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特開2024-71979細胞注入装置、及び外来細胞を内包するオルガノイドの作成方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024071979
(43)【公開日】2024-05-27
(54)【発明の名称】細胞注入装置、及び外来細胞を内包するオルガノイドの作成方法
(51)【国際特許分類】
C12M 1/00 20060101AFI20240520BHJP
C12M 3/00 20060101ALI20240520BHJP
【ＦＩ】
C12M1/00 A
C12M3/00 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022182532
(22)【出願日】2022-11-15
(71)【出願人】
【識別番号】000004204
【氏名又は名称】日本精工株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】504179255
【氏名又は名称】国立大学法人 東京医科歯科大学
(74)【代理人】
【識別番号】110002147
【氏名又は名称】弁理士法人酒井国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】植田 裕基
(72)【発明者】
【氏名】田中 伸明
(72)【発明者】
【氏名】武部 貴則
(72)【発明者】
【氏名】米山 鷹介
【テーマコード（参考）】
4B029
【Ｆターム（参考）】
4B029AA09
4B029AA25
4B029BB11
4B029HA01
4B029HA10
(57)【要約】
【課題】作業者の熟練度及び技術によらず、オルガノイドの内腔に外来細胞を安定して注入することができる細胞注入装置、及び外来細胞を内包するオルガノイドの作成方法を提供する。
【解決手段】細胞注入装置は、細胞から培養され上皮層２１０の内側に内腔２２０を有するオルガノイド２００を、開口６０ａを有する先端に保持可能な第１ピペット６０と、第１ピペット６０の内部圧力を調整可能なシリンジポンプと、オルガノイド２００を構成する細胞とは異なる細胞を示す外来細胞Ｃｅを先端から吐出可能な第２ピペット９０と、第１ピペット６０の内部を陰圧にすることでオルガノイド２００を吸引保持させ、オルガノイド２００の一部が開口６０ａより第１ピペット６０の内部に入り込んだ状態で、第２ピペット９０で上皮層２１０を穿孔させ、外来細胞Ｃｅを内腔２２０に吐出させるコントローラと、を備える。
【選択図】図７
【解決手段】細胞注入装置は、細胞から培養され上皮層２１０の内側に内腔２２０を有するオルガノイド２００を、開口６０ａを有する先端に保持可能な第１ピペット６０と、第１ピペット６０の内部圧力を調整可能なシリンジポンプと、オルガノイド２００を構成する細胞とは異なる細胞を示す外来細胞Ｃｅを先端から吐出可能な第２ピペット９０と、第１ピペット６０の内部を陰圧にすることでオルガノイド２００を吸引保持させ、オルガノイド２００の一部が開口６０ａより第１ピペット６０の内部に入り込んだ状態で、第２ピペット９０で上皮層２１０を穿孔させ、外来細胞Ｃｅを内腔２２０に吐出させるコントローラと、を備える。
【選択図】図７
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞から培養され上皮層の内側に内腔を有するオルガノイドが載置される試料ステージと、
先端に開口を有し、先端に前記オルガノイドを保持可能な第１ピペットを備える第１マニピュレータと、
前記第１ピペットと接続して前記第１ピペットの内部圧力を調整可能なシリンジポンプと、
前記オルガノイドを構成する細胞とは異なる細胞を示す外来細胞を先端から吐出可能な第２ピペットを備える第２マニピュレータと、
前記試料ステージ、前記第１マニピュレータ、前記シリンジポンプ、及び前記第２マニピュレータを制御するコントローラと、
を備え、
前記コントローラは、
前記第１ピペットの内部を陰圧にすることで前記オルガノイドを吸引保持させ、
前記オルガノイドの一部が前記開口より前記第１ピペットの内部に入り込んだ状態で、
前記第２ピペットで前記上皮層を穿孔させ、前記外来細胞を前記内腔に吐出させる、
細胞注入装置。
先端に開口を有し、先端に前記オルガノイドを保持可能な第１ピペットを備える第１マニピュレータと、
前記第１ピペットと接続して前記第１ピペットの内部圧力を調整可能なシリンジポンプと、
前記オルガノイドを構成する細胞とは異なる細胞を示す外来細胞を先端から吐出可能な第２ピペットを備える第２マニピュレータと、
前記試料ステージ、前記第１マニピュレータ、前記シリンジポンプ、及び前記第２マニピュレータを制御するコントローラと、
を備え、
前記コントローラは、
前記第１ピペットの内部を陰圧にすることで前記オルガノイドを吸引保持させ、
前記オルガノイドの一部が前記開口より前記第１ピペットの内部に入り込んだ状態で、
前記第２ピペットで前記上皮層を穿孔させ、前記外来細胞を前記内腔に吐出させる、
細胞注入装置。
【請求項2】
前記第１ピペット及び前記オルガノイドを撮像する撮像部を備え、
前記コントローラは、
前記撮像部の画像データに基づいて、前記オルガノイドの一部が前記開口より前記第１ピペットの内部に入り込んだ状態か否かを前記内腔が前記開口より前記第１ピペットの内部に入り込んでいるか否かで判断する、
請求項１に記載の細胞注入装置。
前記コントローラは、
前記撮像部の画像データに基づいて、前記オルガノイドの一部が前記開口より前記第１ピペットの内部に入り込んだ状態か否かを前記内腔が前記開口より前記第１ピペットの内部に入り込んでいるか否かで判断する、
請求項１に記載の細胞注入装置。
【請求項3】
前記コントローラは、
前記第１ピペットの内部に入り込んだ前記上皮層と前記内腔との境界の頂端膜が、前記開口より前記第１ピペットの内部に位置している場合、前記内腔が前記開口より前記第１ピペットの内部に入り込んでいると判断する、
請求項２に記載の細胞注入装置。
前記第１ピペットの内部に入り込んだ前記上皮層と前記内腔との境界の頂端膜が、前記開口より前記第１ピペットの内部に位置している場合、前記内腔が前記開口より前記第１ピペットの内部に入り込んでいると判断する、
請求項２に記載の細胞注入装置。
【請求項4】
前記コントローラは、
前記第１ピペットで前記オルガノイドを吸引させる前の前記画像データにおける前記内腔の面積を初期値として予め取得し、
前記第１ピペットの内部に入り込んだ前記内腔の前記画像データにおける面積が、前記初期値より大きいか否かを判断し、
前記初期値より大きいと判断した場合、前記内腔が前記開口より前記第１ピペットの内部に入り込んでいると判断する、
請求項２に記載の細胞注入装置。
前記第１ピペットで前記オルガノイドを吸引させる前の前記画像データにおける前記内腔の面積を初期値として予め取得し、
前記第１ピペットの内部に入り込んだ前記内腔の前記画像データにおける面積が、前記初期値より大きいか否かを判断し、
前記初期値より大きいと判断した場合、前記内腔が前記開口より前記第１ピペットの内部に入り込んでいると判断する、
請求項２に記載の細胞注入装置。
【請求項5】
前記第１ピペット及び前記オルガノイドを撮像する撮像部を備え、
前記コントローラは、
前記第１ピペットで前記オルガノイドを吸引させる前の前記撮像部の画像データにおける前記上皮層の厚みを初期値として予め取得し、
前記第１ピペットに吸引保持された前記オルガノイドの前記開口とは反対側の前記上皮層の前記撮像部の画像データにおける厚みが、前記初期値より小さいか否かを判断し、
前記初期値より小さいと判断した場合、前記第２ピペットで前記上皮層を穿孔させ、前記外来細胞を前記内腔に吐出させる、
請求項１に記載の細胞注入装置。
前記コントローラは、
前記第１ピペットで前記オルガノイドを吸引させる前の前記撮像部の画像データにおける前記上皮層の厚みを初期値として予め取得し、
前記第１ピペットに吸引保持された前記オルガノイドの前記開口とは反対側の前記上皮層の前記撮像部の画像データにおける厚みが、前記初期値より小さいか否かを判断し、
前記初期値より小さいと判断した場合、前記第２ピペットで前記上皮層を穿孔させ、前記外来細胞を前記内腔に吐出させる、
請求項１に記載の細胞注入装置。
【請求項6】
前記第２ピペットを軸方向に移動させるための圧電素子を含む微動機構を備え、
前記コントローラは、
前記第２ピペットを軸方向に加振した状態で、前記上皮層を穿孔させる、
請求項１から５のいずれか１項に記載の細胞注入装置。
前記コントローラは、
前記第２ピペットを軸方向に加振した状態で、前記上皮層を穿孔させる、
請求項１から５のいずれか１項に記載の細胞注入装置。
【請求項7】
先端に開口を有する第１ピペットを、細胞から培養され上皮層の内側に内腔を有するオルガノイドに対向させる第１ピペット配置ステップと、
前記オルガノイドを構成する細胞とは異なる細胞を示す外来細胞を先端から吐出可能な第２ピペットを、前記オルガノイドの前記第１ピペットとは反対側の位置に対向させる第２ピペット配置ステップと、
前記第１ピペットの内部を陰圧にさせて、前記先端に前記オルガノイドを吸引保持する保持ステップと、
前記オルガノイドの一部を前記開口より第１ピペットの内部に入り込むまで吸引する吸引ステップと、
前記オルガノイドの一部が前記開口より第１ピペットの内部に入り込んだ後、前記第２ピペットで前記上皮層を穿孔する穿孔ステップと、
前記第２ピペットから前記外来細胞を前記内腔に吐出させる注入ステップと、
を含む、外来細胞を内包するオルガノイドの作成方法。
前記オルガノイドを構成する細胞とは異なる細胞を示す外来細胞を先端から吐出可能な第２ピペットを、前記オルガノイドの前記第１ピペットとは反対側の位置に対向させる第２ピペット配置ステップと、
前記第１ピペットの内部を陰圧にさせて、前記先端に前記オルガノイドを吸引保持する保持ステップと、
前記オルガノイドの一部を前記開口より第１ピペットの内部に入り込むまで吸引する吸引ステップと、
前記オルガノイドの一部が前記開口より第１ピペットの内部に入り込んだ後、前記第２ピペットで前記上皮層を穿孔する穿孔ステップと、
前記第２ピペットから前記外来細胞を前記内腔に吐出させる注入ステップと、
を含む、外来細胞を内包するオルガノイドの作成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞注入装置、及び外来細胞を内包するオルガノイドの作成方法に関する。
【背景技術】
【0002】
細胞は、生体内で周りの細胞と密接な相互作用を介して生命活動を担う。このため、臓器の形成過程を模倣して多能性幹細胞から３次元培養して作成される３次元組織であるオルガノイドは、細胞の機能をより引き出す形態として注目されている。オルガノイドは、臓器を構成する細胞から臓器と同様の構造に形成され、例えば、大腸オルガノイドは、腸管上皮層及び管腔構造を有しており、上皮層の内腔側は頂端膜、外側は基底膜の極性を有している。
【0003】
ところで、オルガノイドの特徴を生かした研究の一環として、臓器を構成する細胞ではない細胞（外来細胞という）と、臓器の内腔の頂端膜との相互作用を、オルガノイドを用いて評価することが求められている。この場合、形成した直径約１００～１０００μｍ程度のオルガノイドの内腔の内部に、直径約１０～２０μｍの外来細胞へ注入して、外来細胞を内包したオルガノイドを作成する必要がある。例えば、特許文献１には、細胞構造物へのインジェクション方法が記載されている。また、特許文献２には、マイクロインジェクションによりオルガノイドの内腔から液体を採取することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特開２０２１－１８５８１０号公報
【特許文献2】特開２０２２－１１９８６２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
特許文献１は、細胞構造物が約５ｍｍ程度であり、使用する注射針は実験動物等への細胞注入に用いられるものであるため、上記オルガノイドに対して注射針の径が大きく、注入操作が困難な上、オルガノイドを損傷させる可能性がある。また、特許文献２は、細胞の注入ではなく、熟練の手技によって行われる採取である。これに対し、外来細胞を内包したオルガノイドを形成するためには、μｍ単位の微小なオルガノイドに対して、大きすぎず細胞注入が可能な口径の毛細管を使用して上皮層を穿孔し、外来細胞を注入する必要がある。しかしながら、オルガノイドの上皮層は粘弾性体であるため、細胞注入が可能な口径の毛細管では穿孔が困難である。
【0006】
本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、作業者の熟練度及び技術によらず、オルガノイドの内腔に外来細胞を安定して注入することができる細胞注入装置、及び外来細胞を内包するオルガノイドの作成方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明の一態様に係る細胞注入装置は、細胞から培養され上皮層の内側に内腔を有するオルガノイドが載置される試料ステージと、先端に開口を有し、先端に前記オルガノイドを保持可能な第１ピペットを備える第１マニピュレータと、前記第１ピペットと接続して前記第１ピペットの内部圧力を調整可能なシリンジポンプと、前記オルガノイドを構成する細胞とは異なる細胞を示す外来細胞を先端から吐出可能な第２ピペットを備える第２マニピュレータと、前記試料ステージ、前記第１マニピュレータ、前記シリンジポンプ、及び前記第２マニピュレータを制御するコントローラと、を備え、前記コントローラは、前記第１ピペットの内部を陰圧にすることで前記オルガノイドを吸引保持させ、前記オルガノイドの一部が前記開口より前記第１ピペットの内部に入り込んだ状態で、前記第２ピペットで前記上皮層を穿孔させ、前記外来細胞を前記内腔に吐出させる。
【0008】
これにより、オルガノイドの一部が第１ピペットの開口より内部に入り込んだ状態では、オルガノイドの上皮層が第１ピペットの開口より内部に引っ張られ、第１ピペットの開口より外部の上皮層に面方向の張力が生じる。粘弾性体である上皮層に張力を生じさせることで、第２ピペットの先端が上皮層に接触した際の反力が増大し、容易に穿孔することができる。第２ピペットで穿孔する前に、第１ピペットでオルガノイドを十分吸引すればよいので、作業者の熟練度及び技術によらず、オルガノイドの内腔に外来細胞を安定して注入することが可能である。
【0009】
本発明の一態様に係る細胞注入装置は、前記第１ピペット及び前記オルガノイドを撮像する撮像部を備え、前記コントローラは、前記撮像部の画像データに基づいて、前記オルガノイドの一部が前記開口より前記第１ピペットの内部に入り込んだ状態か否かを前記内腔が前記開口より前記第１ピペットの内部に入り込んでいるか否かで判断する。
【0010】
これにより、コントローラが、画像データに基づいて第１ピペット及びオルガノイドの位置及び形状を検出することができ、第１ピペットの開口の位置や上皮層と内腔との境界の位置及び形状に基づいて、内腔が開口より内部に入り込んでいるか否かを判断することができる。また、これらの撮像、検出、判断が、制御により自動的に行われるため、効率よくかつ好適に上皮層に張力を生じさせた状態で穿孔することができる。
【0011】
本発明の一態様に係る細胞注入装置において、前記コントローラは、前記第１ピペットの内部に入り込んだ前記上皮層と前記内腔との境界の頂端膜が、前記開口より前記第１ピペットの内部に位置している場合、前記内腔が前記開口より前記第１ピペットの内部に入り込んでいると判断する。
【0012】
これにより、コントローラが、画像データに基づいて、内腔が開口より内部に入り込んでいるか否かを定量的に判断することができる。また、これらの撮像、検出、判断が、制御により自動的に行われるため、効率よくかつ好適に上皮層に張力を生じさせた状態で穿孔することができる。
【0013】
本発明の一態様に係る細胞注入装置において、前記コントローラは、前記第１ピペットで前記オルガノイドを吸引させる前の前記画像データにおける前記内腔の面積を初期値として予め取得し、前記第１ピペットの内部に入り込んだ前記内腔の前記画像データにおける面積が、前記初期値より大きいか否かを判断し、前記初期値より大きいと判断した場合、前記内腔が前記開口より前記第１ピペットの内部に入り込んでいると判断する。
【0014】
これにより、コントローラが、画像データに基づいて、内腔が開口より内部に入り込んでいるか否かを定量的に判断することができる。また、これらの撮像、検出、判断が、制御により自動的に行われるため、効率よくかつ好適に上皮層に張力を生じさせた状態で穿孔することができる。
【0015】
本発明の一態様に係る細胞注入装置は、前記第１ピペット及び前記オルガノイドを撮像する撮像部を備え、前記コントローラは、前記第１ピペットで前記オルガノイドを吸引させる前の前記撮像部の画像データにおける前記上皮層の厚みを初期値として予め取得し、前記第１ピペットに吸引保持された前記オルガノイドの前記開口とは反対側の前記上皮層の前記撮像部の画像データにおける厚みが、前記初期値より小さいか否かを判断し、前記初期値より小さいと判断した場合、前記第２ピペットで前記上皮層を穿孔させ、前記外来細胞を前記内腔に吐出させる。
【0016】
これにより、コントローラが、画像データに基づいて、内腔が開口より内部に入り込んでいるか否かを定量的に判断することができる。また、これらの撮像、検出、判断が、制御により自動的に行われるため、効率よくかつ好適に上皮層に張力を生じさせた状態で穿孔することができる。
【0017】
本発明の一態様に係る細胞注入装置は、前記第２ピペットを軸方向に移動させるための圧電素子を含む微動機構を備え、前記コントローラは、前記第２ピペットを軸方向に加振した状態で、前記上皮層を穿孔させる。
【0018】
これにより、微動機構が第２ピペットを挿入方向に加振することができるため、加振された第２ピペットを上皮層に接触させることで、オルガノイドの大変形を抑制した穿孔を行うことができる。
【0019】
本発明の一態様に係る外来細胞を内包するオルガノイドの作成方法は、先端に開口を有する第１ピペットを、細胞から培養され上皮層の内側に内腔を有するオルガノイドに対向させる第１ピペット配置ステップと、前記オルガノイドを構成する細胞とは異なる細胞を示す外来細胞を先端から吐出可能な第２ピペットを、前記オルガノイドの前記第１ピペットとは反対側の位置に対向させる第２ピペット配置ステップと、前記第１ピペットの内部を陰圧にさせて、前記先端に前記オルガノイドを吸引保持する保持ステップと、前記オルガノイドの一部が前記開口より第１ピペットの内部に入り込むまで吸引する吸引ステップと、前記オルガノイドの一部が前記開口より第１ピペットの内部に入り込んだ後、前記第２ピペットで前記上皮層を穿孔する穿孔ステップと、前記第２ピペットから前記外来細胞を前記内腔に吐出させる注入ステップと、を含む。
【0020】
これにより、オルガノイドの一部が第１ピペットの開口より内部に入り込んだ状態では、オルガノイドの上皮層が第１ピペットの開口より内部に引っ張られ、第１ピペットの開口より外部の上皮層に面方向の張力が生じる。粘弾性体である上皮層に張力を生じさせることで、第２ピペットの先端が上皮層に接触した際の反力が増大し、容易に穿孔することができる。第２ピペットで穿孔する前に、第１ピペットでオルガノイドを十分吸引すればよいので、作業者の熟練度及び技術によらず、オルガノイドの内腔に外来細胞を安定して注入し、外来細胞を内包するオルガノイドを作成することが可能である。
【発明の効果】
【0021】
本発明によれば、作業者の熟練度及び技術によらず、オルガノイドの内腔に外来細胞を安定して注入することができる細胞注入装置、及び外来細胞を内包するオルガノイドの作成方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【発明を実施するための形態】
【0023】
本発明を実施するための形態（実施形態）につき、図面を参照しつつ詳細に説明する。以下の実施形態に記載した内容により本発明が限定されるものではない。また、以下に記載した構成要素には、当業者が容易に想定できるもの、実質的に同一のものが含まれる。さらに、以下に記載した構成要素は適宜組み合わせることが可能である。
【0024】
（実施形態）
［システムの物理構成］
まず、物質注入装置１の物理構成について、図１及び図２を参照して説明する。図１は、実施形態に係る物質注入装置１の構成例を模式的に示す図である。図２は、図１に示す微動機構４２の一例を示す断面図である。物質注入装置１は、顕微鏡観察下で細胞等の微小対象物を操作するためのマニピュレーションシステムであり、本実施形態においてはオルガノイド２００へ細胞Ｃｅを注入するための装置である。
［システムの物理構成］
まず、物質注入装置１の物理構成について、図１及び図２を参照して説明する。図１は、実施形態に係る物質注入装置１の構成例を模式的に示す図である。図２は、図１に示す微動機構４２の一例を示す断面図である。物質注入装置１は、顕微鏡観察下で細胞等の微小対象物を操作するためのマニピュレーションシステムであり、本実施形態においてはオルガノイド２００へ細胞Ｃｅを注入するための装置である。
【0025】
図１において、物質注入装置１は、顕微鏡ユニット１０と、第１マニピュレータ３０と、第２マニピュレータ７０と、物質注入装置１を制御するコントローラ（制御装置）１００とを備えている。顕微鏡ユニット１０の両側に第１マニピュレータ３０と第２マニピュレータ７０とが分かれて配置されている。なお、実施形態において、水平面内の一方向をＸ軸方向、水平面内においてＸ軸方向と交差する方向をＹ軸方向、Ｘ軸方向及びＹ軸方向のそれぞれと交差する方向（すなわち鉛直方向）をＺ軸方向とする。
【0026】
撮像部としての顕微鏡ユニット１０は、顕微鏡１２と、撮像素子を含むカメラ１４と、試料ステージ２０と、を備える。顕微鏡ユニット１０は、顕微鏡１２とカメラ１４とが一体構造となっている、例えば、マイクロスコープである。顕微鏡１２及びカメラ１４は、例えば、試料ステージ２０に支持される試料保持部材２２の直上に配置され、試料保持部材２２に収容された試料（例えば、図６に示すオルガノイド２００）等を平面視可能である。図１に示す実施形態において、顕微鏡１２及びカメラ１４の光軸は、試料等に対して垂直方向に入射する。なお、図１に示す実施形態では、顕微鏡１２及びカメラ１４は、試料保持部材２２の上方に配置されているが、試料保持部材２２の下方に配置してもよい。また、カメラ１４は、顕微鏡１２と別体に設けてもよい。
【0027】
顕微鏡ユニット１０は、さらに、試料保持部材２２に向けて光を照射する不図示の光源と、焦点合わせ機構１６（図３参照）を備えている。試料保持部材２２の試料に光が照射され、試料保持部材２２の試料で反射した光が顕微鏡１２に入射すると、試料に関する光学像は、顕微鏡１２で拡大された後、カメラ１４で撮像される。光学像は、焦点合わせ機構１６によって、顕微鏡１２及びカメラ１４のレンズの位置及びレンズ間の距離を調整して顕微鏡１２及びカメラ１４の焦点合わせを行うことで明瞭に投影される。なお、顕微鏡１２の焦点合わせ方向は、実施形態において、Ｚ軸方向である。顕微鏡ユニット１０は、カメラ１４で撮像された画像を基に試料の観察が可能となっている。
【0028】
試料ステージ２０は、顕微鏡１２及びカメラ１４の下方に配置される台座であり、試料保持部材２２を支持可能である。試料ステージ２０の載置面は、Ｘ軸－Ｙ軸平面に平行なＸ－Ｙ平面である。試料ステージ２０は、例えば、載置面に試料保持部材２２を載置する。試料保持部材２２は、図１に示す一例では培養ディッシュ（シャーレ）であるが、本実施形態ではウェルプレートでもよい。
【0029】
第１マニピュレータ３０は、Ｘ－Ｙ軸テーブル３２と、Ｚ軸テーブル３４と、Ｘ－Ｙ軸テーブル３２を駆動する駆動装置３６と、Ｚ軸テーブル３４を駆動する駆動装置３８と、第１ピペット保持部材４０と、微動機構４２と、を備える。第１マニピュレータ３０は、Ｘ軸－Ｙ軸－Ｚ軸の３軸構成のマニピュレータである。
【0030】
Ｘ－Ｙ軸テーブル３２は、駆動装置３６の駆動により、Ｘ軸方向又はＹ軸方向に移動可能となっている。Ｚ軸テーブル３４は、Ｘ－Ｙ軸テーブル３２上に上下移動可能に配置され、駆動装置３８の駆動によりＺ軸方向に移動可能になっている。駆動装置３６、３８は、コントローラ１００に電気的に接続されている。
【0031】
第１ピペット保持部材４０は、Ｚ軸テーブル３４に連結され、先端に毛細管チップである第１ピペット６０が取り付けられている。第１ピペット保持部材４０は、Ｘ－Ｙ軸テーブル３２とＺ軸テーブル３４の移動に従って３次元空間を移動領域として移動し、試料保持部材２２に収容された試料を、第１ピペット６０を介して保持することができる。
【0032】
すなわち、第１マニピュレータ３０は、試料の保持に用いられる保持用マニピュレータであり、第１ピペット６０は、試料の保持手段として用いられるホールディングピペットである。試料は、例えば、第１ピペット６０と接続されているシリンジポンプ６２によって、第１ピペット６０の先端にて吸引保持される。第１ピペット６０の内部圧力は、シリンジポンプ６２から供給される圧力の制御値により制御される。第１ピペット６０の口径φ１（図５参照）は、保持対象の試料の直径の１／１０以上１／５以下であることが好ましい。実施形態において、オルガノイド２００（図６参照）の直径が２００～４００μｍ程度である場合、第１ピペット６０として、口径φ１が４０μｍのピペットを使用することが好ましい。
【0033】
Ｘ－Ｙ軸テーブル３２とＺ軸テーブル３４は、第１ピペット保持部材４０を、試料保持部材２２に収容された試料等の保持位置まで粗動駆動する粗動機構（３次元移動テーブル）として構成されている。また、Ｚ軸テーブル３４と第１ピペット保持部材４０との連結部には、ナノポジショナとして微動機構４２が備えられている。微動機構４２は、第１ピペット保持部材４０をその長手方向（軸方向）に移動可能に支持するとともに、第１ピペット保持部材４０をその長手方向（軸方向）に沿って微動駆動するように構成される。
【0034】
図２に示すように微動機構４２は、第１ピペット保持部材４０を駆動対象とする圧電アクチュエータ４４を備える。圧電アクチュエータ４４は、筒状のハウジング４６と、ハウジング４６の内部に設けられた転がり軸受４８と、中空部材５０と、ロックナット５２と、スペーサ５４と、圧電素子５６と、蓋５８と、を含む。ハウジング４６の軸方向に第１ピペット保持部材４０が挿通される。
【0035】
第１ピペット保持部材４０は、転がり軸受４８を介してハウジング４６に支持される。転がり軸受４８は、第１ピペット保持部材４０を回転可能に支持する。転がり軸受４８は、内輪４８ａと、外輪４８ｂと、内輪４８ａと外輪４８ｂとの間に設けられたボール４８ｃとを備える。外輪４８ｂがハウジング４６の内周面に固定され、内輪４８ａが中空部材５０を介して第１ピペット保持部材４０の外周面に固定される。このように、転がり軸受４８は、第１ピペット保持部材４０を回転自在に支持するようになっている。第１ピペット保持部材４０の先端側（図２左側）には第１ピペット６０（図１参照）が取り付けられ固定される。
【0036】
中空部材５０の軸方向の略中央部には、径方向外方に突出するフランジ部５０ａが設けられている。転がり軸受４８は、実施形態において、フランジ部５０ａに対して第１ピペット保持部材４０の軸方向の先端側及び後端側に１つずつ、内輪間座としてのフランジ部５０ａを挟んで配置される。ロックナット５２は、外周面にねじ加工が施された第１ピペット保持部材４０に、内輪４８ａの先端側及び後端側から螺合されて、転がり軸受４８の軸方向の位置を固定している。円環状のスペーサ５４は、転がり軸受４８と同軸に外輪４８ｂの軸方向後端側に配置される。
【0037】
スペーサ５４の軸方向後端側には、円環状の圧電素子５６がスペーサ５４と略同軸に配置される。圧電素子５６はスペーサ５４を介して転がり軸受４８と接している。圧電素子５６は、リード線（図示せず）を介して制御回路としてのコントローラ１００に接続されている。圧電素子５６は、コントローラ１００からの印加電圧に応答して第１ピペット保持部材４０の軸方向に沿って伸縮し、第１ピペット保持部材４０をその軸方向に沿って微動させるようになっている。
【0038】
圧電素子５６の軸方向後端側にはハウジング４６の蓋５８が配置される。蓋５８は、圧電素子５６を軸方向に固定するためのもので、第１ピペット保持部材４０が挿通する孔部を有する。蓋５８は、例えば、ハウジング４６の側面に不図示のボルトにより締結されていてもよい。なお、圧電素子５６は、棒状又は角柱状としてスペーサ５４の周方向に略等配となるように並べても良く、第１ピペット保持部材４０を挿通する孔部を有した角筒としても良い。
【0039】
第１ピペット保持部材４０が軸方向に沿って微動すると、この微動が第１ピペット６０（図１参照）に伝達され、第１ピペット６０の位置が微調整されることになる。また、圧電素子５６により第１ピペット保持部材４０が軸方向に振動すると、第１ピペット６０も軸方向に振動する。このように微動機構４２により、試料への操作（試料の保持及び移動）の際には、より正確な操作が可能となる。
【0040】
図１に示すように、第２マニピュレータ７０は、Ｘ－Ｙ軸テーブル７２と、Ｚ軸テーブル７４と、Ｘ－Ｙ軸テーブル７２を駆動する駆動装置７６と、Ｚ軸テーブル７４を駆動する駆動装置７８と、第２ピペット保持部材８０と、微動機構８２と、を備える。第２マニピュレータ７０は、Ｘ軸－Ｙ軸－Ｚ軸の３軸構成のマニピュレータである。
【0041】
Ｘ－Ｙ軸テーブル７２は、駆動装置７６の駆動により、Ｘ軸方向又はＹ軸方向に移動可能となっている。Ｚ軸テーブル７４は、Ｘ－Ｙ軸テーブル７２上に上下移動可能に配置され、駆動装置７８の駆動によりＺ軸方向に移動可能になっている。駆動装置７６、７８は、コントローラ１００に接続されている。
【0042】
第２ピペット保持部材８０は、Ｚ軸テーブル７４に連結され、先端にマイクロピペットである第２ピペット９０が取り付けられている。第２ピペット保持部材８０は、Ｘ－Ｙ軸テーブル７２とＺ軸テーブル７４の移動に従って３次元空間を移動領域として移動し、試料保持部材２２に収容された試料を人工操作することが可能である。
【0043】
すなわち、第２マニピュレータ７０は、試料の操作（ＤＮＡ溶液の注入操作や穿孔操作等）に用いられる操作用マニピュレータであり、第２ピペット９０は、試料のインジェクション操作手段として用いられるインジェクションピペットである。試料は、例えば、第２ピペット９０と接続されている注入ポンプ９２によって、第２ピペット９０の先端から細胞Ｃｅ（図７等参照）等が注入される。第２ピペット９０の内部圧力は、注入ポンプ９２から供給される圧力の制御値により制御される。第２ピペット９０の口径φ２（図５参照）は、細胞Ｃｅの直径以上である。実施形態において、細胞Ｃｅの直径が１０～１５μｍ程度である場合、第２ピペット９０として、口径φ２が１５μｍ以上のピペットが使用される。
【0044】
Ｘ－Ｙ軸テーブル７２とＺ軸テーブル７４は、第２ピペット保持部材８０を、試料保持部材２２に収容された試料等の操作位置まで粗動駆動する粗動機構（３次元移動テーブル）として構成されている。また、Ｚ軸テーブル７４と第２ピペット保持部材８０との連結部には、ナノポジショナとして微動機構８２が備えられている。微動機構８２は、第２ピペット保持部材８０をその長手方向（軸方向）に移動可能に支持するとともに、第２ピペット保持部材８０をその長手方向（軸方向）に沿って微動駆動するように構成される。微動機構８２の構成は、第１マニピュレータ３０の微動機構４２と同様の構成であるため、説明を省略する。
【0045】
第２ピペット保持部材８０が軸方向に沿って微動すると、この微動が第２ピペット９０に伝達され、第２ピペット９０の位置が微調整されることになる。また、圧電素子５６（図２参照）により第２ピペット保持部材８０が軸方向に振動すると、第２ピペット９０も軸方向に振動する。このように微動機構８２により、試料への操作（細胞Ｃｅの注入操作や穿孔操作等）の際には、より正確な操作が可能となる。
【0046】
なお、上述の微動機構４２、８２は、試料の固定用の第１マニピュレータ３０及び試料の操作用の第２マニピュレータ７０のいずれにも設けられるとしているが、操作用の第２マニピュレータ７０のみに設けてもよく、省略することも可能である。
【0047】
【0048】
コントローラ１００は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）等のマイクロプロセッサを有する演算処理装置を含む演算部１１０、ＲＯＭ（Read Only Memory）又はＲＡＭ（Random Access Memory）等のメモリを有する記憶装置を含む記憶部１１２、及び入出力インターフェース装置等のハードウェア資源を備える。コントローラ１００の機能は、記憶部１１２に格納された所定のプログラムを演算部１１０が実行することで実現される。コントローラ１００は、演算部１１０による演算結果に従って、各構成要素に各種機能を実行させる制御信号を出力する。
【0049】
コントローラ１００は、顕微鏡ユニット１０の焦点合わせ機構１６、第１マニピュレータ３０の駆動装置３６、駆動装置３８、圧電素子５６、シリンジポンプ６２、第２マニピュレータ７０の駆動装置７６、駆動装置７８、圧電素子５６、注入ポンプ９２を制御し、必要に応じて設けられたドライバやアンプ等を介してそれぞれに制御信号を出力する。
【0050】
コントローラ１００は、例えば、駆動装置３６、３８、７６、７８にそれぞれ駆動信号ＶＸＹ、ＶＺ（図１参照）を供給する。駆動装置３６、３８、７６、７８は、駆動信号ＶＸＹ、ＶＺに基づいてＸ－Ｙ－Ｚ軸方向に駆動する。コントローラ１００は、微動機構４２、８２にナノポジショナ制御信号ＶＮ（図１参照）を供給して、微動機構４２、８２の制御を行ってもよい。コントローラ１００は、例えば、シリンジポンプ６２に、第１ピペット６０（図１参照）の内部を加圧又は減圧調整するための圧力制御信号ＶＰ１を供給する。シリンジポンプ６２は、圧力制御信号ＶＰ１に基づいて、第１ピペット６０の内部を加圧又は減圧する。コントローラ１００は、例えば、注入ポンプ９２に、第２ピペット９０（図１参照）の内部を加圧又は減圧するための圧力制御信号ＶＰ２を供給する。この場合、注入ポンプ９２は、圧力制御信号ＶＰ１に基づいて、第２ピペット９０の内部を減圧する。
【0051】
コントローラ１００は、情報入力手段としてジョイスティック１１４と、キーボード、マウス又はタッチパネル等の入力部１１６と、シリンジポンプインターフェース１１８と、注入ポンプインターフェース１２０と、が接続されている。
【0052】
ジョイスティック１１４は公知のものを用いることができる。ジョイスティック１１４は、基台１１４ａと、基台１１４ａから直立するハンドル部１１４ｂとを備えており、ハンドル部１１４ｂを傾斜させるように操作することで駆動装置３６、７６のＸ－Ｙ駆動を行うことができ、ハンドル部１１４ｂをねじることで駆動装置３８、７８のＺ駆動を行うことができる。ジョイスティック１１４は、圧電素子５６、シリンジポンプ６２、注入ポンプ９２の各駆動を操作するためのボタン１１４ｃを備えていてもよい。
【0053】
シリンジポンプインターフェース１１８は、作業者がシリンジポンプ６２に対する操作情報を入力するためのポンプ操作情報入力部である。図１に示すように、シリンジポンプインターフェース１１８は、操作ノブ１１８ａを備えている。シリンジポンプインターフェース１１８は、操作ノブ１１８ａを回転させることで、回転変位量に対応した制御値によってシリンジポンプ６２から供給される圧力を調整することができる。
【0054】
注入ポンプインターフェース１２０は、作業者が注入ポンプ９２に対する操作情報を入力するためのポンプ操作情報入力部である。図１に示すように、注入ポンプインターフェース１２０は、操作ノブ１２０ａを備えている。注入ポンプインターフェース１２０は、操作ノブ１２０ａを回転させることで、回転変位量に対応した制御値によって注入ポンプ９２から供給される圧力を調整することができる。
【0055】
また、コントローラ１００は、液晶パネル等の表示部１２２が接続される。表示部１２２にはカメラ１４で取得した顕微鏡画像や各種制御用画面が表示されるようになっている。なお、入力部１１６としてタッチパネルが用いられる場合には、表示部１２２の表示画面にタッチパネルを重ねて用い、作業者が表示部１２２の表示画像を確認しつつ入力操作を行うようにしてもよい。
【0056】
図３に示すように、コントローラ１００は、さらに画像入力部１０２、画像処理部１０４、画像出力部１０６及び、位置検出部１０８を備えている。顕微鏡１２を通してカメラ１４で撮像した画像信号ＶＰＩＸ（図１参照）が画像入力部１０２に入力される。画像処理部１０４は、画像入力部１０２から画像信号を受け取って、画像処理を行う。画像処理部１０４は、例えば、画像入力部１０２から受け取った画像信号をグレースケール化して、グレースケール画像に基づいてエッジ抽出処理やパターンマッチングを行う。画像出力部１０６は、画像処理部１０４で画像処理された画像情報を表示部１２２へ出力する。
【0057】
位置検出部１０８は、カメラ１４で撮像された試料の位置や、試料に対して操作を行う第１ピペット６０及び第２ピペット９０等の治具の位置を、画像処理後の画像情報に基づいて検出することができる。位置検出部１０８は、画像情報に基づいてカメラ１４の撮像領域内における試料及び治具等の有無を検出することができる。画像入力部１０２、画像処理部１０４、画像出力部１０６及び位置検出部１０８は、演算部１１０により制御される。
【0058】
コントローラ１００は、位置検出部１０８からの試料及び治具等の有無の情報及び位置情報に基づいて、第１マニピュレータ３０及び第２マニピュレータ７０を制御してもよい。本実施形態において、コントローラ１００は、第１マニピュレータ３０及び第２マニピュレータ７０を所定のシーケンスで自動的に駆動してもよい。かかるシーケンス駆動は、記憶部１１２にあらかじめ保存された所定のプログラムによる演算部１１０の演算結果に基づいて、コントローラ１００が順次それぞれに駆動信号を出力することで行われる。
【0059】
［オルガノイド２００への細胞Ｃｅの注入手順］
次に、オルガノイド２００への細胞Ｃｅの注入手順について、図４から図７までを参照して説明する。図４は、操作対象であるオルガノイド２００の一例を模式的に示す図である。図５は、比較例におけるオルガノイド２００への穿孔動作の一例を示す図である。図６は、実施形態におけるオルガノイド２００への穿孔準備動作を示す図である。図７は、実施形態におけるオルガノイド２００への穿孔動作を示す図である。
次に、オルガノイド２００への細胞Ｃｅの注入手順について、図４から図７までを参照して説明する。図４は、操作対象であるオルガノイド２００の一例を模式的に示す図である。図５は、比較例におけるオルガノイド２００への穿孔動作の一例を示す図である。図６は、実施形態におけるオルガノイド２００への穿孔準備動作を示す図である。図７は、実施形態におけるオルガノイド２００への穿孔動作を示す図である。
【0060】
オルガノイド２００は、臓器の形成過程を模倣して多能性幹細胞から３次元培養して作成される３次元組織である。オルガノイド２００は、ミニ臓器とも呼ばれ、臓器を構成する細胞から臓器と同様の構造に形成される。実施形態のオルガノイド２００は、上皮層２１０と、内腔２２０と、を有する。すなわち、実施形態のオルガノイド２００は、管腔構造を有する臓器を模倣した構造である。
【0061】
上皮層２１０は、管腔臓器の粘膜を構成する上皮細胞による層であり、粘弾性体である。上皮層２１０は、オルガノイド２００の外部に面する外表面に基底膜２１２を有し、内表面に頂端膜２１４を有する。実施形態において、オルガノイド２００全体の直径が２００～４００μｍ程度であるのに対し、上皮層２１０の厚みは、１０～２０μｍ程度である。内腔２２０は、上皮層２１０の頂端膜２１４より内側の空洞である。すなわち、頂端膜２１４は、上皮層２１０と内腔２２０との境界である。実施形態のオルガノイド２００は、ＭＡＴＲＩＧＡＬ（登録商標）等の基底膜マトリックスの中で成長し培養された後、分注機器によって、試料保持部材２２（図１参照）内に培養用培地により作成された５００μｍ程度の細胞操作用ドロップＤｍ（図９等参照）に分注される。
【0062】
細胞Ｃｅは、オルガノイド２００が摸倣する臓器を構成する細胞ではない細胞（外来細胞という）である。実施形態の細胞Ｃｅの直径は、１０～１５μｍ程度である。試料保持部材２２の細胞懸濁ドロップＤｓ（図９等参照）内には、オルガノイド２００に注入するための細胞Ｃｅが複数配置される。実施形態では、第２ピペット９０によって、細胞懸濁ドロップＤｓ内の細胞Ｃｅを１つ回収する。
【0063】
細胞操作用ドロップＤｍ内で第１ピペット６０によってオルガノイド２００を吸引保持した状態で、１つの細胞Ｃｅを回収した第２ピペット９０をオルガノイド２００に対向する位置まで移動させ、図６に示す穿孔準備動作を行った後、図７に示す穿孔動作を実施してオルガノイド２００の内腔２２０に先端を挿入し、細胞Ｃｅを注入する。
【0064】
ここで、図５に示す比較例のように、後述の穿孔準備動作を実施せずに穿孔を試行した場合について説明する。図５に示すように、第１ピペット６０の先端の開口６０ａをオルガノイド２００に対向させ、シリンジポンプ６２（図１参照）を陰圧に駆動すると、オルガノイド２００が第１ピペット６０の先端に吸引され保持される。
【0065】
この状態で、オルガノイド２００を挟んで、第１ピペット６０の先端の開口６０ａに対して先端の開口９０ａが対向する位置に、第２ピペット９０を配置し、オルガノイド２００に向かって軸方向に移動させる。すると、粘弾性体である上皮層２１０は、第２ピペット９０の先端により内腔２２０側に押されて変形するのみで穿孔されない。
【0066】
実施形態では、第２ピペット９０の先端でオルガノイド２００の上皮層２１０を穿孔する穿孔動作を実施する前に、図６に示す穿孔準備動作を実施する。穿孔準備動作は、穿孔する部分の上皮層２１０に面方向の張力を生じさせるとともに厚みを薄くすることを目的とする。図６に示すように、第１ピペット６０の先端の開口６０ａをオルガノイド２００に対向させ、シリンジポンプ６２（図１参照）を陰圧に駆動すると、オルガノイド２００が第１ピペット６０の先端に吸引され保持される。
【0067】
この状態で、さらに吸引を進め、第１ピペット６０の開口６０ａより内部側に、内腔２２０の一部が入り込むまで、第１ピペット６０の内部にオルガノイド２００を吸引する。これにより、上皮層２１０は、第１ピペット６０の内部に入り込んでいる部分に向かって引っ張られ、面方向の張力が生じるとともに、第１ピペット６０の開口６０ａとは反対側で厚みが薄くなる。第１ピペット６０の開口６０ａより内部側に内腔２２０の一部が入り込み、上皮層２１０の第１ピペット６０の開口６０ａとは反対側で厚みｔが薄くなったことを確認すると、穿孔準備動作を終了する。
【0068】
図６に示す穿孔準備動作の後、図７に示すように、オルガノイド２００を挟んで、第１ピペット６０の先端の開口６０ａに対して先端の開口９０ａが対向する位置に、細胞Ｃｅを内包した第２ピペット９０を配置し、オルガノイド２００に向かって軸方向に移動させる。すると、上皮層２１０は、面方向に張力が生じているため、第２ピペット９０の先端により内腔２２０側に押された際に内腔２２０側に変形して逃げることができず、穿孔される。第２ピペット９０の先端が内腔２２０に挿入された後は、注入ポンプ９２を陽圧に駆動させて、内部の細胞Ｃｅを吐出させることで、オルガノイド２００の内腔２２０内への細胞Ｃｅ注入を実施する。
【0069】
［システムの動作］
次に、物質注入装置１の駆動方法について説明する。図８は、図１に示す物質注入装置１の動作の一例を示すフローチャート図である。図９から図１４までは、図１に示す物質注入装置１の動作を説明するための説明図である。実施形態において、物質注入装置１では、１つのオルガノイド２００に対して、１つの細胞Ｃｅを注入する操作を実行する。
次に、物質注入装置１の駆動方法について説明する。図８は、図１に示す物質注入装置１の動作の一例を示すフローチャート図である。図９から図１４までは、図１に示す物質注入装置１の動作を説明するための説明図である。実施形態において、物質注入装置１では、１つのオルガノイド２００に対して、１つの細胞Ｃｅを注入する操作を実行する。
【0070】
物質注入装置１の動作を開始する前に、作業者は、まず、ジョイスティック１１４を操作して、図１に示すカメラ１４の視野内に、第１ピペット６０及び第２ピペット９０を配置する。ここで、第１ピペット６０の先端の高さは試料保持部材２２の底面よりわずかに上の位置とする。作業者は、次に、顕微鏡１２の焦点合わせ機構１６（図３参照）を用いて、焦点を第１ピペット６０に合わせる。
【0071】
作業者は、焦点を第１ピペット６０に合わせた状態で、焦点が合うように第２ピペット９０の高さを調整する。作業者は、次に、試料保持部材２２内の細胞懸濁ドロップＤｓ及び細胞操作用ドロップＤｍの周辺を、カメラ１４の視野と重なるように試料ステージ２０を移動させる。
【0072】
図８及び図９に示すように、ステップＳ１では、細胞懸濁ドロップＤｓの内部において、先端の開口９０ａが細胞Ｃｅに近接する位置へ、第２ピペット９０を移動させる。具体的には、作業者は、ジョイスティック１１４を操作して、コントローラ１００に第２マニピュレータ７０の駆動装置７６、７８を駆動させ、第２ピペット９０の先端が細胞懸濁ドロップＤｓの内部において細胞Ｃｅに近接する位置へ移動するための駆動信号ＶＸＹを供給させる。これにより、第２ピペット９０は、先端の開口９０ａが、細胞Ｃｅの１つに対向する位置に移動する。
【0073】
図８及び図１０に示すように、ステップＳ２では、注入ポンプ９２を陰圧に駆動し、第２ピペット９０の内部を陰圧にさせて、細胞Ｃｅを回収する。具体的には、作業者は、注入ポンプインターフェース１２０を操作して、コントローラ１００に注入ポンプ９２を陰圧に駆動するための圧力制御信号ＶＰ２を供給させる。これにより、第２ピペット９０の内部が減圧されることで、先端の開口９０ａから内部に細胞Ｃｅが引き込まれて回収される。
【0074】
図８及び図１１に示すように、ステップＳ３では、細胞操作用ドロップＤｍの内部において、先端の開口６０ａ、９０ａがオルガノイド２００を挟んで対向する位置へ、第１ピペット６０及び第２ピペット９０を移動させる。具体的には、作業者は、まず、ジョイスティック１１４を操作して、コントローラ１００に第１マニピュレータ３０の駆動装置３６、３８を駆動させ、第１ピペット６０の先端の開口６０ａが細胞操作用ドロップＤｍの内部においてオルガノイド２００に近接する位置へ移動するための駆動信号ＶＸＹを供給させる。これにより、第１ピペット６０は、先端の開口６０ａが、オルガノイド２００に対向する位置に移動する。
【0075】
作業者は、次に、ジョイスティック１１４を操作して、コントローラ１００に第２マニピュレータ７０の駆動装置７６、７８を駆動させ、第２ピペット９０の先端の開口９０ａが細胞操作用ドロップＤｍの内部において第１ピペット６０と反対側からオルガノイド２００に近接する位置へ移動するための駆動信号ＶＸＹを供給させる。これにより、第２ピペット９０は、先端の開口９０ａが、オルガノイド２００に対向する位置に移動する。
【0076】
図８及び図１２に示すように、ステップＳ４では、シリンジポンプ６２を陰圧に駆動し、第１ピペット６０でオルガノイド２００を吸引保持し、さらにオルガノイド２００の一部を内部に吸引させる。具体的には、作業者は、まず、シリンジポンプインターフェース１１８を操作して、コントローラ１００にシリンジポンプ６２を陰圧に駆動するための圧力制御信号ＶＰ１を供給させる。これにより、第１ピペット６０の内部が減圧されて、開口６０ａからオルガノイド２００が吸引され、オルガノイド２００が第１ピペット６０の先端に吸引保持される。
【0077】
作業者は、第１ピペット６０の開口６０ａより内部側に、オルガノイド２００の一部が入り込むまで、吸引を継続させる。実施形態において、作業者は、第１ピペット６０の開口６０ａより内部側に、内腔２２０の一部が入り込むまで、吸引を継続させる。内腔２２０の一部が入り込んだ状態とは、第１ピペット６０の開口６０ａよりも内部側に、少なくとも頂端膜２１４の一部が存在する状態である。内腔２２０の一部が入り込まない場合、作業者は、シリンジポンプインターフェース１１８を操作して、圧力の制御値をさらに陰圧側に調整し、コントローラ１００にシリンジポンプ６２による陰圧を大きくするための圧力制御信号ＶＰ１を供給させる。第１ピペット６０の内部に内腔２２０の一部が入り込むまでオルガノイド２００を吸引すると、上皮層２１０は、第１ピペット６０の内部に入り込んでいる部分に向かって引っ張られ、面方向の張力が生じるとともに、第１ピペット６０の開口６０ａとは反対側で厚みが薄くなる。
【0078】
作業者は、第１ピペット６０の開口６０ａより内部側に内腔２２０の一部が入り込んだことを確認することで、上皮層２１０の穿孔予定位置に十分な張力が生じたと判断する。作業者は、シリンジポンプインターフェース１１８を操作して、シリンジポンプ６２による圧力の制御値を一定のまま維持させる。第１ピペット６０の開口６０ａより内部側にオルガノイド２００の一部、又は内腔２２０の一部が入り込んだことの確認は、コントローラ１００が実施してもよい。
【0079】
具体的には、第１ピペット６０及びオルガノイド２００を、カメラ１４により撮像し、この画像データを、画像入力部１０２から画像信号として画像処理部１０４に送る。画像データは、第１ピペット６０の開口６０ａの仮想面に平行な方向から撮像したものであることが好ましい。画像処理部１０４は、第１ピペット６０の開口６０ａの位置及び形状と、オルガノイド２００の上皮層２１０の位置及び形状と、が検出できるよう、二値化処理、フィルタ処理、エッジ抽出処理及びパターンマッチングを行う。その処理結果に基づいて、位置検出部１０８は、第１ピペット６０の開口６０ａ及び上皮層２１０の位置及び形状を検出することができる。
【0080】
コントローラ１００は、検出された各々の位置及び形状に基づいて、内腔２２０が開口６０ａより第１ピペット６０の内部に入り込んでいるか否かを判断する。コントローラ１００は、内腔２２０が開口６０ａより第１ピペット６０の内部に入り込んでいるか否かの判断結果によって、オルガノイド２００の一部が開口６０ａより第１ピペット６０の内部に入り込んだ状態か否かを判断する。コントローラ１００は、例えば、開口６０ａのラインより上皮層２１０の内側である頂端膜２１４が第１ピペット６０の内側に位置している場合、第１ピペット６０の開口６０ａより内部側に内腔２２０の一部が入り込んだと判断する。コントローラ１００は、第１ピペット６０の軸方向において、第１ピペット６０の内側に入り込んだ頂端膜２１４と開口６０ａとの距離が所定の閾値以上である場合に、第１ピペット６０の開口６０ａより内部側に内腔２２０の一部が入り込んだと判断してもよい。
【0081】
また、コントローラ１００は、画像データにおいて、第１ピペット６０の開口６０ａより内側に入り込んだ内腔２２０の面積が、ステップＳ４より以前に取得した内腔２２０の面積の初期値より大きいか否かを判断し、初期値より大きいと判断した場合に、第１ピペット６０の開口６０ａより内部側に内腔２２０の一部が入り込んだと判断してもよい。コントローラ１００は、第１ピペット６０の開口６０ａより内側に入り込んだ内腔２２０の面積が、初期値を基準とした所定の閾値以上である場合に、第１ピペット６０の開口６０ａより内部側に内腔２２０の一部が入り込んだと判断してもよい。
【0082】
また、コントローラ１００は、画像データにおいて、第１ピペット６０の開口６０ａより外側である内腔２２０の面積が、ステップＳ４より以前の初期値より小さいか否かを判断し、初期値より小さいと判断した場合に、第１ピペット６０の開口６０ａより内部側に内腔２２０の一部が入り込んだと判断してもよい。コントローラ１００は、第１ピペット６０の開口６０ａより外側である内腔２２０の面積が、初期値に対して、所定の閾値以下に減少した場合に、第１ピペット６０の開口６０ａより内部側に内腔２２０の一部が入り込んだと判断してもよい。すなわち、コントローラ１００は、各状態における画像データを取得し、これら比較することで、第１ピペット６０の開口６０ａより内部側に内腔２２０の一部が入り込んだと判断できる。
【0083】
また、コントローラ１００は、第１ピペット６０の開口６０ａとは反対側の上皮層２１０の厚みｔ（図６参照）が減少しているか否かによって、張力の状態を評価してもよい。すなわち、コントローラ１００は、画像データに基づいて、吸引されている部分とは反対側の上皮層２１０の厚みｔが、オルガノイド２００を吸引保持する前の厚み（初期値）より小さいか否かを判断し、初期値より小さいと判断した場合に、上皮層２１０に十分な張力が生じたと判断し、次のステップＳ５に進んでもよい。コントローラ１００は、厚みｔが、初期値に対して、所定の閾値以上減少した場合、厚みｔが薄くなったと判断し、上皮層２１０に十分な張力が生じたと判断してもよい。
【0084】
ここで、上述した各「所定の閾値」は、予め記憶部１１２等に記憶された値である。例えば、カメラ１４による撮像画像に基づいて取得されたオルガノイド２００の外径や内腔２２０の面積、上皮層２１０の厚み等と、対応する閾値と、の相関関係を記憶部１１２に予め記憶しておき、撮像画像から取得したオルガノイド２００の各部のサイズに基づいて、コントローラ１００が都度閾値を決定してもよい。
【0085】
図８及び図１３に示すように、ステップＳ５では、第２ピペット９０を軸方向に移動させ、先端をオルガノイド２００の内腔２２０内へ挿入させる。具体的には、作業者は、ジョイスティック１１４を操作して、コントローラ１００に第２マニピュレータ７０の駆動装置７６、７８を駆動させ、第２ピペット９０がオルガノイド２００に向かって前進するための駆動信号ＶＸＹを供給させる。これにより、第２ピペット９０の先端でオルガノイド２００の上皮層２１０が穿孔され、先端の開口９０ａが内腔２２０内へ挿入される。
【0086】
図８及び図１４に示すように、ステップＳ６では、注入ポンプ９２を陽圧に駆動し、第２ピペット９０の内部を陽圧にさせて、細胞Ｃｅをオルガノイド２００の内腔２２０内へ吐出させる。具体的には、作業者は、注入ポンプインターフェース１２０を操作して、コントローラ１００に注入ポンプ９２を陽圧に駆動するための圧力制御信号ＶＰ２を供給させる。これにより、第２ピペット９０の内部が加圧されることで、内包された細胞Ｃｅが、先端の開口９０ａを通ってオルガノイド２００内腔２２０内へ吐出される。
【0087】
オルガノイド２００の内腔２２０内へ細胞Ｃｅを吐出した後、作業者は、コントローラ１００に第２マニピュレータ７０の駆動装置７６、７８を駆動させ、第２ピペット９０をオルガノイド２００から抜き、所定の初期位置に移動させるための駆動信号ＶＸＹ、ＶＺを供給させる。これにより、第２ピペット９０は、所定の初期位置に戻る。なお、第２ピペット９０による穿孔で開いた上皮層２１０の孔は、上皮層２１０を構成する細胞が成長することにより数日で閉塞する。
【0088】
また、作業者は、ジョイスティック１１４を操作して、コントローラ１００に第１マニピュレータ３０の駆動装置３６、３８を駆動させ、処理済みのオルガノイド２００を載置する所定の位置に第１ピペット６０が吸引保持するオルガノイド２００を移動させるための駆動信号ＶＸＹを供給させる。これにより、第１ピペット６０は、先端が、処理済みのオルガノイド２００を載置する所定の位置に移動する。
【0089】
作業者は、次に、シリンジポンプインターフェース１１８を操作して、コントローラ１００にシリンジポンプ６２を陽圧に駆動するための圧力制御信号ＶＰ１を供給させる。これにより、第１ピペット６０の内部が加圧されて、オルガノイド２００への吸引が解除され、オルガノイド２００が第１ピペット６０の先端の開口６０ａから離れる。作業者は、次に、ジョイスティック１１４を操作して、コントローラ１００に第１マニピュレータ３０の駆動装置３６、３８を駆動させ、第１ピペット６０を所定の初期位置に移動させるための駆動信号ＶＸＹ、ＶＺを供給させる。これにより、第１ピペット６０は、所定の初期位置に戻る。
【0090】
以上説明したように、実施形態の物質注入装置１は、細胞から培養され上皮層２１０の内側に内腔２２０を有するオルガノイド２００が載置される試料ステージ２０と、先端に開口６０ａを有し、先端にオルガノイド２００を保持可能な第１ピペット６０を備える第１マニピュレータ３０と、第１ピペット６０と接続して第１ピペット６０の内部圧力を調整可能なシリンジポンプ６２と、オルガノイド２００を構成する細胞とは異なる細胞Ｃｅを示す外来細胞を先端から吐出可能な第２ピペット９０を備える第２マニピュレータ７０と、試料ステージ２０、第１マニピュレータ３０、シリンジポンプ６２、及び第２マニピュレータ７０を制御するコントローラ１００と、を備え、コントローラ１００は、第１ピペット６０の内部を陰圧にすることでオルガノイド２００を吸引保持させ、オルガノイド２００の一部が開口６０ａより第１ピペット６０の内部に入り込んだ状態で、第２ピペット９０で上皮層２１０を穿孔させ、外来細胞（細胞Ｃｅ）を内腔２２０に吐出させる。
【0091】
これによれば、オルガノイド２００の一部が第１ピペット６０の開口６０ａより内部に入り込んだ状態では、オルガノイド２００の上皮層２１０が第１ピペット６０の開口６０ａより内部に引っ張られ、第１ピペット６０の開口６０ａより外部の上皮層２１０に面方向の張力が生じる。粘弾性体である上皮層２１０に張力を生じさせることで、第２ピペット９０の先端が上皮層２１０に接触した際の反力が増大し、容易に穿孔することができる。第２ピペット９０で穿孔する前に、第１ピペット６０でオルガノイド２００を十分吸引すればよいので、作業者の熟練度及び技術によらず、オルガノイド２００の内腔２２０に外来細胞を安定して注入することが可能である。
【0092】
また、実施形態の物質注入装置１は、第１ピペット６０及びオルガノイド２００を撮像する撮像部（顕微鏡ユニット１０）を備え、コントローラ１００は、撮像部の画像データに基づいて、オルガノイド２００の一部が開口６０ａより第１ピペット６０の内部に入り込んだ状態か否かを内腔２２０が開口６０ａより第１ピペット６０の内部に入り込んでいるか否かで判断する。
【0093】
これによれば、コントローラ１００が、画像データに基づいて第１ピペット６０及びオルガノイド２００の位置及び形状を検出することができ、第１ピペット６０の開口６０ａの位置や上皮層２１０と内腔２２０との境界の位置及び形状に基づいて、内腔２２０が開口６０ａより内部に入り込んでいるか否かを判断することができる。また、これらの撮像、検出、判断が、制御により自動的に行われるため、効率よくかつ好適に上皮層２１０に張力を生じさせた状態で穿孔することができる。
【0094】
また、実施形態の物質注入装置１おいて、コントローラ１００は、第１ピペット６０の内部に入り込んだ上皮層２１０と内腔２２０との境界の頂端膜２１４が、開口６０ａより第１ピペット６０の内部に位置する場合、内腔２２０が開口６０ａより第１ピペット６０の内部に入り込んでいると判断する。
【0095】
これによれば、コントローラ１００が、画像データに基づいて、内腔２２０が開口６０ａより内部に入り込んでいるか否かを定量的に判断することができる。また、これらの撮像、検出、判断が、制御により自動的に行われるため、効率よくかつ好適に上皮層２１０に張力を生じさせた状態で穿孔することができる。
【0096】
また、実施形態の物質注入装置１おいて、コントローラ１００は、第１ピペット６０でオルガノイド２００を吸引させる前の画像データにおける内腔２２０の面積を初期値として予め取得し、第１ピペット６０の内部に入り込んだ内腔２２０の画像データにおける面積が、初期値より大きいか否かを判断し、初期値より大きいと判断した場合、内腔２２０が開口６０ａより第１ピペット６０の内部に入り込んでいると判断する。
【0097】
これによれば、コントローラ１００が、画像データに基づいて、内腔２２０が開口６０ａより内部に入り込んでいるか否かを定量的に判断することができる。また、これらの撮像、検出、判断が、制御により自動的に行われるため、効率よくかつ好適に上皮層２１０に張力を生じさせた状態で穿孔することができる。
【0098】
また、実施形態の物質注入装置１は、第１ピペット６０及びオルガノイド２００を撮像する撮像部（顕微鏡ユニット１０）を備え、コントローラ１００は、第１ピペット６０でオルガノイド２００を吸引させる前の撮像部の画像データにおける上皮層２１０の厚みを初期値として予め取得し、第１ピペット６０に吸引保持されたオルガノイド２００の開口６０ａとは反対側の上皮層２１０の撮像部の画像データにおける厚みが、初期値より小さいか否かを判断し、初期値より小さいと判断した場合、第２ピペット９０で上皮層２１０を穿孔させ、外来細胞（細胞Ｃｅ）を内腔２２０に吐出させる。
【0099】
これによれば、コントローラ１００が、画像データに基づいて、内腔２２０が開口６０ａより内部に入り込んでいるか否かを定量的に判断することができる。また、これらの撮像、検出、判断が、制御により自動的に行われるため、効率よくかつ好適に上皮層２１０に張力を生じさせた状態で穿孔することができる。
【0100】
また、実施形態の物質注入装置１は、第２ピペット９０を軸方向に移動させるための圧電素子５６を含む微動機構８２を備え、コントローラ１００は、第２ピペット９０を軸方向に加振した状態で、上皮層２１０を穿孔させる。
【0101】
これによれば、微動機構８２が第２ピペット９０を挿入方向に加振することができるため、加振された第２ピペット９０を上皮層２１０に接触させることで、オルガノイド２００の大変形を抑制した穿孔を行うことができる。
【0102】
また、実施形態の外来細胞（細胞Ｃｅ）を内包するオルガノイド２００の作成方法は、先端に開口６０ａを有する第１ピペット６０を、細胞から培養され上皮層２１０の内側に内腔２２０を有するオルガノイド２００に対向させる第１ピペット配置ステップと（ステップＳ３）、オルガノイド２００を構成する細胞とは異なる細胞Ｃｅを示す外来細胞を先端から吐出可能な第２ピペット９０を、オルガノイド２００の第１ピペット６０とは反対側の位置に対向させる第２ピペット配置ステップと（ステップＳ３）、第１ピペット６０の内部を陰圧にさせて、先端にオルガノイド２００を吸引保持する保持ステップと（ステップＳ４）、オルガノイド２００の一部が開口６０ａより第１ピペット６０の内部に入り込むまで吸引する吸引ステップと（ステップＳ４）、オルガノイド２００の一部が開口６０ａより第１ピペット６０の内部に入り込んだ後、第２ピペット９０で上皮層２１０を穿孔する穿孔ステップと（ステップＳ５）、第２ピペット９０から外来細胞を内腔２２０に吐出させる注入ステップと（ステップＳ６）、を含む。
【0103】
これによれば、オルガノイド２００の一部が第１ピペット６０の開口６０ａより内部に入り込んだ状態では、オルガノイド２００の上皮層２１０が第１ピペット６０の開口６０ａより内部に引っ張られ、第１ピペット６０の開口６０ａより外部の上皮層２１０に面方向の張力が生じる。粘弾性体である上皮層２１０に張力を生じさせることで、第２ピペット９０の先端が上皮層２１０に接触した際の反力が増大し、容易に穿孔することができる。第２ピペット９０で穿孔する前に、第１ピペット６０でオルガノイド２００を十分吸引すればよいので、作業者の熟練度及び技術によらず、オルガノイド２００の内腔２２０に外来細胞を安定して注入し、外来細胞を内包するオルガノイド２００を作成することが可能である。
【0104】
なお、本発明は、上記実施形態に限定されるものではない。即ち、本発明の骨子を逸脱しない範囲で種々変形して実施することができる。また、本明細書において「上皮層」とは、複数の細胞によって形成された粘弾性を有する層であり、内腔を囲繞する層をいう。したがって、内腔の外側の層が「上皮層」とは異なった名称にて規定されているオルガノイドに対しても適用可能である。
【0105】
（評価例）
本出願人は、上記実施形態により作成した外来細胞（細胞Ｃｅ）を内包するオルガノイド２００について、以下の通り実験を行った。本実験において、オルガノイド２００は、ヒトｉＰＳ細胞由来の大腸オルガノイド（ＨＣＯ）であり、細胞Ｃｅは、大腸がん細胞である。
本出願人は、上記実施形態により作成した外来細胞（細胞Ｃｅ）を内包するオルガノイド２００について、以下の通り実験を行った。本実験において、オルガノイド２００は、ヒトｉＰＳ細胞由来の大腸オルガノイド（ＨＣＯ）であり、細胞Ｃｅは、大腸がん細胞である。
【0106】
大腸オルガノイドの内腔側（頂端膜側）へ、大腸がん細胞を一細胞レベルで注入することにより、大腸がん細胞が正常上皮及び間質の周辺で増殖して基底膜側へ浸潤する、初期のがん浸潤を模倣するオルガノイドモデルを構築した。大腸がん細胞としては、転移性の細胞株（ＳＷ６２０、ＨＣＴ１１６）、非転移性の細胞株（ＳＷ４８０）を大腸オルガノイドの内腔に数個注入し、経時的に観察した。
【0107】
その結果、大腸オルガノイドの内腔でがん細胞が増殖するとともに、注入後約７日目には上皮層を破り、基底膜側へ浸潤していく遊走挙動が生じることが明らかになった。さらに、非転移性大腸がん細胞株と比較して、転移性大腸がん細胞株は、この浸潤様の挙動をより高い頻度で示すことを見出した。以上の結果は，正常大腸オルガノイドの中でのごく少数のがん細胞の悪性度をin vitroで再現できる可能性を示している。本浸潤モデルは、がん細胞が正常上皮細胞や間質細胞との相互作用を介した浸潤・転移等の機序解明に貢献するとともに、創薬研究での幅広い応用にも期待される。
【符号の説明】
【0108】
１ 物質注入装置
１０ 顕微鏡ユニット
１２ 顕微鏡
１４ カメラ
１６ 焦点合わせ機構
２０ 試料ステージ
２２ 試料保持部材
３０ 第１マニピュレータ
３２ Ｘ－Ｙ軸テーブル
３４ Ｚ軸テーブル
３６、３８ 駆動装置（第１駆動装置）
４０ 第１ピペット保持部材
４２、８２ 微動機構
４４ 圧電アクチュエータ
４６ ハウジング
４８ 転がり軸受
４８ａ 内輪
４８ｂ 外輪
４８ｃ ボール
５０ 中空部材
５０ａ フランジ部
５２ ロックナット
５４ スペーサ
５６ 圧電素子
５８ 蓋
６０ 第１ピペット
６０ａ 開口
６２ シリンジポンプ
７０ 第２マニピュレータ
７２ Ｘ－Ｙ軸テーブル
７４ Ｚ軸テーブル
７６、７８ 駆動装置
８０ 第２ピペット保持部材
９０ 第２ピペット
９０ａ 開口
９２ 注入ポンプ
１００ コントローラ（制御装置）
１０２ 画像入力部
１０４ 画像処理部
１０６ 画像出力部
１０８ 位置検出部
１１０ 演算部
１１２ 記憶部
１１４ ジョイスティック
１１４ａ 基台
１１４ｂ ハンドル部
１１４ｃ ボタン
１１６ 入力部
１１８ シリンジポンプインターフェース
１２０ 注入ポンプインターフェース
１１８ａ、１２０ａ 操作ノブ
１２２ 表示部
２００ オルガノイド
２１０ 上皮層
２１２ 基底膜
２１４ 頂端膜
２２０ 内腔
Ｃｅ 細胞（外来細胞）
Ｄｍ 細胞操作用ドロップ
Ｄｓ 細胞懸濁ドロップ
φ１、φ２ 口径
ｔ 厚み
ＶＸＹ、ＶＺ 駆動信号
ＶＮ ナノポジショナ制御信号
ＶＰ１、ＶＰ２ 圧力制御信号
ＶＰＩＸ 画像信号
Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６ ステップ
１０ 顕微鏡ユニット
１２ 顕微鏡
１４ カメラ
１６ 焦点合わせ機構
２０ 試料ステージ
２２ 試料保持部材
３０ 第１マニピュレータ
３２ Ｘ－Ｙ軸テーブル
３４ Ｚ軸テーブル
３６、３８ 駆動装置（第１駆動装置）
４０ 第１ピペット保持部材
４２、８２ 微動機構
４４ 圧電アクチュエータ
４６ ハウジング
４８ 転がり軸受
４８ａ 内輪
４８ｂ 外輪
４８ｃ ボール
５０ 中空部材
５０ａ フランジ部
５２ ロックナット
５４ スペーサ
５６ 圧電素子
５８ 蓋
６０ 第１ピペット
６０ａ 開口
６２ シリンジポンプ
７０ 第２マニピュレータ
７２ Ｘ－Ｙ軸テーブル
７４ Ｚ軸テーブル
７６、７８ 駆動装置
８０ 第２ピペット保持部材
９０ 第２ピペット
９０ａ 開口
９２ 注入ポンプ
１００ コントローラ（制御装置）
１０２ 画像入力部
１０４ 画像処理部
１０６ 画像出力部
１０８ 位置検出部
１１０ 演算部
１１２ 記憶部
１１４ ジョイスティック
１１４ａ 基台
１１４ｂ ハンドル部
１１４ｃ ボタン
１１６ 入力部
１１８ シリンジポンプインターフェース
１２０ 注入ポンプインターフェース
１１８ａ、１２０ａ 操作ノブ
１２２ 表示部
２００ オルガノイド
２１０ 上皮層
２１２ 基底膜
２１４ 頂端膜
２２０ 内腔
Ｃｅ 細胞（外来細胞）
Ｄｍ 細胞操作用ドロップ
Ｄｓ 細胞懸濁ドロップ
φ１、φ２ 口径
ｔ 厚み
ＶＸＹ、ＶＺ 駆動信号
ＶＮ ナノポジショナ制御信号
ＶＰ１、ＶＰ２ 圧力制御信号
ＶＰＩＸ 画像信号
Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６ ステップ
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】