：
ＣｅｆＥＦおよび／またはＣｅｆＧ遺伝子の欠損；および
外来のＣｅｆＥ遺伝子導入。
ＣｅｆＥＦおよび／またはＣｅｆＧ遺伝子の欠損；および
外来のＣｅｆＥ遺伝子導入。
【0036】
前記外来のＣｅｆＥ遺伝子は、前述したとおりである。
【0037】
本明細書で「遺伝子の欠損」は、菌株の染色体配列で確認されるＣｅｆＥＦおよび／またはＣｅｆＧのそれぞれの遺伝子配列の一部または全部（つまり、開始コドンから終止コドンまで）を除去することを意味し得るが、これに制限されるのではない。
【0038】
一具体例で、前記アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）変異菌株は、受託番号ＫＣＴＣ １４９８９ＢＰが付与された菌株でありうるが、これに制限されるのではない。
【0039】
本明細書で提供されるアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）変異菌株は、ＤＡＯＣ生産能を有するものでありうる。前記アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）変異菌株は、非改変菌株と比較して、改善されたＤＡＯＣ生産能（ＤＡＯＣ生産増加および／またはＤＡＯＣ純度増加（例、ＤＡＣ生産減少（例えば、ＤＡＣ／ＤＡＯＣ比率（％）減少）））および／または増加された７－ＡＤＣＡ生性能を有するものでありうる。前記非改変菌株は、野生型アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）菌株または前述した変異、例えば、配列番号３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターによる変異が導入されていないアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）菌株を意味するものでありうる。
【0040】
他の例は、前記アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）変異菌株および／または前記菌株の培養物または培養培地を含む、ＤＡＯＣおよび／または７－ＡＤＣＡの生産用組成物を提供する。
【0041】
他の例は、アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）菌株にストレプトマイセス・クラブリゲルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）由来のアミノトランスフェラーゼおよびＰＴＳ１を含むＣ－末端断片を含むポリペプチド（例えば、配列番号３のアミノ酸配列）をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを導入する段階を含む、ＤＡＯＣ生産能が改善されたアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）菌株の製造方法および／またはアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）菌株のＤＡＯＣ生産能改善方法を提供する。前記製造されたアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）菌株は、ストレプトマイセス・クラブリゲルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）由来のアミノトランスフェラーゼおよびＰＴＳ１を含むＣ－末端断片を含むポリペプチド（例えば、配列番号３のアミノ酸配列）をコードする核酸配列が導入されていないアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）菌株と比較して改善されたＤＡＯＣ生産能を有する。
【0042】
前記方法は、前記ポリヌクレオチドを導入する段階の前、後、または同時に、下記から選択された一つ以上の段階を追加的に含むことができる：
ＣｅｆＥＦおよび／またはＣｅｆＧ遺伝子の欠損；および
外来のＣｅｆＥ遺伝子導入。
ＣｅｆＥＦおよび／またはＣｅｆＧ遺伝子の欠損；および
外来のＣｅｆＥ遺伝子導入。
【0043】
前記外来のＣｅｆＥ遺伝子は、前述したとおりである。
【0044】
他の例は、前記アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）変異菌株を培養する段階を含む、デアセトキシセファロスポリンＣ（Ｄｅａｃｅｔｏｘｙ ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ Ｃ；ＤＡＯＣ）の生産方法を提供する。前記培養する段階は、ＤＡＯＣ生産が可能な培地および／または条件で行われるものでありうる。前記方法は、前記培養する段階の後に、前記培養物または培養培地からＤＡＯＣを回収（または分離）する段階を追加的に含むことができる。
【0045】
本明細書で提供されるアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）変異菌株は、改善されたＤＡＯＣ生産能を有する。一例において、前記アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）変異菌株は、非改変菌株と比較して、ＤＡＯＣ生産能が３％以上、５％以上、７％以上、１０％以上、１２％以上、または１５％以上増加したものでありうる。
【0046】
他の例で、前記アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）変異菌株は、
ＤＡＣ／ＤＡＯＣ（％）が１０％以下、９．５％以下、９％以下、８．５％以下、８％以下、７．５％以下、７％以下、６．５％以下、６％以下、５．５％以下、５％以下、４．５％以下、４％以下、３．９％以下、３．８％以下、３．７％以下、３．６％以下、または３．５％以下であるか、および／または
ＤＡＣ／ＤＡＯＣ（％）が非改変菌株のＤＡＣ／ＤＡＯＣ（％）（１００％）の９０％以下、８５％以下、８０％以下、７５％以下、７０％以下、６５％以下、６０％以下、５５％以下、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３９％以下、３８％以下、３７％以下、３６％以下、または３５％以下であるものでありうるが、これに制限されるのではない。
ＤＡＣ／ＤＡＯＣ（％）が１０％以下、９．５％以下、９％以下、８．５％以下、８％以下、７．５％以下、７％以下、６．５％以下、６％以下、５．５％以下、５％以下、４．５％以下、４％以下、３．９％以下、３．８％以下、３．７％以下、３．６％以下、または３．５％以下であるか、および／または
ＤＡＣ／ＤＡＯＣ（％）が非改変菌株のＤＡＣ／ＤＡＯＣ（％）（１００％）の９０％以下、８５％以下、８０％以下、７５％以下、７０％以下、６５％以下、６０％以下、５５％以下、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３９％以下、３８％以下、３７％以下、３６％以下、または３５％以下であるものでありうるが、これに制限されるのではない。
【0047】
他の例は、アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）変異菌株、前記変異菌株の培養物、前記培養物の培養培地、および前記培養物および／または培養培地から回収（分離、精製）されたＤＡＯＣからなる群より選択された１種以上を含む７－ＡＤＣＡ（７－Ａｍｉｎｏ ｄｅａｃｅｔｏｘｙ ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒａｎｉｃ ａｃｉｄ）生産用組成物を提供する。
【0048】
他の例は、アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）変異菌株、前記変異菌株の培養物、前記培養物の培養培地、および前記培養物および／または培養培地から回収（分離、精製）されたＤＡＯＣからなる群より選択された１種以上を含む組成物の７－ＡＤＣＡ（７－Ａｍｉｎｏ ｄｅａｃｅｔｏｘｙ ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒａｎｉｃ ａｃｉｄ）の生産のための用途を提供する。
【0049】
他の例は、
前記アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）変異菌株の培養物、培養培地またはこれから回収（分離、精製）されたＤＡＯＣにＣＰＣ（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ Ｃ）アシラーゼを処理する段階、
を含む７－ＡＤＣＡ（７－Ａｍｉｎｏ ｄｅａｃｅｔｏｘｙ ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒａｎｉｃ ａｃｉｄ）の生産方法を提供する。
前記アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）変異菌株の培養物、培養培地またはこれから回収（分離、精製）されたＤＡＯＣにＣＰＣ（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ Ｃ）アシラーゼを処理する段階、
を含む７－ＡＤＣＡ（７－Ａｍｉｎｏ ｄｅａｃｅｔｏｘｙ ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒａｎｉｃ ａｃｉｄ）の生産方法を提供する。
【0050】
前記方法は、ＣＰＣアシラーゼを処理する段階の前に、前記アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）変異菌株を培養する段階を追加的に含むことができる。前記培養する段階は、前述したとおりであり、培養物または培養培地からＤＡＯＣを回収する段階を追加的に含むことができる。
【0051】
前記ＤＡＯＣ培養液にＣＰＣアシラーゼを処理する段階は、ＣＰＣアシラーゼを利用した転換反応を通じて７－ＡＤＣＡを製造する段階である。前記ＣＰＣアシラーゼを利用した転換反応は、通常、振盪培養または回転機による回転のような呼気性条件下で行われ得る。一具体例で、転換反応は、５乃至３０℃の温度条件および／または１分乃至３００分、例えば、１分乃至１２０分間の時間条件下で行われ得るが、これに制限されるのではない。反応ｐＨは、３．０乃至９．０の範囲で維持することができ、無機または有機酸、アルカリ溶液、尿素、カルシウムカーボネート、アンモニアなどで適切に調節することができる。
【0052】
前記７－ＡＤＣＡ生産方法は、前記ＣＰＣアシラーゼを処理する段階の後に反応液から７－ＡＤＣＡを回収（分離、収穫、精製または収集）する段階を追加的に含むことができる。具体的に、７－ＡＤＣＡの回収は、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧、乾燥、蒸発、沈澱、結晶化、電気泳動、分別溶解（例えば硫酸アンモニウム沈澱）、クロマトグラフィー（例えばイオン交換、親和性、疎水性およびサイズ排除）などの方法で行われ得るが、これに制限されるのではない。
【0053】
他の例は、ストレプトマイセス・クラブリゲルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）由来のアミノトランスフェラーゼ（例えば、配列番号１）およびＰＴＳ１を含むＣ－末端断片を含むポリペプチド（例えば、配列番号３のアミノ酸配列）を提供する。
【0054】
他の例は、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。前記ポリヌクレオチドは、配列番号４の核酸配列を含むものでありうる。
【0055】
他の例は、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
【0056】
他の例は、
ストレプトマイセス・クラブリゲルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）由来のアミノトランスフェラーゼ（例えば、配列番号１）およびＰＴＳ１を含むＣ－末端断片を含むポリペプチド（例えば、配列番号３のアミノ酸配列）、
前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号４）、および
前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター（発現ベクター）
からなる群より選択された１種以上のＤＡＯＣ生産菌株の製造および／またはＤＡＯＣ生産能の改善のための用途を提供する。
ストレプトマイセス・クラブリゲルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）由来のアミノトランスフェラーゼ（例えば、配列番号１）およびＰＴＳ１を含むＣ－末端断片を含むポリペプチド（例えば、配列番号３のアミノ酸配列）、
前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号４）、および
前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター（発現ベクター）
からなる群より選択された１種以上のＤＡＯＣ生産菌株の製造および／またはＤＡＯＣ生産能の改善のための用途を提供する。
【0057】
より具体的に、
ストレプトマイセス・クラブリゲルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）由来のアミノトランスフェラーゼ（例えば、配列番号１）およびＰＴＳ１を含むＣ－末端断片を含むポリペプチド（例えば、配列番号３のアミノ酸配列）、
前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号４）、および
前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター（発現ベクター）
からなる群より選択された１種以上を含むＤＡＯＣ生産菌株の製造および／またはＤＡＯＣ生産能改善のための組成物を提供する。
ストレプトマイセス・クラブリゲルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）由来のアミノトランスフェラーゼ（例えば、配列番号１）およびＰＴＳ１を含むＣ－末端断片を含むポリペプチド（例えば、配列番号３のアミノ酸配列）、
前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号４）、および
前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター（発現ベクター）
からなる群より選択された１種以上を含むＤＡＯＣ生産菌株の製造および／またはＤＡＯＣ生産能改善のための組成物を提供する。
【0058】
前記ＤＡＯＣ生産菌株は、アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）であり得、前記ＤＡＯＣ生産能の改善は、アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）のＤＡＯＣ生産能の改善でありうる。
【0059】
本明細書に記載された核酸配列は、コドンの縮重性（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）により目的とするポリペプチドを発現させようとする微生物、例えば、アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）で好まれるコドンを考慮して、コーディング領域から発現する蛋白質のアミノ酸配列および／または機能を変化させない範囲内でコーディング領域に多様な改変が行われ得る。
【0060】
前記ポリヌクレオチドまたはベクターの導入は、公知の形質転換方法を当業者が適切に選択して行うことができる。本明細書において、用語「形質転換」は、標的蛋白質（外来蛋白質）をコードする核酸分子を含むベクターを宿主細胞内に導入して宿主細胞内で前記核酸分子がコードする蛋白質が発現することができるようにすることを意味する。形質転換された核酸分子は、宿主細胞内で発現さえできれば、宿主細胞の染色体内に挿入されるおよび／または染色体外に位置することができる。また、前記核酸分子は、標的蛋白質をコードするＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含む。前記核酸分子は、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、その導入される形態は制限がない。例えば、前記核酸分子は、独自に発現するのに必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）の形態で宿主細胞に導入され得る。前記発現カセットは、通常、前記核酸分子に作動可能に連結されているプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、転写終結信号、リボソーム結合部位および／または翻訳終結信号などの発現調節要素を含むことができる。前記発現カセットは、自己複製が可能な発現ベクターの形態でありうる。また、前記核酸分子は、それ自体の形態で宿主細胞のゲノムに導入されて宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されるものであり得る。前記で用語「作動可能に連結」されるものとは、発現調節要素が目的蛋白質（外来蛋白質）をコードする核酸分子の転写調節（例、転写開始）を行うことができるように発現調節要素（例、プロモーター）と核酸分子が機能的に連結されていることを意味し得る。作動可能な連結は、当業界における公知の遺伝子組換え技術を利用して行うことができ、例えば、通常の部位特異的ＤＮＡ切断および連結により行われ得るが、これに制限されない。
【0061】
前記ポリヌクレオチドを宿主細胞に形質転換（導入）する方法は、核酸分子を細胞（微生物）内に導入する如何なる方法でも遂行可能であり、宿主細胞により当該分野で公知の形質転換技術を適切に選択して行うことができる。前記公知の形質転換方法としてエレクトロポレーション法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈澱法、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈澱法、マイクロインジェクション法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈澱法（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｕｐｔａｋｅ）、ＤＥＡＥ－デキストラン法、陽イオンリポゾーム法、リポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）、酢酸リチウム－ＤＭＳＯ法、ヒートショク（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ）法、パーティクル・ガン法（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｇｕｎ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、シリコン炭化物ウィスカー（Ｓｉｌｉｃｏｎ ｃａｒｂｉｄｅ ｗｈｉｓｋｅｒｓ）、超音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）などが例示され得るが、これに制限されるのではない。
【0062】
本明細書において、用語「ベクター」は、適切な宿主内で目的蛋白質を発現させることができるように適切な調節配列に作動可能に連結された前記目的蛋白質をコードする核酸分子の塩基配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。前記調節配列は、転写を開始できるプロモーター、転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、および／または転写および／または解読の終結を調節する配列を含むことができる。ベクターは、適当な宿主微生物内に形質転換された後、宿主微生物のゲノムと関係なく発現したり、宿主微生物のゲノム内に組み込まれ得る。
【0063】
本明細書で使用可能なベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば特に限定されず、通常使用される全てのベクターの中から選択され得る。通常使用されるベクターの例としては、天然状態または組換えられた状態のプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージなどが挙げられる。例えば、前記ベクターとして、ファージベクターまたはコスミドベクターとしてはｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、およびＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを使用することができ、プラスミドベクターとしてはｐＢＣ系（例、ｐＢＣ－ＫＳ（＋））、ｐＢＲ系（例、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５）、ｐＵＣ系（例、ｐＵＣ１１８およびｐＵＣ１１９）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系、ｐＥＴ系（例、ｐＥＴ－２２ｂ（＋））、バチルスサブチリス由来プラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５）などを使用することができるが、これに制限されない。
【0064】
前記ベクターは、前記染色体内挿入の有無を確認するための選別マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）を追加的に含むことができる。前記選別マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選別、つまり、前記ポリヌクレオチドの挿入有無を確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面蛋白質の発現のような選択可能表現型を付与する遺伝子の中から選択して使用することができる。選択剤（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）が処理された環境では選別マーカーを発現する細胞だけが生存したり他の表現形質を示すため、形質転換された細胞を選別することができる。
【発明の効果】
【0065】
本明細書では、ＣｅｆＤ核酸配列およびＰＴＳ１核酸配列とのハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）を最初に行っており、前記ＣｅｆＤ－ＰＴＳ１融合遺伝子をアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）に導入することにより、ＣｅｆＤ１、ＣｅｆＤ２、チオエステラーゼ（ｔｈｉｏｅｓｔｅｒａｓｅ）が作用する段階を一段階に縮小して代謝経路を最適化し、ＤＡＯＣ生産過程で不純物であるＤＡＣの含有量を画期的に減少させ、目的産物であるＤＡＯＣ生産能を有意水準に増加させることができる。
【図面の簡単な説明】
【0066】
【図1】ｐＢ－ＨＦＤ７ｐｘの切断地図を示す。
【図2】一実施例による変異菌株のＤＡＯＣ生産量（ｇ／Ｌ）とＤＡＯＣ生産過程の不純物であるＤＡＣの比率（ＤＡＣ／ＤＡＯＣ、％）を示すグラフである。
【図3】一実施例による変異菌株の培養期間に応じたＤＡＯＣ生産量（ｇ／Ｌ）を示すグラフである。
【図4】一実施例による変異菌株の培養期間に応じたＤＡＯＣとＤＡＯＣ生産過程の不純物であるＤＡＣとの比率（ＤＡＣ／ＤＡＯＣ、％）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0067】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これは例示的なものに過ぎず、本発明の範囲を制限しようとするものではない。下記に記載された実施例は、発明の本質的な要旨を逸脱しない範囲で変形可能であることは当業者に自明である。
【0068】
実施例１：Ｄ７ｐｘ導入菌株の作製
【0069】
１．１．親菌株の準備
Ｄ７ｐｘ導入のための親菌株として、デアセトキシセファロスポリンＣ（ＤＡＯＣ）生産アクレモニウム・クリソゲナム菌株を大韓民国登録特許第１０－２１９４７４０号（本明細書に参照として含まれる）に記載された実施例を参照して準備した。
Ｄ７ｐｘ導入のための親菌株として、デアセトキシセファロスポリンＣ（ＤＡＯＣ）生産アクレモニウム・クリソゲナム菌株を大韓民国登録特許第１０－２１９４７４０号（本明細書に参照として含まれる）に記載された実施例を参照して準備した。
【0070】
これを簡略に説明すれば、まず、ＣｅｆＥＦおよびＣｅｆＧ遺伝子が欠損されたＣＰＣ高生産性アクレモニウム・クリソゲナム菌株（寄託番号：ＫＣＴＣ １３９２２ＢＰ）にマイコバクテリウム・アブセサス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｂｓｃｅｓｓｕｓ）のＣｅｆＥ３（ｇｅｎｂａｎｋ ＰＩＤ ＳＫＸ８１６１５．１）コードＤＮＡ（配列番号５）が導入された菌株（３－７菌注）およびスフィンゴモナス・ドクドネンシス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｄｏｋｄｏｎｅｎｓｉｓ）のＣｅｆＥ８（ｇｅｎｂａｎｋ ＰＩＤ ＯＷＫ２８８２９．１）コードＤＮＡ（配列番号６）が導入された菌株（８－６０菌株）を準備した。大韓民国登録特許第１０－２１９４７４０号に記載された「形質転換試験法」により、前記準備された３－７菌株および８－６０菌株の原形質体を作製し、前記作製した原形質体を計数した後、それぞれの菌株に対して１×１０７個の原形質体に６０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ溶液２５０μＬを入れて混合した後、氷で４０分放置した。その後、６０％ＰＥＧ溶液２．５ｍＬをさらに入れて混合した後、常温で４０分放置した後、抗生剤を含有するＬＢ－ｓｕｃｒｏｓｅ平板培地に塗抹した。平板培地は２８℃で１４日間コロニーが形成される時まで培養した。
【0071】
前記のように得られた菌株に対して、配列番号７（５’－ｃｇｃｔｔｇａｇｃａ ｇａｃａｔｃａｃｃａ ｔｇａｃｇｇａｃａｔ ｃｇｇｔｇａａｃ－３’）と配列番号８（５’－ｇｃｔａａｇｃｔｔｔ ｔａｔｃａｇｃｃｇａ ｃｇｇｔｔａｔｇｇｃ－３’）のプライマーを利用してＣｅｆＥ３の存在有無を、配列番号９（５’－ｃｇｃｔｔｇａｇｃａ ｇａｃａｔｃａｃｃａ ｔｇｃａｔｃｇｃｇｃ ｇｇｇｃｇｇｃ－３’）と配列番号１０（５’－ｇｃｔａａｇｃｔｔｔ ｔａｔｃａｃｔｔｃｔ ｔｇａｔｇａｇａｃ－３’）のプライマーを利用してＣｅｆＥ８の存在有無をそれぞれ確認して、マイコバクテリウム・アブセサス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｂｓｃｅｓｓｕｓ）のＣｅｆＥ３とスフィンゴモナス・ドクドネンシス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｄｏｋｄｏｎｅｎｓｉｓ）のＣｅｆＥ８が全て導入された融合菌株（Ｅ３－Ｅ８と命名）が得られたことを確認した。
【0072】
１．２．Ｄ７ｐｘ遺伝子合成およびクローニング
セファスポリン抗生剤生産放線菌であるストレプトマイセス・クラブリゲルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）のＣｅｆＤ蛋白質配列を基盤としてアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）で最適化したコドンに変えて再合成した遺伝子配列（以下、「Ｄ７」と命名）および前記アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）のＣｅｆＤ１蛋白質Ｃ－末端に存在する連続する１０個のアミノ酸部位（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ １（ＰＴＳ１）であるアミノ酸３個を含む）コーディング配列を準備した。前記Ｄ７配列の３’末端（Ｃ－末端コドン該当）に前記ＰＴＳ１配列を含むＣｅｆＤ１の１０個のアミノ酸（配列番号２）部位コーディング配列を連結して、これをＤ７ｐｘ（アミノ酸配列：配列番号３；ＤＮＡ配列：配列番号４）と命名した。
セファスポリン抗生剤生産放線菌であるストレプトマイセス・クラブリゲルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）のＣｅｆＤ蛋白質配列を基盤としてアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）で最適化したコドンに変えて再合成した遺伝子配列（以下、「Ｄ７」と命名）および前記アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）のＣｅｆＤ１蛋白質Ｃ－末端に存在する連続する１０個のアミノ酸部位（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ １（ＰＴＳ１）であるアミノ酸３個を含む）コーディング配列を準備した。前記Ｄ７配列の３’末端（Ｃ－末端コドン該当）に前記ＰＴＳ１配列を含むＣｅｆＤ１の１０個のアミノ酸（配列番号２）部位コーディング配列を連結して、これをＤ７ｐｘ（アミノ酸配列：配列番号３；ＤＮＡ配列：配列番号４）と命名した。
【0073】
Ｄ７ｐｘを作製するために、配列分析を通じてストレプトマイセス・クラブリゲルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）のＣｅｆＤのアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）での発現が最適化することができるコドン配列を見出し、前記ＣｅｆＤのＣｅｆＤ１配列およびＰＴＳ１配列とのハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）を最初に行った。アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）にＤ７ｐｘの導入を通じてＣｅｆＤ１、ＣｅｆＤ２、チオエステラーゼ（ｔｈｉｏｅｓｔｅｒａｓｅ）が作用する段階を一段階に縮小して代謝経路を最適化し、ＤＡＯＣ生産過程で不純物であるＤＡＣの含有量を画期的に減らし、目的産物であるＤＡＯＣも有意水準に増加することを確認した。
【0074】
Ｄ７ｐｘの遺伝子配列とこれによりコードされる蛋白質配列は次のとおりである。
【0075】
Ｄ７アミノ酸配列（３９８ａａ）（配列番号１）
MAVADWEEAR GRMLLDPTVV NLNTGSGGPL PRSAFERVTG FRAHLAAEPM DFLLREVPAL
LWQARESLAR LIGGDPLRLA LATNVTAAVN LVASSLRLEA PGEILLSDDE YTPMRWCWER
VARRHGLELR TFRLPELPSD PAEITAAAVA AMGPRTRLFF FSHVVSTTGL ILPAAELCEE
ARARGITTVV DGAHAPGFLD LDLSRIPCDF YAGSGHKWLL APTGVGFLHL APGRLEELEP
TQVSWAYEPP EGSGPPAARD RFGSTPGLRR LECEGTRDIC PWLATPESID FQAELGPGAI
RARRRELTDH ARRLLADRPG RTLLTPDSPE LSGGMVAYRL PPGTDAAELR RGLWERFRIE
AAVAEQPPGP VLRISANFYT TEEEIDRLAD ALDALTGE
MAVADWEEAR GRMLLDPTVV NLNTGSGGPL PRSAFERVTG FRAHLAAEPM DFLLREVPAL
LWQARESLAR LIGGDPLRLA LATNVTAAVN LVASSLRLEA PGEILLSDDE YTPMRWCWER
VARRHGLELR TFRLPELPSD PAEITAAAVA AMGPRTRLFF FSHVVSTTGL ILPAAELCEE
ARARGITTVV DGAHAPGFLD LDLSRIPCDF YAGSGHKWLL APTGVGFLHL APGRLEELEP
TQVSWAYEPP EGSGPPAARD RFGSTPGLRR LECEGTRDIC PWLATPESID FQAELGPGAI
RARRRELTDH ARRLLADRPG RTLLTPDSPE LSGGMVAYRL PPGTDAAELR RGLWERFRIE
AAVAEQPPGP VLRISANFYT TEEEIDRLAD ALDALTGE
【0076】
ＰＴＳ１配列を含むＣｅｆＤ１の１０個のアミノ酸部位のアミノ酸配列（１０ａａ）（配列番号２）
SGQSAARPRL
SGQSAARPRL
【0077】
Ｄ７ｐｘアミノ酸配列（４０８ａａ）（配列番号３）
MAVADWEEAR GRMLLDPTVV NLNTGSGGPL PRSAFERVTG FRAHLAAEPM DFLLREVPAL
LWQARESLAR LIGGDPLRLA LATNVTAAVN LVASSLRLEA PGEILLSDDE YTPMRWCWER
VARRHGLELR TFRLPELPSD PAEITAAAVA AMGPRTRLFF FSHVVSTTGL ILPAAELCEE
ARARGITTVV DGAHAPGFLD LDLSRIPCDF YAGSGHKWLL APTGVGFLHL APGRLEELEP
TQVSWAYEPP EGSGPPAARD RFGSTPGLRR LECEGTRDIC PWLATPESID FQAELGPGAI
RARRRELTDH ARRLLADRPG RTLLTPDSPE LSGGMVAYRL PPGTDAAELR RGLWERFRIE
AAVAEQPPGP VLRISANFYT TEEEIDRLAD ALDALTGESG QSAARPRL
MAVADWEEAR GRMLLDPTVV NLNTGSGGPL PRSAFERVTG FRAHLAAEPM DFLLREVPAL
LWQARESLAR LIGGDPLRLA LATNVTAAVN LVASSLRLEA PGEILLSDDE YTPMRWCWER
VARRHGLELR TFRLPELPSD PAEITAAAVA AMGPRTRLFF FSHVVSTTGL ILPAAELCEE
ARARGITTVV DGAHAPGFLD LDLSRIPCDF YAGSGHKWLL APTGVGFLHL APGRLEELEP
TQVSWAYEPP EGSGPPAARD RFGSTPGLRR LECEGTRDIC PWLATPESID FQAELGPGAI
RARRRELTDH ARRLLADRPG RTLLTPDSPE LSGGMVAYRL PPGTDAAELR RGLWERFRIE
AAVAEQPPGP VLRISANFYT TEEEIDRLAD ALDALTGESG QSAARPRL
【0078】
Ｄ７ｐｘコードＤＮＡ配列（配列番号４）
atggccgttg cggactggga ggaggcgcgc ggccgcatgc tcctggatcc caccgttgtc 60
aatctaaaca cggggtcggg aggcccgctc cccaggtccg ccttcgagag ggtcacaggt 120
ttccgtgccc acctggccgc ggagccgatg gacttcctgc ttcgcgaggt gcctgctctt 180
ctctggcagg ccagggagag cctcgcccgc ctgatcggtg gcgatccctt gcggctcgcc 240
ctggcgacca atgtcacggc agccgtgaat ctggtcgcca gttcgctgcg tctcgaggca 300
ccgggtgaga ttcttctgtc ggacgacgaa tacacaccca tgagatggtg ctgggagcgc 360
gtggcccgta ggcatggctt ggagctccgc acattccgcc tgccagagct gccaagcgat 420
ccggctgaaa tcactgcagc cgcagttgct gcaatgggac cgcggacgcg actctttttc 480
ttctcccacg tcgtttcgac cacgggtctc atactccccg ctgcggagct ctgcgaagag 540
gcccgagccc gtggcatcac gacggtcgtc gatggcgccc atgcccctgg ttttctggat 600
ctcgacctca gccgtatccc gtgcgacttt tacgccggtt ccggtcataa gtggctcctg 660
gcacccactg gcgttggctt cctccacttg gcgccgggcc gcctagagga actcgagcct 720
acacaggtct catgggccta cgagcctcca gagggctcgg gccctccggc ggcgcgagac 780
cggtttggga gtaccccggg cctgcggagg ctcgagtgcg agggcacgcg agatatctgc 840
ccctggctcg ccacccccga aagtatcgac ttccaagcag agctaggtcc cggggctatc 900
cgtgcgcgtc gtcgcgagct gaccgaccat gcgcggcgcc tgctcgccga ccgtcctggg 960
aggaccctcc ttactcctga ctcgccggag ctctcaggcg gaatggttgc ttacaggttg 1020
ccacccggca ccgacgcagc cgagctgcgc cgtggcctgt gggagcgatt tcgcatcgag 1080
gccgccgtcg ccgaacagcc gccgggcccc gtgctacgca tctccgcgaa tttctatacc 1140
accgaggagg agattgatcg actcgccgac gccctcgacg cccttacggg agagtccggc 1200
cagtcggcgg ctcggccaag actctaatga 1230
atggccgttg cggactggga ggaggcgcgc ggccgcatgc tcctggatcc caccgttgtc 60
aatctaaaca cggggtcggg aggcccgctc cccaggtccg ccttcgagag ggtcacaggt 120
ttccgtgccc acctggccgc ggagccgatg gacttcctgc ttcgcgaggt gcctgctctt 180
ctctggcagg ccagggagag cctcgcccgc ctgatcggtg gcgatccctt gcggctcgcc 240
ctggcgacca atgtcacggc agccgtgaat ctggtcgcca gttcgctgcg tctcgaggca 300
ccgggtgaga ttcttctgtc ggacgacgaa tacacaccca tgagatggtg ctgggagcgc 360
gtggcccgta ggcatggctt ggagctccgc acattccgcc tgccagagct gccaagcgat 420
ccggctgaaa tcactgcagc cgcagttgct gcaatgggac cgcggacgcg actctttttc 480
ttctcccacg tcgtttcgac cacgggtctc atactccccg ctgcggagct ctgcgaagag 540
gcccgagccc gtggcatcac gacggtcgtc gatggcgccc atgcccctgg ttttctggat 600
ctcgacctca gccgtatccc gtgcgacttt tacgccggtt ccggtcataa gtggctcctg 660
gcacccactg gcgttggctt cctccacttg gcgccgggcc gcctagagga actcgagcct 720
acacaggtct catgggccta cgagcctcca gagggctcgg gccctccggc ggcgcgagac 780
cggtttggga gtaccccggg cctgcggagg ctcgagtgcg agggcacgcg agatatctgc 840
ccctggctcg ccacccccga aagtatcgac ttccaagcag agctaggtcc cggggctatc 900
cgtgcgcgtc gtcgcgagct gaccgaccat gcgcggcgcc tgctcgccga ccgtcctggg 960
aggaccctcc ttactcctga ctcgccggag ctctcaggcg gaatggttgc ttacaggttg 1020
ccacccggca ccgacgcagc cgagctgcgc cgtggcctgt gggagcgatt tcgcatcgag 1080
gccgccgtcg ccgaacagcc gccgggcccc gtgctacgca tctccgcgaa tttctatacc 1140
accgaggagg agattgatcg actcgccgac gccctcgacg cccttacggg agagtccggc 1200
cagtcggcgg ctcggccaag actctaatga 1230
【0079】
前記Ｄ７ｐｘ遺伝子のクローニングを実施する時、ＰＣＲ法を利用した遺伝子増幅はＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの購入時に同封されたマニュアルに従い、一般にＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）はＰｆｕ－Ｘ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、大韓民国）を使用した。制限酵素、Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ、Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔはＮＥＢ（米国）で購入して同封されたマニュアルに従った。Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ精製、ＰＣＲ産物（ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ）精製、アガロースゲル（Ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ）からＤＮＡ抽出などのためにＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、オランダ）を使用した。
【0080】
クローニングのための大腸菌ＤＨ５ａｌｐｈａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）の形質転換は、コンピテントセル（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）を利用したヒートショック（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ）方法を使用した。大腸菌をＬＢ ｂｒｏｔｈ（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ）に接種してＯＤ６００ ０．４～０．６になる時まで培養した後、遠心分離（４℃、４０００ｒｐｍ）で菌体を回収した。回収した菌体は氷で冷却した０．１Ｍ塩化カルシウム溶液で４回洗浄してコンピテントセルを製造した。ヒートショック形質転換に使用したプラスミドＤＮＡ（ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ）（形質転換過程で使用されたサブクローニング（ｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇ）用プラスミドを通称する）は１００乃至５００ｎｇを準備した。プラスミドＤＮＡとコンピテントセル１００μＬを混合して氷で３０分間反応した後、４２℃で３０秒間ヒートショックを与え、直ちに氷に入れて２分間冷ました後、ＬＢブロス（ＬＢ ｂｒｏｔｈ）１ｍＬを入れた。３７℃で１時間培養した後、抗生剤を含むＬＢプレート（ＬＢ ｐｌａｔｅ）に塗抹し、３７℃で一晩（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）の間に定置培養して形質転換体を得た。
【0081】
Ｄ７ｐｘの遺伝子は合成依頼して確保した鋳型から増幅した。プライマー５’－ＣＧＣＴＴＧＡＧＣＡＧＡＣＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＧＴＴＧＣＧＧＡＣＴＧＧＧ－３’（配列番号１１）と５’－ＴＡＴＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＴＡＧＡＧＴＣＴＴＧＧＣＣＧＡＧ－３’（配列番号１２）を利用してＤ７ｐｘを増幅した。プロモーターであるＰＥＰ３（配列番号１３）はプライマー５’－ＧＣＡＡＣＴＡＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＴＴＧＴＡＴＣＴＣＴＡＣＡＣＡＣＡＧＧＣ－３’（配列番号１４）と５’－ＧＧＴＧＡＴＧＴＣＴＧＣＴＣＡＡＧＣＧ－３’（配列番号１５）を利用してｐＢ－ＨＣＸＥＰ３（配列番号１６）から増幅した。
【0082】
増幅したＤ７ｐｘ遺伝子とプロモーターＰＥＰ３は互いに重複する配列が存在するため、重複ＰＣＲ（ｓｅｗｉｎｇ ＰＣＲ）を行って連結した。増幅したＤ７ｐｘ断片とＰＥＰ３断片を鋳型としてプライマー配列番号１２と配列番号１４を利用してＰＣＲを行い、ＰＥＰ３とＤ７ｐｘが連結されたＰＥＰ３－Ｄ７ｐｘ断片を得た。ターミネーター（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）配列を有するようにするためにターミネーターベクターであるｐＢ－ＴｔｒｐＣ（配列番号１７）を使用した。ＰＥＰ３－Ｄ７ｐｘ断片をＳｐｅＩとＨｉｎｄＩＩＩに切断してｐＢ－ＴｔｒｐＣの同一部位に挿入してｐＢ－Ｄ７ｐｘｃａｓｔ（配列番号１８）を完成した。
【0083】
ｐＢ－Ｄ７ｐｘｃａｓｔからプライマーＴ３（配列番号１９）とＴ７（配列番号２０）を利用してＤ７ｐｘ遺伝子カセットを増幅した後、ｐＢ－ＨＦ（配列番号２１）のＰｍｅＩ制限部位に平滑末端結合（ｂｌｕｎｔ－ｅｎｄ ｌｉｇａｔｉｏｎ）で挿入した。完成されたプラスミドはｐＢ－ＨＦＤ７ｐｘ（配列番号２２）と命名した。完成された発現ベクターの構成は図１に示した。前記プラスミドはハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）抗生剤マーカーを有しており、ｆｌｐ－ＦＲＴシステムでマーカーを除去することができるように構成されている。
【0084】
１．３．Ｄ７ｐｘ遺伝子導入のための形質転換
実施例１．１で準備された親菌株Ｅ３－Ｅ８から抗生剤マーカーを除去するために２％キシロースを含有する抗生剤ＬＢ平板培地に継代培養して１０日後に出たコロニーから総ＤＮＡを抽出してＰＣＲを通じてマーカー遺伝子カセットの欠損有無を確認した。以上の段階を繰り返して抗生剤マーカー遺伝子カセットが全て損失された菌株を選別した後、前記実施例１．２で準備されたｐＢ－ＨＦＤ７ｐｘベクターを形質転換して導入した後、獲得した形質転換体を試験管培養を通じてＤＡＯＣ生産性を比較し、発酵試験のための高生産性菌株を選別した。
実施例１．１で準備された親菌株Ｅ３－Ｅ８から抗生剤マーカーを除去するために２％キシロースを含有する抗生剤ＬＢ平板培地に継代培養して１０日後に出たコロニーから総ＤＮＡを抽出してＰＣＲを通じてマーカー遺伝子カセットの欠損有無を確認した。以上の段階を繰り返して抗生剤マーカー遺伝子カセットが全て損失された菌株を選別した後、前記実施例１．２で準備されたｐＢ－ＨＦＤ７ｐｘベクターを形質転換して導入した後、獲得した形質転換体を試験管培養を通じてＤＡＯＣ生産性を比較し、発酵試験のための高生産性菌株を選別した。
【0085】
アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）への形質転換のためのｐＢ－ＨＦＤ７ｐｘベクターの準備は、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、オランダ）のマニュアルに従った。
【0086】
アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）への形質転換はＰＥＧ（ポリエチレングリコール：ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）法を使用した。菌体確保のためにカビ菌株（Ｅ３－Ｅ８）をＬＢ ｐｌａｔｅに塗抹した後、２８℃で７日培養した。確保した菌糸体は火炎滅菌したメスで一辺の大きさが５～７ｍｍである正四角形で切断してＴＢ ｂｒｏｔｈ（１２ｇ／Ｌトリプトーン、２４ｇ／Ｌ酵母抽出物、９．４ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、２．２ｇ／ＬＫＨ２ＰＯ４、４ｇ／Ｌグリセロール）に４～６個を接種し、接種した培地は２８℃で３日培養した。菌体回収のために培養液を遠心分離（４℃、４０００ｒｐｍ）した後、上澄液を捨てて０．６Ｍ ＭｇＳＯ４で１回洗浄した。
【0087】
プロトプラスト（Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ）の作製のために菌体重量を測定し、２％の細胞溶解酵素（ｌｙｓｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）（シグマ－アルドリッチ、Ｌ１４１２、米国）が含まれている総量（ｔｏｔａｌ ｖｏｌｕｍｅ）が菌体重量の４倍になるようにした。３０℃、１００ｒｐｍで３時間反応させた後、同量の分離バッファ（ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）Ａ（０．６Ｍ ソルビトール（ｓｏｒｂｉｔｏｌ）、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ７．０）を塗り（ｏｖｅｒｌａｙ）、遠心分離（４℃、１、８００ｇ）でプロトプラストを分離した。新たな遠心分離管にプロトプラスト層を移した後、同量の分離バッファ（ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）Ｂ（１．２Ｍ ソルビトール、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ７．５）を混合した後、遠心分離（４℃、１、８００ｇ）でプロトプラストを回収した。上澄液を捨ててプロトプラストをＭＳＣ溶液（１Ｍ ソルビトール、１０ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ６．５、１０ｍＭ ＣａＣｌ２）で１回洗浄した後、顕微鏡を通じて計数した１×１０７個のプロトプラストを確保した。
【0088】
形質転換のために１×１０７個のプロトプラストと１～５μｇ ＤＮＡ（ｐＢ－ＨＦＤ７ｐｘ）、６０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ溶液（ＭＳＣ溶液にポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）６０００を６０％（ｗ／ｖ）濃度に溶かして作る）５０μＬを混合して氷で２０分間反応した。６０％ ＰＥＧ溶液５００μＬを追加的に混合した後、常温で２０分間反応し、形質転換体の選別に適切な抗生剤を含むＬＢ－スクロースプレート（ＬＢ－ｓｕｃｒｏｓｅ ｐｌａｔｅ）（０．８Ｍ スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）、２％（ｗ／ｖ）寒天（ａｇａｒ））に塗抹した。培地は２８℃で１４日間培養して、ｐＢ－ＨＦＤ７ｐｘが成功的に導入された形質転換体を確保した。本実施例に例として使用されたベクターｐＢ－ＨＦＤ７ｐｘは細胞内に導入時にプラスミド形態で存在できないようにデザインされているため、前記確保された形質転換体は大部分Ｄ７ｐｘ遺伝子が染色体内に挿入（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）されている。しかし、これは本発明を実施するための一例に過ぎず、導入された遺伝子がプラスミド形態で存在することが排除されず、如何なる形態で存在しても関係ない。
【0089】
胞子を確保するために、前記確保された形質転換体を火炎滅菌したメスで取った後、クランプでつかんで１．５ｍＬ ｅ－ｔｕｂｅに入れ、０．８５％ ＮａＣｌ ２００μＬを添加した後、乳棒を利用して菌体を破砕した。菌体は胞子培地（デンプン２４ｇ／Ｌ、グリシン１．２ｇ／Ｌ、ポリペプトン４ｇ／Ｌ、酵母抽出物０．３ｇ／Ｌ、カゼイン８ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム６ｇ／Ｌ、リン酸二カリウム１．２ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．６ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０）に塗抹して２８℃で１４日間培養した。胞子は白金耳で掻いて２０％（ｗ／ｖ）グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）に懸濁した後、－８０℃冷凍庫に保管した。
【0090】
このように得られたＤ７ｐｘ遺伝子が導入されたアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）変異菌株を２０２２年６月２日付で大韓民国全羅北道井邑市に所在する韓国生命工学研究院生物資源センターに寄託して受託番号ＫＣＴＣ １４９８９ＢＰが付与された。
【0091】
実施例２．ＤＡＯＣ高生産菌株の選別
前記実施例１．３で準備された形質転換体のＤＡＯＣ（Ｄｅａｃｅｔｏｘｙ ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ Ｃ）およびＤＡＣ（Ｄｅａｃｅｔｙｌ ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ Ｃ）の生産、および７－ＡＤＣＡ転換量を確認した。
前記実施例１．３で準備された形質転換体のＤＡＯＣ（Ｄｅａｃｅｔｏｘｙ ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ Ｃ）およびＤＡＣ（Ｄｅａｃｅｔｙｌ ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ Ｃ）の生産、および７－ＡＤＣＡ転換量を確認した。
【0092】
前記確保された形質転換体の中でＤＡＯＣ生産能が高く、ＤＡＣ生産量が少ない菌株の選別のために、砂糖１５ｇ／Ｌ、ｓｏｙｔｏｎｅ１５ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム５ｇ／Ｌ、メチオニン１０ｇ／Ｌ、炭酸カルシウム１０ｇ／Ｌ、酵母抽出物１０ｇ／Ｌ、葡萄糖５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム２ｇ／Ｌ、オレイン酸メチル（ｍｅｔｈｙｌ ｏｌｅａｔｅ）５０ｇ／Ｌを含む培地で試験管培養を行った。前記実施例１．３で回収した胞子（１ｘ１０７個）を試験管に接種して２８℃、２００ｒｐｍで１０日間培養し、培養液０．５ｍＬを採取した。ＤＡＯＣとＤＡＣ生産量の分析のために上澄液２５μＬと３次蒸溜水９７５μＬを混合して０．２μｍサイズのフィルターでろ過（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）し、ＨＰＬＣで分析した。
【0093】
ＨＰＬＣ分析条件は次のとおりである。使用したＨＰＬＣ機器はＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ１０Ａｖｐであり、ＺＯＲＢＡＸ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｐｌｕｓ Ｃ１８（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５－Ｍｉｃｒｏｎ）カラム（ｃｏｌｕｍｎ）で分析した。移動相（Ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ）は２０ｍＭ 酢酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）：アセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）（９５：５）、ｐＨ７．０、流速は０．８ｍＬ／分、カラム（ｃｏｌｕｍｎ）温度は４０℃、ＵＶ検出器２２０ｎｍを使用して分析した。前記ＨＰＬＣ分析条件は、実施例２と実施例３でＤＡＯＣ、ＤＡＣ、７－ＡＤＣＡを分析するために共通的に使用した。
【0094】
また、ＤＡＣ ａｒｅａ値をＤＡＯＣ ａｒｅａ値で割ってＤＡＯＣとＤＡＣの比率（ＤＡＣ／ＤＡＯＣ、％）を計算した。ＤＡＣ／ＤＡＯＣ値が小さいほど目的産物であるＤＡＯＣの生産量は高く、ＤＡＯＣ生産過程の不純物であるＤＡＣの生産量は低いということを示す。
【0095】
また、前記培養液にＣＰＣアシラーゼを処理して酵素反応によるＤＡＯＣから７－ＡＤＣＡへの転換を行った。前記ＣＰＣアシラーゼは韓国公開特許１０－２０１４－００９４１５０号（本明細書に参照として含まれる）に開示された変異ＣＰＣアシラーゼ（ＰＭ２ ｍｕｔａｎｔ；配列番号２３によりコードされる）を利用した。より具体的に、培養試験管で、前記ＨＰＬＣ分析のために準備されたＤＡＯＣ培養液に１４％（ｖ／ｖ）アンモニア水を添加してｐＨ８．０に調節した後、液状のＣＰＣアシラーゼを最終３０Ｕ／ｍＬ濃度に投入し、１５℃および２００ｒｐｍ条件で１時間反応させた。その後、７－ＡＤＣＡ転換量（ｇ／Ｌ）をＨＰＬＣで分析した。より具体的に、前記反応液を遠心分離して上澄液２５μＬを取った後、３次蒸溜水９７５μＬと混合して４０倍希釈した。希釈した発酵液は０．２μｍフィルターでろ過した後、ＨＰＬＣ分析した。ＨＰＬＣ分析条件は前記で記載された内容に従った。
【0096】
前記で得られたＤＡＯＣ生産量（ｇ／Ｌ）とＤＡＯＣ生産過程の不純物であるＤＡＣの比率（ＤＡＣ／ＤＡＯＣ、％）を図２および表１に示した。また前記得られた７－ＡＤＣＡ転換量（ｇ／Ｌ）を表１に示した。
【0097】
【表1】
【0098】
図２および表１でＥ３－Ｅ８はＤ７ｐｘが導入されていない親菌株（対照群）であり、ＥＤ－１、ＥＤ－２、ＥＤ－３、ＥＤ－４、およびＥＤ－５は全てＥ３－Ｅ８にＤ７ｐｘが導入された形質転換菌株である。
【0099】
図２および表１に示すように、試験した５種の形質転換菌株共に目的産物であるＤＡＯＣの生産性が対照群であるＥ３－Ｅ８より９～１７％増加し、ＤＡＣ／ＤＡＯＣ（％）も対照群であるＥ３－Ｅ８（約１０．５％）より顕著に減った２．５５～３．５４％水準であることを確認した。また、表１に示すように、試験した５種の形質転換菌株共にＤＡＯＣから７－ＡＤＣＡ転換量が対照群であるＥ３－Ｅ８より約６～１７％増加した。
【0100】
実施例３．ＤＡＯＣ生産能、ＤＡＣ／ＤＡＯＣ比率、および７－ＡＤＣＡ転換量の確認
前記実施例でＤＡＯＣ生産量が最も高く、副産物であるＤＡＣ生産量は最も低いと確認されたＥＤ－４菌株の培養期間に応じたＤＡＯＣ生産能およびＤＡＣ／ＤＡＯＣ比率を確認した。また、最大培養期間の７－ＡＤＣＡ転換量を測定した。対照群としてＥ３－Ｅ８菌株を使用した。
前記実施例でＤＡＯＣ生産量が最も高く、副産物であるＤＡＣ生産量は最も低いと確認されたＥＤ－４菌株の培養期間に応じたＤＡＯＣ生産能およびＤＡＣ／ＤＡＯＣ比率を確認した。また、最大培養期間の７－ＡＤＣＡ転換量を測定した。対照群としてＥ３－Ｅ８菌株を使用した。
【0101】
ＤＡＯＣ生産は、１次種培養、２次種培養、本培養の段階で進行した。１次種培養は、コロニーの大きさにより４乃至６コロニーを１次種培養培地（大豆粉２８．５ｇ／Ｌ、とうもろこし浸漬液２５ｍＬ／Ｌ、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）３５ｇ／Ｌ、葡萄糖５ｇ／Ｌ、炭酸カルシウム５ｇ／Ｌ、消泡剤０．８ｍＬ／Ｌ）に接種後、３０℃、２００ｒｐｍで６３時間培養した。２次種培養は、１次種培養液を２次種培養培地（１次種培養培地と同一であるが、大豆油を５ｍＬ／Ｌ追加する）が盛られた発酵槽に全て接種し、３０℃、３５％ＤＯ、４００ｒｐｍ、空気１．０ｖｖｍの条件を始まりとして菌体成長により６％葡萄糖を供給（ｆｅｅｄｉｎｇ）し、攪拌速度を段階的に上げながら６８時間培養した。本培養は、２次種培養液２００ｍＬを本培養培地（落花生粉２３ｇ／Ｌ、とうもろこし浸漬液５０ｍＬ／Ｌ、メチオニン１．５ｇ／Ｌ、デキストリン７０ｇ／Ｌ、コーンミール３５ｇ／Ｌ、硫酸カルシウム１３ｇ／Ｌ、大豆油６０ｍＬ／Ｌ、硫酸アンモニウム１３ｇ／Ｌ、果糖シロップ９ｇ／Ｌ、炭酸カルシウム１０ｇ／Ｌ、消泡剤０．５ｍＬ／Ｌ）が盛られた発酵槽に接種し、２８℃、３５％ＤＯ、４００ｒｐｍ、空気１．０ｖｖｍの条件を始まりとして培養し、ｐＨはアンモニア水を利用して５．４乃至５．７に調節し、菌体成長により攪拌速度を段階的に上げながら培養した。培養２日後に培養温度を２８℃から２５℃に下げた後、菌体成長により５％乃至１０％の大豆油を段階的に供給しながら７日乃至８日目に発酵を完了した。
【0102】
発酵培養液のＤＡＯＣおよびＤＡＣ生産量の分析のために培養液１ｍＬを取って１００倍希釈した後、１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、上澄液を０．２ｕｍシリンジフィルターでろ過してＨＰＬＣ分析に使用した。ＨＰＬＣ分析条件は、前記実施例２に記載された内容に従った。ＤＡＯＣとＤＡＣの比率（ＤＡＣ／ＤＡＯＣ、％）はＤＡＣ ａｒｅａ値をＤＡＯＣ ａｒｅａ値で割って計算した。
【0103】
【0104】
【表2】
【0105】
【表3】
【0106】
【0107】
また、前記培養液にＣＰＣアシラーゼを処理して酵素反応によるＤＡＯＣから７－ＡＤＣＡへの転換を行った。前記ＣＰＣアシラーゼは、韓国公開特許１０－２０１４－００９４１５０号（本明細書に参照として含まれる）に開示された変異ＣＰＣアシラーゼ（ＰＭ２ ｍｕｔａｎｔ；配列番号２３によりコードされる）を利用した。より具体的に、最大培養時間の発酵培養液が盛られた発酵槽に１４％（ｖ／ｖ）アンモニア水を添加してｐＨ８．０に調節した後、液状のＣＰＣアシラーゼを最終３０Ｕ／ｍＬ濃度に投入し、温度１５℃条件で８００ｒｐｍで攪拌しながら１時間反応させた。その後、７－ＡＤＣＡ転換量（ｇ／Ｌ）をＨＰＬＣで分析した。より具体的に、発酵培養液の７－ＡＤＣＡ転換量分析のために反応液１ｍＬを取って１００倍希釈した後、１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、上澄液を０．２ｕｍシリンジフィルターでろ過してＨＰＬＣ分析に使用した。ＨＰＬＣ分析条件は、前記実施例２に記載された内容に従った。
【0108】
前記得られた結果に基づいて、最終のＤＡＯＣ生産量、ＤＡＣ／ＤＡＯＣ比率、および７－ＡＤＣＡ転換量（ｇ／Ｌ）を下記の表４に記載した。
【0109】
【表4】
【0110】
表４に示すように、Ｄ７ｐｘ遺伝子が導入されたＥＤ－４菌株は、対照群であるＥ８－Ｅ３菌株に比べて、ＤＡＯＣ生産量が高く、ＤＡＣ／ＤＡＯＣ比率は顕著に低いだけでなく、７－ＡＤＣＡ転換量も高いことが明らかになった。
【0111】
前記Ｄ７ｐｘ遺伝子が導入されたアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）変異菌株ＥＤ－４を２０２２年６月２日付で大韓民国全羅北道井邑市に所在する韓国生命工学研究院生物資源センターに寄託して受託番号ＫＣＴＣ １４９８９ＢＰが付与された。
【0112】
以上の説明から、本出願が属する技術分野における当業者は、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく他の具体的な形態で実施可能であることを理解できるだろう。これに関連して、以上で記述した実施例は全ての面で例示的なものであり、限定的なものではないと理解しなければならない。本出願の範囲は、前記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導き出される全ての変更または変形された形態が本出願の範囲に含まれると解釈されなければならない。
【0113】
［受託番号］
寄託機関名：韓国生命工学研究院生物資源センター
受託番号：ＫＣＴＣ１４９８９ＢＰ
受託日付：２０２２０６０２
寄託機関名：韓国生命工学研究院生物資源センター
受託番号：ＫＣＴＣ１４９８９ＢＰ
受託日付：２０２２０６０２
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】
【外国語明細書】