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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024069535
(43)【公開日】2024-05-21
(54)【発明の名称】フラップエンドヌクレアーゼを含む乾燥組成物
(51)【国際特許分類】
C12N 9/16 20060101AFI20240514BHJP
C12Q 1/6844 20180101ALN20240514BHJP
C12Q 1/68 20180101ALN20240514BHJP
【ＦＩ】
C12N9/16 Z
C12Q1/6844 Z
C12Q1/68
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024042157
(22)【出願日】2024-03-18
(62)【分割の表示】P 2021171542の分割
【原出願日】2021-10-20
(31)【優先権主張番号】62/508,975
(32)【優先日】2017-05-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/508,990
(32)【優先日】2017-05-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/540,478
(32)【優先日】2017-08-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】500169900
【氏名又は名称】ジェン－プローブ・インコーポレーテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(72)【発明者】
【氏名】パトリック ピーターソン
(72)【発明者】
【氏名】トニー ルー
(72)【発明者】
【氏名】マティアス ジョスト
(57)【要約】
【課題】フラップエンドヌクレアーゼを含む乾燥組成物の提供。
【解決手段】フラップエンドヌクレアーゼ、増量剤、および有機緩衝液を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる水溶液の組成物が開示され、水溶液は５ｍＭ以下の無機塩濃度を有し、組成物はグリセロールを実質的に含まない。本発明は、特に核酸に基づくアッセイにおいて、例えば、増幅に基づかないアッセイ、または増幅に基づくアッセイと組み合わせた増幅に基づかないアッセイに使用される場合に、凍結乾燥組成物の改善を提供しようとするものである。
【選択図】なし
【解決手段】フラップエンドヌクレアーゼ、増量剤、および有機緩衝液を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる水溶液の組成物が開示され、水溶液は５ｍＭ以下の無機塩濃度を有し、組成物はグリセロールを実質的に含まない。本発明は、特に核酸に基づくアッセイにおいて、例えば、増幅に基づかないアッセイ、または増幅に基づくアッセイと組み合わせた増幅に基づかないアッセイに使用される場合に、凍結乾燥組成物の改善を提供しようとするものである。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
明細書に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年５月１９日出願の６２／５０８，９７５、２０１７年５月１９日出願の６２／５０８，９９０、２０１７年８月２日出願の６２／５４０，４７８の各仮特許出願の利益を主張し、各々が参照により全ての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１７年５月１９日出願の６２／５０８，９７５、２０１７年５月１９日出願の６２／５０８，９９０、２０１７年８月２日出願の６２／５４０，４７８の各仮特許出願の利益を主張し、各々が参照により全ての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
核酸に基づくアッセイを行うための市販のキットは、多くの場合、酵素、ヌクレオチド、界面活性剤、緩衝液、プライマー、プローブ、ならびにＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＮａＣｌ、およびＫＣｌを含む無機塩等の試薬を含む（Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ，（１９９０）ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｈ．１，Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＰＣＲｓ）。
【0003】
核酸に基づくアッセイは、「核酸増幅に基づくアッセイ」、すなわち、核酸標的配列を増幅するための１つ以上のステップを用いるアッセイであり得る。核酸に基づくアッセイに使用される様々な増幅方法が当該技術分野で知られている。代替として、核酸に基づくアッセイは、「核酸増幅に基づかないアッセイ」、すなわち、核酸標的配列を増幅するためのいずれのステップにも依存しないアッセイであり得る。例示的な核酸増幅に基づかないアッセイは、「切断に基づくアッセイ」であり、これは、標的核酸への重複オリゴヌクレオチドの特異的ハイブリダイゼーションによって形成される線形二重鎖切断構造の、フラップエンドヌクレアーゼによる特異的切断に依存するアッセイである。これらのアッセイでは、インベーダーオリゴヌクレオチド（「インベーダープローブ」とも称される）が、アッセイ反応温度で標的核酸に安定してアニーリングするように設計される。標的ハイブリダイズ配列と、インベーダーオリゴヌクレオチドを覆う非標的ハイブリダイズフラップ領域とを含むシグナルプローブオリゴヌクレオチドは、ほぼアッセイ温度の融解温度である融解温度で設計される。結果として、シグナルプローブは、反応条件で標的核酸をアニーリングする／標的核酸から解離する状態にある。シグナルプローブがフラップエンドヌクレアーゼの存在下で標的核酸にアニーリングされると、非標的ハイブリダイズフラップ領域は、フラップエンドヌクレアーゼによってオーバーラップ依存的に切断されて切断産物を放出する。次いで、切断されたフラップ領域は、シグナル伝達部分および消光部分を含むヘアピン構成のプローブ（しばしば「ＦＲＥＴプローブ」と称される）とアニーリングして、切断されたフラップ部分の一部とＦＲＥＴプローブの一部との間に、シグナル伝達部分または消光部分の一方に結合するオーバーラップを形成する。フラップエンドヌクレアーゼの存在下で、ＦＲＥＴプローブはオーバーラップ依存的に切断され、シグナル伝達部分または消光部分の一方をＦＲＥＴプローブから放出し、それによって検出可能なシグナルが発生する。これらのアッセイでは、インベーダープローブに比べて過剰なシグナルプローブおよびＦＲＥＴプローブが使用されるため、これらはしばしばシグナル増幅アッセイと称される。切断に基づくアッセイの原理は当該技術分野で周知であり、例示的なアッセイは、例えば、Ｌｙａｍｉｃｈｅｖら（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：２９２－２９６，１９９９）、ＲｙａｎらＭｏｌ．Ｄｉａｇｎ．４：１３５－１４４，１９９９）、Ａｌｌａｗｉら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：３４４３－３４４７，２００６）、Ｂｒｏｗらに対する米国特許第５，８４６，７１７号および同第６，７０６，４７１号、ならびにＤａｈｌｂｅｒｇらに対する米国特許第５，６１４，４０２号に記載されている。切断に基づくアッセイは、例えば、市販のＩｎｖａｄｅｒ（登録商標）アッセイ（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）を含む。
【0004】
状況によっては、同じ反応において「増幅に基づくアッセイ」（例：ＰＣＲ）および「増幅に基づかないアッセイ」（Ｃｌｅａｖａｓｅ（登録商標）酵素を使用するアッセイ）を実行することが望ましい場合がある。Ｃｌｅａｖａｓｅ（登録商標）酵素は、一本鎖と二本鎖のデオキシリボ核の接合部で切断する熱安定性の構造特異的エンドヌクレアーゼである。
【0005】
マグネシウムイオンは、ポリメラーゼおよび他の酵素の活性を高めると報告されている。塩化カリウムは、核酸のハイブリダイゼーションを促進すると報告されている。いくつかの無機塩は、熱、カオトロピック剤への曝露、および凍結乾燥を含む様々なストレス条件下でタンパク質を保護すると報告されている（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ（２００７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ．５８１：１０４７；Ｋａｎａｙａ ｅｔ ａｌ（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３２７２９；Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ，（１９９０）ＰＣＲ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｈ．１，Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＰＣＲｓ；Ｍｅｎｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１６７；Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３２：１６０１，Ｆｏｘ ｅｔ
ａｌ（１９７１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４６：５７３９，Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２７７：４６６３，Ｒｕｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ（１９５８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３３：３７４，Ｈｕｓｚａｒ ｅｔ ａｌ（１９８１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３７：５８０－５８８，Ｗａｎｇ（２０００）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ．２０３：１－６０）。塩はまた、「増幅に基づくアッセイ」および「増幅に基づかないアッセイ」といったアッセイにおいても使用される。例として、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）アッセイを実行するための典型的な反応条件は、酵素ストック中の塩化カリウムおよび反応緩衝液中の塩化マグネシウムを含む。
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｈ．１，Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＰＣＲｓ；Ｍｅｎｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１６７；Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３２：１６０１，Ｆｏｘ ｅｔ
ａｌ（１９７１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４６：５７３９，Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２７７：４６６３，Ｒｕｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ（１９５８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３３：３７４，Ｈｕｓｚａｒ ｅｔ ａｌ（１９８１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３７：５８０－５８８，Ｗａｎｇ（２０００）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ．２０３：１－６０）。塩はまた、「増幅に基づくアッセイ」および「増幅に基づかないアッセイ」といったアッセイにおいても使用される。例として、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）アッセイを実行するための典型的な反応条件は、酵素ストック中の塩化カリウムおよび反応緩衝液中の塩化マグネシウムを含む。
【0006】
しかしながら、凍結乾燥物質の安定性は、凍結乾燥ケーキ中に存在するあらゆる塩の吸湿性によって影響を受ける。凍結乾燥物質の吸湿性は、凍結乾燥物質を包装するのに利用可能な時間に影響を与え、凍結乾燥物質を保存および出荷できる期間および条件に影響を与える。凍結乾燥物質の望ましくない再水和は、凍結乾燥された成分の活性に悪影響を及ぼす。凍結乾燥物質の望ましくない再水和による悪影響を最小限に抑えるために、通常、そのような物質の長期保存は冷蔵によって行われる。
本発明は、特に核酸に基づくアッセイにおいて、例えば、増幅に基づかないアッセイ、または増幅に基づくアッセイと組み合わせた増幅に基づかないアッセイに使用される場合に、凍結乾燥組成物の改善を提供しようとするものである。
本発明は、特に核酸に基づくアッセイにおいて、例えば、増幅に基づかないアッセイ、または増幅に基づくアッセイと組み合わせた増幅に基づかないアッセイに使用される場合に、凍結乾燥組成物の改善を提供しようとするものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ，（１９９０）ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｈ．１，Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＰＣＲｓ
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0008】
フラップエンドヌクレアーゼ、増量剤、および有機緩衝液を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる、水溶液の組成物であって、水溶液は６ｍＭ以下の無機塩濃度を有し、組成物はグリセロールを実質的に含まない、組成物が開示される。
【0009】
好適には、水溶液は、分子アッセイを行うのに有用な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドをさらに含む。
【0010】
好適には、水溶液は、核酸に基づくアッセイを行うのに有用な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドをさらに含む。
【0011】
好適には、フラップエンドヌクレアーゼはＣｌｅａｖａｓｅ（登録商標）酵素である。
【0012】
好適には、組成物は、少なくとも１つのポリメラーゼをさらに含む。
【0013】
好適には、少なくとも１つのポリメラーゼは、水溶液中約０．１０Ｕ／μｌ～約０．２５Ｕ／μｌの濃度で水溶液中に存在するポリメラーゼを含む。
【0014】
好適には、少なくとも１つのポリメラーゼは、０．１１Ｕ／ｕｌ、０．１２Ｕ／ｕｌ、０．１４Ｕ／ｕｌ、０．１４６Ｕ／ｕｌ、０．１６８７Ｕ／ｕｌ、０．２Ｕ／ｕｌ、および０．０２２Ｕ／ｕｌから選択される濃度で水溶液中に存在するポリメラーゼを含む。
【0015】
好適には、少なくとも１つのポリメラーゼは、ホットスタートポリメラーゼであるポリメラーゼを含む。
【0016】
好適には、ホットスタートポリメラーゼは、ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を特異的に遮断する抗体によって結合された組換えＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼである。
【0017】
好適には、ホットスタートポリメラーゼは、化学修飾された組換えＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼであり、化学修飾は、ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を阻害する。
【0018】
好適には、少なくとも１つのポリメラーゼは、好適には、約０．１Ｕ／ｕｌ～約４．０Ｕ／ｕｌの濃度で、水溶液中に存在する逆転写酵素を含む。
【0019】
好適には、逆転写酵素はＡＭＶ逆転写酵素である。
【0020】
好適には、逆転写酵素はＭＭＬＶ逆転写酵素である。
【0021】
好適には、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、インベーダープローブを含む。
【0022】
好適には、インベーダープローブの配列は、標的核酸配列に部分的または完全に相補的である。
【0023】
好適には、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、シグナル伝達プローブを含む。
【0024】
好適には、シグナル伝達プローブの配列は、標的核酸配列に部分的に相補的である。
【0025】
好適には、シグナル伝達プローブの配列は、フラップ領域を含む。
【0026】
好適には、フラップ領域は、インベーダープローブと少なくとも部分的に重複する。
【0027】
好適には、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、ＦＲＥＴプローブを含む。
【0028】
好適には、ＦＲＥＴプローブの配列は、シグナル伝達プローブのフラップ領域に部分的に相補的である。
【0029】
好適には、ＦＲＥＴプローブは、それに共有結合した標識を含む。
【0030】
好適には、標識は蛍光分子である。
【0031】
好適には、標識はＦＲＥＴプローブの５’末端に位置する。
【0032】
好適には、ＦＲＥＴプローブは、蛍光分子を消光できる近接範囲内で、該プローブに共有結合し、かつ蛍光分子からの蛍光を少なくとも部分的に消光することができる、消光分子を含む。
【0033】
好適には、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、標的捕捉プローブを含む。
【0034】
好適には、標的捕捉プローブは、ストリンジェントな条件下で標的核酸に特異的または非特異的にハイブリダイズする標的ハイブリダイズ部分を有する。
【0035】
好適には、標的捕捉プローブは、ストリンジェントな条件下で標的核酸に非特異的にハイブリダイズする標的ハイブリダイズ部分を有する。
【0036】
好適には、標的捕捉プローブの非特異的標的ハイブリダイズ部分は、ランダムに配置されたＫヌクレオチドまたはランダムに配置されたＲヌクレオチドを含む（ＩＵＰＡＢ－ＩＵＢ曖昧性コード）。
【0037】
好適には、水溶液は、多重分子アッセイを行うための２つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。
【0038】
好適には、増量剤はトレハロースである。
【0039】
好適には、増量剤は、約０．２Ｍ～約０．５Ｍ、好適には約０．３６Ｍの濃度で存在する。
【0040】
好適には、水溶液は、６ｍＭ以下の無機塩濃度を含む。好適には、水溶液は、約６ｍＭ～約０．５ｍＭの無機塩濃度を含む。
【0041】
好適には、無機塩は、約０．３７３μｇ／μｌ～約０．０２９μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量で存在する。
【0042】
好適には、無機塩は塩化ナトリウムであり、好適には、塩化ナトリウムは、約０．３５μｇ／ｕｌ～約０．０２９μｇ／ｕｌ、好適には約０．３２μｇ／ｕｌの１マイクロリットル当たりの質量で存在する。
【0043】
好適には、無機塩は塩化カリウムであり、好適には、塩化カリウムは、約０．３７３ｕｇ／ｕｌの塩化カリウム～約０．０１９ｕｇ／ｕｌの塩化カリウム、好適には約０．０３ｕｇ／ｕｌの１マイクロリットル当たりの質量で存在する。
【0044】
好適には、水溶液は、約０．１３５ｕｇ／ｕｌのナトリウムイオン～約０．００６μｇ／μｌのナトリウムイオン、好適には約０．１２７ｕｇ／ｕｌを含む。
【0045】
好適には、水溶液は、約０．１９６ｕｇ／ｕｌのカリウムイオン～約０．０１０ｕｇ／ｕｌのカリウムイオン、好適には約０．０１６ｕｇ／ｕｌのカリウムイオンを含む。
【0046】
好適には、水溶液は、約０．３５５ｕｇ／ｕｌの塩化物イオン～約０．００９ｕｇ／ｕｌの塩化物イオン、好適には約０．３３７ｕｇ／ｕｌを含む。
【0047】
好適には、水溶液は４ｍＭ以下の無機塩濃度を含む。
【0048】
好適には、水溶液は、約０．２９８μｇ／μｌ～約０．２３４μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量の無機塩を含む。
【0049】
好適には、水溶液は、約０．２８４μｇ／μｌ～約０．０７１μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量の塩化物イオンを含む。
【0050】
好適には、水溶液は３ｍＭ以下の無機塩濃度を含む。
【0051】
好適には、水溶液は、約０．２２４μｇ／μｌ～約０．１７５μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量の無機塩を含む。
【0052】
好適には、水溶液は、約０．２１３μｇ／μｌ～約０．０５３μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量の塩化物イオンを含む。
【0053】
好適には、水溶液は２ｍＭ以下の無機塩濃度を含む。
【0054】
好適には、水溶液は、約０．１４９μｇ／μｌ～約０．１１７μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量の無機塩を含む。
【0055】
好適には、水溶液は、約０．１４２μｇ／μｌ～約０．０３６μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量の塩化物イオンを含む。
【0056】
好適には、水溶液は１ｍＭ以下の無機塩濃度を含む。
【0057】
好適には、水溶液は、約０．０７５μｇ／μｌ～約０．０５８μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量の無機塩を含む。
【0058】
好適には、水溶液は、約０．０７１μｇ／μｌ～約０．０１８μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量の塩化物イオンを含む。
【0059】
好適には、水溶液は、５００μＭ以下の無機塩濃度を含む。
【0060】
好適には、水溶液は、約０．０３７μｇ／μｌ～約０．０２９μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量の無機塩を含む。
【0061】
好適には、水溶液は、約０．０３６μｇ／μｌ～約０．００９μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量の塩化物イオンを含む。
【0062】
好適には、水溶液の無機塩濃度は、１ｍＭ未満の塩化ナトリウムである。
【0063】
好適には、水溶液は塩化ナトリウムを含まない。
【0064】
好適には、水溶液は１ｍＭ未満のマグネシウムイオンを含む。
【0065】
好適には、水溶液は０．１ｍＭ未満のマグネシウムイオンを含む。
【0066】
好適には、水溶液は、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）をさらに含む。
【0067】
好適には、ｄＮＴＰは、水溶液中０．１ｍＭ～０．５ｍＭ、好適には約０．２８ｍＭ～約０．４６ｍＭの濃度のｄＡＴＰを含む。
【0068】
好適には、ｄＡＴＰは、水溶液中０．３ｍＭ～０．４ｍＭ、例えば、０．３７５ｍＭの濃度である。
【0069】
好適には、ｄＮＴＰは、水溶液中０．１ｍＭ～０．４ｍＭの濃度のｄＧＴＰを含む。
【0070】
好適には、ｄＧＴＰは、水溶液中０．３ｍＭ～０．４ｍＭ、好適には０．２９～０．４６ｍＭ、例えば０．３７５ｍＭの濃度である。
【0071】
好適には、ｄＮＴＰは、水溶液中０．１ｍＭ～０．４ｍＭ、好適には０．２９～０．４６ｍＭの濃度のｄＣＴＰを含む。
【0072】
好適には、ｄＣＴＰは、水溶液中０．３ｍＭ～０．４ｍＭ、例えば、０．３７５ｍＭの濃度である。
【0073】
好適には、ｄＮＴＰは、水溶液中０．１ｍＭ～０．４ｍＭ、好適には０．２～０．３７ｍＭ、例えば０．２８４ｍＭの濃度のｄＴＴＰを含む。
【0074】
好適には、ｄＮＴＰは、水溶液中０．１ｍＭ～０．４ｍＭ、好適には０．１２５～０．２３４ｍＭ、例えば０．１８２ｍＭの濃度のｄＵＴＰを含む。
【0075】
好適には、フラップエンドヌクレアーゼは、約０．０１０μｇ／μｌ～約０．０５０ｕｇ／ｕｌ、好適には約０．１２ｕｇ／ｕｌ～０．０４７ｕｇ／ｕｌで水溶液中に存在する。
【0076】
好適には、フラップエンドヌクレアーゼは、約０．０３０μｇ／μｌ～約０．０４μｇ／μｌで水溶液中に存在し、好適には、フラップエンドヌクレアーゼは、約０．０３０μｇ／μｌ～約０．０３５μｇ／μｌで水溶液中に存在する。
【0077】
好適には、有機緩衝液は、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液である。
【0078】
好適には、ＭＯＰＳ緩衝液は、水溶液中１０～２０ｍＭの濃度で、好適には、水溶液中１２．５ｍＭ～２０ｍＭの濃度で存在する。
【0079】
好適には、有機緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）緩衝液である。
【0080】
好適には、トリス緩衝液は、水溶液中４０ｍＭ～６０ｍＭの濃度で、好適には、水溶液中５０ｍＭの濃度で存在する。
【0081】
好適には、組成物は球状タンパク質を含む。
【0082】
好適には、球状タンパク質はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。
【0083】
好適には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は、非アセチル化ＢＳＡ、好適には、超高純度非アセチル化ＢＳＡである。
【0084】
好適には、球状タンパク質は、０．４０～０．６０μｇ／μｌ、好適には０．５０μｇ／μｌの量で存在する。
【0085】
好適には、組成物は、Ｃｌｅａｖａｓｅ（登録商標）酵素、トレハロース、ＭＯＰＳ緩衝液、ｄＮＴＰ、５ｍＭ以下の無機塩濃度を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になり、組成物はグリセロールを実質的に含まない。
【0086】
好適には、組成物は、約０．０３０μｇ／μｌで水溶液中に存在するＣｌｅａｖａｓｅ（登録商標）酵素、約０．３Ｍの濃度で存在するトレハロース、約１２．５ｍＭの濃度のＭＯＰＳ緩衝液、各々約０．３ｍＭの濃度のｄＮＴＰ（任意選択的に、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰは約０．３７５ｍＭであり、ｄＴＴＰは約０．２８４ｍＭであり、ｄＵＴＰは約０．１８２ｍＭである）、５ｍＭ以下の無機塩濃度を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になり、組成物はグリセロールを実質的に含まない。
【0087】
好適には、組成物は、Ｃｌｅａｖａｓｅ（登録商標）酵素、トレハロース、トリス緩衝液、ｄＮＴＰ、ウシ血清アルブミン、５ｍＭ以下の無機塩濃度を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になり、組成物はグリセロールを実質的に含まない。
【0088】
好適には、組成物は、約０．０３０μｇ／μｌで水溶液中に存在するＣｌｅａｖａｓｅ（登録商標）酵素、約０．３Ｍの濃度で存在するトレハロース、約５０ｍＭの濃度のトリス緩衝液、各々約０．３ｍＭの濃度のｄＮＴＰ（任意選択的に、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰは約０．３７５ｍＭであり、ｄＴＴＰは約０．２８４ｍＭであり、ｄＵＴＰは約０．１８２ｍＭである）、約０．５μｇ／μｌのウシ血清アルブミン、５ｍＭ以下の無機塩濃度を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になり、組成物はグリセロールを実質的に含まない。
【0089】
好適には、組成物は、Ｃｌｅａｖａｓｅ（登録商標）、トレハロース、ＭＯＰＳ緩衝液、ｄＮＴＰ、ウシ血清アルブミン、５ｍＭ以下の無機塩濃度を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になり、組成物はグリセロールを実質的に含まない。
【0090】
好適には、組成物は、約０．０３５μｇ／μｌで水溶液中に存在するＣｌｅａｖａｓｅ（登録商標）、約０．３６Ｍの濃度で存在するトレハロース、約１５ｍＭの濃度のＭＯＰＳ緩衝液、各々約０．３８ｍＭの濃度のｄＮＴＰ、約０．５μｇ／μｌのウシ血清アルブミン、５ｍＭ以下の無機塩濃度を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になり、組成物はグリセロールを実質的に含まない。
【0091】
好適には、組成物は、例えば０．１～０．５μｇ／ｍｌの濃度のα－シクロデキストリンを含む。
【0092】
本開示による組成物の乾燥形態もまた開示される。例として、２４ｕｌの本明細書に記載の水溶液を乾燥させて、約０．００３ｇ～約０．００４ｇ、約０．００３２ｇ～約０．００３７ｇ～０．００３３ｇ、０．００３４ｇ、０．００３５ｇ、または０．００３６ｇの範囲内の質量を有する乾燥組成物を提供する。単一のバルク水溶液のアリコートから作製された複数の乾燥組成物は、各乾燥組成物の質量に変動があることを理解されたい。例として、バルク水溶液の２つ以上の２４ｕｌアリコートをそれぞれ乾燥させて、約０．００３ｇ～約０．００４ｇの範囲内の質量を有する乾燥組成物を別々に提供する。したがって、複数の乾燥ペレットの各々の平均重量は、約０．００３ｇ～約０．００４ｇ、約０．００３２ｇ～約０．００３７ｇ、０．００３３ｇ、０．００３４ｇ、０．００３５ｇ、または０．００３６ｇの範囲内である。水溶液中の成分の濃度を変更すると、乾燥組成物の質量が変化する。例えば、特定の反応に用いられる酵素活性を最適化するように酵素の濃度を変更すると、乾燥組成物の質量が変化し得る。同様に、使用される成分の種類の変更により、乾燥組成物の質量を変化させることができる。例えば、異なるフラップエンドヌクレアーゼを使用すると、所望の酵素活性レベルを提供するように濃度を変更する必要があり得る。様々な成分のうちの１つ以上の濃度および／または種類を変更することは、本開示の範囲内であると理解され、したがって、結果として生じる乾燥組成物の質量の変化は、同様に本開示の範囲内であると理解されたい。
【0093】
フラップエンドヌクレアーゼ、増量剤、および有機緩衝液を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる乾燥組成物も開示され、１つ以上の無機塩は、乾燥組成物の全質量の０．３５０％以下の質量で乾燥組成物中に存在し、乾燥組成物はグリセロールを実質的に含まない。
【0094】
乾燥組成物は、再構成後の核酸に基づくアッセイに有用である。驚くべきことに、乾燥組成物は、湿潤環境への長期曝露後にロバストな結果をもたらす。組成物の乾燥形態は、湿潤環境への曝露後の核酸に基づくアッセイにおいて有用であり、湿潤環境の絶対湿度レベルは、最大３時間の期間、好ましくは、９０分～１８０分の期間、好ましくは約９０分間、好ましくは約１８０分間、空気１立方メートル当たり２．３グラムを超える水である。驚くべきことに、乾燥組成物は、予備乾燥した水溶液の長期インキュベーション時間後、ロバストな結果をもたらす。
【0095】
好適には、１つ以上の無機塩は、乾燥組成物の全質量の約０．３１１％～約０．０２４％の質量で乾燥組成物中に存在する。
【0096】
好適には、１つ以上の無機塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、および塩化ナトリウムと塩化カリウムの両方からなる群から選択される。
【0097】
好適には、乾燥組成物は、分子アッセイを行うのに有用な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドをさらに含む。
【0098】
好適には、乾燥組成物は、核酸に基づくアッセイを行うのに有用な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドをさらに含む。
【0099】
好適には、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、プローブオリゴヌクレオチド、好適には少なくとも２つのプローブオリゴヌクレオチドを含む。
【0100】
好適には、プローブオリゴヌクレオチド（複数可）は、標的核酸配列に部分的または完全に相補的である。
【0101】
好適には、フラップエンドヌクレアーゼはＣｌｅａｖａｓｅ（登録商標）酵素である。
【0102】
好適には、乾燥組成物は、フラップエンドヌクレアーゼによって認識され得る三次元構造を形成するように標的核酸にアニーリングすることができる少なくとも２つのプローブオリゴヌクレオチドをさらに含む。
【0103】
好適には、乾燥組成物は、少なくとも１つのポリメラーゼをさらに含む。
【0104】
好適には、少なくとも１つのポリメラーゼは、水溶液中約０．１０Ｕ／μｌ～約０．２Ｕ／μｌの濃度で水溶液中に存在するポリメラーゼを含む。
【0105】
好適には、少なくとも１つのポリメラーゼは、約０．１Ｕ／ｕｌ～約０．２５Ｕ／ｕｌから選択される濃度で水溶液中に存在するポリメラーゼを含む。
【0106】
好適には、少なくとも１つのポリメラーゼは、ホットスタートポリメラーゼであるポリメラーゼを含む。
【0107】
好適には、ホットスタートポリメラーゼは、ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を特異的に遮断する抗体によって結合された組換えＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼである。
【0108】
好適には、ホットスタートポリメラーゼは、化学修飾された組換えＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼであり、化学修飾は、ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を阻害する。
【0109】
好適には、少なくとも１つのポリメラーゼは、好適には、約０．１Ｕ／μｌ～約０．６Ｕ／μｌの濃度で、水溶液中に存在する逆転写酵素を含む。
【0110】
好適には、逆転写酵素はＡＭＶ逆転写酵素である。
【0111】
好適には、逆転写酵素はＭＭＬＶ逆転写酵素である。
【0112】
好適には、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、検出プローブを含む。
【0113】
好適には、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、検出プローブを含む。
【0114】
好適には、検出プローブの配列は、標的核酸配列に部分的または完全に相補的である。
【0115】
好適には、検出プローブは、それに共有結合した標識を含む。
【0116】
好適には、標識は、蛍光分子または化学発光分子である。
【0117】
好適には、標識は、検出プローブおよび内部消光分子の５’末端に位置する。
【0118】
好適には、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、インベーダープローブを含む。
【0119】
好適には、インベーダープローブの配列は、標的核酸配列に部分的または完全に相補的である。
【0120】
好適には、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、シグナル伝達プローブを含む。
【0121】
好適には、シグナル伝達プローブの配列は、標的核酸配列に部分的に相補的である。
【0122】
好適には、シグナル伝達プローブの配列は、フラップ領域を含む。
【0123】
好適には、フラップ領域は、インベーダープローブと少なくとも部分的に重複する。
【0124】
好適には、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、ＦＲＥＴプローブを含む。
【0125】
好適には、ＦＲＥＴプローブの配列は、シグナル伝達プローブのフラップ領域に部分的に相補的である。
【0126】
好適には、ＦＲＥＴプローブは、それに共有結合した標識を含む。
【0127】
好適には、標識は蛍光分子である。
【0128】
好適には、標識はＦＲＥＴプローブの５’末端に位置する。好適には、ＦＲＥＴプローブは、蛍光分子を消光できる近接範囲内で、該プローブに共有結合し、かつ蛍光分子からの蛍光を少なくとも部分的に消光することができる、消光分子を含む。
【0129】
好適には、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、標的捕捉プローブを含む。
【0130】
好適には、標的捕捉プローブは、ストリンジェントな条件下で標的核酸に特異的または非特異的にハイブリダイズする標的ハイブリダイズ部分を有する。
【0131】
好適には、標的捕捉プローブは、ストリンジェントな条件下で標的核酸に非特異的にハイブリダイズする標的ハイブリダイズ部分を有する。
【0132】
好適には、標的捕捉プローブの非特異的標的ハイブリダイズ部分は、ランダムに配置されたＫヌクレオチドまたはランダムに配置されたＲヌクレオチドを含む。
【0133】
好適には、組成物は、多重分子アッセイを行うためのオリゴヌクレオチドを含む。
【0134】
好適には、増量剤はトレハロースである。
【0135】
好適には、乾燥組成物は、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）をさらに含む。
【0136】
好適には、有機緩衝液は、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液である。
【0137】
好適には、有機緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）緩衝液である。
【0138】
好適には、乾燥組成物は球状タンパク質を含む。
【0139】
好適には、球状タンパク質はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。
【0140】
好適には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は、非アセチル化ＢＳＡ、好適には、超高純度非アセチル化ＢＳＡである。
【0141】
核酸に基づくアッセイを行う際に使用される混合物を形成する方法もまた開示され、該方法は、再構成溶液と本明細書に記載の乾燥組成物とを組み合わせることを含み、再構成溶液は、少なくとも１つの無機塩を含む。
【0142】
好適には、再構成溶液は、１ｍＭ未満の無機塩濃度を含む。
【0143】
好適には、再構成溶液は、マグネシウムイオンを含む。
【0144】
好適には、再構成溶液は、約５ｍＭ～約１５ｍＭ、好適には、９ｍＭ～１０ｍＭまたは９～１２ｍＭ、任意選択的に１１．２５ｍＭの濃度のＭｇＣｌ２を含む。
【0145】
好適には、再構成溶液は、約０．０１２％ｗ／ｖ～約０．０２０％ｗ／ｖの濃度のメチルパラベン、約０．００６％ｗ／ｖ～約０．０１０％ｗ／ｖの濃度のプロピルパラベン、約０．２０％ｖ／ｖ～約０．３０％ｖ／ｖの濃度の無水エタノール、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0146】
好適には、再構成溶液中のメチルパラベンの濃度は０．０１６％ｗ／ｖである。
【0147】
好適には、再構成溶液中のプロピルパラベンの濃度は０．００８％ｗ／ｖである。
【0148】
好適には、無水エタノールの濃度は、約０．２６％ｖ／ｖで再構成溶液中に存在する。
【0149】
核酸に基づくアッセイを行う際に使用される乾燥組成物を調製するための方法もまた開示され、該方法は、（ｉ）本開示の水溶液を凍結させ、それによって水溶液の凍結形態を形成するステップと、（ｉｉ）ステップ（ｉ）からの凍結形態を凍結乾燥条件に曝露し、それによって乾燥組成物を形成するステップと、を含む。
【0150】
好適には、乾燥組成物は湿潤環境に曝露され、湿潤環境の絶対湿度レベルは、３０℃で空気１立方メートル当たり２．３グラムを超える水である。
【0151】
好適には、乾燥組成物は、最大３時間まで湿潤環境に曝露される。
【0152】
好適には、この方法は、乾燥組成物を密封容器に保存するステップを含む。
【0153】
核酸に基づくアッセイを行う際に使用される乾燥組成物を調製するための方法もまた開示され、該方法は、脱水、乾燥、凍結乾燥、および噴霧乾燥からなる群から選択される乾燥方法を用いて、本開示に記載の水溶液を乾燥させるステップと、それによって乾燥組成物を形成するステップと、を含む
【0154】
好適には、乾燥方法は凍結乾燥であり、乾燥組成物は凍結乾燥組成物である。
【0155】
好適には、この方法は、乾燥組成物を密封容器に保存するステップをさらに含む。
【0156】
核酸に基づくアッセイを行う際に使用されるキットもまた開示され、該キットは、本明細書に記載の乾燥組成物を含む第１の容器と、約３．８ｍＭ～約１４．４ｍＭ、好適には、約９．４ｍＭまたは約１１．２５の濃度のＭｇＣｌ２を含む再構成溶液を含む第２の容器と、を含む。
【0157】
好適には、第１の容器は、１つ以上のウェルを含むマルチウェルプレートである。
【0158】
好適には、１つ以上のウェルの各々は、０．３１１％以下のペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントを含む乾燥単一単位用量ペレットを含む。
【0159】
好適には、第１および第２の容器は、第２の容器から第１の容器への再構成溶液の自動移送に適合したデバイス内に組み込まれる。
【0160】
好適には、１つ以上のウェルの各々は、各ウェルに乾燥単一単位用量ペレットを形成するように乾燥させた水溶液の各マイクロリットルに対して約０．０００１２５ｇ～約０．０００６６７ｇの重量の乾燥単一単位用量ペレットを含む。
【0161】
好適には、１つ以上のウェルの各々は、約０．００３ｇ～約０．００４ｇ、約０．００３２ｇ～約０．００３７ｇ、０．００３３ｇ、０．００３４ｇ、０．００３５ｇ、または０．００３６ｇの範囲内の重量を各々有する乾燥単一単位用量ペレットを含む。
【0162】
有機緩衝液、増量剤、塩化物イオン、およびキレート剤を含む水溶液を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる、透析組成物も開示される。
【0163】
好適には、増量剤はトレハロースである。
【0164】
好適には、増量剤は、約１００ｍＭ～３００ｍＭ、好適には２００ｍＭの濃度で存在する。
【0165】
好適には、有機緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）緩衝液である。
【0166】
好適には、トリス緩衝液は、水溶液中１０ｍＭ～３０ｍＭの濃度で、好適には、水溶液中２０ｍＭの濃度で存在する。好適には、ｐＨは約８．０である。
【0167】
好適には、塩化物イオンはＫＣｌである。
【0168】
好適には、ＫＣｌは、約４０～６０ｍＭ、好適には５０ｍＭの濃度で存在する。
【0169】
好適には、キレート剤はＥＤＴＡである。
【0170】
好適には、ＥＤＴＡは、０．０５～０．２ｍＭ、好適には０．１ｍＭの濃度で水溶液中に存在する。
【0171】
好適には、組成物は、フラップエンドヌクレアーゼ、好適には、Ｃｌｅａｖａｓｅ（登録商標）酵素を含む。
【0172】
グリセロールを実質的に含まないフラップエンドヌクレアーゼ組成物を調製するための方法もまた開示され、該方法は、（ｉ）フラップエンドヌクレアーゼおよびグリセロールを含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる水溶液を提供することと、（ｉｉ）水溶液を本明細書に記載の透析組成物に透析することと、（ｉｉｉ）グリセロールを実質的に含まないフラップエンドヌクレアーゼ組成物を取得することと、を含む。
【0173】
好適には、ステップ（ｉ）の水溶液は、約０．０～約０．５％（ｗ／ｖ）のグリセロール、好適には約０．３５％（ｗ／ｖ）のグリセロール、より好適には０．２％（ｗ／ｖ）未満のグリセロールを含む。
【0174】
乾燥フラップエンドヌクレアーゼ含有組成物を調製するための本明細書に記載の乾燥組成物の使用もまた開示される。
【0175】
核酸に基づくアッセイを行うための再構成溶液と組み合わせた本明細書に記載の乾燥組成物の使用もまた開示される。
【0176】
グリセロールを実質的に含まないフラップエンドヌクレアーゼ組成物を調製するための本明細書に記載の透析組成物の使用もまた開示される。
【0177】
定義
「約」という用語は、組成物の活性または安定性にいかなる有意な影響も及ぼさない組成物の成分の量におけるごくわずかな変動を示す。
「約」という用語は、組成物の活性または安定性にいかなる有意な影響も及ぼさない組成物の成分の量におけるごくわずかな変動を示す。
【0178】
「増量剤」は、乾燥および保存中にタンパク質および他の試薬の沈殿のためのマトリックスを提供する。（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｓｔａｂｌｅ ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１０９－１３３）。増量剤は、生成物の「ケーキ」または他の構造を形成するために使用することができ、乾燥中にバイアルからタンパク質が失われるのを防ぎ、タンパク質の安定性を高める。
【0179】
「キレート剤」は、酵素活性に必要なＭｇ２＋またはＭｎ２＋等の二価イオンを隔離する薬剤である。
【0180】
「凍結乾燥」、「凍結乾燥された」、および「フリーズドライされた」という用語は、乾燥される材料が、最初に凍結され、次いで、真空環境において昇華によって氷または凍結溶媒が除去されるプロセスを指す。「凍結乾燥物」は、凍結乾燥された物質を指す。
【0181】
核酸ハイブリダイゼーションに関する「ストリンジェント」という用語（「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「ストリンジェントな条件」を含む）は、特定のオリゴヌクレオチドが試験試料中に存在する他の核酸よりも標的核酸とハイブリダイズできる条件を指す。これらの条件は、オリゴヌクレオチドのＧＣ含量および長さ、ハイブリダイゼーション温度、ハイブリダイゼーション試薬または溶液の組成、および求められるハイブリダイゼーション特異性の程度を含む要因に応じて変化し得ることを理解されたい。プローブ、オリゴヌクレオチド、標的捕捉ヌクレオチド、遮断薬、および他のヌクレオチドに関する適切なハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野において周知であり、配列組成に基づいて予測され得るか、または日常的な試験方法を用いることによって決定することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）、§§１．９０－１．９１、７．３７－７．５７、９．４７－９．５１および１１．４７－１１．５７、特に§§９．５０－９．５１、１１．１２－１１．１３、１１．４５－１１．４７および１１．５５－１１．５７）。
【0182】
「切断構造」という用語は、２つの核酸が各々第３の核酸上の単一の核酸塩基位置でハイブリダイズするように構成される核酸塩基を含む構成を形成するように、いくつかの核酸の相互作用によって形成される構造を指し、最初の２つの核酸の間にオーバーラップが形成され、結果として得られる非ハイブリダイズフラップ領域（例えば、切断構造）がフラップエンドヌクレアーゼによって切断可能である。切断構造は、二次構造に関係なく核酸分子を切断するホスホジエステラーゼ等の薬剤による非特異的切断のための基質である核酸分子とは対照的に、フラップエンドヌクレアーゼによる特異的切断のための基質である（すなわち、二重構造の形成は必要ではない）。切断構造に関する考察、およびフラップエンドヌクレアーゼ検出アッセイの他の態様については、米国特許第５，８４６，７１７号を参照されたい。
【0183】
「フラップエンドヌクレアーゼ」は、本明細書で使用される場合、核酸の別の鎖によって置換された鎖の一方に一本鎖５’オーバーハングまたはフラップを含む（すなわち、隣接する第１および第２のプローブが標的にハイブリダイズする重複ヌクレオチドが存在するように）二重鎖を有する核酸構造に対して、構造特異的５’エンドヌクレアーゼとして作用する核酸分解酵素のクラスを指す。フラップエンドヌクレアーゼはまた、「５’エンドヌクレアーゼ」、または略して「ＦＥＮ」という頭文字で称され得る。ＦＥＮは、一本鎖および二本鎖核酸の接合部でホスホジエステル結合の加水分解切断を触媒し、オーバーハングまたはフラップを放出する。ＦＥＮは、Ｃｅｓｋａ ａｎｄ Ｓａｖｅｒｓ（Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２３：３３１－３３６，１９９８）およびＬｉｕ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７３：５８９－６１５，２００４）によって検討されている。
【0184】
「オーバーラップ領域」または「フラップ領域」は、標的にハイブリダイズし、第２のプローブオリゴヌクレオチド（例えば、インベーダープローブ）によって重複される第１のプローブオリゴヌクレオチド（例えば、シグナルプローブ）の単数または複数の塩基からなる。第２のプローブオリゴヌクレオチドの３’末端の塩基は、オーバーラップ領域の末端を決定し、標的にハイブリダイズしてもまたはしなくてもよい。
【0185】
切断に基づくアッセイに関する「第１のプローブオリゴヌクレオチド」は、標的核酸と相互作用して、第１のプローブオリゴヌクレオチド（例えば、インベーダープローブ）の上流の領域とハイブリダイズする「第２のプローブオリゴヌクレオチド」の存在下で切断構造を形成するオリゴヌクレオチド（例えば、シグナルプローブ）を指す。標的核酸にアニーリングされると、第１のプローブオリゴヌクレオチドおよび標的は切断構造を形成し、フラップエンドヌクレアーゼによる切断が第１のプローブオリゴヌクレオチド内で生じ得る。標的核酸に沿った第１のプローブオリゴヌクレオチドの上流の重複する第２のプローブオリゴヌクレオチドの存在下で、第１のプローブオリゴヌクレオチド内の切断部位は、最後の重複塩基の後に生じる（切断は、第１のプローブの標的ハイブリダイズ塩基を有する第２のプローブの少なくとも１つの重複塩基に依存する）。標的核酸内の標的配列にハイブリダイズする標的ハイブリダイズ領域に加えて、第１のプローブオリゴヌクレオチドは、５’末端に非標的ハイブリダイズ領域（「フラップ領域」とも称される）を含む。第１および第２のプローブオリゴヌクレオチドが標的核酸にアニーリングされると、フラップエンドヌクレアーゼによる部位特異的切断が生じ、フラップ領域と、第一プローブオリゴヌクレオチドのオーバーラップ領域とを含む切断産物が生成される。
【0186】
切断に基づくアッセイに関する「第２のプローブオリゴヌクレオチド」は、標的核酸にアニーリングされると、下流の第１のプローブオリゴヌクレオチド内の標的ハイブリダイズ配列の５’末端と重複するその３’末端に配列を含むオリゴヌクレオチドを指す。典型的には、これらの領域は、相補的な標的核酸に沿った同じセグメントへのハイブリダイゼーションについて競合する。第２のプローブは、場合によっては、プライマーだけでなくインベーダープローブとしても使用することができる。第２のプローブオリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドは、標的核酸中のヌクレオチドと塩基対を形成してもまたはしなくてもよい。いくつかの変形例において、３’末端ヌクレオチドのみが、第１のプローブオリゴヌクレオチドの標的ハイブリダイズ配列の５’末端と重複する。切断された第２のプローブオリゴヌクレオチドは、二次反応に関与することができ、Ｃｌｅａｖａｓｅ（登録商標）酵素によって認識される重複構造の形成をもたらす蛍光共鳴エネルギー移動カセット（例えば、ＦＲＥＴプローブまたはＦＲＥＴカセット）に対するプローブとして作用する。ＦＲＥＴカセットが切断されると、蛍光シグナルを生成するＦＲＥＴカセットの消光剤からフルオロフォアが放出される。
【0187】
本明細書で使用される場合、「ＦＲＥＴカセット」という用語は、フルオロフォア部分と、フルオロフォアを消光する近傍の消光剤部分とを含むヘアピンオリゴヌクレオチドを指す。切断産物とＦＲＥＴカセットとのハイブリダイゼーションにより、フラップエンドヌクレアーゼの二次基質が生成される。この基質が形成されると、５’フルオロフォア含有塩基がカセットから切断され、それによって蛍光シグナルが生成される。
【0188】
「増幅オリゴマー」は、テンプレート依存性複製を支持することができるプライマーまたはプロモータープライマーである。増幅オリゴマー対は、テンプレートの対向鎖のテンプレート依存性複製を支持するそのようなオリゴマーの対である。多重増幅は、複数の増幅オリゴマー対で同時に行われる増幅である。
【0189】
「検出プローブ」は、増幅産物または初期標的核酸にハイブリダイズして、増幅産物の存在または量を明らかにすることができるオリゴヌクレオチドである。そのような検出プローブは、しばしば、蛍光または他の検出可能なシグナルを生じる分子を組み込んでおり、その場合、それらは検出可能に標識されたプローブと称される。
【0190】
「プライマープローブセット」は、テンプレート核酸から増幅産物を生成するように構成されたプライマーと検出プローブとの組み合わせである。
【0191】
「再構成時間」は、乾燥製剤を溶液で再水和して、肉眼では粒子または濁りのない溶液をもたらすのに必要な時間である。
【0192】
「相対蛍光単位（ＲＦＵ）」は、消光されていないフルオロフォアの尺度である。核酸ベースの増幅反応において、生成物の存在は、いくつかのサイクル時間（Ｃｔ）にＲＦＵを測定することによって決定される。
【0193】
「Ｃｔ」は、リアルタイムＰＣＲにおいて対数期に到達するのに必要であったサイクル数を指す。Ｃｔは、試料中の分析物の量に逆相関する。
【0194】
「陽性」は、アッセイ反応結果に言及する場合、複数の試料を含む試験において指数閾値を超えた試料の割合を指す。例えば、複数の試料が１２個の試料であり、閾値を超えた試料の数が６であると決定された場合、陽性は「５０％」である。
【0195】
「単一単位用量」または「ＳＵＤ」は、単一試料に対してアッセイを行うために使用される反応混合物の体積を指す。単一単位用量は、液体形態または乾燥形態であり得る。例として、単一単位用量は、単一容器内の単一試料の検出に有用な試薬を含む乾燥ペレットであり得る。
【0196】
「ＬＯＤ」は、分析物の検出限界である。ＬＯＤ＋１は、ユーザーが検出したＬＯＤ＋１対数である。換言すると、ＬＯＤ＋１はＬＯＤである分析物の数の１０倍である。
【0197】
ｄＴＴＰおよびｄＵＴＰを含むとして開示された組成物は、示された濃度でｄＴＴＰまたはｄＵＴＰまたは両方を含むことができる。同様に、組成物がｄＴＴＰまたはｄＵＴＰを含むとして開示される場合、その開示は、示された濃度でｄＴＴＰおよびｄＵＴＰの両方を含む組成物を代替的に含むと理解されるべきである。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
フラップエンドヌクレアーゼ、増量剤、および有機緩衝液を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる、水溶液の組成物であって、前記水溶液が５ｍＭ以下の無機塩濃度を有し、前記組成物がグリセロールを実質的に含まない、組成物。
（項目２）
前記水溶液が、分子アッセイを行うのに有用な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドをさらに含む、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記水溶液が、核酸に基づくアッセイを行うのに有用な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドをさらに含む、項目１または項目２に記載の組成物。
（項目４）
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、プローブオリゴヌクレオチド、好適には少なくとも２つのプローブオリゴヌクレオチドを含む、項目３に記載の組成物。
（項目５）
前記プローブオリゴヌクレオチド（複数可）が、標的核酸配列に部分的または完全に相補的である、項目４に記載の組成物。
（項目６）
前記フラップエンドヌクレアーゼがＣｌｅａｖａｓｅ（登録商標）酵素である、項目１～５のいずれかに記載の組成物。
（項目７）
前記フラップエンドヌクレアーゼによって認識され得る三次元構造を形成するように標的核酸にアニーリングすることができる、少なくとも２つのプローブオリゴヌクレオチドを含む、項目２～６のいずれかに記載の組成物。
（項目８）
少なくとも１つのポリメラーゼをさらに含む、項目１～７に記載の組成物。
（項目９）
前記少なくとも１つのポリメラーゼが、前記水溶液中約０．１０Ｕ／μｌ～約０．２Ｕ／μｌの濃度で前記水溶液中に存在するポリメラーゼを含む、項目８に記載の組成物。
（項目１０）
前記少なくとも１つのポリメラーゼが、０．１４Ｕ／μｌ、０．１４６Ｕ／μｌ、および０．１６８６Ｕ／μｌから選択される濃度で前記水溶液中に存在するポリメラーゼを含む、項目８または項目９に記載の組成物。
（項目１１）
前記少なくとも１つのポリメラーゼが、ホットスタートポリメラーゼであるポリメラーゼを含む、項目８～１０のいずれかに記載の組成物。
（項目１２）
前記ホットスタートポリメラーゼが、組換えＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼであり、好適には、前記ポリメラーゼが、前記ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を特異的に遮断する抗体によって結合される、項目１１に記載の組成物。
（項目１３）
前記ホットスタートポリメラーゼが、化学修飾された組換えＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼであり、前記化学修飾が、前記ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を阻害する、項目１２に記載の組成物。
（項目１４）
前記少なくとも１つのポリメラーゼが、好適には、約０．１Ｕ／μｌ～約４．０Ｕ／μｌの濃度で、前記水溶液中に存在する逆転写酵素を含む、項目８～１３のいずれかに記載の組成物。
（項目１５）
前記逆転写酵素がＡＭＶ逆転写酵素である、項目１４に記載の組成物。
（項目１６）
前記逆転写酵素がＭＭＬＶ逆転写酵素である、項目１４に記載の組成物。
（項目１７）
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、インベーダープローブを含む、項目２～１６のいずれかに記載の組成物。
（項目１８）
前記インベーダープローブの配列が、標的核酸配列に部分的または完全に相補的である、項目１７に記載の組成物。
（項目１９）
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、シグナル伝達プローブを含む、項目２～１８のいずれかに記載の組成物。
（項目２０）
前記シグナル伝達プローブの配列が、標的核酸配列に部分的に相補的である、項目１９に記載の組成物。
（項目２１）
前記シグナル伝達プローブの前記配列が、フラップ領域を含む、項目１９または項目２０に記載の組成物。
（項目２２）
前記フラップ領域が、インベーダープローブと少なくとも部分的に重複する、項目２１に記載の組成物。
（項目２３）
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、ＦＲＥＴプローブを含む、項目２～２２のいずれかに記載の組成物。
（項目２４）
前記ＦＲＥＴプローブの配列が、シグナル伝達プローブの前記フラップ領域に部分的に相補的である、項目２３に記載の組成物。
（項目２５）
前記ＦＲＥＴプローブが、それに共有結合した標識を含む、項目２３または項目２４に記載の組成物。
（項目２６）
前記標識が蛍光分子である、項目２５に記載の組成物。
（項目２７）
前記標識が前記ＦＲＥＴプローブの５’末端に位置する、項目２６に記載の組成物。
（項目２８）
前記ＦＲＥＴプローブが、前記蛍光分子を消光する近接範囲内で、該プローブに共有結合し、かつ前記蛍光分子からの蛍光を少なくとも部分的に消光することができる、消光分子を含む、項目２３～２７のいずれかに記載の組成物。
（項目２９）
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、標的捕捉プローブを含む、項目２～２８のいずれかに記載の組成物。
（項目３０）
前記標的捕捉プローブが、ストリンジェントな条件下で標的核酸に特異的または非特異的にハイブリダイズする標的ハイブリダイズ部分を有する、項目２９に記載の組成物。
（項目３１）
前記水溶液が、多重分子アッセイを行うための２つ以上のオリゴヌクレオチドを含む、項目２～３０のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３２）
前記増量剤がトレハロースである、項目１～３１のいずれかに記載の組成物。
（項目３３）
前記増量剤が、約０．２Ｍ～約０．５Ｍ、好適には約０．３６Ｍまたは約０．４７Ｍの濃度で存在する、項目１～３２のいずれかに記載の組成物。
（項目３４）
前記無機塩が、約０．３７３μｇ／μｌ～約０．０２９μｇ／μｌ１マイクロリットル当たりの質量で存在する、項目１～３３のいずれかに記載の組成物。
（項目３５）
前記無機塩が塩化ナトリウムであり、好適には、前記塩化ナトリウムが、約０．２９２μｇ／μｌ～約０．３５μｇ／μｌ、好適には約０．３２ｕｇ／ｕｌの１マイクロリットル当たりの質量で存在する、項目１～３４のいずれかに記載の組成物。
（項目３６）
前記無機塩が塩化カリウムであり、好適には、前記塩化カリウムが、約０．３７３μｇ／μｌの塩化カリウム～約０．０１９μｇ／μｌの塩化カリウム、好適には約０．０３ｕｇ／ｕｌの１マイクロリットル当たりの質量で存在する、項目１～３４のいずれかに記載の組成物。
（項目３７）
前記水溶液が、約０．１３５μｇ／μｌのナトリウムイオン～約０．００６μｇ／μｌのナトリウムイオン、好適には約０．１２７ｕｇ／ｕｌを含む、項目１～３６のいずれかに記載の組成物。
（項目３８）
前記水溶液が、約０．１９６μｇ／μｌのカリウムイオン～約０．０１０μｇ／μｌのカリウムイオン、好適には約０．０１６ｕｇ／ｕｌのカリウムイオンを含む、項目１～３７のいずれかに記載の組成物。
（項目３９）
前記水溶液が、約０．３５５μｇ／μｌの塩化物イオン～約０．００９μｇ／μｌの塩化物イオン、好適には約０．３３７ｕｇ／ｕｌを含む、項目１～３８のいずれかに記載の組成物。
（項目４０）
前記水溶液が４ｍＭ以下の無機塩濃度を含む、項目１～３９のいずれかに記載の組成物。
（項目４１）
前記水溶液が、約０．２９８μｇ／μｌ～約０．２３４μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量の無機塩を含む、項目４０に記載の組成物。
（項目４２）
前記水溶液が、約０．２８４μｇ／μｌ～約０．０７１μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量の塩化物イオンを含む、項目４０または４１に記載の組成物。
（項目４３）
前記水溶液が、３ｍＭ以下の無機塩濃度を含む、項目１～４２のいずれかに記載の組成物。
（項目４４）
前記水溶液が、約０．２２４μｇ／μｌ～約０．１７５μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量の無機塩を含む、項目４３に記載の組成物。
（項目４５）
前記水溶液が、約０．２１３μｇ／μｌ～約０．０５３μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量の塩化物イオンを含む、項目４３または項目４４に記載の組成物。
（項目４６）
前記水溶液が、２ｍＭ以下の無機塩濃度を含む、項目１～４５のいずれかに記載の組成物。
（項目４７）
前記水溶液が、約０．１４９μｇ／μｌ～約０．１１７μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量の無機塩を含む、項目４６に記載の組成物。
（項目４８）
前記水溶液が、約０．１４２μｇ／μｌ～約０．０３６μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量の塩化物イオンを含む、項目４６または４７に記載の組成物。
（項目４９）
前記水溶液が、１ｍＭ以下の無機塩濃度を含む、項目１～４８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５０）
前記水溶液が、約０．０７５μｇ／μｌ～約０．０５８μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量の無機塩を含む、項目４９に記載の組成物。
（項目５１）
前記水溶液が、約０．０７１μｇ／μｌ～約０．０１８μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量の塩化物イオンを含む、項目４９または５０に記載の組成物。
（項目５２）
前記水溶液が、５００μＭ以下の無機塩濃度を含む、項目１～５１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５３）
前記水溶液が、約０．０３７μｇ／μｌ～約０．０２９μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量の無機塩を含む、項目５２に記載の組成物。
（項目５４）
前記水溶液が、約０．０３６μｇ／μｌ～約０．００９μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量の塩化物イオンを含む、項目５２または５３に記載の組成物。
（項目５５）
前記水溶液の前記無機塩濃度が、１ｍＭ未満の塩化ナトリウムである、項目１～５４のいずれかに記載の組成物。
（項目５６）
前記水溶液が塩化ナトリウムを含まない、項目１～５５のいずれかに記載の組成物。
（項目５７）
前記水溶液が１ｍＭ未満のマグネシウムイオンを含む、項目１～５６のいずれかに記載の組成物。
（項目５８）
前記水溶液が、０．１ｍＭ未満のマグネシウムイオンを含む、項目１～５７のいずれかに記載の組成物。
（項目５９）
前記水溶液が、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）をさらに含む、項目１～５８のいずれかに記載の組成物。
（項目６０）
前記ｄＮＴＰが、前記水溶液中０．１ｍＭ～０．４ｍＭ、好適には０．２９～０．４６ｍＭの濃度のｄＡＴＰを含む、項目５９に記載の組成物。
（項目６１）
ｄＡＴＰが、前記水溶液中０．３ｍＭ～０．４ｍＭ、例えば、０３７５ｍＭの濃度である、項目５９または６０に記載の組成物。
（項目６２）
前記ｄＮＴＰが、前記水溶液中０．１ｍＭ～０．４ｍＭ、好適には０．２９～０．４６ｍＭの濃度のｄＧＴＰを含む、項目１～６１のいずれかに記載の組成物。
（項目６３）
前記ｄＧＴＰが、前記水溶液中０．３ｍＭ～０．４ｍＭ、例えば０．３７５ｍＭの濃度である、項目６２に記載の組成物。
（項目６４）
前記ｄＮＴＰが、前記水溶液中０．１ｍＭ～０．４ｍＭ、好適には０．２９～０．４６ｍＭの濃度のｄＣＴＰを含む、項目１～６３のいずれかに記載の組成物。
（項目６５）
前記ｄＣＴＰが、前記水溶液中０．３ｍＭ～０．４ｍＭ、例えば、０．３７５ｍＭの濃度である、項目６４に記載の組成物。
（項目６６）
前記ｄＮＴＰが、前記水溶液中０．１ｍＭ～０．４ｍＭ、好適には０．２～０．３７ｍＭ、例えば０．２８４ｍＭの濃度のｄＴＴＰを含む、項目１～６５のいずれかに記載の組成物。
（項目６７）
前記ｄＴＴＰが、前記水溶液中０．３ｍＭ～０．４ｍＭの濃度である、項目６６に記載の組成物。
（項目６８）
前記ｄＮＴＰが、前記水溶液中０．１ｍＭ～０．４ｍＭ、好適には０．１２５～０．２３４ｍＭ、例えば０．１８２ｍＭの濃度のｄＵＴＰを含む、項目１～６７のいずれかに記載の組成物。
（項目６９）
前記ｄＵＴＰが、前記水溶液中０．３ｍＭ～０．４ｍＭの濃度である、項目６８に記載の組成物。
（項目７０）
前記フラップエンドヌクレアーゼが、約０．０２０μｇ／μｌ～約０．０４０μｇ／μｌで前記水溶液中に存在する、項目１～６９のいずれかに記載の組成物。
（項目７１）
前記フラップエンドヌクレアーゼが、約０．０３０μｇ／μｌ～約０．０４μｇ／μｌで前記水溶液中に存在し、好適には、前記フラップエンドヌクレアーゼが、約０．０３０μｇ／μｌ～約０．０３５μｇ／μｌで前記水溶液中に存在する、項目７０に記載の組成物。
（項目７２）
前記有機緩衝液が、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液である、項目１～７１のいずれかに記載の組成物。
（項目７３）
前記ＭＯＰＳ緩衝液が、前記水溶液中１０～２０ｍＭの濃度で、好適には、前記水溶液中１２．５ｍＭ～１５ｍＭの濃度で存在する、項目７２に記載の組成物。
（項目７４）
前記有機緩衝液が、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）緩衝液である、項目１～７１のいずれかに記載の組成物。
（項目７５）
前記トリス緩衝液が、前記水溶液中４０ｍＭ～６０ｍＭの濃度で、好適にが、前記水溶液中５０ｍＭの濃度で存在する、項目７４に記載の組成物。
（項目７６）
前記組成物が、球状タンパク質を含む、項目１～７５のいずれかに記載の組成物。
（項目７７）
前記球状タンパク質がウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である、項目７６に記載の組成物。
（項目７８）
前記ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が、非アセチル化ＢＳＡ、好適には、超高純度非アセチル化ＢＳＡである、項目７７に記載の組成物。
（項目７９）
前記球状タンパク質が、０．４０～０．６０μｇ／μｌ、好適には０．５０μｇ／μｌの量で存在する、項目７６～７８のいずれかに記載の組成物。
（項目８０）
Ｃｌｅａｖａｓｅ（登録商標）酵素、トレハロース、ＭＯＰＳ緩衝液、ｄＮＴＰ、５ｍＭ以下の無機塩濃度を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になり、前記組成物がグリセロールを実質的に含まない、項目１～７９のいずれかに記載の組成物。
（項目８１）
約０．０３０μｇ／μｌで前記水溶液中に存在するＣｌｅａｖａｓｅ（登録商標）、約０．３Ｍの濃度で存在するトレハロース、約１２．５ｍＭの濃度のＭＯＰＳ緩衝液、各々約０．３ｍＭの濃度のｄＮＴＰ、５ｍＭ以下の無機塩濃度を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になり、前記組成物がグリセロールを実質的に含まない、項目８０に記載の組成物。
（項目８２）
Ｃｌｅａｖａｓｅ（登録商標）酵素、トレハロース、トリス緩衝液、ｄＮＴＰ、ウシ血清アルブミン、５ｍＭ以下の無機塩濃度を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になり、前記組成物がグリセロールを実質的に含まない、項目１～８１のいずれかに記載の組成物。
（項目８３）
約０．０３０μｇ／μｌで前記水溶液中に存在するＣｌｅａｖａｓｅ（登録商標）酵素、約０．３Ｍの濃度で存在するトレハロース、約５０ｍＭの濃度のトリス緩衝液、各々約０．３ｍＭの濃度のｄＮＴＰ、約０．５μｇ／μｌのウシ血清アルブミン、５ｍＭ以下の無機塩濃度を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になり、前記組成物がグリセロールを実質的に含まない、項目８２に記載の組成物。
（項目８４）
Ｃｌｅａｖａｓｅ（登録商標）酵素、トレハロース、ＭＯＰＳ緩衝液、ｄＮＴＰ、ウシ血清アルブミン、５ｍＭ以下の無機塩濃度を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になり、前記組成物がグリセロールを実質的に含まない、項目１～８３のいずれかに記載の組成物。
（項目８５）
約０．０３５μｇ／μｌで前記水溶液中に存在するＣｌｅａｖａｓｅ（登録商標）酵素、約０．３６Ｍの濃度で存在するトレハロース、約１５ｍＭの濃度のＭＯＰＳ緩衝液、各々約０．３８ｍＭの濃度のｄＮＴＰ、約０．５μｇ／μｌのウシ血清アルブミン、５ｍＭ以下の無機塩濃度を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になり、前記組成物がグリセロールを実質的に含まない、項目８４に記載の組成物。
（項目８６）
例えば、０．１～０．５μｇ／ｍｌのα－シクロデキストリンをさらに含む、項目１～８５のいずれかに記載の組成物。
（項目８７）
項目１～８５のいずれかに記載の組成物の、乾燥形態。
（項目８８）
フラップエンドヌクレアーゼ、増量剤、および有機緩衝液を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる乾燥組成物であって、１つ以上の無機塩が、前記乾燥組成物の全質量の０．３５０％以下の質量で前記乾燥組成物中に存在し、前記乾燥組成物がグリセロールを実質的に含まない、乾燥組成物。
（項目８９）
前記１つ以上の無機塩が、前記乾燥組成物の全質量の約０．３１１％～約０．０２４％の質量で前記乾燥組成物中に存在する、項目８８に記載の乾燥組成物。
（項目９０）
前記１つ以上の無機塩が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、および塩化ナトリウムと塩化カリウムの両方からなる群から選択される、項目８８または８９に記載の乾燥組成物。（項目９１）
分子アッセイを行うのに有用な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドをさらに含む、項目８８～９０のいずれかに記載の乾燥組成物。
（項目９２）
核酸に基づくアッセイを行うのに有用な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドをさらに含む、項目８８～９１のいずれかに記載の乾燥組成物。
（項目９３）
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、プローブオリゴヌクレオチド、好適には少なくとも２つのプローブオリゴヌクレオチドを含む、項目９１または９２に記載の乾燥組成物。
（項目９４）
前記プローブオリゴヌクレオチド（複数可）が、標的核酸配列に部分的または完全に相補的である、項目９３に記載の乾燥組成物。
（項目９５）
前記フラップエンドヌクレアーゼがＣｌｅａｖａｓｅ（登録商標）酵素である、項目８８～９４のいずれかに記載の乾燥組成物。
（項目９６）
前記フラップエンドヌクレアーゼによって認識され得る三次元構造を形成するように標的核酸にアニーリングすることができる少なくとも２つのプローブオリゴヌクレオチドを含む、項目９５に記載の乾燥組成物。
（項目９７）
少なくとも１つのポリメラーゼをさらに含む、項目８８～９６のいずれかに記載の乾燥組成物。
（項目９８）
前記少なくとも１つのポリメラーゼが、前記水溶液中約０．１０Ｕ／μｌ～約０．２Ｕ／μｌの濃度で前記水溶液中に存在するポリメラーゼを含む、項目９７に記載の乾燥組成物。
（項目９９）
前記少なくとも１つのポリメラーゼが、０．１４Ｕ／μｌ、０．１４６Ｕ／μｌ、および０．１６８６Ｕ／μｌから選択される濃度で前記水溶液中に存在するポリメラーゼを含む、項目９７に記載の乾燥組成物。
（項目１００）
前記少なくとも１つのポリメラーゼが、ホットスタートポリメラーゼであるポリメラーゼを含む、項目９７～９９のいずれかに記載の乾燥組成物。
（項目１０１）
前記ホットスタートポリメラーゼが、組換えＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼであり、好適には、前記ポリメラーゼが、前記ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を特異的に遮断する抗体によって結合される、項目１００に記載の乾燥組成物
（項目１０２）
前記ホットスタートポリメラーゼが、化学修飾された組換えＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼであり、前記化学修飾が、前記ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を阻害する、項目１０１に記載の乾燥組成物。
（項目１０３）
前記少なくとも１つのポリメラーゼが、好適には、約０．１Ｕ／μｌ～約０．６Ｕ／μｌの濃度で、前記水溶液中に存在する逆転写酵素を含む、項目９７～１０２のいずれかに記載の乾燥組成物。
（項目１０４）
前記逆転写酵素がＡＭＶ逆転写酵素である、項目１０３に記載の乾燥組成物。
（項目１０５）
前記逆転写酵素がＭＭＬＶ逆転写酵素である、項目１０３に記載の乾燥組成物。
（項目１０６）
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、インベーダープローブを含む、項目９２～１０５のいずれかに記載の乾燥組成物。
（項目１０７）
前記インベーダープローブの配列が、標的核酸配列に部分的または完全に相補的である、項目１０６に記載の乾燥組成物。
（項目１０８）
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、シグナル伝達プローブを含む、項目９１～１０７のいずれかに記載の乾燥組成物。
（項目１０９）
前記シグナル伝達プローブの配列が、標的核酸配列に部分的に相補的である、項目１０８に記載の乾燥組成物。
（項目１１０）
前記シグナル伝達プローブの前記配列が、フラップ領域を含む、項目１０８または項目１０９に記載の乾燥組成物。
（項目１１１）
前記フラップ領域が、インベーダープローブと少なくとも部分的に重複する、項目１１０に記載の乾燥組成物。
（項目１１２）
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、ＦＲＥＴプローブを含む、項目９１～１１１のいずれかに記載の乾燥組成物。
（項目１１３）
前記ＦＲＥＴプローブの配列が、シグナル伝達プローブの前記フラップ領域に部分的に相補的である、項目１１２に記載の乾燥組成物。
（項目１１４）
前記ＦＲＥＴプローブが、それに共有結合した標識を含む、項目１１２または項目１１３に記載の乾燥組成物。
（項目１１５）
前記標識が蛍光分子である、項目１１４に記載の乾燥組成物。
（項目１１６）
前記標識が前記ＦＲＥＴプローブの５’末端に位置する、項目１１５に記載の乾燥組成物。
（項目１１７）
前記ＦＲＥＴプローブが、前記蛍光分子を消光する近接範囲内で、該プローブに共有結合し、かつ前記蛍光分子からの蛍光を少なくとも部分的に消光することができる、消光分子を含む、項目１１２～１１６のいずれかに記載の乾燥組成物。
（項目１１８）
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、標的捕捉プローブを含む、項目９１～１１７のいずれかに記載の乾燥組成物。
（項目１１９）
前記標的捕捉プローブが、ストリンジェントな条件下で標的核酸に特異的または非特異的にハイブリダイズする標的ハイブリダイズ部分を有する、項目１１８に記載の乾燥組成物。
（項目１２０）
前記水溶液が、多重分子アッセイを行うためのオリゴヌクレオチドを含む、項目９１～１１９のいずれか一項に記載の乾燥組成物。
（項目１２１）
前記増量剤がトレハロースである、項目９１～１２０のいずれかに記載の乾燥組成物。（項目１２２）
前記組成物が、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）をさらに含む、項目９１～１２１のいずれかに記載の乾燥組成物。
（項目１２３）
前記有機緩衝液が、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液である、項目９１～１２２のいずれかに記載の乾燥組成物。
（項目１２４）
前記有機緩衝液が、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）緩衝液である、項目９１～１２２のいずれかに記載の乾燥組成物。
（項目１２５）
前記乾燥組成物が、球状タンパク質を含む、項目９１～１２４のいずれかに記載の乾燥組成物。
（項目１２６）
前記球状タンパク質がウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である、項目１２５に記載の乾燥組成物。
（項目１２７）
前記ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が、非アセチル化ＢＳＡ、好適には、超高純度非アセチル化ＢＳＡである、項目１２６に記載の乾燥組成物。
（項目１２８）
前記乾燥組成物の質量が、約０．００３ｇ～約０．００４ｇ、もしくは約０．００３２ｇ～約０．００３７ｇ、もしくは０．００３３ｇ、もしくは０．００３４ｇ、もしくは０．００３５ｇ、もしくは０．００３６ｇである、または前記乾燥組成物を形成するように乾燥させた水溶液１マイクロリットル当たり約０．０００１２５ｇ～約０．０００６６７ｇである、項目８７～１２７のいずれか一項に記載の乾燥組成物。
（項目１２９）
核酸に基づくアッセイを行う際に使用される混合物を形成する方法であって、再構成溶液と項目８７～１２８のいずれか一項に記載の乾燥組成物とを組み合わせることを含み、前記再構成溶液が、少なくとも１つの無機塩を含む、方法。
（項目１３０）
前記再構成溶液が、１ｍＭ未満の無機塩濃度を含む、項目１２９に記載の方法。
（項目１３１）
前記再構成溶液が、マグネシウムイオンを含む、項目１２９または１３０に記載の方法。
（項目１３２）
前記再構成溶液が、約５ｍＭ～約１５ｍＭ、好適には９ｍＭ～１２、例えば、１１．２５ｍＭの濃度のＭｇＣｌ２を含む、項目１３１に記載の方法。
（項目１３３）
前記再構成溶液が、約０．０１２％ｗ／ｖ～約０．０２０％ｗ／ｖの濃度のメチルパラベン、約０．００６％ｗ／ｖ～約０．０１０％ｗ／ｖの濃度のプロピルパラベン、約０．２０％ｖ／ｖ～約０．３０％ｖ／ｖの濃度の無水エタノール、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目１２９～１３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３４）
前記再構成溶液中の前記メチルパラベンの前記濃度が０．０１６％ｗ／ｖである、項目１３３に記載の方法。
（項目１３５）
前記再構成溶液中の前記プロピルパラベンの前記濃度が０．００８％ｗ／ｖである、項目１３３または項目１３４に記載の方法。
（項目１３６）
前記無水エタノールの前記濃度が、約０．２６％ｖ／ｖで前記再構成溶液中に存在する、項目１３３～１３５のいずれかに記載の方法。
（項目１３７）
核酸に基づくアッセイを行う際に使用される乾燥組成物を調製するための方法であって、（ｉ）項目１～７８のいずれか一項に記載の水溶液を凍結させ、それによって前記水溶液の凍結形態を形成するステップと、（ｉｉ）ステップ（ｉ）からの前記凍結形態を凍結乾燥条件に曝露し、それによって乾燥組成物を形成するステップと、を含む、方法。
（項目１３８）
前記乾燥組成物が湿潤環境に曝露され、前記湿潤環境の絶対湿度レベルが、３０℃で空気１立方メートル当たり２．３グラムを超える水である、項目１３７に記載の方法。
（項目１３９）
前記乾燥組成物が、最大３時間まで前記湿潤環境に曝露される、項目１３８に記載の方法。
（項目１４０）
前記乾燥組成物を密封容器に保存するステップをさらに含む、項目１３７～１３９のいずれかに記載の方法。
（項目１４１）
前記乾燥組成物の質量が、約０．００３ｇ～約０．００４ｇ、もしくは約０．００３２ｇ～約０．００３７ｇ、もしくは０．００３３ｇ、もしくは０．００３４ｇ、もしくは０．００３５ｇ、もしくは０．００３６ｇである、または前記乾燥組成物を形成するように乾燥させた水溶液１マイクロリットル当たり約０．０００１２５ｇ～約０．０００６６７ｇである、項目１３７～１４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４２）
核酸に基づくアッセイを行う際に使用される乾燥組成物を調製するための方法であって、脱水、乾燥、凍結乾燥、および噴霧乾燥からなる群から選択される乾燥方法を用いて、項目１～８５のいずれか一項に記載の水溶液を乾燥させるステップと、それによって乾燥組成物を形成するステップと、を含む、方法。
（項目１４３）
乾燥方法が凍結乾燥であり、前記乾燥組成物が凍結乾燥組成物である、項目１４２に記載の方法。
（項目１４４）
前記乾燥組成物を密封容器に保存するステップをさらに含む、項目１４２または１４３に記載の方法。
（項目１４５）
核酸に基づくアッセイを行う際に使用されるキットであって、項目８６～１２７のいずれか一項に記載の乾燥組成物を含む第１の容器と、約３．８ｍＭ～約４．４ｍＭの濃度のＭｇＣｌ２を含む再構成溶液を含む第２の容器と、を含む、キット。
（項目１４６）
前記第１の容器が、１つ以上のウェルを含むマルチウェルプレートである、項目１４５に記載のキット。
（項目１４７）
前記１つ以上のウェルの各々が、０．３１１％以下のペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントを含む乾燥単一単位用量ペレットを含む、項目１４５に記載のキット。
（項目１４８）
前記第１および第２の容器が、前記第２の容器から前記第１の容器への前記再構成溶液の自動移送に適合したデバイス内に組み込まれる、項目１４５～１４７のいずれか一項に記載のキット。
（項目１４９）
有機緩衝液、増量剤、塩化物イオン、およびキレート剤を含む水溶液を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、透析組成物。
（項目１５０）
前記増量剤がトレハロースである、項目１４９に記載の透析組成物。
（項目１５１）
前記増量剤が、約１００ｍＭ～３００ｍＭ、好適には２００ｍＭの濃度で存在する、項目１４９または項目１５０に記載の透析組成物。
（項目１５２）
前記有機緩衝液が、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）緩衝液である、項目１４９～１５１のいずれかに記載の透析組成物。
（項目１５３）
前記トリス緩衝液が、前記水溶液中１０ｍＭ～３０ｍＭの濃度で、好適には、前記水溶液中５０ｍＭの濃度で存在する、項目１５２に記載の透析組成物。
（項目１５４）
前記塩化物イオンがＫＣｌである、項目１４９～１５３のいずれかに記載の透析組成物。
（項目１５５）
前記ＫＣｌが、約４０～６０ｍＭ、好適には５０ｍＭの濃度で存在する、項目１５４に記載の透析組成物。
（項目１５６）
前記キレート剤がＥＤＴＡである、項目１５１～１５５のいずれかに記載の透析組成物。
（項目１５７）
前記ＥＤＴＡが、０．０５～０．２ｍＭ、好適には０．１ｍＭの濃度で前記水溶液中に存在する、項目１５６に記載の透析組成物。
（項目１５８）
フラップエンドヌクレアーゼ、好適には、Ｃｌｅａｖａｓｅ（登録商標）酵素をさらに含む、項目１４９～１５７のいずれかに記載の透析組成物。
（項目１５９）
グリセロールを実質的に含まないフラップエンドヌクレアーゼ組成物を調製するための方法であって、（ｉ）フラップエンドヌクレアーゼおよびグリセロールを含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる水溶液を提供することと、（ｉｉ）前記水溶液を項目１４９～１５８のいずれかに記載の透析組成物に透析すること、（ｉｉｉ）グリセロールを実質的に含まないフラップエンドヌクレアーゼ組成物を取得することと、を含む、方法。
（項目１６０）
ステップ（ｉ）の前記水溶液が、約０．３～約０．５％（ｗ／ｖ）のグリセロール、好適には、約０．３５％（ｗ／ｖ）のグリセロールを含む、項目１５９に記載の方法。
（項目１６１）
乾燥フラップエンドヌクレアーゼ含有組成物を調製するための、項目１～８６のいずれかに記載の水性組成物の使用。
（項目１６２）
核酸に基づくアッセイを行うための再構成溶液と組み合わせた、項目１～８６のいずれかに記載の水性組成物の使用。
（項目１６３）
グリセロールを実質的に含まないフラップエンドヌクレアーゼ組成物を調製するための、項目１４９～１５８のいずれかに記載の透析組成物の使用。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
フラップエンドヌクレアーゼ、増量剤、および有機緩衝液を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる、水溶液の組成物であって、前記水溶液が５ｍＭ以下の無機塩濃度を有し、前記組成物がグリセロールを実質的に含まない、組成物。
（項目２）
前記水溶液が、分子アッセイを行うのに有用な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドをさらに含む、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記水溶液が、核酸に基づくアッセイを行うのに有用な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドをさらに含む、項目１または項目２に記載の組成物。
（項目４）
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、プローブオリゴヌクレオチド、好適には少なくとも２つのプローブオリゴヌクレオチドを含む、項目３に記載の組成物。
（項目５）
前記プローブオリゴヌクレオチド（複数可）が、標的核酸配列に部分的または完全に相補的である、項目４に記載の組成物。
（項目６）
前記フラップエンドヌクレアーゼがＣｌｅａｖａｓｅ（登録商標）酵素である、項目１～５のいずれかに記載の組成物。
（項目７）
前記フラップエンドヌクレアーゼによって認識され得る三次元構造を形成するように標的核酸にアニーリングすることができる、少なくとも２つのプローブオリゴヌクレオチドを含む、項目２～６のいずれかに記載の組成物。
（項目８）
少なくとも１つのポリメラーゼをさらに含む、項目１～７に記載の組成物。
（項目９）
前記少なくとも１つのポリメラーゼが、前記水溶液中約０．１０Ｕ／μｌ～約０．２Ｕ／μｌの濃度で前記水溶液中に存在するポリメラーゼを含む、項目８に記載の組成物。
（項目１０）
前記少なくとも１つのポリメラーゼが、０．１４Ｕ／μｌ、０．１４６Ｕ／μｌ、および０．１６８６Ｕ／μｌから選択される濃度で前記水溶液中に存在するポリメラーゼを含む、項目８または項目９に記載の組成物。
（項目１１）
前記少なくとも１つのポリメラーゼが、ホットスタートポリメラーゼであるポリメラーゼを含む、項目８～１０のいずれかに記載の組成物。
（項目１２）
前記ホットスタートポリメラーゼが、組換えＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼであり、好適には、前記ポリメラーゼが、前記ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を特異的に遮断する抗体によって結合される、項目１１に記載の組成物。
（項目１３）
前記ホットスタートポリメラーゼが、化学修飾された組換えＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼであり、前記化学修飾が、前記ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を阻害する、項目１２に記載の組成物。
（項目１４）
前記少なくとも１つのポリメラーゼが、好適には、約０．１Ｕ／μｌ～約４．０Ｕ／μｌの濃度で、前記水溶液中に存在する逆転写酵素を含む、項目８～１３のいずれかに記載の組成物。
（項目１５）
前記逆転写酵素がＡＭＶ逆転写酵素である、項目１４に記載の組成物。
（項目１６）
前記逆転写酵素がＭＭＬＶ逆転写酵素である、項目１４に記載の組成物。
（項目１７）
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、インベーダープローブを含む、項目２～１６のいずれかに記載の組成物。
（項目１８）
前記インベーダープローブの配列が、標的核酸配列に部分的または完全に相補的である、項目１７に記載の組成物。
（項目１９）
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、シグナル伝達プローブを含む、項目２～１８のいずれかに記載の組成物。
（項目２０）
前記シグナル伝達プローブの配列が、標的核酸配列に部分的に相補的である、項目１９に記載の組成物。
（項目２１）
前記シグナル伝達プローブの前記配列が、フラップ領域を含む、項目１９または項目２０に記載の組成物。
（項目２２）
前記フラップ領域が、インベーダープローブと少なくとも部分的に重複する、項目２１に記載の組成物。
（項目２３）
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、ＦＲＥＴプローブを含む、項目２～２２のいずれかに記載の組成物。
（項目２４）
前記ＦＲＥＴプローブの配列が、シグナル伝達プローブの前記フラップ領域に部分的に相補的である、項目２３に記載の組成物。
（項目２５）
前記ＦＲＥＴプローブが、それに共有結合した標識を含む、項目２３または項目２４に記載の組成物。
（項目２６）
前記標識が蛍光分子である、項目２５に記載の組成物。
（項目２７）
前記標識が前記ＦＲＥＴプローブの５’末端に位置する、項目２６に記載の組成物。
（項目２８）
前記ＦＲＥＴプローブが、前記蛍光分子を消光する近接範囲内で、該プローブに共有結合し、かつ前記蛍光分子からの蛍光を少なくとも部分的に消光することができる、消光分子を含む、項目２３～２７のいずれかに記載の組成物。
（項目２９）
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、標的捕捉プローブを含む、項目２～２８のいずれかに記載の組成物。
（項目３０）
前記標的捕捉プローブが、ストリンジェントな条件下で標的核酸に特異的または非特異的にハイブリダイズする標的ハイブリダイズ部分を有する、項目２９に記載の組成物。
（項目３１）
前記水溶液が、多重分子アッセイを行うための２つ以上のオリゴヌクレオチドを含む、項目２～３０のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３２）
前記増量剤がトレハロースである、項目１～３１のいずれかに記載の組成物。
（項目３３）
前記増量剤が、約０．２Ｍ～約０．５Ｍ、好適には約０．３６Ｍまたは約０．４７Ｍの濃度で存在する、項目１～３２のいずれかに記載の組成物。
（項目３４）
前記無機塩が、約０．３７３μｇ／μｌ～約０．０２９μｇ／μｌ１マイクロリットル当たりの質量で存在する、項目１～３３のいずれかに記載の組成物。
（項目３５）
前記無機塩が塩化ナトリウムであり、好適には、前記塩化ナトリウムが、約０．２９２μｇ／μｌ～約０．３５μｇ／μｌ、好適には約０．３２ｕｇ／ｕｌの１マイクロリットル当たりの質量で存在する、項目１～３４のいずれかに記載の組成物。
（項目３６）
前記無機塩が塩化カリウムであり、好適には、前記塩化カリウムが、約０．３７３μｇ／μｌの塩化カリウム～約０．０１９μｇ／μｌの塩化カリウム、好適には約０．０３ｕｇ／ｕｌの１マイクロリットル当たりの質量で存在する、項目１～３４のいずれかに記載の組成物。
（項目３７）
前記水溶液が、約０．１３５μｇ／μｌのナトリウムイオン～約０．００６μｇ／μｌのナトリウムイオン、好適には約０．１２７ｕｇ／ｕｌを含む、項目１～３６のいずれかに記載の組成物。
（項目３８）
前記水溶液が、約０．１９６μｇ／μｌのカリウムイオン～約０．０１０μｇ／μｌのカリウムイオン、好適には約０．０１６ｕｇ／ｕｌのカリウムイオンを含む、項目１～３７のいずれかに記載の組成物。
（項目３９）
前記水溶液が、約０．３５５μｇ／μｌの塩化物イオン～約０．００９μｇ／μｌの塩化物イオン、好適には約０．３３７ｕｇ／ｕｌを含む、項目１～３８のいずれかに記載の組成物。
（項目４０）
前記水溶液が４ｍＭ以下の無機塩濃度を含む、項目１～３９のいずれかに記載の組成物。
（項目４１）
前記水溶液が、約０．２９８μｇ／μｌ～約０．２３４μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量の無機塩を含む、項目４０に記載の組成物。
（項目４２）
前記水溶液が、約０．２８４μｇ／μｌ～約０．０７１μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量の塩化物イオンを含む、項目４０または４１に記載の組成物。
（項目４３）
前記水溶液が、３ｍＭ以下の無機塩濃度を含む、項目１～４２のいずれかに記載の組成物。
（項目４４）
前記水溶液が、約０．２２４μｇ／μｌ～約０．１７５μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量の無機塩を含む、項目４３に記載の組成物。
（項目４５）
前記水溶液が、約０．２１３μｇ／μｌ～約０．０５３μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量の塩化物イオンを含む、項目４３または項目４４に記載の組成物。
（項目４６）
前記水溶液が、２ｍＭ以下の無機塩濃度を含む、項目１～４５のいずれかに記載の組成物。
（項目４７）
前記水溶液が、約０．１４９μｇ／μｌ～約０．１１７μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量の無機塩を含む、項目４６に記載の組成物。
（項目４８）
前記水溶液が、約０．１４２μｇ／μｌ～約０．０３６μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量の塩化物イオンを含む、項目４６または４７に記載の組成物。
（項目４９）
前記水溶液が、１ｍＭ以下の無機塩濃度を含む、項目１～４８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５０）
前記水溶液が、約０．０７５μｇ／μｌ～約０．０５８μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量の無機塩を含む、項目４９に記載の組成物。
（項目５１）
前記水溶液が、約０．０７１μｇ／μｌ～約０．０１８μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量の塩化物イオンを含む、項目４９または５０に記載の組成物。
（項目５２）
前記水溶液が、５００μＭ以下の無機塩濃度を含む、項目１～５１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５３）
前記水溶液が、約０．０３７μｇ／μｌ～約０．０２９μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量の無機塩を含む、項目５２に記載の組成物。
（項目５４）
前記水溶液が、約０．０３６μｇ／μｌ～約０．００９μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量の塩化物イオンを含む、項目５２または５３に記載の組成物。
（項目５５）
前記水溶液の前記無機塩濃度が、１ｍＭ未満の塩化ナトリウムである、項目１～５４のいずれかに記載の組成物。
（項目５６）
前記水溶液が塩化ナトリウムを含まない、項目１～５５のいずれかに記載の組成物。
（項目５７）
前記水溶液が１ｍＭ未満のマグネシウムイオンを含む、項目１～５６のいずれかに記載の組成物。
（項目５８）
前記水溶液が、０．１ｍＭ未満のマグネシウムイオンを含む、項目１～５７のいずれかに記載の組成物。
（項目５９）
前記水溶液が、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）をさらに含む、項目１～５８のいずれかに記載の組成物。
（項目６０）
前記ｄＮＴＰが、前記水溶液中０．１ｍＭ～０．４ｍＭ、好適には０．２９～０．４６ｍＭの濃度のｄＡＴＰを含む、項目５９に記載の組成物。
（項目６１）
ｄＡＴＰが、前記水溶液中０．３ｍＭ～０．４ｍＭ、例えば、０３７５ｍＭの濃度である、項目５９または６０に記載の組成物。
（項目６２）
前記ｄＮＴＰが、前記水溶液中０．１ｍＭ～０．４ｍＭ、好適には０．２９～０．４６ｍＭの濃度のｄＧＴＰを含む、項目１～６１のいずれかに記載の組成物。
（項目６３）
前記ｄＧＴＰが、前記水溶液中０．３ｍＭ～０．４ｍＭ、例えば０．３７５ｍＭの濃度である、項目６２に記載の組成物。
（項目６４）
前記ｄＮＴＰが、前記水溶液中０．１ｍＭ～０．４ｍＭ、好適には０．２９～０．４６ｍＭの濃度のｄＣＴＰを含む、項目１～６３のいずれかに記載の組成物。
（項目６５）
前記ｄＣＴＰが、前記水溶液中０．３ｍＭ～０．４ｍＭ、例えば、０．３７５ｍＭの濃度である、項目６４に記載の組成物。
（項目６６）
前記ｄＮＴＰが、前記水溶液中０．１ｍＭ～０．４ｍＭ、好適には０．２～０．３７ｍＭ、例えば０．２８４ｍＭの濃度のｄＴＴＰを含む、項目１～６５のいずれかに記載の組成物。
（項目６７）
前記ｄＴＴＰが、前記水溶液中０．３ｍＭ～０．４ｍＭの濃度である、項目６６に記載の組成物。
（項目６８）
前記ｄＮＴＰが、前記水溶液中０．１ｍＭ～０．４ｍＭ、好適には０．１２５～０．２３４ｍＭ、例えば０．１８２ｍＭの濃度のｄＵＴＰを含む、項目１～６７のいずれかに記載の組成物。
（項目６９）
前記ｄＵＴＰが、前記水溶液中０．３ｍＭ～０．４ｍＭの濃度である、項目６８に記載の組成物。
（項目７０）
前記フラップエンドヌクレアーゼが、約０．０２０μｇ／μｌ～約０．０４０μｇ／μｌで前記水溶液中に存在する、項目１～６９のいずれかに記載の組成物。
（項目７１）
前記フラップエンドヌクレアーゼが、約０．０３０μｇ／μｌ～約０．０４μｇ／μｌで前記水溶液中に存在し、好適には、前記フラップエンドヌクレアーゼが、約０．０３０μｇ／μｌ～約０．０３５μｇ／μｌで前記水溶液中に存在する、項目７０に記載の組成物。
（項目７２）
前記有機緩衝液が、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液である、項目１～７１のいずれかに記載の組成物。
（項目７３）
前記ＭＯＰＳ緩衝液が、前記水溶液中１０～２０ｍＭの濃度で、好適には、前記水溶液中１２．５ｍＭ～１５ｍＭの濃度で存在する、項目７２に記載の組成物。
（項目７４）
前記有機緩衝液が、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）緩衝液である、項目１～７１のいずれかに記載の組成物。
（項目７５）
前記トリス緩衝液が、前記水溶液中４０ｍＭ～６０ｍＭの濃度で、好適にが、前記水溶液中５０ｍＭの濃度で存在する、項目７４に記載の組成物。
（項目７６）
前記組成物が、球状タンパク質を含む、項目１～７５のいずれかに記載の組成物。
（項目７７）
前記球状タンパク質がウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である、項目７６に記載の組成物。
（項目７８）
前記ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が、非アセチル化ＢＳＡ、好適には、超高純度非アセチル化ＢＳＡである、項目７７に記載の組成物。
（項目７９）
前記球状タンパク質が、０．４０～０．６０μｇ／μｌ、好適には０．５０μｇ／μｌの量で存在する、項目７６～７８のいずれかに記載の組成物。
（項目８０）
Ｃｌｅａｖａｓｅ（登録商標）酵素、トレハロース、ＭＯＰＳ緩衝液、ｄＮＴＰ、５ｍＭ以下の無機塩濃度を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になり、前記組成物がグリセロールを実質的に含まない、項目１～７９のいずれかに記載の組成物。
（項目８１）
約０．０３０μｇ／μｌで前記水溶液中に存在するＣｌｅａｖａｓｅ（登録商標）、約０．３Ｍの濃度で存在するトレハロース、約１２．５ｍＭの濃度のＭＯＰＳ緩衝液、各々約０．３ｍＭの濃度のｄＮＴＰ、５ｍＭ以下の無機塩濃度を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になり、前記組成物がグリセロールを実質的に含まない、項目８０に記載の組成物。
（項目８２）
Ｃｌｅａｖａｓｅ（登録商標）酵素、トレハロース、トリス緩衝液、ｄＮＴＰ、ウシ血清アルブミン、５ｍＭ以下の無機塩濃度を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になり、前記組成物がグリセロールを実質的に含まない、項目１～８１のいずれかに記載の組成物。
（項目８３）
約０．０３０μｇ／μｌで前記水溶液中に存在するＣｌｅａｖａｓｅ（登録商標）酵素、約０．３Ｍの濃度で存在するトレハロース、約５０ｍＭの濃度のトリス緩衝液、各々約０．３ｍＭの濃度のｄＮＴＰ、約０．５μｇ／μｌのウシ血清アルブミン、５ｍＭ以下の無機塩濃度を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になり、前記組成物がグリセロールを実質的に含まない、項目８２に記載の組成物。
（項目８４）
Ｃｌｅａｖａｓｅ（登録商標）酵素、トレハロース、ＭＯＰＳ緩衝液、ｄＮＴＰ、ウシ血清アルブミン、５ｍＭ以下の無機塩濃度を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になり、前記組成物がグリセロールを実質的に含まない、項目１～８３のいずれかに記載の組成物。
（項目８５）
約０．０３５μｇ／μｌで前記水溶液中に存在するＣｌｅａｖａｓｅ（登録商標）酵素、約０．３６Ｍの濃度で存在するトレハロース、約１５ｍＭの濃度のＭＯＰＳ緩衝液、各々約０．３８ｍＭの濃度のｄＮＴＰ、約０．５μｇ／μｌのウシ血清アルブミン、５ｍＭ以下の無機塩濃度を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になり、前記組成物がグリセロールを実質的に含まない、項目８４に記載の組成物。
（項目８６）
例えば、０．１～０．５μｇ／ｍｌのα－シクロデキストリンをさらに含む、項目１～８５のいずれかに記載の組成物。
（項目８７）
項目１～８５のいずれかに記載の組成物の、乾燥形態。
（項目８８）
フラップエンドヌクレアーゼ、増量剤、および有機緩衝液を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる乾燥組成物であって、１つ以上の無機塩が、前記乾燥組成物の全質量の０．３５０％以下の質量で前記乾燥組成物中に存在し、前記乾燥組成物がグリセロールを実質的に含まない、乾燥組成物。
（項目８９）
前記１つ以上の無機塩が、前記乾燥組成物の全質量の約０．３１１％～約０．０２４％の質量で前記乾燥組成物中に存在する、項目８８に記載の乾燥組成物。
（項目９０）
前記１つ以上の無機塩が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、および塩化ナトリウムと塩化カリウムの両方からなる群から選択される、項目８８または８９に記載の乾燥組成物。（項目９１）
分子アッセイを行うのに有用な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドをさらに含む、項目８８～９０のいずれかに記載の乾燥組成物。
（項目９２）
核酸に基づくアッセイを行うのに有用な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドをさらに含む、項目８８～９１のいずれかに記載の乾燥組成物。
（項目９３）
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、プローブオリゴヌクレオチド、好適には少なくとも２つのプローブオリゴヌクレオチドを含む、項目９１または９２に記載の乾燥組成物。
（項目９４）
前記プローブオリゴヌクレオチド（複数可）が、標的核酸配列に部分的または完全に相補的である、項目９３に記載の乾燥組成物。
（項目９５）
前記フラップエンドヌクレアーゼがＣｌｅａｖａｓｅ（登録商標）酵素である、項目８８～９４のいずれかに記載の乾燥組成物。
（項目９６）
前記フラップエンドヌクレアーゼによって認識され得る三次元構造を形成するように標的核酸にアニーリングすることができる少なくとも２つのプローブオリゴヌクレオチドを含む、項目９５に記載の乾燥組成物。
（項目９７）
少なくとも１つのポリメラーゼをさらに含む、項目８８～９６のいずれかに記載の乾燥組成物。
（項目９８）
前記少なくとも１つのポリメラーゼが、前記水溶液中約０．１０Ｕ／μｌ～約０．２Ｕ／μｌの濃度で前記水溶液中に存在するポリメラーゼを含む、項目９７に記載の乾燥組成物。
（項目９９）
前記少なくとも１つのポリメラーゼが、０．１４Ｕ／μｌ、０．１４６Ｕ／μｌ、および０．１６８６Ｕ／μｌから選択される濃度で前記水溶液中に存在するポリメラーゼを含む、項目９７に記載の乾燥組成物。
（項目１００）
前記少なくとも１つのポリメラーゼが、ホットスタートポリメラーゼであるポリメラーゼを含む、項目９７～９９のいずれかに記載の乾燥組成物。
（項目１０１）
前記ホットスタートポリメラーゼが、組換えＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼであり、好適には、前記ポリメラーゼが、前記ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を特異的に遮断する抗体によって結合される、項目１００に記載の乾燥組成物
（項目１０２）
前記ホットスタートポリメラーゼが、化学修飾された組換えＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼであり、前記化学修飾が、前記ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を阻害する、項目１０１に記載の乾燥組成物。
（項目１０３）
前記少なくとも１つのポリメラーゼが、好適には、約０．１Ｕ／μｌ～約０．６Ｕ／μｌの濃度で、前記水溶液中に存在する逆転写酵素を含む、項目９７～１０２のいずれかに記載の乾燥組成物。
（項目１０４）
前記逆転写酵素がＡＭＶ逆転写酵素である、項目１０３に記載の乾燥組成物。
（項目１０５）
前記逆転写酵素がＭＭＬＶ逆転写酵素である、項目１０３に記載の乾燥組成物。
（項目１０６）
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、インベーダープローブを含む、項目９２～１０５のいずれかに記載の乾燥組成物。
（項目１０７）
前記インベーダープローブの配列が、標的核酸配列に部分的または完全に相補的である、項目１０６に記載の乾燥組成物。
（項目１０８）
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、シグナル伝達プローブを含む、項目９１～１０７のいずれかに記載の乾燥組成物。
（項目１０９）
前記シグナル伝達プローブの配列が、標的核酸配列に部分的に相補的である、項目１０８に記載の乾燥組成物。
（項目１１０）
前記シグナル伝達プローブの前記配列が、フラップ領域を含む、項目１０８または項目１０９に記載の乾燥組成物。
（項目１１１）
前記フラップ領域が、インベーダープローブと少なくとも部分的に重複する、項目１１０に記載の乾燥組成物。
（項目１１２）
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、ＦＲＥＴプローブを含む、項目９１～１１１のいずれかに記載の乾燥組成物。
（項目１１３）
前記ＦＲＥＴプローブの配列が、シグナル伝達プローブの前記フラップ領域に部分的に相補的である、項目１１２に記載の乾燥組成物。
（項目１１４）
前記ＦＲＥＴプローブが、それに共有結合した標識を含む、項目１１２または項目１１３に記載の乾燥組成物。
（項目１１５）
前記標識が蛍光分子である、項目１１４に記載の乾燥組成物。
（項目１１６）
前記標識が前記ＦＲＥＴプローブの５’末端に位置する、項目１１５に記載の乾燥組成物。
（項目１１７）
前記ＦＲＥＴプローブが、前記蛍光分子を消光する近接範囲内で、該プローブに共有結合し、かつ前記蛍光分子からの蛍光を少なくとも部分的に消光することができる、消光分子を含む、項目１１２～１１６のいずれかに記載の乾燥組成物。
（項目１１８）
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、標的捕捉プローブを含む、項目９１～１１７のいずれかに記載の乾燥組成物。
（項目１１９）
前記標的捕捉プローブが、ストリンジェントな条件下で標的核酸に特異的または非特異的にハイブリダイズする標的ハイブリダイズ部分を有する、項目１１８に記載の乾燥組成物。
（項目１２０）
前記水溶液が、多重分子アッセイを行うためのオリゴヌクレオチドを含む、項目９１～１１９のいずれか一項に記載の乾燥組成物。
（項目１２１）
前記増量剤がトレハロースである、項目９１～１２０のいずれかに記載の乾燥組成物。（項目１２２）
前記組成物が、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）をさらに含む、項目９１～１２１のいずれかに記載の乾燥組成物。
（項目１２３）
前記有機緩衝液が、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液である、項目９１～１２２のいずれかに記載の乾燥組成物。
（項目１２４）
前記有機緩衝液が、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）緩衝液である、項目９１～１２２のいずれかに記載の乾燥組成物。
（項目１２５）
前記乾燥組成物が、球状タンパク質を含む、項目９１～１２４のいずれかに記載の乾燥組成物。
（項目１２６）
前記球状タンパク質がウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である、項目１２５に記載の乾燥組成物。
（項目１２７）
前記ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が、非アセチル化ＢＳＡ、好適には、超高純度非アセチル化ＢＳＡである、項目１２６に記載の乾燥組成物。
（項目１２８）
前記乾燥組成物の質量が、約０．００３ｇ～約０．００４ｇ、もしくは約０．００３２ｇ～約０．００３７ｇ、もしくは０．００３３ｇ、もしくは０．００３４ｇ、もしくは０．００３５ｇ、もしくは０．００３６ｇである、または前記乾燥組成物を形成するように乾燥させた水溶液１マイクロリットル当たり約０．０００１２５ｇ～約０．０００６６７ｇである、項目８７～１２７のいずれか一項に記載の乾燥組成物。
（項目１２９）
核酸に基づくアッセイを行う際に使用される混合物を形成する方法であって、再構成溶液と項目８７～１２８のいずれか一項に記載の乾燥組成物とを組み合わせることを含み、前記再構成溶液が、少なくとも１つの無機塩を含む、方法。
（項目１３０）
前記再構成溶液が、１ｍＭ未満の無機塩濃度を含む、項目１２９に記載の方法。
（項目１３１）
前記再構成溶液が、マグネシウムイオンを含む、項目１２９または１３０に記載の方法。
（項目１３２）
前記再構成溶液が、約５ｍＭ～約１５ｍＭ、好適には９ｍＭ～１２、例えば、１１．２５ｍＭの濃度のＭｇＣｌ２を含む、項目１３１に記載の方法。
（項目１３３）
前記再構成溶液が、約０．０１２％ｗ／ｖ～約０．０２０％ｗ／ｖの濃度のメチルパラベン、約０．００６％ｗ／ｖ～約０．０１０％ｗ／ｖの濃度のプロピルパラベン、約０．２０％ｖ／ｖ～約０．３０％ｖ／ｖの濃度の無水エタノール、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目１２９～１３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３４）
前記再構成溶液中の前記メチルパラベンの前記濃度が０．０１６％ｗ／ｖである、項目１３３に記載の方法。
（項目１３５）
前記再構成溶液中の前記プロピルパラベンの前記濃度が０．００８％ｗ／ｖである、項目１３３または項目１３４に記載の方法。
（項目１３６）
前記無水エタノールの前記濃度が、約０．２６％ｖ／ｖで前記再構成溶液中に存在する、項目１３３～１３５のいずれかに記載の方法。
（項目１３７）
核酸に基づくアッセイを行う際に使用される乾燥組成物を調製するための方法であって、（ｉ）項目１～７８のいずれか一項に記載の水溶液を凍結させ、それによって前記水溶液の凍結形態を形成するステップと、（ｉｉ）ステップ（ｉ）からの前記凍結形態を凍結乾燥条件に曝露し、それによって乾燥組成物を形成するステップと、を含む、方法。
（項目１３８）
前記乾燥組成物が湿潤環境に曝露され、前記湿潤環境の絶対湿度レベルが、３０℃で空気１立方メートル当たり２．３グラムを超える水である、項目１３７に記載の方法。
（項目１３９）
前記乾燥組成物が、最大３時間まで前記湿潤環境に曝露される、項目１３８に記載の方法。
（項目１４０）
前記乾燥組成物を密封容器に保存するステップをさらに含む、項目１３７～１３９のいずれかに記載の方法。
（項目１４１）
前記乾燥組成物の質量が、約０．００３ｇ～約０．００４ｇ、もしくは約０．００３２ｇ～約０．００３７ｇ、もしくは０．００３３ｇ、もしくは０．００３４ｇ、もしくは０．００３５ｇ、もしくは０．００３６ｇである、または前記乾燥組成物を形成するように乾燥させた水溶液１マイクロリットル当たり約０．０００１２５ｇ～約０．０００６６７ｇである、項目１３７～１４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４２）
核酸に基づくアッセイを行う際に使用される乾燥組成物を調製するための方法であって、脱水、乾燥、凍結乾燥、および噴霧乾燥からなる群から選択される乾燥方法を用いて、項目１～８５のいずれか一項に記載の水溶液を乾燥させるステップと、それによって乾燥組成物を形成するステップと、を含む、方法。
（項目１４３）
乾燥方法が凍結乾燥であり、前記乾燥組成物が凍結乾燥組成物である、項目１４２に記載の方法。
（項目１４４）
前記乾燥組成物を密封容器に保存するステップをさらに含む、項目１４２または１４３に記載の方法。
（項目１４５）
核酸に基づくアッセイを行う際に使用されるキットであって、項目８６～１２７のいずれか一項に記載の乾燥組成物を含む第１の容器と、約３．８ｍＭ～約４．４ｍＭの濃度のＭｇＣｌ２を含む再構成溶液を含む第２の容器と、を含む、キット。
（項目１４６）
前記第１の容器が、１つ以上のウェルを含むマルチウェルプレートである、項目１４５に記載のキット。
（項目１４７）
前記１つ以上のウェルの各々が、０．３１１％以下のペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントを含む乾燥単一単位用量ペレットを含む、項目１４５に記載のキット。
（項目１４８）
前記第１および第２の容器が、前記第２の容器から前記第１の容器への前記再構成溶液の自動移送に適合したデバイス内に組み込まれる、項目１４５～１４７のいずれか一項に記載のキット。
（項目１４９）
有機緩衝液、増量剤、塩化物イオン、およびキレート剤を含む水溶液を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、透析組成物。
（項目１５０）
前記増量剤がトレハロースである、項目１４９に記載の透析組成物。
（項目１５１）
前記増量剤が、約１００ｍＭ～３００ｍＭ、好適には２００ｍＭの濃度で存在する、項目１４９または項目１５０に記載の透析組成物。
（項目１５２）
前記有機緩衝液が、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）緩衝液である、項目１４９～１５１のいずれかに記載の透析組成物。
（項目１５３）
前記トリス緩衝液が、前記水溶液中１０ｍＭ～３０ｍＭの濃度で、好適には、前記水溶液中５０ｍＭの濃度で存在する、項目１５２に記載の透析組成物。
（項目１５４）
前記塩化物イオンがＫＣｌである、項目１４９～１５３のいずれかに記載の透析組成物。
（項目１５５）
前記ＫＣｌが、約４０～６０ｍＭ、好適には５０ｍＭの濃度で存在する、項目１５４に記載の透析組成物。
（項目１５６）
前記キレート剤がＥＤＴＡである、項目１５１～１５５のいずれかに記載の透析組成物。
（項目１５７）
前記ＥＤＴＡが、０．０５～０．２ｍＭ、好適には０．１ｍＭの濃度で前記水溶液中に存在する、項目１５６に記載の透析組成物。
（項目１５８）
フラップエンドヌクレアーゼ、好適には、Ｃｌｅａｖａｓｅ（登録商標）酵素をさらに含む、項目１４９～１５７のいずれかに記載の透析組成物。
（項目１５９）
グリセロールを実質的に含まないフラップエンドヌクレアーゼ組成物を調製するための方法であって、（ｉ）フラップエンドヌクレアーゼおよびグリセロールを含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる水溶液を提供することと、（ｉｉ）前記水溶液を項目１４９～１５８のいずれかに記載の透析組成物に透析すること、（ｉｉｉ）グリセロールを実質的に含まないフラップエンドヌクレアーゼ組成物を取得することと、を含む、方法。
（項目１６０）
ステップ（ｉ）の前記水溶液が、約０．３～約０．５％（ｗ／ｖ）のグリセロール、好適には、約０．３５％（ｗ／ｖ）のグリセロールを含む、項目１５９に記載の方法。
（項目１６１）
乾燥フラップエンドヌクレアーゼ含有組成物を調製するための、項目１～８６のいずれかに記載の水性組成物の使用。
（項目１６２）
核酸に基づくアッセイを行うための再構成溶液と組み合わせた、項目１～８６のいずれかに記載の水性組成物の使用。
（項目１６３）
グリセロールを実質的に含まないフラップエンドヌクレアーゼ組成物を調製するための、項目１４９～１５８のいずれかに記載の透析組成物の使用。
【発明を実施するための形態】
【0198】
Ｉ．概説
本開示は、核酸に基づくアッセイを行うための従来の凍結乾燥キットの不安定性が無機塩の存在に起因するという知見に少なくとも一部基づいている。これらの塩は、乾燥前、乾燥中、および乾燥後に、望ましくないハイブリダイゼーション産物または他の副産物を生じ得る。これらの塩はまた、乾燥組成物が水を吸収するように該組成物を吸湿性にするため、湿気に対する限定された曝露、冷蔵もしくは超低温冷凍による保存および／または乾燥剤の存在下での保存を必要とする。水および塩の存在は、そのようなキットの酵素成分の活性を早期に喪失させ、またそのようなキット内の核酸の互いへのハイブリダイゼーションを促進し得る。本開示は、無機塩を本質的に含まないバルク試薬から核酸に基づくアッセイを実施するための試薬を乾燥させることにより、これらの問題を克服した。そのような塩は、乾燥組成物の再構成時に供給される。核酸に基づくアッセイに使用される酵素の安定性には無機塩が必要であるという予想に反して、無機塩を本質的に含まないように乾燥させた反応混合物は、再構成時に活性を完全または実質的に保持しながら、氷点より高い温度で長期間保存できることがわかっている。
本開示は、核酸に基づくアッセイを行うための従来の凍結乾燥キットの不安定性が無機塩の存在に起因するという知見に少なくとも一部基づいている。これらの塩は、乾燥前、乾燥中、および乾燥後に、望ましくないハイブリダイゼーション産物または他の副産物を生じ得る。これらの塩はまた、乾燥組成物が水を吸収するように該組成物を吸湿性にするため、湿気に対する限定された曝露、冷蔵もしくは超低温冷凍による保存および／または乾燥剤の存在下での保存を必要とする。水および塩の存在は、そのようなキットの酵素成分の活性を早期に喪失させ、またそのようなキット内の核酸の互いへのハイブリダイゼーションを促進し得る。本開示は、無機塩を本質的に含まないバルク試薬から核酸に基づくアッセイを実施するための試薬を乾燥させることにより、これらの問題を克服した。そのような塩は、乾燥組成物の再構成時に供給される。核酸に基づくアッセイに使用される酵素の安定性には無機塩が必要であるという予想に反して、無機塩を本質的に含まないように乾燥させた反応混合物は、再構成時に活性を完全または実質的に保持しながら、氷点より高い温度で長期間保存できることがわかっている。
【0199】
ＩＩ．バルク試薬および乾燥ペレット
本開示によるバルク試薬（凍結乾燥前混合物、溶液、水溶液または組成物と称されることもある）は、典型的には、フラップエンドヌクレアーゼ、増量剤、有機緩衝液を含む。バルク試薬は、１つ以上の核酸および／またはｄＮＴＰを含んでもまたは含まなくてもよい。バルク試薬は、キレート剤およびＲＮａｓｅ阻害剤を含んでもよい。
本開示によるバルク試薬（凍結乾燥前混合物、溶液、水溶液または組成物と称されることもある）は、典型的には、フラップエンドヌクレアーゼ、増量剤、有機緩衝液を含む。バルク試薬は、１つ以上の核酸および／またはｄＮＴＰを含んでもまたは含まなくてもよい。バルク試薬は、キレート剤およびＲＮａｓｅ阻害剤を含んでもよい。
【0200】
そのようなバルク試薬は、無機塩を本質的に含まず、無機塩の濃度は、個々におよび集合的に、５ｍＭ未満、好ましくは１ｍＭ未満であることを意味する。好ましくは、Ｍｇ２＋の濃度は、１ｍＭ未満、０．５ｍＭ未満、０．１ｍＭ未満、または０．０５ｍＭ未満である。好ましくは、Ｎａ＋の濃度は、１ｍＭ未満、０．５ｍＭ未満、０．１ｍＭ未満、または０．０５ｍＭ未満である。好ましくは、Ｋ＋の濃度は、１ｍＭ未満、０．５ｍＭ未満、０．１ｍＭ未満、または０．０５ｍＭ未満である。好ましくは、Ｃｌ－の濃度は、１ｍＭ未満、０．５ｍＭ未満、０．１ｍＭ未満、または０．０５ｍＭ未満である。
【0201】
そのようなバルク試薬は、グリセロールを実質的に含まない。本明細書で使用される場合、「実質的に含まない」という用語は、グリセロールが、酵素調製物に一般的に使用される量で存在しないことを意味する。好適には、グリセロールは、５％（ｗ／ｖ）未満、４％（ｗ／ｖ）未満、３％（ｗ／ｖ）未満、２％（ｗ／ｖ）未満、１％（ｗ／ｖ）未満、０．５％（ｗ／ｖ）未満、０．１％（ｗ／ｖ）未満、または０．０１％（ｗ／ｖ）未満の量で存在する。好適には、グリセロールは、当該技術分野で既知の従来の方法を用いて検出できない量で存在する。例えば、Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）Ｇｌｙｃｅｒｏｌ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを使用して、グリセロールを酵素的に酸化し、プローブと反応して色および蛍光を生成する生成物を生成することにより、遊離グリセロール濃度を測定することができる。このキットは、様々な試料において５０ｐｍｏｌ～１０ｎｍｏｌのグリセロールを検出することができる。好適には、グリセロールは５０ｐｍｏｌ未満の濃度で存在する。
【0202】
反応混合物に組み込まれるヌクレオチドは、典型的にはｄＮＴＰとして提供される。ｄＮＴＰの例示的な濃度は、０．１～０．４ｍＭのｄＡＴＰ、好適には、０．３～０．４ｍＭのｄＡＴＰ、好適には、０．２９～０．４６ｍＭのｄＡＴＰ；０．１～０．４ｍＭのｄＧＴＰ、好適には、０．３～０．４ｍＭのｄＧＴＰ、好適には、０．２９～０．４ｍＭのｄＧＴＰ；０．１～０．４ｍＭのｄＣＴＰ、好適には、０．３～０．４ｍＭのｄＣＴＰ、好適には、０．２９～０．４ｍＭのｄＣＴＰ；０．１～０．４ｍＭのｄＴＴＰ、好適には、０．２～０．３ｍＭのｄＡＴＰ；および０．１～０．４ｍＭのｄＵＴＰ、好適には、好適には、０．１２５～０．２３４ｍＭのｄＵＴＰである。１．５×凍結乾燥混合物または最終反応物（すなわち、１．５×体積で再構成した後）における例示的な濃度は以下の通りである。
【0203】
【化1】
【0204】
そのような混合物は、フラップエンドヌクレアーゼを使用するあらゆる種類の反応に合わせてカスタマイズすることができる。そのような混合物は、フラップエンドヌクレアーゼおよびポリメラーゼを使用するあらゆる種類の反応に合わせてカスタマイズすることができる。
【0205】
フラップエンドヌクレアーゼは、市販されているか、またはユーザーによって調製されてもよい。フラップエンドヌクレアーゼは、５’ヌクレアーゼ活性のみを有する酵素に限定されない。例えば、フラップエンドヌクレアーゼは、５’ヌクレアーゼ活性を有する天然のＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ）、または合成活性を欠くことにより５’ヌクレアーゼ活性を有する修飾ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｃｌｅａｖａｓｅ（登録商標）酵素）であり得る。
【0206】
そのような混合物は、ポリメラーゼ酵素および他の成分の選択によって、ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、および転写媒介増幅を含む異なる種類の増幅に合わせてカスタマイズすることができる。
【0207】
ＤＮＡポリメラーゼ酵素は、市販されているか、またはユーザーによって調製されてもよい。ポリメラーゼ酵素の一例は、Ｑｉａｇｅｎから市販されているＴａｑポリメラーゼ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ、カタログ番号２０１２０３））である。Ｔａｑポリメラーゼの別の例は、ＧｏＴａｑ（登録商標）Ｇ２ Ｆｌｅｘｉ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ、カタログ番号Ｍ７８０１）として市販されている。市販の他のＤＮＡポリメラーゼとして、限定されないが、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ、カタログ番号１１４８００２２００１）、およびＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ、カタログ番号Ｍ０５３０Ｓ）等のキメラＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。ホットスタートＤＮＡポリメラーゼ酵素も、同様に市販されている。例えば、Ｔａｑポリメラーゼは、ＧｏＴａｑ（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｍ５００１）として市販されている。ＧｏＴａｑ（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは、Ｔａｑポリメラーゼがポリメラーゼ活性を遮断する抗体に結合した抗体媒介性ホットスタート酵素である。遮断抗体は高熱を使用して変性されるため、ＰＣＲ反応の初期加熱ステップの間に抗体が変性され、ポリメラーゼ活性が回復される。様々な抗体が、ホットスタート法、例えば、ＴＡＱＳＴＡＲＴ抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ、カタログ番号Ｒ０２８Ａ）とともに使用され得る。同様に、化学的に媒介されるホットスタートポリメラーゼを含む他のホットスタートポリメラーゼ酵素が利用可能である。同等のポリメラーゼおよび抗体は、様々な商業的供給元から入手可能であり、また代替として、ユーザーによって調製されてもよい。
【0208】
逆転写酵素は、市販されているか、またはユーザーによって調製されてもよい。市販の逆転写酵素の例として、限定されないが、ＭＭＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）逆転写酵素およびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ、カタログ番号２８０２５－０１３および１８０８０－０４４）、ＭＭＬＶ ＲＴ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｍ１３０２）、ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ、カタログ番号Ｍ０２７７Ｓ）、ならびにＧｏＳｃｒｉｐｔ（商標）逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ａ５０００３）が挙げられる。ＧｏＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素は、逆転写酵素と、定量的ＰＣＲ増幅用に最適化された一本鎖ｃＤＮＡの合成のための一連の試薬とを含む。同等の逆転写酵素および試薬は、様々な商業的供給元から入手可能であり、また代替として、ユーザーによって調製されてもよい。
【0209】
単一単位用量中のフラップエンドヌクレアーゼの例示的な濃度は、約０．０１μｇ／μｌ～約１．０μｇ／μｌ、好適には、約０．０１μｇ／μｌ～約０．８μｇ／μｌ、または約０．０１μｇ／μｌ～約０．６μｇ／μｌ、または約０．０１μｇ／μｌ～約０．４μｇ／μｌ、または約０．０１μｇ／μｌ～約０．２μｇ／μｌ、または約０．０１μｇ／μｌ～約０．１μｇ／μｌである。より好適には、単一単位用量中のフラップエンドヌクレアーゼの濃度は、約０．０２μｇ／μｌ～約０．０４μｇ／μｌである。より好適には、単一単位用量中のフラップエンドヌクレアーゼの濃度は、約０．０３０μｇ／μｌ～約０．０４μｇ／μｌ、より好適には、約０．０３０μｇ／μｌ～約０．０３５μｇ／μｌである。好適には、フラップエンドヌクレアーゼは、約０．０１０μｇ／μｌ～約０．０５０ｕｇ／ｕｌ、好適には約０．０１２ｕｇ／ｕｌ～０．０４７ｕｇ／ｕｌで水溶液中に存在する。
【0210】
単一単位用量中のＤＮＡポリメラーゼ酵素の例示的な濃度は、０．１～０．２Ｕ／μｌ（その中の全ての整数および分数を含む）である。例えば、０．１４Ｕ／μｌ、０．１４６Ｕ／μｌ、および０．１６８７Ｕ／μｌである。
【0211】
ＤＮＡポリメラーゼの１単位は、７４℃で３０分間に１０ナノモルのｄＮＴＰの酸不溶性物質への取り込みを触媒するのに必要な酵素の量として定義される。単一単位用量中の逆転写酵素の例示的な濃度は－１．０Ｕ／μｌ（その中の全ての整数および分数を含む）である。逆転写酵素の１単位は、３７°Ｃで１０分間に１ｎｍｏｌのデオキシヌクレオチドの酸沈殿性物質への転移を触媒するのに必要な酵素の量として定義される。
【0212】
好ましい有機緩衝液はＭＯＰＳまたはＴｒｉｓである。
【0213】
好適には、ＭＯＰＳ緩衝液は、水溶液中約１０ｍＭ～約２０ｍＭの濃度で、好適には、水溶液中約１２．５ｍＭ～約１５ｍＭの濃度で存在する。
【0214】
好適には、トリス緩衝液は、水溶液中約５ｍＭ～約６０ｍＭの濃度で、好適には水溶液中約４０ｍＭ～６０ｍＭの濃度で、好適には水溶液中約５０ｍＭの濃度で、好適には水溶液中約１０ｍＭの濃度で存在する。
【0215】
バルク試薬に組み込むことができる代替の有機緩衝液は、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、ＣＨＥＳ、ヒスチジン、ならびにＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、トリシン、およびグリシンアミド等のＧｏｏｄの緩衝液だけでなく、緩衝液の組み合わせを含む。他の有機緩衝液として、コハク酸塩、クエン酸塩、グルコン酸塩、リン酸塩等が挙げられる。好ましい緩衝液は、約６．０～約１０．０または約７．０～約９．０のｐＨ範囲、好適には、約７．５または８．０または８．５のｐＨで効果的である。
【0216】
好ましい増量剤はトレハロースである。企図される他の増量剤として、ラフィノース、スクロース、マンニトール、トレハロースおよびマンニトール、スクロースおよびマンニトール、スクロースおよびグリシン、ならびにヒドロキシエチルデンプンが挙げられる。Ｃｌｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９０：３１０；Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ（２００９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．３８：２９；Ｗｅｂｂ ｅｔ ａｌ（２００３）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９２：７１５；Ｇａｒｚｏｎ Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ ｅｔ ａｌ（２００４）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９３：６８４；Ｑｉｕ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．４３７：５１）；Ｖａｎ Ｄｉｊｋ－Ｗｏｌｔｈｕｉｓ ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｐｏｌｙｍｅｒを参照されたい。３８：６２３５ ６２４２．ヒドロキシエチルデンプンは、ヘタスターチ、ヘキサスターチ、ペンタスターチ、およびテトラスターチとして分類される（例えば、ＣｈｏｗのＷＯ２０１４／０９９１９８を参照のこと）。増量剤は、好ましくは、約０．２Ｍ～約０．５Ｍ、好適には約０．２Ｍ～約０．４Ｍ、好適には約０．３Ｍ～約０．４Ｍ、好適には約０．４７Ｍ、好適には約０．３６Ｍの濃度で存在する。
【0217】
バルク試薬は、プローブオリゴマー、増幅オリゴマー、捕捉プローブ、陽性対照テンプレート、および陰性対照テンプレート等の１つ以上の核酸を含んでもよい。バルク試薬は、１つ以上のプローブオリゴヌクレオチドを含む増幅に基づかないアッセイを行うための１つ以上の核酸を含んでもよい。バルク試薬は、１つ以上のプローブオリゴヌクレオチドおよび／または１つ以上の増幅オリゴマーおよび／または１つ以上の増幅オリゴマー対および／または複数の増幅オリゴマー対を含む、増幅に基づかないアッセイおよび増幅に基づくアッセイを行うための１つ以上の核酸を含んでもよい。
【0218】
バルク試薬の任意選択的な追加成分として、ＲＮａｓｅ阻害剤、界面活性剤、両性イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、表面活性剤、プライマー、プローブ、テンプレート、ポリマー、生体高分子、オリゴ糖、多糖、ポリグルコース、アミロース、キレート剤、メチルパラベン、およびプロピルパラベンが挙げられる。メチルパラベンの例示的な濃度は、０．０１～０．０２４重量％、例えば、約０．０１６％、または代替として、約０．０１０％、約０．０１４％、約０．０１６％、約０．０２０％、約０．０２４％、およびこれらの値を境界とする任意の範囲である。プロピルパラベンの例示的な濃度範囲は、０．００２～０．０１６％または０．００８％、または代替として、約０．００２％、約０．００４％、約０．００６％、約０．００８％、約０．０１０％、約０．０１２％、約０．０１４％、約０．０１６％、またはこれらの値を境界とする任意の範囲である。１単位は、５ｎｇのリボヌクレアーゼＡの活性を５０％阻害するために必要なＲＮａｓｉｎ（登録商標）Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ
Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒの量として定義される。活性は、リボヌクレアーゼＡによるシチジン２´，３´環状一リン酸の加水分解の阻害によって測定される。
Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒの量として定義される。活性は、リボヌクレアーゼＡによるシチジン２´，３´環状一リン酸の加水分解の阻害によって測定される。
【0219】
キレート剤は、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸）、ＥＤＤＳ（エチレンジアミン－Ｎ、Ｎ’－二コハク酸）、ＭＧＤＡ（メチルグリシン二酢酸）、およびＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）のうちの１つ以上を含む。キレート剤の例示的な濃度は１．０ｍＭ～２．５ｍＭである。一実施形態において、ＥＤＴＡの使用が好ましい。好適には、ＥＤＴＡは、約０．０５～約０．２ｍＭ、好適には約０．１ｍＭの濃度で存在する。
【0220】
ＲＮａｓｅ阻害剤タンパク質は天然であり、組換え体は、１：１の比率でＲＮａｓｅに非共有結合することによりＲＮａｓｅ Ａファミリーおよびヒト胎盤ＲＮａｓｅを阻害する５０ｋＤａのタンパク質である（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。Ｂｏｔｅｌｌａ－Ｅｓｔｒａｄａ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒ．８：２７８；Ｐｏｌａｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ（１９９２）ＥＸＳ．６１：４２８を参照されたい。ＲＮａｓｅ阻害剤の例示的な濃度は、約０．０４Ｕ／μｌ～約０．４Ｕ／μｌである。
Ｔｈｅｒ．８：２７８；Ｐｏｌａｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ（１９９２）ＥＸＳ．６１：４２８を参照されたい。ＲＮａｓｅ阻害剤の例示的な濃度は、約０．０４Ｕ／μｌ～約０．４Ｕ／μｌである。
【0221】
バルク試薬は、低濃度の界面活性剤を含むことができる。界面活性剤は、多くの商業的供給業者（例えば、Ｇｅｎｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手可能なイオン性（陽イオン性または陰イオン性）、非イオン性、および両性イオン性界面活性剤を含む。例として、限定されないが、ラウリル硫酸リチウム、塩酸アンプロリウム、塩化ベンザルコニウム、コリンｐ－トルエンスルホン酸塩、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム、３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホン酸、臭化エチルヘキサデシルジメチルアンモニウム、塩化ヘキサデシルピリジニウム、塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、ドデシル硫酸ナトリウム、ｐ－トルエンスルホン酸ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、ｌｕｖｉｑｕａｔ（商標）、塩化メチルベンゼトニウム、臭化ミリスチルトリメチルアンモニウム、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’－ポリオキシエチレン（１０）－Ｎ－獣脂－１，３－ジアミノプロパン液、臭化オキシフェノニウム、臭化テトラヘプチルアンモニウム、テトラキス（デシル）アンモニウムブロミド、トリカプリリルメチルアンモニウムクロリド、アミドスルホベタイン－１６、トリドデシルメチルアンモニウムクロリド、トリメチルオクタデシルアンモニウムブロミド、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０（登録商標）、Ｔｗｅｅｎ－２０（登録商標）、Ｔｗｅｅｎ－８０（登録商標）、Ｂｒｉｊ－３５（登録商標）、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（登録商標）が挙げられる。
【0222】
バルク試薬の例示的な体積として約１ｕＬ、約５ｕＬ、約１０ｕＬ、約２０ｕＬ、約２４ｕＬ、約５０ｕＬ、約１００ｕＬ、約２００ｕＬ、約３００ｕＬ、約４００ｕＬ、約５００ｕＬ、約６００ｕＬ、約７００ｕＬ、約８００ｕＬ、約９００ｕＬ、約１，０００ｕＬ（１ｍＬ）、約２ｍＬ、約５ｍＬ、約１０ｍＬ、約２０ｍＬ、約５０ｍＬ等が挙げられる。再構成された組成物は、バルク試薬と同じ体積、より小さな体積、またはより大きな体積で形成することができる。より小さな体積は、バルク試薬と比較して、約９０％、約８０％、約６０％、約４０％、約２０％、約１０％、または約５％であり得る。より大きな体積は、バルク試薬の体積の約１２０％、１４０％、１６０％、１８０％、２００％（２倍）、約４倍、約６倍、約８倍、約１０倍、約２０倍であり得る、
【0223】
分析される試料は、再構成の前、再構成と同時、または再構成の後に、バルク試薬に添加することができる。好ましい実施形態において、再構成後の乾燥組成物全体が試料と組み合わせるために使用され、ここで再構成溶液／試料の相対体積は、例えば約９．９／０．１、９．８／０．２、９．５／０．５、９／１、８／２、７／３、６／４、５／５等であり得る。
【0224】
別途指定のない限り、バルク試薬中の試薬の濃度は、０．０％（試薬を含まない）、０．００１％、０．００４％、０．００８％、０．００１２％、０．００１６％、０．００２０％、０．００３０％、０．００４０％、０．００５０％、０．００６０％、０．００８０％、０．０１％、０．０２％、０．０４％、０．０６％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．８％、１％、２％、３％、４％、５％等であり得る。また、「約」上記濃度、上記濃度を下回る、上記濃度を上回る、上記濃度のいずれか２つを含む範囲にある試薬も提供される。
【0225】
例示的なバルク試薬組成物は、グリセロールを実質的に含まず、５ｍＭ以下の無機塩濃度を有し、０．１～０．４ｍＭ、好適には約０．３ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＵＴＰまたはｄＴＴＰの各々、ならびに０．０２μｇ／μｌ～０．４０ｕｇ／μＬのフラップエンドヌクレアーゼ、好適には約０．０３μｇ／μｌのフラップエンドヌクレアーゼを有する。いくつかの組成物は、約０．２Ｍ～約０．４Ｍ、好適には約０．３Ｍの増量剤、好適にはトレハロースを含む。いくつかの組成物は、好適にはｐＨ約７．５の緩衝液、好適にはＭＯＰＳ緩衝液を含む。
【0226】
別の例示的なバルク試薬組成物は、グリセロールを実質的に含まず、５ｍＭ以下の無機塩濃度を有し、０．１～０．４ｍＭ、好適には約０．３７５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰの各々、および約０．１８２ｍＭのｄＵＴＰまたは約０．２８４ｍＭのｄＴＴＰ、０．０２μｇ／μｌ～０．４０ｕｇ／μＬのフラップエンドヌクレアーゼ、好適には約０．０３μｇ／μｌのフラップエンドヌクレアーゼ、ならびに０．１Ｕ／μｌ～０．２Ｕ／μｌ、好適には０．１４６Ｕ／μｌポリメラーゼを有する。いくつかの組成物は、約０．２Ｍ～約０．４Ｍ、好適には約０．３Ｍの増量剤、好適にはトレハロースを含む。いくつかの組成物は、好適にはｐＨ約７．５の緩衝液、好適にはＭＯＰＳ緩衝液を含む。
【0227】
別の例示的なバルク試薬組成物は、グリセロールを実質的に含まず、５ｍＭ以下の無機塩濃度を有し、０．１～０．４ｍＭ、好適には約０．３７５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰの各々、および約０．１８２ｍＭのｄＵＴＰまたは約０．２８４ｍＭのｄＴＴＰ、０．０２μｇ／μｌ～０．４０ｕｇ／μＬのフラップエンドヌクレアーゼ、好適には約０．０３５μｇ／μｌのフラップエンドヌクレアーゼ、０．１Ｕ／μｌ～０．２Ｕ／μｌ、好適には０．１４６Ｕ／μｌのポリメラーゼ、約０．２Ｍ～約０．４Ｍ、好適には約０．３Ｍの増量剤、好適にはトレハロース、ならびに好適にはｐＨ約７．５の緩衝液、好適にはＭＯＰＳ緩衝液を有する。
【0228】
別の例示的なバルク試薬組成物は、グリセロールを実質的に含まず、５ｍＭ以下の無機塩濃度を有し、０．１～０．４ｍＭ、好適には約０．３７５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰの各々、および約０．１８２ｍＭのｄＵＴＰまたは約０．２８４ｍＭのｄＴＴＰ、ならびに０．０２μｇ／μｌ～０．４０ｕｇ／μＬのフラップエンドヌクレアーゼ、好適には約０．０３μｇ／μｌのフラップエンドヌクレアーゼを有する。いくつかの組成物は、約０．２Ｍ～約０．４Ｍ、好適には約０．３Ｍの増量剤、好適にはトレハロースを含む。いくつかの組成物は、球状タンパク質、好適には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、より好適には、超高純度非アセチル化ＢＳＡを含む。球状タンパク質は、０．４０～０．６０μｇ／μｌ、好適には０．５０μｇ／μｌの量で存在し得る。いくつかの組成物は、好適にはｐＨ約８．５の緩衝液、好適にはトリス緩衝液を含む。
【0229】
別の例示的なバルク試薬組成物は、グリセロールを実質的に含まず、５ｍＭ以下の無機塩濃度を有し、０．１～０．４ｍＭ、好適には約０．３７５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰの各々、および約０．１８２ｍＭのｄＵＴＰまたは約０．２８４ｍＭのｄＴＴＰ、ならびに０．０２μｇ／μｌ～０．４０ｕｇ／μＬのフラップエンドヌクレアーゼ、好適には約０．０３μｇ／μｌのフラップエンドヌクレアーゼ、ならびに０．１Ｕ／μｌ～０．２Ｕ／μｌ、好適には０．１４６Ｕ／μｌのポリメラーゼを有する。いくつかの組成物は、約０．２Ｍ～約０．４Ｍ、好適には約０．３Ｍの増量剤、好適にはトレハロースを含む。いくつかの組成物は、球状タンパク質、好適には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、より好適には、超高純度非アセチル化ＢＳＡを含む。球状タンパク質は、０．４０～０．６０μｇ／μｌ、好適には０．５０μｇ／μｌの量で存在し得る。いくつかの組成物は、好適にはｐＨ約８．５の緩衝液、好適にはトリス緩衝液を含む。
【0230】
別の例示的なバルク試薬組成物は、グリセロールを実質的に含まず、５ｍＭ以下の無機塩濃度を有し、０．１～０．４ｍＭ、好適には０．３ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＵＴＰまたはｄＴＴＰの各々、ならびに０．０２μｇ／μｌ～０．４０ｕｇ／μＬのフラップエンドヌクレアーゼ、好適には約０．０３μｇ／μｌのフラップエンドヌクレアーゼ、ならびに０．１Ｕ／μｌ～０．２Ｕ／μｌ、好適には０．１４６Ｕ／μｌポリメラーゼ、約０．２Ｍ～約０．４Ｍ、好適には約０．３Ｍの増量剤、好適にはトレハロース、球状タンパク質、好適には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、より好適には、超高純度非アセチル化ＢＳＡ（前記球状タンパク質は、０．４０～０．６０μｇ／μｌ、好適には０．５０μｇ／μｌの量で存在する）、ならびに好適にはｐＨ約８．５の緩衝液、好適にはトリス緩衝液を有する。
【0231】
別の例示的なバルク試薬組成物は、グリセロールを実質的に含まず、５ｍＭ以下の無機塩濃度を有し、０．１～０．４ｍＭ、好適には０．３７５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＵＴＰまたはｄＴＴＰの各々、ならびに０．０２μｇ／μｌ～０．４０ｕｇ／μＬのフラップエンドヌクレアーゼ、好適には約０．０３５μｇ／μｌのフラップエンドヌクレアーゼを有する。いくつかの組成物において、フラップエンドヌクレアーゼはＣｌｅａｖａｓｅ（登録商標）酵素である。いくつかの組成物は、約０．２Ｍ～約０．４Ｍ、好適には約０．３６Ｍの増量剤、好適にはトレハロースを含む。いくつかの組成物は、球状タンパク質、好適には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、より好適には、超高純度非アセチル化ＢＳＡを含む。球状タンパク質は、０．４０～０．６０μｇ／μｌ、好適には０．５０μｇ／μｌの量で存在し得る。いくつかの組成物は、好適にはｐＨ約７．５の緩衝液、好適にはＭＯＰＳ緩衝液を含む。
【0232】
別の例示的なバルク試薬組成物は、グリセロールを実質的に含まず、５ｍＭ以下の無機塩濃度を有し、０．１～０．４ｍＭ、好適には０．３７５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＵＴＰまたはｄＴＴＰの各々、ならびに０．０２μｇ／μｌ～０．４０ｕｇ／μＬのフラップエンドヌクレアーゼ、好適には約０．０３５μｇ／μｌのフラップエンドヌクレアーゼ、ならびに０．１Ｕ／μｌ～０．２Ｕ／μｌ、好適には０．１６７Ｕ／μｌのポリメラーゼを有する。いくつかの組成物は、約０．２Ｍ～約０．４Ｍ、好適には約０．３６Ｍの増量剤、好適にはトレハロースを含む。いくつかの組成物は、球状タンパク質、好適には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、より好適には、超高純度非アセチル化ＢＳＡを含む。球状タンパク質は、０．４０～０．６０μｇ／μｌ、好適には０．５０μｇ／μｌの量で存在し得る。いくつかの組成物は、好適にはｐＨ約７．５の緩衝液、好適にはＭＯＰＳ緩衝液を含む。
【0233】
別の例示的なバルク試薬組成物は、グリセロールを実質的に含まず、５ｍＭ以下の無機塩濃度を有し、０．１～０．４ｍＭ、好適には０．３７５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＵＴＰまたはｄＴＴＰの各々、ならびに０．０２μｇ／μｌ～０．４０ｕｇ／μＬのフラップエンドヌクレアーゼ、好適には約０．０３５μｇ／μｌのフラップエンドヌクレアーゼ、ならびに０．１Ｕ／μｌ～０．２Ｕ／μｌ、好適には０．１６７Ｕ／μｌのポリメラーゼ、約０．２Ｍ～約０．４Ｍ、好適には約０．３６Ｍの増量剤、好適にはトレハロース、球状タンパク質、好適には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、より好適には、超高純度非アセチル化ＢＳＡ（前記球状タンパク質は、０．４０～０．６０μｇ／μｌ、好適には０．５０μｇ／μｌの量で存在する）、ならびに好適にはｐＨ約７．５の緩衝液、好適にはＭＯＰＳ緩衝液（１５ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液等）を有する。
【0234】
別の例示的なバルク試薬組成物は、グリセロールを実質的に含まず、５ｍＭ以下の無機塩濃度を有し、０．１～０．４ｍＭ、好適には０．３７５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＵＴＰまたはｄＴＴＰの各々、ならびに０．０２μｇ／μｌ～０．４０ｕｇ／μＬのフラップエンドヌクレアーゼ、好適には約０．０３５μｇ／μｌのフラップエンドヌクレアーゼ、ならびに０．１Ｕ／μｌ～０．２Ｕ／μｌ、好適には０．１６９Ｕ／μｌのポリメラーゼ、約０．２Ｍ～約０．４Ｍ、好適には約０．３６Ｍの増量剤、好適にはトレハロース、球状タンパク質、好適には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、より好適には、超高純度非アセチル化ＢＳＡ（前記球状タンパク質は、０．４０～０．６０μｇ／μｌ、好適には０．５１μｇ／μｌの量で存在する）、好適にはｐＨ約７．５の緩衝液、好適にはＭＯＰＳ緩衝液（１５ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液等）、ならびにキレート剤、約０．０５～０．２ｍＭ、好適には約０．１５ｍＭの濃度の好適にはＥＤＴＡを有する。
【0235】
バルク試薬組成物の形成後、該組成物は乾燥前に有意な期間室温で放置されてもよい。この期間は、乾燥ステップが開始される前の最大８時間、または代替として、乾燥ステップが開始される前の最大１時間、最大２時間、最大４時間、最大６時間、最大１０時間、最大１２時間、最大１４時間前であり得る。バルク試薬に塩が含まれると、このインキュベーション期間中に望ましくないハイブリダイゼーション産物および他の副産物が生じる。そのような望ましくないハイブリダイゼーションおよび副産物は、無機塩を本質的に含まないバルク試薬組成物を形成することによって低減または排除される。
【0236】
バルク試薬中の無機塩の存在は、以下の望ましくない特性のうちの１つ以上をもたらし得る。核酸が一緒にハイブリダイズする可能性があり、カリウム、ナトリウム、マンガン、マグネシウム、および／または塩化物等の無機塩の存在によってハイブリダイゼーションが刺激される。また、マンガンおよびマグネシウム等の無機塩の存在下では、望ましくない酵素活性が発生し得る。塩の存在下での核酸ハイブリダイゼーションおよび酵素活性の結果として、望ましくない副産物が形成し始める可能性がある。さらに、無機塩は吸湿性があり、乾燥ペレットに水分を引き込む。乾燥ペレットの再水和は、貯蔵安定性、酵素安定性を低下させ、追加の偽副産物の形成を許容する。
【0237】
乾燥ペレットは、１つの単一単位用量（ＳＵＤ）、または任意選択的に２つ以上のＳＵＤを提供するように試薬を含むことができる。単一単位用量は、単一試料のみに対して核酸に基づくアッセイを行うために必要な一連の試薬である。単一単位用量は、液体試薬または乾燥ペレットを指し得る。本明細書で言及されるように、単一単位用量は、単一試料に対して核酸に基づくアッセイを行うために必要な全ての試薬を含む必要がないことに注目すべきである。単一単位用量には、核酸に基づくアッセイ反応を行うために必要な試薬が不足している場合がある。同様に、単一単位用量は、核酸に基づくアッセイ反応を行うには不十分な量の試薬を含む場合がある。ほんの一例として、乾燥単一単位用量ペレットは、核酸に基づくアッセイを行うのに十分な単位のフラップエンドヌクレアーゼを含み得るが、マグネシウムを含まなくてもよい。そのような例において、マグネシウムは、例えば再構成溶液によって、乾燥単一単位用量ペレットに添加することができる。また、ほんの一例として、乾燥単一単位用量は、核酸に基づくアッセイを行うには不十分な量のｄＮＴＰを含む場合がある。そのような例において、ｄＮＴＰの残りは、例えば再構成溶液によって、乾燥単一単位用量ペレットに添加することができる。これらの例は非限定的であるため、本開示を十分に把握している当業者は、様々な組成のＳＵＤおよび乾燥ペレットＳＵＤを容易に生成するであろう。
【0238】
好ましい実施形態において、バルク試薬は、５ｍＭ以下の無機塩含有量、より好ましくは４ｍＭ以下の無機塩含有量、より好ましくは３ｍＭ以下の無機塩含有量、より好ましくは２ｍＭ以下の無機塩含有量、より好ましくは１ｍＭ以下の無機塩含有量、またはより好ましくは５００ｕＭ以下の無機塩含有量を含む。したがって、バルク試薬中の無機塩の好ましい濃度範囲は、約５ｍＭ～０ｍＭの無機塩含有量（その中の全ての整数および分数を含む）である。核酸に基づくアッセイ反応混合物のための一般的な無機塩は、いくつか例を挙げると、ナトリウム、カリウム、マンガン、マグネシウム、および塩化物のうちの１つ以上を含む。
【0239】
一態様において、バルク試薬は５ｍＭ以下の無機塩を含み、無機塩は、０．３７３μｇ／μｌ以下、または０．３３２μｇ／μｌ以下、または０．２９２μｇ／μｌ以下の１マイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様において、バルク試薬は５ｍＭ以下の無機塩を含み、塩化ナトリウムは、０．２９２μｇ／μｌ以下、０．１４６μｇ／μｌ以下、または０．０μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様において、バルク試薬は５ｍＭ以下の無機塩を含み、ナトリウムは、０．１１５μｇ／μｌ以下、０．０５７μｇ／μｌ以下、または０．０μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様において、バルク試薬は５ｍＭ以下の無機塩を含み、塩化カリウムは、０．３７３μｇ／μｌ以下、０．１８６μｇ／μｌ以下、または０．０μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様において、バルク試薬は５ｍＭ以下の無機塩を含み、カリウムは、０．１９６μｇ／μｌ以下、０．０９８μｇ／μｌ以下、または０．０μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様において、バルク試薬は５ｍＭ以下の無機塩を含み、塩化物は、０．３５５μｇ／μｌ以下、０．１７８μｇ／μｌ以下、０．０８９μｇ／μｌ以下、または０．０μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様において、乾燥ペレットは、５ｍＭ以下の無機塩を含む液体バルク試薬を乾燥させることから作製され、ペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントは、０．３１１％以下、０．２７７％以下、または０．２４４％以下である。さらなる態様において、ペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントが０．３１１％以下、０．２７７％以下、または０．２４４％以下である乾燥単一単位用量ペレットを含む容器が提供される。さらなる態様において、１つ以上のウェルを含むマルチウェルプレートが提供され、１つ以上のウェルの各々は、０．３１１％以下、０．２７７％以下、または０．２４４％以下のペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントを含む乾燥単一単位用量ペレットを含む。
【0240】
一態様において、バルク試薬は４ｍＭ以下の無機塩を含み、無機塩は、０．２９８μｇ／μｌ以下、または０．２６６μｇ／μｌ以下、または０．２３４μｇ／μｌ以下の１マイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様において、バルク試薬は４ｍＭ以下の無機塩を含み、塩化ナトリウムは、０．２３４μｇ／μｌ以下、０．１１７μｇ／μｌ以下、または０．０μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様において、バルク試薬は４ｍＭ以下の無機塩を含み、ナトリウムは、０．０９２μｇ／μｌ以下、０．０４６μｇ／μｌ以下、または０．０μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様において、バルク試薬は４ｍＭ以下の無機塩を含み、塩化カリウムは、０．２９８μｇ／μｌ以下、０．１４９μｇ／μｌ以下、または０．０μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様において、バルク試薬は４ｍＭ以下の無機塩を含み、カリウムは、０．１５６μｇ／μｌ以下、０．０７８μｇ／μｌ以下、または０．０μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様において、バルク試薬は４ｍＭ以下の無機塩を含み、塩化物は、０．２８４μｇ／μｌ以下、０．１４２μｇ／μｌ以下、０．０７１μｇ／μｌ以下、または０．０μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様において、乾燥ペレットは、４ｍＭ以下の無機塩を含む液体バルク試薬を乾燥させることから作製され、ペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントは、０．２４９％以下、０．２２２％以下、または０．１９５％以下である。さらなる態様において、ペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントが０．２４９％以下、０．２２２％以下、または０．１９５％以下である乾燥単一単位用量ペレットを含む容器が提供される。さらなる態様において、１つ以上のウェルを含むマルチウェルプレートが提供され、１つ以上のウェルの各々は、０．２４９％以下、０．２２２％以下、または０．１９５％以下のペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントを含む乾燥単一単位用量ペレットを含む。
【0241】
一態様において、バルク試薬は３ｍＭ以下の無機塩を含み、無機塩は、０．２２４μｇ／μｌ以下、または０．１９９μｇ／μｌ以下、または０．１７５μｇ／μｌ以下の１マイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様において、バルク試薬は３ｍＭ以下の無機塩を含み、塩化ナトリウムは、０．１７５μｇ／μｌ以下、０．０８８μｇ／μｌ以下、または０．０μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様において、バルク試薬は３ｍＭ以下の無機塩を含み、ナトリウムは、０．０６９μｇ／μｌ以下、０．０３４μｇ／μｌ以下、または０．０μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様において、バルク試薬は３ｍＭ以下の無機塩を含み、塩化カリウムは、０．２２４μｇ／μｌ以下、０．１１２μｇ／μｌ以下、または０．０μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様において、バルク試薬は３ｍＭ以下の無機塩を含み、カリウムは、０．１１７μｇ／μｌ以下、０．０５９μｇ／μｌ以下、または０．０μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様において、バルク試薬は３ｍＭ以下の無機塩を含み、塩化物は、０．２１３μｇ／μｌ以下、０．１０７μｇ／μｌ以下、０．０５３μｇ／μｌ以下、または０．０μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様において、乾燥ペレットは、３ｍＭ以下の無機塩を含む液体バルク試薬を乾燥させることから作製され、ペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントは、０．１８６％以下、０．１６６％以下、または０．１４６％以下である。さらなる態様において、ペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントが０．１８６％以下、０．１６６％以下、または０．１４６％以下である乾燥単一単位用量ペレットを含む容器が提供される。さらなる態様において、１つ以上のウェルを含むマルチウェルプレートが提供され、１つ以上のウェルの各々は、０．１８６％以下、０．１６６％以下、または０．１４６％以下のペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントを含む乾燥単一単位用量ペレットを含む。
【0242】
一態様において、バルク試薬は２ｍＭ以下の無機塩を含み、無機塩は、０．１４９μｇ／μｌ以下、または０．１３３μｇ／μｌ以下、または０．１１７μｇ／μｌ以下の１マイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様において、バルク試薬は２ｍＭ以下の無機塩を含み、塩化ナトリウムは、０．１１７μｇ／μｌ以下、０．０５８μｇ／μｌ以下、または０．０μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様において、バルク試薬は２ｍＭ以下の無機塩を含み、ナトリウムは、０．０４６μｇ／μｌ以下、０．０２３μｇ／μｌ以下、または０．０μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様において、バルク試薬は２ｍＭ以下の無機塩を含み、塩化カリウムは、０．１４９μｇ／μｌ以下、０．０７５μｇ／μｌ以下、または０．０μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様において、バルク試薬は２ｍＭ以下の無機塩を含み、カリウムは、０．０７８μｇ／μｌ以下、０．０３９μｇ／μｌ以下、または０．０μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様において、バルク試薬は２ｍＭ以下の無機塩を含み、塩化物は、０．１４２μｇ／μｌ以下、０．０７１μｇ／μｌ以下、０．０３６μｇ／μｌ以下、または０．０μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様において、乾燥ペレットは、２ｍＭ以下の無機塩を含む液体バルク試薬を乾燥させることから作製され、ペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントは、０．１２４％以下、０．１１１％以下、または０．０９７％以下である。さらなる態様において、ペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントが０．１２４％以下、０．１１１％以下、または０．０９７％以下である乾燥単一単位用量ペレットを含む容器が提供される。さらなる態様において、１つ以上のウェルを含むマルチウェルプレートが提供され、１つ以上のウェルの各々は、０．１２４％以下、０．１１１％以下、または０．０９７％以下のペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントを含む乾燥単一単位ペレットを含む。
【0243】
一態様において、バルク試薬は１ｍＭ以下の無機塩を含み、無機塩は、０．０７５μｇ／μｌ以下、または０．０６６μｇ／μｌ以下、または０．０５８μｇ／μｌ以下の１マイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様において、バルク試薬は１ｍＭ以下の無機塩を含み、塩化ナトリウムは、０．０５８μｇ／μｌ以下、０．０２９μｇ／μｌ以下、または０．０μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様において、バルク試薬は１ｍＭ以下の無機塩を含み、ナトリウムは、０．０２３μｇ／μｌ以下、０．０１１μｇ／μｌ以下、または０．０μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様において、バルク試薬は１ｍＭ以下の無機塩を含み、塩化カリウムは、０．０７５μｇ／μｌ以下、０．０３７μｇ／μｌ以下、または０．０μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様において、バルク試薬は１ｍＭ以下の無機塩を含み、カリウムは、０．０３９μｇ／μｌ以下、０．０２０μｇ／μｌ以下、または０．０μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様において、バルク試薬は１ｍＭ以下の無機塩を含み、塩化物は、０．０７１μｇ／μｌ以下、０．０３６μｇ／μｌ以下、０．０１８μｇ／μｌ以下、または０．０μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様において、乾燥ペレットは、１ｍＭ以下の無機塩を含む液体バルク試薬を乾燥させることから作製され、ペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントは、０．０６２％以下、０．０５５％以下、または０．０４９％以下である。さらなる態様において、ペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントが０．０６２％以下、０．０５５％以下、または０．０４９％以下である乾燥単一単位用量ペレットを含む容器が提供される。さらなる態様において、１つ以上のウェルを含むマルチウェルプレートが提供され、１つ以上のウェルの各々は、０．０６２％以下、０．０５５％以下、または０．０４９％以下のペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントを含む乾燥単一単位用量ペレットを含む。
【0244】
一態様において、バルク試薬は５００ｕＭ以下の無機塩を含み、無機塩は、０．０３７μｇ／μｌ以下、または０．０３３μｇ／μｌ以下、または０．０２９μｇ／μｌ以下の１マイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様において、バルク試薬は５００ｕＭ以下の無機塩を含み、塩化ナトリウムは、０．０２９μｇ／μｌ以下、０．０１５μｇ／μｌ以下、または０．０μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様において、バルク試薬は、５００ｕＭ以下の無機塩を含み、ナトリウムは、０．０１１μｇ／μｌ以下、０．００６μｇ／μｌ以下、または０．０μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様において、バルク試薬は５００ｕＭ以下の無機塩を含み、塩化カリウムは、０．０３７μｇ／μｌ以下、０．０１９μｇ／μｌ以下、または０．０μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様において、バルク試薬は５００ｕＭ以下の無機塩を含み、カリウムは、０．０２０μｇ／μｌ以下、０．０１０μｇ／μｌ以下、または０．０μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様において、バルク試薬は５００ｕＭ以下の無機塩を含み、塩化物は、０．０３６μｇ／μｌ以下、０．０１８μｇ／μｌ以下、０．００９μｇ／μｌ以下、または０．０μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様において、乾燥ペレットは、５００ｕＭ以下の無機塩を含む液体バルク試薬を乾燥させることから作製され、ペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントは、０．０３１％以下、０．０２８％以下、または０．０２４％以下である。さらなる態様において、ペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントが０．０３１％以下、０．０２８％以下、または０．０２４％以下である乾燥単一単位用量ペレットを含む容器が提供される。さらなる態様において、１つ以上のウェルを含むマルチウェルプレートが提供され、１つ以上のウェルの各々は、０．０３１％以下、０．０２８％以下、または０．０２４％以下のペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントを含む乾燥単一単位用量ペレットを含む。
【0245】
一態様において、バルク試薬は約５ｍＭ～約５００ｕＭの無機塩を含み、無機塩は、約０．３７３μｇ／μｌ～約０．０２９μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様において、バルク試薬は約５ｍＭ～約５００ｕＭの無機塩を含み、塩化ナトリウムは、０．２９２μｇ／μｌ～約０．０２９μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様において、バルク試薬は約５ｍＭ～約５００ｕＭの無機塩を含み、ナトリウムは、０．１１５μｇ／μｌ～約０．００６μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様において、バルク試薬は約５ｍＭ～約５００ｕＭの無機塩を含み、塩化カリウムは、約０．３７３μｇ／μｌ～約０．０１９μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様において、バルク試薬は約５ｍＭ～約５００ｕＭの無機塩を含み、カリウムは、０．１９６μｇ／μｌ～約０．０１０μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様において、バルク試薬は約５ｍＭ～約５００ｕＭの無機塩を含み、塩化物は、０．３５５μｇ／μｌ～約０．００９μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様において、バルク試薬は約５ｍＭ～約５００ｕＭの無機塩を含み、無機塩は約０．３７３μｇ／μｌ～約０．０２９μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量で存在し、塩化ナトリウムは約０μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様において、バルク試薬は約５ｍＭ～約５００ｕＭの無機塩を含み、無機塩は約０．３７３μｇ／μｌ～約０．０２９μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量で存在し、塩化カリウムは約０μｇ／μｌの１マイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様において、乾燥ペレットは、５ｍＭ～５００ｕＭの無機塩を含む液体バルク試薬を乾燥させることから作製され、ペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントは約０．３１１％～０．０２４％である。さらなる態様において、乾燥ペレットは、５ｍＭ～５００ｕＭの無機塩を含む液体バルク試薬を乾燥させることから作製され、ペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントは約０．３１１％～０．０２４％であり、ペレットの質量に対する塩化ナトリウムの質量パーセントは約０％であるか、またはペレットの質量に対する塩化カリウムの質量パーセントは約０％である。さらなる態様において、ペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントが約０．３１１％～０．０２４％である乾燥単一単位用量ペレットを含む容器が提供され、ペレットの質量に対する塩化ナトリウムの質量パーセントは約０％であるか、またはペレットの質量に対する塩化カリウムの質量パーセントは約０％である。さらなる態様において、１つ以上のウェルを含むマルチウェルプレートが提供され、１つ以上のウェルの各々は、約０．３１１％～０．０２４％のペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントを含む乾燥単一単位用量ペレットを含み、ペレットの質量に対する塩化ナトリウムの質量パーセントは約０％であるか、ペレットの質量に対する塩化カリウムの質量パーセントは約０％である。
【0246】
一実施形態において、１つ以上のウェルを含むマルチウェルプレートが提供される。一態様において、１つ以上のウェルは、低水蒸気透過率、熱伝導性、光透過性、低い自家蛍光、またはそれらの組み合わせを含む材料から構築された壁を含む。一態様において、１つ以上のウェルは、円錐形の壁を含む。一態様において、ウェルは、核酸に基づくアッセイ反応を行うために、デバイスの熱伝導管受容領域に適合するように構成された壁を含む。一態様において、マルチウェルプレートの１つ以上のウェルは、ウェルのチャンバーにアクセスするための開口部を含む。一態様において、１つ以上のウェルは各々、関連するウェルの開口部を密封するキャップを含む。一態様において、１つ以上のウェルの各々の開口部は、低水蒸気透過性箔であるキャップで密封される。一態様において、１つ以上のウェルの各々の開口部は、低水蒸気透過性エラストマー物質であるキャップで密封される。一態様において、マルチウェルプレートは、本明細書に記載の１つ以上のウェルを含み、ウェルのチャンバーは、フラップエンドヌクレアーゼおよび無機塩を含む乾燥単一単位用量ペレットを含み、ペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントは約０．３１１％～０．０２４％である。
【0247】
ＩＩＩ．乾燥用機器および乾燥方法
バルク試薬は、標準的な方法および機器を使用して凍結乾燥することができる。凍結乾燥機は、例えば、ＧＥＡ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）から入手可能である。契約凍結乾燥サービスは、例えば、Ｂｉｏｐｈａｒｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ．（Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ，Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎ）およびＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｓｔｅｒｉｌｅ Ｃｏｎｔｒａｃｔ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）によって提供される。凍結乾燥のガイダンスは、例えば、Ｌ．Ｒｅｙ，Ｊ．Ｃ．Ｍａｙ（ｅｄｓ．）（２０１０）Ｆｒｅｅｚｅ Ｄｒｙｉｎｇ／Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，３ｒｄ．ｅｄ．Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＮＹもしくはＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２２，Ｐａｇｅｓ３３－３９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７１）、またはＦｒｅｅｚｅ－Ｄｒｙｉｎｇ，Ｅ．Ｗ．Ｆｌｏｓｄｏｒｆ，Ｒｈｅｉｎｈｏｌｄ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９４９）から入手可能である。任意選択的に、凍結乾燥中に酸素含有量を低減することができる（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ．１９：２１９）。
バルク試薬は、標準的な方法および機器を使用して凍結乾燥することができる。凍結乾燥機は、例えば、ＧＥＡ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）から入手可能である。契約凍結乾燥サービスは、例えば、Ｂｉｏｐｈａｒｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ．（Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ，Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎ）およびＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｓｔｅｒｉｌｅ Ｃｏｎｔｒａｃｔ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）によって提供される。凍結乾燥のガイダンスは、例えば、Ｌ．Ｒｅｙ，Ｊ．Ｃ．Ｍａｙ（ｅｄｓ．）（２０１０）Ｆｒｅｅｚｅ Ｄｒｙｉｎｇ／Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，３ｒｄ．ｅｄ．Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＮＹもしくはＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２２，Ｐａｇｅｓ３３－３９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７１）、またはＦｒｅｅｚｅ－Ｄｒｙｉｎｇ，Ｅ．Ｗ．Ｆｌｏｓｄｏｒｆ，Ｒｈｅｉｎｈｏｌｄ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９４９）から入手可能である。任意選択的に、凍結乾燥中に酸素含有量を低減することができる（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ．１９：２１９）。
【0248】
様々な容物が乾燥に適している。容物が部分真空下で密封および保存される場合、該容物は外圧に耐えることができなければならない。容物は、外部から内部への適切な熱伝達を可能にする材料で作製されるべきである。容物のサイズは、オーバーフローを回避するために、乾燥される溶液が全容積の２０％以下を占めるようであると好ましい。
【0249】
試料は、別々の容器または多検体用容器で乾燥させることができる。多検体用容器は、少なくとも２つの検体が同時ではあるが別々に保存および操作され得るようにそれらを含むことができる連続した容器を意味する。多検体用レセプタクルの標準フォーマットは、６、２４、９６、３８４または１５３６個のウェルを含む。９６ウェルフォーマットの例における各ウェルの容積は約３００～４００マイクロリットルであり、作業容積は約７５～２００マイクロリットルである。容積は、一般的に、典型的には各ウェルにつき１ｎＬ～１０ｍＬの範囲で、ウェルの数に反比例して変動するが、他のサイズもまた企図される。例示的なウェルは、特に、平底、丸底、またはＶ字底を有することができる。本明細書で使用される場合、容器はウェルとも称される。本明細書で使用される場合、多検体用容器はマルチウェルプレートとも称される。加えて、ウェルはさらに反応ウェルと称されることもある。反応ウェルという用語は、反応ウェル内でいずれかの反応が実際に起こることを必要としない。むしろ、この用語は、試薬を含み、その中で反応が起こり得ない、その中で部分的な反応が起こり得る、またはその中で完全な反応が起こり得る、容器またはウェルを指すために使用される。
【0250】
本明細書のいくつかの実施形態において、マルチウェルプレートは、水溶液から乾燥組成物を形成するために凍結乾燥を経ることができる。凍結乾燥は、入れ子状デバイスにおいて行われ得る（同時係属米国特許出願第６２／２００，３７０号を参照のこと）。入れ子は、密封された凍結乾燥チャンバーの外から操作可能な機構によって閉鎖することができる通気口を備えたカートリッジ用の容物である。マルチウェルプレートを含む入れ子は、１つ以上の通気口が開放位置にある状態で凍結乾燥チャンバー内に配置される。次いで、チャンバーが密封され、入れ子内の空間を含むチャンバー全体に凍結乾燥雰囲気が適用される。次いで、１つ以上の通気口が閉鎖され、それによって入れ子が密封される。凍結乾燥チャンバーのシールが後に解放され、マルチウェルプレートを含む入れ子が取り出される。次いで、入れ子を再配置し、操作者がその中に配置された凍結乾燥組成物を使用する、またはさらなる保存もしくは販売のために凍結乾燥検体を含むマルチウェルプレートを再密封する準備ができるまで、マルチウェルプレートをその中に配置して保存することができる。次いで、マルチウェルプレートのウェルを密封して、周囲空気から水分が侵入するのを実質的に防ぐことができる。密封されたマルチウェルプレート内への少量の水分の侵入は、乾燥剤の入ったパウチ内に密封したマルチウェルプレートを保存することによって防止することができる。同様に、別々の容器に凍結乾燥を行うこともでき、入れ子で凍結乾燥を行うことができる。
【0251】
他の乾燥方法は、噴霧乾燥、流動床乾燥、除湿機、および真空下、低温で濾過ケーキを乾燥させて自由流動性の乾燥生成物にするバッチ式接触乾燥を含む（ＮＰ Ｃｈｅｒｅｍｉｓｉｎｏｆｆ（２０００）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）。除湿機は、Ｂｒｙ Ａｉｒ，Ｉｎｃ．（Ｓｕｎｂｕｒｙ，Ｏｈｉｏ）およびＤＳＴ Ｓｅｉｂｕ Ｇｉｋｅｎ（Ｗｙｏｍｉｓｓｉｎｇ，ＰＡ）から入手可能である。回転乾燥機、円錐乾燥機、および棚乾燥機が利用可能である（ＭｃＧｉｌｌ ＡｉｒＰｒｅｓｓｕｒｅ ＬＬＣ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，Ｏｈｉｏ）。一実施形態において、真空乾燥機は、材料を減圧に曝露することによって水分を除去し、気化によって失われた熱を補うのにちょうど十分な熱が用いられる。乾燥剤は、シリカゲル乾燥剤、アルミノケイ酸塩および合成ゼオライト等の分子ふるい乾燥剤、ならびにベントナイト乾燥剤を含む。
【0252】
反応混合物は、使用のためにそれらが再構成される容器と同じ容器内で乾燥させることが好ましい。
【0253】
凍結乾燥または別様に乾燥した製剤は、例えば、５重量％未満、４重量％未満、３重量％未満、２重量％未満、１．０重量％未満、０．５重量％未満、０．２重量％未満、０．１重量％未満、０．０５重量％未満、０．０２重量％未満、０．０１重量％未満等の低含水量を有する。
【0254】
ＩＶ．保存
凍結乾燥または別様に乾燥した組成物は、使用前に保存される。保存期間は、乾燥組成物が周囲空気に曝露されて室温で保存される期間を含み得る。そのような期間は、最大３時間、または代替として、最大１．０時間、最大１．５時間、最大２．０時間、最大２．５時間、または１分～１８０分、もしくは１分～１００分、もしくは１分～６０分、もしくは１分～３０分、もしくは１分～２０分、もしくは１分～１０分１８０等の任意の時間の範囲であり得る。そのような保存中の絶対湿度は、３０°Ｃで１立方メートルの空気当たり少なくとも２．３ｇの水、または代替として、３０°Ｃで１立方メートルの空気当たり１．８、２．０、２．２、２．４、２．６、２．８、３．０グラムを超える水である。
凍結乾燥または別様に乾燥した組成物は、使用前に保存される。保存期間は、乾燥組成物が周囲空気に曝露されて室温で保存される期間を含み得る。そのような期間は、最大３時間、または代替として、最大１．０時間、最大１．５時間、最大２．０時間、最大２．５時間、または１分～１８０分、もしくは１分～１００分、もしくは１分～６０分、もしくは１分～３０分、もしくは１分～２０分、もしくは１分～１０分１８０等の任意の時間の範囲であり得る。そのような保存中の絶対湿度は、３０°Ｃで１立方メートルの空気当たり少なくとも２．３ｇの水、または代替として、３０°Ｃで１立方メートルの空気当たり１．８、２．０、２．２、２．４、２．６、２．８、３．０グラムを超える水である。
【0255】
保存は、乾燥組成物が密封され、シール外部の周囲空気との接触を実質的に防止するより長い期間も含み得る。この保存期間は、長期間、例えば、少なくとも１週間、少なくとも１か月、少なくとも６か月、少なくとも１年、または少なくとも２年であり得る。１か月～２年までの期間が例示的である。
【0256】
長期保存のため、または長期もしくは短期安定性試験のための保存温度の範囲は、例えば、０～２℃、０～４℃、２～４℃、２～６℃、２０℃、２５°Ｃ、３０°Ｃ、４０°Ｃ、５０°Ｃ、６０°Ｃ、および液体窒素下－４～－２°Ｃ、－６～－２°Ｃ、－８～－２°Ｃ、－１０～－２°Ｃ、－２０°Ｃ、－４０°Ｃ、－６０°Ｃ、－８０°Ｃ等の０℃を下回る温度を含む。好ましくは、保存は氷点より高く、約４～８℃の範囲内である。加速劣化試験は、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約４０℃で、例えば、１時間、２時間、４時間、２４時間、２日、４日、８日、１か月等の期間実施することができる。保存のため、または代替として、安定性試験のための条件は、氷点を上回る温度から氷点を下回る温度まで変動する条件等の、温度が変動する条件であり得る。
【0257】
無機塩が本質的に存在しないことにより、乾燥前のバルク試薬の保存中、密封前の乾燥組成物の短期保存中、および密封後の長期保存中の酵素活性の喪失および副産物の形成を低減する。好ましくは、全ての保存後の酵素活性は、保存を開始する直前の値の少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、および保存を開始する前の値の、または代替として、最適条件下で保存された比較試料の値に対する、これらのパーセンテージを境界とする範囲である。
【0258】
Ｖ．再構成
好ましい再構成溶液は、水中に約３．０～約１２．０ｍＭのＭｇＣｌ２、および約０～約８０ｍＭのＫＣｌを提供する。再構成溶液はまた、他の成分の中でも、約０．０１２～約０．０２０％（ｗ／ｖ）のメチルパラベン、約０．００６～約０．０１０％（ｗ／ｖ）のプロピルパラベン、および／または約０．２５～約０．３５％（ｖ／ｖ）の無水エタノールも含むことができる。
好ましい再構成溶液は、水中に約３．０～約１２．０ｍＭのＭｇＣｌ２、および約０～約８０ｍＭのＫＣｌを提供する。再構成溶液はまた、他の成分の中でも、約０．０１２～約０．０２０％（ｗ／ｖ）のメチルパラベン、約０．００６～約０．０１０％（ｗ／ｖ）のプロピルパラベン、および／または約０．２５～約０．３５％（ｖ／ｖ）の無水エタノールも含むことができる。
【0259】
再構成時間は、乾燥組成物の意図する用途に適した水溶液を乾燥組成物と接触させた後、１秒未満、２秒未満、５秒未満、１０秒未満、１５秒未満、２０秒未満、５０秒未満、または６０秒（１分）であってもよく、振盪、タッピング、ボルテックス、揺動、ピペットチップからの吸い上げおよび吸い出し、または柔軟性バイアルの折り畳みもしくは圧搾のいずれかによって任意選択的に接触を促進する。例示的な再構成時間は２～１０秒である。再構成時間は、冷蔵庫温度（約４℃）、約２３℃の周囲温度溶液、または約３７℃の温溶液のいずれかの再構成溶液で測定することができる。典型的には、乾燥組成物は冷蔵庫から取り出されるため、再構成溶液の添加前は冷たい。これらの手順のいずれについても、環境（部屋）は、典型的には周囲温度または約２３℃である。物質が再構成されたと判断される時間は、例えば、物質が完全に可溶化したと判断される時間であり得る。完全な可溶化は目視検査によって決定することができ、例えば、濁りの欠如またはシュリーレンパターンの欠如が完全な可溶化の尺度である。代替として、完全な可溶化は、光散乱を測定する機械等の光学機器によって決定することができる。
【0260】
ＶＩ．組成物の安定性
組成物の安定性は、典型的には、乾燥生成物の再構成後に、活性（すなわち、検出の速度または収率）または組成物中で生じた副産物の形成を決定することにより評価される。安定性の欠如は、乾燥前または乾燥後のいずれかの保存中の活性の喪失または副産物の形成から起こり得る。活性または副産物の形成は、絶対的または相対的な尺度であり得る。相対的である場合、比較のためのベースラインは、乾燥および再構成前のバルク試薬混合物、または定義された方法で試験されるものとは異なる対照再構成混合物であり得る（Ｍｇ２＋または他の塩の存在）。活性は、リアルタイムの切断もしくは増幅の割合、または切断もしくは増幅産物の最終収量、またはヒット率によって評価することができる。副産物は、ゲル電気泳動、ゲルスキャナー、アガロースゲル、キャピラリー電気泳動等のうちの１つ以上によってアッセイすることができる。
組成物の安定性は、典型的には、乾燥生成物の再構成後に、活性（すなわち、検出の速度または収率）または組成物中で生じた副産物の形成を決定することにより評価される。安定性の欠如は、乾燥前または乾燥後のいずれかの保存中の活性の喪失または副産物の形成から起こり得る。活性または副産物の形成は、絶対的または相対的な尺度であり得る。相対的である場合、比較のためのベースラインは、乾燥および再構成前のバルク試薬混合物、または定義された方法で試験されるものとは異なる対照再構成混合物であり得る（Ｍｇ２＋または他の塩の存在）。活性は、リアルタイムの切断もしくは増幅の割合、または切断もしくは増幅産物の最終収量、またはヒット率によって評価することができる。副産物は、ゲル電気泳動、ゲルスキャナー、アガロースゲル、キャピラリー電気泳動等のうちの１つ以上によってアッセイすることができる。
【0261】
再構成された増幅混合物の活性（再構成物の異なる体積に起因する任意の差異について必要に応じて補正される）は、乾燥前のバルク試薬の７５、８０、８５、９０、もしくは９５％以内であるか、または乾燥前のバルク試薬の活性と実験誤差内では区別できないことが好ましい。再構成された増幅混合物内に存在する副産物（再構成物の異なる体積に起因する任意の差異について必要に応じて補正される）は、乾燥前のバルク試薬中に存在する元の化合物の２０、１５、１０、５、４、３、２、もしくは１重量％未満であるか、またはその平均モル数である。副産物が検出限界を下回る場合がある。
【0262】
ＶＩＩ．キット
上記の乾燥組成物は、キットにおいて提供され得る。そのようなキットは、試験管等の容器内に乾燥組成物を含むことができる。いくつかの実施形態において、キットは、１つ以上のウェルを含むマルチウェルプレートを含む。いくつかのキットは、別々の容器で供給される複数の乾燥組成物を含む。いくつかのキットは、マルチウォールマルチウェルプレートの１つ以上の密封されたウェル部材に複数の乾燥組成物を含む１つ以上のマルチウェルプレートを含む。
上記の乾燥組成物は、キットにおいて提供され得る。そのようなキットは、試験管等の容器内に乾燥組成物を含むことができる。いくつかの実施形態において、キットは、１つ以上のウェルを含むマルチウェルプレートを含む。いくつかのキットは、別々の容器で供給される複数の乾燥組成物を含む。いくつかのキットは、マルチウォールマルチウェルプレートの１つ以上の密封されたウェル部材に複数の乾燥組成物を含む１つ以上のマルチウェルプレートを含む。
【0263】
いくつかのキットはまた、乾燥組成物とは別の容器に再構成溶液を含む。再構成溶液は、個々の乾燥組成物容器にアリコートを分注するためにバルクで提供され得るか、または乾燥組成物を含む単一の容器と各々組み合わせるために１つ以上の単位投与量の形態で提供され得る。
【0264】
任意選択的に、乾燥組成物を含む容器および再構成溶液を含む容器は、脆性材料によって分離することができる。脆性材料は、アルミ箔、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリエチレンであり得る。バリアは、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の層を含むことができ、各層は同じ組成を有するか、または各層はＰＶＣ層に接触した箔層等の異なる組成を有する。フィルムは、例えば、Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ）またはＡｒｋｅｍａ，Ｉｎｃ．（Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ）から調達することができる。脆性材料に穿孔することにより、再構成溶液を凍結乾燥組成物と接触させることができる。
【0265】
キットは、サーモサイクラーまたはインキュベーターに適合するように設計することができるため、酵素反応がキットのコンパートメント内で直接起こり、組成物を異なる反応容器またはそのような容器を保持する容物に移す必要が回避される。
【0266】
キットは、例えば、ポート、ホース、セプタムに穴を開けるシリンジによって、ユーザーから供給される試薬のキット内の容器への導入に適合させることができるか（ＵＳ２０１４／０１２１５１５およびＵＳ２０１４／０２７６３５６を参照）、または代替として、核酸テンプレート等のユーザーから供給される試薬をユーザーから供給される容物の中で本開示の試薬と混合することができる。キットのコンパートメントのうちの１つ以上は、空の状態で供給され、混合チャンバーとして使用され得る。
【0267】
ＶＩＩＩ．フラップエンドヌクレアーゼの透析
本開示で使用されるいくつかの酵素は、グリセロールを含む緩衝液中で製造される。グリセロール含量は、凍結乾燥を妨げ得るしたがって、グリセロールを含まない緩衝液に酵素を透析することにより、グリセロールを含まない酵素溶液を含み、かつ無機塩を実質的に含まない溶液を調製する必要がある。この透析は、グリセロールを実質的に除去し、それを緩衝液と置き換えるために使用することができる。次いで、無機塩を実質的に含まない、グリセロールを含まない凍結乾燥製剤を調製するために透析された酵素を使用することができる。したがって、本明細書には、有機緩衝液、増量剤、塩化物イオン、およびキレート剤を含む水溶液を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる透析組成物も開示される。増量剤はトレハロースであり得る。増量剤は、約１００ｍＭ～３００ｍＭ、好適には２００ｍＭの濃度で存在し得る。有機緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）緩衝液であり得る。トリス緩衝液は、１０ｍＭ～３０ｍＭの濃度で、好適には５０ｍＭの濃度で存在し得る。塩化物イオンはＫＣｌである。塩化物イオンは、約４０～６０ｍＭ、好適には５０ｍＭの濃度で存在し得る。キレート剤はＥＤＴＡであり得る。キレート剤は、０．０５～０．２ｍＭ、好適には０．１ｍＭの濃度で水溶液中に存在し得る。透析組成物は、フラップエンドヌクレアーゼを含むことができる。
本開示で使用されるいくつかの酵素は、グリセロールを含む緩衝液中で製造される。グリセロール含量は、凍結乾燥を妨げ得るしたがって、グリセロールを含まない緩衝液に酵素を透析することにより、グリセロールを含まない酵素溶液を含み、かつ無機塩を実質的に含まない溶液を調製する必要がある。この透析は、グリセロールを実質的に除去し、それを緩衝液と置き換えるために使用することができる。次いで、無機塩を実質的に含まない、グリセロールを含まない凍結乾燥製剤を調製するために透析された酵素を使用することができる。したがって、本明細書には、有機緩衝液、増量剤、塩化物イオン、およびキレート剤を含む水溶液を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる透析組成物も開示される。増量剤はトレハロースであり得る。増量剤は、約１００ｍＭ～３００ｍＭ、好適には２００ｍＭの濃度で存在し得る。有機緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）緩衝液であり得る。トリス緩衝液は、１０ｍＭ～３０ｍＭの濃度で、好適には５０ｍＭの濃度で存在し得る。塩化物イオンはＫＣｌである。塩化物イオンは、約４０～６０ｍＭ、好適には５０ｍＭの濃度で存在し得る。キレート剤はＥＤＴＡであり得る。キレート剤は、０．０５～０．２ｍＭ、好適には０．１ｍＭの濃度で水溶液中に存在し得る。透析組成物は、フラップエンドヌクレアーゼを含むことができる。
【0268】
例示的な透析組成物は、トリス緩衝液（ｐＨ８．０）、トレハロース、ＫＣｌおよびＥＤＴＡを含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる水溶液である。
【0269】
別の例示的な透析組成物は、約２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８．０）、約２００ｍＭのトレハロース、約５０ｍＭのＫＣｌ、および約０．１ｍＭのＥＤＴＡを含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる水溶液である。
【0270】
また、グリセロールを実質的に含まないフラップエンドヌクレアーゼ組成物を得るために、フラップエンドヌクレアーゼおよびグリセロールが透析される、グリセロールを実質的に含まないフラップエンドヌクレアーゼ組成物を調製するための方法も開示される。好適には、グリセロールは、約０～約０．３５％（ｗ／ｖ）のグリセロール、好適には、約０～約０．２％（ｗ／ｖ）のグリセロール、好適には、約０．１％（ｗ／ｖ）のグリセロール、好適には、約０．０１％（ｗ／ｖ）のグリセロールの量で存在する。
【実施例0271】
実施例１．バルク試薬
【0272】
実施例１～３は、バルク試薬を作製すること、単一単位用量（ＳＵＤ）体積のバルク試薬を乾燥させて容器内にＳＵＤ乾燥ペレットを得ること、ならびに乾燥ペレットを再構成してＳＵＤ増幅および検出混合物を得ることを示す。表１および表２は、例示的な乾燥用バルク試薬の成分を開示している。２つの表はまた、例示的な単一単位用量濃度も開示している。マスターミックス１は、０．４ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰの各々、０．８ｍＭのｄＵＴＰ、ＢＳＡを含み、無機塩を実質的に含まない２Ｘマスターミックスであった。表１のＴａｑポリメラーゼは、陽イオン性界面活性剤を含む、グリセロールを含まないトリス緩衝液中に存在していた。２Ｘマスターミックス２は、０．４ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、０．８ｍＭのｄＵＴＰ、トリスおよび非アセチル化ＢＳＡを含む独自の緩衝液中の０．７４Ｕ／ｕＬのＧｏＴａｑ（登録商標）ＭＤｘ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（グリセロール不含）、０．４８Ｍのトレハロースである。５０Ｘ ＧｏＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍｉｘは以下の通りである：表２の２０Ｕ／μＬＧｏＳｃｒｉｐｔ（登録商標）、８単位／μＬのＲＮａｓｉｎ（登録商標）Ｐｌｕｓ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、表１の１０Ｕ／μｌのＧｏＳｃｒｉｐｔ（登録商標）、８単位／μＬのＲＮａｓｉｎ ＴＭ Ｐｌｕｓ。
【0273】
ＧｏＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ Ｃｕｓｔｏｍは、１６０Ｕ／ｕＬのＧｏＳｃｒｉｐｔ ＲＴの濃縮溶液であり、グリセロールを含まず、ＲＮａｓｅ阻害剤を含まない。含まれ得る安定剤：脱アミド化抑制剤、酸化防止剤、界面活性剤、および表面活性剤、例えば、ポリエトキシル化ソルビタンの脂肪酸エステル等の界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０）、およびポロキサマー１８８。
【表1】
【表2-1】
【表2-2】
【表3】
【0274】
表１～３のバルク増幅試薬の各々における１０Ｘオリゴヌクレオチド混合物は、以下の実施例で増幅および検出反応を行うための一群のプライマーおよびプローブを含んでいた。当業者は、増幅反応用のプライマー／プローブミックスの調製方法を理解するであろう（例えば、Ｉｎｎｉｓ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ａ．ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）を参照）。以下の実施例では、プライマーおよびプローブは、約８ｕＭ～約１２ｕＭの濃度でバルク試薬中に存在していた。
【0275】
実施例２凍結乾燥
この実施例では、凍結乾燥機を使用してバルク反応混合物を乾燥させた。実施例１に概説される２４マイクロリットルのバルク増幅試薬を容器に添加し、次いで、凍結乾燥チャンバーに装填した。本明細書の実施例の場合、２４ｕｌは、単一試料に対して増幅および検出反応を行うために使用されるバルク試薬の量を表す（単一単位用量またはＳＵＤとも称される）。この実施例では、マルチウェルプレート（特に１２ウェルプレート）を、凍結乾燥反応と、マルチウェルプレートのウェル内に存在する凍結乾燥（乾燥）ペレットの保存の両方に使用した。１２ウェルプレートの１２個のウェルの各々に、バルク反応混合物の２４ｕｌアリコートを入れた。凍結乾燥サイクルを開始した（約３６時間実行）。凍結乾燥サイクル後、１２ウェルプレートを回収し、１２ウェルプレートの個々の容器が密封される場所に移した。容器は、容器開口部を覆う金属箔で密封した。金属箔は低水蒸気透過性箔であった。次いで、密封された１２ウェルプレートを乾燥剤とともに袋に入れた。
この実施例では、凍結乾燥機を使用してバルク反応混合物を乾燥させた。実施例１に概説される２４マイクロリットルのバルク増幅試薬を容器に添加し、次いで、凍結乾燥チャンバーに装填した。本明細書の実施例の場合、２４ｕｌは、単一試料に対して増幅および検出反応を行うために使用されるバルク試薬の量を表す（単一単位用量またはＳＵＤとも称される）。この実施例では、マルチウェルプレート（特に１２ウェルプレート）を、凍結乾燥反応と、マルチウェルプレートのウェル内に存在する凍結乾燥（乾燥）ペレットの保存の両方に使用した。１２ウェルプレートの１２個のウェルの各々に、バルク反応混合物の２４ｕｌアリコートを入れた。凍結乾燥サイクルを開始した（約３６時間実行）。凍結乾燥サイクル後、１２ウェルプレートを回収し、１２ウェルプレートの個々の容器が密封される場所に移した。容器は、容器開口部を覆う金属箔で密封した。金属箔は低水蒸気透過性箔であった。次いで、密封された１２ウェルプレートを乾燥剤とともに袋に入れた。
【0276】
実施例３再構成溶液
この実施例は、１つの再構成溶液について説明する。再構成溶液の目的は、再構成されたペレットを使用して試料に対する核酸ベースの検出反応を行うために、調製において乾燥ペレットを再水和することである。実施例２からの１２ウェルプレートの１２ウェルの各々に、ウェル上の箔カバーに事前に穿孔し、次いで再構成溶液をウェルに分注することにより２４ｕｌの再構成溶液を分注した。表４は、これらの実施例で使用される再構成溶液を開示しており、バルク再構成溶液濃度および最終アッセイ濃度の両方を提供する。乾燥ペレットの再構成後、試料からの標的核酸をウェルに添加し、ＰＣＲ増幅および検出反応を行った。
この実施例は、１つの再構成溶液について説明する。再構成溶液の目的は、再構成されたペレットを使用して試料に対する核酸ベースの検出反応を行うために、調製において乾燥ペレットを再水和することである。実施例２からの１２ウェルプレートの１２ウェルの各々に、ウェル上の箔カバーに事前に穿孔し、次いで再構成溶液をウェルに分注することにより２４ｕｌの再構成溶液を分注した。表４は、これらの実施例で使用される再構成溶液を開示しており、バルク再構成溶液濃度および最終アッセイ濃度の両方を提供する。乾燥ペレットの再構成後、試料からの標的核酸をウェルに添加し、ＰＣＲ増幅および検出反応を行った。
【表4】
【0277】
実施例４乾燥バルク試薬に対する無機塩の悪影響
この実施例は、バルク試薬中の無機塩の存在が乾燥ペレットに与える悪影響について説明する。実施例１および表５に概ねしたがって、２つのバルク試薬混合物を調製した。表５のバルク試薬Ａとバルク試薬Ｂとの違いは、反応混合物中のＭｇＣｌ２の存在または非存在であった。
この実施例は、バルク試薬中の無機塩の存在が乾燥ペレットに与える悪影響について説明する。実施例１および表５に概ねしたがって、２つのバルク試薬混合物を調製した。表５のバルク試薬Ａとバルク試薬Ｂとの違いは、反応混合物中のＭｇＣｌ２の存在または非存在であった。
【表5】
【0278】
液体バルク試薬ＡおよびＢの各々を氷上で調製した。次いで、バルク試薬ＡおよびＢを、各々別々にいくつかのマルチウェルプレートのウェルにアリコートした（具体的には、この場合１２ウェルプレートを使用した）。バルク試薬Ａの１２アリコートまたはバルク試薬Ｂの１２アリコートのいずれかを含むこれらの１２ウェルプレートを、次いで、４つの異なるインキュベーション条件に分けた：（１）氷上で９０分間のインキュベーション、（２）室温で９０分間のインキュベーション、（３）氷上で１８０分間のインキュベーション、または（４）室温で１８０分間のインキュベーション。したがって、各バルク試薬混合物の一部を室温で１８０分間インキュベートし、他の部分を氷上で１８０分間インキュベートした。同様に、各バルク試薬混合物の一部を室温で９０分間インキュベートし、他の部分を氷上で９０分間インキュベートした。全ての場合において、反応混合物への核酸成分の添加（最終成分として添加）がインキュベーション時間の開始を意味していた。
【0279】
インキュベーション時間の後、実質的に乾燥した組成物が得られるまで、１２ウェルプレートにアリコートしたバルク試薬を凍結乾燥した。１２ウェルプレートのウェルに得られた乾燥組成物の各々は、試料中のＡ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、および呼吸器合胞体ウイルスＢのうちの１つ以上を同定するための三重増幅および検出反応の乾燥単一単位用量を表していた。
【0280】
乾燥組成物を、６５ｍＭのＫＣｌ、それぞれ０．０２％ｗ／ｖおよび０．０１％ｗ／ｖのメチルおよびプロピルパラベン、ならびに０．３３％ｖ／ｖの無水エチルアルコールを含む再構成溶液で再構成した。バルク試薬Ａから作製された乾燥組成物の再構成溶液も２．５ｍＭのＭｇＣｌ２を含んでいた。
【0281】
Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、および呼吸器合胞体ウイルスＢ陽性試料の３つ全てを、それらのＬｏＤの３倍で再構成反応混合物と組み合わせ、再構成された混合物の全ての成分がバルク試薬濃度の約８０％になるようにした。これらの陽性試料は、陰性血漿中で抽出したウイルスを輸送媒体と組み合わせ、（ＲＳＶＢ試料の連続希釈が１０倍異なっていたことを除いて）所望の濃度まで連続希釈したものである。表６に示すように、プライマーおよびプローブミックスは、単一の分子反応にもかかわらず、別々の蛍光チャネルにおいて３つのウイルス標的、すなわち、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、および呼吸器合胞体ウイルスＢの各々を特異的に検出するように設計された。
【0282】
リアルタイムＰＣＲ互換性サーマルサイクラー（ＡＢＩ ７５００ＦＡＳＴ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して試料をアッセイした。結果を表６に示す。表中の陽性パーセント値は、閾値を超えたＲＦＵ値を有する試料の数を、試験した１２個の試料のパーセンテージとして表している。ウイルスの量（アッセイ当たりのウイルス粒子）は、陽性対照と比較して少なくとも９５％陽性をもたらすのに十分な量であった。
【表6】
【0283】
これらの結果は、バルク試薬（ＭｇＣｌ２およびＫＣｌを含まない凍結乾燥前溶液）が室温で少なくとも１８０分間安定であることを示している。バルク試薬Ａからの乾燥ＳＵＤペレットは、再構成して試料と組み合わせると、バルク試薬Ｂからの乾燥ＳＵＤペレットよりもロバストな増幅および検出反応をもたらした。バルク試薬Ｂは、室温でまたはさらには氷上で９０分間という短時間インキュベートし、次いで乾燥し、再構成して増幅反応混合物を生成すると、同じ条件下のバルク試薬Ａと比較して比較的低いシグナルおよび多数の小さな副産物を伴う増幅反応をもたらした。無機塩をほとんどまたはまったく含まないバルク試薬は、乾燥させて、ポリメラーゼ酵素成分、ｄＮＴＰ、および核酸を含む増幅反応のための成分を含む乾燥組成物を生成するのに有用である。
【0284】
実施例５塩を含むまたは含まない乾燥ペレットの安定性
この実施例は、塩を含む単一単位用量の乾燥ペレットと、塩を含まない単一単位用量の乾燥ペレット（６ｍＭ未満の無機塩）の安定性を比較する。単一単位用量ペレットは、上記の表５に概説されるように、バルク試薬を乾燥させることによって作製した。合成直後に、バルク試薬Ａとバルク試薬Ｂを各々別々のマルチウェル反応プレート（１２ウェル）にアリコートし、凍結乾燥機を使用して乾燥させた。凍結乾燥後、乾燥ペレットを含むマルチウェルプレートを相対湿度約５％の窒素ガス環境に配置し、ウェル開口部を箔で覆うことによりマルチウェルプレートを密封した。乾燥剤を含むアルミニウムのパウチに密封されたプレートを入れ、次いでパウチを密封した。マルチウェルプレート中に乾燥ペレットを含む密封パウチを４℃で８日間保存した。
この実施例は、塩を含む単一単位用量の乾燥ペレットと、塩を含まない単一単位用量の乾燥ペレット（６ｍＭ未満の無機塩）の安定性を比較する。単一単位用量ペレットは、上記の表５に概説されるように、バルク試薬を乾燥させることによって作製した。合成直後に、バルク試薬Ａとバルク試薬Ｂを各々別々のマルチウェル反応プレート（１２ウェル）にアリコートし、凍結乾燥機を使用して乾燥させた。凍結乾燥後、乾燥ペレットを含むマルチウェルプレートを相対湿度約５％の窒素ガス環境に配置し、ウェル開口部を箔で覆うことによりマルチウェルプレートを密封した。乾燥剤を含むアルミニウムのパウチに密封されたプレートを入れ、次いでパウチを密封した。マルチウェルプレート中に乾燥ペレットを含む密封パウチを４℃で８日間保存した。
【0285】
８日後に、パウチに入ったマルチウェルプレートを以下の３つの条件のうちの１つに移した：条件１．バルク試薬Ａからの乾燥ペレットを含むパウチに入ったマルチウェルプレートの１つのサブセットと、バルク試薬Ｂからの乾燥ペレットを含むパウチに入ったマルチウェルプレートの１つのサブセットをパウチから取り出し、相対湿度７０％の１５℃の環境に配置した。条件２．バルク試薬Ａからの乾燥ペレットを含むパウチに入ったマルチウェルプレートの１つのサブセットと、バルク試薬Ｂからの乾燥ペレットを含むパウチに入ったマルチウェルプレートの１つのサブセットをパウチから取り出し、相対湿度１５％の４５℃の環境に配置した（加速安定性）。条件３．バルク試薬Ａからの乾燥ペレットを含むパウチに入ったマルチウェルプレートの１つのサブセットと、バルク試薬Ｂからの乾燥ペレットを含むパウチに入ったマルチウェルプレートの１つのサブセットを４°Ｃに配置した（マルチウェルプレートは、乾燥剤とともにパウチの中にあり、したがって湿度は０パーセントであった）。プレートをこれらの条件でさらに３０日間放置した。
【0286】
インキュベーション終了時に、各条件からの乾燥ペレットを、１００ｍＭのＫＣｌおよび最終濃度２．５ｍＭに十分なＭｇＣｌ２を含む再構成溶液を使用して再構成した。リアルタイムＰＣＲサーマルサイクラー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７０００、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、再構成反応混合物をＡ型インフルエンザ標的の増幅および検出について試験した。端的に述べると、Ａ型インフルエンザ標的を、陰性プール中で同等の液体対照とともにＬＯＤ１０＾０（＋／－１ｌｏｇ）で抽出した。結果を表７に示す。
【表7】
【0287】
これらの結果は、２．５ｍＭ未満の無機塩を含む単一の増幅反応乾燥ペレットが、２．５ｍＭ以上の無機塩を含む単一の増幅反応乾燥ペレットと比較して、いくつかの異なる温度および湿度条件で保存した後により高いＲＦＵ値を有することを示している。
【0288】
実施例６バルク試薬を含むＣｌｅａｖａｓｅ（登録商標）酵素の凍結乾燥
フラップエンドヌクレアーゼＣｌｅａｖａｓｅ（登録商標）を含むバルク試薬を、０．３５％の最終グリセロール濃度を含むように作製した。このバルク試薬をアリコートし、上記に概説したように凍結乾燥した。データは、このレベルのグリセロール含量が、「メルトバック」と称されるものを引き起こすことによってＳＵＤペレットの凍結乾燥を妨げることを示した（データは提示されていない）。メルトバックは、凍結乾燥生成物の崩壊を一般的に指す。メルトバックは、典型的には、一次乾燥段階中にある物質の存在から生じ、該物質はロバストな凍結乾燥組成物の形成に有害である。グリセロールはそのような物質の１つである。したがって、２０ｋＤａ ＭＷＣＯ Ｓｌｙｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒカセットシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｐ／Ｎ番号６６００５）を使用してＣｌｅａｖａｓｅ（登録商標）酵素（５０％グリセロール緩衝液に保存）をグリセロールを含まない緩衝液に透析することにより、グリセロールを含まないＣｌｅａｖａｓｅ（登録商標）を含み、無機塩を実質的に含まない溶液を調製した。透析緩衝液の組成を表８に列挙する。
フラップエンドヌクレアーゼＣｌｅａｖａｓｅ（登録商標）を含むバルク試薬を、０．３５％の最終グリセロール濃度を含むように作製した。このバルク試薬をアリコートし、上記に概説したように凍結乾燥した。データは、このレベルのグリセロール含量が、「メルトバック」と称されるものを引き起こすことによってＳＵＤペレットの凍結乾燥を妨げることを示した（データは提示されていない）。メルトバックは、凍結乾燥生成物の崩壊を一般的に指す。メルトバックは、典型的には、一次乾燥段階中にある物質の存在から生じ、該物質はロバストな凍結乾燥組成物の形成に有害である。グリセロールはそのような物質の１つである。したがって、２０ｋＤａ ＭＷＣＯ Ｓｌｙｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒカセットシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｐ／Ｎ番号６６００５）を使用してＣｌｅａｖａｓｅ（登録商標）酵素（５０％グリセロール緩衝液に保存）をグリセロールを含まない緩衝液に透析することにより、グリセロールを含まないＣｌｅａｖａｓｅ（登録商標）を含み、無機塩を実質的に含まない溶液を調製した。透析緩衝液の組成を表８に列挙する。
【表8】
【0289】
この緩衝液中にＣｌｅａｖａｓｅ（登録商標）酵素を透析することによりグリセロールを除去し、表８に示す緩衝液と置き換えた。次いで、透析されたＣｌｅａｖａｓｅ（登録商標）酵素を使用して、無機塩を実質的に含まないグリセロールを含まないバルク試薬を調製した（表９）。次いで、バルク試薬をいくつかのＳＵＤとしてマルチウェルプレートのウェルにアリコートし、凍結乾燥した。全てのＳＵＤペレットは、メルトバックの兆候を示すことなく凍結乾燥された。
【表9】
【0290】
ＰＣＲ増幅および黄色ブドウ球菌（「Ｓ．ａｕｒｅｕｓ」）の切断に基づくアッセイ検出のためのオリゴヌクレオチドを含む乾燥組成物を再構成溶液で再水和し（９．３７５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０２％（ｗ／ｖ）のメチルパラベン、０．０１％（ｗ／ｖ）のプロピルパラベン、０．３３％（ｖ／ｖ）を含むストック再構成溶液を、水を使用して１リットルの総体積にした）、複数の反応マスターミックスを生成した。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ標的ＤＮＡ（陽性）またはヌクレアーゼを含まない水（陰性）を別々の再構成されたマスターミックスに添加し、シリコーンオイルを付けた。増幅および検出アッセイは、Ｐａｎｔｈｅｒ Ｆｕｓｉｏｎサーモサイクラーを使用して行った。対照として凍結乾燥製剤と並行して、非凍結乾燥バルク試薬を試験した。
【0291】
以下の表１０の結果は、この試験において増幅および検出システムが、３つ全てのチャネルで陽性としてＳ．ａｕｒｅｕｓ陽性試料を、また３つ全てのチャネルで陰性として陰性試料を正常に増幅および検出できたこと、ならびに湿潤混合物対照と比較して匹敵する値を有していたことを示している。
【表10】
【0292】
実施例７Ｃｌｅａｖａｓｅ（登録商標）凍結乾燥前製剤バージョン３
超高純度非アセチル化ＢＳＡ、およびＭＯＰＳ緩衝液からトリス緩衝液への緩衝液変更を含む、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ凍結乾燥前製剤の変更版を作製した（表１１）。
超高純度非アセチル化ＢＳＡ、およびＭＯＰＳ緩衝液からトリス緩衝液への緩衝液変更を含む、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ凍結乾燥前製剤の変更版を作製した（表１１）。
【表11】
【0293】
Ｐｒｏｍｅｇａ Ｘ９９１Ｘは、２Ｘマスターミックスとして配合され、１：１で希釈すると、２５ｕｌの反応混合物中に０．２４Ｍトレハロース、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ（０．４ｍＭ ｄＵＴＰ）、および９．２５Ｕ ＧｏＴａｑ、ならびに非アセチル化ＢＳＡおよびトリスを含む反応混合物が得られるこの製剤から合計２５個のカートリッジを調製し、凍結乾燥することに成功した。
【0294】
増幅および検出反応物を調製し、上記実施例６で概説したように行った。ＭｇＣｌ２の濃度を増加させて再構成反応混合物中に１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２をもたらしたことを除いて、実施例６に記載されるものと類似した再構成溶液を使用して凍結乾燥ペレットを再構成した。対照として、いくつかの非凍結乾燥反応混合物を調製して試験した。これらの反応で使用したＳ．ａｕｒｅｕｓ標的核酸は、１００コピー／ｍＬおよび１，０００コピー／ｍＬ（この標的のアッセイＬｏＤの約３倍）のＳ．ａｕｒｅｕｓ ｇＤＮＡであった。１２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２の存在下で、トリス緩衝反応物は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ陽性試料にＣｔの遅延、ＲＦＵの減少、およびＴ勾配値の減少を示した。さらに、トリス緩衝液製剤を使用した陰性試料は、反応混合物中のＭｇＣｌ２濃度に関係なく、１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液製剤を使用した陰性試料と比較して高いバックグラウンド生成を示した。したがって、これらの結果に基づいて、ＭＯＰＳ緩衝液は、バルク製剤における使用に利点を提供し、最終カートリッジ製剤において最大約１５ｍＭの濃度で使用することができる。
【0295】
表１１に示した製剤をさらに変化させて試験した。製剤の変形例は、１１％トレハロースを様々なトレハロース／糖／ポリマーの組み合わせで置き換えた一連のバルク試薬として調製した。これらのバルク試薬製剤は、以下の試薬の組み合わせを含んでおり、上記のように凍結乾燥および試験を行った。
ａ）３％トレハロース／１％１０ｋＤａポリビニルプロピレン
ｂ）３％トレハロース／２％１０ｋＤａポリビニルプロピレン
ｃ）３％トレハロース／３％１０ｋＤａポリビニルプロピレン
ｄ）３％トレハロース／１％２９ｋＤａポリビニルプロピレン
ｅ）３％トレハロース／２％２９ｋＤａポリビニルプロピレン
ｆ）３％トレハロース／３％２９ｋＤａポリビニルプロピレン
ｇ）３％トレハロース／１％５５ｋＤａポリビニルプロピレン
ｈ）３％トレハロース／２％５５ｋＤａポリビニルプロピレン
ｉ）３％トレハロース／３％５５ｋＤａポリビニルプロピレン
ｊ）３％トレハロース／１％スクロース
ｋ）３％トレハロース／２％スクロース
ｌ）３％トレハロース／３％スクロース
ｍ）１１％トレハロース（対照）
ａ）３％トレハロース／１％１０ｋＤａポリビニルプロピレン
ｂ）３％トレハロース／２％１０ｋＤａポリビニルプロピレン
ｃ）３％トレハロース／３％１０ｋＤａポリビニルプロピレン
ｄ）３％トレハロース／１％２９ｋＤａポリビニルプロピレン
ｅ）３％トレハロース／２％２９ｋＤａポリビニルプロピレン
ｆ）３％トレハロース／３％２９ｋＤａポリビニルプロピレン
ｇ）３％トレハロース／１％５５ｋＤａポリビニルプロピレン
ｈ）３％トレハロース／２％５５ｋＤａポリビニルプロピレン
ｉ）３％トレハロース／３％５５ｋＤａポリビニルプロピレン
ｊ）３％トレハロース／１％スクロース
ｋ）３％トレハロース／２％スクロース
ｌ）３％トレハロース／３％スクロース
ｍ）１１％トレハロース（対照）
【0296】
条件ｉ）および対照条件ｍ）を除いて、全ての組み合わせが十分に凍結乾燥され、いずれの初期崩壊も示さなかった。また、ｔ＝０での機能試験では、ａ）～ｍ）の組み合わせのいずれにもＣｔの有意な遅延はなかったことが示された。しかしながら、３７℃／９５％ＲＨで加速安定性条件に置かれたとき、対照条件を除く全ての組み合わせが４日後に崩壊を示した。１１％トレハロースを用いた対照カートリッジは、１４～１６日まで３７°Ｃ／９５％ＲＨで崩壊を示さなかった。したがって、１１％を含むバルク試薬製剤は、凍結乾燥ペレットを使用前に長期保存するのに適している。
【0297】
実施例８Ｃｌｅａｖａｓｅ（登録商標）凍結乾燥前製剤バージョン４
試料投入量を変更することが望ましい。より少ない試料体積は、患者試料に対する複数の試験に対応するのに有用である。２１０ｕｌ～４２０ｕｌの試料投入量を試験した。より少ない試料吸引量で感度を維持するために、ＰＣＲ反応で使用される溶出液量を５ｕｌから１０ｕｌに増加した。溶出液試料の過剰な５ｕｌによって、反応混合物中の試薬の濃度が変化する。バルク試薬の試薬濃度は、異なる溶出液量を構成するように調節した（表１３を参照）。
試料投入量を変更することが望ましい。より少ない試料体積は、患者試料に対する複数の試験に対応するのに有用である。２１０ｕｌ～４２０ｕｌの試料投入量を試験した。より少ない試料吸引量で感度を維持するために、ＰＣＲ反応で使用される溶出液量を５ｕｌから１０ｕｌに増加した。溶出液試料の過剰な５ｕｌによって、反応混合物中の試薬の濃度が変化する。バルク試薬の試薬濃度は、異なる溶出液量を構成するように調節した（表１３を参照）。
【0298】
４２０ｕｌ／５ｕｌと２１０ｕｌ／１０ｕｌの条件を比較することにより、両方の条件で性能が同等であることがわかった（表１２）。
【表12-1】
【表12-2】
【0299】
３０ｕｌの合計反応混合物量（例えば、２０ｕｌのマスターミックス＋１０ｕｌの溶出液）を提供するために、溶出液の量を５ｕｌから１０ｕｌに増加することによりＳＵＤペレットの濃度を「１．５Ｘ」に変化させた。表１３は、体積の変化を反映しており、トリス緩衝液が１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液、ｐＨ７．５で置き換えられている。
【表13】
【0300】
このバージョン４の製剤は、ＰＣＲ反応の試料溶出液量が２倍になることに対応できるようにさらに濃縮された試薬を有する（５μｌ→１０μｌ）。製剤の濃度の変化に伴い、製剤のロバストネスを確保するために、新しい保持時間試験を行った。０日目に、上記表１３に従って液体Ｓ．ａｕｒｅｕｓ反応混合物を調製し、３つのアリコートに分けた。最初のアリコートを直ちに凍結乾燥し、混合物の第２のアリコートを２～８℃で２日間保存した後凍結乾燥し、最後のアリコートを２～８℃で４日間保存した後凍結乾燥した。得られたカートリッジを密封し、ベースラインで試験（データは図示せず）すると同時に、３０℃／９５％相対湿度（ＲＨ）で４週間の加速安定性条件にも供した。試験は、ＬｏＤ（１，０００ＣＦＵ／ｍＬ）を０．５ｌｏｇ上回るＭＲＳＡ細胞株を使用して、条件ごとに１０反復で実行した。結果は、この製剤がＬｏＤを０．５ｌｏｇ上回るＭＲＳＡを検出することができることを示し、凍結乾燥前の０～４日間の保持時間、および凍結乾燥後の３０℃／９５％ＲＨで最大３０日間の加速安定性でロバストネスを実証した。
【0301】
実施例９
【0302】
捕捉された核酸を洗浄するために使用され得るＳＤＳ等の物質の阻害効果に対抗するために、凍結乾燥される組成物にα－シクロデキストリンを添加することができる。ＳＤＳの一部は、核酸溶液中に残存し、その後、核酸増幅および検出反応中に残存する。最初に、表１３と同様の模擬鼻液（ＳＮＦ）中１，０００ＣＦＵ／ｍＬのＳ．ａｕｒｅｕｓ細胞（ＧＰ１８２２）を使用して、以下の違いを伴う４つのバージョンの製剤を調製した：（１）０ｕｇ／ｕｌシクロデキストリン、（２）０．１ｕｇ／ｕｌシクロデキストリン、（３）０．２５ｕｇ／ｕｌシクロデキストリン、または（４）０．５ｕｇ／ｕｌシクロデキストリン。検体は、Ｐａｎｔｈｅｒ Ｆｕｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｐ１８２）で処理した。３０％洗浄緩衝液を溶出緩衝液にスパイクした（すなわち、正常なＷＢキャリーオーバー＋３０％）。次いで、ペレットをＭＲＳＡ標的核酸の増幅および検出のための試験反応に使用した。これらの増幅反応にはＳＤＳを添加しなかった。この実験は、混合物へのシクロデキストリンの添加がペレットを用いて行われた核酸反応に影響を与えたかどうかを決定する。表１４の条件１～４に見られるように、ｃｔ値は各試験条件で実質的に同一であり、少なくとも０．５ｕｇ／ｕｌのシクロデキストリンを含むペレットの性能に悪影響がないことを示唆している。
【0303】
最初の実験後、表１３と同様の４つのバージョンの製剤を再度調製し、（１）０ｕｇ／ｕｌシクロデキストリン、（２）０．１ｕｇ／ｕｌシクロデキストリン、（３）０．２５ｕｇ／ｕｌシクロデキストリン、または（４）０．５ｕｇ／ｕｌシクロデキストリンのうちの１つを含めた。得られたペレットを、次いで、ＭＲＳＡ標的核酸の増幅および検出のための試験反応に使用した。この一連の増幅反応では、３０％ｖ／ｖの最終濃度になるまでＳＤＳを反応混合物に加えた。増幅および検出反応を行った。表１４の条件５～８に見られるように、ＳＤＳは核酸反応に対して阻害効果を有する（条件５）。０．１ｕｇ／ｕｌシクロデキストリンはＳＤＳの阻害をほぼ完全に中和し（条件６）、０．２５ｕｇ／ｕｌおよび０．５ｕｇ／ｕｌはＳＤＳの阻害を完全に中和した（条件７および８）。
【0304】
【表14】
【0305】
模擬鼻液（ＳＮＦ）中１，０００ ＣＦＵ／ｍＬのＳ．ａｕｒｅｕｓ細胞（ＧＰ１８２２）を使用して、さらなるデータセットを試験した。検体は、Ｐａｎｔｈｅｒ Ｆｕｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｐ３６８）で処理した。３０％洗浄緩衝液を溶出緩衝液にスパイクした（すなわち、正常なＷＢキャリーオーバー＋３０％）。
【表15】
【0306】
表は、ＳＤＳの中和には最大５．０ｕｇ／ｍｌのより高い濃度のシクロデキストリンが効果的であることを示している。
【0307】
したがって、表１３のような製剤にはシクロデキストリン、例えば０．１～５ｕｇ／ｕｌのシクロデキストリン、または０．１～０．５のシクロデキストリンを補充することができる。
【0308】
上記から、特定の実施形態が例示のために本明細書に記載されているが、本発明の主旨および範囲から逸脱することなく様々な変更が行われ得ることを理解されたい。したがって、本発明は明示的な開示によって限定されない。文脈からそうでないことが明らかでない限り、任意の実施形態、特徴、態様、またはステップは、いずれか他のものと組み合わせて使用することができる。文脈からそうでないことが明らかでない限り、列挙される構成要素を含むと言われる任意の組成物は、それらの構成要素からなるか、またはそれらから本質的になる。本明細書に引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、参照により全ての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。