ホーム > 特許ランキング > ＴｏｘｏＴｅｃｈ ＡＢ
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024069606
(43)【公開日】2024-05-21
(54)【発明の名称】ボツリヌス神経毒バイオハイブリッド
(51)【国際特許分類】
C07K 14/33 20060101AFI20240514BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20240514BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240514BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240514BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240514BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20240514BHJP
A61K 8/64 20060101ALI20240514BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20240514BHJP
A61Q 19/08 20060101ALI20240514BHJP
【ＦＩ】
C07K14/33
C12N15/31 ZNA
C07K19/00
C12N15/63 Z
C12N15/62 Z
A61P21/00
A61K8/64
A61K38/16
A61Q19/08
【審査請求】有
【請求項の数】32
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024043984
(22)【出願日】2024-03-19
(62)【分割の表示】P 2020568035の分割
【原出願日】2019-02-21
(31)【優先権主張番号】1850213-8
(32)【優先日】2018-02-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】SE
(71)【出願人】
【識別番号】520325430
【氏名又は名称】トクソテック アー・ベー
【氏名又は名称原語表記】ＴｏｘｏＴｅｃｈ ＡＢ
【住所又は居所原語表記】Ｓｅｒｇｅａｎｔｇｒａｎｄ １６， １７７ ４３ Ｊａｒｆａｌｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ
(74)【代理人】
【識別番号】100114890
【弁理士】
【氏名又は名称】アインゼル・フェリックス＝ラインハルト
(74)【代理人】
【識別番号】100098501
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 拓
(74)【代理人】
【識別番号】100116403
【弁理士】
【氏名又は名称】前川 純一
(74)【代理人】
【識別番号】100134315
【弁理士】
【氏名又は名称】永島 秀郎
(74)【代理人】
【識別番号】100162880
【弁理士】
【氏名又は名称】上島 類
(72)【発明者】
【氏名】ポール ステンマルク
(72)【発明者】
【氏名】ジェフリー マスヤー
(57)【要約】 （修正有）
【課題】シナプトタグミン受容体、シナプス関連小胞２受容体及びガングリオシド受容体に相乗的に結合する新規のボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ）重鎖結合ドメインを提供する。
【解決手段】Ｎ末端（ＨC N）及びＣ末端（ＨCC）を有するボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ）重鎖結合ドメイン（ＨC／ＴＡＢ）であって、ＨC／ＴＡＢは、ａ）シナプトタグミン（Ｓｙｔ）受容体結合部位、ｂ）シナプス関連小胞２（ＳＶ２）受容体結合部位、ｃ）ガングリオシド（Ｇａｎｇ）受容体結合部位を含み、前記ＨC／ＴＡＢは、Ｓｙｔ受容体、ＳＶ２受容体、及び、Ｇａｎｇ受容体に相乗的に結合するように適合されている、前記ＢｏＮＴ重鎖結合ドメイン（ＨC／ＴＡＢ）である。
【選択図】図１４
【解決手段】Ｎ末端（ＨC N）及びＣ末端（ＨCC）を有するボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ）重鎖結合ドメイン（ＨC／ＴＡＢ）であって、ＨC／ＴＡＢは、ａ）シナプトタグミン（Ｓｙｔ）受容体結合部位、ｂ）シナプス関連小胞２（ＳＶ２）受容体結合部位、ｃ）ガングリオシド（Ｇａｎｇ）受容体結合部位を含み、前記ＨC／ＴＡＢは、Ｓｙｔ受容体、ＳＶ２受容体、及び、Ｇａｎｇ受容体に相乗的に結合するように適合されている、前記ＢｏＮＴ重鎖結合ドメイン（ＨC／ＴＡＢ）である。
【選択図】図１４
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｎ末端（ＨCN）及びＣ末端（ＨCC）を有するボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ）重鎖結合ドメイン（ＨC／ＴＡＢ）であって、ＨC／ＴＡＢは、
ａ）シナプトタグミン（Ｓｙｔ）受容体結合部位、及び
ｂ）シナプス関連小胞２（ＳＶ２）受容体結合部位、及び
ｃ）ガングリオシド（Ｇａｎｇ）受容体結合部位
を含み、前記ＨC／ＴＡＢは、シナプトタグミン（Ｓｙｔ）受容体、シナプス関連小胞２（ＳＶ２）受容体及びガングリオシド（Ｇａｎｇ）受容体に相乗的に結合するように適合されている、前記ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ）重鎖結合ドメイン（ＨC／ＴＡＢ）。
ａ）シナプトタグミン（Ｓｙｔ）受容体結合部位、及び
ｂ）シナプス関連小胞２（ＳＶ２）受容体結合部位、及び
ｃ）ガングリオシド（Ｇａｎｇ）受容体結合部位
を含み、前記ＨC／ＴＡＢは、シナプトタグミン（Ｓｙｔ）受容体、シナプス関連小胞２（ＳＶ２）受容体及びガングリオシド（Ｇａｎｇ）受容体に相乗的に結合するように適合されている、前記ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ）重鎖結合ドメイン（ＨC／ＴＡＢ）。
【請求項2】
Ｇａｎｇ受容体結合部位を形成する配列が、任意のＧａｎｇ受容体結合ＢｏＮＴ血清型及びそれらのサブタイプから生じる、請求項１に記載のＨC／ＴＢＡ。
【請求項3】
Ｓｙｔ受容体結合部位を形成する配列が、任意のＳｙｔ受容体結合ＢｏＮＴ血清型及びそれらのサブタイプから生じる、請求項１又は２に記載のＨC／ＴＢＡ。
【請求項4】
ＳＶ２受容体結合部位を形成する配列が、任意のＳＶ２受容体結合ＢｏＮＴ血清型及びそれらのサブタイプから生じる、請求項１から３までのいずれか１項に記載のＨC／ＴＢＡ。
【請求項5】
ＨCN配列が、任意のＳＶ２受容体結合ＢｏＮＴ血清型及びそれらのサブタイプから生じる、請求項１から４までのいずれか１項に記載のＨC／ＴＢＡ。
【請求項6】
ＨCCドメインが、ＢｏＮＴ血清型Ａ（ＢｏＮＴ／Ａ）及びＢｏＮＴ血清型Ｂ（ＢｏＮＴ／Ｂ）からの配列から互換的に構成されることを特徴とする、請求項１から５までのいずれか１項に記載のＨC／ＴＢＡ。
【請求項7】
前記ＨCC端が、配列Ａ1Ｂ1Ａ2Ｂ2Ａ3に従って構成され、ＡがＢｏＮＴ／Ａからの配列を示し、ＢがＢｏＮＴ／Ｂからの配列を示すことを特徴とする、請求項１から６までのいずれか１項に記載のＨC／ＴＢＡ。
【請求項8】
Ｂ1、Ａ2及びＢ2の配列が、ＨC／ＴＡＢ全体のための安定した分子内界面を作出するための変異及び／又は欠失を含む、請求項７に記載のＨC／ＴＢＡ。
【請求項9】
Ｇａｎｇ受容体結合部位を形成する配列が、ＢｏＮＴ／Ｂから生じる、請求項１から８までのいずれか１項に記載のＨC／ＴＢＡ。
【請求項10】
Ｇａｎｇ受容体結合部位を形成する配列が、Ｂ2に位置する、請求項７又は８に記載のＨC／ＴＢＡ。
【請求項11】
Ｓｙｔ受容体結合部位を形成する配列が、ＢｏＮＴ Ｂ、ＤＣ又はＧから生じる、請求項１から１０までのいずれか１項に記載のＨC／ＴＢＡ。
【請求項12】
Ｓｙｔ受容体結合部位を形成する配列が、Ｂ1及びＢ2に位置する、請求項７、８又は１０のいずれか１項に記載のＨC／ＴＢＡ。
【請求項13】
ＨCN配列が、ＢｏＮＴ／Ａから生じる、請求項１から１２までのいずれか１項に記載のＨC／ＴＢＡ。
【請求項14】
ＳＶ２受容体結合部位を形成する配列が、ＨCNに位置し、ＨCCにおいてＡ1及びＡ3に位置する、請求項７、８、１０又は１２のいずれか１項に記載のＨC／ＴＢＡ。
【請求項15】
配列番号１の配列に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１から１４までのいずれか１項に記載のＨC／ＴＡＢ。
【請求項16】
直接又はリンカーを介して他のタンパク質、ポリペプチド、アミノ酸配列又は蛍光プローブのいずれか１つ以上に結合した、請求項１から１５までのいずれか１項に記載のＨC／ＴＡＢを含むポリペプチド。
【請求項17】
前記ポリペプチドが、ＨC／ＴＡＢに加えて重鎖転座ドメイン（ＨN）、軽鎖（ＬＣ）及びポリペプチド配列におけるＬＣとＨNとの間に位置するプロテアーゼ部位を含むことを特徴とするＢｏＮＴポリペプチド（ＢｏＮＴ／ＴＡＢ）であり、ここでＨN及びＬＣは、それぞれ互いに独立して、ＢｏＮＴ血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＤＣ、Ｅ、Ｅｎ、Ｆ、Ｇ又はＸ及びそれらのサブタイプのいずれかから生じる、請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項18】
さらに、直接又はリンカーを介してそれらに連結した、任意の他のタンパク質、ポリペプチド、アミノ酸配列又は蛍光プローブを含む、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項19】
プロテアーゼ部位が、エキソプロテアーゼ部位である、請求項１７又は１８に記載のポリペプチド。
【請求項20】
配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２のいずれかの配列に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１６から１９までのいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項21】
請求項１から１５までのいずれか１項に記載のＨC／ＴＡＢ又は請求項１６から２０までのいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクター。
【請求項22】
配列番号４、配列番号７、配列番号９、配列番号１１又は配列番号１３のいずれかの配列に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％同一である核酸配列を有する、請求項２１に記載のベクター。
【請求項23】
治療的方法又は美容的方法において使用するための、請求項１から１５までのいずれか１項に記載のＨC／ＴＡＢ又は請求項１６から２０までのいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項24】
治療的方法又は美容的方法が、筋肉を弱める及び／又は不活性化する治療である、請求項２３に記載の使用のためのＨC／ＴＡＢ又はポリペプチド。
【請求項25】
治療的方法が、神経筋障害、及び痙性筋障害を含む群から選択される障害の治療及び／又は予防である、請求項２３又は２４に記載の使用のためのＨC／ＴＡＢ又はポリペプチド。
【請求項26】
障害が、痙攣性発声障害、痙性斜頸、喉頭ジストニア、顎口腔発声障害、舌ジストニア、頸部ジストニア、上肢局所性ジストニア、眼瞼痙攣、斜視、片側顔面痙攣、眼瞼疾患、脳性麻痺、局所性痙攣及び他の音声障害、痙攣性大腸炎、神経因性膀胱、アニスムス、四肢痙攣、チック、動作時振戦、歯ぎしり、肛門裂傷、アカラシア、嚥下障害及び他の筋緊張障害、並びに筋肉群の不随意運動、流涙、多汗、過度の唾液分泌、過度の胃腸分泌、分泌障害、筋痙攣による痛み、頭痛、スポーツ外傷、及びうつ状態によって特徴付けられる他の障害から構成される群から選択される、請求項２３から２５までのいずれか１項に記載の使用のためのＨC／ＴＡＢ又はポリペプチド。
【請求項27】
シナプスプロセスにおける前記タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸配列又は蛍光プローブの役割を調査するための、薬理試験で使用するための請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項28】
任意のタンパク質、ポリペプチド、アミノ酸配列又はそれに結合された蛍光プローブを神経表面に効果的に輸送するためのビヒクルとして使用するための、請求項１から１５までのいずれか１項に記載のＨC／ＴＡＢ。
【請求項29】
任意のタンパク質、ポリペプチド、アミノ酸配列又は蛍光プローブを、毒素転座システムを使用して神経細胞質ゾルに効果的に輸送するためのビヒクルとして使用するための、請求項１７から２０までのいずれか１項に記載のＢｏＮＴ／ＴＡＢ。
【請求項30】
請求項１から１５までのいずれか１項に記載のＨC／ＴＡＢ又は請求項１６から２０までのいずれか１項に記載のポリペプチドを含む、医薬組成物又は化粧品組成物。
【請求項31】
請求項３０に記載の組成物及び組成物の治療的投与のための指示を含むキット。
【請求項32】
望ましくないニューロン活性に関連する状態を治療する方法であって、請求項１から１５までのいずれか１項に記載のＨC／ＴＡＢ、又は請求項１６から２０までのいずれか１項に記載のポリペプチド、又は請求項３０に記載の医薬組成物の治療的有効量を対象に投与して、前記状態を治療することを含み、前記状態が、痙攣性発声障害、痙性斜頸、喉頭ジストニア、顎口腔発声障害、舌ジストニア、頸部ジストニア、上肢局所性ジストニア、眼瞼痙攣、斜視、片側顔面痙攣、眼瞼疾患、脳性麻痺、局所性痙攣及び他の音声障害、痙攣性大腸炎、神経因性膀胱、アニスムス、四肢痙攣、チック、動作時振戦、歯ぎしり、肛門裂傷、アカラシア、嚥下障害及び他の筋緊張障害、並びに筋肉群の不随意運動、流涙、多汗、過度の唾液分泌、過度の胃腸分泌、分泌障害、筋痙攣による痛み、頭痛、スポーツ外傷、及びうつ状態、及び皮膚科的又は美的／美容的状態によって特徴付けられる他の障害から構成される群から選択される、望ましくないニューロン活性に関連する状態を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ボツリヌス神経毒ポリペプチド、特にキメラボツリヌス神経毒の重鎖に関する。
【0002】
背景技術
ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ）は、公知の最も強力なタンパク質毒素であり、まれな麻痺性疾患であるボツリヌス中毒の原因物質である。細菌毒のこのファミリーは、８つの血清型であるＢｏＮＴ／Ａ－Ｇ、及び既に述べられているＢｏＮＴ／Ｘ（Ｍｏｎｔａｌ、２０１０年；Ｚｈａｎｇら、２０１７年）からなる。これらは、全て共通の構造を共有し、翻訳後に重鎖（ＨＣ、１００ｋＤａ）に単一のジスルフィド架橋により連結された軽鎖（ＬＣ、５０ｋＤａ）から構成される二本鎖分子に切断される１５０ｋＤａのタンパク質として表される。ＬＣが細胞内触媒活性を担っている場合に、ＨＣはＮ末端転座ドメイン（ＨN）及びＣ末端結合ドメイン（ＨC）を有する２つの機能ドメインを保持する。ＢｏＮＴは、最初に特定の細胞表面受容体を介してコリン作動性神経終末を認識し、そして次に小胞内にエンドサイトーシスによって取り込まれる。酸性のエンドソーム環境は、サイトゾル内でのＬＣの転座を可能にする構造変化を生じ、毒素転座ともいわれる。遊離した触媒ドメインである亜鉛プロテアーゼは、３つのニューロンＳＮＡＲＥ（可溶性Ｎ－エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質受容体）の１つを特異的に標的とすることができる：ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｃ及びＢｏＮＴ／ＥはＳＮＡＰ－２５を切断する；ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／Ｇ及びＢｏＮＴ／ＸはＶＡＭＰ（シナプトブレビン）を標的とする；シンタキシンはＢｏＮＴ／Ｃによって切断される（Ｓｃｈｉａｖｏら、２０００年；Ｚｈａｎｇら、２０１７年）。これらの３つのタンパク質は、シナプス小胞と原形質膜との融合を媒介する複合体を形成する（Ｓｕｄｈｏｆ及びＲｏｔｈｍａｎ、２００９年）。ＳＮＡＲＥのいずれかのタンパク質分解は、エキソサイトーシスを阻害し、したがって神経伝達物質の放出を阻害し、ボツリヌス中毒の弛緩性麻痺症状を効果的に生じる（Ｒｏｓｓｅｔｔｏら、２０１４年）。３つの機能ドメインの配列は以前に記載されている（Ｌａｃｙ ＤＢら、１９９９年）。触媒ドメインは、アミノ酸１～４３７、アミノ酸４４８～８７２の転座ドメイン、及びアミノ酸８７３～１２９５の結合ドメインから構成されており、Ｌａｃｙ ＤＢらのＢｏＮＴ／Ａ配列を参照している。全てのＢｏＮＴ血清型及びそれらのサブタイプは非常に相同であるため、他の血清型又はサブタイプにおいて対応するドメインの位置は非常に似ている。
ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ）は、公知の最も強力なタンパク質毒素であり、まれな麻痺性疾患であるボツリヌス中毒の原因物質である。細菌毒のこのファミリーは、８つの血清型であるＢｏＮＴ／Ａ－Ｇ、及び既に述べられているＢｏＮＴ／Ｘ（Ｍｏｎｔａｌ、２０１０年；Ｚｈａｎｇら、２０１７年）からなる。これらは、全て共通の構造を共有し、翻訳後に重鎖（ＨＣ、１００ｋＤａ）に単一のジスルフィド架橋により連結された軽鎖（ＬＣ、５０ｋＤａ）から構成される二本鎖分子に切断される１５０ｋＤａのタンパク質として表される。ＬＣが細胞内触媒活性を担っている場合に、ＨＣはＮ末端転座ドメイン（ＨN）及びＣ末端結合ドメイン（ＨC）を有する２つの機能ドメインを保持する。ＢｏＮＴは、最初に特定の細胞表面受容体を介してコリン作動性神経終末を認識し、そして次に小胞内にエンドサイトーシスによって取り込まれる。酸性のエンドソーム環境は、サイトゾル内でのＬＣの転座を可能にする構造変化を生じ、毒素転座ともいわれる。遊離した触媒ドメインである亜鉛プロテアーゼは、３つのニューロンＳＮＡＲＥ（可溶性Ｎ－エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質受容体）の１つを特異的に標的とすることができる：ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｃ及びＢｏＮＴ／ＥはＳＮＡＰ－２５を切断する；ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／Ｇ及びＢｏＮＴ／ＸはＶＡＭＰ（シナプトブレビン）を標的とする；シンタキシンはＢｏＮＴ／Ｃによって切断される（Ｓｃｈｉａｖｏら、２０００年；Ｚｈａｎｇら、２０１７年）。これらの３つのタンパク質は、シナプス小胞と原形質膜との融合を媒介する複合体を形成する（Ｓｕｄｈｏｆ及びＲｏｔｈｍａｎ、２００９年）。ＳＮＡＲＥのいずれかのタンパク質分解は、エキソサイトーシスを阻害し、したがって神経伝達物質の放出を阻害し、ボツリヌス中毒の弛緩性麻痺症状を効果的に生じる（Ｒｏｓｓｅｔｔｏら、２０１４年）。３つの機能ドメインの配列は以前に記載されている（Ｌａｃｙ ＤＢら、１９９９年）。触媒ドメインは、アミノ酸１～４３７、アミノ酸４４８～８７２の転座ドメイン、及びアミノ酸８７３～１２９５の結合ドメインから構成されており、Ｌａｃｙ ＤＢらのＢｏＮＴ／Ａ配列を参照している。全てのＢｏＮＴ血清型及びそれらのサブタイプは非常に相同であるため、他の血清型又はサブタイプにおいて対応するドメインの位置は非常に似ている。
【0003】
これらの毒素の高い効力は、神経筋障害、例えば斜視、頸部ジストニア及び眼瞼痙攣、並びにアセチルコリンの放出に関与する他の状態、例えば多汗症の治療において非常に有用な治療薬となる（Ｃｈｅｎ、２０１２年）。ＢｏＮＴ／Ａ及びＢｏＮＴ／Ｂは、治療薬として認証及び市販されている唯一の血清型である。ＢｏＮＴ／Ａは、一般的に、ヒトでの有効性が高いと考えられており、したがって、ほとんどの場合に血清型として選択される（Ｂｅｎｔｉｖｏｇｌｉｏら、２０１５年）。しかしながら、毒素の治療効果が一時的のみであるため、ＢｏＮＴでの治療は、通常、注射を繰り返す必要がある。これは、報告によると、ＢｏＮＴ／Ａに対する免疫応答を生じる患者のごく一部に耐性が出現したことを導く（Ｌａｎｇｅら、２００９年；Ｎａｕｍａｎｎら、２０１３年）。ＢｏＮＴ／Ｂは代替案を表すが、その低い有効性は、高用量を要求することを意味し、したがって免疫原性のリスクが高くなる（Ｄｒｅｓｓｌｅｒ及びＢｉｇａｌｋｅ、２００５年）。さらに、ＢｏＮＴ／Ｂは、いくつかの有害事象、例えば痛い注射、より短い作用期間、及びより頻繁な副作用にも関連する（Ｂｅｎｔｉｖｏｇｌｉｏら、２０１５年）。主な有害作用は、筋痙攣の治療にもしばしば関連しているが、しかし美容用途には関連していない。これは、有害作用が主に身体の他の領域への毒素の拡散によるものであり、毒素の拡散の可能性が注射された用量に直接関係しているからである。有害作用は、一過性の重大でない事象、例えば眼瞼下垂及びや複視から、生命にかかわる事象、さらには死までの範囲にわたる。
【0004】
ＢｏＮＴ／Ａ及びＢｏＮＴ／Ｂのニューロンへの結合は詳細に特徴付けられており、シナプス小胞タンパク質とニューロン膜上で固定されたガングリオシドとを含む二重受容体メカニズムに基づく。ＢｏＮＴ／Ａのタンパク質受容体は、ＳＶ２として同定された（Ｄｏｎｇら、２００６年、Ｍａｈｒｈｏｌｄら、２００６年）。より正確には、ＢｏＮＴ／Ａは、いくつかのヒトＳＶ２アイソフォームＡ、Ｂ及びＣに結合できるが、毒素は、ＳＶ２Ａ及びＳＶ２ＢのＮ－グリコシル化型のみを認識する（Ｙａｏら、２０１６年）。ＢｏＮＴ／Ｂのタンパク質受容体は、シナプトタグミン（Ｓｙｔ）（Ｎｉｓｈｉｋｉら、１９９４年、１９９６年；Ｄｏｎｇら、２００３年）であり、ヒトではＳｙｔ２よりもＳｙｔ１が優先される（Ｓｔｒｏｔｍｅｉｅｒら、２０１２年）。ガングリオシドの認識は、全てのＢｏＮＴ（Ｂｉｎｚ及びＲｕｍｍｅｌ、２００９年）の中毒プロセスの最初のステップであり、それらの配列において保存されたモチーフＨ．．．ＳｘＷＹ．．．Ｇを中心とした共有結合メカニズムにより媒介される。ＢｏＮＴ／Ａは、ＧＴ１ｂ及びＧＤ１ａの末端Ｎ－アセチルガラクトサミン－ガラクトース部分への結合が好ましく（Ｔａｋａｍｉｚａｗａら、１９８６年；Ｓｃｈｅｎｇｒｕｎｄら、１９９１年）、ＢｏＮＴ／Ｂのデータは、ＧＤ１ｂ及びＧＴ１ｂのジシアリルモチーフが好ましいことを示唆している。異なる血清型は、それらの炭水化物の特異性及びアフィニティーにおいて変化する（Ｒｕｍｍｅｌ、２０１３）。
【0005】
種々のＢｏＮＴ血清型のモジュラー配置及び特有の特性は、毒素をタンパク質工学の選択対象とする。特に、いくつかの研究は、血清型間でドメイン全体を交換することが可能であり（Ｍａｓｕｙｅｒら、２０１４年）、したがって独特の製薬の可能性を有する新たな毒素を得ることができることを示している。例えば、ＢｏＮＴ／Ａの転座及び触媒ドメインに関連するＢｏＮＴ／Ｂの結合ドメインからなるいくつかの分子が生成されている（Ｒｕｍｍｅｌら、２０１１年；Ｗａｎｇら、２０１２年；Ｋｕｔｓｃｈｅｎｋｏら、２０１７年）。これらのいわゆるキメラ毒素は、シナプトタグミンについてのＢｏＮＴ／Ｂの高いアフィニティー、及びＳＶ２と比較してニューロン上のこの受容体のより高い発現に関連していた、活性のエフィカシー（efficacy）及び持続期間の点で魅力的な薬理学的特性を示した（Ｔａｋａｍｏｒｉら、２００６年；Ｗｉｌｈｅｌｍら、２０１４年）。
【0006】
発明の要約
中和抗体の生成及び毒素の拡散の双方が注射された投与量に直接関係しているため、同レベルの毒素活性を維持しながら毒素投与量を下げることが強く望まれ、これは、個々の毒素分子のエフィカシーを高める必要があることを意味する。したがって、本発明の目的は、改善された持続期間及びポテンシー（potency）を有し、かつ注射部位から拡散するリスクがより少ないＢｏＮＴポリペプチドを提供することである。本発明者らは、キメラＢｏＮＴポリペプチドの操作における前記した以前の試みの重要な問題を特定している。以前の試みでは、ポリペプチドの構造的側面は考慮されていなかった。
中和抗体の生成及び毒素の拡散の双方が注射された投与量に直接関係しているため、同レベルの毒素活性を維持しながら毒素投与量を下げることが強く望まれ、これは、個々の毒素分子のエフィカシーを高める必要があることを意味する。したがって、本発明の目的は、改善された持続期間及びポテンシー（potency）を有し、かつ注射部位から拡散するリスクがより少ないＢｏＮＴポリペプチドを提供することである。本発明者らは、キメラＢｏＮＴポリペプチドの操作における前記した以前の試みの重要な問題を特定している。以前の試みでは、ポリペプチドの構造的側面は考慮されていなかった。
【0007】
構造に基づくアプローチと、ＢｏＮＴ／Ａ及びＢｏＮＴ／Ｂの受容体結合メカニズムに対する現在の知識とを使用して、本発明者らは、ＳＶ２Ｃ受容体、シナプトタグミン受容体及びガングリオシド受容体を認識できる、特異的に設計されたＨCドメイン（ＨC／ＴＡＢ）を含む新しい分子ＴｒｉＲｅｃＡＢＴｏｘ（ＢｏＮＴ／ＴＡＢ）を設計した。本発明者らは、ＢｏＮＴ／ＴＡＢを組換えにより発現及び精製できることを示している。Ｘ線結晶学を使用して、本発明者らは、さらに、ＢｏＮＴ／ＴＡＢがその３つの受容体に同時に結合できることを実証している。したがって、ＢｏＮＴ／ＴＡＢは、高められたアフィニティーを有する神経細胞を認識し、かつＢｏＮＴ／Ａ治療に代わり高いエフィカシーである可能性を有する。
【0008】
したがって、前記目的は、ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ）重鎖結合ドメイン（ＨC／ＴＡＢ）を提供する第一の態様によって達成され、ここで、ＨC／ＴＡＢは、ａ）シナプトタグミン（Ｓｙｔ）受容体結合部位、及びｂ）シナプス関連小胞２（ＳＶ２）受容体結合部位、及びｃ）ガングリオシド（Ｇａｎｇ）受容体結合部位を含み、前記ＨC／ＴＡＢは、シナプトタグミン（Ｓｙｔ）受容体、シナプス関連小胞２（ＳＶ２）受容体及びガングリオシド（Ｇａｎｇ）受容体に相乗的に結合するように適合されている。
【0009】
ＨC／ＴＡＢは、Ｎ末端（ＨCN）及びＣ末端（ＨCC）を有する。一実施形態に従って、ＨCCドメインは、ＢｏＮＴ血清型Ａ（ＢｏＮＴ／Ａ）及びＢｏＮＴ血清型Ｂ（ＢｏＮＴ／Ｂ）からの配列から互換的に構成される。
【0010】
さらなる実施形態に従って、前記ＨCC端は、配列Ａ1Ｂ1Ａ2Ｂ2Ａ3に従って構成され、ＡはＢｏＮＴ／Ａからの配列を示し、ＢはＢｏＮＴ／Ｂからの配列を示す。
【0011】
さらなる実施形態に従って、Ｂ1、Ａ2及びＢ2の配列は、ＨC／ＴＡＢ全体のための安定した分子内界面を作出するための変異及び／又は欠失を含む。
【0012】
さらなる実施形態に従って、Ｇａｎｇ受容体結合部位を形成する配列は、任意のＧａｎｇ受容体結合ＢｏＮＴ血清型及びそれらのサブタイプから生じる。
【0013】
さらなる実施形態に従って、Ｇａｎｇ受容体結合部位を形成する配列は、ＢｏＮＴ／Ｂから生じる。
【0014】
さらなる実施形態に従って、Ｇａｎｇ受容体結合部位を形成する配列は、Ｂ2に位置する。
【0015】
さらなる実施形態に従って、Ｓｙｔ受容体結合部位を形成する配列は、任意のＳｙｔ受容体結合ＢｏＮＴ血清型及びそれらのサブタイプから生じる。
【0016】
さらなる実施形態に従って、Ｓｙｔ受容体結合部位を形成する配列は、ＢｏＮＴ Ｂ、ＤＣ又はＧから生じる。
【0017】
さらなる実施形態に従って、Ｓｙｔ受容体結合部位を形成する配列は、Ｂ1及びＢ2に位置する。
【0018】
さらなる実施形態に従って、ＨCN配列は、任意のＳＶ２受容体結合ＢｏＮＴ血清型及びそれらのサブタイプから生じる。
【0019】
さらなる実施形態に従って、ＨCN配列は、ＢｏＮＴ／Ａから生じる。
【0020】
さらなる実施形態に従って、ＳＶ２受容体結合部位を形成する配列は、ＨCNに位置し、ＨCCにおいてＡ1及びＡ3に位置する。
【0021】
さらなる実施形態に従って、ＨC／ＴＡＢは、配列番号１、３、５、６、８、１０又は１２のいずれかの配列に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％同一であるアミノ酸配列を有する。
【0022】
第二の態様に従って、直接又はリンカーを介して他のタンパク質、ポリペプチド、アミノ酸配列又は蛍光プローブに結合された、第一の態様及び第一の態様の任意の実施形態に従ったＨC／ＴＡＢを含むポリペプチドが提供される。
【0023】
第二の態様の実施形態に従って、前記ポリペプチドは、ＨC／ＴＡＢに加えて重鎖転座ドメイン（ＨN）、軽鎖（ＬＣ）及びポリペプチド配列におけるＬＣとＨNとの間に位置するプロテアーゼ部位を含むことを特徴とするＢｏＮＴポリペプチド（ＢｏＮＴ／ＴＡＢ）であり、ここでＨN及びＬＣは、それぞれ互いに独立して、ＢｏＮＴ血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＤＣ、Ｅ、Ｅｎ、Ｆ、Ｇ又はＸ及びそれらのサブタイプ、並びにＢｏＮＴ様ポリペプチドのいずれかから生じる。
【0024】
さらなる実施形態に従って、ポリペプチドは、直接又はリンカーを介してそれらに連結された、任意の他のタンパク質、ポリペプチド、アミノ酸配列又は蛍光プローブを含んでよい。
【0025】
さらなる実施形態に従って、プロテアーゼ部位は、エキソプロテアーゼ部位である。さらなる実施形態に従って、エキソプロテアーゼ部位は、Ｘａ因子部位である。
【0026】
さらなる実施形態に従って、第二の態様に従ったポリペプチドは、配列番号１、３、５、６、８、１０又は１２のいずれかの配列に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％同一であるアミノ酸配列を有する。
【0027】
第三の態様に従って、第一の態様及び第一の態様の任意の実施形態に従ったＨC／ＴＡＢをコードする核酸配列、又は第二の態様及び第二の態様の任意の実施形態に従ったポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターが提供される。
【0028】
第四の態様に従って、治療的方法における、又は美容的方法における、第一の態様及び第一の態様の任意の実施形態に従ったＨC／ＴＡＢ、又は第二の態様及び第二の態様の任意の実施形態に従ったポリペプチの使用が提供される。
【0029】
第四の態様の一実施形態に従って、治療的方法又は美容的方法は、筋肉を弱める及び／又は不活性化する治療である。
【0030】
第四の態様のさらなる実施形態に従って、治療的方法は、神経筋障害、アセチルコリンの放出に関与する状態、及び痙性筋障害を含む群から選択される障害の治療及び／又は予防である。
【0031】
さらなる実施形態に従って、障害は、痙攣性発声障害、痙性斜頸、喉頭ジストニア、顎口腔発声障害（oromandibular dysphonia）、舌ジストニア、頸部ジストニア、上肢局所性ジストニア、眼瞼痙攣、斜視、片側顔面痙攣、眼瞼疾患、脳性麻痺、局所性痙攣及び他の音声障害、痙攣性大腸炎、神経因性膀胱、アニスムス、四肢痙攣、チック、動作時振戦、歯ぎしり、肛門裂傷、アカラシア、嚥下障害及び他の筋緊張障害、並びに筋肉群の不随意運動、流涙、多汗、過度の唾液分泌、過度の胃腸分泌、分泌障害、筋痙攣による痛み、頭痛、スポーツ外傷、及びうつ状態によって特徴付けられる他の障害から構成される群から選択される。
【0032】
さらなる実施形態に従って、第一の態様及び第一の態様の任意の実施形態に従ったＨC／ＴＡＢ、又は第二の態様及び第二の態様の任意の実施形態に従ったポリペプチドは、シナプスプロセスにおける前記タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸配列又は蛍光プローブの役割を調査するために薬理学的試験において使用されうる。
【0033】
さらなる実施形態に従って、第一の態様及び第一の態様の任意の実施形態に従ったＨC／ＴＡＢ、又は第二の態様及び第二の態様の任意の実施形態に従ったポリペプチドは、任意のタンパク質、ポリペプチド、アミノ酸配列又はそれに結合された蛍光プローブを神経表面に効果的に輸送するためのビヒクルとして使用されうる。
【0034】
さらなる実施形態に従って、第一の態様及び第一の態様の任意の実施形態に従ったＨC／ＴＡＢ、又は第二の態様及び第二の態様の任意の実施形態に従ったポリペプチドは、任意のタンパク質、ポリペプチド、アミノ酸配列又は蛍光プローブを、毒素転座システムを使用して神経細胞質ゾルに効果的に輸送するためのビヒクルとして使用されうる。
【0035】
第五の態様に従って、第一の態様及び第一の態様の任意の実施形態に従ったＨC／ＴＡＢ、又は第二の態様及び第二の態様の任意の実施形態に従ったポリペプチドを含む医薬組成物又は化粧品組成物が提供される。
【0036】
第五の態様の一実施形態に従って、組成物は、製剤的及び／又は美容的に許容できる賦形剤、キャリヤー又は他の添加剤をさらに含みうる。
【0037】
第六の態様に従って、第五の態様の組成物及び組成物の治療的投与のための指示を含むキット（kit of parts）が提供される。
【0038】
第七の態様に従って、望ましくないニューロン活性に関連する状態を治療する方法が提供され、この方法は、第一の態様及び第一の態様の任意の実施形態に従ったＨC／ＴＡＢ、又は第二の態様及び第二の態様の任意の実施形態に従ったポリペプチド、又は第五の態様の組成物の治療的有効量を対象に投与して、前記状態を治療することを含み、ここで、前記状態は、痙攣性発声障害、痙性斜頸、喉頭ジストニア、顎口腔発声障害、舌ジストニア、頸部ジストニア、上肢局所性ジストニア、眼瞼痙攣、斜視、片側顔面痙攣、眼瞼疾患、脳性麻痺、局所性痙攣及び他の音声障害、痙攣性大腸炎、神経因性膀胱、アニスムス、四肢痙攣、チック、動作時振戦、歯ぎしり、肛門裂傷、アカラシア、嚥下障害及び他の筋緊張障害、並びに筋肉群の不随意運動、流涙、多汗、過度の唾液分泌、過度の胃腸分泌、分泌障害、筋痙攣による痛み、頭痛、スポーツ外傷、及びうつ状態、及び皮膚科的又は美的／美容的状態によって特徴付けられる他の障害から構成される群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【0039】
【図1】ＢｏＮＴ／Ａ及びＢｏＮＴ／Ｂによる受容体結合に関する構造情報。（ａ）ＧＴ１ｂ（ＰＤＢ ２ＶＵ）と、及びヒトのグリコシル化ＳＶ２Ｃ（ＰＤＢ ５ＪＬＶ）と複合したＢｏＮＴ／Ａの結合ドメインの結晶構造の重ね合わせ。（ｂ）ＧＤ１ａ及びラットのシナプトタグミン２（ＰＤＢ ４ＫＢＢ）と複合したＢｏＮＴ／Ｂの結合ドメインの結晶構造。タンパク質はリボンの形式で表示し、炭水化物は棒として表示した。（ｃ）ＨC／Ａ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１０８４５）及びＨC／Ｂ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１０８４４）の配列アラインメント、ここで二次構造要素も提供される（ＥＳＰｒｉｐｔ３．０で作成された図；Ｒｏｂｅｒｔ及びＧｏｕｅｔ、２０１４年）。受容体の結合に直接関与する領域は、ＳＶ２受容体についてＨC／Ａ配列の上及びＳｙｔ受容体についてＨC／Ｂ配列の下の線で、それぞれのドメインについて強調表示されている；ガングリオシド受容体結合部位には、縞模様の灰色の線で下線を引く。
【図2】ＨC／Ａ及びＨC／Ｂによる受容体結合を有するＨC／ＴＡＢの配列アラインメント。タンパク質配列をＣｌｕｓｔａｌＯと共に整列させた（Ｓｉｅｖｅｒｓら、２０１１年）。ＨC／ＴＡＢの設計において使用されるＨC／Ａ及びＨC／Ｂのセグメントを、それぞれ黒（白の文字）及び明るい灰色（黒の文字）で強調表示する。欠失を含む位置を、濃い灰色（ダッシュ）で示した。
【図3】ＨC／ＴＡＢの特徴。（ａ）精製したＨC／ＴＡＢのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析、及びＨC／Ａ及びＨC／Ｂ対照との比較。（ｂ）ポリヒスチジンプローブを使用したウエスタンブロット分析、（ａ）と同一試料。「Ｍ」は分子量マーカーを示す。
【図4】ＳＶ２Ｃ、ヒトのシナプトタグミン１及びＧＤ１ａと複合したＴｒｉＲｅｃＡＢＴｏｘの結合ドメインのＸ線結晶構造。（ａ）ＳＶ２Ｃ、ｈＳｙｔ１及びＧＤ１ａを有するＨC／ＴＡＢのリボン表示。（ｂ～ｄ）ＳＶ２Ｃ受容体結合部位（ｂ）、ＧＤ１ａ（ｃ）及びｈＳｙｔ１（ｄ）の周囲の２σでの２Ｆｏ－Ｆｃ電子密度マップ（メッシュ）の例。
【図5】ＳＶ２受容体への結合。（ａ）ｈＳＶ２Ｃと複合したＨC／ＴＡＢ及びＨC／Ａ（ＰＤＢ ４ＪＲＡ）の結晶構造の重ね合わせ。（ｂ）グリコシル化ｈＳＶ２との複合体におけるＨC／ＴＡＢ及びＨC／Ａ（ＰＤＢ ５ＪＬＶ）の結晶構造の重ね合わせ。結合に関与する残基（Ｂｅｎｏｉｔら、２０１４年）を棒として示し、対応するＨC／Ａ位置に従って標識付けする。
【図6】シナプトタグミンへの結合。それぞれヒトＳｙｔ１及びラットＳｙｔ２と複合したＨC／ＴＡＢ及びＨC／Ｂ（ＰＤＢ ４ＫＢＢ）の結晶構造の重ね合わせ。結合に関与する残基（Ｊｉｎら、２００６年；Ｃｈａｉら、２００６年）を棒として示し、対応するＨC／Ｂ位置に従って標識付けする。
【図7】ＧＤ１ａへの結合。ＧＤ１ａとの複合体におけるＨC／ＴＡＢ及びＨC／Ｂ（ＰＤＢ ４ＫＢＢ）の結晶構造の重ね合わせ（それぞれ暗い灰色及び明るい灰色）。結合に関与する残基（Ｂｅｒｎｔｓｓｏｎら、２０１３年）を棒として示し、対応するＨC／Ｂ位置に従って標識付けする。
【図8】ＢｏＮＴ／ＴＡＢの特徴。（ａ）ＨC／Ａ及びＨC／Ｂ対照との、精製したＢｏＮＴ／ＴＡＢのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。（ｂ～ｄ）ポリヒスチジンプローブ（ｂ）；ＨC／Ａ（ｃ）及びＨC／Ｂ（ｄ）抗血清を使用したウエスタンブロット分析。（ａ）と同一の試料、「Ｍ」は分子量マーカーを示す。
【図9】ＢｏＮＴ／ＴＡＢの活性化。（ａ）機能ドメイン組織化を説明するＢｏＮＴ／ＴＡＢ構築物の略図。設計したプロテアーゼ活性化部位を、黒い破線で示す。軽鎖と重鎖の間の天然のジスルフィド架橋を、黒い線（ｂ）ＢｏＮＴ／ＴＡＢ活性化アッセイのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析として示す。非還元型（ＮＲ）及び還元型（Ｒ）の非活性化ＢｏＮＴ／ＴＡＢ（左）及びＸａ因子活性化ＢｏＮＴ／ＴＡＢ（右）。目的の断片に注釈を付けている；「Ｍ」は分子量マーカーを示す。
【図10】ＨC／ＴＡＢの拡張使用。（ａ）ＨC／ＴＡＢに関連する潜在的な機能性ＢｏＮＴ誘導体の略図。構築物は、任意の血清型又はサブタイプ（「ｎ」）からの機能的なＢｏＮＴドメインからなる。プロテアーゼ活性化部位（黒い破線）も含めるべきである。（ｂ）神経細胞の表面にカーゴタンパク質を輸送するためにＨC／ＴＡＢを使用する潜在的な構築物の概略図。
【図11】ＨC／ＴＡＢの精製。（ａ）５ｍｌのＨｉｓＴｒａｐ ＦＦカラムを使用したアフィニティークロマトグラフィー精製からのクロマトグラフ（Ａ280トレース）。（ｂ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムを使用したサイズ排除精製のクロマトグラフ（Ａ280トレース）。精製プロセスの段階及びＨC／ＴＡＢを有する画分を強調表示する。
【図12】ＳＶ２Ｃ、ｈＳｙｔ１及びＧＤ１ａと複合したＨC／ＴＡＢの結晶。（ａ）２０％（ｖ／ｖ）ポリエチレングリコール６０００、０．１Ｍクエン酸塩（ｐＨ５．０）中で成長させた結晶。（ｂ）Ｄｉａｍｏｎｄ Ｉ０４－１ステーションでデータ収集するためにクライオループに取り付けられた結晶。（ｃ）結晶のＸ線回折パターン。
【図13】ＢｏＮＴ／ＴＡＢの精製。（ａ）５ｍｌのＨｉｓＴｒａｐ ＦＦカラムを使用したアフィニティークロマトグラフィー精製からのクロマトグラフ（Ａ280トレース）。（ｂ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムを使用したサイズ排除精製のクロマトグラフ（Ａ280トレース）。精製プロセスの段階及びＢｏＮＴ／ＴＡＢを有する画分を強調表示する。
【図14】ＳＶ２Ｃ、ヒトシナプトタグミン１及びＧＤ１ａと複合したＨC／ＴＡＢの結合ドメインのＸ線結晶構造。（ａ）及び（ｂ）ＨC／ＴＡＢ（ａ）及びＨC／ＴＡＢ２．１（ｂ）の結晶構造の温度分析（パテ半径表示）、ここで半径はＢ因子に比例する。ループ「３６０」を示し、位置３６０及び３６２を黒で強調表示する。（ｃ）ＳＶ２Ｃ、ｈＳｙｔ１及びＧＤ１ａ（棒で表示）との複合ＨC／ＴＡＢ２．１のＸ線結晶構造。（ｄ）（ｃ）と同様に脂質結合ループを標識付けし、疎水性残基を棒として示す。
【図15】ＨC／ＴＡＢ２．１の精製。（ａ）５ｍｌのＨｉｓＴｒａｐ ＦＦカラムを使用したアフィニティークロマトグラフィー精製からのクロマトグラフ（Ａ280トレース）。（ｂ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムを使用したゲル濾過精製のクロマトグラフ（Ａ280トレース）。ＨC／ＴＡＢ２．１の画分を表示する。（ｃ）及び（ｄ）ＨC／ＴＡＢ２．１の特徴。（ｃ）におけるアフィニティークロマトグラフィー及びゲル濾過（ｄ）から精製したＨC／ＴＡＢ２．１の画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析；左側の最初のレーンは分子量マーカーを示す。ＨC／ＴＡＢ２．１に対応したバンドを表示する。
【図16】ＨC／ＴＡＢ２．１．１及びＨC／ＴＡＢ２．１．３の精製。（ａ）及び（ｂ）それぞれＨC／ＴＡＢ２．１．１のアフィニティークロマトグラフィー精製及びゲル濾過からのクロマトグラフ（Ａ280トレース）。ＨC／ＴＡＢ２．１．１の画分を表示する。（ｃ）及び（ｄ）それぞれＨC／ＴＡＢ２．１．３のアフィニティークロマトグラフィー精製及びゲル濾過からのクロマトグラフ（Ａ280トレース）。ＨC／ＴＡＢ２．１．３の画分を表示する。（ｄ）ＨC／ＴＡＢ２．１．１及びＨC／ＴＡＢ２．１．３の特徴。精製した試料のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析；左側の最初のレーンは分子量マーカーを示す。ＨC／ＴＡＢ２．１．１及びＨC／ＴＡＢ２．１．３に対応したバンドを表示する。
【図17】図Ｘ４：ＢｏＮＴ／ＴＡＢ２．１．３の精製。（ａ）及び（ｂ）ＢｏＮＴ／ＴＡＢ２．１．３精製からの画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。アフィニティークロマトグラフィー（ａ）及びゲル濾過（ｂ）からの画分；左側の最初のレーンは分子量マーカーを示す。ＢｏＮＴ／ＴＡＢ２．１．３に対応するバンドを表示する。（ｃ）精製したＢｏＮＴ／ＴＡＢ２．１．３試料のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。レーン１：トロンビン活性化前の試料、レーン２：最終活性化試料（トロンビン処理後の処理）。完全長（単鎖）、ＨＣ及びＬＣに対応するバンドを表示する。右側のレーンは分子量マーカーを示す。（ｄ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムを使用した最終ゲル濾過（トロンビン処理後の切断）のクロマトグラフ（Ａ280トレース）。ＢｏＮＴ／ＴＡＢ２．１．３の画分を表示する。
【0040】
定義
本明細書において使用される場合に、ボツリヌス神経毒「ＢｏＮＴ」という用語は、ボツリヌス神経毒からの任意のポリペプチド又は断片を包含する。ＢｏＮＴという用語は、完全長のＢｏＮＴを示しうる。ＢｏＮＴという用語は、ＢｏＮＴがニューロンに入り、神経伝達物質の放出を阻害する、全体的な細胞メカニズムを実行できるＢｏＮＴの断片を示しうる。ＢｏＮＴという用語は、任意の特定の機能又は活性をその断片が必要としない単なるＢｏＮＴの断片を示しうる。
本明細書において使用される場合に、ボツリヌス神経毒「ＢｏＮＴ」という用語は、ボツリヌス神経毒からの任意のポリペプチド又は断片を包含する。ＢｏＮＴという用語は、完全長のＢｏＮＴを示しうる。ＢｏＮＴという用語は、ＢｏＮＴがニューロンに入り、神経伝達物質の放出を阻害する、全体的な細胞メカニズムを実行できるＢｏＮＴの断片を示しうる。ＢｏＮＴという用語は、任意の特定の機能又は活性をその断片が必要としない単なるＢｏＮＴの断片を示しうる。
【0041】
本明細書において使用される場合に、「転座ドメイン」又は「ＨN」という用語は、ＢｏＮＴ軽鎖転座を媒介する中毒プロセスの転座ステップを実行できるＢｏＮＴドメインを意味する。したがって、ＨNは、膜を越えて細胞の細胞質へのＢｏＮＴ軽鎖の移動を促進する。
【0042】
本明細書において使用される場合に、「結合ドメイン」という用語は、「ＨCドメイン」と同義であり、例えば標的細胞の原形質膜表面にあるＢｏＮＴ特異的受容体システムへのＢｏＮＴの結合を含む、中毒プロセスの細胞結合ステップを実行できる任意の天然に生じるＢｏＮＴ受容体結合ドメインを意味する。
【0043】
本開示において、「核酸」及び「遺伝子」という用語は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列又はポリヌクレオチドを説明するために互換的に使用される。
【0044】
詳細な説明
背景技術の段落において明記したように、ＢｏＮＴは軽鎖（ＬＣ）を含み、単一のジスルフィド架橋によって重鎖（ＨＣ）に連結される。重鎖（ＨＣ）は、Ｎ末端転座ドメイン（ＨN）及びＣ末端結合ドメイン（ＨC）を有する２つの機能ドメインを保持しているが、ＬＣは細胞内触媒活性を担っている。したがって、ＨCは、感受性ニューロン上に発現する特定の受容体に特異的かつ不可逆的に結合できる受容体結合ドメインを含み、一方で、ＨNは、付着したＬＣをエンドソーム様膜小胞から細胞質ゾルに移動させるチャネルを形成する。異なるＢｏＮＴ血清型は、ＨC上で異なるセットの受容体結合部位、典型的に２つの受容体結合部位を有する。本発明者らは、この知識を使用して、３つの異なる受容体についての結合部位を含む新規のＢｏＮＴ ＨC結合ドメイン（ＨC／ＴＡＢ）を設計している。
背景技術の段落において明記したように、ＢｏＮＴは軽鎖（ＬＣ）を含み、単一のジスルフィド架橋によって重鎖（ＨＣ）に連結される。重鎖（ＨＣ）は、Ｎ末端転座ドメイン（ＨN）及びＣ末端結合ドメイン（ＨC）を有する２つの機能ドメインを保持しているが、ＬＣは細胞内触媒活性を担っている。したがって、ＨCは、感受性ニューロン上に発現する特定の受容体に特異的かつ不可逆的に結合できる受容体結合ドメインを含み、一方で、ＨNは、付着したＬＣをエンドソーム様膜小胞から細胞質ゾルに移動させるチャネルを形成する。異なるＢｏＮＴ血清型は、ＨC上で異なるセットの受容体結合部位、典型的に２つの受容体結合部位を有する。本発明者らは、この知識を使用して、３つの異なる受容体についての結合部位を含む新規のＢｏＮＴ ＨC結合ドメイン（ＨC／ＴＡＢ）を設計している。
【0045】
本発明者は、以下を含むＨC／ＴＡＢドメインを設計することによりこれを達成した：
ａ）シナプトタグミン（Ｓｙｔ）受容体結合部位、及び
ｂ）シナプス関連小胞２（ＳＶ２）受容体結合部位、及び
ｃ）ガングリオシド（Ｇａｎｇ）受容体結合部位。
設計したＨC／ＴＡＢドメインの構造は、ＨC／ＴＡＢを、シナプトタグミン（Ｓｙｔ）受容体、シナプス関連小胞２（ＳＶ２）受容体及びガングリオシド（Ｇａｎｇ）受容体に相乗的に結合させる。したがって、ニューロン細胞上の３つの受容体への相乗的な結合が達せられ、新規のＨC／ＴＡＢドメインに他のＢｏＮＴ ＨCドメインと比較してアフィニティーを強化させる。したがって、ニューロンへの全体的な結合を改善し、結果として毒素のエフィカシーを改善する。
ａ）シナプトタグミン（Ｓｙｔ）受容体結合部位、及び
ｂ）シナプス関連小胞２（ＳＶ２）受容体結合部位、及び
ｃ）ガングリオシド（Ｇａｎｇ）受容体結合部位。
設計したＨC／ＴＡＢドメインの構造は、ＨC／ＴＡＢを、シナプトタグミン（Ｓｙｔ）受容体、シナプス関連小胞２（ＳＶ２）受容体及びガングリオシド（Ｇａｎｇ）受容体に相乗的に結合させる。したがって、ニューロン細胞上の３つの受容体への相乗的な結合が達せられ、新規のＨC／ＴＡＢドメインに他のＢｏＮＴ ＨCドメインと比較してアフィニティーを強化させる。したがって、ニューロンへの全体的な結合を改善し、結果として毒素のエフィカシーを改善する。
【0046】
ＨCは、さらに、Ｎ末端（ＨCN）及びＣ末端（ＨCC）を含む。本発明の重要な特徴は、受容体結合ドメインがＢｏＮＴに配置されているＨC／ＴＡＢのＨCC末端の構造である。
【0047】
ＨC／ＴＡＢの一実施形態において、ＨCC末端は、ＢｏＮＴ血清型Ａ（ＢｏＮＴ／Ａ）及びＢｏＮＴ血清型Ｂ（ＢｏＮＴ／Ｂ）からの配列から交換可能に構成される。この交換可能な構造を設計することにより、本発明者らは、３つ全ての受容体への相乗的な結合を最適化することができた。
【0048】
本発明のさらなる実施形態において、ＨCC端は、配列Ａ1Ｂ1Ａ2Ｂ2Ａ3に従って構成され、ここで、Ａは、ＢｏＮＴ／Ａからの配列を示し、Ｂは、ＢｏＮＴ／Ｂからの配列を示す（図２を参照されたい）。これは、ＨC／ＴＡＢの構造をさらに最適化し、３つの受容体結合ドメインを、３つ全ての前記受容体に少なくとも相乗的に、可能であればさらに同時に結合することを可能にする。本発明者らは、３つ全ての受容体への同時結合が、このＡ1Ｂ1Ａ2Ｂ2Ａ3配列を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで生じることを示している。この特定の実施形態に従って操作されたＡ1Ｂ1Ａ2Ｂ2Ａ3配列は、配列番号１において記載されている。
【0049】
上記に従ってＨC／ＴＡＢをさらに最適化するために、変異及び欠失を導入して、安定した分子内界面を作出している（図２を参照されたい）。配列番号１において、位置３０６、３６０及び３６２において置換を実施し、元の配列と比較して、位置２６５／２６６と位置３６０／３６１の間で欠失を実施した。しかしながら、当業者は、前記の特定位置から＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、又は－１、－２、－３、－４もしくは－５の位置でのアミノ酸の変異及び／又は欠失が、同一の効果を有することを認識するであろう。したがって、特定のアミノ酸位置から±５のアミノ酸の位置での任意のかかる改質は、本開示の範囲内に含まれる。
【0050】
前記特定の実施形態及び以下の全ての実施例に従って、ガングリオシド受容体結合部位はＢｏＮＴ／Ｂに由来するが、任意のＧａｎｇ受容体結合ＢｏＮＴ血清型及びそれらのサブタイプ、例えばＢｏＮＴ血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＤＣ、Ｅ、Ｅｎ、Ｆ、ＧもしくはＸ又はそれらのサブタイプに由来してよいと考えられる。それというのも、全ての血清型がガングリオシド受容体結合部位を有しているからである。
【0051】
本発明の好ましい実施形態に従って、Ｇａｎｇ受容体結合部位を形成する配列は、Ｂ2に位置する。
【0052】
ＳＶ２受容体結合ドメインは、通常、ＳＶ２受容体結合ＢｏＮＴ血清型及びそれらのサブタイプ、特にＢｏＮＴ血清型Ａ、Ｄ、Ｅ及びＦに由来しうる。前記特定の実施形態及び以下の全ての実施例において、ＳＶ２受容体結合ドメインはＢｏＮＴ／Ａに由来するが、当業者が認識しているように、ＳＶ２受容体結合ドメインを含む任意の血清型を、添付の特許請求の範囲によるＨC／ＴＡＢの目的及び意図される使用に従って、前記ドメインの起源として使用してよい。
【0053】
ＳＶ２受容体結合ドメインの一部は、ＨCN末端に存在する。したがって、結果として、ＨCN配列は、ＳＶ２受容体結合ＢｏＮＴ血清型及びそれらのサブタイプのいずれかに由来しうる。前記特定の実施形態及び以下の全ての実施例において、ＨCN末端は、ＢｏＮＴ／Ａに由来する。しかしながら、当業者が認識しているように、ＳＶ２受容体結合ドメインが機能的である限り、ＨCN配列は、ＢｏＮＴ血清型Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ又はＧのいずれかに由来してもよい。
【0054】
さらに、本発明の好ましい実施形態に従って、ＳＶ２受容体結合部位を形成する配列は、ＨCNに位置し、ＨCCにおいてＡ1及びＡ3に位置する。
【0055】
Ｓｙｔ受容体結合部位は、任意のＳｙｔ受容体結合ＢｏＮＴ血清型及びそれらのサブタイプに由来しうる。特に、Ｓｙｔ受容体結合部位は、ＢｏＮＴ血清型Ｂ、キメラＤＣ又はＧに由来しうる。本発明の好ましい実施形態に従って、Ｓｙｔ受容体結合部位を形成する配列は、Ｂ1及びＢ2に位置する。
【0056】
本発明は、前記に従ってＨC／ＴＡＢを含むポリペプチドも提供する。したがって、ポリペプチドは、他のタンパク質、ポリペプチド、アミノ酸配列、又は蛍光プローブを含んでよく、直接又はリンカーを介してＨC／ＴＡＢに結合される。以下、ＨC／ＴＡＢに結合されるタンパク質、ポリペプチド又はアミノ酸配列を「タンパク質」という。
【0057】
好ましい一実施形態に従って、ポリペプチドは、ＨN及びＬＣ、並びにポリペプチド配列におけるＬＣとＨNとの間に位置するエキソプロテアーゼ部位をさらに含む組換えＢｏＮＴポリペプチド（ＢｏＮＴ／ＴＡＢ）である。
【0058】
エキソプロテアーゼ部位は、一本鎖ポリペプチドを二本鎖分子に切断することを可能にし、活性毒素にする分子を生じる。本発明の実施形態に従って、エキソプロテアーゼ部位は、Ｘａ因子部位であるが、これは本発明によるポリペプチドの限定的な特徴ではない。
【0059】
一実施形態に従って、その活性型でのＢｏＮＴ／ＴＡＢは、配列番号５によるものである。他の実施形態に従って、その活性型でのＢｏＮＴ／ＴＡＢは、配列番号６、８、１０又は１２の配列のいずれかによるものである。好ましくは、その活性型でのＢｏＮＴ／ＴＡＢは、配列番号１２によるものである。
【0060】
ＨNとＬＣの双方は、それぞれ独立して、ＢｏＮＴ血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＤＣ、Ｅ、Ｅｎ、Ｆ、Ｇ又はＸ、及びそれらのサブタイプ、並びにＢｏＮＴ様ポリペプチドのいずれかに由来する。ＢｏＮＴに似ている新たなタンパク質、すなわち類似したドメイン構造及び異なる程度の配列同一性を有しているが、クロストリジウム・ボツリヌス（C.-botulinum）以外の生物によって産生された新たなタンパク質が出現している。したがって、当業者は、ＢｏＮＴ血清型、それらのサブタイプ、又はＢｏＮＴ様ポリペプチドのいずれかからＨN及び／又はＬＣを選択することができるであろう。
【0061】
前記したＨC／ＴＡＢに導入された変異及び欠失は、設計したＢｏＮＴ／ＴＡＢが、正確な構造及び要求される活性と共に可溶性タンパク質として生成されることを、さらに確実にする。
【0062】
前記に従ったポリペプチドは、ＨC／ＴＡＢが組換えにより生成される必要があるため、好ましくは組換えにより生成される。
【0063】
したがって、本開示は、前記に従ったＨC／ＴＡＢ又はポリペプチドのいずれかをコードする単離した核酸及び／又は組換え核酸も提供する。本開示のＨC／ＴＡＢ又はポリペプチドをコードする核酸は、二本鎖又は一本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡであってよい。特定の態様において、単離されたポリペプチド断片をコードする目的の核酸は、本明細書において記載したＨC／ＴＡＢ又はポリペプチドのいずれかのバリアントであるポリペプチドをコードする核酸を含むとさらに理解される。バリアントヌクレオチド配列は、１つ以上のヌクレオチドの置換、付加又は欠失によって異なる配列、例えばアレルバリアントを含む。
【0064】
本発明は、前記に従ったＨC／ＴＡＢをコードする核酸配列を含むベクターも提供する。ベクターは、さらに、ＨC／ＴＡＢと共に組み換えにより生成されて、１つのポリペプチドでＨC／ＴＡＢに結合した前記タンパク質又はプローブを得る、他のタンパク質又はプローブをコードする核酸配列を含みうる。ベクターは、好ましくは発現ベクターである。ベクターは、核酸に操作可能に連結させたプロモーターを含みうる。本明細書において記載されるポリペプチドの発現のために種々のプロモーターを使用することができ、それらは当該技術分野における当業者に公知である。
【0065】
核酸を含む発現ベクターは、従来の技術（例えば、エレクトロポレーション、リポソームトランスフェクション、及びリン酸カルシウム沈殿）によって宿主細胞に移すことができ、そしてトランスフェクトした細胞を従来の技術によって培養して、本明細書において記載されるポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態において、本明細書において記載したポリペプチドの発現は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター又は組織特異的プロモーターによって調節される。
【0066】
ポリペプチドは、真核生物又は原核生物の任意の細胞において、又は酵母において生成されうる。本発明によるポリペプチドは、さらに無細胞系で生成されうる。当業者は、選択した発現系をその人に容易に適用できるであろう。本発明のポリペプチドを生成するために使用される発現系は、本発明の範囲を限定するものではない。
【0067】
組換えタンパク質の精製及び改変は、ポリタンパク質前駆体の設計が当業者によって容易に認識される多くの実施形態を含みうるように、当該技術分野において周知である。
【0068】
ポリペプチドに含まれるタンパク質は、神経細胞に輸送される、及び／又は神経細胞に内在化される任意の目的のタンパク質であってよい。
【0069】
タンパク質の内在化が所望される場合に、ＨNがタンパク質を神経細胞に移行させるチャネルを提供するため、ＨC／ＴＡＢと共にポリペプチドに前記に従ったポリペプチド中でＨNを含み、ＬＣを目的のタンパク質に置き換えることが有利であってよい。神経細胞表面がタンパク質の標的である場合に、目的のタンパク質をＨC／ＴＡＢに直接結合することが有利であってよい。したがって、目的とした送達に応じて、以下の組み合わせが得られてよい：
ｉ）タンパク質 － ＨC／ＴＡＢ
ｉｉ）タンパク質 － ＨN － ＨC／ＴＡＢ
ｉｉｉ）タンパク質 － ＬＣ － ＨN －ＨC／ＴＡＢ。
ｉ）タンパク質 － ＨC／ＴＡＢ
ｉｉ）タンパク質 － ＨN － ＨC／ＴＡＢ
ｉｉｉ）タンパク質 － ＬＣ － ＨN －ＨC／ＴＡＢ。
【0070】
前記ｉ）に従って、カーゴタンパク質をＨC／ＴＡＢに結合することにより、カーゴタンパク質は、ニューロン表面を標的としうる。通常の細胞表面のリサイクリングプロセスを介したいくつかの内在化がおそらく生じるが、神経細胞表面は、かかるアプローチの主な標的となる。
【0071】
カーゴタンパク質を、前記ｉｉ）に従ってＨC／ＴＡＢに結合されたＨNに、又は前記ｉｉｉ）に従ってＢｏＮＴ／ＴＡＢに結合することにより、前記カーゴタンパク質は、毒素移行システムを使用して、ニューロン内でより効率的に輸送されうる。背景技術において記載したように、ＢｏＮＴ毒素が小胞におけるニューロン細胞に内在化されると、小胞における酸性エンドソーム環境が、小胞から細胞のサイトゾルへのＬＣの移行を可能にする構造変化をもたらす。したがって、内在化小胞からサイトゾルへＢｏＮＴのＬＣを移行させるためのメカニズムである前記毒素移行システムは、ＢｏＮＴ／ＴＡＢの使用により、前述したカーゴタンパク質をニューロン細胞のサイトゾルに移行するために使用されうる。カーゴタンパク質は、ＬＣの代わりにＨNに結合されてよく、その際、エキソプロテアーゼ部位は、前記で開示したカーゴタンパク質とＨNとの間に配置され、又はカーゴタンパク質は、ＬＣに結合されてよい。双方のバリアントは、神経細胞のサイトゾルへのカーゴタンパク質の輸送を可能にする。
【0072】
したがって、ＨC／ＴＡＢ及びＢｏＮＴ／ＴＡＢの双方は、ニューロンへ及び／又はニューロン中へ任意のタンパク質を輸送するための媒体として使用されてよい。これは、例えばシナプスプロセスにおけるタンパク質の役割を調査するために、薬理学的試験でＨC／ＴＡＢ及び／又はＢｏＮＴ／ＴＡＢを使用する可能性も提供する。
【0073】
カーゴタンパク質は、例えば、任意のタンパク質タグ、例えばアフィニティー又は蛍光のタグ又はプローブであってよい。したがって、かかるタンパク質タグに対応する任意の核酸を、前記で開示したベクターに含めてよい。当業者は、ベクターに目的の任意の遺伝子を含めるための標準的なクローニング方法、及びタンパク質発現のための標準的なプロトコルを使用することができるであろう。
【0074】
ＢｏＮＴの結合ドメイン及びカーゴタンパク質は、翻訳後にそれらの組換えを可能にするソルターゼシステムで別々に発現できた。したがって、ソルターゼのトランスペプチダーゼ活性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで融合タンパク質を生成するためのツールとして使用されてよく、当該技術分野内の当業者の知識の範囲内である。つまり、認識モチーフ（ＬＰＸＴＧ）が、目的のタンパク質のＣ末端に付加され、オリゴグリシンモチーフが、ライゲーションされる第二のタンパク質のＮ末端に付加される。タンパク質混合物にソルターゼを添加すると、２つのペプチドは、天然のペプチド結合を介して共有結合する。この方法は、本発明によるポリペプチドを生成するために使用されうる。この場合に、これは、認識モチーフが、目的のタンパク質のＣ末端に付加され、かつオリゴグリシンモチーフが、ＨC／ＴＡＢ又はＢｏＮＴ／ＴＡＢのＮ末端に付加されることを意味する。
【0075】
さらに、ＨC／ＴＡＢ及び／又はＢｏＮＴ／ＴＡＢは、治療的方法又は美容的方法において使用されてよい。典型的に、ＨC／ＴＡＢ及び／又はＢｏＮＴ／ＴＡＢの使用は、ＢｏＮＴ／Ａ及び／又はＢｏＮＴ／Ｂ生成物のために既に実施されている使用に非常に類似しうる。これらは、方法及び治療を含み、該方法及び治療の目的は、筋肉を弱める及び／又は不活性化することである。
【0076】
本発明によるＨC／ＴＡＢは、細胞に対してより高いアフィニティーを有し、結果としてより高いエフィカシーを有するＢｏＮＴ／ＴＡＢの注入を可能にする。したがって、より少ない投与量を要求し、より長い活性の持続期間を可能にする。したがって、ＢｏＮＴ／Ａ又はＢｏＮＴ／Ｂと比較して少量のＢｏＮＴ／ＴＡＢを注入しても同一の効果が得られ、注入部位から拡散するＢｏＮＴ／ＴＡＢが少なくなるため、有害作用が減少する。より高い効率、より強くより効率的な結合、及びより少ない投与量を要求するため、注入部位を超えて拡散する余剰のＢｏＮＴ／ＴＡＢが少なくなる。さらに、ＢｏＮＴは、持続する効果により投与される頻度が低くなる可能性があり、それらの結果として免疫応答及び有害反応のリスクも最小限にする。
【0077】
前記に従ったＨC／ＴＡＢ及び／又はＢｏＮＴ／ＴＡＢで治療及び／又は予防されうる典型的な病状は、神経筋障害、アセチルコリンの放出に関与する状態、及び痙攣性筋障害を含む群から選択される障害である。より詳述すれば、痙攣性発声障害、痙性斜頸、喉頭ジストニア、顎口腔発声障害、舌ジストニア、頸部ジストニア、上肢局所性ジストニア、眼瞼痙攣、斜視、片側顔面痙攣、眼瞼疾患、脳性麻痺、局所性痙攣及び他の音声障害、痙攣性大腸炎、神経因性膀胱、アニスムス、四肢痙攣、チック、動作時振戦、歯ぎしり、肛門裂傷、アカラシア、嚥下障害及び他の筋緊張障害、並びに筋肉群の不随意運動、流涙、多汗、過度の唾液分泌、過度の胃腸分泌、分泌障害、筋痙攣による痛み、頭痛、スポーツ外傷、及びうつ状態によって特徴付けられる他の障害からなる群から選択される障害に関してよい。
【0078】
美容的方法に関して、ＨC／ＴＡＢ及び／又はＢｏＮＴ／ＴＡＢは、好ましくは、皺、眉間溝又は不要な線を防止及び／又は治療して、前記皺、溝及び線を低減するために使用されうる。
【0079】
前記に従ったＨC／ＴＡＢ及び／又はＢｏＮＴ／ＴＡＢは、任意の適した医薬組成物又は化粧品組成物に配合されうる。ＨC／ＴＡＢ及び／又はＢｏＮＴ／ＴＡＢを含む医薬組成物は、さらに、薬剤的に許容される賦形剤、キャリヤー又は他の添加剤を含みうる。ＨC／ＴＡＢ及び／又はＢｏＮＴ／ＴＡＢを含む化粧品組成物は、さらに、美容的に許容される賦形剤、キャリヤー又は他の添加剤を含みうる。
【0080】
医薬組成物又は化粧品組成物の投与は、注射を介してよく、その際、注射は、望ましくない神経活動が存在する身体の部位に投与される。典型的に、注射による投与のための組成物は、無菌等張水性緩衝液中で溶液である。必要な場合に、組成物は、可溶化剤及び注射部位の痛みを和らげるための局所麻酔薬も含んでよい。
【0081】
さらに、医薬組成物又は化粧品組成物は、組成物の治療的投与のための指示を伴うキットに含まれてよい。かかるキットにおいて、組成物の成分は、例えば、活性剤の量を示す密封容器、例えばアンプル又はサッシェ中で乾燥凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として、単位投与量形で別々に又は共に混合して供給されてよい。組成物は、注入によって投与されてもよく、その場合、無菌の医薬品グレードの水又は生理食塩水を含有する注入ボトルで分配できる。組成物を注射により投与する場合に、投与前に成分を混合できるように、注入のための滅菌水又は生理食塩水のアンプルを提供できる。全身投与のための組成物は、液体、例えば、滅菌生理食塩水、乳酸加リンゲル液又はハンクス液であってよい。さらに、組成物は、固体形態であってよく、かつ使用直前に再び溶解又は懸濁されてよい。凍結乾燥した形も考えられる。組成物は、脂質粒子又は小胞、例えばリポソーム又は微結晶の内部に含まれてよく、非経口投与にも適している。
【0082】
したがって、本発明者らは、ＳＶ２Ｃ受容体、シナプトタグミン受容体及びガングリオシド受容体の３つ全てに同時に結合するように適合された操作したＢｏＮＴバイオハイブリッドを開発した。それにより、先行技術のＢｏＮＴポリペプチドよりも高いポテンシー、エフィカシー及び持続期間を有するＢｏＮＴバイオハイブリッドが提供される。それにより、本発明のバイオハイブリッドの使用は、同一の効果を維持しながら、先行技術による投与量よりも低い投与量の毒素の投与を可能にする。さらに、本発明のバイオハイブリッドの使用は、以前に使用されていたＢｏＮＴの場合よりも低い頻度の投与を可能にする。したがって、本発明のＢｏＮＴバイオハイブリッドでの患者の治療は、先行技術におけるように頻繁に投与する必要がないという点で、より快適である。
【0083】
実験の部
材料及び方法
構築物。ＨC及び完全長（不活性）ＴｒｉＲｅｃＡＢＴｏｘ（それぞれＨC／ＴＡＢ及びＢｏＮＴ／ＴＡＢ）をコードするｃＤＮＡを、大腸菌発現のためにコドン最適化し（ＤＮＡ配列についての補足情報を参照されたい）、Ｎ末端６×Ｈｉｓタグ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、ＮＪ、ＵＳＡ）を有するｐＥＴ－２８ａ（＋）ベクター中で合成及びコロニー形成した。研究において使用したＴｒｉＲｅｃＡＢＴｏｘ構築物は、安全上の不安を回避するために触媒部位に３つの変異を有する（Ｅ２２４Ｑ／Ｒ３６３Ａ／Ｙ３６６Ｆ）（Ｒｏｓｓｅｔｔｏら、２００１年；Ｂｉｎｚら、２００２年）。ＢｏＮＴ／ＴＡＢ遺伝子は、１３１１のアミノ酸をコードし、かつＨC／ＴＡＢ遺伝子は、残基［８７５～１３１１］に対応する。
材料及び方法
構築物。ＨC及び完全長（不活性）ＴｒｉＲｅｃＡＢＴｏｘ（それぞれＨC／ＴＡＢ及びＢｏＮＴ／ＴＡＢ）をコードするｃＤＮＡを、大腸菌発現のためにコドン最適化し（ＤＮＡ配列についての補足情報を参照されたい）、Ｎ末端６×Ｈｉｓタグ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、ＮＪ、ＵＳＡ）を有するｐＥＴ－２８ａ（＋）ベクター中で合成及びコロニー形成した。研究において使用したＴｒｉＲｅｃＡＢＴｏｘ構築物は、安全上の不安を回避するために触媒部位に３つの変異を有する（Ｅ２２４Ｑ／Ｒ３６３Ａ／Ｙ３６６Ｆ）（Ｒｏｓｓｅｔｔｏら、２００１年；Ｂｉｎｚら、２００２年）。ＢｏＮＴ／ＴＡＢ遺伝子は、１３１１のアミノ酸をコードし、かつＨC／ＴＡＢ遺伝子は、残基［８７５～１３１１］に対応する。
【0084】
タンパク質の発現及び精製。目的の遺伝子を保有するプラスミドを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、ＵＳＡ）に形質転換した。同一のプロトコルを、双方のタンパク質に使用した。発現を、カナマイシン５０μｇ／ｍｌを有するＴＢ培地中で３７℃で約３時間細胞を成長させ、そして最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧで誘発させ、ＬＥＸシステム（Ｅｐｙｐｈｉｔｅ３、Ｃａｎａｄａ）で１８℃で一晩放置した。細胞を採取し、そして－８０℃で保存した。タンパク質抽出のための細胞溶解を、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭイミダゾール及び５％（ｖ／ｖ）グリセロールを有する２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）中で、２０ｋＰｓｉでのＥｍｕｌｓｉｆｌｅｘ－Ｃ３（Ａｖｅｓｔｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて実施した。細胞片を、４℃、２６７０００ｇで４５分間の超遠心分離により遠心沈殿した。タンパク質を最初にアフィニティークロマトグラフィーにより精製した：上清を５ｍｌのＨｉｓＴｒａｐ ＦＦカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）上に装填し、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭイミダゾール及び５％（ｖ／ｖ）グリセロールで洗浄し、そして、そのタンパク質を、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール及び５％（ｖ／ｖ）グリセロールで溶出した。そしてその試料を、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、２００ｍＭ ＮａＣｌ、及び５％（ｖ／ｖ）グリセロールに対して一晩透析し、同様の緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）中でＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムを使用して最終サイズ排除精製ステップを実施した。２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２５ｍＭ ＴＣＥＰ及び５％グリセロールを有する２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）中で、ＨC／ＴＡＢを４．５ｍｇ／ｍｌで、及びＢｏＮＴ／ＴＡＢを７．３ｍｇ／ｍｌで維持した。
【0085】
タンパク質の特徴。タンパク質試料を、ＮｕＰＡＧＥ ４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲルを使用してゲル電気泳動、及びＰＶＤＦ膜（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｓｗｅｄｅｎ）上で実施したウエスタンブロットによって分析した。ＨC／Ａ及びＨC／Ｂに対する一次抗体を社内で調製（ウサギで産生）し、抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼ抗体（カタログ＃ＳＡＢ３７００８５２、Ｓｉｇｍａ、Ｓｗｅｄｅｎ）で探索した。ポリヒスチジンタグを、ＨＲＰ接合モノクローナル抗体（ＡＤ１．１．１０、カタログ＃ＭＡ１－８０２１８、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して探索した。検出のためにＴＭＢ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用した。ＨC／ＴＡＢと同様に精製し、Ｈｉｓタグ付きのＨC／Ａ及びＨC／Ｂからなる社内対照を比較のために含んだ。
【0086】
ＢｏＮＴ／ＴＡＢの活性化。完全長（不活性）ＴｒｉＲｅｃＡＢＴｏｘを、二本鎖型に活性化させるために軽鎖と重鎖との間のＸａ因子切断部位（ＩＥＧＲ）で設計した。ＢｏＮＴ／ＴＡＢ １００μｇをＸａ因子２μｇ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、ＵＳＡ）と４℃で一晩インキュベートして活性化を実施した。活性化の結果を（前記のように）ゲル電気泳動により分析した。
【0087】
ＳＶ２Ｃ－Ｌ４のクローニング、発現及び精製。シナプス小胞糖タンパク質２Ｃ（ＳＶ２Ｃ－Ｌ４、残基４７４～５６７ Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ４９６Ｊ９）の４番目の内腔ドメインの相互作用部分を、ｃＤＮＡから増幅させ、そしてＬＩＣクローニングを使用してｐＮＩＣ２８－Ｂｓａ４（ＴＥＶ部位を有するＮ末端Ｈｉｓ６タグ）ベクター中にクローニングした。ＳＶ２ＣＬ４を、前記と同様のプロトコルを使用して、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、ＵＳＡ）中で発現させた。Ｈｉｓタグ付きＳＶ２Ｃ－Ｌ４を、２ｍＭ ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）のアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、５０ｍＭ イミダゾール及び０．５ｍＭ ＴＣＥＰで洗浄した。タンパク質は、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、５００ ｍＭイミダゾール及び０．５ｍＭ ＴＣＥＰで溶出した。そして、ＳＶ２ＣＬ４を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、及び０．５ｍＭ ＴＣＥＰ中でＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ＨｉＬｏａｄ １６／６０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、サイズ排除によりさらに精製した。
【0088】
Ｘ線結晶解析。結晶化のための試料を、３．６ｍｇ／ｍｌでのＨC／ＴＡＢを室温で１５分間、１ｍｇ／ｍｌでのＳＶ２Ｃ－Ｌ４（組換えヒトＳＶ２Ｃ細胞外ループ４［残基４７５～５６５］、１ｍＭ ｈＳｙｔＩペプチド（ＧＥＧＫＥＤＡＦＳＫＬＫＥＫＦＭＮＥＬＨＫ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、ＵＳＡにより合成した）及び４ｍＭ ＧＤ１ａオリゴ糖（Ｅｌｉｃｉｔｙｌ、Ｆｒａｎｃｅ）でプレインキュベートすることにより調製した。
【0089】
結晶を、シッティングドロップセットアップを使用して、２０％（ｖ／ｖ）ポリエチレングリコール６０００、０．１Ｍ クエン酸（ｐＨ５．０）（ＪＣＳＧ－ｐｌｕｓ ｓｃｒｅｅｎ Ｂ９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）からなるリザーバー溶液１００ｎｌと混合した試料２００ｎｌで成長させ、そして２１℃でインキュベートした。結晶が２週間以内に出現し、そしてその結晶をクライオループに移し、液体窒素で凍結した。
【0090】
回折データを、ＰＩＬＡＴＵＳ－６Ｍ検出器（Ｄｅｃｔｒｉｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を備えたＤｉａｍｏｎｄ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ（Ｄｉｄｃｏｔ、ＵＫ）のステーションＩ０４－１で収集した。１．５Åまでの完全なデータセットを、１００°Ｋでの単結晶から収集した。生データ画像を、ＣＣＰ４ ｓｕｉｔｅ ７．０（ＣＣＰ４、１９９４年）を使用して、ＤＩＡＬＳ（Ｇｉｌｄｅａら、２０１４年）及びＡＩＭＬＥＳＳ（Ｅｖａｎｓ、２００６年）で加工及び縮尺した。
【0091】
分子置換を、ＳＶ２Ｃ－Ｌ４（ＰＤＢコード４ＪＲＡ）との複合体でのＨC／Ａの、並びにラットＳｙｔＩＩ及びＧＤ１ａ（ＰＤＢコード４ＫＢＢ）との複合体でのＨC／Ｂの座標から作成されたモデルで実施して、ＰＨＡＳＥＲ（ＭｃＣｏｙら、２００７年）で構造解の初期フェーズを決定した。作業モデルを、ＲＥＦＭＡＣ５（Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖら、２０１１年）を使用して改良し、そしてＣＯＯＴ（Ｅｍｓｌｅｙら、２０１０年）で手動で調整した。Ｆｏ－Ｆｃの電子密度のピークが３σを超える位置に水分子を追加し、そして潜在的な水素結合を作成できた。検証を、ＭＯＬＰＲＯＢＩＴＹ（Ｃｈｅｎら、２０１０年）で実施した。ラマチャンドラン統計は、全ての残基の９７．０％が最も好ましい領域にあり、許可されていない領域に１つの外れ値を有することを示す。結晶解析データの統計を表１にまとめる。図を、ＰｙＭＯＬ（Ｓｃｈｒｏｅｄｉｎｇｅｒ、ＬＬＣ、ＵＳＡ）で作図した。
【0092】
結果
ＴｒｉＲｅｃＡＢＴｏｘの設計：３つの受容体結合部位有する設計したボツリヌス毒素。
ＴｒｉＲｅｃＡＢＴｏｘの設計：３つの受容体結合部位有する設計したボツリヌス毒素。
【0093】
３つの受容体毒素の概念を具体化するために、本発明者らは、最初に受容体とのＢｏＮＴ／Ａ及びＢｏＮＴ／Ｂ分子相互作用に関して利用可能な構造情報を分析した。Ｙａｏら（２０１６年）及びＢｅｎｏｉｔら（２０１４年）による最近の研究は、それぞれ、翻訳後の改変のある（ＰＤＢ ５ＪＬＶ）、及び翻訳後の改変のない（ＰＤＢ ４ＪＲＡ）、ＳＶ２Ｃとの複合体におけるＢｏＮＴ／Ａの受容体結合ドメインのＸ線結晶構造を提供する。ＳＶ２Ｃ（ｌｏｏｐ４）の内腔ドメインは、ＳＶ２ＣのＮ型糖鎖がＨCNに対して伸長している間に、主に２つのサブドメインの界面で開いたβストランドとの骨格間相互作用を介してＨC／Ａに関連付けられる四辺形のβヘリックスを形成する（図１）。これらの構造と一緒に、グリコシル化ＳＶ２Ａ及びＳＶ２Ｂにも伸長されるべき２つのＳＶ２型への共通の結合形式を実証した（Ｙａｏら、２０１６年）。これらの研究は、毒素ＳＶ２相互作用に関与する主要な残基及び複数の部位を強調しており、したがってＴｒｉＲｅｃＡＢＴｏｘの設計において維持する必要がある（図１）。これらは、ＢｏＮＴ／Ａのセグメント［９４９～９５３］、［１０６２～１０６６］、［１１３８～１１５７］及び［１２８７～１２９６］を含んだ。残基数は、ＢｏＮＴ／Ａ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ－Ｐ１０８４５）の配列に基づく。
【0094】
シナプトタグミンと複合したＢｏＮＴ／Ｂのいくつかの結晶構造も説明されており、その受容体との毒素の相互作用を定義するのに役立つ（Ｃｈａｉら、２００６年；Ｊｉｎら、２００６年；Ｂｅｒｎｔｓｓｏｎら、２０１３年）（図１）。結合すると、Ｓｙｔペプチドは、ＢｏＮＴ／Ｂのセグメント［１１１３～１１１８］及び［１１８３～１２０５］を直接含む、Ｃ末端サブドメインの遠端上の溝に沿って結合する短いらせん構造をとる。残基数は、ＢｏＮＴ／Ｂ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ－Ｐ１０８４４）の配列に基づく。したがって、これらの領域を、ＴｒｉＲｅｃＡＢＴｏｘ構築物に含めることが不可欠であると見なした。
【0095】
さらに、ガングリオシド受容体と複合した結晶構造ＢｏＮＴ／Ａ及びＢｏＮＴ／Ｂ（Ｓｔｅｎｍａｒｋら、２００８年；Ｈａｍａｒｋら、２０１７年；Ｂｅｒｎｔｓｓｏｎら、２０１３年）は、それぞれの血清型についての炭水化物結合部位の詳細な説明を提供した。この部位は、ボツリヌス神経毒ファミリーにわたって高度に保存されており、中央のＳｘＷＹモチーフ（／Ａで１２６４～１２６７、／Ｂで１２６０～１２６３）、及び周囲のループ領域から構成されるＨCCサブドメイン（図１）の浅いポケットからなる。注目すべきことに、このポケットは、ＢｏＮＴ／ＢにおけるＳｙｔ受容体結合部位に隣接し、ループ［１２４４～１２５３］により分けられるが、２つの受容体の同時結合に対するアロステリック効果は報告されていない（Ｂｅｒｔｎｓｓｏｎら、２０１３年）。Ｓｙｔ受容体結合部位への任意の構造変化を最小限にする目的で、ＢｏＮＴ／ＡよりむしろＢｏＮＴ／Ｂのガングリオシド受容体結合部位をＴｒｉＲｅｃＡＢＴｏｘの設計に組み込むことがより適していると考えられた。
【0096】
３つの異なる受容体への結合のために不可欠な２つの血清型からの成分を同定した後に、さらなる構造分析を実施して、それらを単一分子に統合した。この程度まで、ＢｏＮＴ／Ａ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１０８４５）及びＢｏＮＴ／Ｂ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１０８４４）の一次配列を、ＣｌｕｓｔａｌＯ（Ｓｉｅｖｅｒｓら、２０１１年）で整列し、それらの結合ドメインの３次元構造を重ね合わせた（図１）。２つの血清型は、全体的な配列同一性を４０％共有するが、しかしながら受容体認識のための主な領域であるＨCのＣ末端サブドメインの類似性は３４％まで低下する。結合ドメインのコアフォールドは、全てのクロストリジウム神経毒にわたって保存されているが（Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎ、２０１１年；Ｒｕｍｍｅｌら、２０１１年）、連結するループの長さに顕著な変動がある。したがって、インタクトなドメインの主な構造を維持するために、二次構造（図１）も考慮することが重要であった。その結果、新たに設計された分子のための鋳型は、ＢｏＮＴ／Ａ及びＢｏＮＴ／Ｂ要素間の複数の代替として現れ、互換性がないであろう新規の非天然分子内界面を作出する。ＨC／Ａ及びＨC／Ｂの重ね合わせた結晶構造の検査は、発明者が主要な位置での単一のアミノ置換又は欠失のいずれかによって潜在的な不調和を修正することにより設計を最適化することを可能にした（図２）。特に、矛盾する領域内の全ての残基の側鎖を見直して、ＢｏＮＴ／Ｂから同等のＢｏＮＴ／Ａアミノ酸への３つの置換を生じた：Ｎ１１８０、Ｇ１２３４、Ｎ１２３６（配列番号３）。さらに、いくつかのアミノ酸を削除して（図２）、二次構造要素を一致させ、転移界面のループ領域におけるＢｏＮＴ／ＡとＢｏＮＴ／Ｂとの間の長さのばらつきを補正した。欠失を、ＢｏＮＴ／Ａ及びＢｏＮＴ／Ｂ配列と比較して、Ｌ１１３９とＧ１１４０との間、及びＧ１２３４とＴ１２３５との間（配列番号３を参照）で実施した（図２）。
【0097】
得られるＴｒｉＲｅｃＡＢＴｏｘという名の分子は、ＳＶ２、シナプトタグミン、ガングリオシドの３つの受容体に結合できるべきである。そのタンパク質配列は、配列番号３（不活性型）及び配列番号５（活性型）で提供される。
【0098】
ＴｒｉＲｅｃＡＢＴｏｘ結合ドメインの調製及び特徴付け。
【0099】
ＴｒｉＲｅｃＡＢＴｏｘの特徴付けに対する最初のステップは、結合ドメイン（ＨC／ＴＡＢ）を組換えにより生成して、その生化学的特性を分析することであった。この目的のために、タンパク質配列を、大腸菌での発現のためにコドン最適化した。得られた遺伝子を、ｐＥＴ－２８ａ（＋）ベクターにクローニングして、Ｎ末端ポリヒスチジンタグを含ませ、そしてタンパク質精製プロセスを容易にした。詳細を方法のセクションにおいて提供する。本発明者らは、アフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除技術（図１１）を使用して、ＨC／ＴＡＢを発現させ、部分的に精製できる（図３）ことを示した。元の試料は、おそらく残留宿主細胞タンパク質に対応するいくつかの低分子量汚染物質を示した。イオン交換クロマトグラフィー又は疎水性相互作用クロマトグラフィーのような方法を使用する追加の精製ステップは、より高純度の試料を得るのに役立つはずである。Ｈｉｓタグ付きＨC／ＴＡＢの存在をウエスタンブロットによって確認し、予期したサイズ（約５３ｋＤａ）での単一のバンドを観察した（図３）。
【0100】
ＴｒｉＲｅｃＡＢＴｏｘ結合ドメインの３つの受容体と複合した結晶構造。
【0101】
ＨC／ＴＡＢがその３つの受容体に結合する能力を評価するために、ＨC／ＴＡＢとヒトＳＶ２Ｃ内腔ドメイン［残基４７５～５６５］、ヒトＳｙｔ１ペプチド［残基３４～５３］及びＧＤ１ａ炭水化物とを含む同時結晶化試験を設定した。高分解能（１．５Å）まで回折した結晶を得て（図１２）、完全なデータセットを収集できた（表１）。その構造を、全ての潜在的な成分を有する入力モデルを使用して分子置換により解析した。その解析は、結晶構造が４つの要素全てを含み、ＨC／ＴＡＢが３つの受容体に同時に結合した（ＨC／ＴＡＢ－３Ｒといわれる）（図４）ことを確認した。この結果は、ＴｒｉＲｅｃＡＢＴｏｘがｉｎ ｖｉｔｒｏでその目的を達成でき、原子の詳細における受容体結合メカニズムの完全な分析も可能にするという最初の実験的証拠を提供する。新たに決定した構造情報を使用して、ＨC／ＴＡＢ、ＨC／Ａ、ＨC／Ｂ、及びそれぞれの受容体の間の相互作用を直接比較できた。
【0102】
【表1-1】
【表1-2】
【0103】
最初に、新たに設計したＢｏＮＴ／ＴＡＢの結合ドメインは、その２つのサブドメイン（レクチン様ＨCN及びとＨCCのβ－トレフォイルフォールド）で予期されるフォールドを示す（図４）。ＨC／Ａと重ね合わせた場合に０．６９Å（３６４Ｃαを超える）、ＨC／Ｂでは０．８１Å（３７０Ｃαを超える）の低い二乗平均偏差（ｒｍｓｄ）により示されるように、作成した複数の新たな分子内界面は、全体的な構造を乱さなかった。完全なＨC／ＴＡＢを、無秩序化したＮ末端ポリヒスチジンタグ及びループ［１１６９～１１７３］を除いてモデル化した［８７６～１３１１］。これらの部分の電子密度の欠如は、これらの領域があらゆる相互作用に関与せず、かつ結晶の溶媒に到達できる領域内に配置されているという事実により説明されうる。
【0104】
ＨC／ＴＡＢ－３Ｒ構造を、ＳＶ２Ｃと複合したＨC／Ａの構造と比較した。ＳＶ２Ｃ内腔ドメインの構造は、双方の複合体で同一であり、０．４８３Å（８８Ｃα超）のｒｍｓｄを有する。２つの構造を、ＨCドメインに基づいて３次元で配置し、ＳＶ２Ｃが同一の位置にあることを示し、このことは本発明者の設計から予期されていた（図５）。特に、ＳＶ２受容体結合に不可欠であると設計され、かつＨC／ＴＡＢに含まれていたＨC／Ａからの領域は、完全に保存される。ＨC／ＡとＳＶ２Ｃの間の界面は、ＰＩＳＡ（Ｋｉｓｓｉｎｅｌ、２０１５年）で分析され、双方のタンパク質からの開鎖が相補的なβ－シート構造を形成する、主に静電相互作用を含む５４０Ａ2の表面積に対応する（Ｂｅｎｏｉｔら、２０１４年）。ＨC／ＴＡＢでの対応する分析は、６３０Å2のＳＶ２Ｃでの表面積を示し、かつ同等数の水素結合を有する結合メカニズムを確認した。さらに、本発明者らは、ＨC／ＴＡＢ－３ＲをＨC／Ａ－ｇＳＶ２Ｃ複合体と比較することにより、グリコシル化ＳＶ２への潜在的な結合も検討した（図５）。Ｎ５５９のＮグリコシル化は、受容体認識に不可欠であることが近年示され、ＳＶ２アイソフォーム全体にわたって保存される（Ｙａｏら、２０１６年）。注目すべきことに、ＨC／ＡとＳＶ２Ｃの間のタンパク質間相互作用は、グリコシル化の有無にかかわらず非常に類似している。炭水化物鎖は、ＨCNサブドメインに向かって伸びている。タンパク質－グリカン相互作用に関与するＨC／Ａ残基の分析は、それらの位置が、ＨC／ＴＡＢ－３Ｒで完全に保存されていることを示し、したがって、ＨC／ＴＡＢは、ＳＶ２のＮ－グリコシル化アイソフォームを認識できる。
【0105】
次に、本発明者らは、ＨC／ＴＡＢ－３Ｒ構造を、ｒＳｙｔ２と複合したＨC／Ｂの構造と比較した。ＢｏＮＴ／Ｂを、さまざまなアフィニティーを有しているが、げっ歯類のホモログと類似の方法でヒトシナプトタグミンに結合すると予測する（Ｔａｏら、２０１７年）。ここで示した結晶構造において、ｈＳｙｔ１は、ＨC／ＢにおけるｒＳｙｔ２と同一の結合溝内に位置するαヘリックス配置もとる（図６）。それぞれのＨCドメインに結合したｒＳｙｔ２とｈＳｙｔ１の重ね合わせは、０．５６０Åのｒｍｓｄ（１３Ｃα以上）で保存したペプチド構成を確認する。さらに、受容体結合ポケットは、ＨC／ＴＡＢ中で完全に保存されており、結合に関与する全ての残基は、双方の構造において同様の構成を示す（図６）。これを、１１個の静電結合も含むＨC／ＴＡＢ：ｈＳｙｔ１相互作用について８６１Å2のインターフェースを算出したＰＩＳＡ分析で確認し、これは７個の静電結合を有する７１２Å2ＨC／Ｂ：ｒＳｙｔ２界面（ＰＤＢ ４ＫＢＢ）に相当する。認識メカニズムは、主に強力なタンパク質間疎水性相互作用に基づく。接触表面積と静電相互作用数とのわずかな差異は、ｈＳｙｔ１とｒＳｙｔ２の間の配列多様性、特にペプチドのＣ末端側に向かう配列多様性により説明されうる。
【0106】
ＨC／ＴＡＢ－３Ｒ構造に含まれる３番目の受容体は、Ｇａｌ２からＳｉａ５までの明確な電子密度を観察したＧＤ１ａ炭水化物に対応する（図４）。非相互作用の柔軟な炭水化物部分から予期されるように、電子密度はＧｌｃ１及びＳｉａ６について見られなかった。ガングリオシド受容体結合部位は詳細に研究されており、ＧＤ１ａと複合したＨC／Ｂの結晶構造は、末端のＳｉａ（α２－３）Ｇａｌ部分についてのこの血清型の好ましさを確認した（Ｂｅｒｔｎｓｓｏｎら、２０１３年；Ｒｕｍｍｅｌ、２０１６年）。ＴｒｉＲｅｃＡＢＴｏｘを、ＨC／Ｂ結合ポケットを統合するように設計し、２つの構造（図７）を比較すると、結合ポケットの主要な残基（Ｓ１２６０、Ｗ１２６２、Ｙ１２６３）は完全に保存されており、かつ天然毒素と同様にＧＤ１ａと相互作用する。ＧＤ１ａ結合ＨC／Ｂと比較すると、ほぼ顕著な例外なく、ほとんどの結合部位は変化しないままである。ＨC／ＴＡＢ－３Ｒにおいて、Ｎ１１２２の側鎖は、リガンドとは反対側を向き、一方でＨC／Ｂの同等物であるＮ１１０５は、Ｓｉａ５と直接水素結合する。これは、ＨC／Ｂ：ＧＤ１ａ構造におけるＩ１２４０（７Å離れている）と比較して、ＨC／ＴＡＢ－３ＲにおけるＳｉａ５とのより強い疎水性相互作用（距離４．３Å）を示すＩ１２５７の位置によりある程度補償される。
【0107】
全体的にＨC／ＴＡＢ－３Ｒ結晶構造から得られた結果は、単一のＴｒｉＲｅｃＡＢＴｏｘ分子が、親ＢｏＮＴ／Ａ及びＢｏＮＴ／Ｂの結合メカニズムを複製する方法でＳＶ２受容体、シナプトタグミン受容体及びそのガングリオシド受容体に同時に結合できることを確認する。
【0108】
完全長の不活性ＴｒｉＲｅｃＡＢＴｏｘの作成及び特徴付け。
【0109】
ＨC／ＴＡＢの結合能力を確立し、本発明者らは、完全長の触媒的に不活性なＴｒｉＲｅｃＡＢＴｏｘ（ＢｏＮＴ／ＴＡＢ；配列番号３）を発現及び精製し続けた。この目的のために、本発明者らは、１３１１個のアミノ酸をコードし、かつＨC／ＴＡＢに関連するＢｏＮＴ／Ａドメインに対応するＬＣ及びＨNと共に３つのＢｏＮＴ機能ドメインを含む合成遺伝子を設計した。安全性を考慮して、触媒部位の３つの変異を含んだ（Ｅ２２４Ｑ／Ｒ３６３Ａ／Ｙ３６６Ｆ）（Ｒｏｓｓｅｔｔｏら、２００１年；Ｂｉｎｚら、２００２年）。前記したＨC／ＴＡＢ構築物のように、タンパク質配列を、大腸菌での発現のためにコドン最適化し、Ｎ末端ポリヒスチジンタグを有するｐＥＴ－２８ａ（＋）にクローニングした。詳細を方法の段落において提供する。本発明者らは、ＢｏＮＴ／ＴＡＢを約１５２ｋＤａの可溶性タンパク質として発現できたことを示した。精製のために使用した最初の方法は、均一でない物質の限られた量を得たが（図８；図１３）、イオン交換クロマトグラフィー又は疎水性相互作用クロマトグラフィーのような方法を使用するさらなる精製が、より純粋な物質を得て、かつゲル電気泳動により見られる残留宿主細胞タンパク質を排除するのに役立つはずである。かかる方法は、純度８０％超を有する組換えＢｏＮＴ／Ｂ構築物を生成するために近年使用されていた（Ｅｌｌｉｏｔら、２０１７年）。
【0110】
追加の特徴付けを実施して、ヒスチジンタグの存在を確信したが、プロービング抗体との反応は、対照と比較して非常に弱く（図８Ｂ）、かすかなバンドを適切なサイズで識別できた。そのアッセイは、約７０ｋＤａの汚染物質との交差反応も示した。さらに、ＢｏＮＴ／ＴＡＢは、双方の結合ドメインのためのエピトープを含むはずであるため、予期したように、ＨC／Ａ（図８Ｃ）及びＨC／Ｂ（図８Ｃ）に対して生じさせた社内の抗血清と最終的に反応させた。
【0111】
ＴｒｉＲｅｃＡＢＴｏｘの制御した活性化
二本鎖型への活性化が完全に活性のある毒素を得るに必要であるため、ＢｏＮＴ／ＴＡＢを、軽鎖と重鎖の間でＸａ因子切断部位ＩＥＧＲ［４４２～４４５］を用いて設計した（図９Ａ）。前記した完全長ＢｏＮＴ／ＴＡＢ試料（配列番号５）を使用して、活性化アッセイを実施した。試料の不均質性にも関わらず、ＢｏＮＴ／ＴＡＢとＸａ因子を毒素５０μｇに対してプロテアーゼ１μｇとの比率で４℃で一晩インキュベートした後に、完全な活性化を得た（図９Ｂ）。ゲル電気泳動は、還元剤の存在下で実行した場合に、ほとんどＨＣ及びＬＣに対応するであろう約１００ｋＤａ及び５０ｋＤａの２つの断片へのＢｏＮＴ／ＴＡＢの分離を示した。これら２つの鎖は、Ｃ４３０とＣ４５８の間でジスルフィド架橋によって共に結合されており、非還元状態で約１５０ｋＤａでの単一バンドを説明する。ＨＣ及びＬＣに対応するバンドは、非還元試料においても見られ、試料調製中のジスルフィド架橋のある程度の還元によって生じてよいが、これらのバンドは非活性化対照において明らかに見られなかった。
二本鎖型への活性化が完全に活性のある毒素を得るに必要であるため、ＢｏＮＴ／ＴＡＢを、軽鎖と重鎖の間でＸａ因子切断部位ＩＥＧＲ［４４２～４４５］を用いて設計した（図９Ａ）。前記した完全長ＢｏＮＴ／ＴＡＢ試料（配列番号５）を使用して、活性化アッセイを実施した。試料の不均質性にも関わらず、ＢｏＮＴ／ＴＡＢとＸａ因子を毒素５０μｇに対してプロテアーゼ１μｇとの比率で４℃で一晩インキュベートした後に、完全な活性化を得た（図９Ｂ）。ゲル電気泳動は、還元剤の存在下で実行した場合に、ほとんどＨＣ及びＬＣに対応するであろう約１００ｋＤａ及び５０ｋＤａの２つの断片へのＢｏＮＴ／ＴＡＢの分離を示した。これら２つの鎖は、Ｃ４３０とＣ４５８の間でジスルフィド架橋によって共に結合されており、非還元状態で約１５０ｋＤａでの単一バンドを説明する。ＨＣ及びＬＣに対応するバンドは、非還元試料においても見られ、試料調製中のジスルフィド架橋のある程度の還元によって生じてよいが、これらのバンドは非活性化対照において明らかに見られなかった。
【0112】
まとめると、活性化アッセイは、最初に、生成したタンパク質が設計したＢｏＮＴ／ＴＡＢに対応するという証拠を提供し、次に、二本鎖分子への活性化ステップを正常に管理できるという証拠を提供した。したがって、かかるステップは、活性のある完全長ＴｒｉＲｅｃＡＢＴｏｘの生成に含まれてよい。
【0113】
ＢｏＮＴ／ＴＡＢの最適化
材料及び方法
構築物。ＨC／ＴＡＢ及びバリアントをコードするｃＤＮＡを、前記したようにｐＥＴ２８（ａ）ベクターにＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（ＮＪ、ＵＳＡ）によりクローニングした。ＢｏＮＴ／ＴＡＢ２．１．３を、Ｔｏｘｏｇｅｎ ＧｍｂＨ（Ｈａｎｎｏｖｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によるｐＥＴ２９（ａ）ベクターにクローニングした。
材料及び方法
構築物。ＨC／ＴＡＢ及びバリアントをコードするｃＤＮＡを、前記したようにｐＥＴ２８（ａ）ベクターにＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（ＮＪ、ＵＳＡ）によりクローニングした。ＢｏＮＴ／ＴＡＢ２．１．３を、Ｔｏｘｏｇｅｎ ＧｍｂＨ（Ｈａｎｎｏｖｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によるｐＥＴ２９（ａ）ベクターにクローニングした。
【0114】
タンパク質の発現及び精製。ＨC／ＴＡＢバリアントについて前記したように、ＢｏＮＴ／ＴＡＢ２．１．３を、ＨC／ＴＡＢのために使用されるもの（アフィニティークロマトグラフィー及びゲル濾過）と同様のプロトコルで、Ｔｏｘｏｇｅｎ ＧｍｂＨ（Ｈａｎｎｏｖｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により調製した。さらに、ＢｏＮＴ／ＴＡＢ２．１．３の活性化及びタグ除去を、０．０５Ｕ／μｇの濃度でのトロンビンを用いて実施し、ＢｏＮＴ／ＴＡＢ２．１．３を、ゲル濾過によってさらに精製した。試料を、２００ｍＭ ＮａＣｌ及び５％グリセロールを有する２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）中で保存した。
【0115】
タンパク質の特徴。前記したとおり（ＮｕＰＡＧＥ ４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲルを使用したゲル電気泳動）。
【0116】
Ｘ線結晶解析。結晶化のための試料を、６．５ｍｇ／ｍｌでのＨC／ＴＡＢ２．１を室温で１５分間、１ｍｇ／ｍｌでのＳＶ２Ｃ－Ｌ４（組換えヒトＳＶ２Ｃ細胞外ループ４［残基４７５～５６５］、１ｍＭ ｈＳｙｔＩペプチド（ＧＥＧＫＥＤＡＦＳＫＬＫＥＫＦＭＮＥＬＨＫ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、ＵＳＡにより合成した）及び４ｍＭ ＧＤ１ａオリゴ糖（Ｅｌｉｃｉｔｙｌ、Ｆｒａｎｃｅ）でプレインキュベートすることにより調製した。結晶を、シッティングドロップセットアップを使用して、２０％（ｖ／ｖ）ポリエチレングリコール３３５０、０．２Ｍ クエン酸カリウム（ＪＣＳＧ－ｐｌｕｓ ｓｃｒｅｅｎ Ｂ１２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）からなるリザーバー溶液１００ｎｌと混合した試料２００ｎｌで成長させ、そして２１℃でインキュベートした。結晶が１週間以内に出現し、そしてその結晶をクライオループに移し、液体窒素で凍結した。回折データを、ＰＩＬＡＴＵＳ－６Ｍ検出器（Ｄｅｃｔｒｉｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を備えたＤｉａｍｏｎｄ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ（Ｄｉｄｃｏｔ、ＵＫ）のステーションＩ０４で収集した。１．４Åまでの完全なデータセットを、１００°Ｋでの単結晶から収集した。生データ画像を、ＣＣＰ４ ｓｕｉｔｅ ７．０（ＣＣＰ４、１９９４年）を使用して、ＤＩＡＬＳ（Ｇｉｌｄｅａら、２０１４年）及びＡＩＭＬＥＳＳ（Ｅｖａｎｓ、２００６年）で加工及び縮尺した。
【0117】
分子置換を、ＰＨＡＳＥＲ（ＭｃＣｏｙら、２００７年）において以前に定義したＨC／ＴＡＢの構造で実施した。作業モデルを、ＲＥＦＭＡＣ５（Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖら、２０１１年）を使用して改良し、そしてＣＯＯＴ（Ｅｍｓｌｅｙら、２０１０年）で手動で調整した。Ｆｏ－Ｆｃの電子密度のピークが３σを超える位置に水分子を追加し、そして潜在的な水素結合を作成できた。検証を、ＭＯＬＰＲＯＢＩＴＹ（Ｃｈｅｎら、２０１０年）で実施した。ラマチャンドラン統計は、全ての残基の９７．０％が最も好ましい領域にあり、許可されていない領域に１つの外れ値を有することを示す。結晶解析データの統計を表Ｘ１にまとめる。
【0118】
ＨC／ＴＡＢ、ＨC／ＴＡＢ２．１の生成
３つの受容体に結合したＨC／ＴＡＢの結晶構造を分析して、分子の安定性及び機能を改善するために改変できた潜在的な部位を同定した。
３つの受容体に結合したＨC／ＴＡＢの結晶構造を分析して、分子の安定性及び機能を改善するために改変できた潜在的な部位を同定した。
【0119】
特に、結晶構造内の局所温度因子（Ｂ因子）の分析は、無秩序な領域を思わせる高いＢ因子を有するタンパク質の局所安定性の指標として解釈されうる。この分析から、ＨC／ＴＡＢの２つのサブドメイン間の界面にある、Ｄ３５７からＮ３６２（配列番号６）からなる標識付けした「ループ３６０」であるループを、最適化のために検討した（図１４を参照されたい）。残基Ｇ３６０及びＮ３６２（配列番号１）を、ＢｏＮＴ／Ｂにおいて同等の残基に変更し、それぞれＰ３６０及びＹ３６２に変異させて、新たな構築物である標識付けしたＨC／ＴＡＢ２．１（配列番号６）の配列に組み込んだ。
【0120】
この新たな構築物のためのプラスミドを、部位特異的突然変異誘発（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、ＵＳＡ）によって調製し、大腸菌でのＨC／ＴＡＢ２．１の組換え発現のために使用した。使用したプロトコルは、ＨC／ＴＡＢの生成と同一であった（発現及び精製についての最初の方法の段落を参照されたい）。ＨC／ＴＡＢ２．１を、アフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除技術を使用して、発現及び部分的に精製できたを示した（図１５）。試料は、おそらく残留宿主細胞タンパク質に対応するいくつかの低分子量汚染物質を示した。イオン交換クロマトグラフィー又は疎水性相互作用クロマトグラフィーのような方法を使用する追加の精製ステップは、より高純度の試料を得るのに役立つはずである。
【0121】
精製したＨC／ＴＡＢ２．１（配列番号６）を、ヒトＳＶ２Ｃ内腔ドメイン［残基４７５～５６５］、ヒトＳｙｔ１ペプチド［残基３４～５３］及びＧＤ１ａ炭水化物との同時結晶化試験で使用した。高分解能（１．４Å）まで回折した結晶を得て、完全なデータセットを収集できた（表２）。その構造を、３つの受容体（ＨC／ＴＡＢ－３Ｒ）に結合したＨC／ＴＡＢの結晶構造を使用して分子置換により解析した。新たな構造は、ＨC／ＴＡＢ－３Ｒに既に見えている全ての要素を示し、ＨC／ＴＡＢ２．１がＨC／ＴＡＢに従って３つの受容体に同時に結合できるという実験的証拠を提供した。Ｂ因子の分析は、ループ「３６０」についての改善した安定性を示した（Ｄ３５７～Ｙ３６２、図１４）。全体として、ＨC／ＴＡＢ２．１の挙動は、ＨC／ＴＡＢの挙動に類似し、双方の構築物は収率及び純度の点で同等の分布を示した。
【0122】
【表2】
【0123】
より可溶性のバリアントＨC／ＴＡＢ２．１．３の生成
ＨC／ＴＡＢバリアントの今後の機能分析に備えるために、ＨC／ＴＡＢ２．１を、近年記載されたソルターゼライゲーション実験（Ｚｈａｎｇら、２０１７年）と互換性を持つように適合させた。この実験は、活性を試験するために使用できる完全長の活性ＢｏＮＴの安全で制御した再構築を可能にする。この構築物は、切断可能なＮ末端Ｈｉｓタグを付けたＮ末端切断型ＨC／ＴＡＢ２．１に対応し、ＨC／ＴＡＢ２．１．１（配列番号８）とラベル付けした。ＨC／ＴＡＢ２．１．１についてのクローンを準備し（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）、前記したように発現及び精製のために使用した（図１６）。ＨC／ＴＡＢ２．１．１を、アフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除技術を使用して、発現及び部分的に精製できたを示した。試料は、おそらく残留宿主細胞タンパク質に対応するいくつかの低分子量汚染物質を示した。イオン交換クロマトグラフィー又は疎水性相互作用クロマトグラフィーのような方法を使用する追加の精製ステップは、より高純度の試料を得るのに役立つはずである。
ＨC／ＴＡＢバリアントの今後の機能分析に備えるために、ＨC／ＴＡＢ２．１を、近年記載されたソルターゼライゲーション実験（Ｚｈａｎｇら、２０１７年）と互換性を持つように適合させた。この実験は、活性を試験するために使用できる完全長の活性ＢｏＮＴの安全で制御した再構築を可能にする。この構築物は、切断可能なＮ末端Ｈｉｓタグを付けたＮ末端切断型ＨC／ＴＡＢ２．１に対応し、ＨC／ＴＡＢ２．１．１（配列番号８）とラベル付けした。ＨC／ＴＡＢ２．１．１についてのクローンを準備し（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）、前記したように発現及び精製のために使用した（図１６）。ＨC／ＴＡＢ２．１．１を、アフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除技術を使用して、発現及び部分的に精製できたを示した。試料は、おそらく残留宿主細胞タンパク質に対応するいくつかの低分子量汚染物質を示した。イオン交換クロマトグラフィー又は疎水性相互作用クロマトグラフィーのような方法を使用する追加の精製ステップは、より高純度の試料を得るのに役立つはずである。
【0124】
ＨC／ＴＡＢ２．１の構造的特徴のさらなる分析は、残りのタンパク質から突出する表面に露出した疎水性ループの存在を明らかにした（残基３８９～３９３、配列番号６、図１４ｄ）。さらに、このループは、ＢｏＮＴ／Ｂ及び他の血清型の脂質結合要素として近年同定された（Ｓｔｅｒｎら、２０１８年）。この疎水性領域がＨC／ＴＡＢの溶解度を妨げうると仮定して、溶解度を高めるためにこのループを切断して、二重アスパラギンモチーフに置き換えた新たな構築物を設計した。この構築物を、ＨC／ＴＡＢ２．１．３（配列番号１０）とラベル付けした。ＨC／ＴＡＢ２．１．３についてのクローンを準備し（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）、前記したように発現及び精製のために使用した（図１６）。ＨC／ＴＡＢ２．１．３を、アフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除技術を使用して、発現及び部分的に精製できたを示した。試料は、おそらく残留宿主細胞タンパク質に対応するいくつかの低分子量汚染物質を示した。イオン交換クロマトグラフィー又は疎水性相互作用クロマトグラフィーのような方法を使用する追加の精製ステップは、より高純度の試料を得るのに役立つはずである。注目すべきことに、ＨC／ＴＡＢ２．１．３は、ＨC／ＴＡＢ２．１．１と比較して、より優れた発現収量及び溶解性を示した（図１６）。
【0125】
完全長の活性ＢｏＮＴ／ＴＡＢ２．１．３の生成
ＢｏＮＴ／ＴＡＢの今後の機能分析に備えるために、ＨC／ＴＡＢ２．１．３構築物に基づく完全長の活性バリアントを生成し、ＢｏＮＴ／ＴＡＢ２．１．３（配列番号１２）とラベル付けした。生成の全てのステップを、Ｔｏｘｏｇｅｎ ＧｍｂＨ（Ｈａｎｎｏｖｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の契約に基づいて、認可された施設で実施した。ＢｏＮＴ／ＴＡＢ２．１．３を、ｐＥＴ２９（ａ）ベクターにクローニングし、前記したように、生成物の活性化のために、切断可能なＣ末端のＳｔｒｅｐタグ及びポリヒスチジンタグ、並びにＨＣドメイン及びＬＣドメインの間に設計したトロンビン切断部位（配列番号１３）を含ませた。ＢｏＮＴ／ＴＡＢ２．１．３を、可溶性タンパク質として発現させ、トロンビンで精製及び活性化させた（図１７）。精製のために使用した方法は、アフィニティークロマトグラフィー及びゲル濾過を含み、純度９０％超を有するＢｏＮＴ／ＴＡＢ２．１．３製品を導いた。
ＢｏＮＴ／ＴＡＢの今後の機能分析に備えるために、ＨC／ＴＡＢ２．１．３構築物に基づく完全長の活性バリアントを生成し、ＢｏＮＴ／ＴＡＢ２．１．３（配列番号１２）とラベル付けした。生成の全てのステップを、Ｔｏｘｏｇｅｎ ＧｍｂＨ（Ｈａｎｎｏｖｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の契約に基づいて、認可された施設で実施した。ＢｏＮＴ／ＴＡＢ２．１．３を、ｐＥＴ２９（ａ）ベクターにクローニングし、前記したように、生成物の活性化のために、切断可能なＣ末端のＳｔｒｅｐタグ及びポリヒスチジンタグ、並びにＨＣドメイン及びＬＣドメインの間に設計したトロンビン切断部位（配列番号１３）を含ませた。ＢｏＮＴ／ＴＡＢ２．１．３を、可溶性タンパク質として発現させ、トロンビンで精製及び活性化させた（図１７）。精製のために使用した方法は、アフィニティークロマトグラフィー及びゲル濾過を含み、純度９０％超を有するＢｏＮＴ／ＴＡＢ２．１．３製品を導いた。
【0126】
さらなる実験
受容体結合アッセイ
アッセイを、ＢｏＮＴ／ＴＡＢの受容体結合特性がＢｏＮＴ／Ａ及び／又はＢｏＮＴ／Ｂと比較する場合に実施する。
受容体結合アッセイ
アッセイを、ＢｏＮＴ／ＴＡＢの受容体結合特性がＢｏＮＴ／Ａ及び／又はＢｏＮＴ／Ｂと比較する場合に実施する。
【0127】
例えば、以前に記載された方法から改変されたガングリオシド受容体結合アッセイを実施する。簡単に言えば、このＥＬＩＳＡにおいて、目的のガングリオシド受容体（ＧＴ１ｂ、ＧＤ１ｂ、ＧＤ１ａ、又はＧＭ１ａ）を、９６ウェルマイクロプレート（Ｃｈｅｎら、２００８年；Ｗｉｌｌｊｅｓら、２０１３年）上で固定し、そして毒素（又はそれらの結合ドメイン）を適用し、ホースラディッシュオキシダーゼ（ＨＲＰ）に接合させたモノクローナル抗ポリヒスチジン抗体で結合した物質をプローブする。この定量的アプローチは、ＢｏＮＴ／ＴＡＢのガングリオシド受容体結合特性がＢｏＮＴ／Ｂの特性と類似していることを確認するのに十分な情報を提供するはずである。
【0128】
ガングリオシド受容体結合ＥＬＩＳＡ。ガングリオシドＧＴ１ｂ、ＧＤ１ｂ、ＧＤ１ａ、及びＧＭ１ａを、Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ（Ｃｏｍｐｔｏｎ、ＵＫ）から購入する。ガングリオシドをメタノールで希釈して、最終濃度２．５μｇ／ｍｌにし、１００μＬ（０．２５μｇ）を９６ウェルＰＶＣアッセイプレートのそれぞれのウェルに適用する。２１℃（一晩）で溶媒を蒸発させた後に、そのウェルを、２００μＬのＰＢＳ／０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡで洗浄（３ｘ）する。非特異的結合部位を、２００μＬのＰＢＳ／２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ中で２１℃で２時間インキュベートすることによりブロックする。結合アッセイを、４℃で２時間、試料を含むウェルあたり１００μＬのＰＢＳ／０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ中で実施した（６μＭ～０．００３μＭの範囲の系列３倍希釈）。インキュベートした後に、ウェルをＰＢＳ／０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡで３回洗浄し、そしてＨＲＰ－抗Ｈｉｓ抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ＃ＭＡ１－８０２１８）で１：２０００希釈（１００μｌ／ウェル）で１時間４℃でインキュベートする。最終的に、ＰＢＳ／０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡで３回洗浄した後に、Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ（１００μＬ／ウェル）を使用して結合試料を検出する。２１℃で５分間インキュベートした後に、１００μＬの１Ｍ硫酸を添加することにより反応を停止する。４５０ｎｍでの吸光度を、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００（Ｍａｅｎｎｅｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で測定する。結果を、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）で、非線形結合フィットを使用して分析する。
【0129】
シナプトタグミン受容体への結合特性を評価するために、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）を、Ｂｅｒｎｔｓｓｏｎら（２０１３）年によって記載されたアッセイと同様に実施する。毒素へのｈＳｙｔペプチドの結合を測定し、ＢｏＮＴ／ＴＡＢがＢｏＮＴ／Ｂに類似して受容体に結合できることを確認するアフィニティー値（Ｋd）を提供するはずである。
【0130】
等温滴定熱量測定。試料を、２０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ中で追加のサイズ排除クロマトグラフィーステップ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）によって調製する。ＢｏＮＴ又はそれらの結合ドメインへのＳｙｔペプチドの会合は、ＩＴＣ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）で２５℃、７５０ｒｐｍで測定する。タンパク質溶液２００μＬ（２０μＭ）を細胞に添加する。結合を、ペプチド（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、ＵＳＡ国）の添加時に、２００μＭの濃度で、それぞれ２．５μＬの１６段階の注入で測定する。最初の滴定を０．５μＬに設定し、その後データ分析で削除する。データを、製造元により提供されるＯｒｉｇｉｎソフトウェアで分析する。
【0131】
ＳＶ２Ｃへの結合を、Ｂｅｎｏｉｔら（２０１４）によって記載されたようにプルダウンアッセイを使用して評価する。簡単に言えば、タグ付けした毒素及びタグなしの受容体（又はその逆）を一緒にインキュベートし、Ｎｉ－セファロースにロードし、そして洗浄して溶出する。結果をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより可視化する。
【0132】
Ｄｉｇｉｔ Ａｂｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｃｏｒｅ（ＤＡＳ）アッセイ
ＢｏＮＴ調製のポテンシーを、マウスＤｉｇｉｔ Ａｂｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｃｏｒｅ（ＤＡＳ）アッセイ（Ｂｒｏｉｄｅら、２０１３年）を使用して評価できる。このアッセイは、マウス又はラットの後肢骨格筋への筋肉内注射後の毒素の局所的な筋力低下エフィカシーをｉｎ ｖｉｖｏで測定する。毒素は、特徴的な後肢驚愕反応を生じる動物の能力における測定可能な用量依存的な減少を誘発する。この非致死法は、近年記載された組換えＢｏＮＴ／Ｂ分子（Ｅｌｌｉｏｔら、２０１７年）のような、種々のＢｏＮＴ血清型又は誘導体の薬理学的特性を推定するために定期的に使用されている。ＢｏＮＴ／Ａ又はＢｏＮＴ／Ｂと比較して、ＢｏＮＴ／ＴＡＢのポテンシー及び効果の持続期間を評価するために、同様の方法論を使用する。
ＢｏＮＴ調製のポテンシーを、マウスＤｉｇｉｔ Ａｂｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｃｏｒｅ（ＤＡＳ）アッセイ（Ｂｒｏｉｄｅら、２０１３年）を使用して評価できる。このアッセイは、マウス又はラットの後肢骨格筋への筋肉内注射後の毒素の局所的な筋力低下エフィカシーをｉｎ ｖｉｖｏで測定する。毒素は、特徴的な後肢驚愕反応を生じる動物の能力における測定可能な用量依存的な減少を誘発する。この非致死法は、近年記載された組換えＢｏＮＴ／Ｂ分子（Ｅｌｌｉｏｔら、２０１７年）のような、種々のＢｏＮＴ血清型又は誘導体の薬理学的特性を推定するために定期的に使用されている。ＢｏＮＴ／Ａ又はＢｏＮＴ／Ｂと比較して、ＢｏＮＴ／ＴＡＢのポテンシー及び効果の持続期間を評価するために、同様の方法論を使用する。
【0133】
考察
この研究において、発明者らは、ＢｏＮＴ／Ａ及びＢｏＮＴ／Ｂの結合メカニズムの構造及び分子の詳細を使用して、強化された細胞認識能力を呈する新たな分子ＴｒｉＲｅｃＡＢＴｏｘを設計する方法を説明した。ＢｏＮＴ／Ａ構造及びＢｏＮＴ／Ｂ構造の厳密な多次元比較は、発明者らが、ＳＶ２のための受容体結合部位、シナプトタグミン、及びガングリオシドを単一分子に統合する無傷の毒素の足場を維持するために必要な主要要素を同定することを可能にした。交互のＢｏＮＴ／Ａ要素及びＢｏＮＴ／Ｂ要素からなる新たに作成した設計を、新たに作成した非天然分子内界面を補償するために適応性の変異又は欠失を含めることによって最適化した。かかる改変を、操作した毒素であるＢｏＮＴ／ＴＡＢが、正確な構造及び要求される活性と共に可溶性タンパク質として生成されるために必要であると見なした。
この研究において、発明者らは、ＢｏＮＴ／Ａ及びＢｏＮＴ／Ｂの結合メカニズムの構造及び分子の詳細を使用して、強化された細胞認識能力を呈する新たな分子ＴｒｉＲｅｃＡＢＴｏｘを設計する方法を説明した。ＢｏＮＴ／Ａ構造及びＢｏＮＴ／Ｂ構造の厳密な多次元比較は、発明者らが、ＳＶ２のための受容体結合部位、シナプトタグミン、及びガングリオシドを単一分子に統合する無傷の毒素の足場を維持するために必要な主要要素を同定することを可能にした。交互のＢｏＮＴ／Ａ要素及びＢｏＮＴ／Ｂ要素からなる新たに作成した設計を、新たに作成した非天然分子内界面を補償するために適応性の変異又は欠失を含めることによって最適化した。かかる改変を、操作した毒素であるＢｏＮＴ／ＴＡＢが、正確な構造及び要求される活性と共に可溶性タンパク質として生成されるために必要であると見なした。
【0134】
本発明者らは、最初に、改変した受容体認識機能を保持するそれ自体の結合ドメインＨC／ＴＡＢを、大腸菌での組換え発現を介して生成することにより、設計の安定性を評価した。ＨC／ＴＡＢを、部分的に精製できる可溶性タンパク質としてＮ末端ポリヒスチジンタグを付けて発現させ、操作した構築物の生存率を実証した。第２のステップにおいて、本発明者らは、触媒により不活性な形態での完全長ＢｏＮＴ／ＴＡＢ構築物の生成を進めた。再び、本発明者らは、それが１５３ｋＤａの可溶性タンパク質として発現し、かつ標準的な液体クロマトグラフィー技術で部分的に精製できたことを示した。ＨC／ＴＡＢ及びＢｏＮＴ／ＴＡＢの双方にポリヒスチジンタグが存在することは、Ｎｉ－セファロースマトリックスでのアフィニティークロマトグラフィーによる精製を可能にした。他のアフィニティー方法を使用してよく、受容体結合での干渉を防ぐためにタンパク質のＮ末端に優先的に配置されるべきアフィニティータグを含んでよい。最初の調製は不均一な試料の純度を示すが、精製プロセスの最適化は、医薬品標準の生成物を導くはずである。ＢｏＮＴ／ＴＡＢの活性型は、本発明の研究において使用される非活性な分子と同様の全体的な構造及び結合特性を有することを付け加える必要がある。本発明者らは、受容体結合を妨害しないように除去可能なＣ末端タグでうまく精製した活性型のＢｏＮＴ／ＴＡＢ（ＢｏＮＴ／ＴＡＢ２．１．３）を生成するためにＴｏｘｏｇｅｎ ＧｍｂＨ（Ｈａｎｎｏｖｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と契約した。
【0135】
さらに、一本鎖ＢｏＮＴの二本鎖分子への翻訳後切断は、毒素の活性のために不可欠なステップである（ＤａｓＧｕｐｔａ及びＳａｔｈｙａｍｏｏｒｔｈｙ、１９８５年；Ｓｈｏｎｅら、１９８５年）。天然毒素は、通常、宿主プロテアーゼによって活性化されるが、組換えＢｏＮＴ生成物は全てエキソペプチダーゼで処理する必要がある。毒素に関する初期の研究は、トリプシンが非特異的にＢｏＮＴ／Ａを活性のある二本鎖型に切断できたことを示した（Ｓｈｏｎｅら、１９８５年）が、しかしながらこれは毒素の望ましくない追加の分解をもたらしうる。より最近では、組換え技術は、目的のタンパク質内の特定のプロテアーゼ認識モチーフを操作でき、したがって、ＢｏＮＴの活性化戦略をより適切に制御できる（Ｓｕｔｔｏｎら、２００５年）。ここで、本発明者らは、ＬＣとＨＣとの間にＸａ因子部位を含ませ、毒素の完全な活性化を観察し、したがって、この酵素の有効性を実証した。ＢｏＮＴ／ＴＡＢの将来的な生成は、毒素の活性化を可能にする精製段階を組み込み、続いて最終生成物からエキソプロテアーゼを除去する必要がある。Ｘａ因子は適切であるように見えるが、他の酵素を試験し、活性化の許容可能な収量を達することに成功していることを証明してよい。本発明者らは、トロンビンエキソプロテアーゼでうまく活性化され、均一に精製させた活性型のＢｏＮＴ／ＴＡＢ（ＢｏＮＴ／ＴＡＢ２．１．３）を製造するためにＴｏｘｏｇｅｎ ＧｍｂＨ（Ｈａｎｎｏｖｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と契約した。
【0136】
ＨC／ＴＡＢの構造的完全性を検証し、その強化された機能性を確認する手段として、本発明者らは、精製した試料をヒトＳＶ２Ｃ、ヒトＳｙｔ１及びＧＤ１ａ炭水化物と複合して同時結晶化した。複合体のＸ線結晶構造を、高分解能（１．５Å）で解析し、ＨC／ＴＡＢの単一分子が３つ全ての受容体に同時に結合できたという決定的な実験的証拠を提供した。さらに、ＨC／Ａ及びＨC／Ｂの公知の構造とそれぞれの受容体との比較は、ＨC／ＴＡＢが。ほぼ同じ結合メカニズムに従っていることを示した。
【0137】
結晶構造はＨC／ＴＡＢが少なくともｉｎ ｖｉｔｒｏでその目的を果たすことができたことを示したが、その受容体結合特性を完全に特徴付けるために追加の生化学実験を実施する必要がある。これらは、タンパク質受容体でのプルダウンアッセイ及びＩＴＣアッセイ、並びにガングリオシド受容体結合ＥＬＩＳＡを含む。ＢｏＮＴ／ＴＡＢは、ＳＶ２受容体結合についてのＢｏＮＴ／Ａと同様に、並びにガングリオシド受容体及びシナプトタグミン受容体の結合に関してはＢｏＮＴ／Ｂと同様に機能すると予期する。さらに、ｉｎ ｖｉｖｏでの実験は、治療薬としてのＢｏＮＴ／ＴＡＢの真の可能性に関する主要な兆候を提供する。マウスＤＡＳアッセイは、ＢｏＮＴ調製物を評価するために古典的に使用されており（Ｂｒｏｉｄｅら、２０１３年）、現在利用可能な生成物と比較して本発明者が分子の有効性及び活性の持続期間を決定することを可能にする。
【0138】
さらに、ＢｏＮＴ／ＴＡＢの設計を、いくつかの配列要素を改変して、その生化学的特性及び安定性を改善することにより、さらに最適化してよい。かかる変更は、３つの受容体に同時に結合できる可溶性ＢｏＮＴを導く欠失又は変異を含みうる。本発明者らは、より安定なバリアント（ＨC／ＴＡＢ２．１）及びより高い生産収率を有するより可溶性のバリアント（ＨC／ＴＡＢ２．１．３）をうまく生成した。
【0139】
安全性の観点から、ＢｏＮＴ／ＴＡＢは、２つの存在する血清型に由来するため、新たな脅威を示さないことを付け加えるべきである。それは、現在入手可能な抗毒素、例えばボツリヌス中毒抗毒素７価ＢＡＴ又はＢｏＮＴ／Ａ及びＢｏＮＴ／Ｂについて他の承認された解毒剤によって認識されることが期待される。
【0140】
血清型Ａ及びＢは、市場で入手可能な唯一の承認されたＢｏＮＴである。ＢｏＮＴ／Ａは治療に使用される主な毒素であるが、低い免疫原性、及び高いエフィカシーを有する分子は、より安全な代替となる（Ｎａｕｍａｎｎら、２０１３年）。ＢｏＮＴの薬理学的ポテンシャルを高めるために、ＢｏＮＴの特性を改善する複数の試みがある（Ｍａｓｕｙｅら、２０１４年）。近年成功した例は、Ｔａｏら（２０１７年）による研究があり、その研究では、ＢｏＮＴ／Ｂ（Ｅ１１９１Ｍ／Ｓ１１９９Ｙ）の主要な位置で操作した変異が、ヒトのシナプトタグミン２受容体に対するより高い毒素のアフィニティーをもたらし、野生型と比較して神経伝達の遮断において約１１倍高いエフィカシーを示した。ＢｏＮＴのエフィカシーを改善するための他のアプローチは、Ｅｌｌｉｏｔｔら（２０１７年）によって採用され、ＢｏＮＴ／Ｂの基質に対する触媒活性を増加させることが公知である単一変異（Ｓ２０１Ｐ）の影響を分析した。この場合、ＢｏＮＴ／Ｂ変異体は、複数の細胞ベースのアッセイで及びｉｎ ｖｉｖｏで野生型を超える利点は存在しなかった。ＢｏＮＴ／Ｂに関するこれら２つの研究をまとめると、毒素のエフィカシーにおける制限段階は、後期の細胞内活性ではなく、初期の神経認識にあることが示唆される。
【0141】
ある血清型の結合特性を別の血清型の触媒活性と組み合わせることを意図した以前の研究は、ドメイン全体を交換したキメラ分子の設計を導いた（Ｗａｎｇら、２００８年、２０１２年；Ｒｕｍｍｅｌら、２０１１年）。より詳述すれば、Ｒｕｍｍｅｌら（２０１１年）及びＷａｎｇら（２０１２年）は、ＢｏＮＴ／ＡのＨＮ＋ＬＣドメインに関連するＨC／Ｂドメインｋａｒａｎａｒｕ類似の分子を設計及び試験した。これらの組換え毒素は、野生型ＢｏＮＴ／Ａと比較して、高められたポテンシーを示し、かつマウスにおけるより長い効果を誘発すると報告した（Ｋｕｔｓｃｈｅｎｋｏら、２０１７年）。血清型Ａの相補的ドメイン（すなわちＬＣ＋ＨN＋ＨCn）と結合させたＢｏＮＴ／ＢのＣ末端サブドメイン（ＨCc）からなる構築物を評価すると同様の観察結果が得られ、野生型と比較して４倍高いポテンシーを示した（Ｒｕｍｍｅｌら、２０１１年）。前記した全ての分子は、ＢｏＮＴ／Ｂの２つの受容体であるシナプトタグミン及びガングリオシドのみを認識するという共通点があった。これらの結果は、ニューロンのＢｏＮＴ／Ｂ受容体のより高い有病率によって許容されるＬＣ／Ａのより多くの摂取のおかげで、長期間の効果及びより高いエフィカシーを得られることを示唆している。さらに、これらのキメラ分子は、異なる血清型のドメインを組み合わせることから生じ、これらの生成物の潜在力に影響しうるドメイン間分子内衝突の可能性を考慮していない。
ＢｏＮＴ操作に関する最新の研究の結果を考慮すると、初期の細胞認識を変更することは、治療生成物の薬理学的特性を高める最も効率的な方法の１つであることは明らかである。したがって、ＢｏＮＴ／ＴＡＢは、ＢｏＮＴ／Ｂ受容体であるシナプトタグミン及びガングリオシドと共にＳＶ２受容体を認識するようにうまく設計させた単一の生成物であり、大きな可能性を示し、かつ野生型ＢｏＮＴ／Ａ及びＢｏＮＴ／Ｂよりもさらに効果的であってよい。
ＢｏＮＴ／ＴＡＢにおける主な技術革新は、複数の受容体相互作用を可能にする結合ドメインの設計である。現在の証拠は、ＨC／ＴＡＢとＢｏＮＴ／Ａの転座及び触媒ドメインとの関連が、最も強力なポテンシーを有する分子（ＢｏＮＴ／ＴＡＢで設計したように）を提供することを暗示している。しかしながら、ＨC／ＴＡＢは、他の血清型の機能ドメインと組み合わせる場合にさらに興味深いかもしれない（図１０ａ）。さらに、ＨC／ＴＡＢは、シナプスプロセスを調査するための薬理学的ツールとして使用する目的の他のタンパク質と組み合わせてもよい（図１０ｂ）。ＢｏＮＴ／ＴＡＢで実施されるｉｎ ｖｉｖｏアッセイは、かかる目的のためにその有用性を明らかにする必要がある。
ＢｏＮＴ操作に関する最新の研究の結果を考慮すると、初期の細胞認識を変更することは、治療生成物の薬理学的特性を高める最も効率的な方法の１つであることは明らかである。したがって、ＢｏＮＴ／ＴＡＢは、ＢｏＮＴ／Ｂ受容体であるシナプトタグミン及びガングリオシドと共にＳＶ２受容体を認識するようにうまく設計させた単一の生成物であり、大きな可能性を示し、かつ野生型ＢｏＮＴ／Ａ及びＢｏＮＴ／Ｂよりもさらに効果的であってよい。
ＢｏＮＴ／ＴＡＢにおける主な技術革新は、複数の受容体相互作用を可能にする結合ドメインの設計である。現在の証拠は、ＨC／ＴＡＢとＢｏＮＴ／Ａの転座及び触媒ドメインとの関連が、最も強力なポテンシーを有する分子（ＢｏＮＴ／ＴＡＢで設計したように）を提供することを暗示している。しかしながら、ＨC／ＴＡＢは、他の血清型の機能ドメインと組み合わせる場合にさらに興味深いかもしれない（図１０ａ）。さらに、ＨC／ＴＡＢは、シナプスプロセスを調査するための薬理学的ツールとして使用する目的の他のタンパク質と組み合わせてもよい（図１０ｂ）。ＢｏＮＴ／ＴＡＢで実施されるｉｎ ｖｉｖｏアッセイは、かかる目的のためにその有用性を明らかにする必要がある。
【0142】
参考文献
【表3-1】
【表3-2】
【表3-3】
【表3-4】
【表3-5】
【表3-6】
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15-1】
【図15-2】
【図15-3】
【図15-4】
【図16-1】
【図16-2】
【図16-3】
【図16-4】
【図16-5】
【図17-1】
【図17-2】
【図17-3】
【図17-4】
【外国語明細書】