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特開2024-69112血管周皮細胞と血管内皮細胞の接着関連因子の発現増大剤、及び肌色改善成分のスクリーニング方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024069112
(43)【公開日】2024-05-21
(54)【発明の名称】血管周皮細胞と血管内皮細胞の接着関連因子の発現増大剤、及び肌色改善成分のスクリーニング方法
(51)【国際特許分類】
A61K 8/9789 20170101AFI20240514BHJP
C12Q 1/06 20060101ALI20240514BHJP
A61Q 19/00 20060101ALI20240514BHJP
A61K 36/739 20060101ALI20240514BHJP
A61K 36/48 20060101ALI20240514BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240514BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20240514BHJP
【ＦＩ】
A61K8/9789
C12Q1/06
A61Q19/00
A61K36/739
A61K36/48
A61P43/00 105
A61P17/00
【審査請求】未請求
【請求項の数】13
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022179927
(22)【出願日】2022-11-09
(71)【出願人】
【識別番号】000113470
【氏名又は名称】ポーラ化成工業株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100137338
【弁理士】
【氏名又は名称】辻田 朋子
(74)【代理人】
【識別番号】100196313
【弁理士】
【氏名又は名称】村松 大輔
(72)【発明者】
【氏名】大葉 椋介
(72)【発明者】
【氏名】佐藤 綾
【テーマコード（参考）】
4B063
4C083
4C088
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ08
4B063QQ79
4B063QR08
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS34
4B063QX02
4C083AA111
4C083AA112
4C083BB51
4C083CC02
4C083EE11
4C088AB51
4C088AB59
4C088AC01
4C088AC11
4C088AC13
4C088CA08
4C088MA07
4C088MA63
4C088NA05
4C088NA14
4C088ZA89
4C088ZB21
4C088ZC75
(57)【要約】
【課題】
新規な血管周皮細胞と血管内皮細胞の接着関連因子の発現増大剤の提供、及び前記接着関連因子の発現増大成分のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【解決手段】
ワレモコウ（Ｓ．ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）のエキスを有効成分とする、血管周皮細胞と血管内皮細胞の接着関連因子の発現増大剤。
及び、血管周皮細胞と血管内皮細胞の接着状態を指標として、肌色改善成分を選出することを含む、スクリーニング方法。
【選択図】 なし
新規な血管周皮細胞と血管内皮細胞の接着関連因子の発現増大剤の提供、及び前記接着関連因子の発現増大成分のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【解決手段】
ワレモコウ（Ｓ．ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）のエキスを有効成分とする、血管周皮細胞と血管内皮細胞の接着関連因子の発現増大剤。
及び、血管周皮細胞と血管内皮細胞の接着状態を指標として、肌色改善成分を選出することを含む、スクリーニング方法。
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ワレモコウ（Ｓａｎｇｕｉｓｏｒｂａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）エキスを有効成分とする、血管周皮細胞と血管内皮細胞の接着関連因子の発現増大剤。
【請求項2】
さらに、ルイボス（Ａｓｐａｌａｔｈｕｓ ｌｉｎｅａｒｉｓ）のエキスを含む、請求項１に記載の接着関連因子の発現増大剤。
【請求項3】
前記接着関連因子が、血管周皮細胞の血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲβ）及び／又はアンジオポエチン１（ＡＮＧＰＴ１）である、請求項１又は２に記載の接着関連因子の発現増大剤。
【請求項4】
低分子ヒアルロン酸に起因する血管周皮細胞と血管内皮細胞の接着の弱化を抑制するための、請求項１又は２に記載の接着関連因子の発現増大剤。
【請求項5】
血管透過性を抑制するための、請求項１又は２に記載の接着関連因子の発現増大剤。
【請求項6】
血管周皮細胞と血管内皮細胞の接着状態を指標として、肌色改善成分を選出することを含む、スクリーニング方法。
【請求項7】
前記接着状態を増大する成分を、肌色改善成分として選出することを含む、請求項６に記載のスクリーニング方法。
【請求項8】
前記接着状態は、血管周皮細胞と血管内皮細胞の接着関連因子の発現量である、請求項６又は７に記載のスクリーニング方法。
【請求項9】
前記接着状態は、血管内皮細胞と接着している血管周皮細胞の数である、請求項６又は７に記載のスクリーニング方法。
【請求項10】
前記接着関連因子が、血管周皮細胞の血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲβ）及び／又はアンジオポエチン１（ＡＮＧＰＴ１）である、請求項８に記載のスクリーニング方法。
【請求項11】
前記肌色改善成分が、赤み、ムラ及び色素沈着の少なくとも何れかの改善成分である、請求項６又は７に記載のスクリーニング方法。
【請求項12】
前記肌色改善成分が、血管透過性の抑制成分である、請求項６又は７に記載のスクリーニング方法。
【請求項13】
低分子ヒアルロン酸存在下における前記接着状態を指標とする、請求項６又は７に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、血管周皮細胞と血管内皮細胞の接着関連因子の発現増大剤、及び肌色改善成分のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【0002】
血管周皮細胞は毛細血管壁を取り巻くように存在している細胞で、毛細血管の血管径や透過性を調整している。具体的には、血管内皮細胞が分泌する血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を、血管周皮細胞が受容体（ＰＤＧＦＲβ）で受け取る事で内皮細胞周辺に集積し、血管周皮細胞が分泌するアンジオポエチン１（ＡＮＧＰＴ１）を血管内皮細胞が受容体で受け取る事で、血管周皮細胞と血管内皮細胞間の接着が強化され、血管径や透過性が制御される（非特許文献１参照）。
【0003】
ここで、前記血管周皮細胞に着目した従来技術として、プロスタン酸誘導体を有効成分とする血管周皮細胞保護剤（特許文献１）が知られている。また、血管内皮細胞に着目した従来技術として、線維芽細胞でのＬＩＮＣ００９４２の発現量から血管内皮細胞の賦活剤をスクリーニングする方法（特許文献２）が知られている。
さらに、血管細胞の接着に着目した従来技術として、血管及び／又はリンパ管における細胞間接着因子（タイトジャンクション関連因子）の発現増大剤（特許文献３）が知られている。
さらに、血管細胞の接着に着目した従来技術として、血管及び／又はリンパ管における細胞間接着因子（タイトジャンクション関連因子）の発現増大剤（特許文献３）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特開２０００－１１９１８４号公報
【特許文献2】特開２０２１－１８５８１８号公報
【特許文献3】特開２０２２－０７７４５６号公報
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】血管成熟化の分子機構、高倉伸幸、血栓止血誌２２（６）：３４３～３４７，２０１１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
血管周皮細胞と血管内皮細胞の接着状態の低下を引き起こす原因は、これまで十分に解明されていなかった。さらに、血管周皮細胞に着目し、前記接着状態に関連する因子を増大させる成分等についてもこれまで知られていなかった。
上記の現状を鑑み、本発明は、新規な血管周皮細胞と血管内皮細胞の接着関連因子の発現増大剤の提供を課題とする。また、本発明は、肌色改善成分のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
上記の現状を鑑み、本発明は、新規な血管周皮細胞と血管内皮細胞の接着関連因子の発現増大剤の提供を課題とする。また、本発明は、肌色改善成分のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは鋭意研究の結果、ＵＶや酸化反応を受けて生じる低分子ヒアルロン酸によって、血管周皮細胞と血管内皮細胞の接着が弱化されることを明らかにした。さらにワレモコウ（Ｓａｎｇｕｉｓｏｒｂａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）エキス、又はワレモコウエキスとルイボス（Ａｓｐａｌａｔｈｕｓ ｌｉｎｅａｒｉｓ）エキスの複合エキスによって、血管周皮細胞と血管内皮細胞の接着関連因子発現量が増加することを明らかにした。
【0008】
すなわち、上記課題を解決する本発明は、ワレモコウ（Ｓａｎｇｕｉｓｏｒｂａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）エキスを有効成分とする、血管周皮細胞と血管内皮細胞の接着関連因子の発現増大剤である。
本発明によれば、血管周皮細胞と血管内皮細胞の接着関連因子の発現を増大させることができる。
本発明によれば、血管周皮細胞と血管内皮細胞の接着関連因子の発現を増大させることができる。
【0009】
本発明の好ましい形態では、前記接着関連因子の発現増大剤は、さらに、ルイボス（Ａｓｐａｌａｔｈｕｓ ｌｉｎｅａｒｉｓ）エキスを含む。
本発明によれば、ワレモコウエキスとルイボスエキスを組み合わせることで、ワレモコウエキス単独での添加と比較して、接着関連因子の発現をより向上させることができる。
本発明によれば、ワレモコウエキスとルイボスエキスを組み合わせることで、ワレモコウエキス単独での添加と比較して、接着関連因子の発現をより向上させることができる。
【0010】
本発明の好ましい形態では、前記接着関連因子が、血管周皮細胞の血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲβ）及び／又はアンジオポエチン１（ＡＮＧＰＴ１）である。
【0011】
本発明の好ましい形態では、前記接着関連因子の発現増大剤は、低分子ヒアルロン酸に起因する血管周皮細胞と血管内皮細胞の接着の弱化を抑制するためのものである。
本発明によれば、低分子ヒアルロン酸に起因する、前記細胞の接着の弱化を抑制することができる。
本発明によれば、低分子ヒアルロン酸に起因する、前記細胞の接着の弱化を抑制することができる。
【0012】
本発明の好ましい形態では、前記接着関連因子の発現増大剤は、血管透過性を抑制するためのものである。
本発明によれば、血管透過性を抑制することができる。
本発明によれば、血管透過性を抑制することができる。
【0013】
さらに、上記課題を解決する本発明は、血管周皮細胞と血管内皮細胞の接着状態を指標として、肌色改善成分を選出することを含む、スクリーニング方法である。
従来、血管透過性が炎症物質の漏出に関連すること、これが肌色に影響を与え得ることが知られている。
本発明によれば、血管周皮細胞と血管内皮細胞の接着状態を指標として、肌色改善成分をスクリーニングすることができる。
従来、血管透過性が炎症物質の漏出に関連すること、これが肌色に影響を与え得ることが知られている。
本発明によれば、血管周皮細胞と血管内皮細胞の接着状態を指標として、肌色改善成分をスクリーニングすることができる。
【0014】
本発明の好ましい形態では、前記スクリーニング方法は、前記接着状態を増大する成分を、肌色改善成分として選出することを含む。
【0015】
本発明の好ましい形態では、前記接着状態は、血管周皮細胞と血管内皮細胞の接着関連因子の発現量である。
【0016】
本発明の好ましい形態では、前記接着状態は、血管内皮細胞と接着している血管周皮細胞の数である。
【0017】
本発明の好ましい形態では、前記接着関連因子は、血管周皮細胞の血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲβ）及び／又はアンジオポエチン１（ＡＮＧＰＴ１）である。
【0018】
本発明の好ましい形態では、前記肌色改善成分は、赤み、ムラ及び色素沈着の少なくとも何れかの改善成分である。
【0019】
本発明の好ましい形態では、前記肌色改善成分は、血管透過性の抑制成分である。
本発明によれば、血管透過性を抑制する成分として、肌色を改善する成分をスクリーニングすることができる。
本発明によれば、血管透過性を抑制する成分として、肌色を改善する成分をスクリーニングすることができる。
【0020】
本発明の好ましい形態では、前記スクリーニング方法は、低分子ヒアルロン酸存在下における前記接着状態を指標とする。
上述の通り、本発明者らは、低分子ヒアルロン酸によって、血管周皮細胞と血管内皮細胞の接着状態が低下することを明らかにした。
すなわち、本発明によれば、低分子ヒアルロン酸に起因する前記接着状態の低下に有効な成分をスクリーニングすることができる。
上述の通り、本発明者らは、低分子ヒアルロン酸によって、血管周皮細胞と血管内皮細胞の接着状態が低下することを明らかにした。
すなわち、本発明によれば、低分子ヒアルロン酸に起因する前記接着状態の低下に有効な成分をスクリーニングすることができる。
【発明の効果】
【0021】
本発明によれば、ワレモコウエキス、又はワレモコウエキスとルイボスエキスの複合エキスを有効成分とする、血管周皮細胞と血管内皮細胞の接着関連因子の発現増大剤を提供することができる。
さらに血管周皮細胞と血管内皮細胞の接着状態を指標として、肌色改善成分を選出するスクリーニングする方法を提供することができる。
さらに血管周皮細胞と血管内皮細胞の接着状態を指標として、肌色改善成分を選出するスクリーニングする方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図1】試験例１において、各植物エキス含有培地で培養した血管周皮細胞のＡＮＧＰＴ１とＰＤＧＦＲβの遺伝子発現量の結果を表すグラフである。
【図2】ａ）は、試験例２において、ワレモコウエキスと各植物エキス含有培地で培養した血管周皮細胞のＡＮＧＰＴ１とＰＤＧＦＲβの遺伝子発現量の結果を表すグラフである。ｂ）は、試験例２において、ワレモコウエキス含有培地と、ワレモコウエキスとルイボスエキスの複合エキス（以下、単に「複合エキス」という。）含有培地で培養した血管周皮細胞のＡＮＧＰＴ１とＰＤＧＦＲβの遺伝子発現量の結果を表すグラフである。
【図3】試験例３において、低分子ヒアルロン酸含有培地又は、低分子ヒアルロン酸、及び複合エキス含有培地で培養した、血管周皮細胞のＡＮＧＰＴ１とＰＤＧＦＲβの遺伝子発現量の結果を表すグラフである。
【図4】試験例４において、低分子ヒアルロン酸含有培地における、血管内皮細胞と接着している血管周皮細胞の数と、低分子ヒアルロン酸、及び複合エキス含有培地における、前記接着している血管周皮細胞の数を示す図である。
【図5】試験例５において、複合エキスによる血管透過性の抑制効果を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0023】
以下本発明を、＜１＞血管周皮細胞と血管内皮細胞の接着関連因子の発現増大剤、及び＜２＞肌色改善成分のスクリーニング方法に項分けし、詳細に説明する。
【0024】
＜１＞血管周皮細胞と血管内皮細胞の接着関連因子の発現増大剤
本発明に係る接着関連因子の発現増大剤は、ワレモコウエキスを含む。また好ましい形態では、さらにルイボスエキスを含む。
実施例で後述するように、ワレモコウエキス単独で上記接着関連因子の発現を増大させる効果を有するが、ワレモコウエキスとルイボスエキスの複合エキスが、ワレモコウエキス単独の場合と比較して、上記接着関連因子の発現を向上させることができる。
本発明に係る接着関連因子の発現増大剤は、ワレモコウエキスを含む。また好ましい形態では、さらにルイボスエキスを含む。
実施例で後述するように、ワレモコウエキス単独で上記接着関連因子の発現を増大させる効果を有するが、ワレモコウエキスとルイボスエキスの複合エキスが、ワレモコウエキス単独の場合と比較して、上記接着関連因子の発現を向上させることができる。
【0025】
ここで、ワレモコウエキスとルイボスエキスは、ワレモコウとルイボス由来の抽出物自体のみならず、これらの抽出物の画分、精製した画分、抽出物乃至は画分、精製物の溶媒除去物の総称を意味するものとする。
また、ワレモコウとルイボス由来の抽出物は、自生若しくは生育された植物、漢方生薬原料等として販売されるものを用いた抽出物、市販されている抽出物等が挙げられる。
上記エキスを抽出する場合、その抽出操作は、植物部位の全草を用いるほか、植物体、地上部、根茎部、木幹部、葉部、茎部、花穂、花蕾等の部位を使用することできるが、予めこれらを粉砕あるいは細切して抽出効率を向上させることが好ましい。
さらに、ワレモコウエキスを抽出する場合、根及び根茎部を使用することが好ましく、ルイボスエキスを抽出する場合、全草を使用することが好ましい。
抽出溶媒としては、水、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノールなどのアルコール類、１，３－ブチレングリコール、１，３－ブタンジオール、ポリプロピレングリコールなどの多価アルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフランなどのエーテル類等の極性溶媒から選択される１種乃至は２種以上が好適なものとして例示することができる。特に、ワレモコウエキスの抽出溶媒としては５０％のエタノールを使用することが好ましく、ルイボスエキスの抽出溶媒としては５０％の１，３－ブチレングリコールを使用することが好ましい。
上記エキスの具体的な抽出方法としては、例えば、植物体等の抽出に用いる部位乃至はその乾燥物１質量に対して、溶媒を１～３０質量部加え、室温であれば数日間、沸点付近の温度であれば数時間浸漬し、室温まで冷却した後、所望により不溶物及び／又は溶媒除去し、カラムクロマトグラフィー等で分画精製する方法が挙げられるが、抽出方法はこれに限定されない。
また、ワレモコウとルイボス由来の抽出物は、自生若しくは生育された植物、漢方生薬原料等として販売されるものを用いた抽出物、市販されている抽出物等が挙げられる。
上記エキスを抽出する場合、その抽出操作は、植物部位の全草を用いるほか、植物体、地上部、根茎部、木幹部、葉部、茎部、花穂、花蕾等の部位を使用することできるが、予めこれらを粉砕あるいは細切して抽出効率を向上させることが好ましい。
さらに、ワレモコウエキスを抽出する場合、根及び根茎部を使用することが好ましく、ルイボスエキスを抽出する場合、全草を使用することが好ましい。
抽出溶媒としては、水、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノールなどのアルコール類、１，３－ブチレングリコール、１，３－ブタンジオール、ポリプロピレングリコールなどの多価アルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフランなどのエーテル類等の極性溶媒から選択される１種乃至は２種以上が好適なものとして例示することができる。特に、ワレモコウエキスの抽出溶媒としては５０％のエタノールを使用することが好ましく、ルイボスエキスの抽出溶媒としては５０％の１，３－ブチレングリコールを使用することが好ましい。
上記エキスの具体的な抽出方法としては、例えば、植物体等の抽出に用いる部位乃至はその乾燥物１質量に対して、溶媒を１～３０質量部加え、室温であれば数日間、沸点付近の温度であれば数時間浸漬し、室温まで冷却した後、所望により不溶物及び／又は溶媒除去し、カラムクロマトグラフィー等で分画精製する方法が挙げられるが、抽出方法はこれに限定されない。
【0026】
本発明の接着関連因子の発現増大剤は、血管周皮細胞と血管内皮細胞の接着に関係する因子の発現を増大する用途で用いられる。好ましい形態では、前記接着関連因子は、血管周皮細胞で発現する因子であり、より好ましくは、ＰＤＧＦＲβ及び／又はＡＮＧＰＴ１であり、特に好ましくは、ＰＤＧＦＲβ及びＡＮＧＰＴ１の両者である。
【0027】
本発明の接着関連因子の発現増大剤、低分子ヒアルロン酸に起因する血管周皮細胞と血管内皮細胞間の接着状態の弱化を抑制するために用いられることが好ましい。
低分子ヒアルロン酸は、ＵＶや日々のストレスなどによって生じる酸化ストレスによって、体内のヒアルロン酸が分解されることによって発生する。言い換えれば、ＵＶや酸化ストレスに起因する前記接着状態の弱化を抑制するために用いることも好ましい。
低分子ヒアルロン酸は、ＵＶや日々のストレスなどによって生じる酸化ストレスによって、体内のヒアルロン酸が分解されることによって発生する。言い換えれば、ＵＶや酸化ストレスに起因する前記接着状態の弱化を抑制するために用いることも好ましい。
【0028】
本発明の接着関連因子の発現増大剤は製剤化に用いられる任意の成分と適宜組み合わせて経口剤や皮膚外用剤の形態をとることができる。
経口剤におけるワレモコウエキスの含有量は、剤形に応じて１回あたりの摂取量が抽出物の乾燥質量として、通常、０．１ｍｇ以上、好ましくは１ｍｇ以上、より好ましくは１０ｍｇ以上である。また、通常、２０００ｍｇ以下、好ましくは１０００ｍｇ以下、より好ましくは５００ｍｇ以下である。なお、複合エキス含む経口剤である場合、ワレモコウエキスの含有量は上記の通りが好ましく、ルイボスエキスの含有量は、剤形に応じて１回あたりの摂取量が抽出物の乾燥質量として、通常、０．１ｍｇ以上、好ましくは１ｍｇ以上、より好ましくは１０ｍｇ以上である。また、通常、２０００ｍｇ以下、好ましくは１０００ｍｇ以下、より好ましくは５００ｍｇ以下である。
経口剤におけるワレモコウエキスの含有量は、剤形に応じて１回あたりの摂取量が抽出物の乾燥質量として、通常、０．１ｍｇ以上、好ましくは１ｍｇ以上、より好ましくは１０ｍｇ以上である。また、通常、２０００ｍｇ以下、好ましくは１０００ｍｇ以下、より好ましくは５００ｍｇ以下である。なお、複合エキス含む経口剤である場合、ワレモコウエキスの含有量は上記の通りが好ましく、ルイボスエキスの含有量は、剤形に応じて１回あたりの摂取量が抽出物の乾燥質量として、通常、０．１ｍｇ以上、好ましくは１ｍｇ以上、より好ましくは１０ｍｇ以上である。また、通常、２０００ｍｇ以下、好ましくは１０００ｍｇ以下、より好ましくは５００ｍｇ以下である。
【0029】
本発明の接着関連因子の発現増大剤を、皮膚外用剤とする場合、例えば化粧料、医薬部外品、皮膚外用医薬等の形態を例示することができる。また、それらの剤形は特に限定されない。具体的には、洗顔料、クレンジング剤、化粧水、美容液、乳液、クリーム、ジェル、サンケア品等の形態が好ましい。また、フェイスパックのような形態とすることも好ましい。
【0030】
皮膚外用剤における、ワレモコウエキスの含有量（乾燥重量）は、通常、０．００００１質量％以上、好ましくは０．０００１質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上である。また、通常１質量％以下、好ましくは０．１質量％以下、より好ましくは０．０１質量％以下、さらに好ましくは０．００１質量％以下、さらに好ましくは０．０００１質量％以下であり、特に好ましくは０．００００５質量％以下である。なお、複合エキス含む経口剤である場合、ワレモコウエキスの含有量は上記の通りが好ましく、ルイボスエキスの含有量は、剤形に応じて１回あたりの摂取量が抽出物の乾燥質量として、通常、０．００００００１質量％以上、好ましくは０．００００００５質量％以上、より好ましくは０．０００００１質量％以上、さらに好ましくは０．００００１質量％以上である。また、通常１質量％以下、好ましくは０．１質量％以下、より好ましくは０．０１質量％以下、さらに好ましくは０．００１質量％以下、さらに好ましくは０．０００１質量％以下、さらに好ましくは０．００００１質量％以下であり、特に好ましくは０．０００００５質量％以下である。
【0031】
本発明の好ましい形態では、接着関連因子の発現増大剤に含まれる、ワレモコウエキスとルイボスエキスの好ましい比率（乾燥質量）は１：０．１～１：１である。より好ましくは１：０．２～１：１である。
【0032】
ワレモコウエキス、又はワレモコウエキスとルイボスエキスの複合エキスを化粧料に配合する場合、これらのエキスの接着関連因子の発現増大効果を損ねない範囲で、その他美白成分、しわ改善成分、抗炎症成分、動植物由来の抽出物、有効成分以外に通常化粧料で使用される成分を、任意成分として配合してもよい。これらの任意成分は、市販されているものを入手して配合してもよく、公知の方法で合成したものを配合してもよい。また、各任意成分は、２以上の効果（例えば、美白効果としわ改善効果）を有していてもよい。
【0033】
美白成分としては、一般的に化粧料で用いられている成分を、特に制限なく使用することができる。例えば、４－ｎ－ブチルレゾルシノール、アスコルビン酸グルコシド、３－О－エチルアスコルビン酸、トラネキサム酸、アルブチン、１－トリフェニルメチルピペリジン、１－トリフェニルメチルピロリジン、２－（トリフェニルメチルオキシ）エタノール、２－（トリフェニルメチルアミノ）エタノール、２－（トリフェニルメチルオキシ）エチルアミン、トリフェニルメチルアミン、トリフェニルメタノール、トリフェニルメタン及びアミノジフェニルメタン、Ｎ－（ｏ－トルオイル）システイン酸、Ｎ－（ｍ－トルオイル）システイン酸、Ｎ－（ｐ－トルイル）システイン酸、Ｎ－（ｐ－メトキシベンゾイル）システイン酸、Ｎ－ベンゾイル－セリン、Ｎ－（ｐ－メチルベンゾイル）セリン、Ｎ－（ｐ－エチルベンゾイル）セリン、Ｎ－（ｐ－メトキシベンゾイル）セリン、Ｎ－（ｐ－フルオロベンゾイル）セリン、Ｎ－（ｐ－トリフルオロメチルベンゾイル）セリン、Ｎ－（２－ナフトイル）セリン、Ｎ－（４－フェニルベンゾイル）セリン、Ｎ－（ｐ－メチルベンゾイル）セリンメチルエステル、Ｎ－（ｐ－メチルベンゾイル）セリンエチルエステル、Ｎ－（２－ナフトイル）セリンメチルエステル、Ｎ－ベンゾイル－Ｏ－メチルセリン、Ｎ－（ｐ－メチルベンゾイル）－Ｏ－メチルセリン、Ｎ－（ｐ－メチルベンゾイル）－Ｏ－アセチルセリン、Ｎ－（２－ナフトイル）－Ｏ－メチルセリン、デクスパンテノールＷ、ナイアシンアミド等が挙げられる。
【0034】
化粧料における美白成分の含有量は、通常０．０００１～３０質量％であり、０．００１～１０質量％が好ましく、０．０１～５質量％がより好ましい（抽出物の場合は乾燥質量）。
しわ改善成分としては、一般的に化粧料で用いられている成分を、特に制限なく使用することができる。例えば、ビタミンＡ又はその誘導体としてレチノール、レチナール、レチノイン酸、トレチノイン、イソトレチノイン、レチノイン酸トコフェロール、パルミチン酸レチノール、酢酸レチノールが挙げられる。また、ウルソール酸ベンジルエステル、ウルソール酸リン酸エステル、ベツリン酸ベンジルエステル、ベンジル酸リン酸エステル、三フッ化イソプロピルオキソプロピルアミノカルボニルピロリジンカルボニルメチルプロピルアミノカルボニルベンゾイルアミノ酢酸ナトリウム、ナイアシンアミド等が挙げられる。
しわ改善成分としては、一般的に化粧料で用いられている成分を、特に制限なく使用することができる。例えば、ビタミンＡ又はその誘導体としてレチノール、レチナール、レチノイン酸、トレチノイン、イソトレチノイン、レチノイン酸トコフェロール、パルミチン酸レチノール、酢酸レチノールが挙げられる。また、ウルソール酸ベンジルエステル、ウルソール酸リン酸エステル、ベツリン酸ベンジルエステル、ベンジル酸リン酸エステル、三フッ化イソプロピルオキソプロピルアミノカルボニルピロリジンカルボニルメチルプロピルアミノカルボニルベンゾイルアミノ酢酸ナトリウム、ナイアシンアミド等が挙げられる。
【0035】
化粧料におけるしわ改善成分の含有量は、通常０．０００１～３０質量％であり、０．００１～１０質量％が好ましく、０．０１～５質量％がより好ましい（抽出物の場合は乾燥質量）。
【0036】
抗炎症成分としては、例えば、クラリノン、グラブリジン、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸、パントテニルアルコール、ナイアシンアミド、トラネキサム酸等が挙げられ、グリチルリチン酸及びその塩、グリチルレチン酸アルキル及びその塩、並びに、グリチルレチン酸及びその塩が好ましく挙げられる。化粧料中における抗炎症成分の含有量は、通常０．０１～３０質量％であり、０．１～１０質量％が好ましく、１～５質量％がより好ましい（抽出物の場合は乾燥質量）。
【0037】
動植物由来の抽出物としては、例えば、アケビエキス、アスナロエキス、アスパラガスエキス、アボガドエキス、アマチャエキス、アーモンドエキス、アルニカエキス、アロニアエキス、アンズエキス、イチョウエキス、ウイキョウエキス、ウドエキス、エゾウコギエキス、エンメイソウエキス、オウバクエキス、オタネニンジンエキス、オドリコソウエキス、カキョクエキス、カッコンエキス、カモミラエキス、カロットエキス、カワラヨモギエキス、カンゾウエキス、キウイエキス、キューカンバーエキス、グアバエキス、クチナシエキス、クマザサエキス、クルミエキス、黒米エキス、クロレラエキス、クワエキス、ケイケットウエキス、ゲットウヨウエキス、ゲンチアナエキス、コメエキス、コメ発酵エキス、コメヌカ発酵エキス、コメ胚芽油、サルビアエキス、サボンソウエキス、ササエキス、サンシャエキス、サンショウエキス、シイタケエキス、ジオウエキス、シコンエキス、シソエキス、シナノキエキス、シモツケソウエキス、ショウキョウエキス、ショウブ根エキス、スギナエキス、ステビアエキス、ステビア発酵物、セイヨウノコギリソウエキス、セイヨウハッカエキス、セージエキス、ゼニアオイエキス、センキュウエキス、センブリエキス、ソウハクヒエキス、ダイオウエキス、ダイズエキス、タイソウエキス、タンポポエキス、チョウジエキス、トウガラシエキス、トウキエキス、トウキンセンカエキス、トウニンエキス、ドクダミエキス、トマトエキス、納豆エキス、ニンジンエキス、ニンニクエキス、ハイビスカスエキス、バクモンドウエキス、ハスエキス、パセリエキス、バーチエキス、ハマメリスエキス、ヒキオコシエキス、ヒノキエキス、ビワエキス、フキタンポポエキス、フキノトウエキス、ブクリョウエキス、ヘチマエキス、ペパーミントエキス、ボダイジュエキス、マツエキス、ミズバショウエキス、メリッサエキス、モズクエキス、モモエキス、ヤグルマギクエキス、ユリエキス、ヨクイニンエキス、ヨモギエキス、ラベンダーエキス、リンゴエキス、レイシエキス、レタスエキス、レンギョウエキス、レンゲソウエキス、ローズマリーエキス、ローマカミツレエキス等のエキスが好ましいものとして挙げられる。
【0038】
化粧料中における前記任意の動植物由来抽出物の含有量（乾燥質量）は、通常０．０１～３０質量％であり、０．１～１０質量％が好ましく、０．３～３質量％がより好ましい。
【0039】
有効成分以外に通常化粧料で使用される成分としては、ポリエチレングリコール、グリセリン、１，３－ブチレングリコール、エリスリトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ジグリセリン、イソプレングリコール、１，２－ペンタンジオール、２，４－ヘキシレングリコール、１，２－ヘキサンジオール、１，２－オクタンジオール等のポリオール、脂肪酸セッケン（ラウリン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム等）、ラウリル硫酸カリウム、アルキル硫酸トリエタノールアミンエーテル等のアニオン界面活性剤類、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、ラウリルアミンオキサイド等のカチオン界面活性剤類、イミダゾリン系両性界面活性剤（２－ココイル－２－イミダゾリニウムヒドロキサイド－１－カルボキシエチロキシ２ナトリウム塩等）、ベタイン系界面活性剤（アルキルベタイン、アミドベタイン、スルホベタイン等）、アシルメチルタウリン等の両性界面活性剤類、ソルビタン脂肪酸エステル類（ソルビタンモノステアレート、セスキオレイン酸ソルビタン等）、グリセリン脂肪酸類（モノステアリン酸グリセリン等）、プロピレングリコール脂肪酸エステル類（モノステアリン酸プロピレングリコール等）、硬化ヒマシ油誘導体、グリセリンアルキルエーテル、ＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル類（ＰＯＥソルビタンモノオレエート、モノステアリン酸ポリオキエチレンソルビタン等）、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル類（ＰＯＥ－ソルビットモノラウレート等）、ＰＯＥグリセリン脂肪酸エステル類（ＰＯＥ－グリセリンモノイソステアレート等）、ＰＯＥ脂肪酸エステル類（ポリエチレングリコールモノオレート、ＰＯＥジステアレート等）、ＰＯＥアルキルエーテル類（ＰＯＥ２－オクチルドデシルエーテル等）、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル類（ＰＯＥノニルフェニルエーテル等）、プルロニック（登録商標）型類、ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエーテル類（ＰＯＥ・ＰＯＰ２－デシルテトラデシルエーテル等）、テトロニック類、ＰＯＥヒマシ油・硬化ヒマシ油誘導体（ＰＯＥヒマシ油、ＰＯＥ硬化ヒマシ油等）、ショ糖脂肪酸エステル、アルキルグルコシド等の非イオン界面活性剤類、ピロリドンカルボン酸ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム等の保湿成分類、表面処理されていても良い、マイカ、タルク、カオリン、合成雲母、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、無水ケイ酸（シリカ）、酸化アルミニウム、硫酸バリウム等の粉体類、表面処理されていても良い、酸化コバルト、群青、紺青、酸化亜鉛の無機顔料類、表面処理されていても良い、酸化鉄二酸化チタン焼結体等の複合顔料、表面処理されていても良い、雲母チタン、魚燐箔、オキシ塩化ビスマス等のパール剤類、レーキ化されていても良い赤色２０２号、赤色２２８号、赤色２２６号、黄色４号、青色４０４号、黄色５号、赤色５０５号、赤色２３０号、赤色２２３号、橙色２０１号、赤色２１３号、黄色２０４号、黄色２０３号、青色１号、緑色２０１号、紫色２０１号、赤色２０４号等の有機色素類、ポリエチレン末、ポリメタクリル酸メチル、ナイロン粉末、オルガノポリシロキサンエラストマー等の有機粉体類、エタノール、イソプロパノール等の低級アルコール類、ビタミンＡ又はその誘導体、ビタミンＢ６塩酸塩、ビタミンＢ６トリパルミテート、ビタミンＢ６ジオクタノエート、ビタミンＢ２又はその誘導体、ビタミンＢ１２、ビタミンＢ１５又はその誘導体等のビタミンＢ類、α－トコフェロール、β－トコフェロール、γ－トコフェロール、ビタミンＥアセテート等のビタミンＥ類、ビタミンＤ類、ビタミンＨ、パントテン酸、パンテチン、ピロロキノリンキノン等のビタミン類が挙げられる。
【0040】
＜２＞スクリーニング方法について
以下、本発明に係るスクリーニング方法について詳細に説明する。
本発明に係るスクリーニング方法は、血管周皮細胞と血管内皮細胞の接着状態を指標として肌色改善成分を選出することを含む、スクリーニング方法である。肌色改善成分は、赤み、ムラ及び色素沈着の少なくとも何れかの改善成分を含み、好ましくはムラ及び色素沈着の少なくとも何れかの改善成分を含む。また、選出の対象は、血管透過性の抑制成分であることが好ましい。すなわち、血管透過性の抑制を通じて肌色を改善する肌色改善成分を選出することが好ましい。
ここで、「選出」又は「スクリーニング」の語句は、肌色改善成分又はその候補を探索することを含む概念である。
以下、本発明に係るスクリーニング方法について詳細に説明する。
本発明に係るスクリーニング方法は、血管周皮細胞と血管内皮細胞の接着状態を指標として肌色改善成分を選出することを含む、スクリーニング方法である。肌色改善成分は、赤み、ムラ及び色素沈着の少なくとも何れかの改善成分を含み、好ましくはムラ及び色素沈着の少なくとも何れかの改善成分を含む。また、選出の対象は、血管透過性の抑制成分であることが好ましい。すなわち、血管透過性の抑制を通じて肌色を改善する肌色改善成分を選出することが好ましい。
ここで、「選出」又は「スクリーニング」の語句は、肌色改善成分又はその候補を探索することを含む概念である。
【0041】
本発明のスクリーニング方法が被験対象とする物質は、純物質、生物由来の抽出物、又はそれらの混合物等のいずれであってもよい。
生物由来の抽出物は、動物又は植物由来の抽出物自体のみならず、抽出物の画分、精製した画分、抽出物乃至は画分、精製物の溶媒除去物の総称を意味するものとし、植物由来の抽出物は、自生若しくは生育された植物、漢方生薬原料等として販売されるものを用いた抽出物、市販されている抽出物等が挙げられる。
抽出操作は、植物部位の全草を用いるほか、植物体、地上部、根茎部、木幹部、葉部、茎部、花穂、花蕾等の部位を使用することできるが、予めこれらを粉砕あるいは細切して抽出効率を向上させることが好ましい。抽出溶媒としては、水、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノールなどのアルコール類、１，３－ブチレングリコール、１，３－ブタンジオール、ポリプロピレングリコールなどの多価アルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフランなどのエーテル類等の極性溶媒から選択される１種乃至は２種以上が好適なものとして例示することができる。
具体的な抽出方法としては、例えば、植物体等の抽出に用いる部位乃至はその乾燥物１質量に対して、溶媒を１～３０質量部加え、室温であれば数日間、沸点付近の温度であれば数時間浸漬し、室温まで冷却した後、所望により不溶物及び／又は溶媒除去し、カラムクロマトグラフィー等で分画精製する方法が挙げられる。
生物由来の抽出物は、動物又は植物由来の抽出物自体のみならず、抽出物の画分、精製した画分、抽出物乃至は画分、精製物の溶媒除去物の総称を意味するものとし、植物由来の抽出物は、自生若しくは生育された植物、漢方生薬原料等として販売されるものを用いた抽出物、市販されている抽出物等が挙げられる。
抽出操作は、植物部位の全草を用いるほか、植物体、地上部、根茎部、木幹部、葉部、茎部、花穂、花蕾等の部位を使用することできるが、予めこれらを粉砕あるいは細切して抽出効率を向上させることが好ましい。抽出溶媒としては、水、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノールなどのアルコール類、１，３－ブチレングリコール、１，３－ブタンジオール、ポリプロピレングリコールなどの多価アルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフランなどのエーテル類等の極性溶媒から選択される１種乃至は２種以上が好適なものとして例示することができる。
具体的な抽出方法としては、例えば、植物体等の抽出に用いる部位乃至はその乾燥物１質量に対して、溶媒を１～３０質量部加え、室温であれば数日間、沸点付近の温度であれば数時間浸漬し、室温まで冷却した後、所望により不溶物及び／又は溶媒除去し、カラムクロマトグラフィー等で分画精製する方法が挙げられる。
【0042】
本発明のスクリーニング方法において、使用する細胞種は、正常なヒトの血管内皮細胞及び／又は血管周皮細胞であることが好ましい。好ましくは、前記細胞は正常なヒト由来の細胞である。また、市販の細胞を用いてもよい。
前記細胞を培養するための培地は、当業者であれば一般に用いられるものを使用することができる。
さらに、前記細胞を培養するための培養条件は、使用する細胞等に応じて適宜設定することが可能である。
前記細胞を培養するための培地は、当業者であれば一般に用いられるものを使用することができる。
さらに、前記細胞を培養するための培養条件は、使用する細胞等に応じて適宜設定することが可能である。
【0043】
本発明では、好ましくは、前記指標である接着状態として、血管周皮細胞と血管内皮細胞の接着関連因子の発現量を用いることができる。細胞の培養系に被験物質を添加し、接着関連因子の発現量を測定し、これを指標とする。好ましくは、前記細胞は血管周皮細胞であり、より好ましくは、前記接着関連因子はＰＤＧＦＲβ及び／又はＡＮＧＰＴ１であり、特に好ましくは、ＰＤＧＦＲβ及びＡＮＧＰＴ１の両者である。
【0044】
具体的には、被験物質を添加して培養した細胞における、ＰＤＧＦＲβ及び／又はＡＮＧＰＴ１の発現量が、被験物質を添加しないで培養した細胞における前記発現量と比較して大きい場合に、当該被験物質を、肌色改善成分として選出することが可能である。
より具体的には、被験物質を添加して培養した細胞における、ＰＤＧＦＲβ及び／又はＡＮＧＰＴ１の発現量が、被験物質を添加しないで培養した細胞における前記発現量と比較して１．２倍より大きい場合、さらに好ましくは１．５倍より大きい場合、肌色改善成分の候補として、選出することが好ましい。
より具体的には、被験物質を添加して培養した細胞における、ＰＤＧＦＲβ及び／又はＡＮＧＰＴ１の発現量が、被験物質を添加しないで培養した細胞における前記発現量と比較して１．２倍より大きい場合、さらに好ましくは１．５倍より大きい場合、肌色改善成分の候補として、選出することが好ましい。
【0045】
上記、接着関連因子の発現量は、ｍＲＮＡ測定、免疫組織化学的解析等の常法により測定することができる。
例えば、ＰＤＧＦＲβ及び／又はＡＮＧＰＴ１の発現量は、当該遺伝子の配列に特異的に結合する配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして用いてＰＣＲを行い、定量的な検出を行う。
なお、血管周皮細胞のＰＤＧＦＲβ及び／又はＡＮＧＰＴ１をコードする遺伝子配列は、公開されているので、当業者は適宜プライマーを設計することが可能である。また、プライマーは市販の物を用いてもよい。
例えば、ＰＤＧＦＲβ及び／又はＡＮＧＰＴ１の発現量は、当該遺伝子の配列に特異的に結合する配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして用いてＰＣＲを行い、定量的な検出を行う。
なお、血管周皮細胞のＰＤＧＦＲβ及び／又はＡＮＧＰＴ１をコードする遺伝子配列は、公開されているので、当業者は適宜プライマーを設計することが可能である。また、プライマーは市販の物を用いてもよい。
【0046】
本発明の好ましい形態では、細胞の培養系に低分子ヒアルロン酸及び被験物質を添加する工程を含む。そして、低分子ヒアルロン酸の存在下で、被験物質と共に血管周皮細胞を培養して、前記因子の発現量を評価する。
上記の工程を含むことによって、低分子ヒアルロン酸に起因する肌色の状態の悪化を防ぐ、あるいは、前記肌色の状態を改善する肌色改善成分を選出することが可能である。
上記の工程を含むことによって、低分子ヒアルロン酸に起因する肌色の状態の悪化を防ぐ、あるいは、前記肌色の状態を改善する肌色改善成分を選出することが可能である。
【0047】
また、本発明では、前記指標である接着状態として、血管内皮細胞と接着している血管周皮細胞の数を用いることができる。すなわち、本発明の好ましい形態では、細胞の培養系に被験物質を添加し、血管内皮細胞と接着している血管周皮細胞の数を測定することを含む。
具体的には、染色した血管周皮細胞を被験物質含有培地で培養し、前記培養した血管周皮細胞を血管内皮細胞の上から播種し、リン酸緩衝液等で複数回洗浄した後に蛍光顕微鏡にて接着している血管周皮細胞の数を数える工程を含む。
具体的には、染色した血管周皮細胞を被験物質含有培地で培養し、前記培養した血管周皮細胞を血管内皮細胞の上から播種し、リン酸緩衝液等で複数回洗浄した後に蛍光顕微鏡にて接着している血管周皮細胞の数を数える工程を含む。
【0048】
そして、被験物質を添加して培養した細胞における、血管内皮細胞と接着している血管周皮細胞の数が、被験物質を添加しないで培養した細胞における前記接着している血管周皮細胞の数と比較して大きい場合に、当該被験物質を、肌色改善成分の候補として選出することが可能である。
【実施例0049】
以下、実施例を参照して本願発明を詳細に説明するが、本願発明の技術的範囲は、以下の実施例に限定されない。
【0050】
＜試験例１＞
各種エキスについて、血管周皮細胞のＡＮＧＰＴ１とＰＤＧＦＲβの遺伝子発現量への影響を測定した。
本実施例で用いた各有効成分エキスの抽出溶媒は以下の通りである。
各種エキスについて、血管周皮細胞のＡＮＧＰＴ１とＰＤＧＦＲβの遺伝子発現量への影響を測定した。
本実施例で用いた各有効成分エキスの抽出溶媒は以下の通りである。
【0051】
【表1】
【0052】
（方法）
１）ヒト胎盤由来血管周皮細胞（Ｐｒｏｍｏ ｃｅｌｌ社製）を２４ｗｅｌｌプレートに３．０×１０４Ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃、５％ＣＯ２環境下で２４時間培養した。
なお細胞培養の試薬・培地として以下を用いた。
・Ｐｅｒｉｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ ２（Ｐｒｏｍｏ ｃｅｌｌ社製、Ｃ－２８０４１）
・ダルベッコＰＢＳ（－）生化学用（富士フイルム和光純薬株式会社製、０４５－２９７９５）
・０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯＴＭ製、２５３００－０６２）
・０．４％トリパンブルー水溶液（ＧＩＢＣＯＴＭ製、１５２５０－０６１）
２）培地を除去し、各ｗｅｌｌに各エキス含有培地（終濃度０．１％）に交換した。
３）２４時間後に周皮細胞のＡＮＧＰＴ１とＰＤＧＦＲβの遺伝子発現量をｑＲＴ－ＰＣＲにて測定し、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と遺伝子発現量を比較した。
なお、ｍＲＮＡ発現の解析には、以下の物を用いた。
ＡＮＧＰＴ１プライマー（Ｈｓ＿ＡＮＧＰＴ１＿１＿ＳＧ ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｓｓａｙ１、株式会社キアゲン製、ＱＴ０００４６８６５）、ＰＤＧＦＲプライマー（Ｈｓ＿ＰＤＧＦＲ＿１＿ＳＧ ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｓｓａｙ、株式会社キアゲン製、ＱＴ０００８２３２７）、ＡＣＴＢプライマー（Ｈｓ＿ＡＣＴＢ＿２＿ＳＧ ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｓｓａｙ、株式会社キアゲン製、ＱＴ０１６８０４７６）、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ ２５０Ｔ（インビトロジェン株式会社製、１１７５４－２５０）、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ－８ （２５０）（株式会社キアゲン製、７４１０６）、Ｆａｓｔ ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ株式会社製、４３８５６１７）
１）ヒト胎盤由来血管周皮細胞（Ｐｒｏｍｏ ｃｅｌｌ社製）を２４ｗｅｌｌプレートに３．０×１０４Ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃、５％ＣＯ２環境下で２４時間培養した。
なお細胞培養の試薬・培地として以下を用いた。
・Ｐｅｒｉｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ ２（Ｐｒｏｍｏ ｃｅｌｌ社製、Ｃ－２８０４１）
・ダルベッコＰＢＳ（－）生化学用（富士フイルム和光純薬株式会社製、０４５－２９７９５）
・０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯＴＭ製、２５３００－０６２）
・０．４％トリパンブルー水溶液（ＧＩＢＣＯＴＭ製、１５２５０－０６１）
２）培地を除去し、各ｗｅｌｌに各エキス含有培地（終濃度０．１％）に交換した。
３）２４時間後に周皮細胞のＡＮＧＰＴ１とＰＤＧＦＲβの遺伝子発現量をｑＲＴ－ＰＣＲにて測定し、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と遺伝子発現量を比較した。
なお、ｍＲＮＡ発現の解析には、以下の物を用いた。
ＡＮＧＰＴ１プライマー（Ｈｓ＿ＡＮＧＰＴ１＿１＿ＳＧ ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｓｓａｙ１、株式会社キアゲン製、ＱＴ０００４６８６５）、ＰＤＧＦＲプライマー（Ｈｓ＿ＰＤＧＦＲ＿１＿ＳＧ ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｓｓａｙ、株式会社キアゲン製、ＱＴ０００８２３２７）、ＡＣＴＢプライマー（Ｈｓ＿ＡＣＴＢ＿２＿ＳＧ ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｓｓａｙ、株式会社キアゲン製、ＱＴ０１６８０４７６）、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ ２５０Ｔ（インビトロジェン株式会社製、１１７５４－２５０）、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ－８ （２５０）（株式会社キアゲン製、７４１０６）、Ｆａｓｔ ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ株式会社製、４３８５６１７）
【0053】
（結果）
試験例１のＡＮＧＰＴ１とＰＤＧＦＲβの遺伝子発現量の結果を図１に示す。
図１の結果より、ワレモコウエキスを含有した培地では、他のエキスを含有した培地と比較して、前記遺伝子の発現向上効果を示した。
試験例１のＡＮＧＰＴ１とＰＤＧＦＲβの遺伝子発現量の結果を図１に示す。
図１の結果より、ワレモコウエキスを含有した培地では、他のエキスを含有した培地と比較して、前記遺伝子の発現向上効果を示した。
【0054】
＜試験例２＞
試験例１の方法を用いて、ワレモコウエキスと他の各植物エキスを組み合わせ、血管周皮細胞のＡＮＧＰＴ１とＰＤＧＦＲβの遺伝子発現量を測定し、前記遺伝子発現量の比較を行った。
本実施例でエキスとして用いた、各植物エキスの抽出溶媒は以下の通りである。
試験例１の方法を用いて、ワレモコウエキスと他の各植物エキスを組み合わせ、血管周皮細胞のＡＮＧＰＴ１とＰＤＧＦＲβの遺伝子発現量を測定し、前記遺伝子発現量の比較を行った。
本実施例でエキスとして用いた、各植物エキスの抽出溶媒は以下の通りである。
【0055】
【表2】
【0056】
（結果）
図２ａ）に、ワレモコウエキスと各植物エキスとの複合エキスについての遺伝子の発現量の結果を示す。各植物エキスとの組み合わせのうち、ワレモコウエキスとルイボスエキスの複合エキスにおいて、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較して前記遺伝子の発現量が増加した。
また、前記で得られた結果を確認するため、ワレモコウ単体の場合と、ワレモコウエキスとルイボスエキスの複合エキスの場合とで、前記遺伝子の発現量を上記に記載した条件で測定した。結果を図２ｂ）に示す。
図２ｂ）に示すとおり、ワレモコウエキスとルイボスエキスの複合エキスの場合において、ワレモコウエキス単体の場合より、前記遺伝子の発現量が増加したことを確認した。
以上の結果から、ワレモコウエキスとルイボスエキスを組み合わせると、単独での添加と比較して、接着関連因子の発現を向上させる効果を有することを確認した。
図２ａ）に、ワレモコウエキスと各植物エキスとの複合エキスについての遺伝子の発現量の結果を示す。各植物エキスとの組み合わせのうち、ワレモコウエキスとルイボスエキスの複合エキスにおいて、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較して前記遺伝子の発現量が増加した。
また、前記で得られた結果を確認するため、ワレモコウ単体の場合と、ワレモコウエキスとルイボスエキスの複合エキスの場合とで、前記遺伝子の発現量を上記に記載した条件で測定した。結果を図２ｂ）に示す。
図２ｂ）に示すとおり、ワレモコウエキスとルイボスエキスの複合エキスの場合において、ワレモコウエキス単体の場合より、前記遺伝子の発現量が増加したことを確認した。
以上の結果から、ワレモコウエキスとルイボスエキスを組み合わせると、単独での添加と比較して、接着関連因子の発現を向上させる効果を有することを確認した。
【0057】
＜試験例３＞
次に、低分子ヒアルロン酸が周皮細胞及び内皮細胞の接着に与える影響を明らかにし、これに対する前記試験例で効果が確認された複合エキス（以下、単に「複合エキス」という。）の前記低分子ヒアルロン酸による影響に対する効果を明らかにするため、以下の試験を行った。
次に、低分子ヒアルロン酸が周皮細胞及び内皮細胞の接着に与える影響を明らかにし、これに対する前記試験例で効果が確認された複合エキス（以下、単に「複合エキス」という。）の前記低分子ヒアルロン酸による影響に対する効果を明らかにするため、以下の試験を行った。
【0058】
（方法）
１）試験例１に記載の試薬・培地を用いて、ヒト胎盤由来血管周皮細胞を培養した。
２）培地を低分子ヒアルロン酸と、複合エキスを含有した培地に交換し、２４時間培養した。終濃度は低分子ヒアルロン酸０．２ｍｇ／ｍＬ、各エキス０．１％であった。
なお、低分子ヒアルロン酸試薬としてＨｙａｌｕｒｏｎａｎ Ｕｌｔｒａ－Ｌｏｗ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ（富士フイルム和光純薬株式会社製、５１３－６９５２１）を用いた。
３）試験例１と同様に、周皮細胞のＡＮＧＰＴ１とＰＤＧＦＲβの遺伝子発現量を測定した。
なお、ｍＲＮＡ発現の解析には、試験例１と同様の試薬を用いた。
１）試験例１に記載の試薬・培地を用いて、ヒト胎盤由来血管周皮細胞を培養した。
２）培地を低分子ヒアルロン酸と、複合エキスを含有した培地に交換し、２４時間培養した。終濃度は低分子ヒアルロン酸０．２ｍｇ／ｍＬ、各エキス０．１％であった。
なお、低分子ヒアルロン酸試薬としてＨｙａｌｕｒｏｎａｎ Ｕｌｔｒａ－Ｌｏｗ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ（富士フイルム和光純薬株式会社製、５１３－６９５２１）を用いた。
３）試験例１と同様に、周皮細胞のＡＮＧＰＴ１とＰＤＧＦＲβの遺伝子発現量を測定した。
なお、ｍＲＮＡ発現の解析には、試験例１と同様の試薬を用いた。
【0059】
（結果）
試験例３の結果を図３に示す。
結果から、低分子ヒアルロン酸の存在下では、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較して、血管周皮細胞と血管内皮細胞の接着因子である、ＡＮＧＰＴ１及びＰＤＧＦＲβ遺伝子の有意な発現低下が確認された。また、複合エキスを添加したところ、両因子の発現低下が抑制された。
試験例３の結果を図３に示す。
結果から、低分子ヒアルロン酸の存在下では、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較して、血管周皮細胞と血管内皮細胞の接着因子である、ＡＮＧＰＴ１及びＰＤＧＦＲβ遺伝子の有意な発現低下が確認された。また、複合エキスを添加したところ、両因子の発現低下が抑制された。
【0060】
＜試験例４＞
次に、低分子ヒアルロン酸が血管周皮細胞と血管内皮細胞の接着に与える影響と、該影響に対する複合エキスの効果を明らかにするため以下の試験を行った。
次に、低分子ヒアルロン酸が血管周皮細胞と血管内皮細胞の接着に与える影響と、該影響に対する複合エキスの効果を明らかにするため以下の試験を行った。
【0061】
（方法）
低分子ヒアルロン酸存在下で、複合エキスの有無で、ＰＢＳ（－）による洗浄後に血管内皮細胞に接着している血管周皮細胞の数に違いがあるかを測定し、比較する試験を行った。
１）正常ヒト胎盤由来血管周皮細胞（Ｐｒｏｍｏ ｃｅｌｌ社製）を核染色後、７５ｍＬフラスコに２．５×１０５ｃｅｌｌｓ播種し、複合エキスを添加した培地にて３７℃、５％ＣＯ２環境下で４８時間培養した。
なお、細胞培養には以下の試薬・培地を用いた。
・Ｐｅｒｉｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ ２（Ｐｒｏｍｏ ｃｅｌｌ社製、Ｃ－２８０４１）
・ダルベッコＰＢＳ（－）生化学用（富士フイルム和光純薬株式会社製、０４５－２９７９５）
・０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯＴＭ製、２５３００－０６２）
・０．４％トリパンブルー水溶液（ＧＩＢＣＯＴＭ製、１５２５０－０６１）
なお、核染色にはＨｏｅｃｈｅｓｔ３３３４２（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた。
２）正常ヒト由来血管内皮細胞（ＫＵＲＡＢＯ株式会社製）を４ｗｅｌｌチャンバースライドに１．０×１０５ｃｅｌｌｓ播種し、２４時間培養した。
なお、細胞培養には以下の培地を用いた。
・Ｈｕｍｅｄｉａ ＥＧ２（ＫＵＲＡＢＯ株式会社製、ＫＥ－２１５０Ｓ）
３）１）の血管周皮細胞を血管内皮細胞の上から１．０×１０４ｃｅｌｌｓ播種し、２４時間培養した。
４）低分子ヒアルロン酸及び複合エキス含有培地（終濃度：低分子ヒアルロン酸０．２ｍｇ／ｍＬ、各エキス０．１％）に交換し７２時間培養した。
５）培地を除去し、ＰＢＳ（－）１ｍＬで洗浄後、蛍光顕微鏡にて血管周皮細胞の数を観察した。
低分子ヒアルロン酸存在下で、複合エキスの有無で、ＰＢＳ（－）による洗浄後に血管内皮細胞に接着している血管周皮細胞の数に違いがあるかを測定し、比較する試験を行った。
１）正常ヒト胎盤由来血管周皮細胞（Ｐｒｏｍｏ ｃｅｌｌ社製）を核染色後、７５ｍＬフラスコに２．５×１０５ｃｅｌｌｓ播種し、複合エキスを添加した培地にて３７℃、５％ＣＯ２環境下で４８時間培養した。
なお、細胞培養には以下の試薬・培地を用いた。
・Ｐｅｒｉｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ ２（Ｐｒｏｍｏ ｃｅｌｌ社製、Ｃ－２８０４１）
・ダルベッコＰＢＳ（－）生化学用（富士フイルム和光純薬株式会社製、０４５－２９７９５）
・０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯＴＭ製、２５３００－０６２）
・０．４％トリパンブルー水溶液（ＧＩＢＣＯＴＭ製、１５２５０－０６１）
なお、核染色にはＨｏｅｃｈｅｓｔ３３３４２（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた。
２）正常ヒト由来血管内皮細胞（ＫＵＲＡＢＯ株式会社製）を４ｗｅｌｌチャンバースライドに１．０×１０５ｃｅｌｌｓ播種し、２４時間培養した。
なお、細胞培養には以下の培地を用いた。
・Ｈｕｍｅｄｉａ ＥＧ２（ＫＵＲＡＢＯ株式会社製、ＫＥ－２１５０Ｓ）
３）１）の血管周皮細胞を血管内皮細胞の上から１．０×１０４ｃｅｌｌｓ播種し、２４時間培養した。
４）低分子ヒアルロン酸及び複合エキス含有培地（終濃度：低分子ヒアルロン酸０．２ｍｇ／ｍＬ、各エキス０．１％）に交換し７２時間培養した。
５）培地を除去し、ＰＢＳ（－）１ｍＬで洗浄後、蛍光顕微鏡にて血管周皮細胞の数を観察した。
【0062】
（結果）
試験例４の結果を図４に示す。図中白く見える点が、血管内皮細胞と接着状態にある、染色された血管周皮細胞である。
Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較すると、低分子ヒアルロン酸の添加により、血管内皮細胞と接着している血管周皮細胞数の減少が確認された（図４、中央図、低分子ヒアルロン酸）。
また、低分子ヒアルロン酸と複合エキスを併せて添加したところ、血管内皮細胞と接着している血管周皮細胞数の減少が抑制されたことが確認された（図４、右図、低分子ヒアルロン酸＋エキス）。
試験例４の結果を図４に示す。図中白く見える点が、血管内皮細胞と接着状態にある、染色された血管周皮細胞である。
Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較すると、低分子ヒアルロン酸の添加により、血管内皮細胞と接着している血管周皮細胞数の減少が確認された（図４、中央図、低分子ヒアルロン酸）。
また、低分子ヒアルロン酸と複合エキスを併せて添加したところ、血管内皮細胞と接着している血管周皮細胞数の減少が抑制されたことが確認された（図４、右図、低分子ヒアルロン酸＋エキス）。
【0063】
＜試験例５＞
ＡＮＧＰＴ１を内皮細胞が受容すると、内皮細胞同士の密着結合関連遺伝子の発現が誘導され、血管透過性が抑制されることが知られている。
複合エキスが、血管透過性の抑制に有効であるか確認するため、以下の試験を行った。
ＡＮＧＰＴ１を内皮細胞が受容すると、内皮細胞同士の密着結合関連遺伝子の発現が誘導され、血管透過性が抑制されることが知られている。
複合エキスが、血管透過性の抑制に有効であるか確認するため、以下の試験を行った。
【0064】
（方法）
以下に、試験例５で使用した細胞腫を示す。
・正常ヒト胎盤由来血管周皮細胞（ｈＰＣ－ＰＬ）（Ｐｒｏｍｏ ｃｅｌｌ社製）
・正常ヒト由来血管内皮細胞（ＫＵＲＡＢＯ株式会社製）
また、本試験例で使用した細胞培養の試薬・培地は以下の通りである。
・Ｐｅｒｉｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ ２（Ｐｒｏｍｏ ｃｅｌｌ社製、Ｃ－２８０４１）
・ダルベッコＰＢＳ（－）生化学用（富士フイルム和光純薬株式会社製、０４５－２９７９５）
・０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯＴＭ製、２５３００－０６２）
・０．４％トリパンブルー水溶液（ＧＩＢＣＯＴＭ製、１５２５０－０６１）
・ＨｕｍｅｄｉａＥＧ２（ＫＵＲＡＢＯ株式会社製、ＫＥ－２１５０Ｓ）
・コラーゲン酸性溶液（Ａｔｅｌｏｃｅｌｌ（登録商標）、ＩＰＣ－３０）
・塩酸（富士フィルム株式会社製、：０８３－０１０９５）
以下に、試験例５で使用した細胞腫を示す。
・正常ヒト胎盤由来血管周皮細胞（ｈＰＣ－ＰＬ）（Ｐｒｏｍｏ ｃｅｌｌ社製）
・正常ヒト由来血管内皮細胞（ＫＵＲＡＢＯ株式会社製）
また、本試験例で使用した細胞培養の試薬・培地は以下の通りである。
・Ｐｅｒｉｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ ２（Ｐｒｏｍｏ ｃｅｌｌ社製、Ｃ－２８０４１）
・ダルベッコＰＢＳ（－）生化学用（富士フイルム和光純薬株式会社製、０４５－２９７９５）
・０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯＴＭ製、２５３００－０６２）
・０．４％トリパンブルー水溶液（ＧＩＢＣＯＴＭ製、１５２５０－０６１）
・ＨｕｍｅｄｉａＥＧ２（ＫＵＲＡＢＯ株式会社製、ＫＥ－２１５０Ｓ）
・コラーゲン酸性溶液（Ａｔｅｌｏｃｅｌｌ（登録商標）、ＩＰＣ－３０）
・塩酸（富士フィルム株式会社製、：０８３－０１０９５）
【0065】
［コラーゲンコート工程］
１）塩酸で１０倍希釈したコラーゲン溶液を、トランズウェルのインサート外側に２００μＬずつ添加し、余分な溶液をピペットマンで除去した。
２）インサートを１２ｗｅｌｌプレートに設置し、インサート内側にコラーゲン溶液を３００μＬずつ添加し、余分なコラーゲン溶液をピペットマンで除去した。
３）３７℃、５％ＣＯ２環境下で３０分以上静置した。
４）インサート外側に１ｍＬ、内側に３００μＬのＰＢＳを添加した。
５）アスピレーターでＰＢＳを除去した。
６）上記４）５）を再度行い、ＰＢＳを除去した状態で静置した。
１）塩酸で１０倍希釈したコラーゲン溶液を、トランズウェルのインサート外側に２００μＬずつ添加し、余分な溶液をピペットマンで除去した。
２）インサートを１２ｗｅｌｌプレートに設置し、インサート内側にコラーゲン溶液を３００μＬずつ添加し、余分なコラーゲン溶液をピペットマンで除去した。
３）３７℃、５％ＣＯ２環境下で３０分以上静置した。
４）インサート外側に１ｍＬ、内側に３００μＬのＰＢＳを添加した。
５）アスピレーターでＰＢＳを除去した。
６）上記４）５）を再度行い、ＰＢＳを除去した状態で静置した。
【0066】
［血管周皮細胞播種－複合エキス添加工程］
１）６．７×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう細胞懸濁液を調製した。
２）１２ｗｅｌｌプレートの上蓋にインサートを裏返して設置し余分なＰＢＳを除去し、インサート上に１５０μＬずつ細胞懸濁液を加えた。
３）新たな１２ｗｅｌｌプレートの上蓋をかぶせ、３７℃、５％ＣＯ２で４時間培養を行った。
４）１２ウェルにそれぞれ１ｍＬの血管周皮細胞培地を添加した。
５）インサート上の培地をピペットマンで除去したのち、１２ｗｅｌｌにセットした。
６）インサートに３００μＬの培地を加え、３７℃、５％ＣＯ２でＯ／Ｎ培養をおこなった。
７）培地を除去し、複合エキス含有培地をインサート内側に３００μＬ、プレートに１ｍＬ加え、３７℃、５％ＣＯ２で２４ｈ培養をおこなった。
１）６．７×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう細胞懸濁液を調製した。
２）１２ｗｅｌｌプレートの上蓋にインサートを裏返して設置し余分なＰＢＳを除去し、インサート上に１５０μＬずつ細胞懸濁液を加えた。
３）新たな１２ｗｅｌｌプレートの上蓋をかぶせ、３７℃、５％ＣＯ２で４時間培養を行った。
４）１２ウェルにそれぞれ１ｍＬの血管周皮細胞培地を添加した。
５）インサート上の培地をピペットマンで除去したのち、１２ｗｅｌｌにセットした。
６）インサートに３００μＬの培地を加え、３７℃、５％ＣＯ２でＯ／Ｎ培養をおこなった。
７）培地を除去し、複合エキス含有培地をインサート内側に３００μＬ、プレートに１ｍＬ加え、３７℃、５％ＣＯ２で２４ｈ培養をおこなった。
【0067】
［内皮細胞播種工程］
１）培地を除去し、インサート及びプレートをそれぞれ３００μＬ、１ｍＬのＰＢＳ（－）で洗浄した。
２）周皮細胞培地：内皮細胞培地＝１：１で培地（以下共培養培地）を作成し、インサート外側に１ｍＬ加えた。
３）２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう、共培養培地で細胞懸濁液を調製後、インサートに５００μＬの内皮細胞懸濁液を加え、３７℃、５％ＣＯ２環境下で９６ｈ培養を行った。
１）培地を除去し、インサート及びプレートをそれぞれ３００μＬ、１ｍＬのＰＢＳ（－）で洗浄した。
２）周皮細胞培地：内皮細胞培地＝１：１で培地（以下共培養培地）を作成し、インサート外側に１ｍＬ加えた。
３）２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう、共培養培地で細胞懸濁液を調製後、インサートに５００μＬの内皮細胞懸濁液を加え、３７℃、５％ＣＯ２環境下で９６ｈ培養を行った。
【0068】
［透過性試験］
１）溶液調製工程：下記に記載の手順によって試薬を作成した。
（ｉ）Ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ Ｂｕｆｆｅｒの作成
１．４５ｍＭ、ＣａＣｌ２（添加量４０．２ｍｇ）と、１０ｍＭ、ｇｌｕｃｏｓｅ（添加量４５０ｍｇ）をＰＢＳ（－）（２５０ｍＬ）に混和しＢａｓｏｌａｔｅｒａｌ Ｂｕｆｆｅｒを作成した。
なお、試薬は以下の物を使用した。
・塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）（富士フイルム和光純薬株式会社製、０３８－２４９８５）
・Ｄ（＋）－グルコース（富士フイルム和光純薬株式会社製、０４９－３１１６５）
（ｉｉ）Ａｐｉｃａｌ Ｂｕｆｆｅｒの作成
１ｍｇ／ｍＬ、ＦＩＴＣ－Ｄｅｘｔｒａｎ（添加量１０ｍｇ）を Ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ Ｂｕｆｆｅｒ（－）（１０ｍＬ）に混和し、遮光して４℃保存した。
なお、試薬は以下の物を使用した。
・ＦＩＴＣ－Ｄｅｘｔｒａｎ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製、ＦＤ４０－１００ＭＧ）
２）培地を除去し、インサート及びプレートをそれぞれ５００μＬ、下層１ｍＬのＰＢＳで洗浄した。
３）測定用に準備した１２ｗｅｌｌプレートに１．５ｍＬのＢａｓｏｌａｔｅｒａｌ Ｂｕｆｆｅｒを加え、セットしたインサートに５００μＬのＡｐｉｃａｌ Ｂｕｆｆｅｒを加えた。
４）３７℃、５％ＣＯ２環境下で３時間インキュベートした。
５）インサートを静かに除去し、プレートのＢａｓｏｌａｔｅｒａｌ Ｂｕｆｆｅｒを振とう後ピペッティングを行った。
６）９６ｗｅｌｌのｐｌａｔｅにＡｐｉｃａｌ Ｂｕｆｆｅｒで標準曲線用のスタンダードシリーズを作製した。
ＦＩＴＣ－Ｄｅｘｔｒａｎの濃度２５０μｇ／ｍｌ－０μｇ／ｍｌの範囲で、公比２、８濃度の溶液を作成した。希釈はＢａｓｏｌａｔｅｒａｌ Ｂｕｆｆｅｒを用いて行った。
７）回収したＢａｓｏｌａｔｅｒａｌ Ｂｕｆｆｅｒを９６ｗｅｌｌに２００ｍｌずつ添加した。
８）分光光度計にてｎ＝３（スタンダードはｎ＝２）で測定を行った。（励起は４８５／５３５ｎｍであった。）
１）溶液調製工程：下記に記載の手順によって試薬を作成した。
（ｉ）Ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ Ｂｕｆｆｅｒの作成
１．４５ｍＭ、ＣａＣｌ２（添加量４０．２ｍｇ）と、１０ｍＭ、ｇｌｕｃｏｓｅ（添加量４５０ｍｇ）をＰＢＳ（－）（２５０ｍＬ）に混和しＢａｓｏｌａｔｅｒａｌ Ｂｕｆｆｅｒを作成した。
なお、試薬は以下の物を使用した。
・塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）（富士フイルム和光純薬株式会社製、０３８－２４９８５）
・Ｄ（＋）－グルコース（富士フイルム和光純薬株式会社製、０４９－３１１６５）
（ｉｉ）Ａｐｉｃａｌ Ｂｕｆｆｅｒの作成
１ｍｇ／ｍＬ、ＦＩＴＣ－Ｄｅｘｔｒａｎ（添加量１０ｍｇ）を Ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ Ｂｕｆｆｅｒ（－）（１０ｍＬ）に混和し、遮光して４℃保存した。
なお、試薬は以下の物を使用した。
・ＦＩＴＣ－Ｄｅｘｔｒａｎ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製、ＦＤ４０－１００ＭＧ）
２）培地を除去し、インサート及びプレートをそれぞれ５００μＬ、下層１ｍＬのＰＢＳで洗浄した。
３）測定用に準備した１２ｗｅｌｌプレートに１．５ｍＬのＢａｓｏｌａｔｅｒａｌ Ｂｕｆｆｅｒを加え、セットしたインサートに５００μＬのＡｐｉｃａｌ Ｂｕｆｆｅｒを加えた。
４）３７℃、５％ＣＯ２環境下で３時間インキュベートした。
５）インサートを静かに除去し、プレートのＢａｓｏｌａｔｅｒａｌ Ｂｕｆｆｅｒを振とう後ピペッティングを行った。
６）９６ｗｅｌｌのｐｌａｔｅにＡｐｉｃａｌ Ｂｕｆｆｅｒで標準曲線用のスタンダードシリーズを作製した。
ＦＩＴＣ－Ｄｅｘｔｒａｎの濃度２５０μｇ／ｍｌ－０μｇ／ｍｌの範囲で、公比２、８濃度の溶液を作成した。希釈はＢａｓｏｌａｔｅｒａｌ Ｂｕｆｆｅｒを用いて行った。
７）回収したＢａｓｏｌａｔｅｒａｌ Ｂｕｆｆｅｒを９６ｗｅｌｌに２００ｍｌずつ添加した。
８）分光光度計にてｎ＝３（スタンダードはｎ＝２）で測定を行った。（励起は４８５／５３５ｎｍであった。）
【0069】
【産業上の利用可能性】
【0070】
本発明によれば、血管周皮細胞と血管内皮細胞の接着関連因子の発現増大剤を提供することができる。さらに血管透過性の抑制に基づいて肌色改善成分をスクリーニングする方法を提供することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
