特開 2024-64265 ＲＮＡの分析方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024064265

(43)【公開日】2024-05-14

(54)【発明の名称】ＲＮＡの分析方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 27/62 20210101AFI20240507BHJP

   H01J 49/16 20060101ALI20240507BHJP

【ＦＩ】

G01N27/62 V

H01J49/16 400

【審査請求】未請求

【請求項の数】8

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022172722

(22)【出願日】2022-10-27

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｓｓｊ．ｊｐ／ｃｏｎｆ／７０／ｐｒｏｇｒａｍ／３Ｐ－１４．ｈｔｍｌ、令和４年６月１日 ［刊行物等］ 第７０回質量分析総合討論会、令和４年６月２４日 ［刊行物等］ 日本核酸医薬学会 第７回年会 事務局、日本核酸医薬学会 第７回年会 講演要旨集、令和４年７月２０日 ［刊行物等］ 日本核酸医薬学会 第７回年会、令和４年８月１日 ［刊行物等］ 湘南アイパーク×島津製作所セミナー、令和４年１０月７日 ［刊行物等］ 第７１回日本感染症学会東日本地方会学術集会・第６９回日本化学療法学会東日本支部総会 合同学会、令和４年１０月２７日

(71)【出願人】

【識別番号】000001993

【氏名又は名称】株式会社島津製作所

(74)【代理人】

【識別番号】110001069

【氏名又は名称】弁理士法人京都国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】福山 裕子

【テーマコード（参考）】

2G041

【Ｆターム（参考）】

2G041CA01

2G041DA04

2G041FA11

2G041GA06

2G041GA08

2G041JA08

(57)【要約】

【課題】ＭＡＬＤＩ質量分析を利用して試料に含まれるＲＮＡを分析する際に、より高感度に均一性高く分子量関連イオンを検出できるようにする。
【解決手段】
マトリックスとして、２，４－ジヒドロキシアセトフェノン（ＤＨＡＰ）及び２，４，６－トリヒドロキシアセトフェノン一水和物（ＴＨＡＰ）を含む混合マトリックスを用い、試料に含まれるＲＮＡをマトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析装置により分析する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

マトリックスとして、２，４－ジヒドロキシアセトフェノン（ＤＨＡＰ）及び２，４，６－トリヒドロキシアセトフェノン一水和物（ＴＨＡＰ）を含む混合マトリックスを用い、試料に含まれるＲＮＡをマトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析装置により分析する、ＲＮＡの分析方法。

【請求項2】

前記混合マトリックスのＤＨＡＰとＴＨＡＰの混合比が３０：１～１０：１である、
請求項１に記載のＲＮＡの分析方法。

【請求項3】

前記混合マトリックスのマトリックス添加剤としてクエン酸水素二アンモニウムを用い、前記試料に含まれるＲＮＡを分析する、
請求項１に記載のＲＮＡの分析方法。

【請求項4】

ＲＮＡを含む試料溶液、ＤＨＡＰを含むマトリックス溶液、及びＴＨＡＰを含むマトリックス溶液を混合して試料/混合マトリックス混合溶液を作製し、あるいは、ＲＮＡを含む試料溶液と、ＤＨＡＰ及びＴＨＡＰを含む混合マトリックス溶液とを混合して試料/混合マトリックス混合溶液を作製し、該試料/混合マトリックス混合溶液をサンプルプレ－ト上に滴下して作製された前記試料/混合マトリックス混合物を前記マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析装置により測定する、
請求項１～３のいずれかに記載のＲＮＡの分析方法。

【請求項5】

ＲＮＡを含む試料溶液と、ＤＨＡＰ及びＴＨＡＰを含む混合マトリックス溶液とを混合して作製した試料/混合マトリックス混合物を前記マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析装置により測定することで、前記試料に含まれるＲＮＡを分析する、
請求項１～３のいずれかに記載のＲＮＡの分析方法。

【請求項6】

ＲＮＡを含む試料溶液、ＤＨＡＰ及びＴＨＡＰのいずれか一方を含むマトリックス溶液、ＤＨＡＰ及びＴＨＡＰの他方を含むマトリックス溶液を作製し、これらの試料溶液および各マトリックス溶液から作製した試料/混合マトリックス混合物を前記マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析装置により測定することで、前記試料に含まれるＲＮＡを分析する、
請求項１～３のいずれかに記載のＲＮＡの分析方法。

【請求項7】

前記マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析装置がデジタルイオントラップ型である、
請求項１～３のいずれかに記載のＲＮＡの分析方法。

【請求項8】

２，４－ジヒドロキシアセトフェノン（ＤＨＡＰ）及び２，４，６－トリヒドロキシアセトフェノン一水和物（ＴＨＡＰ）を含む、ＲＮＡのマトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析用マトリックス。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＲＮＡの分析方法に関する。

【背景技術】

【0002】

核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）の質量分析方法の一つとして、マトリックス支援レーザ脱離イオン化（Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization：ＭＡＬＤＩ）を用いた質量分析方法（以下、ＭＡＬＤＩ質量分析という。）が知られている。ＭＡＬＤＩ質量分析では、レーザ光を吸収しにくい物質やレーザ光により損傷を受けやすい物質をイオン化させるために、マトリックスと呼ばれるイオン化補助剤が使用される。

【0003】

例えば、核酸のＭＡＬＤＩ質量分析において、非特許文献１には、３－ヒドロキシピコリン酸（3-hydroxypicolinic acid：３－ＨＰＡ）、及び１，５－ジアミノナフタレン（1,5-diaminonaphthalene：１，５－ＤＡＮ）がマトリックスとして用いられることが記載されている。非特許文献２には２，４－ジヒドロキシアセトフェノン（2,4-dihydroxyacetophenone：２，４－ＤＨＡＰ）がマトリックスとして用いられることが記載されている。非特許文献３には、２，４，６－トリヒドロキシアセトフェノン（2, 4, 6-trihydroxyacetophenone：２，４，６－ＴＨＡＰ）と２，３，４－トリヒドロキシアセトフェノン（2, 3, 4-trihydroxyacetophenone：２，３，４－ＴＨＡＰ）を含む混合マトリックス、及びアントラニル酸（anthranilic acid：ＡＡ）とニコチン酸（nicotinic acid：ＮＡ）を含む混合マトリックスがマトリックスとして用いられることが記載されている。

【0004】

マトリックスは、通常、所定の溶媒に溶解させたマトリックス溶液として作製され、分析対象物質を含む試料と、様々な方法で混合される。例えば、マトリックス溶液と試料溶液を予め混合して試料/マトリックス混合溶液を作製し、サンプルプレートと呼ばれる金属製の板に複数形成されたウェル（サンプルの滴下部位。例えば、直径2 mmほどの円の外縁を削ったものや、直径2 mmほどの円の内側全体に表面加工処理をしたものなどがある。）に該試料/マトリックス混合溶液を滴下し、乾燥することにより、ウェル上に分析対象物質とマトリックスが混合された試料/マトリックス混合結晶が形成される。或いは、マトリックス溶液と試料溶液をそれぞれウェルに滴下してウェル上で混合し、乾燥することにより試料/マトリックス混合結晶が形成される。いずれの場合も、試料/マトリックス混合結晶が分析用試料としてＭＡＬＤＩ質量分析に供される。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Nathan A. Hagan, 他5名, "Enhanced In-Source Fragmentationin MALDI-TOF-MS of Oligonucleotides Using 1,5-Diaminonapthalene", Journal of the American Society for Mass Spectrometry, （米国）, 2012, 23, pp.773-777

【非特許文献2】H. Shimizu, 他6名, "Application of high-resolution ESI and MALDI mass spectrometry to metabolite profiling of small interfering RNA duplex", Journal of Mass Spectrometry, （米国）, 2012, 47, pp. 1015-1022

【非特許文献3】Li-Kang Zhang, 他1名, "Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry methods for oligodeoxynucleotides: Improvements in matrix, detection limits, quantification, and sequencing", Journal of the American Society for Mass Spectrometry, （米国）, 2000, 11, pp. 854-865

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

従来、核酸のＭＡＬＤＩ質量分析用のマトリックスとして知られているマトリックスを用いて分析用試料を調製すると、試料/マトリックス混合結晶がウェル上に不均一に形成されることが多い。そのため、分析対象物質である核酸の分子量関連イオンを得るためにウェル上にレーザ光を照射しても、照射位置によっては、十分な量の分子量関連イオンを生成することができない。ウェル上の試料/マトリックス混合結晶が形成されている箇所で、且つ分析対象物質である試料分子のイオンが比較的検出されやすい箇所（スイートスポットと呼ばれる）にレーザ光を照射することができれば、十分な感度で良好な分子量関連イオンピークを検出することができるが、測定者が未熟な場合、そのような箇所を短時間で探し出すことが難しく、分析に時間がかかってしまう。

【0007】

ウェル上に形成された試料/マトリックス混合結晶上を、ラスタースキャン機能を用いてレーザ照射することにより、より容易に迅速に、試料/マトリックス混合結晶に含まれる分析対象物質の質量分析を行うことができる。しかしながら、試料/マトリックス混合結晶がウェル上に不均一に形成され、ウェル上の結晶部位のばらつきが大きかったり、あるいは、試料/マトリックス混合結晶が不均一で、混合結晶中の試料の分布（位置）のばらつきが大きかったりすると、照射位置によって生成する分析対象物質のイオン量がばらつきやすく、例えば、照射位置により、分析対象物質の分子量関連イオンが過剰に生成されたり、逆に十分な量の分子量関連イオンが生成されなかったりすることが生じやすくなる。

【0008】

さらに、ＤＮＡに比べるとＲＮＡは、報告されているＭＡＬＤＩ質量分析に用いられるマトリックスの種類が少なく、また、ＲＮＡ分析用に報告されている従来のマトリックスでは上記問題が生じやすかった。そのため、ＲＮＡの高感度で迅速な分析法が望まれていた。

【0009】

本発明の課題は、ＭＡＬＤＩ質量分析を用いてＲＮＡを分析する際に、分子量関連イオンを高感度に、容易に迅速に検出できる手法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0010】

上記課題を解決するために成された本発明に係るＲＮＡの分析方法は、
マトリックスとして、２，４－ジヒドロキシアセトフェノン（ＤＨＡＰ）及び２，４，６－トリヒドロキシアセトフェノン一水和物（ＴＨＡＰ）を含む混合マトリックスを用い、試料に含まれるＲＮＡをマトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析装置により分析するものである。

【0011】

また、上記課題を解決するために成された本発明に係るＲＮＡのマトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析用マトリックスは、２，４－ジヒドロキシアセトフェノン（ＤＨＡＰ）及び２，４，６－トリヒドロキシアセトフェノン一水和物（ＴＨＡＰ）を含むものである。

【発明の効果】

【0012】

本発明に係るＲＮＡの分析方法によれば、マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析装置を用いて試料に含まれるＲＮＡを分析する際に、比較的均一な試料/マトリックス混合結晶を作成し、高感度に、容易に迅速に分子量関連イオンを検出することができる。また、本発明に係るＲＮＡのマトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析用マトリックスを用いてＲＮＡを含む試料の分析用試料を調製することにより、マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析を行う際に、比較的均一な試料/マトリックス混合結晶を作成し、高感度に、容易に迅速に分子量関連イオンを検出することができる。したがって、試料中のＲＮＡを良好に分析することができる。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】実施例１における、各種マトリックスを用いた場合のパティシラン（センス鎖）のマススペクトルを示す図、及び分子量関連イオンの検出状況を示す表。

【図2】実施例２における、各種マトリックスを用いた場合のパティシラン（センス鎖）のマススペクトルを示す図、及び分子量関連イオンの検出状況を示す表。

【図3】実施例３における、各種マトリックスを用いた場合のパティシラン（アンチセンス鎖）のマススペクトルを示す図、及び分子量関連イオンの検出状況を示す表。

【図4】実施例４における、各種マトリックスを用いた場合のパティシラン（センス鎖）のマススペクトルを示す図、及び分子量関連イオンの検出状況を示す表。

【図5】参考例１における、各種マトリックスを用いた場合のミポメルセンのマススペクトルを示す図、及び分子量関連イオンの検出状況を示す表。

【発明を実施するための形態】

【0014】

以下、本発明に係るＲＮＡの分析方法の一実施形態について、説明する。

【0015】

（分析対象物質）
本実施形態の分析対象物質であるＲＮＡは、生物から得られる天然物又はそれらの加工物であってもよく、化学的に合成された人工合成核酸であってもよい。また、ＲＮＡは、修飾ＲＮＡ、ＲＮＡ誘導体、ＲＮＡ医薬品などのＲＮＡ関連物質を含む。ＲＮＡの重合度（塩基長）は特に限定されないが、数～数十個程度のヌクレオチドが重合したオリゴヌクレオチドであることが好ましい。本実施形態の分析方法は、特に高分子量のＲＮＡを感度良く分析できる観点から、ＲＮＡの分子量としては３０００以上、中でも６０００以上であることが好ましい。

【0016】

（分析用試料の調製）
分析用試料の調製は、分析対象物質であるＲＮＡを含む試料と、マトリックスとして２，４－ジヒドロキシアセトフェノン（2,4-dihydroxyacetophenone：以下、ＤＨＡＰと表記する。）及び２，４，６－トリヒドロキシアセトフェノン一水和物（2, 4, 6-trihydroxyacetophenone monohydrate：以下、ＴＨＡＰと表記する。）を混合することにより行う。具体的には、例えば、試料溶液、及びＤＨＡＰとＴＨＡＰを含む混合マトリックス溶液を作製してこれらを予め混合し、あるいは、試料溶液、ＤＨＡＰを含むマトリックス溶液、ＴＨＡＰを含むマトリックス溶液を作製してこれらを予め混合して試料/混合マトリックス混合溶液を作製し、該試料/混合マトリックス混合溶液をウェル上に滴下して、これを乾燥させる（この方法をpre-mix法と呼ぶ）。試料溶液、及び混合マトリックス溶液をウェル上に別々に滴下して混合し、これを乾燥させてもよく、試料溶液、ＤＨＡＰを含むマトリックス溶液、及びＴＨＡＰを含むマトリックス溶液をウェル上に別々に滴下して混合し、これを乾燥させてもよい（この方法をon-target法と呼ぶ）。このようにして、分析対象物質とマトリックスの混合結晶である試料/マトリックス混合結晶（本発明の試料/マトリックス混合物に相当）がウェル上に形成される。

【0017】

混合マトリックス(あるいは混合マトリックス溶液中)のＤＨＡＰとＴＨＡＰの混合比は、混合結晶の均一性が向上する観点、及びＲＮＡを感度よく分析することができる観点から、ＤＨＡＰ：ＴＨＡＰが３０：１～１０：１が好ましく、３０：１～１５：１がより好ましい。

【0018】

マトリックスあるいはマトリックス溶液は、さらにマトリックス添加剤としてクエン酸水素二アンモニウムを含んでもよい。クエン酸のアンモニウム塩は、クエン酸イオンと結合するアンモニウムイオンの数に応じていくつかの種類が存在するが、本実施形態で好適に用いられるのは、１つのクエン酸イオンに対して２つのアンモニウムイオンが結合した塩である。マトリックス溶液中のクエン酸水素二アンモニウムの濃度は、ＲＮＡの分子量関連イオンを感度よく検出することができる観点から、２０～１００ｍＭが好ましい。マトリックス溶液の溶媒としては、特に限定されず、一般的にマトリックス溶液の溶媒として用いられている溶媒を用いることができる。例えば、アセトニトリル、メタノ－ル、エタノ－ルなどの有機溶媒を２０～８０％含む水溶液などを用いることができる。中でも、５０～７０％のアセトニトリルを含む水溶液を用いることが好ましく、５０％のアセトニトリルを含む水溶液を用いることが特に好ましい。マトリックス添加剤は、ＤＨＡＰ又はＴＨＡＰを含むマトリックス溶液に添加されてもよく、ＤＨＡＰ及びＴＨＡＰを含む混合マトリックス溶液に添加されてもよい。

【0019】

（質量分析）
本実施形態の分析方法では、ＭＡＬＤＩ法によるイオン源を有する質量分析装置（ＭＡＬＤＩ－ＭＳ）が用いられる。ＭＡＬＤＩ－ＭＳとしては、例えば、飛行時間型（Time of Flight：ＴＯＦ）のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳ及びイオントラップ型（Ion trap：ＩＴ）のＭＡＬＤＩ－ＩＴＭＳである。ここでいうイオントラップ型のＭＡＬＤＩ－ＩＴＭＳは、イオンを捕捉するためのイオントラップを有するものであり、イオントラップ自体の質量分離機能を利用して該イオントラップ内に捕捉したイオンを質量電荷比（ｍ／ｚ）の小さい順に排出し、イオントラップの外部に配置した検出器でイオンを検出する質量分析装置のほか、イオントラップから一斉に排出されたイオンを例えば飛行時間型質量分離部などのイオントラップの外部に配置した質量分離部で質量電荷比に応じて分離し、同じくイオントラップの外部に配置した検出器で検出する質量分析装置も含むものとする。

【0020】

ＭＡＬＤＩ－ＩＴＭＳのイオントラップとしては、高周波（Radio Frequency：ＲＦ）電場を用いてイオンの捕捉や排出を行うＲＦトラップの場合、正弦波状の高周波電圧をリング電極に印加することで発生する電場を利用してイオンを捕捉するイオントラップでもよく、異なる２つの電圧を高速にスイッチングすることにより生じる矩形波電圧をリング電極に印加することで発生する電場を利用してイオンを捕捉するデジタルイオントラップであってもよい。デジタルイオントラップでは、矩形波電圧の振幅（電圧値）を一定に維持したまま周波数を変化させることにより、捕捉可能なイオンのｍ／ｚの範囲が制御される。周波数を低周波側にスキャンすると、トラップされているイオンはｍ／ｚの小さい順に排出され、それらを検出器で検出することによりマススペクトルが得られる。質量分析装置としては、デジタルイオントラップ型のＭＡＬＤＩ－ＩＴＭＳを用いるのが好ましい。

【0021】

質量分析装置には、ラスタースキャンによる測定の機能が装備されていてもよい。ラスタースキャンによる測定とは、ウェル上の互いに異なる位置に予め設定した多数の測定点のそれぞれにおいて規定回数のレーザ光照射を行って測定データを取得し、それら全ての測定データを積算することによって最終的な測定データを導出する測定手法である。レーザ照射位置を機械的に移動させるため、積算デ－タでは、レーザ照射位置の違いによる測定結果のばらつきの影響を軽減できる。ラスタースキャンによる測定では、手動で照射位置を動かす必要がないため、容易で迅速な測定が可能となる。また、ラスタースキャンによる測定は、人為的な測定位置の選択操作が介入しない自動測定機能であるため、より客観的で再現性の高いデ－タ取得が可能となる。

【0022】

ラスタースキャンの設定条件は、特に限定されないが、使用する装置のサンプルプレートのウェル径、レーザ径などに応じて、適宜、調整できる。サンプルプレートのウェル上、およびウェル上の試料/マトリックス混合物上を、できるだけレーザ照射位置が重複しないよう、ピーク検出に十分な回数だけレーザ照射するのがよい。ラスタースキャンの設定条件の具体的な設定値としては、例えば、直径2 mmの円状のウェルに対し、１ウェルあたり、２５ポイント（ウェル上のレーザ照射位置の数が１ウェルあたり２５点であることを示す）、４ショット/ポイント（レーザ照射位置１点あたりのレーザ照射数が４回であることを示す）、スぺ－シング：0.2 mm（レーザ照射位置間の間隔が0.2 mmであることを示す）、サイズ：0.8 mm（上記２５点のレーザ照射を行う際、0.8 mmだけ横方向に走査した後、折り返してスキャンすることを示す。すなわち、スクエア型のレーザ照射範囲における横軸の長さを示す）などを設定し、それをもとに自動的に算出される５×５＝２５ポイントのスクエア範囲を、ラスタースキャンする。

【0023】

以下、本発明に係るＲＮＡの分析方法をいくつかの実施例によって説明するが、これらは単なる例示であって、本発明はこれらに限定されるものではない。

【実施例0024】

＜１．試料溶液の調製＞
試料溶液として、パティシラン（研究開発用の合成核酸の脱塩精製後の試料。本来はセンスとアンチセンスからなる２本鎖ＲＮＡだが、本実施例で用いたのはセンスのみ。センス: 全長は２１塩基長、コア配列は１９塩基長、３'末端に２塩基のＤＮＡオーバーハング（ｄＴｄＴ）をもつ、ＭＷ ６７６４）（5’-G-Um-A-A-Cm-Cm-A-A-G-A-G-Um-A-Um-Um-Cm-Cm-A-Um-dT-dT-3’、dTはthymidine deoxyribonucleotide、Cmは 2’-O-methylcytidine、Umは 2’-O-methyluridineを示す。：配列番号１）の２０ｐｍｏｌ／μＬ水溶液を作製した。

【0025】

＜２．マトリックス溶液の調製＞
マトリックス溶液として、７０ｍＭのクエン酸水素二アンモニウムをマトリックス添加剤として含む２，４－ジヒドロキシアセトフェノン（ＤＨＡＰ）の４０ｍｇ／ｍＬ５０％アセトニトリル水溶液（ＤＨＡＰ溶液）及び７０ｍＭのクエン酸水素二アンモニウムをマトリックス添加剤として含む２，４，６－トリヒドロキシアセトフェノン一水和物（ＴＨＡＰ）の４０ｍｇ／ｍＬ５０％アセトニトリル水溶液（ＴＨＡＰ溶液）を作製した。作製したＤＨＡＰ溶液とＴＨＡＰ溶液を混合比３０：１、２０：１、１５：１、１０：１、５：１、３：１、１：１、１：３、１：５、１：１０（ｖ／ｖ）で混合し、各混合マトリックス溶液を作製した。

【0026】

＜３．分析用試料の調製＞
１．の試料溶液と２．のマトリックス溶液を１：１（ｖ／ｖ）で混合し、得られた混合溶液１μＬを、サンプルプレート（ＳＵＳプレート）のウェル上に滴下した。滴下後、サンプルプレートを超低湿ドライボックス（商品名：ＭｃＤｒｙ、エクアールシー株式会社製）に入れ、乾燥させた。

【0027】

＜４．質量分析＞
質量分析には、ＭＡＬＤＩデジタルイオントラップ型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ－ＤＩＴＭＳ、商品名：ＭＡＬＤＩｍｉｎｉ－１、株式会社島津製作所製）を用いた。３．のサンプルプレートをＭＡＬＤＩ－ＤＩＴＭＳに挿入し、ポジティブモードで、ラスタースキャン機能を用いて測定を行った。ラスタースキャンの設定条件は、4 shots/point、25 pointsとした。レーザパワーは、各マトリックスの最適値を用いた。レーザパワーはマトリックスに依存し、ピーク検出には、ＤＨＡＰよりもＴＨＡＰで、より高いレーザパワーが必要となる。各マトリックスのレーザパワーの最適値は、ピーク検出状況を確認しながら設定した。具体的には、感度及び分解能が比較的高い条件を探した。なお、最もレーザパワーの最適値が低かったのは、混合マトリックスであった。

【0028】

＜結果＞
マトリックスとしてＤＨＡＰ、ＴＨＡＰ、及びＤＨＡＰとＴＨＡＰを各混合比で含む混合マトリックス（ＤＨＡＰ＋ＴＨＡＰ）を用いた場合の、パティシランのセンスのマススペクトル、及び［Ｍ＋Ｈ］^＋のピーク検出状況（感度、分解能、塩基脱離状況、付加体検出状況、ラスタースキャン測定によるピーク検出の均一性）をまとめた表を、図１に示す。なお、混合比１：０はＤＨＡＰを単独で用いた場合、混合比０：１はＴＨＡＰを単独で用いた場合をそれぞれ示す。

【0029】

塩基脱離状況における塩基脱離は、イオン化の過程で分子量関連イオン（[Ｍ＋Ｈ]^＋）から塩基が脱離する現象のことであり、各マトリックスの特性により、生じやすさが異なる。例えば、ソフトなイオン化を行うマトリックスは塩基脱離を生じにくく、ハードなイオン化を行うマトリックスは塩基脱離を生じやすい。

【0030】

また、付加体検出状況における付加体は、詳細解析はできていないが、ｍ/ｚ値から推測すると、酸化体（[Ｍ＋Ｏ]^＋など）、アルカリ金属イオン付加体（[Ｍ＋Ｎａ]^＋、[Ｍ＋Ｏ＋Ｎａ]^＋、[Ｍ＋２Ｎａ]^＋など）、塩基の付加体（[Ｍ＋Ｂ＋Ｈ]^＋など）、マトリックスイオンの付加体（[Ｍ＋ｍ＋Ｈ]^＋など）などが考えられる。もともと試料に混在していないが、何らかの夾雑物の影響で生じる付加体は、プリパレーションやイオン化の過程などで生じた可能性があり、各マトリックスの特性により、生じやすさが異なる。マトリックスと、試料やアルカリ金属イオンなどとの親和性が関係することも考えられるが、詳細はわかっていない。

【0031】

塩基脱離や付加体検出を生じやすいと、分析対象物である核酸分子が、分子量関連イオン（[Ｍ＋Ｈ]^＋）だけでなく複数のイオン種としてイオン化され、複数種のピークに分散して検出されるため、結果的に、分子量関連イオンの感度低下を引き起こす。さらに、複数種のイオンピークが検出されることから、データ解析が複雑になる。よって、より塩基脱離、及び付加体ピークの検出が抑制されるマトリックスが望まれる。

【0032】

図１のマススペクトルは、ラスタースキャンによる測定において最終的に得られるマススペクトル（各測定点でのマススペクトルデータを全て積算することにより得られるマススペクトル）である。表中の感度、分解能、塩基脱離状況、及び付加体検出状況は、図１のマススペクトルデータに基づくものである。

【0033】

本実施例において、塩基脱離状況は、［Ｍ＋Ｈ］^＋ピークのＳ／Ｎ値に対する塩基脱離により生じた代表的な塩基脱離イオンピークのＳ／Ｎ値の比率（％）により評価した（表中の括弧内に具体的な各Ｓ／Ｎ値を示す。）。また、付加体検出状況は、［Ｍ＋Ｈ］^＋ピークのＳ／Ｎ値に対する代表的な付加体ピークのＳ／Ｎ値の比率（％）により評価した（表中の括弧内に具体的な各Ｓ／Ｎ値を示す。）。

【0034】

ラスタースキャンによるピーク検出の均一性は、Ｓ／Ｎ＞２の感度で［Ｍ＋Ｈ］^＋ピークが検出された測定点の数、Ｓ／Ｎ＞５の感度で［Ｍ＋Ｈ］^＋ピークが検出された測定点の数、及びＳ／Ｎ＞１０の感度で［Ｍ＋Ｈ］^＋ピークが検出された測定点の数のそれぞれについてのラスタースキャン時の測定点の総数（本実施例では２５個）に対する割合（％）により評価した（表中の括弧内に具体的な測定点の数を示す。）。

【0035】

図１より、特に混合比３０：１～１０：１でＤＨＡＰとＴＨＡＰを混合した混合マトリックス（ＤＨＡＰ＋ＴＨＡＰ）を用いた場合に、ＲＮＡの分子量関連イオン［Ｍ＋Ｈ］^＋が高感度に検出された。また、ＤＨＡＰを単独で用いた場合、例えばＳ／Ｎ＞１０の感度で［Ｍ＋Ｈ］^＋が検出された測定点はラスタースキャンによる測定を行った測定点のうちの６割程度であり（図１（ａ））、ＴＨＡＰを単独で用いた場合、Ｓ／Ｎ＞１０の感度で［Ｍ＋Ｈ］^＋が検出された測定点はラスタースキャンによる測定を行った測定点のうちの２割程度であったが（図１（ｌ））、混合マトリックス（ＤＨＡＰ＋ＴＨＡＰ、混合比３０：１～１０：１）を用いた場合は、ラスタースキャンによる測定の９割以上の測定点においてＳ／Ｎ＞１０の感度で［Ｍ＋Ｈ］^＋のピークが検出された（図１（ｂ）～（ｅ））。分解能は全てのマトリックスにおいて同程度であり、塩基脱離状況、及び付加体ピークの検出状況は、全てのマトリックスにおいて同程度に抑制されていた。

【0036】

以上より、混合マトリックス（ＤＨＡＰ＋ＴＨＡＰ、混合比３０：１～１０：１）を用いた場合、ＤＨＡＰ又はＴＨＡＰを単独で用いる従来法に比べてＲＮＡの分子量関連イオンの検出感度が向上し、ラスタースキャンによる測定における均一性が向上することが確認された。

【実施例0037】

＜２．マトリックス溶液の調製＞において、ＤＨＡＰ溶液とＴＨＡＰ溶液を混合比１００：１、５０：１、３０：１、２０：１、１５：１、１０：１、５：１、１：１（ｖ／ｖ）で混合し、各混合マトリックス溶液を作製した以外は、実施例１と同様の方法によりＲＮＡ（パティシランのセンス）の質量分析を行った。

【0038】

＜結果＞
マトリックスとしてＤＨＡＰ、ＴＨＡＰ、及びＤＨＡＰとＴＨＡＰを各混合比で含む混合マトリックス（ＤＨＡＰ＋ＴＨＡＰ）を用いた場合の、パティシランのセンスのマススペクトル、及び［Ｍ＋Ｈ］^＋のピーク検出状況（感度、分解能、塩基脱離状況、付加体検出状況、ラスタースキャン測定によるピーク検出の均一性）をまとめた表を、図２に示す。なお、実施例２は実施例１とは別の日に測定を行った。

【0039】

図２においても、混合マトリックス（ＤＨＡＰ＋ＴＨＡＰ、混合比３０：１～１０：１）を用いた場合に、ＤＨＡＰ及びＴＨＡＰに比べて感度及び均一性が向上することが確認された。