▶ 国立大学法人 東京医科歯科大学の特許一覧 ▶ 株式会社シノテストの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024064487
(43)【公開日】2024-05-14
(54)【発明の名称】認知症の診断マーカー
(51)【国際特許分類】
G01N 33/68 20060101AFI20240507BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20240507BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20240507BHJP
【ＦＩ】
G01N33/68 ZNA
G01N33/53 D
C07K16/18
【審査請求】未請求
【請求項の数】8
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022173105
(22)【出願日】2022-10-28
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】504179255
【氏名又は名称】国立大学法人 東京医科歯科大学
(71)【出願人】
【識別番号】000131474
【氏名又は名称】株式会社シノテスト
(74)【代理人】
【識別番号】100107984
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 雅紀
(74)【代理人】
【識別番号】100182305
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 鉄平
(74)【代理人】
【識別番号】100096482
【弁理士】
【氏名又は名称】東海 裕作
(74)【代理人】
【識別番号】100131093
【弁理士】
【氏名又は名称】堀内 真
(74)【代理人】
【識別番号】100150902
【弁理士】
【氏名又は名称】山内 正子
(74)【代理人】
【識別番号】100141391
【弁理士】
【氏名又は名称】園元 修一
(74)【代理人】
【識別番号】100221958
【弁理士】
【氏名又は名称】篠田 真希恵
(74)【代理人】
【識別番号】100192441
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 仁
(72)【発明者】
【氏名】岡澤 均
(72)【発明者】
【氏名】山田 晋吾
【テーマコード（参考）】
2G045
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G045AA25
2G045CA25
2G045CB30
2G045DA36
2G045FB03
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA75
4H045DA76
4H045EA50
(57)【要約】
【課題】認知症を、大型の専門機器を使用する必要がなく、かつ比較的簡便な方法で精度よく判定する方法や、その判定に用いるキット等の提供。
【解決手段】被験者から採取された１又は２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体を検出し、アミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度を指標として、前記被験者が認知症に罹患しているか否かを判定する。
【選択図】なし
【解決手段】被験者から採取された１又は２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体を検出し、アミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度を指標として、前記被験者が認知症に罹患しているか否かを判定する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の工程（ａ）及び（ｂ）を含む、認知症の判定方法。
（ａ）被験者から採取された１又は２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度を測定する工程；
（ｂ）被験者から採取された１又は２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度を指標として、被験者が認知症に罹患しているか否かを判定する工程；
（ａ）被験者から採取された１又は２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度を測定する工程；
（ｂ）被験者から採取された１又は２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度を指標として、被験者が認知症に罹患しているか否かを判定する工程；
【請求項2】
工程（ｂ）において、被験者から採取された１又は２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度と、認知症に罹患していない対照者由来の１又は２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度とを比較し、被験者から採取された１又は２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度が、認知症に罹患していない対照者由来の１又は２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度よりも高い場合、被験者は認知症に罹患している可能性が高いと判定する、請求項１に記載の判定方法。
【請求項3】
生体試料が、血液試料又は脳脊髄液試料である、請求項１に記載の判定方法。
【請求項4】
工程（ｂ）において、
被験者から採取された２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度と、認知症に罹患していない対照者由来の２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度とを比較し、さらに、
被験者から採取された１又は２以上の生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度と、認知症に罹患していない対照者由来の１又は２以上の生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度とを比較し、
被験者から採取された２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度が、認知症に罹患していない対照者由来の２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度よりも高く、かつ、被験者から採取された１又は２以上の生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度が、認知症に罹患していない対照者由来の１又は２以上の生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度よりも高い場合、被験者は認知症に罹患している可能性が高いと判定する、請求項１に記載の判定方法。
被験者から採取された２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度と、認知症に罹患していない対照者由来の２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度とを比較し、さらに、
被験者から採取された１又は２以上の生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度と、認知症に罹患していない対照者由来の１又は２以上の生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度とを比較し、
被験者から採取された２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度が、認知症に罹患していない対照者由来の２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度よりも高く、かつ、被験者から採取された１又は２以上の生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度が、認知症に罹患していない対照者由来の１又は２以上の生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度よりも高い場合、被験者は認知症に罹患している可能性が高いと判定する、請求項１に記載の判定方法。
【請求項5】
認知症に罹患していない対照者が、健常者又は軽度認知障害患者である、請求項２又は４に記載の判定方法。
【請求項6】
認知症が、アルツハイマー型認知症である、請求項１～４のいずれかに記載の判定方法。
【請求項7】
ヒトアミロイドβに特異的に結合する抗体又はその標識物と、ヒトＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体又はその標識物とを含む、アミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体を検出し、かつ、認知症を判定するためのキット。
【請求項8】
さらに、ＨＭＧＢ１を検出するための、請求項７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体を指標として、被験者がアルツハイマー型認知症（アルツハイマー病）等の認知症に罹患しているか否かを判定する方法や、アミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体を検出し、かつ被験者が認知症に罹患しているか否かを判定するためのキット等に関する。
【背景技術】
【0002】
アルツハイマー病（Alzheimer's disease；以下、「ＡＤ」ということがある）は、不可逆的な進行性中枢神経疾患の１つであり、記憶障害や思考障害を伴う認知機能障害（認知症）、行動障害、人格変化等の症状を呈することが知られている。アルツハイマー病は、認知症患者の中で最も多い疾患であり、認知症患者全体の約６０～８０％を占めている。アルツハイマー病は、一般に６５歳以上の高齢者で発症するが、中には６４歳以下でも発症し、その場合、若年性アルツハイマー病と呼ばれている。
【0003】
内閣府の発表によると、２０１２年の日本における認知症患者数は４６２万人であり、６５歳以上の高齢者の７人に１人であったが、２０２５年には約７００万人まで増加し、５人に１人になると見込まれている。ＡＤ等の認知症患者数が増加すると、医療費の増大や介護問題等で国や患者関係者達の経済的又は精神的負担が深刻化することが予想される。
【0004】
認知症の診断は、面接及び質問紙法が主体であり、客観的診断法は未だ確立されていないのが現状である。面接及び質問紙法は、診断者による差があり、定量性に欠けるという欠点がある。この問題を解決するため、客観的診断法の確立のため研究が行われている。例えば、ＡＤにおいては、症状の進行に伴い大脳の萎縮が認められるため、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を用いた画像診断を行う方法が考案されている。また、過剰にリン酸化されたＴａｕ（以下、「タウ」ということがある）の細胞内凝集（神経原線維変化）が、アミロイドβ（以下、「Ａβ」ということがある）の細胞外蓄積（老人斑）とともに、脳で顕著に観察される。そして、Ａβが蓄積すると、神経細胞内の微小管が構造変化を起こして神経細胞が死んでいくことになり、当該神経細胞死が起こると共にタウも細胞の外に漏れ、脳脊髄液（Cerebrospinal Fluid；以下、「ＣＳＦ」ということがある）試料中に蓄積すると考えられている。このことから、脳脊髄液試料中のタウをマーカーとして用いる診断法も考案されている。しかしながら、これら方法は大型の専門機器が必要となる等、利便性、経済性、汎用性などの面で十分とは言い難いものであった。
【0005】
赤血球に含有されるプラズマローゲンが、認知症の診断マーカーとして有用であることが報告されている（特許文献１）。また、本発明者は、ＨＭＧＢ１（high mobility group box 1）が、軽度認知障害（Mild Cognitive Impairment；以下、「ＭＣＩ」ということがある）の診断マーカーとして有用であることを報告している（特許文献２）。
【0006】
一方、アミロイドβとＨＭＧＢ１が、インビトロにおいて複合体を形成し得ることは報告されている（非特許文献１）。しかしながら、アミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体が、認知症の診断マーカーとして有用であることはこれまで知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】国際公開第２０１２／０９０６２５号パンフレット
【特許文献2】国際公開第２０２０／２５５９３８号パンフレット
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Biochem Biophys Res Commun . 2003 Feb 14;301(3):699-703.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明の課題は、認知症を、大型の専門機器を使用する必要がなく、かつ比較的簡便な方法で精度よく判定する方法や、その判定に用いるキット等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を進める過程において、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay）を用いて、ＡＤ患者における生体試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度が上昇することを見いだすとともに、かかるＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度を指標として、ＡＤ等の認知症に罹患した者と、認知症に罹患していない者（ＭＣＩ患者や脳機能障害と診断されていない健常者）とを判別できることを見いだした。さらに、１又は２の生体試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度と、生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度とを組み合わせて解析することにより、認知症の判定精度が向上することも確認した。前述の特許文献２には、ＨＭＧＢ１濃度は、ＭＣＩ患者においては健常者と比べ上昇するものの、ＡＤ患者においてはむしろ健常者のレベルまで低下することが報告されている。このため、Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体が、ＡＤ等の認知症の診断マーカーとして有用であることや、ＨＭＧＢ１との組合せにより、認知症の判定精度が向上することは驚きであった。本発明は、これらの知見に基づき、完成するに至ったものである。
【0011】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕以下の工程（ａ）及び（ｂ）を含む、認知症の判定方法。
（ａ）被験者から採取された１又は２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度を測定する工程；
（ｂ）被験者から採取された１又は２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度を指標として、被験者が認知症に罹患しているか否かを判定する工程；
〔２〕工程（ｂ）において、被験者から採取された１又は２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度と、認知症に罹患していない対照者由来の１又は２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度とを比較し、被験者から採取された１又は２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度が、認知症に罹患していない対照者由来の１又は２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度よりも高い場合、被験者は認知症に罹患している可能性が高いと判定する、上記〔１〕に記載の判定方法。
〔３〕生体試料が、血液試料又は脳脊髄液試料である、上記〔１〕又は〔２〕に記載の判定方法。
〔４〕工程（ｂ）において、
被験者から採取された２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度と、認知症に罹患していない対照者由来の２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度とを比較し、さらに、
被験者から採取された１又は２以上の生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度と、認知症に罹患していない対照者由来の１又は２以上の生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度とを比較し、
被験者から採取された２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度が、認知症に罹患していない対照者由来の２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度よりも高く、かつ、被験者から採取された１又は２以上の生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度が、認知症に罹患していない対照者由来の１又は２以上の生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度よりも高い場合、被験者は認知症に罹患している可能性が高いと判定する、上記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の判定方法。
〔５〕認知症に罹患していない対照者が、健常者又は軽度認知障害患者である、上記〔２〕～〔４〕のいずれかに記載の判定方法。
〔６〕認知症が、アルツハイマー型認知症である、上記〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の判定方法。
〔７〕ヒトアミロイドβに特異的に結合する抗体又はその標識物と、ヒトＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体又はその標識物とを含む、アミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体を検出し、かつ、認知症を判定するためのキット。
〔８〕さらに、ＨＭＧＢ１を検出するための、上記〔７〕に記載のキット。
〔１〕以下の工程（ａ）及び（ｂ）を含む、認知症の判定方法。
（ａ）被験者から採取された１又は２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度を測定する工程；
（ｂ）被験者から採取された１又は２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度を指標として、被験者が認知症に罹患しているか否かを判定する工程；
〔２〕工程（ｂ）において、被験者から採取された１又は２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度と、認知症に罹患していない対照者由来の１又は２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度とを比較し、被験者から採取された１又は２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度が、認知症に罹患していない対照者由来の１又は２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度よりも高い場合、被験者は認知症に罹患している可能性が高いと判定する、上記〔１〕に記載の判定方法。
〔３〕生体試料が、血液試料又は脳脊髄液試料である、上記〔１〕又は〔２〕に記載の判定方法。
〔４〕工程（ｂ）において、
被験者から採取された２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度と、認知症に罹患していない対照者由来の２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度とを比較し、さらに、
被験者から採取された１又は２以上の生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度と、認知症に罹患していない対照者由来の１又は２以上の生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度とを比較し、
被験者から採取された２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度が、認知症に罹患していない対照者由来の２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度よりも高く、かつ、被験者から採取された１又は２以上の生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度が、認知症に罹患していない対照者由来の１又は２以上の生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度よりも高い場合、被験者は認知症に罹患している可能性が高いと判定する、上記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の判定方法。
〔５〕認知症に罹患していない対照者が、健常者又は軽度認知障害患者である、上記〔２〕～〔４〕のいずれかに記載の判定方法。
〔６〕認知症が、アルツハイマー型認知症である、上記〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の判定方法。
〔７〕ヒトアミロイドβに特異的に結合する抗体又はその標識物と、ヒトＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体又はその標識物とを含む、アミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体を検出し、かつ、認知症を判定するためのキット。
〔８〕さらに、ＨＭＧＢ１を検出するための、上記〔７〕に記載のキット。
【0012】
また本発明の実施の他の形態として、
上記工程（ａ）と、被験者から採取された１又は２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度を指標として、被験者が認知症に罹患しているか否かを判定するためのデータを作成する工程（Ｂ）とを順次含む、認知症を判定するためのデータを作成する方法；や、
上記工程（ａ）及び（ｂ）を含む、認知症の診断方法；や、
上記工程（ａ）及び（ｂ）を含み、かつ、工程（ｂ）において、認知症に罹患している可能性が高いと判定された被験者に対して、認知症を治療する処置又は認知症の悪化を予防する処置を施す（例えば、認知症治療薬を投与する）工程を含む、認知症の治療方法又は認知症悪化の予防方法；や、
１又は２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度が、認知症に罹患していない対照者由来の１又は２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度よりも高い認知症患者に対して、認知症を治療する処置又は認知症の悪化を予防する処置を施す（例えば、認知症治療薬を投与する）工程を含む、認知症の治療方法又は認知症悪化の予防方法；や、
アミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の検出、及び、認知症の判定（診断）における使用のための、ヒトアミロイドβに特異的に結合する抗体、又はその標識物と、ヒトＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体、又はその標識物；
を挙げることができる。
上記工程（ａ）と、被験者から採取された１又は２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度を指標として、被験者が認知症に罹患しているか否かを判定するためのデータを作成する工程（Ｂ）とを順次含む、認知症を判定するためのデータを作成する方法；や、
上記工程（ａ）及び（ｂ）を含む、認知症の診断方法；や、
上記工程（ａ）及び（ｂ）を含み、かつ、工程（ｂ）において、認知症に罹患している可能性が高いと判定された被験者に対して、認知症を治療する処置又は認知症の悪化を予防する処置を施す（例えば、認知症治療薬を投与する）工程を含む、認知症の治療方法又は認知症悪化の予防方法；や、
１又は２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度が、認知症に罹患していない対照者由来の１又は２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度よりも高い認知症患者に対して、認知症を治療する処置又は認知症の悪化を予防する処置を施す（例えば、認知症治療薬を投与する）工程を含む、認知症の治療方法又は認知症悪化の予防方法；や、
アミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の検出、及び、認知症の判定（診断）における使用のための、ヒトアミロイドβに特異的に結合する抗体、又はその標識物と、ヒトＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体、又はその標識物；
を挙げることができる。
【発明の効果】
【0013】
本発明によると、認知症を、大型の専門機器を使用する必要がなく、かつ比較的簡便な方法で精度よく判定できるため、より多くの認知症患者に対して、適切な治療を行うことにより、あるいは、認知症悪化の予防の適切な処置を行うことにより、認知症の治療、及び認知症の病期進行の予防に資するものである。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1a】２種類のＡβ（Ａβ１－４０又はＡβ１－４２）と、ｄｓＨＭＧＢ１及びａｔＨＭＧＢ１を含むヒトＨＭＧＢ１を１：１のモル比で混合・インキュベートした後、抗Ａβ抗体又は抗ＨＭＧＢ１抗体を用いたウェスタンブロッティングを行った結果を示す図である。
【図1c】Ａβ（Ａβ１－４０）と２種類のＨＭＧＢ１（ｄｓＨＭＧＢ１又はａｔＨＭＧＢ１）を１：１のモル比で混合・インキュベートした後、抗Ａβ抗体又は抗ＨＭＧＢ１抗体を用いたウェスタンブロッティングを行った結果を示す図である。
【図1d】２種類のＡＤモデルマウス（５×ＦＡＤマウス及びＡＰＰ－ＫＩマウス）由来の大脳皮質溶解液について、抗Ａβ抗体又は抗ＨＭＧＢ１抗体を用いたウェスタンブロッティングを行った結果を示す図である。
【図1e】種類のＡＤモデルマウス（５×ＦＡＤマウス及びＡＰＰ－ＫＩマウス）由来の大脳皮質溶解液について、抗Ａβ抗体又は抗ＨＭＧＢ１抗体を用いた免疫沈降を行い、抗Ａβ抗体又は抗ＨＭＧＢ１抗体を用いたウェスタンブロッティングを行った結果を示す図である。
【図2a-c】図２ａは、３種類の群（ＡＤ群［ＡＤ患者、ｎ＝７０］、ＭＣＩ群［ＭＣＩ患者、ｎ＝２３］、及びcontrol群［健常者、ｎ＝４８］）における脳脊髄液（ＣＳＦ）試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度を測定した結果を示す図である。図中の「＊＊」は、統計学的に有意差がある（ｐ＜０．０１）ことを示す（以下同じ）。図２ｂは、３種類の群（ＡＤ群［ＡＤ患者、ｎ＝３１］、ＭＣＩ群［ＭＣＩ患者、ｎ＝３］、及びcontrol群［健常者、ｎ＝３０］）における血漿試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度を測定した結果を示す図である。図２ｃは、ＡＤ群（ＡＤ患者、ｎ＝７０）におけるＣＳＦ試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度及びＨＭＧＢ１の濃度を測定し、両者の関係を示す図である。
【図2d-g】図２ｄは、図２ａの結果を基に、ＡＤ群及びcontrol群間のＲＯＣ（Receiver Operating Characteristic）分析を行った結果を示す図である。図２ｅは、図２ａの結果を基に、ＭＣＩ群及びcontrol群間のＲＯＣ分析を行った結果を示す図である。図２ｆは、図２ｂの結果を基に、ＡＤ群及びcontrol群間のＲＯＣ分析を行った結果を示す図である。図２ｇは、図２ｂの結果を基に、ＭＣＩ群及びcontrol群間のＲＯＣ分析を行った結果を示す図である。
【図2h-i】図２ｈは、ＡＤ群及びcontrol群における血漿中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度と、ＡＤＡＳ－ｃｏｇ値との関係を示す図である。図２ｉは、ＡＤ群及びcontrol群における血漿中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度と、ＭＭＳＥ値との関係を示す図である。
【図2j-k】図２ｊは、ＡＤ群における血漿中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度と、ＡＤＡＳ－ｃｏｇ値の年変化との関係を示す図である。図２ｋは、ＡＤ群における血漿中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度と、ＭＭＳＥ値の年変化との関係を示す図である。
【図3】２種類のＡＤモデルマウス（５×ＦＡＤマウス［図３ａ］及びＡＰＰ－ＫＩマウス［図３ｂ］）由来の脳の矢状切片を、抗Ａβ抗体及び抗ＨＭＧＢ１抗体を用いた免疫組織化学染色法により解析した結果を示す図である。図中の「＊＊＊」は、統計学的に有意差がある（ｐ＜０．００１）ことを示す（以下同じ）。
【図4】プレセニリン－１（ＰＳ１）遺伝子にＭ１４６Ｌ変異（ＰＳ１－Ｍ１４６Ｌ）を有する家族性ＡＤ患者由来の脳の矢状切片を、抗Ａβ抗体及び抗ＨＭＧＢ１抗体を用いた免疫組織化学染色法により解析した結果を示す図である。
【図5】２種類のＡＤモデルマウス（５×ＦＡＤマウス［図５ａ］及びＡＰＰ－ＫＩマウス［図５ｂ］）由来の脳の矢状切片と、ＰＳ１－Ｍ１４６Ｌを有する家族性ＡＤ患者（図５ｃ）由来の脳の矢状切片を、抗Ａβ抗体、抗ＨＭＧＢ１抗体、及び抗ＭＡＰ２抗体を用いた免疫組織化学染色法により解析した結果を示す図である。
【図6a-b】初代神経細胞を８種類の被験物質（ｄｓＨＭＧＢ１、ａｔＨＭＧＢ１、Ａβ１－４０、Ａβ１－４２、Ａβ１－４０－ｄｓＨＭＧＢ１複合体、Ａβ１－４０－ａｔＨＭＧＢ１複合体、Ａβ１－４２－ｄｓＨＭＧＢ１複合体、及びＡβ１－４２－ａｔＨＭＧＢ１複合体）の存在下でインキュベートした後、３種類の抗体（抗ｐＳｅｒ４６－ＭＡＲＣＫＳ抗体［図６ａ］、抗リン酸化タウ抗体［図６ｂ］、及び抗β－アクチン抗体［図６ａ及び６ｂ］）を用いたウェスタンブロッティングを行った結果を示す図である。図中の「＃＃」は、「no treatment」に対して統計学的に有意差がある（ｐ＜０．０１）ことを示す。
【図6c-d】図６ｃは、初代神経細胞を４種類の被験物質（ｄｓＨＭＧＢ１、Ａβ１－４０、Ａβ１－４０－ｄｓＨＭＧＢ１複合体、及びＡβ１－４２－ｄｓＨＭＧＢ１複合体）の存在下でかつ、モノクローナル抗体＃１２９の存在下又は非存在下でインキュベートした後、３種類の抗体（抗ｐＳｅｒ４６－ＭＡＲＣＫＳ抗体、抗リン酸化タウ抗体、及び抗β－アクチン抗体）を用いたウェスタンブロッティングを行った結果を示す図である。図６ｄは、ＴＬＲ４をノックダウンした初代神経細胞（図中の「TLR4-siRNA(+)」）と、ＴＬＲ４をノックダウンしない初代神経細胞（図中の「TLR4-siRNA(-)」）とを、それぞれ４種類の被験物質（ｄｓＨＭＧＢ１、Ａβ１－４０、Ａβ１－４０－ｄｓＨＭＧＢ１複合体、及びＡβ１－４２－ｄｓＨＭＧＢ１複合体）の存在下でインキュベートした後、４種類の抗体（抗ＴＬＲ４抗体、抗ｐＳｅｒ４６－ＭＡＲＣＫＳ抗体、抗リン酸化タウ抗体、及び抗β－アクチン抗体）を用いたウェスタンブロッティングを行った結果を示す図である。図中の「＃＃」は、統計学的に有意差がある（ｐ＜０．０１）ことを示す（以下同じ）。
【図6e-f】図６ｅは、初代神経細胞を８種類の被験物質（ｄｓＨＭＧＢ１、ａｔＨＭＧＢ１、Ａβ１－４０、Ａβ１－４２、Ａβ１－４０－ｄｓＨＭＧＢ１複合体、Ａβ１－４０－ａｔＨＭＧＢ１複合体、Ａβ１－４２－ｄｓＨＭＧＢ１複合体、及びＡβ１－４２－ａｔＨＭＧＢ１複合体）の存在下でインキュベートした後、バルーニングした小胞体（ＥＲ）を有する細胞数を測定した結果を示す図である。図６ｆは、初代神経細胞を４種類の被験物質（ｄｓＨＭＧＢ１、Ａβ１－４０、Ａβ１－４０－ｄｓＨＭＧＢ１複合体、及びＡβ１－４２－ｄｓＨＭＧＢ１複合体）の存在下でかつ、モノクローナル抗体＃１２９の存在下又は非存在下でインキュベートした後、バルーニングしたＥＲを有する細胞数を測定した結果を示す図である。
【図7】図７ａは、ＡＤ群（ｎ＝３１）及びＭＣＩ群（ｎ＝２３）におけるＣＳＦ試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度を測定し、両群間のＲＯＣ分析を行った結果を示す図である。図７ｂは、ＡＤ群（ｎ＝３０）及びＭＣＩ群（ｎ＝６）における血漿試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度を測定し、両群間のＲＯＣ分析を行った結果を示す図である。図７ｃは、図７ａにおける、ＣＳＦ試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度と、両群におけるＣＳＦ試料中のＨＭＧＢ１の濃度とを組み合わせて、両群間のＲＯＣ分析を行った結果を示す図である。図７ｄは、図７ｂにおける、血漿試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度と、両群におけるＣＳＦ試料中のＨＭＧＢ１の濃度とを組み合わせて、両群間のＲＯＣ分析を行った結果を示す図である。図７ｅは、図７ａにおける、ＣＳＦ試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度と、図７ｂにおける、血漿試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度と、図７ｃ又は７ｄにおける、ＣＳＦ試料中のＨＭＧＢ１の濃度とを組み合わせて、両群間のＲＯＣ分析を行った結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0015】
本発明の判定方法としては、被験者から採取された１又は２以上の生体試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体（すなわち、ＡβとＨＭＧＢ１との複合体）の濃度を測定（必要に応じてさらに定量）する工程（ａ）；及び被験者から採取された１又は２以上の生体試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度を指標として、被験者が認知症に罹患しているか否か（認知症を発症しているか否か）を判定する工程（ｂ）；を順次含む、認知症を判定する方法（以下、「本件判定方法」ということがある）であれば特に制限されず、本件判定方法は、医師による認知症の有無の診断を補助する方法であって、医師による診断行為を含まない。
【0016】
本発明のキットとしては、「アミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体を検出するため」という用途と、「認知症を判定するため」という用途に特定された、ヒトＡβに特異的に結合する抗体（すなわち、抗ヒトＡβ抗体）又は抗ヒトＡβ抗体の標識物と、ヒトＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体（すなわち、抗ヒトＨＭＧＢ１抗体）又は抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の標識物とを含むキット（以下、「本件キット」ということがある）であれば特に制限されず、本件キットは、認知症を判定するためのキットや、認知症の診断を補助するためのキットに関する用途発明であり、これらキットには、一般にこの種のキットに用いられる成分、例えば担体、ｐＨ緩衝剤、安定剤の他、取扱説明書、認知症を判定するための説明書等の添付文書が通常含まれる。
【0017】
本発明において、「認知症」とは、認知機能（例えば、記憶機能、遂行機能、注意機能、視空間認知機能、言語理解機能）の低下が認められ、認知症の診断基準を満たし、かつ、基本的な日常生活や社会生活には支障がある状態を意味する。すなわち、「認知症」には、認知機能の低下は認められるものの、認知症の診断基準は満たさず、かつ、基本的な日常生活や社会生活には支障がない状態（すなわち、軽度認知障害）は含まれない。ここで「認知症の診断基準を満たす」とは、例えば、ミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ；Mini Mental State Examination）の点数が２０点以下（例えば、１９点以下、１８点以下、１７点以下、１６点以下、１５点以下、１４点以下、１３点以下、１２点以下、１１点以下等）であること；ＡＤＡＳ－ｃｏｇ（Alzheimer's Disease Assessment Scale-cognitive subscale）の点数が１０点以上（例えば、１１点以上、１２点以上、１３点以上、１４点以上、１５点以上、１６点以上、１７点以上、１８点以上、１９点以上、２０点以上、２１点以上、２２点以上等）であること；及び、臨床的認知症尺度（ＣＤＲ；Clinical Dementia Rating）の点数が１点以上（例えば、１．１点以上、１．２点以上、１．３点以上、１．４点以上等）であること；から選択される１又は２以上を意味する。
【0018】
本明細書において、認知症としては、例えば、アルツハイマー病（アルツハイマー型認知症）、パーキンソン病で発症する認知症、Ｌｅｗｙ小体型認知症、前頭側頭型認知症、進行性非流暢性失語で発症する認知症、意味性認知症、大脳皮質基底核変性症で発症する認知症等を挙げることができ、後述する本実施例でその効果が実証されているため、アルツハイマー型認知症を好適に例示することができる。
【0019】
本発明において、「生体試料」としては、被験者（生体）由来の試料であればよく、例えば、血液試料、脳脊髄液（ＣＳＦ）試料、尿試料を挙げることができ、後述する本実施例において、その効果が実証されているため、血液試料やＣＳＦ試料を好適に例示することができる。
【0020】
上記工程（ａ）において、生体試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度を測定・定量する方法としては、生体試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体タンパク質を特異的に検出できる方法であればよく、例えば、生体試料又はその処理物（例えば、血液試料の場合、血清試料や血漿試料；脳脊髄液試料の場合、遠心処理により夾雑物を除いた脳脊髄液；尿試料の場合、遠心処理により夾雑物を除いた尿）を用いて、Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体を特異的に認識する抗体を用いた免疫学的測定法を挙げることができる。
【0021】
上記免疫学的測定法としては、例えば、抗ヒトＡβ抗体又はその標識物と、抗ヒトＨＭＧＢ１抗体又はその標識物とを用いた免疫組織化学染色法、サンドイッチＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＩＡ、サンドイッチＲＩＡ、ウェスタンブロッティング、免疫沈降法とウェスタンブロッティングとの組合せ等を挙げることができる。
【0022】
本発明において、Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体濃度の値は、絶対値であっても、相対値であってもよい。Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体濃度の絶対値は、例えば、既知の濃度のＡβ及び／又はＨＭＧＢ１を用いて、Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体由来のシグナル量（例えば、蛍光量、色素量）と、Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体濃度との関係を示す検量線を作成し、かかる検量線を基に算出することができる。また、Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体濃度の相対値は、例えば、認知症に罹患していない対照者由来のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体由来のシグナル量（例えば、蛍光量、色素量）を基準にして算出することができる。
【0023】
上記工程（ｂ）において、被験者が認知症に罹患しているか否かを判定する方法や、上記工程（Ｂ）において、被験者が認知症に罹患しているか否かを判定するためのデータを作成する方法としては、例えば、ある閾値（カットオフ値）よりも高いことを基準にして、判定する方法を挙げることができ、かかるカットオフ値としては、例えば、認知症に罹患していない対照者における生体試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体濃度の平均値；当該平均値＋標準偏差（ＳＤ）；当該平均値＋２ＳＤ；当該平均値＋３ＳＤ；認知症に罹患していない対照者における生体試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体濃度の中央値；当該Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体濃度の第三四分位数；当該Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体濃度の最大値；等を挙げることができる。また、カットオフ値は、感度（認知症に罹患している者を、正しく陽性と判定できる割合）及び特異度（認知症に罹患していない者を、正しく陰性と判定できる割合）が高くなるように、認知症患者における生体試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体濃度のデータと、認知症に罹患していない対照者における生体試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体濃度のデータを基に、統計解析ソフトウェアを用いたＲＯＣ曲線を用いて算出することもできる。
【0024】
上記工程（ｂ）において、被験者が認知症に罹患しているか否かを判定する方法としては、具体的には、
被験者から採取された１又は２以上の生体試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度と、認知症に罹患していない対照者由来の１又は２以上の生体試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度とを比較し、被験者から採取された１又は２以上の生体試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度が、認知症に罹患していない対照者由来の１又は２以上の生体試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度よりも高い場合、被験者は認知症に罹患している可能性が高いと判定する方法；や、
被験者から採取された２以上の生体試料（好ましくは、血液試料及び脳脊髄液試料）中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度と、認知症に罹患していない対照者由来の２以上の生体試料（好ましくは、血液試料及び脳脊髄液試料）中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度とを比較し、さらに、
被験者から採取された１又は２以上の生体試料（好ましくは、脳脊髄液試料）中のＨＭＧＢ１の濃度と、認知症に罹患していない対照者由来の１又は２以上の生体試料（好ましくは、脳脊髄液試料）中のＨＭＧＢ１の濃度とを比較し、
被験者から採取された２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度が、認知症に罹患していない対照者由来の２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度よりも高く、かつ、被験者から採取された１又は２以上の生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度が、認知症に罹患していない対照者由来の１又は２以上の生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度よりも高い場合、被験者は認知症に罹患している可能性が高いと判定する方法；
等を好適に例示することができる。
被験者から採取された１又は２以上の生体試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度と、認知症に罹患していない対照者由来の１又は２以上の生体試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度とを比較し、被験者から採取された１又は２以上の生体試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度が、認知症に罹患していない対照者由来の１又は２以上の生体試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度よりも高い場合、被験者は認知症に罹患している可能性が高いと判定する方法；や、
被験者から採取された２以上の生体試料（好ましくは、血液試料及び脳脊髄液試料）中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度と、認知症に罹患していない対照者由来の２以上の生体試料（好ましくは、血液試料及び脳脊髄液試料）中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度とを比較し、さらに、
被験者から採取された１又は２以上の生体試料（好ましくは、脳脊髄液試料）中のＨＭＧＢ１の濃度と、認知症に罹患していない対照者由来の１又は２以上の生体試料（好ましくは、脳脊髄液試料）中のＨＭＧＢ１の濃度とを比較し、
被験者から採取された２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度が、認知症に罹患していない対照者由来の２以上の生体試料中のアミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度よりも高く、かつ、被験者から採取された１又は２以上の生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度が、認知症に罹患していない対照者由来の１又は２以上の生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度よりも高い場合、被験者は認知症に罹患している可能性が高いと判定する方法；
等を好適に例示することができる。
【0025】
また、上記工程（Ｂ）において、被験者が認知症に罹患しているか否かを判定するためのデータを作成する方法としては、具体的には、被験者から採取された１又は２以上の生体試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度と、認知症に罹患していない対照者由来の１又は２以上の生体試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度とを比較し、被験者から採取された１又は２以上の生体試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度が、認知症に罹患していない対照者由来の１又は２以上の生体試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度よりも高い場合、被験者は認知症に罹患している可能性が高いと判定するためのデータを作成する方法等を好適に例示することができる。
【0026】
本明細書において、「認知症に罹患していない対照者」としては、認知症に罹患していない者（被験者のコントロール）、すなわち、１）認知機能の低下は認められない；２）認知症の診断基準を満たさない；及び３）基本的な日常生活や社会生活には支障がない；の１）～３）の基準のうち、少なくとも１つの基準を満たす者であればよく、具体的には、健常者、軽度認知障害に罹患している患者を挙げることができ、健常者や軽度認知障害患者を好適に例示することができる。
【0027】
本発明において、認知症の判定の指標であるＡβ－ＨＭＧＢ１複合体におけるＡβは、ヒト由来のＡβ（Amyloid beta）タンパク質又はそれを構成するペプチドであり、Ａβを構成するペプチドは、具体的には、以下の［Ｂ群ペプチド］から選択される１又は２種以上のペプチドを挙げることができる。
［Ｂ群ペプチド］
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド（Ａβ１－４０）、或いは、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、認知症患者における発現量が、認知症に罹患していない対照者と比べ高いＡβ－ＨＭＧＢ１複合体におけるペプチド；
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド（Ａβ１－４２）、或いは、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、認知症患者における発現量が、認知症に罹患していない対照者と比べ高いＡβ－ＨＭＧＢ１複合体におけるペプチド；
［Ｂ群ペプチド］
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド（Ａβ１－４０）、或いは、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、認知症患者における発現量が、認知症に罹患していない対照者と比べ高いＡβ－ＨＭＧＢ１複合体におけるペプチド；
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド（Ａβ１－４２）、或いは、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、認知症患者における発現量が、認知症に罹患していない対照者と比べ高いＡβ－ＨＭＧＢ１複合体におけるペプチド；
【0028】
本発明において、認知症の判定の指標であるＡβ－ＨＭＧＢ１複合体におけるＨＭＧＢ１は、ヒト由来のＨＭＧＢ１（high mobility group box 1）タンパク質又はそれを構成するペプチドであり、ヒト由来のＨＭＧＢ１タンパク質は、具体的には、以下の［Ａ群タンパク質］から選択される１又は２種以上のタンパク質を挙げることができる。
［Ａ群タンパク質］
（１）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ＨＭＧＢ１のアイソフォーム１［NCBIReference Sequence：NP_001300821］）、或いは、配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、認知症患者における発現量が、認知症に罹患していない対照者と比べ高いＡβ－ＨＭＧＢ１複合体におけるタンパク質；
（２）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ＨＭＧＢ１のアイソフォーム４［NCBIReference Sequence：NP_001350590］）、或いは、配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、認知症患者における発現量が、認知症に罹患していない対照者と比べ高いＡβ－ＨＭＧＢ１複合体におけるタンパク質；
［Ａ群タンパク質］
（１）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ＨＭＧＢ１のアイソフォーム１［NCBIReference Sequence：NP_001300821］）、或いは、配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、認知症患者における発現量が、認知症に罹患していない対照者と比べ高いＡβ－ＨＭＧＢ１複合体におけるタンパク質；
（２）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ＨＭＧＢ１のアイソフォーム４［NCBIReference Sequence：NP_001350590］）、或いは、配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、認知症患者における発現量が、認知症に罹患していない対照者と比べ高いＡβ－ＨＭＧＢ１複合体におけるタンパク質；
【0029】
上記「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列」とは、通常１～１０個の範囲内、好ましくは１～７個の範囲内、より好ましくは１～６個の範囲内、さらに好ましくは１～５個の範囲内、さらにより好ましくは１～４個の範囲内、特に好ましくは１～３個の範囲内、特により好ましくは１～２個の範囲内、最も好ましくは１個の数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を意味する。
【0030】
本件キットにおける抗ヒトＡβ抗体や抗ヒトＨＭＧＢ１抗体は、前述した免疫学的測定法等の方法を用いて、アミロイドβ－ＨＭＧＢ１複合体を検出するために使用するものである。本件キットとしては、さらに、「ＨＭＧＢ１を検出するため」という用途に特定されたものが好ましく、ＨＭＧＢ１の検出は、本件キットにおける抗ヒトＨＭＧＢ１抗体を用いて、前述した免疫学的測定法等の方法により行うことができる。
【0031】
本件キットにおける抗ヒトＡβ抗体や抗ヒトＨＭＧＢ１抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などの抗体であってもよく、また、この中には、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ｄｉａｂｏｄｙ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、Ｓｃ（Ｆｖ）２などの抗体の一部からなる抗体断片も含まれる。
【0032】
本件キットにおいて、抗ヒトＡβ抗体や抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の標識物における標識物質としては、例えば、ペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase等）、アルカリフォスファターゼ、β－Ｄ－ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコ－ス－６－ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ等の酵素；ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ローダミン、Alexa Fluor（登録商標）等の蛍光物質；緑色蛍光タンパク質（GreenFluorescence Protein；ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（Cyan Fluorescence Protein；ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（Blue Fluorescence Protein；ＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（YellowFluorescence Protein；ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（Red FluorescenceProtein；ＲＦＰ）、ルシフェラーゼ（luciferase）等の蛍光タンパク質；３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ若しくは１３１Ｉ等の放射性同位体；ビオチン；アビジン；などを挙げることができる。
【0033】
本件キットにおいて、抗ヒトＡβ抗体や抗ヒトＨＭＧＢ１抗体は、公知の手法を用いて作製することができる。例えば、抗ヒトＡβポリクローナル抗体や抗ヒトＨＭＧＢ１ポリクローナル抗体は、非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ）に、ヒトＡβを構成するペプチド（好ましくは、Ａβ１－４０やＡβ１－４２）やヒトＨＭＧＢ１を構成するペプチドを感作抗原として免疫し、抗血清を回収し、精製する、通常の方法により製造することができる。精製は、一般的な生化学的方法、例えば塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせることにより行うことができる。
【0034】
また、抗ヒトＡβモノクローナル抗体や抗ヒトＨＭＧＢ１モノクローナル抗体は、例えば、公知のハイブリドーマ法により作製することができる。まず、抗体産生ハイブリドーマを作製する。ヒトＡβを構成するペプチド（好ましくは、Ａβ１－４０やＡβ１－４２）やヒトＨＭＧＢ１を構成するペプチドを感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法に従って哺乳動物に免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナル抗体産生細胞をクローニングする。感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定はされないが、細胞融合に使用する親細胞（ミエローマ細胞）との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスターなどが使用されることが多い。感作抗原で哺乳動物を免疫する方法としては、公知の方法を用いることができる。上記免疫細胞と融合されるミエローマ細胞としては、公知の種々の細胞株が使用可能である。免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は公知の方法、例えば、ミルスタインらの方法（Methods Enzymol. 73: 3-46 (1981)）などに準じて行うことができる。得られた融合細胞は、通常の選択培地、例えば、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含む培養液）で培養することにより選択することができる。このＨＡＴ培地での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するまで、通常数日から数週間継続される。次に、通常の限界希釈法を実施し、ヒトＡβに結合する抗体を産生するハイブリドーマや、ヒトＨＭＧＢ１に結合する抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニング及びクローニングが行われる。このようにして得られたハイブリドーマの培養上清を精製することによって、ヒトＡβに結合するモノクローナル抗体や、ヒトＨＭＧＢ１に結合するモノクローナル抗体を取得することができる。精製は、一般的な生化学的方法、例えば塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせることにより行うことができる。
【0035】
抗ヒトＡβモノクローナル抗体や抗ヒトＨＭＧＢ１モノクローナル抗体はまた、遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主により産生することもできる。ヒトＡβを構成するペプチド（好ましくは、Ａβ１－４０やＡβ１－４２）やヒトＨＭＧＢ１を構成するペプチドを感作抗原として免疫した哺乳動物の脾細胞；リンパ球；又は、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマからｍＲＮＡを取得し、これを鋳型としてｃＤＮＡライブラリーを作製することができる。感作抗原と反応する抗体を産生しているクローンをスクリーニングし、得られたクローンを培養し、培養上清から一般的な生化学的方法、例えば塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせることにより目的とするモノクローナル抗体を精製することができる。また、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、又はそれらの抗原結合性断片は、例えば、上記モノクローナル抗体の可変領域や超可変領域を用いて遺伝子工学的手法により作製することができる（例えば、Method in Enzymology 203: 99-121(1991)）。
【0036】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例0037】
１．方法
［サンドイッチＥＬＩＳＡを用いたＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の解析］
９６ウェルプレートを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体（１ｍｇ／Ｌ、ｃｌｏｎｅ２Ｄ４、シノテスト社製）でコートし、４℃で一晩インキュベートした。０．０５％のTween 20を含むＰＢＳ（洗浄液）でウェルを洗浄した後、１％のＢＳＡを含むＰＢＳを、各ウェル当たり４００μＬ添加し、３７℃で２時間インキュベートすることによりブロッキング処理を行った。ウェルを上記洗浄液で洗浄した後、ヒトＣＳＦ試料、ヒト血漿試料、又は希釈キャリブレーター（０、１７５、３５０、７００、１４００ｐｇ／ｍＬのＡβ－ＨＭＧＢ１複合体含有液）を、それぞれ１％のＢＳＡ含有ＰＢＳで１／４濃度に希釈し、各１００μＬをウェルに添加し、３７℃で２０～２４時間インキュベートした。ウェルを上記洗浄液で洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識抗Ａβ抗体（クローン６Ｅ１０抗体［Biolegend社製］及びクローン８２Ｅ１抗体［＃１０３２３、ＩＢＬ社製］の混合物）を添加し、室温で２時間インキュベートすることにより抗原－抗体反応を行った。ペルオキシダーゼの基質であるＴＭＢ（3,3',5,5'-tetra-methylbenzidine）（同仁堂研究所社製）を各ウェルに添加し、０．３５ｍｏｌ／Ｌの硫酸ナトリウムで反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（モデル６８０、Bio-Rad社製）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。検出可能なＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度範囲は、３０～２０００ｐｇ／ｍＬであることを確認した。なお、上記抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ２Ｄ４）は、ｄｓＨＭＧＢ１及びａｔＨＭＧＢ１の両方を検出する抗体である。また、上記抗Ａβ抗体（クローン６Ｅ１０抗体及びクローン８２Ｅ１抗体）は、２種類のＡβ（Ａβ１－４０又はＡβ１－４２）を検出する抗体である。
［サンドイッチＥＬＩＳＡを用いたＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の解析］
９６ウェルプレートを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体（１ｍｇ／Ｌ、ｃｌｏｎｅ２Ｄ４、シノテスト社製）でコートし、４℃で一晩インキュベートした。０．０５％のTween 20を含むＰＢＳ（洗浄液）でウェルを洗浄した後、１％のＢＳＡを含むＰＢＳを、各ウェル当たり４００μＬ添加し、３７℃で２時間インキュベートすることによりブロッキング処理を行った。ウェルを上記洗浄液で洗浄した後、ヒトＣＳＦ試料、ヒト血漿試料、又は希釈キャリブレーター（０、１７５、３５０、７００、１４００ｐｇ／ｍＬのＡβ－ＨＭＧＢ１複合体含有液）を、それぞれ１％のＢＳＡ含有ＰＢＳで１／４濃度に希釈し、各１００μＬをウェルに添加し、３７℃で２０～２４時間インキュベートした。ウェルを上記洗浄液で洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識抗Ａβ抗体（クローン６Ｅ１０抗体［Biolegend社製］及びクローン８２Ｅ１抗体［＃１０３２３、ＩＢＬ社製］の混合物）を添加し、室温で２時間インキュベートすることにより抗原－抗体反応を行った。ペルオキシダーゼの基質であるＴＭＢ（3,3',5,5'-tetra-methylbenzidine）（同仁堂研究所社製）を各ウェルに添加し、０．３５ｍｏｌ／Ｌの硫酸ナトリウムで反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（モデル６８０、Bio-Rad社製）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。検出可能なＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度範囲は、３０～２０００ｐｇ／ｍＬであることを確認した。なお、上記抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ２Ｄ４）は、ｄｓＨＭＧＢ１及びａｔＨＭＧＢ１の両方を検出する抗体である。また、上記抗Ａβ抗体（クローン６Ｅ１０抗体及びクローン８２Ｅ１抗体）は、２種類のＡβ（Ａβ１－４０又はＡβ１－４２）を検出する抗体である。
【0038】
［ＡＤモデルマウス］
５×ＦＡＤトランスジェニックＢ６／ＳＪＬマウス（以下、「５×ＦＡＤマウス」という）、すなわち、ヒト変異ＡＰＰ（ＫＭ６７０／６７１ＮＬスウェーデン型変異、Ｉ７１６Ｖフロリダ型変異、及びＶ７１７Ｉロンドン型変異）と、ヒト変異ＰＳ１（Ｍ１４６Ｌ変異及びＬ２８５Ｖ変異）とを過剰発現するＡＤモデルマウス（文献「J Neurosci26, 10129-10140 (2006)」参照）は、Jackson Laboratory（BarHarbor, Maine, USA）から購入した。また、ＡＰＰ－ＫＩマウス、すなわち、ヒト変異ＡＰＰ（ＫＭ６７０／６７１ＮＬスェーデン型変異、Ｅ６９３Ｇ北極圏型変異、Ｉ７１６ＦBeyreuther／Iberian変異）を有するＡＤモデルマウス（文献「Nat Neurosci17, 661-663 (2014)」参照）は、理研バイオリソース研究センターより入手した。５×ＦＡＤマウス及びＡＰＰ－ＫＩマウスから、定法に従って脳組織試料を調製し、凍結保存した。
５×ＦＡＤトランスジェニックＢ６／ＳＪＬマウス（以下、「５×ＦＡＤマウス」という）、すなわち、ヒト変異ＡＰＰ（ＫＭ６７０／６７１ＮＬスウェーデン型変異、Ｉ７１６Ｖフロリダ型変異、及びＶ７１７Ｉロンドン型変異）と、ヒト変異ＰＳ１（Ｍ１４６Ｌ変異及びＬ２８５Ｖ変異）とを過剰発現するＡＤモデルマウス（文献「J Neurosci26, 10129-10140 (2006)」参照）は、Jackson Laboratory（BarHarbor, Maine, USA）から購入した。また、ＡＰＰ－ＫＩマウス、すなわち、ヒト変異ＡＰＰ（ＫＭ６７０／６７１ＮＬスェーデン型変異、Ｅ６９３Ｇ北極圏型変異、Ｉ７１６ＦBeyreuther／Iberian変異）を有するＡＤモデルマウス（文献「Nat Neurosci17, 661-663 (2014)」参照）は、理研バイオリソース研究センターより入手した。５×ＦＡＤマウス及びＡＰＰ－ＫＩマウスから、定法に従って脳組織試料を調製し、凍結保存した。
【0039】
［ヒト脳組織試料］
ＰＳ１－Ｍ１４６Ｌを有する家族性のＡＤ患者及び非認知症の対照者（非神経疾患対照者）から、定法に従って脳組織試料を調製し、凍結保存した。ヒト脳組織試料の使用については、東京医科歯科大学の倫理委員会の承認を得た上で、インフォームドコンセントを得た。
ＰＳ１－Ｍ１４６Ｌを有する家族性のＡＤ患者及び非認知症の対照者（非神経疾患対照者）から、定法に従って脳組織試料を調製し、凍結保存した。ヒト脳組織試料の使用については、東京医科歯科大学の倫理委員会の承認を得た上で、インフォームドコンセントを得た。
【0040】
［ＡＤモデルマウスの脳組織試料を用いた免疫組織化学染色法］
上記ＡＤモデルマウスの脳組織試料を、４％のＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）溶液で固定処理を行った後、ミクロトーム（大和光機工業社製）を用いて５μｍ厚の脳の矢状切片を作製した。キシレン及びエタノールによる脱パラフィン処理後、１０ｍＭのクエン酸溶液中で１５分間煮沸し、抗原賦活化処理を行った。その後、脳の矢状切片を、１０％のＦＢＳを含むＰＢＳ中で６０分間インキュベートし、５種類の１次抗体（マウス抗Ａβ抗体［＃１０３２３、IBL社製、希釈倍率１：１０００］、ラビット抗ＨＭＧＢ１抗体［ａｂ１８２５６、Abcam社製、希釈倍率１：２０００］、Ｃｙ３がコンジュゲートしたマウス抗ＧＦＡＰ抗体［ｃ９２０５、sigma-Aldrich社製、希釈倍率１：５０００］、ラビット抗ＭＡＰ２抗体［ａｂ３２４５４、abcam社製、希釈倍率１：１０００］、及びヤギ抗Ｉｂａ１抗体［０１１－２７９９１、富士フイルム和光純薬社製、希釈倍率１：５００］）の存在下で、４℃で１２時間インキュベートした。その後、脳の矢状切片を、ＰＢＳで洗浄した後、２種類の２次抗体（Alexa Fluor 488でコンジュゲートしたDonkey抗マウスＩｇＧ［Ａ２１２０２、Thermo Fisher Scientific社製、希釈倍率１：１０００］及びＣｙ３でコンジュゲートしたDonkey抗ラビットＩｇＧ［７１１－１６５－１５２、JacksonLaboratory社製、希釈倍率１：１０００］）の存在下で、室温で1時間インキュベートした。その後、脳の矢状切片を、ＰＢＳで洗浄した後、０．２μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（4',6-diamidino-2-phenylindole）を含むＰＢＳ中で、細胞核を染色し、共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＦＶ１２００ＩＸ８３、オリンパス社製）を用い、各種１次抗体由来の蛍光シグナルを検出した画像と、細胞核由来のＤＡＰＩ蛍光シグナルを検出した画像（ＤＡＰＩ画像）と、これらの画像を重ね合わせた画像（Ｍｅｒｇｅ画像）を取得した。
上記ＡＤモデルマウスの脳組織試料を、４％のＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）溶液で固定処理を行った後、ミクロトーム（大和光機工業社製）を用いて５μｍ厚の脳の矢状切片を作製した。キシレン及びエタノールによる脱パラフィン処理後、１０ｍＭのクエン酸溶液中で１５分間煮沸し、抗原賦活化処理を行った。その後、脳の矢状切片を、１０％のＦＢＳを含むＰＢＳ中で６０分間インキュベートし、５種類の１次抗体（マウス抗Ａβ抗体［＃１０３２３、IBL社製、希釈倍率１：１０００］、ラビット抗ＨＭＧＢ１抗体［ａｂ１８２５６、Abcam社製、希釈倍率１：２０００］、Ｃｙ３がコンジュゲートしたマウス抗ＧＦＡＰ抗体［ｃ９２０５、sigma-Aldrich社製、希釈倍率１：５０００］、ラビット抗ＭＡＰ２抗体［ａｂ３２４５４、abcam社製、希釈倍率１：１０００］、及びヤギ抗Ｉｂａ１抗体［０１１－２７９９１、富士フイルム和光純薬社製、希釈倍率１：５００］）の存在下で、４℃で１２時間インキュベートした。その後、脳の矢状切片を、ＰＢＳで洗浄した後、２種類の２次抗体（Alexa Fluor 488でコンジュゲートしたDonkey抗マウスＩｇＧ［Ａ２１２０２、Thermo Fisher Scientific社製、希釈倍率１：１０００］及びＣｙ３でコンジュゲートしたDonkey抗ラビットＩｇＧ［７１１－１６５－１５２、JacksonLaboratory社製、希釈倍率１：１０００］）の存在下で、室温で1時間インキュベートした。その後、脳の矢状切片を、ＰＢＳで洗浄した後、０．２μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（4',6-diamidino-2-phenylindole）を含むＰＢＳ中で、細胞核を染色し、共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＦＶ１２００ＩＸ８３、オリンパス社製）を用い、各種１次抗体由来の蛍光シグナルを検出した画像と、細胞核由来のＤＡＰＩ蛍光シグナルを検出した画像（ＤＡＰＩ画像）と、これらの画像を重ね合わせた画像（Ｍｅｒｇｅ画像）を取得した。
【0041】
［ヒト脳組織試料を用いた免疫組織化学染色法］
上記ヒト脳組織試料について、抗Ａβ抗体、抗ＨＭＧＢ１抗体、及び抗ＭＡＰ２抗体を用いた免疫組織化学染色法は、上記［ＡＤモデルマウスの脳組織試料を用いた免疫組織化学染色法］の項目に記載の方法に従って行った。
上記ヒト脳組織試料について、抗Ａβ抗体、抗ＨＭＧＢ１抗体、及び抗ＭＡＰ２抗体を用いた免疫組織化学染色法は、上記［ＡＤモデルマウスの脳組織試料を用いた免疫組織化学染色法］の項目に記載の方法に従って行った。
【0042】
［ＣＳＦ試料及び血漿試料の調製］
空腹時の３種類の被験者（ＡＤ患者７１名、ＭＣＩ患者２６名、及び、脳機能障害と診断されていない健常者４８名）（表１参照）から腰椎穿刺によりＣＳＦを採取した後、夾雑物を除くために、遠心処理（１０００×ｇ、１０分間、４℃）し、上清をＣＳＦ試料として－８０℃で保存した。また、上記３種類の被験者の肘静脈から採血し、抗凝固剤（ＥＤＴＡ－２Ｋ）入りチューブに入れた後、遠心処理（１５００×ｇ、１０分間、室温）し、上清を血漿試料として、－８０℃で保存した。
空腹時の３種類の被験者（ＡＤ患者７１名、ＭＣＩ患者２６名、及び、脳機能障害と診断されていない健常者４８名）（表１参照）から腰椎穿刺によりＣＳＦを採取した後、夾雑物を除くために、遠心処理（１０００×ｇ、１０分間、４℃）し、上清をＣＳＦ試料として－８０℃で保存した。また、上記３種類の被験者の肘静脈から採血し、抗凝固剤（ＥＤＴＡ－２Ｋ）入りチューブに入れた後、遠心処理（１５００×ｇ、１０分間、室温）し、上清を血漿試料として、－８０℃で保存した。
【0043】
【表1】
【0044】
［神経心理学的スコア］
主治医により、ＭＭＳＥ（日本語版）と、ＡＤＡＳ－ｃｏｇが実施された。
主治医により、ＭＭＳＥ（日本語版）と、ＡＤＡＳ－ｃｏｇが実施された。
【0045】
［ＣＳＦ試料におけるＡβ及びタウの検出］
ＣＳＦ試料におけるＡβ１－４０及びＡβ１－４２は、ヒトＡβ（１－４０）ＥＬＩＳＡキット（２９２－６２３０１、富士フイルム和光純薬社製）及びヒトＡβ（１－４２）ＥＬＩＳＡキット（２９８－６２４０１、富士フイルム和光純薬社製）を用いて検出した。また、ＣＳＦ試料におけるリン酸化タウ（ｐ－Ｔａｕ）は、INNOTEST Phospho-tau（181P）（Innogenetics社製)を用いて検出した。
ＣＳＦ試料におけるＡβ１－４０及びＡβ１－４２は、ヒトＡβ（１－４０）ＥＬＩＳＡキット（２９２－６２３０１、富士フイルム和光純薬社製）及びヒトＡβ（１－４２）ＥＬＩＳＡキット（２９８－６２４０１、富士フイルム和光純薬社製）を用いて検出した。また、ＣＳＦ試料におけるリン酸化タウ（ｐ－Ｔａｕ）は、INNOTEST Phospho-tau（181P）（Innogenetics社製)を用いて検出した。
【0046】
［Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体の調製］
２種類のＡβペプチド粉末（Ａβ１－４０［Amyloidβ-Protein〔Human、1-40〕、4307-v、ペプチド研究所社製］；及びＡβ１－４２［Amyoid β-Protein〔Human、1-42〕、4349-v、ペプチド研究所社製］）を、ＤＭＳＯ中に１ｍＭの濃度で溶解し、Ａβ１－４０含有液及びＡβ１－４２含有液を調製した。また、ジスルフィド型ヒトＨＭＧＢ１（ｄｓＨＭＧＢ１）（ＨＭ－１２０、HMGBiotech社製）を、ＰＢＳ中に１４０μＭの濃度で溶解し、ｄｓＨＭＧＢ１含有液を調製した。また、１００μＭのｄｓＨＭＧＢ１を２０ｍＭのＤＴＴとともに３７℃で２４時間インキュベートした後、ＰＢＳを用いて４℃で３時間透析し、完全還元型ＨＭＧＢ１（ａｔＨＭＧＢ１）含有液を調製した。ｄｓＨＭＧＢ１含有液又はａｔＨＭＧＢ１含有液と、Ａβ含有液とを、それぞれＰＢＳで６０μＭに希釈した後、等モル比で混合し、加熱蓋付きのＰＣＲサーマルサイクラーで３７℃、４８時間インキュベートし、４種類のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体（Ａβ１－４０－ｄｓＨＭＧＢ１複合体、Ａβ１－４０－ａｔＨＭＧＢ１複合体、Ａβ１－４２－ｄｓＨＭＧＢ１複合体、又はＡβ１－４２－ａｔＨＭＧＢ１複合体）含有液を調製し－８０℃で保存した。実験に使用する場合、Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体含有液を氷上で溶解し、使用濃度となるようにＰＢＳで希釈した。
２種類のＡβペプチド粉末（Ａβ１－４０［Amyloidβ-Protein〔Human、1-40〕、4307-v、ペプチド研究所社製］；及びＡβ１－４２［Amyoid β-Protein〔Human、1-42〕、4349-v、ペプチド研究所社製］）を、ＤＭＳＯ中に１ｍＭの濃度で溶解し、Ａβ１－４０含有液及びＡβ１－４２含有液を調製した。また、ジスルフィド型ヒトＨＭＧＢ１（ｄｓＨＭＧＢ１）（ＨＭ－１２０、HMGBiotech社製）を、ＰＢＳ中に１４０μＭの濃度で溶解し、ｄｓＨＭＧＢ１含有液を調製した。また、１００μＭのｄｓＨＭＧＢ１を２０ｍＭのＤＴＴとともに３７℃で２４時間インキュベートした後、ＰＢＳを用いて４℃で３時間透析し、完全還元型ＨＭＧＢ１（ａｔＨＭＧＢ１）含有液を調製した。ｄｓＨＭＧＢ１含有液又はａｔＨＭＧＢ１含有液と、Ａβ含有液とを、それぞれＰＢＳで６０μＭに希釈した後、等モル比で混合し、加熱蓋付きのＰＣＲサーマルサイクラーで３７℃、４８時間インキュベートし、４種類のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体（Ａβ１－４０－ｄｓＨＭＧＢ１複合体、Ａβ１－４０－ａｔＨＭＧＢ１複合体、Ａβ１－４２－ｄｓＨＭＧＢ１複合体、又はＡβ１－４２－ａｔＨＭＧＢ１複合体）含有液を調製し－８０℃で保存した。実験に使用する場合、Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体含有液を氷上で溶解し、使用濃度となるようにＰＢＳで希釈した。
【0047】
［Tricin-ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティング］
Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体を検出するために、文献「Nat. Protoc.1, 16-22 (2006)」に記載の方法に従って、Tricin-ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。まず、電気泳動の６時間前に、ゲル（上ゲル：４％、スペーサーゲル：１０％、下ゲル：１６％）をキャストした。次に、等量のサンプルバッファー（１％のＳＤＳ、３％のメルカプトエタノール、１５％のグリセロール、６５ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ［ｐＨ７．０］、及び０．０５％のＢＰＢ［ブロモフェノールブルー］を含む液）を、サンプル（上記Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体含有液、又はＡＤモデルマウスから定法に従って調製した大脳皮質溶解液）に加え、３７℃で１５分間インキュベートし、電気泳動用バッファー（Anode buffer［１００ｍＭのＴｒｉｓ、２２．５ｍＭのＨＣｌ〔ｐＨ８．９〕］、Cathodebuffer［１００ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのTricin、０．１％のＳＤＳ〔ｐＨ８．２５以下〕］)の存在下で、３０Ｖ、３０分間電気泳動を行った。その後、電気泳動を１５０Ｖに切り替え、サンプルが流れ終わる前に停止した。ゲルを、電極バッファー（３００ｍＭのTris、１００ｍＭの酢酸［ｐＨ８．６］）の存在下で、０．４ｍＡ／ｃｍ２で２４時間、セミドライ法により、イモビロン（登録商標）－Ｐポリフッ化ビニリデンのメンブレン（Millipore社製）へ転写させた。その後、メンブレンを、５％のスキムミルクを含むＴＢＳＴ溶液（１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、０．０５％のTween-20）中で１時間ブロッキング処理を行った後、３種類の１次抗体（ラビット抗ＨＭＧＢ１抗体［ａｂ１８２５６、Abcam社製、希釈倍率１：２０００］、ラビット抗Ａβ抗体［＃２４５４Ｓ、CellSignaling Technology社製、希釈倍率１：１０００］、及びマウス抗Ａβ抗体［＃１０３２３、IBL社製、希釈倍率１：２００］）と、２種類の２次抗体（ＨＲＰ標識抗ラビットＩｇＧ［ＮＡ９３４、GE Healthcare社製、希釈倍率１：３０００］及びＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ［ＮＡ９３１、GE Healthcare社製、希釈倍率１：３０００］）を用いたウェスタンブロッティングを、定法に従って行った。各種１次抗体が結合するタンパク質の検出には、ECL Select Western Blotting Detection Reagent（ＲＰＮ２２３５、GE Healthcare社製）と、発光画像解析装置(ImageQuant LAS500、GE Healthcare社製)を用いた。
Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体を検出するために、文献「Nat. Protoc.1, 16-22 (2006)」に記載の方法に従って、Tricin-ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。まず、電気泳動の６時間前に、ゲル（上ゲル：４％、スペーサーゲル：１０％、下ゲル：１６％）をキャストした。次に、等量のサンプルバッファー（１％のＳＤＳ、３％のメルカプトエタノール、１５％のグリセロール、６５ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ［ｐＨ７．０］、及び０．０５％のＢＰＢ［ブロモフェノールブルー］を含む液）を、サンプル（上記Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体含有液、又はＡＤモデルマウスから定法に従って調製した大脳皮質溶解液）に加え、３７℃で１５分間インキュベートし、電気泳動用バッファー（Anode buffer［１００ｍＭのＴｒｉｓ、２２．５ｍＭのＨＣｌ〔ｐＨ８．９〕］、Cathodebuffer［１００ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのTricin、０．１％のＳＤＳ〔ｐＨ８．２５以下〕］)の存在下で、３０Ｖ、３０分間電気泳動を行った。その後、電気泳動を１５０Ｖに切り替え、サンプルが流れ終わる前に停止した。ゲルを、電極バッファー（３００ｍＭのTris、１００ｍＭの酢酸［ｐＨ８．６］）の存在下で、０．４ｍＡ／ｃｍ２で２４時間、セミドライ法により、イモビロン（登録商標）－Ｐポリフッ化ビニリデンのメンブレン（Millipore社製）へ転写させた。その後、メンブレンを、５％のスキムミルクを含むＴＢＳＴ溶液（１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、０．０５％のTween-20）中で１時間ブロッキング処理を行った後、３種類の１次抗体（ラビット抗ＨＭＧＢ１抗体［ａｂ１８２５６、Abcam社製、希釈倍率１：２０００］、ラビット抗Ａβ抗体［＃２４５４Ｓ、CellSignaling Technology社製、希釈倍率１：１０００］、及びマウス抗Ａβ抗体［＃１０３２３、IBL社製、希釈倍率１：２００］）と、２種類の２次抗体（ＨＲＰ標識抗ラビットＩｇＧ［ＮＡ９３４、GE Healthcare社製、希釈倍率１：３０００］及びＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ［ＮＡ９３１、GE Healthcare社製、希釈倍率１：３０００］）を用いたウェスタンブロッティングを、定法に従って行った。各種１次抗体が結合するタンパク質の検出には、ECL Select Western Blotting Detection Reagent（ＲＰＮ２２３５、GE Healthcare社製）と、発光画像解析装置(ImageQuant LAS500、GE Healthcare社製)を用いた。
【0048】
［初代神経細胞の培養］
Ｅ１５のマウス胚から４～６個の大脳皮質を解剖し、０．０５％のトリプシンを含むＰＢＳ（＃２５２０００５６、Thermo Fisher Scientific社製）４ｍＬ中に、３７℃で１５分間インキュベートした後、ピペッティングにより大脳皮質由来細胞を解離させた。細胞を７０μｍセルストレーナー（＃２２－３６３－５４８、Thermo Fisher Scientific社製）に通し、遠心分離で回収し、２％のＢ２７、０．５ｍＭのＬ－グルタミン、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、及び０．５μＭのＡｒａ－Ｃ（arabinofuranosyl cytosine）を含むneurobasal medium（Thermo FisherScientific社製）で培養することにより、マウス初代大脳皮質ニューロンを得た。培養開始７日後、０．５６ｎＭの８種類の被験物質（ｄｓＨＭＧＢ１、ａｔＨＭＧＢ１、Ａβ１－４０、Ａβ１－４２、Ａβ１－４０－ｄｓＨＭＧＢ１複合体、Ａβ１－４０－ａｔＨＭＧＢ１複合体、Ａβ１－４２－ｄｓＨＭＧＢ１複合体、及びＡβ１－４２－ａｔＨＭＧＢ１複合体）含有液を添加し、室温で３時間インキュベートした。なお、当該被験物質の濃度は、ＭＣＩ／ＡＤ患者由来ＣＳＦにおけるＨＭＧＢ１濃度（文献「Nat. Commun.11, 1-22 (2020).」参照）を参考にして決定した。また、ヒト抗ＨＭＧＢ１抗体による効果を確認するため、当該被験物質とともに、０．５６ｎＭのヒト抗ＨＭＧＢ１抗体も添加し、同様にインキュベートした実験も行った。その後、以下の［ウェスタンブロッティング］の項目に記載の方法に従って、神経突起変性を解析した。また、ＥＲのバルーニング（ballooning）を、ＢＺ－Ｘ７００（キーエンス社製）を用いた生細胞のタイムラプス撮影により解析した。また、ＴＬＲ４のノックダウンは、lipofectamineRNAiMAX reagent（＃１３７７８０３０、Thermo Fisher Scientific社製）を用いて、TLR4 siRNA（Santa Cruz Biotechnology社製）を細胞にトランスフェクションすることにより実施した。細胞は、被験物質の添加の前に、ＴＬＲ４のノックダウン後３６時間培養した。
Ｅ１５のマウス胚から４～６個の大脳皮質を解剖し、０．０５％のトリプシンを含むＰＢＳ（＃２５２０００５６、Thermo Fisher Scientific社製）４ｍＬ中に、３７℃で１５分間インキュベートした後、ピペッティングにより大脳皮質由来細胞を解離させた。細胞を７０μｍセルストレーナー（＃２２－３６３－５４８、Thermo Fisher Scientific社製）に通し、遠心分離で回収し、２％のＢ２７、０．５ｍＭのＬ－グルタミン、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、及び０．５μＭのＡｒａ－Ｃ（arabinofuranosyl cytosine）を含むneurobasal medium（Thermo FisherScientific社製）で培養することにより、マウス初代大脳皮質ニューロンを得た。培養開始７日後、０．５６ｎＭの８種類の被験物質（ｄｓＨＭＧＢ１、ａｔＨＭＧＢ１、Ａβ１－４０、Ａβ１－４２、Ａβ１－４０－ｄｓＨＭＧＢ１複合体、Ａβ１－４０－ａｔＨＭＧＢ１複合体、Ａβ１－４２－ｄｓＨＭＧＢ１複合体、及びＡβ１－４２－ａｔＨＭＧＢ１複合体）含有液を添加し、室温で３時間インキュベートした。なお、当該被験物質の濃度は、ＭＣＩ／ＡＤ患者由来ＣＳＦにおけるＨＭＧＢ１濃度（文献「Nat. Commun.11, 1-22 (2020).」参照）を参考にして決定した。また、ヒト抗ＨＭＧＢ１抗体による効果を確認するため、当該被験物質とともに、０．５６ｎＭのヒト抗ＨＭＧＢ１抗体も添加し、同様にインキュベートした実験も行った。その後、以下の［ウェスタンブロッティング］の項目に記載の方法に従って、神経突起変性を解析した。また、ＥＲのバルーニング（ballooning）を、ＢＺ－Ｘ７００（キーエンス社製）を用いた生細胞のタイムラプス撮影により解析した。また、ＴＬＲ４のノックダウンは、lipofectamineRNAiMAX reagent（＃１３７７８０３０、Thermo Fisher Scientific社製）を用いて、TLR4 siRNA（Santa Cruz Biotechnology社製）を細胞にトランスフェクションすることにより実施した。細胞は、被験物質の添加の前に、ＴＬＲ４のノックダウン後３６時間培養した。
【0049】
［ウェスタンブロッティング］
インキュベートした細胞を、ＰＢＳで掻き取り、回収した。遠心処理（１００００×ｇ、１分間、４℃）し、細胞ペレットを、抽出バッファー（２％のＳＤＳ、１ｍＭのＤＴＴ、及び１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ７．５］を含む液）で溶解した。１００℃で加熱した後、細胞溶解液を遠心処理（１６０００ｇ×１０分間、４℃）し、上清を等量のサンプルバッファー（１２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ６．８］、４％のＳＤＳ、２０％のグリセロール、１２％のメルカプトエタノール、及び０．０５％のＢＰＢを含む液）に添加し、サンプルを調製した。サンプルを定法に従ってＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、セミドライ法にて、イモビロン－Ｐポリフッ化ビニリデンのメンブレン（Millipore社製）へ転写させた。その後、メンブレンを、５％のスキムミルクを含むＴＢＳＴ溶液（１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、０．０５％のTween-20）中で１時間ブロッキング処理を行った後、４種類の１次抗体（ラビット抗ｐＳｅｒ４６－ＭＡＲＣＫＳ抗体［GL Biochem社製、希釈倍率１：１０，０００、反応条件；室温で1時間］、マウス抗リン酸化タウ抗体［ＡＴ－８］［＃９０２０６、Innogenetics社製、希釈倍率１：２０００、反応条件；室温で３時間］、マウス抗β－アクチン抗体［＃ｓｃ－４７７７８、Santa Cruz Biotechnology社製、希釈倍率１：１０００、反応条件；４℃で１２時間］、及びマウス抗ＴＬＲ４抗体［＃ＮＢ１００－５６５６６、Novus社製、希釈倍率１：５０００、反応条件；室温で３時間］を含むCan GetSignal Solution（東洋紡社製）と、２種類の２次抗体（ＨＲＰ標識抗ラビットＩｇＧ［ＮＡ９３４、GEHealthcare社製、希釈倍率１：３０００］及びＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ［ＮＡ９３１、GEHealthcare社製、希釈倍率１：３０００］）を含むCan Get Signal Solution（東洋紡社製）とを用いたウェスタンブロッティングを、定法に従って行った。各種１次抗体が結合するタンパク質の検出には、ECL Select Western Blotting Detection Reagent（ＲＰＮ２２３５、GE Healthcare社製）と、発光画像解析装置(ImageQuant LAS500、GE Healthcare社製)を用いた。
インキュベートした細胞を、ＰＢＳで掻き取り、回収した。遠心処理（１００００×ｇ、１分間、４℃）し、細胞ペレットを、抽出バッファー（２％のＳＤＳ、１ｍＭのＤＴＴ、及び１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ７．５］を含む液）で溶解した。１００℃で加熱した後、細胞溶解液を遠心処理（１６０００ｇ×１０分間、４℃）し、上清を等量のサンプルバッファー（１２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ６．８］、４％のＳＤＳ、２０％のグリセロール、１２％のメルカプトエタノール、及び０．０５％のＢＰＢを含む液）に添加し、サンプルを調製した。サンプルを定法に従ってＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、セミドライ法にて、イモビロン－Ｐポリフッ化ビニリデンのメンブレン（Millipore社製）へ転写させた。その後、メンブレンを、５％のスキムミルクを含むＴＢＳＴ溶液（１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、０．０５％のTween-20）中で１時間ブロッキング処理を行った後、４種類の１次抗体（ラビット抗ｐＳｅｒ４６－ＭＡＲＣＫＳ抗体［GL Biochem社製、希釈倍率１：１０，０００、反応条件；室温で1時間］、マウス抗リン酸化タウ抗体［ＡＴ－８］［＃９０２０６、Innogenetics社製、希釈倍率１：２０００、反応条件；室温で３時間］、マウス抗β－アクチン抗体［＃ｓｃ－４７７７８、Santa Cruz Biotechnology社製、希釈倍率１：１０００、反応条件；４℃で１２時間］、及びマウス抗ＴＬＲ４抗体［＃ＮＢ１００－５６５６６、Novus社製、希釈倍率１：５０００、反応条件；室温で３時間］を含むCan GetSignal Solution（東洋紡社製）と、２種類の２次抗体（ＨＲＰ標識抗ラビットＩｇＧ［ＮＡ９３４、GEHealthcare社製、希釈倍率１：３０００］及びＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ［ＮＡ９３１、GEHealthcare社製、希釈倍率１：３０００］）を含むCan Get Signal Solution（東洋紡社製）とを用いたウェスタンブロッティングを、定法に従って行った。各種１次抗体が結合するタンパク質の検出には、ECL Select Western Blotting Detection Reagent（ＲＰＮ２２３５、GE Healthcare社製）と、発光画像解析装置(ImageQuant LAS500、GE Healthcare社製)を用いた。
【0050】
［Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体とＴＬＲ４との親和性に関するＥＬＩＳＡ］
１ｎＭの２種類のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体（Ａβ１－４０－ｄｓＨＭＧＢ１複合体、及びＡβ１－４２－ｄｓＨＭＧＢ１複合体）を含むＰＢＳ１００μＬと、ヒト抗ｄｓＨＭＧＢ１抗体（モノクローナル抗体＃１２９）（国際公開第２０２０／０５９８４７号パンフレット）とを室温で３０分間インキュベート（プレインキュベート）した後、ヒト抗ｄｓＨＭＧＢ１抗体（HMGB1 ELISA kit Exp、３２６０７８７３８、シノテスト社製）をプレコートした９６ウェルプレートに、プレインキュベートしたサンプルと、１ｎＭの４種類のＨＭＧＢ１（ａｔＨＭＧＢ１、ｄｓＨＭＧＢ１、Ａβ１－４０－ｄｓＨＭＧＢ１複合体、及びＡβ１－４２－ｄｓＨＭＧＢ１複合体）を含むＰＢＳ１００μＬとをそれぞれ添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。各ウェルを、洗浄液（HMGB1 ELISA KIT Exp、３２６０７８７３８、シノテスト社製）で３回洗浄した後、各種濃度（０、０．２５、０．５、１、２、又は４ｎＭ）のペルオキシダーゼ標識（Peroxidase Labeling Kit-NH2、LK11、同仁化学研究所社製）ヒトＴＬＲ４（１４７８－ＴＲ－０５０、R&D社製）１００μＬを各ウェルに添加し、２５℃で２４時間インキュベートした。各ウェルを上記洗浄液で洗浄した後、１００μＬの蛍光試薬（HMGB1 ELISA KIT Exp、３２６０７８７３８、シノテスト社製）を添加し、２５℃で３０分間インキュベートした。１００μＬの停止液（HMGB1 ELISA KIT Exp、３２６０７８７３８、シノテスト社製）で反応を停止させ、プレートリーダー（SPARK 10M、TECAN社製）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
１ｎＭの２種類のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体（Ａβ１－４０－ｄｓＨＭＧＢ１複合体、及びＡβ１－４２－ｄｓＨＭＧＢ１複合体）を含むＰＢＳ１００μＬと、ヒト抗ｄｓＨＭＧＢ１抗体（モノクローナル抗体＃１２９）（国際公開第２０２０／０５９８４７号パンフレット）とを室温で３０分間インキュベート（プレインキュベート）した後、ヒト抗ｄｓＨＭＧＢ１抗体（HMGB1 ELISA kit Exp、３２６０７８７３８、シノテスト社製）をプレコートした９６ウェルプレートに、プレインキュベートしたサンプルと、１ｎＭの４種類のＨＭＧＢ１（ａｔＨＭＧＢ１、ｄｓＨＭＧＢ１、Ａβ１－４０－ｄｓＨＭＧＢ１複合体、及びＡβ１－４２－ｄｓＨＭＧＢ１複合体）を含むＰＢＳ１００μＬとをそれぞれ添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。各ウェルを、洗浄液（HMGB1 ELISA KIT Exp、３２６０７８７３８、シノテスト社製）で３回洗浄した後、各種濃度（０、０．２５、０．５、１、２、又は４ｎＭ）のペルオキシダーゼ標識（Peroxidase Labeling Kit-NH2、LK11、同仁化学研究所社製）ヒトＴＬＲ４（１４７８－ＴＲ－０５０、R&D社製）１００μＬを各ウェルに添加し、２５℃で２４時間インキュベートした。各ウェルを上記洗浄液で洗浄した後、１００μＬの蛍光試薬（HMGB1 ELISA KIT Exp、３２６０７８７３８、シノテスト社製）を添加し、２５℃で３０分間インキュベートした。１００μＬの停止液（HMGB1 ELISA KIT Exp、３２６０７８７３８、シノテスト社製）で反応を停止させ、プレートリーダー（SPARK 10M、TECAN社製）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【0051】
［統計解析］
統計解析は、R version 3.6.2を使用して行った。ボックスプロットを使用して、データ分布を描写した。ボックスプロットは、中央値、四分位、及びひげを示し、２５～７５％範囲外のデータを示す。ｐ値は、Wilcoxonの順位和検定と事後Bonferroni補正を使用して算出した。他の群間比較には、Student’s t testを使用した。多群間比較には、Tukey’s HSD testを使用した。相関分析は、Microsoft Excel for Microsoft 365で行い、Pearsonの相関係数のｐ値はＲで算出した。ＲＯＣ（Receiver Operating Characteristic）分析は、ＲＯＣＲパッケージで行った。
統計解析は、R version 3.6.2を使用して行った。ボックスプロットを使用して、データ分布を描写した。ボックスプロットは、中央値、四分位、及びひげを示し、２５～７５％範囲外のデータを示す。ｐ値は、Wilcoxonの順位和検定と事後Bonferroni補正を使用して算出した。他の群間比較には、Student’s t testを使用した。多群間比較には、Tukey’s HSD testを使用した。相関分析は、Microsoft Excel for Microsoft 365で行い、Pearsonの相関係数のｐ値はＲで算出した。ＲＯＣ（Receiver Operating Characteristic）分析は、ＲＯＣＲパッケージで行った。
【0052】
２．結果
［Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体は、インビトロで形成され、ＡＤモデルマウスの脳（インビボ）にも存在する］
まず、２種類のＡβ（Ａβ１－４０又はＡβ１－４２）と、ｄｓＨＭＧＢ１及びａｔＨＭＧＢ１を含むヒトＨＭＧＢ１（１６９０－ＨＭＢ－０５０、R&D社製）とを１：１のモル比で混合・インキュベートし、抗Ａβ抗体又は抗ＨＭＧＢ１抗体を用いたウェスタンブロッティングを行った結果、いずれの抗体を用いた場合にも、Ａβ（Ａβ１－４０又はＡβ１－４２）とＨＭＧＢ１の１：１複合体の予測分子量である約３５ｋＤａの位置に、バンドが検出された（図１ａ、矢印参照）。
［Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体は、インビトロで形成され、ＡＤモデルマウスの脳（インビボ）にも存在する］
まず、２種類のＡβ（Ａβ１－４０又はＡβ１－４２）と、ｄｓＨＭＧＢ１及びａｔＨＭＧＢ１を含むヒトＨＭＧＢ１（１６９０－ＨＭＢ－０５０、R&D社製）とを１：１のモル比で混合・インキュベートし、抗Ａβ抗体又は抗ＨＭＧＢ１抗体を用いたウェスタンブロッティングを行った結果、いずれの抗体を用いた場合にも、Ａβ（Ａβ１－４０又はＡβ１－４２）とＨＭＧＢ１の１：１複合体の予測分子量である約３５ｋＤａの位置に、バンドが検出された（図１ａ、矢印参照）。
【0053】
また、Ａβ（Ａβ１－４０又はＡβ１－４２）単独では、Ａβのモノマーに相当するバンドに加えて、Ａβのオリゴマーに相当するバンドが検出されたのに対して、ヒトＨＭＧＢ１を添加することにより、Ａβのオリゴマーに相当するバンドが検出されなくなった（図１ａ、矢頭参照）。
【0054】
また、混合するＡβ（Ａβ１－４０又はＡβ１－４２）とヒトＨＭＧＢ１の濃度を上げると、より高分子量のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体由来のバンドが検出された（図１ｂ参照）。例えば、分子量６５ｋＤaの位置に、Ａβ：ＨＭＧＢ１が２：１の複合体由来のバンドが検出され（図１ｂ、矢印参照）、分子量１００ｋＤaの位置に、Ａβ：ＨＭＧＢ１が２：３の複合体由来のバンドが検出された（図１ｂ、矢印参照）。
【0055】
また、Ａβ（Ａβ１－４０）とｄｓＨＭＧＢ１を混合・インキュベートした方が、Ａβ（Ａβ１－４０）とａｔＨＭＧＢ１を混合・インキュベートするよりも、Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体由来のバンドがより強く検出された（図１ｃ参照）。
【0056】
以上の結果から、ＡβとＨＭＧＢ１の複合体が、インビトロで形成されることが確認された。
【0057】
次に、ＡＤモデルマウスの脳内にＡβ－ＨＭＧＢ１複合体が存在するかどうかを解析した（図１ｄ、ｅ参照）。２種類のＡＤモデルマウス（５×ＦＡＤマウス及びＡＰＰ－ＫＩマウス）と対照マウス（Ｂ６／ＳＪＬマウス）から定法に従って調製した大脳皮質溶解液について、抗Ａβ抗体又は抗ＨＭＧＢ１抗体を用いたウェスタンブロッティングを行った結果、抗Ａβ抗体及び抗ＨＭＧＢ１抗体により検出された分子量４５ｋＤａ、５０ｋＤａ、及び７５ｋＤａのバンドは、対照マウスの大脳皮質溶解液よりも、ＡＤモデルマウスの大脳皮質溶解液の方がより強く検出された（図１ｄ参照）。また、ＡＤモデルマウスの大脳皮質溶解液を、抗Ａβ抗体又は抗ＨＭＧＢ１抗体を用いて定法により免疫沈降させると、抗Ａβ抗体及び抗ＨＭＧＢ１抗体で検出されたそれぞれのバンドは、抗ＨＭＧＢ１抗体及び抗Ａβ抗体でも検出されることが示された（図１ｅ参照）。
【0058】
これらの結果は、ＡＤモデルマウスの脳内において、Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体が存在していることを示すとともに、正常マウスと比べ、ＡＤモデルマウスの方がＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の量が増加することを示している。ＨＭＧＢ１は、アセチル化（文献「EMBO J. 22,5551-5560 (2003)」）、リン酸化(文献「J Immunol. 182, 5800 (2009)」、文献「Lab. Invest. 89, 948-959 (2009)」)、メチル化（文献「J Biol. Chem.282, 16336-16344 (2007)」）等の複数の修飾を受けることが報告されている。興味深いことに、胸腺から精製したＨＭＧＢ１の２次元電気泳動解析では、分子量３０ｋＤａ、３５ｋＤａ、及び６０ｋＤａのＨＭＧＢ１タンパク質スポットが検出されていることから（文献「EMBO J. 22,5551-5560 (2003)」）、本実施例において、抗Ａβ抗体及び抗ＨＭＧＢ１抗体により検出された分子量４５ｋＤａ、５０ｋＤａ、及び７５ｋＤａのバンドは、これら修飾ＨＭＧＢ１タンパク質と、Ａβとの複合体由来のバンドであることが示唆された。
【0059】
［ＡＤ患者における生体試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度は上昇する］
図１ｄ及びｅの結果から、ＡＤのバイオマーカーとしてのＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の有用性が示唆された。そこで、Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体を指標として、ＡＤを判定できるかどうかを解析するために、３種類の群（ＡＤ群［ＡＤ患者］、ＭＣＩ群［ＭＣＩ患者］、及びcontrol群［健常者］）におけるＣＳＦ試料及び血漿試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度を、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。その結果、多くのＡＤ群において、ＣＳＦ試料及び血漿試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度が上昇した（図２ａ及び２ｂ参照）。一方、ＭＣＩ群においては、かかる上昇は認められず、また、control群においては、一部（ＣＳＦ試料では、３例［ＮＣ１１、ＮＣ１５、及びＷ２３２］；血漿試料では、２例［ＮＣ０５及びＮＣ１７］）が上昇するにとどまった（図２ａ及び２ｂ参照）。このうち、１例（Ｗ２３２）は、ＭＭＳＥ値が正常以下（２４．０）でｐ－Ｔａｕレベルが高いこと（１８１ｐｇ／ｍＬ）が判明し、再度通院し、４年以内に早期ＡＤと診断された。
図１ｄ及びｅの結果から、ＡＤのバイオマーカーとしてのＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の有用性が示唆された。そこで、Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体を指標として、ＡＤを判定できるかどうかを解析するために、３種類の群（ＡＤ群［ＡＤ患者］、ＭＣＩ群［ＭＣＩ患者］、及びcontrol群［健常者］）におけるＣＳＦ試料及び血漿試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度を、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。その結果、多くのＡＤ群において、ＣＳＦ試料及び血漿試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度が上昇した（図２ａ及び２ｂ参照）。一方、ＭＣＩ群においては、かかる上昇は認められず、また、control群においては、一部（ＣＳＦ試料では、３例［ＮＣ１１、ＮＣ１５、及びＷ２３２］；血漿試料では、２例［ＮＣ０５及びＮＣ１７］）が上昇するにとどまった（図２ａ及び２ｂ参照）。このうち、１例（Ｗ２３２）は、ＭＭＳＥ値が正常以下（２４．０）でｐ－Ｔａｕレベルが高いこと（１８１ｐｇ／ｍＬ）が判明し、再度通院し、４年以内に早期ＡＤと診断された。
【0060】
この結果は、生体試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度が上昇することを指標として、ＡＤ等で発症する認知症に罹患した患者と、認知症に罹患していない者（軽度認知障害患者や脳機能障害と診断されていない健常者）とを判別できる可能性を示唆している。
【0061】
図２ａの結果、すなわち、Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度が、ＡＤ群におけるＣＳＦ試料中において上昇したのに対して、ＭＣＩ群におけるＣＳＦ試料中では上昇しなかったことを示す結果とは対照的に、我々は以前に、ＨＭＧＢ１の発現レベルが、ＡＤ患者のＣＳＦ試料よりもＭＣＩ患者のＣＳＦ試料の方が上昇することを報告している（文献「Nat. Commun.11, 1-22 (2020)」参照）。そこで、同じＡＤ患者から同じ時期に採取したＣＳＦ試料中のＨＭＧＢ１の濃度と、Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度とを比較した。その結果、興味深いことに、ＣＳＦ試料中のＨＭＧＢ１の濃度と、Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度とは、負の相関関係を示した（図２ｃ参照）。この負の相関関係は、ＣＳＦ試料中のＨＭＧＢ１の濃度と、Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度の両方を測定することにより、ＭＣＩとＡＤを識別し、患者の認知機能の低下レベルを評価できることを示している。
【0062】
また、図２ａ及び２ｂの結果を基に、ＡＤ群及びcontrol群間のＲＯＣ分析を行った結果、ＡＵＣ（Area Under the Curve）値はそれぞれ０．５３１４及び０．７７４２であり、共に０．５を超えていた（図２ｄ及び２ｆ参照）。一方、ＡＤ群（ｎ＝８）及びcontrol群（ｎ＝６）におけるＣＳＦ試料中のＡβ（Ａβ１－４０）の濃度を測定した結果を基に、ＡＤ群及びcontrol群間のＲＯＣ分析を行った結果、ＡＵＣ値は０．３３３であり、０．５以下であった。
【0063】
これらの結果は、（Ａβではなく）Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度を指標として、ＡＤ等で発症する認知症に罹患した患者と、認知症に罹患していない者とを判別できることを示している。なお、図２ａ及び２ｂの結果を基に、ＭＣＩ群及びcontrol群間のＲＯＣ分析を行った結果、ＡＵＣ値はそれぞれ０．４６８８及び０．４６６７と、共に０．５以下であることから、Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度は、軽度認知障害に罹患した患者と、軽度認知障害に罹患していない者との判別に使用できないことが確認された（図２ｅ及び２ｇ参照）。
【0064】
また、ＡＤ群及びcontrol群におけるＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度と、２種類の認知機能スコア値（ＡＤＡＳ－ｃｏｇ値及びＭＭＳＥ値）との関係性を解析したところ、ＡＤ群においては、Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度と、ＡＤＡＳ－ｃｏｇ値との間に正の相関関係が認められたのに対して、control群ではかかる相関関係を認められなかった（図２ｈ参照）。また、ＡＤ群においては、Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度と、ＭＭＳＥ値との間に負の相関関係が認められたのに対して、control群ではかかる相関関係を認められなかった（図２ｉ参照）。
この結果は、Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度の上昇と、認知機能の低下との間に、正の相関関係があることを示している。
この結果は、Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度の上昇と、認知機能の低下との間に、正の相関関係があることを示している。
【0065】
さらに、ＡＤ群におけるＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度と、２種類の認知機能スコア値（ＡＤＡＳ－ｃｏｇ値及びＭＭＳＥ値）の年変化との関係性を解析したところ、Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度と、ＡＤＡＳ－ｃｏｇ値の年変化との間に正の相関関係が認められ（図２ｊ参照）、また、Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度と、ＭＭＳＥ値との間に負の相関関係が認められた（図２ｋ参照）。
この結果は、Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度と、認知機能の低下との間に、正の相関関係があることを示している。
この結果は、Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度と、認知機能の低下との間に、正の相関関係があることを示している。
【0066】
［Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体はＡβプラーク周辺の神経細胞に存在する］
我々は以前、細胞死病理学の表現型を３つのパターン（活性ネクローシス［Active Necrosis］、二次ネクローシス［Secondary Necrosis］、及び細胞死のゴースト［Ghost of Cell Death］）に分類した(文献「Nat. Commun.11, 1-22 (2020)」参照)。Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度上昇の病理学的意義を調べるため、２種類のＡＤモデルマウス（５×ＦＡＤマウス及びＡＰＰ－ＫＩマウス）由来の脳の矢状切片を、抗Ａβ抗体及び抗ＨＭＧＢ１抗体を用いた免疫組織化学染色法により解析した。その結果、細胞外Ａβ凝集体（Ａβプラーク）の周辺部で二次ネクローシスが生じた細胞において、Ａβ由来のシグナルと、ＨＭＧＢ１由来のシグナルとが共局在しており（図３ａ及びｂにおける顕微鏡画像参照）、Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体はＡβプラーク周辺の細胞に存在することが示された。また、これら重なったシグナルは、弱いＤＡＰＩシグナルとともに、死滅しつつある細胞の細胞質に存在したことから、Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体は、老人斑形成周辺の二次障害を受けた神経細胞で形成されていることが示唆された。さらに、Ａβ由来のシグナルと、ＨＭＧＢ１由来のシグナルとが共局在する領域を定量した結果、かかる領域は、正常マウスと比べ、ＡＤモデルマウスの方が有意に増加することが確認された（図３ａ及びｂにおけるグラフ参照）。
我々は以前、細胞死病理学の表現型を３つのパターン（活性ネクローシス［Active Necrosis］、二次ネクローシス［Secondary Necrosis］、及び細胞死のゴースト［Ghost of Cell Death］）に分類した(文献「Nat. Commun.11, 1-22 (2020)」参照)。Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度上昇の病理学的意義を調べるため、２種類のＡＤモデルマウス（５×ＦＡＤマウス及びＡＰＰ－ＫＩマウス）由来の脳の矢状切片を、抗Ａβ抗体及び抗ＨＭＧＢ１抗体を用いた免疫組織化学染色法により解析した。その結果、細胞外Ａβ凝集体（Ａβプラーク）の周辺部で二次ネクローシスが生じた細胞において、Ａβ由来のシグナルと、ＨＭＧＢ１由来のシグナルとが共局在しており（図３ａ及びｂにおける顕微鏡画像参照）、Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体はＡβプラーク周辺の細胞に存在することが示された。また、これら重なったシグナルは、弱いＤＡＰＩシグナルとともに、死滅しつつある細胞の細胞質に存在したことから、Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体は、老人斑形成周辺の二次障害を受けた神経細胞で形成されていることが示唆された。さらに、Ａβ由来のシグナルと、ＨＭＧＢ１由来のシグナルとが共局在する領域を定量した結果、かかる領域は、正常マウスと比べ、ＡＤモデルマウスの方が有意に増加することが確認された（図３ａ及びｂにおけるグラフ参照）。
【0067】
さらに，ＰＳ１－Ｍ１４６Ｌを有する家族性のＡＤ患者由来の脳の矢状切片を、抗Ａβ抗体及び抗ＨＭＧＢ１抗体を用いた免疫組織化学染色法により解析した。その結果、Ａβ由来のシグナルと、ＨＭＧＢ１由来のシグナルは、細胞外Ａβ凝集体（老人斑）を取り囲む細胞の細胞質内に、弱いＤＡＰＩシグナルとともに共局在していた（図４参照）。また、ＨＭＧＢ１由来のシグナルは、細胞内Ａβのない正常細胞では核内に検出されたのに対して（図４の矢印参照）、異常細胞では核内に加えて、細胞質内でも検出され、Ａβ由来のシグナルと共局在していた（図４の四角で囲った部分参照）。かかる異常なニューロンの形態学的な変化は、ＨＤ及びＡＤ病態で同定された正常な機能の損なわれたＹＡＰ機能と関連するＴＲＩＡＤ（Transcriptional Repression-Induced Atypical cell Death）ネクローシスの典型的な特徴と一致する（文献「Nat.Commun. 11, 1-22 (2020)」、「J Cell Biol. 172, 589-604 (2006)」、「Hum. Mol.Genet. 25, 4749-4770 (2016)」、及び「Acta Neuropathol. Commun. 5, 19 (2017)」参照）。さらに、Ａβ由来のシグナルと、ＨＭＧＢ１由来のシグナルとが共局在する領域を定量した結果、かかる領域は、非神経疾患対照者と比べ、ＰＳ１－Ｍ１４６Ｌを有する家族性のＡＤ患者の方が有意に増加することが確認された（図４におけるグラフ参照）。
【0068】
［Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体は、死滅しつつある神経細胞で生成され、ミクログリアによって除去される］
Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体の生成に関与する細胞種を確認するため、２種類のＡＤモデルマウス（５×ＦＡＤマウス及びＡＰＰ－ＫＩマウス）由来の脳の矢状切片と、ＰＳ１－Ｍ１４６Ｌを有する家族性ＡＤ患者由来の脳の矢状切片を、抗Ａβ抗体及び抗ＨＭＧＢ１抗体と、抗ＭＡＰ２抗体、抗Ｉｂａ１抗体、又は抗ＧＦＡＰ抗体とを用いた免疫組織化学染色法により解析した。まず、抗ＭＡＰ２抗体、すなわち、神経細胞特異的マーカーであるＭＡＰ２に対する抗体を用いた解析の結果、ＡＤモデルマウス（５×ＦＡＤマウス及びＡＰＰ－ＫＩマウス）由来の脳組織において、Ａβ由来のシグナルと、ＨＭＧＢ１由来のシグナルは、Ａβプラークを取り囲む、死滅しつつある神経細胞に共局在することが確認された（図５ａ及び５ｂ参照）。また、ＰＳ１－Ｍ１４６Ｌを有する家族性ＡＤ患者由来の脳組織においては、Ａβ由来のシグナルと、ＨＭＧＢ１由来のシグナルが、細胞内Ａβを有する死滅しつつある神経細胞（一次ネクローシス［文献「Nat. Commun. 11, 1-22 (2020)」参照］）、及び、老人斑の周辺又は近くの死滅しつつある神経細胞（二次ネクローシス［文献「Commun. Biol.4, 1175 (2021)」及び文献「Nat. Commun.11, 1-22 (2020)」参照］）において、それぞれ共局在することが確認された（図５ｃ参照）。
これらの結果は、Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体は、死滅しつつある神経細胞で生成されたことを示している。
Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体の生成に関与する細胞種を確認するため、２種類のＡＤモデルマウス（５×ＦＡＤマウス及びＡＰＰ－ＫＩマウス）由来の脳の矢状切片と、ＰＳ１－Ｍ１４６Ｌを有する家族性ＡＤ患者由来の脳の矢状切片を、抗Ａβ抗体及び抗ＨＭＧＢ１抗体と、抗ＭＡＰ２抗体、抗Ｉｂａ１抗体、又は抗ＧＦＡＰ抗体とを用いた免疫組織化学染色法により解析した。まず、抗ＭＡＰ２抗体、すなわち、神経細胞特異的マーカーであるＭＡＰ２に対する抗体を用いた解析の結果、ＡＤモデルマウス（５×ＦＡＤマウス及びＡＰＰ－ＫＩマウス）由来の脳組織において、Ａβ由来のシグナルと、ＨＭＧＢ１由来のシグナルは、Ａβプラークを取り囲む、死滅しつつある神経細胞に共局在することが確認された（図５ａ及び５ｂ参照）。また、ＰＳ１－Ｍ１４６Ｌを有する家族性ＡＤ患者由来の脳組織においては、Ａβ由来のシグナルと、ＨＭＧＢ１由来のシグナルが、細胞内Ａβを有する死滅しつつある神経細胞（一次ネクローシス［文献「Nat. Commun. 11, 1-22 (2020)」参照］）、及び、老人斑の周辺又は近くの死滅しつつある神経細胞（二次ネクローシス［文献「Commun. Biol.4, 1175 (2021)」及び文献「Nat. Commun.11, 1-22 (2020)」参照］）において、それぞれ共局在することが確認された（図５ｃ参照）。
これらの結果は、Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体は、死滅しつつある神経細胞で生成されたことを示している。
【0069】
また、抗Ｉｂａ１抗体、すなわち、ミクログリア特異的マーカーであるＩｂａ１に対する抗体を用いた解析の結果、ＡＤモデルマウス（５×ＦＡＤマウス及びＡＰＰ－ＫＩマウス）由来の脳組織、及びＰＳ１－Ｍ１４６Ｌを有する家族性ＡＤ患者由来の脳組織において、Ａβ由来のシグナルと、ＨＭＧＢ１由来のシグナルが、細胞外Ａβ凝集体の境界に共局在することが確認された。しかしながら、ミクログリア自体はＡＰＰ（Ａβ前駆体）の切断によりＡβを生成しないこと、及び、ミクログリアが食細胞として機能していることを考慮すると、これらのミクログリアは、後にＡβプラークを形成するネクローシスした神経細胞のクラスターから生成されたＡβ－ＨＭＧＢ１複合体を、食作用により分解したと考えるのが妥当である（文献「Commun. Biol. 4, 1175 (2021)」及び「Nat. Commun.11, 1-22 (2020)」参照）。
【0070】
また、抗ＧＦＡＰ抗体、すなわち、アストロサイト特異的マーカーであるＧＦＡＰに対する抗体を用いた解析の結果、ＡＤモデルマウス（５×ＦＡＤマウス及びＡＰＰ－ＫＩマウス）由来の脳組織、及びＰＳ１－Ｍ１４６Ｌを有する家族性ＡＤ患者由来の脳組織において、Ａβ由来のシグナルと、ＨＭＧＢ１由来のシグナルの明確な共局在は認められなかった。
【0071】
以上の結果を総合すると、ＨＭＧＢ１－ＴＬＲ４－ＰＫＣ－Ｋｕ７０経路によって誘導される細胞内アミロイドβが蓄積し、ＴＲＩＡＤネクローシスのプロセスを経る神経細胞の細胞質内でＡβ－ＨＭＧＢ１複合体が生成されることを示している（文献「Commun. Biol. 4, 1175 (2021)」及び文献「Nat. Commun.11, 1-22 (2020)」参照）。ＴＲＩＡＤネクローシスに陥った神経細胞は、ＡＤ病態の進行に伴い、「ネクローシスからネクローシスへの増幅」というメカニズムで指数関数的に増加する（文献「Commun. Biol.4, 1175 (2021)」及び文献「Nat.Commun. 11, 1-22 (2020)」参照）。ＡＤ病態の進行に伴い、Ａβの負荷も増加するため、Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体の生成は、ＡＤ後期で増加すると考えられ、生成部位である二次ＴＲＩＡＤ神経細胞にＡβ－ＨＭＧＢ１複合体が局在することが、ＭＣＩ期ではＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の発現レベルが低く、ＡＤ進行期では、Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体の発現レベルが高いことを説明できる。
【0072】
［Ａβ－ｄｓＨＭＧＢ１複合体は神経突起変性を誘導する］
Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体が、ＨＭＧＢ１と同様に、神経突起変性を誘導するかどうかを調べるために、初代神経細胞を８種類の被験物質（ｄｓＨＭＧＢ１、ａｔＨＭＧＢ１、Ａβ１－４０、Ａβ１－４２、Ａβ１－４０－ｄｓＨＭＧＢ１複合体、Ａβ１－４０－ａｔＨＭＧＢ１複合体、Ａβ１－４２－ｄｓＨＭＧＢ１複合体、及びＡβ１－４２－ａｔＨＭＧＢ１複合体）の存在下でインキュベートした後、神経突起／シナプス変性のマーカーであるＭＡＲＣＫＳにおけるＳｅｒ４６のリン酸化を検出する抗体（抗ｐＳｅｒ４６－ＭＡＲＣＫＳ抗体）と、シナプス変性のマーカーとして確立されているタウにおけるＳｅｒ２０２及びＴｈｒ２０５のリン酸化を検出する抗体（抗リン酸化タウ抗体）とを用いたウェスタンブロッティングを行った。その結果、初代神経細胞をａｔＨＭＧＢ１の存在下でインキュベートしても、被験物質の非存在下でインキュベートした場合（図中の「no treatment」）と比べ、ｐＳｅｒ４６－ＭＡＲＣＫＳ及びリン酸化タウのレベルは変わらなかったのに対して、ｄｓＨＭＧＢ１の存在下でインキュベートすると、ｐＳｅｒ４６－ＭＡＲＣＫＳ及びリン酸化タウのレベルが増加した（図６ａ及び６ｂ参照）。一方、初代神経細胞をアミロイドβ（Ａβ１－４０及びＡβ１－４２）の存在下でインキュベートしても、被験物質の非存在下でインキュベートした場合（図中の「no treatment」）と比べ、ｐＳｅｒ４６－ＭＡＲＣＫＳ及びリン酸化タウのレベルは変わらなかった（図６ａ及び６ｂ参照）。また、初代神経細胞を、Ａβ－ａｔＨＭＧＢ１複合体（Ａβ１－４０－ａｔＨＭＧＢ１複合体及びＡβ１－４２－ａｔＨＭＧＢ１複合体）の存在下でインキュベートしても、被験物質の非存在下でインキュベートした場合（図中の「no treatment」）と比べ、ｐＳｅｒ４６－ＭＡＲＣＫＳ及びリン酸化タウのレベルは変わらなかったのに対して、Ａβ－ｄｓＨＭＧＢ１複合体（Ａβ１－４０－ｄｓＨＭＧＢ１複合体及びＡβ１－４２－ｄｓＨＭＧＢ１複合体）の存在下でインキュベートすると、ｐＳｅｒ４６－ＭＡＲＣＫＳ及びリン酸化タウのレベルが増加した（図６ａ及び６ｂ参照）。
Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体が、ＨＭＧＢ１と同様に、神経突起変性を誘導するかどうかを調べるために、初代神経細胞を８種類の被験物質（ｄｓＨＭＧＢ１、ａｔＨＭＧＢ１、Ａβ１－４０、Ａβ１－４２、Ａβ１－４０－ｄｓＨＭＧＢ１複合体、Ａβ１－４０－ａｔＨＭＧＢ１複合体、Ａβ１－４２－ｄｓＨＭＧＢ１複合体、及びＡβ１－４２－ａｔＨＭＧＢ１複合体）の存在下でインキュベートした後、神経突起／シナプス変性のマーカーであるＭＡＲＣＫＳにおけるＳｅｒ４６のリン酸化を検出する抗体（抗ｐＳｅｒ４６－ＭＡＲＣＫＳ抗体）と、シナプス変性のマーカーとして確立されているタウにおけるＳｅｒ２０２及びＴｈｒ２０５のリン酸化を検出する抗体（抗リン酸化タウ抗体）とを用いたウェスタンブロッティングを行った。その結果、初代神経細胞をａｔＨＭＧＢ１の存在下でインキュベートしても、被験物質の非存在下でインキュベートした場合（図中の「no treatment」）と比べ、ｐＳｅｒ４６－ＭＡＲＣＫＳ及びリン酸化タウのレベルは変わらなかったのに対して、ｄｓＨＭＧＢ１の存在下でインキュベートすると、ｐＳｅｒ４６－ＭＡＲＣＫＳ及びリン酸化タウのレベルが増加した（図６ａ及び６ｂ参照）。一方、初代神経細胞をアミロイドβ（Ａβ１－４０及びＡβ１－４２）の存在下でインキュベートしても、被験物質の非存在下でインキュベートした場合（図中の「no treatment」）と比べ、ｐＳｅｒ４６－ＭＡＲＣＫＳ及びリン酸化タウのレベルは変わらなかった（図６ａ及び６ｂ参照）。また、初代神経細胞を、Ａβ－ａｔＨＭＧＢ１複合体（Ａβ１－４０－ａｔＨＭＧＢ１複合体及びＡβ１－４２－ａｔＨＭＧＢ１複合体）の存在下でインキュベートしても、被験物質の非存在下でインキュベートした場合（図中の「no treatment」）と比べ、ｐＳｅｒ４６－ＭＡＲＣＫＳ及びリン酸化タウのレベルは変わらなかったのに対して、Ａβ－ｄｓＨＭＧＢ１複合体（Ａβ１－４０－ｄｓＨＭＧＢ１複合体及びＡβ１－４２－ｄｓＨＭＧＢ１複合体）の存在下でインキュベートすると、ｐＳｅｒ４６－ＭＡＲＣＫＳ及びリン酸化タウのレベルが増加した（図６ａ及び６ｂ参照）。
【0073】
これらの結果は、（Ａβ－ａｔＨＭＧＢ１複合体ではなく）Ａβ－ｄｓＨＭＧＢ１複合体が、神経突起変性作用を有することを示している。
【0074】
次に、ヒト抗ｄｓＨＭＧＢ１抗体（モノクローナル抗体＃１２９）が、Ａβ－ｄｓＨＭＧＢ１複合体による神経突起変性作用に影響を与えるかどうかを調べるために、初代神経細胞を４種類の被験物質（ｄｓＨＭＧＢ１、Ａβ１－４０、Ａβ１－４０－ｄｓＨＭＧＢ１複合体、及びＡβ１－４２－ｄｓＨＭＧＢ１複合体）の存在下でかつ、モノクローナル抗体＃１２９の存在下又は非存在下でインキュベートした後、抗ｐＳｅｒ４６－ＭＡＲＣＫＳ抗体及び抗リン酸化タウ抗体を用いたウェスタンブロッティングを行った。その結果、初代神経細胞を、Ａβ－ｄｓＨＭＧＢ１複合体（Ａβ１－４０－ｄｓＨＭＧＢ１複合体及びＡβ１－４２－ｄｓＨＭＧＢ１複合体）の存在下でインキュベートすると、被験物質の非存在下でインキュベートした場合（図中の「no treatment」）と比べ、ｐＳｅｒ４６－ＭＡＲＣＫＳ及びリン酸化タウのレベルは増加したのに対して、かかるＡβ－ｄｓＨＭＧＢ１複合体とともにモノクローナル抗体＃１２９の存在下でインキュベートすると、ｐＳｅｒ４６－ＭＡＲＣＫＳ及びリン酸化タウのレベルの増加が抑制された（図６ｃ参照）。
【0075】
また、ＴＬＲ４がＡβ－ｄｓＨＭＧＢ１複合体による神経突起変性作用に影響を与えるかどうかを調べるために、ＴＬＲ４をノックダウンした初代神経細胞と、ＴＬＲ４をノックダウンしない初代神経細胞とを、それぞれ４種類の被験物質（ｄｓＨＭＧＢ１、Ａβ１－４０、Ａβ１－４０－ｄｓＨＭＧＢ１複合体、及びＡβ１－４２－ｄｓＨＭＧＢ１複合体）の存在下でインキュベートした後、抗ＴＬＲ４抗体、抗ｐＳｅｒ４６－ＭＡＲＣＫＳ抗体、及び抗リン酸化タウ抗体を用いたウェスタンブロッティングを行った。その結果、ＴＬＲ４をノックダウンしない初代神経細胞を、ｄｓＨＭＧＢ１やＡβ－ｄｓＨＭＧＢ１複合体（Ａβ１－４０－ｄｓＨＭＧＢ１複合体及びＡβ１－４２－ｄｓＨＭＧＢ１複合体）の存在下でインキュベートすると、被験物質の非存在下でインキュベートした場合（図中の「no treatment TLR4-siRNA(-)」）と比べ、ｐＳｅｒ４６－ＭＡＲＣＫＳ及びリン酸化タウのレベルは増加したのに対して、ＴＬＲ４をノックダウンした初代神経細胞を、ｄｓＨＭＧＢ１やＡβ－ｄｓＨＭＧＢ１複合体（Ａβ１－４０－ｄｓＨＭＧＢ１複合体及びＡβ１－４２－ｄｓＨＭＧＢ１複合体）の存在下でインキュベートすると、ｐＳｅｒ４６－ＭＡＲＣＫＳ及びリン酸化タウのレベルの増加が抑制された（図６ｄ参照）。
さらに、Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体（Ａβ１－４０－ｄｓＨＭＧＢ１複合体及びＡβ１－４２－ｄｓＨＭＧＢ１複合体）とＴＬＲ４との親和性に関するＥＬＩＳＡを行った結果、Ａβ－ｄｓＨＭＧＢ１複合体が、ｄｓＨＭＧＢ１と同様に、ＴＬＲ４に対して高い結合親和性を有することも確認した。
さらに、Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体（Ａβ１－４０－ｄｓＨＭＧＢ１複合体及びＡβ１－４２－ｄｓＨＭＧＢ１複合体）とＴＬＲ４との親和性に関するＥＬＩＳＡを行った結果、Ａβ－ｄｓＨＭＧＢ１複合体が、ｄｓＨＭＧＢ１と同様に、ＴＬＲ４に対して高い結合親和性を有することも確認した。
【0076】
以上の結果は、Ａβ－ｄｓＨＭＧＢ１複合体がＴＬＲ４へ結合し、神経突起変性を誘導することを示しているとともに、Ａβ－ｄｓＨＭＧＢ１複合体における当該結合ドメイン（表面）は、ｄｓＨＭＧＢ１の外側領域に存在し、Ａβ（Ａβ１－４０及びＡβ１－４２）が当該結合ドメインの形を安定化していることが示唆された。
【0077】
［Ａβ－ｄｓＨＭＧＢ１複合体は神経細胞死を誘導する］
次に、神経突起変性作用を有するＡβ－ｄｓＨＭＧＢ１複合体が、細胞死を誘導するかどうかを調べるため、初代神経細胞を８種類の被験物質（ｄｓＨＭＧＢ１、ａｔＨＭＧＢ１、Ａβ１－４０、Ａβ１－４２、Ａβ１－４０－ｄｓＨＭＧＢ１複合体、Ａβ１－４０－ａｔＨＭＧＢ１複合体、Ａβ１－４２－ｄｓＨＭＧＢ１複合体、及びＡβ１－４２－ａｔＨＭＧＢ１複合体）の存在下でインキュベートした後、細胞死の形態の１つであるバルーニングしたＥＲを有する細胞数を測定した。その結果、初代神経細胞をａｔＨＭＧＢ１やアミロイドβ（Ａβ１－４０及びＡβ１－４２）、又はＡβ－ａｔＨＭＧＢ１複合体（Ａβ１－４０－ａｔＨＭＧＢ１複合体及びＡβ１－４０－ａｔＨＭＧＢ１複合体）の存在下でインキュベートしても、被験物質の非存在下でインキュベートした場合（図中の「no treatment」）と比べ、バルーニングしたＥＲを有する細胞数はほとんど変わらなかったのに対して、ｄｓＨＭＧＢ１やＡβ－ｄｓＨＭＧＢ１複合体（Ａβ１－４０－ｄｓＨＭＧＢ１複合体及びＡβ１－４２－ｄｓＨＭＧＢ１複合体）の存在下でインキュベートすると、バルーニングしたＥＲを有する細胞数が増加した（図６ｅ参照）。
この結果は、Ａβ－ｄｓＨＭＧＢ１複合体が細胞死を誘導する作用を有することを示している。
次に、神経突起変性作用を有するＡβ－ｄｓＨＭＧＢ１複合体が、細胞死を誘導するかどうかを調べるため、初代神経細胞を８種類の被験物質（ｄｓＨＭＧＢ１、ａｔＨＭＧＢ１、Ａβ１－４０、Ａβ１－４２、Ａβ１－４０－ｄｓＨＭＧＢ１複合体、Ａβ１－４０－ａｔＨＭＧＢ１複合体、Ａβ１－４２－ｄｓＨＭＧＢ１複合体、及びＡβ１－４２－ａｔＨＭＧＢ１複合体）の存在下でインキュベートした後、細胞死の形態の１つであるバルーニングしたＥＲを有する細胞数を測定した。その結果、初代神経細胞をａｔＨＭＧＢ１やアミロイドβ（Ａβ１－４０及びＡβ１－４２）、又はＡβ－ａｔＨＭＧＢ１複合体（Ａβ１－４０－ａｔＨＭＧＢ１複合体及びＡβ１－４０－ａｔＨＭＧＢ１複合体）の存在下でインキュベートしても、被験物質の非存在下でインキュベートした場合（図中の「no treatment」）と比べ、バルーニングしたＥＲを有する細胞数はほとんど変わらなかったのに対して、ｄｓＨＭＧＢ１やＡβ－ｄｓＨＭＧＢ１複合体（Ａβ１－４０－ｄｓＨＭＧＢ１複合体及びＡβ１－４２－ｄｓＨＭＧＢ１複合体）の存在下でインキュベートすると、バルーニングしたＥＲを有する細胞数が増加した（図６ｅ参照）。
この結果は、Ａβ－ｄｓＨＭＧＢ１複合体が細胞死を誘導する作用を有することを示している。
【0078】
また、初代神経細胞を４種類の被験物質（ｄｓＨＭＧＢ１、Ａβ１－４０、Ａβ１－４０－ｄｓＨＭＧＢ１複合体、及びＡβ１－４２－ｄｓＨＭＧＢ１複合体）の存在下でかつ、モノクローナル抗体＃１２９の存在下又は非存在下でインキュベートした後、バルーニングしたＥＲを有する細胞数を測定した結果、初代神経細胞を、Ａβ－ｄｓＨＭＧＢ１複合体（Ａβ１－４０－ｄｓＨＭＧＢ１複合体及びＡβ１－４２－ｄｓＨＭＧＢ１複合体）の存在下でインキュベートすると、被験物質の非存在下でインキュベートした場合（図中の「no treatment」）と比べ、バルーニングしたＥＲを有する細胞数は増加したのに対して、かかるＡβ－ｄｓＨＭＧＢ１複合体とともにモノクローナル抗体＃１２９の存在下でインキュベートすると、バルーニングしたＥＲを有する細胞数の増加が抑制された（図６ｆ参照）。
この結果から、モノクローナル抗体＃１２９が、Ａβ－ｄｓＨＭＧＢ１複合体による細胞死を抑制することが確認された。
この結果から、モノクローナル抗体＃１２９が、Ａβ－ｄｓＨＭＧＢ１複合体による細胞死を抑制することが確認された。
【0079】
以上の結果から、二次ネクローシスの過程で死滅しつつある神経細胞において、ｄｓＨＭＧＢ１とＡβがＡβ－ｄｓＨＭＧＢ１複合体を形成することが示された。ＡＤ病態の後期において、このような神経細胞内でのＡβ－ｄｓＨＭＧＢ１複合体形成によるＨＭＧＢ１放出の抑制や、ミクログリアでの細胞外ＨＭＧＢ１取り込み後のＡβ－ｄｓＨＭＧＢ１複合体へのＨＭＧＢ１の固定化により、細胞外のＨＭＧＢ１量が減少すると考えられる。一方、細胞外のＡβ－ｄｓＨＭＧＢ１複合体は、ネクローシスした神経細胞からの放出により、増加する。Ａβ－ｄｓＨＭＧＢ１複合体はＨＭＧＢ１と同様、シナプス損傷や二次ネクローシスを誘導することが明らかとなった。ＡＤ後期の細胞外Ａβ－ｄｓＨＭＧＢ１複合体の量が増加すると、ＡＤ病態が進行することが予想される。
【0080】
［Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体と、ＨＭＧＢ１等との組合せ解析により、認知症の判定精度が向上する］
図２ｄ及び２ｆに示す結果は、ＡＤ群及びcontrol群における生体試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度を指標として、認知症を判定できることを示している。次に、生体試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度以外の要素を組み合わせることにより、認知症の判定精度が向上するかどうかを検討した。
図２ｄ及び２ｆに示す結果は、ＡＤ群及びcontrol群における生体試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度を指標として、認知症を判定できることを示している。次に、生体試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度以外の要素を組み合わせることにより、認知症の判定精度が向上するかどうかを検討した。
【0081】
まず、ＡＤ群及びＭＣＩ群におけるＣＳＦ試料及び血漿試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度を測定し、両群間のＲＯＣ分析を行った結果、ＡＤ群及びcontrol群間と同様に、ＡＵＣ値はそれぞれ０．６００及び０．７２５と、共に０．５を超えていた（図７ａ及び７ｂ参照）。一方、ＡＤ群（ｎ＝８）及びＭＣＩ群（ｎ＝２）におけるＣＳＦ試料中のＡβ（Ａβ１－４０）の濃度を測定した結果を基に、ＡＤ群及びcontrol群間のＲＯＣ分析を行った結果、ＡＵＣ値は０．４３８であり、０．５以下であった。
【0082】
これらの結果から、（Ａβではなく）Ａβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度を指標として、ＡＤ等で発症する認知症に罹患した患者と、軽度認知症に罹患した患者（すなわち、認知症に罹患していない者）とを判別できることが確認された。
【0083】
次に、かかるＣＳＦ試料又は血漿試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度と、ＣＳＦ試料中のＨＭＧＢ１の濃度とを組み合わせて、両群間のＲＯＣ分析を行った結果、ＡＵＣ値はそれぞれ０．６４４及び０．７５８と向上した（図７ｃ及び７ｄ参照）。さらに、かかるＣＳＦ試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度と、かかる血漿試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度と、かかるＣＳＦ試料中のＨＭＧＢ１の濃度とを組み合わせて、両群間のＲＯＣ分析を行った結果、ＡＵＣ値は０．８１７とさらに向上した（図７ｅ参照）。
【0084】
これらの結果は、ＣＳＦ試料又は血漿試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度と、ＣＳＦ試料中のＨＭＧＢ１の濃度とを組み合わせて解析するか、あるいは、ＣＳＦ試料及び血漿試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度と、ＣＳＦ試料中のＨＭＧＢ１の濃度とを組み合わせて解析することにより、ＣＳＦ試料又は血漿試料中のＡβ－ＨＭＧＢ１複合体の濃度単独で解析した場合と比べ、認知症の判定精度が向上することを示している。
【産業上の利用可能性】
【0085】
本発明は、認知症の早期発見、認知症の治療、及び認知症の病期進行の予防に資するものである。
【図1a】
【図1b】
【図1c】
【図1d】
【図1e】
【図2a-c】
【図2d-g】
【図2h-i】
【図2j-k】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6a-b】
【図6c-d】
【図6e-f】
【図7】
【配列表】