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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024063781
(43)【公開日】2024-05-13
(54)【発明の名称】土壌消毒剤および土壌消毒方法
(51)【国際特許分類】
A01N 37/02 20060101AFI20240502BHJP
A01N 63/30 20200101ALI20240502BHJP
A01P 3/00 20060101ALI20240502BHJP
C12N 1/20 20060101ALI20240502BHJP
【ＦＩ】
A01N37/02 ZNA
A01N63/30
A01P3/00
C12N1/20 A
C12N1/20 D
【審査請求】未請求
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023184285
(22)【出願日】2023-10-26
(31)【優先権主張番号】P 2022171835
(32)【優先日】2022-10-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【新規性喪失の例外の表示】新規性喪失の例外適用申請有り
(71)【出願人】
【識別番号】304021831
【氏名又は名称】国立大学法人千葉大学
(71)【出願人】
【識別番号】522042669
【氏名又は名称】公益財団法人園芸植物育種研究所
(74)【代理人】
【識別番号】100120031
【弁理士】
【氏名又は名称】宮嶋 学
(74)【代理人】
【識別番号】100120617
【弁理士】
【氏名又は名称】浅野 真理
(74)【代理人】
【識別番号】100126099
【弁理士】
【氏名又は名称】反町 洋
(72)【発明者】
【氏名】天知 誠吾
(72)【発明者】
【氏名】門馬 法明
【テーマコード（参考）】
4B065
4H011
【Ｆターム（参考）】
4B065AA23X
4B065AB10
4B065AC14
4B065BA30
4B065BB40
4B065BC50
4B065CA08
4B065CA47
4B065CA54
4B065CA60
4H011AA01
4H011BB06
4H011BB21
(57)【要約】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
カプロン酸もしくはその塩またはカプロン酸産生菌を含んでなる、土壌消毒剤。
【請求項2】
カプロン酸またはその塩を含んでなる、請求項１に記載の土壌消毒剤。
【請求項3】
土壌還元消毒法に用いるための、請求項１または２に記載の土壌消毒剤。
【請求項4】
前記カプロン酸産生菌がクロストリジウム属菌を含んでなる、請求項１に記載土壌消毒剤。
【請求項5】
前記クロストリジウム属菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列が配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項４に記載の土壌消毒剤。
【請求項6】
前記カプロン酸産生菌が受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ－０３９４６の下で寄託されているＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．Ｅ８０１を含んでなる、請求項１に記載の土壌消毒剤。
【請求項7】
受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ－０３９４６の下で寄託されているＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．Ｅ８０１。
【請求項8】
カプロン酸もしくはその塩またはカプロン酸産生菌を土壌に施用する工程を含んでなる、土壌消毒方法。
【請求項9】
前記施用工程が、カプロン酸またはその塩を土壌に施用する工程である、請求項８に記載の土壌消毒方法。
【請求項10】
土壌還元消毒法である、請求項８または９に記載の土壌消毒方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規な土壌消毒剤および土壌消毒方法に関する。より詳細には、本発明は、カプロン酸もしくはその塩またはカプロン酸産生菌を用いる、新規な土壌消毒剤および土壌消毒方法に関する。
【背景技術】
【0002】
連作によって引き起こされる土壌障害は、農作物の収量を大幅に減少させ、農業生産に大きな影響を及ぼす。土壌障害の中で最も被害が大きく、対応も困難であるのが、土壌病害である。土壌病原菌は土壌深層まで存在し、その多くが糸状菌であり厚膜胞子等の耐久器官を形成するため、土壌燻蒸剤が効きにくく、防除が困難となっている。日本のトマト産業においてもＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．ｓｐ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ（Ｆｏｌ）の引き起こす萎凋病により、一農家あたり、年間約２５０万円１０ａ－１の被害が生じている。
【0003】
土壌病害を防ぐためには土壌の消毒が必要不可欠である。これまで、土壌の消毒には土壌燻蒸剤が広く利用されてきた。特に臭化メチルは、抗菌スペクトルが広く、殺菌能力も高いため、最も頻繁に使用されてきた。しかし、臭化メチルは、その強いオゾン層破壊能から、２００５年より先進国での使用が全廃された。現在、臭化メチル代替剤として、クロロピクリンやＤ－Ｄ（１，３－ジクロロプロペン）等が利用されているが、依然として環境や人体への毒性が強く、欧州や米国では使用の禁止、または厳しい規制が設けられている。欧州では、クロロピクリンは水生生物、鳥類、哺乳類に対するリスクと分解産物のジクロロニトロメタンによる地下水汚染リスクから使用が禁止されており、Ｄ－Ｄは、製造時のポリ塩化不純物の環境への放出から緊急利用のみに制限されている。
【0004】
このような技術状況下で開発された新たな土壌消毒方法が、土壌還元消毒法（Ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｓｏｉｌ ｄｉｓｉｎｆｅｓｔａｔｉｏｎ（ＡＳＤ））である（非特許文献１）。ＡＳＤは、土壌微生物の力を利用して土壌を消毒する方法である。ＡＳＤは、１）土壌への米糠や小麦ふすま等の大量の有機物の混和、２）土壌の潅水、２）プラスチックフィルムによる土壌の被覆の３ステップで構成される。ＡＳＤは人体や環境への有害性が無く、同時に潅水による除塩効果も期待できる。また、長期間の処理を必要とせず、大規模な施設を導入する必要もない。以上のメリットから、現在、日本、オランダ、アメリカをはじめとする国々でＡＳＤの利用が増加しつつある。
【0005】
ＡＳＤではまず混和された有機物の影響で好気性微生物が酸素を急速に消費することで土壌中の酸化還元電位が低下し、これに伴い活性化した嫌気性細菌の生成する揮発性脂肪酸やその他揮発性成分、金属イオン、細胞壁分解酵素等が複合的に作用することで、土壌病原微生物が消毒されると推測されている。しかしながら、これら成分の土壌中での作用の詳細については明らかになっておらず、主要な殺菌因子や詳細な殺菌メカニズムは未だ不明である。
【0006】
近年ＡＳＤの普及に伴い、添加する有機物として米糠や小麦ふすま等の固体の代わりに、１％程度の低濃度エタノールを用いる方法が報告されている（非特許文献２）。添加するエタノールは消毒用（７０％）に比べ非常に低濃度であるため、エタノール自体に殺菌効果は無く、有機物として利用される。
【0007】
しかしながら、上述のような低濃度エタノールを使用する場合であっても、土ＡＳＤの殺菌効果が不安定である場合があり、さらなる普及を妨げる原因となっている。したがって、ＡＳＤをより効果的で安定で実施するための新たな技術的手段が依然として求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Ｙ．Ｏｋａ，Ａｐｐｌ．Ｓｏｉｌ Ｅｃｏｌ．，４４，１０１－１１５（２０１０）
【非特許文献2】門馬法明，宇佐見俊行，雨宮良幹，宍戸雅宏，土と微生物，５９，２７－３３（２００５）
【発明の概要】
【0009】
本発明は、土壌消毒に有用な新たな技術手的手段を提供することを目的とする。
【0010】
本発明者らは、今般、鋭意検討した結果、カプロン酸が特定の菌株により産生され、顕著な土壌消毒作用を有することを見出した。本発明はこの知見に基づくものである。
【0011】
本発明の一実施態様によれば、カプロン酸もしくはその塩またはカプロン酸産生菌を含んでなる、土壌消毒剤が提供される。
【0012】
また、本発明の別の実施態様によれば、カプロン酸もしくはその塩またはカプロン酸産生菌を土壌に施用する工程を含んでなる、土壌消毒方法が提供される。
【0013】
本発明によれば、カプロン酸およびそれを産生する細菌を用いて、顕著な土壌消毒作用を奏することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】ＡＳＤ再現試験中の土壌およびその各成分の経時的変化を示す。ＡはＦｏｌ生菌数の経時変化を示す。Ｆｏｌ生菌数は常用対数で示している。Ｂは酸化還元電位の経時変化を示す。Ｃは土壌のｐＨの経時変化を示す。
【図2】ＡＳＤ再現試験中の土壌中の各種有機酸濃度の経時的変化を示す。Ａは、エタノールありの場合を示す。Ｂは、エタノールなしの場合を示す。
【図3】ＡＳＤ前後における細菌群の門レベルでの相対存在量を示す。
【図4】グラム染色にしたＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．Ｅ８０１株を顕微鏡で形態観察した際の写真である。
【図5】１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列に基づきＮｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ法により作成したクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌の系統樹である。ｂｏｏｔｓｔｒａｐ値は１，０００として計算している。
【図6】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．Ｅ８０１株培養上清中の有機酸濃度の経時的変化を示すグラフである。
【図7】ＭＥＳバッファー中でカプロン酸添加時のＦｏｌ生菌数の経時的変化を示すグラフである。ＡはＭＥＳバッファーｐＨ５．０の場合を示す。Ｂは、ＭＥＳバッファーｐＨ５．５の場合を示す。
【図8】ヤシ殻培地で有機酸添加時のＦｏｌ生菌数の経時的変化を示すグラフである。
【図9】カプロン酸がトマト青枯病菌(Ｒ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ)の生菌数に与える影響を示すグラフである。
【発明の具体的説明】
【0015】
本発明の一実施態様によれば、カプロン酸もしくはその塩またはカプロン酸産生菌を含んでなる、土壌消毒剤が提供される。カプロン酸およびそれを産生する細菌が、顕著な土壌消毒作用を奏することは意外な事実である。
【0016】
カプロン酸の塩としては、農園芸上許容可能な塩である限り特に限定されず、無機塩または有機塩のいずれであってもよいが、好適な例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等のアルカリ金属塩が挙げられる。
【0017】
本発明の一実施態様によれば、カプロン酸産生菌は、カプロン酸産生機能を有するクロストリジウム属菌であり、好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉと実質的に同等な菌株を含んでなる。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉと実質的に同等な菌株は一種類であっても複数の組み合わせであってもよい。
【0018】
上記実質的に同等の菌株がＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉと機能的に同等か否かは、後述する実施例の試験例４と同様の実験を行い統計的手法（対応のない群間比較検定、一元配置分散分析）により有意差がない範囲であるか否かにより判定することができる。
【0019】
本発明の一実施態様によれば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉと実質的に同等の菌株は、クロストリジウム属菌であって、その１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号１で示されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列と少なくとも９５％、好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上、さらに好ましくは９９．９％以上の同一性を有する。
【0020】
本発明において、２つのヌクレオチド配列間の「同一性」同一性とは、比較される２つの配列間で、ベストアライメント（最適アライメント）の後に得られる同一のヌクレオチドのパーセントを意味し、このパーセントは単に統計学的なものであり、２つの配列間の違いはそれらの全長にわたりランダムに分布している。２つのヌクレオチド配列間の配列の比較は、通常、最適な方法でアライメントした後にこれらの配列を比較することによりなされるが、この場合、前記比較はセグメントごとに、または「比較ウィンドウ」ごとに行われてよい。比較のための配列の最適アライメントは、コンピューターソフトウエア（ＢＬＡＳＴ Ｐ比較ソフトウエア）によって行うことができる。
【0021】
また、本発明の一実施態様によれば、カプロン酸産生菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．Ｅ８０１を含んでなる。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．Ｅ８０１は、２０２３年７月１８日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（〒２９２－０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）に、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ－０３９４６の下で寄託されている。さらに、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．Ｅ８０１をはじめとするカプロン酸産生菌は,２０２２年９月７日より、国立大学法人千葉大学 環境園芸学専攻 園芸化学コース 応用生命化学領域 微生物工学研究室(千葉県千葉市稲毛区弥生町１番３３号)に分譲可能な状態で保管されている。
【0022】
カプロン酸もしくはその塩またはカプロン酸産生菌を、土壌消毒剤の有効成分として用いる場合は、そのまま用いても良いが、通常は適当な固体担体、液体担体、ガス状担体、界面活性剤、分散剤その他の製剤用補助剤と混合して水和剤、顆粒水和剤、懸濁剤、フロアブル剤、粒剤、微粒剤Ｆ、粉剤、乳剤、ＥＷ剤、液剤、錠剤、油剤、エアゾール等の任意の剤型にして使用することができる。
【0023】
固体担体としては、例えばタルク、ベンナイト、クレー、カオリン、ケイソウ土、バーミキュライト、ゼオライト、ホワイトカーボン、炭酸カルシウム、酸性白土、軽石、アタパルジャイト、酸化チタン等があげられる。
【0024】
液体担体としては、例えばエタノール等のアルコール類、灯油等の脂肪族炭化水素類、芳香族炭化水素類、ジエチルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン等のエーテル類、酢酸エチル等のエステル類、アセトニトリル、イソブチロニトリル等のニトリル類、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等の酸アミド類、ダイズ油、綿実油等の植物油類、ジメチルスルホキシド、水等があげられる。
【0025】
また、ガス担体としてはＬＰＧ、空気、窒素、炭酸ガス、ジメチルエーテル等があげられる。
【0026】
乳化、分散、展着等のための界面活性剤、分散剤としては、例えばアルキル硫酸エステル類、アルキル（アリール）スルホン酸塩類、ポリオキシアルキレンアルキル（アリール）エーテル類、多価アルコールエステル類、ジオクチルスルホコハク酸Ｎａ、アルキルマレイン共重合物、アルキルナフタレンスルホン酸Ｎａ、β－ナフタレンスルホン酸ホルマリン縮合物のＮａ塩、リグニンスルホン酸塩、ポリオキシエチレントリスチリルフェニルエーテル硫酸塩または燐酸塩等が用いられる。
【0027】
更に、製剤の性状を改善するための補助剤としては、例えばα化デンプン、デキストリン、カルボキシメチルセルロース、アラビアガム、ポリエチレングリコール、ステアリン酸カルシウム、ポリビニルピロリドン、アルギン酸ナトリウム、フェノール系酸化防止剤、アミン系酸化防止剤、エポキシ化植物油等が用いられる。
【0028】
上記の担体、界面活性剤、分散剤、および補助剤は、必要に応じて各々単独で、あるいは組み合わせて用いられる。
【0029】
これらの製剤中の有効成分の含有量は、通常１～７５質量％、粉剤では通常０．３～２５質量％、水和剤では通常１～９０重量％、粒剤では通常０．５－１０質量が適当であるが、特に限定されない。
【0030】
また、本発明の別の実施態様によれば、カプロン酸もしくはその塩またはカプロン酸産生菌を土壌に施用する工程を含んでなる、土壌消毒方法が提供される。
【0031】
本発明の一実施態様によれば、カプロン酸もしくはその塩またはカプロン酸産生菌を土壌に施用する工程においては、カプロン酸もしくはその塩またはカプロン酸産生菌と、米糠や小麦ふすま等の有機資材とを混和して土壌に加えてもよく、カプロン酸もしくはその塩またはカプロン酸産生菌と有機資材とを別々に土壌に施用してもよい。また、土壌消毒に使用される従来公知の還元剤を土壌にさらに加えてもよい。さらに、上記土壌への施用工程に加えて、土壌の潅水工程、プラスチックフィルムによる土壌の被覆工程を公知の手法に準じて実施することができる。本発明の土壌消毒方法は、簡易な工程で土壌の消毒を行うことができ、農作物の生育に適した土壌、栽培環境を安定して維持する上で有利に利用することができる。
【0032】
本発明の一実施態様によれば、カプロン酸もしくはその塩またはカプロン酸産生菌の施用量は、土壌や病害生物の種類や性質に応じて適宜調整してよいが、例えば、土壌１反（約１，０００ｍｍ２）当たり１０～２０ｋｇの施用量としてもよい。
【0033】
本発明の一実施態様によれば、米糠や小麦ふすま等の有機資材の施用量は、土壌や病害生物の種類や性質に応じて適宜調整してよいが、例えば、土壌１反（約１，０００ｍｍ２）当たり１００～２００ｋｇとしてもよい。
【0034】
この他、本発明の実施形態では、通常、農作業で用いられる肥料（苦土石灰、貝化石、ケイ酸カルシウム、バークたい肥等）、土壌改良剤（ゼオライト、珪藻土、緑色凝灰岩、腐植酸資材、バーミキュライト、ピートモス等の土壌改良資材）を混用することで、土壌の消毒効果をより高めることができる。
【0035】
一実施態様によれば、本発明は、土壌に生息する病原体に起因する病害に対して効果的に適用することができると考えられる。土壌に生息する病原体に起因する病害としては、例えば、病原性のフザリウム属菌による病害（ウリ科作物（スイカ、メロン等）のつる割病、イチゴの萎黄病、トマトの萎凋病等）、各種作物の苗立枯病、コムギ条斑病、ナス科植物（トマト等）の青枯病、ムギ類萎縮病等が挙げられる。また、本発明が適用される病原体としては、病原性のフザリウム属菌（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．ｓｐ．ｍｅｌｏｎｉｓ、Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．ｓｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅ、Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．ｓｐ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ等のＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ等）をはじめとする糸状菌、ナス科青枯病菌をはじめとする細菌等の土壌伝染性病原体等が挙げられる。
【0036】
また、本発明の別の実施態様によれば、土壌消毒剤の製造における、カプロン酸もしくはその塩またはカプロン酸産生菌の使用が提供される。また、本発明の別の実施態様によれば、土壌消毒剤としての、カプロン酸もしくはその塩またはカプロン酸産生菌の使用が提供される。
【0037】
また、本発明の別の実施態様によれば、以下が提供される。
［１］カプロン酸もしくはその塩またはカプロン酸産生菌を含んでなる、土壌消毒剤。
［２］カプロン酸またはその塩を含んでなる、［１］に記載の土壌消毒剤。
［３］土壌還元消毒法に用いるための、［１］または［２］に記載の土壌消毒剤。
［４］上記カプロン酸産生菌がクロストリジウム属菌を含んでなる、［１］に記載土壌消毒剤。
［５］上記クロストリジウム属菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列が配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する、［４］に記載の土壌消毒剤。
［６］上記カプロン酸産生菌が受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ－０３９４６０の下で寄託されているＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．Ｅ８０１を含んでなる、［１］に記載の土壌消毒剤。
［７］ＮＩＴＥ ＡＰ－０３９４６の下で寄託されているＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．Ｅ８０１。
［８］カプロン酸もしくはその塩またはカプロン酸産生菌を土壌に施用する工程を含んでなる、土壌消毒方法。
［９］上記工程が、カプロン酸またはその塩を土壌に施用する工程である、
［８］に記載の土壌消毒方法。
［１０］土壌還元消毒法である、［８］または［９］に記載の土壌消毒方法。
［１］カプロン酸もしくはその塩またはカプロン酸産生菌を含んでなる、土壌消毒剤。
［２］カプロン酸またはその塩を含んでなる、［１］に記載の土壌消毒剤。
［３］土壌還元消毒法に用いるための、［１］または［２］に記載の土壌消毒剤。
［４］上記カプロン酸産生菌がクロストリジウム属菌を含んでなる、［１］に記載土壌消毒剤。
［５］上記クロストリジウム属菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列が配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する、［４］に記載の土壌消毒剤。
［６］上記カプロン酸産生菌が受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ－０３９４６０の下で寄託されているＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．Ｅ８０１を含んでなる、［１］に記載の土壌消毒剤。
［７］ＮＩＴＥ ＡＰ－０３９４６の下で寄託されているＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．Ｅ８０１。
［８］カプロン酸もしくはその塩またはカプロン酸産生菌を土壌に施用する工程を含んでなる、土壌消毒方法。
［９］上記工程が、カプロン酸またはその塩を土壌に施用する工程である、
［８］に記載の土壌消毒方法。
［１０］土壌還元消毒法である、［８］または［９］に記載の土壌消毒方法。
【実施例0038】
以下の実施例に基づいて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【0039】
試験例１：土壌還元消毒法（ＡＳＤ）の再現実験
Ｆｅ２＋の殺菌への関与を調べるため、鉄をほとんど含まないヤシ殻培地（園芸植物育種研究所より譲渡）を用いてＡＳＤの再現実験を行った。
Ｆｅ２＋の殺菌への関与を調べるため、鉄をほとんど含まないヤシ殻培地（園芸植物育種研究所より譲渡）を用いてＡＳＤの再現実験を行った。
【0040】
５０ｍＬ容バイアル瓶に５ｇのヤシ殻培地を量り入れた。滅菌水２５ｍＬと１％エタノール５ｍＬを加え、窒素ガスで液相を４分間、気相を３０秒間脱気後、ブチル栓とアルミシールで速やかに密栓した。また、密栓後に１２１℃、２０分間のオートクレーブ滅菌を２回行ったものを滅菌コントロールとした。その後、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ． ｓｐ． ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ（Ｆｏｌ）分生子懸濁液を希釈し、１０６ｃｅｌｌｇ－１となるように１ｍＬ添加した。バイアルは３０℃、１７日間インキュベートした。エタノールを加えていない対照試料も調製した。
【0041】
サンプリングは嫌気バック内で行った。嫌気バックの末端を閉じ、窒素ガスを注入した。１～２分後に末端を開放し、ガスを追い出した。再び末端を閉じ、窒素ガスを注入した。十分に窒素ガスが充填したところでガスの注入を止め、嫌気バック内でバイアルを開封した。サンプリングは０、３、６、８、１０、１４、１７日目に行った。
【0042】
酸化還元電位、生菌数、ｐＨの測定
得られたサンプルについて、Ｅｈメーター（ＨＯＲＩＢＡ）を用いて酸化還元電位を測定した。この操作は嫌気バック内で行った。先端を切ったチップを用いてサンプル１ｇを１５ｍＬ容試験管に量り取り、９ｍＬの滅菌水を加えて懸濁液を作製した。懸濁液を滅菌水で適当な倍率に希釈して西村培地（Ｆｏ－Ｇ１培地）（Ｎ．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｍｅｄｉａ ｆｏｒ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ，Ｊ．Ｇｅｎ．ＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌ．，７３，３４２－３４８（２００７））に塗抹した。３０℃で培養後、コロニー数を計数し、Ｆｏｌ生菌数とした。コンパクトｐＨメーター（ＨＯＲＩＢＡ）を用いて、サンプルのｐＨを測定した。残りのサンプルを、先端を切ったチップを用いて１５ ｍＬファルコンチューブに移し、－３０℃で保存した。
得られたサンプルについて、Ｅｈメーター（ＨＯＲＩＢＡ）を用いて酸化還元電位を測定した。この操作は嫌気バック内で行った。先端を切ったチップを用いてサンプル１ｇを１５ｍＬ容試験管に量り取り、９ｍＬの滅菌水を加えて懸濁液を作製した。懸濁液を滅菌水で適当な倍率に希釈して西村培地（Ｆｏ－Ｇ１培地）（Ｎ．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｍｅｄｉａ ｆｏｒ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ，Ｊ．Ｇｅｎ．ＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌ．，７３，３４２－３４８（２００７））に塗抹した。３０℃で培養後、コロニー数を計数し、Ｆｏｌ生菌数とした。コンパクトｐＨメーター（ＨＯＲＩＢＡ）を用いて、サンプルのｐＨを測定した。残りのサンプルを、先端を切ったチップを用いて１５ ｍＬファルコンチューブに移し、－３０℃で保存した。
【0043】
Ｆｅｒｒｏｚｉｎｅ法によるＦｅ
２＋
濃度の測定
また、得られたサンプルについて、Ｆｅ２＋の酸化を防ぐため、嫌気バック内で先端を切ったチップを用いてサンプル５００μＬと２ＮＨＣｌ ５００μＬを混合し塩酸処理を行った。その後、Ｆｅ２＋濃度測定まで－３０℃で保存した。Ｆｅｒｒｏｚｉｎｅ溶液（ＨＥＰＥＳ １１．９ｇ Ｌ－１、Ｆｅｒｒｏｚｉｎｅ（ＰＤＴＳ）１．０ｇＬ－１：ＮａＯＨを用いてｐＨ７．０に調整）を調製した。塩酸処理サンプルを４℃、１７，５００ｇで３分間遠心し、上清を回収した。上清５０μＬとＦｅｒｒｏｚｉｎｅ溶液２．５ｍＬを１０ｍＬ容試験管に加え、ボルテックスミキサーで１５秒間攪拌し、直ちに吸収波長５６２ｎｍの吸光度を測定した。このとき、標準物質には硫酸第一鉄エチルジアミン四水和物（０、５、２５、５０、１００ｍｇ－Ｆｅ Ｌ－１）を用いた。
また、得られたサンプルについて、Ｆｅ２＋の酸化を防ぐため、嫌気バック内で先端を切ったチップを用いてサンプル５００μＬと２ＮＨＣｌ ５００μＬを混合し塩酸処理を行った。その後、Ｆｅ２＋濃度測定まで－３０℃で保存した。Ｆｅｒｒｏｚｉｎｅ溶液（ＨＥＰＥＳ １１．９ｇ Ｌ－１、Ｆｅｒｒｏｚｉｎｅ（ＰＤＴＳ）１．０ｇＬ－１：ＮａＯＨを用いてｐＨ７．０に調整）を調製した。塩酸処理サンプルを４℃、１７，５００ｇで３分間遠心し、上清を回収した。上清５０μＬとＦｅｒｒｏｚｉｎｅ溶液２．５ｍＬを１０ｍＬ容試験管に加え、ボルテックスミキサーで１５秒間攪拌し、直ちに吸収波長５６２ｎｍの吸光度を測定した。このとき、標準物質には硫酸第一鉄エチルジアミン四水和物（０、５、２５、５０、１００ｍｇ－Ｆｅ Ｌ－１）を用いた。
【0044】
ＨＰＬＣによる有機酸の測定
また、得られたサンプルについて、ＡＳＤ中に生成された有機酸をＨＰＬＣ（ＨＩＴＡＣＨＩ、Ｌ－７０００シリーズ）で測定した。検出器にはＤｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＤＡＤ）を使用した。ＤＡＤは紫外・可視域に吸収波長を持つ成分を検出でき、有機酸の測定に一般的に用いられる。サンプルの上清を径０．２０μｍのフィルターで濾過し、分析に供した。このとき、標準物質には、酢酸（０、１、５、２０ｍＭ）、ｎ－酪酸ナトリウム（０、１、５、２０ｍＭ）、カプロン酸ナトリウム（０、１、５、２０ｍＭ）を用いた。
また、得られたサンプルについて、ＡＳＤ中に生成された有機酸をＨＰＬＣ（ＨＩＴＡＣＨＩ、Ｌ－７０００シリーズ）で測定した。検出器にはＤｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＤＡＤ）を使用した。ＤＡＤは紫外・可視域に吸収波長を持つ成分を検出でき、有機酸の測定に一般的に用いられる。サンプルの上清を径０．２０μｍのフィルターで濾過し、分析に供した。このとき、標準物質には、酢酸（０、１、５、２０ｍＭ）、ｎ－酪酸ナトリウム（０、１、５、２０ｍＭ）、カプロン酸ナトリウム（０、１、５、２０ｍＭ）を用いた。
【0045】
ＡＳＤの再現実験の結果
１７日間のＡＳＤ期間中のＦｏｌ生菌数の推移を希釈平板培養によって求めた結果は、図１Ａに示される通りであった。０日目には６．０Ｌｏｇ ＣＦＵ ｇ－１のＦｏｌが存在していた。
１７日間のＡＳＤ期間中のＦｏｌ生菌数の推移を希釈平板培養によって求めた結果は、図１Ａに示される通りであった。０日目には６．０Ｌｏｇ ＣＦＵ ｇ－１のＦｏｌが存在していた。
【0046】
一方で、ＡＳＤの結果、ヤシ殻培地の滅菌と1%エタノールの有無によって殺菌効果が低下した。特にエタノールの有無によって消毒後期に殺菌効果の差が生じ、エタノール添加条件のみで十分な殺菌効果が得られた。生菌数はエタノールの有無により差がでたものの共に１０日目までは減少を続けた。しかし、１０日目以降エタノールありでは、生菌数が検出限界以下まで減少したのに対し、エタノールなしでは、１．５～１．８Ｌｏｇ ＣＦＵｇ－１程度で生菌数が安定した。また、滅菌コントロールでは、１７日間で生菌数が３．０Ｌｏｇ ＣＦＵｇ－１までしか減少しなかった。
【0047】
また、酸化還元電位の結果は、図１Ｂに示される通りであった。測定の結果、０日目の酸化還元電位は－２４２ｍＶであった。エタノールありでは、酸化還元電位は３日目に－１１６ｍＶまで上昇し、１０日目に再び－１９６ｍＶまで低下したが、その後再び上昇した。エタノールなしでは酸化還元電位は徐々に上昇し、１７日目には－４５ｍＶとなった。
【0048】
土壌中のｐＨを経時的に測定した結果、図１Ｃに示される通り、ｐＨはエタノール添加の有無によって大きな差が見られた。測定の結果、０日目のｐＨは５．５であった。全サンプルにおいて、３日目まではｐＨが上昇していることが確認された。その後、エタノールありでは、ｐＨは再び低下していき、１７日目には５．２となった。エタノールなしでは、ｐＨは上昇していき、１７日目には６．３に達した。
【0049】
Ｆｅ２＋濃度の測定の結果、０日目は０．１０ｍＭであった。その後、１７日目には、エタノールありで０．２３ｍＭ、エタノールなしで０．１７ｍＭ、滅菌コントロールで０．１９ｍＭとなり、いずれの条件でも非常に低濃度であった。
【0050】
ＨＰＬＣによる有機酸の測定結果は、図２に示される通りであった。エタノールありでは、６日目まで酢酸の生成量が増加し最大２．８ｍＭ生成したがその後減少した。酪酸の生成は３日目から６日目の間で始まり、１０日目には最大で３．８ｍＭとなったがその後１４日目までに２．２ｍＭへと減少した。一方、カプロン酸の生成は８日目から１０日目の間で始まり、１４日目には、最大で３．１ｍＭとなった（図２Ａ）。これに対し、エタノールなしでは１０日目以降に酢酸の生成が始まり、１７日目に最大で０．６８ｍＭとなった。エタノールありとは異なり酪酸、カプロン酸の生成は見られなかった（図２Ｂ）。
【0051】
以上の結果からヤシ殻培地においてＦｅ２＋はＡＳＤの殺菌因子ではないことが示唆された。なお、本実験ではエタノール無添加条件と滅菌コントロールにおいてもＦｏｌ生菌数がある程度減少したが、窒素ガスでの脱気により、０日目から酸化還元電位が非常に低かったためと推察された。
【0052】
ＡＳＤ中のＦｅ２＋以外の成分を測定した結果、エタノール無添加条件では有機酸はほとんど見られなかったのに対し、エタノール添加条件では酢酸、酪酸、カプロン酸の生成が見られた。また、ＡＳＤ中の有機酸の変化から初期に酢酸が生成され、中期に酢酸が酪酸へ、後期に酪酸がカプロン酸へ変換されたと考えられた。一方、エタノール無添加条件ではｐＨが上昇したのに対し、エタノール添加条件ではｐＨは逆に低下した。有機酸総量とｐＨの経時的変化から、エタノール添加条件では有機酸の蓄積によりｐＨが低下したと考えられた。
【0053】
試験例２：次世代シーケンサーによる細菌群集構造の網羅的解析
ＡＳＤ前後の土壌中細菌群集構造の変化を網羅的に解析するため、以下の手順に従い、次世代シーケンサー（Ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ：ＮＧＳ）解析を行った。－３０℃で保存したサンプルからＤＮＡを抽出し、解析に供した。
ＡＳＤ前後の土壌中細菌群集構造の変化を網羅的に解析するため、以下の手順に従い、次世代シーケンサー（Ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ：ＮＧＳ）解析を行った。－３０℃で保存したサンプルからＤＮＡを抽出し、解析に供した。
【0054】
試験例１で得たサンプルを５００μＬ量りとり、Ｆａｓｔ ＤＮＡ ＳＰＩＮ ｋｉｔ ｆｏｒ Ｓｏｉｌ（ＭＰ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＤＮＡ抽出を行った。抽出方法は付属のプロトコルに従った。抽出したＤＮＡは－３０℃で保存した。
【0055】
サンプルを識別するインデックス配列をＤＮＡに結合させるため１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列のＶ４領域をターゲットとしたプライマーを用いてタグ付けＰＣＲを行った。ＰＣＲ増幅時に正確性が高くエラーが起きにくいＱ５ポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いた。表１に記載のプライマーでＰＣＲ反応を行い、アガロースゲル電気泳動により目的配列の増幅を確認した。５１５ｆプライマーは全てのサンプルで共通であるが、８０６ｒプライマーはタグとして、サンプルごとに異なるインデックス配列をもつように設計されたものを用いた。これらのプライマーにはＭｉＳｅｑのフローセル結合領域や、１６Ｓ配列のユニバーサル領域、インデックス配列が含まれているため配列長が長く、サンプルごとにＰＣＲ効率が異なる。そのため、電気泳動時のバンドの濃さが同等になるようにサイクル数を１７～３０サイクルの間でサンプルごとに変更した。
【0056】
【表1】
【0057】
得られたＰＣＲ反応産物に含まれるプライマーダイマー等の短鎖断片を除去するために、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて精製を行った。操作は付属のプロトコルに従い、２回繰り返し行った。
【0058】
精製サンプルをアガロースゲル電気泳動し、目的配列長である４００ｂｐ付近のバンドを切り出した。切り出したゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＤＮＡを回収した。操作は付属のプロトコルに従った。回収したサンプルのＤＮＡ濃度をＱｕａｎｔ－ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって測定した。すべてのサンプルの濃度を２ｎＭに希釈し、混合したものをライブラリーとしてシーケンス解析に供した。
【0059】
ＭｉＳｅｑ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）と３００－ｃｙｃｌｅ ＭｉＳｅｑ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてペアエンド法によりシーケンス解析を行った。その際にダミーＤＮＡ配列としてＰｈｉＸ ｃｏｎｔｒｏｌ Ｖ３を使用した。シーケンスにより得られた配列はＭｉＳｅｑによるＧｒｅｅｎｇｅｎｅｓデータベースとの相同性検索を行った。また、得られたシーケンスデータからＰｈｉＸ配列を取り除き、ｆａｓｔｑ－ｊｏｉｎ ｔｏｏｌ ｉｎ ｔｈｅ ｅａ－ｕｔｉｌｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐａｃｋａｇｅによりペアエンド配列を結合した後、ＱＩＩＭＥを用いてＱｕａｌｉｔｙが低い配列（Ｑ＜３０）を取り除いた。Ｍｏｔｈｕｒにより得られた配列情報のアライメントを行い、ライブラリーからキメラ配列の決定および除去を行った。キメラ配列の取り除かれたライブラリーをＱＩＩＭＥを用いて解析し、Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｕｎｉｔｓ（ＯＴＵ）（カットオフ値：９７％の配列相同性）を決定した。また、得られたＯＴＵの配列を用いてＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔにより相同性検索を行い、近縁菌を選定した。
【0060】
細菌群集構造の網羅的解析の結果
ＡＳＤによる門レベルでの相対存在量の変化を図３に示した。ＡＳＤ処理前は、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門（４４％）、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ門（１３％）、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ門（８．９％）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門（８．２％）、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門（５．９％）、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅ門（５．２％）が優占していた。一方、ＡＳＤを行った後にはＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門（４４％）とＶｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ門（２１％）は相対存在量が増加したのに対し、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門（２０％）、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ門（４．２％）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門（３．４％）、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅ門（３．０％）は相対存在量が減少した。
ＡＳＤによる門レベルでの相対存在量の変化を図３に示した。ＡＳＤ処理前は、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門（４４％）、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ門（１３％）、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ門（８．９％）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門（８．２％）、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門（５．９％）、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅ門（５．２％）が優占していた。一方、ＡＳＤを行った後にはＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門（４４％）とＶｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ門（２１％）は相対存在量が増加したのに対し、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門（２０％）、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ門（４．２％）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門（３．４％）、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅ門（３．０％）は相対存在量が減少した。
【0061】
ＡＳＤ後の相対存在量が多い順に４つのＯＴＵを、ＡＳＤ前後のＯＴＵ相対存在量と近縁種と共に表２に示した。
【0062】
【表2】
【0063】
Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門細菌のＯＴＵ Ｎｏ．１２７０１とＯＴＵ Ｎｏ．１１４２２が１番目と３番目に優占し、それぞれＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉとＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｗｅｌｌｆｕｎｉａｎｕｍに近縁であった。特にＯＴＵ Ｎｏ．１２７０１は０日目には検出されなかったが、１７日目には全体の２２％まで増加した。Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ門細菌のＯＴＵ Ｎｏ．１２４９８とＯＴＵ Ｎｏ．７７６９が２番目と４番目に優占し、それぞれＥｒｅｂｏｇｌｏｂｕｓ ｌｕｔｅｕｓとＯｐｉｔｕｔｕｓ ｔｅｒｒａｅに近縁であった。
【0064】
試験例３：ＡＳＤ後土壌からの細菌の単離
ＮＧＳによる細菌群集構造の解析結果から、最優占していたＯＴＵ Ｎｏ．１２７０１の単離を試みた。バイアル瓶に蒸留水１９．８ｍＬを入れ、窒素・二酸化炭素混合ガス（Ｎ２：ＣＯ２＝８０％：２０％）で液相を３分間、気相を３０秒間脱気後、ブチル栓とアルミシールで速やかに密栓し嫌気状態とした。その後１２１℃、２０分間のオートクレーブ滅菌を行った。オートクレーブ後、ＡＳＤサンプルの液体成分を２００μＬ加え、ウォーターバスで８０℃、１０分間のヒートショックを行なった。
ヒートショックした接種源１ｍＬをエタノール・酢酸培地１９ｍＬに接種し、３０℃で１週間培養した。培養液１ｍＬを新たなエタノール・酢酸培地に接種し、再び３０℃で１週間培養した。
ＮＧＳによる細菌群集構造の解析結果から、最優占していたＯＴＵ Ｎｏ．１２７０１の単離を試みた。バイアル瓶に蒸留水１９．８ｍＬを入れ、窒素・二酸化炭素混合ガス（Ｎ２：ＣＯ２＝８０％：２０％）で液相を３分間、気相を３０秒間脱気後、ブチル栓とアルミシールで速やかに密栓し嫌気状態とした。その後１２１℃、２０分間のオートクレーブ滅菌を行った。オートクレーブ後、ＡＳＤサンプルの液体成分を２００μＬ加え、ウォーターバスで８０℃、１０分間のヒートショックを行なった。
ヒートショックした接種源１ｍＬをエタノール・酢酸培地１９ｍＬに接種し、３０℃で１週間培養した。培養液１ｍＬを新たなエタノール・酢酸培地に接種し、再び３０℃で１週間培養した。
【0065】
０．４％寒天を加えたエタノール・酢酸培地１７ｍＬを加圧培養試験管（三紳工業）に調製し、４５℃のウォーターバスで保温して寒天が溶解した状態を保った。その後、希釈した集積培養液２ｍＬを接種し、転倒混和後、３０℃で培養した。培養液は段階希釈法によって単一コロニーが形成されるように希釈した。単一コロニーを滅菌パスツールピペットで吸い出し、エタノール・酢酸培地に接種後、３０℃で培養した。この操作をもう一度行い、単離完了とした。以降、無機塩培地で１週間ごとに植え継ぎを行った。以上のとおり、酢酸ナトリウムとエタノールを炭素源とした培地を用いたアガーシェイク法により、細菌Ｅ８０１株を単離した。
【0066】
単離した細菌の形態観察をするため、グラム染色を行った。染色液にはＮａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ社の細菌染色用グラム染色液を用いた。培養液５０μＬをスライドグラスに乗せガスバーナーを用いて完全に乾燥させた後、スライドグラスをガスバーナーの炎に２回くぐらせ菌体を固定した。固定した菌体の上からグラム染色液をかけ１分間染色し、洗い流した。次にグラム染色液で１分間染色し、洗い流した。無水アルコール中でスライドグラスを３０秒間静かに振り、洗い流した。グラム染色液をかけ３０秒間染色し、洗い流した。乾燥後、顕微鏡観察に供した。
【0067】
次に、以下の手法に従い、Ｅ８０１株を１６ＳｒＲＮＡシーケンス解析に供し系統樹を作成した。
まず、培養液１ｍＬをエッペンチューブに移し、８，９００ｇ、４℃で１分間遠心し、菌体を沈殿させた。上清を捨てて滅菌水１ｍＬに懸濁し、再び同条件で遠心した。再び上清を捨て、滅菌水４０μＬに懸濁した。懸濁液の凍結融解を２回繰り返した（凍結：－８０℃で５分間、融解：１００℃で２分間）。Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（１ｍｇ ｍＬ－１）３０μＬとＢＬ ｂｕｆｆｅｒ ５０μＬを加え、チューブを軽くたたいて攪拌した。６０℃、３０分間インキュベートした後、１００℃、１０分間インキュベートし、Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｋを失活させた。１７，５００ｇ、４℃で、５分間遠心し、新しいエッペンチューブに上清６０μＬを回収した。酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）６μＬと１００％エタノール１５０μＬを添加し、－２０℃で２０分間静置した。１７，５００ｇ、４℃で１５分間遠心し、上清を捨てた。７０％エタノール１５０μＬを添加し１７，５００ｇ、４℃で５分間遠心し、上清を捨てた。室温で１０分間乾燥させ、滅菌水２０μＬを添加し、ゲノムＤＮＡを溶解させた。
まず、培養液１ｍＬをエッペンチューブに移し、８，９００ｇ、４℃で１分間遠心し、菌体を沈殿させた。上清を捨てて滅菌水１ｍＬに懸濁し、再び同条件で遠心した。再び上清を捨て、滅菌水４０μＬに懸濁した。懸濁液の凍結融解を２回繰り返した（凍結：－８０℃で５分間、融解：１００℃で２分間）。Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（１ｍｇ ｍＬ－１）３０μＬとＢＬ ｂｕｆｆｅｒ ５０μＬを加え、チューブを軽くたたいて攪拌した。６０℃、３０分間インキュベートした後、１００℃、１０分間インキュベートし、Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｋを失活させた。１７，５００ｇ、４℃で、５分間遠心し、新しいエッペンチューブに上清６０μＬを回収した。酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）６μＬと１００％エタノール１５０μＬを添加し、－２０℃で２０分間静置した。１７，５００ｇ、４℃で１５分間遠心し、上清を捨てた。７０％エタノール１５０μＬを添加し１７，５００ｇ、４℃で５分間遠心し、上清を捨てた。室温で１０分間乾燥させ、滅菌水２０μＬを添加し、ゲノムＤＮＡを溶解させた。
【0068】
抽出したＤＮＡを２５ｎｇμＬ－１に希釈し、Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡとした。表３のプライマーでＰＣＲを行った。その後、アガロースゲル電気泳動によって目的配列の増幅を確認した。
【0069】
【表3】
【0070】
ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＰＣＲ産物の精製を行った。操作は付属のプロトコルに従った。
【0071】
精製ＰＣＲ産物を鋳型とし、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてシーケンス反応を行った。シーケンス反応は表４のプライマーで行った。エッペンチューブに１００％エタノール６０μＬと１２５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）６μＬを加えよく混和させた。シーケンス反応物１０μＬと滅菌水１０μＬを混合し、ここに添加した。室温で１５分間静置後、１７，５００ｇ、４℃で１５分間遠心した。上清を捨て、７０％エタノール２００μＬを加え、１７，５００ｇ、４℃で１０分間遠心した。上清を捨て室温で乾燥させた。ホルムアミド１５μＬを添加し軽く攪拌し、９５℃で３分間加熱した。その後、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３１００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてシーケンス解析を行った。シーケンス解析で得られた配列を用いてＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔにより相同性検索を行った。
【0072】
【表4】
【0073】
その結果、ＯＴＵ Ｎｏ．１２７０１の単離処理により得られた細菌はグラム陽性の桿菌であった（図４）。
この細菌を１６ＳｒＲＮＡシーケンス解析に供し系統樹を作成した結果、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉに近縁で相同率（同一性）は９８．１％であった（図５）。この単離菌株をＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．Ｅ８０１とした。
この細菌を１６ＳｒＲＮＡシーケンス解析に供し系統樹を作成した結果、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉに近縁で相同率（同一性）は９８．１％であった（図５）。この単離菌株をＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．Ｅ８０１とした。
【0074】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉは発酵により、酢酸とエタノールから酪酸を、酪酸とエタノールからカプロン酸を生成することが知られている（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，５５（２），２２３－２３０（１９４８），ＰＮＡＳ，１０５（６），２１２８－２１３３（２００８），Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２４１，６３８－６４４（２０１７）等）。そこで、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．Ｅ８０１はＡＳＤ中の酢酸から酪酸、酪酸からカプロン酸への変換に関与する可能性があると推察し、以下の実験をさらに行った。
【0075】
試験例４：Ｅ８０１株培養上清がＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ． ｓｐ． ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ（Ｆｏｌ）の生育に与える影響の確認試験培養上清添加時のＦｏｌ生菌数の変化
Ｅ８０１株を無機塩培地（ＮＨ４Ｃｌ０．５３５ｇ Ｌ－１、ＫＨ２ＰＯ４ ０．１３６ｇ Ｌ－１、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ０．２０４ｇ Ｌ－１、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０.１４７ｇ Ｌ－１、微量ミネラル溶液１ｍＬ Ｌ－１、ビタミン溶液１ｍＬ Ｌ－１、セレネート／タングステート溶液ｍＬ Ｌ－１、ＮａＨＣＯ３ ２．５２ ｇ Ｌ－１）で３０℃、１週間培養した。培養液１ｍＬをエッペンチューブにとり、８，９００ｇ、４℃で１分間遠心し上清を捨てた。滅菌水１ｍＬを加え懸濁し、再度同じ条件で遠心し上清を捨てた。この操作をもう一度行い、洗浄菌体とした。洗浄菌体を滅菌水１ｍＬに懸濁し、低炭素無機塩培地（無機塩培地においてエタノールと酢酸ナトリウム三水和物の終濃度をそれぞれ２５ｍＭと１０ｍＭに調整したもの)に接種した。３０℃で２週間培養し、培養液を径０．２μｍのフィルターで滅菌した。これをE801培養上清とした。また培養上清をウォーターバスで１００℃、２０分間加熱し、酵素を失活させたものを熱処理培養上清とした。
Ｅ８０１株を無機塩培地（ＮＨ４Ｃｌ０．５３５ｇ Ｌ－１、ＫＨ２ＰＯ４ ０．１３６ｇ Ｌ－１、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ０．２０４ｇ Ｌ－１、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０.１４７ｇ Ｌ－１、微量ミネラル溶液１ｍＬ Ｌ－１、ビタミン溶液１ｍＬ Ｌ－１、セレネート／タングステート溶液ｍＬ Ｌ－１、ＮａＨＣＯ３ ２．５２ ｇ Ｌ－１）で３０℃、１週間培養した。培養液１ｍＬをエッペンチューブにとり、８，９００ｇ、４℃で１分間遠心し上清を捨てた。滅菌水１ｍＬを加え懸濁し、再度同じ条件で遠心し上清を捨てた。この操作をもう一度行い、洗浄菌体とした。洗浄菌体を滅菌水１ｍＬに懸濁し、低炭素無機塩培地（無機塩培地においてエタノールと酢酸ナトリウム三水和物の終濃度をそれぞれ２５ｍＭと１０ｍＭに調整したもの)に接種した。３０℃で２週間培養し、培養液を径０．２μｍのフィルターで滅菌した。これをE801培養上清とした。また培養上清をウォーターバスで１００℃、２０分間加熱し、酵素を失活させたものを熱処理培養上清とした。
【0076】
Ｅ８０１株培養上清がＦｏｌの生育に与える影響を調べるため、低炭素無機塩培地、培養上清または熱処理培養上清を添加したＧＹＰ培地（Ｄ-グルコース２０ｇ Ｌ－１、酵母抽出液５ｇ Ｌ－１、ペプトン１０ｇ Ｌ－１）でＦｏｌを３日間振とう培養し、培養液中のＦｏｌ生菌数を測定した。具体的には、ｐＨ４．０、４．５、５．０、５．５に調整したＧＹＰ培地を１８ｍＬ容試験管に４ｍＬずつ分注した。Ｆｏｌ分生子懸濁液を希釈し、終濃度１０３ｃｅｌｌｍＬ－１となるように５００μＬ添加した。その後、低炭素無機塩培地、Ｅ８０１株培養上清、熱処理培養上清のいずれかを５００μＬ添加し、３０℃、１８０ｒｐｍで３日間振とう培養した。各培養液を適当に希釈し、ＰＤＡ（Ｐｏｔａｔｏ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ａｇａｒ）培地（ＰＤＡ粉末３９ｇ Ｌ－１、１０％酒石酸を用いてｐＨ３．９～４．０に調整）に塗抹した。３０℃で培養し、コロニー数を計数した。
【0077】
結果は表５に示される通りであった。
０日目のＦｏｌ生菌数は２．９Ｌｏｇ ＣＦＵ ｍＬ－１であった。低炭素無機塩培地を添加した場合、Ｆｏｌ生菌数はｐＨに関わらず５．１～５．７Ｌｏｇ ＣＦＵ ｍＬ－１となり、Ｆｏｌの増殖が見られた。培養上清、熱処理培養上清を添加した場合は類似した挙動を示し、ｐＨ４．０と４．５ではＦｏｌは検出されなかったのに対し、ｐＨ５．０と５．５では４．５～５．７Ｌｏｇ ＣＦＵ ｍＬ－１となり、Ｆｏｌの増殖が見られた。
０日目のＦｏｌ生菌数は２．９Ｌｏｇ ＣＦＵ ｍＬ－１であった。低炭素無機塩培地を添加した場合、Ｆｏｌ生菌数はｐＨに関わらず５．１～５．７Ｌｏｇ ＣＦＵ ｍＬ－１となり、Ｆｏｌの増殖が見られた。培養上清、熱処理培養上清を添加した場合は類似した挙動を示し、ｐＨ４．０と４．５ではＦｏｌは検出されなかったのに対し、ｐＨ５．０と５．５では４．５～５．７Ｌｏｇ ＣＦＵ ｍＬ－１となり、Ｆｏｌの増殖が見られた。
【0078】
【表5】
【0079】
Ｅ８０１株培養上清中の有機酸の確認
上記実験において、ｐＨ依存的なＦｏｌ殺菌能が観察されたため、Ｅ８０１株培養上清中に存在する何らかの有機酸が殺菌因子と考えられた。そこで、Ｅ８０１株を低炭素無機塩培地で３０℃、２週間培養し、ＨＰＬＣを用いてＥ８０１株培養上清中の有機酸濃度を経時的に測定した。また、Ｅ８０１株の生育を分光光度計を用いて６００ｎｍの光学密度（ＯＤ６００）で測定した。
上記実験において、ｐＨ依存的なＦｏｌ殺菌能が観察されたため、Ｅ８０１株培養上清中に存在する何らかの有機酸が殺菌因子と考えられた。そこで、Ｅ８０１株を低炭素無機塩培地で３０℃、２週間培養し、ＨＰＬＣを用いてＥ８０１株培養上清中の有機酸濃度を経時的に測定した。また、Ｅ８０１株の生育を分光光度計を用いて６００ｎｍの光学密度（ＯＤ６００）で測定した。
【0080】
結果は、図６に示される通りであった。
Ｅ８０１株の生育は１週間で最大となりＯＤ６００は０．２４４となった。Ｅ８０１株は酢酸を消費し、酪酸、カプロン酸を生産した。酪酸は３日目までに生産が始まり、４日目に最大で３．１ｍＭとなり、その後は減少し２．１～３．０ｍＭとなった。カプロン酸も３日目までに生産が始まり、６日目に最大で９．０ｍＭに達した。
Ｅ８０１株の生育は１週間で最大となりＯＤ６００は０．２４４となった。Ｅ８０１株は酢酸を消費し、酪酸、カプロン酸を生産した。酪酸は３日目までに生産が始まり、４日目に最大で３．１ｍＭとなり、その後は減少し２．１～３．０ｍＭとなった。カプロン酸も３日目までに生産が始まり、６日目に最大で９．０ｍＭに達した。
【0081】
以上の通り、Ｅ８０１株の培養上清中の有機酸をＨＰＬＣで測定した結果、酢酸を消費し、酪酸、カプロン酸を生産していた。酪酸は４日目まで増加し、以降減少したがカプロン酸は増加し続けた。これはＥ８０１株がＣ．ｋｌｕｙｖｅｒｉと同様の代謝を行い、エタノールと酢酸から、鎖長伸長反応で酪酸を経てカプロン酸を生成したためと考えられた。
【0082】
各種有機酸がＦｏｌの生菌数に与える影響の確認
Ｆ８０１株が生産するいずれの有機酸がＦｏｌの生育に影響を与えるか調べるため、酢酸、酪酸、カプロン酸を終濃度１ｍＭで添加したＧＹＰ培地で３日間Ｆｏｌを振とう培養し、培養液中のＦｏｌ生菌数を測定した。
Ｆ８０１株が生産するいずれの有機酸がＦｏｌの生育に影響を与えるか調べるため、酢酸、酪酸、カプロン酸を終濃度１ｍＭで添加したＧＹＰ培地で３日間Ｆｏｌを振とう培養し、培養液中のＦｏｌ生菌数を測定した。
【0083】
結果は、表６に示される通りであった。０日目のＦｏｌ生菌数は３．１Ｌｏｇ ＣＦＵ ｍＬ－１であった。酢酸と酪酸を添加した場合は類似した挙動を示し、Ｆｏｌ生菌数はｐＨに関わらず５．０～６．２Ｌｏｇ ＣＦＵ ｍＬ－１となり、Ｆｏｌの増殖が見られた。これに対し、カプロン酸を添加した場合、ｐＨ４．０とｐＨ４．５ではＦｏｌはほとんど検出されなかった。一方、ｐＨ５．０と５．５では２．４～３．４Ｌｏｇ ＣＦＵ ｍＬ－１となり、接種時のＦｏｌ生菌数が維持されていた。
以上の結果から、カプロン酸は、酢酸や酪酸と比べ、顕著な殺菌効果を有することが示唆された。
以上の結果から、カプロン酸は、酢酸や酪酸と比べ、顕著な殺菌効果を有することが示唆された。
【0084】
【表6】
【0085】
試験例５：ＭＥＳバッファー中のカプロン酸がＦｏｌの生菌数に与える影響の確認
ヤシ殻培地のｐＨ範囲（ｐＨ５．０～５．５）におけるカプロン酸の殺菌能力を評価するため、ＭＥＳバッファーを用いてＦｏｌの非増殖環境でカプロン酸を終濃度０、１、３、５ｍＭ添加し、Ｆｏｌ生菌数の推移を希釈平板培養によって求めた。
ヤシ殻培地のｐＨ範囲（ｐＨ５．０～５．５）におけるカプロン酸の殺菌能力を評価するため、ＭＥＳバッファーを用いてＦｏｌの非増殖環境でカプロン酸を終濃度０、１、３、５ｍＭ添加し、Ｆｏｌ生菌数の推移を希釈平板培養によって求めた。
【0086】
結果は、図７に示される通りであった。
ｐＨ５．０では、カプロン酸０ｍＭでＦｏｌ生菌数が常に２．９～３．７Ｌｏｇ ＣＦＵ ｍＬ－１と維持された。これに対し、カプロン酸３ｍＭと５ｍＭではＦｏｌが３日目に検出されなくなった。また、カプロン酸１ｍＭではＦｏｌ生菌数は徐々に減少し、７日目には０．７２ Ｌｏｇ ＣＦＵ ｍＬ－１となった。一方、ｐＨ５．５でもカプロン酸０ｍＭではＦｏｌ生菌数が常に２．９～４．１ Ｌｏｇ ＣＦＵ ｍＬ－１と維持されたのに対し、カプロン酸３ｍＭと５ｍＭではｐＨ５．０と比べ緩やかだったもののＦｏｌ生菌数が減少し、それぞれ５日目と７日目に検出されなくなった。また、カプロン酸１ｍＭでは５日目まではＦｏｌ生菌数はほとんど減少しなかったが、７日目には１．７Ｌｏｇ ＣＦＵ ｍＬ－１へと減少した。
以上の結果から、カプロン酸は顕著な殺菌効果を有することが示唆された。
ｐＨ５．０では、カプロン酸０ｍＭでＦｏｌ生菌数が常に２．９～３．７Ｌｏｇ ＣＦＵ ｍＬ－１と維持された。これに対し、カプロン酸３ｍＭと５ｍＭではＦｏｌが３日目に検出されなくなった。また、カプロン酸１ｍＭではＦｏｌ生菌数は徐々に減少し、７日目には０．７２ Ｌｏｇ ＣＦＵ ｍＬ－１となった。一方、ｐＨ５．５でもカプロン酸０ｍＭではＦｏｌ生菌数が常に２．９～４．１ Ｌｏｇ ＣＦＵ ｍＬ－１と維持されたのに対し、カプロン酸３ｍＭと５ｍＭではｐＨ５．０と比べ緩やかだったもののＦｏｌ生菌数が減少し、それぞれ５日目と７日目に検出されなくなった。また、カプロン酸１ｍＭでは５日目まではＦｏｌ生菌数はほとんど減少しなかったが、７日目には１．７Ｌｏｇ ＣＦＵ ｍＬ－１へと減少した。
以上の結果から、カプロン酸は顕著な殺菌効果を有することが示唆された。
【0087】
試験例6：ヤシ殻培地中でカプロン酸がＦｏｌの生菌数に与える影響の確認
カプロン酸が実際にヤシ殻培地中で十分な殺菌効果を有するか調べるため、乾燥ヤシ殻培地に酢酸、酪酸、カプロン酸を終濃度３ｍＭで添加し、Ｆｏｌ生菌数の推移を希釈平板培養によって求めた。
カプロン酸が実際にヤシ殻培地中で十分な殺菌効果を有するか調べるため、乾燥ヤシ殻培地に酢酸、酪酸、カプロン酸を終濃度３ｍＭで添加し、Ｆｏｌ生菌数の推移を希釈平板培養によって求めた。
【0088】
結果は、図８に示される通りであった。
０日目のＦｏｌ生菌数は５．３Ｌｏｇ ＣＦＵ ｇ－１であった。有機酸なし、酢酸、酪酸では類似した挙動が見られ、Ｆｏｌ生菌数は減少したものの、６日間で３．２～３．３Ｌｏｇ ＣＦＵ ｇ－１まで減少するにとどまった。これに対し、カプロン酸を添加した場合、２日目から４日目の間にＦｏｌ生菌数が急激に減少し始め、６日目には検出されなくなった。
以上の結果から、カプロン酸はヤシ殻培地中でも殺菌効果を持つことが示された。
０日目のＦｏｌ生菌数は５．３Ｌｏｇ ＣＦＵ ｇ－１であった。有機酸なし、酢酸、酪酸では類似した挙動が見られ、Ｆｏｌ生菌数は減少したものの、６日間で３．２～３．３Ｌｏｇ ＣＦＵ ｇ－１まで減少するにとどまった。これに対し、カプロン酸を添加した場合、２日目から４日目の間にＦｏｌ生菌数が急激に減少し始め、６日目には検出されなくなった。
以上の結果から、カプロン酸はヤシ殻培地中でも殺菌効果を持つことが示された。
【0089】
試験例７：カプロン酸がＲ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍの生菌数に与える影響の確認
カプロン酸がＦｏｌ以外の植物病原菌にも殺菌効果を有するかを、トマト青枯病菌Ｒ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍを用いて調べた。具体的には、まず、ｐＨ５．０、５．５に調整した１００ｍＭ ＭＥＳバッファーを１８ｍＬ容試験管に４ｍＬずつ分注した。次に、１０，０００培希釈したＲ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍの菌体懸濁液を５００μＬ添加した。その後、１００ｍＭカプロン酸溶液を滅菌水で希釈し、終濃度０、１、３、５ｍＭとなるように５００μＬ添加した。３０℃で７日間静置した。サンプルを１．６％寒天ＣＰＧ培地に塗抹した。３０℃で培養し、コロニー数を計数した。また、カプロン酸と同様に酢酸および酪酸を添加した対照試料も調製した。
カプロン酸がＦｏｌ以外の植物病原菌にも殺菌効果を有するかを、トマト青枯病菌Ｒ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍを用いて調べた。具体的には、まず、ｐＨ５．０、５．５に調整した１００ｍＭ ＭＥＳバッファーを１８ｍＬ容試験管に４ｍＬずつ分注した。次に、１０，０００培希釈したＲ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍの菌体懸濁液を５００μＬ添加した。その後、１００ｍＭカプロン酸溶液を滅菌水で希釈し、終濃度０、１、３、５ｍＭとなるように５００μＬ添加した。３０℃で７日間静置した。サンプルを１．６％寒天ＣＰＧ培地に塗抹した。３０℃で培養し、コロニー数を計数した。また、カプロン酸と同様に酢酸および酪酸を添加した対照試料も調製した。
【0090】
結果は、図９に示される通りであった。
ｐＨ５．０では酢酸、酪酸、カプロン酸すべてで類似した挙動を示し、０ｍＭと１ｍＭでは常に生菌数が３．２～４．７Ｌｏｇ ＣＦＵ ｍＬ－１と維持されたのに対し、３ｍＭと５ｍＭでは酢酸と酪酸に比べカプロン酸が強い殺菌効果を示した。
ｐＨ５．５では酢酸と酪酸が類似した挙動を示し、いずれの濃度でも生菌数が３．０～４．６ Ｌｏｇ ＣＦＵ ｍＬ－１と維持され、殺菌効果を失った。これに対し、カプロン酸３ｍＭと５ｍＭではｐＨ５．０と比べ殺菌の速度が落ちたものの、十分な殺菌効果が見られた。
以上の結果から、カプロン酸はＦｏｌ以外の植物病原菌にも殺菌効果を有することが示唆された。
ｐＨ５．０では酢酸、酪酸、カプロン酸すべてで類似した挙動を示し、０ｍＭと１ｍＭでは常に生菌数が３．２～４．７Ｌｏｇ ＣＦＵ ｍＬ－１と維持されたのに対し、３ｍＭと５ｍＭでは酢酸と酪酸に比べカプロン酸が強い殺菌効果を示した。
ｐＨ５．５では酢酸と酪酸が類似した挙動を示し、いずれの濃度でも生菌数が３．０～４．６ Ｌｏｇ ＣＦＵ ｍＬ－１と維持され、殺菌効果を失った。これに対し、カプロン酸３ｍＭと５ｍＭではｐＨ５．０と比べ殺菌の速度が落ちたものの、十分な殺菌効果が見られた。
以上の結果から、カプロン酸はＦｏｌ以外の植物病原菌にも殺菌効果を有することが示唆された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】