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特開2024-71067ウェルアレイフィルター、粒子整列デバイスおよび粒子捕獲方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024071067
(43)【公開日】2024-05-24
(54)【発明の名称】ウェルアレイフィルター、粒子整列デバイスおよび粒子捕獲方法
(51)【国際特許分類】
C12M 1/28 20060101AFI20240517BHJP
C12N 1/00 20060101ALI20240517BHJP
【ＦＩ】
C12M1/28
C12N1/00 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022181802
(22)【出願日】2022-11-14
(71)【出願人】
【識別番号】000220239
【氏名又は名称】東京応化工業株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100165179
【弁理士】
【氏名又は名称】田▲崎▼ 聡
(74)【代理人】
【識別番号】100189337
【弁理士】
【氏名又は名称】宮本 龍
(74)【代理人】
【識別番号】100178847
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 映美
(74)【代理人】
【識別番号】100211122
【弁理士】
【氏名又は名称】白石 卓也
(72)【発明者】
【氏名】大坂 享史
(72)【発明者】
【氏名】高橋 杏奈
(72)【発明者】
【氏名】仲村 亮正
【テーマコード（参考）】
4B029
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B029AA08
4B029AA09
4B029BB01
4B029CC01
4B029HA02
4B029HA06
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA87X
4B065BD50
4B065CA46
(57)【要約】
【課題】できるだけ多くのウェル内に一つずつ細胞等の粒子を捕捉でき、シングルセル率が高く通液性が良好で、多数の細胞等を整列して安定に捕捉できるウェルアレイフィルター、粒子整列デバイスおよび粒子捕獲方法を提供する。
【解決手段】このウェルアレイフィルター１は、フィルタ本体２に複数のウェル３が形成され、隣接するウェル３同士はウェル隔壁６で仕切られ、ウェル底部４には２以上の貫通孔８が形成され、貫通孔８の開口部最小幅は１μｍ以上３．５μｍ以下で、貫通孔の合計開口面積の比率は０．５％以上３．５％以下である。各ウェル底部４の貫通孔８の全てを囲む最小外接円Ｇ１を仮定し、その中心を複数の貫通孔８のいずれの中心に移動させた場合、移動後の最小外接円Ｇ２は複数の貫通孔８の全てに対し少なくとも部分的に重なる。
【選択図】図３
【解決手段】このウェルアレイフィルター１は、フィルタ本体２に複数のウェル３が形成され、隣接するウェル３同士はウェル隔壁６で仕切られ、ウェル底部４には２以上の貫通孔８が形成され、貫通孔８の開口部最小幅は１μｍ以上３．５μｍ以下で、貫通孔の合計開口面積の比率は０．５％以上３．５％以下である。各ウェル底部４の貫通孔８の全てを囲む最小外接円Ｇ１を仮定し、その中心を複数の貫通孔８のいずれの中心に移動させた場合、移動後の最小外接円Ｇ２は複数の貫通孔８の全てに対し少なくとも部分的に重なる。
【選択図】図３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
平板状のフィルタ本体を有し、前記フィルタ本体には前記フィルタ本体の上面のウェル形成領域に開口する複数のウェルが形成され、互いに隣接する前記ウェル同士の間はウェル隔壁によりそれぞれ仕切られ、
前記ウェルの下端にはウェル底部がそれぞれ形成され、前記ウェル底部には前記フィルタ本体の下面に達する２以上の貫通孔が形成され、
前記貫通孔の上面開口部の最小幅は１μｍ以上３．５μｍ以下であり、
前記ウェル形成領域の面積に対する前記貫通孔の合計開口面積の比率は０．５％以上３．５％以下であり、
前記各ウェル底部に形成されている前記複数の貫通孔の全てを囲む最小外接円を仮定し、この最小外接円の中心を前記複数の貫通孔のいずれの中心に移動させた場合にも、前記最小外接円は前記複数の貫通孔の全てに対し少なくとも部分的に重なる位置関係を満たすことを特徴とするウェルアレイフィルター。
前記ウェルの下端にはウェル底部がそれぞれ形成され、前記ウェル底部には前記フィルタ本体の下面に達する２以上の貫通孔が形成され、
前記貫通孔の上面開口部の最小幅は１μｍ以上３．５μｍ以下であり、
前記ウェル形成領域の面積に対する前記貫通孔の合計開口面積の比率は０．５％以上３．５％以下であり、
前記各ウェル底部に形成されている前記複数の貫通孔の全てを囲む最小外接円を仮定し、この最小外接円の中心を前記複数の貫通孔のいずれの中心に移動させた場合にも、前記最小外接円は前記複数の貫通孔の全てに対し少なくとも部分的に重なる位置関係を満たすことを特徴とするウェルアレイフィルター。
【請求項2】
前記各ウェル底部に形成されている前記貫通孔は、仮想的な線分上に２個以上形成されているか、仮想的な三角形の頂点位置および前記三角形の辺上もしくは内側に合計３個以上形成されているか、または、仮想的な四角形の頂点位置および前記四角形の辺上もしくは内側に合計４個以上形成されていることを特徴とする請求項１に記載のウェルアレイフィルター。
【請求項3】
前記貫通孔の開口形状は、円形、楕円形、または複数の円形もしくは楕円形が繋がった形状であることを特徴とする請求項１または２に記載のウェルアレイフィルター。
【請求項4】
前記貫通孔の開口形状は、多角形状または角が丸められた多角形状であることを特徴とする請求項１または２に記載のウェルアレイフィルター。
【請求項5】
少なくとも前記ウェルの内面には、細胞接着を抑制するポリマーが塗布されていることを特徴とする請求項１または２に記載のウェルアレイフィルター。
【請求項6】
請求項１または２に記載のウェルアレイフィルターと、前記ウェルアレイフィルターを支持するとともに前記ウェルアレイフィルターの前記ウェルの開口部側から前記貫通孔を通じて前記ウェルの底面側へ向けて通じるサンプル流路を有するデバイス本体を備えたことを特徴とする粒子整列デバイス。
【請求項7】
請求項６の粒子整列デバイスの前記サンプル流路に、前記ウェルアレイフィルターおよび前記デバイス本体を溶解または変質させない有機溶媒を含む液体を通液させる工程と、
前記サンプル流路に水溶液を通液させて有機溶媒を含む液体を前記水溶液で置換する工程と、
前記サンプル流路に、前記ウェルで捕捉すべき粒子を含む水溶液を通液させ前記ウェル内に前記粒子を捕獲する工程を有する粒子捕獲方法。
前記サンプル流路に水溶液を通液させて有機溶媒を含む液体を前記水溶液で置換する工程と、
前記サンプル流路に、前記ウェルで捕捉すべき粒子を含む水溶液を通液させ前記ウェル内に前記粒子を捕獲する工程を有する粒子捕獲方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞やビーズ等の粒子を捕捉するためのウェルアレイフィルター、粒子整列デバイス、および粒子捕獲方法に関する。
【背景技術】
【0002】
近年、特に創薬分野において、細胞解析のターゲッ卜が細胞群レベルから単一細胞レベルへと細分化され、細胞スクリーニングデバイス（粒子整列デバイス）を用いて、ウェルアレイフィルターの微細かつ多数のウェル内に細胞を１つ１つ捕捉したうえ、多数の細胞に対し一斉にスクリーニングテストを行い、目的の特性を有する細胞を選別する手法が使用されている。細胞をスクリーニングする方法としては、例えば、多数のウェル内に捕捉した細胞を、特定の抗体と結合するキャッチャーなどの試薬を分散させた液と接触させ、キャッチャーと結合した分泌物を分泌した細胞を探し出し、ウェルから回収する方法などが採用されている。
【0003】
特許文献１に開示された粒子整列デバイスは、レジストで作製されたウェルアレイフィルターを備え、このウェルアレイフィルターには、底部にそれぞれ一つの貫通孔を有するウェルが多数配列されて形成されている。各ウェルの開口形状は、細胞に類似させて、円形または楕円形とされている。特許文献１の実施例では、ウェルの開口径は１００μｍ、ウェルの深さは３０～１００μｍ、貫通孔の開口径は２～５μｍとされたウェルアレイフィルターが開示されている。
【0004】
特許文献２に開示された粒子整列デバイスは、シリコンウェハで作製されたウェルアレイフィルターを備え、このウェルアレイフィルターには、エッチングにより多数のウェルが配列されて形成され、各ウェルの底部には、それぞれ一つの貫通孔を形成したＳｉＮｘ膜が設けられている。各ウェルの開口形状は円形とされている。このウェルアレイフィルターは、シリコンウェハから作製されているので、特許文献２の実施例は、フィルタ本体の厚さが３８０μｍ、ウェルの開口径は１００μｍ程度で、ウェル中心間距離は１５０μｍ程度とされている。
【0005】
特許文献３に開示された粒子整列デバイスは、細胞を格納するための底部に貫通孔を有するウェル基板と、その細胞からの分泌物を検出するための細胞を格納するための基板の２層からなる分泌アッセイ用のウェルアレイフィルターを備えている。前記ウェル基板は、レジストで作製されている。特許文献３の実施例では、ウェルは円形で開口径は１２μｍと細胞に近いサイズであるが、ウェル中心間の距離は１００μｍ程度とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】米国特許第１０３７０６３０号明細書
【特許文献2】米国特許第９６３８６３６号明細書
【特許文献3】特開２０１９－２１３５６６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
ところで、上記のようなウェルアレイフィルターでは、細胞やビーズ等を分散媒に分散させたサンプル液体をウェルアレイフィルターに通液した際に、できるだけ多くのウェルに細胞等が捕捉されるとともに、一つのウェル内には一つだけの細胞が格納される、いわゆるシングルセルになるように細胞等が捕捉されることが好ましい。一度の通液で多くのウェルに細胞等を捕捉でき、しかも、シングルセル率が高ければ、ターゲットとなる細胞等を一つ一つ分別して高い確率で捕獲することが可能である。
【0008】
一方、細胞を捕捉した後に培養する場合や、個々のウェルから細胞等をキャピラリーで回収する場合には、ウェルの開口径がある程度大きい方が扱いやすい。開口径が小さいウェルで細胞を培養すると、分裂した細胞がウェルから溢れ出て捕捉し損ねる場合があるうえ、ウェルの開口径がキャピラリーの先端外径より大きい方が、キャピラリーの先端をウェル内に直接挿入でき、細胞等の回収が容易になるためである。
【0009】
しかし、ウェルの開口径を単に大きくすると、ウェルアレイフィルターの単位面積当たりのウェル数は減る。例えば、ウェル間を隔てる壁の幅を一定として、ウェルの開口径が２０μｍの場合と、５０μｍの場合を比較すると、単位面積当たりのウェル数は１／４になる。２０μｍの場合と５０μｍの場合で、ウェル底部に形成されている一つの貫通孔の開口径を同じにすると、フィルターの面積当たりの貫通孔の面積の比率、すなわち貫通孔の開口率も１／４に低下し、ウェルアレイフィルター全体としての通液性が悪化し、通液作業の効率が低下する。
【0010】
ウェルアレイフィルターの通液性を改善するために、ウェル毎に一つ形成された貫通孔の開口径を大きくすると、細胞等が貫通孔を通り抜けるおそれがある。そこで、各ウェル内の貫通孔の数を増やすことが考えられるが、単に貫通孔の数を増やすだけでは、ウェルの開口径が同じ場合にも、シングルセル率が低下する現象が判明した。
【0011】
本発明者らは、この現象を詳細に分析し、ウェルアレイフィルターとしての通液性を確保しながら、シングルセル率を高めるためには、下記の作用が得られるように貫通孔を形成するとよいことを見いだした。すなわち、（１）いずれか一つのウェル内に細胞等が捕捉された場合に、この細胞等によってそのウェル内の貫通孔のいずれもが開口面積を狭められて合計流量が減少し、二つ目の細胞等を同じウェルに導いてしまうほどの流量はなく、隣接する空のウェルに細胞等が導かれて捕捉されること、（２）ただし、一つのウェル内に一つの細胞等が捕捉された場合に、全ての貫通孔が閉塞されて流量が極端に減少すると、ウェルアレイフィルター全体としての通液性を悪化させてしまう。
【0012】
本発明者らは前記作用を達成するための貫通孔の条件を検討した。その結果、ウェル底部に２以上の貫通孔が形成され、前記貫通孔の上面開口部の最小幅は１μｍ以上３．５μｍ以下であり、ウェルアレイフィルターのウェル形成領域の面積に対する前記貫通孔の合計開口面積の比率は０．５％以上３．５％以下であり、同一のウェル内の複数の貫通孔の全てを囲む最小外接円を仮定し、この最小外接円の中心を前記複数の貫通孔のいずれの中心に移動させた場合にも、前記最小外接円は前記複数の貫通孔の全てに対し少なくとも部分的に重なる位置関係を満たす場合に、前記作用が得られることを見いだした。
【0013】
本発明は前記事情に鑑みてなされたものであり、できるだけ多くのウェル内に一つずつ細胞等の粒子を捕捉でき、シングルセル率が高く通液性が良好で、多数の細胞等を整列して安定に捕捉できるウェルアレイフィルター、粒子整列デバイスおよび粒子捕獲方法を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【0014】
［態様１］本発明に係る態様１のウェルアレイフィルターは、平板状のフィルタ本体を有し、 前記フィルタ本体には前記フィルタ本体の上面のウェル形成領域に開口する複数のウェルが形成され、互いに隣接する前記ウェル同士の間はウェル隔壁によりそれぞれ仕切られ、 前記ウェルの下端にはウェル底部がそれぞれ形成され、前記ウェル底部には前記フィルタ本体の下面に達する２以上の貫通孔が形成され、前記貫通孔の上面開口部の最小幅は１μｍ以上３．５μｍ以下であり、前記ウェル形成領域の面積に対する前記貫通孔の合計開口面積の比率は０．５％以上３．５％以下であり、前記各ウェル底部に形成されている前記複数の貫通孔の全てを囲む最小外接円を仮定し、この最小外接円の中心を前記複数の貫通孔のいずれの中心に移動させた場合にも、前記最小外接円は前記複数の貫通孔の全てに対し少なくとも部分的に重なる位置関係を満たすことを特徴とする。
【0015】
態様１のウェルアレイフィルターによれば、前記貫通孔の最小幅は１μｍ以上３．５μｍ以下、前記ウェル形成領域の面積に対する前記貫通孔の合計開口面積の比率は０．５％以上３．５％以下であるから、捕捉すべき細胞またはビーズ等の粒子が貫通孔を通過することを抑制しつつ、ウェルアレイフィルター全体としての流量が確保できる。また、各ウェル底部に形成されている複数の貫通孔が前記位置関係を満たすことにより、ウェル内に前記粒子が一つ捕獲された際に、この粒子が前記複数の貫通孔の全てに対し少なくとも部分的に重なる確率が高い。よって、一つ目の粒子が捕獲された後は、そのウェル内の全ての貫通孔を通過する分散媒の流量が適度に低下し、流れに乗って２つ目以降の粒子が同一のウェル内に入ってくることが抑制され、隣接する空のウェルに細胞等が導かれて捕捉される確率が高まる。これにより、多くのウェル内に一つずつ粒子が捕獲される確率が高く、シングルセル率が高く、かつ通液性が低下せずに良好に保たれ、各ウェルでの粒子の単離が安定して行える。
【0016】
［態様２］態様１において、前記各ウェル底部に形成されている前記貫通孔は、仮想的な線分上に２個以上形成されているか、仮想的な三角形の頂点位置および前記三角形の辺上もしくは内側に合計３個以上形成されているか、または、仮想的な四角形の頂点位置および前記四角形の辺上もしくは内側に合計４個以上形成されていてもよい。
この場合、ウェル内に細胞またはビーズ等の粒子が一つ捕獲された際に、この粒子が前記複数の貫通孔の全てに少なくとも部分的に重なる割合が高い。よって、一つ目の粒子が捕獲された後は、そのウェル内の全ての貫通孔を通過する分散媒の流量が適度に低下し、２つ目以降の粒子がウェル内に入ってくることが抑制されるから、各ウェルでの粒子の単離が一層安定して行える。
この場合、ウェル内に細胞またはビーズ等の粒子が一つ捕獲された際に、この粒子が前記複数の貫通孔の全てに少なくとも部分的に重なる割合が高い。よって、一つ目の粒子が捕獲された後は、そのウェル内の全ての貫通孔を通過する分散媒の流量が適度に低下し、２つ目以降の粒子がウェル内に入ってくることが抑制されるから、各ウェルでの粒子の単離が一層安定して行える。
【0017】
［態様３］態様１または２において、前記貫通孔の開口形状は、円形、楕円形、または複数の円形もしくは楕円形が繋がった形状であってもよい。
この場合、前記貫通孔の開口形状が円形、楕円形、または、複数の円形もしくは楕円形が繋がった形状であることにより、前記貫通孔の上に細胞またはビーズ等の粒子が載った場合に、前記粒子が前記複数の貫通孔の全てに少なくとも部分的に重なる割合が高く、ウェル内に粒子が捕獲される前と後との流量差を大きく確保でき、前記効果を高めることができる。
この場合、前記貫通孔の開口形状が円形、楕円形、または、複数の円形もしくは楕円形が繋がった形状であることにより、前記貫通孔の上に細胞またはビーズ等の粒子が載った場合に、前記粒子が前記複数の貫通孔の全てに少なくとも部分的に重なる割合が高く、ウェル内に粒子が捕獲される前と後との流量差を大きく確保でき、前記効果を高めることができる。
【0018】
［態様４］態様１～３のいずれか１つにおいて、前記貫通孔の開口形状は、多角形状または角が丸められた多角形状であってもよい。多角形状とは三角形状、四角形状、あるいは５角形状であってもよい。
この場合、前記貫通孔の開口形状が多角形状または角が丸められた多角形状である場合には、前記貫通孔の流路断面積に比して、前記貫通孔の上面開口部の最小幅が小さくなるから、捕捉すべき細胞またはビーズ等の粒子が貫通孔を通過することをさらに抑制することができる。また、ウェルが多角形状であるから自動画像解析の際に粒子とウェルとを識別することが容易である。
この場合、前記貫通孔の開口形状が多角形状または角が丸められた多角形状である場合には、前記貫通孔の流路断面積に比して、前記貫通孔の上面開口部の最小幅が小さくなるから、捕捉すべき細胞またはビーズ等の粒子が貫通孔を通過することをさらに抑制することができる。また、ウェルが多角形状であるから自動画像解析の際に粒子とウェルとを識別することが容易である。
【0019】
［態様５］態様１～４のいずれか１つにおいて、少なくとも前記ウェルの内面に細胞接着を抑制するポリマーが塗布されていてもよい。前記ポリマーは例えば、ＭＰＣポリマー、ＰＥＧ、ＰＶＡ、ＰＭＥＡ、およびこれらの混合物であってもよい。
この場合、前記ウェルの内面に塗布されたポリマーが細胞接着を抑制するから、ウェルからの細胞または粒子の取り出しが容易になる。前記ポリマーを塗布するのは、前記ウェルの内面だけでなく、前記ウェル隔壁の上面、前記貫通孔の内面、および前記フィルタ本体の下面にも前記ポリマーを塗布してもよい。その場合、前記ウェル隔壁の上面に細胞等が付着したり、前記フィルタ本体の下面に細胞等が付着したりする問題を抑制できる。
この場合、前記ウェルの内面に塗布されたポリマーが細胞接着を抑制するから、ウェルからの細胞または粒子の取り出しが容易になる。前記ポリマーを塗布するのは、前記ウェルの内面だけでなく、前記ウェル隔壁の上面、前記貫通孔の内面、および前記フィルタ本体の下面にも前記ポリマーを塗布してもよい。その場合、前記ウェル隔壁の上面に細胞等が付着したり、前記フィルタ本体の下面に細胞等が付着したりする問題を抑制できる。
【0020】
［態様６］態様１～５のいずれか１つにおいて、前記貫通孔の最大内接円直径は４μｍ以下であってもよい。
この場合、前記貫通孔を細胞またはビーズ等の粒子が通り抜けてしまうことを効果的に抑制することができる。
この場合、前記貫通孔を細胞またはビーズ等の粒子が通り抜けてしまうことを効果的に抑制することができる。
【0021】
［態様７］態様１～６のいずれか１つにおいて、前記ウェル隔壁と前記ウェル底部は互いに異なる材質で形成され、前記ウェル底部は前記ウェル隔壁よりも強度の高い材質で形成されていてもよい。
この場合、前記ウェル底部は前記ウェル隔壁よりも強度の高い材質で形成されているから、ウェルアレイフィルター全体の強度を高めつつ、前記ウェル壁部の成形時の収縮を緩和してウェルアレイフィルターの反りや歪を低減できる。
この場合、前記ウェル底部は前記ウェル隔壁よりも強度の高い材質で形成されているから、ウェルアレイフィルター全体の強度を高めつつ、前記ウェル壁部の成形時の収縮を緩和してウェルアレイフィルターの反りや歪を低減できる。
【0022】
［態様８］態様１～７のいずれか１つにおいて、前記ウェル隔壁と前記ウェル底部は互いに異なる材質で形成され、前記ウェル底部はそれぞれ前記ウェルの開口部の形状に対応したタイル形状に分割されて隣接する前記ウェル底部の間には間隙が形成され、これら間隙内に前記ウェル隔壁を形成する材料が侵入して固化していてもよい。
この場合、前記ウェル底部がタイル形状に分割されて相互に間隙が形成された状態としたのち、前記ウェル隔壁を形成して前記間隙内に前記ウェル隔壁を形成する材料を侵入固化させることができるため、ウェル底部が一枚板で形成されている場合に比して、固化収縮のためにウェルアレイフィルターに生じる反りや歪を低減できる。
この場合、前記ウェル底部がタイル形状に分割されて相互に間隙が形成された状態としたのち、前記ウェル隔壁を形成して前記間隙内に前記ウェル隔壁を形成する材料を侵入固化させることができるため、ウェル底部が一枚板で形成されている場合に比して、固化収縮のためにウェルアレイフィルターに生じる反りや歪を低減できる。
【0023】
［態様９］態様１～８のいずれか１つにおいて、前記ウェル底部の厚さは、１ｎｍ以上２μｍ以下であってもよい。
この場合、前記ウェル底部が薄いために、倒立顕微鏡でウェル内の捕捉物をウェル底部を通して観察しやすい上に、薄い分自家蛍光が小さいために自家蛍光による観察への悪影響も低減できる。
この場合、前記ウェル底部が薄いために、倒立顕微鏡でウェル内の捕捉物をウェル底部を通して観察しやすい上に、薄い分自家蛍光が小さいために自家蛍光による観察への悪影響も低減できる。
【0024】
［態様１０］本発明の態様１０に係る粒子整列デバイスは、前記態様１～９のいずれか１つに記載のウェルアレイフィルターと、前記ウェルアレイフィルターを支持するとともに前記ウェルアレイフィルターの前記ウェルの開口部側から前記貫通孔を通じて前記ウェルの底面側へ向けてサンプル流路を有するデバイス本体を備えたものである。
態様１０に係る粒子整列デバイスによれば、捕捉すべき細胞またはビーズ等の粒子が貫通孔を通過することを抑制しつつ、ウェルアレイフィルター全体としての流量が確保できる。また、各ウェル底部に形成されている複数の貫通孔が前記位置関係を満たすことにより、ウェル内に前記粒子が一つ捕獲された際に、この粒子が前記複数の貫通孔の全てに対し少なくとも部分的に重なる確率が高い。よって、一つ目の粒子が捕獲された後は、そのウェル内の全ての貫通孔を通過する分散媒の流量が適度に低下し、流れに乗って２つ目以降の粒子がウェル内に入ってくることが抑制され、隣接する空のウェルに細胞等が導かれて捕捉される確率が高まる。これにより、多くのウェル内に一つずつ粒子が捕獲される確率が高く、シングルセル率が高くかつ通液性が良好であり、各ウェルでの粒子の単離が安定して行える。
態様１０に係る粒子整列デバイスによれば、捕捉すべき細胞またはビーズ等の粒子が貫通孔を通過することを抑制しつつ、ウェルアレイフィルター全体としての流量が確保できる。また、各ウェル底部に形成されている複数の貫通孔が前記位置関係を満たすことにより、ウェル内に前記粒子が一つ捕獲された際に、この粒子が前記複数の貫通孔の全てに対し少なくとも部分的に重なる確率が高い。よって、一つ目の粒子が捕獲された後は、そのウェル内の全ての貫通孔を通過する分散媒の流量が適度に低下し、流れに乗って２つ目以降の粒子がウェル内に入ってくることが抑制され、隣接する空のウェルに細胞等が導かれて捕捉される確率が高まる。これにより、多くのウェル内に一つずつ粒子が捕獲される確率が高く、シングルセル率が高くかつ通液性が良好であり、各ウェルでの粒子の単離が安定して行える。
【0025】
［態様１１］本発明の態様１１に係る粒子捕獲方法は、態様１０の粒子整列デバイスの前記サンプル流路に、前記ウェルアレイフィルターおよび前記デバイス本体を溶解または変質させない有機溶媒を含む液体を通液させる工程と、前記サンプル流路に水溶液を通液させて前記有機溶媒を含む液を前記水溶液で置換する工程と、前記水溶液で置換された前記サンプル流路に、前記ウェルで捕捉すべき粒子を含む水溶液を通液させ前記ウェル内に前記粒子を捕獲する工程を有する。前記有機溶媒を含む液体は限定されないが、例えば、エチルアルコールや、３０～８０％程度のエチルアルコール等の有機溶媒を含む水溶液等の液体、好ましくは７０％エチルアルコール水溶液などが使用できる。
態様１１に係る粒子捕獲方法によれば、前記有機溶媒を含む液体を前記サンプル流路に通液させ、次いで前記サンプル流路内を水溶液に置換した後に、細胞、細胞の成分や分泌物を付着させたビーズ、または、細胞の成分や分泌物を付着させるためのビーズ等の粒子を含む水溶液を通液させることにより、ウェルアレイフィルターの通液抵抗が低減されるとともに、ウェルに気泡が残留しにくく、各ウェル内に一つずつ前記細胞または前記粒子を捕獲することが容易である。
態様１１に係る粒子捕獲方法によれば、前記有機溶媒を含む液体を前記サンプル流路に通液させ、次いで前記サンプル流路内を水溶液に置換した後に、細胞、細胞の成分や分泌物を付着させたビーズ、または、細胞の成分や分泌物を付着させるためのビーズ等の粒子を含む水溶液を通液させることにより、ウェルアレイフィルターの通液抵抗が低減されるとともに、ウェルに気泡が残留しにくく、各ウェル内に一つずつ前記細胞または前記粒子を捕獲することが容易である。
【0026】
［態様１２］態様１～１１のいずれか１つにおいて、前記最小外接円の中心を前記複数の貫通孔のいずれの中心に移動させた場合にも、前記最小外接円は前記複数の貫通孔の全てに対し少なくとも部分的に重なり、全ての重複部分のうち最も重複面積が小さい重複部分の最大幅は、前記最小外接円の半径の０．７％以上であってもよい。前記最大幅は移動前後の前記最小外接円の中心同士を結ぶ直線に沿う値とする。前記最大幅は前記最小外接円の半径の０．５％以上、１％以上、２％以上、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、３０％以上のいずれかであってもよい。前記貫通孔の形状が円形である場合であって、重複部分の最大幅が前記最小外接円の半径の０．７％である場合には、全ての重複部分のうち最も重複面積が小さい重複部分の重複面積は、前記貫通孔の開口面積の０．０２５％に該当する。同様に、重複部分の重複面積が、貫通孔の開口面積の０．０５％、０．１０％、０．２５％、０．５０％、１．００％である場合、前記最大幅は前記最小外接円の半径の１．１２％、１．８０％、３．３２％、５．２０％、８．２６％にそれぞれ該当する。貫通孔の形状が円形以外のいかなる形状の場合であっても、全ての重複部分のうち最も重複面積が小さい重複部分の重複面積は、前記貫通孔の開口面積の０．０２５％、０．０５％、０．１０％、０．２５％、０．５０％、または１．００％であってもよい。
【発明の効果】
【0027】
以上説明したように、本発明によれば、捕捉すべき細胞またはビーズ等の粒子が貫通孔を通過することを抑制しつつ、ウェルアレイフィルター全体としての流量が確保できるうえ、各ウェル底部に形成されている複数の貫通孔が前記位置関係を満たすことにより、ウェル内に前記粒子が一つ捕獲された際に、この粒子が前記複数の貫通孔の全てに対し少なくとも部分的に重なる確率が高い。よって、一つ目の粒子が捕獲された後は、そのウェル内の全ての貫通孔を通過する分散媒の流量が適度に低下し、流れに乗って２つ目以降の粒子がウェル内に入ってくることが抑制され、隣接する空のウェルに細胞等が導かれて捕捉される確率が高まる。これにより、多くのウェル内に一つずつ粒子が捕獲される確率が高く、シングルセル率が高くかつ通液性が良好であり、各ウェルでの粒子の単離が安定して行える。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図1】本発明の第１実施形態のウェルアレイフィルターの平面拡大図である。
【図2】第１実施形態のウェルアレイフィルターの断面拡大図である。
【図3】（ａ）および（ｂ）は第１実施形態のウェルアレイフィルターのウェルの平面拡大図、（ｃ）は比較例のウェルアレイフィルターのウェルの平面拡大図である。
【図4】（ａ）～（ｃ）は、第２実施形態～第４実施形態のウェルアレイフィルターのウェルの平面拡大図である。
【図5】（ａ）～（ｃ）は、第５実施形態～第７実施形態のウェルアレイフィルターのウェルの平面拡大図である。
【図6】（ａ）および（ｂ）は第８実施形態および第９実施形態のウェルアレイフィルターのウェルの平面拡大図、（ｃ）は他の比較例のウェルアレイフィルターのウェルの平面拡大図である。
【図7】（ａ）および（ｂ）は第１０実施形態および第１１実施形態のウェルアレイフィルターのウェルの平面拡大図、（ｃ）は他の比較例のウェルアレイフィルターのウェルの平面拡大図である。
【図8】（ａ）～（ｃ）は、他の比較例のウェルアレイフィルターのウェルの平面拡大図である。
【図9】（ａ）および（ｂ）は第１２実施形態および第１３実施形態のウェルアレイフィルターのウェルの平面拡大図、（ｃ）は他の比較例のウェルアレイフィルターのウェルの平面拡大図である。
【図10】（ａ）および（ｂ）は第１４実施形態および第１５実施形態のウェルアレイフィルターのウェルの平面拡大図、（ｃ）は他の比較例のウェルアレイフィルターのウェルの平面拡大図である。
【図11】第１６実施形態のウェルアレイフィルターの平面拡大図である。
【図12】第１７実施形態のウェルアレイフィルターの平面拡大図である。
【図13】（ａ）～（ｆ）は本発明の実施形態のウェルアレイフィルターの製造方法を示す断面拡大図である。
【図14】本発明の一実施形態の粒子整列デバイスを示す平面図である。
【図15】同実施形態の粒子整列デバイスを示す縦断面図である。
【図16】本発明の実施例の成立条件を説明する図である。
【図17】本発明の実施例の成立条件を説明する図である。
【図18】本発明の実施例の成立条件を説明するグラフである。
【図19】本発明の実施例の成立条件を説明する図である。
【図20】本発明の実施例の成立条件を説明するグラフである。
【図21】本発明の実施例の効果を示す表である。
【図22】本発明の実施例の効果を示すグラフである。
【図23】本発明の実施例の効果を示す表である。
【図24】本発明の実施例の効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0029】
以下、本発明の実施形態を図面を用いて説明する。
［第１実施形態］
図１および図２は、ウェルアレイフィルターの第１実施形態を示す平面拡大図および断面拡大図である。このウェルアレイフィルター１は、一定の厚さで平板状のフィルタ本体２を有し、フィルタ本体２には、フィルタ本体２の上面のウェル形成領域に、開口する多数のウェル３が形成されている。ウェル形成領域とは、フィルタ本体２のフィルタとして使用される領域を示し、フィルタ本体２はウェル形成領域の周囲に、フィルタを支持するための、ウェルが形成されていない支持領域等を有していてもよい。
［第１実施形態］
図１および図２は、ウェルアレイフィルターの第１実施形態を示す平面拡大図および断面拡大図である。このウェルアレイフィルター１は、一定の厚さで平板状のフィルタ本体２を有し、フィルタ本体２には、フィルタ本体２の上面のウェル形成領域に、開口する多数のウェル３が形成されている。ウェル形成領域とは、フィルタ本体２のフィルタとして使用される領域を示し、フィルタ本体２はウェル形成領域の周囲に、フィルタを支持するための、ウェルが形成されていない支持領域等を有していてもよい。
【0030】
互いに隣接するウェル３同士の間は、ウェル隔壁６によりそれぞれ仕切られている。個々のウェル３の下端には、図２に示すように平板状のウェル底部４がそれぞれ形成され、ウェル３の下端を塞いでいる。ウェル３の開口部は円形や楕円形でもよいが、好ましい実施形態では多角形状もしくは角が丸められた多角形状をなしている。特に、この実施形態では、ウェル３は正六角形状をなし、各ウェル３およびウェル隔壁６は、ハニカム状に配列されている。倒立顕微鏡でウェル３内の細胞Ｃ等の粒子をウェル底部４を通して観察できるように、少なくともウェル底部４は透明な材質で形成されている。ウェル隔壁６も透明な材質で形成されていてもよいが、不透明な材質で形成することも可能である。
【0031】
ウェル３の開口部の円相当径は限定はされないが、５μｍ以上２００μｍ以下にされていることが好ましい。円相当径とは、ウェル３の開口部と面積が等しい円の直径を示す。ウェル３の開口部の円相当径が５μｍ以上であると、細胞またはビーズ等の粒子を捕捉することが可能となり、２００μｍ以下であると、細胞またはビーズ等の粒子を各ウェル３に一つまたは適切な一定数ずつ、捕捉することが容易になる。ウェル３の開口部の円相当径は、ウェル３で細胞を一つずつ捕捉できるように、より好ましくは１０μｍ以上１００μｍ以下であってもよく、さらに好ましくは１５μｍ以上６０μｍ以下であってもよい。
【0032】
なお、ビーズとは、細胞の成分や分泌物を付着させて分析に供するための、樹脂などからなる粒子である。細胞の特定の分泌物を捕捉・検出するための成分を表面に結合したビーズをウェル３内に生細胞とともに入れて、特定の分泌物を分泌する生細胞を同定する、あるいは、細胞の構成成分を捕捉するための成分を表面に結合したビーズと細胞をウェル３内に入れ、細胞を破壊して内容物をビーズに捕捉し、これをウェル３の外に回収して、ビーズに捕捉された内容物を調べることができる。また、光などの外部刺激で薬剤等を放出するような成分をビーズの表面に結合させて、ウェル３に細胞とビーズを共に入れ、光照射で薬剤を放出して、細胞の薬剤応答を見ることも可能である。また、磁気を帯びたビーズを使用して、ウェルアレイフィルター１の下方に配置された磁石でビーズを吸い寄せて、ウェル３に捕捉する場合もある。
【0033】
ウェル底部４のそれぞれには、フィルタ本体２の下面に達する貫通孔８が複数ずつ形成されている。この実施形態では、貫通孔８の数はウェル３毎に２つであり、図３に示すように、ウェル底部４の中央に、互いの中心間の間隔Ｗを開けて、ウェル底部４を垂直に貫通して形成されている。本発明では貫通孔８の数は限定されず、３個でも、４個以上であってもよいが、ウェル底部４に貫通孔８を複数形成した場合は、十分な流量を確保した場合にも細胞Ｃが貫通孔８を通り抜けにくい利点があるとともに、ウェル底部４の中心から外れた位置に少なくとも一部の貫通孔８が形成されるため、細胞Ｃによって全ての貫通孔８が閉塞されることが少なく、細胞Ｃが捕捉された後も貫通孔８を通じてウェル３内の液体を適度に流通させることが容易である。
【0034】
貫通孔８の上面開口部の最小幅は１μｍ以上３．５μｍ以下にされている。同時に、ウェル形成領域の面積に対する貫通孔８の合計開口面積の比率は、０．５％以上３．５％以下にされている。これにより、捕捉すべき細胞またはビーズ等の粒子が貫通孔を通過することを抑制しつつ、ウェルアレイフィルター全体としての流量は確保できる。
【0035】
貫通孔８の上面開口部の最小幅とは、貫通孔８を平面視した場合に貫通孔８の開口部の幅が最も狭くなっている箇所の幅を意味し、例えば、貫通孔８が円径であれば直径、楕円であれば短径、長方形であれば短辺の長さを意味する。貫通孔８の上面開口部の最小幅はより好ましくは２μｍ以上３．５μｍ以下であってもよく、さらに好ましくは２μｍ以上２．７５μｍ以下であってもよい。
【0036】
貫通孔８の合計開口面積とは、ウェル形成領域内に形成されている全ての貫通孔８の開口面積（＝流路断面積）の合計値である。貫通孔８の合計開口面積の比率が０．５０％以上であると、貫通孔８を通過する流液抵抗が適度に小さくなるため、ピペットの操作でウェルアレイフィルター１に通液することが容易である。貫通孔８の合計開口面積の比率が３．５％以下であると、ピペットの操作でウェルアレイフィルター１に通液する際に、液体サンプルが流れすぎることがなく、操作性に優れる。前記貫通孔８の合計開口面積の比率は、より好ましくは０．７５％以上３．２０％以下であってもよい。
【0037】
本実施形態では、図３（ａ）および（ｂ）に示すように、各ウェル底部４に形成されている貫通孔８の全てを囲む最小外接円Ｇ１を仮定し、この最小外接円Ｇ１の中心を複数の貫通孔８のいずれの中心Ｃ１、Ｃ２に移動させた場合にも、移動後の最小外接円Ｇ２は貫通孔８の全てに対し少なくとも部分的に重なる位置関係を満たしている。例えば、図３（ａ）は、最小外接円Ｇ１の中心を一方の貫通孔８の中心Ｃ２に移動させた場合を示し、中心Ｃ１を有する左側の貫通孔８と、移動後の最小外接円Ｇ２が重複部分Ｊで重複している。図示していないが、最小外接円Ｇ１の中心を他方の貫通孔８の中心Ｃ１に移動させた場合にも、中心Ｃ２を有する右側の貫通孔８と、移動後の最小外接円Ｇ２が同形状の重複部分Ｊを以て重複する。
【0038】
図３（ｂ）に示す実施例は、貫通孔８の中心Ｃ１－Ｃ２間の距離を一定に保ち、図３（ａ）の場合よりも貫通孔８の直径Ｄを小さくした場合において、最小外接円Ｇ１の中心を一方の貫通孔８の中心Ｃ２に移動させた場合を示し、中心Ｃ１を有する貫通孔８と、移動後の最小外接円Ｇ２が重複部分Ｊで接している。
図３（ｃ）に示す比較例は、図３（ｂ）よりさらに貫通孔８の直径Ｄを小さくした場合であり、貫通孔８の直径Ｄが小さいため、中心Ｃ１を有する貫通孔８と、移動後の最小外接円Ｇ２が重複せずに離れている。よって、本発明に必要な関係を満たさない。
図３（ｃ）に示す比較例は、図３（ｂ）よりさらに貫通孔８の直径Ｄを小さくした場合であり、貫通孔８の直径Ｄが小さいため、中心Ｃ１を有する貫通孔８と、移動後の最小外接円Ｇ２が重複せずに離れている。よって、本発明に必要な関係を満たさない。
【0039】
図３のように、２つの貫通孔８が円形かつ互いに同径である場合には、貫通孔８の直径Ｄと、貫通孔８の中心間距離Ｗが次式を満たす場合に、前記関係を満たし、重複部分Ｊが生じる。
Ｄ＞Ｗ／２
図３（ａ）および（ｂ）のように、貫通孔８の直径Ｄと貫通孔８の中心間距離Ｗが前記式を満たすことにより、ウェル３内に細胞Ｃ等の粒子が一つ捕獲された際に、この細胞Ｃ等の粒子が複数の貫通孔８の全てに対し少なくとも部分的に重なる確率が高い。よって、一つ目の細胞Ｃ等の粒子が捕獲された後は、そのウェル３内の全ての貫通孔８を通過する分散媒の流量が適度に低下し、流れに乗って２つ目以降の細胞Ｃ等の粒子がウェル３内に入ってくることが抑制され、隣接する空のウェル３に細胞Ｃ等の粒子が導かれて捕捉される確率が高まる。これにより、多くのウェル３内に一つずつ細胞Ｃ等の粒子が捕獲される確率が高くなる。
Ｄ＞Ｗ／２
図３（ａ）および（ｂ）のように、貫通孔８の直径Ｄと貫通孔８の中心間距離Ｗが前記式を満たすことにより、ウェル３内に細胞Ｃ等の粒子が一つ捕獲された際に、この細胞Ｃ等の粒子が複数の貫通孔８の全てに対し少なくとも部分的に重なる確率が高い。よって、一つ目の細胞Ｃ等の粒子が捕獲された後は、そのウェル３内の全ての貫通孔８を通過する分散媒の流量が適度に低下し、流れに乗って２つ目以降の細胞Ｃ等の粒子がウェル３内に入ってくることが抑制され、隣接する空のウェル３に細胞Ｃ等の粒子が導かれて捕捉される確率が高まる。これにより、多くのウェル３内に一つずつ細胞Ｃ等の粒子が捕獲される確率が高くなる。
【0040】
全ての重複部分Ｊのうち最も重複面積が小さい重複部分Ｊの最大幅は、最小外接円Ｇ１の半径の０．７％以上であってもよい。最大幅は移動前後の最小外接円Ｇ１，Ｇ２の中心Ｃ１，Ｃ２同士を結ぶ直線に沿う値とする。最大幅は最小外接円Ｇ１の半径の０．５％以上、１％以上、２％以上、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、３０％以上のいずれかであってもよい。貫通孔８の形状が図３のように円形である場合であって、重複部分Ｊの最大幅が最小外接円Ｇ１の半径の０．７％である場合には、全ての重複部分Ｊのうち最も重複面積が小さい重複部分Ｊの重複面積は、貫通孔８の開口面積の０．０２５％に該当する。同様に、重複部分Ｊの重複面積が、貫通孔８の開口面積の０．０５％、０．１０％、０．２５％、０．５０％、１．００％である場合、最も重複面積が小さい重複部分Ｊの最大幅は最小外接円Ｇ１の半径の１．１２％、１．８０％、３．３２％、５．２０％、８．２６％にそれぞれ該当する。貫通孔８の形状が円形以外のいかなる形状の場合であっても、全ての重複部分Ｊのうち最も重複面積が小さい重複部分Ｊの重複面積は、貫通孔８の開口面積の０．０２５％、０．０５％、０．１０％、０．２５％、０．５０％、または１．００％であってもよい。以下の実施形態の全てにこの段落の記述を援用する。
【0041】
一方、図３（ｃ）に示す比較例では、貫通孔８の直径Ｄと貫通孔８の中心間距離Ｗが式（１）を満たさず、中心Ｃ１を有する貫通孔８と、移動後の最小外接円Ｇ２が重複していないため、ウェル３内に細胞Ｃ等の粒子が一つ捕獲された際に、この細胞Ｃ等の粒子が何れか一方の貫通孔８に対し重ならない確率が高い。よって、一つ目の細胞Ｃ等の粒子が捕獲された後も、細胞Ｃ等の粒子と重なっていない貫通孔８を通過する分散媒の流量が依然として多く、流れに乗って２つ目以降の細胞Ｃ等の粒子がウェル３内に入って可能性が高い。これにより、シングルセル率が低下する。
【0042】
最小外接円Ｇ１の直径は限定はされないが、３μｍ以上３０μｍ以下が好ましく、５μｍ以上２０μｍ以下がより好ましい。隣り合う貫通孔８を隔てる部分の最小幅は限定されないが、０．５μｍ以上１０μｍ以下が好ましく、１μｍ以上３μｍ以下が、貫通孔８を小さい最小外接円Ｇ１の内側に収めるために、特に好ましい。
【0043】
ウェル隔壁６の水平方向の最大厚さＢ（図１参照）は限定されないが、１μｍ以上２０μｍ以下であることが好ましい。最大厚さＢが１μｍ以上であることにより、ウェル隔壁６の強度を適切にすることができ、例えばピペットをウェル隔壁６の上面に当てて細胞Ｃを吸う場合などに、ウェル隔壁６が崩れてしまうことを防止できる。また、最大厚さＢが２０μｍ以下であることにより、ウェル隔壁６の上に細胞やビーズ等の捕捉すべき粒子が留まってしまうことが抑制でき、ウェル３の密度も高めることができる。また、ピペットを当てたときにウェル隔壁６に適度な可撓性をもたらすことができ、ピペットの先端の破損を抑制することができる。ウェル隔壁６の最大厚さＢは、好ましくは２μｍ以上２０μｍ以下であってもよく、さらに好ましくは２μｍ以上１２μｍ以下であってもよい。
【0044】
ウェル形成領域の面積に対する、ウェル３の合計開口面積の比率は限定されないが、４０％以上とされていることが好ましい。この比率が４０％以上であると、ウェルアレイフィルター１に供給される細胞等の粒子のうち、ウェル３内に捕捉される粒子の割合、すなわち粒子捕捉率を十分に高めることができる。ウェル形成領域の面積に対するウェル３の合計開口面積の比率は、好ましくは４０％以上９５％以下であってもよく、さらに好ましくは４０％以上７５％以下であってもよい。前記比率が高いということは、ウェル隔壁６が薄いということに繋がる。
【0045】
ウェル３の深さとウェル隔壁６の水平方向の最大厚さＢとの比は限定されないが、ウェル３の深さはウェル隔壁６の厚さＢの２倍以上であることが好ましい。ウェル３の深さがウェル隔壁６の厚さＢの２倍以上であると、ウェル３内に捕捉された細胞Ｃ等の粒子が、液体の流れの乱れ等によりウェル３外に抜け出てしまうことが抑制できるから、いったん捕捉された粒子は安定的にウェル３内に保持することができる。より好ましくはウェル３の深さがウェル隔壁６の厚さＢの２倍以上４０倍以下であってもよく、さらに好ましくは２倍以上１５倍以下であってもよい。
【0046】
貫通孔８の平面視形状は、この実施形態では円であるが、本発明は円に限定されず、楕円形、三角形、四角形、五角形、六角形などの多角形、角の丸められた多角形、長方形、星形、スリット、鉄アレイ形状、Ｈ型、その他不定形などいかなる形状であってもよい。変形例については後述する。
【0047】
ウェル３の平面視形状は本発明では限定されず、円形または楕円形であってもよいが、多角形状または角を丸められた多角形状であれば、自動画像解析の際に粒子とウェル３とを識別することが容易である。多角形状の中でも、三角形状、四角形状、または図示のように六角形状のいずれかであることが好ましい。三角形状、四角形状、または六角形状であると、同一形状のウェル３を規則的に配列してウェル３の配列密度を高めることが可能である。中でも、正三角形状、正四角形状、または正六角形状であると、幾何学的に単純な配列で、ウェル３の配列密度を高めることが可能であるから好ましい。変形例については後述する。
【0048】
ウェル隔壁６とウェル底部４は、互いに同じ材質で形成されていてもよいが、好ましくは、互いに異なる材質で形成され、ウェル底部４はウェル隔壁６よりも強度の高い材質で形成されていてもよい。この場合、ウェルアレイフィルター１全体の強度を高めつつ、ウェル底部４の成形時の収縮を緩和してウェルアレイフィルター１の反りや歪を低減できる。ウェルアレイフィルター１に反りが無いことは、ウェル３に捕捉された粒子を倒立顕微鏡で観察する際に観察範囲全面に焦点を合わせるために重要である。
【0049】
ウェル隔壁６とウェル底部４の材質は限定されないが、その微細構造を実現するために各種フォトレジストで形成されていてもよく、フォトレジストの種類や組成を変える、および／または露光条件を変えることにより、ウェル底部４はウェル隔壁６よりも強度の高い材質で形成することが好ましい。ウェル隔壁６とウェル底部４をフォトレジストで形成する場合、例えば、ウェル隔壁６を形成する隔壁レジスト６Ａ（図１３参照）を多官能エポキシ量が相対的に少ないフォトレジストで形成し、ウェル底部４を形成する底部レジスト４Ａ（図１３参照）を多官能エポキシ量が相対的に多いフォトレジストで形成し、ウェル底部４の材質の強度をウェル隔壁６の材質の強度よりも高めることが可能である。この場合、ウェル隔壁６の材質の自家蛍光が相対的に弱く、ウェル底部４の材質の自家蛍光が相対的に強くなりはするが、ウェル底部４の厚さは小さいため、倒立顕微鏡による観察に悪影響を与えることはない。
【0050】
本発明ではウェル底部４とウェル隔壁６の形成方法は限定されないが、ウェルアレイフィルター１の応力を緩和するために、好ましくは、ウェル隔壁６とウェル底部４は互いに別々に形成され、ウェル底部４はそれぞれウェル３の開口部の形状に対応したタイル形状に分割され、隣接するウェル底部４の間には間隙が形成され、これら間隙内にウェル隔壁６を形成する材料が侵入して固化している構造とされてもよい。具体的な製造方法の一例を後述する。このようなタイル状にウェル底部４が分割されて、ウェル隔壁６がウェル底部４の間隙に侵入する構造でウェルアレイフィルター１を形成することにより、ウェル底部４の固化収縮のためにウェルアレイフィルター１に反りや歪が生じることを一層抑制できる。
【0051】
本発明では必須ではないが、ウェル３の内面の少なくとも一部に、細胞接着を抑制するポリマーが予め塗布されていてもよい。この場合、ウェル３の内面に塗布されたポリマーが細胞Ｃの接着を抑制するから、ウェル３からの細胞Ｃまたは粒子の取り出しが容易になる。この種のポリマーとしては、例えば、ＭＰＣポリマー（２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンポリマー）、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ＰＶＡ（ポリビニルアルコール）、ＰＭＥＡ（ポリ（２－メトキシエチルアクリレート））、およびこれらの混合物が採用できる。ポリマーの塗布位置はウェル３の内面だけでなく、ウェル隔壁６の上面、貫通孔８の内面、フィルタ本体２の下面にも前記ポリマーを塗布してもよい。その場合、ウェル隔壁６の上面に細胞等が付着したり、フィルタ本体２の下面に細胞等が付着したりする問題を抑制できる。
【0052】
本発明では限定されないが、ウェル底部４の厚さは１ｎｍ以上２μｍ以下であってもよい。この場合、ウェル底部４が十分に薄いために、倒立顕微鏡でウェル３内の細胞Ｃ等の粒子の捕捉物をウェル底部４を通して観察しやすい上に、ウェル底部４が薄い分、ウェル底部４の自家蛍光が小さく抑えられ、自家蛍光による観察への悪影響も低減できる。ウェル底部４の厚さはより好ましくは１００ｎｍ以上２μｍ以下であってもよく、さらに好ましくは５００ｎｍ以上１．５μｍ以下であってもよい。
【0053】
前記構成からなるウェルアレイフィルター１によれば、貫通孔８の最小幅およびウェル形成領域の面積に対する貫通孔８の合計開口面積の比率が適切であるから、捕捉すべき細胞Ｃ等の粒子が貫通孔８を通過することを抑制しつつ、ウェルアレイフィルター１全体としての流量が確保できる。また、各ウェル底部４に形成されている複数の貫通孔８が前記位置関係（式（１））を満たすことにより、ウェル３内に細胞Ｃ等の粒子が一つ捕獲された際に、この粒子が複数の貫通孔８の全てに対し少なくとも部分的に重なる確率が高い。
【0054】
よって、図２に示すように、一つ目の粒子が捕獲された後は、そのウェル３内の全ての貫通孔８を通過する分散媒の流量が適度に低下し、流れに乗って２つ目以降の粒子が同じウェル３内に入ってくることが抑制され、むしろ、隣接する空のウェル３に細胞Ｃ等が導かれて捕捉される確率が高まる。これにより、多くのウェル３内に一つずつ粒子が捕獲される確率が高く、すなわち捕獲率およびシングルセル率がいずれも高く、かつ通液性が良好であり、各ウェルでの粒子の単離が効率よく安定して行えるという優れた効果を奏する。
【0055】
また、この実施形態では、ウェル３間のウェル隔壁６が十分に薄いため、ウェル隔壁６上に細胞やビーズ等の粒子が残留しにくいうえ、開口径の適切な設定により複数の粒子が一つのウェル３の中に進入する率も減らすことができ、開口径に比して十分に深さのあるウェル３で粒子を安定的に捕捉できる。また、ウェル３が多角形状であるから自動画像解析の際に粒子とウェル３とを識別することが容易であり、さらに高密度にウェル３を配置できるため多数の粒子を一度にスクリーニングできる利点を有する。
【0056】
［ウェルアレイフィルターの第２実施形態］
図４は、ウェルアレイフィルター１の各ウェル底部４の貫通孔８の数が二つである場合に貫通孔８の形状の変形例を示す。
図４（ａ）は第２実施形態であり、貫通孔８が矩形状をなし、互いの２辺がそれぞれ同一線上に並ぶように平行に配置されている。矩形の角は丸みを帯びているが、丸みを帯びていなくてもよい。最小外接円Ｇ１は各貫通孔８の外側の２頂点を通過して各貫通孔８に外接している。貫通孔８の中心Ｃ１，Ｃ２は、貫通孔８が互いに向かい合う方向に延びる最小外接円Ｇ１の直径Ｓと、貫通孔８の開口縁が交差する２点の中心と定義する。他の実施形態においても同様である。
図４は、ウェルアレイフィルター１の各ウェル底部４の貫通孔８の数が二つである場合に貫通孔８の形状の変形例を示す。
図４（ａ）は第２実施形態であり、貫通孔８が矩形状をなし、互いの２辺がそれぞれ同一線上に並ぶように平行に配置されている。矩形の角は丸みを帯びているが、丸みを帯びていなくてもよい。最小外接円Ｇ１は各貫通孔８の外側の２頂点を通過して各貫通孔８に外接している。貫通孔８の中心Ｃ１，Ｃ２は、貫通孔８が互いに向かい合う方向に延びる最小外接円Ｇ１の直径Ｓと、貫通孔８の開口縁が交差する２点の中心と定義する。他の実施形態においても同様である。
【0057】
第２実施形態においても、各ウェル底部４に形成されている貫通孔８の全てを囲む最小外接円Ｇ１を仮定し、この最小外接円Ｇ１の中心を貫通孔８のいずれの中心Ｃ１、Ｃ２に移動させた場合にも、移動後の最小外接円Ｇ２は貫通孔８の全てに対し少なくとも部分的に重なる位置関係を満たしている。図４（ａ）は、最小外接円Ｇ１の中心を一方の貫通孔８の中心Ｃ２に移動させた場合を示し、中心Ｃ１を有する左側の貫通孔８と、移動後の最小外接円Ｇ２が重複部分Ｊで重複している。これにより、第１実施形態と同じ効果が得られる上、貫通孔８が矩形状であるから、円である場合に比して開口面積の割に最大内接円の径が小さく、細胞Ｃ等が通り抜ける可能性が低下する。第２実施形態の他の構成は、第１実施形態と同様でよく、前述の説明を援用する。
【0058】
［ウェルアレイフィルターの第３実施形態］
図４（ｂ）は第３実施形態であり、貫通孔８が楕円形状または長円形状をなし、互いの短径（長径でもよい）がそれぞれ同一線上に並ぶように配置されている。最小外接円Ｇ１は各貫通孔８の外側の１点を通過して各貫通孔８に外接している。貫通孔８の中心Ｃ１，Ｃ２は、貫通孔８が互いに向かい合う方向に延びる最小外接円Ｇ１の直径Ｓと、貫通孔８の開口縁が交差する２点の中心である。
図４（ｂ）は第３実施形態であり、貫通孔８が楕円形状または長円形状をなし、互いの短径（長径でもよい）がそれぞれ同一線上に並ぶように配置されている。最小外接円Ｇ１は各貫通孔８の外側の１点を通過して各貫通孔８に外接している。貫通孔８の中心Ｃ１，Ｃ２は、貫通孔８が互いに向かい合う方向に延びる最小外接円Ｇ１の直径Ｓと、貫通孔８の開口縁が交差する２点の中心である。
【0059】
第３実施形態においても、各ウェル底部４に形成されている貫通孔８の全てを囲む最小外接円Ｇ１を仮定し、この最小外接円Ｇ１の中心を貫通孔８のいずれの中心Ｃ１、Ｃ２に移動させた場合にも、移動後の最小外接円Ｇ２は貫通孔８の全てに対し少なくとも部分的に重なる位置関係を満たしている。図４（ｂ）は、最小外接円Ｇ１の中心を一方の貫通孔８の中心Ｃ２に移動させた場合を示し、中心Ｃ１を有する左側の貫通孔８と、移動後の最小外接円Ｇ２が重複部分Ｊで重複している。これにより、第１実施形態と同じ効果が得られる上、貫通孔８が楕円形であるから、円である場合に比して開口面積の割に最大内接円の径が小さく、細胞Ｃ等が通り抜ける可能性が低下する。第３実施形態の他の構成は、第１実施形態と同様でよく、前述の説明を援用する。
【0060】
［ウェルアレイフィルターの第４実施形態］
図４（ｃ）は第４実施形態であり、貫通孔８が三角形状、好ましくは二等辺三角形をなし、互いの底辺を平行に対向させて配置されている。三角形の角は丸みを帯びているが、丸みを帯びていなくてもよい。最小外接円Ｇ１は各貫通孔８の外側の頂点を通過して各貫通孔８に外接している。貫通孔８の中心Ｃ１，Ｃ２は、貫通孔８が互いに向かい合う方向に延びる最小外接円Ｇ１の直径Ｓと、貫通孔８の開口縁が交差する２点の中心である。
図４（ｃ）は第４実施形態であり、貫通孔８が三角形状、好ましくは二等辺三角形をなし、互いの底辺を平行に対向させて配置されている。三角形の角は丸みを帯びているが、丸みを帯びていなくてもよい。最小外接円Ｇ１は各貫通孔８の外側の頂点を通過して各貫通孔８に外接している。貫通孔８の中心Ｃ１，Ｃ２は、貫通孔８が互いに向かい合う方向に延びる最小外接円Ｇ１の直径Ｓと、貫通孔８の開口縁が交差する２点の中心である。
【0061】
第４実施形態においても、各ウェル底部４に形成されている貫通孔８の全てを囲む最小外接円Ｇ１を仮定し、この最小外接円Ｇ１の中心を貫通孔８のいずれの中心Ｃ１、Ｃ２に移動させた場合にも、移動後の最小外接円Ｇ２は貫通孔８の全てに対し少なくとも部分的に重なる位置関係を満たしている。図４（ｃ）は、最小外接円Ｇ１の中心を一方の貫通孔８の中心Ｃ２に移動させた場合を示し、中心Ｃ１を有する左側の貫通孔８と、移動後の最小外接円Ｇ２が重複部分Ｊで重複している。これにより、第１実施形態と同じ効果が得られる上、貫通孔８が三角形であるから、円である場合に比して開口面積の割に最大内接円の径が小さく、細胞Ｃ等が通り抜ける可能性が低下する。また、三角形の底辺を向かい合わせて配置しているので、重複部分Ｊの面積が大きくしやすく、細胞Ｃ等が載った時の流路閉塞率を高めることができる。第４実施形態の他の構成は、第１実施形態と同様でよく、前述の説明を援用する。
【0062】
［ウェルアレイフィルターの第５実施形態］
図５は、ウェルアレイフィルター１の各ウェル底部４の貫通孔８の数が二つである場合に貫通孔８の形状を細長くした変形例を示す。
図５（ａ）は第５実施形態であり、貫通孔８が細長い矩形状をなし、互いの２つの短辺がそれぞれ同一線上に並ぶように平行に配置されている。矩形の角は丸みを帯びているが、丸みを帯びていなくてもよい。最小外接円Ｇ１は各貫通孔８の外側の２頂点を通過して各貫通孔８に外接している。貫通孔８の中心Ｃ１，Ｃ２は、貫通孔８が互いに向かい合う方向に延びる最小外接円Ｇ１の直径Ｓと、貫通孔８の開口縁が交差する２点の中心である。
図５は、ウェルアレイフィルター１の各ウェル底部４の貫通孔８の数が二つである場合に貫通孔８の形状を細長くした変形例を示す。
図５（ａ）は第５実施形態であり、貫通孔８が細長い矩形状をなし、互いの２つの短辺がそれぞれ同一線上に並ぶように平行に配置されている。矩形の角は丸みを帯びているが、丸みを帯びていなくてもよい。最小外接円Ｇ１は各貫通孔８の外側の２頂点を通過して各貫通孔８に外接している。貫通孔８の中心Ｃ１，Ｃ２は、貫通孔８が互いに向かい合う方向に延びる最小外接円Ｇ１の直径Ｓと、貫通孔８の開口縁が交差する２点の中心である。
【0063】
第５実施形態においても、各ウェル底部４に形成されている貫通孔８の全てを囲む最小外接円Ｇ１を仮定し、この最小外接円Ｇ１の中心を貫通孔８のいずれの中心Ｃ１、Ｃ２に移動させた場合にも、移動後の最小外接円Ｇ２は貫通孔８の全てに対し少なくとも部分的に重なる位置関係を満たしている。図５（ａ）は、最小外接円Ｇ１の中心を一方の貫通孔８の中心Ｃ２に移動させた場合を示し、中心Ｃ１を有する左側の貫通孔８と、移動後の最小外接円Ｇ２が重複部分Ｊで重複している。これにより、第１実施形態と同じ効果が得られる上、貫通孔８が細長い矩形状であるから、円である場合に比して開口面積の割に最大内接円の径が小さく、細胞Ｃ等が通り抜ける可能性が低下する。また、矩形状の長辺を向かい合わせて配置しているので、重複部分Ｊの面積が大きくしやすく、細胞Ｃ等が載った時の流路閉塞率を高めることができる。第５実施形態の他の構成は、第１実施形態と同様でよく、前述の説明を援用する。
【0064】
［ウェルアレイフィルターの第６実施形態］
図５（ｂ）は第６実施形態であり、貫通孔８が半円状をなし、互いの弦を平行に向かい合わせて配置されている。半円の角は丸みを帯びているが、丸みを帯びていなくてもよい。最小外接円Ｇ１は各貫通孔８の外側の頂点を通過して各貫通孔８に外接している。貫通孔８の中心Ｃ１，Ｃ２は、貫通孔８が互いに向かい合う方向に延びる最小外接円Ｇ１の直径Ｓと、貫通孔８の開口縁が交差する２点の中心である。
図５（ｂ）は第６実施形態であり、貫通孔８が半円状をなし、互いの弦を平行に向かい合わせて配置されている。半円の角は丸みを帯びているが、丸みを帯びていなくてもよい。最小外接円Ｇ１は各貫通孔８の外側の頂点を通過して各貫通孔８に外接している。貫通孔８の中心Ｃ１，Ｃ２は、貫通孔８が互いに向かい合う方向に延びる最小外接円Ｇ１の直径Ｓと、貫通孔８の開口縁が交差する２点の中心である。
【0065】
第６実施形態においても、各ウェル底部４に形成されている貫通孔８の全てを囲む最小外接円Ｇ１を仮定し、この最小外接円Ｇ１の中心を貫通孔８のいずれの中心Ｃ１、Ｃ２に移動させた場合にも、移動後の最小外接円Ｇ２は貫通孔８の全てに対し少なくとも部分的に重なる位置関係を満たしている。図５（ｂ）は、最小外接円Ｇ１の中心を一方の貫通孔８の中心Ｃ２に移動させた場合を示し、中心Ｃ１を有する左側の貫通孔８と、移動後の最小外接円Ｇ２が重複部分Ｊで重複している。これにより、第１実施形態と同じ効果が得られる上、貫通孔８が半円状であるから、円である場合に比して開口面積の割に最大内接円の径が小さく、細胞Ｃ等が通り抜ける可能性が低下する。また、半円の弦を向かい合わせて配置しているので、重複部分Ｊの面積が大きくしやすく、細胞Ｃ等が載った時の流路閉塞率を高めることができる。第６実施形態の他の構成は、第１実施形態と同様でよく、前述の説明を援用する。
【0066】
［ウェルアレイフィルターの第７実施形態］
図５（ｃ）は第７実施形態であり、貫通孔８が半円状をなし、互いの弦を平行に向かい合わせて配置され、弦は円弧状に形成されて、いわゆるバナナ形状をなしている。半円の角は丸みを帯びているが、丸みを帯びていなくてもよい。最小外接円Ｇ１は各貫通孔８の外側の頂点を通過して各貫通孔８に外接している。貫通孔８の中心Ｃ１，Ｃ２は、貫通孔８が互いに向かい合う方向に延びる最小外接円Ｇ１の直径Ｓと、貫通孔８の開口縁が交差する２点の中心である。
図５（ｃ）は第７実施形態であり、貫通孔８が半円状をなし、互いの弦を平行に向かい合わせて配置され、弦は円弧状に形成されて、いわゆるバナナ形状をなしている。半円の角は丸みを帯びているが、丸みを帯びていなくてもよい。最小外接円Ｇ１は各貫通孔８の外側の頂点を通過して各貫通孔８に外接している。貫通孔８の中心Ｃ１，Ｃ２は、貫通孔８が互いに向かい合う方向に延びる最小外接円Ｇ１の直径Ｓと、貫通孔８の開口縁が交差する２点の中心である。
【0067】
第７実施形態においても、各ウェル底部４に形成されている貫通孔８の全てを囲む最小外接円Ｇ１を仮定し、この最小外接円Ｇ１の中心を貫通孔８のいずれの中心Ｃ１、Ｃ２に移動させた場合にも、移動後の最小外接円Ｇ２は貫通孔８の全てに対し少なくとも部分的に重なる位置関係を満たしている。図５（ｃ）は、最小外接円Ｇ１の中心を一方の貫通孔８の中心Ｃ２に移動させた場合を示し、中心Ｃ１を有する左側の貫通孔８と、移動後の最小外接円Ｇ２が重複部分Ｊで重複している。これにより、第１実施形態と同じ効果が得られる上、貫通孔８がバナナ形状であるから、円である場合に比して開口面積の割に最大内接円の径が小さく、細胞Ｃ等が通り抜ける可能性が低下する。また、バナナ形状の凹辺を向かい合わせて配置しているので、重複部分Ｊの面積が大きくしやすく、細胞Ｃ等が載った時の流路閉塞率を高めることができ、細胞Ｃを載置できる面積も大きくなる。第７実施形態の他の構成は、第１実施形態と同様でよく、前述の説明を援用する。
【0068】
［ウェルアレイフィルターの第８実施形態］
図６は、ウェル底部４の中央に合計３つの円形の貫通孔８を形成した場合を示している。
図６（ａ）は第８実施形態であり、この例では、ウェル底部４の中央に合計３つの円形の貫通孔８が形成されている。貫通孔８は正三角形の頂点位置にそれぞれ形成されていてもよいが、正三角形以外の二等辺三角形、直角三角形、不等辺三角形の頂点にそれぞれ形成されていてもよい。三角形に配列した場合は、三角形の内側、好ましくは重心位置にウェル底部４の中心が位置することが好ましい。第８実施形態の他の構成は、第１実施形態と同様でよく、前述の説明を援用する。
図６は、ウェル底部４の中央に合計３つの円形の貫通孔８を形成した場合を示している。
図６（ａ）は第８実施形態であり、この例では、ウェル底部４の中央に合計３つの円形の貫通孔８が形成されている。貫通孔８は正三角形の頂点位置にそれぞれ形成されていてもよいが、正三角形以外の二等辺三角形、直角三角形、不等辺三角形の頂点にそれぞれ形成されていてもよい。三角形に配列した場合は、三角形の内側、好ましくは重心位置にウェル底部４の中心が位置することが好ましい。第８実施形態の他の構成は、第１実施形態と同様でよく、前述の説明を援用する。
【0069】
第８実施形態においても、各ウェル底部４に形成されている貫通孔８の全てを囲む最小外接円Ｇ１を仮定し、この最小外接円Ｇ１の中心を３つの貫通孔８のいずれの中心に移動させた場合にも、移動後の最小外接円Ｇ２は貫通孔８の全てに対し少なくとも部分的に重なる位置関係を満たしている。図６（ａ）は、最小外接円Ｇ１の中心を一つの貫通孔８の中心Ｃ２に移動させた場合を示し、中心Ｃ１を有する右側の２つの貫通孔８と、移動後の最小外接円Ｇ２が重複部分Ｊで重複している。これにより、第１実施形態と同じ効果が得られる。また、３つの貫通孔８の中央に、細胞Ｃを載置するための比較的大きい面積を確保できる利点を有する。
【0070】
第８実施形態の貫通孔８の直径Ｄを小さくしていくと、図６（ｂ）のように最小外接円Ｇ１の中心を一つの貫通孔８の中心Ｃ２に移動させた場合に、中心Ｃ１を有する右側の２つの貫通孔８と、移動後の最小外接円Ｇ２が重複部分Ｊで接するようになり、さらに小さくすると、図６（ｃ）のように最小外接円Ｇ１の中心を一つの貫通孔８の中心Ｃ２に移動させた場合に、中心Ｃ１を有する右側の２つの貫通孔８と、移動後の最小外接円Ｇ２が重複しなくなる。したがって、図６（ｃ）は比較例となる。
【0071】
［ウェルアレイフィルターの第９実施形態］
図７は、ウェル底部４の中央に合計４つの貫通孔８が形成されている場合を示している。
図７（ａ）は第９実施形態であり、ウェル底部４の中央に合計４つの貫通孔８が形成されている。各貫通孔８は正方形の頂点位置にそれぞれ形成されていてもよいが、正方形以外の長方形、台形、不等辺四角形の頂点にそれぞれ形成されていてもよい。四角形に配列した場合は、四角形の内側、好ましくは重心位置にウェル底部４の中心が位置することが好ましい。また、３つの貫通孔８を三角形の頂点位置に配列し、三角形の内側もしくは３辺のいずれかの上に、４つ目の貫通孔８を配置してもよい。この場合、三角形は正三角形でもよいが、正三角形以外の二等辺三角形、直角三角形、不等辺三角形であってもよい。三角形に配列した場合は、三角形の内側、好ましくは重心位置にウェル底部４の中心が位置することが好ましい。第９実施形態の他の構成は、第１実施形態と同様でよく、前述の説明を援用する。
図７は、ウェル底部４の中央に合計４つの貫通孔８が形成されている場合を示している。
図７（ａ）は第９実施形態であり、ウェル底部４の中央に合計４つの貫通孔８が形成されている。各貫通孔８は正方形の頂点位置にそれぞれ形成されていてもよいが、正方形以外の長方形、台形、不等辺四角形の頂点にそれぞれ形成されていてもよい。四角形に配列した場合は、四角形の内側、好ましくは重心位置にウェル底部４の中心が位置することが好ましい。また、３つの貫通孔８を三角形の頂点位置に配列し、三角形の内側もしくは３辺のいずれかの上に、４つ目の貫通孔８を配置してもよい。この場合、三角形は正三角形でもよいが、正三角形以外の二等辺三角形、直角三角形、不等辺三角形であってもよい。三角形に配列した場合は、三角形の内側、好ましくは重心位置にウェル底部４の中心が位置することが好ましい。第９実施形態の他の構成は、第１実施形態と同様でよく、前述の説明を援用する。
【0072】
第９実施形態においても、各ウェル底部４に形成されている貫通孔８の全てを囲む最小外接円Ｇ１を仮定し、この最小外接円Ｇ１の中心を４つの貫通孔８のいずれの中心に移動させた場合にも、移動後の最小外接円Ｇ２は貫通孔８の全てに対し少なくとも部分的に重なる位置関係を満たしている。図７（ａ）は、最小外接円Ｇ１の中心を右にある貫通孔８の中心Ｃ２に移動させた場合を示し、左側の３つの貫通孔８と、移動後の最小外接円Ｇ２がそれぞれ重複部分Ｊで重複している。これにより、第１実施形態と同じ効果が得られる。また、３つの貫通孔８の中央に、細胞Ｃを載置するための比較的大きい面積を確保できる利点を有する。
【0073】
第９実施形態の貫通孔８の直径Ｄを小さくしていくと、図７（ｂ）のように最小外接円Ｇ１の中心を一つの貫通孔８の中心Ｃ２に移動させた場合に、中心Ｃ１を有する右側の２つの貫通孔８と、移動後の最小外接円Ｇ２が重複部分Ｊで接する。さらに小さくすると、図７（ｃ）のように最小外接円Ｇ１の中心を一つの貫通孔８の中心Ｃ２に移動させた場合に、中心Ｃ１を有する左側の貫通孔８と、移動後の最小外接円Ｇ２が重複しなくなる。したがって、図７（ｃ）は比較例となる。
【0074】
［ウェルアレイフィルターの他の比較例］
図８は、ウェル底部４の中央に合計７つの貫通孔８が形成された例である。
図８（ａ）～（ｃ）では、いずれも６つの貫通孔８が正六角形の頂点位置にそれぞれ形成され、７つ目の貫通孔８が正六角形の中央に形成されている。この配列であると、貫通孔８の開口径が共通である限り、図８のように最小外接円Ｇ１の中心を一つの貫通孔８の中心Ｃ２に移動させた場合に、中心Ｃ１を有する左側の貫通孔８と、移動後の最小外接円Ｇ２を重複させることができない。したがって、図８（ａ）～（ｃ）はいずれも比較例となる。
図８は、ウェル底部４の中央に合計７つの貫通孔８が形成された例である。
図８（ａ）～（ｃ）では、いずれも６つの貫通孔８が正六角形の頂点位置にそれぞれ形成され、７つ目の貫通孔８が正六角形の中央に形成されている。この配列であると、貫通孔８の開口径が共通である限り、図８のように最小外接円Ｇ１の中心を一つの貫通孔８の中心Ｃ２に移動させた場合に、中心Ｃ１を有する左側の貫通孔８と、移動後の最小外接円Ｇ２を重複させることができない。したがって、図８（ａ）～（ｃ）はいずれも比較例となる。
【0075】
［ウェルアレイフィルターの第１０実施形態］
図９は、ウェルアレイフィルター１の第１０実施形態を示し、この例では、ウェル底部４の中央に、二つの円形の貫通孔８をスリット８Ａでつないだ平面形状（鉄アレイ形状）の貫通孔８が形成されている。このような形状を有する貫通孔８の場合、貫通孔８の最大内接円直径が４μｍ以下である場合にも、スリット８Ａの分、貫通孔８の開口面積（流路断面積）を大きく確保することができ、細胞やビーズ等の粒子が貫通孔８Ａを通り抜けることを阻止しつつ、貫通孔８Ａの流量を大きくすることができる。この場合、ウェル底部４の中心が貫通孔８Ａ上に位置することが好ましい。第１０実施形態の他の構成は、第１実施形態と同様でよく、前述の説明を援用する。
図９は、ウェルアレイフィルター１の第１０実施形態を示し、この例では、ウェル底部４の中央に、二つの円形の貫通孔８をスリット８Ａでつないだ平面形状（鉄アレイ形状）の貫通孔８が形成されている。このような形状を有する貫通孔８の場合、貫通孔８の最大内接円直径が４μｍ以下である場合にも、スリット８Ａの分、貫通孔８の開口面積（流路断面積）を大きく確保することができ、細胞やビーズ等の粒子が貫通孔８Ａを通り抜けることを阻止しつつ、貫通孔８Ａの流量を大きくすることができる。この場合、ウェル底部４の中心が貫通孔８Ａ上に位置することが好ましい。第１０実施形態の他の構成は、第１実施形態と同様でよく、前述の説明を援用する。
【0076】
第１０実施形態においても、各ウェル底部４に形成されている貫通孔８の全てを囲む最小外接円Ｇ１を仮定し、この最小外接円Ｇ１の中心を各貫通孔８のいずれの中心に移動させた場合にも、移動後の最小外接円Ｇ２は貫通孔８の全てに対し少なくとも部分的に重なる位置関係を満たしている。図９（ａ）は、最小外接円Ｇ１の中心を右側にある貫通孔８の中心Ｃ２に移動させた場合を示し、左側の貫通孔８と、移動後の最小外接円Ｇ２が重複部分Ｊで重複している。これにより、第１実施形態と同じ効果が得られる。
【0077】
第１０実施形態の貫通孔８の直径Ｄを小さくしていくと、図９（ｂ）のように最小外接円Ｇ１の中心を一つの貫通孔８の中心Ｃ２に移動させた場合に、中心Ｃ１を有する右側の２つの貫通孔８と、移動後の最小外接円Ｇ２が重複部分Ｊで接する。さらに小さくすると、図９（ｃ）のように最小外接円Ｇ１の中心を一つの貫通孔８の中心Ｃ２に移動させた場合に、中心Ｃ１を有する左側の貫通孔８と、移動後の最小外接円Ｇ２が重複しなくなる。したがって、図９（ｃ）は比較例となる。
【0078】
［ウェルアレイフィルターの第１１実施形態］
図１０（ａ）および（ｂ）は、ウェルアレイフィルター１の第１１実施形態を示し、この例では、ウェル底部４の中央に、中心から放射状に延びる３本のスリット８Ａと、スリット８Ａの末端に形成された貫通孔８が形成されている。このようなスリット８Ａでつなげられた貫通孔８の場合には、最大内接円直径が小さくても、スリット８Ａの分、開口面積（流路断面積）を大きく確保することができる。この場合、ウェル底部４の中心が放射状のスリット８Ａの中心に位置することが好ましい。第１１実施形態の他の構成は、第１実施形態と同様でよく、前述の説明を援用する。
図１０（ａ）および（ｂ）は、ウェルアレイフィルター１の第１１実施形態を示し、この例では、ウェル底部４の中央に、中心から放射状に延びる３本のスリット８Ａと、スリット８Ａの末端に形成された貫通孔８が形成されている。このようなスリット８Ａでつなげられた貫通孔８の場合には、最大内接円直径が小さくても、スリット８Ａの分、開口面積（流路断面積）を大きく確保することができる。この場合、ウェル底部４の中心が放射状のスリット８Ａの中心に位置することが好ましい。第１１実施形態の他の構成は、第１実施形態と同様でよく、前述の説明を援用する。
【0079】
第１１実施形態においても、各ウェル底部４に形成されている貫通孔８の全てを囲む最小外接円Ｇ１を仮定し、この最小外接円Ｇ１の中心を各貫通孔８のいずれの中心に移動させた場合にも、移動後の最小外接円Ｇ２は貫通孔８の全てに対し少なくとも部分的に重なる位置関係を満たしている。図１０（ａ）および（ｂ）は、最小外接円Ｇ１の中心を右側にある貫通孔８の中心Ｃ２に移動させた場合を示し、左側の貫通孔８と、移動後の最小外接円Ｇ２が重複部分Ｊで重複している。これにより、第１実施形態と同じ効果が得られる。
【0080】
第１１実施形態の貫通孔８の直径Ｄをさらに小さくしていくと、図１０（ｃ）のように最小外接円Ｇ１の中心を一つの貫通孔８の中心Ｃ２に移動させた場合に、中心Ｃ１を有する左側の貫通孔８と、移動後の最小外接円Ｇ２が重複しなくなる。したがって、図１０（ｃ）は比較例となる。
【0081】
［ウェルアレイフィルターの第１２実施形態］
図１１は、ウェルアレイフィルター１の第１２実施形態を示し、この例では、ウェル隔壁６が正方眼形状に形成され、ウェル底部４はそれぞれ正方形に形成されていることを特徴とする。ウェル隔壁６は正方眼形状に限定されず、斜方眼形状であっても、直方眼形状であってもよいが、個々のウェル３の形状は互いに同一であることが好ましい。ウェル３を一列ごとに互い違いに配列してもよい。貫通孔８は、第１～第１１実施形態のいずれかと同様でよい。第１２実施形態の他の構成は、第１実施形態と同様でよく、前述の説明を援用する。この第１２実施形態においても、第１～第１１実施形態のそれぞれと同様の効果が得られる。
図１１は、ウェルアレイフィルター１の第１２実施形態を示し、この例では、ウェル隔壁６が正方眼形状に形成され、ウェル底部４はそれぞれ正方形に形成されていることを特徴とする。ウェル隔壁６は正方眼形状に限定されず、斜方眼形状であっても、直方眼形状であってもよいが、個々のウェル３の形状は互いに同一であることが好ましい。ウェル３を一列ごとに互い違いに配列してもよい。貫通孔８は、第１～第１１実施形態のいずれかと同様でよい。第１２実施形態の他の構成は、第１実施形態と同様でよく、前述の説明を援用する。この第１２実施形態においても、第１～第１１実施形態のそれぞれと同様の効果が得られる。
【0082】
［ウェルアレイフィルターの第１３実施形態］
図１２は、ウェルアレイフィルター１の第１３実施形態を示し、この例では、ウェル隔壁６が正三角形を交互に逆向きに並べた、いわゆるトラス形状に形成され、ウェル底部４はそれぞれ正三角形に形成されていることを特徴とする。ウェル隔壁６は正三角形状に限定されず、二等辺三角形状であっても、直角三角形形状であっても、不等辺三角形状であってもよいが、個々のウェル３の形状は互いに同一であることが好ましい。貫通孔８は、第１～第１１実施形態のいずれかと同様でよい。第１３実施形態の他の構成は、第１実施形態と同様でよく、前述の説明を援用する。この第１３実施形態においても、第１～第１２実施形態のそれぞれと同様の効果が得られる。
図１２は、ウェルアレイフィルター１の第１３実施形態を示し、この例では、ウェル隔壁６が正三角形を交互に逆向きに並べた、いわゆるトラス形状に形成され、ウェル底部４はそれぞれ正三角形に形成されていることを特徴とする。ウェル隔壁６は正三角形状に限定されず、二等辺三角形状であっても、直角三角形形状であっても、不等辺三角形状であってもよいが、個々のウェル３の形状は互いに同一であることが好ましい。貫通孔８は、第１～第１１実施形態のいずれかと同様でよい。第１３実施形態の他の構成は、第１実施形態と同様でよく、前述の説明を援用する。この第１３実施形態においても、第１～第１２実施形態のそれぞれと同様の効果が得られる。
【0083】
［ウェルアレイフィルターの製造方法の一実施形態］
図１３（ａ）～（ｆ）は、ウェルアレイフィルター１の製造方法の一例を示す断面図である。まず、図１３（ａ）に示すように、Ｓｉウェーハ等からなる基板１０上に、レジスト溶媒および現像液に溶解しない犠牲膜１２を形成する。犠牲膜１２は例えばスチレン系エラストマー、デキストリン、またはデキストラン等から形成することができる。
図１３（ａ）～（ｆ）は、ウェルアレイフィルター１の製造方法の一例を示す断面図である。まず、図１３（ａ）に示すように、Ｓｉウェーハ等からなる基板１０上に、レジスト溶媒および現像液に溶解しない犠牲膜１２を形成する。犠牲膜１２は例えばスチレン系エラストマー、デキストリン、またはデキストラン等から形成することができる。
【0084】
次に、図１３（ｂ）に示すように、犠牲膜１２上に、ネガ型の底部レジスト４Ａを、ウェル底部４として必要な一定の厚さに形成する。底部レジスト４Ａを所定のパターンで光リソグラフィーにより露光し、さらに現像を行って、図１３（ｃ）に示すように、貫通孔８を有するウェル底部４が、多角形のタイル状をなして、互いに間隙１４を空けて配列された状態とする。間隙１４の幅はウェル隔壁６の厚さよりも若干小さい程度とされる。また、ウェル底部４同士の間隙１４は、部分的に細いブリッジで架橋された状態としてもよい。その場合、ブリッジによりウェル底部４同士の配列が乱れないように位置決めできる。
【0085】
次に、図１３（ｄ）に示すように、ウェル底部４を覆う隔壁レジスト６Ａをウェル隔壁６として必要な厚さに形成する。この時、例えば、隔壁レジスト６Ａを多官能エポキシ量が相対的に少ないフォトレジストで形成し、底部レジスト４Ａを多官能エポキシ量が相対的に多いフォトレジストで形成し、ウェル底部４の材質の強度をウェル隔壁６の材質の強度よりも相対的に高めることが好ましい。この場合、副次効果として、ウェル隔壁６の材質の自家蛍光が相対的に弱く、ウェル底部４の材質の自家蛍光が相対的に強くなりはするが、ウェル底部４の厚さは小さいため、倒立顕微鏡による観察に悪影響を与えることはない。隔壁レジスト６Ａに所定のパターンで光リソグラフィーにより露光し、さらに現像を行って、図１３（ｅ）に示すように、ウェル隔壁６を形成する。これにより、間隙１４の内部には隔壁レジスト６Ａが侵入し、露光により間隙１４内で不溶化され、ウェル底部４同士を連結する。
【0086】
次に、ウェル底部４およびウェル隔壁６の全体を例えば１８０℃に加熱し、レジストをさらに熱硬化させたのち、レジストを変質させない溶媒で犠牲膜１２を溶解し、基板１０をウェル底部４から剥離して、前記第１～第１３実施形態に示すようなウェルアレイフィルター１が完成する。
【0087】
前記製造方法によれば、形状精度の高いウェル３を有するウェルアレイフィルター１が効率よく製造できる。また、この製造方法によれば、ウェル底部４がタイル形状に分割されて相互に間隙１４が形成された状態としたのち、ウェル隔壁６を形成して間隙１４内にウェル隔壁６を形成する材料を侵入固化させるため、ウェル底部４の固化収縮のためにウェルアレイフィルター１に生じる反りや歪を低減できる。
【0088】
［粒子整列デバイスの実施形態］
図１４および図１５は、本発明に係る粒子整列デバイスの一実施形態４０を示す平面図および縦断面図である。この粒子整列デバイス４０は、長方形状の底板部４２と、底板部４２の中央部に形成された壁部４４とを有する。壁部４４は、底板部４２から起立する四角い枠状の周壁部と、この周壁部の内側に起立して互いに平行に形成された２枚の隔壁を有し、周壁部の内側が隔壁により、第１室４６、第２室４８、および第３室５０に区画されている。第１室４６の底部には円筒状の開口部５２が形成され、第３室５０の底部にも円筒状の開口部５４が形成されている。
図１４および図１５は、本発明に係る粒子整列デバイスの一実施形態４０を示す平面図および縦断面図である。この粒子整列デバイス４０は、長方形状の底板部４２と、底板部４２の中央部に形成された壁部４４とを有する。壁部４４は、底板部４２から起立する四角い枠状の周壁部と、この周壁部の内側に起立して互いに平行に形成された２枚の隔壁を有し、周壁部の内側が隔壁により、第１室４６、第２室４８、および第３室５０に区画されている。第１室４６の底部には円筒状の開口部５２が形成され、第３室５０の底部にも円筒状の開口部５４が形成されている。
【0089】
第２室４８の底は開いており、図１５に示すように、ウェルアレイフィルター１が底板部４２から僅かな流路５６を空けて壁部４４の下端に固定されている。第１室４６の底部と底板部４２の間、第３室５０の底部と底板部４２の間もそれぞれ一定の間隙が空けられ、流路５６を形成している。これにより、第２室４８内に細胞Ｃやビーズ等の粒子を含む液体サンプルを入れ、開口部５２または開口部５４から液体を流出させることにより、ウェルアレイフィルター１のウェル３内に細胞Ｃやビーズ等の粒子を捕捉することが可能である。すなわち、第２室４８、ウェルアレイフィルター１、貫通孔８を経て、流路５６へと到るサンプル流路が形成される。また、開口部５２または開口部５４から液体の試薬を入れて第２室４８内の細胞Ｃやビーズ等の粒子と反応させることもできる。
【0090】
［粒子捕獲方法の実施形態］
本発明に係る粒子捕獲方法の一実施形態は、粒子整列デバイス４０のウェルアレイフィルター１を通じるサンプル流路、すなわち、ウェル３の開口部側から貫通孔８を通じてウェル３の底面側へ通じるサンプル流路に、ウェルアレイフィルター１およびデバイス本体４０を溶解または変質させない有機溶媒を含む液体を通液させる工程と、前記サンプル流路に水溶液を通液させて前記有機溶媒を含む液体を前記水溶液で置換する工程と、前記サンプル流路に、ウェル３で捕捉すべき粒子を含む水溶液を通液させ、ウェル３内に粒子を捕獲する工程とを有する。
本発明に係る粒子捕獲方法の一実施形態は、粒子整列デバイス４０のウェルアレイフィルター１を通じるサンプル流路、すなわち、ウェル３の開口部側から貫通孔８を通じてウェル３の底面側へ通じるサンプル流路に、ウェルアレイフィルター１およびデバイス本体４０を溶解または変質させない有機溶媒を含む液体を通液させる工程と、前記サンプル流路に水溶液を通液させて前記有機溶媒を含む液体を前記水溶液で置換する工程と、前記サンプル流路に、ウェル３で捕捉すべき粒子を含む水溶液を通液させ、ウェル３内に粒子を捕獲する工程とを有する。
【0091】
具体的には、粒子整列デバイス４０の第２室４８にエチルアルコール等の水溶性かつ低界面張力の有機溶媒、あるいは、３０～８０％程度のエチルアルコール等の有機溶媒を含む水溶液等の液体を供給し、ウェルアレイフィルター１に有機溶媒を含む液体を通液させる。前記液体としては、例えば７０％エチルアルコール水溶液なども好適に使用できる。これにより、貫通孔８にも有機溶媒が満たされる。次に、リン酸緩衝液 (ＰＢＳ)などの緩衝液等の水溶液を第２室４８に加え、開口部５２および／または開口部５４から有機溶媒を含む液体を吸引する。これを数回繰り返して、第２室４８、貫通孔８、および流路５６の内部の有機溶媒を含む液体をリン酸緩衝液の水溶液で置換する。
【0092】
次に、リン酸緩衝液等に細胞Ｃおよび／またはビーズ等の粒子を分散させたサンプル液体を第２室４８に供給し、開口部５２および／または開口部５４からリン酸緩衝液を吸引することにより、細胞Ｃおよび／またはビーズは各ウェル３に一つずつもしくはほぼ一定の個数ずつ捕捉される。
【0093】
次に、ターゲットとする細胞Ｃまたは細胞分泌物が付着したビーズと結合する試薬を第２室４８または開口部５２，５４から加え、ターゲットをマーキングした後、倒立顕微鏡でターゲットを特定し、ピペットやキャピラリー等でウェル３からターゲットとなる細胞Ｃまたはビーズを補集する。
【0094】
以上の粒子捕獲方法によれば、ウェルアレイフィルター１を通じるサンプル流路に有機溶媒を含む液体を通液させ、さらに水溶液で置換した後に、細胞、細胞の成分や分泌物を付着させたビーズ、または、細胞の成分や分泌物を付着させるためのビーズ等の粒子を含む水溶液を通液させることにより、通液抵抗が減少するとともに、ウェル３に気泡が残留しにくくなり、各ウェル３内に一つずつもしくは所定数ずつ細胞Ｃまたはビーズ等の粒子を捕獲することが容易となる。したがって、第１実施形態～第１３実施形態のウェルアレイフィルター１の効果と相まって、多数の粒子のスクリーニングが効率よく安定して行える利点を有する。
【0095】
以上、本発明の実施形態を説明したが、本発明はこれら実施形態のみに限定されず、特許請求の範囲に記載された範囲内で、構成要件の追加、削除、および変更が可能である。
【実施例0096】
次に、本発明の実施例を説明する。
［実験１］
図１６に示すように、二つの同一矩形状の貫通孔８を、互いの２辺をそれぞれ直線上に配置した場合の本発明の実施例としての成立条件を求めた。貫通孔８の離間量をａ（μｍ）、矩形状の貫通孔８の横辺の長さをｂ（μｍ）、縦辺の長さをｃ（μｍ）、左側の貫通孔８の左上頂点から右側の貫通孔８の右下頂点までの距離の１／２をＲ（μｍ）、一方の貫通孔８の中心から他方の貫通孔８までの長さをｒ（μｍ）とした。距離Ｒ（μｍ）は、最小外接円の半径となる。長さｒ（μｍ）は最小外接円の中心を左側の貫通孔８の中心に移動させた後に移動後の最小外接円が右側の貫通孔８に接するための接触最小半径である。
［実験１］
図１６に示すように、二つの同一矩形状の貫通孔８を、互いの２辺をそれぞれ直線上に配置した場合の本発明の実施例としての成立条件を求めた。貫通孔８の離間量をａ（μｍ）、矩形状の貫通孔８の横辺の長さをｂ（μｍ）、縦辺の長さをｃ（μｍ）、左側の貫通孔８の左上頂点から右側の貫通孔８の右下頂点までの距離の１／２をＲ（μｍ）、一方の貫通孔８の中心から他方の貫通孔８までの長さをｒ（μｍ）とした。距離Ｒ（μｍ）は、最小外接円の半径となる。長さｒ（μｍ）は最小外接円の中心を左側の貫通孔８の中心に移動させた後に移動後の最小外接円が右側の貫通孔８に接するための接触最小半径である。
【0097】
最小外接円の半径Ｒ（μｍ）は、離間量ａ（μｍ）、横辺の長さｂ（μｍ）、縦辺の長さｃ（μｍ）を用いて下記のように求められる。
【数1】
【0098】
接触最小半径ｒ（μｍ）は、離間量ａ（μｍ）、横辺の長さｂ（μｍ）を用いて下記のように求められる。
【数2】
【0099】
したがって、Ｒ＞ｒを満たすように、貫通孔８の離間量をａ（μｍ）、矩形状の貫通孔８の横辺の長さをｂ（μｍ）、縦辺の長さをｃ（μｍ）を設定すれば、本発明の実施例の条件を満たすことになる。実施例の条件を満たす場合（実施例）と、満たさない場合（比較例）の具体例を示すと以下の通りである。
【0100】
［満たす場合の例］
貫通孔８の離間量ａ：１．００（μｍ）、矩形状の貫通孔８の横辺の長さｂ：２．５０（μｍ）、縦辺の長さｃ：６．０２（μｍ）、最小外接円の直径２Ｒ：８．５０（μｍ）
［満たさない場合の例］
貫通孔８の離間量ａ：３．００（μｍ）、矩形状の貫通孔８の横辺の長さｂ：２．５０（μｍ）、縦辺の長さｃ：２．８７（μｍ）、最小外接円の直径２Ｒ：８．５０（μｍ）
貫通孔８の離間量ａ：１．００（μｍ）、矩形状の貫通孔８の横辺の長さｂ：２．５０（μｍ）、縦辺の長さｃ：６．０２（μｍ）、最小外接円の直径２Ｒ：８．５０（μｍ）
［満たさない場合の例］
貫通孔８の離間量ａ：３．００（μｍ）、矩形状の貫通孔８の横辺の長さｂ：２．５０（μｍ）、縦辺の長さｃ：２．８７（μｍ）、最小外接円の直径２Ｒ：８．５０（μｍ）
【0101】
［実験２］
図１７に示すように、正三角形の頂点位置に円形の貫通孔８の中心がくるように３つの同一の貫通孔８を配置した場合の本発明の実施例としての成立条件を求めた。貫通孔８の中心間の離間量をａ（μｍ）、貫通孔８の直径をｒ（μｍ）、最小外接円の半径をＡ（μｍ）、一方の貫通孔８の中心から他方の貫通孔８に接するまでの長さをＢ（μｍ）とした。長さＢ（μｍ）は最小外接円の中心を左下の貫通孔８の中心に移動させた後に移動後の最小外接円が上側の貫通孔８に接するための接触最小半径である。
図１７に示すように、正三角形の頂点位置に円形の貫通孔８の中心がくるように３つの同一の貫通孔８を配置した場合の本発明の実施例としての成立条件を求めた。貫通孔８の中心間の離間量をａ（μｍ）、貫通孔８の直径をｒ（μｍ）、最小外接円の半径をＡ（μｍ）、一方の貫通孔８の中心から他方の貫通孔８に接するまでの長さをＢ（μｍ）とした。長さＢ（μｍ）は最小外接円の中心を左下の貫通孔８の中心に移動させた後に移動後の最小外接円が上側の貫通孔８に接するための接触最小半径である。
【0102】
最小外接円の半径Ａ（μｍ）は下式で表される。
接触最小半径Ｂ（μｍ）は下式で表される。
したがって、重複部分Ｊの幅は、下式で表される。
【数3】
【数4】
【数5】
【0103】
図１８は、貫通孔８の直径ｒを２．２５，２．５０、２．７５、３．００μｍにそれぞれ変更し、貫通孔８の中心間の離間量ａ（μｍ）を変化させた場合のＡ－Ｂの値、すなわち左下の貫通孔８の中心に移動させた後に最小外接円が上側の貫通孔８に重複する幅（μｍ）を示している。
【0104】
図１８のＡ－Ｂ値がマイナスになることは、左下の貫通孔８の中心に移動させた後に最小外接円が上側の貫通孔８に重複しないことを示し、図中「ＮＧ」とした。図１８のＡ－Ｂ値がプラスになることは、左下の貫通孔８の中心に移動させた後に最小外接円が上側の貫通孔８に重複することを示し、図中「ＯＫ」とした。図１８に示すように、例えば、貫通孔８の直径ｒ（μｍ）を２．２５とした場合は離間量ａ（μｍ）＝３．００μｍ以上５．３２μｍ未満の場合に本発明の実施例となり、離間量ａ（μｍ）＝５．３２以上の場合は本発明の要件を満たさず比較例となった。
【0105】
［実験３］
図１９に示すように、４つの同一円形の貫通孔８を、長方形の頂点位置に配置した場合の実施例の成立条件を求めた。貫通孔８の中心の図中左右方向の離間量をａ（μｍ）、貫通孔８の中心の上下方向の離間量をｂ（μｍ）、貫通孔８の直径をｒ（μｍ）、全ての貫通孔８に接する最小外接円の半径をＡ（μｍ）、右下の貫通孔８の中心から左上の貫通孔８に接するまでの距離をＢ（μｍ）とした。距離Ｂ（μｍ）は最小外接円の中心を右下の貫通孔８の中心に移動させた後に移動後の最小外接円が左上の貫通孔８に接するための接触最小半径である。
図１９に示すように、４つの同一円形の貫通孔８を、長方形の頂点位置に配置した場合の実施例の成立条件を求めた。貫通孔８の中心の図中左右方向の離間量をａ（μｍ）、貫通孔８の中心の上下方向の離間量をｂ（μｍ）、貫通孔８の直径をｒ（μｍ）、全ての貫通孔８に接する最小外接円の半径をＡ（μｍ）、右下の貫通孔８の中心から左上の貫通孔８に接するまでの距離をＢ（μｍ）とした。距離Ｂ（μｍ）は最小外接円の中心を右下の貫通孔８の中心に移動させた後に移動後の最小外接円が左上の貫通孔８に接するための接触最小半径である。
【0106】
最小外接円の半径をＡ（μｍ）は、左右方向の離間量をａ（μｍ）、上下方向の離間量をｂ（μｍ）、貫通孔８の直径をｒ（μｍ）を用いて下記のように求められる。
【数6】
【0107】
右下の貫通孔８の中心から左上の貫通孔８に接するまでの距離をＢ（μｍ）は、下式で示される。
【数7】
【0108】
【0109】
図２０は、貫通孔８の直径ｒ（μｍ）を１．５０、１．７５、２．００、２．２５、２．５０、２．７５、３．００、３．２５、３．５０μｍに設定した場合のそれぞれについて、貫通孔８の中心の左右方向の離間量ａ（μｍ）と、貫通孔８の中心の上下方向の離間量ｂ（μｍ）を変化させた場合に、本発明の実施例の成立条件を満たす「ＯＫ」範囲を示している。図２０に示すように、貫通孔８を長方形の頂点位置に配置した場合にも、本発明の実施例の成立条件は容易に判定できることがわかった。図１９の配列において、実施例の条件を満たす場合（実施例）と、満たさない場合（比較例）の例を示すと以下の通りであった。
【0110】
［満たす場合の例］
貫通孔８の中心の左右方向の離間量ａ：４．３５μｍ、貫通孔８の中心の上下方向の離間量ｂ：４．３５μｍ、貫通孔８の直径ｒ：３．３５μｍ、全ての貫通孔８に接する最小外接円の直径（２Ａ）：９．５０μｍ
［満たさない場合の例］
貫通孔８の中心の左右方向の離間量ａ：４．４２μｍ、貫通孔８の中心の上下方向の離間量ｂ：４．５４μｍ、貫通孔８の直径ｒ：３．１６μｍ、全ての貫通孔８に接する最小外接円の直径（２Ａ）：９．５０μｍ
貫通孔８の中心の左右方向の離間量ａ：４．３５μｍ、貫通孔８の中心の上下方向の離間量ｂ：４．３５μｍ、貫通孔８の直径ｒ：３．３５μｍ、全ての貫通孔８に接する最小外接円の直径（２Ａ）：９．５０μｍ
［満たさない場合の例］
貫通孔８の中心の左右方向の離間量ａ：４．４２μｍ、貫通孔８の中心の上下方向の離間量ｂ：４．５４μｍ、貫通孔８の直径ｒ：３．１６μｍ、全ての貫通孔８に接する最小外接円の直径（２Ａ）：９．５０μｍ
【0111】
また、図１９のように矩形状の貫通孔８の４つを縦横辺を同一線上に揃えて配置した場合に実施例の条件を満たす場合（実施例）と、満たさない場合（比較例）の具体例を示すと以下の通りであった。
【0112】
［満たす場合の例］
矩形状の貫通孔８の横辺の長さ：２．５０μｍ、貫通孔８の縦辺の長さ：３．２５μｍ、貫通孔８の左右方向の離間量：１．００μｍ、貫通孔８の上下方向の離間量：１．００μｍ、全ての貫通孔８に接する最小外接円の直径：９．５０μｍ
［満たさない場合の例］
矩形状の貫通孔８の横辺の長さ：２．００μｍ、貫通孔８の縦辺の長さ：２．５１μｍ、貫通孔８の左右方向の離間量：１．００μｍ、貫通孔８の上下方向の離間量：３．０５μｍ、全ての貫通孔８に接する最小外接円の直径：９．５０μｍ
矩形状の貫通孔８の横辺の長さ：２．５０μｍ、貫通孔８の縦辺の長さ：３．２５μｍ、貫通孔８の左右方向の離間量：１．００μｍ、貫通孔８の上下方向の離間量：１．００μｍ、全ての貫通孔８に接する最小外接円の直径：９．５０μｍ
［満たさない場合の例］
矩形状の貫通孔８の横辺の長さ：２．００μｍ、貫通孔８の縦辺の長さ：２．５１μｍ、貫通孔８の左右方向の離間量：１．００μｍ、貫通孔８の上下方向の離間量：３．０５μｍ、全ての貫通孔８に接する最小外接円の直径：９．５０μｍ
【0113】
［実験４］
種々の個数、形状、サイズの貫通孔８を、ウェル底部４に形成したウェルアレイフィルター１を実際に作成し、粒子整列デバイス４０にセットし、細胞Ｃを分散させたサンプル液体を通液した後のシングルセル率と、エタノールの通液性とを調べた。
図１３およびウェルアレイフィルターの製造方法の一実施形態で説明した方法により、実施例１～６および比較例のウェルアレイフィルターを実際に製造した。ウェル３の開口部は正六角形とし、平行な二辺間の開口径は５０μｍとした。隔壁レジスト６Ａは多官能エポキシ量が相対的にネガ型の少ないフォトレジストで形成し、底部レジスト４Ａは多官能エポキシ量が相対的に多いネガ型のフォトレジストで形成した。
種々の個数、形状、サイズの貫通孔８を、ウェル底部４に形成したウェルアレイフィルター１を実際に作成し、粒子整列デバイス４０にセットし、細胞Ｃを分散させたサンプル液体を通液した後のシングルセル率と、エタノールの通液性とを調べた。
図１３およびウェルアレイフィルターの製造方法の一実施形態で説明した方法により、実施例１～６および比較例のウェルアレイフィルターを実際に製造した。ウェル３の開口部は正六角形とし、平行な二辺間の開口径は５０μｍとした。隔壁レジスト６Ａは多官能エポキシ量が相対的にネガ型の少ないフォトレジストで形成し、底部レジスト４Ａは多官能エポキシ量が相対的に多いネガ型のフォトレジストで形成した。
【0114】
図２１は、製造された実施例１～６および比較例のウェルアレイフィルターの貫通孔８のＳＥＭ像（走査型電子顕微鏡写真）と、個々の貫通孔８の平面視形状と、ウェル３毎の貫通孔８の個数と、貫通孔８の配置状態と、貫通孔８の短径（μｍ）および長径（μｍ）と、貫通孔８の中心間距離（μｍ）と、最小外接円をいずれの貫通孔８の中心に移動したとしても必ず全ての貫通孔８と移動後の最小外接円が重複するか否か（貫通孔重なり）を示した。貫通孔重なりは、○が重複し、×が重複しなかったことを示した。
【0115】
図２１に示すように、実施例１～６は全て、最小外接円をいずれの貫通孔８の中心に移動したとしても必ず全ての貫通孔８と移動後の最小外接円が重複した。一方、貫通孔８を正六角形の頂点位置に配列した実施例は、最小外接円を外側の貫通孔８の中心に移動すると反対側の貫通孔８と最小外接円が重複しなかった。
【0116】
次に、実施例１～６および比較例のウェルアレイフィルターを、ウェル形成領域：１７ｍｍ×１７ｍｍ）として粒子整列デバイス４０に装着し、エチルアルコールの通液後、リン酸緩衝液 (ＰＢＳ)を３回通液した。次に、所定の細胞を所定の播種細胞数だけ分散させたリン酸緩衝液１ｍｌを第２室４８に入れて、ウェルアレイフィルターに通液した。細胞としては、ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）を使用した。ウェルアレイフィルター中のウェル数は９００００で、ウェル数に対しておよそ１５～９０％の数の細胞を入れた。
【0117】
次に、ＤＡＰＩ水溶液でウェル３内の細胞を染色し、倒立型蛍光顕微鏡で底板部４２を通してウェル３内の細胞を観察し、顕微鏡の視野内で、全ウェル中で細胞Ｃが１以上捕捉されているウェル数Ａ、細胞Ｃが一つだけ捕捉されているウェル数Ｂを計測し、Ｂ／Ａをシングルセル率とした。ウェル数に対する細胞占有率（％）は、ウェルアレイフィルター中の全ウェル数に対する播種細胞数の比率（播種細胞数／全ウェル数）である。その結果を図２２に示す。
【0118】
図２２中の「ポアソン分布」の数値は、播種細胞数とウェル数の比率から統計的に計算されたウェル数に対する細胞占有率（％）と、シングルセル率（％）を示す。
【0119】
図２２に示すように、実施例１～６のウェルアレイフィルターでは、統計的な確率計算で求められたポアソン分布のシングルセル率（％）よりも、高いシングルセル率（％）が得られた。これは、ウェル３に一つ目の細胞が捕捉された後は、２つ目の細胞が入りにくくなるとともに、隣接する他のウェル３に細胞が流れたことを示し、ウェル３の形状や貫通孔８の設定が適切であることを示していた。貫通孔８の中心間距離はが４．００μｍの実施例１，３，５がシングルセル率が高かった。比較例シングルセル率（％）は、ポアソン分布の場合と同程度に過ぎず、本発明の効果が証明できた。
【0120】
［実験５］
実施例１～６および比較例のウェルアレイフィルターを用いて、エチルアルコールの通液時間の測定を行った。各ウェルアレイフィルターを粒子整列デバイス４０に装着し、ウェルアレイフィルターのウェル形成領域は１７ｍｍ×１７ｍｍの正方形とした。第２室４８にエチルアルコールを０．５ｍｌ注入し、ウェルアレイフィルターを通過して流路５６にエチルアルコールの全量が流れ込むまでの通液時間（秒）を測定した。また、貫通孔８の合計開口面積がウェル形成領域に占める割合、開口率（％）も求めた。これらの結果を図２３および図２４に示す。
実施例１～６および比較例のウェルアレイフィルターを用いて、エチルアルコールの通液時間の測定を行った。各ウェルアレイフィルターを粒子整列デバイス４０に装着し、ウェルアレイフィルターのウェル形成領域は１７ｍｍ×１７ｍｍの正方形とした。第２室４８にエチルアルコールを０．５ｍｌ注入し、ウェルアレイフィルターを通過して流路５６にエチルアルコールの全量が流れ込むまでの通液時間（秒）を測定した。また、貫通孔８の合計開口面積がウェル形成領域に占める割合、開口率（％）も求めた。これらの結果を図２３および図２４に示す。
【0121】
実施例１～６はいずれも、エチルアルコールの通液時間が９９秒以下で、実用上の許容範囲であった。比較例は貫通孔８が７つあるため開口率（％）が高かったが、実施例１，２，４は比較例と比べても通液時間は遜色がなかった。実用上、エチルアルコールの通液時間が６０秒以下であるとより使用しやすいため、貫通孔８の開口率は０．５％以上が望ましいことがわかった。ウェル３が六角形で平行な２辺間の開口径が１０μｍ、ウェル隔壁６の厚さ２μｍで、直径２μｍの円形の貫通孔を設けた場合には、貫通孔８の開口率が３％になる。したがって、開口率は０．５～３％の範囲が望ましいことがわかった。図２１～２４に示す結果から、高いシングルセル率と通液性が両立するのは、実施例１，２，５であり、特に、実施例１，５が良好であった。
【産業上の利用可能性】
【0122】
本発明によれば、捕捉すべき細胞またはビーズ等の粒子が貫通孔を通過することを抑制しつつ、ウェルアレイフィルター全体としての流量が確保できるうえ、各ウェル底部に形成されている複数の貫通孔が前記位置関係を満たすことにより、ウェル内に前記粒子が一つ捕獲された際に、この粒子が前記複数の貫通孔の全てに対し少なくとも部分的に重なる確率が高い。よって、一つ目の粒子が捕獲された後は、そのウェル内の全ての貫通孔を通過する分散媒の流量が適度に低下し、流れに乗って２つ目以降の粒子がウェル内に入ってくることが抑制され、隣接する空のウェルに細胞等が導かれて捕捉される確率が高まる。これにより、多くのウェル内に一つずつ粒子が捕獲される確率が高く、シングルセル率が高くかつ通液性が良好であり、各ウェルでの粒子の単離が安定して行える。したがって、産業上の利用が可能である。
【符号の説明】
【0123】
１ ウェルアレイフィルター
２ フィルタ本体
３ ウェル
４ ウェル底部
４Ａ 底部レジスト
６ ウェル隔壁
６Ａ 隔壁レジスト
８ 貫通孔
１０ 基板
１２ 犠牲膜
１４ 間隙
４０ 粒子整列デバイス
４１ デバイス本体
４２ 底板部
４４ 壁部
４６ 第１室
４８ 第２室
５０ 第３室
５２ 開口部
５４ 開口部
５６ 流路
Ａ 開口径
Ｂ 隔壁厚さ
Ｃ 細胞
Ｐ ピペット
Ｗ 離間幅
Ｄ 直径
Ｇ１ 最小外接円
Ｇ２ 移動後の最小外接円
Ｊ 重複部分
２ フィルタ本体
３ ウェル
４ ウェル底部
４Ａ 底部レジスト
６ ウェル隔壁
６Ａ 隔壁レジスト
８ 貫通孔
１０ 基板
１２ 犠牲膜
１４ 間隙
４０ 粒子整列デバイス
４１ デバイス本体
４２ 底板部
４４ 壁部
４６ 第１室
４８ 第２室
５０ 第３室
５２ 開口部
５４ 開口部
５６ 流路
Ａ 開口径
Ｂ 隔壁厚さ
Ｃ 細胞
Ｐ ピペット
Ｗ 離間幅
Ｄ 直径
Ｇ１ 最小外接円
Ｇ２ 移動後の最小外接円
Ｊ 重複部分
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】