特開 2024-73536 深部イントロン突然変異の遺伝子編集

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024073536

(43)【公開日】2024-05-29

(54)【発明の名称】深部イントロン突然変異の遺伝子編集

(51)【国際特許分類】

   A61K 48/00 20060101AFI20240522BHJP

   A61K 38/46 20060101ALI20240522BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20240522BHJP

   A61K 47/69 20170101ALI20240522BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240522BHJP

   A61K 35/761 20150101ALI20240522BHJP

   A61K 35/763 20150101ALI20240522BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240522BHJP

   A61P 7/04 20060101ALI20240522BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20240522BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20240522BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20240522BHJP

   A61P 27/12 20060101ALI20240522BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240522BHJP

   A61P 7/06 20060101ALI20240522BHJP

   A61P 21/04 20060101ALI20240522BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20240522BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240522BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20240522BHJP

   A61P 13/02 20060101ALI20240522BHJP

   A61P 25/02 20060101ALI20240522BHJP

   A61P 3/12 20060101ALI20240522BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20240522BHJP

   C12N 15/88 20060101ALI20240522BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240522BHJP

   C12N 15/861 20060101ALI20240522BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20240522BHJP

   C12N 15/869 20060101ALI20240522BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20240522BHJP

【ＦＩ】

A61K48/00

A61K38/46 ZNA

A61K31/7105

A61K47/69

A61K35/76

A61K35/761

A61K35/763

A61P43/00 105

A61P7/04

A61P25/00

A61P13/12

A61P27/02

A61P27/12

A61P35/02

A61P7/06

A61P21/04

A61P37/02

A61P35/00

A61P3/00

A61P13/02

A61P25/02

A61P3/12

C12N15/09 110

C12N15/88 Z

C12N15/63 Z

C12N15/861 Z

C12N15/864 100Z

C12N15/869 Z

C12N15/867 Z

【審査請求】有

【請求項の数】19

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2024038537

(22)【出願日】2024-03-13

(62)【分割の表示】P 2021189812の分割

【原出願日】2016-04-15

(31)【優先権主張番号】62/162,720

(32)【優先日】2015-05-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】500034653

【氏名又は名称】ジェンザイム・コーポレーション

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100216105

【弁理士】

【氏名又は名称】守安 智

(72)【発明者】

【氏名】グゥオシィアン・ルアン

(72)【発明者】

【氏名】アブラハム・スカリア

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4C076AA19

4C076AA95

4C076CC01

4C076CC07

4C076CC10

4C076CC14

4C076CC17

4C076CC21

4C076CC26

4C076CC27

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA13

4C084BA01

4C084DC22

4C084MA02

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZA02

4C084ZA20

4C084ZA33

4C084ZA51

4C084ZA53

4C084ZA55

4C084ZA81

4C084ZA94

4C084ZB05

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4C084ZB26

4C084ZB27

4C084ZC21

4C086AA01

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4C086EA16

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4C086NA05

4C086NA14

4C086ZA02

4C086ZA20

4C086ZA33

4C086ZA51

4C086ZA53

4C086ZA55

4C086ZA81

4C086ZA94

4C086ZB05

4C086ZB21

4C086ZB26

4C086ZB27

4C086ZC21

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZA02

4C087ZA20

4C087ZA33

4C087ZA51

4C087ZA53

4C087ZA55

4C087ZA81

4C087ZA94

4C087ZB05

4C087ZB21

4C087ZB26

4C087ZB27

4C087ZC21

(57)【要約】      （修正有）

【課題】ＣＥＰ２９０突然変異によって引き起こされるＬＣＡ１０のような、深部イントロン突然変異と関連のある障害を治療するための組成物、方法、キットおよびウイルス粒子を提供する。
【解決手段】個体の遺伝子における深部イントロン突然変異と関連する疾患または障害を治療するための組成物であって、該組成物が、ａ）深部イントロン突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする、第１および第２のガイドＲＮＡと、ｂ）Ｃａｓタンパク質とを含む、遺伝子操作された、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含み、該Ｃａｓタンパク質は、深部イントロン突然変異の両端に位置する部位で標的ＤＮＡ分子を切断し、それによって、深部イントロン突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出す、前記組成物である。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

個体の遺伝子における深部イントロン突然変異と関連する疾患または障害を治療するための組成物であって、該組成物は、
ａ）該深部イントロン突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡと、
ｂ）Ｃａｓタンパク質と
を含む、遺伝子操作された、天然に存在しないＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ
Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）システムを含み、該Ｃａｓタンパク質は、該深部イントロン突然変異の両端に位置する部位で標的ＤＮＡ分子を切断し、それによって、該深部イントロン突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出す、前記組成物。

【請求項2】

個体の核酸における深部イントロン突然変異と関連する疾患または障害を治療するための組成物であって、該組成物は、
ａ）該深部イントロン突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡと、
ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列と
を含む、遺伝子操作された、天然に存在しないＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ
Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）システムをコードする核酸を含み、該Ｃａｓタンパク質は、該深部イントロン突然変異の両端に位置する部位で標的ＤＮＡ分子を切断し、それによって、該深部イントロン突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出す、前記組成物。

【請求項3】

深部イントロン突然変異と関連する疾患または障害は、無フィブリノーゲン血症、アルポート症候群、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、常染色体劣性多発性嚢胞腎、バース症候群、βサラセミア、先天性無フィブリノーゲン血症、先天性白内障・顔貌異常・ニューロパチー症候群、先天性グリコシル化異常症Ｉａ型、先天性グリコシル化異常症ＩＩ型、嚢胞性線維症、ジヒドロプテリジンレダクターゼ欠乏症、ファブリー病、急性骨髄性白血病を伴う家族性血小板異常症、ファンコニ貧血、ギテルマン症候群、成長ホルモン不応症、フリードライヒ運動失調症、血友病Ａ、遺伝性巨赤芽球性貧血１、ヘルマンスキー・パドラック症候群、ホモシスチン尿症、メープルシロップ尿症、マルファン症候群、メチオニンシンターゼ欠乏症、メチルマロン酸血症、ミトコンドリア三機能タンパク質欠乏症、ムコ多糖症ＩＩ型、マルチミニコア病、筋ジストロフィー、神経線維腫症Ｉ型、ニーマン・ピック病Ｃ型、眼白子症Ｉ型、オルニチンデルタアミノトランスフェラーゼ欠損症、全身性エリテマトーデスの素因、プロピオン酸血症、ラブドイド腫瘍、シュワルツ・ヤンペル症候群、スティックラー症候群、全身性エリテマトーデス、結節性硬化症、ウェルナー症候群、Ｘ連鎖高免疫グロブリンＭ血症またはＸ連鎖低リン酸血症である、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項4】

深部イントロン突然変異は、表１に示される深部イントロン突然変異である、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項5】

個体の核酸における、深部イントロン突然変異と関連する眼の疾患または障害を治療するための組成物であって、該組成物は、
ａ）該深部イントロン突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡと、
ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列と
を含む、遺伝子操作された、天然に存在しないＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ
Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）システムをコードする核酸を含み、該Ｃａｓタンパク質は、該深部イントロン突然変異の両端に位置する部位で標的ＤＮＡ分子を切断し、それによって、該深部イントロン突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出す、前記組成物。

【請求項6】

個体の核酸における深部イントロン突然変異と関連する眼の疾患または障害を治療するための組成物であって、該組成物は、
ａ）該深部イントロン突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡと、
ｂ）Ｃａｓタンパク質と
を含む、遺伝子操作された、天然に存在しないＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ
Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）システムを含み、該Ｃａｓタンパク質は、該深部イントロン突然変異の両端に位置する部位で標的ＤＮＡ分子を切断し、それによって、該深部イントロン突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出す、前記組成物。

【請求項7】

眼の疾患は、レーバー先天黒内障、視神経萎縮症、網膜色素変性症、網膜芽細胞腫、シュタルガルト病、アッシャー症候群またはＸ連鎖網膜色素変性症である、請求項５または６に記載の組成物。

【請求項8】

深部イントロン突然変異は、表２に示される深部イントロン突然変異である、請求項５～７のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項9】

眼の疾患は、レーバー先天黒内障である、請求項５～８のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項10】

第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡガイド配列は、中心体タンパク質２９０ｋＤａ（ＣＥＰ２９０）遺伝子の深部イントロン突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする、請求項５～９のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項11】

深部イントロン突然変異は、ｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ突然変異である、請求項５～１０のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項12】

第１のガイドＲＮＡは、配列番号４１、配列番号４５、配列番号４６または配列番号４７の配列を含むＤＮＡによってコードされる、請求項５～１１のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項13】

第１のガイドＲＮＡは、配列番号１９、配列番号５０、配列番号５１または配列番号５２の配列を含むＤＮＡによってコードされる、請求項５～１２のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項14】

第２のガイドＲＮＡは、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４８または配列番号４９の配列を含むＤＮＡによってコードされる、請求項５～１３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項15】

第２のガイドＲＮＡは、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号５３または配列番号５４の配列を含むＤＮＡによってコードされる、請求項５～１４のいずれか
１項に記載の組成物。

【請求項16】

ＣＥＰ２９０は、ヒトＣＥＰ２９０である、請求項１０～１５のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項17】

ＣＥＰ２９０は、配列番号２３に示される配列の深部イントロン突然変異を含む、請求項１０～１６のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項18】

深部イントロン突然変異は、核酸の５’スプライス供与部位の約１～１０，０００ヌクレオチド、約１～１０００ヌクレオチドまたは約１００～１０００ヌクレオチド下流に位置する、請求項１～１７のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項19】

深部イントロン突然変異は、核酸の３’スプライス受容部位の約１～１０，０００ヌクレオチド、約１～１０００ヌクレオチドまたは約１００～１０００ヌクレオチド上流に位置する、請求項１～１８のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項20】

深部イントロン突然変異は、核酸中にスプライス供与部位またはスプライス受容部位を導入する、請求項１～１９のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項21】

Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である、請求項１～２０のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項22】

Ｃａｓ９タンパク質は、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９タンパク質、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９タンパク質またはトレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）Ｃａｓ９タンパク質である、請求項２１に記載の組成物。

【請求項23】

Ｃａｓ９は、真核細胞における発現のためにコドン最適化される、請求項２１または２２に記載の組成物。

【請求項24】

真核細胞は、哺乳動物細胞である、請求項２３に記載の組成物。

【請求項25】

真核細胞は、ヒト細胞である、請求項２３または２４に記載の組成物。

【請求項26】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、１つまたはそれ以上の核局在性シグナル（ＮＬＳ）をさらに含む、請求項１～２５のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項27】

Ｃａｓタンパク質は、１つまたはそれ以上のＮＬＳを含む、請求項２６に記載の組成物。

【請求項28】

ＮＬＳは、ＳＶ４０ラージＴ抗原中のＣ末端配列である、請求項２６または２７に記載の組成物。

【請求項29】

ＮＬＳは、配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２６）またはＰＫＫＫＲＫＶＥＤＰＫＫＫＲＫＶＤ（配列番号２７）を含む、請求項２８に記載の組成物。

【請求項30】

第１のガイドＲＮＡおよび／または第２のガイドＲＮＡは、トランス活性化ｃｒ（ｔｒ
ａｃｒ）配列と融合されている、請求項１～２９のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項31】

ｔｒａｃｒ配列は、配列番号２５によってコードされるヌクレオチド配列を含む、請求項３０に記載の組成物。

【請求項32】

第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質をコードする核酸は、真核細胞において発現される、請求項２～４および６～３１のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項33】

第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡおよび／またはＣａｓタンパク質をコードする核酸は、１つまたはそれ以上の調節制御エレメントと作動可能に連結されている、請求項２～４および６～３２のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項34】

第１のガイドＲＮＡおよび／または第２のガイドＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターと作動可能に連結されている、請求項３３に記載の組成物。

【請求項35】

ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、Ｕ６、７ＳＫまたはＨ１プロモーターである、請求項３４に記載の組成物。

【請求項36】

Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターと作動可能に連結されている、請求項３３～３５のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項37】

ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ＣＭＶプロモーター（ｍｉｎＣＭＶプロモーター）由来の最小プロモーター断片、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ＣＫ６プロモーター、トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ－アクチン／ウサギβ－グロビンプロモーター（ＣＡＧ）プロモーター、桿体オプシンプロモーター、錐体オプシンプロモーター、βホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）プロモーター、網膜色素変性症（ＲＰ１）プロモーターまたは光受容体間レチノイド結合タンパク質遺伝子（ＩＲＢＰ）プロモーターである、請求項３６に記載の組成物。

【請求項38】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、脂質、カチオン性脂質、リポソーム、ポリカチオンまたは核酸および／もしくはタンパク質の細胞取り込みを増強する物質と複合体形成されている、請求項１、３～５または７～３１のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項39】

第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡまたはＣａｓタンパク質のうちの１つまたはそれ以上をコードする核酸は、システムの同一または異なるベクター上に位置する、請求項２～４および６～３７のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項40】

ベクターは、プラスミドである、請求項３９に記載の組成物。

【請求項41】

ベクターは、送達システムと複合体形成されている、請求項３９または４０に記載の組成物。

【請求項42】

ベクターは、脂質、カチオン性脂質、リポソーム、ポリカチオンまたは核酸の細胞取り込みを増強する物質と複合体形成されている、請求項４１に記載の組成物。

【請求項43】

ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター、組換えアデノウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクターまたは組換え単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターである、請求項２９に記載の組成物。

【請求項44】

ベクターは、組換えアデノウイルスベクターである、請求項４３に記載の組成物。

【請求項45】

組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型２、１、５、６、１９、３、１１、７、１４、１６、２１、１２、１８、３１、８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２４～３０、３７、４０、４１、ＡｄＨｕ２、ＡｄＨｕ３、ＡｄＨｕ４、ＡｄＨｕ２４、ＡｄＨｕ２６、ＡｄＨｕ３４、ＡｄＨｕ３５、ＡｄＨｕ３６、ＡｄＨｕ３７、ＡｄＨｕ４１、ＡｄＨｕ４８、ＡｄＨｕ４９、ＡｄＨｕ５０、ＡｄＣ６、ＡｄＣ７、ＡｄＣ６９、ウシＡｄ３型、イヌＡｄ２型、ヒツジＡｄまたはブタＡｄ３型に由来する、請求項４４に記載の組成物。

【請求項46】

組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型２またはアデノウイルス血清型５の変異体に由来する、請求項４４または４５に記載の組成物。

【請求項47】

ベクターは、組換えレンチウイルスベクターである、請求項４３に記載の組成物。

【請求項48】

組換えレンチウイルスベクターは、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モカラウイルス（Ｍｏｋａｌａ ｖｉｒｕｓ）、狂犬病ウイルス、ＲＤ１１４またはその変異体で偽型化されたレンチウイルスに由来する、請求項４７に記載の組成物。

【請求項49】

ベクターは、ｒＨＳＶベクターである、請求項４３に記載の組成物。

【請求項50】

ｒＨＳＶベクターは、ｒＨＳＶ－１またはｒＨＳＶ－２に由来する、請求項４９に記載の組成物。

【請求項51】

ベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターである、請求項４３に記載の組成物。

【請求項52】

第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡまたはＣａｓタンパク質のうちの１つまたはそれ以上をコードする核酸は、１つまたはそれ以上のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列がその両端に位置する、請求項５１に記載の組成物。

【請求項53】

第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡまたはＣａｓタンパク質のうちの１つまたはそれ以上をコードする核酸は、２つのＡＡＶ ＩＴＲがその両端に位置する、請求項５２に記載の組成物。

【請求項54】

ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶまたはマウスＡＡＶキャプシド血清型ＩＴＲである、請求項５２または請求項５３に記載の組成物。

【請求項55】

ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲである、請求項５２～５４のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項56】

ベクターは、自己相補的ベクターである、請求項５２～５５のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項57】

ベクターは、ウイルス粒子中にキャプシド封入されている、請求項４３に記載の組成物。

【請求項58】

ウイルス粒子は、組換えアデノウイルスベクターをキャプシド封入する組換えアデノウイルス粒子である、請求項５７に記載の組成物。

【請求項59】

組換えアデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型２、１、５、６、１９、３、１１、７、１４、１６、２１、１２、１８、３１、８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２４～３０、３７、４０、４１、ＡｄＨｕ２、ＡｄＨｕ３、ＡｄＨｕ４、ＡｄＨｕ２４、ＡｄＨｕ２６、ＡｄＨｕ３４、ＡｄＨｕ３５、ＡｄＨｕ３６、ＡｄＨｕ３７、ＡｄＨｕ４１、ＡｄＨｕ４８、ＡｄＨｕ４９、ＡｄＨｕ５０、ＡｄＣ６、ＡｄＣ７、ＡｄＣ６９、ウシＡｄ３型、イヌＡｄ２型、ヒツジＡｄまたはブタＡｄ３に由来するキャプシドを含む、請求項５８に記載の組成物。

【請求項60】

組換えアデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型２キャプシドまたはアデノウイルス血清型５キャプシドの変異体を含む、請求項５８または５９に記載の組成物。

【請求項61】

ウイルス粒子は、組換えレンチウイルスベクターをキャプシド封入する組換えレンチウイルス粒子である、請求項５７に記載の組成物。

【請求項62】

組換えレンチウイルス粒子は、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モカラウイルス（Ｍｏｋａｌａ ｖｉｒｕｓ）、狂犬病ウイルス、ＲＤ１１４またはその変異体で偽型化されたキャプシドを含む、請求項６１に記載の組成物。

【請求項63】

ウイルス粒子は、組換えＨＳＶベクターをキャプシド封入する組換えＨＳＶ粒子である、請求項５７に記載の組成物。

【請求項64】

組換えＨＳＶ粒子は、ｒＨＳＶ－１粒子またはｒＨＳＶ－２ウイルス粒子である、請求項６３に記載の組成物。

【請求項65】

ウイルス粒子は、組換えＡＡＶベクターを含む組換えＡＡＶウイルス粒子である、請求項５７に記載の組成物。

【請求項66】

組換えＡＡＶウイルス粒子は、クレードＡ～Ｆに由来するＡＡＶ血清型キャプシドを含む、請求項６５に記載の組成物。

【請求項67】

ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２－７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶまたはマウスＡＡＶキャプシドｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含む、請求項６５または６６に記載の組成物。

【請求項68】

ｒＡＡＶウイルス粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、同一ＡＡＶ血清型に由来する、請求項６５～６７のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項69】

ｒＡＡＶウイルス粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、異なるＡＡＶ血清型に由来する、請求項６５～６７のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項70】

組換えＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９および／またはＡＡＶｒｈ１０キャプシドを含む、請求項６５～６９のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項71】

ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９および／またはＡＡＶｒｈ１０キャプシドは、チロシン突然変異またはヘパラン結合突然変異を含む、請求項７０に記載の組成物。

【請求項72】

ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む、請求項６５～７１のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項73】

個体の核酸における深部イントロン突然変異と関連する疾患または障害を治療するための方法であって、該方法は、
ａ）該深部イントロン突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡと、
ｂ）Ｃａｓタンパク質と
を含む、遺伝子操作された、天然に存在しないＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ
Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）システムを含む組成物の治療有効量を、個体に投与することを含み、該Ｃａｓタンパク質は、該深部イントロン突然変異の両端に位置する部位で標的ＤＮＡ分子を切断し、それによって、該深部イントロン突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出す、前記方法。

【請求項74】

個体の核酸における深部イントロン突然変異と関連する疾患または障害を治療するための方法であって、該方法は、
ａ）該深部イントロン突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡと、
ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列と
を含む、遺伝子操作された、天然に存在しないＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ
Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）システムをコードする核酸を含む組成物の治療有効量を、個体に投与することを含み、該Ｃａｓタンパク質は、該深部イントロン突然変異の両端に位置する部位で標的ＤＮＡ分子を切断し、それによって、該深部イントロン突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出す、前記方法。

【請求項75】

深部イントロン突然変異と関連する疾患または障害は、無フィブリノーゲン血症、アルポート症候群、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、常染色体劣性多発性嚢胞腎、バース症候群、βサラセミア、先天性無フィブリノーゲン血症、先天性白内障・顔貌異常・ニューロパチー症候群、先天性グリコシル化異常症Ｉａ型、先天性グリコシル化異常症ＩＩ型、嚢胞性線維症、ジヒドロプテリジンレダクターゼ欠乏症、ファブリー病、急性骨髄性白血病を伴う家族性血小板異常症、ファンコニ貧血、ギテルマン症候群、成長ホルモン不応症、フリードライヒ運動失調症、血友病Ａ、遺伝性巨赤芽球性貧血１、ヘルマンスキー・パドラック症候群、ホモシスチン尿症、メープルシロップ尿症、マルファン症候群、メチオニンシンターゼ欠乏症、メチルマロン酸血症、ミトコンドリア三機能タンパク質欠乏症、ムコ多糖症ＩＩ型、マルチミニコア病、筋ジストロフィー、神経線維腫症Ｉ型、ニーマン・ピック病Ｃ型、眼白子症Ｉ型、オルニチンデルタアミノトランスフェラ
ーゼ欠損症、全身性エリテマトーデスの素因、プロピオン酸血症、ラブドイド腫瘍、シュワルツ・ヤンペル症候群、スティックラー症候群、全身性エリテマトーデス、結節性硬化症、ウェルナー症候群、Ｘ連鎖高免疫グロブリンＭ血症またはＸ連鎖低リン酸血症である、請求項７３または７４に記載の方法。

【請求項76】

深部イントロン突然変異は、表１に示される深部イントロン突然変異である、請求項７３～７５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項77】

個体の核酸における深部イントロン突然変異と関連する眼の疾患または障害を治療するための方法であって、該方法は、
ａ）該深部イントロン突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡと、
ｂ）Ｃａｓタンパク質と
を含む、遺伝子操作された、天然に存在しないＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ
Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）システムを含む組成物の治療有効量を、個体に投与することを含み、該深部イントロン突然変異の両端に位置する部位で標的ＤＮＡ分子を切断し、それによって、該深部イントロン突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出す、前記方法。

【請求項78】

個体の核酸における深部イントロン突然変異と関連する眼の疾患または障害を治療するための方法であって、該方法は、
ａ）該深部イントロン突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡと、
ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列と
を含む、遺伝子操作された、天然に存在しないＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ
Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）システムをコードする核酸を含む組成物の治療有効量を、個体に投与することを含み、該深部イントロン突然変異の両端に位置する部位で標的ＤＮＡ分子を切断し、それによって、該深部イントロン突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出す、前記方法。

【請求項79】

眼の疾患は、レーバー先天黒内障、視神経萎縮症、網膜色素変性症、網膜芽細胞腫、シュタルガルト病、アッシャー症候群またはＸ連鎖網膜色素変性症である、請求項７７または７８に記載の方法。

【請求項80】

深部イントロン突然変異は、表２に示される深部イントロン突然変異である、請求項７７～７９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項81】

個体は、哺乳動物である、請求項７３～８０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項82】

哺乳動物は、ヒトである、請求項８１に記載の方法。

【請求項83】

眼の疾患は、レーバー先天黒内障である、請求項７７～８２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項84】

組成物は、個体の眼に投与される、請求項７７～８３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項85】

投与は、網膜下または硝子体内である、請求項８４に記載の方法。

【請求項86】

第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡガイド配列は、中心体タンパク質２９０ｋＤａ（ＣＥＰ２９０）遺伝子の深部イントロン突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする、請求項７７～８５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項87】

深部イントロン突然変異は、ｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ突然変異である、請求項７７～８６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項88】

第１のガイドＲＮＡは、配列番号４１、配列番号４５、配列番号４６または配列番号４７の配列を含むＤＮＡによってコードされる、請求項７７～８７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項89】

第１のガイドＲＮＡは、配列番号１９、配列番号５０、配列番号５１または配列番号５２の配列を含むＤＮＡによってコードされる、請求項７７～８８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項90】

第２のガイドＲＮＡは、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４８または配列番号４９の配列を含むＤＮＡによってコードされる、請求項７７～８９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項91】

第２のガイドＲＮＡは、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号５３または配列番号５４の配列を含むＤＮＡによってコードされる、請求項７７～９０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項92】

ＣＥＰ２９０は、ヒトＣＥＰ２９０である、請求項８６～９１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項93】

ＣＥＰ２９０は、配列番号２３に示される配列の深部イントロン突然変異を含む、請求項８６～９２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項94】

深部イントロン突然変異は、核酸の５’スプライス供与部位の約１～１０，０００ヌクレオチド、約１～１０００ヌクレオチドまたは約１００～１０００ヌクレオチド下流に位置する、請求項７３～９３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項95】

深部イントロン突然変異は、核酸の３’スプライス受容部位の約１～１０，０００ヌクレオチド、約１～１０００ヌクレオチドまたは約１００～１０００ヌクレオチド上流に位置する、請求項７３～９４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項96】

深部イントロン突然変異は、核酸中にスプライス供与部位またはスプライス受容部位を導入する、請求項７３～９５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項97】

Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である、請求項７３～９６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項98】

Ｃａｓ９タンパク質は、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９タンパク質、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９タンパク質またはトレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）Ｃａｓ９タンパク質である、請求項９７に記載の方法。

【請求項99】

Ｃａｓ９は、真核細胞における発現のためにコドン最適化される、請求項９７または９８に記載の方法。

【請求項100】

真核細胞は、哺乳動物細胞である、請求項９９に記載の方法。

【請求項101】

真核細胞は、ヒト細胞である、請求項９９または１００に記載の方法。

【請求項102】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、１つまたはそれ以上の核局在性シグナル（ＮＬＳ）をさらに含む、請求項７３～１０１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項103】

Ｃａｓタンパク質は、１つまたはそれ以上のＮＬＳを含む、請求項１０２に記載の方法。

【請求項104】

ＮＬＳは、ＳＶ４０ラージＴ抗原中のＣ末端配列である、請求項１０２または１０３に記載の方法。

【請求項105】

ＮＬＳは、配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２６）またはＰＫＫＫＲＫＶＥＤＰＫＫＫＲＫＶＤ（配列番号２７）を含む、請求項１０２～１０４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項106】

第１のガイドＲＮＡおよび／または第２のガイドＲＮＡは、トランス活性化ｃｒ（ｔｒａｃｒ）配列と融合されている、請求項７３～１０５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項107】

ｔｒａｃｒ配列は、配列番号２５によってコードされるヌクレオチド配列を含む、請求項１０６に記載の方法。

【請求項108】

第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質は、真核細胞において発現される、請求項７３～１０７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項109】

第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡおよび／またはＣａｓタンパク質をコードする核酸は、１つまたはそれ以上の調節制御エレメントと作動可能に連結されている、請求項７４～７６および７８～１０８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項110】

第１のガイドＲＮＡおよび／または第２のガイドＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターと作動可能に連結されている、請求項１０９に記載の方法。

【請求項111】

ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、Ｕ６、７ＳＫまたはＨ１プロモーターである、請求項１１０に記載の方法。

【請求項112】

Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターと作動可能に連結されている、請求項１０９～１１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項113】

ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ＣＭＶプロモーター（ｍｉｎＣＭＶプロモーター）由来の最小プロモーター断片、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ＣＫ６プロモーター、トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／
ニワトリβ－アクチン／ウサギβ－グロビンプロモーター（ＣＡＧ）プロモーター、桿体オプシンプロモーター、錐体オプシンプロモーター、βホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）プロモーター、網膜色素変性症（ＲＰ１）プロモーターまたは光受容体間レチノイド結合タンパク質遺伝子（ＩＲＢＰ）プロモーターである、請求項１１２に記載の方法。

【請求項114】

ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳシステムは、脂質、カチオン性脂質、リポソーム、ポリカチオンまたは核酸の細胞取り込みを増強する物質と複合体形成されている、請求項７３、７５～７７および７９～１０７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項115】

第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡまたはＣａｓタンパク質のうちの１つまたはそれ以上をコードする核酸は、システムの同一または異なるベクター上に位置する、請求項７４～７６および７８～１１４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項116】

ベクターは、プラスミドである、請求項１１５に記載の方法。

【請求項117】

ベクターは、送達システムと複合体形成されている、請求項１１５または１１６に記載の方法。

【請求項118】

ベクターは、脂質、リポソーム、ポリカチオンまたは核酸の細胞取り込みを増強する物質と複合体形成されている、請求項１１７に記載の方法。

【請求項119】

ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター、組換えアデノウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクターまたは組換え単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターである、請求項１１５に記載の方法。

【請求項120】

ベクターは、組換えアデノウイルスベクターである、請求項１１９に記載の方法。

【請求項121】

組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型２、１、５、６、１９、３、１１、７、１４、１６、２１、１２、１８、３１、８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２４～３０、３７、４０、４１、ＡｄＨｕ２、ＡｄＨｕ３、ＡｄＨｕ４、ＡｄＨｕ２４、ＡｄＨｕ２６、ＡｄＨｕ３４、ＡｄＨｕ３５、ＡｄＨｕ３６、ＡｄＨｕ３７、ＡｄＨｕ４１、ＡｄＨｕ４８、ＡｄＨｕ４９、ＡｄＨｕ５０、ＡｄＣ６、ＡｄＣ７、ＡｄＣ６９、ウシＡｄ３型、イヌＡｄ２型、ヒツジＡｄまたはブタＡｄ３型に由来する、請求項１２０に記載の方法。

【請求項122】

組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型２またはアデノウイルス血清型５の変異体に由来する、請求項１２０または１２１に記載の方法。

【請求項123】

ベクターは、組換えレンチウイルスベクターである、請求項１１９に記載の方法。

【請求項124】

組換えレンチウイルスベクターは、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モカラウイルス（Ｍｏｋａｌａ ｖｉｒｕｓ）、狂犬病ウイルス、ＲＤ１１４またはその変異体で偽型化されたレンチウイルスに由来する、請求項１２３に記載の方法。

【請求項125】

ベクターは、ｒＨＳＶベクターである、請求項１１９に記載の方法。

【請求項126】

ｒＨＳＶベクターは、ｒＨＳＶ－１またはｒＨＳＶ－２に由来する、請求項１２５に記載の方法。

【請求項127】

ベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターである、請求項１１９に記載の方法。

【請求項128】

第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡまたはＣａｓタンパク質のうちの１つまたはそれ以上をコードする核酸は、１つまたはそれ以上のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列がその両端に位置する、請求項１２７に記載の方法。

【請求項129】

第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡまたはＣａｓタンパク質のうちの１つまたはそれ以上をコードする核酸は、２つのＡＡＶ ＩＴＲがその両端に位置する、請求項１２８に記載の方法。

【請求項130】

ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶまたはマウスＡＡＶキャプシド血清型ＩＴＲである、請求項１２８または１２９に記載の方法。

【請求項131】

ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲである、請求項１２８～１３０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項132】

ベクターは、自己相補的ベクターである、請求項１２７～１３１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項133】

ベクターは、ウイルス粒子中にキャプシド封入されている、請求項１１９に記載の方法。

【請求項134】

ウイルス粒子は、アデノウイルスベクターをキャプシド封入する組換えアデノウイルス粒子である、請求項１３３に記載の方法。

【請求項135】

組換えアデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型２、１、５、６、１９、３、１１、７、１４、１６、２１、１２、１８、３１、８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２４～３０、３７、４０、４１、ＡｄＨｕ２、ＡｄＨｕ３、ＡｄＨｕ４、ＡｄＨｕ２４、ＡｄＨｕ２６、ＡｄＨｕ３４、ＡｄＨｕ３５、ＡｄＨｕ３６、ＡｄＨｕ３７、ＡｄＨｕ４１、ＡｄＨｕ４８、ＡｄＨｕ４９、ＡｄＨｕ５０、ＡｄＣ６、ＡｄＣ７、ＡｄＣ６９、ウシＡｄ３型、イヌＡｄ２型、ヒツジＡｄまたはブタＡｄ３型に由来するキャプシドを含む、請求項１３４に記載の方法。

【請求項136】

組換えアデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型２キャプシドまたはアデノウイルス血清型５キャプシドの変異体を含む、請求項１３５に記載の方法。

【請求項137】

ウイルス粒子は、組換えレンチウイルスベクターをキャプシド封入する組換えレンチウイルス粒子である、請求項１３３に記載の方法。

【請求項138】

組換えレンチウイルス粒子は、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モカラウイルス（Ｍｏｋａｌａ ｖｉｒｕｓ）、狂犬病ウイルス、ＲＤ１１４またはその変異体で偽型化されたキャプシドを含む、請求項１３７に記載の方法。

【請求項139】

ウイルス粒子は、組換えＨＳＶベクターをキャプシド封入する組換えＨＳＶ粒子である、請求項１３３に記載の方法。

【請求項140】

組換えＨＳＶ粒子は、ｒＨＳＶ－１粒子またはｒＨＳＶ－２ウイルス粒子である、請求項１３９に記載の方法。

【請求項141】

ウイルス粒子は、組換えＡＡＶベクターを含む組換えＡＡＶウイルス粒子である、請求項１３３に記載の方法。

【請求項142】

組換えＡＡＶウイルス粒子は、クレードＡ～Ｆに由来するＡＡＶ血清型キャプシドを含む、請求項１４１に記載の方法。

【請求項143】

ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２－７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶまたはマウスＡＡＶキャプシドｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含む、請求項１４１または１４２に記載の方法。

【請求項144】

ｒＡＡＶウイルス粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、同一ＡＡＶ血清型に由来する、請求項１４１～１４３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項145】

ｒＡＡＶウイルス粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、異なるＡＡＶ血清型に由来する、請求項１４１～１４３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項146】

組換えＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９および／またはＡＡＶｒｈ１０キャプシドを含む、請求項１４１～１４５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項147】

ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９および／またはＡＡＶｒｈ１０キャプシドは、チロシン突然変異またはヘパラン結合突然変異を含む、請求項１４６に記載の方法。

【請求項148】

ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む、請求項１４１～１４７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項149】

組成物は、医薬組成物である、請求項７３～１４８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項150】

個体の核酸における深部イントロン突然変異と関連している障害を治療するための、請求項１～７２のいずれか１項に記載の組成物の使用。

【請求項151】

個体の核酸における深部イントロン突然変異と関連している障害を治療するための医薬の製造における、請求項１～７２のいずれか１項に記載の組成物の使用。

【請求項152】

深部イントロン突然変異と関連する疾患または障害は、無フィブリノーゲン血症、アルポート症候群、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、常染色体劣性多発性嚢胞腎、バース症候群、βサラセミア、先天性無フィブリノーゲン血症、先天性白内障・顔貌異常・ニューロパチー症候群、先天性グリコシル化異常症Ｉａ型、先天性グリコシル化異常症ＩＩ型、嚢胞性線維症、ジヒドロプテリジンレダクターゼ欠乏症、ファブリー病、急性骨髄性白血病を伴う家族性血小板異常症、ファンコニ貧血、ギテルマン症候群、成長ホルモン不応症、フリードライヒ運動失調症、血友病Ａ、遺伝性巨赤芽球性貧血１、ヘル
マンスキー・パドラック症候群、ホモシスチン尿症、メープルシロップ尿症、マルファン症候群、メチオニンシンターゼ欠乏症、メチルマロン酸血症、ミトコンドリア三機能タンパク質欠乏症、ムコ多糖症ＩＩ型、マルチミニコア病、筋ジストロフィー、神経線維腫症Ｉ型、ニーマン・ピック病Ｃ型、眼白子症Ｉ型、オルニチンデルタアミノトランスフェラーゼ欠損症、全身性エリテマトーデスの素因、プロピオン酸血症、ラブドイド腫瘍、シュワルツ・ヤンペル症候群、スティックラー症候群、全身性エリテマトーデス、結節性硬化症、ウェルナー症候群、Ｘ連鎖高免疫グロブリンＭ血症またはＸ連鎖低リン酸血症である、請求項１５０または１５１に記載の使用。

【請求項153】

深部イントロン突然変異は、表１に示される深部イントロン突然変異である、請求項１５０～１５２のいずれか１項に記載の使用。

【請求項154】

深部イントロン突然変異と関連する疾患または障害は、眼の疾患である、請求項１５０～１５３のいずれか１項に記載の使用。

【請求項155】

眼の疾患は、レーバー先天黒内障、視神経萎縮症、網膜色素変性症、網膜芽細胞腫、シュタルガルト病、アッシャー症候群またはＸ連鎖網膜色素変性症である、請求項１５４の使用。

【請求項156】

深部イントロン突然変異は、表２に示される深部イントロン突然変異である、請求項１５４または１５５に記載の使用。

【請求項157】

個体は、哺乳動物である、請求項１５０～１５６のいずれか１項に記載の使用。

【請求項158】

哺乳動物は、ヒトである、請求項１５７に記載の使用。

【請求項159】

眼の疾患は、レーバー先天黒内障である、請求項１５４～１５８のいずれか１項に記載の使用。

【請求項160】

組成物は、個体の眼への投与のために製剤化される、請求項１５４～１５９のいずれか１項に記載の使用。

【請求項161】

投与は、網膜下または硝子体内投与のために製剤化される、請求項１６０に記載の使用。

【請求項162】

第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡガイド配列は、中心体タンパク質２９０ｋＤａ（ＣＥＰ２９０）遺伝子の深部イントロン突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする、請求項１５４～１６１のいずれか１項に記載の使用。

【請求項163】

深部イントロン突然変異は、ｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ突然変異である、請求項１５４～１６２のいずれか１項に記載の使用。

【請求項164】

第１のガイドＲＮＡは、配列番号４１、配列番号４５、配列番号４６または配列番号４７の配列を含むＤＮＡによってコードされる、請求項１５４～１６３のいずれか１項に記載の使用。

【請求項165】

第１のガイドＲＮＡは、配列番号１９、配列番号５０、配列番号５１または配列番号５２の配列を含むＤＮＡによってコードされる、請求項１５４～１６４のいずれか１項に記載の使用。

【請求項166】

第２のガイドＲＮＡは、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４８または配列番号４９の配列を含むＤＮＡによってコードされる、請求項１５４～１６５のいずれか１項に記載の使用。

【請求項167】

第２のガイドＲＮＡは、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号５３または配列番号５４の配列を含むＤＮＡによってコードされる、請求項１５４～１６６のいずれか１項に記載の使用。

【請求項168】

ＣＥＰ２９０は、ヒトＣＥＰ２９０である、請求項１６２～１６７のいずれか１項に記載の使用。

【請求項169】

ＣＥＰ２９０は、配列番号２３に示される配列の深部イントロン突然変異を含む、請求項１６２～１６８のいずれか１項に記載の使用。

【請求項170】

深部イントロン突然変異は、核酸の５’スプライス供与部位の約１～１０，０００ヌクレオチド、約１～１０００ヌクレオチドまたは約１００～１０００ヌクレオチド下流に位置する、請求項１５０～１６９のいずれか１項に記載の使用。

【請求項171】

深部イントロン突然変異は、核酸の３’スプライス受容部位の約１～１０，０００ヌクレオチド、約１～１０００ヌクレオチドまたは約１００～１０００ヌクレオチド上流に位置する、請求項１５０～１７０のいずれか１項に記載の使用。

【請求項172】

深部イントロン突然変異は、スプライス供与部位またはスプライス受容部位を導入する、請求項１５０～１７１のいずれか１項に記載の使用。

【請求項173】

請求項１～７２のいずれか１項に記載の組成物を含むキット。

【請求項174】

請求項７３～１４９のいずれか１項に記載の方法において使用するためのキットであって、請求項１～７３のいずれか１項に記載の組成物を含む前記キット。

【請求項175】

使用のための説明書をさらに含む、請求項１７３または１７４に記載のキット。

【請求項176】

ウイルスベクターを含むウイルス粒子であって、該ウイルスベクターは、
ａ）個体の核酸における深部イントロン突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡと、
ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列と
を含む、遺伝子操作された、天然に存在しないＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ
Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）システムをコードする核酸を含み、該深部イントロン突然変異の両端に位置する部位で標的ＤＮＡ分子を切断し、それによって、該深部イントロン突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出す、前記ウイルス粒子。

【請求項177】

個体の核酸における深部イントロン突然変異は、無フィブリノーゲン血症、アルポート症候群、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、常染色体劣性多発性嚢胞腎、バース症候群、βサラセミア、先天性無フィブリノーゲン血症、先天性白内障・顔貌異常・ニューロパチー症候群、先天性グリコシル化異常症Ｉａ型、先天性グリコシル化異常症ＩＩ型、嚢胞性線維症、ジヒドロプテリジンレダクターゼ欠乏症、ファブリー病、急性骨髄性白血病を伴う家族性血小板異常症、ファンコニ貧血、ギテルマン症候群、成長ホルモン不応症、フリードライヒ運動失調症、血友病Ａ、遺伝性巨赤芽球性貧血１、ヘルマンス
キー・パドラック症候群、ホモシスチン尿症、メープルシロップ尿症、マルファン症候群、メチオニンシンターゼ欠乏症、メチルマロン酸血症、ミトコンドリア三機能タンパク質欠乏症、ムコ多糖症ＩＩ型、マルチミニコア病、筋ジストロフィー、神経線維腫症Ｉ型、ニーマン・ピック病Ｃ型、眼白子症Ｉ型、オルニチンデルタアミノトランスフェラーゼ欠損症、全身性エリテマトーデスの素因、プロピオン酸血症、ラブドイド腫瘍、シュワルツ・ヤンペル症候群、スティックラー症候群、全身性エリテマトーデス、結節性硬化症、ウェルナー症候群、Ｘ連鎖高免疫グロブリンＭ血症またはＸ連鎖低リン酸血症と関連する、請求項１７６に記載のウイルス粒子。

【請求項178】

個体の核酸における深部イントロン突然変異は、表１に示される深部イントロン突然変異である、請求項１７６または１７７に記載のウイルス粒子。

【請求項179】

無フィブリノーゲン血症、アルポート症候群、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、常染色体劣性多発性嚢胞腎、バース症候群、βサラセミア、先天性無フィブリノーゲン血症、先天性白内障・顔貌異常・ニューロパチー症候群、先天性グリコシル化異常症Ｉａ型、先天性グリコシル化異常症ＩＩ型、嚢胞性線維症、ジヒドロプテリジンレダクターゼ欠乏症、ファブリー病、急性骨髄性白血病を伴う家族性血小板異常症、ファンコニ貧血、ギテルマン症候群、成長ホルモン不応症、フリードライヒ運動失調症、血友病Ａ、遺伝性巨赤芽球性貧血１、ヘルマンスキー・パドラック症候群、ホモシスチン尿症、メープルシロップ尿症、マルファン症候群、メチオニンシンターゼ欠乏症、メチルマロン酸血症、ミトコンドリア三機能タンパク質欠乏症、ムコ多糖症ＩＩ型、マルチミニコア病、筋ジストロフィー、神経線維腫症Ｉ型、ニーマン・ピック病Ｃ型、眼白子症Ｉ型、オルニチンデルタアミノトランスフェラーゼ欠損症、全身性エリテマトーデスの素因、プロピオン酸血症、ラブドイド腫瘍、シュワルツ・ヤンペル症候群、スティックラー症候群、全身性エリテマトーデス、結節性硬化症、ウェルナー症候群、Ｘ連鎖高免疫グロブリンＭ血症またはＸ連鎖低リン酸血症を有する個体を治療するために使用される、請求項１７６～１７８のいずれか１項に記載のウイルス粒子。

【請求項180】

ウイルスベクターを含むウイルス粒子であって、該ウイルスベクターは、
ａ）眼の疾患または障害と関連する個体の核酸における深部イントロン突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡと、
ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列と
を含む、遺伝子操作された、天然に存在しないＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ
Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）システムをコードする核酸を含み、該深部イントロン突然変異の両端に位置する部位で標的ＤＮＡ分子を切断し、それによって、該深部イントロン突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出す、前記ウイルス粒子。

【請求項181】

眼の疾患または障害は、レーバー先天黒内障、視神経萎縮症、網膜色素変性症、網膜芽細胞腫、シュタルガルト病、アッシャー症候群またはＸ連鎖網膜色素変性症である、請求項１８０に記載のウイルス粒子。

【請求項182】

深部イントロン突然変異は、表２に示される深部イントロン突然変異である、請求項１８０または１８１に記載のウイルス粒子。

【請求項183】

レーバー先天黒内障、視神経萎縮症、網膜色素変性症、網膜芽細胞腫、シュタルガルト病、アッシャー症候群またはＸ連鎖網膜色素変性症を治療するために使用される、請求項１８０～１８２のいずれか１項に記載のウイルス粒子。

【請求項184】

眼の疾患は、レーバー先天黒内障である、請求項１８０～１８３のいずれか１項に記載のウイルス粒子。

【請求項185】

第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡガイド配列は、中心体タンパク質２９０ｋＤａ（ＣＥＰ２９０）核酸の深部イントロン突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする、請求項１８０～１８４のいずれか１項に記載のウイルス粒子。

【請求項186】

深部イントロン突然変異は、ｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ突然変異である、請求項１８０～１８５のいずれか１項に記載のウイルス粒子。

【請求項187】

第１のガイドＲＮＡは、配列番号４１、配列番号４５、配列番号４６または配列番号４７の配列を含むＤＮＡによってコードされる、請求項１８０～１８６のいずれか１項に記載のウイルス粒子。

【請求項188】

第１のガイドＲＮＡは、配列番号１９、配列番号５０、配列番号５１または配列番号５２の配列を含むＤＮＡによってコードされる、請求項１８０～１８７のいずれか１項に記載のウイルス粒子。

【請求項189】

第２のガイドＲＮＡは、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４８または配列番号４９の配列を含むＤＮＡによってコードされる、請求項１８０～１８８のいずれか１項に記載のウイルス粒子。

【請求項190】

第２のガイドＲＮＡは、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号５３または配列番号５４の配列を含むＤＮＡによってコードされる、請求項１８０～１８９のいずれか１項に記載のウイルス粒子。

【請求項191】

ＣＥＰ２９０は、ヒトＣＥＰ２９０である、請求項１８５～１９０のいずれか１項に記載のウイルス粒子。

【請求項192】

ＣＥＰ２９０は、配列番号２３に示される配列の深部イントロン突然変異を含む、請求項１８５～１９１のいずれか１項に記載のウイルス粒子。

【請求項193】

深部イントロン突然変異は、核酸の５’スプライス供与部位の約１～１０，０００ヌクレオチド、約１～１０００ヌクレオチドまたは約１００～１０００ヌクレオチド下流に位置する、請求項１７６～１９２のいずれか１項に記載のウイルス粒子。

【請求項194】

深部イントロン突然変異は、核酸の３’スプライス受容部位の約１～１０，０００ヌクレオチド、約１～１０００ヌクレオチドまたは約１００～１０００ヌクレオチド上流に位置する、請求項１７６～１９３のいずれか１項に記載のウイルス粒子。

【請求項195】

深部イントロン突然変異は、核酸中にスプライス供与部位またはスプライス受容部位を導入する、請求項１７６～１９４のいずれか１項に記載のウイルス粒子。

【請求項196】

Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である、請求項１７６～１９５のいずれか１項に記載のウイルス粒子。

【請求項197】

Ｃａｓ９タンパク質は、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅ
ｕｓ）Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９タンパク質、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９タンパク質またはトレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）Ｃａｓ９タンパク質である、請求項１９６に記載のウイルス粒子。

【請求項198】

Ｃａｓ９は、真核細胞における発現のためにコドン最適化される、請求項１９６または１９７に記載のウイルス粒子。

【請求項199】

真核細胞は、哺乳動物細胞である、請求項１９８に記載のウイルス粒子。

【請求項200】

真核細胞は、ヒト細胞である、請求項１９８または１９９に記載のウイルス粒子。

【請求項201】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、１つまたはそれ以上の核局在性シグナル（ＮＬＳ）をさらに含む、請求項１７６～２００のいずれか１項に記載のウイルス粒子。

【請求項202】

Ｃａｓタンパク質は、１つまたはそれ以上のＮＬＳを含む、請求項２０１に記載のウイルス粒子。

【請求項203】

ＮＬＳは、ＳＶ４０ラージＴ抗原中のＣ末端配列である、請求項２０１または２０２に記載のウイルス粒子。

【請求項204】

ＮＬＳは、配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２６）またはＰＫＫＫＲＫＶＥＤＰＫＫＫＲＫＶＤ（配列番号２７）を含む、請求項２０１～２０３のいずれか１項に記載のウイルス粒子。

【請求項205】

第１のガイドＲＮＡおよび／または第２のガイドＲＮＡは、トランス活性化ｃｒ（ｔｒａｃｒ）配列と融合されている、請求項１７６～２０４のいずれか１項に記載のウイルス粒子。

【請求項206】

ｔｒａｃｒ配列は、配列番号２５によってコードされるヌクレオチド配列を含む、請求項２０５に記載のウイルス粒子。

【請求項207】

第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質は、真核細胞において発現される、請求項１７６～２０６のいずれか１項に記載のウイルス粒子。

【請求項208】

第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡおよび／またはＣａｓタンパク質をコードする核酸は、１つまたはそれ以上の調節制御エレメントと作動可能に連結されている、請求項１７６～２０７のいずれか１項に記載のウイルス粒子。

【請求項209】

第１のガイドＲＮＡおよび／または第２のガイドＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターと作動可能に連結されている、請求項２０８に記載のウイルス粒子。

【請求項210】

ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、Ｕ６、７ＳＫまたはＨ１プロモーターである、請求項２０９に記載のウイルス粒子。

【請求項211】

Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターと作動可能に連結されている、請求項２０８～２１０のいずれか１項に記載のウイルス粒子。

【請求項212】

ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロ
モーター、ＣＭＶプロモーター（ｍｉｎＣＭＶプロモーター）由来の最小プロモーター断片、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ＣＫ６プロモーター、トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ－アクチン／ウサギβ－グロビンプロモーター（ＣＡＧ）プロモーター、桿体オプシンプロモーター、錐体オプシンプロモーター、βホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）プロモーター、網膜色素変性症（ＲＰ１）プロモーターまたは光受容体間レチノイド結合タンパク質遺伝子（ＩＲＢＰ）プロモーターである、請求項２１１に記載のウイルス粒子。

【請求項213】

ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター、組換えアデノウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクターまたは組換え単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターである、請求項１７６～２１２のいずれか１項に記載のウイルス粒子。

【請求項214】

ベクターは、組換えアデノウイルスベクターである、請求項２１３に記載のウイルス粒子。

【請求項215】

組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型２、１、５、６、１９、３、１１、７、１４、１６、２１、１２、１８、３１、８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２４～３０、３７、４０、４１、ＡｄＨｕ２、ＡｄＨｕ３、ＡｄＨｕ４、ＡｄＨｕ２４、ＡｄＨｕ２６、ＡｄＨｕ３４、ＡｄＨｕ３５、ＡｄＨｕ３６、ＡｄＨｕ３７、ＡｄＨｕ４１、ＡｄＨｕ４８、ＡｄＨｕ４９、ＡｄＨｕ５０、ＡｄＣ６、ＡｄＣ７、ＡｄＣ６９、ウシＡｄ３型、イヌＡｄ２型、ヒツジＡｄまたはブタＡｄ３型に由来する、請求項２１４に記載のウイルス粒子。

【請求項216】

組換えアデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型２、１、５、６、１９、３、１１、７、１４、１６、２１、１２、１８、３１、８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２４～３０、３７、４０、４１、ＡｄＨｕ２、ＡｄＨｕ３、ＡｄＨｕ４、ＡｄＨｕ２４、ＡｄＨｕ２６、ＡｄＨｕ３４、ＡｄＨｕ３５、ＡｄＨｕ３６、ＡｄＨｕ３７、ＡｄＨｕ４１、ＡｄＨｕ４８、ＡｄＨｕ４９、ＡｄＨｕ５０、ＡｄＣ６、ＡｄＣ７、ＡｄＣ６９、ウシＡｄ３型、イヌＡｄ２型、ヒツジＡｄまたはブタＡｄ３型に由来するキャプシドを含む、請求項２１４または２１５に記載のウイルス粒子。

【請求項217】

組換えアデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型２キャプシドまたはアデノウイルス血清型５キャプシドの変異体を含む、請求項２１６に記載のウイルス粒子。

【請求項218】

ベクターは、組換えレンチウイルスベクターである、請求項２１３に記載のウイルス粒子。

【請求項219】

組換えレンチウイルスベクターは、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モカラウイルス（Ｍｏｋａｌａ ｖｉｒｕｓ）、狂犬病ウイルス、ＲＤ１１４またはその変異体で偽型化されたレンチウイルスに由来する、請求項２１８に記載のウイルス粒子。

【請求項220】

組換えレンチウイルス粒子は、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、エボラウイルス、マールブル
グウイルス、モカラウイルス（Ｍｏｋａｌａ ｖｉｒｕｓ）、狂犬病ウイルス、ＲＤ１１４またはその変異体で偽型化されたキャプシドを含む、請求項２１８または２１９に記載のウイルス粒子。

【請求項221】

ベクターは、ｒＨＳＶベクターである、請求項２１３に記載のウイルス粒子。

【請求項222】

ｒＨＳＶベクターは、ｒＨＳＶ－１またはｒＨＳＶ－２に由来する、請求項２２１に記載のウイルス粒子。

【請求項223】

組換えＨＳＶ粒子は、ｒＨＳＶ－１粒子またはｒＨＳＶ－２ウイルス粒子である、請求項２２１または２２２に記載のウイルス粒子。

【請求項224】

ベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターである、請求項２１３に記載のウイルス粒子。

【請求項225】

第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡまたはＣａｓタンパク質のうちの１つまたはそれ以上をコードする核酸は、１つまたはそれ以上のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列がその両端に位置する、請求項２２４に記載のウイルス粒子。

【請求項226】

第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡまたはＣａｓタンパク質のうちの１つまたはそれ以上をコードする核酸は、２つのＡＡＶ ＩＴＲがその両端に位置する、請求項２２５に記載のウイルス粒子。

【請求項227】

ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶまたはマウスＡＡＶキャプシド血清型ＩＴＲである、請求項２２５または２２６に記載のウイルス粒子。

【請求項228】

ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲである、請求項２２４～２２７のいずれか１項に記載のウイルス粒子。

【請求項229】

ベクターは、自己相補的ベクターである、請求項２２４～２２８のいずれか１項に記載のウイルス粒子。

【請求項230】

組換えＡＡＶウイルス粒子は、クレードＡ～Ｆに由来するＡＡＶ血清型キャプシドを含む、請求項２２４～２２９のいずれか１項に記載のウイルス粒子。

【請求項231】

ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２－７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶまたはマウスＡＡＶキャプシドｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含む、請求項２２４～２３０のいずれか１項に記載のウイルス粒子。

【請求項232】

ｒＡＡＶウイルス粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、同一ＡＡＶ血清型に由来する、請求項２２５～２３１のいずれか１項に記載のウイルス粒子。

【請求項233】

ｒＡＡＶウイルス粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、異なるＡＡＶ血清型に由来する、
請求項２２５～２３１のいずれか１項に記載のウイルス粒子。

【請求項234】

組換えＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９および／またはＡＡＶｒｈ１０キャプシドを含む、請求項２２４～２３３のいずれか１項に記載のウイルス粒子。

【請求項235】

ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９および／またはＡＡＶｒｈ１０キャプシドは、チロシン突然変異またはヘパラン結合突然変異を含む、請求項２３４に記載のウイルス粒子。

【請求項236】

ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む、請求項２２４～２３５のいずれか１項に記載のウイルス粒子。

【請求項237】

医薬製剤中にある、請求項１７６～２３６のいずれか１項に記載のウイルス粒子。

【請求項238】

核酸における深部イントロン突然変異と関連する眼の疾患のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを作製するための方法であって、
ａ）真核細胞に、
ｉ）核酸中のイントロンの標的ＤＮＡ配列への単一ガイドＲＮＡ、
ｉｉ）Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
ｉｉｉ）所望のイントロン突然変異およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の両端に位置する相同性アームを含む相同性組換え修復（ＨＤＲ）鋳型を含む一本鎖オリゴヌクレオチド
を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸を導入することと、
ｂ）核酸中に組み込まれた突然変異を含む細胞を単離することと
を含む前記方法。

【請求項239】

深部イントロン突然変異は、核酸の５’スプライス供与部位の約１～１０，０００ヌクレオチド、約１～１０００ヌクレオチドまたは約１００～１０００ヌクレオチド下流に位置する、請求項２３８に記載の方法。

【請求項240】

深部イントロン突然変異は、核酸の３’スプライス受容部位の約１～１０，０００ヌクレオチド、約１～１０００ヌクレオチドまたは約１００～１０００ヌクレオチド上流に位置する、請求項２３８または２３９に記載の方法。

【請求項241】

深部イントロン突然変異は、核酸中にスプライス供与部位またはスプライス受容部位を導入する、請求項２３８～２４０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項242】

ＰＡＭは、細胞において発現されたＣａｓタンパク質による一本鎖オリゴヌクレオチドの切断を避けるために突然変異を含む、請求項２３８～２４１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項243】

Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である、請求項２３８～２４２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項244】

Ｃａｓ９タンパク質は、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９タンパク質、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９タンパク質またはトレポネーマ・デンティコ
ラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）Ｃａｓ９タンパク質である、請求項２４３に記載の方法。

【請求項245】

Ｃａｓ９は、真核細胞における発現のためにコドン最適化される、請求項２４３または２４４に記載の方法。

【請求項246】

真核細胞は、哺乳動物細胞である、請求項２３８～２４５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項247】

真核細胞は、ヒト細胞である、請求項２４６に記載の方法。

【請求項248】

真核細胞は、眼の細胞である、請求項２３８～２４７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項249】

眼の細胞は、網膜細胞である、請求項２４８に記載の方法。

【請求項250】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、１つまたはそれ以上の核局在性シグナル（ＮＬＳ）をさらに含む、請求項２３８～２４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項251】

Ｃａｓタンパク質は、１つまたはそれ以上のＮＬＳを含む、請求項２５０に記載の方法。

【請求項252】

ＮＬＳは、ＳＶ４０ラージＴ抗原中のＣ末端配列である、請求項２５０または２５１に記載の方法。

【請求項253】

ＮＬＳは、配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２６）またはＰＫＫＫＲＫＶＥＤＰＫＫＫＲＫＶＤ（配列番号２７）を含む、請求項２５０～２５２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項254】

単一ガイドＲＮＡは、トランス活性化ｃｒ（ｔｒａｃｒ）配列と融合されている、請求項２３８～２５３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項255】

ｔｒａｃｒ配列は、配列番号２５によってコードされるヌクレオチド配列を含む、請求項２５４に記載の方法。

【請求項256】

単一ガイドＲＮＡおよび／またはＣａｓタンパク質をコードする核酸および一本鎖オリゴヌクレオチドは、１つまたはそれ以上の調節制御エレメントと作動可能に連結されている、請求項２３８～２５５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項257】

単一ガイドＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターと作動可能に連結されている、請求項２５６に記載の方法。

【請求項258】

ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、Ｕ６、７ＳＫまたはＨ１プロモーターである、請求項２５７に記載の方法。

【請求項259】

Ｃａｓタンパク質をコードする核酸および／または一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターと作動可能に連結されている、請求項２５６～２５８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項260】

ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ＣＭＶプロモーター（ｍｉｎＣＭＶプロモーター）由来の最小プロモーター断片、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）
プロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ＣＫ６プロモーター、トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ－アクチン／ウサギβ－グロビンプロモーター（ＣＡＧ）プロモーター、桿体オプシンプロモーター、錐体オプシンプロモーター、βホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）プロモーター、網膜色素変性症（ＲＰ１）プロモーターまたは光受容体間レチノイド結合タンパク質遺伝子（ＩＲＢＰ）プロモーターである、請求項２５９に記載の方法。

【請求項261】

単一ガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質または一本鎖オリゴヌクレオチドのうちの１つまたはそれ以上をコードする核酸は、システムの同一または異なるベクター上に位置する、請求項２３８～２６０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項262】

眼の疾患は、レーバー先天黒内障、視神経萎縮症、網膜色素変性症、網膜芽細胞腫、シュタルガルト病、アッシャー症候群またはＸ連鎖網膜色素変性症である、請求項２３８～２６１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項263】

深部イントロン突然変異は、表２に示される深部イントロン突然変異である、請求項２６２に記載の方法。

【請求項264】

眼の疾患は、レーバー先天黒内障である、請求項２６２または２６３に記載の方法。

【請求項265】

単一ガイドＲＮＡは、中心体タンパク質２９０ｋＤａ（ＣＥＰ２９０）遺伝子のイントロン配列をターゲッティングする、請求項２６２～２６４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項266】

導入された深部イントロン突然変異は、ｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ突然変異である、請求項２６２～２６５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項267】

単一ガイドＲＮＡは、配列番号１および配列番号２の配列を含むＤＮＡによってコードされる、請求項２６２～２６６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項268】

一本鎖オリゴヌクレオチドは、配列番号３の配列を含む、請求項２６２～２６７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項269】

ＣＥＰ２９０は、ヒトＣＥＰ２９０である、請求項２６２～２６８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項270】

ＣＥＰ２９０は、配列番号２３に示される深部配列（ｄｅｅｐ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む、請求項２６９に記載の方法。

【請求項271】

細胞において標的核酸を切断するための方法であって、該方法は、
細胞に、
ａ）突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡを含む、遺伝子操作された、天然に存在しないＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）システムをコードする核酸と、
ｂ）ｉ）Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および
ｉｉ）第１のガイドＲＮＡまたは第２のガイドＲＮＡがハイブリダイズする第１のガ
イドＲＮＡ標的部位
を含むＣａｓ発現カセットと
を含む組成物の有効量を送達することを含み、
該Ｃａｓタンパク質は、該Ｃａｓ発現カセットから発現され、
該Ｃａｓタンパク質は、突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列を切断し、それによって、突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出し、
該Ｃａｓタンパク質は、該第１のガイドＲＮＡ標的部位で該Ｃａｓ発現カセットを切断し、それによって、該Ｃａｓ発現カセットの切断前の該Ｃａｓタンパク質の発現と比較して、該Ｃａｓタンパク質の発現を低減する、前記方法。

【請求項272】

個体の核酸における突然変異と関連する疾患または障害を治療するための方法であって、該方法は、
ａ）突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡを含む、遺伝子操作された、天然に存在しないＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）システムをコードする核酸と、
ｂ）ｉ）Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および
ｉｉ）第１のガイドＲＮＡまたは第２のガイドＲＮＡがハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡ標的部位
を含むＣａｓ発現カセットと
を含む組成物の治療有効量を個体に投与することを含み、
該Ｃａｓタンパク質は、該Ｃａｓ発現カセットから発現され、
該Ｃａｓタンパク質は、突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列を切断し、それによって、突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出し、
該Ｃａｓタンパク質は、該第１のガイドＲＮＡ標的部位で該Ｃａｓ発現カセットを切断し、それによって、該Ｃａｓ発現カセットの切断前の該Ｃａｓタンパク質の発現と比較して、該Ｃａｓタンパク質の発現を低減する、前記方法。

【請求項273】

個体の核酸における突然変異と関連する眼の疾患または障害を治療するための方法であって、該方法は、
ａ）突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡを含む、遺伝子操作された、天然に存在しないＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）システムをコードする核酸と、
ｂ）ｉ）Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および
ｉｉ）第１のガイドＲＮＡまたは第２のガイドＲＮＡがハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡ標的部位
を含むＣａｓ発現カセットと
を含む組成物の治療有効量を個体に投与することを含み、
該Ｃａｓタンパク質は、該Ｃａｓ発現カセットから発現され、
該Ｃａｓタンパク質は、突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列を切断し、それによって、突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出し、
該Ｃａｓタンパク質は、該Ｃａｓ発現カセットを、該第１のガイドＲＮＡ標的部位で切断し、それによって、該Ｃａｓ発現カセットの切断前の該Ｃａｓタンパク質の発現と比較して、該Ｃａｓタンパク質の発現を低減する、前記方法。

【請求項274】

Ｃａｓ発現カセットは、
ｉｉｉ）第１のガイドＲＮＡまたは第２のガイドＲＮＡがハイブリダイズする第２のガ
イドＲＮＡ標的部位
をさらに含み、
Ｃａｓタンパク質は、該Ｃａｓ発現カセットを、第１および第２のガイドＲＮＡ標的部位で切断し、それによって、該Ｃａｓ発現カセットの切断前の該Ｃａｓタンパク質の発現と比較して、該Ｃａｓタンパク質の発現を低減する、請求項２７１～２７３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項275】

第１のガイドＲＮＡは、第１のガイドＲＮＡ標的部位および第２のガイドＲＮＡ標的部位とハイブリダイズする、請求項２７４に記載の方法。

【請求項276】

第２のガイドＲＮＡは、第１のガイドＲＮＡ標的部位および第２のガイドＲＮＡ標的部位とハイブリダイズする、請求項２７４に記載の方法。

【請求項277】

第１のガイドＲＮＡは、第１のガイドＲＮＡ標的部位とハイブリダイズし、第２のガイドＲＮＡは、第２のガイドＲＮＡ標的部位とハイブリダイズする、請求項２７４に記載の方法。

【請求項278】

Ｃａｓ発現カセットは、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結されているポリアデニル化（ポリＡ）配列をさらに含む、請求項２７１～２７７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項279】

ポリＡ配列は、ＳＶ４０ポリＡ配列である、請求項２７８に記載の方法。

【請求項280】

Ｃａｓタンパク質による第１または第２のガイドＲＮＡ標的部位の切断は、該Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびポリＡ配列間の作動可能な連結を妨げる、請求項２７８または２７９に記載の方法。

【請求項281】

第１または第２のガイドＲＮＡ標的部位は、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびポリＡ配列の間にある、請求項２７８～２８０に記載の方法。

【請求項282】

Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、Ｃａｓ発現カセットから発現される該Ｃａｓタンパク質が、１つまたはそれ以上のＮＬＳとインフレームで融合されるように、１つまたはそれ以上の核局在性シグナル（ＮＬＳ）をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結されている、請求項２７１～２８１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項283】

１つまたはそれ以上のＮＬＳをコードするヌクレオチド配列は、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびポリアデニル化（ポリＡ）配列の間にある、請求項２８２に記載の方法。

【請求項284】

第１または第２のガイドＲＮＡ標的部位は、１つまたはそれ以上のＮＬＳをコードするヌクレオチド配列およびポリＡ配列の間にある、請求項２８３に記載の方法。

【請求項285】

１つまたはそれ以上のＮＬＳは、ＳＶ４０ラージＴ抗原中のＣ末端配列を含む、請求項２８２～２８４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項286】

１つまたはそれ以上のＮＬＳは、配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２６）またはＰＫＫＫＲＫＶＥＤＰＫＫＫＲＫＶＤ（配列番号２７）を含む、請求項２８２～２８５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項287】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸および／またはＣａｓ発現カセットは
、１つまたはそれ以上の調節制御エレメントと作動可能に連結されている、請求項２７１～２８６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項288】

Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、プロモーターと作動可能に連結されている、請求項２８７に記載の方法。

【請求項289】

Ｃａｓタンパク質による第１または第２のガイドＲＮＡ標的部位の切断は、調節制御エレメントおよび該Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列の間の作動可能な連結を妨げる、請求項２８７または２８８に記載の方法。

【請求項290】

第１または第２のガイドＲＮＡ標的部位は、プロモーターおよびＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列の間にある、請求項２８８または２８９に記載の方法。

【請求項291】

Ｃａｓ発現カセットは、
ｉｉｉ）第１のガイドＲＮＡまたは第２のガイドＲＮＡがハイブリダイズする第２のガイドＲＮＡ標的部位であって、Ｃａｓタンパク質に特異的なプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と隣接する、前記第２のガイドＲＮＡ標的部位
をさらに含み、
Ｃａｓタンパク質による第１のガイドＲＮＡ標的部位の切断は、調節制御エレメントおよび該Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列の間の作動可能な連結を妨げ、
Ｃａｓタンパク質による第２のガイドＲＮＡ標的部位の切断は、該Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびポリＡ配列の間の作動可能な連結を妨げ、
該Ｃａｓタンパク質の発現および標的ＤＮＡ配列の切断の際に、該Ｃａｓタンパク質は、該Ｃａｓ発現カセットを、第１および第２のガイドＲＮＡ標的部位で切断し、それによって、該Ｃａｓ発現カセットの切断前の該Ｃａｓタンパク質の発現と比較して、該Ｃａｓタンパク質の発現を低減する、請求項２７１～２７３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項292】

Ｃａｓ発現カセットは、
ｉｉｉ）第１のガイドＲＮＡまたは第２のガイドＲＮＡがハイブリダイズする、第２のガイドＲＮＡ標的部位
をさらに含み、
第１のガイドＲＮＡ標的部位は、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列および該Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結されているプロモーターの間にあり、
第２のガイドＲＮＡ標的部位は、該Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列および該Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結されているポリＡ配列の間にあり、
該Ｃａｓタンパク質は、該Ｃａｓ発現カセットを、第１および第２のガイドＲＮＡ標的部位で切断し、それによって、該Ｃａｓ発現カセットの切断前の該Ｃａｓタンパク質の発現と比較して、該Ｃａｓタンパク質の発現を低減する、請求項２７１～２７３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項293】

第１のガイドＲＮＡおよび／または第２のガイドＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターと作動可能に連結されている、請求項２８８～２９２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項294】

ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、Ｕ６、７ＳＫまたはＨ１プロモーターである、請求項２９３に記載の方法。

【請求項295】

Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモー
ターと作動可能に連結されている、請求項２８８～２９４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項296】

ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ＣＭＶプロモーター（ｍｉｎＣＭＶプロモーター）由来の最小プロモーター断片、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ＣＫ６プロモーター、トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ－アクチン／ウサギβ－グロビンプロモーター（ＣＡＧ）プロモーター、桿体オプシンプロモーター、錐体オプシンプロモーター、βホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）プロモーター、網膜色素変性症（ＲＰ１）プロモーターまたは光受容体間レチノイド結合タンパク質遺伝子（ＩＲＢＰ）プロモーターである、請求項２９５に記載の方法。

【請求項297】

突然変異は、深部イントロン突然変異である、請求項２７２～２９６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項298】

個体の核酸における深部イントロン突然変異は、無フィブリノーゲン血症、アルポート症候群、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、常染色体劣性多発性嚢胞腎、バース症候群、βサラセミア、先天性無フィブリノーゲン血症、先天性白内障・顔貌異常・ニューロパチー症候群、先天性グリコシル化異常症Ｉａ型、先天性グリコシル化異常症ＩＩ型、嚢胞性線維症、ジヒドロプテリジンレダクターゼ欠乏症、ファブリー病、急性骨髄性白血病を伴う家族性血小板異常症、ファンコニ貧血、ギテルマン症候群、成長ホルモン不応症、フリードライヒ運動失調症、血友病Ａ、遺伝性巨赤芽球性貧血１、ヘルマンスキー・パドラック症候群、ホモシスチン尿症、メープルシロップ尿症、マルファン症候群、メチオニンシンターゼ欠乏症、メチルマロン酸血症、ミトコンドリア三機能タンパク質欠乏症、ムコ多糖症ＩＩ型、マルチミニコア病、筋ジストロフィー、神経線維腫症Ｉ型、ニーマン・ピック病Ｃ型、眼白子症Ｉ型、オルニチンデルタアミノトランスフェラーゼ欠損症、全身性エリテマトーデスの素因、プロピオン酸血症、ラブドイド腫瘍、シュワルツ・ヤンペル症候群、スティックラー症候群、全身性エリテマトーデス、結節性硬化症、ウェルナー症候群、Ｘ連鎖高免疫グロブリンＭ血症またはＸ連鎖低リン酸血症と関連している、請求項２９７に記載の方法。

【請求項299】

個体の核酸における深部イントロン突然変異は、表２に示される深部イントロン突然変異である、請求項２９７または２９８に記載の方法。

【請求項300】

無フィブリノーゲン血症、アルポート症候群、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、常染色体劣性多発性嚢胞腎、バース症候群、βサラセミア、先天性無フィブリノーゲン血症、先天性白内障・顔貌異常・ニューロパチー症候群、先天性グリコシル化異常症Ｉａ型、先天性グリコシル化異常症ＩＩ型、嚢胞性線維症、ジヒドロプテリジンレダクターゼ欠乏症、ファブリー病、急性骨髄性白血病を伴う家族性血小板異常症、ファンコニ貧血、ギテルマン症候群、成長ホルモン不応症、フリードライヒ運動失調症、血友病Ａ、遺伝性巨赤芽球性貧血１、ヘルマンスキー・パドラック症候群、ホモシスチン尿症、メープルシロップ尿症、マルファン症候群、メチオニンシンターゼ欠乏症、メチルマロン酸血症、ミトコンドリア三機能タンパク質欠乏症、ムコ多糖症ＩＩ型、マルチミニコア病、筋ジストロフィー、神経線維腫症Ｉ型、ニーマン・ピック病Ｃ型、眼白子症Ｉ型、オルニチンデルタアミノトランスフェラーゼ欠損症、全身性エリテマトーデスの素因、プロピオン酸血症、ラブドイド腫瘍、シュワルツ・ヤンペル症候群、スティックラー症候群、全身性エリテマトーデス、結節性硬化症、ウェルナー症候群、Ｘ連鎖高免疫グロブリンＭ血症
またはＸ連鎖低リン酸血症を有する個体を治療するために使用される、請求項２９７～２９９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項301】

疾患または障害は、レーバー先天黒内障、視神経萎縮症、網膜色素変性症、網膜芽細胞腫、シュタルガルト病、アッシャー症候群およびＸ連鎖網膜色素変性症からなる群から選択される眼の疾患または障害である、請求項２７２～２９７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項302】

眼の疾患は、レーバー先天黒内障である、請求項３０１に記載の方法。

【請求項303】

深部イントロン突然変異は、表２に示される深部イントロン突然変異である、請求項２９７に記載の方法。

【請求項304】

個体は、哺乳動物である、請求項２７２～３０３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項305】

哺乳動物は、ヒトである、請求項３０４に記載の方法。

【請求項306】

組成物は、個体の眼に投与される、請求項２７３～３０５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項307】

投与は、網膜下または硝子体内である、請求項３０６に記載の方法。

【請求項308】

第１および第２のガイドＲＮＡは、中心体タンパク質２９０ｋＤａ（ＣＥＰ２９０）遺伝子の深部イントロン突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする、請求項２７２～３０７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項309】

深部イントロン突然変異は、ｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ突然変異である、請求項３０８に記載の方法。

【請求項310】

第１のガイドＲＮＡは、配列番号４１、配列番号４５、配列番号４６または配列番号４７の配列を含むＤＮＡによってコードされる、請求項２７２～３０９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項311】

第１のガイドＲＮＡは、配列番号１９、配列番号５０、配列番号５１または配列番号５２の配列を含むＤＮＡによってコードされる、請求項２７２～３０９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項312】

該第２のガイドＲＮＡは、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４８または配列番号４９の配列を含むＤＮＡによってコードされる、請求項２７２～３１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項313】

第２のガイドＲＮＡは、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号５３または配列番号５４の配列を含むＤＮＡによってコードされる、請求項２７２～３１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項314】

ＣＥＰ２９０は、ヒトＣＥＰ２９０である、請求項３０８～３１３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項315】

ＣＥＰ２９０は、配列番号２３に示される配列の深部イントロン突然変異を含む、請求項３０８～３１４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項316】

深部イントロン突然変異は、核酸の５’スプライス供与部位の約１～１０，０００ヌクレオチド、約１～１０００ヌクレオチドまたは約１００～１０００ヌクレオチド下流に位置する、請求項２９７～３１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項317】

深部イントロン突然変異は、核酸の３’スプライス受容部位の約１～１０，０００ヌクレオチド、約１～１０００ヌクレオチドまたは約１００～１０００ヌクレオチド上流に位置する、請求項２９７～３１６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項318】

深部イントロン突然変異は、核酸中にスプライス供与部位またはスプライス受容部位を導入する、請求項２９７～３１７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項319】

Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である、請求項２７１～３１８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項320】

Ｃａｓ９タンパク質は、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９タンパク質、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９タンパク質またはトレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）Ｃａｓ９タンパク質である、請求項３１９に記載の方法。

【請求項321】

Ｃａｓ９は、真核細胞における発現のためにコドン最適化される、請求項３１９または３２０に記載の方法。

【請求項322】

真核細胞は、哺乳動物細胞である、請求項３２１に記載の方法。

【請求項323】

真核細胞は、ヒト細胞である、請求項３２１または３２２に記載の方法。

【請求項324】

第１のガイドＲＮＡおよび／または第２のガイドＲＮＡは、トランス活性化ｃｒ（ｔｒａｃｒ）配列と融合されている、請求項２７１～３２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項325】

ｔｒａｃｒ配列は、配列番号２５によってコードされるヌクレオチド配列を含む、請求項３２４に記載の方法。

【請求項326】

第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質は、真核細胞において発現される、請求項２７１～３２５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項327】

ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳシステムは、脂質、カチオン性脂質、リポソーム、ポリカチオンまたは核酸の細胞取り込みを増強する物質と複合体形成されている、請求項２７１～３２６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項328】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸およびＣａｓ発現カセットは、同一または異なるベクター上に位置する、請求項２７１～３２７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項329】

ベクターは、プラスミドである、請求項３２８に記載の方法。

【請求項330】

ベクターは、送達システムと複合体形成されている、請求項３２８または３２９に記載の方法。

【請求項331】

ベクターは、脂質、リポソーム、ポリカチオンまたは核酸の細胞取り込みを増強する物質と複合体形成されている、請求項３３０に記載の方法。

【請求項332】

ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター、組換えアデノウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクターまたは組換え単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターである、請求項３２８に記載の方法。

【請求項333】

ベクターは、組換えアデノウイルスベクターである、請求項３３２に記載の方法。

【請求項334】

組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型２、１、５、６、１９、３、１１、７、１４、１６、２１、１２、１８、３１、８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２４～３０、３７、４０、４１、ＡｄＨｕ２、ＡｄＨｕ３、ＡｄＨｕ４、ＡｄＨｕ２４、ＡｄＨｕ２６、ＡｄＨｕ３４、ＡｄＨｕ３５、ＡｄＨｕ３６、ＡｄＨｕ３７、ＡｄＨｕ４１、ＡｄＨｕ４８、ＡｄＨｕ４９、ＡｄＨｕ５０、ＡｄＣ６、ＡｄＣ７、ＡｄＣ６９、ウシＡｄ３型、イヌＡｄ２型、ヒツジＡｄまたはブタＡｄ３型に由来する、請求項３３３に記載の方法。

【請求項335】

組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型２またはアデノウイルス血清型５の変異体に由来する、請求項３３３または３３４に記載の方法。

【請求項336】

ベクターは、組換えレンチウイルスベクターである、請求項３３２に記載の方法。

【請求項337】

組換えレンチウイルスベクターは、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モカラウイルス（Ｍｏｋａｌａ ｖｉｒｕｓ）、狂犬病ウイルス、ＲＤ１１４またはその変異体で偽型化されたレンチウイルスに由来する、請求項３３６に記載の方法。

【請求項338】

ベクターは、ｒＨＳＶベクターである、請求項３３２に記載の方法。

【請求項339】

ｒＨＳＶベクターは、ｒＨＳＶ－１またはｒＨＳＶ－２に由来する、請求項３３８に記載の方法。

【請求項340】

ベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターである、請求項３３２に記載の方法。

【請求項341】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸およびＣａｓ発現カセットは、異なるｒＡＡＶベクター上にある、請求項３４０に記載の方法。

【請求項342】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸および／またはＣａｓ発現カセットは、１つまたはそれ以上のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列がその両端に位置する、請求項３４０または３４１に記載の方法。

【請求項343】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸および／またはＣａｓ発現カセットは、２つのＡＡＶ ＩＴＲがその両端に位置する、請求項３４２に記載の方法。

【請求項344】

ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶまたはマウスＡＡＶキャプシド血清型ＩＴＲである、請求項３４２または３４３
に記載の方法。

【請求項345】

ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲである、請求項３４２～３４４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項346】

ベクターは、自己相補的ベクターである、請求項３４０～３４５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項347】

ベクターは、ウイルス粒子中にキャプシド封入されている、請求項３３２に記載の方法。

【請求項348】

ウイルス粒子は、アデノウイルスベクターをキャプシド封入する組換えアデノウイルス粒子である、請求項３４７に記載の方法。

【請求項349】

組換えアデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型２、１、５、６、１９、３、１１、７、１４、１６、２１、１２、１８、３１、８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２４～３０、３７、４０、４１、ＡｄＨｕ２、ＡｄＨｕ３、ＡｄＨｕ４、ＡｄＨｕ２４、ＡｄＨｕ２６、ＡｄＨｕ３４、ＡｄＨｕ３５、ＡｄＨｕ３６、ＡｄＨｕ３７、ＡｄＨｕ４１、ＡｄＨｕ４８、ＡｄＨｕ４９、ＡｄＨｕ５０、ＡｄＣ６、ＡｄＣ７、ＡｄＣ６９、ウシＡｄ３型、イヌＡｄ２型、ヒツジＡｄまたはブタＡｄ３型に由来するキャプシドを含む、請求項３４８に記載の方法。

【請求項350】

組換えアデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型２キャプシドまたはアデノウイルス血清型５キャプシドの変異体を含む、請求項３４８または３４９に記載の方法。

【請求項351】

ウイルス粒子は、組換えレンチウイルスベクターをキャプシド封入する組換えレンチウイルス粒子である、請求項３４７に記載の方法。

【請求項352】

組換えレンチウイルス粒子は、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モカラウイルス（Ｍｏｋａｌａ ｖｉｒｕｓ）、狂犬病ウイルス、ＲＤ１１４またはその変異体で偽型化されたキャプシドを含む、請求項３５１に記載の方法。

【請求項353】

ウイルス粒子は、組換えＨＳＶベクターをキャプシド封入する組換えＨＳＶ粒子である、請求項３４７に記載の方法。

【請求項354】

組換えＨＳＶ粒子は、ｒＨＳＶ－１粒子またはｒＨＳＶ－２ウイルス粒子である、請求項３５３に記載の方法。

【請求項355】

ウイルス粒子は、組換えＡＡＶベクターを含む組換えＡＡＶウイルス粒子である、請求項３４７に記載の方法。

【請求項356】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸は、第１の組換えＡＡＶウイルス粒子の第１のｒＡＡＶベクター上にあり、Ｃａｓ発現カセットは、第２の組換えＡＡＶウイルス粒子の第２のｒＡＡＶベクター上にある、請求項３４７または３５５に記載の方法。

【請求項357】

組換えＡＡＶウイルス粒子は、クレードＡ～Ｆに由来するＡＡＶ血清型キャプシドを含む、請求項３５５または３５６に記載の方法。

【請求項358】

ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ
６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２－７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶまたはマウスＡＡＶキャプシドｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含む、請求項３５５～３５７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項359】

ｒＡＡＶウイルス粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、同一ＡＡＶ血清型に由来する、請求項３５５～３５８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項360】

ｒＡＡＶウイルス粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、異なるＡＡＶ血清型に由来する、請求項３５５～３５８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項361】

組換えＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９および／またはＡＡＶｒｈ１０キャプシドを含む、請求項３５５～３６０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項362】

ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９および／またはＡＡＶｒｈ１０キャプシドは、チロシン突然変異またはヘパラン結合突然変異を含む、請求項３６１に記載の方法。

【請求項363】

ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む、請求項３５５～３６２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項364】

組成物は、医薬組成物である、請求項２７２～３６３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項365】

細胞において標的核酸を切断するための組成物であって、該組成物は、
ａ）突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドを含む、遺伝子操作された、天然に存在しないＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）システムをコードする核酸と、
ｂ）ｉ）Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および
ｉｉ）第１のガイドＲＮＡまたは第２のガイドＲＮＡがハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡ標的部位
を含むＣａｓ発現カセットと
を含み、
該Ｃａｓタンパク質は、該Ｃａｓ発現カセットから発現され、
該Ｃａｓタンパク質は、突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列を切断し、それによって、突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出し、
該Ｃａｓタンパク質は、該第１のガイドＲＮＡ標的部位で該Ｃａｓ発現カセットを切断し、それによって、該Ｃａｓ発現カセットの切断前の該Ｃａｓタンパク質の発現と比較して、該Ｃａｓタンパク質の発現を低減する、前記組成物。

【請求項366】

個体の核酸における突然変異と関連する疾患または障害を治療するための組成物であって、該組成物は、
ａ）突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡを含む、遺伝子操作された、天然に存在しないＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩ
ＳＰＲ－Ｃａｓ）システムをコードする核酸と、
ｂ）ｉ）Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および
ｉｉ）第１のガイドＲＮＡまたは第２のガイドＲＮＡがハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡ標的部位
を含むＣａｓ発現カセットと
を含み、
該Ｃａｓタンパク質は、該Ｃａｓ発現カセットから発現され、
該Ｃａｓタンパク質は、突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列を切断し、それによって、突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出し、
該Ｃａｓタンパク質は、該第１のガイドＲＮＡ標的部位で該Ｃａｓ発現カセットを切断し、それによって、該Ｃａｓ発現カセットの切断前の該Ｃａｓタンパク質の発現と比較して、該Ｃａｓタンパク質の発現を低減する、前記組成物。

【請求項367】

個体の核酸における突然変異と関連する眼の疾患または障害を治療するための組成物であって、該組成物は、
ａ）突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡを含む、遺伝子操作された、天然に存在しないＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）システムをコードする核酸と、
ｂ）ｉ）Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および
ｉｉ）第１のガイドＲＮＡまたは第２のガイドＲＮＡがハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡ標的部位
を含むＣａｓ発現カセットと
を含み、
該Ｃａｓタンパク質は、該Ｃａｓ発現カセットから発現され、
該Ｃａｓタンパク質は、突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列を切断し、それによって、突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出し、
該Ｃａｓタンパク質は、該Ｃａｓ発現カセットを、該第１のガイドＲＮＡ標的部位で切断し、それによって、該Ｃａｓ発現カセットの切断前の該Ｃａｓタンパク質の発現と比較して、該Ｃａｓタンパク質の発現を低減する、前記組成物。

【請求項368】

Ｃａｓ発現カセットは、
ｉｉｉ）第１のガイドＲＮＡまたは第２のガイドＲＮＡがハイブリダイズする第２のガイドＲＮＡ標的部位
をさらに含み、
Ｃａｓタンパク質は、該Ｃａｓ発現カセットを、第１および第２のガイドＲＮＡ標的部位で切断し、それによって、該Ｃａｓ発現カセットの切断前の該Ｃａｓタンパク質の発現と比較して、該Ｃａｓタンパク質の発現を低減する、請求項３６５～３６７のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項369】

第１のガイドＲＮＡは、第１のガイドＲＮＡ標的部位および第２のガイドＲＮＡ標的部位とハイブリダイズする、請求項３６８に記載の組成物。

【請求項370】

第２のガイドＲＮＡは、第１のガイドＲＮＡ標的部位および第２のガイドＲＮＡ標的部位とハイブリダイズする、請求項３６８に記載の組成物。

【請求項371】

第１のガイドＲＮＡは、第１のガイドＲＮＡ標的部位とハイブリダイズし、第２のガイドＲＮＡは、第２のガイドＲＮＡ標的部位とハイブリダイズする、請求項３６８に記載の組成物。

【請求項372】

Ｃａｓ発現カセットは、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結されているポリアデニル化（ポリＡ）配列をさらに含む、請求項３６５～３７１のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項373】

ポリＡ配列は、ＳＶ４０ポリＡ配列である、請求項３７２に記載の組成物。

【請求項374】

Ｃａｓタンパク質による第１または第２のガイドＲＮＡ標的部位の切断は、該Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびポリＡ配列間の作動可能な連結を妨げる、請求項３７２または３７３に記載の組成物。

【請求項375】

第１または第２のガイドＲＮＡ標的部位は、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびポリＡ配列の間にある、請求項３７２～３７４のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項376】

Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、Ｃａｓ発現カセットから発現される該Ｃａｓタンパク質が、１つまたはそれ以上のＮＬＳとインフレームで融合されるように、１つまたはそれ以上の核局在性シグナル（ＮＬＳ）をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結されている、請求項３６５～３７５のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項377】

１つまたはそれ以上のＮＬＳをコードする該ヌクレオチド配列は、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびポリアデニル化（ポリＡ）配列の間にある、請求項３７６に記載の組成物。

【請求項378】

第１または第２のガイドＲＮＡ標的部位は、１つまたはそれ以上のＮＬＳをコードするヌクレオチド配列およびポリＡ配列の間にある、請求項３７７に記載の組成物。

【請求項379】

１つまたはそれ以上のＮＬＳは、ＳＶ４０ラージＴ抗原中のＣ末端配列を含む、請求項３７６～３７８のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項380】

１つまたはそれ以上のＮＬＳは、配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２６）またはＰＫＫＫＲＫＶＥＤＰＫＫＫＲＫＶＤ（配列番号２７）を含む、請求項３７６～３７９のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項381】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸および／またはＣａｓ発現カセットは、１つまたはそれ以上の調節制御エレメントと作動可能に連結されている、請求項３６５～３８０のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項382】

Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、プロモーターと作動可能に連結されている、請求項３８１に記載の組成物。

【請求項383】

Ｃａｓタンパク質による第１または第２のガイドＲＮＡ標的部位の切断は、調節制御エレメントおよび該Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列の間の作動可能な連結を妨げる、請求項３８１または３８２に記載の組成物。

【請求項384】

第１または第２のガイドＲＮＡ標的部位は、プロモーターおよびＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列の間にある、請求項３８２または３８３に記載の組成物。

【請求項385】

Ｃａｓ発現カセットは、
ｉｉｉ）第１のガイドＲＮＡまたは第２のガイドＲＮＡがハイブリダイズする第２のガ
イドＲＮＡ標的部位であって、Ｃａｓタンパク質に特異的なプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と隣接する、前記第２のガイドＲＮＡ標的部位をさらに含み、
Ｃａｓタンパク質による第１のガイドＲＮＡ標的部位の切断は、調節制御エレメントおよび該Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列の間の作動可能な連結を妨げ、
Ｃａｓタンパク質による第２のガイドＲＮＡ標的部位の切断は、該Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびポリＡ配列の間の作動可能な連結を妨げ、
該Ｃａｓタンパク質の発現および標的ＤＮＡ配列の切断の際に、該Ｃａｓタンパク質は、該Ｃａｓ発現カセットを、第１および第２のガイドＲＮＡ標的部位で切断し、それによって、該Ｃａｓ発現カセットの切断前の該Ｃａｓタンパク質の発現と比較して、該Ｃａｓタンパク質の発現を低減する、請求項３６５～３８４のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項386】

Ｃａｓ発現カセットは、
ｉｉｉ）第１のガイドＲＮＡまたは第２のガイドＲＮＡがハイブリダイズする第２のガイドＲＮＡ標的部位を
をさらに含み
第１のガイドＲＮＡ標的部位は、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列および該Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結されているプロモーターの間にあり、
該第２のガイドＲＮＡ標的部位は、該Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列および該Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結されているポリＡ配列の間にあり、
該Ｃａｓタンパク質は、該Ｃａｓ発現カセットを、第１および第２のガイドＲＮＡ標的部位で切断し、それによって、該Ｃａｓ発現カセットの切断前の該Ｃａｓタンパク質の発現と比較して、該Ｃａｓタンパク質の発現を低減する、請求項３６５～３６７のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項387】

第１のガイドＲＮＡおよび／または第２のガイドＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターと作動可能に連結されている、請求項３８２～３８６のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項388】

ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、Ｕ６、７ＳＫまたはＨ１プロモーターである、請求項３８７に記載の組成物。

【請求項389】

Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターと作動可能に連結されている、請求項３８２～３８８のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項390】

ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ＣＭＶプロモーター（ｍｉｎＣＭＶプロモーター）由来の最小プロモーター断片、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ＣＫ６プロモーター、トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ－アクチン／ウサギβ－グロビンプロモーター（ＣＡＧ）プロモーター、桿体オプシンプロモーター、錐体オプシンプロモーター、βホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）プロモーター、網膜色素変性症（ＲＰ１）プロモーターまたは光受容体間レチノイド結合タンパク質遺伝子（ＩＲＢＰ）プロモーターである、請求項３８９に記載の組成物。

【請求項391】

突然変異は、深部イントロン突然変異である、請求項３６６～３９０のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項392】

個体の核酸における深部イントロン突然変異は、無フィブリノーゲン血症、アルポート症候群、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、常染色体劣性多発性嚢胞腎、バース症候群、βサラセミア、先天性無フィブリノーゲン血症、先天性白内障・顔貌異常・ニューロパチー症候群、先天性グリコシル化異常症Ｉａ型、先天性グリコシル化異常症ＩＩ型、嚢胞性線維症、ジヒドロプテリジンレダクターゼ欠乏症、ファブリー病、急性骨髄性白血病を伴う家族性血小板異常症、ファンコニ貧血、ギテルマン症候群、成長ホルモン不応症、フリードライヒ運動失調症、血友病Ａ、遺伝性巨赤芽球性貧血１、ヘルマンスキー・パドラック症候群、ホモシスチン尿症、メープルシロップ尿症、マルファン症候群、メチオニンシンターゼ欠乏症、メチルマロン酸血症、ミトコンドリア三機能タンパク質欠乏症、ムコ多糖症ＩＩ型、マルチミニコア病、筋ジストロフィー、神経線維腫症Ｉ型、ニーマン・ピック病Ｃ型、眼白子症Ｉ型、オルニチンデルタアミノトランスフェラーゼ欠損症、全身性エリテマトーデスの素因、プロピオン酸血症、ラブドイド腫瘍、シュワルツ・ヤンペル症候群、スティックラー症候群、全身性エリテマトーデス、結節性硬化症、ウェルナー症候群、Ｘ連鎖高免疫グロブリンＭ血症またはＸ連鎖低リン酸血症と関連している、請求項３９１に記載の組成物。

【請求項393】

個体の核酸における深部イントロン突然変異は、表１に示される深部イントロン突然変異である、請求項３９１または３９２に記載の組成物。

【請求項394】

無フィブリノーゲン血症、アルポート症候群、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、常染色体劣性多発性嚢胞腎、バース症候群、βサラセミア、先天性無フィブリノーゲン血症、先天性白内障・顔貌異常・ニューロパチー症候群、先天性グリコシル化異常症Ｉａ型、先天性グリコシル化異常症ＩＩ型、嚢胞性線維症、ジヒドロプテリジンレダクターゼ欠乏症、ファブリー病、急性骨髄性白血病を伴う家族性血小板異常症、ファンコニ貧血、ギテルマン症候群、成長ホルモン不応症、フリードライヒ運動失調症、血友病Ａ、遺伝性巨赤芽球性貧血１、ヘルマンスキー・パドラック症候群、ホモシスチン尿症、メープルシロップ尿症、マルファン症候群、メチオニンシンターゼ欠乏症、メチルマロン酸血症、ミトコンドリア三機能タンパク質欠乏症、ムコ多糖症ＩＩ型、マルチミニコア病、筋ジストロフィー、神経線維腫症Ｉ型、ニーマン・ピック病Ｃ型、眼白子症Ｉ型、オルニチンデルタアミノトランスフェラーゼ欠損症、全身性エリテマトーデスの素因、プロピオン酸血症、ラブドイド腫瘍、シュワルツ・ヤンペル症候群、スティックラー症候群、全身性エリテマトーデス、結節性硬化症、ウェルナー症候群、Ｘ連鎖高免疫グロブリンＭ血症またはＸ連鎖低リン酸血症を有する個体を治療するために使用される、請求項３９１～３９３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項395】

疾患または障害は、レーバー先天黒内障、視神経萎縮症、網膜色素変性症、網膜芽細胞腫、シュタルガルト病、アッシャー症候群およびＸ連鎖網膜色素変性症からなる群から選択される眼の疾患または障害である、請求項３６６～３９１のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項396】

眼の疾患は、レーバー先天黒内障である、請求項３９５に記載の組成物。

【請求項397】

深部イントロン突然変異は、表２に示される深部イントロン突然変異である、請求項３９１に記載の組成物。

【請求項398】

個体は、哺乳動物である、請求項３６６～３９７のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項399】

哺乳動物は、ヒトである、請求項３９８に記載の組成物。

【請求項400】

個体の眼に投与される、請求項３６７～３９９のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項401】

投与は、網膜下または硝子体内である、請求項４００に記載の組成物。

【請求項402】

第１および第２のガイドＲＮＡは、中心体タンパク質２９０ｋＤａ（ＣＥＰ２９０）遺伝子の深部イントロン突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする、請求項３６７～４０１のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項403】

深部イントロン突然変異は、ｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ突然変異である、請求項４０２に記載の組成物。

【請求項404】

第１のガイドＲＮＡは、配列番号４１、配列番号４５、配列番号４６または配列番号４７の配列を含むＤＮＡによってコードされる、請求項３６７～４０３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項405】

第１のガイドＲＮＡは、配列番号１９、配列番号５０、配列番号５１または配列番号５２の配列を含むＤＮＡによってコードされる、請求項３６７～４０３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項406】

第２のガイドＲＮＡは、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４８または配列番号４９の配列を含むＤＮＡによってコードされる、請求項３６７～４０５のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項407】

第２のガイドＲＮＡは、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号５３または配列番号５４の配列を含むＤＮＡによってコードされる、請求項３６７～４０６のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項408】

ＣＥＰ２９０は、ヒトＣＥＰ２９０である、請求項４０２～４０７のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項409】

ＣＥＰ２９０は、配列番号２３に示される配列の深部イントロン突然変異を含む、請求項４０２～４０８のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項410】

深部イントロン突然変異は、核酸の５’スプライス供与部位の約１～１０，０００ヌクレオチド、約１～１０００ヌクレオチドまたは約１００～１０００ヌクレオチド下流に位置する、請求項３９１～４０９のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項411】

深部イントロン突然変異は、核酸の３’スプライス受容部位の約１～１０，０００ヌクレオチド、約１～１０００ヌクレオチドまたは約１００～１０００ヌクレオチド上流に位置する、請求項３９１～４１０のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項412】

深部イントロン突然変異は、核酸中にスプライス供与部位またはスプライス受容部位を導入する、請求項３６５～４１１のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項413】

Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である、請求項３６５～４１２のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項414】

Ｃａｓ９タンパク質は、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎ
ｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９タンパク質、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９タンパク質またはトレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）Ｃａｓ９タンパク質である、請求項４１３に記載の組成物。

【請求項415】

Ｃａｓ９は、真核細胞における発現のためにコドン最適化される、請求項４１３または４１４に記載の組成物。

【請求項416】

真核細胞は、哺乳動物細胞である、請求項４１５に記載の組成物。

【請求項417】

真核細胞は、ヒト細胞である、請求項４１５または４１６に記載の組成物。

【請求項418】

第１のガイドＲＮＡおよび／または第２のガイドＲＮＡは、トランス活性化ｃｒ（ｔｒａｃｒ）配列と融合されている、請求項３６５～４１７のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項419】

ｔｒａｃｒ配列は、配列番号２５によってコードされるヌクレオチド配列を含む、請求項４１８に記載の組成物。

【請求項420】

第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質は、真核細胞において発現される、請求項３６５～４１９のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項421】

ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳシステムは、脂質、カチオン性脂質、リポソーム、ポリカチオンまたは核酸の細胞取り込みを増強する物質と複合体形成されている、請求項３６５～４２０のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項422】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸およびＣａｓ発現カセットは、同一または異なるベクター上に位置する、請求項３６５～４２１のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項423】

ベクターは、プラスミドである、請求項４２２に記載の組成物。

【請求項424】

ベクターは、送達システムと複合体形成されている、請求項４２２または４２３に記載の組成物。

【請求項425】

ベクターは、脂質、リポソーム、ポリカチオンまたは核酸の細胞取り込みを増強する物質と複合体形成されている、請求項４２４に記載の組成物。

【請求項426】

ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター、組換えアデノウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクターまたは組換え単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターである、請求項４２２に記載の組成物。

【請求項427】

ベクターは、組換えアデノウイルスベクターである、請求項４２６に記載の組成物。

【請求項428】

組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型２、１、５、６、１９、３、１１、７、１４、１６、２１、１２、１８、３１、８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２４～３０、３７、４０、４１、ＡｄＨｕ２、ＡｄＨｕ３、ＡｄＨｕ４、ＡｄＨｕ２４、ＡｄＨｕ２６、ＡｄＨｕ３４、ＡｄＨｕ３５、ＡｄＨｕ３６、ＡｄＨｕ３７、ＡｄＨｕ４１、ＡｄＨｕ４８、ＡｄＨｕ４９、ＡｄＨｕ５０、ＡｄＣ６、Ａ
ｄＣ７、ＡｄＣ６９、ウシＡｄ３型、イヌＡｄ２型、ヒツジＡｄまたはブタＡｄ３型に由来する、請求項４２７に記載の組成物。

【請求項429】

組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型２またはアデノウイルス血清型５の変異体に由来する、請求項４２７または４２８に記載の組成物。

【請求項430】

ベクターは、組換えレンチウイルスベクターである、請求項４２６に記載の組成物。

【請求項431】

組換えレンチウイルスベクターは、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モカラウイルス（Ｍｏｋａｌａ ｖｉｒｕｓ）、狂犬病ウイルス、ＲＤ１１４またはその変異体で偽型化されたレンチウイルスに由来する、請求項４３０に記載の組成物。

【請求項432】

ベクターは、ｒＨＳＶベクターである、請求項４２６に記載の組成物。

【請求項433】

ｒＨＳＶベクターは、ｒＨＳＶ－１またはｒＨＳＶ－２に由来する、請求項４３２に記載の組成物。

【請求項434】

ベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターである、請求項４２６に記載の組成物。

【請求項435】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸およびＣａｓ発現カセットは、異なるｒＡＡＶベクター上にある、請求項４３４に記載の組成物。

【請求項436】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸および／またはＣａｓ発現カセットは、１つまたはそれ以上のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列がその両端に位置する、請求項４３４または４３５に記載の組成物。

【請求項437】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸および／またはＣａｓ発現カセットは、２つのＡＡＶ ＩＴＲがその両端に位置する、請求項４３６に記載の組成物。

【請求項438】

ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶまたはマウスＡＡＶキャプシド血清型ＩＴＲである、請求項４３６または４３７に記載の組成物。

【請求項439】

ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲである、請求項４３６～４３８のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項440】

ベクターは、自己相補的ベクターである、請求項４３６～４３９のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項441】

ベクターは、ウイルス粒子中にキャプシド封入されている、請求項４２６に記載の組成物。

【請求項442】

ウイルス粒子は、アデノウイルスベクターをキャプシド封入する組換えアデノウイルス粒子である、請求項４４１に記載の組成物。

【請求項443】

組換えアデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型２、１、５、６、１９、３、１１、７、１４、１６、２１、１２、１８、３１、８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２４～３０、３７、４０、４１、ＡｄＨｕ２、ＡｄＨｕ３、ＡｄＨｕ４、ＡｄＨｕ２４、ＡｄＨｕ２６、ＡｄＨｕ３４、ＡｄＨｕ３５、ＡｄＨｕ３６、ＡｄＨｕ３７、ＡｄＨｕ４１、ＡｄＨｕ４８、ＡｄＨｕ４９、ＡｄＨｕ５０、ＡｄＣ６、ＡｄＣ７、ＡｄＣ６９、ウシＡｄ３型、イヌＡｄ２型、ヒツジＡｄまたはブタＡｄ３型に由来するキャプシドを含む、請求項４４２に記載の組成物。

【請求項444】

組換えアデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型２キャプシドまたはアデノウイルス血清型５キャプシドの変異体を含む、請求項４４２または４４３に記載の組成物。

【請求項445】

ウイルス粒子は、組換えレンチウイルスベクターをキャプシド封入する組換えレンチウイルス粒子である、請求項４４２に記載の組成物。

【請求項446】

組換えレンチウイルス粒子は、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モカラウイルス（Ｍｏｋａｌａ ｖｉｒｕｓ）、狂犬病ウイルス、ＲＤ１１４またはその変異体で偽型化されたキャプシドを含む、請求項４４５に記載の組成物。

【請求項447】

ウイルス粒子は、組換えＨＳＶベクターをキャプシド封入する組換えＨＳＶ粒子である、請求項４４２に記載の組成物。

【請求項448】

組換えＨＳＶ粒子は、ｒＨＳＶ－１粒子またはｒＨＳＶ－２ウイルス粒子である、請求項４４７に記載の組成物。

【請求項449】

ウイルス粒子は、組換えＡＡＶベクターを含む組換えＡＡＶウイルス粒子である、請求項４４２に記載の組成物。

【請求項450】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸は、第１の組換えＡＡＶウイルス粒子の第１のｒＡＡＶベクター上にあり、Ｃａｓ発現カセットは、第２の組換えＡＡＶウイルス粒子の第２のｒＡＡＶベクター上にある、請求項４４２または４４９に記載の組成物。

【請求項451】

組換えＡＡＶウイルス粒子は、クレードＡ～Ｆに由来するＡＡＶ血清型キャプシドを含む、請求項４４９または４５０に記載の組成物。

【請求項452】

ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２－７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶまたはマウスＡＡＶキャプシドｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含む、請求項４４９～４５１のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項453】

ｒＡＡＶウイルス粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、同一ＡＡＶ血清型に由来する、請求項４４９～４５２のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項454】

ｒＡＡＶウイルス粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、異なるＡＡＶ血清型に由来する、請求項４４９～４５２のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項455】

組換えＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡ
Ｖ９および／またはＡＡＶｒｈ１０キャプシドを含む、請求項４４９～４５４のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項456】

ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９および／またはＡＡＶｒｈ１０キャプシドは、チロシン突然変異またはヘパラン結合突然変異を含む、請求項４５５に記載の組成物。

【請求項457】

ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む、請求項４４９～４５６のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項458】

医薬組成物である、請求項３６５～４５７のいずれか１項に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、すべての目的のために参照によってその全文を本明細書に組み入れる２０１５年５月１６日に出願された米国特許仮出願番号第６２／１６２，７２０号の優先権を主張する。

【0002】

ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出の内容は、その全文を参照によって本明細書に組み入れる：配列表のコンピュータによって読み取り可能な形式（ＣＲＦ）（ファイル名：１５９７９２０１３４４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日時：２０１６年４月１４日、サイズ：４９ＫＢ）。

【0003】

本発明は、遺伝子操作された、天然に存在しないクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ
Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）システムを使用して、深部イントロン突然変異と関連する疾患または障害を治療するための方法ならびにそれと関連する組成物、キットおよびウイルス粒子に関する。

【背景技術】

【0004】

イントロンのような非コード配列中の突然変異は、幅広い疾患に関連している。ヒトゲノムは、虫およびハエのようなその他の生物よりも長いイントロンをより高い割合で含有し；ヒトイントロンの９０％超は、１００ヌクレオチドを超える長さであり、すべてのイントロンの３分の１より多くは、２，０００ヌクレオチドまたはそれより長い（非特許文献１）。さらに、深部イントロン突然変異は、ヒト疾患の重要な、無視されている可能性がある原因と同定されており、疾患と関連のある突然変異を同定する多くの試みは、コード配列に焦点を合わせていた（非特許文献２）。ヒトにおけるｍＲＮＡスプライシングの複雑性のために、これらの深部イントロン突然変異は、とりわけ、ｍＲＮＡ不安定化、分解およびミススプライシング（例えば、潜在スプライシング部位を生成する）を含む機序のために、種々の病状を潜在的に引き起こし得る。実際、ヒトにおける、メンデルの法則に従った疾患の最大５％は、深部イントロン突然変異と関連している可能性があると推定した人もいる（非特許文献３）。

【0005】

いくつかの場合に深部イントロン突然変異と関連していた障害の例示的例として、レーバー先天黒内障（ＬＣＡ）は、人生の最初の１年において症状が発生する遺伝性網膜ジストロフィーの最も重症な形態である（非特許文献４）。ＬＣＡ患者における視力は、２０／４００よりも良好であることは稀である（非特許文献５）。ＬＣＡは、一般集団中、３０，０００人の個体あたりおよそ１人に影響を及ぼし、すべての遺伝性網膜ジストロフィーの５％を占める（非特許文献６）。欧州諸国におけるおよび米国におけるすべてのＬＣＡ症例のおよそ１５％を占める、ＬＣＡの最も頻繁な遺伝子的原因は、ＣＥＰ２９０遺伝子のイントロン２６中の深部イントロン突然変異ｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇであり、これは、潜在スプライス供与部位を生成し、その結果、ＣＥＰ２９０ ｍＲＮＡの未熟な停止コドン（ｐ．Ｃ９９８Ｘ）を含有する異常なエキソンを含むことになる（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０）。ＣＥＰ２９０突然変異によって引き起こされるＬＣＡ疾患は、ＬＣＡ１０として知られている。ホモ接合性患者における、すべてではないがいくつかのｍＲＮＡ転写物において、潜在エキソンのＣＥＰ２９０ ｍＲＮＡへの選択的スプライシングが起こっており（非特許文献１１）、これは、このイン
トロン突然変異の低形質性を強調する。

【0006】

ヒトＣＥＰ２９０遺伝子は、２４７９アミノ酸のタンパク質をコードする５４個のエキソンを包含する。ＣＥＰ２９０は、繊毛の構築および繊毛タンパク質輸送の両方において重要な役割を果たす中心体タンパク質である（非特許文献１２；非特許文献１３）。ＣＥＰ２９０突然変異によって最も影響を受ける網膜細胞である光受容体では、ＣＥＰ２９０は、結合繊毛に局在し（非特許文献１４）、これは、光受容体の内側セグメントおよび外側セグメントを結合する。

【0007】

現在、ＣＥＰ２９０突然変異によって引き起こされるＬＣＡの治療法はない。この疾患に立ち向かうための２つの前臨床アプローチとして、遺伝子増強およびアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）がある。ヒトＣＥＰ２９０相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の大きさは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）のカーゴサイズ（約４．８ｋｂ）を超える。レンチウイルスベクター系は、全長ＣＥＰ２９０ ｃＤＮＡを収容し得る；しかし、ＣＥＰ２９０の発現レベルを正確に制御できない場合がある。これまでの報告は、光受容体は、導入遺伝子発現のレベルに対して感受性があり、ＣＥＰ２９０の過剰発現は、細胞傷害性であることを実証した（非特許文献１５；非特許文献１６）。代替戦略は、ＡＯＮを使用して、ＣＥＰ２９０の異常なスプライシングを干渉することである（非特許文献１７；非特許文献１８）。しかし、このアプローチは、網膜の専門家による数年間にわたる毎週または毎月の網膜下注射を必要とする。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ、第６版（Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｂ．ら編、２０１４）

【非特許文献2】Ｈｏｍｏｌｏｖａ，Ｋ．ら（２０１０）Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．第３１巻：４３７～４４４頁

【非特許文献3】Ｃｏｏｐｅｒ，Ｄ．Ｎ．ら（２０１０）Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．第３１巻：６３１～６５５頁

【非特許文献4】Ｌｅｂｅｒ，Ｔ．Ｋ．Ｇ．ｖ．（１８６９）Ｇｒａｅｆｅ’ｓ Ａｒｃｈｉｖｅ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ第１５巻：１～２５頁

【非特許文献5】Ｃｒｅｍｅｒｓ，Ｆ．Ｐ．ら（２００２）Ｈｕｍａｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ第１１巻：１１６９～１１７６頁

【非特許文献6】Ｋｏｅｎｅｋｏｏｐ，Ｒ．Ｋ．（２００４）Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ第４９巻：３７９～３９８頁

【非特許文献7】ｄｅｎ Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ，Ａ．Ｉ．ら（２００６）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．第７９巻：５５６～５６１頁

【非特許文献8】Ｐｅｒｒａｕｌｔ，Ｉ．ら（２００７）Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．第２８巻：４１６頁

【非特許文献9】Ｓｔｏｎｅ，Ｅ．Ｍ．（２００７）Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．第１４４巻：７９１～８１１頁

【非特許文献10】Ｗｉｓｚｎｉｅｗｓｋｉ，Ｗ．ら（２０１１）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．第１２９巻：３１９～３２７頁

【非特許文献11】ｄｅｎ Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ，Ａ．Ｉ．ら（２００６）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．第７９巻：５５６～５６１頁

【非特許文献12】Ｂａｒｂｅｌａｎｎｅ，Ｍ．ら（２０１３）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．第２２巻：２４８２～２４９４頁

【非特許文献13】Ｃｒａｉｇｅ，Ｂ．ら（２０１０）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．第１９０巻：９２７～９４０頁

【非特許文献14】Ｃｈａｎｇ，Ｂ．ら（２００６）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．第１５巻：１８４７～１８５７頁

【非特許文献15】Ｂｕｒｎｉｇｈｔ，Ｅ．Ｒ．ら（２０１４）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．第２１巻：６６２～６７２頁

【非特許文献16】Ｔａｎ，Ｅ．ら（２００１）Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．第４２巻：５８９～６００頁

【非特許文献17】Ｃｏｌｌｉｎ，Ｒ．Ｗ．ら（２０１２）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ第１巻：ｅ１４

【非特許文献18】Ｇｅｒａｒｄ，Ｘ．ら（２０１２）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ第１巻：ｅ２９

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

したがって、ＣＥＰ２９０突然変異によって引き起こされるＬＣＡ１０のような、深部イントロン突然変異と関連のある障害を治療するための改善された治療アプローチが緊急に必要である。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明は、個体の遺伝子における深部イントロン突然変異と関連する疾患または障害を治療するための組成物であって、該組成物が、ａ）深部イントロン突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡと、ｂ）Ｃａｓタンパク質とを含む、遺伝子操作された、天然に存在しないＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）システムを含み、該Ｃａｓタンパク質が、深部イントロン突然変異の両端に位置する部位で標的ＤＮＡ分子を切断し、それによって、深部イントロン突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出す組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、個体の遺伝子における深部イントロン突然変異と関連する疾患または障害を治療するための組成物であって、該組成物が、ａ）深部イントロン突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡと、ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む、遺伝子操作された、天然に存在しないＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）システムをコードする核酸を含み、該Ｃａｓタンパク質が、深部イントロン突然変異の両端に位置する部位で標的ＤＮＡ分子を切断し、それによって、深部イントロン突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出す組成物を提供する。いくつかの実施形態では、深部イントロン突然変異と関連する疾患または障害は、無フィブリノーゲン血症、アルポート症候群、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、常染色体劣性多発性嚢胞腎、バース症候群、βサラセミア、先天性無フィブリノーゲン血症、先天性白内障・顔貌異常・ニューロパチー症候群、先天性グリコシル化異常症Ｉａ型、先天性グリコシル化異常症ＩＩ型、嚢胞性線維症、ジヒドロプテリジンレダクターゼ欠乏症、ファブリー病、急性骨髄性白血病を伴う家族性血小板異常症、ファンコニ貧血、ギテルマン症候群、成長ホルモン不応症、フリードライヒ運動失調症、血友病Ａ、遺伝性巨赤芽球性貧血１、ヘルマンスキー・パドラック症候群、ホモシスチン尿症、メープルシロップ尿症、マルファン症候群、メチオニンシンターゼ欠乏症、メチルマロン酸血症、ミトコンドリア三機能タンパク質欠乏症、ムコ多糖症ＩＩ型、マルチミニコア病、筋ジストロフィー、神経線維腫症Ｉ型、ニーマン・ピック病Ｃ型、眼白子症Ｉ型、オルニチンデルタアミノトランスフェラーゼ欠損症、全身性エリテマトーデスの素因、プロピオン酸血症、ラブドイド腫瘍、シュワルツ・ヤンペル症候群、スティックラー症候群、全身性エリテマトーデス、結節性硬化症、ウェルナー症候群、Ｘ連鎖高免疫グロブリンＭ血症ま
たはＸ連鎖低リン酸血症である。いくつかの実施形態では、深部イントロン突然変異は、表１に示される深部イントロン突然変異である。

【0011】

いくつかの態様では、本発明は、個体の遺伝子における深部イントロン突然変異と関連する眼の疾患または障害を治療するための組成物であって、該組成物が、ａ）深部イントロン突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡと、ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む、遺伝子操作された、天然に存在しないＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）システムをコードする核酸を含み、該Ｃａｓタンパク質が、深部イントロン突然変異の両端に位置する部位で標的ＤＮＡ分子を切断し、それによって、深部イントロン突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出す組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、個体の遺伝子における深部イントロン突然変異と関連する眼の疾患または障害を治療するための組成物であって、該組成物が、ａ）深部イントロン突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡと、ｂ）Ｃａｓタンパク質とを含む、遺伝子操作された、天然に存在しないＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）システムを含み、該Ｃａｓタンパク質が、深部イントロン突然変異の両端に位置する部位で標的ＤＮＡ分子を切断し、それによって、深部イントロン突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出す組成物を提供する。いくつかの実施形態では、眼の疾患は、レーバー先天黒内障、視神経萎縮症、網膜色素変性症、網膜芽細胞腫、シュタルガルト病、アッシャー症候群またはＸ連鎖網膜色素変性症である。いくつかの実施形態では、深部イントロン突然変異は、表２に示される深部イントロン突然変異である。

【0012】

上記の実施形態のいくつかの実施形態では、眼の疾患は、レーバー先天黒内障である。いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡガイド配列は、中心体タンパク質２９０ｋＤａ（ＣＥＰ２９０）遺伝子の深部イントロン突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、深部イントロン突然変異は、ｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ突然変異である。いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡは、配列番号４１（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号４５（ＳａＣａｓ９の）、配列番号４６（ＳａＣａｓ９の）または配列番号４７（ＳａＣａｓ９の）の配列を含むＤＮＡによってコードされる。いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡは、配列番号１９（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号５０（ＳａＣａｓ９の）、配列番号５１（ＳａＣａｓ９の）または配列番号５２（ＳａＣａｓ９の）の配列を含むＤＮＡによってコードされる。いくつかの実施形態では、第２のガイドＲＮＡは、配列番号４２（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号４３（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号４４（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号４８（ＳａＣａｓ９の）または配列番号４９（ＳａＣａｓ９の）の配列を含むＤＮＡによってコードされる。いくつかの実施形態では、第２のガイドＲＮＡは、配列番号２０（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号２１（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号２２（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号５３（ＳａＣａｓ９の）または配列番号５４（ＳａＣａｓ９の）の配列を含むＤＮＡによってコードされる。いくつかの実施形態では、ＣＥＰ２９０は、ヒトＣＥＰ２９０である。いくつかの実施形態では、ＣＥＰ２９０は、配列番号２３に示される配列の深部イントロン突然変異を含む。

【0013】

上記の実施形態のいくつかの実施形態では、深部イントロン突然変異は、遺伝子の５’スプライス供与部位の約１～１０，０００ヌクレオチド、約１～１０００ヌクレオチドまたは約１００～１０００ヌクレオチド下流に位置する。いくつかの実施形態では、深部イントロン突然変異は、遺伝子の３’スプライス受容部位の約１～１０，０００ヌクレオチ
ド、約１～１０００ヌクレオチドまたは約１００～１０００ヌクレオチド上流に位置する。いくつかの実施形態では、深部イントロン突然変異は、遺伝子中にスプライス供与部位またはスプライス受容部位を導入する。

【0014】

上記の実施形態のいくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質（配列番号４０）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９タンパク質（配列番号５５）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９タンパク質、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９タンパク質またはトレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）Ｃａｓ９タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、真核細胞における発現のためにコドン最適化される。いくつかの実施形態では、真核細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、ヒト細胞である。

【0015】

上記の実施形態のいくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、１つまたはそれ以上の核局在性シグナル（ＮＬＳ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１つまたはそれ以上のＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、ＳＶ４０ラージＴ抗原中のＣ末端配列である。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２６）またはＰＫＫＫＲＫＶＥＤＰＫＫＫＲＫＶＤ（配列番号２７）を含む。

【0016】

上記の実施形態のいくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡおよび／または第２のガイドＲＮＡは、トランス活性化ｃｒ（ｔｒａｃｒ）配列と融合されている。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒ配列は、配列番号２５によってコードされるヌクレオチド配列を含む。

【0017】

上記の実施形態のいくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム（例えば、第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質）は、脂質、カチオン性脂質、リポソーム、ポリカチオンまたは核酸および／もしくはタンパク質の細胞取り込みを増強する物質と複合体形成されている。

【0018】

上記の実施形態のいくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質をコードする核酸は、真核細胞において発現される。いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡおよび／またはＣａｓタンパク質をコードする核酸は、１つまたはそれ以上の調節制御エレメントと作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡおよび／または第２のガイドＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターと作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、Ｕ６、７ＳＫまたはＨ１プロモーターである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターと作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ＣＭＶプロモーター由来の最小プロモーター断片（ｍｉｎＣＭＶプロモーター）、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ＣＫ６プロモーター、トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／
ニワトリβ－アクチン／ウサギβ－グロビンプロモーター（ＣＡＧ）プロモーター、桿体オプシンプロモーター、錐体オプシンプロモーター、βホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）プロモーター、網膜色素変性症（ＲＰ１）プロモーターまたは光受容体間レチノイド結合タンパク質遺伝子（ＩＲＢＰ）プロモーターである。

【0019】

上記の実施形態のいくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡまたはＣａｓタンパク質のうちの１つまたはそれ以上をコードする核酸は、システムの同一または異なるベクター上に位置する。いくつかの実施形態では、ベクターは、プラスミドである。いくつかの実施形態では、ベクターは、送達システムと複合体形成されている。いくつかの実施形態では、ベクターは、脂質、カチオン性脂質、リポソーム、ポリカチオンまたは核酸の細胞取り込みを増強する物質と複合体形成されている。

【0020】

上記の実施形態のいくつかの実施形態では、ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター、組換えアデノウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクターまたは組換え単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、組換えアデノウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型２、１、５、６、１９、３、１１、７、１４、１６、２１、１２、１８、３１、８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２４～３０、３７、４０、４１、ＡｄＨｕ２、ＡｄＨｕ３、ＡｄＨｕ４、ＡｄＨｕ２４、ＡｄＨｕ２６、ＡｄＨｕ３４、ＡｄＨｕ３５、ＡｄＨｕ３６、ＡｄＨｕ３７、ＡｄＨｕ４１、ＡｄＨｕ４８、ＡｄＨｕ４９、ＡｄＨｕ５０、ＡｄＣ６、ＡｄＣ７、ＡｄＣ６９、ウシＡｄ３型、イヌＡｄ２型、ヒツジＡｄまたはブタＡｄ３型に由来する。いくつかの実施形態では、組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型２またはアデノウイルス血清型５の変異体に由来する。

【0021】

いくつかの実施形態では、ベクターは、組換えレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、組換えレンチウイルスベクターは、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モカラウイルス（Ｍｏｋａｌａ ｖｉｒｕｓ）、狂犬病ウイルス、ＲＤ１１４またはその変異体で偽型化されたレンチウイルスに由来する。

【0022】

いくつかの実施形態では、ベクターは、ｒＨＳＶベクターである。いくつかの実施形態では、ｒＨＳＶベクターは、ｒＨＳＶ－１またはｒＨＳＶ－２に由来する。

【0023】

いくつかの実施形態では、ベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡまたはＣａｓタンパク質のうちの１つまたはそれ以上をコードする核酸は、１つまたはそれ以上のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列がその両端に位置する。いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡまたはＣａｓタンパク質のうちの１つまたはそれ以上をコードする核酸は、２つのＡＡＶ ＩＴＲがその両端に位置する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶまたはマウスＡＡＶキャプシド血清型ＩＴＲである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲである。いくつかの実施形態では、ベクターは、自己相補的ベクターである。

【0024】

いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルス粒子中にキャプシド封入されている。いくつかの実施形態では、ウイルス粒子は、組換えアデノウイルスベクターをキャプシド封入する組換えアデノウイルス粒子である。いくつかの実施形態では、組換えアデノウイ
ルス粒子は、アデノウイルス血清型２、１、５、６、１９、３、１１、７、１４、１６、２１、１２、１８、３１、８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２４～３０、３７、４０、４１、ＡｄＨｕ２、ＡｄＨｕ３、ＡｄＨｕ４、ＡｄＨｕ２４、ＡｄＨｕ２６、ＡｄＨｕ３４、ＡｄＨｕ３５、ＡｄＨｕ３６、ＡｄＨｕ３７、ＡｄＨｕ４１、ＡｄＨｕ４８、ＡｄＨｕ４９、ＡｄＨｕ５０、ＡｄＣ６、ＡｄＣ７、ＡｄＣ６９、ウシＡｄ３型、イヌＡｄ２型、ヒツジＡｄまたはブタＡｄ３型に由来するキャプシドを含む。いくつかの実施形態では、組換えアデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型２キャプシドまたはアデノウイルス血清型５キャプシドの変異体を含む。

【0025】

いくつかの実施形態では、ウイルス粒子は、組換えレンチウイルスベクターをキャプシド封入する組換えレンチウイルス粒子である。いくつかの実施形態では、組換えレンチウイルス粒子は、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モカラウイルス（Ｍｏｋａｌａ ｖｉｒｕｓ）、狂犬病ウイルス、ＲＤ１１４またはその変異体で偽型化されたキャプシドを含む。

【0026】

いくつかの実施形態では、ウイルス粒子は、組換えＨＳＶベクターをキャプシド封入する組換えＨＳＶ粒子である。いくつかの実施形態では、組換えＨＳＶ粒子は、ｒＨＳＶ－１粒子またはｒＨＳＶ－２ウイルス粒子である。

【0027】

いくつかの実施形態では、ウイルス粒子は、組換えＡＡＶベクターを含む組換えＡＡＶウイルス粒子である。いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶウイルス粒子は、クレードＡ～Ｆに由来するＡＡＶ血清型キャプシドを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２－７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶまたはマウスＡＡＶキャプシドｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶウイルス粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、同一ＡＡＶ血清型に由来する。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶウイルス粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、異なるＡＡＶ血清型に由来する。いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、および／またはＡＡＶｒｈ１０キャプシドを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９および／またはＡＡＶｒｈ１０キャプシドは、チロシン突然変異またはヘパラン結合突然変異を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む。

【0028】

いくつかの態様では、本発明は、個体の遺伝子における深部イントロン突然変異と関連する疾患または障害を治療するための方法であって、該方法が、ａ）深部イントロン突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡと、ｂ）Ｃａｓタンパク質とを含む、遺伝子操作された、天然に存在しないＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）システムを含む組成物の治療有効量を、個体に投与することを含み、該Ｃａｓタンパク質が、深部イントロン突然変異の両端に位置する部位で標的ＤＮＡ分子を切断し、それによって、深部イントロン突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出す方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、個体の遺伝子における深部イントロン突然変異と関連する疾患または障害を治療するための方法であって、該方法が、ａ）深部イントロン突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブ
リダイズする、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡと、ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む、遺伝子操作された、天然に存在しないＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）システムをコードする核酸を含む組成物の治療有効量を個体に投与することを含み、該Ｃａｓタンパク質が、深部イントロン突然変異の両端に位置する部位で標的ＤＮＡ分子を切断し、それによって、深部イントロン突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出す方法を提供する。いくつかの実施形態では、深部イントロン突然変異と関連する疾患または障害は、無フィブリノーゲン血症、アルポート症候群、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、常染色体劣性多発性嚢胞腎、バース症候群、βサラセミア、先天性無フィブリノーゲン血症、先天性白内障・顔貌異常・ニューロパチー症候群、先天性グリコシル化異常症Ｉａ型、先天性グリコシル化異常症ＩＩ型、嚢胞性線維症、ジヒドロプテリジンレダクターゼ欠乏症、ファブリー病、急性骨髄性白血病を伴う家族性血小板異常症、ファンコニ貧血、ギテルマン症候群、成長ホルモン不応症、フリードライヒ運動失調症、血友病Ａ、遺伝性巨赤芽球性貧血１、ヘルマンスキー・パドラック症候群、ホモシスチン尿症、メープルシロップ尿症、マルファン症候群、メチオニンシンターゼ欠乏症、メチルマロン酸血症、ミトコンドリア三機能タンパク質欠乏症、ムコ多糖症ＩＩ型、マルチミニコア病、筋ジストロフィー、神経線維腫症Ｉ型、ニーマン・ピック病Ｃ型、眼白子症Ｉ型、オルニチンデルタアミノトランスフェラーゼ欠損症、全身性エリテマトーデスの素因、プロピオン酸血症、ラブドイド腫瘍、シュワルツ・ヤンペル症候群、スティックラー症候群、全身性エリテマトーデス、結節性硬化症、ウェルナー症候群、Ｘ連鎖高免疫グロブリンＭ血症またはＸ連鎖低リン酸血症である。いくつかの実施形態では、深部イントロン突然変異は、表１に示される深部イントロン突然変異である。

【0029】

態様では、本発明は、個体の遺伝子における深部イントロン突然変異と関連する眼の疾患または障害を治療するための方法であって、該方法が、ａ）深部イントロン突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡと、ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む、遺伝子操作された、天然に存在しないＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）システムを含む組成物の治療有効量を、個体に投与することを含み、該Ｃａｓタンパク質が、深部イントロン突然変異の両端に位置する部位で標的ＤＮＡ分子を切断し、それによって、深部イントロン突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出す方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、個体の遺伝子における深部イントロン突然変異と関連する眼の疾患または障害を治療するための方法であって、該方法が、ａ）深部イントロン突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡと、ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む、遺伝子操作された、天然に存在しないＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ
Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）システムをコードする核酸を含む組成物の治療有効量を、個体に投与することを含み、該Ｃａｓタンパク質が、深部イントロン突然変異の両端に位置する部位で標的ＤＮＡ分子を切断し、それによって、深部イントロン突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出す方法を提供する。いくつかの実施形態では、眼の疾患は、レーバー先天黒内障、視神経萎縮症、網膜色素変性症、網膜芽細胞腫、シュタルガルト病、アッシャー症候群またはＸ連鎖網膜色素変性症である。いくつかの実施形態では、深部イントロン突然変異は、表２に示される深部イントロン突然変異である。

【0030】

上記の方法のいくつかの実施形態では、個体は、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。いくつかの実施形態では、組成物は、個体の眼に投与さ
れる。いくつかの実施形態では、投与は、網膜下または硝子体内である。

【0031】

上記の方法のいくつかの実施形態では、眼の疾患は、レーバー先天黒内障である。いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡガイド配列は、中心体タンパク質２９０ｋＤａ（ＣＥＰ２９０）遺伝子の深部イントロン突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、深部イントロン突然変異は、ｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ突然変異である。いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡは、配列番号４１（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号４５（ＳａＣａｓ９の）、配列番号４６（ＳａＣａｓ９の）または配列番号４７（ＳａＣａｓ９の）の配列を含むＤＮＡによってコードされる。いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡは、配列番号１９（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号５０（ＳａＣａｓ９の）、配列番号５１（ＳａＣａｓ９の）または配列番号５２（ＳａＣａｓ９の）の配列を含むＤＮＡによってコードされる。いくつかの実施形態では、第２のガイドＲＮＡは、配列番号４２（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号４３（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号４４（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号４８（ＳａＣａｓ９の）または配列番号４９（ＳａＣａｓ９の）の配列を含むＤＮＡによってコードされる。いくつかの実施形態では、第２のガイドＲＮＡは、配列番号２０（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号２１（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号２２（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号５３（ＳａＣａｓ９の）または配列番号５４（ＳａＣａｓ９の）の配列を含むＤＮＡによってコードされる。いくつかの実施形態では、ＣＥＰ２９０は、ヒトＣＥＰ２９０である。いくつかの実施形態では、ＣＥＰ２９０は、配列番号２３に示される配列の深部イントロン突然変異を含む。

【0032】

上記の方法のいくつかの実施形態では、深部イントロン突然変異は、遺伝子の５’スプライス供与部位の約１～１０，０００ヌクレオチド、約１～１０００ヌクレオチドまたは約１００～１０００ヌクレオチド下流に位置する。いくつかの実施形態では、深部イントロン突然変異は、遺伝子の３’スプライス受容部位の約１～１０，０００ヌクレオチド、約１～１０００ヌクレオチドまたは約１００～１０００ヌクレオチド上流に位置する。いくつかの実施形態では、深部イントロン突然変異は、遺伝子中にスプライス供与部位またはスプライス受容部位を導入する。

【0033】

上記の方法のいくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓタンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９タンパク質、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９タンパク質またはトレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）Ｃａｓ９タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、真核細胞における発現のためにコドン最適化される。いくつかの実施形態では、真核細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、ヒト細胞である。

【0034】

上記の方法のいくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、１つまたはそれ以上の核局在性シグナル（ＮＬＳ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１つまたはそれ以上のＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、ＳＶ４０ラージＴ抗原中のＣ末端配列である。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２６）またはＰＫＫＫＲＫＶＥＤＰＫＫＫＲＫＶＤ（配列番号２７）を含む。

【0035】

上記の方法のいくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡおよび／または第２のガイドＲＮＡは、トランス活性化ｃｒ（ｔｒａｃｒ）配列と融合されている。いくつかの実施
形態では、ｔｒａｃｒ配列は、配列番号２５によってコードされるヌクレオチド配列を含む。

【0036】

上記の方法のいくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム（例えば、第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質）は、脂質、カチオン性脂質、リポソーム、ポリカチオンまたは核酸および／もしくはタンパク質の細胞取り込みを増強する物質と複合体形成されている。

【0037】

上記の方法のいくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質をコードする核酸は、真核細胞において発現される。いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡおよび／またはＣａｓタンパク質をコードする核酸は、１つまたはそれ以上の調節制御エレメントと作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡおよび／または第２のガイドＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターと作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、Ｕ６、７ＳＫまたはＨ１プロモーターである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターと作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ＣＭＶプロモーター由来の最小プロモーター断片（ｍｉｎＣＭＶプロモーター）、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ＣＫ６プロモーター、トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ－アクチン／ウサギβ－グロビンプロモーター（ＣＡＧ）プロモーター、桿体オプシンプロモーター、錐体オプシンプロモーター、βホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）プロモーター、網膜色素変性症（ＲＰ１）プロモーターまたは光受容体間レチノイド結合タンパク質遺伝子（ＩＲＢＰ）プロモーターである。

【0038】

上記の方法のいくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡまたはＣａｓタンパク質のうちの１つまたはそれ以上をコードする核酸は、システムの同一または異なるベクター上に位置する。いくつかの実施形態では、ベクターは、プラスミドである。いくつかの実施形態では、ベクターは、送達システムと複合体形成されている。いくつかの実施形態では、ベクターは、脂質、カチオン性脂質、リポソーム、ポリカチオンまたは核酸の細胞取り込みを増強する物質と複合体形成されている。

【0039】

上記の実施形態のいくつかの実施形態では、ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター、組換えアデノウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクターまたは組換え単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、組換えアデノウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型２、１、５、６、１９、３、１１、７、１４、１６、２１、１２、１８、３１、８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２４～３０、３７、４０、４１、ＡｄＨｕ２、ＡｄＨｕ３、ＡｄＨｕ４、ＡｄＨｕ２４、ＡｄＨｕ２６、ＡｄＨｕ３４、ＡｄＨｕ３５、ＡｄＨｕ３６、ＡｄＨｕ３７、ＡｄＨｕ４１、ＡｄＨｕ４８、ＡｄＨｕ４９、ＡｄＨｕ５０、ＡｄＣ６、ＡｄＣ７、ＡｄＣ６９、ウシＡｄ３型、イヌＡｄ２型、ヒツジＡｄまたはブタＡｄ３型に由来する。いくつかの実施形態では、組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型２またはアデノウイルス血清型５の変異体に由来する。

【0040】

いくつかの実施形態では、ベクターは、組換えレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、組換えレンチウイルスベクターは、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モカラウイルス（Ｍｏｋａｌａ ｖｉｒｕｓ）、狂犬病ウイルス、ＲＤ１１４またはその変異体で偽型化されたレンチウイルスに由来する。

【0041】

いくつかの実施形態では、ベクターは、ｒＨＳＶベクターである。いくつかの実施形態では、ｒＨＳＶベクターは、ｒＨＳＶ－１またはｒＨＳＶ－２に由来する。

【0042】

いくつかの実施形態では、ベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡまたはＣａｓタンパク質のうちの１つまたはそれ以上をコードする核酸は、１つまたはそれ以上のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列がその両端に位置する。いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡまたはＣａｓタンパク質のうちの１つまたはそれ以上をコードする核酸は、２つのＡＡＶ ＩＴＲがその両端に位置する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶまたはマウスＡＡＶキャプシド血清型ＩＴＲである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲである。いくつかの実施形態では、ベクターは、自己相補的ベクターである。

【0043】

いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルス粒子中にキャプシド封入されている。いくつかの実施形態では、ウイルス粒子は、組換えアデノウイルスベクターをキャプシド封入する組換えアデノウイルス粒子である。いくつかの実施形態では、組換えアデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型２、１、５、６、１９、３、１１、７、１４、１６、２１、１２、１８、３１、８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２４～３０、３７、４０、４１、ＡｄＨｕ２、ＡｄＨｕ３、ＡｄＨｕ４、ＡｄＨｕ２４、ＡｄＨｕ２６、ＡｄＨｕ３４、ＡｄＨｕ３５、ＡｄＨｕ３６、ＡｄＨｕ３７、ＡｄＨｕ４１、ＡｄＨｕ４８、ＡｄＨｕ４９、ＡｄＨｕ５０、ＡｄＣ６、ＡｄＣ７、ＡｄＣ６９、ウシＡｄ３型、イヌＡｄ２型、ヒツジＡｄまたはブタＡｄ３型に由来するキャプシドを含む。いくつかの実施形態では、組換えアデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型２キャプシドまたはアデノウイルス血清型５キャプシドの変異体を含む。

【0044】

いくつかの実施形態では、ウイルス粒子は、組換えレンチウイルスベクターをキャプシド封入する組換えレンチウイルス粒子である。いくつかの実施形態では、組換えレンチウイルス粒子は、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モカラウイルス（Ｍｏｋａｌａ ｖｉｒｕｓ）、狂犬病ウイルス、ＲＤ１１４またはその変異体で偽型化されたキャプシドを含む。

【0045】

いくつかの実施形態では、ウイルス粒子は、組換えＨＳＶベクターをキャプシド封入する組換えＨＳＶ粒子である。いくつかの実施形態では、組換えＨＳＶ粒子は、ｒＨＳＶ－１粒子またはｒＨＳＶ－２ウイルス粒子である。

【0046】

いくつかの実施形態では、ウイルス粒子は、組換えＡＡＶベクターを含む組換えＡＡＶウイルス粒子である。いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶウイルス粒子は、クレードＡ～Ｆに由来するＡＡＶ血清型キャプシドを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、
ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２－７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶまたはマウスＡＡＶキャプシドｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶウイルス粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、同一ＡＡＶ血清型に由来する。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶウイルス粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、異なるＡＡＶ血清型に由来する。いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、および／またはＡＡＶｒｈ１０キャプシドを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９および／またはＡＡＶｒｈ１０キャプシドは、チロシン突然変異またはヘパラン結合突然変異を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む。

【0047】

上記の方法のいくつかの実施形態では、組成物は、医薬組成物である。

【0048】

いくつかの態様では、本発明は、個体の遺伝子における深部イントロン突然変異と関連する障害を治療するための、上記の実施形態のいずれか１つの組成物の使用を提供する。いくつかの態様では、本発明は、個体の遺伝子における深部イントロン突然変異と関連する障害を治療するための医薬の製造における、上記の実施形態のいずれか１つの組成物の使用を提供する。いくつかの実施形態では、深部イントロン突然変異と関連する疾患または障害は、無フィブリノーゲン血症、アルポート症候群、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、常染色体劣性多発性嚢胞腎、バース症候群、βサラセミア、先天性無フィブリノーゲン血症、先天性白内障・顔貌異常・ニューロパチー症候群、先天性グリコシル化異常症Ｉａ型、先天性グリコシル化異常症ＩＩ型、嚢胞性線維症、ジヒドロプテリジンレダクターゼ欠乏症、ファブリー病、急性骨髄性白血病を伴う家族性血小板異常症、ファンコニ貧血、ギテルマン症候群、成長ホルモン不応症、フリードライヒ運動失調症、血友病Ａ、遺伝性巨赤芽球性貧血１、ヘルマンスキー・パドラック症候群、ホモシスチン尿症、メープルシロップ尿症、マルファン症候群、メチオニンシンターゼ欠乏症、メチルマロン酸血症、ミトコンドリア三機能タンパク質欠乏症、ムコ多糖症ＩＩ型、マルチミニコア病、筋ジストロフィー、神経線維腫症Ｉ型、ニーマン・ピック病Ｃ型、眼白子症Ｉ型、オルニチンデルタアミノトランスフェラーゼ欠損症、全身性エリテマトーデスの素因、プロピオン酸血症、ラブドイド腫瘍、シュワルツ・ヤンペル症候群、スティックラー症候群、全身性エリテマトーデス、結節性硬化症、ウェルナー症候群、Ｘ連鎖高免疫グロブリンＭ血症またはＸ連鎖低リン酸血症である。いくつかの実施形態では、深部イントロン突然変異は、表１に示される深部イントロン突然変異である。いくつかの実施形態では、深部イントロン突然変異と関連する疾患または障害は、眼の疾患である。いくつかの実施形態では、眼の疾患は、レーバー先天黒内障、視神経萎縮症、網膜色素変性症、網膜芽細胞腫、シュタルガルト病、アッシャー症候群またはＸ連鎖網膜色素変性症である。いくつかの実施形態では、深部イントロン突然変異は、表２に示される深部イントロン突然変異である。いくつかの実施形態では、個体は、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。いくつかの実施形態では、眼の疾患は、レーバー先天黒内障である。

【0049】

上記の使用のいくつかの実施形態では、組成物は、個体の眼への投与のために製剤化される。いくつかの実施形態では、投与は、網膜下または硝子体内投与のために製剤化される。

【0050】

上記の使用のいくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡガイド配列は、中心体タンパク質２９０ｋＤａ（ＣＥＰ２９０）遺伝子の深部イントロン突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする。いくつかの実施
形態では、深部イントロン突然変異は、ｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ突然変異である。いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡは、配列番号４１（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号４５（ＳａＣａｓ９の）、配列番号４６（ＳａＣａｓ９の）または配列番号４７（ＳａＣａｓ９の）の配列を含むＤＮＡによってコードされる。いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡは、配列番号１９（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号５０（ＳａＣａｓ９の）、配列番号５１（ＳａＣａｓ９の）または配列番号５２（ＳａＣａｓ９の）の配列を含むＤＮＡによってコードされる。いくつかの実施形態では、第２のガイドＲＮＡは、配列番号４２（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号４３（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号４４（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号４８（ＳａＣａｓ９の）または配列番号４９（ＳａＣａｓ９の）の配列を含むＤＮＡによってコードされる。いくつかの実施形態では、第２のガイドＲＮＡは、配列番号２０（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号２１（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号２２（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号５３（ＳａＣａｓ９の）または配列番号５４（ＳａＣａｓ９の）の配列を含むＤＮＡによってコードされる。いくつかの実施形態では、ＣＥＰ２９０は、ヒトＣＥＰ２９０である。いくつかの実施形態では、ＣＥＰ２９０は、配列番号２３に示される配列の深部イントロン突然変異を含む。

【0051】

上記の使用のいくつかの実施形態では、深部イントロン突然変異は、遺伝子の５’スプライス供与部位の約１～１０，０００ヌクレオチド、約１～１０００ヌクレオチドまたは約１００～１０００ヌクレオチド下流に位置する。いくつかの実施形態では、深部イントロン突然変異は、遺伝子の３’スプライス受容部位の約１～１０，０００ヌクレオチド、約１～１０００ヌクレオチドまたは約１００～１０００ヌクレオチド上流に位置する。いくつかの実施形態では、深部イントロン突然変異は、スプライス供与部位またはスプライス受容部位を導入する。

【0052】

いくつかの態様では、本発明は、上記の実施形態のいずれか１つの組成物を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載される方法のいずれかにおいて使用するための、上記の実施形態のいずれか１つの組成物を含む。いくつかの実施形態では、キットは、使用のための説明書をさらに含む。

【0053】

いくつかの態様では、本発明は、ウイルスベクターを含むウイルス粒子であって、該ウイルスベクターが、ａ）個体の遺伝子における深部イントロン突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡと、ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む、遺伝子操作された、天然に存在しないＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）システムをコードする核酸を含み、該Ｃａｓタンパク質が、深部イントロン突然変異の両端に位置する部位で標的ＤＮＡ分子を切断し、それによって、深部イントロン突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出すウイルス粒子を提供する。いくつかの実施形態では、個体の遺伝子における深部イントロン突然変異は、無フィブリノーゲン血症、アルポート症候群、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、常染色体劣性多発性嚢胞腎、バース症候群、βサラセミア、先天性無フィブリノーゲン血症、先天性白内障・顔貌異常・ニューロパチー症候群、先天性グリコシル化異常症Ｉａ型、先天性グリコシル化異常症ＩＩ型、嚢胞性線維症、ジヒドロプテリジンレダクターゼ欠乏症、ファブリー病、急性骨髄性白血病を伴う家族性血小板異常症、ファンコニ貧血、ギテルマン症候群、成長ホルモン不応症、フリードライヒ運動失調症、血友病Ａ、遺伝性巨赤芽球性貧血１、ヘルマンスキー・パドラック症候群、ホモシスチン尿症、メープルシロップ尿症、マルファン症候群、メチオニンシンターゼ欠乏症、メチルマロン酸血症、ミトコンドリア三機能タンパク質欠乏症、ムコ多糖症ＩＩ型、マルチミニコア病、筋ジストロフィー、神経線維腫症Ｉ型、ニーマン・ピック病Ｃ型、眼白子症Ｉ型、オルニチンデルタアミノトランスフェラーゼ欠損症、全身性エリテマトーデスの素因、プロ
ピオン酸血症、ラブドイド腫瘍、シュワルツ・ヤンペル症候群、スティックラー症候群、全身性エリテマトーデス、結節性硬化症、ウェルナー症候群、Ｘ連鎖高免疫グロブリンＭ血症またはＸ連鎖低リン酸血症と関連する。いくつかの実施形態では、個体の遺伝子における深部イントロン突然変異は、表１に示される深部イントロン突然変異である。

【0054】

いくつかの実施形態では、ウイルス粒子は、無フィブリノーゲン血症、アルポート症候群、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、常染色体劣性多発性嚢胞腎、バース症候群、βサラセミア、先天性無フィブリノーゲン血症、先天性白内障・顔貌異常・ニューロパチー症候群、先天性グリコシル化異常症Ｉａ型、先天性グリコシル化異常症ＩＩ型、嚢胞性線維症、ジヒドロプテリジンレダクターゼ欠乏症、ファブリー病、急性骨髄性白血病を伴う家族性血小板異常症、ファンコニ貧血、ギテルマン症候群、成長ホルモン不応症、フリードライヒ運動失調症、血友病Ａ、遺伝性巨赤芽球性貧血１、ヘルマンスキー・パドラック症候群、ホモシスチン尿症、メープルシロップ尿症、マルファン症候群、メチオニンシンターゼ欠乏症、メチルマロン酸血症、ミトコンドリア三機能タンパク質欠乏症、ムコ多糖症ＩＩ型、マルチミニコア病、筋ジストロフィー、神経線維腫症Ｉ型、ニーマン・ピック病Ｃ型、眼白子症Ｉ型、オルニチンデルタアミノトランスフェラーゼ欠損症、全身性エリテマトーデスの素因、プロピオン酸血症、ラブドイド腫瘍、シュワルツ・ヤンペル症候群、スティックラー症候群、全身性エリテマトーデス、結節性硬化症、ウェルナー症候群、Ｘ連鎖高免疫グロブリンＭ血症またはＸ連鎖低リン酸血症を有する個体を治療するために使用される。

【0055】

いくつかの態様では、本発明は、ウイルスベクターを含むウイルス粒子であって、該ウイルスベクターが、ａ）眼の疾患または障害と関連する個体の遺伝子における深部イントロン突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡと、ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む、遺伝子操作された、天然に存在しないＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）システムをコードする核酸を含み、該Ｃａｓタンパク質が、深部イントロン突然変異の両端に位置する部位で標的ＤＮＡ分子を切断し、それによって、深部イントロン突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出すウイルス粒子を提供する。いくつかの実施形態では、眼の疾患または障害は、レーバー先天黒内障、視神経萎縮症、網膜色素変性症、網膜芽細胞腫、シュタルガルト病、アッシャー症候群またはＸ連鎖網膜色素変性症である。いくつかの実施形態では、深部イントロン突然変異は、表２に示される深部イントロン突然変異である。いくつかの実施形態では、ウイルス粒子は、レーバー先天黒内障、視神経萎縮症、網膜色素変性症、網膜芽細胞腫、シュタルガルト病、アッシャー症候群またはＸ連鎖網膜色素変性症を治療するために使用される。

【0056】

いくつかの実施形態では、眼の疾患は、レーバー先天黒内障である。いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡガイド配列は、中心体タンパク質２９０ｋＤａ（ＣＥＰ２９０）遺伝子の深部イントロン突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、深部イントロン突然変異は、ｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ突然変異である。いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡは、配列番号４１（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号４５（ＳａＣａｓ９の）、配列番号４６（ＳａＣａｓ９の）または配列番号４７（ＳａＣａｓ９の）の配列を含むＤＮＡによってコードされる。いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡは、配列番号１９（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号５０（ＳａＣａｓ９の）、配列番号５１（ＳａＣａｓ９の）または配列番号５２（ＳａＣａｓ９の）の配列を含むＤＮＡによってコードされる。いくつかの実施形態では、第２のガイドＲＮＡは、配列番号４２（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号４３（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号４４（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号４８（Ｓ
ａＣａｓ９の）または配列番号４９（ＳａＣａｓ９の）の配列を含むＤＮＡによってコードされる。いくつかの実施形態では、第２のガイドＲＮＡは、配列番号２０（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号２１（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号２２（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号５３（ＳａＣａｓ９の）または配列番号５４（ＳａＣａｓ９の）の配列を含むＤＮＡによってコードされる。いくつかの実施形態では、ＣＥＰ２９０は、ヒトＣＥＰ２９０である。いくつかの実施形態では、ＣＥＰ２９０は、配列番号２３に示される配列の深部イントロン突然変異を含む。

【0057】

上記のウイルス粒子のいくつかの実施形態では、深部イントロン突然変異は、遺伝子の５’スプライス供与部位の約１～１０，０００ヌクレオチド、約１～１０００ヌクレオチドまたは約１００～１０００ヌクレオチド下流に位置する。いくつかの実施形態では、深部イントロン突然変異は、遺伝子の３’スプライス受容部位の約１～１０，０００ヌクレオチド、約１～１０００ヌクレオチドまたは約１００～１０００ヌクレオチド上流に位置する。いくつかの実施形態では、深部イントロン突然変異は、遺伝子中にスプライス供与部位またはスプライス受容部位を導入する。

【0058】

上記のウイルス粒子のいくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９タンパク質、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９タンパク質またはトレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）Ｃａｓ９タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、真核細胞における発現のためにコドン最適化される。いくつかの実施形態では、真核細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、ヒト細胞である。

【0059】

上記のウイルス粒子のいくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、１つまたはそれ以上の核局在性シグナル（ＮＬＳ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１つまたはそれ以上のＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、ＳＶ４０ラージＴ抗原中のＣ末端配列である。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２６）またはＰＫＫＫＲＫＶＥＤＰＫＫＫＲＫＶＤ（配列番号２７）を含む。

【0060】

上記のウイルス粒子のいくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡおよび／または第２のガイドＲＮＡは、トランス活性化ｃｒ（ｔｒａｃｒ）配列と融合されている。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒ配列は、配列番号２５によってコードされるヌクレオチド配列を含む。

【0061】

上記のウイルス粒子のいくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質をコードする核酸は、真核細胞において発現される。いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡおよび／またはＣａｓタンパク質をコードする核酸は、１つまたはそれ以上の調節制御エレメントと作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡおよび／または第２のガイドＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターと作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、Ｕ６、７ＳＫまたはＨ１プロモーターである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターと作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ＣＭＶプロモーター由来の最小プロモーター断片（ｍｉｎＣＭＶプロモー
ター）、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ＣＫ６プロモーター、トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ－アクチン／ウサギβ－グロビンプロモーター（ＣＡＧ）プロモーター、桿体オプシンプロモーター、錐体オプシンプロモーター、βホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）プロモーター、網膜色素変性症（ＲＰ１）プロモーターまたは光受容体間レチノイド結合タンパク質遺伝子（ＩＲＢＰ）プロモーターである。

【0062】

上記のウイルス粒子のいくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡまたはＣａｓタンパク質のうちの１つまたはそれ以上をコードする核酸は、システムの同一または異なるベクター上に位置する。いくつかの実施形態では、ベクターは、プラスミドである。いくつかの実施形態では、ベクターは、送達システムと複合体形成されている。いくつかの実施形態では、ベクターは、脂質、カチオン性脂質、リポソーム、ポリカチオンまたは核酸の細胞取り込みを増強する物質と複合体形成されている。

【0063】

上記のウイルス粒子のいくつかの実施形態では、ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター、組換えアデノウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクターまたは組換え単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、組換えアデノウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型２、１、５、６、１９、３、１１、７、１４、１６、２１、１２、１８、３１、８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２４～３０、３７、４０、４１、ＡｄＨｕ２、ＡｄＨｕ３、ＡｄＨｕ４、ＡｄＨｕ２４、ＡｄＨｕ２６、ＡｄＨｕ３４、ＡｄＨｕ３５、ＡｄＨｕ３６、ＡｄＨｕ３７、ＡｄＨｕ４１、ＡｄＨｕ４８、ＡｄＨｕ４９、ＡｄＨｕ５０、ＡｄＣ６、ＡｄＣ７、ＡｄＣ６９、ウシＡｄ３型、イヌＡｄ２型、ヒツジＡｄまたはブタＡｄ３型に由来する。いくつかの実施形態では、組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型２またはアデノウイルス血清型５の変異体に由来する。いくつかの実施形態では、ウイルス粒子は、組換えアデノウイルスベクターをキャプシド封入する組換えアデノウイルス粒子である。いくつかの実施形態では、組換えアデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型２、１、５、６、１９、３、１１、７、１４、１６、２１、１２、１８、３１、８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２４～３０、３７、４０、４１、ＡｄＨｕ２、ＡｄＨｕ３、ＡｄＨｕ４、ＡｄＨｕ２４、ＡｄＨｕ２６、ＡｄＨｕ３４、ＡｄＨｕ３５、ＡｄＨｕ３６、ＡｄＨｕ３７、ＡｄＨｕ４１、ＡｄＨｕ４８、ＡｄＨｕ４９、ＡｄＨｕ５０、ＡｄＣ６、ＡｄＣ７、ＡｄＣ６９、ウシＡｄ３型、イヌＡｄ２型、ヒツジＡｄまたはブタＡｄ３型に由来するキャプシドを含む。いくつかの実施形態では、組換えアデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型２キャプシドまたはアデノウイルス血清型５キャプシドの変異体を含む。

【0064】

いくつかの実施形態では、ベクターは、組換えレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、組換えレンチウイルスベクターは、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モカラウイルス（Ｍｏｋａｌａ ｖｉｒｕｓ）、狂犬病ウイルス、ＲＤ１１４またはその変異体で偽型化されたレンチウイルスに由来する。いくつかの実施形態では、ウイルス粒子は、組換えレンチウイルスベクターをキャプシド封入する組換えレンチウイルス粒子である。いくつかの実施形態では、組換えレンチウイルス粒子は、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モカラウ
イルス（Ｍｏｋａｌａ ｖｉｒｕｓ）、狂犬病ウイルス、ＲＤ１１４またはその変異体で偽型化されたキャプシドを含む。

【0065】

いくつかの実施形態では、ベクターは、ｒＨＳＶベクターである。いくつかの実施形態では、ｒＨＳＶベクターは、ｒＨＳＶ－１またはｒＨＳＶ－２に由来する。いくつかの実施形態では、ウイルス粒子は、組換えＨＳＶベクターをキャプシド封入する組換えＨＳＶ粒子である。いくつかの実施形態では、組換えＨＳＶ粒子は、ｒＨＳＶ－１粒子またはｒＨＳＶ－２ウイルス粒子である。

【0066】

いくつかの実施形態では、ベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡまたはＣａｓタンパク質のうちの１つまたはそれ以上をコードする核酸は、１つまたはそれ以上のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列が両端に位置する。いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡまたはＣａｓタンパク質のうちの１つまたはそれ以上をコードする核酸は、２つのＡＡＶ ＩＴＲが両端に位置する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶまたはマウスＡＡＶキャプシド血清型ＩＴＲである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲである。いくつかの実施形態では、ベクターは、自己相補的ベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルス粒子は、組換えＡＡＶベクターを含む組換えＡＡＶウイルス粒子である。いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶウイルス粒子は、クレードＡ～Ｆに由来するＡＡＶ血清型キャプシドを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２－７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶまたはマウスＡＡＶキャプシドｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶウイルス粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、同一ＡＡＶ血清型に由来する。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶウイルス粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、異なるＡＡＶ血清型に由来する。いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９および／またはＡＡＶｒｈ１０キャプシドを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９および／またはＡＡＶｒｈ１０キャプシドは、チロシン突然変異またはヘパラン結合突然変異を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む。

【0067】

上記のウイルス粒子のいくつかの実施形態では、ウイルス粒子は、医薬組成物中にある。

【0068】

いくつかの態様では、本発明は、ａ）真核細胞に、ｉ）遺伝子中のイントロンの標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする単一ガイドＲＮＡと、ｉｉ）Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、ｉｉｉ）所望のイントロン突然変異およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の両端に位置する相同性アームを含む相同性組換え修復（ＨＤＲ）鋳型を含む一本鎖オリゴヌクレオチドとを含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸を導入することと、ｂ）遺伝子中に組み込まれた突然変異を含む細胞を単離することとを含む、遺伝子における深部イントロン突然変異と関連する眼の疾患のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを作製するための方法を提供する。

【0069】

いくつかの実施形態では、深部イントロン突然変異は、遺伝子の５’スプライス供与部位の約１～１０，０００ヌクレオチド、約１～１０００ヌクレオチドまたは約１００～１０００ヌクレオチド下流に位置する。いくつかの実施形態では、深部イントロン突然変異は、遺伝子の３’スプライス受容部位の約１～１０，０００ヌクレオチド、約１～１０００ヌクレオチドまたは約１００～１０００ヌクレオチド上流に位置する。いくつかの実施形態では、深部イントロン突然変異は、遺伝子中にスプライス供与部位またはスプライス受容部位を導入する。

【0070】

いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、細胞において発現されたＣａｓタンパク質による一本鎖オリゴヌクレオチドの切断を避けるために突然変異を含む。

【0071】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９タンパク質、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９タンパク質またはトレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）Ｃａｓ９タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、真核細胞における発現のためにコドン最適化される。いくつかの実施形態では、真核細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、眼の細胞である。いくつかの実施形態では、眼の細胞は、網膜細胞である。

【0072】

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、１つまたはそれ以上の核局在性シグナル（ＮＬＳ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１つまたはそれ以上のＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、ＳＶ４０ラージＴ抗原中のＣ末端配列である。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２６）またはＰＫＫＫＲＫＶＥＤＰＫＫＫＲＫＶＤ（配列番号２７）を含む。

【0073】

いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡおよび／または第２のガイドＲＮＡは、トランス活性化ｃｒ（ｔｒａｃｒ）配列と融合されている。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒ配列は、配列番号２５によってコードされるヌクレオチド配列を含む。

【0074】

いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質をコードする核酸は、真核細胞において発現される。いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡおよび／またはＣａｓタンパク質をコードする核酸は、１つまたはそれ以上の調節制御エレメントと作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡおよび／または第２のガイドＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターと作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、Ｕ６、７ＳＫまたはＨ１プロモーターである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターと作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ＣＭＶプロモーター由来の最小プロモーター断片（ｍｉｎＣＭＶプロモーター）、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ＣＫ６プロモーター、トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、テロメラー
ゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ－アクチン／ウサギβ－グロビンプロモーター（ＣＡＧ）プロモーター、桿体オプシンプロモーター、錐体オプシンプロモーター、βホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）プロモーター、網膜色素変性症（ＲＰ１）プロモーターまたは光受容体間レチノイド結合タンパク質遺伝子（ＩＲＢＰ）プロモーターである。

【0075】

いくつかの実施形態では、単一ガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質または一本鎖オリゴヌクレオチドのうちの１つまたはそれ以上をコードする核酸は、システムの同一または異なるベクター上に位置する。

【0076】

いくつかの実施形態では、眼の疾患は、レーバー先天黒内障、視神経萎縮症、網膜色素変性症、網膜芽細胞腫、シュタルガルト病、アッシャー症候群またはＸ連鎖網膜色素変性症である。いくつかの実施形態では、深部イントロン突然変異は、表２に示される深部イントロン突然変異である。いくつかの実施形態では、ウイルス粒子は、レーバー先天黒内障、視神経萎縮症、網膜色素変性症、網膜芽細胞腫、シュタルガルト病、アッシャー症候群またはＸ連鎖網膜色素変性症を治療するために使用される。

【0077】

いくつかの実施形態では、眼の疾患は、レーバー先天黒内障である。いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡガイド配列は、中心体タンパク質２９０ｋＤａ（ＣＥＰ２９０）遺伝子の深部イントロン突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、深部イントロン突然変異は、ｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ突然変異である。いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡは、配列番号４１（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号４５（ＳａＣａｓ９の）、配列番号４６（ＳａＣａｓ９の）または配列番号４７（ＳａＣａｓ９の）の配列を含むＤＮＡによってコードされる。いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡは、配列番号１９（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号５０（ＳａＣａｓ９の）、配列番号５１（ＳａＣａｓ９の）または配列番号５２（ＳａＣａｓ９の）の配列を含むＤＮＡによってコードされる。いくつかの実施形態では、第２のガイドＲＮＡは、配列番号４２（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号４３（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号４４（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号４８（ＳａＣａｓ９の）または配列番号４９（ＳａＣａｓ９の）の配列を含むＤＮＡによってコードされる。いくつかの実施形態では、第２のガイドＲＮＡは、配列番号２０（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号２１（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号２２（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号５３（ＳａＣａｓ９の）または配列番号５４（ＳａＣａｓ９の）の配列を含むＤＮＡによってコードされる。いくつかの実施形態では、ＣＥＰ２９０は、ヒトＣＥＰ２９０である。いくつかの実施形態では、ＣＥＰ２９０は、配列番号２３に示される配列の深部イントロン突然変異を含む。

【0078】

いくつかの態様では、本発明は、細胞において標的核酸を切断するための方法であって、該方法が、細胞に、ａ）突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡを含む、遺伝子操作された、天然に存在しないＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）システムをコードする核酸と、ｂ）ｉ）Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびｉｉ）第１のガイドＲＮＡまたは第２のガイドＲＮＡがハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡ標的部位を含むＣａｓ発現カセットとを含む組成物の有効量を送達することを含み、該Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ発現カセットから発現され、Ｃａｓタンパク質は、突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列を切断し、それによって、突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出し、Ｃａｓタンパク質は、第１のガイドＲＮＡ標的部位でＣａｓ発現カセットを切断し、それによって、Ｃａｓ発現カセットの切断前のＣａｓタンパク質の発現と比較して、Ｃａｓタンパク質の発現を低
減する方法を提供する。いくつかの態様では、本発明は、個体の核酸における突然変異と関連する疾患または障害を治療するための方法であって、該方法が、ａ）突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡを含む、遺伝子操作された、天然に存在しないＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）システムをコードする核酸と、ｂ）ｉ）Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびｉｉ）第１のガイドＲＮＡまたは第２のガイドＲＮＡがハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡ標的部位を含むＣａｓ発現カセットとを含む組成物の治療有効量を個体に投与することを含み、該Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ発現カセットから発現され、該Ｃａｓタンパク質が、突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列を切断し、それによって、突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出し、該Ｃａｓタンパク質が、第１のガイドＲＮＡ標的部位でＣａｓ発現カセットを切断し、それによって、Ｃａｓ発現カセットの切断前のＣａｓタンパク質の発現と比較して、Ｃａｓタンパク質の発現を低減する方法を提供する。いくつかの態様では、本発明は、個体の核酸における突然変異と関連する眼の疾患または障害を治療するための方法であって、該方法が、ａ）突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡを含む、遺伝子操作された、天然に存在しないＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）システムをコードする核酸と、ｂ）ｉ）Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびｉｉ）第１のガイドＲＮＡまたは第２のガイドＲＮＡがハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡ標的部位を含むＣａｓ発現カセットとを含む組成物の治療有効量を個体に投与することを含み、該Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ発現カセットから発現され、該Ｃａｓタンパク質が、突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列を切断し、それによって、突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出し、該Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ発現カセットを、第１のガイドＲＮＡ標的部位で切断し、それによって、Ｃａｓ発現カセットの切断前のＣａｓタンパク質の発現と比較して、Ｃａｓタンパク質の発現を低減する方法を提供する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ発現カセットは、ｉｉｉ）第１のガイドＲＮＡまたは第２のガイドＲＮＡがハイブリダイズする第２のガイドＲＮＡ標的部位をさらに含み、Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ発現カセットを、第１および第２のガイドＲＮＡ標的部位で切断し、それによって、Ｃａｓ発現カセットの切断前のＣａｓタンパク質の発現と比較して、Ｃａｓタンパク質の発現を低減する。

【0079】

上記の方法のいくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡは、第１のガイドＲＮＡ標的部位および第２のガイドＲＮＡ標的部位とハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、第２のガイドＲＮＡは、第１のガイドＲＮＡ標的部位および第２のガイドＲＮＡ標的部位とハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡは、第１のガイドＲＮＡ標的部位とハイブリダイズし、第２のガイドＲＮＡは、第２のガイドＲＮＡ標的部位とハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ発現カセットは、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結されているポリアデニル化（ポリＡ）配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリＡ配列は、ＳＶ４０ポリＡ配列である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質による第１または第２のガイドＲＮＡ標的部位の切断は、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびポリＡ配列の間の作動可能な連結を妨げる。いくつかの実施形態では、第１または第２のガイドＲＮＡ標的部位は、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびポリＡ配列の間にある。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、Ｃａｓ発現カセットから発現されるＣａｓタンパク質が、１つまたはそれ以上のＮＬＳとインフレームで融合されるように、１つまたはそれ以上の核局在性シグナル（ＮＬＳ）をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、１
つまたはそれ以上のＮＬＳをコードするヌクレオチド配列は、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびポリアデニル化（ポリＡ）配列の間にある。いくつかの実施形態では、第１または第２のガイドＲＮＡ標的部位は、１つまたはそれ以上のＮＬＳをコードするヌクレオチド配列およびポリＡ配列の間にある。いくつかの実施形態では、１つまたはそれ以上のＮＬＳは、ＳＶ４０ラージＴ抗原中のＣ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、１つまたはそれ以上のＮＬＳは、配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２６）またはＰＫＫＫＲＫＶＥＤＰＫＫＫＲＫＶＤ（配列番号２７）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸および／またはＣａｓ発現カセットは、１つまたはそれ以上の調節制御エレメントと作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、プロモーターと作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質による第１または第２のガイドＲＮＡ標的部位の切断は、調節制御エレメントおよびＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列の間の作動可能な連結を妨げる。いくつかの実施形態では、第１または第２のガイドＲＮＡ標的部位は、プロモーターおよびＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列の間にある。

【0080】

上記の方法のいくつかの実施形態では、Ｃａｓ発現カセットは、ｉｉｉ）第１のガイドＲＮＡまたは第２のガイドＲＮＡがハイブリダイズする第２のガイドＲＮＡ標的部位であって、Ｃａｓタンパク質に特異的なプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と隣接する、第２のガイドＲＮＡ標的部位をさらに含み、Ｃａｓタンパク質による第１のガイドＲＮＡ標的部位の切断が、調節制御エレメントおよびＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列の間の作動可能な連結を妨げ、Ｃａｓタンパク質による第２のガイドＲＮＡ標的部位の切断が、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびポリＡ配列の間の作動可能な連結を妨げ、Ｃａｓタンパク質の発現および標的ＤＮＡ配列の切断の際に、Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ発現カセットを、第１および第２のガイドＲＮＡ標的部位で切断し、それによって、Ｃａｓ発現カセットの切断前のＣａｓタンパク質の発現と比較して、Ｃａｓタンパク質の発現を低減する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ発現カセットは、ｉｉｉ）第１のガイドＲＮＡまたは第２のガイドＲＮＡがハイブリダイズする、第２のガイドＲＮＡ標的部位をさらに含み、第１のガイドＲＮＡ標的部位は、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結されているプロモーターの間にあり、第２のガイドＲＮＡ標的部位は、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結されているポリＡ配列の間にあり、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ発現カセットを、第１および第２のガイドＲＮＡ標的部位で切断し、それによって、Ｃａｓ発現カセットの切断前のＣａｓタンパク質の発現と比較して、Ｃａｓタンパク質の発現を低減する。

【0081】

上記の方法のいくつかの実施形態では、深部イントロン突然変異と関連する疾患または障害は、無フィブリノーゲン血症、アルポート症候群、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、常染色体劣性多発性嚢胞腎、バース症候群、βサラセミア、先天性無フィブリノーゲン血症、先天性白内障・顔貌異常・ニューロパチー症候群、先天性グリコシル化異常症Ｉａ型、先天性グリコシル化異常症ＩＩ型、嚢胞性線維症、ジヒドロプテリジンレダクターゼ欠乏症、ファブリー病、急性骨髄性白血病を伴う家族性血小板異常症、ファンコニ貧血、ギテルマン症候群、成長ホルモン不応症、フリードライヒ運動失調症、血友病Ａ、遺伝性巨赤芽球性貧血１、ヘルマンスキー・パドラック症候群、ホモシスチン尿症、メープルシロップ尿症、マルファン症候群、メチオニンシンターゼ欠乏症、メチルマロン酸血症、ミトコンドリア三機能タンパク質欠乏症、ムコ多糖症ＩＩ型、マルチミニコア病、筋ジストロフィー、神経線維腫症Ｉ型、ニーマン・ピック病Ｃ型、眼白子症Ｉ型、オルニチンデルタアミノトランスフェラーゼ欠損症、全身性エリテマトーデスの素因、プロピオン酸血症、ラブドイド腫瘍、シュワルツ・ヤンペル症候群、スティックラー症候群
、全身性エリテマトーデス、結節性硬化症、ウェルナー症候群、Ｘ連鎖高免疫グロブリンＭ血症またはＸ連鎖低リン酸血症である。いくつかの実施形態では、深部イントロン突然変異は、表１に示される深部イントロン突然変異である。

【0082】

いくつかの態様では、本発明は、個体の遺伝子における深部イントロン突然変異と関連する眼の疾患または障害を治療するための組成物であって、該組成物が、ａ）深部イントロン突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡと、ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む、遺伝子操作された、天然に存在しないＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）システムをコードする核酸を含み、該Ｃａｓタンパク質が、深部イントロン突然変異の両端に位置する部位で標的ＤＮＡ分子を切断し、それによって、深部イントロン突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出す組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、個体の遺伝子における深部イントロン突然変異と関連する眼の疾患または障害を治療するための組成物であって、該組成物が、ａ）深部イントロン突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡと、ｂ）Ｃａｓタンパク質とを含む、遺伝子操作された、天然に存在しないＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）システムを含み、該Ｃａｓタンパク質が、深部イントロン突然変異の両端に位置する部位で標的ＤＮＡ分子を切断し、それによって、深部イントロン突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出す組成物を提供する。いくつかの実施形態では、眼の疾患は、レーバー先天黒内障、視神経萎縮症、網膜色素変性症、網膜芽細胞腫、シュタルガルト病、アッシャー症候群またはＸ連鎖網膜色素変性症である。いくつかの実施形態では、深部イントロン突然変異は、表２に示される深部イントロン突然変異である。

【0083】

上記の実施形態のいくつかの実施形態では、眼の疾患は、レーバー先天黒内障である。いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡガイド配列は、中心体タンパク質２９０ｋＤａ（ＣＥＰ２９０）遺伝子の深部イントロン突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、深部イントロン突然変異は、ｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ突然変異である。いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡは、配列番号４１（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号４５（ＳａＣａｓ９の）、配列番号４６（ＳａＣａｓ９の）または配列番号４７（ＳａＣａｓ９の）の配列を含むＤＮＡによってコードされる。いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡは、配列番号１９（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号５０（ＳａＣａｓ９の）、配列番号５１（ＳａＣａｓ９の）または配列番号５２（ＳａＣａｓ９の）の配列を含むＤＮＡによってコードされる。いくつかの実施形態では、第２のガイドＲＮＡは、配列番号４２（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号４３（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号４４（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号４８（ＳａＣａｓ９の）または配列番号４９（ＳａＣａｓ９の）の配列を含むＤＮＡによってコードされる。いくつかの実施形態では、第２のガイドＲＮＡは、配列番号２０（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号２１（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号２２（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号５３（ＳａＣａｓ９の）または配列番号５４（ＳａＣａｓ９の）の配列を含むＤＮＡによってコードされる。いくつかの実施形態では、ＣＥＰ２９０は、ヒトＣＥＰ２９０である。いくつかの実施形態では、ＣＥＰ２９０は、配列番号２３に示される配列の深部イントロン突然変異を含む。

【0084】

上記の実施形態のいくつかの実施形態では、深部イントロン突然変異は、遺伝子の５’スプライス供与部位の約１～１０，０００ヌクレオチド、約１～１０００ヌクレオチドまたは約１００～１０００ヌクレオチド下流に位置する。いくつかの実施形態では、深部イ
ントロン突然変異は、遺伝子の３’スプライス受容部位の約１～１０，０００ヌクレオチド、約１～１０００ヌクレオチドまたは約１００～１０００ヌクレオチド上流に位置する。いくつかの実施形態では、深部イントロン突然変異は、遺伝子中にスプライス供与部位またはスプライス受容部位を導入する。

【0085】

上記の実施形態のいくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質（配列番号４０）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９タンパク質（配列番号５５）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９タンパク質、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９タンパク質またはトレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）Ｃａｓ９タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、真核細胞における発現のためにコドン最適化される。いくつかの実施形態では、真核細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、ヒト細胞である。

【0086】

上記の実施形態のいくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡおよび／または第２のガイドＲＮＡは、トランス活性化ｃｒ（ｔｒａｃｒ）配列と融合されている。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒ配列は、配列番号２５によってコードされるヌクレオチド配列を含む。

【0087】

上記の実施形態のいくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム（例えば、第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質）は、脂質、カチオン性脂質、リポソーム、ポリカチオンまたは核酸および／もしくはタンパク質の細胞取り込みを増強する物質と複合体形成されている。

【0088】

上記の実施形態のいくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質をコードする核酸は、真核細胞において発現される。いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡおよび／またはＣａｓタンパク質をコードする核酸は、１つまたはそれ以上の調節制御エレメントと作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡおよび／または第２のガイドＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターと作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、Ｕ６、７ＳＫまたはＨ１プロモーターである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターと作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ＣＭＶプロモーター由来の最小プロモーター断片（ｍｉｎＣＭＶプロモーター）、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ＣＫ６プロモーター、トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ－アクチン／ウサギβ－グロビンプロモーター（ＣＡＧ）プロモーター、桿体オプシンプロモーター、錐体オプシンプロモーター、βホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）プロモーター、網膜色素変性症（ＲＰ１）プロモーターまたは光受容体間レチノイド結合タンパク質遺伝子（ＩＲＢＰ）プロモーターである。

【0089】

上記の実施形態のいくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡ
またはＣａｓタンパク質のうちの１つまたはそれ以上をコードする核酸は、システムの同一または異なるベクター上に位置する。いくつかの実施形態では、ベクターは、プラスミドである。いくつかの実施形態では、ベクターは、送達システムと複合体形成されている。いくつかの実施形態では、ベクターは、脂質、カチオン性脂質、リポソーム、ポリカチオンまたは核酸の細胞取り込みを増強する物質と複合体形成されている。

【0090】

上記の実施形態のいくつかの実施形態では、ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター、組換えアデノウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクターまたは組換え単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、組換えアデノウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型２、１、５、６、１９、３、１１、７、１４、１６、２１、１２、１８、３１、８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２４～３０、３７、４０、４１、ＡｄＨｕ２、ＡｄＨｕ３、ＡｄＨｕ４、ＡｄＨｕ２４、ＡｄＨｕ２６、ＡｄＨｕ３４、ＡｄＨｕ３５、ＡｄＨｕ３６、ＡｄＨｕ３７、ＡｄＨｕ４１、ＡｄＨｕ４８、ＡｄＨｕ４９、ＡｄＨｕ５０、ＡｄＣ６、ＡｄＣ７、ＡｄＣ６９、ウシＡｄ３型、イヌＡｄ２型、ヒツジＡｄまたはブタＡｄ３型に由来する。いくつかの実施形態では、組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型２またはアデノウイルス血清型５の変異体に由来する。

【0091】

いくつかの実施形態では、ベクターは、組換えレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、組換えレンチウイルスベクターは、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モカラウイルス（Ｍｏｋａｌａ ｖｉｒｕｓ）、狂犬病ウイルス、ＲＤ１１４またはその変異体で偽型化されたレンチウイルスに由来する。

【0092】

いくつかの実施形態では、ベクターは、ｒＨＳＶベクターである。いくつかの実施形態では、ｒＨＳＶベクターは、ｒＨＳＶ－１またはｒＨＳＶ－２に由来する。

【0093】

いくつかの実施形態では、ベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡまたはＣａｓタンパク質のうちの１つまたはそれ以上をコードする核酸は、１つまたはそれ以上のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列がその両端に位置する。いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡまたはＣａｓタンパク質のうちの１つまたはそれ以上をコードする核酸は、２つのＡＡＶ ＩＴＲがその両端に位置する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶまたはマウスＡＡＶキャプシド血清型ＩＴＲである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲである。いくつかの実施形態では、ベクターは、自己相補的ベクターである。

【0094】

いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルス粒子中にキャプシド封入されている。いくつかの実施形態では、ウイルス粒子は、組換えアデノウイルスベクターをキャプシド封入する組換えアデノウイルス粒子である。いくつかの実施形態では、組換えアデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型２、１、５、６、１９、３、１１、７、１４、１６、２１、１２、１８、３１、８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２４～３０、３７、４０、４１、ＡｄＨｕ２、ＡｄＨｕ３、ＡｄＨｕ４、ＡｄＨｕ２４、ＡｄＨｕ２６、ＡｄＨｕ３４、ＡｄＨｕ３５、ＡｄＨｕ３６、ＡｄＨｕ３７、ＡｄＨｕ４１、ＡｄＨｕ４８、ＡｄＨｕ４９、ＡｄＨｕ５０、ＡｄＣ６、ＡｄＣ７、ＡｄＣ６９、ウシＡｄ３型、イヌＡｄ２型、ヒツジＡｄまたはブタＡｄ３型に由来するキャプシドを含む
。いくつかの実施形態では、組換えアデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型２キャプシドまたはアデノウイルス血清型５キャプシドの変異体を含む。

【0095】

いくつかの実施形態では、ウイルス粒子は、組換えレンチウイルスベクターをキャプシド封入する組換えレンチウイルス粒子である。いくつかの実施形態では、組換えレンチウイルス粒子は、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モカラウイルス（Ｍｏｋａｌａ ｖｉｒｕｓ）、狂犬病ウイルス、ＲＤ１１４またはその変異体で偽型化されたキャプシドを含む。

【0096】

いくつかの実施形態では、ウイルス粒子は、組換えＨＳＶベクターをキャプシド封入する組換えＨＳＶ粒子である。いくつかの実施形態では、組換えＨＳＶ粒子は、ｒＨＳＶ－１粒子またはｒＨＳＶ－２ウイルス粒子である。

【0097】

いくつかの実施形態では、ウイルス粒子は、組換えＡＡＶベクターを含む組換えＡＡＶウイルス粒子である。いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶウイルス粒子は、クレードＡ～Ｆに由来するＡＡＶ血清型キャプシドを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２－７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶまたはマウスＡＡＶキャプシドｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶウイルス粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、同一ＡＡＶ血清型に由来する。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶウイルス粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、異なるＡＡＶ血清型に由来する。いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、および／またはＡＡＶｒｈ１０キャプシドを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９および／またはＡＡＶｒｈ１０キャプシドは、チロシン突然変異またはヘパラン結合突然変異を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む。

【0098】

いくつかの態様では、本発明は、細胞において標的核酸を切断するための組成物であって、該組成物が、ａ）突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドを含む、遺伝子操作された、天然に存在しないＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）システムをコードする核酸と、ｂ）ｉ）Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびｉｉ）第１のガイドＲＮＡまたは第２のガイドＲＮＡがハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡ標的部位を含むＣａｓ発現カセットとを含み、該Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ発現カセットから発現され、該Ｃａｓタンパク質が、突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列を切断し、それによって、突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出し、該Ｃａｓタンパク質が、第１のガイドＲＮＡ標的部位でＣａｓ発現カセットを切断し、それによって、Ｃａｓ発現カセットの切断前のＣａｓタンパク質の発現と比較して、Ｃａｓタンパク質の発現を低減する組成物を提供する。いくつかの態様では、本発明は、個体の核酸における突然変異と関連する疾患または障害を治療するための組成物であって、該組成物が、ａ）突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡを含む、遺伝子操作された、天然に存在しないＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩ
ＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）システムをコードする核酸と、ｂ）ｉ）Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびｉｉ）第１のガイドＲＮＡまたは第２のガイドＲＮＡがハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡ標的部位を含むＣａｓ発現カセットとを含み、該Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ発現カセットから発現され、該Ｃａｓタンパク質が、突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列を切断し、それによって、突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出し、該Ｃａｓタンパク質が、第１のガイドＲＮＡ標的部位でＣａｓ発現カセットを切断し、それによって、Ｃａｓ発現カセットの切断前のＣａｓタンパク質の発現と比較して、Ｃａｓタンパク質の発現を低減する組成物を提供する。いくつかの態様では、本発明は、個体の核酸における突然変異と関連する眼の疾患または障害を治療するための組成物であって、該組成物が、ａ）突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡを含む、遺伝子操作された、天然に存在しないＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）システムをコードする核酸と、ｂ）ｉ）Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびｉｉ）第１のガイドＲＮＡまたは第２のガイドＲＮＡがハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡ標的部位を含むＣａｓ発現カセットとを含み、該Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ発現カセットから発現され、該Ｃａｓタンパク質が、突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列を切断し、それによって、突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出し、該Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ発現カセットを、第１のガイドＲＮＡ標的部位で切断し、それによって、Ｃａｓ発現カセットの切断前のＣａｓタンパク質の発現と比較して、Ｃａｓタンパク質の発現を低減する組成物を提供する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ発現カセットは、ｉｉｉ）第１のガイドＲＮＡまたは第２のガイドＲＮＡがハイブリダイズする第２のガイドＲＮＡ標的部位をさらに含み、Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ発現カセットを、第１および第２のガイドＲＮＡ標的部位で切断し、それによって、Ｃａｓ発現カセットの切断前のＣａｓタンパク質の発現と比較して、Ｃａｓタンパク質の発現を低減する。

【0099】

上記の組成物のいくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡは、第１のガイドＲＮＡ標的部位および第２のガイドＲＮＡ標的部位とハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、第２のガイドＲＮＡは、第１のガイドＲＮＡ標的部位および第２のガイドＲＮＡ標的部位とハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡは、第１のガイドＲＮＡ標的部位とハイブリダイズし、第２のガイドＲＮＡは、第２のガイドＲＮＡ標的部位とハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ発現カセットは、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結されているポリアデニル化（ポリＡ）配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリＡ配列は、ＳＶ４０ポリＡ配列である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質による第１または第２のガイドＲＮＡ標的部位の切断は、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびポリＡ配列の間の作動可能な連結を妨げる。いくつかの実施形態では、第１または第２のガイドＲＮＡ標的部位は、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびポリＡ配列の間にある。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、Ｃａｓ発現カセットから発現されるＣａｓタンパク質が、１つまたはそれ以上のＮＬＳとインフレームで融合されるように、１つまたはそれ以上の核局在性シグナル（ＮＬＳ）をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、１つまたはそれ以上のＮＬＳをコードするヌクレオチド配列は、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびポリアデニル化（ポリＡ）配列の間にある。いくつかの実施形態では、第１または第２のガイドＲＮＡ標的部位は、１つまたはそれ以上のＮＬＳをコードするヌクレオチド配列およびポリＡ配列の間にある。いくつかの実施形態では、１つまたはそれ以上のＮＬＳは、ＳＶ４０ラージＴ抗原中のＣ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、１つまたはそれ以上のＮＬＳは、配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２６）またはＰＫＫＫＲＫＶＥＤＰＫＫＫＲＫＶＤ（配列番号２７）を含む。いくつかの実施形態
では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸および／またはＣａｓ発現カセットは、１つまたはそれ以上の調節制御エレメントと作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、プロモーターと作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質による第１または第２のガイドＲＮＡ標的部位の切断は、調節制御エレメントおよびＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列の間の作動可能な連結を妨げる。いくつかの実施形態では、第１または第２のガイドＲＮＡ標的部位は、プロモーターおよびＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列の間にある。

【0100】

上記の組成物のいくつかの実施形態では、Ｃａｓ発現カセットは、ｉｉｉ）第１のガイドＲＮＡまたは第２のガイドＲＮＡがハイブリダイズする第２のガイドＲＮＡ標的部位であって、Ｃａｓタンパク質に特異的なプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と隣接する、第２のガイドＲＮＡ標的部位をさらに含み、Ｃａｓタンパク質による第１のガイドＲＮＡ標的部位の切断は、調節制御エレメントおよびＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列の間の作動可能な連結を妨げ、Ｃａｓタンパク質による第２のガイドＲＮＡ標的部位の切断は、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびポリＡ配列の間の作動可能な連結を妨げ、Ｃａｓタンパク質の発現および標的ＤＮＡ配列の切断の際に、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ発現カセットを、第１および第２のガイドＲＮＡ標的部位で切断し、それによって、Ｃａｓ発現カセットの切断前のＣａｓタンパク質の発現と比較して、Ｃａｓタンパク質の発現を低減する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ発現カセットは、ｉｉｉ）第１のガイドＲＮＡまたは第２のガイドＲＮＡがハイブリダイズする第２のガイドＲＮＡ標的部位をさらに含み、第１のガイドＲＮＡ標的部位は、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結されているプロモーターの間にあり、第２のガイドＲＮＡ標的部位は、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結されているポリＡ配列の間にあり、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ発現カセットを、第１および第２のガイドＲＮＡ標的部位で切断し、それによって、Ｃａｓ発現カセットの切断前のＣａｓタンパク質の発現と比較して、Ｃａｓタンパク質の発現を低減する。

【0101】

上記の組成物のいくつかの実施形態では、深部イントロン突然変異と関連する疾患または障害は、無フィブリノーゲン血症、アルポート症候群、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、常染色体劣性多発性嚢胞腎、バース症候群、βサラセミア、先天性無フィブリノーゲン血症、先天性白内障・顔貌異常・ニューロパチー症候群、先天性グリコシル化異常症Ｉａ型、先天性グリコシル化異常症ＩＩ型、嚢胞性線維症、ジヒドロプテリジンレダクターゼ欠乏症、ファブリー病、急性骨髄性白血病を伴う家族性血小板異常症、ファンコニ貧血、ギテルマン症候群、成長ホルモン不応症、フリードライヒ運動失調症、血友病Ａ、遺伝性巨赤芽球性貧血１、ヘルマンスキー・パドラック症候群、ホモシスチン尿症、メープルシロップ尿症、マルファン症候群、メチオニンシンターゼ欠乏症、メチルマロン酸血症、ミトコンドリア三機能タンパク質欠乏症、ムコ多糖症ＩＩ型、マルチミニコア病、筋ジストロフィー、神経線維腫症Ｉ型、ニーマン・ピック病Ｃ型、眼白子症Ｉ型、オルニチンデルタアミノトランスフェラーゼ欠損症、全身性エリテマトーデスの素因、プロピオン酸血症、ラブドイド腫瘍、シュワルツ・ヤンペル症候群、スティックラー症候群、全身性エリテマトーデス、結節性硬化症、ウェルナー症候群、Ｘ連鎖高免疫グロブリンＭ血症またはＸ連鎖低リン酸血症である。いくつかの実施形態では、深部イントロン突然変異は、表１に示される深部イントロン突然変異である。

【0102】

いくつかの態様では、本発明は、個体の遺伝子における深部イントロン突然変異と関連する眼の疾患または障害を治療するための組成物であって、該組成物が、ａ）深部イントロン突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする、第１のガイ
ドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡと、ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む、遺伝子操作された、天然に存在しないＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）システムをコードする核酸を含み、該Ｃａｓタンパク質が、深部イントロン突然変異の両端に位置する部位で標的ＤＮＡ分子を切断し、それによって、深部イントロン突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出す組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、個体の遺伝子における深部イントロン突然変異と関連する眼の疾患または障害を治療するための組成物であって、ａ）深部イントロン突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡと、ｂ）Ｃａｓタンパク質とを含む、遺伝子操作された、天然に存在しないＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）システムを含み、該Ｃａｓタンパク質が、深部イントロン突然変異の両端に位置する部位で標的ＤＮＡ分子を切断し、それによって、深部イントロン突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出す組成物を提供する。いくつかの実施形態では、眼の疾患は、レーバー先天黒内障、視神経萎縮症、網膜色素変性症、網膜芽細胞腫、シュタルガルト病、アッシャー症候群またはＸ連鎖網膜色素変性症である。いくつかの実施形態では、深部イントロン突然変異は、表２に示される深部イントロン突然変異である。

【0103】

上記の組成物のいくつかの実施形態では、眼の疾患は、レーバー先天黒内障である。いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡガイド配列は、中心体タンパク質２９０ｋＤａ（ＣＥＰ２９０）遺伝子の深部イントロン突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、深部イントロン突然変異は、ｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ突然変異である。いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡは、配列番号４１（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号４５（ＳａＣａｓ９の）、配列番号４６（ＳａＣａｓ９の）または配列番号４７（ＳａＣａｓ９の）の配列を含むＤＮＡによってコードされる。いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡは、配列番号１９（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号５０（ＳａＣａｓ９の）、配列番号５１（ＳａＣａｓ９の）または配列番号５２（ＳａＣａｓ９の）の配列を含むＤＮＡによってコードされる。いくつかの実施形態では、第２のガイドＲＮＡは、配列番号４２（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号４３（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号４４（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号４８（ＳａＣａｓ９の）または配列番号４９（ＳａＣａｓ９の）の配列を含むＤＮＡによってコードされる。いくつかの実施形態では、第２のガイドＲＮＡは、配列番号２０（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号２１（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号２２（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号５３（ＳａＣａｓ９の）または配列番号５４（ＳａＣａｓ９の）の配列を含むＤＮＡによってコードされる。いくつかの実施形態では、ＣＥＰ２９０は、ヒトＣＥＰ２９０である。いくつかの実施形態では、ＣＥＰ２９０は、配列番号２３に示される配列の深部イントロン突然変異を含む。

【0104】

上記の組成物のいくつかの実施形態では、深部イントロン突然変異は、遺伝子の５’スプライス供与部位の約１～１０，０００ヌクレオチド、約１～１０００ヌクレオチドまたは約１００～１０００ヌクレオチド下流に位置する。いくつかの実施形態では、深部イントロン突然変異は、遺伝子の３’スプライス受容部位の約１～１０，０００ヌクレオチド、約１～１０００ヌクレオチドまたは約１００～１０００ヌクレオチド上流に位置する。いくつかの実施形態では、深部イントロン突然変異は、遺伝子中にスプライス供与部位またはスプライス受容部位を導入する。

【0105】

上記の組成物のいくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質（配列番号４０）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９タンパク質（配列番号５５）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９タンパク質、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９タンパク質またはトレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）Ｃａｓ９タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、真核細胞における発現のためにコドン最適化される。いくつかの実施形態では、真核細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、ヒト細胞である。

【0106】

上記の組成物のいくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡおよび／または第２のガイドＲＮＡは、トランス活性化ｃｒ（ｔｒａｃｒ）配列と融合されている。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒ配列は、配列番号２５によってコードされるヌクレオチド配列を含む。

【0107】

上記の組成物のいくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム（例えば、第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質）は、脂質、カチオン性脂質、リポソーム、ポリカチオンまたは核酸および／もしくはタンパク質の細胞取り込みを増強する物質と複合体形成されている。

【0108】

上記の組成物のいくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質をコードする核酸は、真核細胞において発現される。いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡおよび／またはＣａｓタンパク質をコードする核酸は、１つまたはそれ以上の調節制御エレメントと作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡおよび／または第２のガイドＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターと作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、Ｕ６、７ＳＫまたはＨ１プロモーターである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターと作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ＣＭＶプロモーター由来の最小プロモーター断片（ｍｉｎＣＭＶプロモーター）、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ＣＫ６プロモーター、トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ－アクチン／ウサギβ－グロビンプロモーター（ＣＡＧ）プロモーター、桿体オプシンプロモーター、錐体オプシンプロモーター、βホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）プロモーター、網膜色素変性症（ＲＰ１）プロモーターまたは光受容体間レチノイド結合タンパク質遺伝子（ＩＲＢＰ）プロモーターである。

【0109】

上記の組成物のいくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡまたはＣａｓタンパク質のうちの１つまたはそれ以上をコードする核酸は、システムの同一または異なるベクター上に位置する。いくつかの実施形態では、ベクターは、プラスミドである。いくつかの実施形態では、ベクターは、送達システムと複合体形成されている。いくつかの実施形態では、ベクターは、脂質、カチオン性脂質、リポソーム、ポリカチオンまたは核酸の細胞取り込みを増強する物質と複合体形成されている。

【0110】

上記の組成物のいくつかの実施形態では、ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒ
ＡＡＶ）ベクター、組換えアデノウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクターまたは組換え単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、組換えアデノウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型２、１、５、６、１９、３、１１、７、１４、１６、２１、１２、１８、３１、８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２４～３０、３７、４０、４１、ＡｄＨｕ２、ＡｄＨｕ３、ＡｄＨｕ４、ＡｄＨｕ２４、ＡｄＨｕ２６、ＡｄＨｕ３４、ＡｄＨｕ３５、ＡｄＨｕ３６、ＡｄＨｕ３７、ＡｄＨｕ４１、ＡｄＨｕ４８、ＡｄＨｕ４９、ＡｄＨｕ５０、ＡｄＣ６、ＡｄＣ７、ＡｄＣ６９、ウシＡｄ３型、イヌＡｄ２型、ヒツジＡｄまたはブタＡｄ３型に由来する。いくつかの実施形態では、組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型２またはアデノウイルス血清型５の変異体に由来する。

【0111】

いくつかの実施形態では、ベクターは、組換えレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、組換えレンチウイルスベクターは、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モカラウイルス（Ｍｏｋａｌａ ｖｉｒｕｓ）、狂犬病ウイルス、ＲＤ１１４またはその変異体で偽型化されたレンチウイルスに由来する。

【0112】

いくつかの実施形態では、ベクターは、ｒＨＳＶベクターである。いくつかの実施形態では、ｒＨＳＶベクターは、ｒＨＳＶ－１またはｒＨＳＶ－２に由来する。

【0113】

いくつかの実施形態では、ベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡまたはＣａｓタンパク質のうちの１つまたはそれ以上をコードする核酸は、１つまたはそれ以上のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列がその両端に位置する。いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡまたはＣａｓタンパク質のうちの１つまたはそれ以上をコードする核酸は、２つのＡＡＶ ＩＴＲがその両端に位置する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶまたはマウスＡＡＶキャプシド血清型ＩＴＲである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲである。いくつかの実施形態では、ベクターは、自己相補的ベクターである。

【0114】

いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルス粒子中にキャプシド封入されている。いくつかの実施形態では、ウイルス粒子は、組換えアデノウイルスベクターをキャプシド封入する組換えアデノウイルス粒子である。いくつかの実施形態では、組換えアデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型２、１、５、６、１９、３、１１、７、１４、１６、２１、１２、１８、３１、８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２４～３０、３７、４０、４１、ＡｄＨｕ２、ＡｄＨｕ３、ＡｄＨｕ４、ＡｄＨｕ２４、ＡｄＨｕ２６、ＡｄＨｕ３４、ＡｄＨｕ３５、ＡｄＨｕ３６、ＡｄＨｕ３７、ＡｄＨｕ４１、ＡｄＨｕ４８、ＡｄＨｕ４９、ＡｄＨｕ５０、ＡｄＣ６、ＡｄＣ７、ＡｄＣ６９、ウシＡｄ３型、イヌＡｄ２型、ヒツジＡｄまたはブタＡｄ３型に由来するキャプシドを含む。いくつかの実施形態では、組換えアデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型２キャプシドまたはアデノウイルス血清型５キャプシドの変異体を含む。

【0115】

いくつかの実施形態では、ウイルス粒子は、組換えレンチウイルスベクターをキャプシド封入する組換えレンチウイルス粒子である。いくつかの実施形態では、組換えレンチウイルス粒子は、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モカ
ラウイルス（Ｍｏｋａｌａ ｖｉｒｕｓ）、狂犬病ウイルス、ＲＤ１１４またはその変異体で偽型化されたキャプシドを含む。

【0116】

いくつかの実施形態では、ウイルス粒子は、組換えＨＳＶベクターをキャプシド封入する組換えＨＳＶ粒子である。いくつかの実施形態では、組換えＨＳＶ粒子は、ｒＨＳＶ－１粒子またはｒＨＳＶ－２ウイルス粒子である。

【0117】

いくつかの実施形態では、ウイルス粒子は、組換えＡＡＶベクターを含む組換えＡＡＶウイルス粒子である。いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶウイルス粒子は、クレードＡ～Ｆに由来するＡＡＶ血清型キャプシドを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２－７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶまたはマウスＡＡＶキャプシドｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶウイルス粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、同一ＡＡＶ血清型に由来する。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶウイルス粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、異なるＡＡＶ血清型に由来する。いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、および／またはＡＡＶｒｈ１０キャプシドを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９および／またはＡＡＶｒｈ１０キャプシドは、チロシン突然変異またはヘパラン結合突然変異を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む。

【0118】

特許出願および刊行物を含む、本明細書において引用されるすべての参考文献は、参照によりその全文を組み入れる。

【図面の簡単な説明】

【0119】

【図1】ＣＥＰ２９０遺伝子におけるイントロンｃ．２２９１＋１６５５Ａ＞Ｇ突然変異の模式図である。Ａ＞Ｇ突然変異は、イントロン２６内に位置する潜在性エキソンの５’スプライス部位の＋５位で起こる。ＣＥＰ２９０エキソン２６からエキソン２７領域のエキソン－イントロン構造を、野生型（実線）および突然変異体（破線）の転写物に関するスプライシングパターンと共に、それぞれ、四角および線で表す。突然変異ヌクレオチドを太字および下線で示し、黒い星印で表す。潜在性エキソンの５’スプライス部位配列を、ＢＤＧＰ：ニューラルネットワークによるスプライス部位予測（例えば、ｗｗｗ．ｆｒｕｉｔｆｌｙ．ｏｒｇ／ｓｅｑ＿ｔｏｏｌｓ／ｓｐｌｉｃｅ．ｈｔｍｌ、およびＲｅｅｓｅ，Ｍ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．４：３１１～３２３頁を参照されたい）によって計算したそのスプライス部位の強さスコアと共に示す。エキソンヌクレオチドを大文字で示す。エキソンおよびイントロンのサイズを図の下に注釈する。

【図2】ＣＥＰ２９０のｃ．２２９１＋１６５５Ａ＞Ｇ突然変異の両端に位置するイントロン領域を欠失させる戦略を示す模式図である。上流のｓｇＲＮＡは、イントロン突然変異の上流に位置する第１のＣａｓ９切断を導き、下流のｓｇＲＮＡは、突然変異の下流に位置する第２のＣａｓ９切断を導く。上流の標的座は、潜在性エキソンの上流または潜在性エキソン内のいずれかに位置することができることに注目されたい。２つの切断末端を、非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）プロセスを通して直接ライゲートすると、ｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ突然変異の両端に位置するイントロン断片が欠失される。イントロン２６はさらに、ｍＲＮＡプロセシングの際にＲＮＡスプライシングによって除去される。

【図3】異なる細胞株におけるｍＲＮＡ（図３Ａおよび３Ｂ）およびタンパク質（図３Ｃ）発現レベルを示す。図３Ａおよび３Ｂは、野生型細胞（白色の棒グラフ）、ｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇおよびｃ．２９９１＋１６６６Ｃ＞Ｇ突然変異を有する染色体に関してヘテロ接合である細胞（灰色の棒グラフ）、ならびにホモ接合ｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇおよびｃ．２９９１＋１６６６Ｃ＞Ｇ細胞（突然変異体細胞；黒色の棒グラフ）における、ＲＴ－ｑＰＣＲによって決定した野生型（図３Ａ）および突然変異体（図３Ｂ）ｍＲＮＡの基礎発現レベルのグラフを示す。データは、３回の独立したトランスフェクションからの試料の平均値±標準偏差（ｎ＝３）として表す。一元配置ＡＮＯＶＡの後にテューキーのＨＳＤ事後検定を使用して比較を実施した。^＊＝ｐ＜０．０５、^＊＊＝ｐ＜０．０１、^＊＊＊＝ｐ＜０．００１。図３Ｃは、野生型細胞（ＷＴ）、ヘテロ接合細胞（Ｈｅｔ）、および突然変異体細胞（ＭＴ）から調製したライセートのイムノブロットである。メンブレンを、ＣＥＰ２９０（上）およびローディング対照としてのベータ－アクチン（下）に関してプロービングした。

【図4】ＰＣＲ（図４Ａ）および次世代シークエンシング（図４Ｂ）によって決定した、ｓｇＲＮＡ対およびＳｐＣａｓ９による標的化欠失の効率を示す。図４Ａでは、予想される欠失領域の外側のプライマーを使用した。上のバンドは、野生型ＣＥＰ２９０のイントロン２６から増幅されたＰＣＲ産物であり、下のバンドは、予想されるゲノム欠失後のＣＥＰ２９０対立遺伝子から増幅されたＰＣＲ産物である（それぞれ、「Ｗｔ」および「Ｔｒｕｎｃ」と表示する）。Ｍ、１ｋｂ ＤＮＡラダー。図４Ｂは、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）によって決定した、ｓｇＲＮＡ対およびＳｐＣａｓ９をトランスフェクトした突然変異体細胞におけるＤＮＡの野生型およびトランケート型の百分率を示す。

【図5】ｓｇＲＮＡ対およびＳｐＣａｓ９によるＣＥＰ２９０発現のレスキューを示す。図５Ａおよび５Ｂは、ＲＴ－ｑＰＣＲによって測定した、ｓｇＲＮＡ対およびＳｐＣａｓ９をトランスフェクトした野生型（白色の棒グラフ）、ヘテロ接合（灰色の棒グラフ）、および突然変異体（黒色の棒グラフ）細胞における野生型（図５Ａ）および突然変異体（図５Ｂ）ｍＲＮＡの発現レベルを示す。データを、２回の独立したトランスフェクションからの試料の平均値±標準偏差（ｎ＝２）として表す。一元配置ＡＮＯＶＡの後にテューキーのＨＳＤ事後検定を使用して比較を実施した。^＊＝ｐ＜０．０５、^＊＊＝ｐ＜０．０１。図５Ｃは、ｓｇＲＮＡ対およびＳｐＣａｓ９をトランスフェクトした突然変異体細胞から調製したライセートのイムノブロットである。メンブレンを、ＣＥＰ２９０（上）およびローディング対照としてのベータ－アクチン（下）に関してプロービングした。

【図6-1】自己限定性ＣＲＩＳＰＲ－ＳｐＣａｓ９システムを示す。図６Ａは、自己限定性ＣＲＩＳＰＲ－ＳｐＣａｓ９システムにおいて使用されるｐＡＡＶ－ＳｐＣａｓ９ベクターの模式図である。ＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼの認識配列（ｓｐＲＮＡ標的配列プラスＰＡＭモチーフ）を、挿入部位１（ｍｉｎＣＭＶプロモーターとＳｐＣａｓ９の間）および／または挿入部位２（ＳｐＣａｓ９－ＮＬＳとＳＶ４０ｐＡの間）に組み込む。ＮＬＳ、核局在化シグナル、ＳＶ４０ｐＡ、サルウイルス４０ポリアデニル化シグナル。図６Ｂは、Ｕ１Ｄ３ ｓｇＲＮＡ対を発現する第１のＡＡＶパッケージングプラスミドおよびＳｐＣａｓ９を発現する第２のＡＡＶパッケージングプラスミドをトランスフェクトした突然変異体細胞から調製したライセートのイムノブロットである。ＳｐＣａｓ９プラスミドは、２つの挿入部位においてＵ１ ｓｇＲＮＡ認識配列（Ｕ１Ｔ）および／またはＤ３ ｓｇＲＮＡ認識配列（Ｄ３Ｔ）を含む。Ｕ１Ｄ３プラスミド単独をトランスフェクトした突然変異体細胞を、この場合の対照とした。メンブレンをＳｐＣａｓ９（上）およびローディング対照としてのベータ－アクチン（下）に関してプロービングした。図６Ｃは、ＰＣＲによって決定した、突然変異体細胞にＵ１Ｄ３ ｓｇＲＮＡ対と自己限定性ＳｐＣａｓ９をトランスフェクトした後の標的化欠失を示す。上のバンドは、野生型ＣＥＰ２９０イントロン２６から増幅されたＰＣＲ産物であり、下のバンドは、Ｕ１およびＤ３ ｓｇＲＮＡにより導かれたゲノム欠失後のＣＥＰ２９０対立遺伝子から増幅されたＰＣＲ産物である。Ｍ、１ｋｂ ＤＮＡラダー。図６Ｄおよび６Ｅは、ＲＴ－ｑＰＣＲによって測定した、Ｕ１Ｄ３ ｓｇＲＮＡ対および自己限定性ＳｐＣａｓ９をトランスフェクトした突然変異体細胞における野生型（図６Ｄ）および突然変異体（図６Ｅ）ｍＲＮＡの発現レベルを示す。データは、３回の独立したトランスフェクションからの試料の平均値±標準偏差（ｎ＝３）として表す。一元配置ＡＮＯＶＡの後にテューキーのＨＳＤ事後検定を使用して比較を実施した。Ｕ１Ｄ３ ｓｇＲＮＡ対単独をトランスフェクトした細胞と比較して、^＊＝ｐ＜０．０５、^＊＊＝ｐ＜０．０１、^＊＊＊＝ｐ＜０．００１。

【図6-2】図６－１の続き。

【図7】デュアルＡＡＶシステムによるマウス網膜におけるＣｅｐ２９０遺伝子のイントロン２５における領域の欠失を示す。図７Ａは、網膜下注射に使用したデュアルＡＡＶの模式図である。図７Ｂは、ＰＣＲによって決定した、（１）ＡＡＶ５－ＲＫ－ＥＧＦＰ（対照）、またはＡＡＶ５－Ｕ１１Ｄ１１ ｓｇＲＮＡ対－ＲＫ－ＥＧＦＰおよび（２）ＡＡＶ５－ＳｐＣａｓ９による標的化欠失を示す。上のバンドは、野生型マウスＣｅｐ２９０イントロン２５から増幅されたＰＣＲ産物であり、下のバンドは、Ｕ１１およびＤ１１ ｓｇＲＮＡにより導かれたゲノム欠失後のＣｅｐ２９０対立遺伝子から増幅されたＰＣＲ産物である。Ｍ、１ｋｂ ＤＮＡラダー。

【図8】ＰＣＲ（図８Ａ）およびＲＴ－ｑＰＣＲ（図８Ｂおよび８Ｃ）によって決定した、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）およびＳｐＣａｓ９による標的化欠失を示す。突然変異体細胞に、ＳａＣａｓ９またはＳｐＣａｓ９のいずれかと共に、対になったｓｇＲＮＡ対をトランスフェクトした。ｓｇＲＮＡ対およびＳａＣａｓ９は、１つのＡＡＶパッケージングプラスミドに存在するが、ｓｇＲＮＡ対およびＳｐＣａｓ９は、２つの異なるＡＡＶパッケージングプラスミドに存在することに注意されたい。図８Ａにおいて、上のバンドは野生型ＣＥＰ２９０のイントロン２６から増幅されたＰＣＲ産物であり、下のバンドは、予想されるゲノム欠失後のＣＥＰ２９０対立遺伝子から増幅されたＰＣＲ産物である（それぞれ、「Ｗｔ」および「Ｔｒｕｎｃ」と表示）。Ｍ、１ｋｂ ＤＮＡラダー。図８Ａおよび８Ｂは、ＲＴ－ｑＰＣＲによって測定した、ＳａＣａｓ９（白色の棒グラフ）またはＳｐＣａｓ９（灰色の棒グラフ）のいずれかと共にｓｇＲＮＡ対をトランスフェクトした突然変異体細胞における野生型（図８Ａ）および突然変異体（図８Ｂ）ｍＲＮＡの発現レベルを示す。データは、３回の独立したトランスフェクションからの試料の平均値±標準偏差（ｎ＝３）として表す。一元配置ＡＮＯＶＡの後にテューキーのＨＳＤ事後検定を使用して比較を実施した。^＊＝ｐ＜０．０５、^＊＊＝ｐ＜０．０１、^＊＊＊＝ｐ＜０．００１。ＳａＣａｓ９単独をトランスフェクトした突然変異体細胞と比較して、＃＝ｐ＜０．０５。

【発明を実施するための形態】

【0120】

本発明は、深部イントロン突然変異を編集するための組成物、方法およびウイルス粒子を提供する。いくつかの実施形態では、個体の遺伝子における深部イントロン突然変異と関連する疾患または障害を治療するための組成物は、ａ）深部イントロン突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡと、ｂ）Ｃａｓタンパク質とを含む、遺伝子操作された、天然に存在しないＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）システムを含み、該Ｃａｓタンパク質は、深部イントロン突然変異の両端に位置する部位で標的ＤＮＡ分子を切断し、それによって、深部イントロン突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出す。その他の実施形態では、個体の遺伝子における深部イントロン突然変異と関連する疾患または障害を治療するための組成物は、ａ）深部イントロン突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡと、ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む、遺伝子操作された、天然に存在しないＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）システムをコードする核酸を含み、該Ｃａｓタンパク質は、深部イントロン突然変異の両端
に位置する部位で標的ＤＮＡ分子を切断し、それによって、深部イントロン突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出す。

【0121】

いくつかの態様では、本発明は、眼の疾患を治療するための組成物、方法およびウイルス粒子を提供する。上記のように、ＬＣＡの最も頻繁な遺伝子的原因は、ＣＥＰ２９０遺伝子のイントロン２６中の深部イントロン突然変異ｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇであり、これは、潜在スプライス供与部位を生成し、その結果、ＣＥＰ２９０ ｍＲＮＡの未熟な停止コドン（ｐ．Ｃ９９８Ｘ）を含有する異常なエキソンを含むことになる（図１）。本発明者らは、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）およびＣｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）およびＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）システムの対による、ヒト細胞におけるターゲッティングされたゲノムＤＮＡ欠失によって、ＣＥＰ２９０遺伝子中にイントロン性ｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ突然変異を有するＬＣＡ患者を治療するための簡単で効率的な方法を設計した（図２）。このアプローチは、イントロン性ｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ突然変異を効率的に、永久に欠失させ、ＣＥＰ２９０ ｍＲＮＡ中に挿入された潜在エキソンのスプライシングを防ぎ、一方で、内因性ゲノム調節エレメントは無傷のまま残る。

【0122】

Ｉ．一般技術
本明細書において記載されるか、または参照される技術および手順は、一般的に十分に理解され、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、第４版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、２０１２）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、２００３）；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編、１９９５）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編、１９８８）；Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、第６版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、２０１０）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９８）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、１９９８）；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ、Ｊ．Ｂ．ＧｒｉｆｆｉｔｈｓおよびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ編、Ｊ．ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ、１９９３～８）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９９６）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊ．ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ、２００２）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙら、２００４）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８８～１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．Ｄｅａｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２０００）；Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９９）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ編、Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５）；およびＣａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｖ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａら編、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ、２０１１）において記載される、広く使用される方法論などの従来方法論を使用して当業者によって一般的に使用される。

【0123】

ＩＩ．定義
本明細書において、「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ」は、ガイドＲＮＡおよびＣａｓエンドヌクレアーゼを有する２成分リボヌクレオタンパク質複合体を指す。ＣＲＩＳＰＲは、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ ＩＩ型システムを指す。ＣＲＩＳＰＲは、細菌および古細菌が、外来核酸（例えば、ウイルスまたはプラスミド由来の）を検出し、サイレンシングすることを可能にする適応防御システムとして発見されたが、配列特異的にポリヌクレオチド編集することを可能にするために種々の細胞種における使用のために適応されてきた（例えば、Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．ら（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ 第３３７巻：８１６～８２１頁およびＲａｎ，Ｆ．Ａ．ら（２０１３）Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．第８巻：２２８１～２３０８頁を参照のこと）。ＩＩ型システムでは、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓと相互作用し、Ｃａｓ酵素のヌクレアーゼ活性を、ガイドＲＮＡガイド配列と同一の標的ＤＮＡ配列に向ける。ガイドＲＮＡは、標的配列の逆鎖と塩基対形成する。次いで、Ｃａｓヌクレアーゼ活性は、標的ＤＮＡにおいて二本鎖切断を生成する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。

【0124】

本明細書において、「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ単一ガイドＲＮＡ」（用語「単一ガイドＲＮＡ」および「ｓｇＲＮＡ」は、本明細書において同義的に使用することができる）は、標的ＤＮＡのＣａｓ媒介性切断を導くことができる単一ＲＮＡ種を指す。いくつかの実施形態では、単一ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）ヌクレアーゼ活性に必要な配列および目的の標的ＤＮＡと同一のガイド配列を含有し得る。

【0125】

用語「キメラＲＮＡ」、「キメラガイドＲＮＡ」、「ガイドＲＮＡ」、「単一ガイドＲＮＡ」および「合成ガイドＲＮＡ」は、本明細書において同義的に使用され得、ガイド配列、ｔｒａｃｒ配列およびｔｒａｃｒメイト配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。用語「ガイド配列」は、本明細書において、標的部位を特定するガイドＲＮＡ内の約２０ｂｐの配列を指し、用語「ガイド」または「スペーサー」または「プロトスペーサー」と同義的に使用することができる。用語「ｔｒａｃｒメイト配列」はまた、用語「ダイレクトリピート」と同義的に使用することができる。

【0126】

本明細書において、「ｓｇＲＮＡガイド配列」は、標的ＤＮＡ配列の逆鎖と結合し、Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）ヌクレアーゼ活性をその遺伝子座に向けるｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列を指し得る。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡガイド配列は、標的配列と同一である。ハイブリダイゼーションを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な類似性があれば、完全同一性は必ずしも必要ではない。ガイド配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドなどの任意のポリヌクレオチドを含み得る。

【0127】

本明細書において、「Ｃａｓ」ポリペプチドは、ガイドＲＮＡ、例えば、ｓｇＲＮＡと複合体形成された場合にヌクレアーゼとして機能するポリペプチドである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓポリペプチドは、Ｃａｓ９ポリペプチド（Ｃｓｎ１としても知られるＣＲＩＳＰＲ関連９）である。Ｃａｓポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）は、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡガイドまたは単一ガイドＲＮＡと結合されると、標的ＤＮＡを、ｓｇＲＮＡガイド配列と同一の、ＰＡＭモチーフと隣接する配列で切断できる。Ｃａｓ９ポリペプチドは、その他のＣａｓポリペプチドとは異なり、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに特徴的である（種々のＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのＣａｓタンパク質の説明については、Ｍａｋａｒｏｖａ，Ｋ．Ｓ．ら（２０１１）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．第９巻（６号）：４６７～７７頁を参照のこと）。本明細書において、「Ｃａｓ」は、特に断りのない限り、ｓｇＲＮＡまたは複合体のポリペプチド成分とのリボヌクレオタンパク質複合体を指し得る。

【0128】

用語「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）」は、本明細書において、標的ＤＮＡ配列に対して切断を導くためにＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムによって使用されるガイド配列を含むＲＮＡを指す。用語「トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）」は、本明細書において、ＤＮＡ切断を媒介するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクター複合体に必要な構造を形成する配列を含むＲＮＡを指す。内因性細菌性および古細菌性ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムでは、エフェクターＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体は、２つのポリリボヌクレオチド分子：ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡと複合体形成されたＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）を含む。ｃｒＲＮＡは、標的認識を媒介する約２０ヌクレオチドのガイド配列およびｔｒａｃｒＲＮＡと二本鎖を形成する配列を含有する。ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖は、Ｃａｓタンパク質と結合し、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクター複合体機能に必要である。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ機能は、標的認識を媒介する配列およびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクター複合体にとって必要な構造を生成する配列の両方を含有する単一ＲＮＡ（単一ガイドＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）によって実施される。

【0129】

用語「深部イントロン突然変異」は、本明細書において、野生型スプライス受容配列およびスプライス供与配列の外側の領域のイントロン配列内の突然変異を指す。いくつかの場合には、深部イントロン突然変異は、関連遺伝子のスプライシングの変更、例えば、成熟ｍＲＮＡ中にイントロン配列を含むことにつながり得る。限定されない例では、深部イントロン突然変異は、エキソンの約１００ｂｐ超下流（すなわち、３’）、エキソンの約１００ｂｐ超上流（すなわち、５’）または第１のエキソンの約１００ｂｐ超下流かつ第２のエキソンの約１００ｂｐ超上流である。

【0130】

用語「レーバー先天黒内障（ＬＣＡ）」は、本明細書において、視力喪失、網膜機能不全および眼振を特徴とする早期発症型障害の群を指す。種々の突然変異が、ＬＣＡと関与しているが、ＬＣＡは、通常、常染色体劣性遺伝疾患として遺伝性である。さらなる説明および例示的ＬＣＡ疾患遺伝子および遺伝子座については、例えば、ＯＭＩＭ Ｅｎｔｒｙ２０４０００を参照のこと。

【0131】

用語「ＣＥＰ２９０」は、本明細書において、ＭＫＳ４、ＣＴ８７、ＰＯＣ３、ｒｄ１６、ＢＢＳ１４、ＬＣＡ１０、ＪＢＴＳ５、ＮＰＨＰ６、ＳＬＳＮ６および３Ｈ１１Ａｇとしても知られる、繊毛形成に関与する中心体タンパク質をコードする遺伝子を指す。ＣＥＰ２９０中の突然変異は、ＬＣＡと関与している。このような突然変異の１つの例として、潜在スプライス供与部位を導入し、その結果、未熟な停止コドンを有する異常なエキソンを含むことになるｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ突然変異がある。例えば、それぞれ、例示的ヒト遺伝子およびタンパク質配列について、ＮＣＢＩ遺伝子番号８０１８４およびＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｏ１５０７８を参照のこと。ＣＥＰ２９０遺伝子のその他の例とし
て、制限するものではないが、マウスＣＥＰ２９０（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子番号２１６２７４）、ラットＣＥＰ２９０（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子番号３１４７８７）、アカゲザルＣＥＰ２９０（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子番号７０８２８６）、ゼブラフィッシュＣＥＰ２９０（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子番号５６０５８８）、イヌＣＥＰ２９０（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子番号４８２５９１）、チンパンジーＣＥＰ２９０（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子番号４５２１１３）、ネコＣＥＰ２９０（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子番号１００１１３４７１）、ニワトリＣＥＰ２９０（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子番号４１７８８７）およびウシＣＥＰ２９０（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子番号２８２７０７）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＣＥＰ２９０遺伝子は、配列番号２３に示される配列の深部イントロン突然変異を含む。

【0132】

「ベクター」は、本明細書において、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏいずれかにおいて宿主細胞中に送達されるべき核酸を含む組換えプラスミドまたはウイルスを指す。

【0133】

用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、本明細書において、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドいずれかの任意の長さのヌクレオチドの多量体型を指す。したがって、この用語は、それだけには限らないが、一本鎖、二本鎖または多重鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドまたはプリンおよびピリミジン塩基もしくはその他の天然、化学もしくは生化学的に修飾された非天然もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを含む。ポリヌクレオチドの主鎖は、糖およびリン酸基（ＲＮＡまたはＤＮＡ中に通常見られるような）または修飾されたもしくは置換された糖またはリン酸基を含み得る。あるいは、ポリヌクレオチドの主鎖は、ホスホロアミド酸などの合成サブユニットのポリマーを含むこともあり得、したがって、オリゴデオキシヌクレオシドホスホルアミダート（Ｐ－ＮＨ_２）または混合ホスホルアミダート－ホスホジエステルオリゴマーであり得る。さらに、二本鎖ポリヌクレオチドは、相補鎖を合成することおよび適当な条件下で鎖をアニーリングすることまたは適当なプライマーととともにＤＮＡポリメラーゼを使用して相補鎖をｄｅ ｎｏｖｏ合成することによって、化学合成の一本鎖ポリヌクレオチド産物から得ることができる。

【0134】

用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すように同義的に使用され、最小の長さに制限されない。アミノ酸残基のこのようなポリマーは、天然または非天然アミノ酸残基を含有し得、それだけには限らないが、ペプチド、オリゴペプチド、アミノ酸残基の二量体、三量体および多量体を含み得る。全長タンパク質およびその断片の両方が、定義によって包含される。用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、シアリル化、アセチル化、リン酸化などを含む。さらに、本発明の目的上、「ポリペプチド」は、タンパク質が、所望の活性を維持する限り、天然配列に対する欠失、付加および置換（一般的に、天然に保存的）などの修飾を含むタンパク質を指す。これらの修飾は、部位特異的突然変異誘発によってのような意図的なものである場合も、ＰＣＲ増幅によるタンパク質またはエラーをもたらす宿主の突然変異による偶発的なものである場合もある。

【0135】

「組換えウイルスベクター」は、１つまたはそれ以上の異種配列（すなわち、ウイルス起源ではない核酸配列）を含む組換えポリヌクレオチドベクターを指す。組換えＡＡＶベクターの場合には、組換え核酸は、少なくとも１つの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）がその両端に位置する。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、２つのＩＴＲがその両端に位置する。

【0136】

「組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶベクター）」は、少なくとも１つのＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）がその両端に位置する１つまたはそれ以上の異種配列（すなわち、
ＡＡＶ起源ではない核酸配列）を含むポリヌクレオチドベクターを指す。このようなｒＡＡＶベクターは、適したヘルパーウイルスに感染しており（または適したヘルパー機能を発現している）ならびにＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物（すなわち、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質）を発現している宿主細胞中に存在する場合に、複製され、感染性ウイルス粒子中にパッケージングされる。ｒＡＡＶベクターが、より大きなポリヌクレオチド中に（例えば、染色体中またはクローニングもしくはトランスフェクションのために使用されるプラスミドなどの別のベクター中に）組み込まれる場合には、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶパッケージング機能および適したヘルパー機能の存在下での複製およびキャプシド封入によって「レスキュー」される「プロベクター」と呼ばれる。ｒＡＡＶベクターは、それだけには限らないが、プラスミド、線形人工染色体を含む、いくつかの形態のいずれかであり得、脂質と複合体形成され、リポソーム内にカプセル封入され、ウイルス粒子、例えば、ＡＡＶ粒子中にキャプシド封入される。ｒＡＡＶベクターを、ＡＡＶウイルスキャプシド中にパッケージングし、「組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ粒子）」を作製することができる。

【0137】

「ｒＡＡＶウイルス」または「ｒＡＡＶウイルス粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶキャプシドタンパク質およびキャプシド封入されたｒＡＡＶベクターゲノムから構成されるウイルス粒子を指す。

【0138】

「組換えアデノウイルスベクター」は、少なくとも１つのアデノウイルス逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）がその両端に位置する、１つまたはそれ以上の異種配列（すなわち、アデノウイルス起源ではない核酸配列）を含むポリヌクレオチドベクターを指す。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、２つの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）がその両端に位置する。このような組換えウイルスベクターは、組換えウイルスゲノムから欠失された必須アデノウイルス遺伝子（例えば、Ｅ１遺伝子、Ｅ２遺伝子、Ｅ４遺伝子など）を発現している宿主細胞中に存在する場合に、複製され、感染性ウイルス粒子中にパッケージングされる。組換えウイルスベクターが、より大きなポリヌクレオチド中に（例えば、染色体中またはクローニングもしくはトランスフェクションのために使用されるプラスミドなどの別のベクター中に）組み込まれる場合には、組換えウイルスベクターは、アデノウイルスパッケージング機能の存在下での複製およびキャプシド封入によって「レスキュー」される「プロベクター」と呼ばれる。組換えウイルスベクターは、それだけには限らないが、プラスミド、線形人工染色体を含む、いくつかの形態のいずれかであり得、脂質と複合体形成され、リポソーム内にカプセル封入され、ウイルス粒子、例えば、アデノウイルス粒子中にキャプシド封入される。組換えウイルスベクターを、アデノウイルスのウイルスキャプシド中にパッケージングして、「組換えアデノウイルス粒子」を作製することができる。

【0139】

「組換えレンチウイルスベクター」は、少なくとも１つのレンチウイルス末端反復配列（ＬＴＲ）がその両端に位置する１つまたはそれ以上の異種配列（すなわち、レンチウイルス起源ではない核酸配列）を含むポリヌクレオチドベクターを指す。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、２つのレンチウイルス末端反復配列（ＬＴＲ）がその両端に位置する。このような組換えウイルスベクターは、適したヘルパー機能を有する感染している宿主細胞中に存在する場合に、複製され、感染性ウイルス粒子中にパッケージングされる。組換えレンチウイルスベクターを、レンチウイルスキャプシド中にパッケージングし、「組換えレンチウイルス粒子」を作製することができる。

【0140】

「組換え単純ヘルペスベクター（組換えＨＳＶベクター）」は、ＨＳＶ末端反復配列がその両端に位置する、１つまたはそれ以上の異種配列（すなわち、ＨＳＶ起源ではない核酸配列）を含むポリヌクレオチドベクターを指す。このような組換えウイルスベクターは、適したヘルパー機能を有する感染している宿主細胞中に存在する場合に、複製され、感
染性ウイルス粒子中にパッケージングされる。組換えウイルスベクターが、より大きなポリヌクレオチド中に（例えば、染色体中またはクローニングもしくはトランスフェクションのために使用されるプラスミドなどの別のベクター中に）組み込まれる場合には、組換えウイルスベクターは、ＨＳＶパッケージング機能の存在下での複製およびキャプシド封入によって「レスキュー」される「プロベクター」と呼ばれる。組換えウイルスベクターは、それだけには限らないが、プラスミド、線形人工染色体を含む、いくつかの形態のいずれかであり得、脂質と複合体形成され、リポソーム内にカプセル封入され、ウイルス粒子、例えば、ＨＳＶ粒子中にキャプシド封入される。組換えウイルスベクターを、ＨＳＶキャプシド中にパッケージングして、「組換え単純ヘルペスウイルス粒子」を作製することができる。

【0141】

「異種」とは、それと比較されるまたはその中に導入されるもしくは組み込まれる実体の残部のものとは遺伝子型的に異なる実体に由来することを意味する。例えば、遺伝子工学技術によって、異なる細胞型中に導入されるポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである（発現されると、異種ポリペプチドをコードし得る）。同様に、ウイルスベクター中に組み込まれる細胞性配列（例えば、遺伝子またはその一部）は、ベクターに対して異種ヌクレオチド配列である。

【0142】

用語「導入遺伝子」は、細胞中に導入され、適当な条件下で、ＲＮＡ中に転写され、場合により、翻訳され、および／または発現されることが可能であるポリヌクレオチドを指す。態様では、導入遺伝子は、それが導入された細胞に所望の特性を付与する、もしくはそうでなければ、所望の療法または診断結果につながる。別の態様では、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなどのＲＮＡ干渉を媒介する分子中に転写される。

【0143】

ウイルス力価に関連して使用されるような、用語「ゲノム粒子（ｇｐ）」、「ゲノム等価物」または「ゲノムコピー」は、感染性または機能性にかかわらず、組換えＡＡＶ ＤＮＡゲノムを含有するビリオンの数を指す。特定のベクター調製物中のゲノム粒子の数を、本明細書における実施例に、または例えば、Ｃｌａｒｋら（１９９９）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、第１０巻：１０３１～１０３９頁；Ｖｅｌｄｗｉｊｋら（２００２）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、第６巻：２７２～２７８頁に記載されるような手順によって測定することができる。

【0144】

用語「ベクターゲノム（ｖｇ）」は、本明細書において、ベクター、例えば、ウイルスベクターのポリヌクレオチド配列のセットを含む１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドを指し得る。ベクターゲノムは、ウイルス粒子中にキャプシド封入される。特定のウイルスベクターに応じて、ベクターゲノムは、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡまたは二本鎖ＲＮＡを含み得る。ベクターゲノムは、特定のウイルスベクターおよび／または組換え技術によって特定のウイルスベクター中に挿入された任意の異種配列と会合する内因性配列を含み得る。例えば、組換えＡＡＶベクターゲノムは、プロモーターの両端に位置する少なくとも１つのＩＴＲ配列、スタッファー、目的の配列（例えば、ＲＮＡｉ）およびポリアデニル化配列を含み得る。完全ベクターゲノムは、ベクターのポリヌクレオチド配列の完全セットを含み得る。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの核酸力価を、ｖｇ／ｍＬの単位で測定することができる。この力価を測定するのに適した方法は、当技術分野で公知である（例えば、定量的ＰＣＲ）。

【0145】

ウイルス力価に関連して使用されるような、用語「感染単位（ｉｕ）」、「感染性粒子」または「複製単位」は、複製中心アッセイとしても知られる、例えば、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら（１９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、第６２巻：１９６３～１９７３頁に記載されるような感染中心アッセイによって測定されるような感染性および複製可能な組換えＡＡＶベクター粒子の数を指す。

【0146】

ウイルス力価に関連して使用されるような、用語「形質導入単位（ｔｕ）」は、本明細書における実施例に、または、例えば、Ｘｉａｏら（１９９７）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、第１４４巻：１１３～１２４頁に；またはＦｉｓｈｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、第７０巻：５２０～５３２頁（ＬＦＵアッセイ）に記載されるものなどの機能的アッセイにおいて測定されるような、機能的導入遺伝子産物の製造をもたらす感染性組換えＡＡＶベクター粒子の数を指す。

【0147】

「逆方向末端反復」または「ＩＴＲ」配列は、当技術分野で十分に理解されている用語であり、反対の配向にある、ウイルスゲノムの末端に見られる比較的短い配列を指す。

【0148】

当技術分野で十分に理解されている用語である、「ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）」配列は、天然一本鎖ＡＡＶゲノムの両端に存在するおよそ１４５ヌクレオチドの配列である。最も外側の１２５ヌクレオチドのＩＴＲは、２つの代替配向のいずれかで存在し得、異なるＡＡＶゲノム間および単一ＡＡＶゲノムの２つの末端間の不均一性につながる。最も外側の１２５ヌクレオチドはまた、自己相補性のいくつかのより短い領域（Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’およびＤ領域と表される）を含有し、ストランド内塩基対合がＩＴＲのこの部分内に生じることを可能にする。

【0149】

「末端解離配列」または「ｔｒｓ」は、ウイルスＤＮＡ複製の際にＡＡＶ ｒｅｐタンパク質によって切断されるＡＡＶ ＩＴＲのＤ領域中の配列である。突然変異体末端解離配列は、ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質による切断に対して抵抗性である。

【0150】

ＡＡＶの「ヘルパーウイルス」は、ＡＡＶ（欠陥パルボウイルスである）が、宿主細胞によって複製され、パッケージングされることを可能にするウイルスを指す。いくつかのこのようなヘルパーウイルスは同定されており、アデノウイルス、ヘルペスウイルスおよびワクシニアなどのポックスウイルスが挙げられる。サブグループＣのアデノウイルス５型（Ａｄ５）が、最もよく知られているが、アデノウイルスは、いくつかの異なるサブグループを包含する。ヒト、非ヒト哺乳動物および鳥類起源の多数のアデノウイルスが公知であり、ＡＴＣＣなどの寄託機関から入手可能である。同様に、ＡＴＣＣなどの寄託機関から入手可能であるヘルペス科のウイルスとして、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）が挙げられる。

【0151】

参照ポリペプチドまたは核酸配列と関連する「配列同一性パーセント（％）」は、最大配列同一性パーセントを達成するように、配列をアラインし、必要に応じてギャップを導入した後に、いかなる保存的置換も配列同一性の部分として考慮せずに、参照ポリペプチドまたは核酸配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドと同一である候補配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドのパーセンテージとして定義される。アミノ酸または核酸配列同一性パーセントを決定する目的のアラインメントは、当業者の範囲内である種々の方法で、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）、付録３０、７．７．１８節、表７．７．１に記載されたものおよびＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを含め、例えば、公的に入手可能なコンピュータソフトウェアプログラムを使用して達成することができる。アラインメントプログラムの一例として、ＡＬＩＧＮ Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）がある。当業者ならば、比較されている配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含め、アラインメントを測定するための適当なパラメータを決定することができる。本明細書における目的上、所与のアミノ酸配列Ｂに対しての、との、またはそれに
対する、所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（所与のアミノ酸配列Ｂに対しての、との、またはそれに対する特定のアミノ酸配列同一性％を有する、または含む所与のアミノ酸配列Ａと言い換えることができる）は、以下のとおりに算出される：分数Ｘ／Ｙ（式中、Ｘは、ＡおよびＢのそのプログラムのアラインメントにおいて、配列アラインメントプログラムによって同一マッチとしてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である）を１００倍する。アミノ酸配列Ａの長さが、アミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合には、ＡのＢに対するアミノ酸配列同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％と等しくないことが認められよう。本明細書における目的上、所与の核酸配列Ｄに対しての、との、またはそれに対する所与の核酸配列Ｃの核酸配列同一性％（所与の核酸配列Ｄに対しての、との、またはそれに対する特定の核酸配列同一性％を有する、または含む所与の核酸配列Ｃと言い換えることができる）は、以下のとおりに算出される：分数Ｗ／Ｚ（式中、Ｗは、ＣおよびＤのそのプログラムのアラインメントにおいて、配列アラインメントプログラムによって同一マッチとしてスコア化されたヌクレオチドの数であり、Ｚは、Ｄ中のヌクレオチドの総数である）を１００倍する。核酸配列Ｃの長さが、核酸配列Ｄの長さと等しくない場合には、ＣのＤに対する核酸配列同一性％は、ＤのＣに対する核酸配列同一性％と等しくないことが認められよう。

【0152】

「単離された」分子（例えば、核酸またはタンパク質）または細胞とは、それが同定され、その天然環境の成分から分離および／または回収されていることを意味する。

【0153】

「有効量」とは、臨床結果（例えば、症状の回復、臨床エンドポイントの達成など）を含む、有益なまたは所望の結果を達成するのに十分な量である。有効量は、１回またはそれ以上の投与で投与される。疾患状態の点では、有効量とは、疾患を回復させ、安定化させ、またはその発生を遅延するのに十分な量である。

【0154】

「個体」または「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物として、それだけには限らないが、家畜化動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌおよびウマ）、霊長類（例えば、ヒトおよびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギおよびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）が挙げられる。特定の実施形態では、個体または対象は、ヒトである。

【0155】

本明細書において、「治療」は、有益なまたは所望の臨床結果を得るためのアプローチである。本発明の目的上、有益なまたは所望の臨床結果として、それだけには限らないが、検出可能であろうと、検出不可能であろうと、症状の軽減、疾患の程度の減少、疾患の安定化された（例えば、悪化しない）状態、疾患の広がり（例えば、転移）を防ぐこと、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の回復または緩和および緩解（部分的であろうと、全体であろうと）が挙げられる。「治療」はまた、治療を受けていない場合に予測される生存と比較した生存の延長を意味することもある。

【0156】

本明細書において、用語「予防的処置」は、個体が、障害を有すると知られている、または有すると疑われる、または有するリスクがあるが、障害の症状を示していない、または障害の最小症状を示している場合の処置を指す。予防的処置を受けている個体は、症状の発生に先立って治療される。

【0157】

本明細書において、「治療的」薬剤（例えば、治療的ポリペプチド、核酸または導入遺伝子）は、上記の例示的臨床結果などの有益なまたは所望の臨床結果を提供するものである。したがって、治療的薬剤は、上記のような治療において使用される。

【0158】

用語「中心網膜」は、本明細書において、外部黄斑および／または内部黄斑および／または中心窩を指す。用語「中心網膜細胞種」は、本明細書において、例えば、ＲＰＥおよび光受容体細胞などの中心網膜の細胞種を指す。

【0159】

用語「黄斑」は、末梢網膜と比較して高い相対濃度の光受容体細胞、具体的には、桿体および錐体を含有する霊長類における中心網膜の領域を指す。用語「外部黄斑」は、本明細書においてまた、「末梢黄斑」とも呼ばれる。用語「内部黄斑」は、本明細書においてまた、「中心黄斑」とも呼ばれる。

【0160】

用語「中心窩」は、末梢網膜および黄斑と比較して高い相対濃度の光受容体細胞、具体的には錐体を含有する直径およそ０．５ｍｍ以下の霊長類の中心網膜中の小さい領域を指す。

【0161】

用語「網膜下空間」は、本明細書において、光受容体細胞および網膜色素上皮細胞の間の網膜中の位置を指す。網膜下空間は、流体の任意の網膜下注射などに先立つ、潜在空間であり得る。網膜下空間はまた、潜在空間中に注射される流体を含有し得る。この場合には、流体は、「網膜下空間と接触して」いる。「網膜下空間と接触して」いる細胞として、ＲＰＥおよび光受容体細胞などの網膜下空間と隣接する細胞が挙げられる。

【0162】

用語「ブレブ」は、本明細書において、眼の網膜下空間内の流体空間を指す。本発明のブレブは、単一空間への流体の単回注射によって、同一空間への１つまたはそれ以上の流体の複数回注射によって、または複数空間への複数回注射によって作製され、これは、再配置されると、網膜下空間の所望の部分にわたる治療効果を達成するのに有用な総流体空間を作製する。

【0163】

本明細書における「約」値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする実施形態を含む（および記載する）。例えば、「約Ｘ」を言及する記載は、「Ｘ」の記載を含む。

【0164】

本明細書において、冠詞「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」の単数形は、特に断りのない限り、複数の言及を含む。

【0165】

本明細書に記載される本発明の態様および実施形態は、態様および実施形態を「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」および／または「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」を含むと理解される。

【0166】

ＩＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ
本開示の特定の態様は、遺伝子操作された、天然に存在しないＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）システムに関する。これらのシステムは、とりわけ、個体の遺伝子における深部イントロン突然変異と関連する疾患または障害、例えば、深部イントロン突然変異と関連する眼の疾患または障害を治療するために使用される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、深部イントロン突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡと、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含み、Ｃａｓタンパク質は、深部イントロン突然変異の両端に位置する部位で標的ＤＮＡ分子を切断し、それによって、深部イントロン突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出す。

【0167】

上記のように、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、細菌および古細菌における外来核酸に対する適応防御として元々発見された。実際、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、制限するものではないが、アエロピルム属（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ）、ピロバキュラム属（Ｐｙｒｏｂａ
ｃｕｌｕｍ）、スルホロブス属（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）、アーケオグロブス属（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロアーキュラ属（Ｈａｌｏｃａｒｃｕｌａ）、メタノバクテリウム属（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎ）、メタノコッカス属（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）、メタノサルシナ属（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）、メタノピルス属（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ）、ピロコッカス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ピクロフィルス（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ）、サーモプラズマ属（Ｔｈｅｒｎｉｏｐｌａｓｎｉａ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アクウェイフェクス属（Ａｑｕｉｆｒｘ）、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｖｒｏｍｏｎａｓ）、クロロビウム属（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、サーマス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、サーモアナエロバクター属（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アザーカス属（Ａｚａｒｃｕｓ）、クロモバクテリウム属（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）、デスルホビブリオ属（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）、ジオバクター属（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ）、マイクロコッカス属（Ｍｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ウォリネラ属（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、メチロコッカス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、フォトバクテリウム属（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）およびサーモトガ属（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）を含む、４０種を超える原核生物において同定されている（例えば、Ｊａｎｓｅｎ，Ｒ．ら（２００２）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．第４３巻：１５６５～１５７５頁およびＭｏｊｉｃａ，Ｆ．Ｊ．ら（２００５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．第６０巻：１７４～１８２頁を参照のこと）。

【0168】

細菌では、Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）タンパク質は、２つの異なるガイドＲＮＡ：ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と結合する。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡリボヌクレオチドが塩基対形成し、標的ＤＮＡのＣａｓ媒介性切断に必要な構造を形成する。しかし、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ構造を形成し、標的ＤＮＡのＣａｓ媒介性切断を導くように遺伝子操作することができることが最近実証された（Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．ら（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ第３３７巻（６０９６）：８１６～２１頁）。Ｃａｓヌクレアーゼ活性の特異性は、ガイドＲＮＡによって決定されるので、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムが、異種細胞における二本鎖ＤＮＡ切断を導き、カスタマイズ可能なゲノム編集を可能にするツールとして調査された（Ｍａｌｉ，Ｐ．ら（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ第３３９巻（６１２１）：８２３～６頁）。例示的ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムおよびそれに関連する使用の方法のさらなる説明の記載は、とりわけ、米国特許第８，６９７，３５９号に見ることができる。いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるようなガイドＲＮＡ（例えば、第１または第２のガイドＲＮＡ）は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるようなガイドＲＮＡ（例えば、第１または第２のガイドＲＮＡ）は、トランス活性化ｃｒ（ｔｒａｃｒ）配列と融合されている。いくつかの実施形態では、トランス活性化ｃｒ（ｔｒａｃｒ）配列は、配列番号２５の配列を含む。

【0169】

したがって、本明細書において記載されるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、多くの理由のために天然に存在するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムと対照的であり得る。例えば、とりわけ、本開示のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、非天然配列（例えば、真核細胞のイントロン）とハイブリダイズする１つまたはそれ以上のガイドＲＮＡを含み得る。天然に存在するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、プラスミドまたはファージ配列などの、細菌および古細菌が通常曝露される配列を認識する。また、本開示のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの多くは、単一ガイドＲＮＡを含むが、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、通常、別個のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。

【0170】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、自己限定性（ｓｅｌｆ－ｌｉｍｉｔｉｎｇ）であり得る。例えば、以下に記載されるように、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、そのシステム自体内の標的配列（単数または複数）、例えば、その切断が、Ｃａｓタンパク質などのシステム成分の発現レベルに影響を及ぼす配列（単数または複数）とハイブリダイズする１つまたはそれ以上のガイドＲＮＡを含み得る。理論に捉われることを望むものではないが、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、宿主細胞において持続的に発現される必要はないので、システムを「自己限定性」である（例えば、持続および／または発現の低減を特徴とする）ように遺伝子操作することは、例えば、オフターゲット効果を低減し、不要な免疫応答および／または安全性の問題の可能性を低減するなどのために有利であり得ると考えられる。

【0171】

自己限定性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムでは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体は、複合体自体の１つまたはそれ以上の成分を発現させるために使用されるベクター中の１つまたはそれ以上の部位を標的とする。したがって、ガイドＲＮＡ（単数または複数）およびＣａｓタンパク質の発現の際、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、目的の遺伝子座（例えば、本明細書に記載されるような突然変異の部位）ならびにＣａｓベクター中の１つまたはそれ以上の標的（単数または複数）を標的とし、最終的に、Ｃａｓベクターの切断およびＣａｓタンパク質発現の低減または排除（目的の遺伝子座での切断後）につながる。実施例３は、このような自己限定性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、目的の標的配列（単数または複数）での効果的な切断（例えば、深部イントロン突然変異の切除）を依然として可能にしながら、Ｃａｓ持続時間の低減を特徴とすることを以下で実証する。

【0172】

本開示の特定の態様は、自己限定性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを使用する、個体の遺伝子における突然変異と関連する疾患または障害を治療するための方法に関する。例えば、突然変異は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムによって個体の遺伝子から切り出される不要な配列（例えば、深部イントロン突然変異）であり得る。その他の実施形態では、突然変異は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムによって修正される（例えば、特に、相同性鋳型が含まれる場合には、相同ＤＮＡが切断されたＤＮＡ配列で修復する）ミスセンス、点またはその他の突然変異であり得る。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、組成物中にある。いくつかの実施形態では、組成物は、治療有効量で個体に投与される。

【0173】

いくつかの実施形態では、組成物は、ａ）目的の突然変異（それだけには限らないが、本明細書に記載される深部イントロン突然変異を含む）の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸；およびｂ）Ｃａｓ発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ発現カセットは、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびガイドＲＮＡ標的部位を含む。第１または第２のガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡ標的部位とハイブリダイズし、したがって、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムが、ガイドＲＮＡ標的部位での切断を触媒することを可能にする。ガイドＲＮＡ標的部位はまた、
Ｃａｓタンパク質に特異的な、ガイドＲＮＡとハイブリダイズする配列に隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含み得る。Ｃａｓタンパク質が発現すると、Ｃａｓタンパク質は、突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列を切断し、それによって、突然変異を含む標的ＤＮＡを切り出す。Ｃａｓタンパク質が発現すると、Ｃａｓタンパク質はまた、Ｃａｓ発現カセットをガイドＲＮＡ標的部位で切断し、それによって、Ｃａｓタンパク質の発現を低減する。したがって、Ｃａｓ発現は、細胞へのＣａｓ発現カセットの導入後、最初は増大するが、Ｃａｓタンパク質が細胞中に蓄積するにつれ、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ発現カセットを切断する。Ｃａｓ発現カセットの多くが、Ｃａｓタンパク質によって妨げられるにつれ、さらなるＣａｓタンパク質の発現が低減される（すなわち、Ｃａｓは、それ自身の発現カセットの発現を制限し、自己限定性Ｃａｓ発現カセットと考えられる）。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質の発現は、最初の増大と、それに続くガイドＲＮＡ標的部位での切断後の発現の減少を特徴とする。本明細書において記載されるように、Ｃａｓタンパク質の発現の低減は、Ｃａｓタンパク質の量および／または持続の低減を指し得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質の発現は、Ｃａｓ発現カセットの切断の前と比較して（例えば、Ｃａｓの最初の発現と比較して）低減される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質の発現は、ガイドＲＮＡ標的部位を欠くＣａｓ発現カセットの使用と比較して低減される。いくつかの実施形態では、自己限定性Ｃａｓ発現カセットを含む組成物は、標的核酸を切断するために使用される。いくつかの実施形態では、組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで標的核酸を切断するために使用される。いくつかの実施形態では、組成物は、突然変異（例えば、深部イントロン突然変異）を含む標的核酸を切断するために使用される。例えば、自己限定性Ｃａｓ発現カセットは、核酸における突然変異と関連する疾患または障害を治療するために使用される。

【0174】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ発現カセットは、第２のガイドＲＮＡ標的部位をさらに含み、第１のガイドＲＮＡまたは第２のガイドＲＮＡは、第２のガイドＲＮＡ標的部位とハイブリダイズし、第２のガイドＲＮＡ標的部位は、Ｃａｓタンパク質に特異的なプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と隣接している。Ｃａｓタンパク質が発現すると、Ｃａｓタンパク質は、突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列を切断し、それによって、突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出す。さらに、Ｃａｓタンパク質が発現すると、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ発現カセットを両ガイドＲＮＡ標的部位で切断し、それによって、Ｃａｓタンパク質の発現を低減する。以下に例示されるように、１つのガイドＲＮＡは、２つのガイドＲＮＡ標的部位とハイブリダイズし得、第１のガイドＲＮＡは、第１のガイドＲＮＡ標的部位とハイブリダイズし得、第２のガイドＲＮＡは、第２のガイドＲＮＡ標的部位とハイブリダイズし得るか、または第２のガイドＲＮＡは、第１のガイドＲＮＡ標的部位とハイブリダイズし得、第１のガイドＲＮＡは、第２のガイドＲＮＡ部位とハイブリダイズし得る。

【0175】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ発現カセットは、Ｃａｓタンパク質の発現を導く／促進するのに有用な、５’または３’非翻訳領域中に存在する、１つまたはそれ以上のプロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化（ポリＡ）配列、ターミネーター、調節エレメントなどを含み得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、プロモーターと作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ標的部位は、プロモーターおよびＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列の間にあり得、その結果、切断の際、Ｃａｓタンパク質の発現の低減をもたらす。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質の発現は、プロモーターおよびＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列の間の作動可能な連結の切断によって低減される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ポリＡ配列と作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ標的部位は、ポリＡ配列およびＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列の間にあり得、そ
の結果、切断の際に、Ｃａｓタンパク質の発現の低減をもたらす。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質の発現は、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびポリアデニル化配列の間の作動可能な連結の切断によって低減される。いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡ標的部位は、プロモーターおよびＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列の間にあり得、第２のガイドＲＮＡ標的部位は、ポリＡ配列およびＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列の間にあり得、その結果、切断の際、Ｃａｓタンパク質の発現の低減をもたらす。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１つまたはそれ以上のＮＬＳとインフレームで融合され、ガイドＲＮＡ標的部位は、１つまたはそれ以上のＮＬＳをコードする配列およびポリＡ配列の間にあり得（特に、ＮＬＳが、Ｃａｓタンパク質のＣ末端と融合されている場合には）、その結果、切断の際に、ＮＬＳが融合しているＣａｓタンパク質の発現の低減をもたらす。

【0176】

本明細書において記載されるように、自己限定性ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムなどのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、本明細書において記載されるベクターまたはウイルスベクター／粒子のいずれかなどの、１つまたはそれ以上のベクター上にコードされる。いくつかの実施形態では、第１および第２のガイドＲＮＡをコードする核酸は、Ｃａｓ発現カセットと同一のベクター上にあり得る。その他の実施形態では、第１および第２のガイドＲＮＡをコードする核酸は、Ｃａｓ発現カセットとは異なるベクターであり得る。例えば、第１および第２のガイドＲＮＡは、第１のｒＡＡＶベクターによってコードされ、Ｃａｓ発現カセットは、第２のｒＡＡＶベクターによってコードされる。いくつかの実施形態では、標的細胞は、両ベクターをトランスフェクトされ、ひいては、自己限定性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの発現につながる。

【0177】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、標的ＤＮＡ分子を突然変異（例えば、深部イントロン突然変異）の両端に位置する部位で切断し、それによって、突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出す。例えば、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）などのＤＮＡ修復プロセスは、切断された末端を結合することによって、切断されたＤＮＡ配列を修復し、それによって、深部イントロン突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出し得る。その他の実施例では、相同ＤＮＡ修復は、特に、相同性鋳型が含まれる場合に、切断されたＤＮＡ配列を修復し得る。本明細書において記載され、例示されるように、標的ＤＮＡ配列（例えば、深部イントロン突然変異を有する配列）の両端に位置する２つのガイドＲＮＡの使用は、深部イントロン突然変異を有する配列などの標的ＤＮＡ配列の部分の切り出しを可能にする（また、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを使用する例示的遺伝子欠失戦略の説明については、Ｂｒａｎｄｌ，Ｃ．ら（２０１４）ＦＥＢＳ Ｏｐｅｎ Ｂｉｏ．第５巻：２６～３５頁；Ｚｈｅｎｇ，Ｑ．ら（２０１４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ第５７巻：１１５～１２４頁を参照のこと）。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡ配列の切り出された部分は、イントロンＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡ配列の切り出された部分は、イントロンＤＮＡのみからなる。

【0178】

いくつかの実施形態では、第１および／または第２のガイドＲＮＡは、突然変異（例えば、深部イントロン突然変異）の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする。理論に捉われることを望むものではないが、第１および／または第２のガイドＲＮＡは、深部イントロン突然変異から任意の距離離れたイントロン内に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズし得ると考えられる。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のガイドＲＮＡは、深部イントロン突然変異から、１塩基対から約１０，０００塩基対の間の標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のガイドＲＮＡは、深部イントロン突然変異から、（ヌクレオチドの単位で）およそ、以下の距離のいずれか未満の距離に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする：１０，０００；９，５００；９，０００；８，５００；８，０００；７，５００；７，０００；６，５００；６，０００；５，５００；５，０００；４
，５００；４，０００；３，５００；３，０００；２，５００；２，０００；１，５００；１，０００；９５０；９００；８５０；８００；７５０；７００；６５０；６００；５５０；５００；４５０；４００；３５０；３００；２５０；２００；１５０；１００；９５；９０；８５；８０；７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４；３；２；またはその間の任意の値。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のガイドＲＮＡは、深部イントロン突然変異から、（ヌクレオチドの単位で）およそ、以下の距離のいずれかを超える距離に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする：１；２；３；４；５；６；７；８；９；１０；１５；２０；２５；３０；３５；４０；４５；５０；５５；６０；６５；７０；７５；８０；８５；９０；９５；１００；１５０；２００；２５０；３００；３５０；４００；４５０；５００；５５０；６００；６５０；７００；７５０；８００；８５０；９００；９５０；１，０００；１，５００；２，０００；２，５００；３，０００；３，５００；４，０００；４，５００；５，０００；５，５００；６，０００；６，５００；７，０００；７，５００；８，０００；８，５００；９，０００；９，５００；またはそれらの間の任意の値。すなわち、第１および／または第２のガイドＲＮＡは、１０，０００；９，５００；９，０００；８，５００；８，０００；７，５００；７，０００；６，５００；６，０００；５，５００；５，０００；４，５００；４，０００；３，５００；３，０００；２，５００；２，０００；１，５００；１，０００；９５０；９００；８５０；８００；７５０；７００；６５０；６００；５５０；５００；４５０；４００；３５０；３００；２５０；２００；１５０；１００；９５；９０；８５；８０；７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４；３；２；またはそれらの間の任意の値の上限および１；２；３；４；５；６；７；８；９；１０；１５；２０；２５；３０；３５；４０；４５；５０；５５；６０；６５；７０；７５；８０；８５；９０；９５；１００；１５０；２００；２５０；３００；３５０；４００；４５０；５００；５５０；６００；６５０；７００；７５０；８００；８５０；９００；９５０；１，０００；１，５００；２，０００；２，５００；３，０００；３，５００；４，０００；４，５００；５，０００；５，５００；６，０００；６，５００；７，０００；７，５００；８，０００；８，５００；９，０００；９，５００；またはそれらの間の任意の値の独立して選択された下限を有する距離の範囲（ヌクレオチドの単位で）であって、下限が上限未満である範囲のうちの任意のもののであり得る、深部イントロン突然変異からの距離に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズし得る。

【0179】

Ｃａｓタンパク質の限定されない例として、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、その相同体またはその修飾されたものが挙げられる。これらの酵素は、当技術分野で一般的に知られている。

【0180】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素）は、Ｃａｓ９タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９などの未修飾ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ切断活性を有する。例示的Ｃａｓ９タンパク質として、制限するものではないが、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース受託番号Ｑ９９ＺＷ２を参照のこと）、Ｓ．オーレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＣＫ７４１７３を参照のこと）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９（例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデ
ータベース受託番号Ｇ３ＥＣＲ１を参照のこと）、Ｎ．メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｃ９Ｘ１Ｇ５を参照のこと）およびＴ．デンティコラ（Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）Ｃａｓ９（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＭＢ４１０７８を参照のこと）が挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列内および／または標的配列の相補体内などの、標的配列の位置での一方の鎖または両鎖の切断を導く。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の第１のまたは最後のヌクレオチドから約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００またはそれ以上の塩基対内の一方の鎖または両鎖の切断を導く。

【0181】

いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓタンパク質をコードする酵素コード配列は、真核細胞などの特定の細胞における発現のためにコドン最適化される。真核細胞は、それだけには限らないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌまたは非ヒト霊長類を含む、哺乳動物などの特定の生物のものまたはそれに由来するものであり得る。一般に、コドン最適化とは、天然アミノ酸配列を維持しながら、天然配列の少なくとも１つのコドンを、その宿主細胞の遺伝子においてより頻繁にもしくは最も頻繁に使用されるコドンで置換することによって、目的の宿主細胞における増強された発現のために核酸配列を修飾するプロセスを指す。種々の種は、特定のアミノ酸の特定のコドンについて特定のバイアスを示す。コドン使用表は、例えば、「コドン使用データベース」で容易に入手可能であり、これらの表は、いくつかの方法で適応させることができる（例えば、Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．ら（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．第２８巻：２９２頁）。特定の宿主細胞における発現のために特定の配列をコドン最適化するためのコンピュータアルゴリズムも入手可能であり、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ、Ｐａ．）なども入手可能である。

【0182】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１つまたはそれ以上の異種タンパク質ドメイン（ＣＲＩＳＰＲ酵素に加えて、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくはそれ以上のドメインまたは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上を超えるドメイン）を含む融合タンパク質である。Ｃａｓ融合タンパク質は、任意のさらなるタンパク質配列および場合により、任意の２つのドメイン間のリンカー配列を含み得る。Ｃａｓタンパク質と融合されるタンパク質ドメインの例として、制限するものではないが、エピトープタグ、リポーター遺伝子配列および以下の活性：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性および核酸結合活性のうちの１つまたはそれ以上を有するタンパク質ドメインが挙げられる。エピトープタグの例として、制限するものではないが、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ－Ｇタグおよびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが挙げられる。リポーター遺伝子の例として、制限するものではないが、グルタチオン－５－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼおよび蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＢＦＰなど）が挙げられる。Ｃａｓタンパク質は、それだけには限らないが、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ－タグ、Ｌｅｘ Ａ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合物、ＧＡＬ４Ａ ＤＮＡ結合ドメイン融合物および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合物を含む、ＤＮＡ分子と結合するか、またはその他の細胞性分子と結合するタンパク質またはタンパク質の断片をコードする遺伝子配列と融合される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、機能の増強のために修飾される。

【0183】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、突然変異体Ｃａｓタンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）は、ニッカーゼ突然変異体である（Ｒａｎら、２０１３ Ｃｅｌｌ第１５６巻（６）：１３８０～９頁）。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼ突然変異体は、ターゲッティングされた二本鎖切断を導入し、オフターゲットＤＮＡ切断を低減するために、ガイドＲＮＡの対とともに使用される。

【0184】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、アミノ酸変更を有し、頑強なオンターゲット活性を示すが、オフターゲット切断は無視できる正確性が高いＣａｓタンパク質変異体である（Ｓｌａｙｍａｋｅｒ，Ｉ．Ｍ．ら（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ第３５１巻（６２６８）：８４～８８頁；Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ，Ｂ．Ｐ．ら（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ第５２９巻：４９０～４９５頁）。

【0185】

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、１つまたはそれ以上の核局在性シグナル（ＮＬＳ）をさらに含む。例えば、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）は、１つまたはそれ以上のＮＬＳを含み得る。ＮＬＳとともにＣａｓ９を含む例示的プラスミドは、Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．ら（２０１３）Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．第８巻：２２８１～２３０８頁に見ることができる。さまざまな宿主細胞に適した種々のＮＬＳが、当技術分野で公知である。例えば、制限するものではないが、ＮＬＳは、ＳＶ４０ ＮＬＳ（例えば、Ｍａｌｉ，Ｐ．ら（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ第３３９巻（６１２１）：８２３～６頁に記載されるような）、ＳＶ４０ラージＴ抗原単節型（ｍｏｎｏｐａｒｔｉｔｅ）ＮＬＳ、ヌクレオプラスミンＮＬＳおよびｈｎＲＮＰ Ａ１ ＮＬＳであり得る。使用される例示的ＮＬＳ配列として、制限するものではないが、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２６）またはＰＫＫＫＲＫＶＥＤＰＫＫＫＲＫＶＤ（配列番号２７）が挙げられる（例えば、Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．ら（２０１３）ｅＬｉｆｅ ２：ｅ００４７１を参照のこと）。

【0186】

ＣＲＩＳＰＲ複合体（標的配列の逆鎖とハイブリダイズし、１つまたはそれ以上のＣａｓタンパク質と複合体形成されたガイド配列を含む）の形成は、通常、内因性ＣＲＩＳＰＲシステム中の標的配列中またはその付近の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０またはそれ以上の塩基対内の）一方の鎖または両鎖の切断をもたらす。野生型ｔｒａｃｒ配列のすべてまたは一部を含み得るｔｒａｃｒ配列もまた、ｔｒａｃｒ配列の少なくとも一部に沿った、ｔｒａｃｒメイト配列のすべてまたは一部、例えば、ガイド配列と作動可能に連結されているｔｒａｃｒメイト配列とのハイブリダイゼーションなどによって、ＣＲＩＳＰＲ複合体の一部を形成することができると考えられる。

【0187】

一般に、ｔｒａｃｒメイト配列は、対応するｔｒａｃｒ配列を含有する細胞における、ｔｒａｃｒメイト配列がその両端に位置するガイド配列の切り出し；標的配列でのｔｒａｃｒ配列とハイブリダイズしたｔｒａｃｒメイト配列を含むＣＲＩＳＰＲ複合体の形成；またはその両方を促進するのに十分な、ｔｒａｃｒ配列との相補性を有する任意の配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒ配列は、ｔｒａｃｒメイト配列にハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に加わるのに十分な相補性を有する。標的配列に関して以下に記載されるように、少なくとも機能的であるために十分な相補性が必要である（すなわち、ｔｒａｃｒおよびｔｒａｃｒメイト配列の間の完全相補性は必要ではない）と考えられる。

【0188】

一般に、相補性の程度は、２つの配列の短い方の長さに沿ったｔｒａｃｒメイト配列およびｔｒａｃｒ配列の最適アラインメントを指す。最適アラインメントは、任意の適したアラインメントアルゴリズム（例えば、本明細書に記載されるような）によって決定され、ｔｒａｃｒ配列またはｔｒａｃｒメイト配列のいずれか内の自己相補性などの二次構造
をさらに構成し得る。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒ配列は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０もしくはそれ以上のヌクレオチド長または約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０もしくはそれ以上を超えるヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒ配列は、最適にアラインされた場合にｔｒａｃｒメイト配列の長さに沿って、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の配列相補性を有する（例えば、本明細書において記載される例示的アラインメント方法のいずれかによって決定されるような）。

【0189】

理論に捉われることを望むものではないが、任意の目的とする所望の標的ＤＮＡ配列が、ｓｇＲＮＡガイド配列によってターゲッティングされ、標的ＤＮＡ配列の唯一の必要条件は、ｓｇＲＮＡ標的配列に隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の存在であると考えられる（Ｍａｌｉ，Ｐ．ら（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ第３３９巻（６１２１）：８２３～６頁）。異なるＣａｓ複合体は、異なるＰＡＭモチーフを有すると知られている。例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９は、ＧＧジヌクレオチドＰＡＭモチーフを有する。さらなる例を挙げると、Ｓ．オーレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９のＰＡＭモチーフは、ＧＲＲＴ（式中、Ｒは、プリン（ＡまたはＧ）である）であり、Ｎ．メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９のＰＡＭモチーフは、ＧＡＴＴであり、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９のＰＡＭモチーフは、ＡＧＡＡであり、Ｔ．デンティコラ（Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）Ｃａｓ９のＰＡＭモチーフは、ＡＡＡＡＣである。

【0190】

一般に、ガイド配列は、標的配列の逆鎖とハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列との配列特異的結合を導くのに十分な、標的ポリヌクレオチド配列との類似性を有する任意のポリヌクレオチド配列であり得る。いくつかの実施形態では、ガイド配列とその対応する標的配列との間の同一性度は、適したアラインメントアルゴリズムを使用して最適にアラインされた場合に、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％もしくはそれ以上または約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％もしくはそれ以上を超える。最適アラインメントは、配列をアラインするための任意の適したアルゴリズムを使用して決定される；限定されない例として、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）に基づくアルゴリズム、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＣｌｕｓｔａｌＸ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎで入手可能）、Ｍａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで入手可能）などが挙げられる。

【0191】

いくつかの実施形態では、ガイド配列は、約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５もしくはそれ以上のうちいずれか１つのヌクレオチド長または約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５もしくはそれ以上のうちいずれか１つのヌクレオチド長を超える。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２もしくはそれ以下のうちいずれか１つのヌクレオチド長未満である。ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列との配列特異的結合を導くガイド配列の能力を調べるためのアッセイは、当技術分野で公知である。例えば、試験されるべきガイド配列を含むＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するのに十分なＣＲＩＳＰＲシステムの成分が、例えば、米国特許第８
，６９７，３５９号に記載されるように、ＣＲＩＳＰＲ配列の成分をコードするベクターのトランスフェクションと、それに続く、標的配列内の好ましい切断の評価などによって、対応する標的配列を有する宿主細胞に提供される。

【0192】

いくつかの実施形態では、本開示のガイドＲＮＡ（例えば、第１のガイドＲＮＡ）は、配列番号４１（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号４５（ＳａＣａｓ９の）、配列番号４６（ＳａＣａｓ９の）または配列番号４７（ＳａＣａｓ９の）の配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のガイドＲＮＡ（例えば、第１のガイドＲＮＡ）は、配列番号１９（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号５０（ＳａＣａｓ９の）、配列番号５１（ＳａＣａｓ９の）または配列番号５２（ＳａＣａｓ９の）の配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＣＥＰ２９０遺伝子のＣａｓ切断のガイドＲＮＡとしてのその機能を維持しながら、配列番号４１（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号４５（ＳａＣａｓ９の）、配列番号４６（ＳａＣａｓ９の）、配列番号４７（ＳａＣａｓ９の）、配列番号１９（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号５０（ＳａＣａｓ９の）、配列番号５１（ＳａＣａｓ９の）または配列番号５２（ＳａＣａｓ９の）の配列の１、２、３、４または５つの置換、欠失または挿入を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＣＥＰ２９０遺伝子のＣａｓ切断のためのガイドＲＮＡとしての機能が増強した、配列番号４１（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号４５（ＳａＣａｓ９の）、配列番号４６（ＳａＣａｓ９の）、配列番号４７（ＳａＣａｓ９の）、配列番号１９（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号５０（ＳａＣａｓ９の）、配列番号５１（ＳａＣａｓ９の）または配列番号５２（ＳａＣａｓ９の）のガイドＲＮＡの変異体である。

【0193】

いくつかの実施形態では、本開示のガイドＲＮＡ（例えば、第２のガイドＲＮＡ）は、配列番号４２（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号４３（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号４４（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号４８（ＳａＣａｓ９の）または配列番号４９（ＳａＣａｓ９の）の配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のガイドＲＮＡ（例えば、第２のガイドＲＮＡ）は、配列番号２０（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号２１（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号２２（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号５３（ＳａＣａｓ９の）または配列番号５４（ＳａＣａｓ９の）の配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＣＥＰ２９０遺伝子のＣａｓ切断のためのガイドＲＮＡとしてのその機能を維持しながら、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８の配列の１、２、３、４または５つの置換、欠失または挿入を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＣＥＰ２９０遺伝子のＣａｓ切断のためのガイドＲＮＡとしての機能が増強した、配列番号４２（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号４３（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号４４（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号４８（ＳａＣａｓ９の）、配列番号４９（ＳａＣａｓ９の）、配列番号２０（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号２１（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号２２（ＳｐＣａｓ９の）、配列番号５３（ＳａＣａｓ９の）または配列番号５４（ＳａＣａｓ９の）のガイドＲＮＡの変異体である。

【0194】

いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒ配列およびｔｒａｃｒメイト配列は、これら２つの間のハイブリダイゼーションが、二次構造（例えば、ヘアピン）を有する転写物をもたらすように、単一転写物内に含有される。いくつかの実施形態では、ヘアピン構造において使用するためのループ形成配列は、４ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ループ形成配列は、配列ＧＡＡＡを有する。しかし、代替配列のように、より長いまたはより短いループ配列が使用される。その他のループ形成配列の例として、制限するものではないが、ＣＡＡＡおよびＡＡＡＧが挙げられる。いくつかの実施形態では、転写物または転写されたポリヌクレオチド配列は、少なくとも２以上のヘアピン、例えば、２、３、４または５つのヘアピンを有する。いくつかの実施形態では、単一転写物は、転写終結配列、例えば、６つのＴヌクレオチドなどのポリＴ配列をさらに含む。

【0195】

ＩＶ．深部イントロン突然変異
本開示のある特定の態様は、深部イントロン突然変異に関する。上記のように、深部イントロン突然変異によって、成熟（例えば、スプライスされた）ｍＲＮＡに異常にイントロン配列を含めることが起こりうる。例えば、深部イントロン突然変異は、遺伝子にスプライス供与部位、スプライス受容部位、またはスプライシングエンハンサー部位を導入しうる。その結果、イントロン配列が潜在性エキソンとして含められる。これによって典型的に、特に潜在性エキソンがフレームシフト突然変異または未成熟終止コドンを含む場合は、突然変異したポリペプチドが起こる。

【0196】

上記のように、深部イントロン突然変異は、内因性のスプライス受容部またはスプライス供与部での突然変異とは対照的に、野生型スプライス受容配列およびスプライス供与配列の外側の突然変異を指す。典型的に、深部イントロン突然変異は、内因性のスプライス受容部位／スプライス供与部位からある程度の距離で起こる。

【0197】

いくつかの実施形態において、深部イントロン突然変異は、遺伝子の５’スプライス供与部位から少なくとも約１００ヌクレオチドに位置する。いくつかの実施形態において、深部イントロン突然変異は、遺伝子の３’スプライス受容部位から少なくとも約１００ヌクレオチドに位置する。いくつかの実施形態において、深部イントロン突然変異は、遺伝子の５’スプライス供与部位から少なくとも約１００ヌクレオチド、かつ３’スプライス受容部位から少なくとも約１００ヌクレオチドに位置する。いくつかの実施形態において、深部イントロン突然変異は、内因性のスプライス受容部位および／またはスプライス供与部位（例えば、５’スプライス供与部位および／または３’スプライス受容部位）から約１００ヌクレオチド超、約１５０ヌクレオチド超、約２００ヌクレオチド超、約２５０ヌクレオチド超、３００ヌクレオチド超、約３５０ヌクレオチド超、約４００ヌクレオチド超、約４５０ヌクレオチド超、約５００ヌクレオチド超、約５５０ヌクレオチド超、約６００ヌクレオチド超、約６５０ヌクレオチド超、約７００ヌクレオチド超、約７５０ヌクレオチド超、約８００ヌクレオチド超、約８５０ヌクレオチド超、約９００ヌクレオチド超、約９５０ヌクレオチド超、約１，０００ヌクレオチド超、約１，５００ヌクレオチド超、約２，０００ヌクレオチド超、約２，５００ヌクレオチド超、約３，０００ヌクレオチド超、約３，５００ヌクレオチド超、約４，０００ヌクレオチド超、約４，５００ヌクレオチド超、約５，０００ヌクレオチド超、約５，５００ヌクレオチド超、約６，０００ヌクレオチド超、約６，５００ヌクレオチド超、約７，０００ヌクレオチド超、約７，５００ヌクレオチド超、約８，０００ヌクレオチド超、約８，５００ヌクレオチド超、約９，０００ヌクレオチド超、約９，５００ヌクレオチド超、約１０，０００ヌクレオチド超、約１５，０００ヌクレオチド超、約２０，０００ヌクレオチド超、約２５，０００ヌクレオチド超、約３０，０００ヌクレオチド超、約３５，０００ヌクレオチド超、約４０，０００ヌクレオチド超、約４５，０００ヌクレオチド超、約５０，０００ヌクレオチド超、約５５，０００ヌクレオチド超、約６０，０００ヌクレオチド超、約６５，０００ヌクレオチド超、約７０，０００ヌクレオチド超、約７５，０００ヌクレオチド超、約８０，０００ヌクレオチド超、または約８５，０００ヌクレオチド超で起こる。

【0198】

いくつかの実施形態において、深部イントロン突然変異は、内因性のスプライス受容部位および／またはスプライス供与部位（例えば、５’スプライス供与部位または３’スプライス受容部）から、（ヌクレオチドの単位で）およそ、以下の距離のいずれか未満の距離で起こる：約８５，０００；８０，０００；７５，０００；７０，０００；６５，０００；６０，０００；５５，０００；５０，０００；４５，０００；４０，０００；３５，０００；３０，０００；２５，０００；２０，０００；１５，０００；１０，０００；９，５００；９，０００；８，５００；８，０００；７，５００；７，０００；６，５００；６，０００；５，５００；５，０００；４，５００；４，０００；３，５００；３，０００；２，５００；２，０００；１，５００；１，０００；９５０；９００；８５０；８
００；７５０；７００；６５０；６００；５５０；５００；４５０；４００；３５０；３００；２５０；２００；または１５０。いくつかの実施形態において、深部イントロン突然変異は、内因性のスプライス受容部位および／またはスプライス供与部位から、（ヌクレオチドの単位で）およそ、以下の距離のいずれかを超える距離で起こる：約１００，１５０，２００，２５０，３００，３５０，４００，４５０，５００，５５０，６００，６５０，７００，７５０，８００，８５０，９００；９５０；１，０００；１，５００；２，０００；２，５００；３，０００；３，５００；４，０００；４，５００；５，０００；５，５００；６，０００；６，５００；７，０００；７，５００；８，０００；８，５００；９，０００；９，５００；１０，０００；１５，０００；２０，０００；２５，０００；３０，０００；３５，０００；４０，０００；４５，０００；５０，０００；５５，０００；６０，０００；６５，０００；７０，０００；７５，０００；または８０，０００。すなわち、深部イントロン突然変異から内因性のスプライス受容部位および／またはスプライス供与部位（例えば、５’スプライス供与部位）までの距離は、８５，０００；８０，０００；７５，０００；７０，０００；６５，０００；６０，０００；５５，０００；５０，０００；４５，０００；４０，０００；３５，０００；３０，０００；２５，０００；２０，０００；１５，０００；１０，０００；９，５００；９，０００；８，５００；８，０００；７，５００；７，０００；６，５００；６，０００；５，５００；５，０００；４，５００；４，０００；３，５００；３，０００；２，５００；２，０００；１，５００；１，０００；９５０；９００；８５０；８００；７５０；７００；６５０；６００；５５０；５００；４５０；４００；３５０；３００；２５０；２００；または１５０の上限と、独立して選択される、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００；９５０；１，０００；１，５００；２，０００；２，５００；３，０００；３，５００；４，０００；４，５００；５，０００；５，５００；６，０００；６，５００；７，０００；７，５００；８，０００；８，５００；９，０００；９，５００；１０，０００；１５，０００；２０，０００；２５，０００；３０，０００；３５，０００；４０，０００；４５，０００；５０，０００；５５，０００；６０，０００；６５，０００；７０，０００；７５，０００；または８０，０００の下限を有する距離の範囲（ヌクレオチドの単位で）であって、下限が上限未満である範囲のうちの任意のものでありうる。

【0199】

本開示のある特定の態様は、例えば中でも個体の遺伝子における深部イントロン突然変異と関連する疾患または障害を治療するために使用することができる方法、キット、組成物、およびウイルス粒子に関する。多様な深部イントロン突然変異が当技術分野で公知である。疾患と関連する例示的な深部イントロン突然変異を、以下の表１に提供する（表１に提供される特異的突然変異、遺伝子、およびイントロンサイズは、参照としてヒトＤＮＡ配列を指すことに注意されたい）。

【0200】

【表1】

【0201】

【表2】

【0202】

【表3】

【0203】

いくつかの実施形態において、深部イントロン突然変異と関連する疾患または障害は、無フィブリノーゲン血症、アルポート症候群、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、常染色体劣性多発性嚢胞腎、バース症候群、ベータサラセミア、先天性無フィブリノーゲン血症、先天性白内障・顔貌異常・ニューロパチー症候群、先天性グリコシル化異常症Ｉａ型、先天性グリコシル化異常症ＩＩ型、嚢胞性線維症、ジヒドロプテリジンレダクターゼ欠乏症、ファブリー病、急性骨髄性白血病の素因を有する家族性血小板異常症、ファンコニ貧血、ギテルマン症候群、成長ホルモン不応症、フリードライヒ運動失調症、血友病Ａ、遺伝性巨赤芽球性貧血１、ヘルマンスキー・パドラック症候群、ホモシスチン尿症、メープルシロップ尿症、マルファン症候群、メチオニンシンターゼ欠乏症、メチルマロン酸血症、ミトコンドリア三機能タンパク質欠乏症、ムコ多糖症ＩＩ型、マルチミニコア病、筋ジストロフィー、神経線維腫症Ｉ型、ニーマン・ピック病Ｃ型、眼白子症Ｉ
型、オルニチンデルタアミノトランスフェラーゼ欠損症、全身性エリテマトーデスの素因、プロピオン酸血症、ラブドイド腫瘍、シュワルツ・ヤンペル症候群、スティックラー症候群、全身性エリテマトーデス、結節性硬化症、ウェルナー症候群、Ｘ連鎖高免疫グロブリンＭ血症、またはＸ連鎖低リン酸血症である。いくつかの実施形態において、深部イントロン突然変異は、表１に示される深部イントロン突然変異である。

【0204】

いくつかの実施形態において、深部イントロン突然変異と関連する疾患または障害は、眼の疾患である。本明細書において使用される用語「眼の疾患」は、最も広い意味で使用され、角膜、光彩、水晶体、網膜、視神経、房水、結膜、１つまたはそれ以上の眼筋、強膜、硝子体、黄斑、中心窩、毛様体、１つまたはそれ以上の靱帯または水晶体支持靱帯小帯、瞳孔、前眼房、および／または後眼房を含むがこれらに限定されるわけではない、眼の任意の構造の病的状態を起源とする、または起因する疾患を指しうる。眼の疾患と関連する例示的な深部イントロン突然変異を、以下の表２に提供する（表２に提供される特異的突然変異、遺伝子、およびイントロンサイズは、参照としてヒトＤＮＡ配列を指すことに注意されたい）

【0205】

【表4】

【0206】

いくつかの実施形態において、眼の疾患は、レーバー先天黒内障、視神経萎縮症、網膜色素変性症、網膜芽細胞腫、シュタルガルト病、アッシャー症候群、またはＸ連鎖網膜色素変性症である。いくつかの実施形態において、深部イントロン突然変異は、表２に示される深部イントロン突然変異である。

【0207】

いくつかの実施形態において、眼の疾患は、レーバー先天黒内障である。レーバー先天黒内障（ＬＣＡ）は、重度の視力喪失、眼振、網膜機能障害、羞明、眼指兆候（例えば、眼をこする、突く、および押すこと）、および円錐角膜のような症状によって特徴付けられる眼の障害群を指す。ＬＣＡは、典型的に出生時に重度の視力喪失および眼振と共に現れる。ＬＣＡの症例は、典型的に常染色体劣性障害として遺伝するが、多様な遺伝子座の突然変異が関係している。例えば、表３はＬＣＡの型に関係する座のいくつかを記載する。

【0208】

【表5】

【0209】

ＬＣＡの最も頻繁な型は、中心体および繊毛の発達において重要な役割を果たす中心体タンパク質をコードするＣＥＰ２９０の突然変異によって引き起こされる（例えば、例示的なヒト遺伝子およびタンパク質配列に関してはそれぞれ、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ Ｎｏ．８０１８４およびＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｎｏ．Ｏ１５０７８を参照されたい）。ＣＥＰ２９０は、網膜後部の光受容体、ならびに体の腎臓、脳、および他の多くの臓器において重要な役割を果たす細胞膜上の一次繊毛の形成において必須である。ＣＥＰ２９０はまた、ＭＫＳ４、ＣＴ８７、ＰＯＣ３、ｒｄ１６、ＢＢＳ１４、ＬＣＡ１０、ＪＢＴＳ５、ＮＰＨＰ６、ＳＬＳＮ６、および３Ｈ１１Ａｇとしても知られる。いくつかの実施形態において、原因となる突然変異は、潜在性スプライス供与部位を導入するｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ突然変異であり、それによって未成熟終止コドンと共に異常なエキソンを含めることが起こる。いくつかの実施形態において、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡのガイド配列は、中心体タンパク質２９０ｋＤａ（ＣＥＰ２９０）遺伝子の深部イントロン突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖にハイブリダイズする。ある特定の実施形態において、深部イントロン突然変異は、ｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ突然変異である。いくつかの実施形態において、ＣＥＰ２９０は、ヒトＣＥＰ２９０である（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＧ＿００８４１７に従うヒトＣＥＰ２９０配列を参照されたい）。いくつかの実施形態において、ＣＥＰ２９０は、配列番号２３に記載の配列の深部イントロン突然変異を含む。

【0210】

本開示のある特定の態様はさらに、遺伝子における深部イントロン突然変異と関連する眼の疾患のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを作製する方法に関する。いくつかの実施形態において、方法は、真核細胞に、ｉ）遺伝子におけるイントロンの標的ＤＮＡ配列への単一ガイドＲＮＡ、ｉｉ）Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列、ｉｉｉ）所望のイントロン突然変異およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の両端に位置する相同性アームを含む相同性組換え修復（ＨＤＲ）鋳型を含む一本鎖オリゴヌクレオチド、を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸を導入することと、遺伝子に組み込まれた突然変異を含む細胞を単離することとを含む。このアプローチと関連する例示的な方法を以下の実施例に例証する。上記のように、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ媒介ＤＮＡ切断は、Ｎ
ＨＥＪによって修復され、それによって例えば標的ＤＮＡ配列の切り出しが起こりうる。しかし、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ媒介ＤＮＡ切断はまた、相同性組換え修復（ＨＤＲ）によっても修復され、それによって例えばＨＤＲ鋳型に存在する配列の導入（例えば、深部イントロン突然変異の導入）が起こる。例えば、Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．８：２２８１～２３０８頁を参照されたい。これらの方法は、治療方法、ウイルス粒子、組成物、およびキットに関して本明細書において記述される任意の特徴、態様、または要素を含みうる。

【0211】

相同性組換え修復（ＨＤＲ）鋳型は、二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチド、または一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）のような多様な形態をとることができる。ＨＤＲ鋳型は、所望のイントロン突然変異の両端に位置する１つまたはそれ以上の相同性アームを含みうる。これらの相同性アームは、標的座と比較してセンスまたはアンチセンス方向でありうる。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上の相同性アームは、標的座から少なくとも約４０塩基対、少なくとも約５０塩基対、少なくとも約６０塩基対、少なくとも約７０塩基対、少なくとも約８０塩基対、少なくとも約９０塩基対、または少なくとも約１００塩基対離れうる。

【0212】

ＨＤＲ鋳型はまた、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）も含みうる。いくつかの実施形態において、ＰＡＭは、細胞中の発現されたＣａｓタンパク質による一本鎖オリゴヌクレオチドの切断を回避するために突然変異を含む。例えば、ＰＡＭは、特定の発現されたＣａｓタンパク質がＨＤＲ鋳型を切断しないように突然変異させてもよく、またはゲノム座のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ媒介編集時に、識別配列（例えば、以下の実施例に例証される独自の制限部位）が、導入されるように突然変異させてもよい。

【0213】

任意の適した真核細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏモデルのために使用してもよい。いくつかの実施形態において、真核細胞は哺乳動物またはヒト細胞である。いくつかの実施形態において、真核細胞は、ヒト細胞株（例えば、ＨｅＬａ、Ａ５４９、２９３等）、哺乳動物細胞株、脊椎動物細胞株、または昆虫細胞株（例えば、Ｓｆ９、またはＳ２）のような細胞株である。いくつかの実施形態において、真核細胞は、光受容細胞のような網膜細胞（例えば、ＷＥＲＩ細胞）である。

【0214】

Ｖ．送達方法
本開示のある特定の態様は、個体の遺伝子における深部イントロン突然変異と関連する疾患または障害を治療することに関する。いくつかの態様において、本発明は、個体の遺伝子における深部イントロン突然変異と関連する疾患または障害を治療する方法であって、個体に本開示の組成物、例えば本開示の遺伝子操作された、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸を含む組成物の治療有効量を投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡでありうる。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質はタンパク質として送達される。

【0215】

ベクター
いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上の第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡ、またはＣａｓタンパク質をコードする核酸は、システムの同じまたは異なるベクターに位置する。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つまたはそれ以上のエレメントの発現を駆動する（ｄｒｉｖｉｎｇ）１つまたはそれ以上のベクターは、ＣＲＩＳＰＲシステムのエレメントの発現が、１つまたはそれ以上の標的部位でＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を導くように、細胞に導入される。例えば、Ｃａｓ酵素、ｔｒａｃｒメイト配列に連結したガイド配列、およびｔｒａｃｒ配列をそれぞれ、別個のベクター上の別個の調節エレメントに作動可能に連結することができる。あるいは、２つまたはそ
れ以上の上記のエレメントを、同じもしくは異なる調節エレメントから発現させてもよく、および／または場合により第１のベクターに含まれないＣＲＩＳＰＲシステムの任意の構成要素を提供する１つもしくは複数の追加のベクターと共に単一のベクターにおいて組み合わせてもよい。ベクターにおいて組み合わせたＣＲＩＳＰＲシステムのエレメントを、任意の適した方向に配置してもよい。例えば、１つのエレメントのコード配列は、第２のエレメントのコード配列の同じもしくは逆の鎖に位置してもよく、および／または同じもしくは逆方向を向いてもよい。

【0216】

いくつかの実施形態において、１つのプロモーターが、Ｃａｓタンパク質と、１つまたはそれ以上のガイド配列、ｔｒａｃｒメイト配列（場合によりガイド配列に作動可能に連結された）、および１つまたはそれ以上のイントロン配列内に埋もれたｔｒａｃｒ配列（例えば、それぞれが異なるイントロン、少なくとも１つのイントロンのうちの２つもしくはそれ以上、または単一のイントロンにおける全て）をコードする転写物の発現を駆動する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質、ガイド配列、ｔｒａｃｒメイト配列、およびｔｒａｃｒ配列は、同じプロモーターに作動可能に連結され、同じプロモーターから発現される。いくつかの実施形態において、第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡ、および／またはＣａｓタンパク質をコードする核酸は、１つまたはそれ以上の調節制御エレメントおよび／またはプロモーターに作動可能に連結される。

【0217】

いくつかの実施形態において、ベクターはプラスミドである。

【0218】

いくつかの実施形態において、第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡ、およびＣａｓタンパク質は、真核細胞において発現される。いくつかの実施形態において、第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡ、およびＣａｓタンパク質は、真核細胞における発現を可能にする１つまたはそれ以上のプロモーターに作動可能に連結される。真核細胞において発現される多様なプロモーターが当技術分野で公知である。限定されない例示的なプロモーターを以下に提供する。

【0219】

いくつかの実施形態において、第１のガイドＲＮＡおよび／または第２のガイドＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターに作動可能に連結される。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによる転写を駆動するために十分な完全長のプロモーターまたはその断片を含みうる。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの型、構造特徴、およびＲＮＡポリメラーゼＩＩＩとの相互作用、ならびに適したＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターのより詳細な説明に関しては、Ｓｃｈｒａｍｍ，Ｌ．ａｎｄ Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｎ．（２００２）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１６：２５９３～６２０頁を参照されたい。ｔＲＮＡ、５Ｓ ＲＮＡ、Ｕ６ ｓｎＲＮＡ、Ｈ１、７ＳＫ、ＲＮアーゼＰ、シグナル認識粒子のＲＮＡ構成要素、およびｓｎｏＲＮＡを含むがこれらに限定されるわけではない、当技術分野で公知の任意の適したＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを使用してもよい（例えば、Ｍａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ３：ｅ１６１を参照されたい）。いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターはＵ６、Ｈ１、または７ＳＫプロモーターである。いくつかの実施形態において、第１のガイドＲＮＡおよび／または第２のガイドＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩターミネーターに作動可能に連結する。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩターミネーターの例には、長さが少なくとも５～６塩基の一連のウリジンヌクレオチドが挙げられるがこれらに限定されるわけではない（ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩターミネーターに関するより詳細な情報に関しては、Ｍａｒｃｋ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３４（６）：１８１６～３５頁を参照されたい）。

【0220】

いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、ＲＮＡポリメラ
ーゼＩＩプロモーターに作動可能に連結する。ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写を駆動するために十分な完全長のプロモーターまたはその断片を含みうる。当技術分野で公知の任意の適したＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを使用してもよく、これらにはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ＣＭＶプロモーター由来の最小プロモーター断片（ｍｉｎＣＭＶプロモーター）、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、およびＣＫ６プロモーター、トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータ－アクチン／ウサギベータ－グロビンプロモーター（ＣＡＧプロモーター；Ｎｉｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１９９１，１０８（２）：１９３～９頁）、および伸長因子１－アルファプロモーター（ＥＦ１－アルファ）プロモーター（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１９９０，９１（２）：２１７～２３頁およびＧｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１９９６，３（９）：８０２～１０頁）が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ヒトベータ－グルクロニダーゼプロモーター、またはニワトリベータ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーターに連結したサイトメガロウイルスエンハンサーを含む。プロモーターは、構成的、誘導可能、または抑制可能なプロモーターでありうる。いくつかの実施形態において、プロモーターは、眼の細胞において異種核酸を発現することができる。いくつかの実施形態において、プロモーターは、光受容細胞またはＲＰＥにおいて異種核酸を発現することができる。実施形態において、プロモーターは、ロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーター、例えばヒトＲＫプロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターはオプシンプロモーター、例えばヒトオプシンプロモーターまたはマウスオプシンプロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、桿体オプシンプロモーター、錐体オプシンプロモーター、ベータホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）プロモーター、網膜色素変性症（ＲＰ１）プロモーター、または光受容体間レチノイド結合タンパク質遺伝子（ＩＲＢＰ）プロモーターである。

【0221】

誘導可能なプロモーターは、遺伝子発現の調節を可能にし、外部から供給された化合物、温度のような環境要因、もしくは特異的生理状態、例えば急性期、細胞の特定の分化状態の存在によって、または複製中の細胞に限って調節することができる。誘導可能なプロモーターおよび誘導可能なシステムは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、およびＡｒｉａｄを含むがこれらに限定されるわけではない、多様な販売元から入手可能である。他の多くのシステムが記載されており、当業者が容易に選択することができる。外部から供給されるプロモーターによって調節される誘導可能なプロモーターの例には、亜鉛で誘導可能なヒツジメタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）で誘導可能なマウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＭＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターシステム（国際公開第９８／１００８８号）、エクジソン昆虫プロモーター（Ｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：３３４６～３３５１頁（１９９６））、テトラサイクリン発現抑制可能なシステム（Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７～５５５１頁（１９９２））、テトラサイクリンで誘導可能なシステム（Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６～１７６９頁（１９９５）、同様にＨａｒｖｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２：５１２～５１８頁（１９９８）も参照されたい）、ＲＵ４８６で誘導可能なシステム（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５：２３９～２４３頁（１９９７）、およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，４：４３２～４４１頁（１９９７））ならびにラパマイシンで誘導可能なシステム（Ｍａｇａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．
Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：２８６５～２８７２頁（１９９７））が挙げられる。本文において有用でありうるさらに他の型の誘導可能なプロモーターは、特異的生理状態、例えば温度、急性期、細胞の特定の分化状態によって、または複製中の細胞に限って調節されるプロモーターである。

【0222】

別の実施形態において、トランスジーンのネイティブプロモーターまたはその断片が使用される。ネイティブプロモーターは、トランスジーンの発現がネイティブの発現を模倣することが望ましいときに使用することができる。トランスジーンの発現を時間的もしくは発達的に、または組織特異的に、または特異的転写刺激に応答して調節しなければならないとき、ネイティブプロモーターを使用してもよい。さらなる実施形態において、エンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位、またはコザックコンセンサス配列のような他のネイティブ発現制御エレメントもまた、ネイティブ発現を模倣するために使用してもよい。

【0223】

いくつかの実施形態において、調節配列は、組織特異的遺伝子発現能を付与する。一部の場合において、組織特異的調節配列は、組織特異的に転写を誘導する組織特異的転写因子に結合する。そのような組織特異的調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー等）は、当技術分野で周知である。例示的な組織特異的調節配列には、以下の組織特異的プロモーターが挙げられるがこれらに限定されるわけではない：ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１３：５０３～１５頁（１９９３））、ニューロフィラメント軽鎖遺伝子プロモーター（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６１１～５頁（１９９１））、およびニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子プロモーター（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，１５：３７３～８４頁（１９９５））のようなニューロン特異的プロモーター。いくつかの実施形態において、組織特異的プロモーターは、神経核（ＮｅｕＮ）、グリア原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、腺腫性大腸ポリポーシス（ＡＰＣ）、およびイオン化カルシウム結合アダプター分子１（Ｉｂａ－１）から選択される遺伝子のプロモーターである。他の適切な組織特異的プロモーターは、当業者に明らかであろう。いくつかの実施形態において、プロモーターはニワトリベータ－アクチンプロモーターである。

【0224】

本発明は、ウイルス粒子、例えば以下に記述されるウイルス粒子にパッケージングするために、１つまたはそれ以上の核酸配列（例えば、ガイドＲＮＡおよび／またはＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列）を導入するための組み換え型ウイルスゲノムの使用を企図する。組換えウイルスゲノムは、ガイドＲＮＡおよび／またはＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を確立するための任意のエレメント、例えば、プロモーター、ＩＴＲ、リボソーム結合エレメント、ターミネーター、エンハンサー、選択マーカー、イントロン、ポリＡシグナル、および／または複製開始点を含みうる。例示的なウイルスゲノムエレメントおよび多様なウイルス粒子の送達方法を以下により詳細に説明する。

【0225】

非ウイルス送達システム
通常の非ウイルス遺伝子移入方法もまた、細胞または標的組織に核酸を導入するために使用することができる。非ウイルスベクター送達システムは、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡまたはＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列）、裸の核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、および送達システムと複合体形成した核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む。例えば、ベクターは、脂質（例えば、カチオン性または中性脂質）、リポソーム、ポリカチオン、ナノ粒子、または核酸の細胞取り込みを増強する試剤と複合体形成してもよい。ベクターは、本明細書において記述されるいかなる送達方法にも適した試剤と複合体を形成することができる。

【0226】

核酸の非ウイルス送達方法は、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、ナノ粒子（例えば、Ｊｉｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５４４：５４７～５５７頁）、ビロゾーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン、または脂質：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、および試剤によるＤＮＡの取り込みの増強を含む。リポフェクションは、例えば米国特許第５，０４９，３８６号、第４，９４６，７８７号；および第４，８９７，３５５号に記述され、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）、およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションにとって適したカチオン性および中性の脂質は、Ｆｅｌｇｎｅｒ、国際公開第９１／１７４２４号；国際公開第９１／１６０２４号に記載の脂質を含む。

【0227】

免疫脂質複合体のような標的化リポソームを含む、脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４～４１０頁（１９９５）；Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２９１～２９７頁（１９９５）：Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２～３８９頁（１９９４）；Ｒｅｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７～６５４頁（１９９４）；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０～７２２頁（１９９５）；Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：４８１７～４８２０頁（１９９２）；米国特許第４，１８６，１８３号、第４，２１７，３４４号、第４，２３５，８７１号、第４，２６１，９７５号、第４，４８５，０５４号、第４，５０１，７２８号、第４，７７４，０８５号、第４，８３７，０２８号、および第４，９４６，７８７号を参照されたい）。

【0228】

本開示のベクターと複合体形成することができる他の化合物には、カチオン性ペプチド（例えば、ポリＬ－リシン）、塩（例えば、リン酸カルシウム）、ＤＥＡＥデキストラン、デンドリマー（例えば、ポリアミドアミンまたはＰＡＭＡＭ）、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、およびそのコンジュゲート等が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。そのような試剤のより詳細な考察に関しては、例えば、Ｌｕｏ，Ｄ．ａｎｄ Ｓａｌｔｚｍａｎ，Ｗ．Ｍ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：３３～３７頁を参照されたい。

【0229】

いくつかの実施形態において、核酸は医薬製剤中にある。いくつかの実施形態において、医薬製剤は、薬学的に許容される担体を含む。そのような担体は当技術分野で周知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１０３５～１０３８頁および１５７０～１５８０頁を参照されたい）。いくつかの実施形態において、本明細書において記述される核酸と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物は、眼の注射にとって適している。そのような薬学的に許容される担体は、滅菌液体、例えば水、および石油、動物、植物、または合成起源の油を含む油、例えば落花生油、ダイズ油、鉱油等を含む油でありうる。食塩水溶液およびデキストロース水溶液、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびグリセロール溶液もまた、特に注射用溶液のための液体担体として使用することができる。医薬組成物はさらに、追加の成分、例えば保存剤、緩衝剤、等張剤、抗酸化剤および安定剤、非イオン性湿潤剤または清澄剤、増粘剤等を含みうる。本明細書において記述される医薬組成物は、単回単位用量または複数回単位用量に包装することができる。組成物は一般的に、無菌的で実質的に等張の溶液として製剤化される。

【0230】

ウイルス粒子
いくつかの実施形態において、ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベ
クター、組換えアデノウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクター、または組換え単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターである。

【0231】

ｒＡＡＶ粒子
いくつかの実施形態において、ベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実施形態において、第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡ、またはＣａｓタンパク質の１つまたはそれ以上をコードする核酸は、１つまたはそれ以上のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列がその両端に位置する。いくつかの実施形態において、ウイルス粒子は、１つまたは２つのＩＴＲが両端に位置するトランスジーンを含む核酸を含む組換えＡＡＶ粒子である。いくつかの実施形態において、第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡ、またはＣａｓタンパク質の１つまたはそれ以上をコードする核酸は２つのＡＡＶ ＩＴＲがその両端に位置する。

【0232】

いくつかの実施形態において、核酸は、転写の方向に構成要素が作動可能に連結された、本開示の１つまたは２つのガイドＲＮＡ、および／または本開示のＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列、転写開始および終止配列を含む制御配列を含み、それによって発現カセットを形成する。発現カセットは、５’および３’末端上で少なくとも１つの機能的ＡＡＶ ＩＴＲ配列が両端に位置する。「機能的ＡＡＶ ＩＴＲ配列」とは、ＩＴＲ配列がＡＡＶビリオンのレスキュー、複製、およびパッケージングに関して意図されるように機能することを意味する。その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２０００，９７（７）３４２８～３２頁；Ｐａｓｓｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００３，７７（１２）：７０３４～４０頁；およびＰｅｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２００９，１６：１０～１６頁を参照されたい。本発明のいくつかの態様の実施に関して、組換えベクターは、キャプシド封入に必須のＡＡＶの配列およびｒＡＡＶによる感染のための物理的構造の少なくとも全てを含む。本発明のベクターにおいて使用するためのＡＡＶ ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列（例えば、Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１９９４，５：７９３～８０１頁に記述されるように）を有する必要はなく、ヌクレオチドの挿入、欠失、もしくは置換によって変化してもよく、またはＡＡＶ ＩＴＲはいくつかのＡＡＶ血清型のいずれに由来してもよい。ＡＡＶの４０超の血清型が現在公知であり、新規血清型および既存の血清型の変異体が絶えず同定されている。Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２００２，９９（１８）：１１８５４～６頁；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２００３，１００（１０）：６０８１～６頁；およびＢｏｓｓｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００３，７７（１２）：６７９９～８１０頁を参照されたい。

【0233】

任意のＡＡＶ血清型の使用が本発明の範囲内で検討される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、以下を含むがこれらに限定されるわけではないＡＡＶ血清型に由来するベクターである。ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ
ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ ＩＴＲなどである。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ中の核酸は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶなどである、ＡＡＶ ＩＴＲのＩＴＲを含む。ある特定の実施形態において、ＡＡＶ ＩＴＲｓはＡＡＶ２ ＩＴＲである。

【0234】

いくつかの実施形態において、ベクターは、スタッファー核酸を含みうる。いくつかの実施形態において、スタッファー核酸は、緑色蛍光タンパク質をコードしうる。いくつかの実施形態において、スタッファー核酸は、プロモーターと、１つまたはそれ以上の本開
示の１つもしくは２つのガイドＲＮＡおよび／または本開示のＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列との間に位置しうる。

【0235】

いくつかの態様において、本発明は、組換え自己相補的ゲノムを含むウイルス粒子を提供する。いくつかの実施形態において、ベクターは自己相補的ベクターである。自己相補的ゲノムを有するＡＡＶウイルス粒子および自己相補的ＡＡＶゲノムを使用する方法は、その全体が参照により本明細書に組み入れられている、米国特許第６，５９６，５３５号；第７，１２５，７１７号；第７，７６５，５８３号；第７，７８５，８８８号；第７，７９０，１５４号；第７，８４６，７２９号；第８，０９３，０５４号；および第８，３６１，４５７号；ならびにＷａｎｇ Ｚ．，ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０：２１０５～２１１１頁に記述されている。自己相補的ゲノムを含むｒＡＡＶは、その部分的に相補的な配列（例えば、トランスジーンの相補的なコードおよび非コード鎖）のために、急速に二本鎖ＤＮＡ分子を形成する。いくつかの実施形態において、本発明は、ＡＡＶゲノムを含むＡＡＶウイルス粒子を提供し、ｒＡＡＶゲノムは、第１の異種ポリヌクレオチド配列（例えば、本開示の１つまたは２つのガイドＲＮＡおよび／または本開示のＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列）と、第２の異種ポリヌクレオチド配列（例えば、本開示の１つまたは２つのガイドＲＮＡの非コードまたはアンチセンス鎖および／または本開示のＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列）とを含み、第１の異種ポリヌクレオチド配列は、その長さのほとんどまたは全てに沿って、第２のポリヌクレオチド配列と鎖内塩基対を形成することができる。

【0236】

いくつかの実施形態において、第１の異種ポリヌクレオチド配列および第２の異種ポリヌクレオチド配列は、鎖内塩基対形成、例えばヘアピンＤＮＡ構造を促進する配列によって連結される。例えばｓｉＲＮＡ分子におけるヘアピン構造は、当技術分野で公知である。いくつかの実施形態において、第１の異種ポリヌクレオチド配列および第２の異種ポリヌクレオチド配列は、突然変異ＩＴＲ（例えば、右のＩＴＲ）によって連結される。突然変異ＩＴＲは、末端解離配列を含むＤ領域の欠失を含む。その結果、ＡＡＶウイルスゲノムが複製すると、ｒｅｐタンパク質は、突然変異ＩＴＲでウイルスゲノムを切断せず、そのため、以下を５’から３’の順に含む組換えウイルスゲノムが、ウイルスキャプシドにパッケージングされる：ＡＡＶ ＩＴＲ、調節配列を含む第１の異種ポリヌクレオチド配列、突然変異ＡＡＶ ＩＴＲ、第１の異種ポリヌクレオチドとは逆方向の第２の異種ポリヌクレオチド、および第３のＡＡＶ ＩＴＲ。

【0237】

いくつかの実施形態において、第１の異種核酸配列および第２の異種核酸配列は、突然変異ＩＴＲ（例えば、右のＩＴＲ）によって連結される。いくつかの実施形態において、ＩＴＲは、ポリヌクレオチド配列５’－ＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧ－３’（配列番号２４）を含む。突然変異ＩＴＲは、末端解離配列を含むＤ領域の欠失を含む。その結果、ＡＡＶウイルスゲノムが複製すると、ｒｅｐタンパク質は、突然変異ＩＴＲでウイルスゲノムを切断せず、そのため、以下を５’から３’の順に含む組換えウイルスゲノムが、ウイルスキャプシドにパッケージングされる：ＡＡＶ ＩＴＲ、調節配列を含む第１の異種ポリヌクレオチド配列、突然変異ＡＡＶ ＩＴＲ、第１の異種ポリヌクレオチドとは逆方向の第２の異種ポリヌクレオチド、および第３のＡＡＶ ＩＴＲ。

【0238】

いくつかの実施形態において、ベクターはウイルス粒子にキャプシド封入される。いくつかの実施形態において、ウイルス粒子は、組換えＡＡＶベクターを含む組換えＡＡＶウイルス粒子である。異なるＡＡＶ血清型を使用して、特定の標的細胞の形質導入を最適化する、または特定の標的組織（例えば、眼の組織）内の特異的細胞型を標的とすることができる。ｒＡＡＶ粒子は、同じ血清型または混合血清型のウイルスタンパク質およびウイ
ルス核酸を含みうる。例えば、いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、本発明のＡＡＶ２キャプシドタンパク質と少なくとも１つのＡＡＶ２ ＩＴＲとを含むことができ、またはＡＡＶ２キャプシドタンパク質と少なくとも１つのＡＡＶ１ ＩＴＲとを含むことができる。ｒＡＡＶ粒子の産生のためのＡＡＶ血清型のいかなる組み合わせも、それぞれの組み合わせが本明細書において明白に述べられていたかのように本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、本発明は、本発明のＡＡＶ２キャプシドを含むｒＡＡＶ粒子を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、本発明のＡＡＶｒｈ８Ｒキャプシドを含むｒＡＡＶ粒子を提供する。

【0239】

いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１キャプシド、ＡＡＶ２キャプシド、ＡＡＶ３キャプシド、ＡＡＶ４キャプシド、ＡＡＶ５キャプシド、ＡＡＶ６キャプシド（例えば、野生型ＡＡＶ６キャプシド、または米国特許付与前公報第２０１２／０１６４１０６号に記述されるＳｈＨ１０のような変異体ＡＡＶ６キャプシド）、ＡＡＶ７キャプシド、ＡＡＶ８キャプシド、ＡＡＶｒｈ８キャプシド、ＡＡＶｒｈ８Ｒキャプシド、ＡＡＶ９キャプシド（例えば、野生型ＡＡＶ９キャプシド、または米国特許付与前公報第２０１３／０３２３２２６号に記述される改変されたＡＡＶ９キャプシド）、ＡＡＶ１０キャプシド、ＡＡＶｒｈ１０キャプシド、ＡＡＶ１１キャプシド、ＡＡＶ１２キャプシド、チロシンキャプシド突然変異体、ヘアピン結合キャプシド突然変異体、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａキャプシド、ＡＡＶＡＡＶ２／２－７ｍ８キャプシド、ＡＡＶ ＤＪキャプシド（例えば、ＡＡＶ－ＤＪ／８キャプシド、ＡＡＶ－ＤＪ／９キャプシド、または米国特許付与前公報第２０１２／００６６７８３号に記述される他の任意のキャプシド）、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａキャプシド、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａキャプシド、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａキャプシド、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋキャプシド、ヤギＡＡＶキャプシド、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラキャプシド、ウシＡＡＶキャプシド、マウスＡＡＶキャプシド、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１キャプシド、または米国特許第８，２８３，１５１号もしくは国際出願国際公開第２００３／０４２３９７号に記述されるＡＡＶキャプシドを含む。いくつかの実施形態において、突然変異体キャプシドタンパク質は、ＡＡＶキャプシドの形成能を維持する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子はＡＡＶ５チロシン突然変異体キャプシドを含む（Ｚｈｏｎｇ Ｌ．ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０５（２２）：７８２７～７８３２頁）。さらなる実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、クレードＡ～ＦのＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質を含む（Ｇａｏ，ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００４，７８（１２）：６３８１頁）。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１キャプシドタンパク質またはその突然変異体を含む。他の実施形態において、ｒＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質またはその突然変異体を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、またはＡＡＶｒｈ１０である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）キャプシドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）キャプシドを含む。いくつかの実施形態において、組換えＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、および／またはＡＡＶｒｈ１０キャプシドを含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、および／またはＡＡＶｒｈ１０キャプシドは、例えば以下に記述されるチロシン突然変異またはヘパラン結合突然変異を含む。

【0240】

ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶｒｈ８Ｒ等）のキャプシドは、３つのキャプシドタンパク質：ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３を含むことが知られている。これらのタンパク質は、有意な量の重なり合うアミノ酸配列および独自のＮ末端配列を含む。ＡＡＶ２キャプシドは、正二十面体の対称性で配置される６０のサブユニットを含む（Ｘｉｅ，Ｑ．，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９（１６）：１０
４０５～１０頁）。ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３は、１：１：１０の比率で存在することが見出されている。

【0241】

ＡＡＶ２キャプシドタンパク質とＨＳＰＧの間の結合は、塩基性のＡＡＶ２キャプシドタンパク質残基と陰性荷電のグリコサミノグリカン残基との間の静電気相互作用を介して起こることが知られている（Ｏｐｉｅ，ＳＲ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：６９９５～７００６頁；Ｋｅｒｎ，Ａ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：１１０７２～１１０８１頁）。これらの相互作用に関係する特異的キャプシド残基は、Ｒ４８４、Ｒ４８７、Ｋ５３２、Ｒ５８５、およびＲ５８８を含む。これらの残基における突然変異は、Ｈｅｌａ細胞およびヘパランそのものに対するＡＡＶ２の結合を低減させることが示されている（Ｏｐｉｅ，ＳＲ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：６９９５～７００６頁；Ｋｅｒｎ，Ａ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：１１０７２～１１０８１頁；国際公開第２００４／０２７０１９
Ａ２号、米国特許第７，６２９，３２２号）。さらに、理論に捉われることを望むものではないが、ＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づくナンバリングのアミノ酸４８４、４８７、５３２、５８５、または５８８位に対応する１つまたはそれ以上の残基でのアミノ酸置換は、ＨＳＰＧに結合しないＡＡＶキャプシド型の形質導入特性を調節し得るか、またはそのＨＳＰＧの結合能とは無関係にＡＡＶキャプシド型の形質導入特性を調節し得ると考えられている。

【0242】

いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＨＳＰＧと相互作用する残基で、またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づくナンバリングのアミノ酸４８４、４８７、５３２、５８５、または５８８位に対応する１つまたはそれ以上の残基で、キャプシドタンパク質において突然変異を有する。したがって、いくつかの実施形態において、送達時に、ｒＡＡＶベクターによってコードされる異種核酸は、参照ｒＡＡＶキャプシドタンパク質（例えば、野生型ｒＡＡＶキャプシドタンパク質）を含むｒＡＡＶキャプシドを含むｒＡＡＶ粒子の異種核酸の発現レベルと比較して、増加した発現レベルで発現される。いくつかの実施形態において、核酸の発現は、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％増加する。いくつかの実施形態において、送達時に、ｒＡＡＶ粒子は、参照ｒＡＡＶキャプシドタンパク質（例えば、野生型ｒＡＡＶキャプシドタンパク質）を含むｒＡＡＶ粒子と比較して、低減された神経炎症を引き起こす。いくつかの実施形態において、神経炎症は、なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％低減される。適した参照ｒＡＡＶキャプシドタンパク質は、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を欠如する任意のキャプシドタンパク質を含みうる（このため、参照キャプシドは、ＨＳＰＧに対する結合を変化させない１つまたはそれ以上の「バックグラウンド」置換を含みうる）。

【0243】

いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ａ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶキャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶキャプシド、およびｂ）異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ逆方向末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含む。

【0244】

いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換により、ヘパラン硫酸プロテオグリカンに対するｒＡＡＶ粒子の結合は、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％低減する。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換により、ヘパラン硫酸プロテオグリカンに対するｒＡＡＶ粒子の結合は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも
約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％（野生型キャプシドを含むｒＡＡＶ粒子の結合と比較して）低減する。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換により、ヘパラン硫酸プロテオグリカンに対するｒＡＡＶ粒子の結合は、約１０％～約１００％、約２０％～約１００％、約３０％～約１００％、約４０％～約１００％、約５０％～約１００％、約６０％～約１００％、約７０％～約１００％、約８０％～約１００％、約９０％～約１００％、約１０％～約９０％、約２０％～約９０％、約３０％～約９０％、約４０％～約９０％、約５０％～約９０％、約６０％～約９０％、約７０％～約９０％、約８０％～約９０％、約１０％～約８０％、約２０％～約８０％、約３０％～約８０％、約４０％～約８０％、約５０％～約８０％、約６０％～約８０％、約７０％～約８０％、約１０％～約７０％、約２０％～約７０％、約３０％～約７０％、約４０％～約７０％、約５０％～約７０％、約６０％～約７０％、約１０％～約６０％、約２０％～約６０％、約３０％～約６０％、約４０％～約６０％、約５０％～約６０％、約１０％～約５０％、約２０％～約５０％、約３０％～約５０％、約４０％～約５０％、約１０％～約４０％、約２０％～約４０％、約３０％～約４０％、約１０％～約３０％、約２０％～約３０％、または約１０％～約２０％のうちの任意の割合だけ（野生型キャプシドを含むｒＡＡＶ粒子の結合と比較して）低減する。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換によって、野生型ｒＡＡＶ粒子の結合と比較して、ヘパラン硫酸プロテオグリカンに対するｒＡＡＶ粒子の検出可能な結合が起こらない。ＨＳＰＧに対するＡＡＶ粒子の結合、例えば、ヘパラン硫酸クロマトグラフィー培地に対する結合、またはその表面上にＨＳＰＧを発現することが知られている細胞に対する結合を測定する手段は、当技術分野で公知である。例えば、Ｏｐｉｅ，ＳＲ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：６９９５～７００６頁およびＫｅｒｎ，Ａ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：１１０７２～１１０８１頁を参照されたい。

【0245】

いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ヘパラン硫酸プロテオグリカンに対するｒＡＡＶ粒子の結合を低減または消失させるキャプシドタンパク質の１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含み、および／または１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づくナンバリングのアミノ酸４８４、４８７、５３２、５８５、または５８８位に存在する。本明細書において使用される「ＡＡＶ２のＶＰ１に基づくナンバリング」とは、ＡＡＶ２のＶＰ１の列挙されたアミノ酸に対応する列挙されたキャプシドタンパク質のアミノ酸を指す。例えば、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換が、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づくナンバリングの３４７、３５０、３９０、３９５、４４８、４５１、４８４、４８７、５２７、５３２、５８５、および／または５８８位に存在する場合、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸３４７、３５０、３９０、３９５、４４８、４５１、４８４、４８７、５２７、５３２、５８５、および／または５８８に対応する列挙されたキャプシドタンパク質のアミノ酸におけるものである。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１の４８４、４８７、５３２、５８５、または５８８位に存在する。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づくナンバリングの、ＡＡＶ３のＶＰ１の４８４、４８７、５３２、５８５、または５８８位に存在する。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づくナンバリングの４８５、４８８、５２８、５３３、５８６、または５８９位に存在する。いくつかの実施形態において、アミノ酸５８５および／または５８８（ＡＡＶ２のＶＰ１に基づくナンバリング）に対応する位置の１つまたはそれ以上のアミノ酸は、アルギニン残基で置換されている（例えば、ＡＡＶ１またはＡＡＶ６に関してＳ５８６および／またはＴ５８９；ＡＡＶ９に関してＳ５８６および／またはＡ５８９；ＡＡＶｒｈ８Ｒに関してＡ５８６および／またはＴ５８９；ＡＡＶ８に関して
Ｑ５８８および／またはＴ５９１；ならびにＡＡＶｒｈ１０に関してＱ５８８および／またはＡ５９１）。他の実施形態において、アミノ酸４８４、４８７、５２７、および／または５３２（ＡＡＶ２のＶＰ１に基づくナンバリング）に対応する位置の１つまたはそれ以上のアミノ酸（例えば、アルギニンまたはリシン）は、アラニンのような非陽性荷電アミノ酸で置換されている（例えば、ＡＡＶ１またはＡＡＶ６に関してＲ４８５、Ｒ４８８、Ｋ５２８、および／またはＫ５３３；ＡＡＶ９またはＡＡＶｒｈ８Ｒに関してＲ４８５、Ｒ４８８、Ｋ５２８、および／またはＲ５３３；ならびにＡＡＶ８またはＡＡＶｒｈ１０に関してＲ４８７、Ｒ４９０、Ｋ５３０、および／またはＲ５３５）。

【0246】

他のウイルス粒子
いくつかの実施形態において、ベクターは組換えアデノウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ウイルス粒子はアデノウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、アデノウイルス粒子は組換えアデノウイルス粒子、例えば本開示の１つまたは２つのガイドＲＮＡおよび／または２つのＩＴＲの間に本開示のＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドベクターである。いくつかの実施形態において、アデノウイルス粒子は、アデノウイルスを複製欠損にする１つまたはそれ以上のＥ１遺伝子を欠如するか、または欠損コピーを含む。アデノウイルスは、大きい（約９５０Å）非エンベロープの正二十面体キャプシド内に直線状の二本鎖ＤＮＡゲノムを含む。アデノウイルスは、３０ｋｂ超の異種配列を組み込むことができる大きいゲノムを有し（例えば、Ｅ１および／またはＥ３領域の代わりに）、それによって、それらはより大きい異種遺伝子と共に使用するために独自に適している。それらはまた、分裂中および非分裂細胞に感染することが知られており、宿主ゲノムに本来組み込まれない（ハイブリッド変異体はこの能力を保有しうる）。いくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターは、Ｅ１の代わりに異種配列を有する第一世代アデノウイルスベクターでありうる。いくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターは、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、および／またはＥ４に追加の突然変異または欠失を有する第二世代アデノウイルスベクターでありうる。いくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターは、全てのウイルスコード遺伝子を欠如するが、ＩＴＲおよびパッケージングシグナルのみを保持し、複製およびパッケージングのためにヘルパーアデノウイルスをトランスで必要とする第三世代またはｇｕｔｔｅｄアデノウイルスベクターでありうる。アデノウイルス粒子は、哺乳動物細胞の一過性のトランスフェクションのためのベクターとしてならびに遺伝子治療ベクターとしての使用が研究されている。詳しい説明に関しては、Ｄａｎｔｈｉｎｎｅ，Ｘ．ａｎｄ Ｉｍｐｅｒｉａｌｅ，Ｍ．Ｊ．（２０００）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１７０７～１４頁およびＴａｔｓｉｓ，Ｎ．ａｎｄ Ｅｒｔｌ，Ｈ．Ｃ．（２００４）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１０：６１６～２９頁を参照されたい。

【0247】

いくつかの実施形態において、ウイルス粒子は、本開示の１つまたは２つのガイドＲＮＡおよび／または本開示のＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む組換えアデノウイルス粒子である。任意のアデノウイルス血清型の使用が、本発明の範囲内で検討される。いくつかの実施形態において、組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型２、１、５、６、１９、３、１１、７、１４、１６、２１、１２、１８、３１、８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２４～３０、３７、４０、４１、ＡｄＨｕ２、ＡｄＨｕ３、ＡｄＨｕ４、ＡｄＨｕ２４、ＡｄＨｕ２６、ＡｄＨｕ３４、ＡｄＨｕ３５、ＡｄＨｕ３６、ＡｄＨｕ３７、ＡｄＨｕ４１、ＡｄＨｕ４８、ＡｄＨｕ４９、ＡｄＨｕ５０、ＡｄＣ６、ＡｄＣ７、ＡｄＣ６９、ウシＡｄ３型、イヌＡｄ２型、ヒツジＡｄ、またはブタＡｄ３型を含むがこれらに限定されるわけではない、アデノウイルス血清型に由来するベクターである。いくつかの実施形態において、組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型２またはアデノウイルス血清型５の変異体に由来する。

【0248】

いくつかの実施形態において、ベクターは、ウイルス粒子にキャプシド封入されている。いくつかの実施形態において、ウイルス粒子は、組換えアデノウイルスベクターをキャプシド封入する組換えアデノウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子は、１つまたはそれ以上の外来のウイルスキャプシドタンパク質と組み合わせてアデノウイルス粒子を含む。そのような組み合わせを、偽型化された組換えアデノウイルス粒子と呼ぶ。いくつかの実施形態において、偽型化された組換えアデノウイルス粒子において使用される外来のウイルスキャプシドタンパク質は、外来のウイルスまたはもう一つのアデノウイルスの血清型に由来する。いくつかの実施形態において、外来のウイルスキャプシドタンパク質は、レオウイルス３型を含むがこれらに限定されるわけではないウイルスに由来する。偽型化されたアデノウイルス粒子において使用されるベクターとキャプシドタンパク質の組み合わせの例は、以下の参考文献に見出すことができる（Ｔａｔｓｉｓ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１０（４）：６１６～６２９頁、およびＡｈｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１１（４）：３０７～３２０頁）。異なるＨＳＶ血清型を使用して、特定の標的細胞の形質導入を最適化する、または特定の標的組織（例えば、疾患組織）内の特異的細胞型を標的とすることができる。特異的アデノウイルス血清型が標的とする組織または細胞には、肺（例えば、ＨｕＡｄ３）、脾臓および肝臓（例えば、ＨｕＡｄ３７）、平滑筋、滑膜細胞、樹状細胞、心血管細胞、腫瘍細胞株（例えば、ＨｕＡｄ１１）、および樹状細胞（例えば、レオウイルス３型によって偽型化されたＨｕＡｄ５、ＨｕＡｄ３０、またはＨｕＡｄ３５）が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。詳しい説明に関しては、Ａｈｉ、Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１１（４）：３０７～３２０頁、Ｋａｙ、Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７（１）：３３～４０頁、およびＴａｔｓｉｓ、Ｎ．ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１０（４）：６１６～６２９頁を参照されたい。いくつかの実施形態において、組換えアデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型２、１、５、６、１９、３、１１、７、１４、１６、２１、１２、１８、３１、８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２４－３０、３７、４０、４１、ＡｄＨｕ２、ＡｄＨｕ３、ＡｄＨｕ４、ＡｄＨｕ２４、ＡｄＨｕ２６、ＡｄＨｕ３４、ＡｄＨｕ３５、ＡｄＨｕ３６、ＡｄＨｕ３７、ＡｄＨｕ４１、ＡｄＨｕ４８、ＡｄＨｕ４９、ＡｄＨｕ５０、ＡｄＣ６、ＡｄＣ７、ＡｄＣ６９、ウシＡｄ３型、イヌＡｄ２型、ヒツジＡｄ、またはブタＡｄ３型を含むがこれらに限定されるわけではない、アデノウイルス血清型からのキャプシドを含みうる。いくつかの実施形態において、組換えアデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型２キャプシドまたはアデノウイルス血清型５キャプシドの変異体を含む。

【0249】

いくつかの実施形態において、ベクターは、組換えレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ウイルス粒子はレンチウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、レンチウイルス粒子は、組換えレンチウイルス粒子、例えば２つのＬＴＲの間に本開示の１つまたは２つのガイドＲＮＡおよび／または本開示のＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドベクターである。レンチウイルスは、およそ１０ｋｂのゲノムを有するプラスセンスのｓｓＲＮＡレトロウイルスである。レンチウイルスは、分裂中および非分裂細胞のゲノムに組み込まれることが知られている。レンチウイルス粒子は、例えば、多数のプラスミド（典型的に、レンチウイルスゲノムと、複製および／またはパッケージングのために必要な遺伝子とは、ウイルス複製を防止するために分離される）を、改変されたレンチウイルスゲノムをレンチウイルス粒子にパッケージングするパッケージング細胞株にトランスフェクトすることによって産生することができる。いくつかの実施形態において、レンチウイルス粒子は、エンベロープタンパク質を欠如する第一世代ベクターを指しうる。いくつかの実施形態において、レンチウイルス粒子は、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｔａｔ／ｒｅｖ領域を除く全ての遺伝子を欠如する第二世代ベクターを指しうる。いくつかの実施形態において、レンチウイルス粒子は、内因性のｒｅｖ、ｇａｇ、およびｐｏｌ遺伝子のみを含み、ｔａｔ遺伝子を有しない形質導入
のためのキメラＬＴＲを有する第三世代ベクターを指しうる（Ｄｕｌｌ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３～７１頁を参照されたい）。詳しい説明に関しては、Ｄｕｒａｎｄ，Ｓ．ａｎｄ Ｃｉｍａｒｅｌｌｉ，Ａ．（２０１１）Ｖｉｒｕｓｅｓ ３：１３２～５９頁を参照されたい。

【0250】

いくつかの実施形態において、ウイルス粒子は、本開示の１つまたは２つのガイドＲＮＡおよび／または本開示のＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む組換えレンチウイルス粒子である。任意のレンチウイルスベクターの使用が、本発明の範囲内において検討される。いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルス－１（ＨＩＶ－１）、ヒト免疫不全ウイルス－２（ＨＩＶ－２）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ジェンブラナ病ウイルス（ＪＤＶ）、ビスナウイルス（ＶＶ）、およびヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）を含むがこれらに限定されるわけではないレンチウイルスに由来する。

【0251】

いくつかの実施形態において、ベクターは、ウイルス粒子にキャプシド封入される。いくつかの実施形態において、ウイルス粒子は、組換えレンチウイルスベクターをキャプシド封入する組換えレンチウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子は、１つまたはそれ以上の外来のウイルスキャプシドタンパク質と組み合わせてレンチウイルスベクターを含む。そのような組み合わせを、偽型化された組換えレンチウイルス粒子と呼ぶ。いくつかの実施形態において、偽型化された組換えレンチウイルス粒子に使用される外来ウイルスキャプシドタンパク質は、外来ウイルスに由来する。いくつかの実施形態において、偽型化された組換えレンチウイルス粒子に使用される外来ウイルスキャプシドタンパク質は、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ－ＧＰ）である。ＶＳＶ－ＧＰは、遍在する細胞受容体と相互作用して、偽型化された組換えレンチウイルス粒子に対して広い組織向性を提供する。加えて、ＶＳＶ－ＧＰは、偽型化された組換えレンチウイルス粒子に対してより高い安定性を提供すると考えられる。他の実施形態において、外来のウイルスキャプシドタンパク質は、チャンディプラウイルス、狂犬病ウイルス、モコラウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、エボラウイルスレストン株、エボラウイルスザイール株、マールブルグウイルス、ラッサウイルス、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）、ヤーグジークテヒツジレトロウイルス（ＪＳＲＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）、ネコ内在性レトロウイルス（ＲＤ１１４）、ヒトＴ－リンパ好性ウイルス（ＨＴＬＶ－１）、ヒトフォーミーウイルス、マエディ・ビスナウイルス（ＭＶＶ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、センダイウイルス、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス３型、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、インフルエンザウイルス、トリペストウイルス（ＦＰＶ）、またはカイコ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）を含むがこれらに限定されるわけではないウイルスに由来する。

【0252】

いくつかの実施形態において、組換えレンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モカラウイルス、狂犬病ウイルス、ＲＤ１１４、またはその変異体によって偽型化されたレンチウイルスに由来する。偽型化されたレンチウイルス粒子において使用されるベクターとキャプシドタンパク質の組み合わせの例は、例えば、Ｃｒｏｎｉｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００５）．Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５（４）：３８７－３９８に見出すことができる。異なる偽型化された組換えレンチウイルス粒子を使用して、特定の標的細胞の形質導入を最適化する、または特定の標的組織（例えば、疾患組織）内の特異的細胞型を標的とすることができる。例えば、特異的偽型化された組換えレンチウイルス粒子が標的とする組織には、肝臓（例えば、ＶＳ
Ｖ－Ｇ、ＬＣＭＶ、ＲＲＶ、またはＳｅＶ Ｆタンパク質によって偽型化される）、肺（例えば、エボラ、マールブルグ、ＳｅＶ ＦおよびＨＮ、またはＪＳＲＶタンパク質によって偽型化される）、膵島細胞（例えば、ＬＣＭＶタンパク質によって偽型化される）、中枢神経系（例えば、ＶＳＶ－Ｇ、ＬＣＭＶ、狂犬病、またはモカラタンパク質によって偽型化される）、網膜（例えば、ＶＳＶ－Ｇまたはモカラタンパク質によって偽型化される）、単球または筋肉（例えば、モカラまたはエボラタンパク質によって偽型化される）、造血系（例えば、ＲＤ１１４またはＧＡＬＶタンパク質によって偽型化される）、またはがん細胞（例えば、ＧＡＬＶまたはＬＣＭＶタンパク質によって偽型化される）が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。詳しい説明に関しては、Ｃｒｏｎｉｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００５）．Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５（４）：３８７～３９８頁およびＫａｙ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７（１）：３３～４０頁を参照されたい。いくつかの実施形態において、組換えレンチウイルス粒子は、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モカラウイルス、狂犬病ウイルス、ＲＤ１１４、またはその変異体によって偽型化されたキャプシドを含む。

【0253】

いくつかの実施形態において、ベクターは、ｒＨＳＶベクターである。いくつかの実施形態において、ウイルス粒子は単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）粒子である。いくつかの実施形態において、ＨＳＶ粒子は、ｒＨＳＶ粒子、例えば、２つのＴＲの間に本開示の１つまたは２つのガイドＲＮＡおよび／または本開示のＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドベクターである。ＨＳＶは、およそ１５２ｋｂのゲノムを有するエンベロープを有する二本鎖ＤＮＡウイルスである。有利なことには、その遺伝子のおよそ半数が非必須であり、異種配列に適合させるために欠失させてもよい。ＨＳＶ粒子は非分裂細胞に感染する。加えて、それらは、本来ニューロンに潜伏して定着し、逆行性輸送によって移動し、シナプスを越えて運ばれることから、神経系を巻き込むニューロンのトランスフェクションおよび／または遺伝子治療アプローチにとって有用となる。いくつかの実施形態において、ＨＳＶ粒子は、複製欠損または複製コンピテント（例えば、１つまたはそれ以上の後期遺伝子の不活化を通して単一の複製サイクルに関してコンピテント）でありうる。詳しい説明に関しては、Ｍａｎｓｅｒｖｉｇｉ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｏｐｅｎ Ｖｉｒｏｌ．Ｊ．４：１２３～５６頁を参照されたい。

【0254】

いくつかの実施形態において、ウイルス粒子は、本開示の１つまたは２つのガイドＲＮＡおよび／または本開示のＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含むｒＨＳＶ粒子である。任意のＨＳＶベクターの使用が、本発明の範囲内において考慮される。いくつかの実施形態において、ＨＳＶベクターは、ＨＳＶ－１およびＨＳＶ－２を含むがこれらに限定されるわけではないＨＳＶ血清型に由来する。

【0255】

いくつかの実施形態において、ベクターはウイルス粒子にキャプシド封入される。いくつかの実施形態において、ウイルス粒子は、組換えＨＳＶベクターをキャプシド封入する組換えＨＳＶ粒子である。いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子は、１つまたはそれ以上の外来のウイルスキャプシドタンパク質と組み合わせたＨＳＶベクターを含む。そのような組み合わせを、偽型化されたｒＨＳＶ粒子と呼ぶ。いくつかの実施形態において、偽型化されたｒＨＳＶ粒子に使用される外来ウイルスキャプシドタンパク質は、外来ウイルスまたはもう一つのＨＳＶ血清型に由来する。いくつかの実施形態において、偽型化されたｒＨＳＶ血清型に使用される外来ウイルスキャプシドタンパク質は、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ－ＧＰ）である。ＶＳＶ－ＧＰは、遍在する細胞受容体と相互作用し、偽型化されたｒＨＳＶ粒子に対して広い組織向性を提供する。いくつかの実施形態において、ＶＳＶ－ＧＰは、偽型化されたｒＨＳＶ粒子に対してより高い安定性を提供すると考えられる。他の実施形態において、外来ウイルスキャプシドタンパク質は、異なるＨＳＶ血清型に由来しうる。例えば、ＨＳＶ－１ベクターは、１つまたはそ
れ以上のＨＳＶ－２キャプシドタンパク質を含みうる。異なるＨＳＶ血清型を使用して、特定の標的細胞の形質導入を最適化する、または特定の標的組織（例えば、疾患組織）内の特異的細胞型を標的とすることができる。特異的アデノウイルス血清型が標的とする組織または細胞には、中枢神経系およびニューロン（例えば、ＨＳＶ－１）が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。詳しい説明に関しては、Ｍａｎｓｅｒｖｉｇｉ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｏｐｅｎ Ｖｉｒｏｌ Ｊ ４：１２３～１５６頁，Ｋａｙ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７（１）：３３～４０頁、およびＭｅｉｇｎｉｅｒ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５５（５）：９２１～９３０頁を参照されたい。いくつかの実施形態において、組換えＨＳＶ粒子は、ｒＨＳＶ－１粒子、またはｒＨＳＶ－２ウイルス粒子である。

【0256】

ウイルス粒子の産生
アデノウイルスベクター粒子の産生に関して、多数の方法が当技術分野で公知である。例えば、ｇｕｔｔｅｄアデノウイルスベクターに関して、アデノウイルスベクターゲノムおよびヘルパーアデノウイルスゲノムを、パッケージング細胞株（例えば、２９３細胞株）にトランスフェクトしてもよい。いくつかの実施形態において、ヘルパーアデノウイルスゲノムは、そのパッケージングシグナルの両端に位置する組換え部位を含み、両方のゲノムを、目的のアデノウイルスベクターがヘルパーアデノウイルスより効率的にパッケージングされるように、リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムを使用してもよい）を発現するパッケージング細胞株にトランスフェクトしてもよい（例えば、Ａｌｂａ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２ Ｓｕｐｐｌ １：Ｓ１８～２７頁を参照されたい）。アデノウイルスベクターは、本明細書において記述される方法のような標準的な方法を使用して回収および精製してもよい。

【0257】

レンチウイルスベクター粒子の産生に関して、多数の方法が当技術分野で公知である。例えば、第３世代のレンチウイルスベクターに関して、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を有する目的のレンチウイルスゲノムを含むベクターを、ｒｅｖ遺伝子を含むベクターと共に、パッケージング細胞株（例えば、２９３細胞株）に同時トランスフェクトしてもよい。目的のレンチウイルスゲノムはまた、Ｔａｔの非存在下で転写を促進するキメラＬＴＲも含む（Ｄｕｌｌ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３～７１頁を参照されたい）。レンチウイルスベクターは、本明細書において記述される方法（例えば、Ｓｅｇｕｒａ ＭＭ，ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．１３（７）：９８７～１０１１頁）を使用して回収および使用してもよい。

【0258】

ＨＳＶ粒子の産生に関して、多数の方法が当技術分野で公知である。ＨＳＶベクターは、本明細書において記述される方法のような標準的な方法を使用して回収および精製してもよい。例えば、複製欠損ＨＳＶベクターに関して、最初期（ＩＥ）遺伝子の全てを欠如する目的のＨＳＶゲノムを、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、およびＩＣＰ０のような、ウイルス産生に必要な遺伝子を提供する相補的細胞株にトランスフェクトしてもよい（例えば、Ｓａｍａｎｉｅｇｏ，Ｌ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：３３０７～２０頁を参照されたい）。ＨＳＶベクターは、記述の方法を使用して回収および精製してもよい（例えば、Ｇｏｉｎｓ，ＷＦ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
１１４４：６３～７９頁）。

【0259】

ｒＡＡＶベクターの産生に関して、トランスフェクション、安定な細胞株産生、およびアデノウイルス－ＡＡＶハイブリッド、ヘルペスウイルス－ＡＡＶハイブリッド（Ｃｏｎｗａｙ，ＪＥ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１（１１）：８７８０～８７８９頁）およびバキュロウイルス－ＡＡＶハイブリッドを含む感染性ハイブ
リッドウイルス産生系を含む多数の方法が当技術分野で公知である。ｒＡＡＶウイルス粒子を産生するためのｒＡＡＶ産生培養は全て、１）適した宿主細胞、２）適したヘルパーウイルス機能、３）ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子および遺伝子産物、４）少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲ配列（例えば、サイズ超過のｒＡＡＶベクターゲノム）が両端に位置する核酸（例えば、治療核酸）、および５）ｒＡＡＶ産生を支持するために適した培地および培地成分、を必要とする。いくつかの実施形態において、適した宿主細胞は霊長類の宿主細胞である。いくつかの実施形態において、適した宿主細胞は、ＨｅＬａ、Ａ５４９、２９３、またはＰｅｒｃ．６細胞のようなヒト由来の細胞株である。いくつかの実施形態において、適したヘルパーウイルス機能は、野生型または突然変異体アデノウイルス（温度感受性アデノウイルスのような）、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、バキュロウイルス、またはヘルパー機能を提供するプラスミド構築物によって提供される。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物は、任意のＡＡＶ血清型に由来しうる。一般的に、しかし必須ではないが、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子産物は、ｒｅｐ遺伝子産物がｒＡＡＶゲノムを複製およびパッケージングするように機能しうる限り、ｒＡＡＶベクターゲノムのＩＴＲと同じ血清型の遺伝子産物である。当技術分野で公知の適した培地を、ｒＡＡＶベクターの産生のために使用してもよい。これらの培地には、改変イーグル培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含む、Ｈｙｃｌｏｎｅ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓおよびＪＲＨが製造する培地、米国特許第６，５６６，１１８号に記述される配合のようなカスタム配合、および米国特許第６，７２３，５５１号に記述されるＳｆ－９００ ＩＩ ＳＦＭ培地が挙げられるがこれらに限定されるわけではなく、これらの特許文献は、特に組換えＡＡＶベクターの産生に使用するためのカスタム培地配合に関して、そのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み入れられる。いくつかの実施形態において、ＡＡＶヘルパー機能は、アデノウイルスまたはＨＳＶによって提供される。いくつかの実施形態において、ＡＡＶヘルパー機能は、バキュロウイルスによって提供され、宿主細胞は昆虫細胞（例えば、ツマジロクサヨトウ（Spodoptera frugiperda）（Ｓｆ９）細胞）である。ＡＡＶの複製に関するアデノウイルスヘルパー機能の例
には、Ｅ１Ａ機能、Ｅ１Ｂ機能、Ｅ２Ａ機能、ＶＡ機能、およびＥ４ｏｒｆ６機能が挙げられる。寄託所から入手可能なバキュロウイルスには、カイコ核多角体病ウイルスが挙げられる。

【0260】

ｒＡＡＶ粒子は、当技術分野で公知の方法を使用して産生することができる。例えば、米国特許第６，５６６，１１８号；第６，９８９，２６４号；および第６，９９５，００６号を参照されたい。本発明の実践において、ｒＡＡＶ粒子を産生するための宿主細胞には、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、微生物および酵母が挙げられる。宿主細胞はまた、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子が宿主細胞において安定に維持されるパッケージング細胞、またはＡＡＶベクターゲノムが安定に維持される産生細胞でありうる。例示的なパッケージングおよび産生細胞は、２９３、Ａ５４９、またはＨｅＬａ細胞に由来する。ＡＡＶベクターは、当技術分野で公知の標準的な技術を使用して精製および製剤化される。

【0261】

いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、以下に提供される例示的なトリプルトランスフェクション法のようなトリプルトランスフェクション法によって産生することができる。簡単に説明すると、ｒｅｐ遺伝子およびキャプシド遺伝子を含むプラスミドをヘルパーアデノウイルスプラスミドと共に、細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）にトランスフェクトして（例えば、リン酸カルシウム法を使用して）、ウイルスを収集して、場合により精製してもよい。

【0262】

いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、産生細胞株法によって産生してもよい（例えば、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：２５３～２６９頁を参照されたい）。簡単に説明すると
、細胞株（例えば、ＨｅＬａ細胞株）に、ｒｅｐ遺伝子、キャプシド遺伝子、およびプロモーター－トランスジーン配列を含むプラスミドを安定にトランスフェクトしてもよい。細胞株をスクリーニングして、ｒＡＡＶ産生のためのリードクローンを選択して、次に、これを産生バイオリアクターにおいて増殖させて、ｒＡＡＶ産生を開始するためのヘルパーとしてのアデノウイルス（例えば、野生型アデノウイルス）を感染させてもよい。次に、ウイルスを回収して、アデノウイルスを不活化（例えば、熱によって）および／または除去し、ｒＡＡＶ粒子を精製してもよい。いくつかの実施形態において、産生細胞株は、ＨｅＬａ、２９３、Ａ５４９、またはＰｅｒｃ．６細胞に由来する。いくつかの実施形態において、産生細胞株は、浮遊培養での増殖に適合させる。いくつかの実施形態において、ＡＡＶヘルパー機能は、アデノウイルス、ＨＳＶ、またはバキュロウイルスによって提供される。

【0263】

いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ヘルパー機能の提供後約４８時間～約９６時間の間に回収される。例えば、いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ヘルパー機能の提供の約４８時間後、約６０時間後、約７２時間後、約８４時間後、または約９６時間後に回収される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ヘルパー機能の提供の、約４８時間および約９６時間後、約４８時間および約８４時間後、約４８時間および約７２時間後、約４８時間および約６０時間後、約６０時間および約９６時間後、約６０時間および約８４時間後、約６０時間および約７２時間後、約７２時間および約９６時間後、約７２時間および約８４時間後、または約８４時間および約９６時間後に回収される。

【0264】

本発明の適したｒＡＡＶ産生培養培地に、０．５％～２０％（ｖ／ｖまたはｗ／ｖ）のレベルで血清または血清由来組換えタンパク質を補充してもよい。あるいは、当技術分野で公知であるように、ｒＡＡＶベクターを、動物由来産物を有しない培地とも呼ばれる無血清条件で産生してもよい。当業者は、産生培養物におけるｒＡＡＶの力価を増加させるために、ｒＡＡＶベクターの産生を支持するように設計された市販のまたはカスタム培地に、グルコース、ビタミン、アミノ酸、および／または増殖因子を含むがこれらに限定されるわけではない、当技術分野で公知の１つまたはそれ以上の細胞培養構成要素を補充してもよいことを認識し得る。

【0265】

ｒＡＡＶ産生培養物は、利用される特定の宿主細胞にとって適した多様な条件（広い温度範囲、多様な期間等）で増殖させることができる。当技術分野で公知であるように、ｒＡＡＶ産生培養物は、例えばローラーボトル、中空繊維フィルター、マイクロキャリア、および充填床または流動床バイオリアクターのような適した付着依存的容器中で培養することができる、付着依存的培養物を含む。ｒＡＡＶベクター産生培養物はまた、例えばスピナーフラスコ、攪拌タンクバイオリアクター、およびＷａｖｅバッグシステムのような使い捨てシステムを含む多様な方法で培養することができるＨｅＬａ、２９３、およびＳＦ－９細胞のような浮遊培養に適合させた宿主細胞を含みうる。

【0266】

本発明のｒＡＡＶベクター粒子は、米国特許第６，５６６，１１８号により詳しく記述されているように、インタクト細胞からの培地にｒＡＡＶ粒子を放出させるために細胞を当技術分野で公知の条件で培養することを条件として、産生培養物の宿主細胞の溶解によって、または産生培養物から消費された培地を回収することによってｒＡＡＶ産生培養物から回収することができる。細胞の適した溶解方法もまた当技術分野で公知であり、例えば多数の凍結／融解サイクル、超音波処理、マイクロフルイダイゼーション、ならびに洗浄剤および／またはプロテアーゼのような化学物質による処理が挙げられる。

【0267】

さらなる実施形態において、ウイルス粒子は精製される。本明細書において使用される用語「精製」は、ウイルス粒子が本来存在するまたは当初そこから調製される場所に同様
に存在しうる他の構成要素の少なくとも一部を含まないウイルス粒子の調製を含む。このため、例えば、単離ウイルス粒子は、培養物ライセートまたは産生培養物上清のような起源混合物からそれを濃縮するための精製技術を使用して調製することができる。濃縮は、例えば溶液中に存在するＤＮアーゼ抵抗性粒子（ＤＲＰ）もしくはゲノムコピー（ｇｃ）の割合、もしくは感染度のような多様な方法で測定することができ、またはヘルパーウイルス、培地構成要素等を含む産生培養混入物質または処理中の混入物質を含む混入物質のような、起源混合物に存在する第２の場合によっては干渉性の物質に関連して測定することができる。

【0268】

いくつかの実施形態において、ウイルス産生培養回収物は、宿主細胞破片を除去するために清澄化される。いくつかの実施形態において、産生培養回収物は、例えばグレードＤＯＨＣ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋ＨＣ Ｐｏｄフィルター、グレードＡ１ＨＣ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋ＨＣ Ｐｏｄフィルター、および０．２μｍフィルターＯｐｔｉｃａｐ ＸＬ１Ｏ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ
ＳＨＣ親水性メンブレンフィルターを含む一連の深さのフィルターを通した濾過によって清澄化される。清澄化はまた、遠心分離または当技術分野で公知の孔サイズ０．２μｍもしくはそれ以上の任意の酢酸セルロースフィルターを通しての濾過のような、当技術分野で公知の多様な他の標準的な技術によって得ることができる。

【0269】

いくつかの実施形態において、ウイルス産生培養回収物を、産生培養物に存在する任意の高分子量ＤＮＡを消化するためにＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）によってさらに処理する。いくつかの実施形態において、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）の消化は、例えば最終濃度１～２．５単位／ｍｌのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）を、周囲温度から３７℃の範囲の温度で３０分間から数時間の期間を含む、当技術分野で公知の標準的な条件下で実施される。

【0270】

ｒＡＡＶ粒子は、１つまたはそれ以上の以下の精製工程を使用して単離または精製することができる：平衡遠心分離；フロースルー陰イオン交換濾過；ｒＡＡＶ粒子を濃縮するための接線流濾過（ＴＦＦ）；アパタイトクロマトグラフィーによるｒＡＡＶの捕捉；ヘルパーウイルスの熱不活化；疎水性相互作用クロマトグラフィーによるｒＡＡＶの捕捉；サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による緩衝液交換；ナノフィルトレーション；および陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、またはアフィニティクロマトグラフィーによるｒＡＡＶ捕捉。これらの工程は、単独で、様々な組み合わせで、または異なる順序で使用してもよい。ｒＡＡＶ粒子を精製する方法は、例えばＸｉａｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２：２２２４～２２３２頁；米国特許第６，９８９，２６４号および第８，１３７，９４８号；ならびに国際公開第２０１０／１４８１４３号に見出される。アデノウイルス粒子を精製する方法は、例えば、Ｂｏ，Ｈ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６７Ｃ：１１９～１２５頁に見出される。レンチウイルス粒子を精製する方法は、例えばＳｅｇｕｒａ ＭＭ，ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ
Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．１３（７）：９８７～１０１１頁に見出される。ＨＳＶ粒子を精製する方法は、例えばＧｏｉｎｓ，ＷＦ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １１４４：６３～７９頁に見出される。

【0271】

いくつかの実施形態において、ウイルス粒子は医薬製剤中にある。いくつかの実施形態において、医薬製剤は、薬学的に許容される担体を含む。そのような担体は当技術分野で周知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１０３５～１０３８頁および１５７０～１５８０頁を参照されたい）。いくつかの実施形態において、本明細書において記述されるウイ
ルス粒子と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物は、眼の注射に適している。そのような薬学的に許容される担体は、滅菌液体、例えば水、および石油、動物、植物、または合成起源の油を含めた油、例えば落花生油、ダイズ油、鉱油等でありうる。食塩水溶液およびデキストロース水溶液、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびグリセロール溶液もまた、特に注射用溶液のための液体担体として使用することができる。医薬組成物はさらに、追加の成分、例えば保存剤、緩衝剤、等張剤、抗酸化剤および安定剤、非イオン性湿潤剤または清澄剤、増粘剤等を含みうる。本明細書において記述される医薬組成物は、単回単位用量または複数回単位用量に包装することができる。組成物は一般的に、無菌的で実質的に等張の溶液として製剤化される。

【0272】

ＶＩ．治療方法
本開示のある特定の態様は、例えば上記のような、本開示の遺伝子操作された、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸を含む組成物の治療有効量を個体に投与することを含む。

【0273】

いくつかの実施形態において、本開示の態様は、本開示のＣａｓタンパク質と、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡを含む１つまたはそれ以上の核酸とを含む組成物の治療有効量を個体に投与することを含み、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡは、例えば上記の深部イントロン突然変異を含む突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖にハイブリダイズする。すなわち、本開示の方法、組成物、およびキットのいずれに関しても、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列として、またはポリペプチドとして供給することができる。非制限的な例として、Ｃａｓタンパク質は、カチオン性脂質媒介送達（例えば、Ｚｕｒｉｓ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３：７３～８０頁を参照されたい）を使用して、１つまたはそれ以上のガイドＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）と共に投与することができる。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質を、例えばＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクター複合体として１つまたはそれ以上のガイドＲＮＡとの複合体として投与してもよい。以下に記述される送達および／または投与方法のいずれも、１つまたはそれ以上のガイドＲＮＡと共に投与されるＣａｓタンパク質の送達のために使用してもよいと認識される。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、上記の自己限定性発現カセットから発現される。

【0274】

いくつかの実施形態において、本開示の遺伝子操作された、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸を含む組成物（または本開示のＣａｓタンパク質と本開示の１つまたはそれ以上のガイドＲＮＡとを含む組成物）は、静脈内、筋肉内、皮下、局所、経口、経皮、腹腔内、眼窩内、植え込み、吸入、髄腔内、脳室内、または鼻腔内投与される。

【0275】

いくつかの実施形態において、本開示の遺伝子操作された、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸を含む組成物（または本開示のＣａｓタンパク質と本開示の１つまたはそれ以上のガイドＲＮＡとを含む組成物）は、網膜下または硝子体内に投与される。深部イントロン突然変異と関連する眼の疾患のような網膜疾患の遺伝子治療プロトコールは、網膜の細胞への核酸の局所送達を必要とする。これらの疾患における治療標的である細胞は、網膜の光受容細胞または網膜神経感覚上皮の下にあるＲＰＥの細胞のいずれかである。これらの細胞に対する核酸の送達は、網膜とＲＰＥとの間の網膜下腔への注射を必要とする。

【0276】

いくつかの態様において、本発明は、場合により薬学的に許容される賦形剤中に本明細書に記述される任意の核酸を含む組成物を提供する。当技術分野において周知であるように、薬学的に許容される賦形剤は、薬理学的に有効な物質の投与を促進する比較的不活性
な物質であり、液体溶液もしくは懸濁液、乳剤、または使用前に液体に溶解もしくは懸濁するために適した固体剤形として供給することができる。例えば、賦形剤は、形もしくはコンシステンシーを与えることができ、または希釈剤として作用することができる。適した賦形剤には、安定剤、湿潤剤および乳化剤、浸透圧を変化させるための塩、カプセル化剤、ｐＨ緩衝物質、および緩衝剤が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。そのような賦形剤は、過度の毒性を示すことなく投与される、眼に直接送達するために適した任意の薬剤を含む。薬学的に許容される賦形剤には、ソルビトール、様々なＴＷＥＥＮ化合物のいずれか、および水、食塩水、グリセロールおよびエタノールのような液体が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。薬学的に許容される賦形剤には、薬学的に許容される塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩等のような無機酸の塩；ならびに酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩等のような有機酸の塩を含めることができる。薬学的に許容される賦形剤の詳しい考察は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ． Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１）において利用可能である。

【0277】

一般的に、これらの組成物は、網膜下注射によって投与されるように製剤化される。したがって、これらの組成物は、食塩水、リンゲル緩衝塩類溶液（ｐＨ７．４）等のような薬学的に許容されるビヒクルと組み合わせることができる。必要ではないが、組成物は場合により、正確な量を投与するために適した単位投与剤形で供給してもよい。

【0278】

網膜下送達方法
網膜下送達方法は当技術分野において公知である。例えば、参照により本明細書に組み入れられる、国際公開第２００９／１０５６９０号を参照されたい。簡単に説明すると、組成物（例えば、上記のウイルス送達または非ウイルス送達を通して送達してもよい、本開示の遺伝子操作された、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸）を黄斑および中心窩の網膜下に送達する一般的な方法を、以下の簡単な概要によって例証する。この例は、単に方法の特定の特徴を例証することを意味しており、決して制限的であることを意味しない。

【0279】

一般的に、ベクターは、手術用顕微鏡を使用して直接観察下で眼内（網膜下）に注射される組成物の形態で送達することができる。この技法は、硝子体切除後に、細いカニューレを使用して１つまたはそれ以上の小さい網膜切開部を通してベクター懸濁液の網膜下腔への注射を伴いうる。

【0280】

簡単に説明すると、手術の間を通して、輸注（例えば、食塩水の）によって正常な眼球の体積を維持するために、輸注カニューレを留置して縫合することができる。硝子体切除を、適切な孔径（例えば、２０～２７ゲージ）のカニューレを使用して実施し、除去される硝子体ゲルの体積を、輸注カニューレから食塩水または他の等張溶液を輸注することによって交換する。硝子体切除は、（１）その皮質（後部硝子体膜）の除去により、カニューレによる網膜の貫通が容易となる；（２）その除去および流体（例えば、食塩水）との交換により、ベクターの眼内注射に適合する空間が作製される、および（３）その制御された除去により、網膜裂傷および計画外の網膜剥離の可能性が低減することから、実施することが都合がよい。

【0281】

いくつかの実施形態において、ベクター組成物は、適切な孔サイズ（例えば２７～４５ゲージ）のカニューレを利用することによって中心網膜外部の網膜下腔に直接注射され、このようにして網膜下腔にブレブを作製する。他の実施形態において、ベクター組成物の網膜下注射の前に、適切な流体（食塩水またはリンゲル液のような）の少量（例えば、約０．１～約０．５ｍｌ）を、中心網膜外の網膜下腔に網膜下注射する。網膜下腔へのこの初回注射により、網膜下腔内に最初の流体ブレブが確立され、最初のブレブの位置で局所
網膜剥離を引き起こす。この最初の流体ブレブにより、網膜下腔へのベクター組成物の標的化送達が促進され（ベクター送達の前に注射平面を定義することにより）、脈絡膜への起こりうるベクター投与、および硝子体腔への注射または逆流の可能性を最小限にすることができる。いくつかの実施形態において、この最初の流体ブレブにさらに、１つまたはそれ以上のベクター組成物および／または１つまたはそれ以上の追加の治療剤を含む流体を、同じまたは追加の細孔（ｆｉｎｅ ｂｏｒｅ）カニューレのいずれかによって、これらの流体を最初の流体ブレブに直接投与することによって注射することができる。

【0282】

ベクター組成物および／または最初の少量の流体の眼内投与は、シリンジに取り付けた細孔カニューレ（例えば、２７～４５ゲージ）を使用して実施することができる。いくつかの実施形態において、このシリンジのプランジャーは、フットペダルを押すことのような、機械的装置によって駆動することができる。細孔カニューレを、強膜切除術を通して硝子体腔を越えて、標的となる網膜の領域（しかし、中心網膜の外部）に従ってそれぞれの対象において予め決定された網膜の部位まで前進させる。直接可視下で、ベクター懸濁液を、自己閉鎖非拡大網膜切除術によって局所網膜剥離を引き起こす神経感覚上皮の下に機械的に注射する。上記のように、ベクター組成物を、中心網膜外部のブレブを作製する網膜下腔に直接注射するか、またはベクターを中心網膜外の最初のブレブに注入して、それを拡大させる（および網膜剥離領域を拡大させる）ことができる。いくつかの実施形態において、ベクター組成物の注射後に、別の流体のブレブへの注射を行う。

【0283】

理論に捉われることを望むものではないが、網膜下注射の速度および位置によって、黄斑、中心窩、および／またはその下のＲＰＥ細胞の損傷を引き起こしうる局所剪断力が起こりうる。網膜下注射は剪断力を最小限にするまたは回避する速度で実施することができる。いくつかの実施形態において、ベクター組成物を約１５～１７分間かけて注射する。いくつかの実施形態において、ベクターを約１７～２０分間かけて注射する。いくつかの実施形態において、ベクター組成物を約２０～２２分間かけて注射する。いくつかの実施形態において、ベクター組成物を約３５～約６５μｌ／分の速度で注射する。いくつかの実施形態において、ベクター組成物を約３５μｌ／分の速度で注射する。いくつかの実施形態において、ベクター組成物を約４０μｌ／分の速度で注射する。いくつかの実施形態において、ベクター組成物を約４５μｌ／分の速度で注射する。いくつかの実施形態において、ベクター組成物を約５０μｌ／分の速度で注射する。いくつかの実施形態において、ベクター組成物を約５５μｌ／分の速度で注射する。いくつかの実施形態において、ベクター組成物を約６０μｌ／分の速度で注射する。いくつかの実施形態において、ベクター組成物を約６５μｌ／分の速度で注射する。当業者は、ブレブの注射速度および時間が例えば、中心網膜の細胞に近づくために十分な網膜剥離を作製するために必要な、ベクター組成物の体積またはブレブのサイズ、ベクター組成物を送達するために使用されるカニューレのサイズ、および本発明のカニューレの位置を安全に維持する能力によって指示されることを認識するであろう。

【0284】

本発明のいくつかの実施形態において、網膜の網膜下腔に注射される組成物の体積は、約１μｌ、２μｌ、３μｌ、４μｌ、５μｌ、６μｌ、７μｌ、８μｌ、９μｌ、１０μｌ、１５μｌ、２０μｌ、２５μｌ、５０μｌ、７５μｌ、１００μｌ、２００μｌ、３００μｌ、４００μｌ、５００μｌ、６００μｌ、７００μｌ、８００μｌ、９００μｌ、もしくは１ｍＬ、またはその間の任意の量のいずれか１つより多い。

【0285】

いくつかの実施形態において、方法は、本開示のベクターを含む組換えウイルス粒子の有効量の眼への投与（例えば、網膜下および／または硝子体内投与によって）を含む。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、約５×１０^１２、６×１０^１２、７×１０^１２、８×１０^１２、９×１０^１２、１０×１０^１２、１１×１０^１２、１５×１０^１２、２０×１０^１２、２５×１０^１２、３０×１０^１２、または５０×１０^１２ゲ
ノムコピー／ｍＬの少なくともいずれかである。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、約５×１０^１２～６×１０^１２、６×１０^１２～７×１０^１２、７×１０^１２～８×１０^１２、８×１０^１２～９×１０^１２、９×１０^１２～１０×１０^１２、１０×１０^１２～１１×１０^１２、１１×１０^１２～１５×１０^１２、１５×１０^１２～２０×１０^１２、２０×１０^１２～２５×１０^１２、２５×１０^１２～３０×１０^１２、３０×１０^１２～５０×１０^１２、または５０×１０^１２～１００×１０^１２ゲノムコピー／ｍＬのいずれかである。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、約５×１０^１２～１０×１０^１２、１０×１０^１２～２５×１０^１２、または２５×１０^１２～５０×１０^１２ゲノムコピー／ｍＬのいずれかである。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、約５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、９×１０^９、１０×１０^９、１１×１０^９、１５×１０^９、２０×１０^９、２５×１０^９、３０×１０^９、または５０×１０^９形質導入単位／ｍＬの少なくともいずれかである。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、約５×１０^９～６×１０^９、６×１０^９～７×１０^９、７×１０^９～８×１０^９、８×１０^９～９×１０^９、９×１０^９～１０×１０^９、１０×１０^９～１１×１０^９、１１×１０^９～１５×１０^９、１５×１０^９～２０×１０^９、２０×１０^９～２５×１０^９、２５×１０^９～３０×１０^９、３０×１０^９～５０×１０^９、または５０×１０^９～１００×１０^９形質導入単位／ｍＬのいずれかである。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、約５×１０^９～１０×１０^９、１０×１０^９～１５×１０^９、１５×１０^９～２５×１０^９、または２５×１０^９～５０×１０^９形質導入単位／ｍＬのいずれかである。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、約５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０、９×１０^１０、１０×１０^１０、１１×１０^１０、１５×１０^１０、２０×１０^１０、２５×１０^１０、３０×１０^１０、４０×１０^１０、または５０×１０^１０感染単位／ｍＬの少なくともいずれかである。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、約５×１０^１０～６×１０^１０、６×１０^１０～７×１０^１０、７×１０^１０～８×１０^１０、８×１０^１０～９×１０^１０、９×１０^１０～１０×１０^１０、１０×１０^１０～１１×１０^１０、１１×１０^１０～１５×１０^１０、１５×１０^１０～２０×１０^１０、２０×１０^１０～２５×１０^１０、２５×１０^１０～３０×１０^１０、３０×１０^１０～４０×１０^１０、４０×１０^１０～５０×１０^１０、または５０×１０^１０～１００×１０^１０感染単位／ｍＬの少なくともいずれかである。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、約５×１０^１０～１０×１０^１０、１０×１０^１０～１５×１０^１０、１５×１０^１０～２５×１０^１０、または２５×１０^１０～５０×１０^１０感染単位／ｍＬの少なくともいずれかである。

【0286】

いくつかの実施形態において、方法は、本開示のベクターを含む組換えウイルス粒子の有効量の個体（例えば、ヒト）の眼（例えば、網膜下および／または硝子体内投与）への投与を含む。いくつかの実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の用量は、約１×１０^８～約１×１０^１３ゲノムコピー／ｋｇ体重の少なくともいずれかである。いくつかの実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の用量は、約１×１０^８～約１×１０^１３ゲノムコピー／ｋｇ体重のいずれかである。

【0287】

１つまたはそれ以上（例えば、２、３、またはそれ以上）のブレブを作製することができる。一般的に、本発明の方法およびシステムによって作製されるブレブまたは複数のブレブの総体積は、眼の流体体積、例えば典型的なヒト対象において約４ｍｌを超えてはならない。それぞれの個々のブレブの総体積は、中心網膜の細胞型を露出するため、および最適な操作のために十分な依存性のブレブを作製するために十分なサイズの網膜剥離を促進するため、少なくとも約０．３ｍｌ、または少なくとも約０．５ｍｌでありうる。当業者は、眼の構造に対する損傷を回避するために、本発明の方法およびシステムに従うブレブの作製において、適切な眼内圧を維持しなければならないことを認識する。それぞれの個々のブレブのサイズは、例えば、約０．５～約１．２ｍｌ、約０．８～約１．２ｍｌ、
約０．９～約１．２ｍｌ、約０．９～約１．０ｍｌ、約１．０～約２．０ｍｌ、約１．０～約３．０ｍｌでありうる。このように、一例において、ベクター組成物懸濁液の全量３ｍｌを注射するために、各約１ｍｌのブレブ３個を確立することができる。組み合わせた全てのブレブの総体積は、例えば、約０．５～約３．０ｍｌ、約０．８～約３．０ｍｌ、約０．９～約３．０ｍｌ、約１．０～約３．０ｍｌ、約０．５～約１．５ｍｌ、約０．５～約１．２ｍｌ、約０．９～約３．０ｍｌ、約０．９～約２．０ｍｌ、約０．９～約１．０ｍｌでありうる。

【0288】

ブレブの当初の位置の端部の外側の標的網膜（例えば、中心網膜）の領域に安全かつ効率的に形質導入するために、形質導入の標的領域にブレブを再配置するようにブレブを操作してもよい。ブレブの操作は、ブレブの体積によって作製されるブレブの依存性、ブレブを含む眼の再配置、１つまたはそれ以上のブレブを含む眼または複数の眼を有するヒトの頭部の再配置、および／または流体－空気交換によって行うことができる。これは特に、中心網膜が典型的に網膜下注射による剥離に耐えることから、中心網膜に特に適切である。いくつかの実施形態において、流体－空気交換は、ブレブを再配置するために利用され、輸注カニューレからの流体を、例えば網膜の表面上に空気を流れさせることによって、一時的に空気に交換する。空気の体積が、網膜の表面から硝子体腔の流体を押しのけると、硝子体腔内の流体がカニューレから流れ出ることがある。硝子体腔の流体からの圧の一時的な欠如により、ブレブが、眼の依存部分へと移動して引き寄せられる。眼球を適切に配置することによって、網膜下ベクター組成物のブレブを、隣接する領域（例えば、黄斑および／または中心窩）を巻き込むように操作する。一部の例において、ブレブの質量は、流体－空気交換を使用しない場合であっても、それを引き寄せるために十分である。ブレブの所望の位置への移動は、ブレブを眼の中の所望の位置に引き寄せるために、対象の頭部の位置を変更することによってさらに促進することができる。ブレブの所望の形状が達成されると、流体を硝子体腔に戻す。流体は適切な流体、例えば、新鮮な食塩水である。一般的に、網膜下ベクター組成物は、網膜切除に対する網膜復位を行わなくとも、および眼内タンポナーデを行わなくともその場に留まり、網膜は約４８時間位内に自然に再接着するであろう。

【0289】

眼の細胞（例えば、黄斑および／または中心窩の、例えばＲＰＥおよび／または光受容細胞）に本開示のベクターを安全かつ有効に形質導入することによって、本発明の方法は、深部イントロン突然変異と関連する眼の障害を有する個体、例えばヒトを治療するために使用することができ、形質導入細胞は、眼の障害を治療するために十分量のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを産生する。

【0290】

ベクター（いくつかの実施形態において、ウイルス粒子の形状）の有効量を、治療の目的に応じて投与する。例えば、低い百分率の形質導入が所望の治療効果を達成することができる場合、治療の目的は一般的に、形質導入のこのレベルに合致するか、または超えることである。一部の例において、このレベルの形質導入は、標的細胞のわずか約１～５％、いくつかの実施形態において、所望の組織型の細胞の少なくとも約２０％、いくつかの実施形態において少なくとも約５０％、いくつかの実施形態において少なくとも約８０％、いくつかの実施形態において少なくとも約９５％、いくつかの実施形態において少なくとも約９９％の形質導入によって達成することができる。手引きとして、注射あたりに投与されるウイルス粒子の数は、一般的に１ｘ１０^６～約１ｘ１０^１４個の粒子の間、約１ｘ１０^７～１ｘ１０^１３個の粒子の間、約１ｘ１０^９～１ｘ１０^１２個の粒子の間、または約１ｘ１０^１１個の粒子である。ベクター組成物は、同じ技法の間に、または数日、数週間、数カ月、もしくは数年の間隔を空けて１回または複数回の網膜下注射によって投与してもよい。いくつかの実施形態において、多数のベクターをヒトを治療するために使用してもよい。

【0291】

いくつかの実施形態において、本開示のベクターまたは核酸の有効量の網膜への投与は、投与部位またはその近傍の光受容細胞に形質導入する。いくつかの実施形態において、光受容細胞の約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または１００％超のいずれかが形質導入される。いくつかの実施形態において、光受容細胞の約５％～約１００％、約１０％～約５０％、約１０％～約３０％、約２５％～約７５％、約２５％～約５０％、または約３０％～約５０％が形質導入される。形質導入された光受容細胞を同定する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、免疫組織化学または増強緑色蛍光タンパク質のようなマーカーを使用して形質導入を検出することができる。

【0292】

本発明のいくつかの実施形態において、方法は、眼の障害を有する個体、例えば深部イントロン突然変異と関連する眼の障害を有するヒトを治療するために、本開示のベクターまたは核酸の有効量を、哺乳動物の網膜下（例えば、網膜下腔）に投与することを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、光受容細胞において核酸を発現させるために網膜下の１つまたはそれ以上の位置に注射される。いくつかの実施形態において、組成物は、網膜下の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０超の位置のいずれか１つに注射される。

【0293】

いくつかの実施形態において、組成物は、１つ超の位置に同時または連続的に投与される。いくつかの実施形態において、複数回注射はわずか１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、９時間、１２時間、または２４時間の間隔である。いくつかの実施形態において、複数回の注射は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１５日、２０日、２５日、または３０日の間隔である。いくつかの実施形態において、複数回注射は、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、８カ月、１０カ月、または１１カ月の間隔である。いくつかの実施形態において、複数回の注射は、１年、２年、３年、４年、５年、６年、８年、１０年、１５年、２０年、２５年、３０年、３５年、４０年、４５年、５５年、または６０年の間隔である。

【0294】

硝子体内注射方法
一般的な硝子体内注射方法を以下の簡単な概要によって例証する。本実施例は、方法のある特定の特徴を例証することを意味しており、決して制限することを意味していない。硝子体内注射の技法は当技術分野で公知である（例えば、Ｐｅｙｍａｎ，Ｇ．Ａ．，ｅｔ
ａｌ．（２００９）Ｒｅｔｉｎａ ２９（７）：８７５～９１２頁およびＦａｇａｎ，Ｘ．Ｊ．ａｎｄ Ａｌ－Ｑｕｒｅｓｈｉ，Ｓ．（２０１３）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．４１（５）：５００～７頁を参照されたい）。

【0295】

簡単に説明すると、硝子体内注射の対象に、瞳孔散大、眼の消毒、および麻酔薬の投与によって技法の準備を行う。当技術分野で公知の任意の適した散瞳剤を瞳孔散大のために使用することができる。瞳孔散大が適切であるかを治療前に確認することができる。眼の消毒処置剤、例えばポビドンヨード（ＢＥＴＡＤＩＮＥ（登録商標））のようなヨウ化物含有溶液を適用することによって、消毒を行ってもよい。類似の溶液を使用して、眼瞼、まつげ、および他の任意の近傍の組織（例えば、皮膚）を清浄にする。リドカインまたはプロパラカインのような任意の適した麻酔薬を、任意の適した濃度で使用してもよい。麻酔薬は、局所用滴剤、ジェル、またはゼリー、および麻酔薬の結膜下適用を含むがこれらに限定されるわけではない当技術分野で公知の任意の方法によって投与してもよい。

【0296】

注射前に、滅菌眼瞼用検鏡を使用して、領域のまつげをきれいにしてもよい。注射部位にシリンジで印をつけてもよい。注射部位は、患者の水晶体に基づいて選択される。例えば、注射部位は、偽水晶体眼または無水晶体眼の患者では辺縁部から３～３．５ｍｍであり、有水晶体眼の患者では辺縁部から３．５～４ｍｍでありうる。患者は、注射部位と反
対方向を見ていてもよい。

【0297】

いくつかの実施形態において、方法は、本開示のベクターを含む組換えウイルス粒子の有効量を、眼（例えば、網膜下および／または硝子体内投与によって）に投与することを含む。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、約５×１０^１２、６×１０^１２、７×１０^１２、８×１０^１２、９×１０^１２、１０×１０^１２、１１×１０^１２、１５×１０^１２、２０×１０^１２、２５×１０^１２、３０×１０^１２、または５０×１０^１２ゲノムコピー／ｍＬの少なくともいずれかである．いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、約５×１０^１２～６×１０^１２、６×１０^１２～７×１０^１２、７×１０^１２～８×１０^１２、８×１０^１２～９×１０^１２、９×１０^１２～１０×１０^１２、１０×１０^１２～１１×１０^１２、１１×１０^１２～１５×１０^１２、１５×１０^１２～２０×１０^１２、２０×１０^１２～２５×１０^１２、２５×１０^１２～３０×１０^１２、３０×１０^１２～５０×１０^１２、または５０×１０^１２～１００×１０^１２ゲノムコピー／ｍＬのいずれかである。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、約５×１０^１２～１０×１０^１２、１０×１０^１２～２５×１０^１２、または２５×１０^１２～５０×１０^１２ゲノムコピー／ｍＬのいずれかである。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、約５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、９×１０^９、１０×１０^９、１１×１０^９、１５×１０^９、２０×１０^９、２５×１０^９、３０×１０^９、または５０×１０^９形質導入単位／ｍＬの少なくともいずれかである。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、約５×１０^９～６×１０^９、６×１０^９～７×１０^９、７×１０^９～８×１０^９、８×１０^９～９×１０^９、９×１０^９～１０×１０^９、１０×１０^９～１１×１０^９、１１×１０^９～１５×１０^９、１５×１０^９～２０×１０^９、２０×１０^９～２５×１０^９、２５×１０^９～３０×１０^９、３０×１０^９～５０×１０^９、または５０×１０^９～１００×１０^９形質導入単位／ｍＬのいずれかである。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、約５×１０^９～１０×１０^９、１０×１０^９～１５×１０^９、１５×１０^９～２５×１０^９、または２５×１０^９～５０×１０^９形質導入単位／ｍＬのいずれかである。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、約５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０、９×１０^１０、１０×１０^１０、１１×１０^１０、１５×１０^１０、２０×１０^１０、２５×１０^１０、３０×１０^１０、４０×１０^１０、または５０×１０^１０感染単位／ｍＬの少なくともいずれかである。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、約５×１０^１０～６×１０^１０、６×１０^１０～７×１０^１０、７×１０^１０～８×１０^１０、８×１０^１０～９×１０^１０、９×１０^１０～１０×１０^１０、１０×１０^１０～１１×１０^１０、１１×１０^１０～１５×１０^１０、１５×１０^１０～２０×１０^１０、２０×１０^１０～２５×１０^１０、２５×１０^１０～３０×１０^１０、３０×１０^１０～４０×１０^１０、４０×１０^１０～５０×１０^１０、または５０×１０^１０～１００×１０^１０感染単位／ｍＬの少なくともいずれかである。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、約５×１０^１０～１０×１０^１０、１０×１０^１０～１５×１０^１０、１５×１０^１０～２５×１０^１０、または２５×１０^１０～５０×１０^１０感染単位／ｍＬの少なくともいずれかである。

【0298】

いくつかの実施形態において、方法は、本開示のベクターを含む組換えウイルス粒子の有効量の個体（例えば、ヒト）の眼（例えば、網膜下および／または硝子体内投与）への投与を含む。いくつかの実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の用量は、約１×１０^８～約１×１０^１３ゲノムコピー／ｋｇ体重の少なくともいずれかである。いくつかの実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の用量は、約１×１０^８～約１×１０^１３ゲノムコピー／ｋｇ体重のいずれかである。

【0299】

注射の間、針を強膜に垂直に挿入して、眼の中心を指してもよい。針を、先端が、網膜下腔ではなくて硝子体で終わるように挿入してもよい。注射に関して当技術分野で公知の
任意の適した量を使用してもよい。注射後、針を抗生物質のような消毒剤によって処置してもよい。また、過剰量の消毒剤を除去するために眼をすすいでもよい。

【0300】

網膜の構造および核酸送達の有効性を決定する手段
網膜は多数の層を含むことが知られている。網膜の細胞層は、内境界膜、神経線維、神経節細胞、内網状層、内顆粒層、外網状層、外顆粒層、外境界膜、光受容体、および網膜色素上皮層を含みうる。硝子体に対して最も近位の層は、内境界膜である。この層は、神経膠細胞の一種であるミュラー細胞を含みうる。神経線維層は、視神経を形成する神経節細胞からの軸索を含みうる。神経節細胞層は、神経節細胞およびアマクリン細胞を含みうる。内網状層は、神経節およびアマクリン細胞の樹状突起と、双極細胞の軸索との間のシナプスを含みうる。内顆粒層はアマクリン、双極、および水平細胞の細胞核を含みうる。外網状層は、水平細胞樹状突起と光受容細胞の突起との間のシナプスを含みうる。外顆粒層は、光受容細胞体を含みうる。外または内境界膜は、ミュラー細胞の先端突起における接着結合およびデスモゾームのような、ならびにこれらの突起と光受容細胞の内部セグメントとの間の細胞接続部を含みうる。光受容体層は、桿錐状体層およびヤコブ膜としても知られ、桿体および椎体を含む光受容細胞を含みうる。硝子体に対して最も遠位の網膜層は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）であり、これは色素顆粒を含む六角形の上皮細胞の層を含みうる。

【0301】

網膜はまた、多くの異なる細胞型を含むことが知られている。網膜ニューロンは、光受容細胞、双極細胞、神経節細胞、アマクリン細胞、および水平細胞を含みうる。光受容細胞は、光に対して感受性である。光受容細胞は、光を感知して、双極細胞および神経節細胞を通して、シグナルを視神経に伝達することによって応答しうる。光受容細胞は、一般的に弱い光の条件で光を感知する桿体細胞と、一般的に色およびより明るい光の認識を感知する椎体細胞とを含みうる。双極細胞は、光受容細胞からの入力を受容して、シナプスを介してアマクリンまたは神経節細胞へと伝達する。神経節細胞は、アマクリン細胞または水平細胞からの情報を受容し得、その軸索は視神経を形成する。水平細胞は、多数の光受容体からの入力を統合し得、光のレベルの調節を助ける。アマクリン細胞は、双極細胞を調節するために役立ち、神経節細胞に入力を提供する介在ニューロンである。網膜の神経膠細胞は、ミュラー細胞、星状膠細胞、および小膠細胞を含みうる。

【0302】

網膜下または硝子体内注射による核酸送達の有効性は、本明細書において記述されるいくつかの基準によってモニターすることができる。いくつかの実施形態において、有効性は、核酸が送達された１つまたはそれ以上の細胞を含む試料における深部イントロン突然変異および／または両端に位置する配列の欠失を検出することによってアッセイされる。欠失は、サザンブロッティング、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ＤＮＡシークエンシング（例えば、サンガーシークエンシングおよび次世代シークエンシング）、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＤＮＡマイクロアレイ、およびＳｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼアッセイ（例えば、Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．８：２２８１～２３０８頁を参照されたい）を含むがこれらに限定されるわけではない当技術分野で公知の任意の手段によって検出することができる。例示的な方法を以下の実施例に例証する。

【0303】

いくつかの実施形態において、有効性は機能的にアッセイされる。例えば、本発明の方法を使用する対象の治療の後、対象を、例えば、１つまたはそれ以上の臨床パラメータによって疾患状態の１つまたはそれ以上の兆候または症状の改善、および／または安定化、および／または進行の遅延に関して評価してもよい。そのような試験の例は、当技術分野で公知であり、客観的測定ならびに主観的測定（例えば、対象が報告する）を含む。例えば、対象の視機能に及ぼす治療の有効性を測定するために、以下の１つまたはそれ以上を評価してもよい：対象の主観的な見え方の質または中心視機能の改善（例えば、対象が流
ちょうに読む能力および顔を認識する能力の改善）、対象の眼のモビリティ（例えば、迷路を通り抜けるのに要する時間の減少）、視力（例えば、対象のＬｏｇＭＡＲスコアの改善）、マイクロ視野計（例えば、対象のｄＢスコアの改善）、暗順応視野計（例えば、対象のｄＢスコアの改善）、ファインマトリックスのマッピング（例えば、対象のｄＢスコアの改善）、ゴルドマン視野計（例えば、暗点領域（すなわち盲点）のサイズの低減およびより小さい視標の解像能の改善）、フリッカー感受性（例えば、ヘルツの改善）、自発蛍光、および電気生理学測定（例えば、ＥＲＧの改善）。いくつかの実施形態において、視機能は、対象の視覚モビリティによって測定される。いくつかの実施形態において、視機能は、対象の視力によって測定される。いくつかの実施形態において、視機能は、マイクロ視野計によって測定される。いくつかの実施形態において、視機能は、暗順応視野計によって測定される。いくつかの実施形態において、視機能はＥＲＧによって測定される。いくつかの実施形態において、視機能は、対象の主観的な見え方の質によって測定される。

【0304】

進行性の視機能変性が起こる疾患の場合、対象を若年齢で治療すれば、疾患の進行を遅延または停止させるのみならず、後天性の弱視による視機能喪失を改善または予防することができる。弱視には２つの型がある。出生後数カ月まで完全な暗闇に置いた非ヒト霊長類および仔ネコの研究において、動物をその後光に曝露すると、網膜が機能的シグナルを送っているにもかかわらず、機能的に非可逆的盲目である。この盲目は、皮質の神経接続および「教育」が、刺激停止により出生後から発達時に停止しているために起こる。この機能が回復するか否かは不明である。網膜変性疾患の場合、通常の視覚野の回路は、当初、変性により有意な機能障害が引き起こされる時点までは、「学習した」かまたは発達上適切であった。機能障害の眼におけるシグナル伝達という観点での視覚刺激の喪失は、「後天性」または「学習性」の機能障害（「後天性弱視」）を生じ、それによって脳がシグナルを解釈できなくなるか、またはその眼を「使用する」ことができなくなる。これらの「後天性弱視」の場合、弱視の眼の遺伝子治療の結果としての網膜からのシグナル伝達の改善によって、疾患状態の進行の遅延または安定化に加えて、より正常な機能の獲得がさらに起こるか否かは不明である。いくつかの実施形態において、治療されるヒトは年齢３０歳未満である。いくつかの実施形態において、治療されるヒトは年齢２０歳未満である。いくつかの実施形態において、治療されるヒトは年齢１８歳未満である。いくつかの実施形態において、治療されるヒトは年齢１５歳未満である。いくつかの実施形態において、治療されるヒトは年齢１４歳未満である。いくつかの実施形態において、治療されるヒトは年齢１３歳未満である。いくつかの実施形態において、治療されるヒトは年齢１２歳未満である。いくつかの実施形態において、治療されるヒトは年齢１０歳未満である。いくつかの実施形態において、治療されるヒトは年齢８歳未満である。いくつかの実施形態において、治療されるヒトは年齢６歳未満である。

【0305】

一部の眼の障害では、１つの細胞型の機能の改善が別の機能を改善する「ナース細胞」現象が存在する。例えば、中心網膜のＲＰＥに本発明の核酸を形質導入すると、桿体の機能を改善し、次に改善された桿体機能により椎体機能の改善が起こる。したがって、１つの細胞型の治療によって、別の細胞型の機能の改善が起こりうる。

【0306】

特定のベクターおよび組成物の選択は、個々のヒトの病歴、ならびに治療される状態および個体の特徴を含むがこれらに限定されるわけではない、多数の異なる要因に依存する。そのような特徴の評価および適切な治療レジメンの設計は、最終的には、主治医の責任である。

【0307】

いくつかの実施形態において、治療されるヒトは、遺伝性の眼の障害（例えば、深部イントロン突然変異と関連する）を有するが、まだ臨床徴候または症状を発現していない。いくつかの実施形態において、治療されるヒトは、眼の障害（例えば、深部イントロン突
然変異と関連する）を有する。いくつかの実施形態において、治療されるヒトは、眼の障害（例えば、深部イントロン突然変異と関連する）の１つまたはそれ以上の兆候または症状を発現している。いくつかの実施形態において、深部イントロン突然変異は、治療されるヒトにおいて同定されている。

【0308】

本発明の組成物は、単独で、または眼の障害を治療するための１つもしくは複数の追加の治療剤との併用のいずれかで使用することができる。連続的投与の間の間隔は、少なくとも数分、数時間、または数日（またはあるいはそれ未満）でありうる。

【0309】

いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上の追加の治療剤を、網膜下または硝子体に投与してもよい（例えば、硝子体内投与を通して）。追加の治療剤の非制限的な例には、ポリペプチド神経栄養因子（例えば、ＧＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＢＤＮＦ、ＦＧＦ２、ＰＥＤＦ、ＥＰＯ）、ポリペプチド抗血管新生因子（例えば、ｓＦｌｔ、アンジオスタチン、エンドスタチン）、抗血管新生核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム）、例えばＶＥＧＦに対する抗血管新生核酸、抗血管新生モルホリノ、例えばＶＥＧＦに対する抗血管新生モルホリノ、抗血管新生抗体、および／または抗体断片（例えば、Ｆａｂ断片）、例えばＶＥＧＦに対する抗血管新生抗体および／または抗体断片が挙げられる。

【0310】

ＶＩＩ．キット
本明細書において記述される組成物、核酸、およびウイルス粒子は、本明細書において記述される本発明の方法の１つにおいて使用するために設計されたキットに含めることができる。

【0311】

本発明の組成物、核酸、およびウイルス粒子を、さらにキットにパッケージしてもよく、キットはさらに使用説明書を含みうる。いくつかの実施形態において、使用説明書は、本明細書に記述される方法の１つに従う説明書を含む。

【0312】

いくつかの実施形態において、キットはさらに、緩衝液および／または薬学的に許容される賦形剤を含む。当技術分野で周知であるように、薬学的に許容される賦形剤は、薬理学的に有効な物質の投与を促進する比較的不活性な物質であり、液体溶液もしくは懸濁液、乳液、または使用前に液体に溶解または懸濁させるために適した固体剤形として供給することができる。例えば、賦形剤は、形状もしくはコンシステンシーを生じることができ、または希釈剤として作用することができる。適した賦形剤には、安定剤、湿潤剤および乳化剤、浸透圧を変化させるための塩、カプセル化剤、ｐＨ緩衝物質、および緩衝剤を含むがこれらに限定されるわけではない。そのような賦形剤は、過度の毒性を起こすことなく投与することができる、眼に直接送達するために適した任意の医薬剤を含みうる。薬学的に許容される賦形剤には、ソルビトール、様々なＴＷＥＥＮ化合物のいずれか、および水、食塩水、グリセロールおよびエタノールのような液体が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。薬学的に許容される賦形剤には、薬学的に許容される塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩等のような無機酸の塩、ならびに酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩等のような有機酸の塩を含めることができる。薬学的に許容される賦形剤の詳しい考察は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１）において利用可能である。

【0313】

いくつかの実施形態において、薬学的に許容される賦形剤は、薬学的に許容される担体を含みうる。そのような薬学的に許容される担体は、滅菌液体、例えば水、および石油、動物、植物、または合成起源の油、例えば落花生油、ダイズ油、鉱油等を含む油でありうる。食塩水溶液およびデキストロース水溶液、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および
グリセロール溶液もまた、特に注射用溶液のための液体担体として使用することができる。追加の成分、例えば保存剤、緩衝剤、等張剤、抗酸化剤および安定化剤、非イオン性湿潤剤または清澄剤、増粘剤等も同様に使用することができる。本明細書において記述されるキットは、単回単位用量または複数回単位用量に包装することができる。キットの内容物は一般的に、無菌的で実質的に等張の溶液として製剤化される。

【実施例0314】

本発明は、以下の実施例を参照してより十分に理解されるであろう。しかし、以下の実施例は、本発明の範囲を制限すると解釈すべきではない。本明細書において記述される実施例および実施形態は、単に説明目的のためであり、それに照らして様々な変更または変化が当業者に示唆されるが、それらも本出願および添付の特許請求の範囲の精神および範囲に含まれると理解される。

【実施例0315】

Ｃｒｉｓｐｒ－Ｃａｓ９技術を使用したレーバー先天黒内障のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルの作製
方法
プラスミド
ｐＳｐＣａｓ９を発現するｐＳｐＣａｓ９プラスミドを、Ｓｉｇｍａ（カタログ番号：ＣＡＳ９Ｐ－１ＥＡ）に注文した。ＢＧＨポリＡにおけるＢｂｓＩ制限部位を、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）および一対の突然変異誘発プライマー（配列番号２８～２９）を使用して製造元のプロトコールに従って除去した。Ｕ６プロモーター－ＢｂｓＩ：ＢｂｓＩ－ｓｇＲＮＡスキャホールド－Ｕ６ターミネーターカセット（配列番号３０）を、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって合成して、ｐＳｐＣａｓ９－ＢｂｓＩヌルプラスミドのＰｃｉＩおよびＮｒｕＩ制限部位に挿入し、ｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）プラスミドを作製した。ｓｇＲＮＡオリゴ（配列番号１～２）を、既に記述されたプロトコールに従って（Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．８：２２８１～２３０８頁）、ｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）プラスミドの２つのＢｂｓＩ制限部位にサブクローニングした。

【0316】

ヌクレオフェクション
ｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）－Ｕ６－ｓｇＲＮＡプラスミドＤＮＡ ２．５マイクログラムおよびｓｓＯＤＮ（１０マイクロモル濃度）（配列番号３）５マイクロリットルを、Ａｍａｘａ ＳＦ細胞株４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＸキットＬ（Ｌｏｎｚａ）および４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒシステム（Ｌｏｎｚａ）のプログラムＣＭ－１３０を使用して、製造元のプロトコールに従って、１ｘ１０^６個のＨＥＫ ２９３ＦＴ細胞に同時トランスフェクトした。

【0317】

スクリーニング
ＣＥＰ２９０のｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ突然変異を有するクローンを同定するために、細胞を、４８時間の同時トランスフェクション後に単細胞に解離させて、ウェルあたり複数の細胞を有する可能性を低減させるために、１００マイクロリットルあたり細胞０．５個の最終濃度に連続希釈した。希釈した細胞１００マイクロリットルを９６ウェルプレート９枚のそれぞれのウェルに播種した。細胞を５％ＣＯ_２、３７℃のインキュベーター内で２週間増殖させた。

【0318】

２３５個の単細胞クローンを同定して、ＣＥＰ２９０のｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ突然変異に関してスクリーニングした。ゲノムＤＮＡを、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ抽出溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用して抽出し、ＧｏＴａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒ
ｔ Ｇｒｅｅｎマスターミックス（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびイントロン突然変異の両端に位置するＰＣＲプライマー（配列番号４～５）によって増幅した。ＰＣＲ産物の増幅は、以下のサイクリングパラメータによって得られた：９５℃で２分間を１サイクル；９５℃で３０秒、６０℃で３０秒、および７２℃で３分間を３５サイクル；７２℃で１５分間を１サイクル。ＰＣＲ産物を、ＳｎａＢＩ消化およびシークエンシングプライマー（配列番号６）によるサンガーシークエンシングに供した。

【0319】

ＲＴ－ｑＰＣＲ
ｍＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、製造元のプロトコールに従ってＷＴ、Ｈｅｔ、およびＭＴ細胞から抽出した。総ＲＮＡ １マイクログラムを使用して、ｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して製造元のプロトコールに従ってｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡを、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７５００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において、低濃度ＲＯＸ（Ｂｉｏｔｉｕｍ）を含むＦａｓｔ Ｐｌｕｓ ＥｖａＧｒｅｅｎ ｑＰＣＲマスターミックス、ならびに野生型ＣＥＰ２９０ ｍＲＮＡ（配列番号７～８）および突然変異体ＣＥＰ２９０ ｍＲＮＡ（配列番号９～１０）をそれぞれ特異的に検出するプライマーを含む緩衝液中でリアルタイムＰＣＲ増幅に供した。以下の条件を使用した：５０℃で２分間を１サイクル；９５℃で１０分間を１サイクル；９５℃で１５秒間および６０℃で６０秒間を４０サイクル。増幅産物の特異性を、９５℃で１５秒間、６０℃で６０秒間、９５℃で１５秒間および６０℃で１５秒間のサイクルを使用してそれぞれの試行の最後に実施した融解曲線分析から決定した。データをＳＤＳ ２．３ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して分析した。ＣＥＰ２９０発現レベルを、ＰＰＩＡ ｍＲＮＡの発現レベルに対して標準化した（プライマーの配列に関しては、配列番号３１～３２を参照されたい）。

【0320】

ウェスタンブロット分析
細胞を、氷中で、１ミリモル／リットルのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）および１Ｘプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を補充したＲＩＰＡ溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）中で溶解した。次に、細胞をこすり取り、エッペンドルフチューブに収集して、ライセートを１３，０００ｒｐｍ、４℃で６分間の遠心分離によって透明にした。ＮｕＰａｇｅ ４Ｘ ＬＤＳ試料緩衝液およびＮｕＰａｇｅ １０Ｘ還元剤（いずれもＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加して、７０℃で１０分間加熱し、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離することによって、試料を調製した。タンパク質試料を、ＨｉＭａｒｋ染色済みタンパク質標準物質（いずれもＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共にＮｕＰＡＧＥ ３～８％Ｔｒｉｓ－酢酸ゲルにロードした。試料をゲル電気泳動によって、１８０ボルトで１時間分離した。使用した泳動緩衝液は、Ｔｒｉｓ－酢酸ＳＤＳ泳動緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）であった。転写のために、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）メンブレンを、親水性にするためにメタノール中で短時間処理して水ですすいだ。ＸＣｅｌｌ
ＩＩブロットモジュール（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）においてＰＶＤＦメンブレンおよびゲルを濾紙およびスポンジの間に挟むことによって、転写サンドイッチを調製した。使用した転写緩衝液は、２０％メタノールを含むＮｕＰａｇｅ ２０Ｘ転写緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）であった。転写は、ＸＣｅｌｌ ＳｕｒｅＬｏｃｋ Ｍｉｎｉ－Ｃｅｌｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、３０ボルトで２時間実施した。転写後、ＰＶＤＦメンブレンを、１％脱脂粉乳を含むＰｉｅｒｃｅ ＴＢＳＴ緩衝液（Ｔｗｅｅｎ２０洗浄剤を含むＴｒｉｓ－緩衝食塩水；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中、室温で１時間振とうさせながらブロックした。ブロットをブロック溶液中で作製した一次抗体溶液中でインキュベートして、４℃で終夜揺り動かした。使用した一次抗体は、ウサギポリクローナル抗ＣＥＰ２９０抗体（ウスタ
ー、マサチューセッツ大学のＨｅｍａｎｔ Ｋｈａｎｎａ教授の寄贈）、マウスモノクローナル抗Ｃａｓ９抗体（クローン７Ａ９；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＨＲＰコンジュゲートウサギモノクローナル抗ベータ－アクチン抗体（クローン１３Ｅ５；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）であった。未結合の一次抗体をＴＢＳＴで各１０分間３回洗浄した。ブロック溶液中の二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７コンジュゲート抗ウサギまたは抗マウスＩｇＧ；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を、メンブレンに添加して、シェーカーにおいて室温で１時間維持した。非特異的バックグラウンドを低減させるために、メンブレンをＴＢＳＴによって各１０分間３回洗浄した。メンブレンを、Ｐｉｅｒｃｅ増強化学発光（ＥＣＬ）ウェスタンブロット用基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して４分間現像した。最後に、ブロット中のタンパク質バンドを、Ｋｏｄａｋ Ｘ－ＯＭＡＴ ２０００プロセッサにおいて、フィルムを様々な時間間隔で露出することによって可視化した。抗ベータ－アクチン抗体のブロットを再プロービングするために、メンブレンを最初に、回復用ウェスタンブロットストリッピング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中、３７℃で３０分間インキュベートすることによってストリッピングした後、抗ベータ－アクチン抗体によって再プロービングした。本試験で示したブロッティングデータは、少なくとも３回の独立した実験の代表であった。

【0321】

結果
最初に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ゲノム編集技術を使用して、ＣＥＰ２９０においてイントロンスプライス突然変異ｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇを有する細胞モデルを作製した。この細胞モデルは、ＣＥＰ２９０においてｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ突然変異を有するＬＣＡ患者を治療する治療薬を評価するための貴重なツールであった。

【0322】

細菌型ＩＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムによるゲノム編集を、ｓｇＲＮＡ標的配列およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）によって定義される標的化ゲノム座での二本鎖切断（ＤＳＢ）の導入によって開始した後、相同性組換え修復（ＨＤＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）のいずれかを通してＤＳＢの修復を行った（Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６～８２１頁；Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．８：２２８１～２３０８頁）。ＨＤＲ鋳型の存在下では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを使用して、ＨＤＲプロセスを通して標的座で正確かつ定義された遺伝子操作を行うことができる。

【0323】

標的化ゲノムＤＮＡ置換を得るために、ｓｇＲＮＡおよび化膿連鎖球菌Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）の両方を発現するプラスミドを、直線状のＨＤＲ鋳型と共に２９３ＦＴ細胞にヌクレオフェクションによって導入した。ＨＤＲ鋳型は、突然変異ＰＡＭ（ｃ．２９９１＋１６６６Ｃ＞Ｇ）と共にｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ突然変異の両端に位置する７５ｂｐの相同性アームを含む一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ；配列番号３）であった。突然変異ＰＡＭは、細胞においてドナーｓｓＯＤＮがＣａｓ９によって分解されるのを回避して、その間にＣＥＰ２９０のイントロン２６に独自のＳｎａＢＩ制限部位を導入した。

【0324】

ＣＥＰ２９０のｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ突然変異を有する細胞を得るために、ｓｇＲＮＡ／ＳｐＣａｓ９およびｓｓＯＤＮ同時トランスフェクト細胞から、２３５個の単細胞クローンを単離してスクリーニングした。ゲノムＤＮＡを抽出して、イントロン突然変異の両端に位置するＰＣＲプライマー（配列番号４～５）によって増幅した。ＰＣＲ産物を、ＳｎａＢＩ消化およびシークエンシングプライマー（配列番号６）によるサンガーシークエンシングに供した。

【0325】

２３５個の単細胞クローン中、１つのクローンが、両方のＣＥＰ２９０対立遺伝子にｃ
．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇおよびｃ．２９９１＋１６６６Ｃ＞Ｇ突然変異を含んだ（本明細書において以降、「突然変異体細胞」または「ＭＴ細胞」と呼ぶ）。別のクローンは、１つのＣＥＰ２９０対立遺伝子上に２つの突然変異、および他の対立遺伝子上に内因性の野生型ＣＥＰ２９０ ＤＮＡを含んだ（本明細書において以降、「ヘテロ接合細胞」または「Ｈｅｔ細胞」と呼ぶ）。内因性の野生型ＣＥＰ２９０の２つの対立遺伝子を含む細胞を、本明細書において以降「野生型細胞」または「ＷＴ細胞」と呼ぶ。

【0326】

野生型、ヘテロ接合、および突然変異体細胞における野生型および突然変異体ＣＥＰ２９０ ｍＲＮＡの発現レベルを、野生型ＣＥＰ２９０ ｍＲＮＡ（配列番号７～８）および突然変異体ＣＥＰ２９０ ｍＲＮＡ（配列番号９～１０）をそれぞれ特異的に検出するプライマーを使用して、逆転写定量的ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）によって測定した。結果を、ＰＰＩＡ ｍＲＮＡ（配列番号３１～３２）の発現レベルに対して標準化した。

【0327】

野生型細胞と比較して、ヘテロ接合および突然変異体細胞では、野生型ＣＥＰ２９０のｍＲＮＡレベルがそれぞれ２７％および４８％低減された（図３Ａ）。予想されるように、野生型細胞は、突然変異体ＣＥＰ２９０ ｍＲＮＡを発現しなかったが、そのレベルは突然変異体細胞ではヘテロ接合細胞より２４％高かった（図３Ｂ）。ヘテロ接合細胞と比較して、突然変異体細胞は、有意により低レベルの野生型ＣＥＰ２９０ ｍＲＭＡを発現し、有意により高レベルの突然変異体ＣＥＰ ｍＲＮＡを発現した。したがって、この細胞モデルは、ｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ突然変異を有するＬＣＡ患者が、野生型ＣＥＰ２９０ ｍＲＮＡの約５０％低減されたレベルを発現することから（ｄｅｎ Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ，Ａ．Ｉ．ｅｔ ａｌ．（２００６）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７９：５５６～５６１頁）、これらの患者における表現型を要約する。

【0328】

野生型、ヘテロ接合、および突然変異体細胞におけるＣＥＰ２９０のタンパク質レベルをウェスタンブロット分析によって調べた。野生型細胞と比較すると、ヘテロ接合および突然変異体細胞におけるＣＥＰ２９０タンパク質レベルは、大きく低減された（図３Ｃ）。突然変異体細胞は、ヘテロ接合細胞と比較してより低いレベルのＣＥＰ２９０タンパク質を発現した（図３Ｃ）。したがって、イムノブロットデータは、ＲＴ－ｑＰＣＲデータと一貫した。