特開 2024-69539 操作されたキメラ抗原受容体およびＣＡＲの調節因子を含む組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024069539

(43)【公開日】2024-05-21

(54)【発明の名称】操作されたキメラ抗原受容体およびＣＡＲの調節因子を含む組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20240514BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20240514BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20240514BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20240514BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240514BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240514BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20240514BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20240514BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20240514BHJP

   C07K 14/725 20060101ALN20240514BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20240514BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20240514BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10 ZNA

C12N7/01

C12N15/867 Z

A61K35/17

A61P35/00

A61P35/02

C12N15/12

C12N15/13

C12N15/62 Z

C07K14/725

C07K16/28

C07K19/00

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2024042171

(22)【出願日】2024-03-18

(62)【分割の表示】P 2021552866の分割

【原出願日】2020-03-06

(31)【優先権主張番号】1903237.4

(32)【優先日】2019-03-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(31)【優先権主張番号】1914216.5

(32)【優先日】2019-10-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(31)【優先権主張番号】1916077.9

(32)【優先日】2019-11-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(71)【出願人】

【識別番号】517215973

【氏名又は名称】オートラス リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】マーティン プーレ

(72)【発明者】

【氏名】ヴィジャイ ペッダレッディガリ

(72)【発明者】

【氏名】クリスティアン イティン

(57)【要約】

【課題】細胞組成物を作製する方法であって、細胞の集団を少なくとも２つのウイルスベクターの混合物で形質導入するステップを含み、ここで、少なくとも１つのベクターが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含み；ここで、少なくとも１つのベクターが、前記ＣＡＲ、前記ＣＡＲを発現する細胞、または標的細胞の活性を調整する活性調節因子をコードする核酸を含む、方法を提供すること。
【解決手段】かかる方法によって作製された細胞組成物およびがんなどの疾患の処置でのその使用も提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

本明細書に記載の発明。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明の分野
本発明は、ウイルスベクター組成物、細胞に形質導入するためのその使用、およびかかる方法によって作製された細胞組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

発明の背景
腫瘍不均一性は、異なる腫瘍細胞がそれぞれ異なる形態および表現型のプロフィール（細胞の形態、遺伝子発現、代謝、運動性、増殖、および転移能が含まれる）を示し得るという所見を指す。

【0003】

不均一性は、患者間、腫瘍間（腫瘍間不均一性）、腫瘍内（腫瘍内不均一性）で生じる。不均一性は腫瘍細胞間で複数のタイプが認められており、これらのタイプは、遺伝的および非遺伝的なばらつきの両方に由来する。

【0004】

腫瘍細胞間の不均一性は、腫瘍微小環境内の不均一性によりさらに増大し得る。腫瘍内の位置（例えば、利用できる酸素）が異なると腫瘍細胞が受ける選択圧が異なり、その結果、腫瘍の異なる空間的領域内で優位なサブクローンの範囲が広くなる。また、クローン優位性が微小環境に影響されることは、多くの患者で認められる原発性腫瘍と転移性腫瘍との間の不均一性ならびに同一タイプの腫瘍を有する患者間で認められる腫瘍間不均一性の理由である可能性がある。

【0005】

がん細胞の不均一性は、有効な処置ストラテジーを設計する上での重要な課題をもたらしている。

【0006】

例えば、不均一な腫瘍は、異なるクローン集団間で細胞傷害薬に対する感受性が異なり得る。これは、治療有効性を阻害または変化させ得るクローンの相互作用に起因する。

【0007】

不均一な腫瘍に薬物を投与しても、全ての腫瘍細胞を死滅させることは稀である。最初の不均一な腫瘍集団が障壁となる場合があり、その結果、わずかな薬物耐性細胞（存在するならば）が生存する。これにより、耐性を示す腫瘍集団は、分岐進化メカニズムによって新規の腫瘍を複製および成長させることができる（上記を参照のこと）。結果として再度集合した腫瘍は不均一であり、最初に使用した薬物治療に耐性を示す。また、再度集合した腫瘍は、より悪性度の高い様式で再発し得る。

【0008】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
キメラ抗原受容体は、例えば、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の特異性をＴ細胞のエフェクター機能とつなぎ合わせたタンパク質である。その通常の形態は、抗原認識アミノ末端、スペーサー、Ｔ細胞の生存シグナルおよび活性化シグナルを伝達する化合物エンドドメインと全てが接続された膜貫通ドメインを有するタイプＩ膜貫通ドメインタンパク質の形態である（図１Ａを参照のこと）。

【0009】

これらの分子の最も一般的な形態は、標的抗原を認識するモノクローナル抗体由来の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の、スペーサーおよび膜貫通ドメインを介してシグナル伝達エンドドメインと融合した融合物である。かかる分子により、その標的のｓｃＦｖによる認識に応答してＴ細胞を活性化させる。Ｔ細胞がかかるＣＡＲを発現するとき、Ｔ細胞は、標的抗原を発現する標的細胞を認識して死滅させる。腫瘍関連抗原に対していくつかのＣＡＲが開発されており、かかるＣＡＲ発現Ｔ細胞を用いた養子移入アプローチは、種々のがんの処置について現在臨床試験中である。

【0010】

ＣＡＲ処置を成功させるには、腫瘍細胞が標的抗原を発現する必要がある。不均一な腫瘍、特に固形がんでは、抗原発現が不均一であり、全てのがん細胞によって発現された単一の標的抗原を見出すことは可能でない場合がある。

【0011】

さらに、Ｂ細胞悪性疾患におけるＣＡＲ Ｔ細胞試験から新たに得られたデータは、この治療薬クラスに対する共通の耐性機序が、標的抗原が喪失したか下方調節された腫瘍の出現であることを実証している。抗原の喪失または低抗原による回避が生じると、さらに不均一に標的抗原が発現され、固形腫瘍を処置する上でさらに大きな障壁となる可能性がある。この課題を克服するための潜在的なアプローチには、ＣＡＲ Ｔ細胞を多重特異性にし、低レベルの標的抗原に応答するように操作すること、およびＣＡＲ誘導性の炎症反応の結果としての天然の抗腫瘍免疫応答のより効率の良い誘導が含まれる。

【0012】

ＣＡＲ Ｔ細胞の臨床研究から、ＣＡＲ Ｔ細胞の生着、拡大増殖（expansion）、お
よび存続が臨床活性、特に応答の持続に必須であることが確証されている。ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＡＲ－Ｔ細胞、特に固形がんの処置のためのＣＡＲ－Ｔ細胞が十分に存続できない重要な理由は、ＣＡＲ－Ｔ細胞が好ましくない腫瘍の微小環境を克服することが困難であることにある。特に、ＣＡＲ Ｔ細胞は、固形がんの腫瘍床内に生着および拡大増殖できない場合がある。

【0013】

ＣＡＲ Ｔ細胞の存続および活性を、サイトカインの投与、またはサイトカイン、毒素、もしくは他の因子を分泌または発現するようにＣＡＲ Ｔ細胞を操作することによって増強することができる。しかしながら、これらのアプローチには以下の限界がある：サイトカインの全身投与は有毒であり得る；サイトカインの構成的産生が制御されない増殖および形質転換をもたらし得る。

【0014】

したがって、患者間ならびに同一患者内の腫瘍細胞間および腫瘍細胞部位間の不均一性を特に念頭に置いたＣＡＲ－Ｔ細胞治療が一般に遭遇する問題に取り組む代替ＣＡＲ処置アプローチが必要である。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】古典的キメラ抗原受容体を示す概要図。（ａ）キメラ抗原受容体の基本スキーム；（ｂ）第１世代の受容体；（ｃ）第２世代の受容体；（ｄ）第３世代の受容体。

【0016】

【図2】ｉｎ ｖｉｖｏでのａ）Ｔ細胞活性化およびｂ）Ｔ細胞阻害の機序を示す概要図。

【0017】

【図3】ＪＡＫ－ＳＴＡＴシグナル伝達経路（α－インターフェロンによって活性化される）を示す概要図。

【0018】

【図4】キメラ抗原受容体の異なる結合ドメイン形式。（ａ）Ｆａｂ ＣＡＲ形式；（ｂ）ｄＡｂ ＣＡＲ形式；（ｃ）ｓｃＦｖ ＣＡＲ形式

【0019】

【図5】２つの遺伝子を共発現するシングルベクター（Ａ）；および各々が単一の遺伝子を発現する２つのベクターの混合物（Ｂ）での形質導入によって得た形質導入細胞組成物の相違を示す概要図。バイシストロン性カセットを有するシングルベクターで細胞を形質導入する場合、首尾よく形質導入されたあらゆる細胞は、およそ１：１の化学量論量で両方の導入遺伝子を発現する（Ａ）。しかしながら，細胞を複数のベクターで形質導入する場合、さらに多くの不均一な集団が得られる：形質導入された細胞は、第１の導入遺伝子のみ、第２の導入遺伝子のみ、または両方の導入遺伝子を発現し得る。両方の導入遺伝子を発現する細胞では、遺伝子Ａおよび遺伝子Ｂの相対発現レベルは、完全に不定である（Ｂ）。

【0020】

【図6】Ｔ細胞をベクター（ＡおよびＢ）の混合物で形質導入した場合、ある比率の細胞を形質導入しない場合；ある比率の細胞をベクターＡのみで形質導入した場合；ある比率の細胞をベクターＢのみで形質導入した場合；およびある比率の細胞をベクターＡおよびＢで形質導入した場合を示す散布図。この研究では、細胞をベクターの混合物で形質導入し、そのうちの１つは抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現し、そのうちの１つはＣＤ２２ ＣＡＲを発現する。

【0021】

【図7】実施例３に記載のデュアルベクター組成物で使用したベクターによって発現された分子を示す概要図。ベクター１は、ＧＤ２に結合する抗原結合ドメインを有するＣＡＲ（ＧＤ２ ＣＡＲ）、構成性に活性なサイトカイン受容体（ＣＣＲ）および選別／自殺遺伝子（ＲＱＲ８）を発現する。ベクター２は、同一のＧＤ２ ＣＡＲ、ドミナントネガティブＳＨＰ－２（ΔＳＨＰ２）；ドミナントネガティブトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）βＩＩ受容体（ΔＴＧＦｂＲＩＩ）、および同一の選別／自殺遺伝子（ＲＱＲ８）を発現する。

【0022】

【図8】一重および二重に形質導入されたＴ細胞集団がＧＤ２発現（ＳｕｐＴ１ ＧＤ２）標的細胞および非発現（ＳｕｐＴ１ ＮＴ）標的細胞を死滅させる能力の調査。

【0023】

【図9】さらなる抗原刺激を行わずに無サイトカイン完全細胞培養培地中で７日間培養した後の一重および二重に形質導入されたＴ細胞集団の増殖の調査。

【0024】

【図10-1】一重および二重に形質導入されたＴ細胞集団がＴＧＦβの存在下または非存在下でＧＤ２発現（ＳｕｐＴ１ ＧＤ２）標的細胞および非発現（ＳｕｐＴ１ ＮＴ）標的細胞を死滅させる能力の調査。

【図10-2】一重および二重に形質導入されたＴ細胞集団がＴＧＦβの存在下または非存在下でＧＤ２発現（ＳｕｐＴ１ ＧＤ２）標的細胞および非発現（ＳｕｐＴ１ ＮＴ）標的細胞を死滅させる能力の調査。

【0025】

【図11-1】ＴＧＦβの存在下または非存在下でＧＤ２発現（ＳｕｐＴ１ ＧＤ２）標的細胞および非発現（ＳｕｐＴ１ ＮＴ）標的細胞を共培養した後の一重および二重に形質導入されたＴ細胞集団由来のサイトカイン産生（ＩＦＮγ）の調査。

【図11-2】ＴＧＦβの存在下または非存在下でＧＤ２発現（ＳｕｐＴ１ ＧＤ２）標的細胞および非発現（ＳｕｐＴ１ ＮＴ）標的細胞を共培養した後の一重および二重に形質導入されたＴ細胞集団由来のサイトカイン産生（ＩＦＮγ）の調査。

【0026】

【図12A】図１２。ＮＳＧマウスの樹立神経芽細胞腫異種移植片モデルにおける静脈内投与によるデュアルベクター組成物で形質導入されたＴ細胞の抗腫瘍活性を調査したｉｎ ｖｉｖｏアッセイの結果。１×１０^６個のＣＨＬＡ－２５５ Ｆｌｕｃ細胞を、雌ＮＳＧマウスにｉ．ｖ．注射した。ＢＬＩによって安定な生着を検出することができるまで１５日間異種移植片を定着させた。ＧＤ２ ＣＡＲを発現するシングルベクター（ＧＤ２ ＣＡＲ）での細胞の形質導入または実施例３に記載され、図７に例示されたデュアルベクター組成物（ＧＤ２ ＣＡＲ＋ＩＬ７ ＣＣＲ／ＧＤ２ ＣＡＲ＋ｄＳＨＰ２＋ｄＴＧＦｂＲＩＩ）での形質導入のいずれかによって、ＣＡＲ－Ｔ細胞を作製した。ＣＡＲ Ｔ細胞を、３×１０^６個のＣＡＲ Ｔ細胞／マウスの用量でｉ．ｖ．投与した。ＣＨＬＡ－２５５ Ｆｌｕｃの定量した生物発光シグナルを、全流束（total flux）（光子／秒）として経時的にプロットした。Ａ．ＧＤ２ ＣＡＲのみを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞（ＧＤ２ ＣＡＲ）；非形質導入Ｔ細胞（ＮＴ）、または緩衝液のみ（ＰＢＳ）を投与したマウスについての経時蛍光シグナルを示すグラフ。Ｂ．ＧＤ２ ＣＡＲのみを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞（ＧＤ２ ＣＡＲ）；非形質導入Ｔ細胞（ＮＴ）、または緩衝液のみ（ＰＢＳ）の投与から－１、２、７、１０、および１４日後に得たマウスの腹側画像。Ｃ．実施例３に記載され、図７に例示されたデュアルベクター組成物（ＧＤ２ ＣＡＲ＋ＩＬ７ ＣＣＲ／ＧＤ２ ＣＡＲ＋ｄＳＨＰ２＋ｄＴＧＦｂＲＩＩ）；非形質導入Ｔ細胞（ＮＴ）、または緩衝液のみ（ＰＢＳ）で形質導入された細胞を投与したマウスについての経時蛍光シグナルを示すグラフ。Ｄ．実施例３に記載され、図７に例示されたデュアルベクター組成物（ＧＤ２ ＣＡＲ＋ＩＬ７ ＣＣＲ／ＧＤ２ ＣＡＲ＋ｄＳＨＰ２＋ｄＴＧＦｂＲＩＩ）；非形質導入Ｔ細胞（ＮＴ）、または緩衝液のみ（ＰＢＳ）で形質導入された細胞の投与から－１、２、７、１０、および１４日後に得たマウスの腹側画像。

【図12B】図１２。ＮＳＧマウスの樹立神経芽細胞腫異種移植片モデルにおける静脈内投与によるデュアルベクター組成物で形質導入されたＴ細胞の抗腫瘍活性を調査したｉｎ ｖｉｖｏアッセイの結果。１×１０^６個のＣＨＬＡ－２５５ Ｆｌｕｃ細胞を、雌ＮＳＧマウスにｉ．ｖ．注射した。ＢＬＩによって安定な生着を検出することができるまで１５日間異種移植片を定着させた。ＧＤ２ ＣＡＲを発現するシングルベクター（ＧＤ２ ＣＡＲ）での細胞の形質導入または実施例３に記載され、図７に例示されたデュアルベクター組成物（ＧＤ２ ＣＡＲ＋ＩＬ７ ＣＣＲ／ＧＤ２ ＣＡＲ＋ｄＳＨＰ２＋ｄＴＧＦｂＲＩＩ）での形質導入のいずれかによって、ＣＡＲ－Ｔ細胞を作製した。ＣＡＲ Ｔ細胞を、３×１０^６個のＣＡＲ Ｔ細胞／マウスの用量でｉ．ｖ．投与した。ＣＨＬＡ－２５５ Ｆｌｕｃの定量した生物発光シグナルを、全流束（total flux）（光子／秒）として経時的にプロットした。Ａ．ＧＤ２ ＣＡＲのみを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞（ＧＤ２ ＣＡＲ）；非形質導入Ｔ細胞（ＮＴ）、または緩衝液のみ（ＰＢＳ）を投与したマウスについての経時蛍光シグナルを示すグラフ。Ｂ．ＧＤ２ ＣＡＲのみを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞（ＧＤ２ ＣＡＲ）；非形質導入Ｔ細胞（ＮＴ）、または緩衝液のみ（ＰＢＳ）の投与から－１、２、７、１０、および１４日後に得たマウスの腹側画像。Ｃ．実施例３に記載され、図７に例示されたデュアルベクター組成物（ＧＤ２ ＣＡＲ＋ＩＬ７ ＣＣＲ／ＧＤ２ ＣＡＲ＋ｄＳＨＰ２＋ｄＴＧＦｂＲＩＩ）；非形質導入Ｔ細胞（ＮＴ）、または緩衝液のみ（ＰＢＳ）で形質導入された細胞を投与したマウスについての経時蛍光シグナルを示すグラフ。Ｄ．実施例３に記載され、図７に例示されたデュアルベクター組成物（ＧＤ２ ＣＡＲ＋ＩＬ７ ＣＣＲ／ＧＤ２ ＣＡＲ＋ｄＳＨＰ２＋ｄＴＧＦｂＲＩＩ）；非形質導入Ｔ細胞（ＮＴ）、または緩衝液のみ（ＰＢＳ）で形質導入された細胞の投与から－１、２、７、１０、および１４日後に得たマウスの腹側画像。

【図12C】図１２。ＮＳＧマウスの樹立神経芽細胞腫異種移植片モデルにおける静脈内投与によるデュアルベクター組成物で形質導入されたＴ細胞の抗腫瘍活性を調査したｉｎ ｖｉｖｏアッセイの結果。１×１０^６個のＣＨＬＡ－２５５ Ｆｌｕｃ細胞を、雌ＮＳＧマウスにｉ．ｖ．注射した。ＢＬＩによって安定な生着を検出することができるまで１５日間異種移植片を定着させた。ＧＤ２ ＣＡＲを発現するシングルベクター（ＧＤ２ ＣＡＲ）での細胞の形質導入または実施例３に記載され、図７に例示されたデュアルベクター組成物（ＧＤ２ ＣＡＲ＋ＩＬ７ ＣＣＲ／ＧＤ２ ＣＡＲ＋ｄＳＨＰ２＋ｄＴＧＦｂＲＩＩ）での形質導入のいずれかによって、ＣＡＲ－Ｔ細胞を作製した。ＣＡＲ Ｔ細胞を、３×１０^６個のＣＡＲ Ｔ細胞／マウスの用量でｉ．ｖ．投与した。ＣＨＬＡ－２５５ Ｆｌｕｃの定量した生物発光シグナルを、全流束（total flux）（光子／秒）として経時的にプロットした。Ａ．ＧＤ２ ＣＡＲのみを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞（ＧＤ２ ＣＡＲ）；非形質導入Ｔ細胞（ＮＴ）、または緩衝液のみ（ＰＢＳ）を投与したマウスについての経時蛍光シグナルを示すグラフ。Ｂ．ＧＤ２ ＣＡＲのみを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞（ＧＤ２ ＣＡＲ）；非形質導入Ｔ細胞（ＮＴ）、または緩衝液のみ（ＰＢＳ）の投与から－１、２、７、１０、および１４日後に得たマウスの腹側画像。Ｃ．実施例３に記載され、図７に例示されたデュアルベクター組成物（ＧＤ２ ＣＡＲ＋ＩＬ７ ＣＣＲ／ＧＤ２ ＣＡＲ＋ｄＳＨＰ２＋ｄＴＧＦｂＲＩＩ）；非形質導入Ｔ細胞（ＮＴ）、または緩衝液のみ（ＰＢＳ）で形質導入された細胞を投与したマウスについての経時蛍光シグナルを示すグラフ。Ｄ．実施例３に記載され、図７に例示されたデュアルベクター組成物（ＧＤ２ ＣＡＲ＋ＩＬ７ ＣＣＲ／ＧＤ２ ＣＡＲ＋ｄＳＨＰ２＋ｄＴＧＦｂＲＩＩ）；非形質導入Ｔ細胞（ＮＴ）、または緩衝液のみ（ＰＢＳ）で形質導入された細胞の投与から－１、２、７、１０、および１４日後に得たマウスの腹側画像。

【図12D】図１２。ＮＳＧマウスの樹立神経芽細胞腫異種移植片モデルにおける静脈内投与によるデュアルベクター組成物で形質導入されたＴ細胞の抗腫瘍活性を調査したｉｎ ｖｉｖｏアッセイの結果。１×１０^６個のＣＨＬＡ－２５５ Ｆｌｕｃ細胞を、雌ＮＳＧマウスにｉ．ｖ．注射した。ＢＬＩによって安定な生着を検出することができるまで１５日間異種移植片を定着させた。ＧＤ２ ＣＡＲを発現するシングルベクター（ＧＤ２ ＣＡＲ）での細胞の形質導入または実施例３に記載され、図７に例示されたデュアルベクター組成物（ＧＤ２ ＣＡＲ＋ＩＬ７ ＣＣＲ／ＧＤ２ ＣＡＲ＋ｄＳＨＰ２＋ｄＴＧＦｂＲＩＩ）での形質導入のいずれかによって、ＣＡＲ－Ｔ細胞を作製した。ＣＡＲ Ｔ細胞を、３×１０^６個のＣＡＲ Ｔ細胞／マウスの用量でｉ．ｖ．投与した。ＣＨＬＡ－２５５ Ｆｌｕｃの定量した生物発光シグナルを、全流束（total flux）（光子／秒）として経時的にプロットした。Ａ．ＧＤ２ ＣＡＲのみを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞（ＧＤ２ ＣＡＲ）；非形質導入Ｔ細胞（ＮＴ）、または緩衝液のみ（ＰＢＳ）を投与したマウスについての経時蛍光シグナルを示すグラフ。Ｂ．ＧＤ２ ＣＡＲのみを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞（ＧＤ２ ＣＡＲ）；非形質導入Ｔ細胞（ＮＴ）、または緩衝液のみ（ＰＢＳ）の投与から－１、２、７、１０、および１４日後に得たマウスの腹側画像。Ｃ．実施例３に記載され、図７に例示されたデュアルベクター組成物（ＧＤ２ ＣＡＲ＋ＩＬ７ ＣＣＲ／ＧＤ２ ＣＡＲ＋ｄＳＨＰ２＋ｄＴＧＦｂＲＩＩ）；非形質導入Ｔ細胞（ＮＴ）、または緩衝液のみ（ＰＢＳ）で形質導入された細胞を投与したマウスについての経時蛍光シグナルを示すグラフ。Ｄ．実施例３に記載され、図７に例示されたデュアルベクター組成物（ＧＤ２ ＣＡＲ＋ＩＬ７ ＣＣＲ／ＧＤ２ ＣＡＲ＋ｄＳＨＰ２＋ｄＴＧＦｂＲＩＩ）；非形質導入Ｔ細胞（ＮＴ）、または緩衝液のみ（ＰＢＳ）で形質導入された細胞の投与から－１、２、７、１０、および１４日後に得たマウスの腹側画像。

【0027】

【図13A】図１３。（Ａ）実施例６に記載のトリプルベクター組成物「ＡＵＴＯ７」で使用したベクターによって発現された分子を示す概要図。 ベクターＡは、短縮ＳＨＰ２（ｄＳＨＰ２）；安全スイッチＲＱＲ８；新規のヒト化バインダー７Ａ１２に基づいた抗ＰＳＭＡ ＣＡＲ（７Ａ１２－２８ｚ）；およびドミナントネガティブＴＧＦβＲＩＩ（ｄｎＴＢＲＩＩ）を発現する。 ベクターＢは、構成性に活性なＩＬ－７受容体（ＣＣＲ＿ＩＬ７）を発現する。 ベクターＣは、ＲａｐａＣａｓｐ９自殺遺伝子（ＲａｐａＣａｓｐ９）；ＣＤ１９（ｄＣＤ１９）、およびＩＬ－１２モジュール（ｆｌｅｘｉＩＬ－１２）を発現する。「２Ａ」は、ＦＭＤＶ ２Ａペプチドに基づいた共発現配列である。 （Ｂ）トリプルベクター組成物についての別の配置。成分は、上記の（Ａ）に示すとおりである。ｄＮＧＦＲは、マーカータンパク質として使用される短縮神経成長因子受容体である。

【図13B】図１３。（Ａ）実施例６に記載のトリプルベクター組成物「ＡＵＴＯ７」で使用したベクターによって発現された分子を示す概要図。 ベクターＡは、短縮ＳＨＰ２（ｄＳＨＰ２）；安全スイッチＲＱＲ８；新規のヒト化バインダー７Ａ１２に基づいた抗ＰＳＭＡ ＣＡＲ（７Ａ１２－２８ｚ）；およびドミナントネガティブＴＧＦβＲＩＩ（ｄｎＴＢＲＩＩ）を発現する。 ベクターＢは、構成性に活性なＩＬ－７受容体（ＣＣＲ＿ＩＬ７）を発現する。 ベクターＣは、ＲａｐａＣａｓｐ９自殺遺伝子（ＲａｐａＣａｓｐ９）；ＣＤ１９（ｄＣＤ１９）、およびＩＬ－１２モジュール（ｆｌｅｘｉＩＬ－１２）を発現する。「２Ａ」は、ＦＭＤＶ ２Ａペプチドに基づいた共発現配列である。 （Ｂ）トリプルベクター組成物についての別の配置。成分は、上記の（Ａ）に示すとおりである。ｄＮＧＦＲは、マーカータンパク質として使用される短縮神経成長因子受容体である。

【0028】

【図14】一重、二重、および三重に形質導入されたＴ細胞がＰＳＭＡを発現する標的細胞を死滅させる能力を調査したＦＡＣＳベースの殺滅（ＦＢＫ）アッセイの結果。Ａ：標的細胞の生存を示すために細胞蛍光分析を使用した２４時間のインキュベーション後のＦＢＫ。Ｂ：２４時間後に記載の共培養物から上清を回収し、ＥＬＩＳＡによって検出することによって測定したＣＡＲ Ｔ細胞によるＩＬ－２およびＩＦＮγの分泌。 ＡＵＴＯ７を、ベクターＡを使用した一重形質導入の産物（「ＡＵＴＯ７／Ａ」）、またはベクターＡおよびＢを使用したダブル形質導入の産物（「ＡＵＴＯ７／ＡＢ」）、またはベクターＡ、Ｂ、およびＣを使用した三重形質導入の産物（「ＡＵＴＯ７／ＡＢＣ」）として調査した。ＡＵＴＯ７を、同一の抗ＰＳＭＡバインダー７Ａ１２を使用して開発した第２世代のＣＡＲ（「親」）に対して試験した。 異なるレベルでヒトＰＳＭＡ抗原を発現するように操作したＳｕｐＴ１標的細胞（ＳｕｐＴ１－ＰＳＭＡｈｉｇｈ、ＳｕｐＴ１－ＰＳＭＡｌｏｗ）を、標的細胞として使用した。非操作ＳｕｐＴ１細胞（ＳｕｐＴ１－ＮＴ）を、負の対照として使用した。ＣＡＲ Ｔ細胞を、エフェクター：標的比１：２で標的細胞と共培養した。

【0029】

【図15A】図１５。無サイトカイン完全細胞培養培地中での培養後に、一重、二重、および三重に形質導入されたＴ細胞がＰＳＭＡを発現する標的細胞を死滅させる能力を調査したＦＡＣＳベースの殺滅（ＦＢＫ）アッセイの結果。「飢餓条件」での７日間の培養後、ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＳｕｐＴ１－ＰＳＭＡｈｉｇｈ標的細胞およびＳｕｐＴ１－ＰＳＭＡｌｏｗ標的細胞（または負の対照としてのＳｕｐＴ１－ＮＴ細胞）と１：２および１：８のエフェクター：標的比で共培養した。Ａ：標的細胞の生存を示すために細胞蛍光分析を使用した２４時間のインキュベーション後のＦＢＫ。Ｂ：２４時間後に記載の共培養物から上清を回収し、ＥＬＩＳＡによって検出することによって測定したＣＡＲ Ｔ細胞によるＩＬ－２およびＩＦＮγの分泌。

【図15B】図１５。無サイトカイン完全細胞培養培地中での培養後に、一重、二重、および三重に形質導入されたＴ細胞がＰＳＭＡを発現する標的細胞を死滅させる能力を調査したＦＡＣＳベースの殺滅（ＦＢＫ）アッセイの結果。「飢餓条件」での７日間の培養後、ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＳｕｐＴ１－ＰＳＭＡｈｉｇｈ標的細胞およびＳｕｐＴ１－ＰＳＭＡｌｏｗ標的細胞（または負の対照としてのＳｕｐＴ１－ＮＴ細胞）と１：２および１：８のエフェクター：標的比で共培養した。Ａ：標的細胞の生存を示すために細胞蛍光分析を使用した２４時間のインキュベーション後のＦＢＫ。Ｂ：２４時間後に記載の共培養物から上清を回収し、ＥＬＩＳＡによって検出することによって測定したＣＡＲ Ｔ細胞によるＩＬ－２およびＩＦＮγの分泌。

【0030】

【図16】ＴＧＦβの存在下または非存在下で一重、二重、および三重に形質導入されたＴ細胞がＰＳＭＡを発現する標的細胞を死滅させる能力を調査したＦＡＣＳベースの殺滅（ＦＢＫ）アッセイの結果。ＣＡＲ Ｔ細胞を、１０ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβ１の存在下または非存在下のいずれかでＳｕｐＴ１－ＰＳＭＡｈｉｇｈ標的およびＳｕｐＴ１－ＰＳＭＡｌｏｗ標的と１：２および１：８（Ｅ：Ｔ）の比で７日間共培養した（ＳｕｐＴ１－ＮＴを対照として使用した）。標的細胞の殺滅をＦＡＣＳによって定量し、標的のみに対して正規化した。

【0031】

【図17】標的細胞での再刺激を繰り返した後の一重、二重、および三重に形質導入されたＴ細胞がＰＳＭＡを発現する標的細胞を死滅させる能力を調査したＦＡＣＳベースの殺滅（ＦＢＫ）アッセイの結果。形質導入されたＴ細胞を、ＳｕｐＴ１－ＰＳＭＡｈｉｇｈ標的細胞またはＳｕｐＴ１－ＰＳＭＡｌｏｗ標的細胞と１：１（Ｅ：Ｔ）の比で共培養した。７日ごとにＣＡＲ Ｔ細胞を５×１０^４個のＳｕｐＴ１細胞で再度刺激した。標的細胞の殺滅をＦＡＣＳによって定量後、各々新たに再刺激を行った。

【0032】

【図18A-1】図１８。ＮＳＧマウスの前立腺がん異種移植片モデルにおける静脈内投与によるトリプルベクター組成物で形質導入されたＴ細胞の抗腫瘍活性を調査したｉｎ ｖｉｖｏアッセイ。５×１０^６個のＰＳＭＡ陽性ＰＣ３ヒト細胞株を、雌ＮＳＧマウスの側腹部に注射した。触診およびカリパスによる測定によって安定な生着を検出することができるまで３週間異種移植片を定着させた。ＣＡＲ Ｔ細胞を、１×１０^６個のＣＡＲ Ｔ細胞／マウスの用量でｉ．ｖ．投与した。カリパス測定を、１週間に２～３回行った。Ａ：ベクターＡを使用した一重形質導入（「ＡＵＴＯ７／Ａ」）、ベクターＡおよびＢを使用した二重形質導入（「ＡＵＴＯ７／ＡＢ」）、ベクターＡ、Ｂ、およびＣを使用した三重形質導入（「ＡＵＴＯ７／ＡＢＣ」）；または同一の抗ＰＳＭＡバインダー７Ａ１２を使用して開発した第２世代のＣＡＲ（「親」）によって作製した細胞を投与したマウスについてのデータ；Ｂ：図１８Ａに示すデータのまとめ。

【図18A-2】図１８。ＮＳＧマウスの前立腺がん異種移植片モデルにおける静脈内投与によるトリプルベクター組成物で形質導入されたＴ細胞の抗腫瘍活性を調査したｉｎ ｖｉｖｏアッセイ。５×１０^６個のＰＳＭＡ陽性ＰＣ３ヒト細胞株を、雌ＮＳＧマウスの側腹部に注射した。触診およびカリパスによる測定によって安定な生着を検出することができるまで３週間異種移植片を定着させた。ＣＡＲ Ｔ細胞を、１×１０^６個のＣＡＲ Ｔ細胞／マウスの用量でｉ．ｖ．投与した。カリパス測定を、１週間に２～３回行った。Ａ：ベクターＡを使用した一重形質導入（「ＡＵＴＯ７／Ａ」）、ベクターＡおよびＢを使用した二重形質導入（「ＡＵＴＯ７／ＡＢ」）、ベクターＡ、Ｂ、およびＣを使用した三重形質導入（「ＡＵＴＯ７／ＡＢＣ」）；または同一の抗ＰＳＭＡバインダー７Ａ１２を使用して開発した第２世代のＣＡＲ（「親」）によって作製した細胞を投与したマウスについてのデータ；Ｂ：図１８Ａに示すデータのまとめ。

【図18B】図１８。ＮＳＧマウスの前立腺がん異種移植片モデルにおける静脈内投与によるトリプルベクター組成物で形質導入されたＴ細胞の抗腫瘍活性を調査したｉｎ ｖｉｖｏアッセイ。５×１０^６個のＰＳＭＡ陽性ＰＣ３ヒト細胞株を、雌ＮＳＧマウスの側腹部に注射した。触診およびカリパスによる測定によって安定な生着を検出することができるまで３週間異種移植片を定着させた。ＣＡＲ Ｔ細胞を、１×１０^６個のＣＡＲ Ｔ細胞／マウスの用量でｉ．ｖ．投与した。カリパス測定を、１週間に２～３回行った。Ａ：ベクターＡを使用した一重形質導入（「ＡＵＴＯ７／Ａ」）、ベクターＡおよびＢを使用した二重形質導入（「ＡＵＴＯ７／ＡＢ」）、ベクターＡ、Ｂ、およびＣを使用した三重形質導入（「ＡＵＴＯ７／ＡＢＣ」）；または同一の抗ＰＳＭＡバインダー７Ａ１２を使用して開発した第２世代のＣＡＲ（「親」）によって作製した細胞を投与したマウスについてのデータ；Ｂ：図１８Ａに示すデータのまとめ。

【発明の概要】

【0033】

発明の態様の概要
本発明者らは、ＣＡＲ治療における腫瘍細胞および微小環境の不均一性の問題に取り組むための組み合わせアプローチを開発した。

【0034】

細胞を複数のベクターで同時に形質導入する場合、得られた産物は、単独でおよび組み合わせで形質導入された細胞の混合物である。例えば、細胞を２つのベクター（導入遺伝子Ａを含むベクターおよび導入遺伝子Ｂを含むベクター）で形質導入する場合、形質導入された細胞は、Ａのみを発現する細胞；Ｂのみを発現する細胞；ならびにＡおよびＢの両方を発現する細胞の混合物である（図５Ｂ）。各々導入遺伝子を含む３つのベクターで形質導入された細胞について、得られた形質導入された細胞は、以下の混合物である：Ａのみ；Ｂのみ；Ｃのみ；ＡおよびＢ；ＡおよびＣ；ＢおよびＣ；ならびにＡ、Ｂ、およびＣを発現する細胞。

【0035】

本発明は、治療用ＣＡＲ－Ｔ細胞産物などの混合物を使用することを含む。組み合わせ産物を使用すると、標的細胞におけるおよび腫瘍微小環境における差違に適応する産物の能力を強化する固有の柔軟性が得られる。

【0036】

例えば、ベクターは、異なるＣＡＲ（例えば、その抗原結合ドメインおよび／または共刺激ドメイン（複数可）が異なり得る）の組み合わせをコードし得る。あるいはまたはさらに、１またはそれを超えるベクターは、ＣＡＲの、ＣＡＲを発現する細胞の、または標的細胞の活性を調整する活性調節因子をコードし得る。組み合わせＣＡＲ Ｔ細胞組成物をｉｎ ｖｉｖｏで投与する場合、細胞は、体内の異なる腫瘍部位に移動する。ＣＡＲ（複数可）と活性調節因子（複数可）の特定の組み合わせを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞亜集団はどれであっても腫瘍部位で生存し、存続し、標的細胞を死滅させる能力を最適に備えているので、産物中の他の亜集団を超える選択的利点を有し、これらの亜集団に打ち勝つ。こうして、ＣＡＲ－Ｔ細胞産物は、患者間および同一患者内の部位間の腫瘍不均一性に適応することができる。

【0037】

また、本方法を使用して、患者を分析して患者内でどのＣＡＲ－Ｔ細胞の亜集団が最良の存続および／または活性を示すのかを調査することによって、どのベクターの組み合わせが特定の疾患または疾患のサブタイプの処置のためのＣＡＲ－Ｔ細胞の生成に最適であるのかを確証することができる。

【0038】

したがって、第１の態様では、本発明は、細胞組成物を作製する方法であって、細胞の集団を少なくとも２つのウイルスベクターの混合物で形質導入するステップを含み、ここで、少なくとも１つのベクターが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含む、方法を提供する。

【0039】

本発明の方法を、操作されたＴ細胞受容体を発現する細胞に等しく適用し得る。また、下記のありとあらゆる態様および実施形態は、操作されたＴＣＲ発現細胞に適用可能である。

【0040】

混合物は、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれを超えるウイルスベクターを含み得る。

【0041】

混合物中の２またはそれを超えるウイルスベクターは、各々、ＣＡＲをコードする核酸配列を含み得る。第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲは、異なる抗原結合ドメインおよび／または異なるスペーサーおよび／または異なるエンドドメインを有し得る。

【0042】

１またはそれを超えるウイルスベクターのＣＡＲをコードする核酸は、２またはそれを超えるＣＡＲをコードし得る。例えば、核酸は、ＣＡＲ論理ゲート（ＯＲゲートなど）をコードし得る。

【0043】

本発明は、細胞組成物を作製する方法であって、細胞の集団を少なくとも２つのウイルスベクターの混合物で形質導入するステップを含み、ここで、少なくとも１つのベクターが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含み；ここで、少なくとも１つのベクターが、前述のＣＡＲの、前述のＣＡＲを発現する細胞の、または標的細胞の活性を調整する活性調節因子をコードする核酸を含む、方法を提供する。

【0044】

本発明のテクノロジーは、活性調節因子（複数可）の発現に関連する限り、ＣＡＲや操作されたＴＣＲを発現しない養子細胞治療用の細胞（腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）など）に等しく適用される。また、下記のありとあらゆる態様および実施形態は、活性調節因子（複数可）の発現に関連する限り、治療用Ｔ細胞（ＴＩＬなど）に一般に適用可能である。

【0045】

混合物中の１またはそれを超えるウイルスベクターは、このベクターで形質導入された細胞がＣＡＲおよび活性調節因子を共発現するように、ＣＡＲおよび活性調節因子の両方をコードする核酸配列を含み得る。

【0046】

ＣＡＲの活性を調整する活性調節因子は、ＣＡＲ発現細胞：標的細胞シナプスでのリン酸化と脱リン酸化との間のバランスに影響を及ぼし得る。例えば、活性調節因子は、ＣＡＲエンドドメインにおいて免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）をリン酸化することができるキナーゼドメインを含み得る。

【0047】

あるいは、活性調節因子は、キナーゼをＣＡＲの近傍（キナーゼがＣＡＲエンドドメインにおいてＩＴＡＭをリン酸化することができる場所）に動員することができる場合がある。

【0048】

ＣＡＲ発現細胞の活性を調整する活性調節因子は、細胞内分子であり得るか、細胞表面に発現され得る。

【0049】

ｉｎ ｖｉｖｏでは、膜結合した免疫阻害性受容体（ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、またはＢＴＬＡ１など）は、Ｔ細胞活性化を阻害する。活性調節因子は、この阻害性経路を遮断するか、影響を及ぼし得る。

【0050】

活性調節因子は、阻害性免疫受容体に結合するか、阻害性免疫受容体（ｉｍｍｕｎｒｅｃｅｐｔｏｒ）のリガンドに結合する抗体などの作用因子であり得る。

【0051】

阻害性免疫受容体（ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、またはＢＴＬＡ１など）によって媒介された阻害を遮断または軽減する活性調節因子は、ＩＴＡＭのリン酸化が有利となるように、Ｔ細胞：標的細胞シナプスでのリン酸化：脱リン酸化（ｄｅｐｈｏｓｐｏｒｙｌａｔｉｏｎ）のバランスを崩し、Ｔ細胞の活性化をもたらし得る。例えば、活性調節因子は、阻害性受容体（複数可）のエンドドメイン（ｅｎｄｏｄｍａｉｎ）においてＩＴＩＭのリン酸化を遮断または軽減し得るか、ＳＨＰ－１およびＳＨＰ－２などのタンパク質によるＣＡＲシグナル伝達ドメインにおけるＩＴＡＭの脱リン酸化を遮断または軽減し得る。

【0052】

活性調節因子は、ドミナントネガティブなＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２であり得る。

【0053】

例えば、活性調節因子は、リン酸化した免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）に結合するタンパク質（ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２など）に由来するＳＨ２ドメインを含むが、ホスファターゼドメインを欠く短縮タンパク質であり得る。

【0054】

活性調節因子は、ＩＬ１２、ｆｌｅｘｉＩＬ－１２、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ７、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＩＬ２、またはＣＣＬ１９などのサイトカインまたはケモカインであり得る。

【0055】

あるいは、活性調節因子は、ＣＡＲ発現細胞におけるサイトカイン／ケモカインシグナル伝達経路に影響を及ぼし得る。

【0056】

例えば、活性調節因子は、サイトカイン受容体エンドドメインを含むキメラサイトカイン受容体であり得る。エキソドメインは、異なるサイトカイン－受容体に由来し得るか、サイトカイン受容体に由来しない場合がある。エキソドメインは、リガンド（例えば、腫瘍抗原または分泌因子）に結合し得る。リガンドが存在するとサイトカイン受容体エンドドメインの２つの鎖が会合してサイトカインシグナル伝達に至り得る。

【0057】

活性調節因子は、構成性に活性なキメラサイトカイン受容体であり得る。活性調節因子は、自発的にか作用因子（二量体化の化学誘導物質すなわちＣＩＤ）の存在下で２つのサイトカイン受容体エンドドメインが一緒になって二量体化する２つの鎖を含み得る。

【0058】

活性調節因子は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴサイトカインシグナル伝達経路に影響を及ぼし得る。活性調節因子は、誘導性または構成性に活性なシグナル伝達兼転写活性化因子（ＳＴＡＴ）またはヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）を含み得る。

【0059】

活性調節因子は、接着分子または転写因子であり得るか、これらを含み得る。転写因子は、ＣＡＲ発現細胞の分化および／または疲弊を防止または軽減し得る。

【0060】

本発明の活性調節因子は、ＴＧＦβシグナル伝達を調整し得る。

【0061】

例えば、活性調節因子は、ＴＧＦβ受容体へのＴＧＦβ結合を遮断または軽減し得る；活性調節因子は、ＴＧＦβまたはＴＧＦβＲと、ＴＧＦβＲまたはＴＧＦβへの結合を競合し得る；あるいは、活性調節因子は、例えばＳＭＡＤを介した下流ＴＧＦβシグナル伝達を調整し得る。活性調節因子は、ドミナントネガティブＴＧＦβ受容体であり得る。

【0062】

本発明の活性調節因子は、Ｔ細胞に共刺激シグナルを提供し得る。

【0063】

例えば、活性調節因子（ａｃｔｉｖｉｔｙ ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ）は、ＴＮＦ受容体、キメラＴＮＦ受容体、またはＴＮＦ受容体リガンドであり得る。

【0064】

活性調節因子は、標的細胞（例えば、腫瘍細胞）の活性を調整し得る。

【0065】

作用因子は、毒素、プロドラッグ、またはプロドラッグ活性化化合物であり得る。

【0066】

活性調節因子は、細胞内で発現されたか、組み合わせて発現された場合に小分子を合成することができる酵素であり得る。ＣＡＲ発現細胞内でかかる酵素または酵素の組み合わせが発現すると、前述の細胞上で小分子（腫瘍細胞に有毒な小分子など）を合成する能力を付与することができる。

【0067】

あるいは、活性調節因子は、ＣＡＲ発現細胞によって分泌される酵素であり得る。活性調節因子は、細胞表面で分泌または発現された場合に、操作された細胞の細胞外の分子を枯渇させる１またはそれを超える酵素であり得、前述の分子は、以下：
（ｉ）腫瘍細胞が生存、増殖、転移するか、または化学抵抗性を示すために必要であり、そして／または
（ｉｉ）操作された細胞の生存、増殖、または活性に有害である。

【0068】

酵素（複数可）は、例えば、アミノ酸もしくはアミノ酸代謝産物、核酸塩基（ヌクレオシドまたはヌクレオチドなど）、または脂質を枯渇させ得る。

【0069】

本発明の方法では、ウイルスベクターの混合物は、ドミナントネガティブなＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２をコードする核酸配列を含む少なくとも１つのベクター；およびドミナントネガティブトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）β受容体をコードする核酸配列を含む少なくとも１つのベクターを含み得る。

【0070】

ウイルスベクターの混合物は、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのウイルスベクターを含み得、そのうちの少なくとも１つが、ＣＡＲをコードする核酸配列を含み；そのうちの少なくとも１つが、活性調節因子をコードする核酸配列を含む。

【0071】

本発明は、以下のステップを含み得る：
（ｉ）細胞の集団を少なくとも２つのウイルスベクターの混合物で形質導入するステップ；および
（ｉｉ）ステップ（ｉ）由来の前述の形質導入された細胞集団からＣＡＲ発現細胞を選択するステップ。

【0072】

あるいは、混合物中のウイルスベクターの各々がＣＡＲをコードする核酸配列を含む場合、形質導入された細胞集団からＣＡＲ発現細胞を選択または精製する必要はない場合がある。

【0073】

第２の態様では、本発明は、ウイルスベクター組成物を提供する。ウイルスベクター組成物は、２またはそれを超えるベクターの混合物を含み得る。ベクター組成物は、本発明の第１の態様の方法での使用に適切であり得る。

【0074】

ウイルスベクター組成物は、第１のベクターおよび第２のベクターを含み得、その両方がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含む。

【0075】

第１のベクターによって発現されるＣＡＲは、第２のベクターによって発現されるＣＡＲと同一であり得る。例えば、第１のベクターによって発現されるＣＡＲは、第２のベクターによって発現されるＣＡＲと同一の抗原結合ドメインを有し得る。

【0076】

また、第１のベクターおよび／または第２のベクターは、ＣＡＲの、ＣＡＲを発現する細胞の、または標的細胞の活性を調整する活性調節因子を発現し得る。第１のベクターおよび第２のベクターの両方が活性調節因子を発現する場合、第１のベクターおよび第２のベクターは、異なる活性調節因子または活性調節因子の異なる組み合わせを発現し得る。

【0077】

例えば、第１のベクターおよび第２のベクターは、ドミナントネガティブなＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２；ドミナントネガティブトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）β受容体；および構成性に活性なキメラサイトカイン受容体から選択される１またはそれを超える活性調節因子を発現し得る。

【0078】

１つの配置において、第１のベクターは、ドミナントネガティブなＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２をコードする核酸配列およびドミナントネガティブトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）β受容体をコードする核酸配列を含み得る；第２のベクターは、構成性に活性なキメラサイトカイン受容体をコードする核酸配列を含み得る。

【0079】

第１および第２のベクターが同一のＣＡＲをコードする場合、ＣＡＲは、ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）に結合する抗原結合ドメインを有し得る。

【0080】

第１のベクターおよび／または第２のベクターは、自殺遺伝子をコードする核酸配列を含み得る。

【0081】

また、本発明は、本発明の方法によって作製されたか、ｅｘ ｖｉｖｏで細胞を本発明のベクター組成物で形質導入することによって作製された細胞組成物を提供する。

【0082】

第３の態様では、本発明は、本発明の第１の態様の方法によって作製されたか、細胞の集団を本発明の第２の態様のウイルスベクター組成物で形質導入することによって作製された細胞組成物を提供する。

【0083】

第４の態様では、本発明の第３の態様の細胞組成物を被験体に投与するステップを含む、被験体の疾患を処置する方法を提供する。

【0084】

第５の態様では、疾患の処置および／または防止に使用するための、本発明の第３の態様の細胞組成物を提供する。

【0085】

第６の態様では、疾患の処置および／または防止のための医薬の製造における、本発明の第３の態様の細胞組成物の使用を提供する。

【0086】

第７の態様では、疾患を処置するためのＣＡＲ発現細胞の成分の最適な組み合わせを決定する方法であって、以下のステップ：
（ｉ）本発明の第２の態様に記載の細胞組成物を、前述の疾患を有する被験体に投与するステップ；
（ｉｉ）前述の患者または前述の患者由来の試料をモニタリングして、前述の細胞組成物中のどの細胞の亜集団が最も高いレベルの生着および／または増殖を示すのかを決定する、モニタリングするステップ；および
（ｉｉｉ）亜集団中の前述の細胞の表現型／遺伝子型を解析して、これらの前述の細胞によって発現されたＣＡＲ（複数可）および／または活性調節因子（複数可）を確認する、解析するステップ
を含む、方法を提供する。

【0087】

さらなる態様
本発明はまた、以下の番号をつけたパラグラフにまとめたさらなる態様を提供する。
１．ドミナントネガティブＳＨＰ－２をコードする核酸配列およびドミナントネガティブＴＧＦβ受容体をコードする核酸配列を含む核酸構築物。
２．以下の構造を有するパラグラフ１に記載の核酸構築物：
ｄｎＳＨＰ－ｃｏｅｘｐｒ－ｄｎＴＧＦβＲ、または
ｄｎＴＧＦβＲ－ｃｏｅｘｐｒ－ｄｎＳＨＰ
ここで、
ｄｎＳＨＰは、ドミナントネガティブＳＨＰ－２をコードする核酸配列であり、
「ｃｏｅｘｐｒ」は、個別の実体として２つのポリペプチドを共発現することができる核酸配列であり、
「ｄｎＴＧＦβＲ」は、ドミナントネガティブＴＧＦβ受容体をコードする核酸配列である。
３．ＣＡＲをコードする核酸配列も含むパラグラフ１に記載の核酸構築物。
４．以下の構造を有するパラグラフ３に記載の核酸構築物：
ＣＡＲ－ｃｏｅｘｐｒ１－ｄｎＳＨＰ－ｃｏｅｘｐｒ２－ｄｎＴＧＦβＲ
ＣＡＲ－ｃｏｅｘｐｒ１－ｄｎＴＧＦβＲ－ｃｏｅｘｐｒ２－ｄｎＳＨＰ
ｄｎＴＧＦβＲ－ｃｏｅｘｐｒ１－ＣＡＲ－ｃｏｅｘｐｒ２－ｄｎＳＨＰ
ｄｎＴＧＦβＲ－ｃｏｅｘｐｒ１－ｄｎＳＨＰ－ｃｏｅｘｐｒ２－ＣＡＲ
ｄｎＳＨＰ－ｃｏｅｘｐｒ１－ｄｎＴＧＦβＲ－ｃｏｅｘｐｒ２－ＣＡＲまたは
ｄｎＳＨＰ－ｃｏｅｘｐｒ１－ＣＡＲ－ｃｏｅｘｐｒ２－ｄｎＴＧＦβＲ
ここで、
ｄｎＳＨＰは、ドミナントネガティブＳＨＰ－２をコードする核酸配列であり、
「ｃｏｅｘｐｒ１」および「ｃｏｅｘｐｒ２」は、同一でも異なっていてもよく、個別の実体として３つのポリペプチドを共発現することができる核酸配列であり、
「ｄｎＴＧＦβＲ」は、ドミナントネガティブＴＧＦβ受容体をコードする核酸配列であり；
「ＣＡＲ」は、キメラ抗原受容体をコードする核酸配列である。
５．以下の構造を有するパラグラフ４に記載の核酸構築物：
ｄｎＳＨＰ－ｃｏｅｘｐｒ１－ＣＡＲ－ｃｏｅｘｐｒ２－ｄｎＴＧＦβＲ。
６．ＣＡＲが以下の標的抗原：ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＢＣＭＡ、ＰＳＭＡ、ＣＤ７９、ＧＤ２、またはＦＣＲＬ５のうちの１つに結合する、パラグラフ３～５のいずれかに記載の核酸構築物。
７．２つのＣＡＲをコードするバイシストロン性核酸配列を含む、パラグラフ３に記載の核酸構築物。
８．以下の構造を有するパラグラフ７に記載の核酸構築物：
ｄｎＳＨＰ－ｃｏｅｘｐｒ１－ＣＡＲ１－ｃｏｅｘｐｒ２－ＣＡＲ２－ｃｏｅｘｐｒ３－ｄｎＴＧＦβＲ
ここで、
「ｄｎＳＨＰ」は、ドミナントネガティブＳＨＰ－２をコードする核酸配列であり、
「ｃｏｅｘｐｒ１」、「ｃｏｅｘｐｒ２」、および「ｃｏｅｘｐｒ３」は、同一でも異なっていてもよく、個別の実体として４つのポリペプチドを共発現することができる核酸配列であり；
「ＣＡＲ１」は、第１のキメラ抗原受容体をコードする核酸配列であり；
「ＣＡＲ２」は、第２のキメラ抗原受容体をコードする核酸配列であり；
「ｄｎＴＧＦβＲ」は、ドミナントネガティブＴＧＦβ受容体をコードする核酸配列である。
９．一方のＣＡＲはＣＤ１９に結合し、他方のＣＡＲはＣＤ２２に結合する、パラグラフ７または８に記載の核酸構築物。
１０．ＣＡＲは、ＣＤ１９に結合し、以下を含む抗原結合ドメインを有するパラグラフ６に記載の核酸構築物：
ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：
ＣＤＲ１－ＧＹＡＦＳＳＳ（配列番号１）；
ＣＤＲ２－ＹＰＧＤＥＤ（配列番号２）
ＣＤＲ３－ＳＬＬＹＧＤＹＬＤＹ（配列番号３）；および
ｂ）以下の配列を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：
ＣＤＲ１－ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号４）；
ＣＤＲ２－ＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号５）
ＣＤＲ３－ＱＱＷＮＩＮＰＬＴ（配列番号６）。
１１．抗原結合ドメインが、配列番号７として示した配列を有するＶＨドメインおよび配列番号８として示した配列を有するＶＬドメインを含む、パラグラフ１０に記載の核酸構築物。
１２．自殺遺伝子をコードする核酸配列も含む、前述のパラグラフのいずれかに記載の核酸構築物。
１３．前述のパラグラフのいずれかに記載の核酸構築物を含むベクター。
１４．パラグラフ１３に記載の第１のベクターおよびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または活性調節因子をコードする核酸配列を含む第２のベクターを含む、ベクターのキット。
１５．ドミナントネガティブＳＨＰ－２をコードする核酸配列を含む第１のベクターおよびドミナントネガティブＴＧＦβ受容体をコードする核酸配列を含む第２のベクターを含む、ベクターのキット。
１６．第１のベクターが第１のＣＡＲをコードする核酸配列を含み、第２のベクターが第２のＣＡＲをコードする核酸配列を含む、パラグラフ１５に記載のベクターのキット。
１７．第１および第２のＣＡＲが同一の標的抗原を有する、パラグラフ１６に記載のベクターのキット。
１８．第１および第２のＣＡＲが同一である、パラグラフ１６に記載のベクターのキット。
１９．パラグラフ１２に記載の第１のベクター、およびキメラサイトカイン受容体（ＣＣＲ）をコードする第２のベクターを含む、ベクターのキット。
２０．第１のベクターが第１のＣＡＲをコードする核酸配列を含み、第２のベクターが第２のＣＡＲをコードする核酸配列を含む、パラグラフ１９に記載のベクターのキット。
２１．第１および第２のＣＡＲが同一の標的抗原を有する、パラグラフ２０に記載のベクターのキット。
２２．第１および第２のＣＡＲが同一である、パラグラフ２０に記載のベクターのキット。
２３．第１のベクターが第１の自殺遺伝子をコードする核酸配列を含み、第２のベクターが第２の自殺遺伝子をコードする核酸配列を含む、パラグラフ１４～２２のいずれかに記載のベクターのキット。
２４．第１および第２の自殺遺伝子が同一の分子によって誘発される、パラグラフ２３に記載のベクターのキット。
２５．第１および第２の自殺遺伝子が異なる分子によって誘発される、パラグラフ２３に記載のベクターのキット。
２６．ベクターが以下の構造を有する、パラグラフ２３～２５のいずれかに記載のベクターのキット：
ベクター１：ＣＡＲ１－ｃｏｅｘｐｒ１－ＳＧ１－ｃｏｅｐｒ２－ｄＳＨＰ２－ｃｏｅｘｐｒ３－ｄｎＴＧＦβＲ
ベクター２：ＣＡＲ２－ｃｏｅｘｐｒ４－ＳＧ２－ｃｏｅｐｒ５－ＣＣＲ
ここで、
「ＣＡＲ１」は、第１のキメラ抗原受容体をコードする核酸配列であり；
「ｃｏｅｘｐｒ１」、「ｃｏｅｘｐｒ２」、「ｃｏｅｘｐｒ３」、「ｃｏｅｘｐｒ４」、「ｃｏ－ｅｘｐｒ５」は、同一でも異なっていてもよく、個別の実体として７つのポリペプチドを共発現することができる核酸配列であり；
「ＳＧ１」は、第１の自殺遺伝子をコードする核酸配列であり；
「ｄｎＳＨＰ」は、ドミナントネガティブＳＨＰ－２をコードする核酸配列であり；
「ｄｎＴＧＦβＲ」は、ドミナントネガティブＴＧＦβ受容体をコードする核酸配列であり；
「ＣＡＲ２」は、ＣＡＲ１と同一でも同一でなくてもよい第２のキメラ抗原受容体をコードする核酸配列であり；
「ＳＧ２」は、ＳＧ１と同一でも同一でなくてもよい第１の自殺遺伝子をコードする核酸配列であり；
「ＣＣＲ」は、キメラサイトカイン受容体をコードする核酸配列である。
２７．サイトカインをコードする核酸配列を含む第３のベクターも含む、パラグラフ１４～２６のいずれかに記載のベクターのキット。
２８．サイトカインが、ＩＬ－１２またはＦｌｅｘｉ－ＩＬ１２である、パラグラフ２７に記載のベクターのキット。
２９．ベクターが以下の構造を有するパラグラフ２８に記載のベクターのキット：
ベクター１：ｄｎＳＨＰ２－ｃｏｅｘｐｒ１－ＳＧ１－ｃｏｅｐｒ２－ＣＡＲ－ｃｏｅｘｐｒ３－ｄｎＴＧＦβＲ
ベクター２：ＣＣＲ
ベクター３：ＳＧ２－ｃｏｅｘｐｒ４－ｆｌｅｘｉＩＬ１２
ここで、
「ｄｎＳＨＰ」は、ドミナントネガティブＳＨＰ－２をコードする核酸配列であり；
「ｃｏｅｘｐｒ１」、「ｃｏｅｘｐｒ２」、「ｃｏｅｘｐｒ３」、および「ｃｏｅｘｐｒ４」は、同一でも異なっていてもよく、個別の実体としてベクター１および３上の６つのポリペプチドを共発現することができる核酸配列であり；
「ＳＧ１」は、第１の自殺遺伝子をコードする核酸配列であり；
「ＣＡＲ」は、キメラ抗原受容体をコードする核酸配列であり；
「ｄｎＴＧＦβＲ」は、ドミナントネガティブＴＧＦβ受容体をコードする核酸配列であり；
「ＣＣＲ」は、キメラサイトカイン受容体をコードする核酸配列であり；
「ＳＧ２」は、ＳＧ１と同一でも同一でなくてもよい第１の自殺遺伝子をコードする核酸配列であり；
「ｆｌｅｘｉＩＬ１２」は、ｆｌｅｘｉ－ＩＬ－１２をコードする核酸配列である。
３０．以下の混合物を含むベクター組成物：パラグラフ１３に記載のベクターおよび少なくとも１つの他のウイルスベクター；パラグラフ１４～２６のいずれかに定義の第１および第２のベクター；またはパラグラフ２７～２９のいずれかに定義の第１、第２、および第３のベクター。
３１．パラグラフ１３に記載のベクター、パラグラフ１４～２９のいずれかに記載のベクターのキット、またはパラグラフ３０に記載のベクター組成物で細胞の集団を形質導入するステップを含む、細胞組成物を作製する方法。
３２．ドミナントネガティブＳＨＰ－２およびドミナントネガティブＴＧＦβ受容体を共発現する細胞。
３３．１またはそれを超えるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ（複数可））も発現する、パラグラフ３２に記載の細胞。
３４．ＣＡＲ（複数可）がパラグラフ６～１１のいずれかに定義の通りである、パラグラフ３３に記載の細胞。
３５．パラグラフ３１に記載の方法によって作製されたか、パラグラフ３２～３４のいずれかに記載の複数の細胞を含む、細胞組成物。
３６．パラグラフ３５に記載の細胞組成物を被験体に投与するステップを含む、疾患を処置および／または防止する方法。
３７．疾患ががんである、パラグラフ３６に記載の方法。
３８．疾患の処置および／または防止で用いるためのパラグラフ３５に記載の細胞組成物。
３９．疾患の処置および／または防止のための医薬の製造におけるパラグラフ３２～３４のいずれかに記載の細胞の使用。
４０．ドミナントネガティブＴＧＦβ受容体をコードする核酸配列；ＩＬ７をコードする核酸配列；およびＣＣＬ１９をコードする核酸配列を含む、核酸構築物。
４１．以下の構造を有するパラグラフ４０に記載の核酸構築物：
ｄｎＴＧＦβＲ－ｃｏｅｘｐｒ１－ＩＬ７－ｃｏｅｘｐｒ２－ＣＣＬ１９；
ｄｎＴＧＦβＲ－ｃｏｅｘｐｒ１－ＣＣＬ１９－ｃｏｅｘｐｒ２－ＩＬ７；
ＩＬ７－ｃｏｅｘｐｒ１－ＣＣＬ１９－ｃｏｅｘｐｒ２－ｄｎＴＧＦβＲ；
ＩＬ７－ｃｏｅｘｐｒ１－ｄｎＴＧＦβＲ－ＣＣＬ１９－ｃｏｅｘｐｒ２；
ＣＣＬ１９－ｃｏｅｘｐｒ１－ＩＬ７－ｃｏｅｘｐｒ２－ｄｎＴＧＦβＲ；または
ＣＣＬ１９－ｃｏｅｘｐｒ１－ｄｎＴＧＦβＲ－ｃｏｅｘｐｒ２－ＩＬ７
ここで、
「ｄｎＴＧＦβＲ」は、ドミナントネガティブＴＧＦβ受容体をコードする核酸配列であり；
「ＩＬ７」は、ＩＬ７をコードする核酸配列であり、
「ＣＣＬ１９」は、ＣＣＬ１９をコードする核酸配列であり、
「ｃｏｅｘｐｒ１」および「ｃｏｅｘｐｒ２」は、同一でも異なっていてもよく、個別の実体として３つのポリペプチドを共発現することができる核酸配列である。
４２．ＣＡＲをコードする核酸配列も含む、パラグラフ４０に記載の核酸構築物。
４３．以下の構造を有するパラグラフ３に記載の核酸構築物：
ＣＡＲ－ｃｏｅｘｐｒ１－ｄｎＴＧＦβＲ－ｃｏｅｘｐｒ２－ＩＬ７－ｃｏｅｘｐｒ３－ＣＣＬ１９；
ここで、
ｄｎＴＧＦβＲ」は、ドミナントネガティブＴＧＦβ受容体をコードする核酸配列であり；
「ＩＬ７」は、ＩＬ７をコードする核酸配列であり、
「ＣＣＬ１９」は、ＣＣＬ１９をコードする核酸配列であり、
「ＣＡＲ」は、キメラ抗原受容体をコードする核酸配列であり、
「ｃｏｅｘｐｒ１」、「ｃｏｅｘｐｒ２」、および「ｃｏｅｘｐｒ３」は、同一でも異なっていてもよく、個別の実体として４つのポリペプチドを共発現することができる核酸配列である。
４４．ＣＡＲがＧＤ２に結合する、パラグラフ３～５のいずれかに記載の核酸構築物。
４５．パラグラフ４０～４４のいずれかに記載の核酸構築物を含むベクター。
４６．ＩＬ７をコードする核酸配列およびＣＣＬ１９をコードする核酸配列を含む第１のベクター；およびドミナントネガティブＴＧＦβ受容体をコードする核酸配列を含む第２のベクターを含む、ベクターのキット。
４７．両方のベクターが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列も含む、パラグラフ４６に記載のベクターのキット。
４８．第１のベクターによってコードされるＣＡＲが、第２のベクターによってコードされるＣＡＲと同一である、パラグラフ４７に記載のベクターのキット。
４９．ＣＡＲがＧＤ２に結合する、パラグラフ４８に記載のベクターのキット。
５０．細胞の集団を、パラグラフ４５に記載のベクターまたはパラグラフ４６～４９のいずれかに記載のベクターのキットで形質導入するステップを含む、細胞組成物を作製する方法。
５１．ドミナントネガティブＴＧＦβ受容体、ＩＬ７、およびＣＣＬ１９を共発現する細胞。
５２．１またはそれを超えるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ（複数可））も発現する、パラグラフ５１に記載の細胞。
５３．パラグラフ４６に記載の方法によって作製されたか、パラグラフ５１または５２に記載の複数の細胞を含む、細胞組成物。
５４．パラグラフ４９に記載の細胞組成物を被験体に投与するステップを含む、疾患を処置および／または防止する方法。
５５．疾患ががんである、パラグラフ５４に記載の方法。
５６．疾患の処置および／または防止で用いるためのパラグラフ５３に記載の細胞組成物。
５７．疾患の処置および／または防止のための医薬の製造におけるパラグラフ５１または５２に記載の細胞の使用。

【0088】

上記のパラグラフおよび下記の特許請求の範囲では、核酸構築物またはベクターのポリペプチドをコードするエレメント（「ｄｎＳＨＰ」、「ｄｎＴＧＦβＲ」、「ＩＬ７」、「ＣＣＬ１９」、および「ＣＡＲ」など）は、構築物中に任意の順序で存在し得る。

【0089】

以下の詳細な説明は、核酸およびポリペプチド配列、ポリペプチド成分、ベクター、細胞、方法などに関連する限り、特許請求の範囲内の本発明の態様に関する上記パラグラフに説明された態様に等しく適用される。

【発明を実施するための形態】

【0090】

詳細な説明
本発明は、細胞の集団を少なくとも２つのウイルスベクターの混合物で形質導入するステップを含む、細胞組成物を作製する方法に関する。

【0091】

ウイルスベクターは、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであり得る。

【0092】

レトロウイルスは、そのゲノムをＲＮＡからＤＮＡに「逆転写する」能力を主な特徴とする二本鎖ＲＮＡエンベロープウイルスである。ビリオンは直径が１００～１２０ｎｍであり、ヌクレオキャプシドタンパク質と複合体化した同一のＲＮＡプラス鎖の二量体ゲノムを含む。ゲノムは、ウイルス感染に必要な酵素タンパク質（すなわち逆転写酵素、インテグラーゼ、およびプロテアーゼ）も含むタンパク質キャプシド中に封入されている。マトリックスタンパク質は、キャプシドコアに外側に、エンベロープ（宿主の細胞膜に由来し、ウイルスのコア粒子を取り囲む脂質二重層）と相互作用する層を形成する。ウイルスエンベロープ糖タンパク質はこの二重層上に係留し、宿主細胞上の特異的受容体の認識および感染過程の開始を担う。エンベロープタンパク質は、２つのサブユニット（脂質膜内にタンパク質を係留する膜貫通（ＴＭ）サブユニットおよび細胞受容体に結合する表面（ＳＵ）サブユニット）によって形成される。

【0093】

ゲノム構造に基づいて、レトロウイルスは、シンプルレトロウイルス（ＭＬＶおよびマウス白血病ウイルスなど）；またはコンプレックスレトロウイルス（ＨＩＶおよびＥＩＡＶなど）に分類される。レトロウイルスは、以下の４つの遺伝子をコードする：ｇａｇ（群特異抗原）、ｐｒｏ（プロテアーゼ）、ｐｏｌ（ポリメラーゼ）、およびｅｎｖ（エンベロープ）。ｇａｇ配列は、以下の３つの主な構造タンパク質をコードする：マトリックスタンパク質、ヌクレオキャプシドタンパク質、およびキャプシドタンパク質。ｐｒｏ配列は、粒子のアセンブリ、出芽、および成熟中のＧａｇおよびＧａｇ－Ｐｏｌの切断を担うプロテアーゼをコードする。ｐｏｌ配列は、酵素（逆転写酵素およびインテグラーゼ、前者は感染過程中のウイルスゲノムのＲＮＡからＤＮＡへの逆転写を触媒し、後者は、プロウイルスＤＮＡの宿主細胞ゲノムへの組込みを担う）をコードする。ｅｎｖ配列は、エンベロープ糖タンパク質のＳＵサブユニットおよびＴＭサブユニットの両方をコードする。さらに、レトロウイルスゲノムには、以下などの非コードシス作用配列が存在する：２つのＬＴＲ（長末端反復）（遺伝子発現、逆転写、および宿主細胞の染色体への組込みを駆動するのに必要なエレメントを含む）；新規に形成されたビリオンへのウイルスＲＮＡの特異的パッケージングに必要なパッケージングシグナル（ψ）と呼ばれる配列；および逆転写中にプラス鎖ＤＮＡ合成を開始するための部位として機能するポリプリントラクト（ＰＰＴ）。ｇａｇ、ｐｒｏ、ｐｏｌ、およびｅｎｖに加えて、コンプレックスレトロウイルス（レンチウイルスなど）は、ウイルス遺伝子発現、感染粒子のアセンブリを調節し、感染細胞中でのウイルス複製を調整するアクセサリ遺伝子（ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｎｅｆ、ｔａｔ、およびｒｅｖが含まれる）を有する。

【0094】

感染過程中、レトロウイルスは、最初に、特異的細胞表面受容体に付着する。感受性宿主細胞に侵入すると、次いで、レトロウイルスＲＮＡゲノムは、親ウイルス内に保有されているウイルスがコードした逆転写酵素によってＤＮＡにコピーされる。このＤＮＡは宿主の細胞核に輸送され、その後に細胞核でＤＮＡが宿主ゲノムに組み込まれる。この段階では、典型的にはプロウイルスと呼ばれる。プロウイルスは、細胞分裂中は宿主染色体内で安定であり、他の細胞タンパク質と同様に転写される。プロウイルスは、さらなるウイルスの作製に必要なタンパク質およびパッケージング機序をコードし、「出芽」として公知の過程によって細胞から離れることができる。

【0095】

レトロウイルスおよびレンチウイルスなどのエンベロープを有するウイルスが宿主細胞から出芽する場合、これらのウイルスは宿主細胞の脂質膜の一部となる。こうして、宿主細胞由来膜タンパク質は、レトロウイルス粒子の一部になる。本発明は、目的のタンパク質をウイルス粒子のエンベロープに導入するためにこの過程を利用する。

【0096】

ウイルスベクター
レトロウイルスおよびレンチウイルスを、核酸配列または複数の核酸配列を標的細胞に導入するためのベクターまたは送達系として使用しても良い。ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏで移入することができる。この様式で使用する場合、ウイルスは、典型的には、ウイルスベクターと呼ばれる。

【0097】

一般にレトロウイルスベクターと呼ばれるガンマ－レトロウイルスベクターは、１９９０年の遺伝子療法の臨床試験で使用された最初のウイルスベクターであり、依然として最も使用されているものの１つである。最近になって、コンプレックスレトロウイルス（ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）など）由来のレンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入できるので、関心が持たれている。レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターの遺伝子移入ツールとしての最も魅力的な特徴には、巨大な遺伝子を負荷できること（９ｋｂまで）、患者の免疫応答が最小限であること、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでの形質導入効率が高いこと、ならびに標的細胞の遺伝的内容を持続的に改変して、送達された遺伝子の発現を長期間維持できることが含まれる。

【0098】

レトロウイルスベクターは、遺伝情報を真核細胞に送達させることができる任意の適切なレトロウイルスに基づくことができる。例えば、レトロウイルスベクターは、アルファレトロウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはスプマレトロウイルスベクターであり得る。かかるベクターは、遺伝子療法による処置および他の遺伝子送達用途で広く使用されている。

【0099】

本発明のウイルスベクターは、レトロウイルスベクター（ガンマ－レトロウイルスベクターなど）であり得る。ウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルスに基づき得る。

【0100】

本発明のウイルスベクターは、レンチウイルスベクターであり得る。ベクターは、非霊長類レンチウイルス（ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）など）に基づき得る。

【0101】

核酸配列および構築物
本発明の方法で使用されるウイルスベクターの混合物では、各ベクターは、１またはそれを超える核酸配列を含み得る。例えば、混合物中のベクターの１つまたは複数は、共発現される複数の核酸配列を含む核酸構築物を含み得る。核酸構築物は、例えば、バイシストロン性またはトリシストロン性であり得る。核酸構築物は、２、３、４、または５つの導入遺伝子を含み得る。

【0102】

核酸構築物中の核酸配列は、２またはそれを超えるポリペプチドが翻訳された時点で細胞内または細胞上に個別に発現することができる「共発現」配列によって分離され得る。

【0103】

共発現配列は、核酸構築物が切断部位（複数可）によって連結した２またはそれを超えるポリペプチドを産生し含むように、切断部位をコードし得る。ポリペプチドが産生されたときに、いかなる外部の切断活性を必要とすることなく個別のポリペプチドに直ちに切断されるように、切断部位は自己切断され得る。

【0104】

切断部位は、２またはそれを超えるポリペプチドが分離されることを可能にする任意の配列であり得る。

【0105】

用語「切断」を本明細書中で便宜上使用するが、切断部位により、古典的な切断以外の機序によってポリペプチドを個別の実体に分離することができる。例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ自己切断ペプチド（以下を参照のこと）について、以下の「切断」活性を説明するための種々のモデルが提案されている：宿主細胞プロテイナーゼによるタンパク質分解活性、自己タンパク質分解、または翻訳効果（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（２００１）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７－１０４１）。かかる「切断」の正確な機序は、切断部位がタンパク質をコードする核酸配列の間に配置されたときに個別の実体としてタンパク質を発現する限り、本発明の目的には重要でない。

【0106】

切断部位は、フューリン切断部位であり得る。

【0107】

フューリンは、サブチリシン様プロタンパク質転換酵素ファミリーに属する酵素である。このファミリーのメンバーは、潜在的な前駆体タンパク質をその生物学的に活性な生成物へと処理するプロタンパク質転換酵素である。フューリンは、カルシウム依存性セリンエンドプロテアーゼであり、その対となる塩基性アミノ酸プロセシング部位で前駆体タンパク質を効率的に切断することができる。フューリン基質の例には、プロ副甲状腺ホルモン、トランスフォーミング成長因子ベータ１前駆体、プロアルブミン、プロ－ベータ－セクレターゼ、１型膜マトリックスメタロプロテイナーゼ、プロ神経成長因子のベータサブユニット、およびフォンウィルブランド因子が含まれる。フューリンは、塩基性アミノ酸標的配列（規範的に、Ａｒｇ－Ｘ－（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）－Ａｒｇ’）（配列番号５８）のすぐ下流のタンパク質を切断し、ゴルジ装置中で富化される。

【0108】

切断部位は、タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）切断部位であり得る。

【0109】

ＴＥＶプロテアーゼは、高度に配列特異的なシステインプロテアーゼであり、キモトリプシン様プロテアーゼである。ＴＥＶプロテアーゼは、その標的切断部位に非常に特異的であり、したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方において融合タンパク質の切断を制御するために頻繁に使用される。コンセンサスＴＥＶ切断部位は、ＥＮＬＹＦＱ＼Ｓ（ここで、「＼」は切断されるペプチド結合を示す）（配列番号５９）である。哺乳動物細胞（ヒト細胞など）は、ＴＥＶプロテアーゼを発現しない。したがって、本核酸構築物がＴＥＶ切断部位を含み、哺乳動物細胞中で発現される実施形態では、外因性ＴＥＶプロテアーゼは哺乳動物細胞中でも発現されなければならない。

【0110】

切断部位は、自己切断ペプチドをコードし得る。

【0111】

「自己切断ペプチド」は、タンパク質および自己切断ペプチドを含むポリペプチドが産生されたときに、いかなる外部の切断活性も必要とせずに個別かつ分離した第１および第２のポリペプチドに直ちに「切断される」かまたは分離されるように機能するペプチドを指す。

【0112】

自己切断ペプチドは、アフトウイルスまたはカルジオウイルス由来の２Ａ自己切断ペプチドであり得る。アフトウイルスおよびカルジオウイルスの一次２Ａ／２Ｂ切断は、それ自体のＣ末端での２Ａ「切断」によって媒介される。アフトウイルス（ａｐｔｈｏｖｉｒｕｓ）（口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）およびウマ鼻炎Ａウイルスなど）では、２Ａ領域は、約１８アミノ酸の短い部分であり、タンパク質２ＢのＮ末端残基（保存プロリン残基）と共に、それ自体のＣ末端での「切断」を媒介することができる自律エレメントを示す（上記のＤｏｎｅｌｌｙら（２００１））。

【0113】

「２Ａ様」配列は、アフトウイルスまたはカルジオウイルス以外のピコルナウイルス、「ピコルナウイルス様」昆虫ウイルス、タイプＣロタウイルス、ならびにＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｓｐｐおよび細菌配列内の反復配列で見出されている（上記のＤｏｎｎｅｌｌｙら（２００１））。

【0114】

切断部位は、配列番号９に示す２Ａ様配列を含み得る。
配列番号９
ＲＡＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ

【0115】

本発明は、ドミナントネガティブなＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２をコードする核酸配列およびドミナントネガティブＴＧＦβ受容体をコードする核酸配列を含む核酸構築物を提供する。

【0116】

ドミナントネガティブなＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２およびＴＧＦβ受容体を、以下により詳細に記載する。

【0117】

核酸構築物は、以下の構造を有し得る：
ｄｎＳＨＰ－ｃｏｅｘｐｒ－ｄｎＴＧＦβＲ、または
ｄｎＴＧＦβＲ－ｃｏｅｘｐｒ－ｄｎＳＨＰ
ここで、
ｄｎＳＨＰは、ドミナントネガティブなＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２をコードする核酸配列であり、
「ｃｏｅｘｐｒ」は、個別の実体として２つのポリペプチドを共発現することができる核酸配列であり、
ｄｎＴＧＦβＲは、ドミナントネガティブＴＧＦβ受容体である。

【0118】

また、核酸構築物は、ＣＡＲをコードする核酸配列を含み得る。その場合、核酸構築物は、以下の構造を有し得る：
ＣＡＲ－ｃｏｅｘｐｒ１－ｄｎＳＨＰ－ｃｏｅｘｐｒ２－ｄｎＴＧＦβＲ
ＣＡＲ－ｃｏｅｘｐｒ１－ｄｎＴＧＦβＲ－ｃｏｅｘｐｒ２－ｄｎＳＨＰ
ｄｎＴＧＦβＲ－ｃｏｅｘｐｒ１－ＣＡＲ－ｃｏｅｘｐｒ２－ｄｎＳＨＰ
ｄｎＴＧＦβＲ－ｃｏｅｘｐｒ１－ｄｎＳＨＰ－ｃｏｅｘｐｒ２－ＣＡＲ
ｄｎＳＨＰ－ｃｏｅｘｐｒ１－ｄｎＴＧＦβＲ－ｃｏｅｘｐｒ２－ＣＡＲまたは
ｄｎＳＨＰ－ｃｏｅｘｐｒ１－ＣＡＲ－ｃｏｅｘｐｒ２－ｄｎＴＧＦβＲ
ここで、
ｄｎＳＨＰは、ドミナントネガティブＳＨＰ－２をコードする核酸配列であり、
「ｃｏｅｘｐｒ１」および「ｃｏｅｘｐｒ２」は、同一でも異なっていてもよく、個別の実体として３つのポリペプチドを共発現することができる核酸配列であり、
ｄｎＴＧＦβＲは、ドミナントネガティブＴＧＦβ受容体であり；
ＣＡＲは、キメラ抗原受容体をコードする核酸配列である。

【0119】

自殺遺伝子
また、核酸構築物は、自殺遺伝子をコードする核酸を含み得る。

【0120】

Ｔ細胞は生着し、自律性であるので、患者におけるＣＡＲ Ｔ細胞を選択的に欠失させる手段が望ましい。自殺遺伝子は、許容できない毒性に直面したときに注入したＴ細胞を選択的に破壊する遺伝子コード可能な機序である。自殺遺伝子を用いた初期の臨床経験は、Ｔ細胞をガンシクロビル感受性にするヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）を用いたものである。ＨＳＶ－ＴＫは、有効性の高い自殺遺伝子である。しかしながら、予め形成された免疫応答により、ハプロタイプ一致の幹細胞移植などのかなり免疫抑制された臨床的状況へのＨＳＶ－ＴＫの使用は制限され得る。誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）は、カスパーゼ９の活性化ドメインを改変されたＦＫＢＰ１２で置き換えることによって構築された自殺遺伝子である。ｉＣａｓｐ９は、本来は不活性な小分子の二量体化の誘導化合物（ＣＩＤ）によって活性化される。ｉＣａｓｐ９は、ハプロタイプ一致のＨＳＣＴの状況で最近試験されており、ＧｖＨＤを予防する（abort）ことができる。
ｉＣａｓｐ９およびＨＳＶ－ＴＫの両方は細胞内タンパク質であるため、唯一の導入遺伝子として使用する場合、これらをマーカー遺伝子と共発現させて形質導入された細胞を選択することが可能である。

【0121】

ＷＯ２０１６／１３５４７０号は、カスパーゼ９も含むが、ラパマイシンまたはラパマイシンアナログを使用して二量体化するように誘導することができる自殺遺伝子を記載している。

【0122】

この自殺遺伝子は、時折Ｒａｐｃａｓｐ９またはＲａｐａｃａｓｐ９と呼ばれ、配列番号８０として示したアミノ酸配列を有する。
配列番号８０（Ｒａｐｃａｓｐ９）

【化4】

【0123】

ＷＯ２０１３／１５３３９１号は、抗体ＱＢＥｎｄ１０および治療用抗体リツキシマブを用いて溶解される発現細胞で検出することができるＲＱＲ８として公知のマーカー／自殺遺伝子を記載している。

【0124】

選別／自殺遺伝子ＲＱＲ８は、配列番号７９として示したアミノ酸配列を有する。
配列番号７９（ＲＱＲ８）
ＣＰＹＳＮＰＳＬＣＳＧＧＧＧＳＥＬＰＴＱＧＴＦＳＮＶＳＴＮＶＳＰＡＫＰＴＴＴＡＣＰＹＳＮＰＳＬＣＳＧＧＧＧＳＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮＲＲＲＶＣＫＣＰＲＰＶＶ

【0125】

本発明のウイルスベクター組成物内のベクターのうちの１つまたは複数中で自殺遺伝子を誘導することにより、ある比率の被験体内の形質導入された細胞を選択的に消失させることができる。

【0126】

例えば、２つのベクターＡおよびＢについて、形質導入された細胞は、ベクターＡのみで形質導入された細胞、ベクターＢのみで形質導入された細胞、およびベクターＡおよびＢの両方で形質導入された細胞の混合物である。ベクターＡが自殺遺伝子を発現するか共発現する場合、自殺遺伝子を活性化するとベクターＡのみまたはベクターＡおよびＢで形質導入された細胞は欠失されるが、ベクターＢのみで形質導入された細胞は欠失されない。

【0127】

これは、混合物中の１つのベクターが潜在的に危険であるか有毒である遺伝子をコードする場合に特に有用である。自殺遺伝子がそのベクターのカセット上含まれる場合、患者が許容できない免疫学的事象または有毒な事象にある場合には、自殺遺伝子を誘発することによって問題の遺伝子を発現する細胞を選択的に欠失させることができる。潜在的に危険な遺伝子／自殺遺伝子の組み合わせを含まない他のベクター組み合わせを発現する細胞は欠失されず、その治療効果を継続することができる。

【0128】

例えば、自殺遺伝子（ｓｕｉｃｉｄｅ ｇｅｅ）を、免疫調節サイトカイン（ＩＬ－１２など）または構成性に活性なサイトカイン受容体を発現するベクター中に含めてよい（以下を参照のこと）。

【0129】

ウイルスベクター組成物
本発明は、ウイルスベクター混合物を含むウイルスベクター組成物を提供する。組成物は、２またはそれを超える（two of more）ウイルスベクターの簡潔な混合によって作
製され得る。組成物は、２個と１０個との間のウイルスベクター（例えば、２、３、４、５、または６個のウイルスベクター）を含み得る。

【0130】

混合物中のウイルスベクターは、各々が１またはそれを超える導入遺伝子を含み得る。組成物中の２またはそれを超えるウイルスベクターは、１またはそれを超える導入遺伝子が重複し得る。例えば、組成物中の２つのウイルスベクターは、同一のＣＡＲをコードする核酸配列を含み得るが、他の核酸配列によってコードされる活性調節因子（複数可）の存在またはタイプが異なり得る。

【0131】

組成物中のウイルスベクター（複数可）のうちの１つまたは複数は、ドミナントネガティブなＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２をコードする核酸配列を含み得る。組成物中の１またはそれを超えるウイルスベクターは、ドミナントネガティブＴＧＦβ受容体をコードする核酸配列を含み得る。組成物中の１またはそれを超えるウイルスベクターは、キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含み得る。

【0132】

ウイルスベクター組成物は、ドミナントネガティブなＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２をコードする核酸配列およびドミナントネガティブＴＧＦβ受容体をコードする核酸配列を含むベクターを含み得る。

【0133】

ウイルスベクター組成物は、複数のベクターを含み得、その各々が異なる活性調節因子（複数可）または活性調節因子の組み合わせをコードする。

【0134】

キメラ抗原受容体
本発明の方法では、ウイルスベクターの混合物中の少なくとも１つのベクターは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含み得る。

【0135】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
図１に模式的に示されるＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメイン（バインダー）が細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）に接続しているキメラタイプＩ膜貫通タンパク質である。バインダーは、典型的には、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）由来の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であるが、抗体様抗原結合部位を含む他の形式に基づくことができる。スペーサードメインは、通常、バインダーを膜から分離し、適切な配向を可能にするために必要である。使用される一般的なスペーサードメインは、ＩｇＧ１のＦｃである。より小型のスペーサー、例えば、抗原に応じて、ＣＤ８α由来のストーク、さらにはＩｇＧ１ヒンジのみですら十分な場合がある。膜貫通ドメインは、細胞膜内にタンパク質を係留し、スペーサーをエンドドメインに接続する。

【0136】

初期のＣＡＲデザインは、ＦｃεＲ１のγ鎖またはＣＤ３ζのいずれかの細胞内部分に由来するエンドドメインを有していた。結果的に、これらの第１世代の受容体は免疫学的シグナル１を伝達し、同族標的細胞のＴ細胞による殺滅を引き起こすのに十分であったが、Ｔ細胞を、それが増殖および生存するように十分に活性化することはできなかった。この限界を克服するために、複合エンドドメインが以下のように構築された：Ｔ細胞共刺激分子の細胞内部分とＣＤ３ζの細胞内部分との融合により、抗原認識後に活性化および共刺激シグナルを同時に伝達することができる第２世代の受容体が得られる。最も一般的に使用される共刺激ドメインは、ＣＤ２８の共刺激ドメインである。これは最も効力のある共刺激シグナル（すなわち、Ｔ細胞増殖を引き起こす免疫学的シグナル２）を供給する。いくつかの受容体も記載されており、この受容体には、ＴＮＦ受容体ファミリーエンドドメイン（生存シグナルを伝達する密接に関連するＯＸ４０および４１ＢＢなど）が含まれる。活性化、増殖、および生存シグナルを伝達することができるエンドドメインを有するさらにより効力のある第３世代のＣＡＲをここに記載している。

【0137】

ＣＡＲコード核酸を、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを使用してＴ細胞に導入して、養子細胞移入のためのがん特異的Ｔ細胞を生成し得る。ＣＡＲが標的抗原に結合するとき、この結合により、ＣＡＲが発現されるＴ細胞に活性化シグナルが伝達される。したがって、ＣＡＲは、Ｔ細胞の特異性および細胞傷害性を、標的にされた抗原を発現する腫瘍細胞に向ける。

【0138】

タンデムＣＡＲ（ＴａｎＣＡＲ）
タンデムＣＡＲまたはＴａｎＣＡＲとして公知の二重特異性ＣＡＲは、２つまたはそれを超えるがん特異的マーカーを同時に標的にするように開発されている。ＴａｎＣＡＲでは、細胞外ドメインは、リンカーによって連結された２つの抗原結合特異性部位をタンデムで含む。したがって、２つの結合特異性部位（ｓｃＦｖｓ）の両方は、単一の膜貫通部分に連結される：一方のｓｃＦｖは膜に近接しており、他方は遠位にある。ＴａｎＣＡＲが標的抗原のいずれかまたは両方に結合する場合、これにより、ＴａｎＣＡＲが発現される細胞に活性化シグナルが伝達される。

【0139】

Ｇｒａｄａ ｅｔ ａｌ（２０１３、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
２：ｅ１０５）は、ＣＤ１９特異的ｓｃＦｖを含み、その後にＧｌｙ－Ｓｅｒリンカー、次いで、ＨＥＲ２特異的ｓｃＦｖが続くＴａｎＣＡＲを記載している。ＨＥＲ２－ｓｃＦｖは、膜近傍の位置に存在し、ＣＤ１９－ｓｃＦｖは遠位に存在した。ＴａｎＣＡＲは、２つの腫瘍制限抗原の各々に対して別個のＴ細胞反応性を誘導することが示された。それぞれの長さのＨＥＲ２（６３２ａａ／１２５Å）およびＣＤ１９（２８０ａａ、６５Å）が空間配置に役立つので、この配置を選択した。ＨＥＲ２ ｓｃＦｖがＨＥＲ２の最も遠位の４ループに結合することも知られていた。

【0140】

抗原結合ドメイン
抗原結合ドメインは、抗原を認識するＣＡＲの一部である。多数の抗原結合ドメインが当該分野で公知であり、抗体、抗体模倣物、およびＴ細胞受容体の抗原結合部位に基づいた抗原結合ドメインが含まれる。例えば、抗原結合ドメインは、以下を含み得る：モノクローナル抗体由来の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）；標的抗原の天然リガンド；標的に対して十分な親和性を有するペプチド；単一ドメイン抗体；Ｄａｒｐｉｎなどの人工単一バインダー（設計されたアンキリン反復タンパク質）；またはＴ細胞受容体由来の単鎖。

【0141】

古典的ＣＡＲでは、抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体由来の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む（図４ｃを参照のこと）。ドメイン抗体（ｄＡｂ）抗原結合ドメインまたはＶＨＨ抗原結合ドメインを有するＣＡＲも産生されている（図４ｂを参照のこと）、または、それは、例えば、モノクローナル抗体のＦａｂ断片を含む（図４ａを参照のこと）。ＦａｂＣＡＲは、以下の２つの鎖を含む：抗体様軽鎖可変領域（ＶＬ）および定常領域（ＣＬ）を有する鎖；および重鎖可変領域（ＶＨ）および定常領域（ＣＨ）を有する鎖。一方の鎖はまた、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ＣＬとＣＨとの間の会合により、受容体が組み立てられる。

【0142】

Ｆａｂ ＣＡＲの２本の鎖は、以下の一般構造を有し得る：
ＶＨ－ＣＨ－スペーサー－膜貫通ドメイン－細胞内シグナル伝達ドメイン；および
ＶＬ－ＣＬ
または
ＶＬ－ＣＬ－スペーサー－膜貫通ドメイン－細胞内シグナル伝達ドメイン；および
ＶＨ－ＣＨ。

【0143】

Ｆａｂ型キメラ受容体について、抗原結合ドメインは、一方のポリペプチド鎖由来のＶＨおよび他方のポリペプチド鎖由来のＶＬで構成されている。

【0144】

ポリペプチド鎖は、ＶＨ／ＶＬドメインとＣＨ／ＣＬドメインとの間にリンカーを含み得る。リンカーは、可動性を示し、ＶＨ／ＶＬドメインをＣＨ／ＣＬドメインから空間的
に分離するのに役立ち得る。

【0145】

ＣＡＲの抗原結合ドメインは、腫瘍関連抗原に結合し得る。例えば、以下の表１に示すように、種々の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が公知である。

【0146】

【表1】

【0147】

各ＣＡＲは、以下の標的抗原のうちの１つに結合し得る：ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＢＣＭＡ、ＰＳＭＡ、ＧＤ２、ＣＤ７９、またはＦＣＲＬ５。

【0148】

ＣＤ１９
ＣＤ１９に結合するＣＡＲの抗原結合ドメインは、表２に示すＣＤ１９バインダーの１つに由来する配列を含み得る。

【0149】

【表2】

【0150】

あるいは、ＣＤ１９に結合するＣＡＲは、以下を含む抗原結合ドメインを有し得る：
ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：
ＣＤＲ１－ＧＹＡＦＳＳＳ（配列番号１）；
ＣＤＲ２－ＹＰＧＤＥＤ（配列番号２）
ＣＤＲ３－ＳＬＬＹＧＤＹＬＤＹ（配列番号３）；および
ｂ）以下の配列を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：
ＣＤＲ１－ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号４）；
ＣＤＲ２－ＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号５）
ＣＤＲ３－ＱＱＷＮＩＮＰＬＴ（配列番号６）。

【0151】

抗原結合ドメインは、配列番号７として示した配列を有するＶＨドメイン；および配列番号８として示した配列を有するＶＬドメインを含み得る。
配列番号７－ＶＨ配列
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＡＦＳＳＳＷＭＮＷＶＫＱＲＰＧＫＧＬＥＷＩＧＲＩＹＰＧＤＥＤＴＮＹＳＧＫＦＫＤＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＴＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＳＬＬＹＧＤＹＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ
配列番号８－ＶＬ配列
ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＦＬＴＩＮＮＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＮＩＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲ

【0152】

ＣＤ２２
Ｈａｓｏ ｅｔ ａｌ．（Ｂｌｏｏｄ；２０１３；１２１（７））に記載のように、ＣＤ２２に結合するＣＡＲは、ｍ９７１、ＨＡ２２、またはＢＬ２２に由来する抗原ドメインを有し得る。

【0153】

あるいは、ＣＤ２２に結合するＣＡＲは、英国特許出願第１８０９７７３．３号に記載の抗原結合ドメイン（以下を含むものなど）を有し得る：
ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：
ＣＤＲ１－ＮＦＡＭＡ（配列番号１０）
ＣＤＲ２－ＳＩＳＴＧＧＧＮＴＹＹＲＤＳＶＫＧ（配列番号１１）
ＣＤＲ３－ＱＲＮＹＹＤＧＳＹＤＹＥＧＹＴＭＤＡ（配列番号１２）；および
ｂ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：
ＣＤＲ１－ＲＳＳＱＤＩＧＮＹＬＴ（配列番号１３）
ＣＤＲ２－ＧＡＩＫＬＥＤ（配列番号１４）
ＣＤＲ３－ＬＱＳＩＱＹＰ（配列番号１５）

【0154】

ＣＤ２２ ＣＡＲの抗原結合ドメインは、配列番号１６として示した配列を有するＶＨドメイン；および配列番号１７として示した配列を有するＶＬドメインを含み得る。
配列番号１６
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＦＡＭＡＷＶＲＱＰＰＴＫＧＬＥＷＶＡＳＩＳＴＧＧＧＮＴＹＹＲＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＡＫＮＴＱＹＬＱＭＤＳＬＲＳＥＤＴＡＴＹＹＣＡＲＱＲＮＹＹＤＧＳＹＤＹＥＧＹＴＭＤＡＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
配列番号１７
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＴＣＲＳＳＱＤＩＧＮＹＬＴＷＦＱＱＫＶＧＲＳＰＲＲＭＩＹＧＡＩＫＬＥＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＳＤＹＳＬＴＩＳＳＬＥＳＥＤＶＡＤＹＱＣＬＱＳＩＱＹＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫ

【0155】

ＢＣＭＡ
いくつかのＢＣＭＡ標的ＣＡＲは、臨床開発中である（ｂｂ２１２１、ＬＣＡＲ－Ｂ３８Ｍ、ＭＣＡＲＨ１７１、ＪＣＡＲＨ１２５、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１、ＦＣＡＲＨ１４３、ｂｂ２１２１７、およびＣＴ０５３が含まれる）。

【0156】

ＷＯ２０１５／０５２５３８号は、抗原結合ドメインがＢＣＭＡの天然リガンドである増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）に由来するＢＣＭＡ標的ＣＡＲを記載している。

【0157】

英国特許出願第１８１５７７５．０号は、１４種のＢＣＭＡ結合ドメインについてのＶＨおよびＶＬドメインおよびＣＡＲにおけるその使用を記載している。

【0158】

ＰＳＭＡ
前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に特異的なＣＡＲを発現するＴ細胞は、前立腺がん処置について現在臨床試験中である（Ｊｕｎｈａｎｓ ｅｔ ａｌ（２０１６）Ｐｒｏｓｔａｔｅ ７６：１２５７－１２７０）。

【0159】

ＧＤ２
ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）（シアル酸含有スフィンゴ糖脂質（ｇｌｙｃｏｓｐｈｉｎｏｌｉｐｉｄ））に結合するＣＡＲが開発されている。かかるＣＡＲは、例えば、ＧＤ２バインダー１４ｇ２ａ、またはＷＯ２０１５／１３２６０４号に記載のｈｕＫ６６６に基づき得る。

【0160】

ＧＤ２に結合するＣＡＲは、以下を含む抗原結合ドメインを有し得る：
ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：
ＣＤＲ１－ＳＹＮＩＨ（配列番号７１）；
ＣＤＲ２－ＶＩＷＡＧＧＳＴＮＹＮＳＡＬＭＳ（配列番号７２）
ＣＤＲ３－ＲＳＤＤＹＳＷＦＡＹ（配列番号７３）；および
ｂ）以下の配列を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：
ＣＤＲ１－ＲＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＨ（配列番号７４）；
ＣＤＲ２－ＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号７５）
ＣＤＲ３－ＱＱＹＳＧＹＰＩＴ（配列番号７６）。

【0161】

ＧＤ２結合ドメインは、配列番号７７として示した配列を有するＶＨドメイン；および／または配列番号７８として示した配列を有するＶＬドメインを含み得る。
配列番号７７（ヒト化ＫＭ６６６ ＶＨ配列）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＡＳＹＮＩＨＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＡＧＧＳＴＮＹＮＳＡＬＭＳＲＬＴＩＳＫＤＮＳＫＮＱＶＦＬＫＭＳＳＬＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＫＲＳＤＤＹＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号７８（ヒト化ＫＭ６６６ ＶＨ配列）
ＥＮＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＨＷＹＱＱＫＳＧＫＡＰＫＶＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＳＧＹＰＩＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ

【0162】

ＦＣＲＬ５
市販のＦｃＲＬ５に対するモノクローナル抗体（ＣＤ３０７ｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびＲＥＡ３９１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）など）が公知である。

【0163】

ＷＯ２０１６０９０３３７号は、ＦｃＲＬ５に結合するいくつかのｓｃＦｖ型抗原結合ドメインを記載している。

【0164】

英国特許出願第１８１５７７５．０号は、抗ＦＣＲＬ５ ＣＡＲを記載している。

【0165】

ＣＤ７９
いくつかの抗ＣＤ７９抗体が以前に記載されている（ＪＣＢ１１７、ＳＮ８、ＣＢ３．１、２Ｆ２（ポラツズマブ）など）。

【0166】

英国特許出願第１８０７８７０．９号は、種々のＣＤ７９ ＣＡＲを記載している。

【0167】

ウイルスベクターの組成物がＣＡＲをコードする核酸配列を含む１つを超えるベクターを含む場合、ＣＡＲは、異なる抗原結合ドメインを有し得る。ＣＡＲは異なる抗原を認識し得るか、ＣＡＲは同一の抗原に結合し得るが、異なる抗原結合ドメインを有する。同一の抗原に結合するが、異なる抗原結合ドメインを有するＣＡＲは、抗原の異なるエピトープに結合し得、そして／または異なる親和性および／またはオンまたはオフレートを有し得る。

【0168】

ＣＡＲの標的抗原に対する親和性および／またはそのオンおよびオフレートは、ＣＡＲが標的細胞を死滅させる能力に影響を及ぼすことができる。例えば、米国特許出願公開第ＵＳ ２０１８／００６４７８５号において、オンレートおよびオフレートが迅速な抗体由来のＣＡＲによってＣＡＲ Ｔ細胞が標的細胞をより良好に連続的に死滅させることが報告されている。標的抗原に対する複数のＣＡＲを含むＣＡＲ－Ｔ細胞組成物を患者に投与することにより、患者または患者の特定の部位において標的細胞を死滅させるのに最良に適した抗原結合ドメインを有するＣＡＲは、活性化／生存／増殖シグナルを受け取り、優位になる。本発明の組成物はこの点における柔軟性を付与し、さらに、異なるＣＡＲを有するＣＡＲ－Ｔ細胞の亜集団が同一の患者内の異なる部位で「打ち勝つ」ことを可能にする。

【0169】

細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）
ＣＡＲは、活性化エンドドメイン（ＣＡＲのシグナル伝達部分）を含むか、これに会合し得る。抗原認識後、受容体のクラスターおよびシグナルが細胞に伝達される。最も一般的に使用されているエンドドメイン成分は、３つのＩＴＡＭを含むＣＤ３－ゼータのエンドドメイン成分である。これは、抗原への結合後にＴ細胞に活性化シグナルを伝達する。ＣＤ３－ゼータは、十分に適格な活性化シグナルを提供しない場合があり、さらなる共刺激シグナル伝達が必要であり得る。例えば、キメラＣＤ２８およびＯＸ４０を、増殖／生存シグナルを伝達させるためにＣＤ３－ゼータと共に使用することができるか、３つ全てを共に使用することができる。

【0170】

ＣＡＲのエンドドメインは、ＣＤ２８エンドドメインならびにＯＸ４０およびＣＤ３－ゼータエンドドメインを含み得る。

【0171】

エンドドメインは、以下を含み得る：
（ｉ）ＩＴＡＭ含有エンドドメイン（ＣＤ３ゼータ由来のエンドドメインなど）；および／または
（ｉｉ）共刺激ドメイン（ＣＤ２８由来のエンドドメインなど）；および／または
（ｉｉｉ）生存シグナルを伝達するドメイン（例えば、ＴＮＦ受容体ファミリーエンドドメイン（ＯＸ－４０または４－１ＢＢなど））。

【0172】

ＩＴＡＭモチーフを含むエンドドメインは、本発明において活性化エンドドメインとして作用することができる。いくつかのタンパク質は、１またはそれを超えるＩＴＡＭモチーフを有するエンドドメインを含むことが公知である。かかるタンパク質の例には、ＣＤ３イプシロン鎖、ＣＤ３ガンマ鎖、およびＣＤ３デルタ鎖が含まれる。ＩＴＡＭモチーフを、任意の２つの他のアミノ酸によってロイシンまたはイソロイシンと隔てられたチロシン（それにより、シグネチャーＹｘｘＬ／Ｉ（配列番号６０）が得られる）として容易に認識することができる。常にではないが典型的には、これらのモチーフのうちの２つは、分子のテールで６～８アミノ酸によって隔てられている（ＹｘｘＬ／Ｉｘ（６－８）ＹｘｘＬ／Ｉ）。それ故に、当業者は、活性化シグナルを伝達するために１またはそれを超えるＩＴＡＭを含む既存のタンパク質を容易に見出すことができる。さらに、モチーフが簡潔な二次構造および複雑な二次構造を必要としないことを考慮すると、当業者は、活性化シグナルを伝達するための人工ＩＴＡＭを含むポリペプチドを設計することができる（合成シグナル伝達分子に関するＷＯ２０００／０６３３７２号を参照のこと）。

【0173】

ＣＡＲの抗原認識部分がシグナル伝達部分由来の個別の分子上に存在するいくつかの系が記載されている（ＷＯ０１５／１５０７７１号；ＷＯ２０１６／１２４９３０号、およびＷＯ２０１６／０３０６９１号に記載のものなど）。本発明の方法で使用されるウイルスベクターのうちの１つまたは複数は、かかる「分割ＣＡＲ」をコードし得る。あるいは、１つのベクターは、抗原認識部分をコードする核酸配列を含み得、１つのベクターは、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列を含み得る。

【0174】

ウイルスベクターの組成物がＣＡＲをコードする核酸配列を含む１つを超えるベクターを含む場合、ＣＡＲは、異なるエンドドメインまたは異なるエンドドメインの組み合わせを有し得る。例えば、１つのＣＡＲは第２世代のＣＡＲであり得、１つのＣＡＲは第３世代のＣＡＲであり得る。あるいは、両方のＣＡＲが第２世代のＣＡＲであり得るが、異なる共刺激ドメインを有し得る。例えば、異なる第２世代のＣＡＲシグナル伝達ドメインには、以下が含まれる：４１ＢＢ－ＣＤ３ζ；ＯＸ４０－ＣＤ３ζ、およびＣＤ２８－ＣＤ３ζ。

【0175】

シグナルペプチド
ベクター組成物中の１またはそれを超える核酸配列は、ＣＡＲまたは活性調節因子が細胞の内側に発現される場合に、新生タンパク質が小胞体に導かれ、その後に細胞表面に導かれ、細胞表面で発現される（または分泌される）ようなシグナルペプチドをコードし得る。

【0176】

シグナルペプチドのコアは、単一のアルファ－ヘリックスを形成する傾向がある一続きの長い疎水性アミノ酸を含み得る。シグナルペプチドは、短い正電荷のアミノ酸鎖から始まる場合があり、これは、移動（translocation）中のポリペプチドの適切なトポロジー
を強化するのに役立つ。シグナルペプチドの末端では、典型的には、シグナルペプチダーゼによって認識および切断される一続きのアミノ酸が存在する。シグナルペプチダーゼは、移動中または移動完了後のいずれかにシグナルペプチドを切断して、遊離シグナルペプチドおよび成熟タンパク質を生成し得る。次いで、遊離シグナルペプチドは、特異的プロテアーゼによって消化される。

【0177】

シグナルペプチドは、分子のアミノ末端に存在し得る。

【0178】

ＣＡＲは、以下の一般式を有し得る：
シグナルペプチド－抗原結合ドメイン－スペーサードメイン－膜貫通ドメイン－細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）。

【0179】

スペーサー
ＣＡＲは、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインと接続し、かつ抗原結合ドメインをエンドドメインから空間的に分離するスペーサー配列を含む。可動性スペーサーにより、抗原結合ドメインを異なる方向に配向させて抗原結合を可能にする。

【0180】

スペーサー配列は、例えば、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジ、もしくはＣＤ８ストーク、またはその組み合わせを含み得る。スペーサーは、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジ、またはＣＤ８ストークと類似の長さおよび／またはドメインスペーシング特性を有する代替配列を代替的に含み得る。

【0181】

ウイルスベクターの組成物がＣＡＲをコードする核酸配列を含む１つを超えるベクターを含む場合、ＣＡＲは異なるスペーサーを有し得る。

【0182】

ＯＲゲート
本発明の細胞組成物は、２つまたはそれを超えるＣＡＲを含み得る。これは、各々がＣＡＲをコードする核酸配列を含む２またはそれを超えるベクターでの形質導入の結果としてであり得る；あるいは、２またはそれを超えるＣＡＲをコードする核酸構築物を含むシングルベクターでの形質導入の結果としてであり得る。

【0183】

ＣＡＲを、１またはそれより多くの他の賦活性または抑制性のキメラ抗原受容体と組み合わせて使用してよい。例えば、本発明のＣＡＲを、「論理ゲート」において１またはそれより多くのＣＡＲと組み合わせて使用してよく、ＣＡＲ組み合わせは、Ｔ細胞などの細胞によって発現されるとき、少なくとも２つの標的抗原の特定の発現パターンを検出することができる。少なくとも２つの標的抗原が抗原Ａおよび抗原Ｂとして任意に示される場合、３つの可能な選択肢は以下の通りである：
「ＯＲゲート」－Ｔ細胞は、抗原Ａまたは抗原Ｂのいずれかが標的細胞上に存在するときに引き起こす 「ＡＮＤゲート」－Ｔ細胞は、抗原ＡおよびＢの両方が標的細胞上に存在するときに引き起こす
「ＡＮＤ ＮＯＴゲート」－Ｔ細胞は、抗原Ａが単独で標的細胞上に存在する場合に引き起こすが、Ｔ細胞は、抗原ＡおよびＢの両方が標的細胞上に存在する場合に引き起こさない

【0184】

これらのＣＡＲ組み合わせを発現する操作されたＴ細胞を、２またはそれより多くのマーカーのがん細胞の特定の発現（または発現の欠如）に基づいて、がん細胞に精巧に特異的であるように調整することができる。

【0185】

かかる「論理ゲート」は、例えば、ＷＯ２０１５／０７５４６９号、ＷＯ２０１５／０７５４７０号、およびＷＯ２０１５／０７５４７０号に記載されている。

【0186】

「ＯＲゲート」は、標的細胞によって発現された個別の標的抗原にそれぞれ指向する２つまたはそれより多くの賦活ＣＡＲを含む。ＯＲゲートの利点は、有効性が抗原Ａ＋抗原Ｂとなるので、標的細胞上の有効に標的可能な抗原が増加することである。単一抗原のレベルが、ＣＡＲ－Ｔ細胞が有効に標的にするのに必要な閾値未満であり得るので、このことは標的細胞上に変動するか低い密度で発現される抗原に特に重要である。また、ＯＲゲートは、抗原回避現象が避けられる。例えば、いくつかのリンパ腫および白血病は、ＣＤ１９が標的にされた後にＣＤ１９陰性になる：この現象が起こる場合、別の抗原と組み合わせてＣＤ１９を標的にするＯＲゲートを使用すると「バックアップ」抗原が得られる。ＷＯ２０１６／１０２９６５号に記載のように、「バックアップ」抗原はＣＤ２２であり得る。

【0187】

活性調節因子
本発明の方法では、ウイルスベクター混合物中の少なくとも１つのベクターは、活性調節因子をコードする核酸配列を含み得る。これが事実である場合、本発明のＣＡＲ発現細胞組成物で形質導入された細胞の少なくとも一部は、１またはそれを超える活性調節因子を発現する。活性調節因子は、ＣＡＲの、ＣＡＲを発現する細胞の、または標的細胞の活性を調整するＣＡＲ発現細胞によって作製された分子である。

【0188】

活性調節因子は、細胞表面で発現されるか、ＣＡＲ発現細胞によって分泌される細胞内分子であり得る。

【0189】

ＣＡＲの活性の調整
１．ＩＴＡＭリン酸化の強化
ｉｎ ｖｉｖｏでのＴ細胞活性化中に（図２ａに模式的に示す）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）によって抗原認識されると、ＣＤ３ζ上の免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）がリン酸化される。リン酸化されたＩＴＡＭは、ＺＡＰ７０ ＳＨ２ドメインによって認識されてＴ細胞が活性化される。

【0190】

Ｔ細胞活性化は、ＴＣＲによる抗原認識を下流の活性化シグナルに変換するために速度論的分離（kinetic segregation）を使用する。簡潔に述べれば、基底状態では、Ｔ細胞膜上のシグナル伝達成分は動的ホメオスタシスにあるため、脱リン酸化されたＩＴＡＭがリン酸化されたＩＴＡＭよりも優先される。これは、ｌｃｋなどの膜係留キナーゼよりも膜貫通ＣＤ４５／ＣＤ１４８ホスファターゼの活性が高いことに起因する。Ｔ細胞が同族抗原のＴ細胞受容体（またはＣＡＲ）認識によって標的細胞に結合する場合、強固な免疫学的シナプスが形成される。このＴ細胞と標的膜が近接して並置されることにより、ＣＤ４５／ＣＤ１４８は、そのエクトドメインが巨大でシナプスに収まることができないために排除される。ホスファターゼの非存在下でシナプス中の高濃度のＴ細胞受容体に結合したＩＴＡＭおよびキナーゼが分離すると、リン酸化されたＩＴＡＭが優位の状態に至る。ＺＡＰ７０は、閾値のリン酸化されたＩＴＡＭを認識し、Ｔ細胞活性化シグナルを伝達する。

【0191】

この過程は、ＣＡＲ媒介性Ｔ細胞活性化中の過程と本質的に同一である。活性化ＣＡＲは、その細胞内シグナル伝達ドメイン内に１またはそれを超えるＩＴＡＭを含み、これは、通常は、このシグナル伝達ドメインがＣＤ３ζのエンドドメインを含むからである。ＣＡＲによって抗原が認識されると、ＣＡＲシグナル伝達ドメイン内のＩＴＡＭ（複数可）がリン酸化され、それによりＴ細胞が活性化される。

【0192】

図２ｂに模式的に示されるように、ＰＤ１などの抑制性免疫受容体により、リン酸化されたＩＴＡＭが脱リン酸化される。ＰＤ１は、そのエンドドメイン内にＩＴＩＭを有し、ＩＴＩＭは、ＰＴＰＮ６（ＳＨＰ－１）およびＳＨＰ－２などの分子のＳＨ２ドメインによって認識される。認識の際に、ＰＴＰＮ６は、膜近傍領域に動員され、そのホスファターゼドメインはその後にＩＴＡＭドメインを脱リン酸化し、免疫活性化が阻害される。

【0193】

ＣＡＲ活性を調整することができる活性調節因子は、ＣＡＲシグナル伝達ドメイン内のＩＴＡＭ（複数可）を直接または間接的にリン酸化することができる場合がある。

【0194】

１．１ キナーゼの供給または動員
例えば、活性調節因子は、キナーゼドメインを含むか、キナーゼドメインを含む個別の分子をＣＡＲの周辺に動員することができる膜標的分子であり得る。ＷＯ２０１８／１９３２３１号は、かかる「リン酸化増幅エンドドメイン」を有する種々の分子を記載している。

【0195】

ＩＴＡＭを直接リン酸化することができる活性調節因子は、チロシンキナーゼドメイン（Ｓｒｃファミリーキナーゼのキナーゼドメインなど）を含み得、その例には、Ｆｙｎ、Ｓｒｃ、Ｌｃｋ、またはその誘導体（Ｌｃｋ（Ｙ５０５Ｆ）など）が含まれる。Ｆｙｎ、Ｓｒｃ、Ｌｃｋ、およびＬｃｋ（Ｙ５０５）のチロシンキナーゼドメインを、配列番号１８～２１として以下にそれぞれ示す。

【0196】

Ｆｙｎのチロシンキナーゼドメイン（配列番号１８）
ＬＱＬＩＫＲＬＧＮＧＱＦＧＥＶＷＭＧＴＷＮＧＮＴＫＶＡＩＫＴＬＫＰＧＴＭＳＰＥＳＦＬＥＥＡＱＩＭＫＫＬＫＨＤＫＬＶＱＬＹＡＶＶＳＥＥＰＩＹＩＶＴＥＹＭＮＫＧＳＬＬＤＦＬＫＤＧＥＧＲＡＬＫＬＰＮＬＶＤＭＡＡＱＶＡＡＧＭＡＹＩＥＲＭＮＹＩＨＲＤＬＲＳＡＮＩＬＶＧＮＧＬＩＣＫＩＡＤＦＧＬＡＲＬＩＥＤＮＥＹＴＡＲＱＧＡＫＦＰＩＫＷＴＡＰＥＲＡＬＹＧＲＦＴＩＫＳＤＶＷＳＦＧＩＬＬＴＥＬＶＴＫＧＲＶＰＹＰＧＭＮＮＲＥＶＬＥＱＶＥＲＧＹＲＭＰＣＰＱＤＣＰＩＳＬＨＥＬＭＩＨＣＷＫＫＤＰＥＥＲＰＴＦＥＹＬＱＳＦＬＥＤＹＦ

【0197】

Ｓｒｃのチロシンキナーゼドメイン（配列番号１９）
ＬＲＬＥＶＫＬＧＱＧＣＦＧＥＶＷＭＧＴＷＮＧＴＴＲＶＡＩＫＴＬＫＰＧＴＭＳＰＥＡＦＬＱＥＡＱＶＭＫＫＬＲＨＥＫＬＶＱＬＹＡＶＶＳＥＥＰＩＹＩＶＴＥＹＭＳＫＧＳＬＬＤＦＬＫＧＥＴＧＫＹＬＲＬＰＱＬＶＤＭＡＡＱＩＡＳＧＭＡＹＶＥＲＭＮＹＶＨＲＤＬＲＡＡＮＩＬＶＧＥＮＬＶＣＫＶＡＤＦＧＬＡＲＬＩＥＤＮＥＹＴＡＲＱＧＡＫＦＰＩＫＷＴＡＰＥＡＡＬＹＧＲＦＴＩＫＳＤＶＷＳＦＧＩＬＬＴＥＬＴＴＫＧＲＶＰＹＰＧＭＶＮＲＥＶＬＤＱＶＥＲＧＹＲＭＰＣＰＰＥＣＰＥＳＬＨＤＬＭＣＱＣＷＲＫＥＰＥＥＲＰＴＦＥＹＬＱＡＦＬＥＤＹＦ

【0198】

Ｌｃｋのチロシンキナーゼドメイン（配列番号２０）：
ＬＫＬＶＥＲＬＧＡＧＱＦＧＥＶＷＭＧＹＹＮＧＨＴＫＶＡＶＫＳＬＫＱＧＳＭＳＰＤＡＦＬＡＥＡＮＬＭＫＱＬＱＨＱＲＬＶＲＬＹＡＶＶＴＱＥＰＩＹＩＩＴＥＹＭＥＮＧＳＬＶＤＦＬＫＴＰＳＧＩＫＬＴＩＮＫＬＬＤＭＡＡＱＩＡＥＧＭＡＦＩＥＥＲＮＹＩＨＲＤＬＲＡＡＮＩＬＶＳＤＴＬＳＣＫＩＡＤＦＧＬＡＲＬＩＥＤＮＥＹＴＡＲＥＧＡＫＦＰＩＫＷＴＡＰＥＡＩＮＹＧＴＦＴＩＫＳＤＶＷＳＦＧＩＬＬＴＥＩＶＴＨＧＲＩＰＹＰＧＭＴＮＰＥＶＩＱＮＬＥＲＧＹＲＭＶＲＰＤＮＣＰＥＥＬＹＱＬＭＲＬＣＷＫＥＲＰＥＤＲＰＴＦＤＹＬＲＳＶＬＥＤＦＦ

【0199】

Ｌｃｋ＿Ｙ５０５Ｆのチロシンキナーゼドメイン（配列番号２１）
ＬＫＬＶＥＲＬＧＡＧＱＦＧＥＶＷＭＧＹＹＮＧＨＴＫＶＡＶＲＳＬＫＱＧＳＭＳＰＤＡＦＬＡＥＡＮＬＭＫＱＬＱＨＱＲＬＶＲＬＹＡＶＶＴＱＥＰＩＹＩＩＴＥＹＭＥＮＧＳＬＶＤＦＬＫＴＰＳＧＩＫＬＴＩＮＫＬＬＤＭＡＡＱＩＡＥＧＭＡＦＩＥＥＲＮＹＩＨＲＤＬＲＡＡＮＩＬＶＳＤＴＬＳＣＫＩＡＤＦＧＬＡＲＬＩＥＤＮＥＹＴＡＲＥＧＡＫＦＰＩＫＷＴＡＰＥＡＩＮＹＧＴＦＴＩＫＳＤＶＷＳＦＧＩＬＬＴＥＩＶＴＨＧＲＩＰＹＰＧＭＴＮＰＥＶＩＱＮＬＥＲＧＹＲＭＶＲＰＤＮＣＰＥＥＬＹＱＬＭＲＬＣＷＫＥＲＰＥＤＲＰＴＦＤＹＬＲＳＶＬＥＤＦＦ

【0200】

ＩＴＡＭを間接的にリン酸化することができる活性調節因子は、ＣＤ４またはＣＤ８共受容体の細胞内ドメインを含み得る。

【0201】

上述のように、Ｔ細胞活性化中に、ＣＤ３（またはＣＡＲ）のＩＴＡＭは、Ｌｃｋによってリン酸化され、次いで、ＺＡＰ７０に結合する。ＺＡＰ７０がＣＤ３に結合した後に、共受容体ＣＤ４またはＣＤ８はＴＣＲ／ＣＤ３複合体と会合するようになり、主要適合遺伝子複合体（ｍａｊｏｒ ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ）（ＭＨＣ）に結合する。ＣＤ４／ＣＤ８共受容体の前述の複合体との会合により、ＴＣＲ－ＭＨＣペプチド（ＭＨＣｐ）相互作用が安定化し、動員された／遊離Ｌｃｋ（recruited/free Lck）がＣＤ３エレメント、ＺＡＰ７０、ならびに多くの他の下流標的をリン酸化し続ける
。

【0202】

ＣＤ４およびＣＤ８の細胞質尾部を含む活性調節因子は、Ｌｃｋの動員によってＣＡＲが生成したシグナルを増幅し、これは活性化されたＴ細胞のシグナル伝達カスケードの多数の分子成分の活性化に不可欠である。ヒトＣＤ４およびＣＤ８の細胞内ドメインの配列を、配列番号２２および２３として以下に示す。
ＣＤ４の細胞質尾部（配列番号２２）
ＣＶＲＣＲＨＲＲＲＱＡＥＲＭＳＱＩＫＲＬＬＳＥＫＫＴＣＱＣＰＨＲＦＱＫＴＣＳＰＩ
ＣＤ８の細胞質尾部（配列番号２３）
ＬＹＣＮＨＲＮＲＲＲＶＣＫＣＰＲＰＶＶＫＳＧＤＫＰＳＬＳＡＲＹＶ

【0203】

ＣＡＲ活性によって調整される活性調節因子は、膜に係留され得る。この点において、かかる活性調節因子は、膜貫通ドメイン配列またはミリストイル化配列を含み得る。

【0204】

ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性の調整
１．チェックポイント阻害
ＣＡＲ発現細胞活性を調整することができる活性調節因子は、阻害性免疫受容体（ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、またはＢＴＬＡ１など）によって媒介されるＣＡＲ媒介性Ｔ細胞活性化の阻害を遮断または軽減し得る（前述および図２ｂに模式的に記載）。

【0205】

活性調節因子は、阻害性免疫受容体に結合するか、阻害性免疫受容体（ｉｍｍｕｎｒｅｃｅｐｔｏｒ）のリガンドに結合する抗体などの作用因子であり得る。活性調節因子は、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、またはＢＴＬＡ１に結合し得るか、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、またはＢＴＬＡ１のリガンドに結合し得る。

【0206】

ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１
がんの病状において、上記のように、腫瘍細胞上のＰＤ－Ｌ１がＴ細胞上のＰＤ－１と相互作用するとＴ細胞活性化が軽減され、したがって、免疫系が腫瘍細胞を攻撃しようとするのを妨害する。ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１受容体との相互作用を遮断する阻害剤を使用すると、前述の方法でがんが免疫系を回避するのを防止することができる。いくつかのＰＤ－１阻害剤およびＰＤ－Ｌ１阻害剤は、数あるがんタイプのうちで特に、進行性黒色腫、非小細胞肺がん、腎細胞癌、膀胱がん、およびホジキンリンパ腫での使用について病院内で臨床試験中である。いくつかのかかる阻害剤が現在承認されている（ＰＤ１阻害剤ニボルマブおよびペムブロリズマブならびにＰＤ－Ｌ１阻害剤アテゾリズマブ、アベルマブ、およびデュルバルマブが含まれる）。

【0207】

ＣＴＬＡ４
ＣＴＬＡ４は、活性化されたＴ細胞によって発現され、Ｔ細胞に阻害シグナルを伝達する免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。ＣＴＬＡ４はＴ細胞共刺激タンパク質（ＣＤ２８）に類似し、両分子は抗原提示細胞上のＣＤ８０およびＣＤ８６（それぞれＢ７－１およびＢ７－２とも呼ばれる）に結合する。ＣＴＬＡ－４はＣＤ２８よりも高い親和性およびアビディティでＣＤ８０およびＣＤ８６に結合するため、ＣＴＬＡ－４はそのリガンドのために、ＣＤ２８を打ち負かすことができる。ＣＴＬＡ４はＴ細胞に阻害シグナルを伝達するのに対して、ＣＤ２８は刺激シグナルを伝達する。

【0208】

ＣＴＬＡ４に対するアンタゴニスト抗体には、イピリムマブおよびトレメリムマブが含まれる。

【0209】

ＬＡＧ－３
ＬＡＧ－３およびＣＤ２２３としても公知のリンパ球活性化遺伝子３は、Ｔ細胞機能に多様な生物学的効果を有する免疫チェックポイント受容体である。

【0210】

ＬＡＧ３に対する抗体には、現在のところ第１相臨床試験中のレラチマブおよび前臨床開発段階のいくつかの他の抗体が含まれる。ＬＡＧ－３は、ＣＴＬＡ－４またはＰＤ－１より良好なチェックポイント阻害剤の標的であり得るが、これは、これら２つのチェックポイントに対する抗体がエフェクターＴ細胞のみを活性化し、Ｔｒｅｇ活性を阻害しないのに対して、アンタゴニストＬＡＧ－３抗体はＴエフェクター細胞の活性化（予め活性化されたＬＡＧ－３＋細胞へのＬＡＧ－３阻害シグナルの下方調節による）および誘導性の（すなわち、抗原特異的）Ｔｒｅｇ抑制活性の阻害の両方が可能であるからである。ＬＡＧ－３抗体およびＣＴＬＡ－４抗体またはＰＤ－１抗体が関与する併用療法も進行中である。

【0211】

１．２ ドミナントネガティブＳＨＰ
阻害性免疫受容体（ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、またはＢＴＬＡ１など）によって媒介された阻害を遮断または軽減する活性調節因子は、ＩＴＡＭのリン酸化が有利となるように、Ｔ細胞：標的細胞シナプスでのリン酸化：脱リン酸化（ｄｅｐｈｏｓｐｏｒｙｌａｔｉｏｎ）のバランスを崩し、Ｔ細胞の活性化をもたらし得る。例えば、活性調節因子は、阻害性受容体（複数可）のエンドドメイン（ｅｎｄｏｄｍａｉｎ）においてＩＴＩＭのリン酸化を遮断または軽減し得るか、ＳＨＰ－１およびＳＨＰ－２などのタンパク質によるＣＡＲシグナル伝達ドメインにおけるＩＴＡＭの脱リン酸化を遮断または軽減し得る。

【0212】

ＷＯ２０１６／１９３６９６号は、Ｔ細胞：標的細胞シナプスでのリン酸化：脱リン酸化（ｄｅｐｈｏｓｐｏｒｙｌａｔｉｏｎ）のバランスを調整することができる種々の異なるタイプのタンパク質を記載している。例えば、活性調節因子は、一方または両方のＳＨ２ドメインを含むが、ホスファターゼドメインを欠くＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２の短縮形態を含み得る。ＣＡＲ－Ｔ細胞中で発現された場合、これらの分子は、野生型ＳＨＰ－１およびＳＨＰ－２のドミナントネガティブバージョンとして作用し、内因性分子とリン酸化されたＩＴＩＭへの結合を競合する。

【0213】

活性調節因子は、リン酸化された免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）に結合するが、ホスファターゼドメインを欠くタンパク質由来のＳＨ２ドメインを含む短縮タンパク質であり得る。短縮タンパク質は、一方または両方のＳＨＰ－１ ＳＨ２ドメインを含み得るが、ＳＨＰ－１ホスファターゼドメインを欠き得る。あるいは、短縮タンパク質は、一方または両方のＳＨＰ－２ ＳＨ２ドメインを含み得るが、ＳＨＰ－２ホスファターゼドメインを欠き得る。

【0214】

ＳＨＰ－１
Ｓｒｃ相同領域２ドメイン含有ホスファターゼ－１（ＳＨＰ－１）は、タンパク質チロシンホスファターゼファミリーのメンバーである。これは、ＰＴＰＮ６としても公知である。

【0215】

ＳＨＰ－１のＮ末端領域は、ＳＨＰ－１とその基質との相互作用を媒介する２つのタンデムＳＨ２ドメインを含む。Ｃ末端領域は、チロシン－タンパク質ホスファターゼドメインを含む。

【0216】

ＳＨＰ－１は、いくつかの抑制性免疫受容体またはＩＴＩＭ含有受容体に結合し、これらからのシグナルを伝播することができる。かかる受容体の例には、ＰＤ１、ＰＤＣＤ１、ＢＴＬＡ４、ＬＩＬＲＢ１、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５、ＫＩＲ３ＤＬ１、およびＫＩＲ３ＤＬ３が含まれるが、これらに限定されない。

【0217】

ヒトＳＨＰ－１タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号Ｐ２９３５０を有する。

【0218】

活性調節因子は、配列番号２４として以下に示すＳＨＰ－１タンデムＳＨ２ドメインを含むか、これからなり得る。

【0219】

ＳＨＰ－１ ＳＨ２完全ドメイン（配列番号２４）
ＭＶＲＷＦＨＲＤＬＳＧＬＤＡＥＴＬＬＫＧＲＧＶＨＧＳＦＬＡＲＰＳＲＫＮＱＧＤＦＳＬＳＶＲＶＧＤＱＶＴＨＩＲＩＱＮＳＧＤＦＹＤＬＹＧＧＥＫＦＡＴＬＴＥＬＶＥＹＹＴＱＱＱＧＶＬＱＤＲＤＧＴＩＩＨＬＫＹＰＬＮＣＳＤＰＴＳＥＲＷＹＨＧＨＭＳＧＧＱＡＥＴＬＬＱＡＫＧＥＰＷＴＦＬＶＲＥＳＬＳＱＰＧＤＦＶＬＳＶＬＳＤＱＰＫＡＧＰＧＳＰＬＲＶＴＨＩＫＶＭＣＥＧＧＲＹＴＶＧＧＬＥＴＦＤＳＬＴＤＬＶＥＨＦＫＫＴＧＩＥＥＡＳＧＡＦＶＹＬＲＱＰＹＹ

【0220】

ＳＨＰ－１は、配列のＮ末端の残基４～１００および１１０～２１３に２つのＳＨ２ドメインを有する。活性調節因子は、配列番号２５および２６として示した配列の一方または両方を含み得る。

【0221】

ＳＨＰ－１ ＳＨ２ １（配列番号２５）
ＷＦＨＲＤＬＳＧＬＤＡＥＴＬＬＫＧＲＧＶＨＧＳＦＬＡＲＰＳＲＫＮＱＧＤＦＳＬＳＶＲＶＧＤＱＶＴＨＩＲＩＱＮＳＧＤＦＹＤＬＹＧＧＥＫＦＡＴＬＴＥＬＶＥＹＹＴＱＱＱＧＶＬＱＤＲＤＧＴＩＩＨＬＫＹＰＬ

【0222】

ＳＨＰ－２ ＳＨ２ ２（配列番号２６）
ＷＹＨＧＨＭＳＧＧＱＡＥＴＬＬＱＡＫＧＥＰＷＴＦＬＶＲＥＳＬＳＱＰＧＤＦＶＬＳＶＬＳＤＱＰＫＡＧＰＧＳＰＬＲＶＴＨＩＫＶＭＣＥＧＧＲＹＴＶＧＧＬＥＴＦＤＳＬＴＤＬＶＥＨＦＫＫＴＧＩＥＥＡＳＧＡＦＶＹＬＲＱＰＹ

【0223】

活性調節因子は、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％の配列同一性を有する配列番号２４、２５、または２６のバリアントを含み得るが、但し、バリアントの配列が必要な性質を有するＳＨ２ドメイン配列であることを条件とする。換言すれば、バリアント配列は、ＳＨＰ－１を動員することが可能なＰＤ１、ＰＤＣＤ１、ＢＴＬＡ４、ＬＩＬＲＢ１、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５、ＫＩＲ３ＤＬ１、またはＫＩＲ３ＤＬ３のうちの少なくとも１つの細胞質尾部中のリン酸化されたチロシン残基に結合するはずである。

【0224】

ＳＨＰ－２
ＰＴＰＮ１１、ＰＴＰ－１Ｄ、およびＰＴＰ－２Ｃとしても公知のＳＨＰ－２は、タンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）ファミリーのメンバーである。ＰＴＰＮ６と同様に、ＳＨＰ－２は、そのＮ末端の２つのタンデムＳＨ２ドメイン、それに続くタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）ドメインからなるドメイン構造を有する。不活性状態では、Ｎ末端ＳＨ２ドメインは、ＰＴＰドメインに結合し、活性部位への潜在的な基質の接近を遮断する。したがって、ＳＨＰ－２は自己阻害される。標的ホスホ－チロシル残基への結合の際に、Ｎ末端ＳＨ２ドメインがＰＴＰドメインから放出され、自己阻害を軽減することによって酵素を触媒的に活性化する。

【0225】

ヒトＳＨＰ－２は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号Ｐ３５２３５－１を有する。

【0226】

活性調節因子は、配列番号２９として以下に示すＳＨＰ－１タンデムＳＨ２ドメインを含むか、これからなり得る。ＳＨＰ－１は、配列のＮ末端の残基６～１０２および１１２～２１６に２つのＳＨ２ドメインを有する。活性調節因子は、配列番号２７および２８として示した配列の一方または両方を含み得る。

【0227】

ＳＨＰ－２の第１のＳＨ２ドメイン（配列番号２７）
ＷＦＨＰＮＩＴＧＶＥＡＥＮＬＬＬＴＲＧＶＤＧＳＦＬＡＲＰＳＫＳＮＰＧＤＦＴＬＳＶＲＲＮＧＡＶＴＨＩＫＩＱＮＴＧＤＹＹＤＬＹＧＧＥＫＦＡＴＬＡＥＬＶＱＹＹＭＥＨＨＧＱＬＫＥＫＮＧＤＶＩＥＬＫＹＰＬ

【0228】

ＳＨＰ－２の第２のＳＨ２ドメイン（配列番号２８）
ＷＦＨＧＨＬＳＧＫＥＡＥＫＬＬＴＥＫＧＫＨＧＳＦＬＶＲＥＳＱＳＨＰＧＤＦＶＬＳＶＲＴＧＤＤＫＧＥＳＮＤＧＫＳＫＶＴＨＶＭＩＲＣＱＥＬＫＹＤＶＧＧＧＥＲＦＤＳＬＴＤＬＶＥＨＹＫＫＮＰＭＶＥＴＬＧＴＶＬＱＬＫＱＰＬ

【0229】

ＳＨＰ－２の両方のＳＨ２ドメイン（配列番号２９）
ＷＦＨＰＮＩＴＧＶＥＡＥＮＬＬＬＴＲＧＶＤＧＳＦＬＡＲＰＳＫＳＮＰＧＤＦＴＬＳＶＲＲＮＧＡＶＴＨＩＫＩＱＮＴＧＤＹＹＤＬＹＧＧＥＫＦＡＴＬＡＥＬＶＱＹＹＭＥＨＨＧＱＬＫＥＫＮＧＤＶＩＥＬＫＹＰＬＮＣＡＤＰＴＳＥＲＷＦＨＧＨＬＳＧＫＥＡＥＫＬＬＴＥＫＧＫＨＧＳＦＬＶＲＥＳＱＳＨＰＧＤＦＶＬＳＶＲＴＧＤＤＫＧＥＳＮＤＧＫＳＫＶＴＨＶＭＩＲＣＱＥＬＫＹＤＶＧＧＧＥＲＦＤＳＬＴＤＬＶＥＨＹＫＫＮＰＭＶＥＴＬＧＴＶＬＱＬＫＱＰＬ

【0230】

活性調節因子は、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％の配列同一性を有する配列番号２７、２８、または２９のバリアントを含み得るが、但し、バリアントの配列が必要な性質を有するＳＨ２ドメイン配列であることを条件とする。換言すれば、バリアント配列は、ＳＨＰ－２を動員することが可能なＰＤ１、ＰＤＣＤ１、ＢＴＬＡ４、ＬＩＬＲＢ１、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５、ＫＩＲ３ＤＬ１、またはＫＩＲ３ＤＬ３のうちの少なくとも１つの細胞質尾部中のリン酸化されたチロシン残基に結合するはずである。

【0231】

３．サイトカインおよびサイトカインシグナル伝達
活性調節因子は、サイトカインまたはケモカインであり得る。サイトカインは、ＣＡＲ発現細胞の活性を調整し、そして／または腫瘍微小環境を調整し得る。

【0232】

活性調節因子は、以下から選択されるサイトカインまたはケモカインであり得る：ＩＬ１２、ｆｌｅｘｉＩＬ１２、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ７、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＩＬ２、およびＣＣＬ１９。特に、この作用因子は、ＩＬ－７またはＩＬ－１２であり得る。

【0233】

ＩＬ－７は、Ｂ細胞およびＴ細胞の発生に重要なサイトカインである。ＩＬ－７は、複能性（多能性）造血幹細胞のリンパ球系前駆細胞への分化を刺激し、全てのリンパ球系細胞（Ｂ細胞、Ｔ細胞、およびＮＫ細胞）の増殖を刺激する。

【0234】

Ｉｌ－７および肝細胞成長因子（ＨＧＦ）はヘテロ二量体を形成し、プレ－プロＢ細胞成長刺激因子として機能する。このサイトカインは、初期Ｔ細胞発生中のＴ細胞受容体ベータ（ＴＣＲβ）のＶ（Ｄ）Ｊ再編成の補因子であることが見いだされている。ヒトＩｌ－７のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（受託番号Ｐ１３２３２）から入手可能である。

【0235】

インターロイキン１２（ＩＬ－１２）は、腫瘍微小環境を調整してがんに対する免疫応答を向け直すことに特に関心が持たれている強力な免疫調節性サイトカインである。ＩＬ－１２は全身毒性を示すため、ＩＬ－１２を局所産生する方法に関心が寄せられている。ＰＣＴ／ＧＢ２０１８／０５２２０４号は、環境代謝産物（キヌレニンなど）の存在下で活性化されるプロモーターの制御下でＩＬ－１２などの免疫調節サイトカインが産生される構築物を記載している。キヌレニンなどの代謝産物の存在下でＩＬ－１２が選択的に産生されると、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現する細胞が腫瘍微小環境に存在する場合のみにおいてＩＬ－１２を局所的に産生することができる。

【0236】

あるいは、免疫調節サイトカインは、フレーム－スリップモチーフまたは翻訳リードスルーモチーフ（translational readthrough motif）の下流に配置され得る。これによ
り、サイトカイン発現を制御し、ＣＡＲに関してサイトカインの発現のレベルを低下させる手段が得られる。

【0237】

フレーム－スリップモチーフ（ＦＳＭ）は、ウラシル、チミン、またはグアニンの各塩基の反復（配列ＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号６１）など）を含み得る。

【0238】

また、フレーム－スリップモチーフは、終止コドンを含み得る。例えば、ＦＳＭは、以下の配列のうちの１つを含み得る：
ＵＵＵＵＵＵＵＧＡ（配列番号６２）
ＵＵＵＵＵＵＵＡＧ（配列番号６３）
ＵＵＵＵＵＵＵＡＡ（配列番号６４）。

【0239】

翻訳リードスルーモチーフ（ＴＲＭ）は、配列ＳＴＯＰ－ＣＵＡＧまたはＳＴＯＰ－ＣＡＡＵＵＡ（ここで、「ＳＴＯＰ」は終止コドンである）を含み得る。例えば、翻訳リードスルーモチーフは、以下の配列のうちの１つを含み得る：
ＵＧＡ－ＣＵＡＧ（配列番号６５）
ＵＡＧ－ＣＵＡＧ（配列番号６６）
ＵＡＡ－ＣＵＡＧ（配列番号６７）
ＵＧＡ－ＣＡＡＵＵＡ（配列番号６８）
ＵＡＧ－ＣＡＡＵＵＡ（配列番号６９）
ＵＡＡ－ＣＡＡＵＵＡ（配列番号７０）。

【0240】

ＩＬ－１２は、２つの個別の遺伝子であるＩＬ－１２Ａ（ｐ３５）およびＩＬ－１２Ｂ（ｐ４０）によってコードされるヘテロ二量体サイトカインである。活性なヘテロ二量体（「ｐ７０」と呼ばれる）は、タンパク質合成後に形成される。活性調節因子は、「ｆｌｅｘｉ－ＩＬ１２」であり得、これは、リンカーによって連結されたＩＬ－１２αサブユニットとＩＬ－１２βサブユニットとの間の融合物である。安定なｆｌｅｘｉ－ＩＬ－１２配列を、配列番号８１として以下に示す。

【0241】

配列番号８１（ｆｌｅｘｉ－ＩＬ－１２配列）

【化1】

【化2】

【0242】

配列番号８１では、セリン－グリシンリンカーを、下線をつけた太字で示している。

【0243】

本発明の活性調節因子は、細胞の微小環境内の環境代謝産物の存在に応じて選択的に発現されるサイトカインであり得る。環境代謝産物は、アリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）を活性化し得る。環境代謝産物は、キヌレニなどのトリプトファン代謝産物であり得る。

【0244】

あるいは、作用因子は、サイトカインまたはケモカインの発現または活性に影響を及ぼし得る。例えば、作用因子は、サイトカインまたはケモカインのドミナントネガティブバージョンであり得る。ドミナントネガティブバージョンは、例えば、受容体に結合して野生型サイトカイン／ケモカインと競合するが、サイトカイン／ケモカインシグナル伝達を誘発しないサイトカイン／ケモカインの変異バージョンまたは短縮バージョンであり得る。

【0245】

例えば、作用因子は、サイトカイン受容体またはケモカイン受容体のドミナントネガティブバージョンであり得る。ドミナントネガティブバージョンは、例えば、サイトカインに結合して野生型サイトカイン／ケモカイン受容体へのその結合を遮断するサイトカイン／ケモカイン受容体の変異バージョンまたは短縮バージョンであり得る。

【0246】

あるいは、作用因子は、サイトカインまたはケモカインのシグナル伝達経路を遮断するか、そうでなければ調整する抗体または抗体断片であり得る。

【0247】

活性調節因子は、サイトカイン受容体エンドドメインを含むキメラサイトカイン受容体であり得る。

【0248】

活性調節因子は、Ｔ細胞増殖を強化するサイトカイン（ＩＬ－７など）由来のエンドドメインに融合した免疫阻害性サイトカイン（ＩＬ－４など）由来のエキソドメインを含み得る（Ｌｅｅｎ ｅｔ ａｌ（２０１４）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２２：１２１１－１２２０）。

【0249】

活性調節因子は、ＣＣＬ１９などのケモカインであり得る。ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１９（ＣＣＬ１９）は、ＥＢＩ１リガンドケモカイン（ＥＬＣ）およびマクロファージ炎症タンパク質－３－ベータ（ＭＩＰ－３－ベータ）としても公知のＣＣケモカインファミリーに属する小型サイトカインである。ＣＣＬ１９は、ケモカイン受容体ケモカイン受容体ＣＣＲ７への結合によってその標的細胞への効果を顕在化させる。ＣＣＬ１９は、ある特定の免疫系細胞（樹状細胞および抗原結合Ｂ細胞およびＣＣＲ７＋セントラルメモリーＴ細胞が含まれる）を誘引する。ヒトＣＣＬ１９のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（受託番号 Ｑ９９７３１）から入手可能である。

【0250】

３．１ キメラサイトカイン受容体
あるいは、活性調節因子は、非サイトカイン受容体エキソドメインを含み得る。ＷＯ２０１７／０２９５１２号は、以下を含むキメラサイトカイン受容体（ＣＣＲ）を記載している：腫瘍分泌因子、ケモカイン、および細胞表面抗原から選択されるリガンドに結合するエキソドメイン；およびサイトカイン受容体エンドドメイン。

【0251】

キメラサイトカイン受容体は、以下の２つのポリペプチドを含み得る：
（ｉ）以下を含む第１のポリペプチド：
（ａ）リガンドの第１のエピトープに結合する第１の抗原結合ドメイン
（ｂ）サイトカイン受容体エンドドメインの第１の鎖；および
（ｉｉ）以下を含む第２のポリペプチド：
（ａ）リガンドの第２のエピトープに結合する第２の抗原結合ドメイン（ｂ）サイトカイン－受容体エンドドメインの第２の鎖。

【0252】

あるいは、以下の２つのポリペプチドを含むキメラサイトカイン受容体：
（ｉ）以下を含む第１のポリペプチド：
（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）
（ｂ）サイトカイン受容体エンドドメインの第１の鎖；および
（ｉｉ）以下を含む第２のポリペプチド：
（ａ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
（ｂ）サイトカイン－受容体エンドドメインの第２の鎖。

【0253】

例えば、サイトカイン受容体エンドドメインは、以下を含み得る：
（ｉ）ＩＬ－２受容体β鎖エンドドメイン
（ｉｉ）ＩＬ－７受容体α鎖エンドドメイン；
（ｉｉｉ）ＩＬ－１５受容体α鎖エンドドメイン；または
（ｉｖ）共通のγ鎖受容体エンドドメイン。

【0254】

サイトカイン受容体エンドドメインは、（ｉ）、（ｉｉ）、または（ｉｉｉ）；および（ｉｖ）を含み得る。

【0255】

サイトカイン受容体エンドドメインは、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子受容体（ＧＭＣＳＦ－Ｒ）由来のα鎖エンドドメインおよびβ鎖エンドドメインを含み得る。

【0256】

リガンドは、腫瘍分泌因子、例えば、以下から選択される腫瘍分泌因子であり得る：前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、およびＣＡ１２５。

【0257】

リガンドは、ケモカイン、例えば、以下から選択されるケモカインであり得る：ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、およびＣＣＬ２２。

【0258】

リガンドは、細胞表面分子（膜貫通タンパク質など）であり得る。リガンドは、例えば、ＣＤ２２であり得る。

【0259】

構成性に活性なキメラサイトカイン受容体
活性調節因子は、構成性に活性なキメラサイトカイン受容体であり得る。活性調節因子は、自発的にか作用因子（二量体化の化学誘導物質すなわちＣＩＤ）の存在下で２つのサイトカイン受容体エンドドメインを一緒にして二量体化する２つの鎖を含み得る。

【0260】

したがって、活性調節因子は、二量体化ドメイン；およびサイトカイン受容体エンドドメインを含み得る。

【0261】

二量体化は自発的に起こる場合があり、この場合、キメラ膜貫通タンパク質は構成性に活性である。あるいは、二量体化は二量体化の化学誘導物質（ＣＩＤ）の存在下でのみ起こる場合があり、この場合、膜貫通タンパク質のみにより、ＣＩＤの存在下でサイトカイン型シグナル伝達が生じる。

【0262】

適切な二量体化ドメインおよびＣＩＤは、ＷＯ２０１５／１５０７７１号（その内容が本明細書中で参考として援用される）に記載されている。

【0263】

例えば、一方の二量体化ドメインがＦＫ結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）のラパマイシン結合ドメインを含む場合があり、他方はｍＴＯＲのＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインを含む場合があり；ＣＩＤは、ラパマイシンまたはその誘導体であり得る。

【0264】

一方の二量体化ドメインは、ＦＫ結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）のＦＫ５０６（タクロリムス）結合ドメインを含む場合があり、他方の二量体化ドメインは、シクロフィリンＡ（ｃｙｌｃｏｐｈｉｌｉｎ Ａ）のシクロスポリン結合ドメインを含む場合があり；ＣＩＤは、ＦＫ５０６／シクロスポリン融合物またはその誘導体であり得る。

【0265】

一方の二量体化ドメインは、エストロゲン結合ドメイン（ＥＢＤ）を含む場合があり、他方の二量体化ドメインは、ストレプトアビジン結合ドメインを含む場合があり；ＣＩＤは、エストロン／ビオチン融合タンパク質またはその誘導体であり得る。

【0266】

一方の二量体化ドメインは、糖質コルチコイド結合ドメイン（ＧＢＤ）を含む場合があり、他方の二量体化ドメインは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）結合ドメインを含む場合があり；ＣＩＤは、デキサメタゾン／メトトレキサート融合タンパク質またはその誘導体であり得る。

【0267】

一方の二量体化ドメインは、Ｏ６－アルキルグアニン－ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）結合ドメインを含む場合があり、他方の二量体化ドメインは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）結合ドメインを含む場合があり；ＣＩＤは、Ｏ６－ベンジルグアニン誘導体／メトトレキサー融合タンパク質またはその誘導体であり得る。

【0268】

一方の二量体化ドメインは、レチノイン酸受容体ドメインを含む場合があり、他方の二量体化ドメインは、エクジソン（ｅｃｏｄｙｓｏｎｅ）受容体ドメインを含む場合があり；ＣＩＤは、ＲＳＬ１またはその誘導体であり得る。

【0269】

二量体化ドメインが自発的にヘテロ二量体化する場合、このドメインは、抗体の二量体化ドメインに基づき得る。特に、二量体化ドメインは、重鎖定常ドメイン（ＣＨ）および軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）の二量体化部分を含み得る。定常ドメインの「二量体化部分」は、鎖間ジスルフィド結合を形成する配列の一部である。

【0270】

キメラサイトカイン受容体は、エキソドメインとして抗体のＦａｂ部分を含み得る。この点において、キメラ抗原は、以下の２つのポリペプチドを含み得る：
（ｉ）以下を含む第１のポリペプチド：
（ａ）重鎖定常ドメイン（ＣＨ）
（ｂ）サイトカイン受容体エンドドメインの第１の鎖；および
（ｉｉ）以下を含む第２のポリペプチド：
（ａ）軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）
（ｂ）サイトカイン－受容体エンドドメインの第２の鎖。

【0271】

サイトカイン受容体エンドドメインは、以下を含み得る：
（ｉ）ＩＬ－２受容体β鎖エンドドメイン
（ｉｉ）ＩＬ－７受容体α鎖エンドドメイン；または
（ｉｉｉ）ＩＬ－１５受容体α鎖エンドドメイン；および／または
（ｉｖ）共通のγ鎖受容体エンドドメイン。

【0272】

サイトカイン受容体エンドドメインは、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子受容体（ＧＭＣＳＦ－Ｒ）由来のα鎖エンドドメインおよびβ鎖エンドドメインを含み得る。

【0273】

ＩＬ－２、ＩＬ－７、またはＧＭ－ＣＳＦの各受容体エンドドメインを有する構成性に活性なＣＣＲは、以下の構造のうちの１つを有し得る：
Ｆａｂ＿ＣＣＲ＿ＩＬ２：ＨｕＬｉｇｈｔＫａｐｐａ－ＩＬ２ＲｇＴＭ－ＩＬ２ＲｇＥｎｄｏ－２Ａ－ＨｕＣＨ１－ＩＬ２ｂＴＭ－ＩＬ２ＲｂＥＮＤＯ
Ｆａｂ＿ＣＣＲ＿ＩＬ７：ＨｕＬｉｇｈｔＫａｐｐａ－ＩＬ２ＲｇＴＭ－ＩＬ２ＲｇＥｎｄｏ－２Ａ－ＨｕＣＨ１－ＩＬ７ＲａＴＭ－ＩＬ７ＲａＥＮＤＯ
Ｆａｂ＿ＣＣＲ＿ＧＭＣＳＦ：
ＨｕＬｉｇｈｔＫａｐｐａ－ＧＭＣＳＦＲｂＴＭ－ＧＭＣＳＦＲｂＥｎｄｏ－２Ａ－ＨｕＣＨ１－ＧＭＣＳＦＲａＴＭ－ＧＭＣＳＦＲａＥＮＤＯ
ここで、
ＨｕＬｉｇｈｔＫａｐｐａはヒトκ軽鎖であり、
ＩＬ２ＲｇＴＭは、ヒトＩＬ２Ｒ共通ガンマ鎖由来の膜貫通ドメインであり、
ＩＬ２ＲｇＥｎｄｏは、ヒトＩＬ２Ｒ共通ガンマ鎖由来のエンドドメインであり、
２Ａは、２Ａペプチドなどの自己切断ペプチドであり得る２つのポリペプチドの共発現（ｃｏ－ｅｘｐｅｓｉｏｎ）が可能な配列であり、
ＨｕＣＨ１はヒトＣＨ１であり、
ＩＬ２ｂＴＭは、ヒトＩＬ－２Ｒベータ由来の膜貫通ドメインであり、
ＩＬ２ＲｂＥＮＤＯは、ヒトＩＬ２Ｒベータ由来のエンドドメインであり、
ＩＬ７ＲａＴＭは、ヒトＩＬ－７Ｒアルファ由来の膜貫通ドメインであり、
ＩＬ７ＲａＥＮＤＯは、ヒトＩＬ－７Ｒアルファ由来のエンドドメインであり、
ＧＭＣＳＦＲｂＴＭは、ヒトＧＭ－ＣＳＦＲ共通ベータ鎖由来の膜貫通ドメインであり、
ＧＭＣＳＦＲｂＥｎｄｏは、ＧＭ－ＣＳＦＲ共通ベータ鎖由来のエンドドメインであり、
ＧＭＣＳＦＲａＴＭは、ヒトＧＦ－ＣＳＦＲアルファ由来の膜貫通ドメインであり、
ＧＭＣＳＦＲａＥＮＤＯは、ヒトＧＭ－ＣＳＦＲアルファ由来のエンドドメインである。

【0274】

配列番号３０～４３として以下に示した構成性に活性なサイトカイン受容体を作製するための成分の配列。

【0275】

配列番号３０（ヒトκ軽鎖）
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

【0276】

配列番号３１（ヒトヒンジ）
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＫＤＰＫ

【0277】

配列番号３２（ヒトＣＨ１）
ＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶ

【0278】

配列番号３３（ヒトＩＬ２Ｒ共通ガンマ鎖由来の膜貫通ドメイン）：
ＶＶＩＳＶＧＳＭＧＬＩＩＳＬＬＣＶＹＦＷＬ

【0279】

配列番号３４（ヒトＩＬ－２Ｒベータ由来の膜貫通ドメイン）
ＩＰＷＬＧＨＬＬＶＧＬＳＧＡＦＧＦＩＩＬＶＹＬＬＩ

【0280】

配列番号３６（ヒトＩＬ－７Ｒアルファ由来の膜貫通ドメイン）
ＰＩＬＬＴＩＳＩＬＳＦＦＳＶＡＬＬＶＩＬＡＣＶＬＷ

【0281】

配列番号３７（ヒトＧＦ－ＣＳＦＲアルファ由来の膜貫通ドメイン）
ＮＬＧＳＶＹＩＹＶＬＬＩＶＧＴＬＶＣＧＩＶＬＧＦＬＦ

【0282】

配列番号３８（ヒトＧＭ－ＣＳＦＲ共通ベータ鎖由来の膜貫通ドメイン）
ＶＬＡＬＩＶＩＦＬＴＩＡＶＬＬＡＬ

【0283】

配列番号３９（ヒトＩＬ２Ｒ共通ガンマ鎖由来のエンドドメイン）
ＥＲＴＭＰＲＩＰＴＬＫＮＬＥＤＬＶＴＥＹＨＧＮＦＳＡＷＳＧＶＳＫＧＬＡＥＳＬＱＰＤＹＳＥＲＬＣＬＶＳＥＩＰＰＫＧＧＡＬＧＥＧＰＧＡＳＰＣＮＱＨＳＰＹＷＡＰＰＣＹＴＬＫＰＥＴ

【0284】

配列番号４０（ヒトＩＬ－２Ｒベータ由来のエンドドメイン）
ＮＣＲＮＴＧＰＷＬＫＫＶＬＫＣＮＴＰＤＰＳＫＦＦＳＱＬＳＳＥＨＧＧＤＶＱＫＷＬＳＳＰＦＰＳＳＳＦＳＰＧＧＬＡＰＥＩＳＰＬＥＶＬＥＲＤＫＶＴＱＬＬＬＱＱＤＫＶＰＥＰＡＳＬＳＳＮＨＳＬＴＳＣＦＴＮＱＧＹＦＦＦＨＬＰＤＡＬＥＩＥＡＣＱＶＹＦＴＹＤＰＹＳＥＥＤＰＤＥＧＶＡＧＡＰＴＧＳＳＰＱＰＬＱＰＬＳＧＥＤＤＡＹＣＴＦＰＳＲＤＤＬＬＬＦＳＰＳＬＬＧＧＰＳＰＰＳＴＡＰＧＧＳＧＡＧＥＥＲＭＰＰＳＬＱＥＲＶＰＲＤＷＤＰＱＰＬＧＰＰＴＰＧＶＰＤＬＶＤＦＱＰＰＰＥＬＶＬＲＥＡＧＥＥＶＰＤＡＧＰＲＥＧＶＳＦＰＷＳＲＰＰＧＱＧＥＦＲＡＬＮＡＲＬＰＬＮＴＤＡＹＬＳＬＱＥＬＱＧＱＤＰＴＨＬＶ

【0285】

配列番号４１（ヒトＩＬ－７Ｒアルファ由来のエンドドメイン）
ＫＫＲＩＫＰＩＶＷＰＳＬＰＤＨＫＫＴＬＥＨＬＣＫＫＰＲＫＮＬＮＶＳＦＮＰＥＳＦＬＤＣＱＩＨＲＶＤＤＩＱＡＲＤＥＶＥＧＦＬＱＤＴＦＰＱＱＬＥＥＳＥＫＱＲＬＧＧＤＶＱＳＰＮＣＰＳＥＤＶＶＩＴＰＥＳＦＧＲＤＳＳＬＴＣＬＡＧＮＶＳＡＣＤＡＰＩＬＳＳＳＲＳＬＤＣＲＥＳＧＫＮＧＰＨＶＹＱＤＬＬＬＳＬＧＴＴＮＳＴＬＰＰＰＦＳＬＱＳＧＩＬＴＬＮＰＶＡＱＧＱＰＩＬＴＳＬＧＳＮＱＥＥＡＹＶＴＭＳＳＦＹＱＮＥＱ

【0286】

配列番号４２（ヒトＧＭ－ＣＳＦＲアルファ由来のエンドドメイン）
ＫＲＦＬＲＩＱＲＬＦＰＰＶＰＱＩＫＤＫＬＮＤＮＨＥＶＥＤＥＩＩＷＥＥＦＴＰＥＥＧＫＧＹＲＥＥＶＬＴＶＫＥＩＴ

【0287】

配列番号４３（ＧＭ－ＣＳＦＲ共通ベータ鎖由来のエンドドメイン）
ＲＦＣＧＩＹＧＹＲＬＲＲＫＷＥＥＫＩＰＮＰＳＫＳＨＬＦＱＮＧＳＡＥＬＷＰＰＧＳＭＳＡＦＴＳＧＳＰＰＨＱＧＰＷＧＳＲＦＰＥＬＥＧＶＦＰＶＧＦＧＤＳＥＶＳＰＬＴＩＥＤＰＫＨＶＣＤＰＰＳＧＰＤＴＴＰＡＡＳＤＬＰＴＥＱＰＰＳＰＱＰＧＰＰＡＡＳＨＴＰＥＫＱＡＳＳＦＤＦＮＧＰＹＬＧＰＰＨＳＲＳＬＰＤＩＬＧＱＰＥＰＰＱＥＧＧＳＱＫＳＰＰＰＧＳＬＥＹＬＣＬＰＡＧＧＱＶＱＬＶＰＬＡＱＡＭＧＰＧＱＡＶＥＶＥＲＲＰＳＱＧＡＡＧＳＰＳＬＥＳＧＧＧＰＡＰＰＡＬＧＰＲＶＧＧＱＤＱＫＤＳＰＶＡＩＰＭＳＳＧＤＴＥＤＰＧＶＡＳＧＹＶＳＳＡＤＬＶＦＴＰＮＳＧＡＳＳＶＳＬＶＰＳＬＧＬＰＳＤＱＴＰＳＬＣＰＧＬＡＳＧＰＰＧＡＰＧＰＶＫＳＧＦＥＧＹＶＥＬＰＰＩＥＧＲＳＰＲＳＰＲＮＮＰＶＰＰＥＡＫＳＰＶＬＮＰＧＥＲＰＡＤＶＳＰＴＳＰＱＰＥＧＬＬＶＬＱＱＶＧＤＹＣＦＬＰＧＬＧＰＧＰＬＳＬＲＳＫＰＳＳＰＧＰＧＰＥＩＫＮＬＤＱＡＦＱＶＫＫＰＰＧＱＡＶＰＱＶＰＶＩＱＬＦＫＡＬＫＱＱＤＹＬＳＬＰＰＷＥＶＮＫＰＧＥＶＣ

【0288】

活性調節因子は、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％の配列同一性を有する配列番号３０～４３のうちの１つまたは複数のバリアントを含み得るが、但し、バリアント配列は必要な性質を有することを条件とする。例えば、バリアントＣＨまたはＣＬ配列は、ＣＬ／ＣＨ含有鎖と二量体を形成する能力を保持すべきである。サイトカイン受容体エンドドメイン由来のバリアント鎖は、サイトカイン受容体の相互鎖（reciprocal chain）とカップリングした場合にサイトカイン媒介性シグナル伝達を誘発する能
力を保持すべきである。

【0289】

３．３ ＪＡＫ／ＳＴＡＴ
シグナル伝達兼転写活性化因子（ＳＴＡＴ）分子は、サイトカイン媒介性シグナル伝達に関与する転写因子のファミリーである。ＳＴＡＴ転写因子は、細胞表面受容体の細胞質領域に動員され、リン酸化によって活性化される。活性化された時点で、ＳＴＡＴ転写因子は二量体化して、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む活性化されたＳＴＡＴ分子を形成し、細胞核内に移動し、そこで遺伝子発現に影響を及ぼす。ＳＴＡＴ転写因子は、細胞成長過程および細胞分化の調節で役割を果たす。ＪＡＫ－ＳＴＡＴシグナル伝達は、以下の３つの主な成分からなる：（１）細胞膜を透過する受容体、（２）前述の受容体に結合されるヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）、および（３）シグナルを核およびＤＮＡ内に輸送するシグナル伝達兼転写活性化因子（ＳＴＡＴ）（図３を参照のこと）。

【0290】

細胞内に構成性に活性なまたは誘導性に活性なＪＡＫ分子またはＳＴＡＴ分子を含めることによって、ＣＡＲ発現細胞の生着および存続を強化することが可能である。国際特許出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２０１８／０５２５８３号は、構成性に活性なＳＴＡＴ分子（国際特許出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２０１８／０５２５８３号の図４）および誘導性ＳＴＡＴ分子（国際特許出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２０１８／０５２５８３号の図５）の種々の代替配置を記載している。

【0291】

国際特許出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２０１８／０５２５８３号に記載のように、構成性に活性なＪＡＫ分子は、構成性に活性なＳＴＡＴ分子について下記のように、自発的に二量体化するか、リンカーによって連結される２つのＪＡＫポリペプチドを発現することによって作製され得る。あるいは、機能獲得型変異を含む構成性に活性なＪＡＫが発現され得る。

【0292】

活性調節因子は、構成性に活性なまたは誘導性のシグナル伝達兼転写活性化因子（ＳＴＡＴ）分子であり得る。

【0293】

細胞のＳＴＡＴ分子は、第１の二量体化ドメイン（ＤＤ）を含む第１のＳＴＡＴポリペプチドおよび第１のＤＤに結合する第２のＤＤを含む第２のＳＴＡＴポリペプチドを含み得る。

【0294】

細胞のＳＴＡＴ分子の第１および第２のＤＤは、例えば、ロイシンジッパードメイン；または重鎖定常領域および軽鎖定常領域を含み得る。

【0295】

細胞の誘導性ＳＴＡＴ分子は、ＳＴＡＴ分子の第１のＤＤおよび第２のＤＤを二量体化させ、それにより、ＳＴＡＴ分子の活性化を誘導する作用因子の存在下で誘導性に活性であり得る。例えば、第１のＤＤはＦＲＢを含み得、第２のＤＤはＦＫＢＰ１２を含み得、作用因子はラパマイシンであり得る。

【0296】

あるいは、細胞のＳＴＡＴ分子は、ＳＴＡＴ分子の第１のＤＤおよび第２のＤＤを解離させ、それにより、ＳＴＡＴ分子の非活性化を誘導する作用因子の存在下で誘導性に不活性であり得る。第１のＤＤはＴｅｔＲＢを含み得、第２のＤＤはＴｉＰを含み得、作用因子は、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、またはミノサイクリンであり得る。

【0297】

構成性に活性なＳＴＡＴは、機能獲得型（ＧＯＦ）変異を含み得るか、リンカー配列によって連結された第１のＳＴＡＴポリペプチドおよび第２のＳＴＡＴポリペプチドを含み得る。

【0298】

細胞は、係留ドメインおよび第１の結合ドメイン（ＢＤ）を含む膜係留分子、ならびに第１のＢＤに特異的に結合する第２のＢＤを含む構成性に活性なＳＴＡＴ分子を含み得る。第１および第２のＢＤの結合は、作用因子の存在下で構成性に活性なＳＴＡＴ分子が膜係留分子から解離されるような作用因子の存在によって破壊することができ、それにより構成性に活性なＳＴＡＴ分子が自由に核に移動する。

【0299】

細胞のＳＴＡＴ分子の第１および第２のＤＤ；または細胞の膜係留分子の第１のＢＤおよび細胞のＳＴＡＴ分子の第２のＢＤは、Ｔｅｔ抑制タンパク質（ＴｅｔＲ）および転写誘導ペプチド（ＴｉＰ）をそれぞれ含み得；作用因子は、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、またはミノサイクリンであり得る。

【0300】

細胞は、ａ）ＳＴＡＴ放出ドメインによって連結されたＣＡＲおよび構成性に活性なＳＴＡＴ分子、およびｂ）ＳＴＡＴ放出分子であって、ＣＡＲに特異的な標的抗原を認識したときのみにＳＴＡＴ放出ドメインでＣＡＲから構成性に活性なＳＴＡＴ分子を放出し、その結果、放出の際に、構成性に活性なＳＴＡＴ分子が自由に核に移動する、ＳＴＡＴ放出分子を含み得る。

【0301】

ＳＴＡＴ放出分子は、例えばリン酸化された免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）に結合するＣＡＲ標的ドメインを含み得る。例えば、ＣＡＲ標的ドメインは、１またはそれを超えるＺＡＰ７０ ＳＨ２ドメインを含み得る。

【0302】

本発明の細胞のＳＴＡＴ放出ドメインは、プロテアーゼ切断部位を含み得、細胞のＳＴＡＴ放出分子は、プロテアーゼドメインを含み得、その結果、ＣＡＲの標的抗原の認識の際にプロテアーゼドメインがプロテアーゼ切断部位を切断し、ＳＴＡＴ分子が放出される。

【0303】

４．接着分子
細胞接着分子（ＣＡＭ）は、細胞表面上に存在し、細胞接着における他の細胞または細胞外マトリックス（ＥＣＭ）との結合に関与するタンパク質である。

【0304】

これらのタンパク質は、典型的には膜貫通受容体であり、以下の３つのドメインから構成される：細胞骨格と相互作用する細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、および同種の他のＣＡＭ（同種結合）または他のＣＡＭもしくは細胞外マトリックス（異種結合）のいずれかと相互作用する細胞外ドメイン。

【0305】

ほとんどのＣＡＭは、以下の４つのタンパク質ファミリーに属する：Ｉｇ（免疫グロブリン）スーパーファミリー（ＩｇＳＦ ＣＡＭ）、インテグリン、カドヘリン、およびセレクチン。

【0306】

本発明の活性調節因子は、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞の活性を調整する接着分子であり得るか、これらを含み得る。

【0307】

５．転写因子
本発明の作用因子は、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞の活性を調整する転写因子であり得るか、これらを含み得る。

【0308】

転写因子は、特異的ＤＮＡ配列への結合によってＤＮＡから伝令ＲＮＡへの遺伝情報の転写速度を制御し、前述の配列を含むか、前述の配列に近接する遺伝子の発現を調節するタンパク質である。

【0309】

転写因子は、ＲＮＡポリメラーゼの動員を促進するか（アクチベーターとして）、遮断する（リプレッサーとして）ことによって作用する。

【0310】

転写因子は、ＤＮＡのエンハンサー領域またはプロモーター領域のいずれかに付着する少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を含む。転写因子に応じて、隣接遺伝子の転写は、上方調節されるか下方調節される。また、転写因子は、転写共調節因子などの他のタンパク質の結合部位を有するトランス活性化ドメイン（ＴＡＤ）を含む。

【0311】

転写因子は、遺伝子発現調節のための種々の機序（ＤＮＡへのＲＮＡポリメラーゼの結合の安定化もしくは遮断、またはヒストンタンパク質のアセチル化もしくは脱アセチル化の触媒が含まれる）を使用する。転写因子は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）活性を有し得る（ヒストンタンパク質をアセチル化してＤＮＡのヒストンとの会合を減弱し、ＤＮＡをより転写しやすくし、それにより転写が上方調節される）。あるいは、転写因子は、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）活性を有し得る（ヒストンタンパク質を脱アセチル化してＤＮＡのヒストンとの会合を強化し、ＤＮＡをより転写しにくくし、それにより転写が下方調節される）。転写因子が機能し得る別の機序は、コアクチベータータンパク質またはコリプレッサータンパク質を転写因子ＤＮＡ複合体に動員することによる機序である。

【0312】

転写は、構成性に活性であるか条件的に（すなわち、活性化を必要とする）活性であり得る。

【0313】

転写因子は、天然に存在するか人工物であり得る。

【0314】

５．１ 転写再プログラミング
ＣＡＲ－Ｔ細胞を有効にするためには、ＣＡＲ－Ｔ細胞がｉｎ ｖｉｖｏで存続して拡大増殖し、過度の急速な分化および疲弊に耐性を示すことが重要である。ＣＡＲ Ｔ細胞の存続および生着は、ナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞、およびＴ幹細胞記憶Ｔ細胞の投与比率が関連する。

【0315】

ＷＯ２０１８／１１５８６５号は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および転写因子を共発現する細胞を記載している。転写因子が発現すると、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏでの細胞の分化および／または疲弊が防止または軽減される場合がある。細胞内でＣＡＲが転写因子と共発現することにより、細胞の分化および／または疲弊を防止または軽減することが可能である。これにより、免疫療法用の細胞組成物中のナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞、および幹細胞記憶細胞の比率が高くなり、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞がより有効に存続および拡大増殖される。

【0316】

本発明の活性調節因子は、転写因子であり得る。転写因子は、細胞の分化および／または疲弊を防止または軽減し得る。

【0317】

転写因子は、エフェクターメモリーリプレッサー（ＢＬＩＭＰ－１など）であり得る。

【0318】

あるいは、転写因子は、セントラルメモリーリプレッサー（ＢＣＬ６またはＢａｃｈ２など）であり得る。

【0319】

転写因子は、ＡＬＫによるリン酸化能が低下しているか除去されているＢａｃｈ２またはＢａｃｈ２の改変バージョンであり得るか、これらを含み得る。例えば、改変Ｂａｃｈ２は、１またはそれを超える以下の位置に変異を含み得る：Ｓｅｒ－５３５、Ｓｅｒ－５０９、Ｓｅｒ－５２０。

【0320】

転写因子は、ＦＯＸＯ１、ＥＯＭＥＳ、Ｒｕｎｘ３、またはＣＢＦベータであり得る。

【0321】

６．ＴＧＦβシグナル伝達の調整

【0322】

操作された細胞は、養子免疫療法が制限される厳しい微小環境に直面する。腫瘍微小環境内の主な阻害機序のうちの１つは、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）である。ＴＧＦβシグナル伝達経路は、種々の細胞過程を調節するシグナル伝達調節において極めて重要な役割を果たす。また、ＴＧＦβは、Ｔ細胞ホメオスタシスおよび細胞機能の調節において中心的な役割を果たす。特に、ＴＧＦβシグナル伝達は、Ｔ細胞の免疫低下状態（増殖および活性化の低下）に関与する。ＴＧＦβ発現は、腫瘍の免疫抑制性微小環境に関連する。

【0323】

種々のがん性腫瘍細胞は、ＴＧＦβを直接産生することが公知である。がん性細胞によるＴＧＦβ産生に加えて、ＴＧＦβは、腫瘍部位に存在する多種多様ながん性細胞（腫瘍関連Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、上皮細胞、および間質細胞など）が産生できる。

【0324】

トランスフォーミング成長因子ベータ受容体は、セリン／トレオニンキナーゼ受容体のスーパーファミリーである。これらの受容体は、成長因子およびサイトカインシグナル伝達タンパク質のＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーに結合する。５つのＩＩ型受容体（活性型受容体である）および７つのＩ型受容体（シグナル伝達型伝播受容体である）が存在する。

【0325】

補助共受容体（ＩＩＩ型受容体としても公知）も存在する。リガンドのＴＧＦβスーパーファミリーの各サブファミリーは、Ｉ型受容体およびＩＩ型受容体に結合する。

【0326】

３つのトランスフォーミング成長因子は、多くの活性を有する。ＴＧＦβ１および２は、がんに関与し、これらは、がん幹細胞を刺激し、線維症／線維形成性反応を増大させ、腫瘍の免疫認識を抑制し得る。

【0327】

ＴＧＦβ１、２、および３は、受容体ＴβＲＩＩへの結合、その後のＴβＲＩへの会合、ＴＧＦβ２の場合はさらなるＴβＲＩＩＩへの会合によってシグナルを伝達する。これにより、ＴβＲＩを介したＳＭＡＤによってその後にシグナルが伝達される。

【0328】

ＴＧＦβは、典型的には、プレプロ形態で分泌される。「プレ」は、小胞体（ＥＲ）へ侵入した際に切断されるＮ末端シグナルペプチドである。「プロ」は、ＥＲ中で切断されるが共有結合が持続し、ＴＧＦβ周囲に潜伏関連ペプチド（ＬＡＰ）と呼ばれるケージを形成する。ケージは、種々のプロテアーゼ（特にトロンビンおよびメタロプロテアーゼが含まれる）に反応して開く。Ｃ末端領域は、タンパク質分解的切断によるプロ領域からのＴＧＦβ分子の放出後に成熟ＴＧＦβ分子になる。成熟ＴＧＦβタンパク質が二量体化して、活性なホモ二量体を産生する。

【0329】

ＴＧＦβホモ二量体は、ＴＧＦβ遺伝子産物のＮ末端領域由来のＬＡＰと相互作用して、小型の潜伏型複合体（ＳＬＣ）と呼ばれる複合体を形成する。この複合体は、別のタンパク質（潜伏型ＴＧＦβ結合タンパク質（ＬＴＢＰ）と呼ばれる細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質）に結合されるまで細胞内に残存し、このタンパク質と共に大型の潜伏型複合体（ＬＬＣ）と呼ばれる複合体を形成する。ＬＬＣは、ＥＣＭに分泌される。ＴＧＦβは、いくつかのプロテアーゼクラス（メタロプロテアーゼおよびトロンビンが含まれる）によってこの複合体から生物学的に活性な形態に放出される。

【0330】

本発明の活性調節因子は、ＴＧＦβシグナル伝達を調整し得る。

【0331】

例えば、活性調節因子は、ＴＧＦβ受容体へのＴＧＦβ結合を遮断または軽減し得る；活性調節因子は、ＴＧＦβまたはＴＧＦβＲと、ＴＧＦβＲまたはＴＧＦβへの結合を競合し得る；あるいは、活性調節因子は、例えばＳＭＡＤを介した下流ＴＧＦβシグナル伝達を調整し得る。

【0332】

活性調節因子は、ＴＧＦβまたはＴＧＦβ受容体に結合する抗体などの作用因子であり得る。

【0333】

フレソリムマブは、ＴＧＦβ１～３を遮断する免疫調節性抗体である。フレソリムマブは、転移性黒色腫および高悪性度神経膠腫で試験されている。フレソリムマブは、腫瘍特異的免疫応答の増強効果をいくらか示したが、腫瘍を根絶できなかった。ＴＧＦβに結合する他の抗体には、レルデリムバブおよびメテリムマブが含まれる。
Ｂｅｄｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ（２０１６）は、複数のＴＧＦβイソ型を中和する種々のヒトモノクローナル抗体を記載している（ＭＡｂｓ ８（２）：３８９－４０４）。

【0334】

あるいは、活性調節因子は、ＴβＲＩＩ（ＴβＲＩＩ－Ｆｃ）またはＩＩＩ型受容体（ベータグリカン）のいずれかの可溶性エクトドメインを含む組み換えＦｃ－融合タンパク質であり得る。可溶性ＴβＲＩＩおよび可溶性ＴβＲＩＩＩ（βグリカン）は、ＴＧＦ－βの結合を防止するデコイ受容体として機能する。

【0335】

６．１ ドミナントネガティブＴＧＦβ
活性調節因子は、トランスフォーミング成長因子ベータ受容体（ＴβＲ）に結合してトランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）とのＴβＲの相互作用を破壊することができる分泌性因子であり得る。

【0336】

活性調節因子は、ドミナントネガティブＴＧＦβであり得る。

【0337】

本明細書中で使用される「ドミナントネガティブＴＧＦβ」またはｄｎＴＧＦβは、分泌性因子ＴＧＦβが野生型ＴＧＦβに拮抗的に作用することを意味する。

【0338】

ドミナントネガティブＴＧＦβは、野生型ＴＧＦβによって誘導されたシグナル伝達を阻害するため、その生物学的作用を中和する。

【0339】

活性調節因子は、変異体ＴＧＦβであり得る。

【0340】

野生型ＴＧＦβ２の成熟タンパク質を、配列番号４４として以下に示す。
ＡＬＤＡＡＹＣＦＲＮＶＱＤＮＣＣＬＲＰＬＹＩＤＦＫＲＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＮＡＮＦＣＡＧＡＣＰＹＬＷＳＳＤＴＱＨＳＲＶＬＳＬＹＮＴＩＮＰＥＡＳＡＳＰＣＣＶＳＱＤＬＥＰＬＴＩＬＹＹＩＧＫＴＰＫＩＥＱＬＳＮＭＩＶＫＳＣＫＣＳ（配列番号４４）。

【0341】

変異体ＴＧＦβは、アミノ酸番号を配列番号４４とのアラインメントによって決定した場合に、アミノ酸残基Ｗ３０、Ｗ３２、Ｌ１０１、Ｌ５１、Ｑ６７、およびＹ６に１またはそれを超える変異を含み得、変異は以下の通りである：
アミノ酸残基３０は、Ｎ、Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｑ、Ｌ、Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｉ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ａ、またはＥに変異しており；そして／または
アミノ酸残基３２は、Ａに変異しており；そして／または
アミノ酸残基１０１は、Ａ、Ｅに変異しており；そして／または
アミノ酸残基５１は、Ｑ、Ｗ、Ｙ、Ａに変異しており；そして／または
アミノ酸残基６７は、Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｙに変異しており；そして／または
アミノ酸残基６は、Ａまたはそのバリアントに変異している。

【0342】

あるいは、活性調節因子は、短縮ＴＧＦβポリペプチド（単量体ＴＧＦβなど）を含み得る。Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ（２０１７）は、ＴＧＦβシグナル伝達を遮断するためのドミナントネガティブとして機能する操作されたＴＧＦβ単量体を記載している（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１６．７６８７５４）。

【0343】

短縮ＴＧＦβは、ヒールヘリックスα３（ＴＧＦβＩ型受容体（ＴβＲＩ）への結合に不可欠であるが、ＴβＲＩＩへの結合には必ずしも必要でない構造モチーフ）を欠き得る。

【0344】

ＴＧＦβ単量体のアミノ酸配列を配列番号４５に記載する。配列番号４５は、シグナルペプチドおよび潜伏関連ペプチド（ＬＡＰ）を含む。
ＭＨＹＣＶＬＳＡＦＬＩＬＨＬＶＴＶＡＬＳＬＳＴＣＳＴＬＤＭＤＱＦＭＲＫＲＩＥＡＩＲＧＱＩＬＳＫＬＫＬＴＳＰＰＥＤＹＰＥＰＥＥＶＰＰＥＶＩＳＩＹＮＳＴＲＤＬＬＱＥＫＡＳＲＲＡＡＡＣＥＲＥＲＳＤＥＥＹＹＡＫＥＶＹＫＩＤＭＰＰＦＦＰＳＥＮＡＩＰＰＴＦＹＲＰＹＦＲＩＶＲＦＤＶＳＡＭＥＫＮＡＳＮＬＶＫＡＥＦＲＶＦＲＬＱＮＰＫＡＲＶＰＥＱＲＩＥＬＹＱＩＬＫＳＫＤＬＴＳＰＴＱＲＹＩＤＳＫＶＶＫＴＲＡＥＧＥＷＬＳＦＤＶＴＤＡＶＨＥＷＬＨＨＫＤＲＮＬＧＦＫＩＳＬＨＣＰＣＣＴＦＶＰＳＮＮＹＩＩＰＮＫＳＥＥＬＥＡＲＦＡＧＩＤＧＴＳＴＹＴＳＧＤＱＫＴＩＫＳＴＲＫＫＮＳＧＫＴＰＨＬＬＬＭＬＬＰＳＹＲＬＥＳＱＱＴＮＲＲＫＫＲＡＬＤＡＡＹＣＦＲＮＶＱＤＮＣＣＬＲＰＬＹＩＤＦＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＮＡＮＦＣＡＧＡＣＰＹＲＡＳＫＳＰＳＣＶＳＱＤＬＥＰＬＴＩＶＹＹＶＧＲＫＰＫＶＥＱＬＳＮＭＩＶＫＳＣＫＣＳ（配列番号４５）。

【0345】

活性調節因子は、配列番号４５に記載のアミノ酸配列またはそのバリアントを有し得る。バリアントＴＧＦβ単量体は、配列番号４５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有し得るが、但し、ポリペプチドが、トランスフォーミング成長因子ベータ受容体（ＴβＲ）に結合し、かつトランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）との相互作用を破壊することができる単量体を提供することを条件とする。

【0346】

６．２ ドミナントネガティブＴＧＦβ受容体
活性ＴＧＦβ受容体（ＴβＲ）は、２つのＴＧＦβ受容体Ｉ（ＴβＲＩ）および２つのＴＧＦβ受容体 ＩＩ（ＴβＲＩＩ）によって構成されるヘテロ四量体である。ＴＧＦβ１は、潜伏形態で分泌され、複数の機序によって活性化される。活性化された時点で、ＴＧＦβ１はＴβＲＩＩ、ＴβＲＩと複合体を形成し、ＴβＲＩがリン酸化および活性化される。

【0347】

活性調節因子は、ドミナントネガティブＴＧＦβ受容体であり得る。ドミナントネガティブＴＧＦβ受容体は、キナーゼドメインを欠き得る。

【0348】

例えば、活性調節因子は、ＴＧＦ受容体ＩＩの単量体バージョンである配列番号４６として示した配列を含むか、これからなり得る。

【0349】

配列番号４６（ｄｎＴＧＦβ ＲＩＩ）
ＴＩＰＰＨＶＱＫＳＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤＬＬＬＶＩＦＱＶＴＧＩＳＬＬＰＰＬＧＶＡＩＳＶＩＩＩＦＹＣＹＲＶＮＲＱＱＫＬＳＳ

【0350】

ドミナントネガティブＴＧＦ－βＲＩＩ（ｄｎＴＧＦ－βＲＩＩ）は、侵襲性ヒト前立腺がんマウスモデルにおけるＰＳＭＡ標的ＣＡＲ－Ｔ細胞増殖、サイトカイン分泌、疲弊耐性、長期ｉｎ ｖｉｖｏ存続、および腫瘍根絶の誘導を増強することが報告されている（Ｋｌｏｓｓ ｅｔ ａｌ（２０１８）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２６：１８５５－１８６６）。

【0351】

６．３ ＳＭＡＤ
上述のように、活性ＴＧＦβ受容体（ＴβＲ）は、２つのＴＧＦβ受容体 Ｉ（ＴβＲＩ）および２つのＴＧＦβ受容体 ＩＩ（ＴβＲＩＩ）によって構成されるヘテロ四量体である。活性化されたＴＧＦ－βが親和性の高いトランスフォーミング成長因子－β受容体－２（ＴβＲＩＩ）に結合したときにシグナル伝達が開始される。この結合には、トランスフォーミング成長因子－β受容体－３（ＴβＲＩＩＩ）（βグリカンとしても公知であり、ＴβＲＩＩの高次構造を変化させてリガンド－受容体結合を容易にする）の関与を必要とし、次いで、ＴＧＦ－β受容体－１／ＡＬＫ－５（ＴβＲ１）（セリン／トレオニンキナーゼ）がＴＧＦ－β／ＴβＲＩＩ複合体に動員され、ＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３（ＳＭＡＤタンパク質の受容体調節ファミリーに属する）のリン酸化によってシグナル伝達を開始する。リン酸化されたＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３が組み合わされてＳＭＡＤ４とヘテロマー複合体を形成し、この複合体が細胞核に移行して種々の転写因子と相互作用し、最終的に細胞応答に至る。

【0352】

ＳＭＡＤタンパク質は、ＴＧＦβの活性化の際に細胞外シグナルを膜から核へ伝達するための細胞内転写因子である。以下の３つのタイプのＳＭＡＤが同定されている：受容体調節ＳＭＡＤ（Ｒ－ＳＭＡＤ）（ＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３が含まれる）およびコモンメディエーターＳＭＡＤ（ｃｏ－ＳＭＡＤ）（ＳＭＡＤ４のみが含まれる。最後に、阻害性ＳＭＡＤ（Ｉ－ＳＭＡＤ）（ＳＭＡＤ６およびＳＭＡＤ７が含まれる）。

【0353】

ＳＭＡＤタンパク質は、リンカー領域によって連結された２つの球状ドメインからなる。ＳＭＡＤのＮ末端ドメイン（すなわち、「Ｍａｄホモロジー１」（ＭＨ１）ドメイン）の主な機能は、ＤＮＡに結合することである。Ｃ末端ドメイン（すなわち、ＭＨ２ドメイン）は、多数のレギュレータータンパク質およびエフェクタータンパク質（ＴβＲ受容体が含まれる）、ある特定の細胞質アンカータンパク質、系列特異的ＤＮＡ結合補因子、およびクロマチン修飾因子とのタンパク質間相互作用を媒介する。ＴＧＦβの存在下で、Ｒ－ＳＭＡＤは、ＴＧＦβ受容体によってリン酸化される。このリン酸化は、ＳＭＡＤのＣ末端配列ｐＳｅｒ－Ｘ－ｐＳｅｒ中の２つのセリン残基を標的にし、ＳＭＡＤ転写複合体の形成を駆動する酸性テールが生成される。ＭＨ２ドメインのＮ末端部分内の２つの保存されたアミノ酸のミスセンス変異が、結腸直腸がん患者で同定されている。これら２つの変異により、ＷＴ ＳＭＡＤタンパク質の活性に対抗するドミナントネガティブな挙動が獲得される。

【0354】

活性調節因子は、単剤療法としてか、アルキル化剤である、膠芽細胞腫用のロムスチンまたはテモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌａｍｉｄｅ）との組み合わせ、および他の組み合わせで試験されているガルニセルチブなどのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤であり得る。

【0355】

あるいは、活性調節因子は、ＭＨ２ドメインのみを発現するシグナル短縮ＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３およびＳＭＡＤ４のドミナントネガティブバージョンであり得る。活性調節因子は、以下であり得る：ｉ）ＭＨ２、ｉｉ）短縮された最後の２４ａａを欠くＭＨ２、およびｉｉｉ）短縮ＳＭＡＤ２＿ＭＨ２－リンカー－ＳＭＡＤ３＿ＭＨ２。これらのドミナントネガティブは、野生型ＳＭＡＤタンパク質と、受容体ドッキングドメインについておよびパートナータンパク質との結合について競合するため、ＴＧＦβシグナル伝達が軽減または遮断される。

【0356】

ｄｎＳＭＡＤは、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、および／またはＳＭＡＤ４のうちの１つまたは複数から選択され得る。ｄｎＳＭＡＤは、機能的なＭＨ１ドメインを欠く。

【0357】

ＭＨ１ドメインは、ＳＭＡＤタンパク質のＮ末端の保存されたＭＡＤホモロジードメインである。ＭＨ１ドメインは、ＤＮＡに結合することができ、ＭＨ２ドメインの機能を負に調節する。

【0358】

ＭＨ２ドメインは、ＳＭＡＤタンパク質のＣ末端の保存されたＭＡＤホモロジードメインである。ＭＨ２ドメインは、中央のβ－サンドイッチを保存されたループ－ヘリックスと共に含み、ホスホ－セリン残基に結合することができる。ＭＨ２ドメインは、レギュレータータンパク質およびエフェクタータンパク質（ＴβＲ受容体、細胞質アンカータンパク質、系列特異的ＤＮＡ結合補因子、およびクロマチン修飾因子が含まれる）とのタンパク質：タンパク質相互作用を媒介する

【0359】

活性調節因子は、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、およびＳＭＡＤ４由来の野生型 ＭＨ２ドメインを含み得るか、これらから本質的になり得るか、これらからなり得る。これらのＭＨ２ドメインのアミノ酸配列を、配列番号４７～４９として以下に示す。
ＷＣＳＩＡＹＹＥＬＮＱＲＶＧＥＴＦＨＡＳＱＰＳＬＴＶＤＧＦＴＤＰＳＮＳＥＲＦＣＬＧＬＬＳＮＶＮＲＮＡＴＶＥＭＴＲＲＨＩＧＲＧＶＲＬＹＹＩＧＧＥＶＦＡＥＣＬＳＤＳＡＩＦＶＱＳＰＮＣＮＱＲＹＧＷＨＰＡＴＶＣＫＩＰＰＧＣＮＬＫＩＦＮＮＱＥＦＡＡＬＬＡＱＳＶＮＱＧＦＥＡＶＹＱＬＴＲＭＣＴＩＲＭＳＦＶＫＧＷＧＡＥＹＲＲＱＴＶＴＳＴＰＣＷＩＥＬＨＬＮＧＰＬＱＷＬＤＫＶＬＴＱＭＧＳＰＳＶＲＣＳＳＭＳ（配列番号４７－ＳＭＡＤ２のＭＨ２ドメイン）

ＷＣＳＩＳＹＹＥＬＮＱＲＶＧＥＴＦＨＡＳＱＰＳＭＴＶＤＧＦＴＤＰＳＮＳＥＲＦＣＬＧＬＬＳＮＶＮＲＮＡＡＶＥＬＴＲＲＨＩＧＲＧＶＲＬＹＹＩＧＧＥＶＦＡＥＣＬＳＤＳＡＩＦＶＱＳＰＮＣＮＱＲＹＧＷＨＰＡＴＶＣＫＩＰＰＧＣＮＬＫＩＦＮＮＱＥＦＡＡＬＬＡＱＳＶＮＱＧＦＥＡＶＹＱＬＴＲＭＣＴＩＲＭＳＦＶＫＧＷＧＡＥＹＲＲＱＴＶＴＳＴＰＣＷＩＥＬＨＬＮＧＰＬＱＷＬＤＫＶＬＴＱＭＧＳＰＳＩＲＣＳＳＶＳ（配列番号４８－ＳＭＡＤ３のＭＨ２ドメイン）

ＷＣＳＩＡＹＦＥＭＤＶＱＶＧＥＴＦＫＶＰＳＳＣＰＩＶＴＶＤＧＹＶＤＰＳＧＧＤＲＦＣＬＧＱＬＳＮＶＨＲＴＥＡＩＥＲＡＲＬＨＩＧＫＧＶＱＬＥＣＫＧＥＧＤＶＷＶＲＣＬＳＤＨＡＶＦＶＱＳＹＹＬＤＲＥＡＧＲＡＰＧＤＡＶＨＫＩＹＰＳＡＹＩＫＶＦＤＬＲＱＣＨＲＱＭＱＱＱＡＡＴＡＱＡＡＡＡＡＱＡＡＡＶＡＧＮＩＰＧＰＧＳＶＧＧＩＡＰＡＩＳＬＳＡＡＡＧＩＧＶＤＤＬＲＲＬＣＩＬＲＭＳＦＶＫＧＷＧＰＤＹＰＲＱＳＩＫＥＴＰＣＷＩＥＩＨＬＨＲＡＬＱＬＬＤＥＶＬＨＴＭＰＩＡＤＰＱＰＬＤ（配列番号４９－ＳＭＡＤ４のＭＨ２ドメイン）

【0360】

活性調節因子は、野生型ＭＨ２ドメインのＣ末端から最大２４アミノ酸が欠失した、上に概説したＭＨ２ドメインの１つの短縮バージョンを含み得るか、これから本質的になり得る。

【0361】

活性調節因子は、リン酸化されたＴＧＦβ受容体に対するｄｎＳＭＡＤの結合親和性を増加させる変異をＭＨ２ドメイン中に含み得る。活性調節因子は、以下から本質的になりうるか、以下からなり得る：変異Ｒ４９７Ｈ、Ｋ５０７Ｑ、および／またはＲ５１５Ｇ（アミノ酸付番は配列番号４９に記載の付番に対応する）を含むＳＭＡＤ４ポリペプチドのＭＨ２ドメイン；変異Ｋ３７８Ｒおよび／またはＫ３１４Ｒ（アミノ酸付番は配列番号４８に記載の付番に対応する）を含むＳＭＡＤ３のＭＨ２ドメイン。

【0362】

活性調節因子は、少なくとも２つの上記定義のｄｎＳＭＡＤポリペプチドを含むキメラｄｎＳＭＡＤであり得る。キメラｄｎＳＭＡＤのｄｎＳＭＡＤポリペプチドは、リンカードメインによって連結され得る。

【0363】

ｄｎＳＭＡＤ２ポリペプチドおよびｄｎＳＭＡＤ３ポリペプチドを含むキメラｄｎＳＭＡＤのアミノ酸配列を、配列番号５０として以下に示す。
ＷＣＳＩＡＹＹＥＬＮＱＲＶＧＥＴＦＨＡＳＱＰＳＬＴＶＤＧＦＴＤＰＳＮＳＥＲＦＣＬＧＬＬＳＮＶＮＲＮＡＴＶＥＭＴＲＲＨＩＧＲＧＶＲＬＹＹＩＧＧＥＶＦＡＥＣＬＳＤＳＡＩＦＶＱＳＰＮＣＮＱＲＹＧＷＨＰＡＴＶＣＫＩＰＰＧＣＮＬＫＩＦＮＮＱＥＦＡＡＬＬＡＱＳＶＮＱＧＦＥＡＶＹＱＬＴＲＭＣＴＩＲＭＳＦＶＫＧＷＧＡＥＹＲＲＱＴＶＴＳＴＰＣＷＩＥＬＨＬＮＧＰＬＱＷＬＤＫＶＬＴＱＭＬＥＹＳＧＧＧＳＧＧＧＳＬＥＷＣＳＩＳＹＹＥＬＮＱＲＶＧＥＴＦＨＡＳＱＰＳＭＴＶＤＧＦＴＤＰＳＮＳＥＲＦＣＬＧＬＬＳＮＶＮＲＮＡＡＶＥＬＴＲＲＨＩＧＲＧＶＲＬＹＹＩＧＧＥＶＦＡＥＣＬＳＤＳＡＩＦＶＱＳＰＮＣＮＱＲＹＧＷＨＰＡＴＶＣＫＩＰＰＧＣＮＬＫＩＦＮＮＱＥＦＡＡＬＬＡＱＳＶＮＱＧＦＥＡＶＹＱＬＴＲＭＣＴＩＲＭＳＦＶＫＧＷＧＡＥＹＲＲＱＴＶＴＳＴＰＣＷＩＥＬＨＬＮＧＰＬＱＷＬＤＫＶＬＴＱＭ （配列番号５０）

【0364】

ｄｎＳＭＡＤまたはキメラｄｎＳＭＡＤは、以下として示した配列を含み得る：配列番号４７～５０；または配列番号４７～５０に対して少なくとも８０％（好ましくは少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％）の配列同一性を有するバリアントであって、但し、バリアント配列が野生型ＳＭＡＤタンパク質と、受容体ドッキングドメインについておよびパートナータンパク質との結合について競合し、ＴＧＦβシグナル伝達を軽減または遮断する能力を保持することを条件とする。

【0365】

７．代謝酵素
活性調節因子は、代謝酵素（ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）またはイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＤＨ）など）であり得る。

【0366】

ＡＭＰＫは、そのほとんどが細胞エネルギーが低いときにグルコースおよび脂肪酸の取り込みおよび酸化を活性化させるための細胞エネルギーホメオスタシスで役割を果たす。

【0367】

ＡＭＰＫは、α、β、およびγサブユニットによって形成されたヘテロ三量体タンパク質複合体である。これら３つのサブユニットの各々は、ＡＭＰＫの安定性および活性の両方で特異的な役割を担っている。具体的には、γサブユニットは、ＡＭＰＫにＡＭＰ：ＡＴＰ比のシフトを高感度で検出する能力を付与する４つの特定のシスタチオニンβシンターゼ（ＣＢＳ）ドメインを含む。４つのＣＢＳドメインは、一般にＢａｔｅｍａｎドメインと呼ばれるＡＭＰの２つの結合部位を作出する。１つのＡＭＰがＢａｔｅｍａｎドメインに結合すると、他のＢａｔｅｍａｎドメインに対する第２のＡＭＰの結合親和性が協同的に増加する。ＡＭＰが両方のＢａｔｅｍａｎドメインに結合するので、γサブユニットは高次構造が変化し、αサブユニット上に見いだされる触媒ドメインが露出する。上流ＡＭＰＫキナーゼ（ＡＭＰＫＫ）によってトレオニン－１７２がリン酸化される場合にＡＭＰＫが活性化されるようになる場所はこの触媒ドメイン内である。また、α、β、およびγサブユニットは、異なるイソ型で見いだすことができる：γサブユニットは、γ１、γ２、またはγ３イソ型のいずれかとして存在することができ；βサブユニットは、β１またはβ２イソ型のいずれかとして存在することができ；αサブユニットは、α１またはα２イソ型のいずれかとして存在することができる。

【0368】

以下のヒト遺伝子は、ＡＭＰＫサブユニットをコードする：
α－ＰＲＫＡＡ１、ＰＲＫＡＡ２
β－ＰＲＫＡＢ１、ＰＲＫＡＢ２
γ－ＰＲＫＡＧ１、ＰＲＫＡＧ２、ＰＲＫＡＧ３。

【0369】

活性調節因子は、１またはそれを超えるＡＭＰＫサブユニットを含み得る。活性調節因子は、ＡＭＰＫ由来のα、β、およびγサブユニットを含み得る。

【0370】

ＩＤＨはイソシトラートの酸化的カルボキシル化を触媒し、アルファ－ケトグルタラート（α－ケトグルタラート）およびＣＯ_２が産生される。これは、イソシトラート（第二級アルコール）のオキサロスクシナート（ケトン）への酸化、その後のカルボキシル基ベータのケトンへの脱カルボキシル化（アルファ－ケトグルタラートが形成される）を含む２つの過程である。ヒトでは、ＩＤＨは、以下の３つのイソ型で存在する：ＩＤＨ３は、クエン酸サイクルの第３のステップを触媒する一方で、ミトコンドリア内でＮＡＤ＋をＮＡＤＨへ変換する。イソ型ＩＤＨ１およびＩＤＨ２は、クエン酸サイクルの環境の外側で同一の反応を触媒し、補因子としてＮＡＤ＋の代わりにＮＡＤＰ＋を使用する。これらは、サイトゾルならびにミトコンドリアおよびペルオキシソームに局在する。

【0371】

活性調節因子は、ＩＨＤ１、ＩＨＤ２、またはＩＨＤ３であり得る。ヒトＩＤＨ１、２、および３のアミノ酸配列は、以下の受託番号でＮＣＢＩデータベースにある：ＣＡＧ３８７３８．１（ＩＤＨ１）；ＮＰ＿００２１５９．２（ＩＤＨ２、イソ型１）；ＮＰ＿００１２７６８３９．１（ＩＤＨ２、イソ型２）；ＮＰ＿００１２７７０４３．１（ＩＤＨ２、イソ型３）；ＮＰ＿６８９９９６．４（ＩＤＨ３、イソ型１）；ＮＰ＿００１２７４１７８．１（ＩＤＨ３、イソ型２）；ＮＰ＿００１３３９７５３．１（ＩＤＨ３、イソ型３）。

【0372】

８．共刺激シグナル
本発明の活性調節因子は、Ｔ細胞に共刺激シグナルを提供し得る。

【0373】

例えば、活性調節因子（ａｃｔｉｖｉｔｙ ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ）は、ＴＮＦ受容体、キメラＴＮＦ受容体、またはＴＮＦ受容体リガンドであり得る。

【0374】

ＴＮＦファミリー共刺激分子は、その個体発生中にＴ細胞に生存シグナルおよび拡大シグナル（expansion signal）を提供する。これらのＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）は、ＴＮ
Ｆ受容体関連因子（ＴＲＡＦ）セカンドメッセンジャーを介して、シグナルを発する。

【0375】

ＴＮＦＲＳＦ９（４－１ＢＢ）、ＴＮＦＲＳＦ４（ＯＸ４０）、ＴＮＦＲＳＦ５（ＣＤ４０）、およびＴＮＦＲＳＦ１４（ＧＩＴＲ）は、Ｔ細胞に生存シグナルを伝達する。ＴＮＦＲＳＦ７（ＣＤ２７）およびＴＮＦＲＳＦ１４（ＨＶＥＭ）は、ナイーブＴ細胞によって発現される。ＯＸ４０および４－１ＢＢの発現は抗原刺激に応答して誘導され、これらのＴＮＦＲは、エフェクターＴ細胞のマーカーであることが提案されている。ＣＤ２７およびＧＩＴＲが従来のＴ細胞によって構成性に発現され得るのにもかかわらず、これらの発現はまた、ＯＸ４０および４－１ＢＢの発現の上方調節と並行して、Ｔ細胞活性化後に強く上方調節される。

【0376】

ＯＸ４０、４－１ＢＢ、およびＧＩＴＲの発現の誘導または上方調節は、ナイーブＴ細胞による抗原認識およびその活性化後２４時間以内に生じ、記憶Ｔ細胞ではより一層迅速に生じる；これらの受容体の発現は、数時間または実に数日間継続し得る。

【0377】

ＴＮＦ受容体ＴＮＦＲＳＦ３５／デス受容体３（Ｄ３Ｒ）は、炎症組織によって一過性に上方調節されるＴＬ１Ａによって活性化され、この相互作用は、確立された免疫応答後のＴ細胞活性の後期に重要なようである。

【0378】

ＣＤ４０はＴ細胞によって発現されないが、ＣＤ４０ＬおよびＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌは、Ｂ細胞の分化および拡大に特に重要である。

【0379】

ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ（ＲＡＮＫ）はＴ細胞によって発現されないが、ＲＡＮＫ／ＲＡＮＫ－Ｌ経路は免疫発達に重要であり、破骨細胞活性の重要な経路でもあり、骨転移中で活性である。

【0380】

ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ（Ｆｎ１４）はＴ細胞によって発現されないが、損傷組織または炎症組織およびほとんどのがんにおいてそのリガンドＴＷＥＡＫと共に発現される。

【0381】

８．１ キメラＴＮＦ受容体
国際特許出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２０１８／０５３６２９号は、（ａ）ＴＮＦＲリガンドに結合することができる結合ドメイン；および（ｂ）ＴＮＦＲシグナル伝達ドメインを含むキメラＴＮＦ受容体を記載している。

【0382】

キメラＴＮＦＲの存在により、操作された細胞（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞）へ改善された生存シグナルが提供されるように、ＴＮＦＲシグナル伝達の厳格な時間的および／または空間的な制御を切り離すことができる。キメラＴＮＦＲは、腫瘍微小環境における完全な生理学的免疫応答の欠如を補い得る。キメラＴＮＦＲは、抗原結合ドメインが会合し、それ故に、腫瘍微小環境で必要な共刺激シグナルが誘導されるように構築することができる。

【0383】

キメラＴＮＦＲの抗原結合ドメインは、ＴＮＦＲのリガンド結合ドメインを含み得る。例えば、抗原結合ドメインは、Ｄ３Ｒ、ＨＶＥＭ、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、またはＦｎ１４のリガンド結合ドメインを含み得る。

【0384】

キメラＴＮＦＲのシグナル伝達ドメインは、活性化シグナル伝達ドメイン（ＴＮＦＲ関連因子（ＴＲＡＦ）を介してシグナル伝達することができるものなど）であり得る。例えば、活性化シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢエンドドメイン、ＯＸ４０エンドドメイン、またはＧＩＴＲエンドドメインのシグナル伝達部分を含み得る。

【0385】

活性調節因子は、ＨＶＥＭ－４１ＢＢキメラ、ＣＤ２７－４１ＢＢキメラ、ＲＡＮＫ－４１ＢＢキメラ、またはＦｎ１４－４１ＢＢキメラであり得る。これらのキメラＴＮＦ受容体の適切なアミノ酸配列の例を、配列番号５１～５４として以下に示し、ここで、エクトドメイン（ｅｃｔｏｔｏｍａｉｎ）を通常の文字で示し、膜貫通ドメインを太字で示し、４１ＢＢエンドドメインを斜体で示す。

【0386】

【化3】

【0387】

８．２ ＴＮＦ受容体リガンド
ＴＮＦ関連サイトカイン（ＴＮＦファミリーリガンド）は、短い細胞質側尾部（１５～２５残基長）および受容体結合部位が位置するシグネチャーＴＮＦ相同ドメインを含むより大きな細胞外領域（約５０アミノ酸）を有するタイプＩＩ膜貫通タンパク質（細胞内Ｎ末端）である。

【0388】

ＴＮＦＲおよびそのリガンドの概要を、表３に提供する。

【0389】

【表3-1】

【表3-2】

【0390】

活性調節因子は、ＴＮＦ受容体リガンド（ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）、ＯＸ４０Ｌ（ＣＤ１３４）、または４１ＢＢＬなど）であり得るか、これらを含み得る。これらのタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号５５～５７として以下に示す。

【0391】

配列番号５５（ＣＤ４０Ｌ）
ＭＩＥＴＹＮＱＴＳＰＲＳＡＡＴＧＬＰＩＳＭＫＩＦＭＹＬＬＴＶＦＬＩＴＱＭＩＧＳＡＬＦＡＶＹＬＨＲＲＬＤＫＩＥＤＥＲＮＬＨＥＤＦＶＦＭＫＴＩＱＲＣＮＴＧＥＲＳＬＳＬＬＮＣＥＥＩＫＳＱＦＥＧＦＶＫＤＩＭＬＮＫＥＥＴＫＫＥＮＳＦＥＭＱＫＧＤＱＮＰＱＩＡＡＨＶＩＳＥＡＳＳＫＴＴＳＶＬＱＷＡＥＫＧＹＹＴＭＳＮＮＬＶＴＬＥＮＧＫＱＬＴＶＫＲＱＧＬＹＹＩＹＡＱＶＴＦＣＳＮＲＥＡＳＳＱＡＰＦＩＡＳＬＣＬＫＳＰＧＲＦＥＲＩＬＬＲＡＡＮＴＨＳＳＡＫＰＣＧＱＱＳＩＨＬＧＧＶＦＥＬＱＰＧＡＳＶＦＶＮＶＴＤＰＳＱＶＳＨＧＴＧＦＴＳＦＧＬＬＫＬ

【0392】

配列番号５６（ＯＸ４０Ｌ）
ＭＥＲＶＱＰＬＥＥＮＶＧＮＡＡＲＰＲＦＥＲＮＫＬＬＬＶＡＳＶＩＱＧＬＧＬＬＬＣＦＴＹＩＣＬＨＦＳＡＬＱＶＳＨＲＹＰＲＩＱＳＩＫＶＱＦＴＥＹＫＫＥＫＧＦＩＬＴＳＱＫＥＤＥＩＭＫＶＱＮＮＳＶＩＩＮＣＤＧＦＹＬＩＳＬＫＧＹＦＳＱＥＶＮＩＳＬＨＹＱＫＤＥＥＰＬＦＱＬＫＫＶＲＳＶＮＳＬＭＶＡＳＬＴＹＫＤＫＶＹＬＮＶＴＴＤＮＴＳＬＤＤＦＨＶＮＧＧＥＬＩＬＩＨＱＮＰＧＥＦＣＶＬ

【0393】

配列番号５７（４１ＢＢＬ）
ＭＥＹＡＳＤＡＳＬＤＰＥＡＰＷＰＰＡＰＲＡＲＡＣＲＶＬＰＷＡＬＶＡＧＬＬＬＬＬＬＬＡＡＡＣＡＶＦＬＡＣＰＷＡＶＳＧＡＲＡＳＰＧＳＡＡＳＰＲＬＲＥＧＰＥＬＳＰＤＤＰＡＧＬＬＤＬＲＱＧＭＦＡＱＬＶＡＱＮＶＬＬＩＤＧＰＬＳＷＹＳＤＰＧＬＡＧＶＳＬＴＧＧＬＳＹＫＥＤＴＫＥＬＶＶＡＫＡＧＶＹＹＶＦＦＱＬＥＬＲＲＶＶＡＧＥＧＳＧＳＶＳＬＡＬＨＬＱＰＬＲＳＡＡＧＡＡＡＬＡＬＴＶＤＬＰＰＡＳＳＥＡＲＮＳＡＦＧＦＱＧＲＬＬＨＬＳＡＧＱＲＬＧＶＨＬＨＴＥＡＲＡＲＨＡＷＱＬＴＱＧＡＴＶＬＧＬＦＲＶＴＰＥＩＰＡＧＬＰＳＰＲＳＥ

【0394】

キメラＲＴＫ
受容体タンパク質－チロシンキナーゼ（ＲＰＴＫ）は、胚発生、細胞の成長、代謝、および免疫機能を媒介する細胞内シグナル調節因子のファミリーを構成する。ＲＰＴＫはしばしばがんにおいて調節不全となり、増殖を促進する。

【0395】

ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖能は、異なるバインダーと構造との間で一致せず、増殖を最大に促す特徴はよくわかっていない。ＣＡＲ Ｔ細胞は、厳しい腫瘍微小環境に曝され、二量体様式でＲＰＴＫを組み込むことによりＣＡＲ Ｔ細胞の増殖を有利にすることができる。同族リガンドの非存在下でシグナル伝達可能なＲＴＫを発現させると、腫瘍の免疫欠損環境が破壊されてＣＡＲ Ｔ細胞の生存シグナルが改善される。

【0396】

ＲＴＫは、リガンド誘導性二量体化／オリゴマー化によってシグナルを伝達し、その細胞質尾部のキナーゼドメイン活性化ループ中のチロシン残基が自己リン酸化される。ＲＴＫがリガンドを媒介してオリゴマー化されると、２ステップで活性化される（触媒活性の増加および下流シグナル伝達タンパク質のドッキング部位の生成）。

【0397】

典型的には、ＲＴＫはホモ二量体化されてシグナルを伝達する。

【0398】

ＲＴＫの自己リン酸化は、シスまたはトランスで起こり得る。リン酸化されたチロシン残基は、多数のＳＨ２含有シグナル伝達分子のドッキング部位を構成する。一般に、全てのＲＴＫは、以下などの共通の下流シグナルタンパク質を介してシグナルを伝達する：ＰＩ３キナーゼ、Ｒａｓ－Ｒａｆ－ＭＡＰＫ、ＪＮＫ、およびＰＬＣγ。シグナル伝達は、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ経路によって媒介される。

【0399】

活性調節因子は、同族リガンドの非存在下でシグナルを伝達することができる受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）であり得る。かかるＲＴＫは、英国特許出願公開第１８０３０７９．１号に記載されている。

【0400】

ＲＴＫは、同族リガンドの非存在下でシグナルを伝達することができるように、過剰発現され、そして／または変異を含み得る。

【0401】

ＲＴＫは、キメラＲＴＫであり得る。キメラＲＴＫは、キメラＲＴＫの二量体化またはオリゴマー化を媒介するエクトドメインまたはエンドドメインを含み得る。

【0402】

キメラＲＴＫの二量体化またはオリゴマー化を媒介するドメインは、ジスルフィド結合を含み得る（例えば、前述のドメインは、ヒンジドメインであり得るか、これを含み得る）。

【0403】

あるいは、キメラＲＴＫの二量体化またはオリゴマー化を媒介するドメインは、化学的に操作可能な二量体化ドメインまたはオリゴマー化ドメインを含み得る。キメラＲＴＫの二量体化またはオリゴマー化は、作用因子によって誘導可能な場合がある。

【0404】

ヒトＲＴＫサブファミリーおよびＲＴＫのまとめを、表４に示す。

【表4】

【0405】

表２に示したヒトＲＴＫのＵｎｉＰｒｏｔ受託番号および関連するアミノ酸配列の例を、表５に提供する。

【0406】

【表5-1】

【表5-2】

【表5-3】

【0407】

標的細胞活性の調整

【0408】

活性調節因子は、標的細胞（例えば、腫瘍細胞）の活性を調整し得る。

【0409】

例えば、作用因子は、毒素（腫瘍細胞に有毒な毒素など）であり得る。例えば、作用因子は、ジフテリア毒素、シュードモナス毒素、またはシゲラ毒素であり得る。

【0410】

あるいは、活性調節因子は、プロドラッグまたはプロドラッグ活性化化合物であり得る。活性調節因子は、プロドラッグ活性化酵素であり得る。

【0411】

プロドラッグは、細胞傷害性化合物のがん細胞への標的送達で広く使用されている。プロドラッグは、酵素的または化学的な変換を受けて活性形態を再生する薬物分子の不活性または低活性の誘導体である。

【0412】

標的がん治療では、内因性の標的特異性を欠く従来の化学療法剤は、腫瘍細胞に集中してその細胞傷害性を腫瘍細胞に向け直すように合理的に修正される。多数の従来の非特異的化学療法剤（ドキソルビシン、パクリタキセル、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａｎ）、シスプラチン、およびその誘導体など）の有用性は、プロドラッグ（特に、細胞標的部分を有するプロドラッグ）への改変によって有意に拡大されている。

【0413】

活性調節因子は、個別に投与された特異的不活性基質（プロドラッグ）を細胞傷害性生成物に活性化する酵素であり得る。活性調節因子は、シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）であり得るか、これを含み得、これは、プロドラッグ５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）を５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）に変換し、その下流代謝拮抗物質によりいわゆる「チミン飢餓死」に至る。あるいは、活性調節因子は、シトシンデアミナーゼ／ウラシルホスホ－リボシルトランスフェラーゼ融合物（ＣＤ／ＵＰＲＴ；Ｆｃｙ：：Ｆｕｒ遺伝子によってコードされる）であり得るか、これを含み得、これは、５－ＦＵ系代謝拮抗物質を生成するためにも使用されている。他の代謝拮抗物質のプロドラッグには、アシクロビルおよびガンシクロビル（組換えチミジル酸キナーゼを使用して活性な三リン酸に活性化される）ならびに６－メチル－２’－デオキシリボシドおよび２－フルオロ－２’－デオキシアデノシン（プリンヌクレオシドホスホリラーゼによって６’－メチルプリンおよび２－フルオロアデニンにそれぞれ変換される）などのヌクレオシドアナログが含まれる。ヒトデオキシシチジンキナーゼ（ＤＣＫ）およびチミジル酸キナーゼ（ｔｍｐｋ）は、ある範囲の（非生理学的）プロドラッグを一リン酸化することができる（ゲムシタビン（ｄＦｄＣ）、ブロモビニル－デオキシウリジン（ＢＶｄＵ）、シタラビン（ＡｒａＣ）、および３’－アジド－３’－デオキシチミジン（ＡＺＴ）一リン酸など）。また、ＤＣＫのウリジン一リン酸キナーゼとのキメラ融合物（ＤＣＫ：：ＵＭＫ）が、膵癌においてゲムシタビンをその細胞傷害性二リン酸代謝産物（ｄＦｄＣＤＰ）に直接活性化するために開発されている。化学療法剤が特異的活性化酵素の基質に誘導体化された「デザイナー」プロドラッグも存在する。例には、ドキソルビシンとメルファランのフェノキシアセトアミドコンジュゲート（ペニシリン－Ｖアミダーゼによって加水分解される）、エトポシド（ＶＰ－１６）のジピペリジニルコンジュゲート（組換えカルボキシルエステラーゼによって加水分解される）、および５－ＦＵのセファロスポリンコンジュゲート（β－ラクタマーゼによる加水分解のために設計された）が含まれる。

【0414】

活性調節因子は、プロドラッグ－コンジュゲート（ｃｏｎｇｕｇａｔｅ）（例えば、毒素を含むプロドラッグコンジュゲート）を切断することができる酵素であり得る。プロドラッグコンジュゲートと同様に、多数の標的毒素は、ターゲティング部分（例えば、免疫毒素の場合、抗体）、切断可能なリンカー、および薬物（細胞傷害性酵素）からなる。モキセツモマブパスドトクスは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来の短縮外毒素Ａ（天然受容体－結合ドメイン（Ｎ末端の２５０残基に位置する）が細胞表面ＣＤ２２抗原を標的にする単鎖可変断片で置き換えられている）からなる。細胞傷害活性は、Ｃ末端セグメント（残基４０５～６１３、ＰＥ３と呼ばれる）によって完全に付与されている。このコンジュゲートはこのままでは不活性な毒素である：細胞傷害性に活性化するには、エンドサイトーシス中にプロテアーゼフューリンによって残基２７９と２８０との間を切断する必要がある。したがって、モキセツモマブパスドトクスは、機能的には、標的化プロドラッグコンジュゲートであり、外毒素Ａ由来の残基２５１～３６４（ドメインＩＩ）がその切断によって細胞傷害性ＰＥ３を放出するリンカーとしての機能を果たす。

【0415】

１．ＣＡＲ Ｔ細胞の生合成
活性調節因子は、細胞内で発現されたか、組み合わせて発現された場合に小分子を合成することができる酵素であり得る。

【0416】

国際特許出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２０１８／０５３２６２号は、操作された細胞が小分子、特に治療小分子を産生することができるトランスジェニックな合成生物経路をコードする操作された細胞を記載している。操作された細胞は、以下を含み得る；（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）；および（ｉｉ）細胞内で組み合わせて発現された場合に治療小分子を合成することができる１またはそれを超える酵素をコードする１またはそれを超える操作されたポリヌクレオチド。

【0417】

例えば１、２、３、４、または５つの酵素が存在し得る。１またはそれを超える酵素は、１またはそれを超えるオープンリーディングフレームでコードされ得る。１またはそれを超える酵素は、単一のオープンリーディングフレームでコードされ得る。適切には、各酵素は、切断部位によって隔てられ得る。切断部位は、自己切断部位（ＦＭＤ－２Ａ様ペプチドをコードする配列など）であり得る。

【0418】

治療小分子は、例えば、細胞傷害性分子；細胞増殖抑制分子；腫瘍の分化を誘導することができる作用因子；または炎症誘発性分子であり得る。特に、小分子は、ビオラセインもしくはその誘導体、またはゲラニオールであり得る。

【0419】

標的細胞の微小環境を調整する作用因子
活性調節因子は、標的細胞（例えば、腫瘍細胞）の環境を調整する作用因子であり得る。

【0420】

例えば、作用因子は、上記で考察したサイトカイン（ＩＬ－７またはＩＬ－１２など）またはケモカイン（ＣＣＬ１９など）であり得る。あるいは、作用因子は、上記で考察したサイトカインまたはケモカインの発現または活性に影響を及ぼし得る。

【0421】

１．ＣＡＲ－Ｔ細胞分泌酵素
免疫微小環境は、腫瘍の生存および／または進行と免疫応答との間のバランスを変化させることができる小分子代謝産物および栄養素を含む。微小環境の調整は、免疫応答に有利となるようにバランスを変化させ得、そして／または適応免疫治療の活性または有効性（ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲを発現する操作された細胞の有効性など）を改善することができる。

【0422】

本発明に関連する活性調節因子（ａｃｔｉｖｉｔｙ ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ）は、腫瘍微小環境内の１またはそれを超える代謝産物または栄養素のレベルを調整し、免疫細胞（免疫応答に関与するＴ細胞など）に有利であり、そして／または腫瘍細胞を排除するようにバランスを偏らせる場合がある。

【0423】

例えば、活性調節因子は、細胞表面で分泌または発現された場合に、操作された細胞の細胞外の分子を枯渇させる１またはそれを超える酵素であり得、前述の分子は、以下：
（ｉ）腫瘍細胞が生存、増殖、転移するか、または化学抵抗性を示すために必要であり、そして／または
（ｉｉ）操作された細胞の生存、増殖、または活性に有害である。

【0424】

英国特許出願第１８２０４４３．８号は、細胞表面でかかる酵素を分泌するか発現する操作された細胞を記載している。

【0425】

酵素（複数可）は、アミノ酸もしくはアミノ酸代謝産物、核酸塩基（ヌクレオシドまたはヌクレオチドなど）、または脂質を枯渇させ得る。

【0426】

活性調節因子が腫瘍細胞の成長または生存に必要な栄養素または代謝産物を枯渇させる場合、免疫細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）は、前述の分子の非存在下にて細胞外環境内で生存するように操作され得る。例えば、細胞は、前述の分子またはその前駆体が細胞内で合成されるように操作され得る。

【0427】

細胞組成物
また、本発明は、本発明の方法によって作製された細胞組成物を提供する。

【0428】

本発明は、細胞組成物であって、前述の組成物が非形質導入細胞、一重に形質導入された細胞、組み合わせて形質導入された細胞の混合物を含むように複数のウイルスベクターで細胞を形質導入することによって作製された細胞組成物を提供する。

【0429】

本発明の方法で使用したウイルスベクターの混合物中の少なくとも１つのベクターは、ＣＡＲをコードする核酸配列を含む。したがって、細胞組成物は、単一および組み合わせて形質導入されたＣＡＲ発現細胞の混合物を含み得る。

【0430】

「組み合わせて形質導入された」は、細胞が少なくとも２つのウイルスベクターで形質導入されることを意味する。例えば、細胞を２つのベクター（導入遺伝子Ａを含むベクターおよび導入遺伝子Ｂを含むベクター）で形質導入する場合、形質導入された細胞は、Ａのみを発現する細胞；Ｂのみを発現する細胞；ならびにＡおよびＢの両方を発現する細胞の混合物である。この状況では、ＡおよびＢを発現する細胞は、組み合わせて形質導入される。

【0431】

各々導入遺伝子を含む３つのベクターで形質導入された細胞について、得られた形質導入された細胞は、以下の混合物である：Ａのみ；Ｂのみ；Ｃのみ；ＡおよびＢ；ＡおよびＣ；ＢおよびＣ；ならびにＡ、Ｂ、およびＣを発現する細胞。この状況では、ＡおよびＢ；ＡおよびＣ；ＢおよびＣを発現する３つの亜集団；ならびにＡ、Ｂ、およびＣを発現する細胞は、組み合わせて形質導入されている。

【0432】

細胞組成物は、ウイルスベクターの混合物中に異なるベクターの組み合わせでの形質導入によって得られた複数の亜集団を含む。

【0433】

細胞組成物は、細胞溶解性免疫細胞（Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞など）を含み得る。

【0434】

Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞性免疫において中心的な役割を果たすリンパ球の１つの型である。これらは、細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在によって他のリンパ球（Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）など）と区別することができる。以下にまとめているように、種々のタイプのＴ細胞が存在する。

【0435】

ヘルパーＴヘルパー細胞（ＴＨ細胞）は、免疫学的過程（Ｂ細胞の形質細胞およびメモリーＢ細胞への成熟ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化が含まれる）において他の白血球を補助する。ＴＨ細胞は、その表面上でＣＤ４を発現する。ＴＨ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上のＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原が提示されたときに活性化されるようになる。これらの細胞は、異なるタイプの免疫応答を容易にするために異なるサイトカインを分泌するいくつかのサブタイプ（ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、Ｔｈ９、またはＴＦＨ）のうちの１つに分化することができる。

【0436】

細胞溶解性Ｔ細胞（ＴＣ細胞、またはＣＴＬ）は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、移植片拒絶にも関与する。ＣＴＬは、その表面にＣＤ８を発現する。これらの細胞は、全ての有核細胞の表面上に存在するＭＨＣクラスＩに関連する抗原への結合によってその標的を認識する。ＩＬ－１０、アデノシン、および制御性Ｔ細胞によって分泌される他の分子を介して、ＣＤ８＋細胞をアネルギー状態に不活性化することができ、それにより実験的自己免疫性脳脊髄炎などの自己免疫疾患を予防する。

【0437】

メモリーＴ細胞は、感染から回復した後に長期間にわたって維持される抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。メモリーＴ細胞は、その同族抗原への再曝露の際に迅速に多数のエフェクターＴ細胞へと拡大増殖する（expand）ため、免疫系に過去の感染を「記憶」させている。メモリーＴ細胞は、以下の３つのサブタイプを含む：セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）および２つのタイプのエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）。メモリー細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかであり得る。メモリーＴ細胞は、典型的には、細胞表面タンパク質ＣＤ４５ＲＯを発現する。

【0438】

以前は抑制性Ｔ細胞として公知であった制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、免疫寛容の維持に不可欠である。その主な役割は、免疫反応の終了に向けてＴ細胞性免疫を停止させること、および胸腺内でのネガティブ選択過程を回避した自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。

【0439】

ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の２つの主なクラス（内在性Ｔｒｅｇ細胞および適応Ｔｒｅｇ細胞）が記載されている。

【0440】

内在性Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞としても公知）は、胸腺内で生じ、発生中のＴ細胞の、ＴＳＬＰで活性化されている骨髄系（ＣＤ１１ｃ＋）樹状細胞および形質細胞様（ＣＤ１２３＋）樹状細胞の両方との相互作用に関与している。内在性Ｔｒｅｇ細胞は、ＦｏｘＰ３と呼ばれる細胞内分子の存在によって他のＴ細胞と区別することができる。ＦＯＸＰ３遺伝子を変異させると制御性Ｔ細胞の発生が阻止され、致死性自己免疫疾患ＩＰＥＸを引き起こし得る。

【0441】

適応Ｔｒｅｇ細胞（Ｔｒ１細胞またはＴｈ３細胞としても公知）は、正常な免疫応答中に生じ得る。

【0442】

ナチュラルキラー細胞（またはＮＫ細胞）は、先天性免疫系の一部を成す。ＮＫ細胞は、ウイルス感染細胞からの内生シグナルに対してＭＨＣ依存性様式で迅速に応答する。

【0443】

ＮＫ細胞（先天性リンパ球系細胞群に属する）は大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）と定義され、Ｂリンパ球およびＴリンパ球を生成する共通のリンパ球系前駆細胞から分化した第３の細胞を構成する。ＮＫ細胞は、骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃腺、および胸腺で分化および成熟し、次いで、循環内に入ることが公知である。

【0444】

本発明の細胞は、上記の細胞型のうちのいずれかであり得る。

【0445】

本発明の方法を用いて導入されるべき細胞は、血液試料、例えば、白血球除去物（ｌｅｕｋａｐｈｅｒｅｓａｔｅ）に由来し得る。細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）であり得るか、これを含み得る。

【0446】

細胞は、患者自体の末梢血（第一者）から、またはドナー末梢血（第二者）または無関係のドナー由来の末梢血（第三者）由来の造血幹細胞移植においてｅｘ ｖｉｖｏで作り出すことができる。

【0447】

あるいは、細胞は、誘導前駆細胞または胚性前駆細胞の、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞へのｅｘ ｖｉｖｏ分化に由来し得る。あるいは、溶解機能を保持し、かつ治療に役立つもの（therapeutic）として作用することができる不死化Ｔ細胞株が使用され得る。

【0448】

細胞は、本発明の第１の態様のキメラポリペプチドが得られる分子をコードする核酸で形質導入される前に、例えば抗ＣＤ３モノクローナル抗体での処置によって活性化および／または拡大増殖され得る。

【0449】

形質導入後、次いで、細胞を、ＣＡＲの発現に基づいて精製する（例えば、選択する）ことができる。形質導入後にＣＡＲの非存在下で活性調節因子を発現する細胞の亜集団が存在し得る場合に、ＣＡＲ発現に基づいて細胞を選択することが望ましい場合がある。ウイルスベクター混合物中のベクターの各々がＣＡＲをコードする核酸配列を含む場合、いかなる細胞もＣＡＲの非存在下では活性調節因子を発現することが可能でないはずであるので、ＣＡＲ発現に基づいて細胞を精製または選別する必要はない場合がある。

【0450】

医薬組成物
単一および組み合わせて形質導入されたＣＡＲ発現細胞の混合物を含む本発明の細胞組成物は、医薬組成物として患者に投与され得る。

【0451】

医薬組成物は、さらに、薬学的に許容され得る担体、希釈剤、または賦形剤を含み得る。医薬組成物は、必要に応じて、１またはそれより多くのさらなる薬学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含み得る。かかる製剤は、例えば、静脈内注入に適切な形態であり得る。

【0452】

処置方法
本発明は、（例えば、上記の医薬組成物中の）本発明の細胞組成物を被験体に投与するステップを含む、疾患を処置する方法を提供する。

【0453】

疾患を処置する方法は、本発明の細胞組成物の治療的使用に関する。疾患に関連する少なくとも１つの症状を緩和、軽減、もしくは改善し、および／または疾患の進行を遅延、軽減、もしく遮断するために、疾患または状態を既に有する被験体に細胞組成物を投与することができる。

【0454】

疾患を予防する方法は、本発明の細胞組成物の予防的使用に関する。未だ罹患しておらず、および／または疾患のいかなる症状も示していない被験体に、疾患の原因を予防するか損なわせるか、疾患に関連する少なくとも１つの症状の発生を軽減または予防するためにかかる細胞組成物を投与することができる。被験体は、疾患の素因を有し得るか、発症リスクがあると考えられ得る。

【0455】

本方法は、以下のステップを含み得る：
（ｉ）細胞を含む試料を単離するステップ；
（ｉｉ）かかる細胞を、少なくとも２つのウイルスベクターの混合物で形質導入するするステップ；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）由来の細胞を被験体に投与するステップ。

【0456】

本発明はまた、疾患の処置および／または予防で用いるための本発明の細胞組成物に提供する。

【0457】

本発明はまた、疾患の処置のための医薬の製造における本発明の細胞組成物の使用に関する。

【0458】

本発明の方法によって処置されるべき疾患は、がん性疾患（膀胱がん、乳がん、結腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん（腎細胞がん）、白血病、肺がん、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、膵臓がん、前立腺がん、および甲状腺がんなど）であり得る。

【0459】

疾患は、多発性骨髄腫（ＭＭ）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、神経芽細胞腫、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、またはびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）であり得る。

【0460】

疾患は、形質細胞障害、例えば、形質細胞腫、形質細胞白血病、多発性骨髄腫、マクログロブリン血症，アミロイドーシス、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、孤立性骨形質細胞腫、髄外性形質細胞腫、骨硬化性骨髄腫、重鎖病、意義未確定の単クローン性ガンマグロブリン血症、またはくすぶり型多発性骨髄腫であり得る。

【0461】

本発明の組成物の細胞は、がん細胞などの標的細胞を死滅させることが可能であり得る。標的細胞は、標的細胞付近の腫瘍分泌性のリガンドまたはケモカインリガンドの存在によって特徴付けられ得る。標的細胞は、標的細胞表面に腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現と共に可溶性リガンドが存在することによって特徴付けられ得る。

【0462】

本発明の組成物内の異なる細胞亜集団は、同一の疾患を有する異なる患者間および患者内の異なる疾患部位（例えば、腫瘍部位）の両方において標的細胞を死滅させる能力のレベルが異なり得る。

【0463】

ＣＡＲ発現細胞の結果に基づく操作
また、本発明は、疾患を処置するためのＣＡＲ発現細胞の成分の最適な組み合わせを決定する方法を提供する。

【0464】

上記で説明した通り、本発明の細胞組成物は、ＣＡＲ発現細胞の混合物を含み、混合物には単一で形質導入されているものもあれば、組み合わせて形質導入されているものもある。異なる亜集団の数は、形質導入のために使用した混合物中のウイルスベクターの数に依存する。３つのベクターＡ、Ｂ、およびＣについて、以下の７つの形質導入細胞集団が存在するはずである：以下で形質導入した集団：Ａのみ；Ｂのみ；Ｃのみ；ＡおよびＢ；ＡおよびＣ；ＢおよびＣ；ならびにＡ、Ｂ、およびＣ。４つのベクターＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤについて、以下の１５の異なる亜集団が存在する：Ａのみ；Ｂのみ；Ｃのみ；Ｄのみ；ＡおよびＢ；ＡおよびＣ；ＡおよびＤ；ＢおよびＣ；ＢおよびＤ；ＣおよびＤ；Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、およびＤ；Ａ、Ｃ、およびＤ；Ｂ、Ｃ、およびＤ；ならびにＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤ。

【0465】

組成物中の各ベクターがＣＡＲをコードする核酸および／または活性調節因子をコードする核酸を含む場合、細胞組成物は、各々がＣＡＲ（複数可）および活性調節因子（複数可）の異なる組み合わせを発現する形質導入された細胞亜集団の混合物である。

【0466】

例えば、ウイルスベクターの混合物は、１またはそれを超えるＣＡＲおよび複数の異なる活性調節因子を発現し得る。ベクターの混合物での細胞の形質導入によって作製されたＣＡＲ発現細胞は、標的細胞の殺滅、生存、生着、チェックポイント阻害への耐性、および／または厳しい腫瘍微小環境に対する耐性に関して異なる性質をＣＡＲ発現細胞に付与し得る活性調節因子（複数可）の複数の異なる組み合わせを発現する。ｉｎ ｖｉｖｏでは、ＣＡＲ（複数可）および活性調節因子の特定の組み合わせを発現する細胞の１つの亜集団は、患者内または患者における特定の部位内の特定の条件に最良に適合する。前述の亜集団は、最も有効な活性化シグナル、生存シグナル、および／または増殖シグナルを受け、細胞組成物中の他の亜集団に打ち勝つ。

【0467】

投与後の患者においてＣＡＲ発現細胞を分析することにより、どの亜集団が最良に生存し、生着し、標的細胞を死滅させるのかを解明することが可能である。この亜集団の表現型または遺伝子型を分析することにより、亜集団のベクターのどの組み合わせが細胞組成物の作製中に首尾よく形質導入されるのかを解明することが可能である。

【0468】

この情報を使用して、あらゆる形質導入細胞がＣＡＲ（複数可）および活性調節因子（複数可）の最も首尾の良い組み合わせを発現する相同な（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）ＣＡＲ発現細胞組成物を設計することができる。

【0469】

方法は、以下のステップを含み得る：
（ｉ）疾患を有する被験体に細胞組成物を投与するステップ；
（ｉｉ）患者または患者由来の試料（複数可）をモニタリングして、細胞組成物中のどの細胞の亜集団が最も高い生存、生着、増殖活性化、および／または標的細胞殺滅レベルを示すのかを決定する、モニタリングするステップ；および
（ｉｉｉ）亜集団中の前述の細胞の表現型／遺伝子型を解析して、前述の細胞によって発現されたＣＡＲ（複数可）および／または活性調節因子（複数可）を確認する、解析するステップ。

【0470】

また、上記の方法によって疾患を処置するためのＣＡＲ発現細胞の成分の最適な組み合わせを決定し、次いで、同定された成分の組み合わせを発現するシングルベクターで細胞を形質導入するステップを含む、疾患の処置での使用のためのＣＡＲ発現細胞組成物を産生する方法を提供する。得られた細胞組成物は、全てのＣＡＲ発現細胞が成分の同一の組み合わせを発現するという意味において均一である。

【0471】

成分の同定された組み合わせを発現する２またはそれを超えるベクターで細胞を形質導入し、次いで、均一なＣＡＲ発現細胞組成物に到達するように全ての同定された成分を発現する細胞を選別することも可能である。

【0472】

また、本発明は、かかる方法によって作製された細胞組成物を提供する。

【0473】

本発明を、ここに、実施例によってさらに説明するが、実施例は本発明の実施において当業者を補助することを意図し、本発明の範囲を制限することを決して意図しない。

【実施例0474】

実施例１－複数のベクターで形質導入されたＣＡＲ－Ｔ細胞組成物の生成
以下のいずれかを発現するレンチウイルスベクターを生成した：ａ）ＰＧＫプロモーターの制御下、抗ＣＤ１９抗原結合ドメイン、ＣＤ８ストークスペーサーおよび膜貫通ドメイン、ならびに化合物４－１ＢＢ－ＣＤ３ζエンドドメインを含むＷＯ２０１６／１３９４８７号に記載の第２世代の抗ＣＤ１９ ＣＡＲ（ｐＣＣＬ．ＰＧＫ．ａＣＤ１９ｃａｔ－ＣＤ８ＳＴＫ－４１ＢＢＺ）；またはｂ）ＥＦ１αプロモーターの制御下、上記に配列番号１０～１５として示したＣＤＲ、ＣＤ８ストークスペーサーおよびＣＤ３ζを含む第２世代のエンドドメイン、ならびに４－１ＢＢ共刺激ドメインを有する抗ＣＤ２２ ＣＡＲ（ｐＣＣＬ．ＥＦ１ａ．ａＣＤ２２＿９Ａ８－１－６４＿ＬＨ＿ｓｃＦｖ－ＣＤ８ＳＴＫ－４１ＢＢｚ）。

【0475】

２つの個別のレンチウイルス上清を作製し、２．５＋２．５のＭＯＩで１：１に混合した。２つのＣＡＲの発現パターンを、抗イディオタイプ抗体を使用して抗ＣＤ１９ ＣＡＲの発現について染色し、可溶性ＣＤ２２を使用してＣＤ２２ ＣＡＲの発現について染色するフローサイトメトリーによって調査した。結果を図６に示す。レンチウイルス組成物での形質導入後、細胞は、非形質導入細胞（４６．５％）；抗ＣＤ１９ ＣＡＲのみを発現する細胞（２３．１％）；抗ＣＤ２２ ＣＡＲのみを発現する細胞（１１．１％）、ならびにＣＤ１９およびＣＤ２２ ＣＡＲの両方を発現する細胞（１９．３％）の混合物である。

【0476】

実施例２－複数のベクターを用いた形質導入による組み合わせ様式で拡張モジュール（複数可）を組み合わせたＣＡＲ（複数可）の発現
マーカー遺伝子および特定の条件下で活性を示すことが予想される以下の拡張モジュールのうちの１つと組み合わせた第２世代の抗ＣＤ１９ ＣＡＲ（Ｆｍｃ６３－４１ＢＢｚ）を含むベクターを構築する：

【0477】

ｄｎＳＨＰ２－ＳＨ２ドメインを有するが、ホスファターゼドメインを欠くＳＨＰ２の短縮バージョン。配列は、配列番号２９として上に示している。短縮タンパク質は、ドミナントネガティブとして作用し、野生型タンパク質とＰＤ１などの阻害性免疫受容体上のリン酸化されたＩＴＩＭへの結合を競合する。

【0478】

ｄｎＴＧＦＢＲＩＩ－キナーゼドメインを欠くドミナントネガティブＴＧＦβ受容体。配列は、配列番号４６として上に示している。ｄｎＴＧＦＢＲＩＩは、野生型ＴＧＦ－β受容体とＴＧＦ－βへの結合を競合し、ＴＧＦβ媒介性シグナル伝達を下方調節する。

【0479】

ＣＣＲ－上記のようにＩＬ－２、ＩＬ－７、またはＧＭ－ＣＳＦ受容体エンドドメインを有する構成性に活性なキメラサイトカイン受容体。かかる構成性に活性なＣＣＲの成分の配列は、配列番号３０～４３として上に示している。かかる受容体が存在すると、構成性に（すなわち、関連するサイトカインの非存在下で）サイトカインシグナル伝達が生じる。

【0480】

以下のカセットを含むレトロウイルスベクターを構築する（ＧＦＰ、ｍＫａｔｅ、およびＲＱＲ８はマーカー遺伝子である）：
ベクターＡ－ＣＡＲ＋ｄｎＳＨＰ＋ＧＦＰ
ベクターＢ－ＣＡＲ＋ｄｎＴＢＲＩＩ＋ｍＫａｔｅ
ベクターＣ－ＣＡＲ＋ＣＣＲ＋ＲＱＲ８

【0481】

Ｔ細胞を、ＭＯＩが２．５：２．５の１：１混合物中の上記の２つのベクターをコードする２つのレトロウイルスの混合物で形質導入する。得られた混合集団は、第１のベクターまたは第２のベクターまたは両方のベクターを発現するＴ細胞を含む。マーカー遺伝子の発現を測定するフローサイトメトリーによって形質導入を検出および測定する。例えば、ベクターＡおよびＢの混合物で形質導入した細胞について、マーカー遺伝子ＧＦＰおよびｍＫａｔｅを使用して形質導入を検出および測定する。

【0482】

増殖を測定するために、形質導入したＴ細胞集団を、色素Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）（細胞内で加水分解されて保持される蛍光色素）で標識した。ＣＴＶは４０５ｎｍ（紫色）レーザーによって励起され、蛍光をパシフィックブルーチャネルで検出することができる。Ｔ細胞を、ＰＢＳ中で２×１０^６細胞／ｍｌに再懸濁し、１ｕｌ／ｍｌの５ｍＭ ＣＴＶを添加する。Ｔ細胞を、ＣＴＶとともに３７℃で２０分間インキュベートする。その後に、細胞を５Ｖの完全培地を添加してクエンチする。５分間のインキュベーション後、Ｔ細胞を洗浄し、２ｍｌの完全培地に再懸濁する。室温でさらに１０分間インキュベートすると酢酸加水分解が生じ、色素が保持されることが可能である。

【0483】

標識したＴ細胞を、ＣＤ－１９発現標的細胞と４日間または７日間共培養する。ベクターＡを含むベクター混合物中のｄｎＳＨＰ２拡張モジュールの機能を調査するために、標的抗原およびＰＤＬ１を共発現する標的細胞を使用する。ベクターＢを含むベクター混合物中のｄｎＴＢＲＩＩ 拡張モジュールの機能を調査するために、Ｔ細胞を、可溶性ＴＧＦ－βの存在下で標的細胞と共培養する。

【0484】

ウェルあたり５×１０^４個の形質導入されたＴ細胞および等数の標的細胞（比１：１）を使用して、総体積が０．２ｍｌの９６ウェルプレート中でアッセイを行う。４日目または７日目の時点で、Ｔ細胞をフローサイトメトリーによって分析して、Ｔ細胞が分裂するにつれて生じるＣＴＶの希釈を測定する。共培養終了時のＴ細胞の存在数を計算し、Ｔ細胞の投入数と比較した増殖を倍数として表す。

【0485】

標的細胞が発揮した免疫抑制に対応するモジュール中の優先的な拡大増殖を、前述の集団におけるセルトレースバイオレット色素の減少および集団に対応するマーカーの増加によって評価する。

【0486】

実施例３－２つの個別のレトロウイルスベクターでの二重形質導入による拡張モジュールを有する抗ＧＤ２－ＣＡＲ Ｔ細胞産物の生成
背景：神経芽細胞腫は、小児において最もよく見られる頭蓋外固形がんであり、高リスク疾患を有する小児の長期生存率は低い。

【0487】

難治性／再発性神経芽細胞腫のためのＧＤ２標的ＣＡＲＴの現在進行中の第Ｉ相臨床研究（ＮＣＴ０２７６１９１５）は、オンターゲット／オフ腫瘍毒性を誘導しない播種性疾患に対する活性を示す。しかしながら、ＣＡＲＴの存続は制限され、臨床活性は一過性で不完全であった。

【0488】

この研究で使用したＧＤ２ ＣＡＲを基礎として、本発明者らは、ＡＵＴＯ６ＮＧと名付けた次世代のＴ細胞産物候補を開発した。ＡＵＴＯ６ＮＧ産物は、２つの個別のレトロウイルスベクターでのＴ細胞の二重形質導入によって産生された３つの個別のＧＤ２標的ＣＡＲ Ｔ細胞集団からなる。第１のベクターは、構成性にシグナル伝達するＩＬ７サイトカイン受容体（ＩＬ７Ｒ＿ＣＣＲ）または構成性にシグナル伝達するＩＬ２サイトカイン受容体（ＩＬ２Ｒ＿ＣＣＲ）と共発現するＧＤ２を標的にするＣＡＲの発現を指示し（産物Ａ）、一方で、第２のベクターは、ドミナントネガティブＴＧＦｂＲＩＩ（ｄｎＴＧＦｂＲＩＩ）および短縮ＳＨＰ２（ｄＳＨＰ２）と共発現する同一のＧＤ２ ＣＡＲをコードするトリシストロン性レトロウイルスベクターである（産物Ｂ）。ｄＳＨＰ２は、阻害シグナル（ＰＤ１に由来する阻害シグナルなど）に対する耐性を付与する。

【0489】

ベクターデザインを、図７に模式的に示す。

【0490】

ＧＤ２ ＣＡＲは、ＷＯ２０１５／１３２６０４号に記載の通りであり、配列番号７７として示した配列を有するＶＨドメインおよび配列番号７８として示した配列を有するＶＬドメインを有する抗原結合ドメインを有する。

【0491】

構成性にシグナル伝達するＩＬ２およびＩＬ７サイトカイン受容体は、ＷＯ２０１７／０２９５１２号に記載の通りである。ＩＬ２ ＣＣＲは、ＩＬ－２受容体β鎖エンドドメイン（配列番号４０）を有する第１のポリペプチドおよび共通のγ鎖受容体エンドドメイン（配列番号３９）を含む第２のポリペプチドを含み；それに対して、ＩＬ７ ＣＣＲは、ＩＬ－７受容体α鎖エンドドメイン（配列番号４１）を有する第１のポリペプチドおよび共通のγ鎖受容体エンドドメイン（配列番号３９）を含む第２のポリペプチドを含む。

【0492】

選別／自殺遺伝子ＲＱＲ８は、ＷＯ２０１３／１５３３９１号に記載の通りであり、配列番号７９として示した配列を有する。

【0493】

ドミナントネガティブＴＧＦｂＲＩＩ（ｄｎＴＧＦｂＲＩＩ）は、配列番号４６として上に示した配列を有する。

【0494】

短縮ＳＨＰ２（ｄＳＨＰ２）は、配列番号２９として上に示した配列を有する。

【0495】

実施例４－一重および二重に形質導入された細胞の細胞傷害能およびｉｎ ｖｉｔｒｏでの種々のベクター発現エレメントの機能の調査
ヒトＴ細胞を、産物の混合物Ａ／Ｂ／Ａ＋Ｂ（ＡＵＴＯ６ＮＧ）を生じる両方のベクターにて二重に形質導入したか、産物ＡまたはＢを個別に生じる各ベクターにて一重に形質導入した。対照は、非形質導入細胞（ＮＴ）およびＧＤ２ ＣＡＲのみを発現する細胞を含んでいた。

【0496】

ｉ）細胞傷害性アッセイ
種々のエフェクター細胞型を、ＧＤ２発現ＳｕｐＴ１標的細胞（ＳｕｐＴ１ ＧＤ２）または対照（非形質導入標的細胞（ＳｕｐＴ１ ＮＴ））と７２時間共培養し、標的細胞の溶解率をフローサイトメトリーによって分析した。結果を図８に示す。全てのＣＡＲ発現エフェクター細胞は、ＧＤ２発現標的細胞を死滅させることができた。デュアルベクター組成物（産物Ａ／Ｂ／Ａ＋Ｂ）で形質導入したＴ細胞は、細胞傷害性アッセイにおいてＧＤ２陽性腫瘍細胞株に対して効力が高かったが、一重に形質導入されたＣＡＲ Ｔ細胞（産物ＡまたはＢ）と比較して差異は認められなかった。

【0497】

ｉｉ）ＣＣＲの検証
上記の種々の形質導入されたＣＡＲ Ｔ細胞および対照ＮＴ Ｔ細胞を、セルトレースバイオレット（ＣＴＶ）で標識し、さらに抗原刺激することなく無サイトカイン完全細胞培養培地中で７日間培養した。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの存続を、７日後のＣＴＶ色素が薄まった増殖細胞の比率およびＣＡＲ Ｔ細胞の絶対数として定量した。結果を図９に示す。構成性にシグナル伝達するＩＬ７サイトカイン受容体（ＩＬ７Ｒ＿ＣＣＲ）または構成性にシグナル伝達するＩＬ２サイトカイン受容体（ＩＬ２Ｒ＿ＣＣＲ）のいずれかを発現する産物Ａで形質導入したＴ細胞；または産物Ａ＋Ｂで形質導入したＴ細胞は、非形質導入細胞（ＮＴ）、ＧＤ２ ＣＡＲのみを発現するベクターで形質導入した細胞、または産物Ｂ（ＧＤ２ ＣＡＲ＋ｄＳＨＰ２＋ｄＴＧＦｂＲＩＩ）のみを発現するベクターで形質導入した細胞と比較して増殖が増加した。ＩＬ２またはＩＬ７Ｒ＿ＣＣＲのいずれかが発現すると、Ｔ細胞が自律的に成長することなく改変Ｔ細胞に外因性サイトカイン非依存性の生存能および恒常的増殖が付与された。

【0498】

ｉｉｉ）ｄＴＧＦｂＲＩＩの検証
上記の種々の形質導入ＣＡＲ Ｔ細胞および対照ＮＴ Ｔ細胞を、ＧＤ２発現ＳｕｐＴ１標的細胞（ＳｕｐＴ１ ＧＤ２）または対照（非形質導入標的細胞（ＳｕｐＴ１ ＮＴ））と、Ｅ：Ｔ比１：２または１：８で、１０ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβの存在下または非存在下にて７日間共培養した。標的細胞の殺滅をフローサイトメトリーによって分析し、ＩＦＮγの分泌をＥＬＩＳＡによって分析した。結果をそれぞれ図１０および１１に示す。ｄｎＴＧＦｂＲＩＩを発現する産物Ｂで形質導入したか；産物Ａ＋Ｂで形質導入したＣＡＲ Ｔ細胞は、ＧＤ２ ＣＡＲのみを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞またはいずれかの産物Ａ（ＧＤ２ ＣＡＲ＋ＩＬ２ ＣＣＲまたはＧＤ２ ＣＡＲ＋ＩＬ７ ＣＣＲ）のみを発現するベクターで形質導入した細胞と比較して、標的細胞殺滅のＴＧＦβ媒介性阻害に対する耐性を示した。産物Ｂまたは産物Ａ＋Ｂで形質導入したＣＡＲ Ｔ細胞は、ＴＧＦβの存在下でのＩＦＮγ分泌が、ＴＧＦβの非存在下で認められるものに匹敵するレベルまで回復した。対照的に、ＧＤ２ ＣＡＲのみを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞、またはいずれかの産物Ａのみを発現するベクターで形質導入した細胞によるＩＦＮγ分泌は、ＴＧＦβの存在下で有意に阻害された。したがって、ｄｎＴＧＦｂＲＩＩを発現するＴ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴＧＦβ媒介性免疫抑制に対する耐性が証明された。

【0499】

実施例５－神経芽細胞腫の異種移植片モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの二重形質導入したＣＡＲ－Ｔ細胞産物の抗腫瘍活性の調査
ｉｎ ｖｉｖｏアッセイを使用して、ＮＳＧマウスの樹立神経芽細胞腫異種移植片モデルにおける静脈内投与によるデュアルベクター組成物で形質導入されたＴ細胞の抗腫瘍活性を調査した。１０～１４週齢の雌ＮＳＧマウスに、１００万個のホタルルシフェラーゼ発現ＣＨＬＡ－２５５細胞（ＣＨＬＡ－２５５ ＦＦｌｕｃ）を静脈内注射した。ＢＬＩによって安定な生着を検出することができるまで１５日間異種移植片を定着させた。ＧＤ２ ＣＡＲを発現するシングルベクター（ＧＤ２ ＣＡＲ）での細胞の形質導入または実施例３に記載され、図７に例示されたデュアルベクター組成物（ＧＤ２ ＣＡＲ＋ＩＬ７
ＣＣＲ／ＧＤ２ ＣＡＲ＋ｄＳＨＰ２＋ｄＴＧＦｂＲＩＩ）での形質導入のいずれかによって、ＣＡＲ－Ｔ細胞を作製した。マウスに、１０×１０^６個のＣＡＲ Ｔ細胞（導入効率５０％）、３×１０^６個のＣＡＲ Ｔ細胞（導入効率５０％）、２０×１０^６個のＮＴ Ｔ細胞（１０×１０^６個のＣＡＲ Ｔ細胞の用量に等価な総Ｔ細胞）、またはＰＢＳを静脈内注射した。１４日後、腫瘍成長を、週２回の生物発光イメージングによって評価した。

【0500】

結果を図１２に示す。簡潔なＧＤ２ ＣＡＲのみを発現するＣＡＲ Ｔ細胞の静脈内送達は、腫瘍成長に有意な影響を及ぼさなかった（図１２ＡおよびＢ）。対照的に、デュアルベクター組成物で形質導入したＣＡＲ Ｔ細胞を３×１０^６個および１０×１０^６個の両方の用量にて静脈内送達すると、腫瘍負荷量が立証されているＮＳＧマウスにおいて強力な抗腫瘍活性および延命が示された（図１２ＣおよびＤ）。

【0501】

実施例６－３つの個別のレトロウイルスベクターでの三重形質導入による拡張モジュールを有する抗ＰＳＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞産物の生成
本発明者らは、以下のいくつかの機能的モジュールからなる前立腺がん処置のための組み合わせ／多モジュールＣＡＲ Ｔ治療薬（「ＡＵＴＯ７」）を開発した：１）第２世代のＣＤ２８－ＣＤ３ｚ化合物エンドドメイン（７Ａ１２－２８ｚ）を有する抗ＰＳＭＡ ＣＡＲ；２）安全スイッチ（ＷＯ２０１６／１３５４７０号に記載されており、上記の配列番号８０として示した配列を有するＲａｐａＣａｓｐ９）；３）上記の配列番号４６として示した配列を有するＴＧＦβ１耐性を誘導するためのドミナントネガティブＴＧＦβＲＩＩ（ｄｎＴＢＲＩＩ）；４）上記の配列番号２９として示した配列を有するＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１経路阻害のための短縮ＳＨＰ２（ｄｎＳＨＰ２）；５）上記の増殖を誘導するための構成性に活性なＩＬ７受容体（ＣＣＲ＿ＩＬ７）；６）配列番号７９として示した配列を有する選別－自殺遺伝子 ＲＱＲ８；および７）配列番号８１として示した配列を有するストップ－スキップ配列（ＳＳ）の下流に位置するリンパ球動員／活性化のための超低分泌性ＩＬ－１２（ｆｌｅｘｉＩＬ－１２）。ベクターデザインを、図１３Ａに示す。

【0502】

第１のベクター（Ａ）は、ｄｎＳＨＰ２、自殺遺伝子ＲＱＲ８、ＣＡＲ、およびｄｎＴＢＲＩＩをコードし；第２のベクター（Ｂ）は、構成性に活性なＩＬ７受容体をコードし；第３のベクター（Ｃ）は、第２の自殺遺伝子：Ｒａｐｃａｓｐ９；およびｆｌｅｘｉ－ＩＬ１２をコードする。

【0503】

ベクターＡおよびベクターＣ上に異なる自殺遺伝子を有することで、柔軟性が得られる。ＣＡＲ関連毒性が患者に認められる場合、リツキシマブを用いた患者を処置する通常の方法（ＲＱＲ８選別／自殺遺伝子を介してＣＡＲを発現する細胞のアポトーシスを誘発する）でＣＡＲを発現する細胞を選択的に除去することが可能である。しかしながら、ＩＬ－１２分泌に関連すると考えられる毒性が認められる場合、ＲａｐａＣａｓｐ９自殺遺伝子を介してアポトーシスを誘発するためにラパマイシンまたはラパマイシン類似体を付加することによってベクターＣで形質導入した細胞を選択的に破壊することができる。治療産物が３つのベクターの混合物で形質導入した細胞を含むので、治療産物は、１つ、２つ、または３つ全てのベクターの全ての種々の組み合わせで形質導入した細胞の異なる亜集団を有する組み合わせ産物である。これは、ＲａｐａＣａｓｐ９自殺遺伝子を誘発するいくつかのＣＡＲ発現細胞が生存するはずであることを意味する。例えば、ベクターＡのみまたはベクターＡおよびＢの組み合わせで形質導入した細胞は、ＲａｐａＣａｓｐ９を発現せず、ラパマイシンでの処置に影響を受けないはずである。これは、ｉｎ ｖｉｖｏで治療産物を「改変し」、ＩＬ－１２発現細胞を選択的に欠失させる一方で、ＣＡＲ媒介性の抗腫瘍効果を維持するためのＣＡＲ発現細胞集団を残存させることが可能であることを意味する。

【0504】

ＡＵＴＯ７を、ベクターＡを使用した一重形質導入の産物（「ＡＵＴＯ７／Ａ」）、またはベクターＡおよびＢを使用したダブル形質導入の産物（「ＡＵＴＯ７／ＡＢ」）、またはベクターＡ、Ｂ、およびＣを使用した三重形質導入の産物（「ＡＵＴＯ７／ＡＢＣ」）として調査した。同一の抗ＰＳＭＡバインダー７Ａ１２を使用して開発した第２世代のＣＡＲ（「親」）に対してＡＵＴＯ７を試験した。

【0505】

実施例７－一重、二重、および三重に形質導入された細胞の細胞傷害能およびｉｎ ｖｉｔｒｏでの種々のベクター発現エレメントの機能の調査
上記のシングル、デュアル、およびトリプルベクターの組み合わせで形質導入したＴ細胞が標的細胞を死滅させる能力を、ＦＡＣＳベースの殺滅アッセイを使用して調査した。
異なるレベルでヒトＰＳＭＡ抗原を発現するように操作したＳｕｐＴ１細胞（ＳｕｐＴ１－ＰＳＭＡｈｉｇｈ、ＳｕｐＴ１－ＰＳＭＡｌｏｗ）を、標的細胞として使用した。非操作ＳｕｐＴ１細胞（ＳｕｐＴ１－ＮＴ）を、負の対照として使用した。ＣＡＲ Ｔ細胞を、エフェクター：標的比１：２で標的細胞と共培養した。ＦＢＫを、２４時間のインキュベーション後に細胞蛍光分析によってアッセイし、結果を図１４Ａに示す。ＣＡＲ Ｔ細胞によるＩＬ－２およびＩＦＮγの分泌を、２４時間後に記載の共培養物から上清を回収し、ＥＬＩＳＡによって検出することによって測定し、結果を１４ＢおよびＣにそれぞれ示す。

【0506】

ベクターＡを使用した一重形質導入（「ＡＵＴＯ７／Ａ」）、ベクターＡおよびＢを使用したダブル形質導入（「ＡＵＴＯ７／ＡＢ」）、またはベクターＡ、Ｂ、およびＣを使用した三重形質導入（「ＡＵＴＯ７／ＡＢＣ」）によって産生された細胞組成物の全てが、細胞傷害性アッセイにおいてＰＳＭＡ陽性腫瘍細胞株に対する効力が高いことが見いだされた。細胞傷害性およびサイトカイン放出は、ＣＡＲのみの対照（CAR alone control）として使用した同一の抗ＰＳＭＡバインダー７Ａ１２を使用して開発した第２世代の
ＣＡＲ（「親」）で認められたものに匹敵した。

【0507】

一重、二重、および三重に形質導入されたＡＵＴＯ７Ｔ細胞がＩＬ－２の非存在下での培養後に標的細胞を死滅させる能力を調査するために、形質導入されたＴ細胞を、ＩＬ２の上清を含まない培地を用いて飢餓条件で７日間培養した。７日後、ＣＡＲ Ｔ細胞を計数し、ＳｕｐＴ１－ＰＳＭＡｈｉｇｈ標的細胞およびＳｕｐＴ１－ＰＳＭＡｌｏｗ標的細胞（または負の対照としてのＳｕｐＴ１－ＮＴ細胞）と共にプレーティングした。ＣＡＲ
Ｔ細胞を、標的細胞と、エフェクター：標的比１：２および１：８で共培養した。ＦＢＫを、インキュベーション２４時間後に細胞蛍光分析によってアッセイした（図１５Ａ）。ＣＡＲ Ｔ細胞によるＩＬ－２およびＩＦＮγの分泌を、２４時間後に記載の共培養物から上清を回収し、ＥＬＩＳＡによって検出することによって測定した（図１５Ｂ）。

【0508】

対照ＣＡＲを発現する細胞およびベクターＡのみで形質導入した細胞が、飢餓条件下での培養後に細胞傷害性およびサイトカイン放出を阻害したにもかかわらず、この効果はデュアルまたはトリプルベクター組み合わせ（ベクターＡ＋ＢまたはＡ、Ｂ＋Ｃ）で形質導入した細胞ではあまり顕著ではなかったことが見いだされた。ベクターＢは、構成性に活性なサイトカイン受容体を発現する遺伝子を含む：ＩＬ７Ｒ＿ＣＣＲモジュール。このモジュールが発現すると、細胞傷害性を妨害することなくサイトカイン非依存性での生存能力および増殖がもたらされる；飢餓後、ＡＵＴＯ７／ＡＢまたはＡＵＴＯ７／ＡＢＣで形質導入した細胞は、ＰＳＭＡ発現標的細胞を依然として有効に死滅させることが示された。

【0509】

一重、二重、および三重に形質導入されたＡＵＴＯ７ Ｔ細胞がＴＧＦβの存在下で標的細胞を死滅させる能力を調査するために、形質導入されたＴ細胞を、ＳｕｐＴ１－ＰＳＭＡｈｉｇｈ標的およびＳｕｐＴ１－ＰＳＭＡｌｏｗ標的と１：２および１：８（Ｅ：Ｔ）の比にて１０ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβ１の存在下または非存在下のいずれかで７日間共培養した（ＳｕｐＴ１－ＮＴを対照として使用した）。標的細胞の殺滅をＦＡＣＳによって定量し、標的のみに対して正規化した。結果を図１６に示す。

【0510】

１：８のＥ：Ｔ比で、ＣＡＲのみの対照を発現するＴ細胞による標的細胞の殺滅は、培養培地にＴＧＦβ１を添加することによって阻害された。この阻害効果は、ベクター組み合わせＡ；Ａ＋Ｂ；またはＡ、Ｂ＋Ｃのうちのいずれかで形質導入した細胞で軽減された。ベクターＡは、Ｔ細胞シグナル伝達のＴＧＦβ媒介性阻害を遮断することが以前に示されているｄｎＴＧＦβＲＩＩエレメントをコードする。

【0511】

一重、二重、および三重に形質導入されたＡＵＴＯ７ Ｔ細胞が標的抗原への反復曝露後に標的細胞を死滅させる能力を調査するために、形質導入された細胞を、ＳｕｐＴ１－ＰＳＭＡｈｉｇｈ標的細胞またはＳｕｐＴ１－ＰＳＭＡｌｏｗ標的細胞と１：１の比（Ｅ：Ｔ）で共培養し、７日毎にＣＡＲ Ｔ細胞を５×１０^４個のＳｕｐＴ１細胞で再度刺激した。標的細胞の殺滅をＦＡＣＳによって定量後、新規の各々のＣＡＲ Ｔ細胞を再刺激した。結果を図１７に示す。

【0512】

２回の再刺激後（２週目）、ベクター組み合わせＡ＋ＢまたはＡ＋Ｂ＋Ｃで形質導入した細胞は、ＣＡＲのみまたはベクターＡで形質導入した細胞よりも標的細胞を遥かに多く死滅させた。３回の再刺激後（３週目）、ベクター組み合わせＡ＋Ｂ＋Ｃで形質導入した細胞は、最良の標的細胞の殺滅を示した。

【0513】

実施例８－一重、二重、および三重に形質導入された細胞の細胞傷害能およびｉｎ ｖｉｖｏでの種々のベクター発現エレメントの機能の調査
ｉｎ ｖｉｖｏアッセイを使用して、ＮＳＧマウスの樹立異種移植片モデルにおける静脈内投与によるシングル、デュアル、またはトリプルベクター組成物で形質導入されたＴ細胞の抗腫瘍活性を調査した。

【0514】

雌ＮＳＧマウスに、５×１０^６個のＰＳＭＡ陽性ＰＣ３ヒト細胞株を側腹部に注射した。触診およびカリパスによる測定によって安定な生着を検出することができるまで３週間異種移植片を定着させた。ＣＡＲ Ｔ細胞を、１×１０^６個のＣＡＲ Ｔ細胞／マウスの用量でｉ．ｖ．投与した。カリパス測定を、１週間に２～３回行った。結果を図１８に示す。

【0515】

ＣＡＲのみを発現するＴ細胞で（非経口）処置したマウスは、非形質導入細胞を投与したマウスよりも腫瘍成長の遅延を示したが、腫瘍成長は制御されなかった。ＣＡＲ、ｄｎＳＨＰ２、およびｄｎＴＧＦβＲＩＩをコードするベクターＡで形質導入したＴ細胞を投与したマウスは、初期に腫瘍成長を示し（９月９日）、その後に腫瘍サイズが減少した（９月２３日）。研究終了時に、腫瘍成長がいくらか再開が観察された（１０月７日）。

【0516】

ベクターＡ＋Ｂで形質導入したＴ細胞を投与したマウスは、初期に腫瘍成長を示し（９月９日～１６日）、しかしながらその後に腫瘍サイズが減少し、この効果は研究期間にわたって持続された。三重に形質導入されたＡＵＴＯ７ ＣＡＲ Ｔ細胞は、腫瘍を完全に根絶させ、毒性の兆候は認められなかった。ベクター組み合わせ、特にＡ＋ＢおよびＡ＋Ｂ＋Ｃは、異種移植片モデルでのマウスにおける腫瘍成長の軽減および生存の促進がＣＡＲのみよりも有意に改善されることを示している。

【0517】

結果は、多モジュールＡＵＴＯ７産物の実行可能性および有効性を証明している。ＩＬ７Ｒ＿ＣＣＲ、ｓｓ＿ｆＩＬ１２、ｄｎＴＧＦβＲＩＩ、およびｄＳＨＰ２の各モジュールを抗ＰＳＭＡ ＣＡＲ産物に付加すると、存続の延長、増殖、活性化、ならびにＴＧＦβ１およびＰＤ１／ＰＤＬ１によって駆動される免疫阻害に対する耐性によってＴ細胞機能が強化された。

【0518】

方法
バインダーの生成
ＰＳＭＡ－バインダーを、遺伝子ワクチン接種したラット由来の抗ＰＳＭＡ抗体のＣＤＲグラフティングによって生成した。

【0519】

細胞株
ＰＣ３細胞、ＳｕｐＴ１細胞株（ＮＴおよびＰＳＭＡ＋）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％ＧｌｕｔａＭＡＸを補充したＲＰＭＩ－１６４０培地中で培養した。Ｔ細胞を末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から単離し、１０％ＦＢＳ、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ、および１００Ｕ／ｍＬ ＩＬ－２を補充したＲＰＭＩ－１６４０培地中で維持した。

【0520】

形質導入
レトロウイルスを、ＲＤＦプラスミド（ＲＤ１１４エンベロープ）、ｇａｇ／ｐｏｌプラスミド、およびＣＡＲプラスミドを含むＧｅｎｅＪｕｉｃｅを用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞を一過性にトランスフェクトすることによって生成した。レトロウイルスの上清を、４８時間後および７２時間後に採取した。Ｔ細胞を、ＴＣ処理したＴ１７５フラスコ中で０．５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を使用して刺激し、１００Ｕ／ｍＬ
ＩＬ－２中で保持した。ＴＣ未処理の６ウェルプレートを、Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎでコーティングし、４℃で２４時間インキュベーション後、Ｔ細胞を形質導入した。合計３ｍｌのウイルス上清／複数の上清をプレーティング後に１ｍｌの活性化Ｔ細胞（濃度１×１０^６細胞／ｍｌ）を添加し、次いで、１００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２を添加し、１０００×ｇにて室温で４０分間遠心分離し、３７℃および５％ＣＯ２で２～３日間インキュベートした。

【0521】

ヒトＴ細胞は以下であった：
・ベクターＡ、Ｂ、およびＣで三重形質導入され、産物の混合物（ＡＵＴＯ７／ＡＢＣ）を生成するもの
・ベクターＡおよびＢで二重形質導入され、産物の混合物（ＡＵＴＯ７／ＡＢ）を生成するもの
・ベクターＡで一重形質導入され、単一の産物（ＡＵＴＯ７／Ａ）を生成するもの

【0522】

細胞傷害性アッセイ
ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＳｕｐＴ１－ＮＴおよびＳｕｐＴ１－ＰＳＭＡとエフェクター：標的比（Ｅ：Ｔ比）１：２または１：８でＴＣ処置した９６ウェルプレート中で共培養した。２４時間の共培養後に抗ＣＤ３－ＰｅＣｙ７およびＱｂｅｎ１０－ＡＰＣで染色することによって読み取りを行ってエフェクターＴ細胞および標的細胞を識別し、ＳＹＴＯＸ Ｂｌｕｅ７－ＡＡＤ死細胞染色剤を使用して、死細胞を排除した。細胞傷害性の読み取り値をフローサイトメトリーによって評価した。

【0523】

ＴＧＦの存在下での細胞傷害性アッセイ
ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＳｕｐＴ１－ＮＴおよびＳｕｐＴ１－ＰＳＭＡｈｉｇｈおよびＳｕｐＴ１－ＰＳＭＡｌｏｗとエフェクター：標的比（Ｅ：Ｔ比）１：２または１：８でＴＣ処置した９６ウェルプレート中で共培養した。ＴＧＦβ１を０日目に１０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加し、細胞傷害性の読み取り値を７日目にフローサイトメトリーによって評価した。

【0524】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ再刺激アッセイ
ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＳｕｐＴ１－ＰＳＭＡｈｉｇｈ標的細胞またはＳｕｐＴ１－ＰＳＭＡｌｏｗ標的細胞と１：１の比（Ｅ：Ｔ）で共培養した。７日ごとにＣＡＲ Ｔ細胞を５×１０^４個のＳｕｐＴ１細胞で再度刺激した。細胞傷害性を、上記のようにＦＢＫアッセイによって評価し、再刺激後の標的：エフェクター比を、細胞蛍光分析によって高めた。上清を回収してサイトカイン放出を評価した。

【0525】

サイトカインＥＬＩＳＡ
ヒトＩＬ－２ ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ（商標）ＤｅｌｕｘｅキットおよびヒトＩＦＮ－γ
ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ（商標）Ｄｅｌｕｘｅキットを使用して、細胞傷害性アッセイから採取した共培養物上清中のサイトカイン分泌レベルを評価した。

【0526】

ｉｎ ｖｉｖｏ実験
５×１０^６個のＰＳＭＡ陽性ＰＣ３ヒト細胞株を、雌ＮＳＧマウスの側腹部に注射した。触診およびカリパスによる測定によって安定な生着を検出することができるまで３週間異種移植片を定着させた。ヒトＰＢＭＣを、一重、二重、または三重形質導入によって作出した。ＣＡＲ Ｔ細胞を、１×１０^６個のＣＡＲ Ｔ細胞／マウスの用量でｉ．ｖ．投与した。１週間に２～３回カリパスで測定し、動物プロトコールが終了するまで追跡した。

【0527】

上記明細書中に記載の全ての刊行物は、本明細書中で参考として援用される。本発明の記載の方法およびシステムの種々の修正および変形は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者に明らかである。本発明を特定の好ましい実施形態と併せて記載しているが、特許請求の範囲に記載の発明がかかる特定の実施形態に過度に制限されるべきではないと理解すべきである。実際、分子生物学または関連分野の当業者に明らかな本発明の実施のための記載の様式の種々の修正は、以下の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
細胞組成物を作製する方法であって、細胞の集団を少なくとも２つのウイルスベクターの混合物で形質導入するステップを含み、ここで、少なくとも１つのベクターが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含み；ここで、少なくとも１つのベクターが、前記ＣＡＲ、前記ＣＡＲを発現する細胞、または標的細胞の活性を調整する活性調節因子をコードする核酸を含む、方法。
（項目２）
前記活性調節因子が、ドミナントネガティブなＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記活性調節因子が、ドミナントネガティブトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）β受容体である、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記活性調節因子が、構成性に活性なキメラサイトカイン受容体である、項目１に記載の方法。
（項目５）
ウイルスベクターの前記混合物中で、少なくとも１つのベクターが、ドミナントネガティブなＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２をコードする核酸配列を含み；少なくとも１つのベクターが、ドミナントネガティブトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）β受容体をコードする核酸配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
ウイルスベクターの前記混合物が、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのウイルスベクターを含み、そのうちの少なくとも１つが、ＣＡＲをコードする核酸配列を含み；そのうちの少なくとも１つが、活性調節因子をコードする核酸配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
以下のステップ：
（ｉ）細胞の集団を少なくとも２つのウイルスベクターの混合物で形質導入するステップ；および
（ｉｉ）ステップ（ｉ）由来の前記形質導入された細胞の集団からＣＡＲ発現細胞を選択するステップ
を含む、前記項目のいずれかに記載の細胞組成物を作製する方法。
（項目８）
前記混合物中の前記ウイルスベクターの各々が、ＣＡＲをコードする核酸配列を含む、項目１～５のいずれかに記載の方法。
（項目９）
項目１～８のいずれかに定義のウイルスベクター混合物を含むウイルスベクター組成物。
（項目１０）
第１のベクターおよび第２のベクターを含み、その両方がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含む、項目９に記載のウイルスベクター組成物。
（項目１１）
前記第１のベクターの核酸配列および前記第２のベクターの核酸配列が同一のＣＡＲをコードする、項目１０に記載のウイルスベクター組成物。
（項目１２）
前記第１のベクターおよび前記第２のベクターの両方が、前記ＣＡＲ、前記ＣＡＲを発現する細胞、または標的細胞の活性を調整する活性調節因子をコードする核酸も含む、項目１０または１１に記載のウイルスベクター組成物。
（項目１３）
前記活性調節因子が、ドミナントネガティブなＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２；ドミナントネガティブトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）β受容体；および構成性に活性なキメラサイトカイン受容体から選択される、項目１２に記載のウイルスベクター組成物。（項目１４）
前記第１のベクターが、ドミナントネガティブなＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２をコードする核酸配列およびドミナントネガティブトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）β受容体をコードする核酸配列を含み；前記第２のベクターが、構成性に活性なキメラサイトカイン受容体をコードする核酸配列を含む、項目１３に記載のウイルスベクター組成物。（項目１５）
前記第１および第２のベクターが同一のＣＡＲをコードし、前記ＣＡＲがジシアロガングリオシド（ＧＤ２）に結合する抗原結合ドメインを有する、項目１１～１４のいずれかに記載のウイルスベクター組成物。
（項目１６）
前記第１のベクターおよび／または前記第２のベクターが、自殺遺伝子をコードする核酸配列を含む、項目１０～１５のいずれかに記載のウイルスベクター組成物。
（項目１７）
項目１～８のいずれかに記載の方法によって作製されたか、細胞を項目９～１６のいずれかに記載のベクター組成物で形質導入することによって作製された細胞組成物。
（項目１８）
被験体の疾患を処置する方法であって、項目１７に記載の細胞組成物を前記被験体に投与するステップを含む、方法。
（項目１９）
疾患の処置および／または防止に使用するための、項目１７に記載の細胞組成物。
（項目２０）
疾患の処置および／または防止のための医薬の製造における、項目１７に記載の細胞組成物の使用。
（項目２１）
疾患を処置するためのＣＡＲ発現細胞の成分の最適な組み合わせを決定する方法であって、以下のステップ：
（ｉ）項目１７に記載の細胞組成物を、前記疾患を有する被験体に投与するステップ；
（ｉｉ）前記患者または前記患者由来の試料をモニタリングして、前記細胞組成物中のどの細胞の亜集団が最も高いレベルの生着および／または増殖を示すのかを決定する、モニタリングするステップ；および
（ｉｉｉ）亜集団中の前記細胞の表現型／遺伝子型を解析して、前記細胞によって発現されたＣＡＲ（複数可）および／または活性調節因子（複数可）を確認する、解析するステップ
を含む、方法。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10-1】

【図10-2】

【図11-1】

【図11-2】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図12D】

【図13A】

【図13B】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【図16】

【図17】

【図18A-1】

【図18A-2】

【図18B】

【配列表】

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【外国語明細書】