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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024068648
(43)【公開日】2024-05-20
(54)【発明の名称】カチオン性脂質及びその使用
(51)【国際特許分類】
C07C 233/49 20060101AFI20240513BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240513BHJP
A61K 9/14 20060101ALI20240513BHJP
A61K 47/14 20170101ALI20240513BHJP
A61K 47/18 20170101ALI20240513BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240513BHJP
A61K 31/711 20060101ALI20240513BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20240513BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20240513BHJP
A61K 47/24 20060101ALI20240513BHJP
A61K 47/34 20170101ALI20240513BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240513BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20240513BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20240513BHJP
C12N 15/88 20060101ALI20240513BHJP
C07C 229/08 20060101ALI20240513BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20240513BHJP
【ＦＩ】
C07C233/49 CSP
A61K45/00 ZNA
A61K9/14
A61K47/14
A61K47/18
A61K31/7088
A61K31/711
A61K31/7105
A61K31/713
A61K47/24
A61K47/34
A61P35/00
A61P37/06
A61P31/00
C12N15/88 Z
C07C229/08
C12N15/113 Z
【審査請求】有
【請求項の数】31
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2023189004
(22)【出願日】2023-11-06
(31)【優先権主張番号】63/423506
(32)【優先日】2022-11-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】508324396
【氏名又は名称】美洛生物科技股▲ふん▼有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】100167689
【弁理士】
【氏名又は名称】松本 征二
(72)【発明者】
【氏名】チェング， シャン・チュー
(72)【発明者】
【氏名】チェン， イー・アン
(72)【発明者】
【氏名】リン， シー・ラング
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C086
4H006
【Ｆターム（参考）】
4C076AA31
4C076CC07
4C076CC27
4C076CC31
4C076DD51
4C076DD52
4C076DD63
4C076DD70
4C076EE23
4C084AA17
4C084MA41
4C084NA13
4C084ZB081
4C084ZB082
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZB311
4C084ZB312
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA02
4C086MA05
4C086NA13
4C086ZB08
4C086ZB26
4C086ZB31
4H006AA01
4H006AA03
4H006AB20
4H006AC46
4H006AC48
4H006AC52
4H006AC53
4H006AC80
4H006BN10
4H006BT12
4H006BU32
4H006BV22
(57)【要約】 （修正有）
【課題】細胞内に薬学的有効成分（ＡＰＩ）（例えば、核酸）をカプセル化して効果的に送達するための新規で安全なカチオン性脂を提供する。
【解決手段】カチオン性脂質は、式（Ｉ）の構造を有し、
Ｘ及びＹの少なくとも一方は－（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２ＮＨ２であり、他方のＸ、Ｙ及びＺは－（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２ＮＨ２、－［（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２ＮＨ］（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１、－（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１及びＨからなる群から独立して選択され、Ｒ１はＣ９－２５アルキル又はＣ１３－２１アルケニルである。
【選択図】なし
【解決手段】カチオン性脂質は、式（Ｉ）の構造を有し、
Ｘ及びＹの少なくとも一方は－（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２ＮＨ２であり、他方のＸ、Ｙ及びＺは－（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２ＮＨ２、－［（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２ＮＨ］（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１、－（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１及びＨからなる群から独立して選択され、Ｒ１はＣ９－２５アルキル又はＣ１３－２１アルケニルである。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
式（Ｉ）
のカチオン性脂質であって、
Ｘ及びＹの少なくとも一方は、－（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２ＮＨ２であり、他方のＸ、Ｙ及びＺは、－（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２ＮＨ２、－［（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２ＮＨ］（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１、－（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１及びＨからなる群から独立して選択され、Ｒ１はＣ９－２５アルキル又はＣ１３－２１アルケニルである、カチオン性脂質。
【化1】
Ｘ及びＹの少なくとも一方は、－（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２ＮＨ２であり、他方のＸ、Ｙ及びＺは、－（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２ＮＨ２、－［（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２ＮＨ］（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１、－（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１及びＨからなる群から独立して選択され、Ｒ１はＣ９－２５アルキル又はＣ１３－２１アルケニルである、カチオン性脂質。
【請求項2】
Ｘ及びＺは独立して－（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２ＮＨ２であり、Ｙは－［（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２ＮＨ］（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１であり、Ｒ１はＣ１３－２１アルケニルである、請求項１に記載のカチオン性脂質。
【請求項3】
Ｘは－（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２ＮＨ２であり、Ｙ及びＺは独立して－［（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２ＮＨ］（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１であり、Ｒ１はＣ１３－２１アルケニルである、請求項１に記載のカチオン性脂質。
【請求項4】
Ｙは－（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２ＮＨ２であり、Ｘ及びＺは独立して－（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１であり、Ｒ１はＣ１３－２１アルケニルである、請求項１に記載のカチオン性脂質。
【請求項5】
Ｘ及びＺは独立して－（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２ＮＨ２であり、Ｙは－（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１であり、Ｒ１はＣ１３－２１アルケニルである、請求項１に記載のカチオン性脂質。
【請求項6】
Ｘは－（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２ＮＨ２であり、ＹはＨであり、Ｚは－（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１であり、Ｒ１はＣ１３－２１アルケニルである、請求項１に記載のカチオン性脂質。
【請求項7】
式（Ｉ）の前記カチオン性脂質は、
からなる群から選択される、請求項１に記載のカチオン性脂質。
【化2】
【請求項8】
請求項１に記載のカチオン性脂質、非カチオン性脂質及び薬学的有効成分（ＡＰＩ）を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）。
【請求項9】
前記ＡＰＩは、核酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、プロテオグリカン、糖タンパク質又はそれらの組合せである、請求項８に記載のＬＮＰ。
【請求項10】
前記核酸は、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）、葉緑体ＤＮＡ（ｃｐＤＮＡ）、プラスミド、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又はアプタマーである、請求項９に記載のＬＮＰ。
【請求項11】
前記ｍｉＲＮＡは、前駆体ｍｉＲＮＡ又は成熟ｍｉＲＮＡである、請求項１０に記載のＬＮＰ。
【請求項12】
前記カチオン性脂質は、
からなる群から選択され、前記ＡＰＩは、配列番号１の配列を備える前記ｍｉＲＮＡである、請求項８に記載のＬＮＰ。
【化3】
【請求項13】
前記ｍｉＲＮＡは、配列番号２、３、４又は５の配列を有する、請求項１２に記載のＬＮＰ。
【請求項14】
前記カチオン性脂質は、
であり、前記ＡＰＩは、配列番号６又は７の配列を有する前記ｓｉＲＮＡである、請求項８に記載のＬＮＰ。
【化4】
であり、前記ＡＰＩは、配列番号６又は７の配列を有する前記ｓｉＲＮＡである、請求項８に記載のＬＮＰ。
【請求項15】
前記非カチオン性脂質の各々は、ヘルパー脂質、リン脂質、ＰＥＧ化脂質、ＰＥＧ化リン脂質及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項８に記載のＬＮＰ。
【請求項16】
前記ヘルパー脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）又はジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）である、請求項１５に記載のＬＮＰ。
【請求項17】
前記ヘルパー脂質はＤＳＰＣである、請求項１６に記載のＬＮＰ。
【請求項18】
前記カチオン性脂質及び前記非カチオン性脂質は、それぞれ１：５～５：１のモル比で前記ＬＮＰ中に存在する、請求項８に記載のＬＮＰ。
【請求項19】
コレステロール、ラノステロール、エルゴステロール、フィトステロール、スチグマステロール及びブラジカステロールからなる群から選択されるステロイドをさらに含む請求項８に記載のＬＮＰ。
【請求項20】
前記ステロイドはコレステロールである、請求項１９に記載のＬＮＰ。
【請求項21】
それを必要とする被検体における疾患を処置するための、請求項８に記載のＬＮＰを含む薬学的組成物。
【請求項22】
前記疾患は、癌、感染性疾患又は自己免疫疾患である、請求項２１に記載の薬学的組成物。
【請求項23】
前記癌は、膀胱癌、骨癌、骨髄癌、脳癌、乳癌、胆管癌、結腸癌、食道癌、消化器癌、歯肉癌、頭頸部癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、上咽頭癌、白血病、リンパ腫、卵巣癌、前立腺癌、皮膚癌、胃癌、精巣癌、舌癌及び子宮癌からなる群から選択される、請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項24】
前記癌は前記肺癌であり、前記カチオン性脂質は、
からなる群から選択され、前記ＡＰＩは配列番号１の配列を備えるｍｉＲＮＡである、請求項２３に記載の薬学的組成物。
【化5】
【請求項25】
前記ｍｉＲＮＡは、配列番号２、３、４又は５の配列を有する、請求項２４に記載の薬学的組成物。
【請求項26】
前記癌は前記肺癌であり、前記カチオン性脂質は、
であり、前記ＡＰＩは、配列番号６又は７の配列を有するｓｉＲＮＡである、請求項２３に記載の薬学的組成物。
【化6】
【請求項27】
前記被検体はヒトである、請求項２１に記載の薬学的組成物。
【請求項28】
培養細胞内にＡＰＩを送達する方法であって、前記培養細胞を有効量の請求項８に記載のＬＮＰと接触させるステップを備え、前記ＡＰＩは、核酸、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、プロテオグリカン、糖タンパク質又はそれらの組合せである、方法。
【請求項29】
前記核酸は、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）、葉緑体ＤＮＡ（ｃｐＤＮＡ）、プラスミド、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又はアプタマーである、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
前記ｍｉＲＮＡは、前駆体ｍｉＲＮＡ又は成熟ｍｉＲＮＡである、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記培養細胞は、幹細胞、免疫細胞又はそれらの組合せである、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２２年１１月８日に出願された米国仮特許出願第６３／４２３，５０６号の優先権及び利益を主張し、その内容が参照によりここに取り込まれる。
本出願は、２０２２年１１月８日に出願された米国仮特許出願第６３／４２３，５０６号の優先権及び利益を主張し、その内容が参照によりここに取り込まれる。
【0002】
本開示は、治療薬の送達を増強するための新規カチオン性脂質及びそれらの使用に関する。より具体的には、本開示は、細胞内に核酸をカプセル化して送達するためのカチオン性脂質及びそれらの使用に関する。
【背景技術】
【0003】
遺伝子療法は、宿主細胞内に外来のゲノム物質を導入して治療効果を引き出す処理である。ＤＮＡ、プラスミド型干渉核酸、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）における使用のための短鎖干渉核酸、アンチセンス分子及びアプタマーを含む様々なタイプの核酸が、現在、遺伝子療法における治療薬として開発されている。一方、２つの主要な送達システムであるウイルス性及び非ウイルス性システムも、前述の治療薬を安定的かつ長い半減期の形態でカプセル化して送達するために開発されている。
【0004】
数十年来、多数のウイルス性及び非ウイルス性遺伝子送達システムが利用可能であるが、それらの各々は何らかの形で制限されている。例えば、ウイルス性送達システムは、それらの高いトランスフェクション効率では有利であるが、それらにはいくつかの生物学的安全性の懸念がある。非ウイルス性送達システム（例えば、ポリマー、脂質、リポソーム、ミセル、デンドリマー及びナノ材料）は、レシピエントの免疫システムに影響することなく、様々なサイズの核酸をカプセル化するそれらの能力において非常に汎用性が高く、一方で、それらのトランスフェクション効率は未だ改善されていない。
【0005】
リポプレックスは、核酸及びカチオン性脂質の間の複合体として定義され、現在までに最も研究されている非ウイルス性送達システムのうちの一つとなっている。リポフェクタミンは、慣例的に利用可能なカチオン性脂質であるが、その成分のうちの一つであるＤＯＳＰＡ（２，３－ジオレオイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパニミニウムトリフルオロアセテート）（２，３－ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ－Ｎ－［２（ｓｐｅｒｍｉｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ｅｔｈｙｌ］－Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－１－ｐｒｏｐａｎｉｍｉｎｉｕｍ ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ）は、遺伝子トランスフェクションの間に高い細胞毒性を有することが報告されている。
【0006】
前述に鑑み、関連技術において、細胞内に治療薬を効果的に送達するための新規で安全なカチオン性脂質のニーズが存在する。
【発明の概要】
【0007】
以下に、基本的な理解を読者に与えるために本開示の簡略化した概要を提示する。この概要は、開示の網羅的な概観ではなく、本発明の鍵となる／重要な要素を特定するものでも本発明の範囲を記するものでもない。その専らの目的は、ここに開示される幾つかの概念を、後述のさらに詳細な説明の序章としての簡略な形態で提示することである。
【0008】
本開示は、細胞内に核酸をカプセル化して送達するための新規のカチオン性脂質及びそれらの組成物を提供する。本カチオン性脂質及び／又は組成物の使用を介した疾患の処置もここに開示される。
【0009】
一態様では、本開示は、以下に示す式（Ｉ）のカチオン性脂質に向けられる。
【化1】
【0010】
本式では、Ｘ及びＹの少なくとも一方は、－（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２ＮＨ２であり、他方のＸ、Ｙ及びＺは、－（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２ＮＨ２、－［（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２ＮＨ］（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１、－（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１及びＨからなる群から独立して選択され、Ｒ１はＣ９－２５アルキル又はＣ１３－２１アルケニルである。
【0011】
本開示のいくつかの実施形態によると、式（Ｉ）では、Ｘ及びＺは独立して－（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２ＮＨ２であり、Ｙは－［（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２ＮＨ］（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１であり、Ｒ１はＣ１３－２１アルケニルである。
【0012】
本開示の他の実施形態によると、式（Ｉ）では、Ｘは－（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２ＮＨ２であり、Ｙ及びＺは独立して－［（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２ＮＨ］（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１であり、Ｒ１はＣ１３－２１アルケニルである。
【0013】
本開示のさらなる実施形態によると、式（Ｉ）では、Ｙは－（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２ＮＨ２であり、Ｘ及びＺは独立して－（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１であり、Ｒ１はＣ１３－２１アルケニルである。
【0014】
本開示のさらに他の実施形態によると、式（Ｉ）では、Ｘ及びＺは独立して－（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２ＮＨ２であり、Ｙは－（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１であり、Ｒ１はＣ１３－２１アルケニルである。
【0015】
本開示のさらなる実施形態によると、式（Ｉ）では、Ｘは－（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２ＮＨ２であり、ＹはＨであり、Ｚは－（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１であり、Ｒ１はＣ１３－２１アルケニルである。
【0016】
好ましくは、式（Ｉ）のカチオン性脂質のサブセットは、
からなる群から選択される。
【化2】
【0017】
本開示の他の態様は、本カチオン性脂質、非カチオン性脂質及び薬学的有効成分（ＡＰＩ）を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に向けられる。
【0018】
本開示のいくつかの実施形態によると、本ＬＮＰに配置されるＡＰＩは、核酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、プロテオグリカン、糖タンパク質又はそれらの組合せであり得る。
【0019】
本ＬＮＰでの使用に適した核酸の例は、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）、葉緑体ＤＮＡ（ｃｐＤＮＡ）、プラスミド、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及びアプタマーを含むが、これらに限定されない。好ましくは、ｍｉＲＮＡは、前駆体ｍｉＲＮＡ又は成熟ｍｉＲＮＡである。
【0020】
本開示のいくつかの好適な実施形態では、本ＬＮＰにおいて、カチオン性脂質は、
からなる群から選択されてもよく、ＡＰＩは、配列番号１の配列を備えるｍｉＲＮＡである。効果的な実施形態では、本ｍｉＲＮＡは、配列番号２、３、４又は５の配列を有する。
【化3】
【0021】
本開示の他の好適な実施形態では、本ＬＮＰにおいて、カチオン性脂質は、
であり、ＡＰＩは、配列番号６又は７の配列を有するｓｉＲＮＡである。
【化4】
【0022】
本開示のいくつかの実施形態によると、本ＬＮＰに含まれる非カチオン性脂質は、ヘルパー脂質、リン脂質、ＰＥＧ化脂質、ＰＥＧ化リン脂質又はそれらの組合せであり得る。本開示での使用に適したヘルパー脂質の例は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）（ＤＯＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）（ＤＳＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）（ＤＭＰＥ）及びジステアロイルホスファチジルコリン（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）（又は１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１，２－ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、ＤＳＰＣ）を含むが、これらに限定されない。本開示の実施形態によると、本ＬＮＰに含まれる非カチオン性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）のヘルパー脂質である。
【0023】
本開示のいくつかの実施形態によると、カチオン性脂質及び非カチオン性脂質は、それぞれ１：５～５：１のモル比でＬＮＰ中に存在する。
【0024】
代替的又は任意選択的な実施形態では、本ＬＮＰは、ステロイドをさらに含む。本ＬＮＰでの使用に適したステロイドの例は、コレステロール、ラノステロール、エルゴステロール、フィトステロール、スチグマステロール及びブラジカステロールを含むが、これらに限定されない。効果的な一実施例では、本ＬＮＰは、コレステロールをさらに含む。
【0025】
本開示の他の態様は、有効量の上述したＬＮＰを被検体に投与するステップを備える、それを必要とする被検体における疾患を処置する方法に向けられる。
【0026】
本開示の実施形態によると、疾患は、癌、感染性疾患又は自己免疫疾患であり得る。
【0027】
本方法によって処置可能な癌の例は、膀胱癌、骨癌、骨髄癌、脳癌、乳癌、胆管癌、結腸癌、食道癌、消化器癌、歯肉癌、頭頸部癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、上咽頭癌、白血病、リンパ腫、卵巣癌、前立腺癌、皮膚癌、胃癌、精巣癌、舌癌及び子宮癌を含むが、これらに限定されない。
【0028】
本開示のいくつかの好適な実施形態では、疾患が肺癌の場合、本ＬＮＰは、
からなる群から選択されるカチオン性脂質を含み、ＡＰＩは配列番号１の配列を備えるｍｉＲＮＡである。好ましくは、ｍｉＲＮＡは、配列番号２、３、４又は５の配列を有する。
【化5】
【0029】
他の好適な実施形態では、疾患が肺癌の場合、本ＬＮＰは、
のカチオン性脂質を含み、ＡＰＩは、配列番号６又は７の配列を有するｓｉＲＮＡである。
【化6】
のカチオン性脂質を含み、ＡＰＩは、配列番号６又は７の配列を有するｓｉＲＮＡである。
【0030】
本開示のいくつかの実施形態によると、被検体はヒトである。
【0031】
本開示のさらに他の態様は、培養細胞内にＡＰＩを送達する方法であって、培養細胞を有効量の上述したＬＮＰと接触させるステップを備え、ＡＰＩは、核酸、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、プロテオグリカン、糖タンパク質又はそれらの組合せである、方法に向けられる。
【0032】
本方法での使用に適した核酸の例は、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）、葉緑体ＤＮＡ（ｃｐＤＮＡ）、プラスミド、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及びアプタマーを含むが、これらに限定されない。好ましくは、ｍｉＲＮＡは、前駆体ｍｉＲＮＡ又は成熟ｍｉＲＮＡである。
【0033】
本方法での使用に適した培養細胞の例は、多能性幹細胞及び免疫細胞を含むが、これらに限定されない。
【0034】
本開示の付随する特徴及び有利な効果の多くは、添付図面との関連で検討される以下の詳細な説明を参照してより深く理解されることになる。
【0035】
本説明は、添付図面に照らして読まれる以下の詳細な説明からより深く理解される。
【図面の簡単な説明】
【0036】
【発明を実施するための形態】
【0037】
添付図面との関連で以下に与えられる詳細な説明は、本実施例の説明としてのものであり、本実施例が構成又は利用され得る唯一の形態を示すものではない。その説明は、実施例の機能及び実施例を構成して動作させるためのステップの配列を説明する。ただし、同一又は同等の機能及び配列が、異なる実施例によっても実現され得る。
【0038】
１．定義
便宜上、明細書、実施例及び添付の特許請求の範囲で採用される特定の用語をここにまとめる。特に断りのない限り、ここに用いられるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同様の意味を有する。
便宜上、明細書、実施例及び添付の特許請求の範囲で採用される特定の用語をここにまとめる。特に断りのない限り、ここに用いられるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同様の意味を有する。
【0039】
単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、そうでないことを文脈が明示しない限り、複数の参照を含むものとしてここでは用いられる。
【0040】
ここで用いられる用語「アルキル」は、９～２５個の炭素原子を含む、直鎖又は分岐炭化水素基をいう。本発明での使用に適したＣ９－２５アルキルの例は、ノニル、デシル、ウンデシル（同様にヘンデシル）、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、イコシル、ヘンエイコシル（同様にヘンイコシル）、ドコシル、トリコシル、テトラコシル及びペンタコシルを含む。
【0041】
用いられる用語「アルケニル」は、１３～２１個の炭素原子及び１以上の二重結合を含む、長い直鎖炭化水素基をいう。本発明での使用に適したＣ１３－２１アルケニルの例は、トリデセニル、テトラデセニル、ペンタデセニル、ヘキサデセニル、ヘプタデセニル、オクタデセニル、ノナデセニル、イコセニル及びヘンエイコセニル（同様にヘンイコセニル）を含む。一般に、アルケンにおける炭素原子（Ｃ）及び二重結合（Ｄ）の総数は、１４：１、１６：１、１８：１、１８：２、１８：３、２０：４又は２０：５などの「Ｃ：Ｄ」の数字記号によってそれぞれ表される。
【0042】
本文書で用いられる用語「薬学的有効成分（ａｃｔｉｖｅ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）（ＡＰＩ）」は、それによって被検体における疾患及び／又は状態が遅延、改善、阻害又は予防され得る、医薬、薬剤、組成物、ワクチン及び／又は薬学的生成物の形態として又はその形態の一部として生物学的に活性である成分をいう。本開示での使用に適したＡＰＩの例は、核酸、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、プロテオグリカン、糖タンパク質及びそれらの組合せを含むが、これらに限定されない。
【0043】
ここで用いられるように、用語「カチオン性脂質」は、１以上の脂肪酸又は脂肪アルキル鎖を有し、極性頭部基中に存在する１以上のアミンを通じて正電荷を獲得する脂質のものをいう。カチオン性脂質は、通常、そのｐＫａ未満のｐＨでプロトン化（すなわち、正に帯電）する。
【0044】
ここで用いられるように、用語「非カチオン性脂質」は、中性脂質又はアニオン性脂質などの正電荷を所有しない脂質をいう。本開示の実施形態によると、用語「非カチオン性脂質」は、ＬＮＰの構造を安定化し、それによりＬＮＰによって担持されるＡＰＩの送達を増強することが知られている「ヘルパー脂質」を包含することも意図する。ヘルパー脂質はまた、ＡＰＩ（例えば、核酸）のカプセル化を最適化し、それらを分解から保護し、それらの標的細胞内への輸送を容易にするのに役立つ。本開示での使用に適したヘルパー脂質の例は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）及びジステアロイルホスファチジルコリン（又は１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、ＤＳＰＣ）を含むが、これらに限定されない。
【0045】
ここで用いられるように、用語「ステロイド」は、二重結合を有さない四環式炭化水素であるゴナン又はシクロペンタノペルヒドロフェナントレンのコア構造（すなわち、ステロイド核）に由来する化学物質のクラスをいう。本ＬＮＰの形成での役割を果たすステロイドの例は、コレステロール、ラノステロール、エルゴステロール、フィトステロール、スチグマステロール及びブラジカステロールを含むが、これらに限定されない。
【0046】
ここで用いられる用語「マイクロＲＮＡ」又は「ｍｉＲＮＡ」は、遺伝子発現を調節する役割を果たす非コードＲＮＡのクラスをいう。大部分のｍｉＲＮＡは、ＤＮＡ配列から一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）に転写され、前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）及び最終的に成熟ｍｉＲＮＡにプロセシングされる。したがって、ここで用いられる用語「ｍｉＲＮＡ」は、ｍｉＲＮＡのプロセシング及び成熟に関与するすべての非コードＲＮＡをいい、好ましくは前駆体ｍｉＲＮＡ及び成熟ｍｉＲＮＡを含む。
【0047】
ここで用いられる用語「感染性疾患」は、通常、発熱、炎症、上気道症状、下痢等などの急性症状を引き起こす細菌、ウイルス、真菌又は寄生虫などの病原体によって引き起こされる障害をいう。
【0048】
用語「被検体」又は「患者」は、ここでは互換可能に用いられ、本カチオン性脂質内のＡＰＩによって処置可能なヒト種を含む哺乳類を意味するように意図される。用語「哺乳類」は、ヒト、霊長類（例えば、サル及びチンパンジー）、ウサギ、ブタ、ヤギ、ヒツジ及びウシなどの飼育動物及び家畜、その他動物園、競技用又はペット用動物（例えば、ウマ、イヌ、ネコなど）並びにマウス、ラット、モルモット及びハムスターなどの齧歯類を含む哺乳動物網のすべてのメンバーをいう。効果的な実施例では、被検体はヒトである。さらに、用語「被検体」又は「患者」は、一方の性別が具体的に示されていない限り、雄及び雌の双方の性別をいうことを意図している。
【0049】
２．好適な実施形態の詳細な説明
本開示は、いくつかの新規のカチオン性脂質が細胞内へのポリヌクレオチドの送達のためのビヒクルとして作用し得るという発見に、少なくともある程度基づく。したがって、本開示は、治療薬の送達のためのビヒクルとして作用する新規のカチオン性脂質及びその組成物を提供する。本カチオン性脂質及び／又は組成物の使用による疾患の処置も、ここに開示される。
本開示は、いくつかの新規のカチオン性脂質が細胞内へのポリヌクレオチドの送達のためのビヒクルとして作用し得るという発見に、少なくともある程度基づく。したがって、本開示は、治療薬の送達のためのビヒクルとして作用する新規のカチオン性脂質及びその組成物を提供する。本カチオン性脂質及び／又は組成物の使用による疾患の処置も、ここに開示される。
【0050】
２．１ 本開示のカチオン性脂質
本開示は、治療薬を送達するための新規のカチオン性脂質及びそれを含む組成物を提供することを目的とする。一態様では、本発明は、式（Ｉ）のカチオン性脂質に関し、
Ｘ及びＹの少なくとも一方は、－（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２ＮＨ２であり、他方のＸ、Ｙ及びＺは、－（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２ＮＨ２、－［（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２ＮＨ］（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１、－（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１及びＨからなる群から独立して選択され、Ｒ１はＣ９－２５アルキル又はＣ１３－２１アルケニルである。
本開示は、治療薬を送達するための新規のカチオン性脂質及びそれを含む組成物を提供することを目的とする。一態様では、本発明は、式（Ｉ）のカチオン性脂質に関し、
【化7】
【0051】
いくつかの実施形態では、Ｒ１はＣ９－２５アルキルであり、好適な実施形態では、Ｒ１はＣ１１－２３アルキルであり、他の好適な実施形態では、Ｒ１はＣ１３－２１アルキルであり、さらに他の好適な実施形態では、Ｒ１はＣ１５－１９アルキルである。いくつかの効果的な実施例では、Ｒ１はＣ１５アルキルである。
【0052】
他の実施形態では、Ｒ１はＣ１３－２１アルケニルであり、好適な実施形態では、Ｒ１はＣ１５－１９アルケニルである。いくつかの効果的な実施例では、Ｒ１はＣ１５アルケニルであり、他の効果的な実施例では、Ｒ１はＣ１７アルケニルである。
【0053】
式（Ｉ）の例示的な化合物は、
（化合物６，ＴＧＧ－リノ－ル酸（ＴＧＧ－ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ））、
（化合物９、ＴＧＧ－ジ（リノール酸）（ＴＧＧ－ｄｉ（ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）））、
（化合物１１、ＤＧＧ－リノール酸（ＤＧＧ－ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ））、
（化合物１４、ＭＧＧ－ジ（リノール酸）（ＭＧＧ－ｄｉ（ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）））、
（化合物１８、ＭＧＧ－リノール酸（ＭＧＧ－ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ））、
（化合物２２、ＴＧＧ－ジ（パルミトレイン酸）（ＴＧＧ－ｄｉ（ｐａｌｍｉｔｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）））又は
（化合物２４、ＴＧＧ－パルミトレイン酸（ＴＧＧ－ｐａｌｍｉｔｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ））である。
【化8】
【化9】
【化10】
【化11】
【化12】
【化13】
【化14】
【0054】
本開示のカチオン性脂質は、効果的な実施例に記載された手順により調製され得る。簡潔には、まずグリシンのアミノ基（ＮＨ２）をフェナシル（ＰＡｃ）基又はｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）（Ｂｏｃ）基などの保護基によって保護する。そして、グリセロールの少なくとも１つの水酸基とグリシンのカルボキシル基との間に生じる縮合反応（すなわち脱水）を介して、ＰＡｃ－又はＢｏｃ保護されたグリシンの少なくとも１つがグリセロールと連結する。最後に、１つ又は２つの脂肪酸を、グリセロールの残りの水酸基と連結して、本カチオン性脂質を形成する。代替的な実施形態によると、脂肪酸のカルボキシル基とグリシンのアミノ基との間に生じる縮合反応は、それらの間にアミノ結合を生じさせ、それにより、後続のグリセロールの水酸基との反応のための遊離カルボキシル基を有する中間化合物を生成し、したがって、本発明の最終的なカチオン性脂質生成物を生成する。本カチオン性脂質化合物を生成するための詳細な反応条件及び化学薬剤は、本開示の趣旨から逸脱することなく当業者によって変更され得る。
【0055】
式（Ｉ）の本化合物の生成での使用に適した脂肪酸の例は、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘニン酸、リグノセリン酸、セロチン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、サピエン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、リノール酸、リノエライジン酸、α-リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、エルカ酸及びドコサヘキサエン酸を含むが、これらに限定されない。効果的な実施例では、式（Ｉ）の本化合物の生成で用いられる脂肪酸は、パルミトレイン酸又はリノール酸である。
【0056】
エナンチオマー及びジアステレオマー形態を含む式（Ｉ）の化合物の各Ｘ、Ｙ及びＺ置換基における不斉炭素により存在し得るものなどの本化合物のすべての立体異性体は、本発明の範囲内であると考えられる。
【0057】
２．２ 脂質ナノ粒子
患者の細胞内への、生物学的に活性な治療用分子の細胞内送達を容易とする、新規の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）もここに開示される。
患者の細胞内への、生物学的に活性な治療用分子の細胞内送達を容易とする、新規の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）もここに開示される。
【0058】
本開示の実施形態によると、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、上記の式（Ｉ）のカチオン性脂質、非カチオン性脂質及び薬学的有効成分（ＡＰＩ）を含む。本ＬＮＰを構成するのに適した非カチオン性脂質の例は、ヘルパー脂質、リン脂質、ＰＥＧ化脂質、ＰＥＧ化リン脂質及びそれらの組合せを含むが、これらに限定されない。本開示での使用に適したヘルパー脂質の例は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）及びジステアロイルホスファチジルコリン（又は１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、ＤＳＰＣ）を含むが、これらに限定されない。本開示の実施形態によると、本ＬＮＰに含まれる非カチオン性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）のヘルパー脂質である。本開示での使用に適したＰＥＧ化脂質の例は、ジエチレングリコールに結合されたＰＥＧ（ＤＥＧ－ＰＥＧ）（例えば、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（１，２－ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ－ｒａｃ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｍｅｔｈｏｘｙｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ－２０００）（ＤＥＧ－ＰＥＧ２０００））、ジアルキルオキシプロピルに結合されたＰＥＧ（ＰＥＧ－ＤＡＡ）（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ））、ジアシルグリセロールに結合されたＰＥＧ（ＰＥＧ－ＤＡＧ）（例えば、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ－Ｎ－［ｍｅｔｈｏｘｙ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）－２０００］）（ＤＯＰＥ－ＰＥＧ２０００））、ホスファチジルエタノールアミンに結合されたＰＥＧ（ＰＥＧ－ＰＥ）（例えば、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（１，２－ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ－Ｎ－［ｍｅｔｈｏｘｙ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ）－２０００］）、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）及びそれらの組合せを含むが、これらに限定されない。効果的な一実施例では、ＰＥＧ化脂質は、ＤＥＧ－ＰＥＧ２０００である。
【0059】
本開示の実施形態によると、本カチオン性脂質及び非カチオン性脂質は、１：５、１：４．５、１：４、１：３．５、１：３、１：２．５、１：２、１：１．５、１：１、１．５：１、２：１、２．５：１、３：１、３．５：１、４：１、４．５：１又は５：１などの１：５～５：１のモル比でＬＮＰ中に存在する。いくつかの効果的な実施例では、本カチオン性脂質及び非カチオン性脂質は、１：１のモル比でＬＮＰ中に存在する。代替的な効果的な実施例では、本カチオン性脂質及び非カチオン性脂質は、約４．３：１のモル比でＬＮＰ中に存在する。
【0060】
代替的に又は追加的に、本ＬＮＰは、ＬＮＰの構造を安定化するのに役立つステロイドをさらに含み得る。本ＬＮＰを構成するのに適したステロイドの例は、コレステロール、ラノステロール、エルゴステロール、フィトステロール、スチグマステロール及びブラジカステロールを含むが、これらに限定されない。好ましくは、本ＬＮＰは、コレステロールをさらに含む。
【0061】
本開示のいくつかの実施形態によると、各ＬＮＰは、カチオン性（例えば、式（Ｉ）の少なくとも１つの化合物）及び非カチオン性脂質の双方からなる脂質２重層によって封入された親水性のコア並びに任意選択的に脂質２重層内に埋め込まれたステロイド及び／又はヘルパー脂質を有し、したがって、本来は疎水性であるＡＰＩは、脂質２重層の間の疎水性領域の間に挿入されるが、本来は親水性であるＡＰＩは、親水性コア内に配置され得る。他の実施形態では、上記に示すように脂質２重層によって封入された親水性コアを有するかわりに、各ＬＮＰは、その中により小さい複数の逆ミセルが封入されたミセルの構造となる。ミセルは、脂質の親水性頭部基は外向きであるが、脂質の疎水性尾部が中心に向かって延びている脂質（例えば、本開示のカチオン性及び非カチオン性脂質）の単層によって封入された疎水性コアを有する。さらに、ミセルよりもサイズが小さい複数の逆ミセルが、ミセルの疎水性コア内に封入されてもよく、なお、用語「逆ミセル」は、脂質の疎水性尾部は外へ延びるが脂質の頭部基は中心にあるミセルをいう。したがって、親水性ＡＰＩ（例えば、核酸）は、逆ミセルの親水性コアの内側に配置され得る。
【0062】
本ＬＮＰは、薄層水和、エタノール注入、マイクロ流体装置などを含む、当技術分野で周知の手順及び／又はツールを介して生成されてもよく、カチオン性脂質（すなわち、式（Ｉ）の化合物）、非カチオン性脂質及び任意選択的にステロイドは、自己組織化して脂質２重層を形成し、ＡＰＩは、ＬＮＰ内に直接カプセル化されることもあれば、ＬＮＰ内にカプセル化される前にカチオン性脂質に結合されることもあり、それにより、ナノ粒子、リポソーム又はミセルの形態の複合体を生成し得る。液体又は固体のいずれかの形態で本ＬＮＰによって送達されるＡＰＩは、核酸、ポリペプチド、タンパク質、抗体、炭水化物、プロテオグリカン、糖タンパク質、小分子又はそれらの組合せであり得る。
【0063】
本開示のいくつかの実施形態では、ＡＰＩは、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）、葉緑体ＤＮＡ（ｃｐＤＮＡ）、プラスミド、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又はアプタマーを含むがこれらに限定されない核酸である。好適な実施形態では、ＡＰＩは、ｍｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡである。ｍｉＲＮＡの例は、前駆体ｍｉＲＮＡ又は成熟ｍｉＲＮＡを含むが、これらに限定されない。いくつかの効果的な実施例では、本カチオン性脂質を介してカプセル化されて送達されるｍｉＲＮＡは配列番号１の配列を備え、より好ましくは、ｍｉＲＮＡは配列番号２、３、４又は５の配列を有する。他の効果的な実施例では、本カチオン性脂質を介して送達されるのに用いられるｓｉＲＮＡは、配列番号６又は７の配列を有する。いくつかの代替的な実施形態では、ＡＰＩは、プラスミドである。
【0064】
２．３ 本カチオン性脂質の使用を介した処置
式（Ｉ）のカチオン性脂質及びその脂質ナノ粒子は、生物学的な活性薬剤の送達に有用であり、したがって、それらは疾患の処置に用いられ得る。したがって、本開示は、それを必要とする被検体における疾患を処置する方法を包含する。方法は主に、有効量の組成物（すなわち、式（Ｉ）の化合物から構成された脂質ナノ粒子（ＬＮＰ））を被検体に投与するステップを含む。
式（Ｉ）のカチオン性脂質及びその脂質ナノ粒子は、生物学的な活性薬剤の送達に有用であり、したがって、それらは疾患の処置に用いられ得る。したがって、本開示は、それを必要とする被検体における疾患を処置する方法を包含する。方法は主に、有効量の組成物（すなわち、式（Ｉ）の化合物から構成された脂質ナノ粒子（ＬＮＰ））を被検体に投与するステップを含む。
【0065】
式（Ｉ）のカチオン性脂質を含む本脂質ナノ粒子は、粉末、顆粒、溶液若しくは懸濁液、坐剤又は貼付剤に処方されてもよく、そのような製剤を投与又は非経口投与して、適切な又は所望の作用部位及び病変部位に有効成分を効果的に輸送し得る。本開示によると、本脂質ナノ粒子は、被検体の病変（例えば、腫瘍）に非経口投与され得る。例示的な適切な非経口経路は、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、硬腔内、脳室内、真皮内、皮下、直腸、膣内及び腹腔内経路を含むが、これらに限定されない。適切な経路は、当業者によって認識されるように、処置される特定の状態、状態の重篤度、年齢、体調、体格、性別及び体重を含む個々の患者パラメータ、処置の期間、（ある場合には）併用療法の性質、有効成分の投与量及び性質、遺伝的要因並びに医療従事者の知識及び専門技能の範囲内の同様の要因に応じて変化する。これらの要因は、当業者には周知であり、定型的な実験だけで対応され得る。一般に、最も適切な投与経路は、循環システムの環境における薬剤の安定性及び／又は被検体の状態（例えば、被検体の肺がんの重篤度又は被検体が慣例的な処置に耐え得る否か）を含む様々な要因に依存する。本開示のいくつかの実施形態によると、本脂質ナノ粒子は、非経口投与のための注射製剤に処方される。本開示の他の実施形態によると、本脂質ナノ粒子は、経皮投与のための貼付剤に処方される。
【0066】
本脂質ナノ粒子は、被検体における疾患、状態又は特質を効果的に予防、阻害、抑制又は処置する頻度で投与され得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、１日に４回から３か月毎に１回の頻度、例えば、１日に４回、１日に３回、１日に２回、１日に１回、隔日毎に１回、３日毎に１回、１週間毎に１回、隔週毎に１回、１か月に１回、１か月に２回、１か月に３回、隔月毎に１回又は３か月毎に１回の頻度で投与され得る。好ましくは、脂質ナノ粒子は、１週間に２回（３日又は４日毎に１回）の頻度で被検体に投与される。任意選択的に、脂質ナノ粒子は、１週間に１回の頻度で被検体に投与される。さらに任意選択的に、脂質ナノ粒子は、隔週毎に１回の頻度で被検体に投与される。
【0067】
本開示の実施形態によると、本方法によって処置可能な疾患は、癌、（炎症性疾患を含む）感染性疾患、移植及び／又は組織拒絶、自己免疫疾患などであり得る。
【0068】
本方法によって処置可能な癌の例は、膀胱癌、骨癌、骨髄癌、脳癌、乳癌、胆管癌、結腸癌、食道癌、消化器癌、歯肉癌、頭頸部癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、上咽頭癌、白血病、リンパ腫、卵巣癌、前立腺癌、皮膚癌、胃癌、精巣癌、舌癌及び子宮癌を含むが、これらに限定されない。
【0069】
好適な一実施形態では、肺癌被検体は、
のカチオン性脂質及び配列番号６又は７の配列を有するｓｉＲＮＡを含む、有効量の本脂質ナノ粒子を被検体に投与するステップを介して処置される。
【化15】
【0070】
他の好適な実施形態では、肺癌被検体は、カチオン性脂質が
からなる群から選択され、ｍｉＲＮＡが配列番号２、３、４及び５からなる群から選択される配列を有する、有効量の本脂質ナノ粒子を被検体に投与して処置される。
【化16】
からなる群から選択され、ｍｉＲＮＡが配列番号２、３、４及び５からなる群から選択される配列を有する、有効量の本脂質ナノ粒子を被検体に投与して処置される。
【0071】
２．４ 本カチオン性脂質の使用を介したＡＰＩ送達プラットフォーム
本脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、培養細胞内へのＡＰＩの送達に有用であり、したがって、それらは、細胞療法の調製における治療用材料の送達のためのプラットフォームとして使用され得る。したがって、本開示は、培養細胞内にＡＰＩを送達する方法を包含する。方法は主に、培養細胞を有効量の本ＬＮＰと接触させるステップを含み、ＡＰＩは、核酸、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、プロテオグリカン、糖タンパク質又はそれらの組合せである。
本脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、培養細胞内へのＡＰＩの送達に有用であり、したがって、それらは、細胞療法の調製における治療用材料の送達のためのプラットフォームとして使用され得る。したがって、本開示は、培養細胞内にＡＰＩを送達する方法を包含する。方法は主に、培養細胞を有効量の本ＬＮＰと接触させるステップを含み、ＡＰＩは、核酸、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、プロテオグリカン、糖タンパク質又はそれらの組合せである。
【0072】
本実施形態において提供される培養細胞は、被検体から単離され、又は被検体に由来し、細胞移植体が、再生医療、免疫システム障害及び癌を含む選定分野に適応する細胞療法に有用となり、かつ有益となるように、本ＬＮＰを介して送達される遺伝子又は遺伝子産物を受けることによって治療効果を有する細胞移植体に分化又は発達する効力を有し得る。一般に、培養細胞は、幹細胞及び免疫細胞を含む。本方法での使用に適した幹細胞の例は、多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）（ＰＳＣ、例えば、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）（ＥＳＣ）、胚盤葉上層幹細胞（ｅｐｉｂｌａｓｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）（ＥｐｉＳＣ）、胚性生殖細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ）（ＥＧＣ）及び人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）（ｉＰＳＣ））、成体幹細胞（ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）（ＡＳＣ、例えば、造血幹細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）（ＨＳＣ）、皮膚幹細胞（ｓｋｉｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）（ＳＳＣ）、神経幹細胞（ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）（ＮＳＣ）及び間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）（ＭＳＣ））並びに癌幹細胞（ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）（ＣＳＣ）を含むが、これらに限定されない。本方法での使用に適した免疫細胞の例は、Ｔ細胞、樹状細胞（ＤＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びマクロファージを含むが、これらに限定されない。免疫細胞は、一般に、活性化、刺激性及び共刺激性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ、ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）及びそれらの組合せを含むＣＡＲなどの、遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及び機能的な非ＴＣＲ抗原受容体を含む、遺伝子操作された抗原受容体を発現する。
【0073】
上記の特徴により、本開示は、そこに充填されたポリヌクレオチドをカプセル化して細胞に送達可能とする新規のカチオン性脂質を提供し、それによって、癌を含む疾患を効果的かつ効率的に処置可能とする。
【実施例0074】
材料及び方法
細胞培養
ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞（大細胞肺癌細胞株）を、熱不活性化した１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％のペニシリン－ストレプトマイシン（ＰＳ）溶液を補足したＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）１６４０培地で培養した。（ヒト肺がん組織から樹立した）Ａ５４９細胞を、熱不活性化した１０％のＦＢＳ及び１％のＰＳ溶液を補足したＨａｍ’ｓ Ｆ－１２Ｋ（Ｋａｉｇｈｎ’ｓ）培地で培養した。すべての細胞を、５％のＣＯ２を含む雰囲気下で、３７℃で培養した。
細胞培養
ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞（大細胞肺癌細胞株）を、熱不活性化した１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％のペニシリン－ストレプトマイシン（ＰＳ）溶液を補足したＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）１６４０培地で培養した。（ヒト肺がん組織から樹立した）Ａ５４９細胞を、熱不活性化した１０％のＦＢＳ及び１％のＰＳ溶液を補足したＨａｍ’ｓ Ｆ－１２Ｋ（Ｋａｉｇｈｎ’ｓ）培地で培養した。すべての細胞を、５％のＣＯ２を含む雰囲気下で、３７℃で培養した。
【0075】
本カチオン性脂質を介したプラスミド安定化
本カチオン性脂質（すなわち、化合物６、９、１１、１４、１８、２２又は２４）、レシチン及びコレステロールを、２：２：１のモル比で十分に混合して、エタノールに完全に溶解し、溶液をＤＰＢＳ緩衝液によって３０～５０μＬに希釈した。そして、希釈溶液を１．５μｇのＥＧＦＰ－プラスミド（ｐＵＣ１９、４５６４ｂｐ、Ａｄｄｇｅｎｅ社）を含む５０μＬのスクロース水溶液（５％ｗ／ｖ）と室温で１時間共培養して、カチオン性脂質－ＤＮＡ複合体を生成した。得られた溶液を２つのバイアルに分け、その一方に１μＬのＤＮａｓｅ及び１０μＬの１０×ＤＮａｓｅ緩衝液を添加し、３７℃でさらに１５分間インキュベーションした。その後、１００μＬのフェノール／クロロホルム（５／１）を添加し、１３０００×ｇで５分間の遠心によって混合してＤＮＡを抽出した。すべてのサンプルをゲル電気泳動（１％アガロースゲル、１１０Ｖ）にかけた。
本カチオン性脂質（すなわち、化合物６、９、１１、１４、１８、２２又は２４）、レシチン及びコレステロールを、２：２：１のモル比で十分に混合して、エタノールに完全に溶解し、溶液をＤＰＢＳ緩衝液によって３０～５０μＬに希釈した。そして、希釈溶液を１．５μｇのＥＧＦＰ－プラスミド（ｐＵＣ１９、４５６４ｂｐ、Ａｄｄｇｅｎｅ社）を含む５０μＬのスクロース水溶液（５％ｗ／ｖ）と室温で１時間共培養して、カチオン性脂質－ＤＮＡ複合体を生成した。得られた溶液を２つのバイアルに分け、その一方に１μＬのＤＮａｓｅ及び１０μＬの１０×ＤＮａｓｅ緩衝液を添加し、３７℃でさらに１５分間インキュベーションした。その後、１００μＬのフェノール／クロロホルム（５／１）を添加し、１３０００×ｇで５分間の遠心によって混合してＤＮＡを抽出した。すべてのサンプルをゲル電気泳動（１％アガロースゲル、１１０Ｖ）にかけた。
【0076】
カチオン性脂質－ＲＮＡ複合体の調製
本組成物を生成するために、本カチオン性脂質（化合物６又は２２）、コレステロール、ＤＥＧ－ＰＥＧ ２０００及びジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）を５０：３８．５：１．５：１０のモル比でエタノールにおいて十分に混合し、全体積を５００μＬとし、それにより脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の液体製剤を生成した。コントロール群として、ＬＮＰ調製に慣例的に用いられるイオン化可能なアミノ脂質であるＤ－ｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３０）を、コレステロール、ＤＥＧ－ＰＥＧ ２０００及びＤＳＰＣと、本ＬＮＰと同じモル比で混合した。０．２６８ｍＭ、２６５μＬのｍｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ（例えば、配列番号２～７のポリヌクレオチド）を６９５μＬの（１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）及びヌクレアーゼフリー水から構成される）酸性緩衝液に添加してＲＮＡ作業溶液を生成し、全体積を９６０μＬとした。ＲＮＡ作業溶液及びＬＮＰ（モル比は１：６である）を、流速比（ＦＲＲ）を３に設定し、かつ総流量（ＴＦＲ）を１２ｍＬ／ｍｉｎに設定したマイクロ流体装置（ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒプラットフォーム）の２つの注入口にそれぞれ送液し、流路内で混合し、マイクロ流体装置の排出口に到達した合流液を全体積１．２ｍＬで採取した。そして、採取された混合物をろ過し、遠心フィルタ（１０ｋＤａのカットオフ分子量のメンブレンフィルタ）による２，０００ｇでの２０分間で３回遠心分離し、ｍｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡをその中にカプセル化した脂質ナノ粒子（すなわち、カチオン性脂質－ＲＮＡ複合体）を含むろ液を、使用まで４℃で保存した。
本組成物を生成するために、本カチオン性脂質（化合物６又は２２）、コレステロール、ＤＥＧ－ＰＥＧ ２０００及びジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）を５０：３８．５：１．５：１０のモル比でエタノールにおいて十分に混合し、全体積を５００μＬとし、それにより脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の液体製剤を生成した。コントロール群として、ＬＮＰ調製に慣例的に用いられるイオン化可能なアミノ脂質であるＤ－ｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３０）を、コレステロール、ＤＥＧ－ＰＥＧ ２０００及びＤＳＰＣと、本ＬＮＰと同じモル比で混合した。０．２６８ｍＭ、２６５μＬのｍｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ（例えば、配列番号２～７のポリヌクレオチド）を６９５μＬの（１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）及びヌクレアーゼフリー水から構成される）酸性緩衝液に添加してＲＮＡ作業溶液を生成し、全体積を９６０μＬとした。ＲＮＡ作業溶液及びＬＮＰ（モル比は１：６である）を、流速比（ＦＲＲ）を３に設定し、かつ総流量（ＴＦＲ）を１２ｍＬ／ｍｉｎに設定したマイクロ流体装置（ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒプラットフォーム）の２つの注入口にそれぞれ送液し、流路内で混合し、マイクロ流体装置の排出口に到達した合流液を全体積１．２ｍＬで採取した。そして、採取された混合物をろ過し、遠心フィルタ（１０ｋＤａのカットオフ分子量のメンブレンフィルタ）による２，０００ｇでの２０分間で３回遠心分離し、ｍｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡをその中にカプセル化した脂質ナノ粒子（すなわち、カチオン性脂質－ＲＮＡ複合体）を含むろ液を、使用まで４℃で保存した。
【0077】
カチオン性脂質－ＲＮＡ複合体の特徴付け
カチオン性脂質－ＲＮＡ複合体の粒子サイズ及びゼータ電位を、粒子サイズ及びゼータ電位分析装置（ＤｅｌｓａＮａｎｏ Ｃ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を用いてそれぞれ決定した。
カチオン性脂質－ＲＮＡ複合体の粒子サイズ及びゼータ電位を、粒子サイズ及びゼータ電位分析装置（ＤｅｌｓａＮａｎｏ Ｃ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を用いてそれぞれ決定した。
【0078】
ｍｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡをカプセル化するためにリポソームのカプセル化の比率を、蛍光色素（ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ）を含むＲＮＡ定量キットを活用して、蛍光リーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ２００ Ｐｒｏ）によって決定した。標準曲線の構成のために、既知濃度（すなわち、１００μｇ／ｍＬ）のｍｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡの吸収スペクトルをまず取得した。そして（通常、各サンプルウェルについて５０μＬの全体積を有する）カチオン性脂質－ＲＮＡ複合体を、各ウェルにおいてＲＮＡ定量キットによる試薬と混合した。任意選択的に、カチオン性脂質－ＲＮＡ複合体を溶解緩衝液にさらし、それによりＲＮＡを懸濁液に戻した。ｍｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡの量を５３５ｎｍでのそれらの吸収強度を標準曲線のものに内挿することによって定量し、ＷｔはＬＮＰ溶解懸濁液中に放出されたｍｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡの全量であり、Ｗｉは調製の間に最初に添加したｍｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡの全分量であるとして、カプセル化効率（ＥＥ）を以下の式、
カプセル化効率（ＥＥ％）＝（Ｗｔ／Ｗｉ）×１００％
によって算出した。
カプセル化効率（ＥＥ％）＝（Ｗｔ／Ｗｉ）×１００％
によって算出した。
【0079】
フローサイトメトリー分析
細胞選別は、フルオロクロムを結合させたｍｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡによるフローサイトメトリーを介して実施され、具体的には、ｍｉＲＮＡに遠赤色蛍光標識Ｃｙ５色素を結合した。選別前の最終洗浄後、細胞塊の除去のために３５μｍのナイロンセルストレーナーを通じて細胞をろ過し、そしてフローサイトメーター（ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ Ｘ－２０）及び解析ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて選別にかけた。
細胞選別は、フルオロクロムを結合させたｍｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡによるフローサイトメトリーを介して実施され、具体的には、ｍｉＲＮＡに遠赤色蛍光標識Ｃｙ５色素を結合した。選別前の最終洗浄後、細胞塊の除去のために３５μｍのナイロンセルストレーナーを通じて細胞をろ過し、そしてフローサイトメーター（ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ Ｘ－２０）及び解析ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて選別にかけた。
【0080】
実施例１ 本カチオン性脂質の化学合成
本カチオン性脂質を、スキームＩ～ＩＶに記載したステップによりそれぞれ合成した。一般に、グリシンのアミノ（ＮＨ２）基を、まずフェナシル（ＰＡｃ）基又はｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基で保護した。グリセロールとグリシンの間及び／又はグリセロールと脂肪酸の間の縮合反応（すなわち、脱水）の後、保護基を除去し、ＮＨ２基に還元した。
本カチオン性脂質を、スキームＩ～ＩＶに記載したステップによりそれぞれ合成した。一般に、グリシンのアミノ（ＮＨ２）基を、まずフェナシル（ＰＡｃ）基又はｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基で保護した。グリセロールとグリシンの間及び／又はグリセロールと脂肪酸の間の縮合反応（すなわち、脱水）の後、保護基を除去し、ＮＨ２基に還元した。
【0081】
スキームＩ
【化17】
【0082】
スキームＩＩ
【化18】
【0083】
スキームＩＩＩ
【化19】
【0084】
スキームＩＶ
【化20】
【0085】
例示的な化合物を調製する方法並びに結果として調製された化合物に関する分析データを以下に記載する。
【0086】
１．１ ＴＧＧ－リノール酸（ＴＧＧ－ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）（化合物６）
【化21】
【0087】
ｔｅｒｔ－ブチル２－（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエナミド）アセテート（ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ ２－（（９Ｚ，１２Ｚ）－ｏｃｔａｄｅｃａ－９，１２－ｄｉｅｎａｍｉｄｏ）ａｃｅｔａｔｅ）（１）の調製
Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（Ｎ，Ｎ’－Ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）（ＤＣＣ、０．４０ｇ、１．９６ｍｍｏｌ）を１０ｍＬのジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）（ＤＣＭ）に溶解した溶液に、リノール酸（０．５ｇ、１．７８ｍｍｏｌ）、ｔ－ブチル２－アミノアセテート（０．２７ｍＬ、１．９６ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．１３、１．０７ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を、室温で一晩撹拌した。十分に混合した後、１，３－ジシクロヘキシル尿素（１，３－Ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｕｒｅａ）（ＤＣＵ）をろ過除去し、溶液をロータリーエバポレーターによって除去した。残留溶液を酢酸エチル（ヘキサン：ＥＡ、３：１）で溶出されるカラムクロマトグラフィによって精製して４８０ｍｇの固体（化合物１）を得た（収率６９％）。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 5.93 (s, 1H), 5.44 - 5.26 (m, 4H), 3.95 (d, J = 4.9 Hz, 2H), 2.78 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 2.29 - 2.17 (m, 2H), 2.10 - 2.02 (m, 4H), 1.66 (dd, J = 15.7, 8.8 Hz, 3H), 1.49 (s, 9H), 1.39 - 1.28 (m, 14H), 0.91 (t, J = 7.0 Hz, 3H).
Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（Ｎ，Ｎ’－Ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）（ＤＣＣ、０．４０ｇ、１．９６ｍｍｏｌ）を１０ｍＬのジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）（ＤＣＭ）に溶解した溶液に、リノール酸（０．５ｇ、１．７８ｍｍｏｌ）、ｔ－ブチル２－アミノアセテート（０．２７ｍＬ、１．９６ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．１３、１．０７ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を、室温で一晩撹拌した。十分に混合した後、１，３－ジシクロヘキシル尿素（１，３－Ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｕｒｅａ）（ＤＣＵ）をろ過除去し、溶液をロータリーエバポレーターによって除去した。残留溶液を酢酸エチル（ヘキサン：ＥＡ、３：１）で溶出されるカラムクロマトグラフィによって精製して４８０ｍｇの固体（化合物１）を得た（収率６９％）。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 5.93 (s, 1H), 5.44 - 5.26 (m, 4H), 3.95 (d, J = 4.9 Hz, 2H), 2.78 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 2.29 - 2.17 (m, 2H), 2.10 - 2.02 (m, 4H), 1.66 (dd, J = 15.7, 8.8 Hz, 3H), 1.49 (s, 9H), 1.39 - 1.28 (m, 14H), 0.91 (t, J = 7.0 Hz, 3H).
【0088】
２－（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエナミド）酢酸（２－（（９Ｚ，１２Ｚ）－ｏｃｔａｄｅｃａ－９，１２－ｄｉｅｎａｍｉｄｏ）ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）（２）の調製
トリフルオロ酢酸（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）（ＴＦＡ、２．８０ｍＬ、３６．５９ｍｍｏｌ）を化合物１の溶液（８ｍＬのＤＣＭに溶解した４８０ｍｇ、１．２２ｍｍｏｌ）にゆっくり添加した。溶液を撹拌し、ＴＬＣでモニタリングした。完全に反応させた後、ＤＣＭを減圧下で除去した。残留物をヘキサン及びＥＡによって数回洗浄した。残った溶媒をロータリーエバポレーターによって除去してさらなる使用のための化合物２を得た。
トリフルオロ酢酸（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）（ＴＦＡ、２．８０ｍＬ、３６．５９ｍｍｏｌ）を化合物１の溶液（８ｍＬのＤＣＭに溶解した４８０ｍｇ、１．２２ｍｍｏｌ）にゆっくり添加した。溶液を撹拌し、ＴＬＣでモニタリングした。完全に反応させた後、ＤＣＭを減圧下で除去した。残留物をヘキサン及びＥＡによって数回洗浄した。残った溶媒をロータリーエバポレーターによって除去してさらなる使用のための化合物２を得た。
【0089】
２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）酢酸（２－（（ｔｅｒｔ－ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ａｍｉｎｏ）ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）（３）の調製
２ＮのＮａＯＨ（８．６６ｍＬ、１７．３２ｍｍｏｌ）の溶液を有するボトルに、グリシン（１ｇ、１３．３２ｍｍｏｌ）を添加し、混合物をすべてのグリシンが溶解するまで撹拌し、そしてＴＨＦ（２０ｍＬ）に溶解したＢｏｃ２Ｏ（３．３４ｇ、１５．３２ｍｍｏｌ）の溶液をボトルに添加し、室温で一晩撹拌した。ＴＨＦを蒸発によって除去した。塩基性溶液を作るために、２ＮのＮａＯＨ溶液を残留物に添加し、ＥＡによって洗浄した。ｐＨ値を、２ＭのＨＣｌを添加することによって３～４に調整した。水相をＥＡで抽出した。有機相をＭｇＳＯ４において乾燥させ、ろ過し、溶媒をロータリーエバポレーターによって除去して１．３８ｇの白色固体生成物を得た（化合物３、収率５９％）。
1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 5.03 (s, 1H), 3.97 (t, J = 20.4 Hz, 2H), 1.48 (s, 9H).
２ＮのＮａＯＨ（８．６６ｍＬ、１７．３２ｍｍｏｌ）の溶液を有するボトルに、グリシン（１ｇ、１３．３２ｍｍｏｌ）を添加し、混合物をすべてのグリシンが溶解するまで撹拌し、そしてＴＨＦ（２０ｍＬ）に溶解したＢｏｃ２Ｏ（３．３４ｇ、１５．３２ｍｍｏｌ）の溶液をボトルに添加し、室温で一晩撹拌した。ＴＨＦを蒸発によって除去した。塩基性溶液を作るために、２ＮのＮａＯＨ溶液を残留物に添加し、ＥＡによって洗浄した。ｐＨ値を、２ＭのＨＣｌを添加することによって３～４に調整した。水相をＥＡで抽出した。有機相をＭｇＳＯ４において乾燥させ、ろ過し、溶媒をロータリーエバポレーターによって除去して１．３８ｇの白色固体生成物を得た（化合物３、収率５９％）。
1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 5.03 (s, 1H), 3.97 (t, J = 20.4 Hz, 2H), 1.48 (s, 9H).
【0090】
２－ヒドロキシプロパン－１，３－ジイルビス（２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）アセテート）（２－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅ－１，３－ｄｉｙｌ ｂｉｓ（２－（（ｔｅｒｔ－ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ａｍｉｎｏ）ａｃｅｔａｔｅ））（４）の調製
ＤＣＭに溶解したＤＣＣ（０．９９ｇ、４．７８ｍｍｏｌ）の溶液に、グリセロール（０．２ｇ、２．１７ｍｍｏｌ）、化合物３（０．８０ｇ、４．５６ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．２７ｇ、２．１７ｍｍｏｌ）を添加し、室温で一晩撹拌した。混合物をろ過にかけてＤＣＵを除去し、そして蒸発させて粗生成物を得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィ（ヘキサン：ＥＡ、５０：５０→３０：７０）によって精製して１３０ｍｇの粘着性の透明な液体生成物を得た（化合物４、収率１５％）。LC-MS (ESI); m/z: [M+H]+ Calcd. for C17H30N2O9,406.20. Found 407.41.
ＤＣＭに溶解したＤＣＣ（０．９９ｇ、４．７８ｍｍｏｌ）の溶液に、グリセロール（０．２ｇ、２．１７ｍｍｏｌ）、化合物３（０．８０ｇ、４．５６ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．２７ｇ、２．１７ｍｍｏｌ）を添加し、室温で一晩撹拌した。混合物をろ過にかけてＤＣＵを除去し、そして蒸発させて粗生成物を得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィ（ヘキサン：ＥＡ、５０：５０→３０：７０）によって精製して１３０ｍｇの粘着性の透明な液体生成物を得た（化合物４、収率１５％）。LC-MS (ESI); m/z: [M+H]+ Calcd. for C17H30N2O9,406.20. Found 407.41.
【0091】
２－（２－（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエナミド）アセトキシ）プロパン－１，３－ジイルビス（２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）アセテート）（２－（２－（（９Ｚ，１２Ｚ）－ｏｃｔａｄｅｃａ－９，１２－ｄｉｅｎａｍｉｄｏ）ａｃｅｔｏｘｙ）ｐｒｏｐａｎｅ－１，３－ｄｉｙｌ ｂｉｓ（２－（（ｔｅｒｔ－ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ａｍｉｎｏ）ａｃｅｔａｔｅ））（５）の調製
ＤＣＭに溶解したＤＣＣ（０．０７３ｇ、０．３５ｍｍｏｌ）の溶液に、化合物４（０．１３ｇ、０．３２ｍｍｏｌ）、化合物２（０．１２ｇ、０．３５ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．０３９ｇ、０．３２ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を室温で一晩撹拌した。完全に混合した後、溶液をろ過してＤＣＵを除去し、そして減圧下で蒸発させてＤＣＭを除去した。残留溶液をカラムクロマトグラフィ（ヘキサン：ＥＡ、２：３）によって精製して２００ｍｇの白色固体生成物を得た（化合物５、収率８６％）。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 5.36 (ddd, J = 27.2, 14.1, 6.3 Hz, 4H), 5.21 (s, 1H), 4.40 (dt, J = 18.0, 9.0 Hz, 2H), 4.34 - 4.23 (m, 2H), 4.13 - 3.97 (m, 2H), 3.97 - 3.82 (m, 4H), 2.79 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 2.27 (dd, J = 14.3, 6.9 Hz, 2H), 2.11 (d, J = 5.8 Hz, 1H), 2.06 (dd, J = 13.8, 6.8 Hz, 3H), 1.95 (s, 2H), 1.86 (dd, J = 9.8, 4.7 Hz, 2H), 1.78 (d, J = 13.3 Hz, 2H), 1.70 - 1.61 (m, 3H), 1.47 (s, 18H), 1.41 - 1.26 (m, 16H), 0.91 (t, J = 6.6 Hz, 3H). LC-MS (ESI); m/z: [M+H]+ Calcd. for C37H63N3O11, 725.45. Found 726.7.
ＤＣＭに溶解したＤＣＣ（０．０７３ｇ、０．３５ｍｍｏｌ）の溶液に、化合物４（０．１３ｇ、０．３２ｍｍｏｌ）、化合物２（０．１２ｇ、０．３５ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．０３９ｇ、０．３２ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を室温で一晩撹拌した。完全に混合した後、溶液をろ過してＤＣＵを除去し、そして減圧下で蒸発させてＤＣＭを除去した。残留溶液をカラムクロマトグラフィ（ヘキサン：ＥＡ、２：３）によって精製して２００ｍｇの白色固体生成物を得た（化合物５、収率８６％）。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 5.36 (ddd, J = 27.2, 14.1, 6.3 Hz, 4H), 5.21 (s, 1H), 4.40 (dt, J = 18.0, 9.0 Hz, 2H), 4.34 - 4.23 (m, 2H), 4.13 - 3.97 (m, 2H), 3.97 - 3.82 (m, 4H), 2.79 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 2.27 (dd, J = 14.3, 6.9 Hz, 2H), 2.11 (d, J = 5.8 Hz, 1H), 2.06 (dd, J = 13.8, 6.8 Hz, 3H), 1.95 (s, 2H), 1.86 (dd, J = 9.8, 4.7 Hz, 2H), 1.78 (d, J = 13.3 Hz, 2H), 1.70 - 1.61 (m, 3H), 1.47 (s, 18H), 1.41 - 1.26 (m, 16H), 0.91 (t, J = 6.6 Hz, 3H). LC-MS (ESI); m/z: [M+H]+ Calcd. for C37H63N3O11, 725.45. Found 726.7.
【0092】
２－（２－（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエナミド）アセトキシ）プロパン－１，３－ジイルビス（２－アミノアセテート）（２－（２－（（９Ｚ，１２Ｚ）－ｏｃｔａｄｅｃａ－９，１２－ｄｉｅｎａｍｉｄｏ）ａｃｅｔｏｘｙ）ｐｒｏｐａｎｅ－１，３－ｄｉｙｌ ｂｉｓ（２－ａｍｉｎｏａｃｅｔａｔｅ））（６）の調製
６ｍＬのＤＣＭに溶解した化合物５（０．２ｇ、０．２８ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（０．４２ｍＬ、５．５１ｍｍｏｌ）をゆっくり添加した。反応物質が消費されるまで溶液を撹拌した。そして、結果として得られた溶液を減圧下で蒸発させて溶媒を除去し、エーテル及びＤＣＭで洗浄した。残留溶媒を蒸発によって除去して４８ｍｇの粘着性の透明な生成物を提供した（化合物６、収率３３％）。1H NMR (600 MHz, MeOD) δ 5.53 - 5.44 (m, 1H), 5.41 - 5.28 (m, 4H), 4.60 - 4.37 (m, 4H), 3.94 - 3.84 (m, 6H), 2.79 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.28 (dd, J = 9.8, 5.0 Hz, 2H), 2.07 (dd, J = 12.2, 6.2 Hz, 4H), 1.67 - 1.55 (m, 2H), 1.41 - 1.27 (m, 15H), 0.92 (t, J = 6.8 Hz, 3H). LC-MS (ESI); m/z: [M+H]+ Calcd. for C27H47N3O7, 525.34. Found 527.38.
６ｍＬのＤＣＭに溶解した化合物５（０．２ｇ、０．２８ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（０．４２ｍＬ、５．５１ｍｍｏｌ）をゆっくり添加した。反応物質が消費されるまで溶液を撹拌した。そして、結果として得られた溶液を減圧下で蒸発させて溶媒を除去し、エーテル及びＤＣＭで洗浄した。残留溶媒を蒸発によって除去して４８ｍｇの粘着性の透明な生成物を提供した（化合物６、収率３３％）。1H NMR (600 MHz, MeOD) δ 5.53 - 5.44 (m, 1H), 5.41 - 5.28 (m, 4H), 4.60 - 4.37 (m, 4H), 3.94 - 3.84 (m, 6H), 2.79 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.28 (dd, J = 9.8, 5.0 Hz, 2H), 2.07 (dd, J = 12.2, 6.2 Hz, 4H), 1.67 - 1.55 (m, 2H), 1.41 - 1.27 (m, 15H), 0.92 (t, J = 6.8 Hz, 3H). LC-MS (ESI); m/z: [M+H]+ Calcd. for C27H47N3O7, 525.34. Found 527.38.
【0093】
１．２ ＴＧＧ－ジ（リノール酸）（ＴＧＧ－ｄｉ（ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ））化合物９
【0094】
手順１
【化22】
【0095】
２，３－ジヒドロキシプロピル２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）アセテート（２，３－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ２－（（ｔｅｒｔ－ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ａｍｉｎｏ）ａｃｅｔａｔｅ）（７）の調製
グリセロール（０．４２ｇ、４．５７ｍｍｏｌ）、化合物３（０．２ｇ、１．１４ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（０．３５ｇ、２．２８ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．１４ｇ、１．１４ｍｍｏｌ）を混合し、ＤＣＭに溶解した。溶液を室温で一晩撹拌した。結果として得られた溶液を蒸発させてＤＣＭを除去して粗生成物を得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィ（ＥＡ、１００％）によって精製して１２０ｍｇの粘着性の液体生成物を得た（化合物７、収率４２％）。1H NMR (600 MHz, MeOD) δ 4.59 (s, 1H), 4.22 (dd, J = 11.3, 4.3 Hz, 1H), 4.16 - 4.10 (m, 1H), 3.88 - 3.81 (m, 2H), 3.57 (dd, J = 5.6, 2.1 Hz, 2H), 1.46 (s, 9H).
グリセロール（０．４２ｇ、４．５７ｍｍｏｌ）、化合物３（０．２ｇ、１．１４ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（０．３５ｇ、２．２８ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．１４ｇ、１．１４ｍｍｏｌ）を混合し、ＤＣＭに溶解した。溶液を室温で一晩撹拌した。結果として得られた溶液を蒸発させてＤＣＭを除去して粗生成物を得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィ（ＥＡ、１００％）によって精製して１２０ｍｇの粘着性の液体生成物を得た（化合物７、収率４２％）。1H NMR (600 MHz, MeOD) δ 4.59 (s, 1H), 4.22 (dd, J = 11.3, 4.3 Hz, 1H), 4.16 - 4.10 (m, 1H), 3.88 - 3.81 (m, 2H), 3.57 (dd, J = 5.6, 2.1 Hz, 2H), 1.46 (s, 9H).
【0096】
３－（２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）アセトキシ）プロパン－１，２－ジイルビス（２－（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエナミド）アセテート）（３－（２－（（ｔｅｒｔ－ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ａｍｉｎｏ）ａｃｅｔｏｘｙ）ｐｒｏｐａｎｅ－１，２－ｄｉｙｌ ｂｉｓ（２－（（９Ｚ，１２Ｚ）－ｏｃｔａｄｅｃａ－９，１２－ｄｉｅｎａｍｉｄｏ）ａｃｅｔａｔｅ））（８）の調製
化合物７（０．１ｇ、０．４０ｍｍｏｌ）、化合物２（０．３０ｇ、０．８８ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（０．１６ｇ、１．００ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．０５９ｇ、０．４８ｍｍｏｌ）を混合し、ＤＣＭに溶解した。室温で一晩撹拌した後、混合物を蒸発させてＤＣＭを除去した。残留溶液をＥＡ／Ｈ２Ｏで抽出した。有機相を採取し、ＭｇＳＯ４において乾燥させてろ過した。結果として得られたろ液を蒸発させてＥＡを除去した。粗生成物をカラムクロマトグラフィ（ヘキサン：ＥＡ、３：７）によって精製して１９０ｍｇの粘着性の褐色液体生成物を得た（化合物９、収率５３％）。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 5.46 - 5.31 (m, 8H), 4.46 (dd, J = 12.0, 3.5 Hz, 1H), 4.41 - 4.33 (m, 2H), 4.28 (ddd, J = 17.9, 12.1, 6.2 Hz, 1H), 4.14 (q, J = 7.1 Hz, 1H), 4.07 (ddd, J = 19.8, 9.8, 5.1 Hz, 3H), 4.00 (d, J = 3.6 Hz, 2H), 3.96 - 3.83 (m, 2H), 2.79 (t, J = 6.8 Hz, 3H), 2.27 (ddd, J = 9.9, 7.8, 5.2 Hz, 4H), 2.13 - 2.00 (m, 8H), 1.76 - 1.61 (m, 8H), 1.47 (s, 9H), 1.40 - 1.26 (m, 28H), 0.91 (t, J = 7.0 Hz, 6H).
化合物７（０．１ｇ、０．４０ｍｍｏｌ）、化合物２（０．３０ｇ、０．８８ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（０．１６ｇ、１．００ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．０５９ｇ、０．４８ｍｍｏｌ）を混合し、ＤＣＭに溶解した。室温で一晩撹拌した後、混合物を蒸発させてＤＣＭを除去した。残留溶液をＥＡ／Ｈ２Ｏで抽出した。有機相を採取し、ＭｇＳＯ４において乾燥させてろ過した。結果として得られたろ液を蒸発させてＥＡを除去した。粗生成物をカラムクロマトグラフィ（ヘキサン：ＥＡ、３：７）によって精製して１９０ｍｇの粘着性の褐色液体生成物を得た（化合物９、収率５３％）。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 5.46 - 5.31 (m, 8H), 4.46 (dd, J = 12.0, 3.5 Hz, 1H), 4.41 - 4.33 (m, 2H), 4.28 (ddd, J = 17.9, 12.1, 6.2 Hz, 1H), 4.14 (q, J = 7.1 Hz, 1H), 4.07 (ddd, J = 19.8, 9.8, 5.1 Hz, 3H), 4.00 (d, J = 3.6 Hz, 2H), 3.96 - 3.83 (m, 2H), 2.79 (t, J = 6.8 Hz, 3H), 2.27 (ddd, J = 9.9, 7.8, 5.2 Hz, 4H), 2.13 - 2.00 (m, 8H), 1.76 - 1.61 (m, 8H), 1.47 (s, 9H), 1.40 - 1.26 (m, 28H), 0.91 (t, J = 7.0 Hz, 6H).
【0097】
手順２
【化23】
【0098】
３－（２－（トリチルアミノ）アセトキシ）プロパン－１，２－ジイルビス（２－（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエナミド）アセテート）（３－（２－（ｔｒｉｔｙｌａｍｉｎｏ）ａｃｅｔｏｘｙ）ｐｒｏｐａｎｅ－１，２－ｄｉｙｌ ｂｉｓ（２－（（９Ｚ，１２Ｚ）－ｏｃｔａｄｅｃａ－９，１２－ｄｉｅｎａｍｉｄｏ）ａｃｅｔａｔｅ））（２５）の調製
グリセロール（０．２９ｇ、３．１５ｍｍｏｌ）、ｔｒｔ－グリシン（０．２ｇ、０．６３ｍｍｏｌ）を混合し、ＤＣＭ／ジオキサンの溶媒に溶解して混合物を提供した。混合物にＤＣＣ（０．１７ｇ、０．８２ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．０３８ｇ、０．３２ｍｍｏｌ）を徐々に添加し、室温で一晩撹拌した。溶液をろ過してＤＣＵを除去し、減圧下で蒸発させて溶媒を除去した。粗生成物をカラムクロマトグラフィ（Ｈｅｘ：ＥＡ＝１：３）によって精製して１９５ｍｇの白色固体生成物を得た（化合物２５、収率７９％）。1H NMR (600 MHz, MeOD) δ 7.62 - 7.38 (m, 6H), 7.30 (dd, J = 10.6, 5.0 Hz, 6H), 7.24 - 7.16 (m, 3H), 4.11 (dd, J = 11.3, 4.2 Hz, 1H), 4.02 (dd, J = 11.3, 6.4 Hz, 1H), 3.76 (td, J = 9.9, 5.7 Hz, 1H), 3.50 (d, J = 5.7 Hz, 2H), 3.13 (s, 2H).
グリセロール（０．２９ｇ、３．１５ｍｍｏｌ）、ｔｒｔ－グリシン（０．２ｇ、０．６３ｍｍｏｌ）を混合し、ＤＣＭ／ジオキサンの溶媒に溶解して混合物を提供した。混合物にＤＣＣ（０．１７ｇ、０．８２ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．０３８ｇ、０．３２ｍｍｏｌ）を徐々に添加し、室温で一晩撹拌した。溶液をろ過してＤＣＵを除去し、減圧下で蒸発させて溶媒を除去した。粗生成物をカラムクロマトグラフィ（Ｈｅｘ：ＥＡ＝１：３）によって精製して１９５ｍｇの白色固体生成物を得た（化合物２５、収率７９％）。1H NMR (600 MHz, MeOD) δ 7.62 - 7.38 (m, 6H), 7.30 (dd, J = 10.6, 5.0 Hz, 6H), 7.24 - 7.16 (m, 3H), 4.11 (dd, J = 11.3, 4.2 Hz, 1H), 4.02 (dd, J = 11.3, 6.4 Hz, 1H), 3.76 (td, J = 9.9, 5.7 Hz, 1H), 3.50 (d, J = 5.7 Hz, 2H), 3.13 (s, 2H).
【0099】
３－（２－（トリチルアミノ）アセトキシ）プロパン－１，２－ジイルビス（２－（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエナミド）アセテート）（３－（２－（ｔｒｉｔｙｌａｍｉｎｏ）ａｃｅｔｏｘｙ）ｐｒｏｐａｎｅ－１，２－ｄｉｙｌ ｂｉｓ（２－（（９Ｚ，１２Ｚ）－ｏｃｔａｄｅｃａ－９，１２－ｄｉｅｎａｍｉｄｏ）ａｃｅｔａｔｅ））（２６）の調製
化合物２５（０．２ｇ、０．５１ｍｍｏｌ）、化合物２（０．４０ｇ、１．１８ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（０．１８ｇ、１．１８ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．０６２ｇ、０．５１ｍｍｏｌ）を混合し、ＤＣＭに溶解した。溶液を室温で一晩撹拌し、そして減圧下で蒸発させて乾燥させてＤＣＭを除去した。粗生成物をカラムクロマトグラフィ（ヘキサン：ＥＡ、３：２）によって精製して２６６ｍｇの粘着性の白色生成物を得た（化合物２６、収率５１％）。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.49 (d, J = 7.7 Hz, 6H), 7.36 (d, J = 6.4 Hz, 5H), 7.31 (dd, J = 6.7, 2.3 Hz, 2H), 5.46 - 5.29 (m, 6H), 5.27 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 4.26 (ddd, J = 19.0, 11.9, 5.4 Hz, 3H), 4.14 (dd, J = 11.8, 5.8 Hz, 1H), 4.09 - 3.91 (m, 4H), 2.79 (t, J = 6.8 Hz, 3H), 2.27 (dd, J = 14.0, 6.6 Hz, 4H), 2.07 (dd, J = 12.3, 5.3 Hz, 6H), 1.62 (dd, J = 27.0, 19.6 Hz, 11H), 1.52 - 1.20 (m, 28H), 0.97 - 0.81 (m, 6H).
化合物２５（０．２ｇ、０．５１ｍｍｏｌ）、化合物２（０．４０ｇ、１．１８ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（０．１８ｇ、１．１８ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．０６２ｇ、０．５１ｍｍｏｌ）を混合し、ＤＣＭに溶解した。溶液を室温で一晩撹拌し、そして減圧下で蒸発させて乾燥させてＤＣＭを除去した。粗生成物をカラムクロマトグラフィ（ヘキサン：ＥＡ、３：２）によって精製して２６６ｍｇの粘着性の白色生成物を得た（化合物２６、収率５１％）。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.49 (d, J = 7.7 Hz, 6H), 7.36 (d, J = 6.4 Hz, 5H), 7.31 (dd, J = 6.7, 2.3 Hz, 2H), 5.46 - 5.29 (m, 6H), 5.27 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 4.26 (ddd, J = 19.0, 11.9, 5.4 Hz, 3H), 4.14 (dd, J = 11.8, 5.8 Hz, 1H), 4.09 - 3.91 (m, 4H), 2.79 (t, J = 6.8 Hz, 3H), 2.27 (dd, J = 14.0, 6.6 Hz, 4H), 2.07 (dd, J = 12.3, 5.3 Hz, 6H), 1.62 (dd, J = 27.0, 19.6 Hz, 11H), 1.52 - 1.20 (m, 28H), 0.97 - 0.81 (m, 6H).
【0100】
３－（２－アミノアセトキシ）プロパン－１，２－ジイルビス（２－（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエナミド）アセテート）（３－（２－ａｍｉｎｏａｃｅｔｏｘｙ）ｐｒｏｐａｎｅ－１，２－ｄｉｙｌ ｂｉｓ（２－（（９Ｚ，１２Ｚ）－ｏｃｔａｄｅｃａ－９，１２－ｄｉｅｎａｍｉｄｏ）ａｃｅｔａｔｅ））（９）の調製
ＤＣＭに溶解した化合物２６（０．２７ｇ、０．２６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（０．３ｍＬ、３．９３ｍｍｏｌ）をゆっくり添加し、すべての反応物質が消費されるまで撹拌した。溶液を蒸発させ、エーテルで数回洗浄して溶媒を除去した。粗生成物をカラムクロマトグラフィ（Ｈｅｘ：ＥＡ＝１：１→ＤＣＭ：ＭｅＯＨ，９５：５）によって精製して１３１ｍｇの糊状の褐色生成物を得た（化合物９、収率６４％）。1H NMR (600 MHz, MeOD) δ 5.48 - 5.25 (m, 8H), 4.53 - 4.44 (m, 2H), 4.37 (ddd, J = 18.1, 12.1, 5.0 Hz, 2H), 4.06 - 3.81 (m, 6H), 2.79 (t, J = 6.8 Hz, 3H), 2.27 (td, J = 7.5, 4.1 Hz, 4H), 2.08 (dt, J = 10.9, 5.1 Hz, 7H), 1.72 - 1.56 (m, 4H), 1.50 - 1.14 (m, 28H), 0.92 (t, J = 7.0 Hz, 6H). LC-MS (ESI); m/z: [M+H]+ Calcd. for C45H77N3O8,787.57. Found 789.48.
ＤＣＭに溶解した化合物２６（０．２７ｇ、０．２６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（０．３ｍＬ、３．９３ｍｍｏｌ）をゆっくり添加し、すべての反応物質が消費されるまで撹拌した。溶液を蒸発させ、エーテルで数回洗浄して溶媒を除去した。粗生成物をカラムクロマトグラフィ（Ｈｅｘ：ＥＡ＝１：１→ＤＣＭ：ＭｅＯＨ，９５：５）によって精製して１３１ｍｇの糊状の褐色生成物を得た（化合物９、収率６４％）。1H NMR (600 MHz, MeOD) δ 5.48 - 5.25 (m, 8H), 4.53 - 4.44 (m, 2H), 4.37 (ddd, J = 18.1, 12.1, 5.0 Hz, 2H), 4.06 - 3.81 (m, 6H), 2.79 (t, J = 6.8 Hz, 3H), 2.27 (td, J = 7.5, 4.1 Hz, 4H), 2.08 (dt, J = 10.9, 5.1 Hz, 7H), 1.72 - 1.56 (m, 4H), 1.50 - 1.14 (m, 28H), 0.92 (t, J = 7.0 Hz, 6H). LC-MS (ESI); m/z: [M+H]+ Calcd. for C45H77N3O8,787.57. Found 789.48.
【0101】
１．３ ＤＧＧ－リノール酸（ＤＧＧ－ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）（化合物１１）
【化24】
【0102】
２－（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノイルオキシ）プロパン－１，３－ジイルビス（２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）アセテート）（２－（（９Ｚ，１２Ｚ）－ｏｃｔａｄｅｃａ－９，１２－ｄｉｅｎｏｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐａｎｅ－１，３－ｄｉｙｌ ｂｉｓ（２－（（ｔｅｒｔ－ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ａｍｉｎｏ）ａｃｅｔａｔｅ））（１０）の調製
８ｍＬのＤＣＭに溶解したＤＣＣ（７６ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）の溶液に、化合物４（０．１５ｇ、０．３７ｍｍｏｌ）、リノール酸（９３ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（３２ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を混合して添加した。混合物を室温で一晩撹拌し、そしてろ過してＤＣＵを除去した。そして、溶液を蒸発させて粗生成物を得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィ（ヘキサン：ＥＡ、７：３）によって精製して１４０ｍｇの透明な液体生成物を得た（化合物１０、収率６３％）。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 5.33 (ddt, J = 14.9, 10.0, 7.8 Hz, 2H), 5.14 - 5.01 (m, 1H), 4.47 - 4.34 (m, 2H), 4.25 (dd, J = 11.9, 5.7 Hz, 1H), 4.22 - 4.11 (m, 1H), 4.11 - 4.00 (m, 1H), 3.93 (s,4H), 2.79 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 2.41 - 2.28 (m, 2H), 2.16 - 2.01 (m, 2H), 1.92 - 1.83 (m, 1H), 1.69 - 1.51 (m, 9H), 1.47 (s, 18H), 1.42 - 1.20 (m, 14H), 0.91 (dd, J = 8.6, 5.3 Hz, 3H).
８ｍＬのＤＣＭに溶解したＤＣＣ（７６ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）の溶液に、化合物４（０．１５ｇ、０．３７ｍｍｏｌ）、リノール酸（９３ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（３２ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を混合して添加した。混合物を室温で一晩撹拌し、そしてろ過してＤＣＵを除去した。そして、溶液を蒸発させて粗生成物を得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィ（ヘキサン：ＥＡ、７：３）によって精製して１４０ｍｇの透明な液体生成物を得た（化合物１０、収率６３％）。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 5.33 (ddt, J = 14.9, 10.0, 7.8 Hz, 2H), 5.14 - 5.01 (m, 1H), 4.47 - 4.34 (m, 2H), 4.25 (dd, J = 11.9, 5.7 Hz, 1H), 4.22 - 4.11 (m, 1H), 4.11 - 4.00 (m, 1H), 3.93 (s,4H), 2.79 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 2.41 - 2.28 (m, 2H), 2.16 - 2.01 (m, 2H), 1.92 - 1.83 (m, 1H), 1.69 - 1.51 (m, 9H), 1.47 (s, 18H), 1.42 - 1.20 (m, 14H), 0.91 (dd, J = 8.6, 5.3 Hz, 3H).
【0103】
２－（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノイルオキシ）プロパン－１，３－ジイルビス（２－アミノアセテート）（２－（（９Ｚ，１２Ｚ）－ｏｃｔａｄｅｃａ－９，１２－ｄｉｅｎｏｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐａｎｅ－１，３－ｄｉｙｌ ｂｉｓ（２－ａｍｉｎｏａｃｅｔａｔｅ））（１１）の調製
６ｍＬのＤＣＭに溶解した化合物１０（０．１４ｇ、０．２１ｍｍｏｌ）を含む溶液に、ＴＦＡ（０．４０ｍＬ、５．２３ｍｍｏｌ）をゆっくり添加した。反応物質が消費されるまで溶液を撹拌し、そして蒸発させて溶媒を除去し、エーテル及びＤＣＭで洗浄した。結果として得られたものを蒸発させて化合物１１を得た（６０ｍｇの糊状の透明な生成物、収率６１％）。1H NMR (600 MHz, MeOD) δ 5.51 (s, 1H), 5.45 (dd, J = 9.3, 4.9 Hz, 1H), 5.42 - 5.29 (m, 4H), 4.57 (dt, J = 12.0, 4.1 Hz, 1H), 4.50 - 4.43 (m, 1H), 4.39 (dd, J = 12.0, 6.4 Hz, 1H), 3.96 - 3.82 (m, 3H), 2.79 (t, J = 6.7 Hz, 2), 2.38 (td, J = 7.5, 4.9 Hz, 2H), 2.16 - 1.99 (m, 3H), 1.64 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 1.44 - 1.26 (m, 13H), 0.92 (dd, J = 9.4, 4.5 Hz, 3H). LC-MS (ESI); m/z: [M+H]+ Calcd. for C25H44N2O6,468.32. Found 470.22.
６ｍＬのＤＣＭに溶解した化合物１０（０．１４ｇ、０．２１ｍｍｏｌ）を含む溶液に、ＴＦＡ（０．４０ｍＬ、５．２３ｍｍｏｌ）をゆっくり添加した。反応物質が消費されるまで溶液を撹拌し、そして蒸発させて溶媒を除去し、エーテル及びＤＣＭで洗浄した。結果として得られたものを蒸発させて化合物１１を得た（６０ｍｇの糊状の透明な生成物、収率６１％）。1H NMR (600 MHz, MeOD) δ 5.51 (s, 1H), 5.45 (dd, J = 9.3, 4.9 Hz, 1H), 5.42 - 5.29 (m, 4H), 4.57 (dt, J = 12.0, 4.1 Hz, 1H), 4.50 - 4.43 (m, 1H), 4.39 (dd, J = 12.0, 6.4 Hz, 1H), 3.96 - 3.82 (m, 3H), 2.79 (t, J = 6.7 Hz, 2), 2.38 (td, J = 7.5, 4.9 Hz, 2H), 2.16 - 1.99 (m, 3H), 1.64 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 1.44 - 1.26 (m, 13H), 0.92 (dd, J = 9.4, 4.5 Hz, 3H). LC-MS (ESI); m/z: [M+H]+ Calcd. for C25H44N2O6,468.32. Found 470.22.
【0104】
１．４ ＭＧＧ－ジ（リノール酸）（ＭＧＧ－ｄｉ（ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ））（化合物１４）
【化25】
【0105】
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）－２－ヒドロキシプロパン－１，３－ジイルビス（オクタデカ－９，１２－ジエノエート）（（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）－２－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅ－１，３－ｄｉｙｌ ｂｉｓ（ｏｃｔａｄｅｃａ－９，１２－ｄｉｅｎｏａｔｅ））（１２）の調製
丸底ボトルにおいて、グリセロール（０．２ｇ、２．１７ｍｍｏｌ）、リノール酸（１．２８ｇ、４．５６ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（０．７８ｇ、５．００ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．２７ｇ、２．１７ｍｍｏｌ）を１２ｍＬのＤＣＭに溶解して混合した。溶液を室温で一晩撹拌し、そして蒸発させてＤＣＭを除去した。粗生成物をカラムクロマトグラフィ（ヘキサン：ＥＡ、３：２）によって精製して３１０ｍｇの生成物を得た（化合物１２、収率２３％）。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 5.51 - 5.24 (m, 7H), 4.33 - 3.94 (m, 5H), 2.79 (t, J = 6.8 Hz, 4H), 2.37 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.07 (q, J = 6.9 Hz, 8H), 1.64 (dd, J = 14.5, 7.2 Hz, 4H), 1.48 - 1.19 (m, 28H), 0.91 (t, J = 7.0 Hz, 6H).
丸底ボトルにおいて、グリセロール（０．２ｇ、２．１７ｍｍｏｌ）、リノール酸（１．２８ｇ、４．５６ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（０．７８ｇ、５．００ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．２７ｇ、２．１７ｍｍｏｌ）を１２ｍＬのＤＣＭに溶解して混合した。溶液を室温で一晩撹拌し、そして蒸発させてＤＣＭを除去した。粗生成物をカラムクロマトグラフィ（ヘキサン：ＥＡ、３：２）によって精製して３１０ｍｇの生成物を得た（化合物１２、収率２３％）。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 5.51 - 5.24 (m, 7H), 4.33 - 3.94 (m, 5H), 2.79 (t, J = 6.8 Hz, 4H), 2.37 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.07 (q, J = 6.9 Hz, 8H), 1.64 (dd, J = 14.5, 7.2 Hz, 4H), 1.48 - 1.19 (m, 28H), 0.91 (t, J = 7.0 Hz, 6H).
【0106】
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）－２－（２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）アセトキシ）プロパン－１，３－ジイルビス（オクタデカ－９，１２－ジエノエート）（（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）－２－（２－（（ｔｅｒｔ－ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ａｍｉｎｏ）ａｃｅｔｏｘｙ）ｐｒｏｐａｎｅ－１，３－ｄｉｙｌ ｂｉｓ（ｏｃｔａｄｅｃａ－９，１２－ｄｉｅｎｏａｔｅ））（１３）の調製
１０ｍＬのＤＣＭに溶解したＤＣＣ（０．１２ｇ、０．６０ｍｍｏｌ）の溶液に、化合物１２（０．３１ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）、化合物３（０．１１ｇ、０．６０ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（４．３ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を室温で一晩撹拌し、そしてろ過してＤＣＵを除去した。溶液を蒸発させて溶媒を除去し、カラムクロマトグラフィ（ヘキサン：ＥＡ、７：３）によって精製して２７０ｍｇの生成物を得た（化合物１３、収率７０％）。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 5.46 - 5.21 (m, 8H), 4.99 (s,1H), 4.35 (dd, J = 12.1, 4.1 Hz, 2H), 4.17 (dd, J = 12.1, 5.9 Hz, 2H), 3.95 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 2.79 (t, J = 6.8 Hz, 4H), 2.33 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.07 (q, J = 7.0 Hz, 7H), 1.62 (dd, J = 15.9, 8.6 Hz, 5H), 1.47 (s, 9H), 1.43 - 1.17 (m, 28H), 0.91 (t, J = 6.9 Hz, 6H).
１０ｍＬのＤＣＭに溶解したＤＣＣ（０．１２ｇ、０．６０ｍｍｏｌ）の溶液に、化合物１２（０．３１ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）、化合物３（０．１１ｇ、０．６０ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（４．３ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を室温で一晩撹拌し、そしてろ過してＤＣＵを除去した。溶液を蒸発させて溶媒を除去し、カラムクロマトグラフィ（ヘキサン：ＥＡ、７：３）によって精製して２７０ｍｇの生成物を得た（化合物１３、収率７０％）。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 5.46 - 5.21 (m, 8H), 4.99 (s,1H), 4.35 (dd, J = 12.1, 4.1 Hz, 2H), 4.17 (dd, J = 12.1, 5.9 Hz, 2H), 3.95 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 2.79 (t, J = 6.8 Hz, 4H), 2.33 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.07 (q, J = 7.0 Hz, 7H), 1.62 (dd, J = 15.9, 8.6 Hz, 5H), 1.47 (s, 9H), 1.43 - 1.17 (m, 28H), 0.91 (t, J = 6.9 Hz, 6H).
【0107】
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）－２－（２－アミノアセトキシ）プロパン－１，３－ジイルビス（オクタデカ－９，１２－ジエノエート）（（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）－２－（２－ａｍｉｎｏａｃｅｔｏｘｙ）ｐｒｏｐａｎｅ－１，３－ｄｉｙｌ ｂｉｓ（ｏｃｔａｄｅｃａ－９，１２－ｄｉｅｎｏａｔｅ））（１４）の調製
５ｍＬのＤＣＭに溶解した化合物１３（０．２７ｇ、０．３５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（０．５３ｍＬ、６．９８ｍｍｏｌ）をゆっくり添加し、反応物質が消費されるまで撹拌した。溶液を蒸発させて溶媒を除去した。残留物をエーテル及びヘキサンで洗浄し、残留溶媒を減圧下での蒸発によって除去し、それにより、約２００ｍｇの糊状の橙色生成物を得た（化合物１４、収率８５％）。1H NMR (600 MHz, MeOD) δ 5.43 - 5.28 (m, 8H), 4.43 (dd, J = 12.2, 4.2 Hz, 2H), 4.26 (dd, J = 12.2, 5.7 Hz, 2H), 3.88 (s, 2H), 2.79 (t, J = 6.6 Hz, 4H), 2.37 (t, J = 7.4 Hz, 4H), 2.15 - 2.03 (m, 8H), 1.68 - 1.58 (m, 4H), 1.44 - 1.25 (m, 28H), 0.92 (t, J = 7.0 Hz, 6H). LC-MS (ESI); m/z: [M+H]+ Calcd. for C41H71NO6, 673.53. Found 675.91.
５ｍＬのＤＣＭに溶解した化合物１３（０．２７ｇ、０．３５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（０．５３ｍＬ、６．９８ｍｍｏｌ）をゆっくり添加し、反応物質が消費されるまで撹拌した。溶液を蒸発させて溶媒を除去した。残留物をエーテル及びヘキサンで洗浄し、残留溶媒を減圧下での蒸発によって除去し、それにより、約２００ｍｇの糊状の橙色生成物を得た（化合物１４、収率８５％）。1H NMR (600 MHz, MeOD) δ 5.43 - 5.28 (m, 8H), 4.43 (dd, J = 12.2, 4.2 Hz, 2H), 4.26 (dd, J = 12.2, 5.7 Hz, 2H), 3.88 (s, 2H), 2.79 (t, J = 6.6 Hz, 4H), 2.37 (t, J = 7.4 Hz, 4H), 2.15 - 2.03 (m, 8H), 1.68 - 1.58 (m, 4H), 1.44 - 1.25 (m, 28H), 0.92 (t, J = 7.0 Hz, 6H). LC-MS (ESI); m/z: [M+H]+ Calcd. for C41H71NO6, 673.53. Found 675.91.
【0108】
１．５ ＭＧＧ－リノール酸（ＭＧＧ－ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）（化合物１８）
【化26】
【0109】
（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）アセトキシ）－２－ヒドロキシプロピルオクタデカ－９，１２－ジエノエート（（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（２－（（ｔｅｒｔ－ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ａｍｉｎｏ）ａｃｅｔｏｘｙ）－２－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ ｏｃｔａｄｅｃａ－９，１２－ｄｉｅｎｏａｔｅ）（１７）の調製
丸底ボトルにおいて、化合物７（０．１９ｇ、０．７５ｍｍｏｌ）、リノール酸（０．１ｇ、０．３６ｍｍｏｌ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（１－Ｅｔｈｙｌ－３－（３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）（ＥＤＣＩ、０．１１ｇ、０．７３ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（４４ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）を混合し、１０ｍＬのＤＣＭに溶解した。溶液を室温で一晩撹拌し、そして蒸発させてＤＣＭを除去した。粗生成物をカラムクロマトグラフィ（Ｈｅｘ：ＥＡ、２：３）によって精製して７５ｍｇの粘着性の液体生成物を得た（化合物１７、収率４１％）。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 5.47 - 5.30 (m, 2H), 4.50 - 4.01 (m, 5H), 3.96 (d, J = 5.4 Hz, 2H), 2.79 (t, J = 6.9 Hz, 1H), 2.37 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.07 (dd, J = 13.4, 7.2 Hz, 2H), 1.63 (dd, J = 23.5, 18.2 Hz, 8H), 1.53 - 1.38 (m, 9H), 1.45 - 1.19 (m, 14H), 0.99 - 0.85 (m, 3H).
丸底ボトルにおいて、化合物７（０．１９ｇ、０．７５ｍｍｏｌ）、リノール酸（０．１ｇ、０．３６ｍｍｏｌ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（１－Ｅｔｈｙｌ－３－（３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）（ＥＤＣＩ、０．１１ｇ、０．７３ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（４４ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）を混合し、１０ｍＬのＤＣＭに溶解した。溶液を室温で一晩撹拌し、そして蒸発させてＤＣＭを除去した。粗生成物をカラムクロマトグラフィ（Ｈｅｘ：ＥＡ、２：３）によって精製して７５ｍｇの粘着性の液体生成物を得た（化合物１７、収率４１％）。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 5.47 - 5.30 (m, 2H), 4.50 - 4.01 (m, 5H), 3.96 (d, J = 5.4 Hz, 2H), 2.79 (t, J = 6.9 Hz, 1H), 2.37 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.07 (dd, J = 13.4, 7.2 Hz, 2H), 1.63 (dd, J = 23.5, 18.2 Hz, 8H), 1.53 - 1.38 (m, 9H), 1.45 - 1.19 (m, 14H), 0.99 - 0.85 (m, 3H).
【0110】
（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（２－アミノアセトキシ）－２－ヒドロキシプロピルオクタデカ－９，１２－ジエノエート（（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（２－ａｍｉｎｏａｃｅｔｏｘｙ）－２－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ ｏｃｔａｄｅｃａ－９，１２－ｄｉｅｎｏａｔｅ）（１８）の調製
４ｍＬのＤＣＭに溶解した化合物１７（７５ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（０．２２ｍＬ、２．９３ｍｍｏｌ）をゆっくり添加し、反応物質が消費されるまで撹拌し、そして溶液を蒸発させてＤＣＭを除去した。残留物をエーテル及びＤＣＭで洗浄した。そして、残った溶媒を減圧下で再度蒸発させ、それにより約７５ｍｇの糊状の淡褐色生成物を得た（化合物１８、収率１００％）。1H NMR (600 MHz, MeOD) δ 5.43 - 5.29 (m, 4H), 4.33 (dd, J = 11.4, 4.3 Hz, 1H), 4.28 (dd, J = 11.4, 5.8 Hz, 1H), 4.15 (dd, J = 5.4, 3.8 Hz, 1H), 4.11 - 4.03 (m, 1H), 3.89 (s, 2H), 2.79 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.38 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.11 - 2.05 (m, 4H), 1.68 - 1.59 (m, 2H), 1.41 - 1.28 (m, 14H), 0.92 (t, J = 7.0 Hz, 3H). LC-MS (ESI); m/z: [M+H]+ Calcd. for C23H41NO5,411.30. Found 412.98.
４ｍＬのＤＣＭに溶解した化合物１７（７５ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（０．２２ｍＬ、２．９３ｍｍｏｌ）をゆっくり添加し、反応物質が消費されるまで撹拌し、そして溶液を蒸発させてＤＣＭを除去した。残留物をエーテル及びＤＣＭで洗浄した。そして、残った溶媒を減圧下で再度蒸発させ、それにより約７５ｍｇの糊状の淡褐色生成物を得た（化合物１８、収率１００％）。1H NMR (600 MHz, MeOD) δ 5.43 - 5.29 (m, 4H), 4.33 (dd, J = 11.4, 4.3 Hz, 1H), 4.28 (dd, J = 11.4, 5.8 Hz, 1H), 4.15 (dd, J = 5.4, 3.8 Hz, 1H), 4.11 - 4.03 (m, 1H), 3.89 (s, 2H), 2.79 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.38 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.11 - 2.05 (m, 4H), 1.68 - 1.59 (m, 2H), 1.41 - 1.28 (m, 14H), 0.92 (t, J = 7.0 Hz, 3H). LC-MS (ESI); m/z: [M+H]+ Calcd. for C23H41NO5,411.30. Found 412.98.
【0111】
１．６ ＴＧＧ－ジ（パルミトレイン酸）（ＴＧＧ－ｄｉ（ｐａｌｍｉｔｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ））（化合物２２）
【0112】
手順１
【化27】
【0113】
（Ｚ）－２－（２－（ヘキサデック－９－エナミド）アセトキシ）プロパン－１，３－ジイルビス（２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）アセテート）（（Ｚ）－２－（２－（ｈｅｘａｄｅｃ－９－ｅｎａｍｉｄｏ）ａｃｅｔｏｘｙ）ｐｒｏｐａｎｅ－１，３－ｄｉｙｌ ｂｉｓ（２－（（ｔｅｒｔ－ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ａｍｉｎｏ）ａｃｅｔａｔｅ））（１９）の調製
丸底ボトルにおいて、１２ｍＬのＤＣＭに溶解したＤＣＣ（０．９７ｇ、４．７２ｍｍｏｌ）の溶液に、パルミトレイン酸（１ｇ、３．９３ｍｍｏｌ）、ｔ－ブチル２－アミノアセテート（０．６２ｇ、４．７２ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．３４ｇ、２．７５ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を室温で一晩撹拌し、そしてろ過してＤＣＵを除去し、蒸発させて溶媒を除去した。粗生成物をカラムクロマトグラフィ（ヘキサン：ＥＡ、３：１）によって精製して約１．０４ｇの粘着性の透明な液体生成物を得た（化合物１９、収率７２％）。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 5.92 (s, 1H), 5.36 (ddd, J = 7.5, 3.9, 1.9 Hz, 2H), 3.96 (d, J = 4.9 Hz, 2H), 2.24 (dd, J = 10.1, 5.3 Hz, 2H), 2.03 (q, J = 6.5 Hz, 3H), 1.66 (dd, J = 14.5, 7.7 Hz, 2H), 1.49 (s, 9H), 1.31 (ddd, J = 21.0, 13.6, 7.1 Hz, 16H), 0.90 (dd, J = 9.7, 4.4 Hz, 3H).
丸底ボトルにおいて、１２ｍＬのＤＣＭに溶解したＤＣＣ（０．９７ｇ、４．７２ｍｍｏｌ）の溶液に、パルミトレイン酸（１ｇ、３．９３ｍｍｏｌ）、ｔ－ブチル２－アミノアセテート（０．６２ｇ、４．７２ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．３４ｇ、２．７５ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を室温で一晩撹拌し、そしてろ過してＤＣＵを除去し、蒸発させて溶媒を除去した。粗生成物をカラムクロマトグラフィ（ヘキサン：ＥＡ、３：１）によって精製して約１．０４ｇの粘着性の透明な液体生成物を得た（化合物１９、収率７２％）。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 5.92 (s, 1H), 5.36 (ddd, J = 7.5, 3.9, 1.9 Hz, 2H), 3.96 (d, J = 4.9 Hz, 2H), 2.24 (dd, J = 10.1, 5.3 Hz, 2H), 2.03 (q, J = 6.5 Hz, 3H), 1.66 (dd, J = 14.5, 7.7 Hz, 2H), 1.49 (s, 9H), 1.31 (ddd, J = 21.0, 13.6, 7.1 Hz, 16H), 0.90 (dd, J = 9.7, 4.4 Hz, 3H).
【0114】
（Ｚ）－２－（ヘキサデック－９－エナミド）酢酸（（Ｚ）－２－（ｈｅｘａｄｅｃ－９－ｅｎａｍｉｄｏ）ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）（２０）の調製
ＤＣＭに溶解した化合物１９（１．０４ｇ、２．８３ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（４．３３ｍＬ、５６．５９ｍｍｏｌ）をゆっくり添加し、反応物質が消費されるまで撹拌した。溶液を蒸発させてＤＣＭを除去した。残留物をエーテル及びヘキサンで洗浄し、残った溶媒を減圧下での蒸発によって再度除去し、それにより、さらなる使用のための白色粉末生成物（約８７０ｍｇ、化合物２０）（収率９９％）を提供した。1H NMR (600 MHz, MeOD) δ 5.36 (t, J = 4.7 Hz, 2H), 3.90 (s, 2H), 2.26 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.04 (dd, J = 11.9, 6.2 Hz, 4H), 1.73 - 1.60 (m, 2H), 1.33 (dd, J = 14.6, 8.6 Hz, 16H), 0.92 (t, J = 7.0 Hz, 3H).
ＤＣＭに溶解した化合物１９（１．０４ｇ、２．８３ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（４．３３ｍＬ、５６．５９ｍｍｏｌ）をゆっくり添加し、反応物質が消費されるまで撹拌した。溶液を蒸発させてＤＣＭを除去した。残留物をエーテル及びヘキサンで洗浄し、残った溶媒を減圧下での蒸発によって再度除去し、それにより、さらなる使用のための白色粉末生成物（約８７０ｍｇ、化合物２０）（収率９９％）を提供した。1H NMR (600 MHz, MeOD) δ 5.36 (t, J = 4.7 Hz, 2H), 3.90 (s, 2H), 2.26 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.04 (dd, J = 11.9, 6.2 Hz, 4H), 1.73 - 1.60 (m, 2H), 1.33 (dd, J = 14.6, 8.6 Hz, 16H), 0.92 (t, J = 7.0 Hz, 3H).
【0115】
（Ｚ）－３－（２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）アセトキシ）プロパン－１，２－ジイルビス（２－（（Ｚ）－ヘキサデック－９－エナミド）アセテート）（（Ｚ）－３－（２－（（ｔｅｒｔ－ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ａｍｉｎｏ）ａｃｅｔｏｘｙ）ｐｒｏｐａｎｅ－１，２－ｄｉｙｌ ｂｉｓ（２－（（Ｚ）－ｈｅｘａｄｅｃ－９－ｅｎａｍｉｄｏ）ａｃｅｔａｔｅ））（２１）の調製
丸底ボトルにおいて、化合物７（５０ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）、化合物２０（０．１４ｇ、０．４４ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（７０ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（２５ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を混合し、１０ｍｌのＤＣＭに添加した。溶液を室温で一晩撹拌し、そして減圧下で蒸発させてＤＣＭを除去した。粗生成物をカラムクロマトグラフィ（Ｈｅｘ：ＥＡ、１：４）によって精製して１４０ｍｇの粘着性の橙色液体生成物を得た（化合物２１、収率８４％）。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 5.43 - 5.33 (m, 2H), 4.41 - 4.32 (m, 2H), 4.11 - 4.03 (m, 4H), 3.95 - 3.86 (m, 2H), 2.28 (tt, J = 13.8, 6.9 Hz, 4H), 2.07 - 1.99 (m, 4H), 1.92 (tdd, J = 20.5, 12.6, 7.8 Hz, 2H), 1.86 - 1.76 (m, 2H), 1.75 - 1.51 (m, 12H), 1.48 (s, 9H), 1.44 - 1.21 (m, 32H), 0.91 (q, J = 6.9 Hz, 6H).
丸底ボトルにおいて、化合物７（５０ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）、化合物２０（０．１４ｇ、０．４４ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（７０ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（２５ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を混合し、１０ｍｌのＤＣＭに添加した。溶液を室温で一晩撹拌し、そして減圧下で蒸発させてＤＣＭを除去した。粗生成物をカラムクロマトグラフィ（Ｈｅｘ：ＥＡ、１：４）によって精製して１４０ｍｇの粘着性の橙色液体生成物を得た（化合物２１、収率８４％）。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 5.43 - 5.33 (m, 2H), 4.41 - 4.32 (m, 2H), 4.11 - 4.03 (m, 4H), 3.95 - 3.86 (m, 2H), 2.28 (tt, J = 13.8, 6.9 Hz, 4H), 2.07 - 1.99 (m, 4H), 1.92 (tdd, J = 20.5, 12.6, 7.8 Hz, 2H), 1.86 - 1.76 (m, 2H), 1.75 - 1.51 (m, 12H), 1.48 (s, 9H), 1.44 - 1.21 (m, 32H), 0.91 (q, J = 6.9 Hz, 6H).
【0116】
（Ｚ）－３－（２－アミノアセトキシ）プロパン－１，２－ジイルビス（２－（（Ｚ）－ヘキサデック－９－エナミド）アセテート）（（Ｚ）－３－（２－ａｍｉｎｏａｃｅｔｏｘｙ）ｐｒｏｐａｎｅ－１，２－ｄｉｙｌ ｂｉｓ（２－（（Ｚ）－ｈｅｘａｄｅｃ－９－ｅｎａｍｉｄｏ）ａｃｅｔａｔｅ））（２２）の調製
４ｍＬのＤＣＭに溶解した化合物２１（０．１４ｇ、０．１７ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（０．２６ｍＬ、３．３５ｍｍｏｌ）をゆっくり添加し、反応物質が完全に消費されるまで撹拌した。そして溶液を蒸発させてＤＣＭを除去し、残留物をヘキサン及びＤＣＭで洗浄した。残った溶媒を減圧下での蒸発によってさらに除去した。結果として、約８０ｍｇの糊状の橙色生成物を得た（化合物２２、収率６４％）。1H NMR (600 MHz, MeOD) δ 5.37 (dd, J = 19.9, 15.0 Hz, 5H), 4.61 - 4.24 (m, 4H), 4.04 - 3.79 (m, 6H), 2.27 (td, J = 7.5, 4.0 Hz, 4H), 2.17 - 1.92 (m, 8H), 1.70 - 1.55 (m, 4H), 1.49 - 1.23 (m, 32H), 0.92 (t, J = 7.0 Hz, 6H). LC-MS (ESI); m/z: [M+H]+ Calcd. for C41H73N3O8, 735.54. Found 737.33.
４ｍＬのＤＣＭに溶解した化合物２１（０．１４ｇ、０．１７ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（０．２６ｍＬ、３．３５ｍｍｏｌ）をゆっくり添加し、反応物質が完全に消費されるまで撹拌した。そして溶液を蒸発させてＤＣＭを除去し、残留物をヘキサン及びＤＣＭで洗浄した。残った溶媒を減圧下での蒸発によってさらに除去した。結果として、約８０ｍｇの糊状の橙色生成物を得た（化合物２２、収率６４％）。1H NMR (600 MHz, MeOD) δ 5.37 (dd, J = 19.9, 15.0 Hz, 5H), 4.61 - 4.24 (m, 4H), 4.04 - 3.79 (m, 6H), 2.27 (td, J = 7.5, 4.0 Hz, 4H), 2.17 - 1.92 (m, 8H), 1.70 - 1.55 (m, 4H), 1.49 - 1.23 (m, 32H), 0.92 (t, J = 7.0 Hz, 6H). LC-MS (ESI); m/z: [M+H]+ Calcd. for C41H73N3O8, 735.54. Found 737.33.
【0117】
手順２
【化28】
【0118】
（Ｚ）－２－（２－（ヘキサデック－９－エナミド）アセトキシ）プロパン－１，３－ジイルビス（２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）アセテート）（（Ｚ）－２－（２－（ｈｅｘａｄｅｃ－９－ｅｎａｍｉｄｏ）ａｃｅｔｏｘｙ）ｐｒｏｐａｎｅ－１，３－ｄｉｙｌ ｂｉｓ（２－（（ｔｅｒｔ－ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ａｍｉｎｏ）ａｃｅｔａｔｅ））（１９）の調製
丸底ボトルにおいて、１０ｍｌのＤＣＭに溶解したＤＣＣ（１．１６ｇ、５．６６ｍｍｏｌ）の溶液に、パルミトレイン酸（１．２ｇ、４．７２ｍｍｏｌ）、ｔ－ブチル２－アミノアセテート（０．７４ｇ、５．６６ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．４ｇ、３．３ｍｍｏｌ）を徐々に添加し、室温で一晩撹拌した。混合物をろ過してＤＣＵを除去し、蒸発させて溶媒を除去した。粗生成物をカラムクロマトグラフィ（ヘキサン：ＥＡ、４：１）によって精製して約１．３７ｇの粘着性の透明な液体生成物を得た（化合物１９、収率７２％）。
丸底ボトルにおいて、１０ｍｌのＤＣＭに溶解したＤＣＣ（１．１６ｇ、５．６６ｍｍｏｌ）の溶液に、パルミトレイン酸（１．２ｇ、４．７２ｍｍｏｌ）、ｔ－ブチル２－アミノアセテート（０．７４ｇ、５．６６ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．４ｇ、３．３ｍｍｏｌ）を徐々に添加し、室温で一晩撹拌した。混合物をろ過してＤＣＵを除去し、蒸発させて溶媒を除去した。粗生成物をカラムクロマトグラフィ（ヘキサン：ＥＡ、４：１）によって精製して約１．３７ｇの粘着性の透明な液体生成物を得た（化合物１９、収率７２％）。
【0119】
（Ｚ）－２－（ヘキサデック－９－エナミド）酢酸（（Ｚ）－２－（ｈｅｘａｄｅｃ－９－ｅｎａｍｉｄｏ）ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）（２０）の調製
ＤＣＭに溶解した化合物１９（１．３７ｇ、３．７３ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（４．２８ｍＬ、５５．９１ｍｍｏｌ）をゆっくり添加し、反応物質が消費されるまで撹拌した。溶液を蒸発させてＤＣＭを除去した。残留物をエーテル及びヘキサンで洗浄し、残った溶媒を減圧下での蒸発によって再度除去し、それにより、さらなる使用のための白色粉末生成物（約１１５０ｍｇ、化合物２０）（収率９９％）を提供した。
ＤＣＭに溶解した化合物１９（１．３７ｇ、３．７３ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（４．２８ｍＬ、５５．９１ｍｍｏｌ）をゆっくり添加し、反応物質が消費されるまで撹拌した。溶液を蒸発させてＤＣＭを除去した。残留物をエーテル及びヘキサンで洗浄し、残った溶媒を減圧下での蒸発によって再度除去し、それにより、さらなる使用のための白色粉末生成物（約１１５０ｍｇ、化合物２０）（収率９９％）を提供した。
【0120】
３－（２－（トリチルアミノ）アセトキシ）プロパン－１，２－ジイルビス（２－（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエナミド）アセテート）（３－（２－（ｔｒｉｔｙｌａｍｉｎｏ）ａｃｅｔｏｘｙ）ｐｒｏｐａｎｅ－１，２－ｄｉｙｌ ｂｉｓ（２－（（９Ｚ，１２Ｚ）－ｏｃｔａｄｅｃａ－９，１２－ｄｉｅｎａｍｉｄｏ）ａｃｅｔａｔｅ））（２５）の調製
グリセロール（０．２９ｇ、３．１５ｍｍｏｌ）、ｔｒｔ－グリシン（０．２ｇ、０．６３ｍｍｏｌ）を丸底ボトルに注入し、ＤＣＭ／ジオキサンの混合物を溶媒として添加した。ＤＣＣ（０．１７ｇ、０．８２ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（３８ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）を丸底ボトル中に徐々に添加した。溶液を室温で一晩撹拌した後、ＤＣＵを除去した。溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をカラムクロマトグラフィ（Ｈｅｘ：ＥＡ＝１：３）によって精製して１９５ｍｇの白色固体生成物を得た（収率７９％）。
グリセロール（０．２９ｇ、３．１５ｍｍｏｌ）、ｔｒｔ－グリシン（０．２ｇ、０．６３ｍｍｏｌ）を丸底ボトルに注入し、ＤＣＭ／ジオキサンの混合物を溶媒として添加した。ＤＣＣ（０．１７ｇ、０．８２ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（３８ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）を丸底ボトル中に徐々に添加した。溶液を室温で一晩撹拌した後、ＤＣＵを除去した。溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をカラムクロマトグラフィ（Ｈｅｘ：ＥＡ＝１：３）によって精製して１９５ｍｇの白色固体生成物を得た（収率７９％）。
【0121】
（Ｚ）－３－（２－（トリチルアミノ）アセトキシ）プロパン－１，２－ジイルビス（２－（（Ｚ）－ヘキサデック－９－エナミド）アセテート）（（Ｚ）－３－（２－（ｔｒｉｔｙｌａｍｉｎｏ）ａｃｅｔｏｘｙ）ｐｒｏｐａｎｅ－１，２－ｄｉｙｌ ｂｉｓ（２－（（Ｚ）－ｈｅｘａｄｅｃ－９－ｅｎａｍｉｄｏ）ａｃｅｔａｔｅ））（２７）の調製
化合物２５（０．２ｇ、０．５１ｍｍｏｌ）、化合物２０（０．３７ｇ、１．１８ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（０．１８ｇ、１．１８ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（６０ｍｇ、０．５１ｍｍｏｌ）を混合し、１０ｍｌのＤＣＭに溶解し、混合物を室温で一晩撹拌した。そして、混合物を蒸発させてＤＣＭを除去して粗生成物を得た。そして、粗生成物をカラムクロマトグラフィ（Ｈｅｘ：ＥＡ、３：２）によって精製して２８０ｍｇの粘性の白色生成物を得た（化合物２７、収率５６％）。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.49 (d, J = 7.6 Hz, 6H), 7.36 (s, 5H), 5.37 (dd, J = 9.6, 4.3 Hz, 2H), 5.32 - 5.20 (m, 1H), 4.31 - 4.20 (m, 3H), 4.15 (s, 1H), 4.09 - 4.02 (m, 4H), 3.96 (dd, J = 18.1, 5.3 Hz, 1H), 2.27 (td, J = 7.7, 3.9 Hz, 4H), 2.08 - 1.97 (m, 4H), 1.97 - 1.87 (m, 2H), 1.86 - 1.75 (m, 2H), 1.63 (dd, J = 23.3, 15.7 Hz, 14H), 1.49 - 1.20 (m, 30H), 0.91 (q, J = 6.9 Hz, 6H).
化合物２５（０．２ｇ、０．５１ｍｍｏｌ）、化合物２０（０．３７ｇ、１．１８ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（０．１８ｇ、１．１８ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（６０ｍｇ、０．５１ｍｍｏｌ）を混合し、１０ｍｌのＤＣＭに溶解し、混合物を室温で一晩撹拌した。そして、混合物を蒸発させてＤＣＭを除去して粗生成物を得た。そして、粗生成物をカラムクロマトグラフィ（Ｈｅｘ：ＥＡ、３：２）によって精製して２８０ｍｇの粘性の白色生成物を得た（化合物２７、収率５６％）。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.49 (d, J = 7.6 Hz, 6H), 7.36 (s, 5H), 5.37 (dd, J = 9.6, 4.3 Hz, 2H), 5.32 - 5.20 (m, 1H), 4.31 - 4.20 (m, 3H), 4.15 (s, 1H), 4.09 - 4.02 (m, 4H), 3.96 (dd, J = 18.1, 5.3 Hz, 1H), 2.27 (td, J = 7.7, 3.9 Hz, 4H), 2.08 - 1.97 (m, 4H), 1.97 - 1.87 (m, 2H), 1.86 - 1.75 (m, 2H), 1.63 (dd, J = 23.3, 15.7 Hz, 14H), 1.49 - 1.20 (m, 30H), 0.91 (q, J = 6.9 Hz, 6H).
【0122】
（Ｚ）－３－（２－アミノアセトキシ）プロパン－１，２－ジイルビス（２－（（Ｚ）－ヘキサデック－９－エナミド）アセテート）（（Ｚ）－３－（２－ａｍｉｎｏａｃｅｔｏｘｙ）ｐｒｏｐａｎｅ－１，２－ｄｉｙｌ ｂｉｓ（２－（（Ｚ）－ｈｅｘａｄｅｃ－９－ｅｎａｍｉｄｏ）ａｃｅｔａｔｅ））（２２）の調製
８ｍＬのＤＣＭに溶解した化合物２７（０．２８ｇ、０．２９ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（０．３３ｍＬ、４．２９ｍｍｏｌ）をゆっくり添加し、反応物質が完全に消費されるまで撹拌した。溶液を蒸発させて溶媒を除去し、残留物をカラムクロマトグラフィ（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ、９５：５～９０：１０）によって精製して約２００ｍｇの粘性の白色から淡黄色の固体生成物を得た（化合物２２、収率９４％）。1H NMR (600 MHz, MeOD) δ 5.40 (tt, J = 6.3, 4.1 Hz, 1H), 5.37 - 5.29 (m, 3H), 4.51 - 4.43 (m, 2H), 4.37 (tt, J = 18.1, 6.2 Hz, 2H), 4.05 - 3.76 (m, 6H), 2.26 (td, J = 7.5, 4.1 Hz, 4H), 2.02 (dd, J = 20.5, 13.2 Hz, 7H), 1.71 - 1.55 (m, 5H), 1.46 - 1.17 (m, 32H), 0.90 (t, J = 7.0 Hz, 6H). LC-MS (ESI); m/z: [M+H]+ Calcd. for C41H73N3O8, 735.54. Found 737.18.
８ｍＬのＤＣＭに溶解した化合物２７（０．２８ｇ、０．２９ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（０．３３ｍＬ、４．２９ｍｍｏｌ）をゆっくり添加し、反応物質が完全に消費されるまで撹拌した。溶液を蒸発させて溶媒を除去し、残留物をカラムクロマトグラフィ（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ、９５：５～９０：１０）によって精製して約２００ｍｇの粘性の白色から淡黄色の固体生成物を得た（化合物２２、収率９４％）。1H NMR (600 MHz, MeOD) δ 5.40 (tt, J = 6.3, 4.1 Hz, 1H), 5.37 - 5.29 (m, 3H), 4.51 - 4.43 (m, 2H), 4.37 (tt, J = 18.1, 6.2 Hz, 2H), 4.05 - 3.76 (m, 6H), 2.26 (td, J = 7.5, 4.1 Hz, 4H), 2.02 (dd, J = 20.5, 13.2 Hz, 7H), 1.71 - 1.55 (m, 5H), 1.46 - 1.17 (m, 32H), 0.90 (t, J = 7.0 Hz, 6H). LC-MS (ESI); m/z: [M+H]+ Calcd. for C41H73N3O8, 735.54. Found 737.18.
【0123】
１．７ ＴＧＧ－パルミトレイン酸（ＴＧＧ－ｐａｌｍｉｔｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）（化合物２４）
【化29】
【0124】
（Ｚ）－２－（２－（ヘキサデック－９－エナミド）アセトキシ）プロパン－１，３－ジイルビス（２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）アセテート）（（Ｚ）－２－（２－（ｈｅｘａｄｅｃ－９－ｅｎａｍｉｄｏ）ａｃｅｔｏｘｙ）ｐｒｏｐａｎｅ－１，３－ｄｉｙｌ ｂｉｓ（２－（（ｔｅｒｔ－ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ａｍｉｎｏ）ａｃｅｔａｔｅ））（２３）の調製
丸底ボトルにおいて、化合物４（０．２２ｇ、０．５４ｍｍｏｌ）、化合物２０（０．２０ｇ、０．６５ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（０．１０ｇ、０．６５ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．０７ｇ、０．５４ｍｍｏｌ）を混合し、１０ｍｌのＤＣＭに溶解した。混合物を室温で一晩撹拌し、そして蒸発させてＤＣＭを除去した。残留物をＥＡ／Ｈ２Ｏで抽出し、有機相を採取し、ＭｇＳＯ４において乾燥させ、ろ過した。ろ液を減圧下で蒸発させて溶媒を除去した。粗生成物をカラムクロマトグラフィ（ヘキサン：ＥＡ、２：３）によって精製して２９０ｍｇの粘着性の透明な液体生成物を得た（化合物２３、収率７７％）。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 5.43 - 5.31 (m, 2H), 5.21 (s, 1H), 4.50 - 4.35 (m, 2H), 4.30 (dd, J = 15.4, 8.4 Hz, 2H), 4.14 - 3.96 (m, 3H), 3.98 - 3.81 (m, 3H), 2.27 (ddd, J = 15.2, 7.3, 3.2 Hz, 2H), 2.03 (dd, J = 13.1, 6.7 Hz, 2H), 1.92 (ddd, J = 19.1, 9.5, 4.8 Hz, 1H), 1.87 - 1.75 (m, 1H), 1.75 - 1.51 (m, 8H), 1.47 (s, 15H), 1.44 - 1.23 (m, 16H), 0.91 (q, J = 6.9 Hz, 3H).
丸底ボトルにおいて、化合物４（０．２２ｇ、０．５４ｍｍｏｌ）、化合物２０（０．２０ｇ、０．６５ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（０．１０ｇ、０．６５ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．０７ｇ、０．５４ｍｍｏｌ）を混合し、１０ｍｌのＤＣＭに溶解した。混合物を室温で一晩撹拌し、そして蒸発させてＤＣＭを除去した。残留物をＥＡ／Ｈ２Ｏで抽出し、有機相を採取し、ＭｇＳＯ４において乾燥させ、ろ過した。ろ液を減圧下で蒸発させて溶媒を除去した。粗生成物をカラムクロマトグラフィ（ヘキサン：ＥＡ、２：３）によって精製して２９０ｍｇの粘着性の透明な液体生成物を得た（化合物２３、収率７７％）。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 5.43 - 5.31 (m, 2H), 5.21 (s, 1H), 4.50 - 4.35 (m, 2H), 4.30 (dd, J = 15.4, 8.4 Hz, 2H), 4.14 - 3.96 (m, 3H), 3.98 - 3.81 (m, 3H), 2.27 (ddd, J = 15.2, 7.3, 3.2 Hz, 2H), 2.03 (dd, J = 13.1, 6.7 Hz, 2H), 1.92 (ddd, J = 19.1, 9.5, 4.8 Hz, 1H), 1.87 - 1.75 (m, 1H), 1.75 - 1.51 (m, 8H), 1.47 (s, 15H), 1.44 - 1.23 (m, 16H), 0.91 (q, J = 6.9 Hz, 3H).
【0125】
（Ｚ）－２－（２－（ヘキサデック－９－エナミド）アセトキシ）プロパン－１，３－ジイルビス（２－アミノアセテート）（（Ｚ）－２－（２－（ｈｅｘａｄｅｃ－９－ｅｎａｍｉｄｏ）ａｃｅｔｏｘｙ）ｐｒｏｐａｎｅ－１，３－ｄｉｙｌ ｂｉｓ（２－ａｍｉｎｏａｃｅｔａｔｅ））（２４）の調製
５ｍＬのＤＣＭに溶解した化合物２３（０．２９ｇ、０．４１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（０．９５ｍＬ、１２．４３ｍｍｏｌ）をゆっくり添加し、すべての反応物質が消費されるまで撹拌した。溶液中のＤＣＭをロータリーエバポレーターによって除去した後、残留物をヘキサン及びエーテルによって洗浄した。残った溶媒を減圧下での蒸発によって除去し、それにより約１７０ｍｇの粘着性の透明な生成物を得た（化合物２４、収率８３％）。1H NMR (600 MHz, MeOD) δ 5.51 - 5.45 (m, 1H), 5.36 (dd, J = 7.5, 3.4 Hz, 2H), 4.57 - 4.44 (m, 3H), 3.94 - 3.88 (m, 5H), 2.33 - 2.22 (m, 2H), 2.05 (dt, J = 12.1, 4.2 Hz, 4H), 1.63 (dd, J = 14.4, 7.2 Hz, 2H), 1.45 - 1.22 (m, 16H), 0.91 (t, J = 7.0 Hz, 3H). LC-MS (ESI); m/z: [M+H]+ Calcd. for C25H45N3O7 499.33. Found 501.12.
５ｍＬのＤＣＭに溶解した化合物２３（０．２９ｇ、０．４１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（０．９５ｍＬ、１２．４３ｍｍｏｌ）をゆっくり添加し、すべての反応物質が消費されるまで撹拌した。溶液中のＤＣＭをロータリーエバポレーターによって除去した後、残留物をヘキサン及びエーテルによって洗浄した。残った溶媒を減圧下での蒸発によって除去し、それにより約１７０ｍｇの粘着性の透明な生成物を得た（化合物２４、収率８３％）。1H NMR (600 MHz, MeOD) δ 5.51 - 5.45 (m, 1H), 5.36 (dd, J = 7.5, 3.4 Hz, 2H), 4.57 - 4.44 (m, 3H), 3.94 - 3.88 (m, 5H), 2.33 - 2.22 (m, 2H), 2.05 (dt, J = 12.1, 4.2 Hz, 4H), 1.63 (dd, J = 14.4, 7.2 Hz, 2H), 1.45 - 1.22 (m, 16H), 0.91 (t, J = 7.0 Hz, 3H). LC-MS (ESI); m/z: [M+H]+ Calcd. for C25H45N3O7 499.33. Found 501.12.
【0126】
実施例２ 本カチオン性脂質の核酸のカプセル化及び送達支援
２．１ 核酸のカプセル化
この実施例では、核酸を保護するための本カチオン性脂質についての能力を調査した。この目的のために、実施例１のカチオン性脂質（すなわち、化合物６、９、１１、１４、１８、２２又は２４）を独立してプラスミドと共培養し、そして「材料及び方法」の節に記載された手順に従ってＤＮＡ消化及び抽出にかけた。サンプルを、アガロースゲル電気泳動を介して分析し、結果を図１に提供する。
２．１ 核酸のカプセル化
この実施例では、核酸を保護するための本カチオン性脂質についての能力を調査した。この目的のために、実施例１のカチオン性脂質（すなわち、化合物６、９、１１、１４、１８、２２又は２４）を独立してプラスミドと共培養し、そして「材料及び方法」の節に記載された手順に従ってＤＮＡ消化及び抽出にかけた。サンプルを、アガロースゲル電気泳動を介して分析し、結果を図１に提供する。
【0127】
消化後、すべての検出可能なヌクレオチドが抽出され、リポソーム（すなわち、カチオン性脂質－ＤＮＡ複合体）に由来することがゲル電気泳動から明らかとなり、本カチオン性脂質がプラスミドをカプセル化可能であり、プラスミドをヌクレアーゼの作用から保護可能であることが示された（図１のレーン２５～２８及び３１～３４）。
【0128】
さらに、短鎖ＲＮＡをカプセル化するための本カチオン性脂質のカプセル化の比率を調査した。この目的のために、市販のカチオン性脂質及び本カチオン性脂質（すなわち、化合物６（ＴＧＧ－リノール酸）及び２２（ＴＧＧ－ジ（パルミトレイン酸）））を、「材料及び方法」の節に記載された調製手順に従って、それぞれフルオロクロム結合短鎖ＲＮＡ（すなわち、Ｃｙ５－ｍｉｒ３０２ａ－ｓｉＲＮＡ、配列番号６及び７）と混合し、それにより、その中に短鎖ＲＮＡを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を生成した。各ＬＮＰのサイズ、ゼータ電位及びカプセル化効率（ＥＥ）を「材料と方法」の節に記載された手順により分析した。結果を表１にまとめる。
【表1】
【0129】
表１のデータは、化合物６及び２２の双方が順調にリポソームを形成し、それらの中にｓｉＲＮＡをカプセル化したことを明らかにした。具体的には、市販のカチオン性脂質ＭＣ３０で作製されたＬＮＰと比較して、本化合物２２から構成された本ＬＮＰでは、サイズがより小さく、カプセル化効率がより高かった。
【0130】
２．２ 核酸の送達
この実施例では、本カチオン性脂質が細胞内への核酸の送達を促進し得るか否かを調査した。この目的のために、Ａ５４９及びＮＣＩ－Ｈ４６０肺癌細胞株を、それぞれ、様々な濃度のｓｉＲＮＡ（０．２５、１．２５又は２．５ｎｇ／μＬ）をその中に有する本ＬＮＰ又はコントロールＬＮＰと２４時間共培養し、フローサイトメトリーによってトランスフェクション効率を検証した。結果を図２Ａ～２Ｂに示す。
この実施例では、本カチオン性脂質が細胞内への核酸の送達を促進し得るか否かを調査した。この目的のために、Ａ５４９及びＮＣＩ－Ｈ４６０肺癌細胞株を、それぞれ、様々な濃度のｓｉＲＮＡ（０．２５、１．２５又は２．５ｎｇ／μＬ）をその中に有する本ＬＮＰ又はコントロールＬＮＰと２４時間共培養し、フローサイトメトリーによってトランスフェクション効率を検証した。結果を図２Ａ～２Ｂに示す。
【0131】
化合物６又は２２から構成された本ＬＮＰと共培養した後、肺癌細胞から放出される蛍光強度は徐々に増加することが、図２Ａ及び２Ｂのフローサイトメトリーヒストグラムから明らかとなり、外部からの核酸が癌細胞内に順調にトランスフェクションされたことを示す。さらに、ピークは、本化合物２２（ＴＧＧ－ジ（パルミトレイン酸））から構成されたＬＮＰの最右端のヒストグラムにシフトしており、それが化合物６から構成されたＬＮＰのものよりも良好な送達有効性を有することが示された。
【0132】
上述のデータは、本新規のカチオン性脂質はその中に機能性核酸をカプセル化可能であることを全体として示し、したがって、本カチオン性脂質によって組み立てられた脂質ナノ粒子は細胞内への治療薬の送達のための担体として作用可能であり、それにより、効果的な遺伝子編集、細胞工学及び疾患処置が達成される。
【0133】
実施形態の上記説明は例示としてのみ与えられること及び種々の変形が当業者によってなされ得ることが理解されるはずである。上記仕様、実施例及びデータは、発明の例示的実施形態の構造及び使用の完全な説明を与える。発明の種々の実施形態がある程度の特殊性で又は１以上の個別の実施形態を参照して上述されたが、当業者であれば、本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく開示の実施形態に対して多数の変更を行うことができるはずである。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【配列表】
【外国語明細書】