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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024070748
(43)【公開日】2024-05-23
(54)【発明の名称】非ゲノム配列抗ウイルス用オリゴヌクレオチド
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20240516BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240516BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20240516BHJP
A61P 31/16 20060101ALI20240516BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20240516BHJP
C07H 21/04 20060101ALI20240516BHJP
C07H 21/02 20060101ALI20240516BHJP
C07K 14/08 20060101ALN20240516BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z
A61K31/7088 ZNA
A61P31/14
A61P31/16
A61P31/12
C07H21/04
C07H21/02
C07K14/08
【審査請求】未請求
【請求項の数】21
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022181458
(22)【出願日】2022-11-11
(71)【出願人】
【識別番号】722013209
【氏名又は名称】久下 周佐
(72)【発明者】
【氏名】久下 周佐
(72)【発明者】
【氏名】関根 僚也
(72)【発明者】
【氏名】色川 隼人
【テーマコード（参考）】
4C057
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C057BB02
4C057CC03
4C057DD01
4C057MM02
4C057MM04
4C057MM09
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZB33
4H045AA30
4H045CA01
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
【課題】複数種のRNAウイルスの感染細胞に働き抗ウイルス効果を示し、また、耐性ウイルスが出現しにくい抗ウイルス用オリゴヌクレオチドおよびその薬理学的組成物を提供する。
【解決手段】ＲＮＡゲノムを持つウイルスのゲノムＲＮＡとヌクレオキャプシドタンパク質の結合を阻害するゲノム配列に存在しないオリゴヌクレオチドであって、ウイルス粒子及び／あるいはウイルス感染細胞においてウイルスの増殖を抑制する抗ウイルス用オリゴヌクレオチドおよびその薬学的組成物を用いる。
【選択図】なし
【解決手段】ＲＮＡゲノムを持つウイルスのゲノムＲＮＡとヌクレオキャプシドタンパク質の結合を阻害するゲノム配列に存在しないオリゴヌクレオチドであって、ウイルス粒子及び／あるいはウイルス感染細胞においてウイルスの増殖を抑制する抗ウイルス用オリゴヌクレオチドおよびその薬学的組成物を用いる。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ウイルスのゲノムＲＮＡ中に少なくとも６塩基連続して存在しない配列を含む６～１９ヌクレオチド長であって、ウイルスのヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質とＲＮＡの結合を抑制する活性を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項2】
ウイルスのゲノムＲＮＡ中に少なくとも６塩基連続して存在しない配列を含む６～１９ヌクレオチド長であって、ウイルスの増殖を抑制するオリゴヌクレオチド。
【請求項3】
ウイルスのＮタンパク質とＲＮＡの結合を抑制する活性を有するオリゴヌクレオチドであって、グアニンヌクレオチドが少なくとも６つ連続した配列を含む６～１９ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド。
【請求項4】
ウイルス及び／又はウイルス感染細胞に接触させた場合にウイルスの増殖を抑制する活性を有する抗ウイルス用オリゴヌクレオチドであって、グアニンヌクレオチドが少なくとも６つ連続した配列を含む６～１９ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド。
【請求項5】
請求項１～４に記載されたオリゴヌクレオチドでグアニンヌクレオチドが１２個または１２を超える数が連続したオリゴヌクレオチド。
【請求項6】
請求項１～５に記載されたオリゴヌクレオチドの一部又は全てがリボヌクレオチドであるオリゴヌクレオチド。
【請求項7】
請求項１～５に記載されたオリゴヌクレオチドの一部又は全てがデオキシリボヌクレオチドであるオリゴヌクレオチド。
【請求項8】
請求項１～７に記載されたオリゴヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の一部又は全てがホスホロチオエート化されたオリゴヌクレオチド。
【請求項9】
請求項１～８に記載されたオリゴヌクレオチドの一部又は全てのリボース部分への２′‐Ｏメチル、２′‐Ｏ（２‐メトキシエチル)、２′‐フルオロ化のいずれかあるいは組み合わせた修飾を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項10】
請求項１～９に記載されたオリゴヌクレオチドの、一部又は全ての塩基に修飾を加えたオリゴヌクレオチド。
【請求項11】
請求項１～１０に記載されたオリゴヌクレオチドの、一部又は全がペプチド核酸であるオリゴヌクレオチド。
【請求項12】
ウイルスの増殖を抑制する目的で使用する、請求項１～１１に記載された抗ウイルス用オリゴヌクレオチド。
【請求項13】
請求項１２のウイルスが、リボヌクレオチドゲノムをもつウイルスである、請求項１２に記載の抗ウイルス用オリゴヌクレオチド。
【請求項14】
請求項１２のウイルスがコロナウイルス又はインフルエンザウイルスである、請求項１２に記載の抗ウイルス用オリゴヌクレオチド。
【請求項15】
ウイルス感染症の予防又は治療のための、請求項１～１４に記載された抗ウイルス用オリゴヌクレオチド薬学的組成物。
【請求項16】
請求項１５のウイルス感染症が、リボヌクレオチドゲノムをもつウイルスによる感染症である、請求項１５に記載の抗ウイルス用オリゴヌクレオチド薬学的組成物。
【請求項17】
請求項１５のウイルス感染症がコロナウイルス感染症又はインフルエンザウイルス感染症である、請求項１５に記載の抗ウイルス用オリゴヌクレオチド薬学的組成物。
【請求項18】
治療上有効量の請求項１～１７のいずれか一項に記載の少なくとも１つの薬理学的に許容される抗ウイルス用オリゴヌクレオチド、及び薬学的に許容されるキャリアを含む抗ウイルス用薬学的組成物。
【請求項19】
ウイルスに病因のある疾患の治療、抑制又は予防に適合される、請求項１８に記載の抗ウイルス用薬学的組成物。
【請求項20】
眼内注射、経口摂取、経腸、経鼻、吸入、皮膚注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、くも膜下注入、気管内注入及び静脈内注射から成る群より選択される方式による送達に適合される、請求項１８～１９に記載の抗ウイルス用薬学的組成物。
【請求項21】
少なくとも１つのそのほかの抗ウイルス用薬学的組成物を組み合わせた、請求項１８～２０に記載の抗ウイルス用薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ウイルス及び／又はウイルス感染細胞に作用しウイルスの増殖を阻害する抗ウイルス用オリゴヌクレオチド、並びにヒト及び動物のウイルスにより起きるウイルス感染、および病因がウイルスに基づくその他の疾患における治療剤としての該抗ウイルス用オリゴヌクレオチドとその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
以下の議論は、単に読者の理解を助けるために提供されるのであって、議論された情報又は引用された文献のいかなるものも本発明の先行技術を構成することを容認するものではない。
【0003】
有史以来世界の人々を苦しめてきた痘瘡の根絶が１９７７年に宣言され、「ウイルス感染症は克服できるもの」と認識された時期があった。しかし、エボラウイルス病、新型インフルエンザ、新型コロナウイルス感染症など新たな感染症が次々見いだされ人類を苦しめている。ヒトに病気を起こす新たな感染症の多くは自然界の動物より派生する人獣共通感染症である。
【0004】
インフルエンザＡ型ウイルスは、８本の分節に分かれたゲノムをもち、ヒト、ブタ、トリに感染する。複数の異なった型のインフルエンザＡウイルスがブタの気道上皮細胞に同時感染したときに、分節ゲノムの組み換えを起こす。さらに変異を繰り返す過程で、ヒトに感染しさらにヒトからヒトへの感染が成立した場合に、人類がこれまで経験したことがない（免疫を持たない）新型インフルエンザウイルスの発生とその感染拡大につながると考えられている。
【0005】
コロナウイルスは多くの動物に固有のウイルスが存在する。ヒトコロナウイルス（ＨＣｏＶ）としてはＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ‐ＯＣ４３、ＨＣｏＶ‐ＮＬ６３、ＨＣｏＶ‐ＨＫＵ１が存在し通常の風邪の１０～１５％（流行期３５％）の原因となる。これら風邪のコロナウイルスに加えて、重症肺炎を起こす重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）を起こすＳＡＲＳコロナウイルス（２００２年）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）の原因となるＭＥＲＳコロナウイルス（２０１２年）、新型コロナウイルス(ＳＡＲＳコロナウイルス２型、２０１９年)が発生した。ＳＡＲＳのり患者は８０９６人で９．７％の致死率と高いが1年足らずで収束した。一方ＭＥＲＳは２２５００名以上のり患者で致死率は３５％と高く感染は継続している。新型コロナウイルス感染症は発生後４年が経過し約６億３千万人以上がり患し６６０万人が犠牲になっており、この新感染症が医療の混乱をはじめ感染対策による社会経済活動の停滞と混乱の原因となっている。これらのコロナウイルスのほとんどは、もともとはコウモリが持つコロナウイルスに由来し、ヒトに感染するようになったと考えられている（非特許文献１）。
【0006】
これらの状況から考えて、今後も新型インフルエンザや新型コロナウイルス感染症などの新感染症の発生を防ぐのは難しく、発生時に対応するための有効な予防法および治療法の開発が求められる。
【0007】
これまでに人類が唯一根絶に成功した感染症は痘瘡である。痘瘡は痘瘡ウイルスの接触、飛沫感染により起こる。感染者を早期に発見して隔離治療をするとともに、広くワクチン接種（種痘）を施したことによる。自然界で痘瘡ウイルスにり患する動物はヒトのみで、痘瘡にり患すると症状が現れること、痘瘡ワクチン接種による感染防御の有効性は高いことが理由で１９８０年に根絶することに成功した。
【0008】
一方で新型インフルエンザや新型コロナウイルス感染症は、自然界のヒト以外の動物よりその派生する人獣共通感染症ためにその発生を防ぐことは難しい。また、これらの感染症は感染しても症状が出ない場合や発症前の数日の期間（潜伏期）の人の移動が感染拡大の要因となっている。
【0009】
新型コロナウイルス感染症の発生で実用化されたｍＲＮＡワクチンは感染予防効果、重症化を防ぐ効果を示してその有効性が認められている（非特許文献２）。しかし、新型コロナウイルスに対する感染予防効果を示す免疫は数カ月で減弱する。さらにウイルスのゲノムの変異が積み重なり、抗原性を担うＳタンパク質の抗原性が変化し人の免疫から逃れた変異株が発生し、それによる度重なる流行を繰り返した（非特許文献３）。そのため、感染症の流行の抑制には有効なワクチンと共に抗ウイルス薬の実用化が好ましい。
【0010】
新型インフルエンザではないインフルエンザ、いわゆる季節性インフルエンザは毎年流行を繰り返し、世界で毎年３～５約万人がり患し２９～６５万人が呼吸器死すると見積もられている感染症である（非特許文献４）。地球上のどこかで流行し、変異を繰り返すことで抗原性を変えながら流行地を変えていく。したがって年ごとに流行する可能性のある抗原型を予測して、それに合わせたワクチンを用意するという計画的な施策がなされている。また、ワクチンの有効性も数か月で減弱することからその予防には毎年の接種が求められる。
【0011】
インフルエンザ、新型インフルエンザおよび新型コロナウイルス感染症の重症化を防ぐためには、ワクチン接種による予防に加えて、感染時にウイルスの増殖を抑制する抗ウイルス薬が有効である。
【0012】
抗ウイルス薬はウイルスタンパク質の構造に特異的に作用してその活性を阻害する。これまでに、ウイルスの増殖に機能する数種類のタンパク質をターゲットに、それぞれ特異的な数種類の抗ウイルス薬が開発されているが、これらウイルスタンパク質はウイルスごとに異なった立体構造を持つことから、対象となるウイルスタンパク質ごとに開発することが望ましい。
【0013】
ウイルスタンパク質に特異的に作用する化合物は、ウイルスの変異によるウイルスタンパク質の構造変化でその有効性が低下することがある（非特許文献５）。ウイルスの感染拡大に伴って、そのウイルスに有効な特定の抗ウイルス薬が多用されると、ウイルスゲノムの変異によりその抗ウイルス薬の結合部位が変化して耐性化することがある。
【0014】
これまでに、耐性ウイルスが広がりその使用ができなくなった抗インフルエンザ薬が知られている。インフルエンザＡ型ウイルスが細胞に侵入しウイルス粒子からゲノムＲＮＡを細胞内に放出する「脱殻」の段階を阻害するアマンタジンが使用されたが、アマンタジン耐性化ウイルスの拡大により使用ができなくなっている。また、ウイルスの出芽に機能するノイラミニダーゼを阻害するタミフルに対する耐性ウイルスも出現し拡大した（非特許文献６）。さらにｍＲＮＡ合成の段階を阻害する新規抗インフルエンザ薬のゾフルーザの耐性ウイルスの出現も指摘されている（非特許文献７）。
【0015】
抗インフルエンザ薬でヌクレオキャプシドタンパク質（ＮＰ）に結合してその機能を阻害するＮｕｃｌｅｏｚｉｎが開発された（非特許文献８）。これはゲノムＲＮＡとＮＰが結合して形成されるｖＲＮＰの形成阻害やｖＲＮＰ細胞内輸送を阻害しウイルスの増殖を阻害する。一方、ＮＰのＹ２８９Ｈ変異はＮｕｃｌｅｏｚｉｎに抵抗性を示す（非特許文献９）。
【0016】
以上のように、ウイルスは感染拡大に伴い感染宿主の免疫や使用された抗ウイルス薬から逃れる変異を繰り返し流行するため、当該抗ウイルス薬に抵抗性を獲得したウイルスが感染拡大する傾向がある。また、新たな感染症に備えるため広いウイルス種およびウイルスの変異に抵抗性がある抗ウイルス薬を創出することが好ましい。
【0017】
核酸医薬としてアンチセンス核酸（ＡＳＯ）はターゲットＲＮＡに相補的なおよそ２１ヌクレオチド長の配列である。このＡＳＯが細胞内で相補的なｍＲＮＡとハイブリダイズして細胞内の酵素によりそのｍＲＮＡの分解を促し遺伝子発現を抑制する。
【0018】
ＡＳＯ医薬としてＲＳウイルス感染症の治療を目的に開発されたＡＬＮ－ＲＳＶ０１はＲＳウイルス感染を抑制し（非特許文献１０、１１）、経鼻投与による臨床試験も良好な結果が得られている（非特許文献１２）。ＡＳＯの効果は配列特異性があるためウイルスごとに配列を選択することが望ましい。さらに、ウイルスが変異しにくい配列を選択するなど、ウイルスの変異によるＡＳＯの効果の減弱を防ぐことが望まれる。
【0019】
特許第５５１４１７９号においては、配列番号２３（ＲＥＰ ２０５５）は ＡおよびＣが２０回繰り返した４０塩基長でありそのすべての連結がホスホロチオエート化したヌクレオチドポリマーが抗ウイルスオリゴヌクレオチドとしてＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の増殖を抑制することが示された。ＲＥＰ２１３９はＲＥＰ ２１５５に５′メチルシトシン及び２′Ｏ－メチルリボースの修飾を加えたヌクレオチドポリマーであるが、これはＨＢＶ感染細胞内のウイルス複製（ＨＢＶ ＤＮＡ、ＲＮＡの合成）及びＨＢＶの細胞からの放出は阻害しないが、ＨＢｓ抗原の放出を阻害することが明らかとなった。特許第５７９６０２４号では少なくとも１つの完全にホスホロチオエート化された２０及び１２０ヌクレオチド長の抗ウイルス性ヌクレオチドポリマーが、インフルエンザウイルスおよびコロナウイルスを含む各種ウイルスに対して抗ウイルス性を示す。前述したＨＢＶの結果から、これらのヌクレオチドポリマーは細胞外でウイルスの放出を阻害する効果があると予想される。
【0020】
抗ウイルス効果を高めるため細胞内に導入され、明確な機構でウイルスの複製を阻害し、しかもウイルスの変異に抵抗性である薬剤が望ましい。
【0021】
特許第２８１８０３１号（１９９９, 米国特許第５，９５２，４９０号）においては、Ｇカルテット形成を起こすコンセンサス配列を持つ８～２７塩基長のオリゴヌクレオチド配列がヒト免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス及びインフルエンザウイルスに抗ウイルス活性を示すことが示された。この配列はグアニン塩基のみで形成されたものでなく、３塩基あるいは４塩基の連続したグアニン塩基を多くの場合はグアニン塩基以外の１塩基以上のスペーサーを持つ構造を基本とし、請求項の配列番号 ８、１０および３４が連続した５つのグアニンを持つが６つ以上連続した配列は含まれていない。
【0022】
Ｇカルテット構造は４つのグアニン塩基（Ｇ）の中心に向いた酸素分子が1価の陽イオンを中心に水素結合により平面構造を形成したものである。核酸塩基配列上に４つのＧＧＧが、ループと呼ばれる１～７塩基長をはさみ存在するときに、それぞれのＧ塩基により形成される３つのＧカルテット構造によりＧ‐ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘと呼ばれる４重鎖構造を形成する（非特許文献１３）。この構造はＤＮＡにもＲＮＡにも存在し、ＤＮＡにはテロメアやプロモーター領域に存在し特異的結合タンパク質との相互作用がそれらの機能制御に寄与している。また、ｍＲＮＡの非翻訳領域やｍｉＲＮＡなどの種々の低分子ＲＮＡに存在し結合タンパク質の影響によりその機能に影響を与える（非特許文献１４）。Ｇ‐ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘのコンセンサス配列は５′‐Ｇ３－５Ｎ１－７Ｇ３－５Ｎ１－７Ｇ３－５Ｎ１－７Ｇ３－５Ｎ１－７－３‘ （ＮはＡ，Ｃ，Ｇ，ＴあるいはＵ）で構成される（非特許文献１５、１６）。
【0023】
アプタマーＡＳ１４１１はグアニンヌクレオチドに富む２６塩基のデオキシオリゴヌクレオチドはＧ‐ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成し、がん細胞特異的に細胞内のｎｕｃｌｅｏｌｉｎに結合し急性骨髄性白血病の増殖を抑制する（非特許文献１７）。
【0024】
一方、試験管内でＧ‐ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成するグアニンヌクレオチドリッチなデオキシオリゴヌクレオチドを細胞外から処理した場合の細胞増殖抑制作用は、Ｇ‐ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの形成に相関がなく、デオキシグアノシン１リン酸やグアニンなどのデオキシオリゴヌクレオチドの分解産物に起因することが示唆されておおり（非特許文献１８）、その作用点や作用機序が不明瞭である可能性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0025】
【特許文献1】特許第２８１８０３１号
【特許文献2】特許第５５１４１７９号
【特許文献3】特許第５７９６０２４号
【非特許文献】
【0026】
【非特許文献1】Cui, J., F. Li, and Z.L. Shi, Origin and evolution of pathogenic coronaviruses. Nat Rev Microbiol, 2019. 17(3): p. 181-192.
【非特許文献2】Zeng, B., et al., Effectiveness of COVID-19 vaccines against SARS-CoV-2 variants of concern: a systematic review and meta-analysis. BMC Med, 2022. 20(1): p. 200.
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0027】
解決しようとする課題は、従前の抗ウイルス薬より広い範囲のウイルス種に抗ウイルス効果を示し、また耐性ウイルスが出現しにくい様態を示す抗ウイルス用オリゴヌクレオチドおよびその薬学的組成物を提供する点である。
【課題を解決するための手段】
【0028】
本発明は、ウイルスゲノムＲＮＡ中に存在しない配列を含むＲＮＡオリゴマーが、ウイルスのゲノムＲＮＡとその結合タンパク質である（ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｎタンパク質）との相互作用を阻害しウイルス複製を抑制することを主要な特徴とする。以下にその内容を示す。
【0029】
一般的にＮタンパク質とＲＮＡの結合は、ウイルス特異的タンパク質合成、ゲノムＲＮＡ複製に寄与し、さらに最終的にはＲＮＡ配列に依存せずにゲノムＲＮＡ全体がＮタンパク質-ＲＮＡ（ｖｉｒａｌ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ、ｖＲＮＰ）のポリマーを形成しウイルス粒子の核を形成する。ｖＲＮＰポリマーが適切に形成されることは、効率の良いウイルス粒子の形成や他の細胞への感染（感染力）の維持に機能する。
【0030】
ウイルスの複製酵素は、ＲＮＡウイルスゲノムがそのコピーを作る複製過程で誤って塩基を取り込む。ウイルス進化の過程でウイルスの複製に不利な配列が形成された場合には、その配列を持つウイルスの増殖が阻害され、結果的に淘汰されると考えられる。逆に、コードされるタンパク質の機能に不利な影響を及ぼさない変異はゲノムＲＮＡ中に蓄積すると考えられる。ｖＲＮＰポリマー形成を想定した場合、Ｎタンパク質への結合が極端に強いＲＮＡ配列や、ｖＲＮＰの構造に影響を与えるＲＮＡ配列が存在する場合は、正常なゲノムＲＮＡのＮ蛋白質への結合を阻害するなど複製に不利な影響を与え、このような配列はゲノムＲＮＡ上から変異により排除されると洞察して鋭意研究の結果、本発明に至った。
【0031】
すなわち、本発明は以下の１）～６）に関するものである。
１）動物ウイルスのゲノムＲＮＡ中に少なくとも６塩基連続して存在しない配列を含む６～１９ヌクレオチド長であって、ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質とＲＮＡの結合を抑制する活性を有する抗ウイルス用オリゴヌクレオチド。
２）動物ウイルスのＮタンパク質とＲＮＡの結合を抑制する活性を有する抗ウイルス用オリゴヌクレオチドであって、グアニンリボヌクレオチドが少なくとも６つ連続した配列を含む６～１９ヌクレオチド長あるいはグアニンヌクレオチドが１２個連続したオリゴヌクレオチド。
３）ウイルス及び／又はウイルス感染細胞に接触させた場合にウイルスの増殖を抑制する活性を有する抗ウイルス用オリゴヌクレオチドであって、グアニンヌクレオチドが少なくとも６つ連続した配列を含む６～１９ヌクレオチド長のオリゴリボヌクレオチド。
４）上記１）～３）のオリゴヌクレオチドの塩基以外および塩基部分に公知の技術を用いて修飾して安定性及び／又は抗ウイルス効果を高めたオリゴヌクレオチド。
５）上記１）～４）のオリゴヌクレオチドであってコロナウイルス感染およびインフルエンザウイルス感染を防ぐオリゴヌクレオチド。
６）上記１）～５）のオリゴヌクレオチドであってＲＮＡをゲノムとして持つウイルスの感染を防ぐオリゴヌクレオチド。
７）上記１）～６）のオリゴヌクレオチドを含む抗ウイルス用薬学的組成物。
８）上記１）～６）を他の抗ウイルス剤と組み合わせた抗ウイルス用薬学的組成物。
１）動物ウイルスのゲノムＲＮＡ中に少なくとも６塩基連続して存在しない配列を含む６～１９ヌクレオチド長であって、ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質とＲＮＡの結合を抑制する活性を有する抗ウイルス用オリゴヌクレオチド。
２）動物ウイルスのＮタンパク質とＲＮＡの結合を抑制する活性を有する抗ウイルス用オリゴヌクレオチドであって、グアニンリボヌクレオチドが少なくとも６つ連続した配列を含む６～１９ヌクレオチド長あるいはグアニンヌクレオチドが１２個連続したオリゴヌクレオチド。
３）ウイルス及び／又はウイルス感染細胞に接触させた場合にウイルスの増殖を抑制する活性を有する抗ウイルス用オリゴヌクレオチドであって、グアニンヌクレオチドが少なくとも６つ連続した配列を含む６～１９ヌクレオチド長のオリゴリボヌクレオチド。
４）上記１）～３）のオリゴヌクレオチドの塩基以外および塩基部分に公知の技術を用いて修飾して安定性及び／又は抗ウイルス効果を高めたオリゴヌクレオチド。
５）上記１）～４）のオリゴヌクレオチドであってコロナウイルス感染およびインフルエンザウイルス感染を防ぐオリゴヌクレオチド。
６）上記１）～５）のオリゴヌクレオチドであってＲＮＡをゲノムとして持つウイルスの感染を防ぐオリゴヌクレオチド。
７）上記１）～６）のオリゴヌクレオチドを含む抗ウイルス用薬学的組成物。
８）上記１）～６）を他の抗ウイルス剤と組み合わせた抗ウイルス用薬学的組成物。
【発明の効果】
【0032】
本発明により、ＲＮＡゲノムを持つ複数のウイルスに対する抗ウイルス効果を示すオリゴヌクレオチドおよび、これを含む抗ウイルス用薬学的組成物が提供される。また、好適には遺伝子変異による抗ウイルス効果の低下を起こしにくい抗ウイルス用オリゴヌクレオチドおよび、抗ウイルス用薬学的組成物として有用である。
【図面の簡単な説明】
【0033】
【図1】図１はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＮＣ＿０４４５１２．２）中に存在する配列で出現頻度の低い３塩基、４塩基、５塩基および６塩基の配列の出現頻度を示す。２９．８７Ｋ塩基長にランダムに４種の塩基（Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ）が出現すると仮定してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノム中に出現頻度をグラフに示した。Ｉｎ－１（ＣＣＧＧＣＧ）およびＧ６（ＧＧＧＧＧＧ）は存在しない。
【図2】図２はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質のＮ末端ＲＮＡ結合ドメイン（ＮＴＤ、Ｎタンパク質のアミノ酸番号４６－１７４、前出ＮＣ＿０４４５１２．２）と３２塩基のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ（ＮＣ＿０４４５１２．２、塩基番号２９７３３－２９７６４）を３２Ｐで放射性標識したＲＮＡプローブを混和してアガロースゲル電気泳動により移動度シフトを検出した結果を示す。６塩基のオリゴＲＮＡのＩｎ－１（ＣＣＧＧＣＧ）およびその塩基置換体のｍＩｎ－１（ＣＣＡＧＣＧ）、Ｇ６（ＧＧＧＧＧＧ）、Ａ６（ＡＡＡＡＡＡ）を図に示す濃度（μＭ）で添加したときの移動度シフトの結果を示す。
【図3】図３は、図２の移動度シフト法で見出した６塩基のオリゴＲＮＡのプローブＲＮＡ―ＮＴＤの移動度シフトしたバンドの５０％阻害効果を示す。各６塩基ＲＮＡのＮＴＤ―ＲＮＡ結合の５０％阻害効果の平均値は、Ｉｎ－１ ３４．４μＭ、ｍＩｎ－１ ３．４８μＭ、Ｇ６ ０．６２μＭ、Ａ６ ２２．９μＭである。
【図4】図４はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の全長のＮタンパク質は６塩基長オリゴＲＮＡを添加するとＬＬＰＳの誘導効果を示す。Ｉｎ－１は数μｍの強大なＬＬＰＳを誘導するが、それ以外の６塩基オリゴＲＮＡは１μｍ程度の球状あるいは線状のＬＬＰＳを誘導する。
【図5】図５の上段にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質と３２塩基長の蛍光標識ＲＮＡプローブによるＬＬＰＳの形成と形成されたＬＬＰＳの６塩基長オリゴＲＮＡによる阻害効果を示す。下段はＮ末端ＲＮＡ結合領域（ＮＴＤ）を欠失したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質と３２塩基長の蛍光標識ＲＮＡプローブによるＬＬＰＳの形成と形成されたＬＬＰＳの６塩基長オリゴＲＮＡによる阻害効果を示す。Ｇ６及びＩｎ－１はＬＬＰＳの相転移を促進する。
【図6】図６はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質と３２塩基長の蛍光標識ＲＮＡプローブによるＬＬＰＳ内の蛍光標識ＲＮＡプローブの蛍光はグアノシンが１２個連続したＲＮＡのＧ１２（ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ）により濃度依存的に消失効果を示す。
【図8】図８はＧ１２によるコロナウイルスＯＣ４３の増殖阻害効果を示す。Ｇ１２を培養液に添加したときのＯＣ４３感染ＨＣＴ８細胞内のＯＣ４３ＲＮＡの減少効果を、逆転写後の定量ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）で検出した結果を示す。Ａ）阻害効果は４日継続した。Ｂ）０．２μＭで阻害効果がある。
【図9】図９はＧ１２のＯＣ４３の細胞内Ｎタンパク質の量を減少させる効果を示す。感染細胞の溶解液をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離後に抗ＯＣ４３Ｎ抗体を用いてウエスタンブロティング法を行った結果を示す。Ｇ１２はＯＣ４３感染細胞内のＮタンパク質を減少する効果、即ち増殖阻害効果を示す。
【図10】図１０はＧ１２のＯＣ４３感染細胞内のＮタンパク質細胞内分布を変える効果を示す。Ａ５４９細胞にＯＣ４３を感染させＧ１２未処理、処理細胞を固定して免疫染色し共焦点レーザー顕微鏡で観察した。ＯＣ４３のＮタンパク質は膜近辺に検出されるが、Ｇ１２存在下では中間の輝度の分布が増加して、細胞内に広く分布した。
【図12】図１２（Ａ）はホスホロチオエート化したＧ１２（Ｇ１２（Ｓ））は３２塩基長蛍光ＲＮＡプローブで形成されたＬＬＰＳの相転移の進行を促す効果を示す。また、（Ｂ）は、Ｇ１２（Ｓ）がＯＣ４３感染ＨＣＲ８感染細胞のＮタンパク質のレベルを低下する効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0034】
以下に本発明の好適な実施形態について説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【0035】
本発明において使用するプローブＲＮＡは、特に限定はされないがウイルスゲノム配列の一部あるいはランダムな配列をもつＲＮＡが挙げられる。また、Ｎタンパク質はウイルスから調整したタンパク質、あるいはＮタンパク質全体およびＲＮＡが結合することが知られているＮタンパク質の一部、あるいは精製時に使用するＨＩＳタグ等のペプチド配列をＮタンパク質の全長あるいはＮタンパク質の一部と融合した融合タンパク質を遺伝子組換え技術により大腸菌などに発現させ精製したものなど（Ｎタンパク質等）が挙げられる。
【0036】
ＲＮＡウイルスのゲノム配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋやＤＤＢＪなどの公的データベースに公開されているものが使用できる。データベースより得たゲノム配列から６塩基程度の連続した配列でゲノム配列中に存在しない配列を選択することができる。単なる例示として挙げると、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の配列のその配列の中にグアノシンが６つ連続したＧ６およびＩｎ－１の配列が存在しない（図１）。
【0037】
Ｎタンパク質とプローブＲＮＡの結合を阻害するオリゴヌクレオチドの選択は、一つの好適例として電気泳動移動度シフト法が挙げられる。例えば、プローブとしては、α‐３２Ｐ‐ＣＴＰを含ませたリボヌクレオチド（ＡＴＰ、ＵＴＰ，ＧＴＣ、低濃度ＣＴＰ）溶液中でＴ７‐ＲＮＡポリメラーゼ等を利用したインビトロＲＮＡ合成系を用いて３２Ｐ―ＲＮＡプローブを作製することができる。精製したＮタンパク質等をこのプローブに接触させアガロースゲルあるいはアクリルアミドゲル電気泳動により分離後し、オートラジオグラフィーで３２Ｐ―プローブＲＮＡのバンドの移動度を検出する。Ｎタンパク質等が結合することで移動度が遅延したバンドを定量することでＮタンパク質等とプローブＲＮＡの結合レベルを検出することができる。即ち、例えば候補オリゴヌクレオチドを接触させＮタンパク質により出現したバンドのレベルを定量することで、候補オリゴヌクレオチドのＮタンパク質―ＲＮＡ結合の阻害効果を定量的に見積もることができる。
【0038】
Ｎタンパク質等とＲＮＡの結合を阻害する化合物の選択は、他の好適例として、液―液相分離（ＬＬＰＳ, Ｌｉｑｕｉｄ－ｌｉｑｕｉｄ ｐｈａｓｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ)による液滴形成を指標とすることができる。単なる例示として挙げるが、蛍光物質で標識したプローブＲＮＡとＮタンパク質あるいはＮタンパク質の一部分は、シラン化ポリエチレングリコールでコートしたガラス表面でＬＬＰＳを起こし数μmの小さな液滴を形成する。形成した液滴を、蛍光顕微鏡により蛍光像と微分干渉光学系で液滴の形態を観察すると、プローブＲＮＡとＮタンパク質等との可逆的な結合とＬＬＰＳを検出することができる。
【0039】
一つの好適例として挙げると、候補オリゴヌクレオシドがＮタンパク質等に接したときに相状態が変化するとＮタンパク質等の間の相互作用が強調されるなどの影響をうける例が挙げられる。例えば候補オリゴヌクレオチドの存在によりＬＬＰＳが進行した場合に１μｍ程度の液滴が数μmの大きさに成長したり相転移を起こし液滴が崩壊したりすることがある。また、他方ＬＬＰＳ内の蛍光プローブＲＮＡと候補オリゴヌクレオチドが置き換わりＬＬＰＳ液滴中の蛍光強度の減少する場合などが挙げられる。１本のゲノムＲＮＡとＮタンパク質等が会合してウイルス粒子を形成することから考えると、これらの変化の何れの場合もウイルスｖＲＮＡ形成は阻害されたあるいは負の影響を受けたと考えることができる。
【0040】
以上のように、ゲノムＲＮＡとＮタンパク質等の相互作用の変化を、好適例として電気泳動移動度シフト法およびＬＬＰＳの変化を見出した候補オリゴヌクレオチドは、Ｎタンパク質とプローブＲＮＡとの結合を効率よく阻害する目的で、例えば塩基長を６塩基以上１９塩基以下の長さの間で変更してもよい。
【0041】
選択された候補オリゴヌクレオチドの安定性、及び/あるいは細胞内への侵入効率を上げるために、その抗ウイルス用オリゴヌクレオチドの構成する塩基部分、リボース部分、ホスホジエステル結合のいずれか、あるいはそれぞれを組み合わせて、該候補オリゴヌクレオチドの一部あるいは全てを修飾してもよい。
【0042】
候補オリゴヌクレオチドの修飾としては、リボース部分の一部又は全部を２′位をデオキ化、２′－Ｏメチル化修飾、２′－Ｏ（２－メトキシエチル）化修飾、２′フルオロ化修飾、架橋型人工核酸（Ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、および/またはＬｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）に変更することができる。リン酸ジエステル結合一部又は全部をホスホロチオエート化してもよい。
【0043】
ホスホジエステル結合の修飾法としては、候補オリゴヌクレオチドのホスホジエステル結合の一部または全てのリン酸をホスホロチオエート化修飾してもよい。
【0044】
選択された候補オリゴヌクレオチドが低分子の場合には細胞内に侵入することが知られている。また、効率よく細胞内に導入するために、好適例として脂質類似膜やＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ（ＰＥＩ）のキャリアを用いて導入する方法、また、細胞透過性ペプチド等を候補オリゴヌクレオチドに共有結合する方法などが挙げられる。
【0045】
選択された候補オリゴヌクレオチドあるいは、以上のように修飾した抗ウイルス用オリゴヌクレオチドの効果を確認する。例えば、感染症の原因となるＲＮＡウイルスの感染細胞培養系がある場合には、感染細胞の培養液に抗ウイルス用オリゴヌクレオチドを添加し、ウイルスの増殖の抑制効率を観察する方法を用いる。ウイルスの増殖抑制効果は、例えばウイルス複製に伴い誘導されるウイルスタンパク質の定量、あるいは細胞内ウイルスＲＮＡや細胞外に放出されたウイルスＲＮＡあるいはウイルスの感染力価を定量する方法を用いる。ウイルスＲＮＡの定量は、例えば塩基配列を元に設計した２つの特異的なプライマーＤＮＡと検出用蛍光標識オリゴＤＮＡを用いて、逆転写反応後の定量ＰＣＲ（ＲＴ‐ｑＰＣＲ）により該ウイルス特異的なｍＲＮＡおよびゲノムＲＮＡを定量する方法を用いる。ウイルスタンパク質の存在量は、例えば特異抗体を用いたウエスタンブロッティングや蛍光抗体法などが挙げられる。また、ウイルスの細胞変性効果や蛍光抗体法を用いて候補オリゴヌクレオチドによる感染力価を低下する効果を求める方法も挙げられる。
【0046】
候補オリゴヌクレオチドの抗ウイルス効果は、実験動物を用いることができる。好適例として、マウスなどの実験動物の新生仔の鼻腔、気道、肺内にＲＮＡウイルスを接種しながら候補オリゴヌクレオチドを投与し、その動物体内におけるウイルスの増殖レベルを定量ＰＣＲ法や組織切片の蛍光抗体法により検出する方法、動物の病態の変化を観察することにより候補オリゴヌクレオチドの効果を見積もる方法が挙げられる。
【0047】
抗ウイルス効果がある候補オリゴヌクレオチドを抗ウイルス用オリゴヌクレオチドとする。
【実施例0048】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【0049】
【0050】
Ｎタンパク質のＮ末端のＲＮＡ結合ドメイン（ＮＴＤ）と３２Ｐ‐ＲＮＡプローブの混合液に候補オリゴリボヌクレオチドを添加して、ＲＮＡ‐ＮＰ結合阻害効果を見積もることができる。本発明はこの方法を用いて、数種の異なった配列の６塩基長のオリゴリボヌクレオシドの中からＩｎ－１の阻害効果は極端に低いが、Ｇ６に最も効果が最も高いことを示す（図２－１、図２－２、図３）。
【0051】
本発明者らは、この方法でＩｎ－１はＮタンパク質のＣ末端側に結合してＬＬＰＳが進行させ～数μmの液滴とさらに相転移を誘導すること、Ｇ６はＮＴＤおよびそれ以外の領域に結合して液滴の成長と相転移を誘導することを見出した。さらに、グアノシンが連続した１２塩基長のオリゴリボヌクレオチド（Ｇ１２）が高いＮタンパク質-ＲＮＡの結合阻害活性を持つことを発見した（図４、図５）。Ｇ１２の効果は、形成されたＬＬＰＳ液滴中のプローブＲＮＡを追い出す効果（図６）、プローブＲＮＡによる安定な液滴形成そのものを阻害し相転移を促進する両方の効果がある（図７）。
【0052】
βコロナウイルス間でＮタンパク質の立体構造を比較した研究が多数あるが、Ｎタンパク質の共通の立体構造が見出されている。また、発明者らが見出したＧ６やＩｎ－１の配列も他のコロナウイルスゲノム中には極端に少ないことから、Ｇ１２の効果はコロナウイルス感染細胞に同様な影響を与える可能性を検討した。
【0053】
選択されたオリゴヌクレオチドのＧ１２は、核酸を包む脂質膜等がない状態でウイルス感染細胞培養液に添加することで効果を示すことを見出した。すなわち、Ｇ１２の効果をヒトコロナウイルスでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と同様にβコロナウイルス科にＯＣ４３を用いて検証した。ＯＣ４３感染ヒト細胞の培養液中にＧ１２加えて培養すると、感染細胞のＲＮＡの合成（図８）およびＯＣ４３のタンパク質が阻害されるた（図９）。さらに、ヒトがん細胞Ａ５４９を用いてＯＣ４３のＮタンパク質の細胞内分布を、蛍光抗体法を用いて検出した結果、Ｇ１２は感染細胞において点状に分布するＮタンパク質を拡散させる効果があることを示すことができる（図１０）。これの結果より、Ｇ１２はＯＣ４３のＲＮＡの複製、ｍＲＮＡの転写、複製された新生ＲＮＡとＮタンパク質との会合に影響を与えるものと推察された。
【0054】
培養液中のＧ１２は最終濃度で２０μＭ程度に増加しても細胞の増殖は８０％以上で細胞に毒性はないことがわかる（図１１）。
【0055】
【0056】
候補オリゴヌクレオチドは、Ｇ１２の抗ウイルス効果は、コロナウイルス以外でｖＲＮＰ構造を持ちエンベロープにくるまれたウイルスの感染細胞にも有効であると洞察して、インフルエンザＡ型ウイルス感染ＭＤＣＫ細胞の培養液に添加し、その増殖を検討した。インフルエンザウイルスの細胞由来のＨＡタンパク質の合成を効率よく阻害することを発見した（図１３）。また、細胞内ＲＮＡレベルの増加もＧ１２存在下で阻害される（図１４―Ａ）。さらに細胞外ＲＮＡ（培養液ＲＮＡ）を同時に定量した結果、細胞内部のＲＮＡが増加してもＧ１２は細胞外への放出も阻害していることを見出した（図１４－ＢおよびＣ）。
【0057】
これらの結果から、Ｇ１２はコロナウイルスおよびインフルエンザウイルスのＲＮＡ合成に加えて、ウイルス粒子の産生のステップで阻害することを見出した。これらの知見より、Ｎタンパク質とゲノムＲＮＡが結合してｖＲＮＰ構造を形成するＲＮＡウイルスに共通した阻害効果を示す抗ウイルス用オリゴヌクレオチドを見出し、本発明を完成した。
【産業上の利用可能性】
【0058】
オリゴヌクレオチドの好適な修飾により核酸分解酵素の抵抗性を上げる効果がある。さらに、低分子のオリゴヌクレオチドは細胞内に侵入するため、抗ウイルス用オリゴヌクレオチドとして生体に適応できる。複数のウイルスに効果があることから好適には新感染症にも適応が可能な抗ウイルス薬が創出される。
【用語の説明】
【0059】
１ 「候補オリゴヌクレオチド」とは、ウイルスゲノム中に存在しない塩基配列、あるいは／およびＮタンパク質とプローブＲＮＡの結合を阻害するオリゴヌクレオチド。
２ 「抗ウイルス用オリゴヌクレオチド」とは、Ｎタンパク質とプローブＲＮＡの結合に影響を与えウイルスの増殖を低下させるオリゴヌクレオチド。
２ 「抗ウイルス用オリゴヌクレオチド」とは、Ｎタンパク質とプローブＲＮＡの結合に影響を与えウイルスの増殖を低下させるオリゴヌクレオチド。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【配列表】