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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024073190
(43)【公開日】2024-05-29
(54)【発明の名称】γ－アミノ酪酸の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/60 20060101AFI20240522BHJP
C12P 13/00 20060101ALI20240522BHJP
C12N 9/88 20060101ALI20240522BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240522BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240522BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240522BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240522BHJP
C12N 15/31 20060101ALN20240522BHJP
【ＦＩ】
C12N15/60
C12P13/00
C12N9/88
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N15/31
【審査請求】未請求
【請求項の数】17
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022184273
(22)【出願日】2022-11-17
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 刊行物名：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．１３４（５），４２４－４３１，２０２２ 発行日：令和４年９月１９日
(71)【出願人】
【識別番号】000104113
【氏名又は名称】カゴメ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】中谷 友樹
【テーマコード（参考）】
4B050
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B050CC01
4B050CC03
4B050DD02
4B050FF01
4B050FF14E
4B050KK13
4B050LL01
4B050LL02
4B050LL05
4B064AE01
4B064CA21
4B064CC24
4B064DA01
4B064DA10
4B065AA01X
4B065AA01Y
4B065AA30Y
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA27
4B065CA41
4B065CA44
(57)【要約】
【課題】グルタミン酸デカルボキシラーゼを用いて、効率的にＬ－グルタミン酸からＧＡＢＡを製造する。
【解決手段】Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｉｇｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｉｍｏｓｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｅｖｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｆｒｕｃｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属又はＡｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌由来のグルタミン酸デカルボキシラーゼをＬ－グルタミン酸と反応させ、γ－アミノ酪酸を生成する。
【選択図】なし
【解決手段】Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｉｇｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｉｍｏｓｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｅｖｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｆｒｕｃｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属又はＡｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌由来のグルタミン酸デカルボキシラーゼをＬ－グルタミン酸と反応させ、γ－アミノ酪酸を生成する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｉｇｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｉｍｏｓｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｅｖｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｆｒｕｃｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属又はＡｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌由来のグルタミン酸デカルボキシラーゼをＬ－グルタミン酸と反応させる工程を含む、γ－アミノ酪酸の製造方法。
【請求項2】
Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌由来のグルタミン酸デカルボキシラーゼをＬ－グルタミン酸と反応させる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記グルタミン酸デカルボキシラーゼの至適ｐＨが３．５～５．５である、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記グルタミン酸デカルボキシラーゼの至適温度が４０～６５℃である、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記グルタミン酸デカルボキシラーゼとＬ－グルタミン酸とを、ｐＨ３．５～５．５の条件下で接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記グルタミン酸デカルボキシラーゼとＬ－グルタミン酸とを、４０～６５℃の条件下で接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記グルタミン酸デカルボキシラーゼとＬ－グルタミン酸とを、ピリドキサール５’－リン酸濃度が０．２ｍＭ未満の条件下で接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記グルタミン酸デカルボキシラーゼがＧａｄＢ２である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
前記グルタミン酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列が、配列番号４で示されるアミノ酸配列又は配列番号４と７５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記グルタミン酸デカルボキシラーゼが４量体である、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記Ｌ－グルタミン酸が、野菜又は果実に由来するものを含有する、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
配列番号４で示されるアミノ酸配列又は配列番号４と７５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、グルタミン酸デカルボキシラーゼ。
【請求項13】
４量体である、請求項１２に記載のグルタミン酸デカルボキシラーゼ。
【請求項14】
グルタミン酸デカルボキシラーゼをコードする核酸であって、配列番号４で示されるアミノ酸配列又は配列番号４と７５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、核酸。
【請求項15】
請求項１４に記載の核酸を含む、形質転換体。
【請求項16】
請求項１４に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項17】
Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｉｇｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｉｍｏｓｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｅｖｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｆｒｕｃｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属又はＡｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌由来のグルタミン酸デカルボキシラーゼを用いて、Ｌ－グルタミン酸からγ－アミノ酪酸を生成する工程を含む、γ－アミノ酪酸を含む組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、γ－アミノ酪酸を製造する方法、及びγ－アミノ酪酸を含む組成物を製造する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
γ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）は、生物界に広く分布する非タンパク質アミノ酸で、高等動物においては、抗高血圧作用、抗不安作用、精神安定作用、利尿作用、抗糖尿作用など様々な重要な生理機能を有することが報告されている（非特許文献１～４）。近年、ＧＡＢＡを含むサプリメントや飲料などの健康食品が多く製造されている（非特許文献５～６）。
【0003】
ＧＡＢＡは、食品では玄米等や一部の野菜や果実等に含まれているが、含有量は微量であり、通常の摂取量では、上記生理機能を奏するのに十分な量は得られない。ＧＡＢＡは、Ｌ－グルタミン酸から、乳酸菌等の微生物に含まれるグルタミン酸デカルボキシラーゼを介した不可逆的α－脱炭酸によって生成することができることから、食品産業においては、乳酸菌等による発酵によってＧＡＢＡを高濃度化する手法がとられてきた（特許文献１～３、非特許文献７）。グルタミン酸を多く含む発酵原料として、トマト果実やその処理物（トマト加工品等）が用いられている。しかし、発酵食品は、ＧＡＢＡのみでなく、副生成物として、乳酸、酢酸等の有機酸やジアセチル等の香気成分が生成されることから、食品産業への応用には香味面で制約があった。
【0004】
微生物から精製されたグルタミン酸デカルボキシラーゼを用いて、Ｌ－グルタミン酸からＧＡＢＡを生成できることが知られるが、現在のところ、精製された酵素として食品製造の現場で実用化されたものは報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特開２００７－０６０９９０号公報
【特許文献2】特開２００７－２８９００８号公報
【特許文献3】特開２０２０－０５８３０９号公報
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Pouliot-Mathieu, K., et al., PharmaNutrition, Vol. 1, pp. 141-148 (2013)
【非特許文献2】Parkash, J. and Kaur, G., Brain Res. Bull., Vol. 74, pp. 317-328 (2007)
【非特許文献3】Dongoh, H., et al., J. Microbiol. Biotechnol., Vol. 17, pp. 1661-1669 (2007)
【非特許文献4】Wong, C. G. T., et al., Ann. Neurol., Vol. 54, pp. 3-12 (2003)
【非特許文献5】Jeng, K. C., J. Agric. Food Chem., Vol. 55, pp. 8787-8792 (2007)
【非特許文献6】Chiu, T. H., et al., Soc. Chem. Ind., Vol. 93, pp. 859-866 (2012)
【非特許文献7】Nakatani Y., et al., Microbiol. Resour, Ann. 8, 29 (2019)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、グルタミン酸デカルボキシラーゼを用いて、効率的にＬ－グルタミン酸からγ－アミノ酪酸を製造する方法、及び、該方法を用いて組成物を製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明は以下を包含する。
（１）Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｉｇｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｉｍｏｓｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｅｖｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｆｒｕｃｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属又はＡｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌由来のグルタミン酸デカルボキシラーゼをＬ－グルタミン酸と反応させる工程を含む、γ－アミノ酪酸の製造方法。
（２）Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌由来のグルタミン酸デカルボキシラーゼをＬ－グルタミン酸と反応させる工程を含む、（１）に記載の方法。
（３）前記グルタミン酸デカルボキシラーゼの至適ｐＨが３．５～５．５である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記グルタミン酸デカルボキシラーゼの至適温度が４０～６５℃である、（１）～（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記グルタミン酸デカルボキシラーゼとＬ－グルタミン酸とを、ｐＨ３．５～５．５の条件下で接触させる、（１）～（４）のいずれかに記載の方法。
（６）前記グルタミン酸デカルボキシラーゼとＬ－グルタミン酸とを、４０～６５℃の条件下で接触させる、（１）～（５）のいずれかに記載の方法。
（７）前記グルタミン酸デカルボキシラーゼとＬ－グルタミン酸とを、ピリドキサール５’－リン酸濃度が０．２ｍＭ未満の条件下で接触させる、（１）～（６）のいずれかに記載の方法。
（８）前記グルタミン酸デカルボキシラーゼがＧａｄＢ２である、（１）～（７）のいずれかに記載の方法。
（９）前記グルタミン酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列が、配列番号４で示されるアミノ酸配列又は配列番号４と７５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、（８）に記載の方法。
（１０）前記グルタミン酸デカルボキシラーゼが４量体である、（９）に記載の方法。
（１１）前記Ｌ－グルタミン酸が、野菜又は果実に由来するものを含有する、（１）～（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）配列番号４で示されるアミノ酸配列又は配列番号４と７５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、グルタミン酸デカルボキシラーゼ。
（１３）４量体である、（１２）に記載のグルタミン酸デカルボキシラーゼ。
（１４）グルタミン酸デカルボキシラーゼをコードする核酸であって、配列番号４で示されるアミノ酸配列又は配列番号４と７５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、核酸。
（１５）（１４）に記載の核酸を含む、形質転換体。
（１６）（１４）に記載の核酸を含む、発現ベクター。
（１７）Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｉｇｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｉｍｏｓｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｅｖｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｆｒｕｃｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属又はＡｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌由来のグルタミン酸デカルボキシラーゼを用いて、Ｌ－グルタミン酸からγ－アミノ酪酸を生成する工程を含む、γ－アミノ酪酸を含む組成物の製造方法。
（１）Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｉｇｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｉｍｏｓｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｅｖｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｆｒｕｃｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属又はＡｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌由来のグルタミン酸デカルボキシラーゼをＬ－グルタミン酸と反応させる工程を含む、γ－アミノ酪酸の製造方法。
（２）Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌由来のグルタミン酸デカルボキシラーゼをＬ－グルタミン酸と反応させる工程を含む、（１）に記載の方法。
（３）前記グルタミン酸デカルボキシラーゼの至適ｐＨが３．５～５．５である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記グルタミン酸デカルボキシラーゼの至適温度が４０～６５℃である、（１）～（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記グルタミン酸デカルボキシラーゼとＬ－グルタミン酸とを、ｐＨ３．５～５．５の条件下で接触させる、（１）～（４）のいずれかに記載の方法。
（６）前記グルタミン酸デカルボキシラーゼとＬ－グルタミン酸とを、４０～６５℃の条件下で接触させる、（１）～（５）のいずれかに記載の方法。
（７）前記グルタミン酸デカルボキシラーゼとＬ－グルタミン酸とを、ピリドキサール５’－リン酸濃度が０．２ｍＭ未満の条件下で接触させる、（１）～（６）のいずれかに記載の方法。
（８）前記グルタミン酸デカルボキシラーゼがＧａｄＢ２である、（１）～（７）のいずれかに記載の方法。
（９）前記グルタミン酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列が、配列番号４で示されるアミノ酸配列又は配列番号４と７５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、（８）に記載の方法。
（１０）前記グルタミン酸デカルボキシラーゼが４量体である、（９）に記載の方法。
（１１）前記Ｌ－グルタミン酸が、野菜又は果実に由来するものを含有する、（１）～（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）配列番号４で示されるアミノ酸配列又は配列番号４と７５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、グルタミン酸デカルボキシラーゼ。
（１３）４量体である、（１２）に記載のグルタミン酸デカルボキシラーゼ。
（１４）グルタミン酸デカルボキシラーゼをコードする核酸であって、配列番号４で示されるアミノ酸配列又は配列番号４と７５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、核酸。
（１５）（１４）に記載の核酸を含む、形質転換体。
（１６）（１４）に記載の核酸を含む、発現ベクター。
（１７）Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｉｇｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｉｍｏｓｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｅｖｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｆｒｕｃｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属又はＡｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌由来のグルタミン酸デカルボキシラーゼを用いて、Ｌ－グルタミン酸からγ－アミノ酪酸を生成する工程を含む、γ－アミノ酪酸を含む組成物の製造方法。
【発明の効果】
【0009】
本発明によると、グルタミン酸デカルボキシラーゼを用いて、効率的にＬ－グルタミン酸からγ－アミノ酪酸を製造することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】精製した組換えＧＡＤのＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す写真である。クーマシーブルーで染色した電気泳動後の１２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。Ｍのレーンは、タンパク質分子量マーカー、１のレーンは、精製した組換えＧａｄＢ１、２のレーンは精製した組換えＧａｄＢ２である。
【図2】ＧＡＤの酵素活性とｐＨとの関係を示すグラフである。塗りつぶしたマーカーはＧａｄＢ１、塗りつぶされていないマーカーはＧａｄＢ２の酵素活性を示す。ｐＨ２．５はグリシン－ＨＣｌ緩衝液（■：ＧａｄＢ１、□：ＧａｄＢ２）、ｐＨ３．０～３．５は、クエン酸ナトリウム緩衝液（▲：ＧａｄＢ１、△：ＧａｄＢ２）、ｐＨ４．０～５．５は酢酸ナトリウム緩衝液（●：ＧａｄＢ１、〇：ＧａｄＢ２）、ｐＨ６．０～６．５はリン酸カリウム緩衝液（菱形）を使用した。測定はｎ＝３で行い、平均値を算出した。図中のエラーバーは標準偏差を示す。
【図3】ＧＡＤの酵素活性と温度の関係を示すグラフである。●は、ＧａｄＢ１、〇はＧａｄＢ２の酵素活性を示す。ＧａｄＢ１は、０．２ｍＭ ＰＬＰを含む２００ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．０）中で、５０ｍＭのＭＳＧと反応させた。ＧａｄＢ２は、０．２ｍＭ ＰＬＰを含む２００ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．５）中で、５０ｍＭのＭＳＧと反応させた。測定はｎ＝３で行い、平均値を算出した。図中のエラーバーは標準偏差を示す。
【図4】ＧＡＤの酵素活性とＰＬＰ濃度の関係を示すグラフである。●は、ＧａｄＢ１、〇はＧａｄＢ２の酵素活性を示す。ＧａｄＢ１は、２００ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．０）中で、５０ｍＭのＭＳＧと反応させた。ＧａｄＢ２は、２００ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．５）中で、５０ｍＭのＭＳＧと反応させた。測定はｎ＝３で行い、平均値を算出した。図中のエラーバーは標準偏差を示す。
【図5】ＫＢ１２５３株由来のＧａｄＢ１及びＧａｄＢ２、並びに既報のＧａｄＢ１及びＧａｄＢ２のアミノ酸配列のアラインメントである。図中、「＊」は、アミノ酸残基が一致する位置、「：」は強い関連性のあるアミノ酸残基の位置、「．」は弱い関連性のあるアミノ酸残基の位置を示す。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本明細書において、「Ｌ－グルタミン酸」の用語は、Ｌ－グルタミン酸及びその塩（ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等）を包含するものとする。他の化合物で塩が存在し得る化合物についても、当該化合物名の表記は、特に説明のない限り、その塩を包含するものとする。本明細書において、「Ａ～Ｂ」（Ａ、Ｂはともに数値）の表記は、特に説明のない限り、「Ａ以上Ｂ以下」を示すものとする。本明細書において「％」の表記は、特に説明のない限り重量％を示すものとする。
【0012】
本明細書において、「組成物」とは、２以上の成分を含む混合物を指し、より具体的には、飲食品、サプリメント、医薬品、飼料、又はこれらの原材料等として用いられる混合物を指す。特に、ヒトに経口摂取される飲食品又は飲食品原材料を指す。
【0013】
本明細書において、「実質的にＸを添加しない」、「実質的にＸが存在しない」、「実質的にＸを含まない」等の記載は、Ｘ（成分）が意図的に添加された状態は除外するものの、原材料等に含まれる不純物として、Ｘが意図せず微量に含まれる状態は除外しないことを意味する。
【0014】
１．γ－アミノ酪酸の製造方法
本発明の第１の実施形態は、γ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の製造方法であって、Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｉｇｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｉｍｏｓｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｅｖｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｆｒｕｃｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属又はＡｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌由来のグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）をＬ－グルタミン酸（Ｌ－Ｇｌｕ）と反応させる工程を含む、ことを特徴とする。上記特徴を有することにより、本実施形態の方法は、低ｐＨ、高温状態での製造が可能であることから、腐敗等のリスクを低減した状態で効率よくＧＡＢＡを製造することが可能である。本実施形態の方法で製造されるＧＡＢＡは、摂取した哺乳動物（特にヒト）の健康増進に寄与することが期待される成分であり、飲食品、健康食品、サプリメント、医薬品、飼料等に幅広く利用可能である。
本発明の第１の実施形態は、γ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の製造方法であって、Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｉｇｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｉｍｏｓｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｅｖｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｆｒｕｃｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属又はＡｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌由来のグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）をＬ－グルタミン酸（Ｌ－Ｇｌｕ）と反応させる工程を含む、ことを特徴とする。上記特徴を有することにより、本実施形態の方法は、低ｐＨ、高温状態での製造が可能であることから、腐敗等のリスクを低減した状態で効率よくＧＡＢＡを製造することが可能である。本実施形態の方法で製造されるＧＡＢＡは、摂取した哺乳動物（特にヒト）の健康増進に寄与することが期待される成分であり、飲食品、健康食品、サプリメント、医薬品、飼料等に幅広く利用可能である。
【0015】
１－１ グルタミン酸デカルボキシラーゼの由来細菌
Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｉｇｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｉｍｏｓｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｅｖｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｆｒｕｃｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属又はＡｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌は、以前はいずれもＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属と称されてきた細菌であり、発酵食品の製造や、様々な動物種に対するプロバイオティクスとして広く利用されている乳酸菌である。２０２０年に、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に分類されていた全ての菌種（２６１菌種）の基準株のゲノムデータを用いたゲノムレベルで属分類の再評価が行われた結果、旧Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属は、合計２５属に再分類された（Zheng J. et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., Vol. 70, No. 4, pp. 2782-2858 (2020)）。上記９属は、その中でも特に主要な菌種を含む属として知られる。
Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｉｇｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｉｍｏｓｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｅｖｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｆｒｕｃｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属又はＡｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌は、以前はいずれもＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属と称されてきた細菌であり、発酵食品の製造や、様々な動物種に対するプロバイオティクスとして広く利用されている乳酸菌である。２０２０年に、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に分類されていた全ての菌種（２６１菌種）の基準株のゲノムデータを用いたゲノムレベルで属分類の再評価が行われた結果、旧Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属は、合計２５属に再分類された（Zheng J. et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., Vol. 70, No. 4, pp. 2782-2858 (2020)）。上記９属は、その中でも特に主要な菌種を含む属として知られる。
【0016】
１－２ グルタミン酸デカルボキシラーゼ
本明細書において、「グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）」とは、グルタミン酸を脱炭酸する酵素を指す。より具体的には、ＧＡＤは、グルタミン酸をＧＡＢＡと二酸化炭素に分解する酵素である。ＧＡＤは、ほぼすべての微生物に存在が確認されている酵素である。例えば、大腸菌には、ＧＡＤＡ及びＧＡＤＢの２つのアイソフォームが存在することが知られ、また、６量体のサブユニット構成を有することが知られている。
本明細書において、「グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）」とは、グルタミン酸を脱炭酸する酵素を指す。より具体的には、ＧＡＤは、グルタミン酸をＧＡＢＡと二酸化炭素に分解する酵素である。ＧＡＤは、ほぼすべての微生物に存在が確認されている酵素である。例えば、大腸菌には、ＧＡＤＡ及びＧＡＤＢの２つのアイソフォームが存在することが知られ、また、６量体のサブユニット構成を有することが知られている。
【0017】
本実施形態の方法で使用されるＧＡＤは、「１－１ グルタミン酸デカルボキシラーゼの由来細菌」の項に記載した９属（以下、「Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ属等」とも称する）のいずれかの菌種の細菌に由来するＧＡＤである。ＧＡＤは、Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ属等においても、ＧａｄＢ１及びＧａｄＢ２の２つのアイソフォームが存在することが知られ、それぞれ主に２量体を形成することが知られている。Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ属等のＧＡＤの２つのアイソフォームは、大腸菌等のＧＡＤと比較して、いずれも至適ｐＨが低く、かつ、高温に耐性を有する傾向を有する。好ましくは、前記ＧＡＤは、Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌に由来するＧＡＤである。ここでいう、特定の細菌に由来するＧＡＤは、当該細菌を培養して菌体から直接精製されたＧＡＤや、分離分画等により粗精製された粗酵素であってもよいが、組換えＧＡＤであってもよい。
【0018】
組換えＧＡＤは、特に限定されないが、例えば、宿主細胞に目的のＧＡＤをコードする遺伝子を導入して形質転換させた形質転換体を使用して生成することができる。宿主は、特に限定されず、通常遺伝子導入の宿主として使用されるものをいずれも使用できるが、特に大腸菌を好適に使用できる。遺伝子導入の手法は、既知の手法をいずれも使用でき、例えば、目的の遺伝子を組み込んだ発現ベクター（例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクターなど）を導入する方法、ゲノム編集を用いる方法等から適宜選択することができる。大腸菌を宿主とする場合に多用される手法として、プラスミドベクターを導入する手法を好適に用いることができる。
【0019】
宿主として利用可能な大腸菌は多数市販されており、例えば、ＢＬ２１株、ＲＥＬ６０６株、Ｗ３１１０株、ＤＨ１０Ｂ株、ＢＷ２５１１３株、ＤＨ５α株、ＭＧ１６５５株、ＪＭ１０９株、ＲＶ３０８株等が知られるが、いずれを使用してもよい。これらの大腸菌株は、通常、遺伝子導入に適したコンピテント細胞の状態で市販される。プラスミドベクターは、転写プロモーター、転写ターミネーター、選択マーカーを含むものが好ましく、また、生成したタンパク質を分離するためのタグ（例えば、ヒスチジンタグ）がコードされていることが好ましい。さらに、必要があれば、エンハンサーなどのシスエレメント、オペレーター、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。プラスミドベクターとしては、例えば、ｐＥＴ、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＳＣ１０１、ｐＢＲ３２２、ｐＨＳＧ２９８、ｐＶＣ１８、ｐＶＣ１９、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＭａｌ－ｃ２、ｐＧＥＸ２Ｔ、ｐＴＶ１１８Ｎ、ｐＴＶ１１９Ｎ、ｐＴＲＰ等を好適に使用できる。プラスミドベクターを大腸菌に導入する手法としては、ケミカルトランスフォーメーション法、エレクトロポレーション法等が知られるが、使用する大腸菌株及び導入するプラスミドベクターのサイズや性質に応じて適宜選択することができる。
【0020】
発現ベクターを組み込んだ大腸菌をＬＢ培地等で培養した後、菌体破砕、遠心分離、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過等の通常のタンパク質精製手法を経ることで、目的のタンパク質である組換えＧＡＤを得ることができる。
【0021】
本実施形態において、使用されるＧＡＤは、その至適ｐＨ、すなわち、高い酵素活性を示すｐＨが、３．５～５．５、特に４．０～５．０であることが好ましい。また、使用されるＧＡＤは、その至適温度、すなわち、高い酵素活性を示す温度が、４０～６５℃、特に４５～６０℃であることが好ましい。
【0022】
本発明者は、ナスの漬物からＬａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＫＢ１２５３株を分離した。Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＫＢ１２５３株は、平成３０年１０月３日に独立行政法人製品評価技術基 盤機構特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室）に国内寄託がなされ、寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ－００２７９０が付与されている。表１に、ＫＢ１２５３株のｇａｄＢ１遺伝子（配列番号１）及びｇａｄＢ２遺伝子（配列番号２）の塩基配列を示す。また、表２にＧａｄＢ１（配列番号３）及びＧａｄＢ２（配列番号４）のアミノ酸配列を示す。
【0023】
【表1】
【0024】
【表2】
【0025】
本発明者は、ＫＢ１２５３株から、ＧａｄＢ１及びＧａｄＢ２の遺伝子（ｇａｄＢ１及びｇａｄＢ２）をクローニングし、そこから生成した組換えＧＡＤについて、その物性及び酵素活性を各条件で評価した。その結果、組換えＧａｄＢ１及びＧａｄＢ２のいずれも、他のＬａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ属等と同様に、低ｐＨ、高温で高い酵素活性を有することを見出した。これに加え、本発明者は、生成した前記ＧａｄＢ２が４量体を形成すること、及び実質的にピリドキサール５’－リン酸（ＰＬＰ）の存在しない条件下で酵素活性を奏し得ることを見出した。
【0026】
ＧＡＤは、活性中心にＰＬＰを有するビタミンＢ６酵素であるが、Ｌ－Ｇｌｕを基質として、α位のカルボキシ基を脱炭酸する反応を触媒する。しかし、形質転換等を経て生成したＧＡＤは、必ずしも活性中心にＰＬＰが存在しないことから、酵素活性を維持するために基質とともにＰＬＰを外添することを要する。これは、組換えＧＡＤを使用するＧＡＢＡの製造において、製造コストを増加させる要因となっていた。
【0027】
本実施形態の方法において、ＧＡＤとしてＬａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ属等のＧａｄＢ２を使用することが好ましい。より具体的には、ＧＡＤのアミノ酸配列は、配列番号４で示されるアミノ酸配列又は配列番号４と７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上若しくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことが好ましい。あるいは、ＧＡＤのアミノ酸配列は、配列番号４で示されるアミノ酸配列又は配列番号４と７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上若しくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなることが好ましい。また、本実施形態の方法において、ＧＡＤは、４量体を形成することが好ましい。
【0028】
ＧＡＤとしてＬａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ属等のＧａｄＢ２を使用することで、実質的にＰＬＰを添加することなく、Ｌ－ＧｌｕからＧＡＢＡを製造することが可能となる。したがって、本実施形態の方法は、ＧＡＤとＬ－ＧｌｕをＰＬＰ濃度が０．２ｍＭ未満、特に０．１ｍＭ未満の条件下で接触させることが好ましい。これにより、ＰＬＰによる製造コストの増加を生じることなく、効率よくＬ－ＧｌｕからＧＡＢＡを製造することが可能となる。
【0029】
１－３ 製造方法の各工程
本実施形態のＧＡＢＡの製造方法の一態様は、以下の工程を備える。
（１）Ｌ－Ｇｌｕを含む緩衝液を調製する工程；
（２）（１）の緩衝液にＧＡＤを添加する工程；
（３）（２）の緩衝液中でＬ－ＧｌｕとＧＡＤを反応させる工程；及び
（４）（３）の緩衝液からＧＡＢＡを精製する工程。
以下、工程ごとに、上記態様を説明する。
本実施形態のＧＡＢＡの製造方法の一態様は、以下の工程を備える。
（１）Ｌ－Ｇｌｕを含む緩衝液を調製する工程；
（２）（１）の緩衝液にＧＡＤを添加する工程；
（３）（２）の緩衝液中でＬ－ＧｌｕとＧＡＤを反応させる工程；及び
（４）（３）の緩衝液からＧＡＢＡを精製する工程。
以下、工程ごとに、上記態様を説明する。
【0030】
工程（１）として、Ｌ－Ｇｌｕを緩衝液に溶解して、Ｌ－Ｇｌｕを含む緩衝液を調製する。緩衝液としては、設定するｐＨに適した緩衝液を適宜選択することができる。本実施形態において、緩衝液は、ｐＨ３．５～５．５、特にｐＨ４．０～５．０とすることが好ましい。この場合、調製する緩衝液は、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液等とすることができる。
【0031】
基質となるＬ－Ｇｌｕの濃度は、０．１～１００ｍＭ、特に５～５０ｍＭ、さらに１０～３５ｍＭとすることが好ましい。
【0032】
好ましくは、緩衝液中のＰＬＰ濃度は、０．２ｍＭ未満、特に０．１ｍＭ未満である。最も好ましくは、緩衝液はＰＬＰを含まない、あるいはＰＬＰを実質的に含まない。
【0033】
工程（２）として、工程（１）で調製した緩衝液にＧＡＤを添加する。ＧＡＤは、「１－２ グルタミン酸デカルボキシラーゼ」の項に記載したＧＡＤをいずれも使用することができる。特に、配列番号４又は配列番号４と７５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子を用いて生成された組換えＧａｄＢ２を好適に使用できる。
【0034】
ＧＡＤの添加量は、特に限定されないが、例えば、０．０１～１０Ｕ／ｍＬ、特に０．１～１Ｕ／ｍＬとすることができる。ここで、１Ｕ（ユニット）は、１分間で１μｍｏｌのＬ－Ｇｌｕを消費する酵素活性量を指す。
【0035】
工程（３）として、Ｌ－ＧｌｕとＧＡＤとを接触させ、反応させる。反応時の温度は、４０～６５℃、特に４５～６０℃とすることが好ましい。
【0036】
工程（４）として、生成した緩衝液中のＧＡＢＡを精製する。精製手段は特に限定されないが、例えば、微生物の菌体等の固形成分が除去された培養液をイオン交換樹脂に通塔してアミノ酸を樹脂に吸着させた後、該アミノ酸を溶出する手法を用いることができる。
【0037】
本実施形態の方法の工程は、Ｌ－Ｇｌｕと特定のＧＡＤとを接触させる工程を含んでいれば、必ずしも上記（１）～（４）の工程に限定することを意図しない。例えば、工程（１）に記載のＬ－Ｇｌｕを添加した緩衝液に代えて、Ｌ－Ｇｌｕを多く含む飲食品等の組成物（例えば、トマト果汁等）を使用してもよい。また、反応時の温度は、必ずしも高温とする必要はなく、例えば、室温としてもよい。
【0038】
２．Ｌ－グルタミン酸をγ－アミノ酪酸に変換する方法
本発明の第２の実施形態は、Ｌ－ＧｌｕをＧＡＢＡに変換する方法であって、Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｉｇｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｉｍｏｓｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｅｖｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｆｒｕｃｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属又はＡｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌由来のグルタミン酸デカルボキシラーゼを用いることを特徴とする。
本発明の第２の実施形態は、Ｌ－ＧｌｕをＧＡＢＡに変換する方法であって、Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｉｇｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｉｍｏｓｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｅｖｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｆｒｕｃｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属又はＡｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌由来のグルタミン酸デカルボキシラーゼを用いることを特徴とする。
【0039】
本実施形態において使用されるＧＡＤは、具体的には、「１－２ グルタミン酸デカルボキシラーゼ」の項に記載したＧＡＤを使用することができる。特に、配列番号４又は配列番号４と７５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子を用いて生成された組換えＧａｄＢ２を好適に使用できる。より具体的には、ＧＡＤは、配列番号４で示されるアミノ酸配列又は配列番号４と７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上若しくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことが好ましい。あるいは、ＧＡＤは、配列番号４で示されるアミノ酸配列又は配列番号４と７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上若しくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなることが好ましい。
【0040】
本実施形態の方法の一態様は、以下の工程を備える。
（１）Ｌ－Ｇｌｕを含む緩衝液を調製する工程；
（２）（１）の緩衝液にＧＡＤを添加する工程；及び
（３）（２）の緩衝液中でＬ－ＧｌｕとＧＡＤを反応させる工程。
以下、工程ごとに、上記態様を説明する。
（１）Ｌ－Ｇｌｕを含む緩衝液を調製する工程；
（２）（１）の緩衝液にＧＡＤを添加する工程；及び
（３）（２）の緩衝液中でＬ－ＧｌｕとＧＡＤを反応させる工程。
以下、工程ごとに、上記態様を説明する。
【0041】
工程（１）として、Ｌ－Ｇｌｕを緩衝液に溶解して、Ｌ－Ｇｌｕを含む緩衝液を調製する。緩衝液としては、設定するｐＨに適した緩衝液を適宜選択することができる。本実施形態において、緩衝液は、ｐＨ３．５～５．５、特にｐＨ４．０～５．０とすることが好ましい。
【0042】
基質となるＬ－Ｇｌｕの濃度は、０．１～１００ｍＭ、特に５～５０ｍＭ、さらに１０～３５ｍＭとすることが好ましい。
【0043】
好ましくは、緩衝液中のＰＬＰ濃度は、０．２ｍＭ未満、特に０．１ｍＭ未満である。最も好ましくは、緩衝液はＰＬＰを含まない、あるいはＰＬＰを実質的に含まない。
【0044】
工程（２）として、工程（１）で調製した緩衝液にＧＡＤを添加する。ＧＡＤの添加量は、特に限定されないが、例えば、０．０１～１０Ｕ／ｍＬ、特に０．１～１Ｕ／ｍＬとすることができる。
【0045】
工程（３）として、Ｌ－ＧｌｕとＧＡＤとを接触させ、反応させる。反応時の温度は、４０～６５℃、特に４５～６０℃とすることが好ましい。
【0046】
本実施形態の方法の工程は、Ｌ－Ｇｌｕと特定のＧＡＤとを接触させる工程を含んでいれば、必ずしも上記（１）～（３）の工程に限定することを意図するものではなく、必要に応じて条件を適宜変更することが可能である。例えば、工程（１）に記載のＬ－Ｇｌｕを添加した緩衝液に代えて、Ｌ－Ｇｌｕを多く含む飲食品等の組成物（例えば、トマト果汁等）を使用してもよい。また、反応時の温度は、必ずしも高温とする必要はなく、例えば、室温としてもよい。
【0047】
３．グルタミン酸デカルボキシラーゼ
本実施形態の第３の実施形態は、配列番号４で示されるアミノ酸配列又は配列番号４と７５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）である。
本実施形態の第３の実施形態は、配列番号４で示されるアミノ酸配列又は配列番号４と７５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）である。
【0048】
本実施形態のＧＡＤは、より具体的には、配列番号４で示されるアミノ酸配列又は配列番号４と７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上若しくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことが好ましい。あるいは、本実施形態のＧＡＤは、配列番号４で示されるアミノ酸配列又は配列番号４と７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上若しくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなることが好ましい。また、本実施形態のＧＡＤは、４量体を形成することが好ましい。
【0049】
本実施形態のＧＡＤは、上記の特徴を有することにより、ＰＬＰ濃度の低い条件下、より好ましくは実質的にＰＬＰが存在しない条件下で、Ｌ－ＧｌｕをＧＡＢＡに変換することが可能である、という利点を有する。
【0050】
４．核酸
本発明の第４の実施形態は、グルタミン酸デカルボキシラーゼをコードする核酸であって、配列番号４で示されるアミノ酸配列又は配列番号４と７５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、核酸である。より具体的には、本実施形態の核酸は、配列番号４で示されるアミノ酸配列又は配列番号４と７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上若しくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むことが好ましい。あるいは、本実施形態の核酸は、配列番号４で示されるアミノ酸配列又は配列番号４と７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上若しくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなることが好ましい。
本発明の第４の実施形態は、グルタミン酸デカルボキシラーゼをコードする核酸であって、配列番号４で示されるアミノ酸配列又は配列番号４と７５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、核酸である。より具体的には、本実施形態の核酸は、配列番号４で示されるアミノ酸配列又は配列番号４と７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上若しくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むことが好ましい。あるいは、本実施形態の核酸は、配列番号４で示されるアミノ酸配列又は配列番号４と７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上若しくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなることが好ましい。
【0051】
より好ましくは、本実施形態の核酸は、配列番号２で示される塩基配列又は配列番号２と７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上若しくは９５％以上の配列同一性を有する塩基配列を含む。
【0052】
本実施形態の核酸は、大腸菌等の宿主細胞に導入されることにより、ＧＡＤを生成することが可能な核酸である。生成されるＧＡＤは、低ｐＨ、高温で酵素活性を有する、実質的にＰＬＰが存在しない条件下でＬ－ＧｌｕをＧＡＢＡに変換できる等の利点を有する。
【0053】
５．形質転換体
本発明の第５の実施形態は、「４．核酸」の項に記載の核酸を含む、形質転換体である。形質転換体は、具体的には、前記核酸を導入した宿主細胞を指す。
本発明の第５の実施形態は、「４．核酸」の項に記載の核酸を含む、形質転換体である。形質転換体は、具体的には、前記核酸を導入した宿主細胞を指す。
【0054】
宿主細胞は、通常、遺伝子導入に使用される細胞であれば特に限定されないが、特に大腸菌を使用することが好ましい。宿主として利用可能な大腸菌は多数市販されており、例えば、ＢＬ２１株、ＲＥＬ６０６株、Ｗ３１１０株、ＤＨ１０Ｂ株、ＢＷ２５１１３株、ＤＨ５α株、ＭＧ１６５５株、ＪＭ１０９株、ＲＶ３０８株等が知られるが、いずれを使用してもよい。これらの大腸菌株は、通常、遺伝子導入に適したコンピテント細胞の状態で市販される。
【0055】
形質転換体の形成には、宿主細胞に目的の遺伝子を導入することを要する。遺伝子導入の手法は、既知の手法をいずれも使用でき、例えば、目的の遺伝子を組み込んだ発現ベクター（例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクターなど）を導入する方法、ゲノム編集を用いる方法等から適宜選択することができる。大腸菌を宿主とする場合に多用される手法として、プラスミドベクターを導入する手法をとることができる。
【0056】
６．発現ベクター
本発明の第６の実施形態は、「４．核酸」の項に記載の核酸を含む、発現ベクターである。発現ベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター等の既知のベクターのいずれを使用してもよいが、大腸菌等を宿主として目的の遺伝子を発現させる場合は、特にプラスミドベクターを好適に使用できる。
本発明の第６の実施形態は、「４．核酸」の項に記載の核酸を含む、発現ベクターである。発現ベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター等の既知のベクターのいずれを使用してもよいが、大腸菌等を宿主として目的の遺伝子を発現させる場合は、特にプラスミドベクターを好適に使用できる。
【0057】
プラスミドベクターは、転写プロモーター、転写ターミネーター、選択マーカーを含むものが好ましく、また、生成したタンパク質を分離するためのタグ（例えば、ヒスチジンタグ）がコードされていることが好ましい。さらに、必要があれば、エンハンサーなどのシスエレメント、オペレーター、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。プラスミドベクターとしては、例えば、ｐＥＴ、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＳＣ１０１、ｐＢＲ３２２、ｐＨＳＧ２９８、ｐＶＣ１８、ｐＶＣ１９、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＭａｌ－ｃ２、ｐＧＥＸ２Ｔ、ｐＴＶ１１８Ｎ、ｐＴＶ１１９Ｎ、ｐＴＲＰ等を好適に使用できる。プラスミドベクターを大腸菌に導入する手法としては、ケミカルトランスフォーメーション法、エレクトロポレーション法等が知られるが、使用する大腸菌株及び導入するプラスミドベクターのサイズや性質に応じて適宜選択することができる。
【0058】
７．組成物の製造方法
本発明の第７の実施形態は、γ－アミノ酪酸を含む組成物の製造方法であって、Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｉｇｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｉｍｏｓｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｅｖｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｆｒｕｃｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属又はＡｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌由来のグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）を用いて、Ｌ－グルタミン酸（Ｌ－Ｇｌｕ）からγ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を生成する工程を含む、ことを特徴とする。本実施形態の方法で製造される組成物は、ＧＡＢＡを含有し、食品等としてヒトが経口摂取した場合、その健康増進効果が期待される組成物である。
本発明の第７の実施形態は、γ－アミノ酪酸を含む組成物の製造方法であって、Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｉｇｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｉｍｏｓｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｅｖｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｆｒｕｃｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属又はＡｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌由来のグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）を用いて、Ｌ－グルタミン酸（Ｌ－Ｇｌｕ）からγ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を生成する工程を含む、ことを特徴とする。本実施形態の方法で製造される組成物は、ＧＡＢＡを含有し、食品等としてヒトが経口摂取した場合、その健康増進効果が期待される組成物である。
【0059】
本実施形態において使用されるＧＡＤは、具体的には、「１－２ グルタミン酸デカルボキシラーゼ」の項に記載したＧＡＤを使用することができる。特に、配列番号４又は配列番号４と７５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子を用いて生成された組換えＧａｄＢ２を好適に使用できる。より具体的には、ＧＡＤは、配列番号４で示されるアミノ酸配列又は配列番号４と７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上若しくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことが好ましい。あるいは、ＧＡＤは、配列番号４で示されるアミノ酸配列又は配列番号４と７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上若しくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなることが好ましい。
【0060】
本実施形態の方法の一態様は、以下の工程を備える。
（１）Ｌ－Ｇｌｕを含む組成物を調製する工程；
（２）（１）の組成物にＧＡＤを添加する工程；及び
（３）（２）の組成物でＬ－ＧｌｕとＧＡＤを反応させる工程。
以下、工程ごとに、上記態様を説明する。
（１）Ｌ－Ｇｌｕを含む組成物を調製する工程；
（２）（１）の組成物にＧＡＤを添加する工程；及び
（３）（２）の組成物でＬ－ＧｌｕとＧＡＤを反応させる工程。
以下、工程ごとに、上記態様を説明する。
【0061】
工程（１）として、Ｌ－Ｇｌｕを含む組成物を調製する。当該組成物は、Ｌ－Ｇｌｕを多く含み、かつ、酸性（ｐＨ３．５～５．５、特にｐＨ４．０～５．０）のものを使用できる。例えば、トマト果汁などの野菜汁や果汁を好適に使用できるが、これに限定されるものではない。野菜汁や果汁は、ｐＨが低く、かつ、飲食品は加熱による殺菌が必要であるため、本実施形態の方法は、前記ＧＡＤを用いることで、加熱殺菌とＧＡＢＡ生成を同時に行うことも可能であり、効率よくＧＡＢＡを豊富に含む飲食品や飲食品用原材料を製造することが可能である。当該観点から、前記Ｌ－Ｇｌｕは、野菜又は果実に由来するものを含有してもよい。あるいは、前記Ｌ－Ｇｌｕは、実質的に全てが野菜又は果実に由来するものであってもよい。Ｌ－Ｇｌｕは、精製されたものを組成物に添加してもよい。また、ｐＨはｐＨ調整剤で適した範囲に調整してもよい。組成物中のＬ－Ｇｌｕの濃度は、０．１～１００ｍＭ、特に５～５０ｍＭ、さらに１０～３５ｍＭとすることが好ましい。
【0062】
組成物中には、ＰＬＰを実質的に添加しない、特に全く添加しないことが好ましい。ＰＬＰ濃度は、０．２ｍＭ未満、特に０．１ｍＭ未満とすることが好ましい。上記組成物には、必要に応じて、食塩、甘味料、増粘安定剤、乳化剤、調味料等を添加してもよい。
【0063】
工程（２）として、工程（１）で調製した緩衝液にＧＡＤを添加する。ＧＡＤの添加量は、特に限定されないが、例えば、０．０１～１０Ｕ／ｍＬ、特に０．１～１Ｕ／ｍＬとすることができる。
【0064】
工程（３）として、Ｌ－ＧｌｕとＧＡＤとを接触させ、反応させる。反応時の温度は、４０～６５℃、より好ましくは４５～６０℃、特に４５～５５℃とすることが好ましい。
【0065】
本実施形態の方法の工程は、Ｌ－Ｇｌｕと特定のＧＡＤとを接触させる工程を含んでいれば、必ずしも上記（１）～（３）の工程に限定することを意図するものではなく、必要に応じて条件を適宜変更することが可能である。
【実施例0066】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【0067】
［試験例１］ＧＡＢＡ産生能の高い細菌Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＫＢ１２５３株由来のｇａｄＢ１遺伝子及びｇａｄＢ２遺伝子のクローニング
ナスの漬物から分離されたＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＫＢ１２５３（以下、単に「ＫＢ１２５３」とも称する）を、ＭＲＳ寒天培地（Ｏｘｏｉｄ）を用いて、エアレーションなし、３０℃の条件で培養した。
ナスの漬物から分離されたＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＫＢ１２５３（以下、単に「ＫＢ１２５３」とも称する）を、ＭＲＳ寒天培地（Ｏｘｏｉｄ）を用いて、エアレーションなし、３０℃の条件で培養した。
【0068】
ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔｓ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＫＢ１２５３の菌体からＤＮＡを分離・精製した。精製されたＤＮＡを鋳型として、ＫＢ１２５３由来のｇａｄＢ１配列に基づく下記のプライマーセットを用いて、ｇａｄＢ１遺伝子を増幅した。
ｇａｄＢ１フォワードプライマー：gggcatatggcaatgttatacggta（配列番号５）
ｇａｄＢ１リバースプライマー：actgtcgacgtgtgtgaatc（配列番号６）
同様に、KB１２５３由来のｇａｄＢ２に基づく下記のプライマーセットを用いてｇａｄＢ２遺伝子を増幅した。
ｇａｄＢ２フォワードプライマー：gggcatatgacaaataacgatgaac（配列番号７）
ｇａｄＢ２リバースプライマー：gggctcgagttttgtcaccctat（配列番号８）
ｇａｄＢ１フォワードプライマー：gggcatatggcaatgttatacggta（配列番号５）
ｇａｄＢ１リバースプライマー：actgtcgacgtgtgtgaatc（配列番号６）
同様に、KB１２５３由来のｇａｄＢ２に基づく下記のプライマーセットを用いてｇａｄＢ２遺伝子を増幅した。
ｇａｄＢ２フォワードプライマー：gggcatatgacaaataacgatgaac（配列番号７）
ｇａｄＢ２リバースプライマー：gggctcgagttttgtcaccctat（配列番号８）
【0069】
２０ｎｇの鋳型ＤＮＡ、１０ｐｍｏｌの各プライマー、０．４ｍＭ ｄＮＴＰ（東洋紡株式会社）、および１．０ＵのＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡株式会社）を含むＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏ用ＰＣＲ緩衝液（２倍希釈、東洋紡株式会社）５０μＬ中でＰＣＲ反応を行った。９４℃で２分間の初期変性された後、９８℃１０秒間、６５℃３０秒間、６８℃１分間のサイクルを３０サイクル実施してＤＮＡを増幅させた。得られたＰＣＲ産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。ｇａｄ遺伝子および発現ベクターｐＥＴ－２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）を制限酵素で消化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製した。精製したｇａｄＢ１遺伝子及びｇａｄＢ２遺伝子は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（東洋紡株式会社）を用いて、それぞれプラスミドｐＥＴ－２１ａ（＋）に連結させた後、大腸菌ＪＭ１０９に導入した。遺伝子導入した菌体をＬＢ－アンピシリンプレート上に播種した後、コロニーを選択して、ＰＣＲで陽性クローンを同定した。プラスミドミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、陽性クローンから組換え発現ベクターを精製した。
【0070】
［試験例２］組換ＧａｄＢ１及びＧａｄＢ２の生成
得られた組換え発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、ＬＢ－アンピシリンプレートに播種した。コロニーを選択してＰＣＲで陽性クローンをＰＣＲで同定した。陽性クローンの大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、１ｍＭイソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地中で３７℃で１６時間培養して、組換え発現ベクターを発現させた。培養液を８０００×ｇで２０分間遠心分離して菌体を回収し、生理食塩水で２回洗浄した後、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で再懸濁した。超音波発振器（Ｉｎｓｉｎａｔｏｒ２０１Ｍ、株式会社クボタ）を用いて菌体を破砕して、２００００×ｇ、１０分間の遠心分離で残渣を除去した。発現した標的タンパク質を、Ｃａｐｔｕｒｅｍ（商標）Ｈｉｓ－Ｔａｇｇｅｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社）を用いて精製した。タンパク質合成を、１２％（ｗ／ｖ）アクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認し、合成したタンパク質量は、ウシ血清アルブミンを基準としたＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて吸光度測定により確認した。
得られた組換え発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、ＬＢ－アンピシリンプレートに播種した。コロニーを選択してＰＣＲで陽性クローンをＰＣＲで同定した。陽性クローンの大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、１ｍＭイソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地中で３７℃で１６時間培養して、組換え発現ベクターを発現させた。培養液を８０００×ｇで２０分間遠心分離して菌体を回収し、生理食塩水で２回洗浄した後、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で再懸濁した。超音波発振器（Ｉｎｓｉｎａｔｏｒ２０１Ｍ、株式会社クボタ）を用いて菌体を破砕して、２００００×ｇ、１０分間の遠心分離で残渣を除去した。発現した標的タンパク質を、Ｃａｐｔｕｒｅｍ（商標）Ｈｉｓ－Ｔａｇｇｅｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社）を用いて精製した。タンパク質合成を、１２％（ｗ／ｖ）アクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認し、合成したタンパク質量は、ウシ血清アルブミンを基準としたＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて吸光度測定により確認した。
【0071】
［試験例３］組換えＧａｄＢ１、ＧａｄＢ２の物性・酵素活性評価
得られた組換えＧａｄＢ１及びＧａｄＢ２の物性、酵素活性について、分子量、至適ｐＨ、至適温度、ピリドキサール５’－リン酸（ＰＬＰ）濃度の影響を調査した。酵素活性の試験は全てｎ＝３で行った。ＫＢ１２５３由来の上記組換えＧａｄＢ１及びＧａｄＢ２の物性及び酵素活性に加えて、既報のＬａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ属由来のＧａｄＢ１、ＧａｄＢ２の物性及び酵素活性を表３に示す。
得られた組換えＧａｄＢ１及びＧａｄＢ２の物性、酵素活性について、分子量、至適ｐＨ、至適温度、ピリドキサール５’－リン酸（ＰＬＰ）濃度の影響を調査した。酵素活性の試験は全てｎ＝３で行った。ＫＢ１２５３由来の上記組換えＧａｄＢ１及びＧａｄＢ２の物性及び酵素活性に加えて、既報のＬａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ属由来のＧａｄＢ１、ＧａｄＢ２の物性及び酵素活性を表３に示す。
【0072】
［３－１］分子量
精製されたＧａｄＢ１及びＧａｄＢ２について、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００Ｉｎｃｒｅａｓｅ１０／３００ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたＨＰＬＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌを含有する２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）でロード）と、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分子量を測定した。コンアルブミン（分子量７５０００）、オボアルブミン（分子量４４０００）、炭酸脱水酵素（分子量２９０００）、リボヌクレアーゼＡ（分子量１３７００）、およびシトクロムＣ（分子量１２４００）（いずれもＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を分子量標準として使用した。
精製されたＧａｄＢ１及びＧａｄＢ２について、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００Ｉｎｃｒｅａｓｅ１０／３００ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたＨＰＬＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌを含有する２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）でロード）と、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分子量を測定した。コンアルブミン（分子量７５０００）、オボアルブミン（分子量４４０００）、炭酸脱水酵素（分子量２９０００）、リボヌクレアーゼＡ（分子量１３７００）、およびシトクロムＣ（分子量１２４００）（いずれもＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を分子量標準として使用した。
【0073】
精製した組換えＧａｄＢ１及びＧａｄＢ２のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を図１に示す。ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果より、組換えＧａｄＢ１及びＧａｄＢ２の単量体の分子量が、それぞれ５２１００および５５４００であることが確認された。ＨＰＬＣの結果、未変性の組換えＧａｄＢ１及びＧａｄＢ２の分子量は、それぞれ１０４７００および２１９６００であることが確認された（データ示さず）。これらの結果より、ＧａｄＢ１が二量体、ＧａｄＢ２が四量体であることが示唆された（表３）。
【0074】
［３－２］至適ｐＨ
５０ｍＭグルタミン酸一ナトリウム（ＭＳＧ）、０．２ｍＭ ＰＬＰ、および１０μｇの組換えグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）を含む緩衝液２５μＬを、各種ｐＨ条件（ｐＨ２．５～６．５）となるように調製し、５０℃で１５分間インキュベーションした。緩衝液は、２００ｍＭグリシン－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．５）、２００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０～３．５）、２００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０～５．５）、又は２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ６．０～６．５）とした。インキュベーション後、９９．５％エタノールを添加することによって酵素反応を停止させ、残留Ｌ－Ｇｌｕの量をＬ－グルタミン酸アッセイＦ－ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用いて測定した。実験条件下で、１分間で１μｍｏｌ Ｌ－Ｇｌｕを消費する酵素の量をＧＡＤ活性の１Ｕとした。
５０ｍＭグルタミン酸一ナトリウム（ＭＳＧ）、０．２ｍＭ ＰＬＰ、および１０μｇの組換えグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）を含む緩衝液２５μＬを、各種ｐＨ条件（ｐＨ２．５～６．５）となるように調製し、５０℃で１５分間インキュベーションした。緩衝液は、２００ｍＭグリシン－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．５）、２００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０～３．５）、２００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０～５．５）、又は２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ６．０～６．５）とした。インキュベーション後、９９．５％エタノールを添加することによって酵素反応を停止させ、残留Ｌ－Ｇｌｕの量をＬ－グルタミン酸アッセイＦ－ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用いて測定した。実験条件下で、１分間で１μｍｏｌ Ｌ－Ｇｌｕを消費する酵素の量をＧＡＤ活性の１Ｕとした。
【0075】
結果を図２に示す。組換えＧａｄＢ１及びＧａｄＢ２の至適ｐＨは、それぞれ４．０および４．５であり、既報のＬａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ属由来の組換えＧＡＤと比較して大きな差異は見られなかった（表３）。
【0076】
［３－３］至適温度
５０ｍＭ ＭＳＧ、０．２ｍＭ ＰＬＰ、および１０μｇ組換えＧＡＤを含む２００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０（ＧａｄＢ１用）又は４．５（ＧａｄＢ２用））２５μＬを調製した。３５℃～７５℃の温度で１５分間インキュベーションした後、９９．５％エタノールを添加して酵素反応を停止させ、残留Ｌ－Ｇｌｕの量を測定した。
５０ｍＭ ＭＳＧ、０．２ｍＭ ＰＬＰ、および１０μｇ組換えＧＡＤを含む２００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０（ＧａｄＢ１用）又は４．５（ＧａｄＢ２用））２５μＬを調製した。３５℃～７５℃の温度で１５分間インキュベーションした後、９９．５％エタノールを添加して酵素反応を停止させ、残留Ｌ－Ｇｌｕの量を測定した。
【0077】
結果を図３に示す。組換えＧａｄＢ１とＧａｄＢ２の至適温度はそれぞれ６０℃と５０℃であった。これらの温度は、既報のＬａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ属由来の組換えＧＡＤの至適温度（３０～５０℃、表３）と比較して高い値となった。
【0078】
［３－４］ＰＬＰ濃度
５０ｍＭ ＭＳＧ、０～１ｍＭのＰＬＰ及び１０μｇ組換えＧＡＤを含む２００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０（ＧａｄＢ１用）又は４．５（ＧａｄＢ２用））を調製した。５０℃～６０℃で１５分間インキュベーションした後、９９．５％エタノールを添加して酵素反応を停止させ、残留Ｌ－Ｇｌｕの量を測定した。
５０ｍＭ ＭＳＧ、０～１ｍＭのＰＬＰ及び１０μｇ組換えＧＡＤを含む２００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０（ＧａｄＢ１用）又は４．５（ＧａｄＢ２用））を調製した。５０℃～６０℃で１５分間インキュベーションした後、９９．５％エタノールを添加して酵素反応を停止させ、残留Ｌ－Ｇｌｕの量を測定した。
【0079】
結果を図４に示す。ＧａｄＢ１は、Ｌ－Ｇｌｕの変換にＰＬＰを必要とすることが示された。ＰＬＰのない条件では、ＧａｄＢ１は、Ｌ－ＧｌｕをＧＡＢＡに変換することができないが、ＰＬＰを添加することで、活性が回復した。ＧａｄＢ２は、ＰＬＰのない条件下でも４１．２±３．４％のＧＡＢＡ変換率を示した。ＧａｄＢ１、ＧａｄＢ２共に、ＧＡＤ活性はＰＬＰ濃度に応じて高くなり、約０．２mM PLPで最大の活性を示した。ＧａｄＢ１とＧａｄＢ２のＧＡＢＡ変換率は、それぞれ６１．４±４．８％、７７．９±３．９％であった。
【0080】
［試験例４］Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ属由来のＧａｄＢ１及びＧａｄＢ２のアミノ酸配列アラインメント
表３に、試験例１－２で取得したＫＢ１２５３株由来のＧａｄＢ１及びＧａｄＢ２、並びに既報のＬａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ属由来のＧａｄＢ１及びＧａｄＢ２の分子量、至適ｐＨ、至適温度を示す。表中のＬａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＡＴＣＣ １４９１７は、Shin S., et al., J. Agric. Food Chem., Vol. 62, pp. 12186-12193 (2014)で既報の菌株である。Ｌｅｖｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ８７７Ｇは、Seo M. J., et al., Food Sci. Biotechnol., Vol. 22, pp. 751-755 (2013)で既報の菌株である。Ｌｅｖｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＣＧＭＣＣ １３０６は、Fan E., et al., Ann. Microbiol., Vol. 62, pp. 689-698 (2012)で既報の菌株である。Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ＮＦＲＩ ７４１５は、Komatsuzaki N., et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., Vol. 72, pp. 278-285 (2008)で既報の菌株である。Ｌｅｖｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＩＦＯ １２００５は、Ueno Y., et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., Vol. 61, pp. 1168-1171 (1997)で既報の菌株である。Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ Ａ１５６は、Sa H. D., et al., J. Microbiol. Biotechnol., Vol. 25, pp. 696-703 (2015)で既報の菌株である。Ｌｅｖｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｚｙｍａｅ ＧＵ２４０は、Park J. Y., et al., H, Biotechnol. Lett., Vol. 36, pp. 1791-1799 (2014)で既報の菌株である。表３に示す既報の各ＧＡＤのアミノ酸配列を表４に示す。
表３に、試験例１－２で取得したＫＢ１２５３株由来のＧａｄＢ１及びＧａｄＢ２、並びに既報のＬａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ属由来のＧａｄＢ１及びＧａｄＢ２の分子量、至適ｐＨ、至適温度を示す。表中のＬａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＡＴＣＣ １４９１７は、Shin S., et al., J. Agric. Food Chem., Vol. 62, pp. 12186-12193 (2014)で既報の菌株である。Ｌｅｖｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ８７７Ｇは、Seo M. J., et al., Food Sci. Biotechnol., Vol. 22, pp. 751-755 (2013)で既報の菌株である。Ｌｅｖｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＣＧＭＣＣ １３０６は、Fan E., et al., Ann. Microbiol., Vol. 62, pp. 689-698 (2012)で既報の菌株である。Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ＮＦＲＩ ７４１５は、Komatsuzaki N., et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., Vol. 72, pp. 278-285 (2008)で既報の菌株である。Ｌｅｖｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＩＦＯ １２００５は、Ueno Y., et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., Vol. 61, pp. 1168-1171 (1997)で既報の菌株である。Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ Ａ１５６は、Sa H. D., et al., J. Microbiol. Biotechnol., Vol. 25, pp. 696-703 (2015)で既報の菌株である。Ｌｅｖｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｚｙｍａｅ ＧＵ２４０は、Park J. Y., et al., H, Biotechnol. Lett., Vol. 36, pp. 1791-1799 (2014)で既報の菌株である。表３に示す既報の各ＧＡＤのアミノ酸配列を表４に示す。
【0081】
図５に、表３に示す各菌株のＧＡＤのアミノ酸配列のアラインメントを示す。各菌株のＧａｄＢ１同士で８３～１００％、ＧａｄＢ２同士で７９～１００％の高い配列同一性が示された。
【0082】
【表3】
【0083】
【表4】
【産業上の利用可能性】
【0084】
本発明は、食品製造業、医薬品製造業等において利用可能な発明である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】