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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024064062
(43)【公開日】2024-05-14
(54)【発明の名称】多糖類生産性細胞の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/04 20060101AFI20240507BHJP
C12P 19/04 20060101ALI20240507BHJP
A01H 6/12 20180101ALN20240507BHJP
【ＦＩ】
C12N5/04
C12P19/04 Z
A01H6/12
【審査請求】未請求
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022172374
(22)【出願日】2022-10-27
(71)【出願人】
【識別番号】000000918
【氏名又は名称】花王株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】山下 大智
(72)【発明者】
【氏名】小川 晃範
(72)【発明者】
【氏名】遠藤 圭二
【テーマコード（参考）】
2B030
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
2B030AA02
2B030AB03
2B030AD07
2B030AD08
2B030CB02
2B030CD05
2B030CD07
2B030CD09
2B030CD10
2B030CD17
4B064AF11
4B064CA11
4B064CC03
4B064CD02
4B064DA20
4B065AA88X
4B065AA89X
4B065AC14
4B065AC15
4B065BB03
4B065BB04
4B065BB35
4B065BD50
4B065CA01
4B065CA22
4B065CA50
(57)【要約】
【課題】多糖類高生産性細胞を効率よく製造する方法の提供。
【解決手段】
細胞外に多糖類を分泌する植物細胞を、基本培地に金属塩が終濃度で５～２００ｍＭ高くなるように添加された固体培地で培養してカルス誘導することを含む、多糖類生産性細胞の製造方法。
【選択図】なし
【解決手段】
細胞外に多糖類を分泌する植物細胞を、基本培地に金属塩が終濃度で５～２００ｍＭ高くなるように添加された固体培地で培養してカルス誘導することを含む、多糖類生産性細胞の製造方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞外に多糖類を分泌する植物細胞を、基本培地に金属塩が終濃度で５～２００ｍＭ高くなるように添加された固体培地で培養してカルス誘導することを含む、多糖類生産性細胞の製造方法。
【請求項2】
誘導されたカルスを液体培地で培養することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項3】
金属塩が、カリウム、ナトリウム、カルシウム、及びマグネシウムからなる群より選択される少なくとも１種の金属の塩である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項4】
固体培地が、オーキシン類からなる群より選択される少なくとも１種、又はオーキシン類からなる群より選択される少なくとも１種とサイトカイニン類からなる群より選択される少なくとも１種の組み合わせの植物ホルモンを含有する、請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
【請求項5】
固体培地が炭素源を含有する、請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
【請求項6】
植物がポリアンテス属植物である、請求項１～５のいずれか１項記載の方法。
【請求項7】
植物がポリアンテス属のチューベロース（Ｐｏｌｉａｎｔｈｅｓ ｔｕｂｅｒｏｓａ Ｌ．)である、請求項１～６のいずれか１項記載の方法。
【請求項8】
多糖類がグルクロン酸、マンノース、アラビノース、ガラクトース、及びキシロースを構成成分とする酸性ヘテロ多糖である、請求項１～７のいずれか１項記載の方法。
【請求項9】
カルス誘導開始時から液体培地で培養を開始するまでの期間が３００日以内である、請求項２～８のいずれか１項記載の方法。
【請求項10】
請求項１～９のいずれか１項記載の方法により製造された多糖類生産性細胞を液体培地で培養すること含む、多糖類の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、多糖類生産性細胞の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
多糖類を生産する植物としては多くの種類のものが知られている。そのような植物からの多糖類の取得には、天然の、又は栽培した植物の種子、果実、花、茎、幹、葉、根、塊茎、あるいは塊根等からの抽出またはタッピング等による方法が利用されている。しかし、それらの天然の植物または栽培植物は、自然環境や天候の影響を受け易く、従って生産量や価格が安定しないという欠点がある。このため、それらの植物の細胞または組織を液体培地にて培養することによって、細胞や組織を増殖させ、同時に多糖類を生産させて、培地中に分泌させる方法も利用されている。
【0003】
植物細胞の培養による多糖類の製造方法は、自然環境や天候の影響を受けないため、多糖類を安定的に生産することができる有利な方法ということができ、斯かる方法において多糖類の生産量向上が可能となる技術が求められている。
【0004】
たとえば、特許文献１及び２では、ポリアンテス属のチューベロースから誘導されるカルスなどの植物細胞を液体培地にて培養する際に、その液体培地に一定範囲の量の金属塩を存在させることによって多糖類の生産量の向上を図っている。多糖類生産用細胞は一般に、対象の植物からカルスを誘導した後、このカルスを継代培養することにより増殖させて多数の細胞として取得し、この増殖した多糖類生産用細胞を大量の液体培地にて培養して多糖類を生産させ、細胞外に分泌させ、最後に、この細胞外に分泌された多糖類を細胞から分離して、目的の多糖類を取得する方法に利用される。特許文献１では、多糖類生産用液体培地に金属塩を存在させて、液体培地の粘度の上昇を抑制している。そして、液体培地の粘度の上昇が抑制される結果、培養液の拡散、混合が良好になり、多糖類の生産性が向上する他、カルスや細胞と目的物を含有する上澄液との分離も容易となり生産性が向上するとされている。また、特許文献２では、継代培養時の液体培地に金属塩を存在させることで、多糖類生産用細胞のストレス耐性が向上し、多糖類の生産性が増すとされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特開平５－２０７８８８号公報
【特許文献2】特開平８－１３１１５９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明者が、細胞外に多糖類を分泌する植物細胞を固体培地で培養してカルス誘導し、次いでカルスを液体培地で培養する従来の多糖類生産性細胞の製造方法について検討したところ、得られた多糖類生産性細胞には、由来するカルスの株によって多糖類生産能に大きな差があり、多糖類生産能の低い多糖類低生産性細胞（株）が存在することが判明した。植物細胞の培養による多糖類生産にあたっては、多糖類生産能の高い多糖類高生産性細胞が好適に利用されることから、多糖類高生産性細胞を効率よく製造する手法が望まれる。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者は、細胞外に多糖類を分泌する植物細胞を基本培地にさらに特定濃度の金属塩が添加された固体培地で培養してカルス誘導することで、多糖類生産能の低い多糖類低生産性細胞を選択的に除去できること、換言すれば、多糖類生産能の高い多糖類高生産性細胞を効率よく製造できること、また、多糖類生産性細胞の製造に要する期間を短縮できることを見出した。
【0008】
すなわち、本発明は、細胞外に多糖類を分泌する植物細胞を、基本培地に金属塩が終濃度で５～２００ｍＭ高くなるように添加された固体培地で培養してカルス誘導することを含む、多糖類生産性細胞の製造方法を提供する。
本発明は、また、該多糖類生産性細胞の製造方法により製造された多糖類生産性細胞を液体培地で培養すること含む、多糖類の生産方法を提供する。
本発明は、また、該多糖類生産性細胞の製造方法により製造された多糖類生産性細胞を液体培地で培養すること含む、多糖類の生産方法を提供する。
【発明の効果】
【0009】
本発明によれば、多糖類低生産性細胞を選択的に除去でき、多糖類高生産性細胞を短期間で効率よく製造できる。該多糖類高生産性細胞を用いることにより、多糖類の生産量向上が可能となる。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
【0011】
本発明において、「カルス」とは、植物細胞が脱分化して生じる再分化能を有する細胞塊を指す。植物細胞からカルスを形成させることを「カルス誘導」という。
【0012】
本発明で用いられる「植物の細胞」は、それが多糖類を生産する種類のものである限り特に制限はなく、例えば、アオイ科植物のオクラ、アオイ科植物のブッソウゲ、セリ科植物のニンジン、シソ科植物のハッカなど各種の植物の細胞を用いることができる。なかでも、本発明では、好ましくはポリアンテス属（Ｐｏｌｉａｎｔｈｅｓ Ｌ．）の植物の細胞、より好ましくはポリアンテス属のチューベロース（Ｐｏｌｉａｎｔｈｅｓ ｔｕｂｅｒｏｓａ Ｌ．）の細胞を好適に使用できる。
【0013】
ポリアンテス属のチューベロースから誘導されるカルスは、チューベロース多糖（Ｔｕｂｅｒｏｓｅ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ；ＴＰＳ）を生産することで知られている。ＴＰＳは、グルクロン酸、マンノース、アラビノース、ガラクトース、及びキシロースを構成成分とする酸性ヘテロ多糖であり、表面平滑化効果や角質保護効果を有することから、化粧品配合成分として有用である。
【0014】
一態様において、本発明は、多糖類生産性細胞の製造方法を提供する。当該方法は、細胞外に多糖類を分泌する植物細胞を、基本培地に金属塩が終濃度で５～２００ｍＭ高くなるように添加された固体培地でカルス誘導することを含む。
【0015】
カルス誘導に用いられる固体培地は、基本培地に本来含まれる金属塩に加えてさらに金属塩が添加された固体培地であり、基本培地にさらなる金属塩が添加されていない固体培地は包含されない。固体培地は、基本培地に所定量の金属塩、アガロース、ゲランガム、寒天などのゲル化剤、及び必要に応じて用いられるその他の成分を添加して、常法により調製することができる。ここで、基本培地とは、植物細胞の維持、増殖が可能な培地を指す。基本培地としては、植物細胞の培養に通常用いられる培地を使用することができ、また、市販品を使用することもできる。基本培地の例としては、ＬＳ（Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ－Ｓｋｏｏｇ）培地、ＭＳ（Ｍｕｒａｓｉｇｅ－Ｓｋｏｏｇ）培地、Ｇａｍｂｏｒｇ Ｂ５培地（Ｓｉｇｍａ、Ｇ５７６８）、Ｗｈｉｔｅ培地（Ｓｉｇｍａ、Ｗ０８７６）、Ｃｈｕ（Ｎ６）培地（Ｓｉｇｍａ、Ｃ１４１６）、ＤＫＷ培地（Ｓｉｇｍａ、Ｄ６１６２）、Ｈｏａｇｌａｎｄ培地（Ｓｉｇｍａ、Ｈ２３９５）、ＭｃＣｏｗｎ培地（Ｓｉｇｍａ、Ｍ６７７４）、ＳＨ培地（Ｓｉｇｍａ、Ｓ６７６５）などが挙げられる。なかでも、ＬＳ培地又はＭＳ培地が好ましい。
【0016】
基本培地には、通常、一定の金属塩が含まれている。例えば、基本培地に含まれるカリウム塩濃度は、ＬＳ培地で２０．０ｍＭ、ＭＳ培地で２０．０ｍＭ、Ｇａｍｂｏｒｇ Ｂ５培地で２４．７ｍＭ、Ｗｈｉｔｅ培地で１．７ｍＭ、Ｃｈｕ（Ｎ６）培地で３０．９ｍＭ、ＤＫＷ培地で１９．８ｍＭ、Ｈｏａｇｌａｎｄ培地で６．０ｍＭ、ＭｃＣｏｗｎ培地で１２．６ｍＭ、ＳＨ培地で２４．７ｍＭである。また、基本培地に含まれるナトリウム塩濃度は、ＬＳ培地で０．２ｍＭ、ＭＳ培地で０．２ｍＭ、Ｇａｍｂｏｒｇ Ｂ５培地で１．３ｍＭ、Ｗｈｉｔｅ培地で３．０ｍＭ、Ｃｈｕ（Ｎ６）培地で０．２ｍＭ、ＤＫＷ培地で０．３ｍＭ、Ｈｏａｇｌａｎｄ培地で０．０ｍＭ、ＭｃＣｏｗｎ培地で０．２ｍＭ、ＳＨ培地で０．１ｍＭである。また、基本培地に含まれるカルシウム塩濃度は、ＬＳ培地で３．０ｍＭ、ＭＳ培地で３．０ｍＭ、Ｇａｍｂｏｒｇ Ｂ５培地で１．０ｍＭ、Ｗｈｉｔｅ培地で１．２ｍＭ、Ｃｈｕ（Ｎ６）培地で１．１ｍＭ、ＤＫＷ培地で９．３ｍＭ、Ｈｏａｇｌａｎｄ培地で４．０ｍＭ、ＭｃＣｏｗｎ培地で３．０ｍＭ、ＳＨ培地で１．４ｍＭである。また、基本培地に含まれるマグネシウム塩濃度は、ＬＳ培地で１．５ｍＭ、ＭＳ培地で１．５ｍＭ、Ｇａｍｂｏｒｇ Ｂ５培地で１．０ｍＭ、Ｗｈｉｔｅ培地で３．０ｍＭ、Ｃｈｕ（Ｎ６）培地で０．８ｍＭ、ＤＫＷ培地で３．０ｍＭ、Ｈｏａｇｌａｎｄ培地で２．０ｍＭ、ＭｃＣｏｗｎ培地で１．５ｍＭ、ＳＨ培地で１．６ｍＭである。また、基本培地に含まれる金属塩濃度は、合計で、ＬＳ培地で２５．０ｍＭ、ＭＳ培地で２５．０ｍＭ、Ｇａｍｂｏｒｇ Ｂ５培地で２８．２ｍＭ、Ｗｈｉｔｅ培地で８．９ｍＭ、Ｃｈｕ（Ｎ６）培地で３３．２ｍＭ、ＤＫＷ培地で３２．８ｍＭ、Ｈｏａｇｌａｎｄ培地で１２．０ｍＭ、ＭｃＣｏｗｎ培地で１７．６ｍＭ、ＳＨ培地で２８．０ｍＭである。
【0017】
カルス誘導に用いられる固体培地は、基本培地に本来含まれる金属塩に加えてさらに金属塩を含有する。基本培地に添加される金属塩の濃度は、終濃度として、５ｍＭ以上が好ましく、８ｍＭ以上がより好ましく、１０ｍＭ以上がさらに好ましく、かつ２００ｍＭ以下が好ましく、１５０ｍＭ以下がより好ましく、１００ｍＭ以下がさらに好ましい。すなわち、金属塩濃度が、基本培地に本来含まれる金属塩の濃度と比較して終濃度として、好ましくは５ｍＭ以上、より好ましくは８ｍＭ以上、さらに好ましくは１０ｍＭ以上、かつ好ましくは２００ｍＭ以下、より好ましくは１５０ｍＭ以下、さらに好ましくは１００ｍＭ以下高くなるように金属塩が添加される。基本培地に添加される金属塩の濃度範囲は、終濃度として、５～２００ｍＭが好ましく、８～１５０ｍＭがより好ましく、１０～１００ｍＭがさらに好ましい。固体培地における金属塩濃度は、基本培地に本来含まれる金属塩と基本培地に添加される金属塩の合計濃度であり、終濃度として、１３ｍＭ以上が好ましく、１６ｍＭ以上がより好ましく、１８ｍＭ以上がさらに好ましく、かつ２３５ｍＭ以下が好ましく、１８５ｍＭ以下がより好ましく、１３５ｍＭ以下がさらに好ましい。固体培地における金属塩濃度範囲は、終濃度として、１３～２３５ｍＭが好ましく、１６～１８５ｍＭがより好ましく、１８～１３５ｍＭがさらに好ましい。
【0018】
あるいは、基本培地に添加される金属塩の濃度は、終濃度として、基本培地に本来含まれる金属塩の濃度を１００％としたときに、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは４０％以上、かつ好ましくは５００％以下、より好ましくは４５０％以下、さらに好ましくは４００％以下の濃度であり得る。すなわち、金属塩濃度が、基本培地に本来含まれる金属塩の濃度を１００％としたときに、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは４０％以上、かつ好ましくは５００％以下、より好ましくは４５０％以下、さらに好ましくは４００％以下高くなるように金属塩が添加される。基本培地に添加される金属塩の濃度範囲は、基本培地に本来含まれる金属塩の濃度を１００％としたときに、好ましくは２０～５００％、より好ましくは３０～４５０％、さらに好ましくは４０～４００％の濃度範囲であり得る。
【0019】
金属塩としては、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属、カルシウム、マグネシウム、バリウムなどのアルカリ土類金属、そして鉄、亜鉛、アルミニウムなどの一～三価の金属の塩、例えば、塩化物、硫酸塩、炭酸塩、リン酸塩、硝酸塩が用いられる。具体的な金属塩の例としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化バリウム、塩化マグネシウム、塩化鉄、塩化亜鉛、塩化アルミニウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸バリウム、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、硫酸アルミニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、炭酸バリウム、炭酸マグネシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸カルシウム、リン酸マグネシウム、リン酸バリウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸カルシウム、硝酸マグネシウム、硝酸バリウムなどを挙げることができる。このうち、アルカリ金属の塩及びアルカリ土類金属の塩からなる群より選択される少なくとも１種が好ましく、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、及びマグネシウム塩からなる群より選択される少なくとも１種がより好ましく、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、及び塩化マグネシウムからなる群より選択される少なくとも１種がさらに好ましい。
【0020】
固体培地には、カルス誘導効率の観点から、植物ホルモンが添加されていることが好ましい。植物ホルモンの種類や濃度は、用いる植物細胞に応じて適宜選択、設定すればよい。植物ホルモンとしては、２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）、α－ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、インドール酢酸（ＩＡＡ）、インドール酪酸（ＩＢＡ）等のオーキシン類；フルフリルアミノプリン（カイネチン）、６－ベンジルアミノプリン（ＢＡ）、ジメチルアミノプリン（２ｉＰ）等のサイトカイニン類が挙げられる。なかでも、オーキシン類からなる群より選択される少なくとも１種、又はオーキシン類からなる群より選択される少なくとも１種とサイトカイニン類からなる群より選択される少なくとも１種の組み合わせが好ましく、２，４－ＤもしくはＮＡＡ単独、ＮＡＡとＢＡの組み合わせ、２，４－Ｄとカイネチンの組み合わせ、２，４－ＤとＢＡの組み合わせ、又はＮＡＡとカイネチンの組み合わせがより好ましい。固体培地中の植物ホルモンの濃度は、例えば、２，４－Ｄ又はＮＡＡを単独で用いる場合、５×１０－４Ｍから１×１０－７Ｍが好ましく、１×１０－５Ｍから１×１０－６Ｍがより好ましく、ＮＡＡとＢＡの組み合わせ、２，４－Ｄとカイネチンの組み合わせ、２，４－ＤとＢＡの組み合わせ、又はＮＡＡとカイネチンの組み合わせを用いる場合、２，４－Ｄ又はＮＡＡの濃度は、１×１０－４Ｍから１×１０－７Ｍが好ましく、１×１０－４Ｍから５×１０－６Ｍがより好ましく、そしてＢＡ又はカイネチンの濃度は１×１０－５Ｍから１×１０－９Ｍが好ましく、１×１０－６Ｍから１×１０－７Ｍがより好ましい。
【0021】
固体培地には、さらに炭素源等の公知の各種の添加剤が添加されていてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、マンノース、キシロース、スクロース、ラムノース、フコース、デンプンなどが用いられ、通常はスクロースなどの少糖類が炭素源として用いられる。炭素源は、通常は０．５～１０重量％、好ましくは１～７重量％、より好ましくは３～５重量％の範囲の濃度で用いられる。
【0022】
固体培地のｐＨは、例えば、４．５～７．０が好ましく、５．５～６．５がより好ましい。
【0023】
本発明の多糖類生産性細胞の製造方法においては、細胞外に多糖類を分泌する植物細胞を上記固体培地で培養してカルスを誘導する。例えば、植物細胞として植物体の一部を上記固体培地上に置床して培養することで、該植物細胞からカルスを誘導することができる。植物体の一部としては、特に限定されず、葉、茎、花、芽、果皮、果実、木質部、樹皮、根、根茎、種子、それらの一部、及びそれらの組み合わせなどが挙げられ、植物の種類に応じて適宜選択すればよい。例えば、ポリアンテス属（Ｐｏｌｉａｎｔｈｅｓ Ｌ．）の植物であれば、花の一部を用いるのが好ましく、花弁を用いるのがより好ましい。カルス誘導に供する植物体の一部の大きさは、カルス誘導が可能な大きさである限り特に限定されない。カルス誘導に供する植物体の一部は、事前に常法により滅菌しておくことが好ましい。
【0024】
カルス誘導のための培養条件は、カルス誘導が可能な条件であればいかなる条件であってもよく、植物の種類、用いる植物の部位、培地の種類等に応じて適切に調節され得る。例えば、培養温度は、好ましくは１５～３５℃、より好ましくは２０～３０℃である。培養期間は、好ましくは１０～１２０日間、より好ましくは３０～９０日間である。また、好ましくは暗所で培養される。ここで、暗所とは、植物細胞培養で通常用いられる暗所を意味し、完全に暗所である必要はない。
【0025】
斯くして誘導されたカルスは、多糖類生産性細胞であり、液体培地で培養することでさらに増殖させて多数の多糖類生産性細胞を得ることができる。よって、一実施形態において、本発明の多糖類生産性細胞の製造方法は、誘導されたカルスを液体培地で培養することをさらに含んでいてもよい。一方、液体培地での培養を行う前に、必要に応じて、誘導されたカルスを同じ状態を維持したまま上記固体培地を用いて継代培養することもできる。よって、別の一実施形態において、本発明の多糖類生産性細胞の製造方法は、誘導されたカルスを上記固体培地で継代培養すること、及び継代培養されたカルスを液体培地で培養することをさらに含んでいてもよい。
【0026】
上記固体培地での継代培養は、好ましくは１５～３５℃、より好ましくは２０～３０℃で、好ましくは１０～１２０日間、より好ましくは３０～９０日間の培養を数回実施することにより行うことができる。継代回数に特に制限はないが、通常は１０回以下である。カルス誘導開始時から液体培地で培養を開始するまでの期間（カルス誘導のための上記固体培地での培養開始日を１日目とし、誘導されたあるいは誘導され上記固体培地で継代されたカルスの液体培地での培養開始日の前日を最終日とする期間）は、最短でカルス誘導のための上記固体培地での培養期間に相当し、また、３００日以内が好ましく、２００日以内がより好ましく、１００日以内がさらに好ましい。
【0027】
カルスの培養のための液体培地としては、カルス誘導のための固体培地の基本培地と同様のものを用いることができる。このうち、ＬＳ培地又はＭＳ培地が好ましい。液体培地には、さらに植物ホルモンや炭素源等の公知の各種の添加剤が添加されていてもよい。植物ホルモンの種類や濃度は、多糖類の生産性に関係がある。植物ホルモンとしては、例えば、２，４－Ｄ、ＮＡＡ、ＩＡＡ、ＩＢＡなどのオーキシン類；カイネチン、ＢＡ、２ｉＰなどのサイトカイニン類；ジベレリンＡ３（ＧＡ３）などのジベレリン類などを使用することができる。なかでも、オーキシン類からなる群より選択される少なくとも１種、又はオーキシン類からなる群より選択される少なくとも１種とサイトカイニン類からなる群より選択される少なくとも１種の組み合わせが好ましく、２，４－ＤもしくはＮＡＡ単独、ＮＡＡとＢＡの組み合わせ、２，４－Ｄとカイネチンの組み合わせ、２，４－ＤとＢＡの組み合わせ、又はＮＡＡとカイネチンの組み合わせがより好ましい。液体培地中の植物ホルモンの濃度は、２，４－Ｄ又はＮＡＡを単独で用いる場合、５×１０－４Ｍから１×１０－７Ｍが好ましく、１×１０－５Ｍから１×１０－６Ｍがより好ましく、ＮＡＡとＢＡの組み合わせ、２，４－Ｄとカイネチンの組み合わせ、２，４－ＤとＢＡの組み合わせ、又はＮＡＡとカイネチンの組み合わせを用いる場合、２，４－Ｄ又はＮＡＡの濃度は、１×１０－４Ｍから１×１０－７Ｍが好ましく、１×１０－４Ｍから５×１０－６Ｍがより好ましく、ＢＡ又はカイネチンの濃度は、１×１０－５Ｍから１×１０－９Ｍが好ましく、１×１０－６Ｍから１×１０－７Ｍがより好ましい。
【0028】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、マンノース、キシロース、スクロース、ラムノース、フコース、デンプンなどが用いられ、通常はスクロースなどの少糖類が炭素源として用いられる。炭素源は、通常は０．５～１０重量％、好ましくは１～７重量％、より好ましくは３～５重量％の範囲の濃度で用いられる。
【0029】
液体培地には、多糖類生産性の向上の観点から、基本培地に本来含まれる金属塩に加えてさらに金属塩が添加されていてもよい。基本培地に添加される金属塩の濃度は、終濃度として、５ｍＭ以上が好ましく、８ｍＭ以上がより好ましく、１０ｍＭ以上がさらに好ましく、かつ２００ｍＭ以下が好ましく、１５０ｍＭ以下がより好ましく、１００ｍＭ以下がさらに好ましい。すなわち、金属塩濃度が、基本培地に本来含まれる金属塩の濃度と比較して終濃度として、好ましくは５ｍＭ以上、より好ましくは８ｍＭ以上、さらに好ましくは１０ｍＭ以上、かつ好ましくは２００ｍＭ以下、より好ましくは１５０ｍＭ以下、さらに好ましくは１００ｍＭ以下高くなるように金属塩が添加される。基本培地に添加される金属塩の濃度範囲は、終濃度として、５～２００ｍＭが好ましく、８～１５０ｍＭがより好ましく、１０～１００ｍＭがさらに好ましい。液体培地における金属塩濃度は、基本培地に本来含まれる金属塩と基本培地に添加される金属塩の合計濃度であり、終濃度として、１３ｍＭ以上が好ましく、１６ｍＭ以上がより好ましく、１８ｍＭ以上がさらに好ましく、かつ２３５ｍＭ以下が好ましく、１８５ｍＭ以下がより好ましく、１３５ｍＭ以下がさらに好ましい。液体培地における金属塩濃度範囲は、１３～２３５ｍＭが好ましく、１６～１８５ｍＭがより好ましく、１８～１３５ｍＭがさらに好ましい。
【0030】
あるいは、基本培地に添加される金属塩の濃度は、終濃度として、基本培地に本来含まれる金属塩の濃度を１００％としたときに、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは４０％以上、かつ好ましくは５００％以下、より好ましくは４５０％以下、さらに好ましくは４００％以下の濃度であり得る。すなわち、金属塩濃度が、基本培地に本来含まれる金属塩の濃度を１００％としたときに、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは４０％以上、かつ好ましくは５００％以下、より好ましくは４５０％以下、さらに好ましくは４００％以下高くなるように金属塩が添加される。基本培地に添加される金属塩の濃度範囲は、基本培地に本来含まれる金属塩の濃度を１００％としたときに、好ましくは２０～５００％、より好ましくは３０～４５０％、さらに好ましくは４０～４００％の濃度範囲であり得る。
【0031】
金属塩としては、上記固体培地の場合と同様のものを例示することができる。このうち、アルカリ金属の塩及びアルカリ土類金属の塩からなる群より選択される少なくとも１種が好ましく、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、及びマグネシウム塩からなる群より選択される少なくとも１種がより好ましく、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、及び塩化マグネシウムからなる群より選択される少なくとも１種がさらに好ましく、塩化カリウムがさらに好ましい。
【0032】
カルスの液体培地での培養は、好ましくは１５～３５℃、より好ましくは２０～３０℃で、７～３０日間程度の培養を数回実施することにより行なわれる。培養方法としては、特に限定されないが、振盪培養が好ましい。また、培養の回数（継代回数）は、特に限定されないが、３回以上行うのが好ましい。尚、継代培養時の金属塩の添加は、必ずしも毎回の継代培養用液体培地に行う必要はないが、多糖類生産性の向上のためには、多くの回の継代培養用液体培地に金属塩を存在させることが好ましい。またカルスは組成が大きく異なる液体培地へ継代培養する際、褐変を生じる場合があり、褐変を生じたカルスは増殖性や多糖類生産性が低下する。そのため、液体培地の金属塩や炭素源などの濃度を変更する際には、継代培養毎に徐々に濃度を変化させていくことが望ましい。
【0033】
カルスの液体培地での培養に用いられる培養装置、培養槽などについては特に制限はない。培養槽としては縦型ドラム、横型ドラム、回転ドラムなど各種のタイプのものを用いることができる。ただし、振盪可能な培養槽の使用が好ましい。培養装置には通常は撹拌装置が付設され使用されるが、液体培地が培養槽の内部で循環移動するようにしてあれば、撹拌装置の設置と使用は必ずしも必要ではない。
【0034】
後記実施例に示すように、本発明の多糖類生産性細胞の製造方法によれば、基本培地にさらに特定濃度の金属塩が添加された固体培地で誘導されたカルス（多糖類生産性細胞）は、基本培地にさらなる金属塩が添加されていない通常の固体培地で誘導された従来法のカルス（多糖類生産性細胞）に比して、カルスの株間の多糖類生産能のばらつきが抑制されており、多糖類生産能の低いカルスの株を選択的に除去することができる。すなわち、本発明の多糖類生産性細胞の製造方法によれば、多糖類生産能の高い多糖類高生産性細胞を効率よく製造することができる。よって、本発明の多糖類生産性細胞の製造方法は、多糖類高生産性細胞の製造方法もしくは選択方法又は多糖類低生産性細胞の除去方法と言い換えることができる。ここで、多糖類低生産性とは、多糖類の生産量が、従来法（例えば、後記実施例の比較例１の方法）における平均多糖類生産量の８０％未満であることをいい、多糖類高生産性とは、多糖類の生産量が、該平均多糖類生産量の８０％以上であることをいう。多糖類の生産量は、高速液体クロマトグラフィーなど公知の手段により測定することができる。金属塩高含有条件下での植物細胞からのカルス誘導は、通常、カルスの増殖不良や細胞死を生じ、カルス誘導の系として適さないと考えられるところ、基本培地にさらに特定濃度の金属塩が添加された固体培地でカルス誘導を行うことで多糖類高生産性細胞を効率よく製造できることは全く意外であった。これは、従来法では、塩ストレス耐性が低い植物細胞からもカルス誘導され、その後も誘導されたカルスが生存することで、多糖類生産能の低いカルスが存在していたのに対し、本発明の方法では、塩ストレス耐性が高い細胞から選択的にカルスが誘導された結果、多糖類生産能の高いカルスが得られたためと推測される。
また、後記実施例に示すように、本発明の多糖類生産性細胞の製造方法では、誘導されたカルスを固体培地で継代する従来の多糖類生産性細胞の製造方法（例えば、後記実施例の比較例１）とは異なり、誘導されたカルスを固体培地で継代することなく液体培地での培養に供することができる。さらに、本発明の多糖類生産性細胞の製造方法では、従来の多糖類生産性細胞の製造方法（例えば、後記実施例の比較例１）に比して、誘導されたカルスを液体培地で培養する期間を短縮することができる。よって、本発明の多糖類生産性細胞の製造方法によれば、多糖類生産性細胞の製造に伴う期間、労力、資源などの削減が可能となる。
また、後記実施例に示すように、本発明の多糖類生産性細胞の製造方法では、誘導されたカルスを固体培地で継代する従来の多糖類生産性細胞の製造方法（例えば、後記実施例の比較例１）とは異なり、誘導されたカルスを固体培地で継代することなく液体培地での培養に供することができる。さらに、本発明の多糖類生産性細胞の製造方法では、従来の多糖類生産性細胞の製造方法（例えば、後記実施例の比較例１）に比して、誘導されたカルスを液体培地で培養する期間を短縮することができる。よって、本発明の多糖類生産性細胞の製造方法によれば、多糖類生産性細胞の製造に伴う期間、労力、資源などの削減が可能となる。
【0035】
本発明の多糖類生産性細胞の製造方法により得られる多糖類生産性細胞は、そのまま多糖類生産用細胞として、公知の培養条件にて培養し、工業的あるいは実験室的な多糖類の生産に利用できる。よって、別の一態様において、本発明は、多糖類の生産方法を提供する。当該方法は、本発明の多糖類生産性細胞の製造方法により得られる多糖類生産性細胞を液体培地で培養することを含む。多糖類生産のための液体培地としては、上記の液体培地と同様な組成の液体培地、あるいは多糖類の生産に適した液体培地を用いることが好ましく、上記同様に金属塩を含む液体培地を用いることがより好ましい。
【0036】
このようにして得られた培養物からの多糖類の採取は、例えば、培養物から細胞を遠沈又はろ過等によって除去したのち、培養液をロータリーエバポレーター等を用いて濃縮し、濃縮液にエタノールを加えて沈澱させ、沈澱物を凍結乾燥することによって行われる。多糖類の精製は、通常の多糖類の精製法に従って行うことができる。例えば、粗精製の多糖類を水に溶解し、遠心分離して不溶物を完全に除去した後、透析あるいはイオン交換クロマトグラフィー又はゲル濾過クロマトグラフィーにかけることによって、高純度精製品を得ることができる。
【実施例0037】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【0038】
比較例１
（１）固体培養１（カルスの誘導）
チューベロースのつぼみを切り取り、７０％エタノール溶液で１分間滅菌し、更に１１倍希釈したキッチンハイター（ＫＡＯ）で１５分間滅菌した後、滅菌水で洗浄した。滅菌処理されたつぼみから花弁を適当な大きさに切り、固体培地に接種した。固体培地の基本培地にはリンスマイヤー・スクーグの培地（ＬＳ培地）を使用し、さらに０．１８重量％のゲランガム、オーキシンとして１０－５ＭのＮＡＡ（α－ナフタレン酢酸）、サイトカイニンとして１０－６ＭのＢＡ（６－ベンジルアミノプリン）、炭素源として３重量％のスクロースを含む組成とした。この培地をＫＯＨ（水酸化カリウム）でｐＨ５．７に調整したのち、オートクレーブを用いて１２１℃、１５分間滅菌した。
培養は暗所にて２６±１℃で行なった。３０～９０日間の培養の後、それぞれの花弁からはカルスが誘導されていることが確認された。
培養９０日後に１５株分のカルス湿重量をそれぞれ測定したところ平均値は０．７１ｇだった。
（１）固体培養１（カルスの誘導）
チューベロースのつぼみを切り取り、７０％エタノール溶液で１分間滅菌し、更に１１倍希釈したキッチンハイター（ＫＡＯ）で１５分間滅菌した後、滅菌水で洗浄した。滅菌処理されたつぼみから花弁を適当な大きさに切り、固体培地に接種した。固体培地の基本培地にはリンスマイヤー・スクーグの培地（ＬＳ培地）を使用し、さらに０．１８重量％のゲランガム、オーキシンとして１０－５ＭのＮＡＡ（α－ナフタレン酢酸）、サイトカイニンとして１０－６ＭのＢＡ（６－ベンジルアミノプリン）、炭素源として３重量％のスクロースを含む組成とした。この培地をＫＯＨ（水酸化カリウム）でｐＨ５．７に調整したのち、オートクレーブを用いて１２１℃、１５分間滅菌した。
培養は暗所にて２６±１℃で行なった。３０～９０日間の培養の後、それぞれの花弁からはカルスが誘導されていることが確認された。
培養９０日後に１５株分のカルス湿重量をそれぞれ測定したところ平均値は０．７１ｇだった。
【0039】
（２）固体培養２（カルスの継代）
上記の工程で９０日間培養することで得られたカルスを花弁から切り離した。カルスを新しい固体培地へ置床して同一条件下で９０日間培養する継代培養を３回行なった。
上記の工程で９０日間培養することで得られたカルスを花弁から切り離した。カルスを新しい固体培地へ置床して同一条件下で９０日間培養する継代培養を３回行なった。
【0040】
（３）液体培養１
液体培地Ａの基本培地にはＬＳ培地を使用し、さらにオーキシンとして１０－５ＭのＮＡＡ（α－ナフタレン酢酸）、サイトカイニンとして１０－６ＭのＢＡ（６－ベンジルアミノプリン）、炭素源として３重量％のスクロースを含む組成とした。この培地をＫＯＨでｐＨ５．７に調整したのち、５００ｍＬ容の三角フラスコに２００ｍＬを仕込み、オートクレーブを用いて１２１℃、１５分間滅菌した。この培地に固体培養で得られたカルスを接種した。暗所、２６℃、９０ｒｐｍで２～４週間振盪培養した後、液体培地からカルスを分離し、新しい液体培地Ａが２００ｍＬ入った５００ｍＬ容の三角フラスコにカルスを継代する工程を複数回行った。液体培養１は計５ヶ月以上行った。
液体培地Ａの基本培地にはＬＳ培地を使用し、さらにオーキシンとして１０－５ＭのＮＡＡ（α－ナフタレン酢酸）、サイトカイニンとして１０－６ＭのＢＡ（６－ベンジルアミノプリン）、炭素源として３重量％のスクロースを含む組成とした。この培地をＫＯＨでｐＨ５．７に調整したのち、５００ｍＬ容の三角フラスコに２００ｍＬを仕込み、オートクレーブを用いて１２１℃、１５分間滅菌した。この培地に固体培養で得られたカルスを接種した。暗所、２６℃、９０ｒｐｍで２～４週間振盪培養した後、液体培地からカルスを分離し、新しい液体培地Ａが２００ｍＬ入った５００ｍＬ容の三角フラスコにカルスを継代する工程を複数回行った。液体培養１は計５ヶ月以上行った。
【0041】
（４）液体培養２
液体培地Ａのスクロース濃度を５重量％に変更した培地を液体培地Ｂとした。５００ｍＬ容の三角フラスコに２００ｍＬの液体培地Ｂを仕込み、オートクレーブを用いて１２１℃、１５分間滅菌した。この培地に液体培養１を経たカルスを接種した。暗所、２６℃、９０ｒｐｍで２～４週間振盪培養した後、液体培地からカルスを分離し、新しい液体培地Ｂが２００ｍＬ入った５００ｍＬ容の三角フラスコにカルスを継代する工程を複数回行った。液体培養２は計５ヶ月以上行った。
液体培地Ａのスクロース濃度を５重量％に変更した培地を液体培地Ｂとした。５００ｍＬ容の三角フラスコに２００ｍＬの液体培地Ｂを仕込み、オートクレーブを用いて１２１℃、１５分間滅菌した。この培地に液体培養１を経たカルスを接種した。暗所、２６℃、９０ｒｐｍで２～４週間振盪培養した後、液体培地からカルスを分離し、新しい液体培地Ｂが２００ｍＬ入った５００ｍＬ容の三角フラスコにカルスを継代する工程を複数回行った。液体培養２は計５ヶ月以上行った。
【0042】
（５）液体培養３
液体培地Ｂの組成に塩化カリウム（ＫＣｌ）の終濃度が２５ｍＭ高くなるようにＫＣｌを加えた培地を液体培地Ｃとした。５００ｍＬ容の三角フラスコに２００ｍＬの液体培地Ｃを仕込み、オートクレーブを用いて１２１℃、１５分間滅菌した。この培地に液体培養２を経たカルスを接種した。暗所、２６℃、９０ｒｐｍで２～４週間振盪培養した後、液体培地からカルスを分離し、新しい液体培地Ｃが２００ｍＬ入った５００ｍＬ容の三角フラスコにカルスを継代する工程を複数回行った。液体培養３は計５ヶ月以上行った。
液体培地Ｂの組成に塩化カリウム（ＫＣｌ）の終濃度が２５ｍＭ高くなるようにＫＣｌを加えた培地を液体培地Ｃとした。５００ｍＬ容の三角フラスコに２００ｍＬの液体培地Ｃを仕込み、オートクレーブを用いて１２１℃、１５分間滅菌した。この培地に液体培養２を経たカルスを接種した。暗所、２６℃、９０ｒｐｍで２～４週間振盪培養した後、液体培地からカルスを分離し、新しい液体培地Ｃが２００ｍＬ入った５００ｍＬ容の三角フラスコにカルスを継代する工程を複数回行った。液体培養３は計５ヶ月以上行った。
【0043】
（６）ＴＰＳ生産培養
液体培地Ｃに含まれている植物ホルモン（ＮＡＡ及びＢＡ）を１０－５Ｍの２，４－Ｄ（２，４－ジクロロフェノキシ酢酸）に変更した培地を液体培地Ｄとした。５００ｍＬ容の三角フラスコに２００ｍＬの液体培地Ｄを仕込み、オートクレーブを用いて１２１℃、１５分間滅菌した。この培地に液体培養３を経たカルスを湿重量で１０ｇ接種して、暗所、２６℃、９０ｒｐｍで１４日間振盪培養した後、液体培地からカルスを分離し、新しい液体培地Ｄが２００ｍＬ入った５００ｍＬ容の三角フラスコにカルスを湿重量で１０ｇ継代した。暗所、２６℃、９０ｒｐｍで１４日間振盪培養した後、培養上清を回収した。
液体培地Ｃに含まれている植物ホルモン（ＮＡＡ及びＢＡ）を１０－５Ｍの２，４－Ｄ（２，４－ジクロロフェノキシ酢酸）に変更した培地を液体培地Ｄとした。５００ｍＬ容の三角フラスコに２００ｍＬの液体培地Ｄを仕込み、オートクレーブを用いて１２１℃、１５分間滅菌した。この培地に液体培養３を経たカルスを湿重量で１０ｇ接種して、暗所、２６℃、９０ｒｐｍで１４日間振盪培養した後、液体培地からカルスを分離し、新しい液体培地Ｄが２００ｍＬ入った５００ｍＬ容の三角フラスコにカルスを湿重量で１０ｇ継代した。暗所、２６℃、９０ｒｐｍで１４日間振盪培養した後、培養上清を回収した。
【0044】
（７）ＴＰＳ生産性評価
（ｉ）検量線の作製
透析膜にいれたソフケアＴＰ－Ｓ（ＫＡＯ）を超純水に浸漬して透析した後、透析膜内のソフケアＴＰ－Ｓを回収して凍結乾燥した（凍結乾燥ＴＰＳ）。凍結乾燥ＴＰＳを０．５ＭのＮａＣｌ（塩化ナトリウム）溶液に溶解することで複数濃度のＴＰＳ溶液を作製した後、高速液体クロマトグラフィーに供した。得られたＴＰＳ由来のピーク面積値とＴＰＳ溶液の濃度から検量線を作製した。高速液体クロマトグラフィーには装置にＣｈｒｏｍａｓｔｅｒ（日立ハイテクサイエンス）、カラムにＴＳＫｇｅｌ Ｇ６０００ＰＷＸＬ（東ソー）、移動相に０．５ＭのＮａＣｌ、０．５％の安息香酸ナトリウム溶液、検出にＲＩ（示差屈折率検出器）を使用した。
（ｉ）検量線の作製
透析膜にいれたソフケアＴＰ－Ｓ（ＫＡＯ）を超純水に浸漬して透析した後、透析膜内のソフケアＴＰ－Ｓを回収して凍結乾燥した（凍結乾燥ＴＰＳ）。凍結乾燥ＴＰＳを０．５ＭのＮａＣｌ（塩化ナトリウム）溶液に溶解することで複数濃度のＴＰＳ溶液を作製した後、高速液体クロマトグラフィーに供した。得られたＴＰＳ由来のピーク面積値とＴＰＳ溶液の濃度から検量線を作製した。高速液体クロマトグラフィーには装置にＣｈｒｏｍａｓｔｅｒ（日立ハイテクサイエンス）、カラムにＴＳＫｇｅｌ Ｇ６０００ＰＷＸＬ（東ソー）、移動相に０．５ＭのＮａＣｌ、０．５％の安息香酸ナトリウム溶液、検出にＲＩ（示差屈折率検出器）を使用した。
【0045】
（ｉｉ）測定
ＴＰＳ生産培養で回収した培養上清を遠心機（ｈｉｍａｃ ＣＦ７Ｄ２）にて３０００ｒｐｍ、５分間遠心分離した後、上清を回収して等量の０．５ＭのＮａＣｌ溶液と混合し、材質がセルロースアセテートで孔径が０．８μｍのフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ、３９１２２１８１）にて濾過精製した。濾過精製後の液を検量線の作製と同じ条件の高速液体クロマトグラフィーに供して、得られたピーク面積値と検量線から回収した培養上清のＴＰＳ濃度を算出した。
ＴＰＳ生産培養で回収した培養上清を遠心機（ｈｉｍａｃ ＣＦ７Ｄ２）にて３０００ｒｐｍ、５分間遠心分離した後、上清を回収して等量の０．５ＭのＮａＣｌ溶液と混合し、材質がセルロースアセテートで孔径が０．８μｍのフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ、３９１２２１８１）にて濾過精製した。濾過精製後の液を検量線の作製と同じ条件の高速液体クロマトグラフィーに供して、得られたピーク面積値と検量線から回収した培養上清のＴＰＳ濃度を算出した。
【0046】
計２２株を評価した際の結果を表１に示す。ＴＰＳ濃度の平均値は１．０１ｇ／Ｌだった。またＴＰＳ濃度の平均値の８割（０．８ｇ／Ｌ）に満たないＴＰＳ低生産な株は２２株中８株（３６．４％）存在した。
【0047】
【表1】
【0048】
実施例１
（１）固体培養（カルスの誘導）
比較例１記載の（１）固体培養１のうち、固体培地のスクロース濃度を５重量％とし、さらにＫＣｌの終濃度が２５ｍＭ高くなるようにＫＣｌを加えた以外は同じ条件でカルスを誘導した。３０または９０日間の培養の後、それぞれの花弁からはカルスが誘導されていることが確認された。
培養９０日後に回収した５株分のカルス湿重量をそれぞれ測定したところ平均値は０．２０ｇだった。
（１）固体培養（カルスの誘導）
比較例１記載の（１）固体培養１のうち、固体培地のスクロース濃度を５重量％とし、さらにＫＣｌの終濃度が２５ｍＭ高くなるようにＫＣｌを加えた以外は同じ条件でカルスを誘導した。３０または９０日間の培養の後、それぞれの花弁からはカルスが誘導されていることが確認された。
培養９０日後に回収した５株分のカルス湿重量をそれぞれ測定したところ平均値は０．２０ｇだった。
【0049】
（２）液体培養
５００ｍＬ容の三角フラスコに比較例１（５）記載の液体培地Ｃと同じ組成の培地を２００ｍＬ仕込み、オートクレーブを用いて１２１℃、１５分間滅菌した。この培地に実施例１（１）カルスの誘導で得られたカルスを接種した。暗所、２６℃、９０ｒｐｍで２～４週間振盪培養した後、液体培地からカルスを分離し、新しい液体培地Ｃが２００ｍＬ入った５００ｍＬ容の三角フラスコにカルスを継代する工程を複数回行った。液体培養は計４ヶ月以上行った。
５００ｍＬ容の三角フラスコに比較例１（５）記載の液体培地Ｃと同じ組成の培地を２００ｍＬ仕込み、オートクレーブを用いて１２１℃、１５分間滅菌した。この培地に実施例１（１）カルスの誘導で得られたカルスを接種した。暗所、２６℃、９０ｒｐｍで２～４週間振盪培養した後、液体培地からカルスを分離し、新しい液体培地Ｃが２００ｍＬ入った５００ｍＬ容の三角フラスコにカルスを継代する工程を複数回行った。液体培養は計４ヶ月以上行った。
【0050】
（３）ＴＰＳ生産培養
カルスとして実施例１（２）液体培養で得られたカルスを使用する以外は、比較例１（６）記載のＴＰＳ生産培養と同じ条件で培養と培養上清の回収を行った。
カルスとして実施例１（２）液体培養で得られたカルスを使用する以外は、比較例１（６）記載のＴＰＳ生産培養と同じ条件で培養と培養上清の回収を行った。
【0051】
（４）ＴＰＳ生産性評価
比較例１（７）と同様の方法でＴＰＳ濃度を算出した。
計９株を評価した際の結果を表２に示す。ＴＰＳ濃度が０．８ｇ／Ｌに満たないＴＰＳ低生産な株は存在しなかった。
比較例１（７）と同様の方法でＴＰＳ濃度を算出した。
計９株を評価した際の結果を表２に示す。ＴＰＳ濃度が０．８ｇ／Ｌに満たないＴＰＳ低生産な株は存在しなかった。
【0052】
【表2】
【0053】
実施例２
（１）固体培養（カルスの誘導）
比較例１記載の（１）固体培養１のうち、固体培地のＫＣｌの終濃度が２５ｍＭ高くなるようにＫＣｌを加えた以外は同じ条件でカルスを誘導した。９０日間の培養の後、それぞれの花弁からはカルスが誘導されていることが確認された。
培養９０日後に１０株分のカルス湿重量をそれぞれ測定したところ平均値は０．４０ｇだった。
（１）固体培養（カルスの誘導）
比較例１記載の（１）固体培養１のうち、固体培地のＫＣｌの終濃度が２５ｍＭ高くなるようにＫＣｌを加えた以外は同じ条件でカルスを誘導した。９０日間の培養の後、それぞれの花弁からはカルスが誘導されていることが確認された。
培養９０日後に１０株分のカルス湿重量をそれぞれ測定したところ平均値は０．４０ｇだった。
【0054】
（２）液体培養
５００ｍＬ容の三角フラスコに比較例１（５）記載の液体培地Ｃと同じ組成の培地を２００ｍＬ仕込み、オートクレーブを用いて１２１℃、１５分間滅菌した。この培地に実施例２（１）カルスの誘導で得られたカルスを接種した。暗所、２６℃、９０ｒｐｍで２～４週間振盪培養した後、液体培地からカルスを分離し、新しい液体培地Ｃが２００ｍＬ入った５００ｍＬ容の三角フラスコにカルスを継代する工程を複数回行った。液体培養は計４ヶ月以上行った。
５００ｍＬ容の三角フラスコに比較例１（５）記載の液体培地Ｃと同じ組成の培地を２００ｍＬ仕込み、オートクレーブを用いて１２１℃、１５分間滅菌した。この培地に実施例２（１）カルスの誘導で得られたカルスを接種した。暗所、２６℃、９０ｒｐｍで２～４週間振盪培養した後、液体培地からカルスを分離し、新しい液体培地Ｃが２００ｍＬ入った５００ｍＬ容の三角フラスコにカルスを継代する工程を複数回行った。液体培養は計４ヶ月以上行った。
【0055】
（３）ＴＰＳ生産培養
カルスとして実施例２（２）液体培養で得られたカルスを使用する以外は、比較例１（６）のＴＰＳ生産培養と同じ条件で培養と培養上清の回収を行った。
カルスとして実施例２（２）液体培養で得られたカルスを使用する以外は、比較例１（６）のＴＰＳ生産培養と同じ条件で培養と培養上清の回収を行った。
【0056】
（４）ＴＰＳ生産性評価
比較例１（７）と同様の方法でＴＰＳ濃度を算出した。
計１０株を評価した際の結果を表３に示す。ＴＰＳ濃度が０．８ｇ／Ｌに満たないＴＰＳ低生産な株は存在しなかった。
比較例１（７）と同様の方法でＴＰＳ濃度を算出した。
計１０株を評価した際の結果を表３に示す。ＴＰＳ濃度が０．８ｇ／Ｌに満たないＴＰＳ低生産な株は存在しなかった。
【0057】
【表3】
【0058】
実施例３
（１）固体培養（カルスの誘導）
比較例１記載の（１）固体培養１のうち、固体培地にさらにＫＣｌ、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）または塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）を加えた以外は同じ条件でカルスを誘導した。９０または１１０日間の培養の後、それぞれの花弁からはカルスが誘導されていることが確認された。
培養９０または１１０日後に回収したカルス湿重量を表４に示す。いずれも比較例１の固体培養１よりもカルス量が少なかった。
（１）固体培養（カルスの誘導）
比較例１記載の（１）固体培養１のうち、固体培地にさらにＫＣｌ、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）または塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）を加えた以外は同じ条件でカルスを誘導した。９０または１１０日間の培養の後、それぞれの花弁からはカルスが誘導されていることが確認された。
培養９０または１１０日後に回収したカルス湿重量を表４に示す。いずれも比較例１の固体培養１よりもカルス量が少なかった。
【0059】
【表4】
【0060】
（２）液体培養
５００ｍＬ容の三角フラスコに比較例１（５）記載の液体培地Ｃと同じ組成の培地を２００ｍＬ仕込み、オートクレーブを用いて１２１℃、１５分間滅菌した。この培地に実施例３（１）カルスの誘導で得られたカルスを接種した。暗所、２６℃、９０ｒｐｍで２～４週間振盪培養した後、液体培地からカルスを分離し、新しい液体培地Ｃが２００ｍＬ入った５００ｍＬ容の三角フラスコにカルスを継代する工程を複数回行った。液体培養は計４ヶ月以上行った
５００ｍＬ容の三角フラスコに比較例１（５）記載の液体培地Ｃと同じ組成の培地を２００ｍＬ仕込み、オートクレーブを用いて１２１℃、１５分間滅菌した。この培地に実施例３（１）カルスの誘導で得られたカルスを接種した。暗所、２６℃、９０ｒｐｍで２～４週間振盪培養した後、液体培地からカルスを分離し、新しい液体培地Ｃが２００ｍＬ入った５００ｍＬ容の三角フラスコにカルスを継代する工程を複数回行った。液体培養は計４ヶ月以上行った
【0061】
（３）ＴＰＳ生産培養
カルスとして実施例３（２）液体培養で得られたカルスを使用する以外は、比較例１（６）記載のＴＰＳ生産培養と同じ条件で培養と培養上清の回収を行った。
カルスとして実施例３（２）液体培養で得られたカルスを使用する以外は、比較例１（６）記載のＴＰＳ生産培養と同じ条件で培養と培養上清の回収を行った。
【0062】
（４）ＴＰＳ生産性評価
比較例１（７）と同様の方法でＴＰＳ濃度を算出した。
評価した際の結果を表５に示す。ＴＰＳ濃度が０．８ｇ／Ｌに満たないＴＰＳ低生産な株は存在しなかった。
比較例１（７）と同様の方法でＴＰＳ濃度を算出した。
評価した際の結果を表５に示す。ＴＰＳ濃度が０．８ｇ／Ｌに満たないＴＰＳ低生産な株は存在しなかった。
【0063】
【表5】