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特開2024-68456（Ｒ）－（－）又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位を含むポリマーの製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024068456
(43)【公開日】2024-05-20
(54)【発明の名称】（Ｒ）－（－）又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位を含むポリマーの製造方法
(51)【国際特許分類】
C12P 7/62 20220101AFI20240513BHJP
C08L 67/04 20060101ALI20240513BHJP
C12N 1/21 20060101ALN20240513BHJP
C12N 15/54 20060101ALN20240513BHJP
C08L 101/16 20060101ALN20240513BHJP
【ＦＩ】
C12P7/62 ZBP
C08L67/04
C12N1/21
C12N15/54
C08L101/16
【審査請求】未請求
【請求項の数】20
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022178923
(22)【出願日】2022-11-08
(71)【出願人】
【識別番号】304021417
【氏名又は名称】国立大学法人東京工業大学
(71)【出願人】
【識別番号】000003001
【氏名又は名称】帝人株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100134784
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 和美
(72)【発明者】
【氏名】柘植 丈治
(72)【発明者】
【氏名】マルグプ ミリザティ
(72)【発明者】
【氏名】山本 智義
(72)【発明者】
【氏名】小澤 優
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4J002
4J200
【Ｆターム（参考）】
4B064AD83
4B064CA02
4B064CA19
4B064DA16
4B065AA10Y
4B065AA26X
4B065AA26Y
4B065AA41X
4B065AA41Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065CA12
4B065CA60
4J002CF181
4J002GA01
4J002GB01
4J002GG01
4J002GG02
4J200AA04
4J200AA13
4J200BA12
4J200CA01
4J200DA02
4J200DA03
4J200DA17
4J200DA22
4J200EA07
4J200EA18
4J200EA19
(57)【要約】
【課題】（Ｒ）－（－）又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸を構成単位とするＰＨＡを提供すること。
【解決手段】炭素源と、前駆物質としての（Ｒ）－（－）又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸との存在下に、微生物にポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子が導入された形質転換体を培養し、得られた培養物から（Ｒ）－（－）又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位を含むポリマーを採取する工程を含む、（Ｒ）－（－）又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位を含むポリマーの製造方法；（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位と３－ヒドロキシブタン酸単位とからなるコポリマー、又は（Ｒ）－（－）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位と３－ヒドロキシブタン酸単位とからなるコポリマー；及び、（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位のホモポリマー。
【選択図】図５
【解決手段】炭素源と、前駆物質としての（Ｒ）－（－）又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸との存在下に、微生物にポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子が導入された形質転換体を培養し、得られた培養物から（Ｒ）－（－）又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位を含むポリマーを採取する工程を含む、（Ｒ）－（－）又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位を含むポリマーの製造方法；（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位と３－ヒドロキシブタン酸単位とからなるコポリマー、又は（Ｒ）－（－）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位と３－ヒドロキシブタン酸単位とからなるコポリマー；及び、（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位のホモポリマー。
【選択図】図５
【特許請求の範囲】
【請求項1】
炭素源と、前駆物質としての（Ｒ）－（－）又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸との存在下に、微生物にポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子が導入された形質転換体を培養し、得られた培養物から（Ｒ）－（－）又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸を構成単位として含むポリマーを採取する工程を含む、（Ｒ）－（－）又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸を構成単位として含むポリマーの製造方法。
【請求項2】
前記（Ｒ）－（－）又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸を構成単位として含むポリマーが、（Ｒ）－（－）又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位のホモポリマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記（Ｒ）－（－）又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸を構成単位として含むポリマーが、（Ｒ）－（－）又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位と３－ヒドロキシブタン酸単位とのコポリマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記前駆物質としての（Ｒ）－（－）又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸を培養液１Ｌあたり０．１～０．８ｇの範囲で添加して、それぞれ、（Ｒ）－（－）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位と３－ヒドロキシブタン酸単位とからなるコポリマー、又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位と３－ヒドロキシブタン酸単位とからなるコポリマーを光学純度１００％ｅｅで製造する、請求項３に記載の方法であって、前記コポリマー中の、前記（Ｒ）－（－）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位の分率又は前記（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位の分率が８モル％以下である、方法。
【請求項5】
前記前駆物質としての（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸を培養液１Ｌあたり０．９～２．０ｇの範囲で添加して、（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位と３－ヒドロキシブタン酸単位とからなるコポリマーを光学純度１００％ｅｅで製造する、請求項３に記載の方法であって、前記コポリマー中の、前記（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位の分率が３５～６５モル％の範囲である、方法。
【請求項6】
前記前駆物質としての（Ｒ）－（－）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸を培養液１Ｌあたり０．９～２．０ｇの範囲で添加する、請求項３に記載の方法であって、前記コポリマー中の３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位が（Ｒ）－（－）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位と（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位とが混合した形態にあり、前記前駆物質の添加量の増加に伴い、前記混合形態中の（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位の割合が増加する、方法。
【請求項7】
前記前駆物質としての（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸を培養液１Ｌあたり２．１～７．０ｇの範囲で添加して、（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位のホモポリマーを光学純度９９％ｅｅ以上で製造する、請求項２に記載の方法。
【請求項8】
前記前駆物質としての（Ｒ）－（－）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸を培養液１Ｌあたり２．１～７．０ｇの範囲で添加する、請求項２に記載の方法であって、前記ホモポリマー中の３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位が（Ｒ）－（－）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位と（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位とが混合した形態にあり、前記前駆物質の添加量の増加に伴い、前記混合形態中の（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位の割合が増加する、方法。
【請求項9】
前記ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子が、アエロモナス・キャビエ（Aeromonas caviae）由来のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子であって、前記アエロモナス・キャビエ由来のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素がＮ末端から１４９番目のアスパラギンのセリンへの置換、及び／又は１７１番目のアスパラギン酸のグリシンへの置換を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
前記微生物が、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、ラルストニア（Ralstonia）属菌、及びシュードモナス（Pseuomonas）属菌からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位と３－ヒドロキシブタン酸単位とからなるコポリマー、又は（Ｒ）－（－）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位と３－ヒドロキシブタン酸単位とからなるコポリマー。
【請求項12】
前記コポリマー中の、前記（Ｒ）－（－）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位の分率又は前記（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位の分率が８モル％以下である、請求項１１に記載のコポリマー。
【請求項13】
（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位と３－ヒドロキシブタン酸単位とからなるコポリマーであって、光学純度が１００％ｅｅである、請求項１１に記載のホモポリマー。
【請求項14】
（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位のホモポリマー。
【請求項15】
光学純度が９９％ｅｅ以上である、請求項１４に記載のホモポリマー。
【請求項16】
メソダイアド又はアイソタクチック構造を有する、請求項１４に記載のホモポリマー。
【請求項17】
３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位と３－ヒドロキシブタン酸単位とからなるコポリマーであって、３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位の（Ｓ）－エナンチオマーが過剰であり、エナンチオマー過剰率が１４～４０％ｅｅである、コポリマー。
【請求項18】
３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位のホモポリマーであって、（Ｓ）－エナンチオマーが過剰であり、エナンチオマー過剰率が２０～６６％ｅｅである、ホモポリマー。
【請求項19】
請求項１１～１８のいずれか１項に記載のコポリマー又はホモポリマーを含む組成物。
【請求項20】
請求項１１～１８のいずれか１項に記載のコポリマー又はホモポリマーを含むプラスチック材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、（Ｒ）－（－）又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位を含むポリマーの製造方法、（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸と３－ヒドロキシブタン酸とからなるコポリマー、又は（Ｒ）－（－）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸と３－ヒドロキシブタン酸とからなるコポリマー、（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸のホモポリマー、及び、（Ｒ）－（－）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸のホモポリマーに関する。本発明はまた、前記ホモポリマー又はコポリマーを含む組成物、及び前記ホモポリマー又はコポリマーを含むプラスチック材料に関する。
【背景技術】
【0002】
ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）は微生物が細胞内に蓄積するバイオポリエステルである。近年では、生分解性プラスチック素材としてのみならず、バイオマス由来のプラスチック素材として注目されている。
【0003】
ポリエステルの加工工程において、ポリエステルの結晶化速度の高さは加工時間の短縮につながるため、非常に重要である。最も一般的なＰＨＡである、３－ヒドロキシブタン酸（３ＨＢ）を構成単位とするホモポリマー（Ｐ（３ＨＢ））は、高結晶性であるために硬くて脆く、実用性に乏しい。また、溶融時にポリマーが低分子量化してしまうなど成型加工時の劣化が問題となり、工業生産には向いていない。この物性を改善する手段の一つとして、３ＨＢと他のモノマーとの共重合体が種々開発されてきた（非特許文献１～４）。
【0004】
ところで、α炭素に側鎖を有するヒドロキシアルカン酸は、低温での溶融性など優れた加工特性を付与できる点から、非常に魅力的なポリマー単位である。
３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸（３Ｈ２ＭＰ）は、そのα炭素にメチル基を有するため、α炭素上にキラル中心が存在する。したがって、ＰＨＡ材料として、（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰ又は（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰのうちの一方のエナンチオマーを含むＰＨＡ（すなわち、キラルＰＨＡ）も製造可能である。
３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸（３Ｈ２ＭＰ）は、そのα炭素にメチル基を有するため、α炭素上にキラル中心が存在する。したがって、ＰＨＡ材料として、（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰ又は（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰのうちの一方のエナンチオマーを含むＰＨＡ（すなわち、キラルＰＨＡ）も製造可能である。
【0005】
これまで、３Ｈ２ＭＰを構成単位とするＰＨＡとして、炭素源として３Ｈ２ＭＰを用い、アルカリゲネス属細菌を培養することにより３Ｈ２ＭＰ単位を含むポリマーの製造が試みられたが、得られたポリマーは約１０モル％の３Ｈ２ＭＰ単位を含むターポリマー又はテトラポリマーであった（非特許文献５）。最近になって、コマモナス・エスピー（Comamonas sp.）を用いて、３Ｈ２ＭＰから３Ｈ２ＭＰホモポリマー（Ｐ（３Ｈ２ＭＰ））が乾燥菌体の最大３７重量％で製造できることが報告されたが（非特許文献６）、Ｐ（３Ｈ２ＭＰ）のキラリティーについては不明であった。
【0006】
また、乳酸は３Ｈ２ＭＰと同じα炭素にキラル中心を有するが、そのポリマーであるポリＬ－乳酸（ＰＬＬＡ）とポリＤ－乳酸（ＰＤＬＡ）は、ＰＬＬＡとＰＤＬＡとの存在比に依って、結晶性、熱安定性、機械的強度などの材料特性が変化することが知られている（非特許文献７）。
【0007】
このように、（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰ単位又は（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰ単位は、新たな材料特性を有するＰＨＡ材料としての可能性を有することが期待されるところ、これまでそのような報告は存在しない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Tsuge T, Yano K, Imazu SI et al., Macromol Biosci 2005; 5: 112-7. DOI: 10.1002/mabi.200400152
【非特許文献2】Mizuno K, Ohta A, Hyakutake M et al., Polym Degrad Stab 2010; 95: 1335-9. DOI: 10.1016/j.polymdegradstab.2010.01.033
【非特許文献3】Furutate S, Kamoi J, Nomura CT et al., NPG Asia Mater 2021; 13: 1-11. DOI: 10.1038/s41427-021-00296-x
【非特許文献4】Mierzati M, Mizuno S, Tsuge T., Polym Degrad Stab 2020; 178: 109193. DOI: 10.1016/j.polymdegradstab.2020.109193.
【非特許文献5】D. O. I. YOSHIHARU and K. SHIRO, 1995 [Online]. Available: https://lens.org/183-171-147-994-58
【非特許文献6】C. M. Vermeer, L. J. Bons, and R. Kleerebezem, Appl. Microbiol. Biotechnol., vol. 106, no. 2, pp. 605-618, 2022
【非特許文献7】L. Han, Q. Xie, J. Bao, G. Shan, Y. Bao, and P. Pan, Polym. Chem., vol. 8, no. 6, pp. 1006-1016, 2017
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
従って、本発明は、（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰ又は（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰを構成単位として含むＰＨＡを製造することを目的とする。また、当該ＰＨＡを構成する３Ｈ２ＭＰのエナンチオマーの種類又はその存在比によってポリマーの材料特性がどのように変化するかを探索し、優れた材料特性を有するポリマーを製造することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者らは、斯かる実状に鑑み鋭意検討した結果、前駆物質としてのエナンチオマーである（Ｒ）－又は（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰ、及び炭素源の存在下に、微生物にポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子が導入された形質転換体を培養することにより、（Ｒ）－又は（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰを構成単位として含むポリマーが得られることを見出し、本発明を完成するに至った。特に、添加する前駆物質の濃度によって、得られるポリマーのキラリティーが制御可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0011】
すなわち、本発明は以下を提供する。
（１）炭素源と、前駆物質としての（Ｒ）－（－）又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸との存在下に、微生物にポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子が導入された形質転換体を培養し、得られた培養物から（Ｒ）－（－）又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸を構成単位として含むポリマーを採取する工程を含む、（Ｒ）－（－）又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸を構成単位として含むポリマーの製造方法。
（２）前記（Ｒ）－（－）又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸を構成単位として含むポリマーが、（Ｒ）－（－）又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位のホモポリマーである、（１）に記載の方法。
（３）前記（Ｒ）－（－）又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸を構成単位として含むポリマーが、（Ｒ）－（－）又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位と３－ヒドロキシブタン酸単位とのコポリマーである、（１）に記載の方法。
（４）前記前駆物質としての（Ｒ）－（－）又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸を培養液１Ｌあたり０．１～０．８ｇの範囲で添加して、それぞれ、（Ｒ）－（－）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位と３－ヒドロキシブタン酸単位とからなるコポリマー、又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位と３－ヒドロキシブタン酸単位とからなるコポリマーを光学純度１００％ｅｅで製造する、（３）に記載の方法であって、前記コポリマー中の、前記（Ｒ）－（－）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位の分率又は前記（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位の分率が８モル％以下である、方法。
（５）前記前駆物質としての（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸を培養液１Ｌあたり０．９～２．０ｇの範囲で添加して、（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位と３－ヒドロキシブタン酸単位とからなるコポリマーを光学純度１００％ｅｅで製造する、（３）に記載の方法であって、前記コポリマー中の、前記（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位の分率が３５～６５モル％の範囲である、方法。
（６）前記前駆物質としての（Ｒ）－（－）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸を培養液１Ｌあたり０．９～２．０ｇの範囲で添加する、（３）に記載の方法であって、前記コポリマー中の３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位が（Ｒ）－（－）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位と（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位とが混合した形態にあり、前記前駆物質の添加量の増加に伴い、前記混合形態中の（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位の割合が増加する、方法。
（６）前記前駆物質としての（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸を培養液１Ｌあたり２．１～７．０ｇの範囲で添加して、（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位のホモポリマーを光学純度９９％ｅｅ以上で製造する、（２）に記載の方法。
（８）前記前駆物質としての（Ｒ）－（－）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸を培養液１Ｌあたり２．１～７．０ｇの範囲で添加する、（２）に記載の方法であって、前記ホモポリマー中の３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位が（Ｒ）－（－）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位と（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位とが混合した形態にあり、前記前駆物質の添加量の増加に伴い、前記混合形態中の（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位の割合が増加する、方法。
（９）前記ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子が、アエロモナス・キャビエ（Aeromonas caviae）由来のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子であって、前記アエロモナス・キャビエ由来のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素がＮ末端から１４９番目のアスパラギンのセリンへの置換、及び／又は１７１番目のアスパラギン酸のグリシンへの置換を含む、（１）～（８）のいずれか１に記載の方法。
（１０）前記微生物が、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、ラルストニア（Ralstonia）属菌、及びシュードモナス（Pseuomonas）属菌からなる群から選択される、（１）に記載の方法。
（１１）（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位と３－ヒドロキシブタン酸単位とからなるコポリマー、又は（Ｒ）－（－）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位と３－ヒドロキシブタン酸単位とからなるコポリマー。
（１２）前記コポリマー中の、前記（Ｒ）－（－）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位の分率又は前記（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位の分率が８モル％以下である、（１１）に記載のコポリマー。
（１３）（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位と３－ヒドロキシブタン酸単位とからなるコポリマーであって、光学純度が１００％ｅｅである、（１１）に記載のホモポリマー。
（１４）（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位のホモポリマー。
（１５）光学純度が９９％ｅｅ以上である、（１４）に記載のホモポリマー。
（１６）メソダイアド又はアイソタクチック構造を有する、（１４）に記載のホモポリマー。
（１７）３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位と３－ヒドロキシブタン酸単位とからなるコポリマーであって、３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位の（Ｓ）－エナンチオマーが過剰であり、エナンチオマー過剰率が１４～４０％ｅｅである、コポリマー。
（１８）３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸のホモポリマーであって、（Ｓ）－エナンチオマーが過剰であり、エナンチオマー過剰率が２０～６６％ｅｅである、ホモポリマー。
（１９）（１１）～（１８）のいずれか１に記載のコポリマー又はホモポリマーを含む組成物。
（２０）（１１）～（１８）のいずれか１に記載のコポリマー又はホモポリマーを含むプラスチック材料。
（１）炭素源と、前駆物質としての（Ｒ）－（－）又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸との存在下に、微生物にポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子が導入された形質転換体を培養し、得られた培養物から（Ｒ）－（－）又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸を構成単位として含むポリマーを採取する工程を含む、（Ｒ）－（－）又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸を構成単位として含むポリマーの製造方法。
（２）前記（Ｒ）－（－）又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸を構成単位として含むポリマーが、（Ｒ）－（－）又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位のホモポリマーである、（１）に記載の方法。
（３）前記（Ｒ）－（－）又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸を構成単位として含むポリマーが、（Ｒ）－（－）又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位と３－ヒドロキシブタン酸単位とのコポリマーである、（１）に記載の方法。
（４）前記前駆物質としての（Ｒ）－（－）又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸を培養液１Ｌあたり０．１～０．８ｇの範囲で添加して、それぞれ、（Ｒ）－（－）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位と３－ヒドロキシブタン酸単位とからなるコポリマー、又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位と３－ヒドロキシブタン酸単位とからなるコポリマーを光学純度１００％ｅｅで製造する、（３）に記載の方法であって、前記コポリマー中の、前記（Ｒ）－（－）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位の分率又は前記（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位の分率が８モル％以下である、方法。
（５）前記前駆物質としての（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸を培養液１Ｌあたり０．９～２．０ｇの範囲で添加して、（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位と３－ヒドロキシブタン酸単位とからなるコポリマーを光学純度１００％ｅｅで製造する、（３）に記載の方法であって、前記コポリマー中の、前記（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位の分率が３５～６５モル％の範囲である、方法。
（６）前記前駆物質としての（Ｒ）－（－）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸を培養液１Ｌあたり０．９～２．０ｇの範囲で添加する、（３）に記載の方法であって、前記コポリマー中の３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位が（Ｒ）－（－）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位と（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位とが混合した形態にあり、前記前駆物質の添加量の増加に伴い、前記混合形態中の（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位の割合が増加する、方法。
（６）前記前駆物質としての（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸を培養液１Ｌあたり２．１～７．０ｇの範囲で添加して、（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位のホモポリマーを光学純度９９％ｅｅ以上で製造する、（２）に記載の方法。
（８）前記前駆物質としての（Ｒ）－（－）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸を培養液１Ｌあたり２．１～７．０ｇの範囲で添加する、（２）に記載の方法であって、前記ホモポリマー中の３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位が（Ｒ）－（－）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位と（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位とが混合した形態にあり、前記前駆物質の添加量の増加に伴い、前記混合形態中の（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位の割合が増加する、方法。
（９）前記ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子が、アエロモナス・キャビエ（Aeromonas caviae）由来のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子であって、前記アエロモナス・キャビエ由来のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素がＮ末端から１４９番目のアスパラギンのセリンへの置換、及び／又は１７１番目のアスパラギン酸のグリシンへの置換を含む、（１）～（８）のいずれか１に記載の方法。
（１０）前記微生物が、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、ラルストニア（Ralstonia）属菌、及びシュードモナス（Pseuomonas）属菌からなる群から選択される、（１）に記載の方法。
（１１）（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位と３－ヒドロキシブタン酸単位とからなるコポリマー、又は（Ｒ）－（－）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位と３－ヒドロキシブタン酸単位とからなるコポリマー。
（１２）前記コポリマー中の、前記（Ｒ）－（－）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位の分率又は前記（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位の分率が８モル％以下である、（１１）に記載のコポリマー。
（１３）（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位と３－ヒドロキシブタン酸単位とからなるコポリマーであって、光学純度が１００％ｅｅである、（１１）に記載のホモポリマー。
（１４）（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位のホモポリマー。
（１５）光学純度が９９％ｅｅ以上である、（１４）に記載のホモポリマー。
（１６）メソダイアド又はアイソタクチック構造を有する、（１４）に記載のホモポリマー。
（１７）３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位と３－ヒドロキシブタン酸単位とからなるコポリマーであって、３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位の（Ｓ）－エナンチオマーが過剰であり、エナンチオマー過剰率が１４～４０％ｅｅである、コポリマー。
（１８）３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸のホモポリマーであって、（Ｓ）－エナンチオマーが過剰であり、エナンチオマー過剰率が２０～６６％ｅｅである、ホモポリマー。
（１９）（１１）～（１８）のいずれか１に記載のコポリマー又はホモポリマーを含む組成物。
（２０）（１１）～（１８）のいずれか１に記載のコポリマー又はホモポリマーを含むプラスチック材料。
【発明の効果】
【0012】
本発明により、（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰ又は（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰを構成単位として含むキラルなコポリマーＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｈ２ＭＰ）、及び（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰ又は（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰを構成単位とするキラルなホモポリマーＰ（３Ｈ２ＭＰ）を製造することができる。また、ポリマーを構成する３Ｈ２ＭＰのエナンチオマーの種類又はその存在比を変化させることによって種々の材料特性を有するポリマーを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】図１は、３Ｈ２ＭＰ単位を含むＰＨＡの合成経路を示す図である。破線で囲まれたブロックは、ＰＨＡ合成の重要な酵素を有する組換えＥ．ｃｏｌｉ ＬＳＢＪを用いる生合成経路を示す。「ｐｈａＡ」は３－ケトチオラーゼを、「ｐｈａＢ」はＮＡＤＰＨ依存的アセトアセチル－ＣｏＡレダクターゼを、「ＰＣＴ」はプロピオニル－ＣｏＡトランスフェラーゼを、「ＰｈａＣ」はＰＨＡ重合酵素をそれぞれ示す。左下の細かい破線で囲まれたブロックは、メチル３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸の化学的加水分解を示す。
【図2】図２は、ＰＨＡの４００ＭＨｚ １ＨＮＭＲスペクトルを示す図である。ＡはＰ（３ＨＢ）、ＢはＰ（３Ｈ２ＭＰ）（試料「３－Ｒａｃ」）を、ＣはＰ（３ＨＢ－ｃｏ－５ｍｏｌ％ ３Ｈ２ＭＰ）（試料「１－Ｒａｃ」）をそれぞれ示す。
【図3】図３は、ＰＨＡの１００ＭＨｚ １３ＣＮＭＲスペクトルを示す図である。ＡはＰ（３Ｈ２ＭＰ）（試料「３－Ｒａｃ」）を、ＢはＰ（３ＨＢ－ｃｏ－５ｍｏｌ％ ３Ｈ２ＭＰ）（試料「１－Ｒａｃ」）をそれぞれ示す。
【図4】図４は、ＰＨＡ又は標準物質のＧＣ－ＭＳスペクトルを示す図である。Ａは、ｍ／ｚ８８でのメチル（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰ及びメチル（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰ標準物質の保持時間を、Ｂは表１に記載の全試料についての（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰ、（Ｓ）－３Ｈ２Ｍの保持時間及びピーク強度を示す。
【図5】図５は、ＰＨＡ組成中の３Ｈ２ＭＰの含有量の増加に伴う、ＰＨＡ中の３Ｈ２ＭＰエナンチオマー比の変化を示す図である。Ａは、前駆物質として（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰを用いた時の結果を、Ｂは前駆物質として（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰを用いた時の結果を、Ｃは前駆物質として２つのエナンチオマーの混合物を用いた時の結果をそれぞれ示す。
【図6】図６は、５００ＭＨｚ １３Ｃスペクトルでの、ＰＨＡのメチル領域（約１４ｐｐｍ）、メチン領域（約４０ｐｐｍ）及びカルボニル領域（約１７４ｐｐｍ）の拡大を示す図である。ＡはＰ（３Ｈ２ＭＰ）（％Ｓ：％Ｒ＝６０：４０）（試料「３－Ｒ」；２０％ｅｅ）を、ＢはＰ（３Ｈ２ＭＰ）（％Ｓ：％Ｒ＝９９：１）（試料「３－Ｓ」；９８％ｅｅ）を、ＣはＰ（３Ｈ２ＭＰ）（％Ｓ：％Ｒ＝８３：１７）（試料「３－Ｒａｃ」；６０％ｅｅ）をそれぞれ示す。「ｍ」はメソダイアドを、「ｍｍ」はアイソタクチックトリアドを、「ｒ」はラセモダイアドを、「ｒｒ」はシンジオタクチックトリアドをそれぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【0014】
以下、具体的な実施態様に即して本発明を詳細に説明する。但し、本発明は決して以下の実施態様に束縛されるものではなく、適宜変更を加えて実施することが可能である。
【0015】
本発明において、３－ヒドロキシブタン酸を「３ＨＢ」、３ＨＢを構成単位とするホモポリマーを「Ｐ（３ＨＢ）」、３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸を「３Ｈ２ＭＰ」、３Ｈ２ＭＰを構成単位とするホモポリマーを「Ｐ（３Ｈ２ＭＰ）」、３ＨＢ単位と３Ｈ２ＭＰ単位とのコポリマーを「Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｈ２ＭＰ）」と表記する。例えば、Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－５ｍｏｌ％ ３Ｈ２ＭＰ）とは、３Ｈ２ＭＰを５ｍｏｌ％で含むコポリマーを意味する。
【0016】
また、本発明において、３Ｈ２ＭＰの２つのエナンチオマーとは、（Ｒ）－（－）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸（適宜、「（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰ」又は「（Ｒ）－エナンチオマー」と表記）、又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸（適宜、「（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰ」又は「（Ｓ）－エナンチオマー」と表記）を指す。
「混合物」とは、（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰと（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰとの存在比にかかわらず、これらのエナンチオマーの混合物を指し、「Ｒａｃ」で表示される。「混合物」には、（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰと（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰとが等量存在するラセミ体も含まれる。更に、「混合物」は、場合により、Ｐ（３Ｈ２ＭＰ）又はＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｈ２ＭＰ）において、３Ｈ２ＭＰ単位がエナンチオマーの混合物であるポリマーを指す。
「キラルホモポリマーＰ（３Ｈ２ＭＰ）」又は「キラルコポリマーＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｈ２ＭＰ）」とは、３Ｈ２ＭＰ単位がいずれかのエナンチオマーであり、エナンチオマー過剰率が１００％ｅｅであるものを指す。
「混合物」とは、（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰと（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰとの存在比にかかわらず、これらのエナンチオマーの混合物を指し、「Ｒａｃ」で表示される。「混合物」には、（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰと（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰとが等量存在するラセミ体も含まれる。更に、「混合物」は、場合により、Ｐ（３Ｈ２ＭＰ）又はＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｈ２ＭＰ）において、３Ｈ２ＭＰ単位がエナンチオマーの混合物であるポリマーを指す。
「キラルホモポリマーＰ（３Ｈ２ＭＰ）」又は「キラルコポリマーＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｈ２ＭＰ）」とは、３Ｈ２ＭＰ単位がいずれかのエナンチオマーであり、エナンチオマー過剰率が１００％ｅｅであるものを指す。
【0017】
本発明において「前駆物質」とは、（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰ、（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰ、又はそれらの混合物を指す。
【0018】
本発明の第１の実施形態は、炭素源と、前駆物質としての（Ｒ）－又は（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰとの存在下に、微生物にポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子が導入された形質転換体を培養し、得られた培養物から（Ｒ）－又は（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰを構成単位とするポリマーを採取する工程を含む、（Ｒ）－又は（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰを構成単位とするポリマーの製造方法に関する。
（Ｒ）－又は（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰを構成単位とするポリマーには、（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰのホモポリマー、（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰのホモポリマー、又は（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰ単位もしくは（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰ単位と３ＨＢ単位とのコポリマーが含まれる。
（Ｒ）－又は（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰを構成単位とするポリマーには、（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰのホモポリマー、（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰのホモポリマー、又は（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰ単位もしくは（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰ単位と３ＨＢ単位とのコポリマーが含まれる。
【0019】
本発明のＰＨＡの合成経路を図１に示す。
グルコース等の炭素源はピルビン酸、次いでアセチル－ＣｏＡに変換された後、このアセチル－ＣｏＡはβ－ケトチオラーゼ（ＰｈａＡ）により２量化（ＰｈａＡ）され、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＰｈａＢ）によって還元されて、３ＨＢ－ＣｏＡに変換される（図１の破線で囲まれたブロック）。一方、３Ｈ２ＭＰは、例えば３Ｈ２ＭＰのメチルエステルの化学的な加水分解などにより容易に得られる（図１の細かい破線で囲まれたブロック）。３Ｈ２ＭＰのメチルエステルの加水分解物はプロピオニル－ＣｏＡトランスフェラーゼによって３Ｈ２ＭＰ－ＣｏＡに変換される。
３ＨＢ－ＣｏＡ生成経路で供給されたモノマー（３ＨＢ－ＣｏＡ）及び３Ｈ２ＭＢ－ＣｏＡ生成経路で供給されたモノマー（３Ｈ２ＭＰ－ＣｏＡ）は、ＰＨＡ重合酵素（ＰｈａＣ）の基質として利用され、コポリマーＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｈ２ＭＰ）が合成され（以下、適宜「製造方法１」、「製造方法１－１」と表記）、モノマー（３Ｈ２ＭＰ－ＣｏＡ）からホモポリマーＰ（３Ｈ２ＭＰ）が合成される（以下、適宜「製造方法２」と表記）（図１の破線で囲まれたブロック）。
グルコース等の炭素源はピルビン酸、次いでアセチル－ＣｏＡに変換された後、このアセチル－ＣｏＡはβ－ケトチオラーゼ（ＰｈａＡ）により２量化（ＰｈａＡ）され、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＰｈａＢ）によって還元されて、３ＨＢ－ＣｏＡに変換される（図１の破線で囲まれたブロック）。一方、３Ｈ２ＭＰは、例えば３Ｈ２ＭＰのメチルエステルの化学的な加水分解などにより容易に得られる（図１の細かい破線で囲まれたブロック）。３Ｈ２ＭＰのメチルエステルの加水分解物はプロピオニル－ＣｏＡトランスフェラーゼによって３Ｈ２ＭＰ－ＣｏＡに変換される。
３ＨＢ－ＣｏＡ生成経路で供給されたモノマー（３ＨＢ－ＣｏＡ）及び３Ｈ２ＭＢ－ＣｏＡ生成経路で供給されたモノマー（３Ｈ２ＭＰ－ＣｏＡ）は、ＰＨＡ重合酵素（ＰｈａＣ）の基質として利用され、コポリマーＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｈ２ＭＰ）が合成され（以下、適宜「製造方法１」、「製造方法１－１」と表記）、モノマー（３Ｈ２ＭＰ－ＣｏＡ）からホモポリマーＰ（３Ｈ２ＭＰ）が合成される（以下、適宜「製造方法２」と表記）（図１の破線で囲まれたブロック）。
【0020】
前駆物質である（Ｒ）－又は（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰは、約０．１～約１０．０ｇ／Ｌ、約０．１～約７．０ｇ／Ｌの範囲で添加することが好ましい。
製造方法１では、例えば培養液１Ｌあたり０．１～０．８ｇの範囲で（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰ又は（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰを添加することができる。この場合、（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰ単位と３ＨＢ単位とから実質的になるコポリマー、又は（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰ単位と３ＨＢ単位とから実質的になるコポリマーをいずれも実質的に光学純度１００％ｅｅで合成することができる。前記コポリマー組成中の、（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰ単位の分率又は（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰ単位の分率は約８モル％以下である。
本明細書において「実質的になる」とは、上記コポリマー中の、３Ｈ２ＭＰ単位及び３ＨＢ単位以外の３－ヒドロキシアルカン酸単位の分率が実質的にゼロであることを意味する。例えば、３Ｈ２ＭＰ単位及び３ＨＢ単位以外の３－ヒドロキシアルカン酸単位の分率は、好ましくは１０％未満、好ましくは７％未満、好ましくは５％未満、好ましくは３％未満、好ましくは２％未満、より好ましくは１％未満である。以下、「実質的になる」なる語を省略する場合があるが、「３Ｈ２ＭＰ単位と３ＨＢ単位とからなるコポリマー」とは上記の意味を有する。
また、本明細書において「実質的に光学純度１００％ｅｅ」とは、その光学純度が目的とする用途において要求される水準を満足していればよく、必ずしも１００％ｅｅである必要はない。例えば、少なくとも９０％ｅｅ、好ましくは少なくとも９５％ｅｅ、好ましくは少なくとも９８％ｅｅ、好ましくは少なくとも９９％ｅｅ、好ましくは少なくとも９９．５％ｅｅ、より好ましくは少なくとも９９．９％ｅｅである。
製造方法１では、例えば培養液１Ｌあたり０．１～０．８ｇの範囲で（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰ又は（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰを添加することができる。この場合、（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰ単位と３ＨＢ単位とから実質的になるコポリマー、又は（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰ単位と３ＨＢ単位とから実質的になるコポリマーをいずれも実質的に光学純度１００％ｅｅで合成することができる。前記コポリマー組成中の、（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰ単位の分率又は（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰ単位の分率は約８モル％以下である。
本明細書において「実質的になる」とは、上記コポリマー中の、３Ｈ２ＭＰ単位及び３ＨＢ単位以外の３－ヒドロキシアルカン酸単位の分率が実質的にゼロであることを意味する。例えば、３Ｈ２ＭＰ単位及び３ＨＢ単位以外の３－ヒドロキシアルカン酸単位の分率は、好ましくは１０％未満、好ましくは７％未満、好ましくは５％未満、好ましくは３％未満、好ましくは２％未満、より好ましくは１％未満である。以下、「実質的になる」なる語を省略する場合があるが、「３Ｈ２ＭＰ単位と３ＨＢ単位とからなるコポリマー」とは上記の意味を有する。
また、本明細書において「実質的に光学純度１００％ｅｅ」とは、その光学純度が目的とする用途において要求される水準を満足していればよく、必ずしも１００％ｅｅである必要はない。例えば、少なくとも９０％ｅｅ、好ましくは少なくとも９５％ｅｅ、好ましくは少なくとも９８％ｅｅ、好ましくは少なくとも９９％ｅｅ、好ましくは少なくとも９９．５％ｅｅ、より好ましくは少なくとも９９．９％ｅｅである。
【0021】
製造方法１－１では、培養液１Ｌあたり０．９～２．０ｇの範囲で（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰを添加することができる。この場合、（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰ単位と３ＨＢ単位とから実質的になるコポリマーを実質的に光学純度１００％ｅｅで合成することができる。前記コポリマー組成中の、（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰ単位の分率は約３５～約６５モル％の範囲である。
本明細書において「実質的になる」とは、上記ホモポリマー中の、３Ｈ２ＭＰ単位以外の３－ヒドロキシアルカン酸単位の分率が実質的にゼロであることを意味する。例えば、３Ｈ２ＭＰ単位以外の３－ヒドロキシアルカン酸単位の分率は、好ましくは１０％未満、好ましくは７％未満、好ましくは５％未満、好ましくは３％未満、好ましくは２％未満、より好ましくは１％未満である。以下、「実質的になる」なる語を省略する場合があるが、「３Ｈ２ＭＰ単位からなるホモポリマー」、「３Ｈ２ＭＰ単位のホモポリマー」とは上記の意味を有する。
また、本明細書において「実質的に光学純度１００％ｅｅ」とは、上記の通りである。
本明細書において「実質的になる」とは、上記ホモポリマー中の、３Ｈ２ＭＰ単位以外の３－ヒドロキシアルカン酸単位の分率が実質的にゼロであることを意味する。例えば、３Ｈ２ＭＰ単位以外の３－ヒドロキシアルカン酸単位の分率は、好ましくは１０％未満、好ましくは７％未満、好ましくは５％未満、好ましくは３％未満、好ましくは２％未満、より好ましくは１％未満である。以下、「実質的になる」なる語を省略する場合があるが、「３Ｈ２ＭＰ単位からなるホモポリマー」、「３Ｈ２ＭＰ単位のホモポリマー」とは上記の意味を有する。
また、本明細書において「実質的に光学純度１００％ｅｅ」とは、上記の通りである。
【0022】
また、製造方法１－１では、培養液１Ｌあたり０．９～２．０ｇの範囲で（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰを添加することもできる。この場合には、得られたコポリマーの３Ｈ２ＭＰ単位は、（Ｒ）－エナンチオマーと（Ｓ）－エナンチオマーとが混合した形態にある。また、（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰの添加量を当該範囲で増加させるに伴い、前記混合形態中の（Ｓ）－エナンチオマーの割合が増加する。
【0023】
製造方法２では、培養液１Ｌあたり２．１～７．０ｇの範囲で（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰを添加して、（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰのホモポリマーを光学純度９９％ｅｅ以上で合成することができる。「光学純度９９％ｅｅ以上」とは、例えば、好ましくは少なくとも９９．５％ｅｅ、好ましくは少なくとも９９．５％ｅｅ、より好ましくは少なくとも９９．９％ｅｅである。
【0024】
また、製造方法２では、培養液１Ｌあたり２．１～７．０ｇの範囲で（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰを添加することもできる。この場合には、得られたホモポリマーの（Ｒ）－エナンチオマーと（Ｓ）－エナンチオマーとが混合した形態にある。また、（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰの添加量を当該範囲で増加させるに伴い、前記混合形態中の（Ｓ）－エナンチオマーの割合が増加する。
【0025】
製造方法１－１、２において、（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰの添加量の増加に伴い、（Ｓ）－エナンチオマーの割合が増加する理由として、いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＳＢＪの代謝経路において、バリン代謝中間体であるメタクリリル－ＣｏＡから（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰ－ＣｏＡへの代謝、及び（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰ－ＣｏＡからメタクリリル－ＣｏＡへの代謝は、３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡヒドロリアーゼ（３ＨＩＢＣＨ）によって相互に起こる（R. J. A. Wanders, at al., J. Inherit. Metab. Dis., vol. 35, no. 1, pp. 5-12, 2012）のに対して、３ＨＩＢＣＨによるメタクリリル－ＣｏＡから（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰ－ＣｏＡへの代謝は比較的活性が弱く、そのため、メタクリリル－ＣｏＡの加水分解物はほとんど（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰ－ＣｏＡとなるためであると考えられる。
【0026】
前記前駆物質は、一般に、細胞に対して毒性が高いために、細胞成長を阻害し、微生物におけるＰＨＡ蓄積を低下させる。このような前駆物質によって誘発される毒性のリスクを排除又は低減するために、上記の量を数回に分けて断続的に添加することが好ましい。また、前駆物質の初回の添加は、実質的な細胞成長が達成された数時間後に培養培地に行うことが好ましい（Furutate S, Kamoi J, Nomura CT et al., NPG Asia Mater 2021; 13: 1-11. DOI: 10.1038/s41427-021-00296-x）。
【0027】
ＰＨＡ重合酵素遺伝子が導入された形質転換体は、宿主中で目的の遺伝子を発現するための広宿主域ベクターに、ＰＨＡ重合酵素遺伝子及び公知のモノマー供給遺伝子を挿入して得られるプラスミドを宿主細胞に導入することによって得られる。
【0028】
ＰＨＡ重合酵素遺伝子としては、例えば、シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）61-3株、シュードモナス・スツッツェリ（Pseudomonas stutzeri）、シュードモナス・エスピー A33、アロクロマティウム・ビノサム（Allochromatium vinosum）、バシルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バシルス・セレウス（Bacillus cereus）、バシルス・エスピー（Bacillus sp.）INT005、ランプロシスティス・ロゼオペルシシナ（Lamprocystis roseopersicina）、ノカルディア・コラリナ（Nocardia corallina）、ロドバクター・シャエロイデス（Rhodobactor shaeroides）、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）、ロドコッカス・エスピー（Rhodococcus sp.）NCIMB 40126、チオカプサ・フェニギー（Thiocapsa pfennigii）、アエロモナス・キャビエ（Aeromonas caviae）、及びアエロモナス・ハイドロフィラ（Aeromonas hydrophila）から選ばれる微生物に由来するものが挙げられる。これらの中で、アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ重合酵素は、３ＨＢとＣ４～Ｃ６の（Ｒ）－３－ヒドロキシアルカン酸とのコポリマーを蓄積する能力を有する点で、特に好ましい。
【0029】
また、ＰＨＡ重合酵素遺伝子としては、上記のＰＨＡ重合酵素の変異体をコードする遺伝子でもよい。かかる変異体は、野生型のＰＨＡ重合酵素のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されてなるアミノ酸配列からなり、かつＰＨＡ重合活性を有するタンパク質である。かかる変異体は、野生型のＰＨＡ重合酵素のアミノ酸配列に対して８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、更に好ましくは９９％以上の配列同一性を有する。かかる変異体を用いることにより、ＰＨＡの生産量が増加する。例えば、本発明に用いられるＰＨＡ重合酵素変異体としては、アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ重合酵素（ＰｈａＣ）のＮ末端から１４９番目のアスパラギンからセリンへの置換、及び／又はＰｈａＣの１７１番目のアスパラギン酸からグリシンへの置換を含む変異体が挙げられ、これら２つの変異を含む二重変異体（ｐｈａＣＡｃＮＳＤＧ）が好ましい。
なお、プレジオモナス・シゲロイデス（Plesiomonas shigelloides）由来のＰＨＡ重合酵素（アクセッション番号：ＷＰ＿１１６５４６９９９）又はその改変体も、アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ重合酵素の変異体と同等に好ましく使用することができる。
なお、プレジオモナス・シゲロイデス（Plesiomonas shigelloides）由来のＰＨＡ重合酵素（アクセッション番号：ＷＰ＿１１６５４６９９９）又はその改変体も、アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ重合酵素の変異体と同等に好ましく使用することができる。
【0030】
更に、ＰＨＡ重合酵素遺伝子の上流には、フェイシン（ｐｈａｓｉｎ）（適宜、「ＰｈａＰ」と表記）と呼ばれるタンパク質をコードする遺伝子が導入される（例えば、特開２０１３－４２６９７号参照）。フェイシンは、細菌の細胞内でＰＨＡ顆粒に共局在することが知られており、ＰＨＡ顆粒の形成、安定化などに関わると考えられている。
【0031】
フェイシンとしては、Ｎ末端から２０番目までのアミノ酸領域において１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されてなるアミノ酸配列を有する変異体も好ましく用いられる。例えば、フェイシンのＮ末端から４番目のアスパラギン酸をアスパラギンに置換してなる変異体が挙げられる（例えば、特開２０１３－４２６９７号参照）。フェイシンの変異体は、同様にＰＨＡの生産性を向上させる。本発明におけるフェイシン遺伝子は、本発明における形質転換微生物の宿主とは異なる生物種由来のフェイシン遺伝子であれば特に限定されない。当該フェイシン遺伝子としては、ラルストニア（Ralstonia）属、カプリアビダス（Cupriavidus）属、ワウテルシア（Woutersia）属、アルカリゲネス（Alcaligenes）属、アエロモナス（Aeromonas）属、シュードモナス（Pseudomonas）属に類する生物に由来するフェイシン遺伝子や、それらの変異体などが挙げられ、好ましくは、アエロモナス属の微生物に由来するフェイシン遺伝子、又はその変異体、より好ましくは、アエロモナス・キャビエ（Aeromonas caviae）に由来するフェイシン遺伝子、又はその変異体である。当該変異体としては、１以上のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入、又は置換されたフェイシンをコードする塩基配列などを用いることができる。かかる変異体は、野生型のフェイシンのアミノ酸配列に対して８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、更に好ましくは９９％以上の配列同一性を有する。
【0032】
宿主中で目的の遺伝子を発現するための広宿主域ベクターとしては、プロモーター、リボゾーム結合部位、遺伝子クローニング部位、ターミネーターなどを有する公知のベクターを用いることができる。例えば、移動能を有するｍｏｂ領域を持つベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２、ｐＪＲＤ２１５、ｐＬＡ２９１７が挙げられる。
【0033】
公知のモノマー供給遺伝子としては、例えば、ラルニトニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）由来のｐｈｂＡ、ｐｈｂＢ、ｐｈａＡ、ｐｈａＢ（Peoples, O. P. and Sinskey, A. J., J. Biol. Chem. 264: 15293-15297 (1989)）、アエロモナス・キャビエ由来のｐｈａＪ（Fukui, T. and Doi, Y., J. Bacteriol. 179: 4821-4830 (1997)）などが挙げられる。
【0034】
本発明で使用される宿主微生物は、糖類や油脂類を炭素源として使用した場合の増殖性が良好で、菌株の安定性が高く、菌体と培養液との分離が比較的容易なものであれば特に制限されないが、例えば、エシュリキア（Escherichia）属、ラルストニア（Ralstonia）属、カプリアビダス（Cupriavidus）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、アエロモナス（Aeromonas）属、アルカリゲネス（Alcaligenes）属、バチルス（Bacillus）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）、セラチア（Serratia）属、又はビブリオ（Vibrio）属の微生物が好ましい。より好ましくは、エシュリキア（Escherichia）属である。エシュリキア属の微生物としは、例えばエシェリキア・コリ（Escherichia coli）である。
【0035】
炭素源としては、例えば、糖類、カルボン酸、油脂類などを用いることができる。糖類としては、グルコース、フルクトース、ガクトース、キシロース、アラビノース、サッカロース、マルトース、でんぷん、でんぷん加水分解物などが挙げられる。カルボン酸としては、酢酸、乳酸などが挙げられる。油脂類としては、植物油が好ましく、例えば大豆油、コーン油、綿実油、落花生油、ヤシ油、パーム油、パーム核油、又はこられの分別油、例えばパームＷオレイン油（パーム油を２回無溶媒分別した低沸点画分）、パーム核油オレイン（パーム核油を１回無溶媒分別した低沸点画分）、又はこれらの油脂やその画分を化学的もしくは生化学的に処理した合成油、あるいはこれらの混合油が挙げられる。
【0036】
炭素源としてグルコースを用いる場合、グルコースの高い濃度は、イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって誘導されるＰＨＡ生合成遺伝子の異化抑制を引き起こす可能性があるため（Furutate S, Kamoi J, Nomura CT et al., NPG Asia Mater 2021; 13 : 1-11. DOI: 10.1038/s41427-021-00296-x）、グルコース濃度は細胞成長のみを促進するために最小限に維持することが好ましい。例えば、グルコースの添加量は、約１～約２０ｇ／Ｌの範囲が好ましい。また、細胞に対する予期せぬ影響を除くか又はより少なくするために、これらの量を数回に分けて断続的に添加することが好ましい。
【0037】
前記製造方法１では、例えば、０．１～０．８ｇ／Ｌの（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰ又は（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰに対して、グルコースの添加量は約１６～約２０ｇ／Ｌの範囲が好ましい。前記製造方法１－１では、例えば、０．９～２．０ｇ／Ｌの（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰ又は（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰに対して、グルコースの添加量は約１０～約１５ｇ／Ｌの範囲が好ましい。前記製造方法２では、例えば、２．１～７．０ｇ／Ｌの（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰ又は（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰに対して、グルコースの添加量は約３～約９ｇ／Ｌの範囲が好ましい。
【0038】
培養温度は、菌の生育可能な温度、好ましくは１５～４０℃、特に好ましくは２０～４０℃、更に好ましくは２８～３４℃である。培養時間は、特に限定されないが、例えばバッチ培養では１～７日間が好ましく、また連続培養も可能である。培養培地は、本発明の宿主が利用できるものである限り特に限定されない。炭素源に加えて、窒素源、無機塩類、その他の有機栄養源などを含有する培地を使用することができる。
窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸水素二アンモニウムなどのアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、酵母エキスなどが挙げられる。
窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸水素二アンモニウムなどのアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、酵母エキスなどが挙げられる。
【0039】
無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸水素マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウムなどが挙げられる。
その他の有機栄養源としては、例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリンなどのアミノ酸類；ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビオチン、ニコチン酸アミド、パントテン酸、ビタミンＣなどのビタミン類などが挙げられる。
その他の有機栄養源としては、例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリンなどのアミノ酸類；ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビオチン、ニコチン酸アミド、パントテン酸、ビタミンＣなどのビタミン類などが挙げられる。
【0040】
本発明のＰＨＡの菌体からの回収は、例えば、次の方法によって行うことができる。培養終了後、遠心分離器などで培養液から菌体を分離し、その菌体を蒸留水、メタノールなどにより洗浄した後、乾燥させた後、この乾燥菌体から、クロロホルムなどの有機溶媒を用いてポリマーを抽出する。次いで、このポリマーを含む有機溶媒溶液から、濾過などによって菌体成分を除去し、その濾液にメタノール、へキサンなどの貧溶媒を加えてポリマーを沈殿させる。沈殿した共重合体から、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させ、ポリマーを回収することができる。得られたポリマーの分析は、例えば、ガスクロマトグラフ法、核磁気共鳴法などにより行うことができる。
【0041】
本発明の第２の実施形態は、３ＨＢ単位と（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰ単位とからなるコポリマーＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｈ２ＭＰ）、又は３ＨＢ単位と（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰ単位とからなるコポリマー（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｈ２ＭＰ）である。当該コポリマーは、例えば前記製造方法１によって製造され、３ＨＢ単位に富む。各コポリマー中の、（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰ単位の分率又は（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰ単位の分率は約８モル％以下である。また、各ポリマーは１００％ｅｅの光学純度を有する。また、３ＨＢ単位と（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰ単位とからなるコポリマーＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｈ２ＭＰ）は、例えば前記製造方法１－１によっても製造することができる。
製造方法１、１－１で得られたポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）は、例えば、１×１０５～１０×１０５程度、使用目的によっては１×１０５～８×１０５程度である。
製造方法１、１－１で得られたポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）は、例えば、１×１０５～１０×１０５程度、使用目的によっては１×１０５～８×１０５程度である。
【0042】
本発明の第３の実施形態は、（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰ単位のホモポリマーである。当該ホモポリマーは光学純度が９９％ｅｅ以上であり、実質的に（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰ単位を含まない。また、高度なメソダイアド構造、又はアイソタクチック構造を有する。そのため、顕著な結晶挙動を示し、高い降伏強度を有する。
製造方法２で得られたポリマーの数平均分子量は、例えば、例えば、１×１０５～１０×１０５程度、使用目的によっては１×１０５～８×１０５程度である。
製造方法２で得られたポリマーの数平均分子量は、例えば、例えば、１×１０５～１０×１０５程度、使用目的によっては１×１０５～８×１０５程度である。
【0043】
本発明の第５の実施形態は、（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰと（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰとの混合物を前駆物質として得られる、コポリマーＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｈ２ＭＰ）、又はホモポリマーＰ（３Ｈ２ＭＰ）である。
前駆物質としての（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰと（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰとの混合物中の、エナンチオマー比は特に限定されないが、例えば、（Ｓ）－エナンチオマーとＲ－エナンチオマーとの比は、約１：９～約９：１、約２：８～約８：２、約３：７～約７：３、又は、約４：６～約６：４の範囲である。
前記混合物を前駆物質として得られるコポリマーＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｈ２ＭＰ）としては、例えば、３Ｈ２ＭＰ単位を約５～約３７％の分率で含むコポリマーである。当該コポリマーでは、３Ｈ２ＭＰの（Ｓ）－エナンチオマーが過剰であり、そのエナンチオマー過剰率は、例えば、約１４～約４０％ｅｅ、好ましくは約２０～約４０％ｅｅ、好ましくは約２５～約４０％ｅｅ、好ましくは約３０～約４０％ｅｅ、より好ましくは約３０～約３６％ｅｅである。かかるコポリマーＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｈ２ＭＰ）の一例である、後記実施例に示す試料「１－Ｒａｃ」及び試料「１－Ｒａｃ－１」は、ポリマー構造中により多くの非晶質領域を有するため、結晶化度が低い。そのため、高い展延性及び破断伸びを示す。
また、（Ｓ）－エナンチオマーが過剰で、そのエナンチオマー過剰率が上記の約１４～約４０％ｅｅの範囲であれば、得られたコポリマーは、ポリマー全体として多くの非晶質領域を有するため、結晶化度が低くなり、高い展延性及び破断伸びを示す蓋然性が高いと考えられる。
なお、かかるコポリマーＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｈ２ＭＰ）は、製造方法１で合成することができる。
前駆物質としての（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰと（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰとの混合物中の、エナンチオマー比は特に限定されないが、例えば、（Ｓ）－エナンチオマーとＲ－エナンチオマーとの比は、約１：９～約９：１、約２：８～約８：２、約３：７～約７：３、又は、約４：６～約６：４の範囲である。
前記混合物を前駆物質として得られるコポリマーＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｈ２ＭＰ）としては、例えば、３Ｈ２ＭＰ単位を約５～約３７％の分率で含むコポリマーである。当該コポリマーでは、３Ｈ２ＭＰの（Ｓ）－エナンチオマーが過剰であり、そのエナンチオマー過剰率は、例えば、約１４～約４０％ｅｅ、好ましくは約２０～約４０％ｅｅ、好ましくは約２５～約４０％ｅｅ、好ましくは約３０～約４０％ｅｅ、より好ましくは約３０～約３６％ｅｅである。かかるコポリマーＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｈ２ＭＰ）の一例である、後記実施例に示す試料「１－Ｒａｃ」及び試料「１－Ｒａｃ－１」は、ポリマー構造中により多くの非晶質領域を有するため、結晶化度が低い。そのため、高い展延性及び破断伸びを示す。
また、（Ｓ）－エナンチオマーが過剰で、そのエナンチオマー過剰率が上記の約１４～約４０％ｅｅの範囲であれば、得られたコポリマーは、ポリマー全体として多くの非晶質領域を有するため、結晶化度が低くなり、高い展延性及び破断伸びを示す蓋然性が高いと考えられる。
なお、かかるコポリマーＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｈ２ＭＰ）は、製造方法１で合成することができる。
【0044】
前記混合物を前駆物質として得られるホモポリマーＰ（３Ｈ２ＭＰ）としては、例えば、３Ｈ２ＭＰの（Ｓ）－エナンチオマーが過剰であるホモポリマーである。そのエナンチオマー過剰率は、約２０～約６６％ｅｅ、好ましくは約３０～約６６％ｅｅ、好ましくは約３５～約６６％ｅｅ、好ましくは約４０～約６６％ｅｅ、好ましくは約４５～約６６％ｅｅ、好ましくは約５０～約６６％ｅｅ、好ましくは約５５～約６６％ｅｅ、より好ましくは約６０～約６６％ｅｅである。かかるホモポリマーＰ（３Ｈ２ＭＰ）の一例である、後記実施例に示す試料「３－Ｒａｃ」は、アイソタクチックに富む構造を有するものの、高度なアイソタクチック構造を有するキラルホモポリマーＰ（３Ｈ２ＭＰ）（例えば、試料「３－Ｓ」）と比べて低い結晶挙動を有するため、高い展延性及び破断伸びを有する。特に、試料「３－Ｓ」と比べて約２倍の破断伸びを示す。また、試料「３－Ｒａｃ」は、試料「３－Ｓ」と共に、低ガラス転移温度かつ高熱安定性を有し、このことは、タクチシティの制御と共に、ホモポリマーＰ（３Ｈ２ＭＰ）の広い加工領域を期待させる。
また、（Ｓ）－エナンチオマーが過剰で、そのエナンチオマー過剰率が上記の約２０～約６６％ｅｅの範囲であれば、得られたホモポリマーは、ポリマー全体として多くの非晶質領域を有するため、結晶化度が低くなり、高い展延性及び破断伸びを示す蓋然性が高いと考えられる。
なお、かかるホモポリマーＰ（３Ｈ２ＭＰ）は、製造方法２で合成することができる。
また、（Ｓ）－エナンチオマーが過剰で、そのエナンチオマー過剰率が上記の約２０～約６６％ｅｅの範囲であれば、得られたホモポリマーは、ポリマー全体として多くの非晶質領域を有するため、結晶化度が低くなり、高い展延性及び破断伸びを示す蓋然性が高いと考えられる。
なお、かかるホモポリマーＰ（３Ｈ２ＭＰ）は、製造方法２で合成することができる。
【0045】
本発明の第６の実施形態は、第２の実施形態～第５の実施形態で得られたコポリマー又はホモポリマーを含む組成物である。本発明の組成物は、添加剤として、例えば酸化防止剤、紫外線吸収剤、染料・顔料などの着色剤、可塑剤、滑剤、無機充填剤、帯電防止剤、防カビ剤、抗菌剤、発泡剤、難燃剤等を必要に応じて含有することができる。また、本発明の第６の実施形態は、第２の実施形態～第５の実施形態で得られたコポリマー又はホモポリマーを含むプラスチック材料である。第２の実施形態～第５の実施形態で得られたコポリマー又はホモポリマーは、比較的硬質から軟質までの幅広い硬度を有するバイオプラスチックであり、各種容器、包装材、農園芸用のフィルム、医療材料などに用いることができる。
【0046】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【実施例0047】
［材料及び調製方法］
（１）前駆物質
３ｇのメチル（Ｒ）－（－）－３－ヒドロキシ－２－プロピオン酸（メチル（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰ）及びメチル（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－プロピオン酸（メチル（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰ）（東京化成工業株式会社）を１５ｍＬのメタノールに溶解し、氷浴中の当該メタノール溶液に２ｍｏｌ当量のＮａＯＨを加えた。次いで、当該溶液を撹拌し、白色粉末様の３－ヒドロキシ－２－プロピオン酸ナトリウム塩が沈殿するまで４０℃の水浴中で加熱し、次いで室温で乾燥させた。使用時に、当該乾燥粉末を逆浸透膜でろ過した水（ＲＯ水）に溶解し、溶液のｐＨを１ｍｏｌ／ＬのＨＣｌで７～７．４に調整した。等量の（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰナトリウム塩及び（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰナトリウム塩を、ラセミ３Ｈ２ＭＰ前駆物質のために混合した。
（１）前駆物質
３ｇのメチル（Ｒ）－（－）－３－ヒドロキシ－２－プロピオン酸（メチル（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰ）及びメチル（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－プロピオン酸（メチル（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰ）（東京化成工業株式会社）を１５ｍＬのメタノールに溶解し、氷浴中の当該メタノール溶液に２ｍｏｌ当量のＮａＯＨを加えた。次いで、当該溶液を撹拌し、白色粉末様の３－ヒドロキシ－２－プロピオン酸ナトリウム塩が沈殿するまで４０℃の水浴中で加熱し、次いで室温で乾燥させた。使用時に、当該乾燥粉末を逆浸透膜でろ過した水（ＲＯ水）に溶解し、溶液のｐＨを１ｍｏｌ／ＬのＨＣｌで７～７．４に調整した。等量の（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰナトリウム塩及び（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰナトリウム塩を、ラセミ３Ｈ２ＭＰ前駆物質のために混合した。
【0048】
（２）細菌株
ＰＨＡの生合成における反復単位のより高い制御を可能にする、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＳＢＪ（E. coli LS5218のfadB fadJノックアウト変異株［fadR601, atoC(Con)］（Tappel RC, Wang Q, Nomura CT, J Biosci Bioeng 2012; 113 :480-6. DOI: 10.1016/j.jbiosc.2011.12.004））をＰＨＡ生合成のための宿主として使用した。
ＰＨＡの生合成における反復単位のより高い制御を可能にする、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＳＢＪ（E. coli LS5218のfadB fadJノックアウト変異株［fadR601, atoC(Con)］（Tappel RC, Wang Q, Nomura CT, J Biosci Bioeng 2012; 113 :480-6. DOI: 10.1016/j.jbiosc.2011.12.004））をＰＨＡ生合成のための宿主として使用した。
【0049】
（３）プラスミド
コポリマーＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｈ２ＭＰ）製造のために、プラスミドｐＢＢＲ１Ｐ（Ｄ４Ｎ）ＣＪＡｃＡＢＲｅＮＳＤＧ及びプラスミドｐＴＴＱ１９－ＰＣＴを使用した。また、ホモポリマーＰ（３Ｈ２ＭＰ）製造のために、プラスミドｐＢＢＲ１Ｐ（Ｄ４Ｎ）ＣＡｃＮＳＤＧ及びプラスミドｐＴＴＱ１９－ＰＣＴを使用した。
（ａ）ｐＢＢＲ１Ｐ（Ｄ４Ｎ）ＣＪＡｃＡＢＲｅＮＳＤＧ
ｐＢＢＲ１Ｐ（Ｄ４Ｎ）ＣＪＡｃＡＢＲｅＮＳＤＧは、広宿主範囲プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２（Kovach ME, Elzer PH, Hill DS et al., Gene 1995; 166: 175-6. DOI: 10.1016/0378-1119(95)00584-1）に、ｐｈａＰＣＪオペロンの発現後に高いＰＨＡ収量を与えるアエロモナス・キャビエ（A. caviae）由来のＤ４Ｎ点変異を有するＰＨＡ顆粒結合タンパク質遺伝子（ｐｈａＰＡｃ）；Ｐ（３ＨＢ）型コポリマーにおけるコモノマー単位の取り込みを強化するためのＮ１４９Ｓ及びＤ１７１Ｇ点変異を有するＰＨＡ重合酵素遺伝子（ｐｈａＣＡｃＮＳＤＧ）；（Ｒ）特異的エノイル-ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子（ｐｈａＪＡｃ）；並びにラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）Ｈ１６由来の３－ケトチオラーゼ遺伝子（ｐｈａＡＲｅ）及びラルストニア・ユートロファＨ１６由来のアセトアセチル－ＣｏＡレダクターゼ遺伝子（ｐｈａＢＲｅ）を導入して作製した。ｐｈａＰには４位のアスパラギン酸（Ｄ）がアスパラギン（Ｎ）に、ｐｈａＣには１４９位のアスパラギン（Ｎ）がセリン（Ｓ）に、１７１位のアスパラギン酸（Ｄ）がグリシン（Ｇ）に変異している（Ushimaru et al., J. Gen. Appl. Microbiol. 2015, 61, 63）
（ｂ）ｐＴＴＱ１９－ＰＣＴ
ｐｃｔ遺伝子を含むＮｈｅ Ｉ－Ｍｕｎ Ｉ断片を、ＰＣＲ法によってｐＴＶｐｃｔＣ１ＳＴＱＫＡＢＲｅから増幅し、次いで、当該断片をｐＴＴＱ１９のＸｂａ Ｉ－ＥｃｏＲ Ｉ部位に挿入することによって、ｐＴＴＱ１９－ＰＣＴを作製した（Furutate et al., J. Polym. Res. 2017, 24: 221）。当該ｐＴＴＱ１９－ＰＣＴは、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉ由来のプロピオン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（ｐｃｔ）遺伝子を有している（同文献）。
（ｃ）ｐＢＢＲ１Ｐ（Ｄ４Ｎ）ＣＡｃＮＳＤＧ
ｐＢＢＲ１Ｐ（Ｄ４Ｎ）ＣＪＡｃＡＢＲｅＳＤＧ（Saika et al., J. Biosci. Bioeng. 2014, 117, 670）のｐｈａＪ及びｐｈａＡＢを含まない領域をＰＣＲ法により増幅し、７ｋｂの増幅断片を平滑末端化及びリン酸化し、自己環状化させることでｐＢＢＲ１Ｐ（Ｄ４Ｎ）ＣＡｃＮＳＤＧを作製した。
コポリマーＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｈ２ＭＰ）製造のために、プラスミドｐＢＢＲ１Ｐ（Ｄ４Ｎ）ＣＪＡｃＡＢＲｅＮＳＤＧ及びプラスミドｐＴＴＱ１９－ＰＣＴを使用した。また、ホモポリマーＰ（３Ｈ２ＭＰ）製造のために、プラスミドｐＢＢＲ１Ｐ（Ｄ４Ｎ）ＣＡｃＮＳＤＧ及びプラスミドｐＴＴＱ１９－ＰＣＴを使用した。
（ａ）ｐＢＢＲ１Ｐ（Ｄ４Ｎ）ＣＪＡｃＡＢＲｅＮＳＤＧ
ｐＢＢＲ１Ｐ（Ｄ４Ｎ）ＣＪＡｃＡＢＲｅＮＳＤＧは、広宿主範囲プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２（Kovach ME, Elzer PH, Hill DS et al., Gene 1995; 166: 175-6. DOI: 10.1016/0378-1119(95)00584-1）に、ｐｈａＰＣＪオペロンの発現後に高いＰＨＡ収量を与えるアエロモナス・キャビエ（A. caviae）由来のＤ４Ｎ点変異を有するＰＨＡ顆粒結合タンパク質遺伝子（ｐｈａＰＡｃ）；Ｐ（３ＨＢ）型コポリマーにおけるコモノマー単位の取り込みを強化するためのＮ１４９Ｓ及びＤ１７１Ｇ点変異を有するＰＨＡ重合酵素遺伝子（ｐｈａＣＡｃＮＳＤＧ）；（Ｒ）特異的エノイル-ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子（ｐｈａＪＡｃ）；並びにラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）Ｈ１６由来の３－ケトチオラーゼ遺伝子（ｐｈａＡＲｅ）及びラルストニア・ユートロファＨ１６由来のアセトアセチル－ＣｏＡレダクターゼ遺伝子（ｐｈａＢＲｅ）を導入して作製した。ｐｈａＰには４位のアスパラギン酸（Ｄ）がアスパラギン（Ｎ）に、ｐｈａＣには１４９位のアスパラギン（Ｎ）がセリン（Ｓ）に、１７１位のアスパラギン酸（Ｄ）がグリシン（Ｇ）に変異している（Ushimaru et al., J. Gen. Appl. Microbiol. 2015, 61, 63）
（ｂ）ｐＴＴＱ１９－ＰＣＴ
ｐｃｔ遺伝子を含むＮｈｅ Ｉ－Ｍｕｎ Ｉ断片を、ＰＣＲ法によってｐＴＶｐｃｔＣ１ＳＴＱＫＡＢＲｅから増幅し、次いで、当該断片をｐＴＴＱ１９のＸｂａ Ｉ－ＥｃｏＲ Ｉ部位に挿入することによって、ｐＴＴＱ１９－ＰＣＴを作製した（Furutate et al., J. Polym. Res. 2017, 24: 221）。当該ｐＴＴＱ１９－ＰＣＴは、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉ由来のプロピオン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（ｐｃｔ）遺伝子を有している（同文献）。
（ｃ）ｐＢＢＲ１Ｐ（Ｄ４Ｎ）ＣＡｃＮＳＤＧ
ｐＢＢＲ１Ｐ（Ｄ４Ｎ）ＣＪＡｃＡＢＲｅＳＤＧ（Saika et al., J. Biosci. Bioeng. 2014, 117, 670）のｐｈａＪ及びｐｈａＡＢを含まない領域をＰＣＲ法により増幅し、７ｋｂの増幅断片を平滑末端化及びリン酸化し、自己環状化させることでｐＢＢＲ１Ｐ（Ｄ４Ｎ）ＣＡｃＮＳＤＧを作製した。
【0050】
（４）培養条件
組換えＥ．ｃｏｌｉ ＬＳＢＪを、２０ｍＬのＬｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地（Ｂａｃｔｏ ｔｒｙｐｔｏｎ（Difco Laboratories, Detroit, MI, USA）１０ｇ、酵母エキス（Difco Laboratories）５ｇ、ＮａＣｌ １０ｇを脱イオン水１Ｌに溶かして、１２１℃で２０分間オートクレーブして調製した。抗生物質（カナマイシン：終濃度５０μｇ／ｍＬ、及びカルベニシリン：終濃度５０μｇ／ｍＬを含む。）で、３０℃で１８時間インキュベートし、種培養物を得た。
組換えＥ．ｃｏｌｉ ＬＳＢＪを、２０ｍＬのＬｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地（Ｂａｃｔｏ ｔｒｙｐｔｏｎ（Difco Laboratories, Detroit, MI, USA）１０ｇ、酵母エキス（Difco Laboratories）５ｇ、ＮａＣｌ １０ｇを脱イオン水１Ｌに溶かして、１２１℃で２０分間オートクレーブして調製した。抗生物質（カナマイシン：終濃度５０μｇ／ｍＬ、及びカルベニシリン：終濃度５０μｇ／ｍＬを含む。）で、３０℃で１８時間インキュベートし、種培養物を得た。
【0051】
（i）Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｈ２ＭＰ）製造
５００ｍＬの振盪フラスコ中の１００ｍＬ（終体積）のＭ９改変培地（Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ １７．１ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ３ｇ、ＮａＣｌ ０．５ｇ、１Ｍ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２ｍＬ、１Ｍ ＣａＣｌ２ ０．１ｍＬ、２．５ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏ－ｙｅａｓｔエキスを脱イオン水１Ｌに溶かして、１２１℃で２０分間オートクレーブして調製した）に、カナマイシン５０ｍｇ／Ｌ及びカルベニシリン５０ｍｇ／Ｌを添加し、１ｍＬの種培養物を加えた。ここに、２０ｇ／Ｌグルコース及び０．５ｇ／Ｌ又は１ｇ／Ｌの３Ｈ２ＭＰを添加し、１ｍＭイソプロピルΒ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加してＰＨＡ生合成遺伝子の発現を誘導した。培養は１３０ｒｐｍ、３０℃で７２時間行った。全試料を３回培養した。
（ii）Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｈ２ＭＰ）製造
５００ｍＬの振盪フラスコ中の１００ｍＬ（終体積）のＭ９改変培地に、カナマイシン５０ｍｇ／Ｌ及びカルベニシリン５０ｍｇ／Ｌを添加し、５ｍＬの種培養物を加えた。４時間の培養後、１ｍＭイソプロピルΒ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加した。ここに、５ｇ／Ｌグルコース及び０．０３ｇ／Ｌの（Ｒ）－３ＨＢ及び０．４ｇ／Ｌの３Ｈ２ＭＰを４、２８及び５２時間で添加した。
（iii）Ｐ（３Ｈ２ＭＰ）製造
１．２５ｇ／Ｌのグルコース及び２ｇ／Ｌの３Ｈ２ＭＰ前駆物質を４、２８及び５２時間で添加した。振盪フラスコ培養は、１３０ｒｐｍ、３０℃で７６時間行った。全試料を３回培養した。
５００ｍＬの振盪フラスコ中の１００ｍＬ（終体積）のＭ９改変培地（Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ １７．１ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ３ｇ、ＮａＣｌ ０．５ｇ、１Ｍ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２ｍＬ、１Ｍ ＣａＣｌ２ ０．１ｍＬ、２．５ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏ－ｙｅａｓｔエキスを脱イオン水１Ｌに溶かして、１２１℃で２０分間オートクレーブして調製した）に、カナマイシン５０ｍｇ／Ｌ及びカルベニシリン５０ｍｇ／Ｌを添加し、１ｍＬの種培養物を加えた。ここに、２０ｇ／Ｌグルコース及び０．５ｇ／Ｌ又は１ｇ／Ｌの３Ｈ２ＭＰを添加し、１ｍＭイソプロピルΒ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加してＰＨＡ生合成遺伝子の発現を誘導した。培養は１３０ｒｐｍ、３０℃で７２時間行った。全試料を３回培養した。
（ii）Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｈ２ＭＰ）製造
５００ｍＬの振盪フラスコ中の１００ｍＬ（終体積）のＭ９改変培地に、カナマイシン５０ｍｇ／Ｌ及びカルベニシリン５０ｍｇ／Ｌを添加し、５ｍＬの種培養物を加えた。４時間の培養後、１ｍＭイソプロピルΒ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加した。ここに、５ｇ／Ｌグルコース及び０．０３ｇ／Ｌの（Ｒ）－３ＨＢ及び０．４ｇ／Ｌの３Ｈ２ＭＰを４、２８及び５２時間で添加した。
（iii）Ｐ（３Ｈ２ＭＰ）製造
１．２５ｇ／Ｌのグルコース及び２ｇ／Ｌの３Ｈ２ＭＰ前駆物質を４、２８及び５２時間で添加した。振盪フラスコ培養は、１３０ｒｐｍ、３０℃で７６時間行った。全試料を３回培養した。
【0052】
超音波抽出法によって、乾燥細胞重量及びポリマー含有量を決定した（H. Arikawa, et al., J. Biosci. Bioeng., vol. 124, no. 2, pp. 250-254, 2017）。１０ｍＬの培養物を２本の５０ｍＬファルコンチューブに別々に添加し、チューブ及び培養物の重量を測定した。このチューブに３０ｍＬのメタノールを添加し、培地残渣を除去し、高速冷凍マイクロ遠心分離機（MX-307，東京セイコーインスツルメンツ社）を使用して、９０００ｒｐｍ（７３００相対遠心力（ＲＣＦ））で５分間遠心分離した。細胞ペレットを１０ｍＬのＲＯ水及び３０ｍＬのメタノールに再懸濁し、凍結乾燥前に更に２回遠心分離した。ポリマー含有チューブに３０ｍＬのメタノールを加え、９０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。細胞ペレットを２０ｍＬのＲＯ水及び１０ｍＬの１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）に再懸濁した。得られた溶液を出力レベル４（１５Ｗ）で４分間連続的に超音波処理し、９０００ｒｐｍ（７３００ＲＣＦ）で５分間遠心分離した。次いで、細胞ペレットを１０ｍＬのメタノールに再懸濁し、ボルテックスして細胞を完全に破壊した。この工程を２回繰り返した後、９０００ｒｐｍ（７３００ＲＣＦ）で５分間遠心分離し、７２時間凍結乾燥した。
【0053】
［ＰＨＡ抽出及びＰＨＡキャストフィルムの調製］
クロロホルム（１ｍｇのＰＨＡに対して、２ｍｌのクロロホルム）を用いて、室温で３日間、凍結乾燥した細胞からＰＨＡを抽出した。細胞残渣を濾過し、得られたポリマー溶液を冷ヘキサン中での再沈殿により精製した。次いで、ポリマーをＮｏ．１濾紙（アドバンテック社製）によって回収した。
クロロホルム（１ｍｇのＰＨＡに対して、２ｍｌのクロロホルム）を用いて、室温で３日間、凍結乾燥した細胞からＰＨＡを抽出した。細胞残渣を濾過し、得られたポリマー溶液を冷ヘキサン中での再沈殿により精製した。次いで、ポリマーをＮｏ．１濾紙（アドバンテック社製）によって回収した。
【0054】
すべてのＰＨＡキャストフィルムを材料特性分析のために調製した。約２００ｍｇの精製ＰＨＡをある量のクロロホルムに溶解し、０．４５μｍポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）フィルターで濾過した。次いで，溶液をペルフルオロアルコキシアルカン（ＰＦＡ）ペトリ皿に添加し、溶媒が完全に蒸発するまでドラフトチャンバー中で蒸発させた後、室温で４週間エージングした。
【0055】
［ＰＨＡの構造及び物性の分析法］
（１）核磁気共鳴（ＮＭＲ）
約１０～１５ｍｇの精製されたＰＨＡ試料を１ｍＬの重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ３）に溶解し、測定試料とした。核磁気共鳴分光装置（BioSpin Avance III 400A（Bruker）及びBioSpin Avance III HD 500）を使用した。ＰＨＡのタクチシティ研究のため、５００ＭＨｚ １３Ｃ－ＮＭＲ分光分析を行った。
なお、ＰＨＡのモノマー組成は、ＮＭＲスぺクトルにおけるメチン領域のピーク面積間の比を計算することによって決定した。
（１）核磁気共鳴（ＮＭＲ）
約１０～１５ｍｇの精製されたＰＨＡ試料を１ｍＬの重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ３）に溶解し、測定試料とした。核磁気共鳴分光装置（BioSpin Avance III 400A（Bruker）及びBioSpin Avance III HD 500）を使用した。ＰＨＡのタクチシティ研究のため、５００ＭＨｚ １３Ｃ－ＮＭＲ分光分析を行った。
なお、ＰＨＡのモノマー組成は、ＮＭＲスぺクトルにおけるメチン領域のピーク面積間の比を計算することによって決定した。
【0056】
（２）ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）
ＰＨＡ試料の絶対キラル構成分析は、ガスクロマトグラフ（GC-MS, QC2010, 株式会社島津製作所）を用いて行った。β－ＤＥＸ １２０カラム（溶融シリカキャピラリーカラム；長さ３０ｍ；内径０．２５ｍｍ；膜厚０．２５μｍ；Supelco）を、別々のキラルモノマーに適用した。温度プログラムは、８５℃で１５分間の恒温オーブン温度から始まり、１０℃／分の加熱速度で２００℃まで温度を上昇させ、最後に２００℃で５分間保持してカラム内の化学物質残存物を除去した。メチル（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰ及びメチル（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰを標準として用い、２～３ｍｇのＰＨＡ試料を１５％（ｖ／ｖ）硫酸／メタノール中、１００℃で８時間メタノール化した。
ＰＨＡ試料の絶対キラル構成分析は、ガスクロマトグラフ（GC-MS, QC2010, 株式会社島津製作所）を用いて行った。β－ＤＥＸ １２０カラム（溶融シリカキャピラリーカラム；長さ３０ｍ；内径０．２５ｍｍ；膜厚０．２５μｍ；Supelco）を、別々のキラルモノマーに適用した。温度プログラムは、８５℃で１５分間の恒温オーブン温度から始まり、１０℃／分の加熱速度で２００℃まで温度を上昇させ、最後に２００℃で５分間保持してカラム内の化学物質残存物を除去した。メチル（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰ及びメチル（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰを標準として用い、２～３ｍｇのＰＨＡ試料を１５％（ｖ／ｖ）硫酸／メタノール中、１００℃で８時間メタノール化した。
【0057】
エナンチオマー分率は、ｍ／ｚ８８でのＭＳ分光法における各エナンチオマーのピーク面積を計算することによって決定した。また、エナンチオマー過剰率（ｅｅ）は下記式に従って計算した。
【0058】
【数1】
【0059】
（式中、Ｆｒは（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰのモル分率を、Ｆｓは（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰのモル分率をそれぞれ表し；Ｆｒ＋Ｆｓ＝１である。）
【0060】
（３）示差走査熱量（ＤＳＣ）
融解及び結晶化挙動は、ヘリウム雰囲気下で示差走査熱量測定（ＤＳＣ）８５００（Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA）を用いて分析した。約５～１０ｍｇのＰＨＡ試料を秤量し、アルミパンに密封した。温度プログラムは、－５０℃で２分間保持した後、２０℃／分の加熱速度で２００℃に昇温（第１加熱工程）、２００℃で１分間保持、５００℃／分の冷却速度で－５０℃に急激に低下、－５０℃で１分間保持、２０℃／分の加熱速度で２００℃に昇温（第２加熱工程）した。最初の融解温度（Ｔｍ）及び融解エンタルピー（ΔＨｍ）を第１の加熱工程から決定し、ガラス転移温度（Ｔｇ）及び低温結晶化温度（Ｔｃｃ）を第２の加熱工程から決定した。
融解及び結晶化挙動は、ヘリウム雰囲気下で示差走査熱量測定（ＤＳＣ）８５００（Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA）を用いて分析した。約５～１０ｍｇのＰＨＡ試料を秤量し、アルミパンに密封した。温度プログラムは、－５０℃で２分間保持した後、２０℃／分の加熱速度で２００℃に昇温（第１加熱工程）、２００℃で１分間保持、５００℃／分の冷却速度で－５０℃に急激に低下、－５０℃で１分間保持、２０℃／分の加熱速度で２００℃に昇温（第２加熱工程）した。最初の融解温度（Ｔｍ）及び融解エンタルピー（ΔＨｍ）を第１の加熱工程から決定し、ガラス転移温度（Ｔｇ）及び低温結晶化温度（Ｔｃｃ）を第２の加熱工程から決定した。
【0061】
（４）ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）
菌体から精製したポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）及び分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）（Ｍｗ：重量平均分子量）を求めた。標準物質としてポリスチレンを使用しているため、本発明で求めた分子量はポリスチレン換算分子量である。用いた５種類のポリスチレンの分子量は、３，７９０、３０，３００、２１９，０００、７５６，０００及び４，２３０，０００である。
ＧＰＣ試料は、約２～３ｍｇの精製ポリマーを５ｍＬバイアルに秤量し，１ｍｇ／ｍＬとなるようにクロロホルムに溶解し、孔径０．４５μｍのＭｉｌｌｅｘ－ＦＨ ＰＶＤＦフィルター（ミリポア社製）を取り付けたシリンジでろ過して調製した。
ＧＰＣ測定には、島津製作所製のＳｈｉｍａｄｚｕ １０Ａ ＧＰＣシステムを使用し、カラムにはＳｈｏｄｅｘ社製のＫ－８０６Ｍ及びＫ－８０２を用いた。移動層にはクロロホルムを用い、総液流量は０．８ｍＬ／分、カラム温度は４０℃に設定し、試料注入量は５０μＬとした。データの解析にはＣＬＡＳＳ－ＶＰ用ＧＰＣ（株式会社島津製作所）を用いた。ポリスチレンスタンダードから検量線を引き、これと試料データとを照合することによりポリスチレン換算分子量及び分子量分布を算出した。
菌体から精製したポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）及び分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）（Ｍｗ：重量平均分子量）を求めた。標準物質としてポリスチレンを使用しているため、本発明で求めた分子量はポリスチレン換算分子量である。用いた５種類のポリスチレンの分子量は、３，７９０、３０，３００、２１９，０００、７５６，０００及び４，２３０，０００である。
ＧＰＣ試料は、約２～３ｍｇの精製ポリマーを５ｍＬバイアルに秤量し，１ｍｇ／ｍＬとなるようにクロロホルムに溶解し、孔径０．４５μｍのＭｉｌｌｅｘ－ＦＨ ＰＶＤＦフィルター（ミリポア社製）を取り付けたシリンジでろ過して調製した。
ＧＰＣ測定には、島津製作所製のＳｈｉｍａｄｚｕ １０Ａ ＧＰＣシステムを使用し、カラムにはＳｈｏｄｅｘ社製のＫ－８０６Ｍ及びＫ－８０２を用いた。移動層にはクロロホルムを用い、総液流量は０．８ｍＬ／分、カラム温度は４０℃に設定し、試料注入量は５０μＬとした。データの解析にはＣＬＡＳＳ－ＶＰ用ＧＰＣ（株式会社島津製作所）を用いた。ポリスチレンスタンダードから検量線を引き、これと試料データとを照合することによりポリスチレン換算分子量及び分子量分布を算出した。
【0062】
（５）熱重量分析－示差熱分析（ＴＧ－ＤＴＡ）
ＰＨＡ試料の熱安定性はＴＧ－ＤＴＡ（DTG-60，株式会社島津製作所）を用いて分析した。約８～１０ｍｇのＰＨＡ試料を窒素雰囲気下で、温度プログラムは室温から開始し、１０℃／分の加熱速度で５００℃まで上昇させた。
ＰＨＡ試料の熱安定性はＴＧ－ＤＴＡ（DTG-60，株式会社島津製作所）を用いて分析した。約８～１０ｍｇのＰＨＡ試料を窒素雰囲気下で、温度プログラムは室温から開始し、１０℃／分の加熱速度で５００℃まで上昇させた。
【0063】
（６）引張試験
ＰＨＡ試料の機械的性質は緊張試験機（EZ-S 500N，株式会社島津製作所）によって解析した。ダンベル形状のＰＨＡ試料を、スーパーダンベルカッター（SDMP-1000, ISO 37-4/ISO 527-2-5B）を用いて約０．１ｍｍの膜厚で切断した。引張り速度は５ｍｍ／分であった。引張強度、降伏強度、ヤング率及び破断伸びは、試験結果の応力－歪み曲線から決定した。
ＰＨＡ試料の機械的性質は緊張試験機（EZ-S 500N，株式会社島津製作所）によって解析した。ダンベル形状のＰＨＡ試料を、スーパーダンベルカッター（SDMP-1000, ISO 37-4/ISO 527-2-5B）を用いて約０．１ｍｍの膜厚で切断した。引張り速度は５ｍｍ／分であった。引張強度、降伏強度、ヤング率及び破断伸びは、試験結果の応力－歪み曲線から決定した。
【0064】
実施例１ ３Ｈ２ＭＰを構成単位として含むＰＨＡの生合成
Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｈ２ＭＰ）及びＰ（３Ｈ２ＭＰ）は、異なる濃度のグルコース及び前駆物質３Ｈ２ＭＰを、異なるプラスミドのセットを有する組換えＥ．ｃｏｌｉ ＬＳＢＪに供給することによって合成した。Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｈ２ＭＰ）合成のためには、プラスミドｐＢＢＲ１Ｐ（Ｄ４Ｎ）ＣＪＡｃＡＢＲｅＮＳＤＧ及びプラスミドｐＴＴＱ１９－ＰＣＴを使用し、Ｐ（３Ｈ２ＭＰ）合成のためには、プラスミドｐＢＢＲ１Ｐ（Ｄ４Ｎ）ＣＡｃＮＳＤＧ及びプラスミドｐＴＴＱ１９－ＰＣＴを使用した。前駆物質３Ｈ２ＭＰは、（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰ、（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰ、又は（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰと（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰとの混合物を用いた。結果を表１に示す。
Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｈ２ＭＰ）及びＰ（３Ｈ２ＭＰ）は、異なる濃度のグルコース及び前駆物質３Ｈ２ＭＰを、異なるプラスミドのセットを有する組換えＥ．ｃｏｌｉ ＬＳＢＪに供給することによって合成した。Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｈ２ＭＰ）合成のためには、プラスミドｐＢＢＲ１Ｐ（Ｄ４Ｎ）ＣＪＡｃＡＢＲｅＮＳＤＧ及びプラスミドｐＴＴＱ１９－ＰＣＴを使用し、Ｐ（３Ｈ２ＭＰ）合成のためには、プラスミドｐＢＢＲ１Ｐ（Ｄ４Ｎ）ＣＡｃＮＳＤＧ及びプラスミドｐＴＴＱ１９－ＰＣＴを使用した。前駆物質３Ｈ２ＭＰは、（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰ、（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰ、又は（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰと（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰとの混合物を用いた。結果を表１に示す。
【0065】
【表1】
【0066】
表１より、前記（i）の合成条件下では、５～８ｍｏｌ％の３Ｈ２ＭＰ単位を含むＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｈ２ＭＰ）が得られ、細胞増殖速度及びポリマー含有量は全試料についてほぼ同じであった。また、前駆物質の混合物（試料「１－Ｒａｃ－１」）を添加した場合には、２１ｍｏｌ％の３Ｈ２ＭＰ単位を含むＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｈ２ＭＰ）が得られた。
一方、グルコース添加量を抑えた前記（ii）の合成条件下では、３Ｈ２ＭＰ単位に富むＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｈ２ＭＰ）（３７～５０ｍｏｌ％ ３Ｈ２ＭＰ）が得られた。細胞増殖及びポリマー収率は、全試料についてほぼ同じであり、（Ｒ）－３ＨＢの導入によって引き起こされ得る顕著な変化がないことを示している。
一方、グルコース添加量を抑えた前記（ii）の合成条件下では、３Ｈ２ＭＰ単位に富むＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｈ２ＭＰ）（３７～５０ｍｏｌ％ ３Ｈ２ＭＰ）が得られた。細胞増殖及びポリマー収率は、全試料についてほぼ同じであり、（Ｒ）－３ＨＢの導入によって引き起こされ得る顕著な変化がないことを示している。
【0067】
実施例２ ＰＨＡの化学構造
図２に、Ｐ（３ＨＢ）、Ｐ（３Ｈ２ＭＰ）、及びＰ（３ＨＢ－ｃｏ－５ｍｏｌ％ ３Ｈ２ＭＰ）（試料「１－Ｒａｃ」）の４００ＭＨｚ １Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す。コポリマー試料のモノマー組成比の計算のためにシグナル２及び４を選択した。また、上記試料の１００ＭＨｚ １３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを図３に示す。
図２に、Ｐ（３ＨＢ）、Ｐ（３Ｈ２ＭＰ）、及びＰ（３ＨＢ－ｃｏ－５ｍｏｌ％ ３Ｈ２ＭＰ）（試料「１－Ｒａｃ」）の４００ＭＨｚ １Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す。コポリマー試料のモノマー組成比の計算のためにシグナル２及び４を選択した。また、上記試料の１００ＭＨｚ １３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを図３に示す。
【0068】
３Ｈ２ＭＰ単位のα‐炭素にキラル中心が存在するため、（Ｒ）－又は（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰを前駆物質として合成されたＰＨＡはキラル特性を示すと予想された。メチル（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰ及びメチル（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰを標準物質として使用し、キラル分離カラムを備えたＧＣによって合成されたＰＨＡを分析した（図４）。
図４のＡには、メチル（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰ及びメチル（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰのＧＣ－ＭＳスペクトルを示す。メチル３Ｈ２ＭＰのフラグメンテーションパターンに基づいてｍ／ｚ８８のベーススペクトルを設定することにより、メチル（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰは１１．９分の保持時間、メチル（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰは１２．４分の保持時間を示し、このことは２つのエナンチオマーがＭＳスペクトルで明確に分離できることを示している。
図４のＢには、表１に記載の全試料についての（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰ及び（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰの保持時間及びピーク強度を示す。試料の純度に起因するピークの僅かなシフトにより保持時間が僅かに変化した。最左カラムの、（Ｒ）－及び（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰは１００％のアイソタクチシティを示し、（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰと（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰとの混合物（（Ｒａｃ）－３Ｈ２ＭＰ）は１：１に近いＲ：Ｓ比を有する。
図４のＡには、メチル（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰ及びメチル（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰのＧＣ－ＭＳスペクトルを示す。メチル３Ｈ２ＭＰのフラグメンテーションパターンに基づいてｍ／ｚ８８のベーススペクトルを設定することにより、メチル（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰは１１．９分の保持時間、メチル（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰは１２．４分の保持時間を示し、このことは２つのエナンチオマーがＭＳスペクトルで明確に分離できることを示している。
図４のＢには、表１に記載の全試料についての（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰ及び（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰの保持時間及びピーク強度を示す。試料の純度に起因するピークの僅かなシフトにより保持時間が僅かに変化した。最左カラムの、（Ｒ）－及び（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰは１００％のアイソタクチシティを示し、（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰと（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰとの混合物（（Ｒａｃ）－３Ｈ２ＭＰ）は１：１に近いＲ：Ｓ比を有する。
【0069】
前駆物質として（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰ又は（Ｒａｃ）－３Ｈ２ＭＰを用いて合成したＰＨＡでは、ＰＨＡ中の３Ｈ２ＭＰの組成比の増大に伴って、（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰの割合はそれぞれ１００％から４０％に、４３％から１７％に直線的に減少する傾向が見られた（表２、図５）。一方、前駆物質として（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰを用いた場合には、全てのＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｈ２ＭＰ）試料中に１００％の（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰ単位が存在し、Ｐ（３Ｈ２ＭＰ）試料中に９９％の（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰ単位が存在し、キラリティーの変化を示さなかった（表２、図５）。
【0070】
【表2】
【0071】
また、Ｐ（３Ｈ２ＭＰ）のタクチシティを５００ＭＨｚ １３Ｃ－ＮＭＲ分光法で解析し（図６）、メチル領域（約１４ｐｐｍ）、メチン領域（約４０ｐｐｍ）、及びカルボニル領域（約１７４ｐｐｍ）を、ＧＣ－ＭＳデータ及び文献（N. Ajellal et al., Macromolecules, vol. 42, no. 4, pp. 987-993, 2009；J. Kiriratnikom, et al., Front. Chem., vol. 7, p. 301, 2019）に従って、ダイアド及びトライアドに割り当てた。試料「３－Ｓ」は、上記の全ての領域において、極めて高いメソダイアド（ｍ）配列又はアイソタクチックトリアド（ｍｍ）配列を示した（図６のＢ）。試料「３－Ｒ」及び「３－Ｒａｃ」についても、ダイアド配列とトライアド配列との間の比を除いて、同様のパターンが得られた。試料「３－Ｒ」は、シンジオタクチックに富む配列（ｍ又はｍｍ）を有するポリマーであるのに対して、試料「３－Ｒａｃ」はアイソタクチックに富むポリマーであることが分かった（図６のＡ及びＣ）。
図６において、「メソダイアド」は２つの同一の配向単位から成り、「アイソタクチックトリアド」は２つの隣接するメソダイアドから成る。「ラセモダイアド」は２つの反対の配向単位から成り、「シンジオタクチックトリアド」は２つの隣接するラセモダイアドから成る。
図６において、「メソダイアド」は２つの同一の配向単位から成り、「アイソタクチックトリアド」は２つの隣接するメソダイアドから成る。「ラセモダイアド」は２つの反対の配向単位から成り、「シンジオタクチックトリアド」は２つの隣接するラセモダイアドから成る。
【0072】
実施例３ ＰＨＡの分子量及び熱特性
ＧＰＣを用いてＰＨＡ試料の分子量を測定した（表２）。全試料の重量平均分子量（Ｍｗ）は３．４×１０４～８４．６×１０４まで変化した。試料「３－Ｒ」はＭｗの最低値を有し、前駆物質を変える以外は同一条件下で合成された試料「３－Ｓ」及び「３－Ｒａｃ」と比べて僅か１０分の１であった。この結果は、ＰＨＡ重合酵素（ｐｈａＣＡｃＮＳＤＧ）による（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰ－ＣｏＡの取込みが、（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰ－ＣｏＡと比較して相対的に低いことを示す。
ＧＰＣを用いてＰＨＡ試料の分子量を測定した（表２）。全試料の重量平均分子量（Ｍｗ）は３．４×１０４～８４．６×１０４まで変化した。試料「３－Ｒ」はＭｗの最低値を有し、前駆物質を変える以外は同一条件下で合成された試料「３－Ｓ」及び「３－Ｒａｃ」と比べて僅か１０分の１であった。この結果は、ＰＨＡ重合酵素（ｐｈａＣＡｃＮＳＤＧ）による（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰ－ＣｏＡの取込みが、（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰ－ＣｏＡと比較して相対的に低いことを示す。
【0073】
ＤＳＣを用いてＰＨＡ試料の熱特性を測定した（表３）。
【0074】
【表3】
【0075】
第１の加熱工程に関して，室温で４週間のエージング後の全試料の晶析履歴を測定した。試料「３－Ｒ」を除いて、全試料が結晶化挙動を示した。Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｈ２ＭＰ）の試料は、モノマー組成及びキラリティーに関わらず、約１５５℃と約１７０℃の融点（Ｔｍ２とＴｍ３）を示した（図７）。２つの融点はラメラ結晶の二次結晶化に関連し、１５５℃付近の最初のピークはポリマーの最初の結晶化に対応し、１７０℃でのピークは加熱過程中の３ＨＢ結晶の再形成に対応する（H. Mitomo, et al., Polym. J., vol. 19, no. 11, pp. 1241-1253, 1987；S. Kusaka, et al., J. Macromol. Sci. Part A Pure Appl. Chem., vol. 35, no. 2, pp. 319-335, 1998）。
【0076】
３ＨＢに富むＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｈ２ＭＰ）の融解エンタルピー（ΔＨｍ）は、３Ｈ２ＭＰの組成比の増加と共に減少し、低い結晶化度をもたらした。このことは、大量のコモノマー単位（３Ｈ２ＭＰ）が３ＨＢポリマーマトリックスに導入された場合に結晶構造を形成することが困難であることを示唆している。
また、融点Ｔｍ２とＴｍ３に加えて、５０℃付近に小エンタルピーを持つＴｍ１が現れた。これは、エージング過程でＰ（３Ｈ２ＭＰ）の結晶が形成されたことを示す。Ｐ（３Ｈ２ＭＰ）に関しては、３Ｈ２ＭＰ単位のキラリティーがポリマーの結晶化度に重要な役割を果たした。
試料「３－Ｓ」は、試料「３－Ｒａｃ」の５０℃及び６８℃の融点と比較して、１１４℃及び１１９℃のより高い融点を示した。これは、試料「３－Ｓ」が試料「３－Ｒ」を超える比較的高い結晶挙動を有することを示すものである。一方、ランダムに分布した（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰ及び（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰ単位から構成される試料「３－Ｒ」は非晶質であった。
また、融点Ｔｍ２とＴｍ３に加えて、５０℃付近に小エンタルピーを持つＴｍ１が現れた。これは、エージング過程でＰ（３Ｈ２ＭＰ）の結晶が形成されたことを示す。Ｐ（３Ｈ２ＭＰ）に関しては、３Ｈ２ＭＰ単位のキラリティーがポリマーの結晶化度に重要な役割を果たした。
試料「３－Ｓ」は、試料「３－Ｒａｃ」の５０℃及び６８℃の融点と比較して、１１４℃及び１１９℃のより高い融点を示した。これは、試料「３－Ｓ」が試料「３－Ｒ」を超える比較的高い結晶挙動を有することを示すものである。一方、ランダムに分布した（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰ及び（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰ単位から構成される試料「３－Ｒ」は非晶質であった。
【0077】
全試料のガラス転移温度Ｔｇは、Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｈ２ＭＰ）中の３Ｈ２ＭＰ単位の組成比が高くなるにつれて低下した。このことは、同様の主鎖構造を有するＰＨＡのＴｇに対応しており、主鎖構造が側鎖よりもＴｇに対してより有意な影響を有することを示している（M. Mierzati, et al., Polym. Degrad. Stab., vol. 178, p. 109193, 2020）。全てのＰ（３Ｈ２ＭＰ）試料について－２３℃の最低Ｔｇが観察され、ポリマーのタクチシティはＴｇに影響を与えないことが明らかとなった。
【0078】
試料「１－Ｒａｃ」（５ｍｏｌ％ ３Ｈ２ＭＰ）、試料「１－Ｒａｃ－１」（２１ｍｏｌ％ ３Ｈ２ＭＰ）、試料「３－Ｓ」（１００ｍｏｌ％ ３Ｈ２ＭＰ）、及び試料「３－Ｒａｃ」（１００ｍｏｌ％ ３Ｈ２ＭＰ）の熱安定性をＴＧ分析により決定した。データを表３に、熱分解曲線を図８に示す。ＰＨＡ中の３Ｈ２ＭＰ分率の増加によって、試料はより強い熱安定性を示し、試料「３－Ｓ」及び「３－Ｒａｃ」は、いずれも３１３℃の５％重量減量温度（Ｔｄ５）を示した。これらの試料は、熱処理後にほぼ１００％の重量減少に達した。このことは熱処理後に固体残渣がなく、主にガスであったことを示している。
【0079】
実施例４ ＰＨＡの機械的特性
ＰＨＡの機械的特性を引張試験により測定した（表４）。全試料のうち、ダンベル形状のフィルムに切断することができた試料「３－Ｓ」、「３－Ｒａｃ」、及び３ＨＢに富む試料「１－Ｒａｃ」、「１－Ｒａｃ－１」のみを分析した。他の試料は、柔らかく脆いために、ダンベル形状のフィルムに切断することができなかった。
ＰＨＡの機械的特性を引張試験により測定した（表４）。全試料のうち、ダンベル形状のフィルムに切断することができた試料「３－Ｓ」、「３－Ｒａｃ」、及び３ＨＢに富む試料「１－Ｒａｃ」、「１－Ｒａｃ－１」のみを分析した。他の試料は、柔らかく脆いために、ダンベル形状のフィルムに切断することができなかった。
【0080】
【表4】
【0081】
応力－歪み曲線を図９に示す。図９のＡは、試料「１－Ｒａｃ」（５ｍｏｌ％ ３Ｈ２ＭＰ）と試料「１－Ｒａｃ－１」（２１ｍｏｌ％ ３Ｈ２ＭＰ）との比較を示す。両ＰＨＡコポリマーにおいて５～２１ｍｏｌ％の３Ｈ２ＭＰ単位の組み込みは、ポリマーの展延性を十分に増強し、破断伸びは引張強度を維持しながら２５％～７６４％であった。この結果はポリマーの結晶化度に依る。３Ｈ２ＭＰ単位の分率の増加はポリマー構造中により多くの非晶質領域をもたらし、よってポリマーをより弾性にした。図９のＢは、アイソタクチックホモポリマー試料「３－Ｓ」とアタクチックホモポリマー試料「３－Ｒａｃ」との比較を示す。結晶性の低い試料「３－Ｒａｃ」は８８０％の高い破断伸びを示し、これは試料「３－Ｓ」のほぼ２倍であった。また、試料「３－Ｓ」と試料「３－Ｒａｃ」とは同じ引張強度を有するものの、試料「３－Ｓ」の降伏強度は試料「３－Ｒａｃ」よりも遥かに高かった。ポリマーの変形は、ランダムに整列した非晶質相がその分子形成を再配列し始める時に起こるので、より多い結晶相を有するポリマーはより高い抵抗力を有することになる。
【産業上の利用可能性】
【0082】
本発明によって製造された、（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰ又は（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰを構成単位として含むキラルなコポリマーＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｈ２ＭＰ）、及び（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰ又は（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰを構成単位とするキラルなホモポリマーＰ（３Ｈ２ＭＰ）含む様々なＰＨＡは、種々の材料特性を有し、バイオプラスチック材料として有用である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
