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特開2024-73571クロマチンアクセシビリティ及び心筋細胞の再生を誘発する、Ｈｉｐｐｏエフェクターである優性活性Ｙａｐ
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024073571
(43)【公開日】2024-05-29
(54)【発明の名称】クロマチンアクセシビリティ及び心筋細胞の再生を誘発する、Ｈｉｐｐｏエフェクターである優性活性Ｙａｐ
(51)【国際特許分類】
A61K 38/17 20060101AFI20240522BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20240522BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240522BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240522BHJP
【ＦＩ】
A61K38/17
A61P9/10
A61P43/00 107
C12N15/12 ZNA
【審査請求】有
【請求項の数】5
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024040081
(22)【出願日】2024-03-14
(62)【分割の表示】P 2022105207の分割
【原出願日】2018-03-14
(31)【優先権主張番号】62/471,204
(32)【優先日】2017-03-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】391058060
【氏名又は名称】ベイラー カレッジ オブ メディスン
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＹＬＯＲ ＣＯＬＬＥＧＥ ＯＦ ＭＥＤＩＣＩＮＥ
(74)【代理人】
【識別番号】110000729
【氏名又は名称】弁理士法人ユニアス国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】モンロー、タナー
(72)【発明者】
【氏名】リーチ、ジョン
(72)【発明者】
【氏名】マーティン、ジェームズ、エフ．
【テーマコード（参考）】
4C084
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA22
4C084BA23
4C084DC50
4C084MA65
4C084NA14
4C084ZA331
4C084ZA332
4C084ZA341
4C084ZA342
4C084ZA361
4C084ZA362
4C084ZA401
4C084ZA402
4C084ZA941
4C084ZA942
4C084ZB221
4C084ZB222
(57)【要約】 （修正有）
【課題】細胞（心筋細胞、網膜細胞、中枢神経系のニューロン、又は耳の有毛細胞を含む）再生を促進する活性を有する組成物を提供する。
【解決手段】本開示は、１つ以上の突然変異型Ｙａｐ変異体を有する既存細胞から細胞または組織を作製する方法を包含する。具体的な実施形態では、本開示は、分裂して新たな心筋細胞を生じさせる１つ以上の突然変異型Ｙａｐ変異体による既存心筋細胞の治療に関する。具体的な事例では、突然変異型Ｙａｐ変異体は、Ｙａｐの１個、２個、３個、４個、５個、６個、またはそれ以上のセリンに、セリンからアラニンへの置換を有する。
【選択図】なし
【解決手段】本開示は、１つ以上の突然変異型Ｙａｐ変異体を有する既存細胞から細胞または組織を作製する方法を包含する。具体的な実施形態では、本開示は、分裂して新たな心筋細胞を生じさせる１つ以上の突然変異型Ｙａｐ変異体による既存心筋細胞の治療に関する。具体的な事例では、突然変異型Ｙａｐ変異体は、Ｙａｐの１個、２個、３個、４個、５個、６個、またはそれ以上のセリンに、セリンからアラニンへの置換を有する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１の６１位、１０９位、１２７位、１６４位及び３８１位のセリンのアミノ酸置換を含む、突然変異型Ｙａｐタンパク質を含有する、個体において心筋細胞を再生する方法に用いるための組成物であって、
前記アミノ酸置換が、アラニンへの置換である、組成物。
前記アミノ酸置換が、アラニンへの置換である、組成物。
【請求項2】
配列番号１の６１位、１０９位、１２７位、１６４位及び３８１位のセリンのアミノ酸置換を含む、突然変異型Ｙａｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、個体において心筋細胞を再生する方法に用いるための組成物前記アミノ酸置換が、アラニンへの置換である、組成物。
【請求項3】
配列番号１の６１位、１０９位、１２７位、１６４位及び３８１位のセリンのアミノ酸置換を含む、突然変異型Ｙａｐタンパク質を含有する、個体において心筋梗塞を治療する方法に用いるための組成物であって、
前記アミノ酸置換がアラニンへの置換である、組成物。
前記アミノ酸置換がアラニンへの置換である、組成物。
【請求項4】
配列番号１の６１位、１０９位、１２７位、１６４位及び３８１位のセリンのアミノ酸置換を含む、突然変異型Ｙａｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、個体において心筋梗塞を治療する方法に用いるための組成物であって、
前記アミノ酸置換が、アラニンへの置換である、組成物。
前記アミノ酸置換が、アラニンへの置換である、組成物。
【請求項5】
前記個体の心臓組織へ送達される、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０１７年３月１４日出願の米国仮特許出願第６２／４７１，２０４号に対
する優先権を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
する優先権を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
（連邦政府支援の研究または開発に関する声明）
本発明は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）により授与されたＨＬ１２７７１７に基づく
政府支援を受けて実施された。政府は本発明において、ある一定の権利を有する。
本発明は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）により授与されたＨＬ１２７７１７に基づく
政府支援を受けて実施された。政府は本発明において、ある一定の権利を有する。
【0003】
本開示の実施形態は、少なくとも細胞生物学、分子生物学、生化学、心臓学、及び医学
の分野に関連する。
の分野に関連する。
【背景技術】
【0004】
完全なヒト心筋細胞の供給は生後１か月以内に確立され、成人の心筋細胞は年間約１％
の割合で再生されることが、Ｃ１４年代測定実験で示された１。成体マウスの心筋細胞も
同様に再生率が低い２。Ｈｉｐｐｏ経路は進化的に保存されたキナーゼカスケードであり
、Ｌａｒｇｅ Ｔｕｍｏｒ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ（Ｌａｔｓ）１および２キナーゼによ
る転写コアクチベーターＹａｐのリン酸化及び阻害をもたらす３。Ｈｉｐｐｏ経路の構成
要素を出生後に除去すると、セリン（Ｓ）からアラニン（Ａ）への単一の突然変異をもつ
活性型Ｙａｐを発現できるように、ＣＭの再生を適度に増加させることができる４～７。
の割合で再生されることが、Ｃ１４年代測定実験で示された１。成体マウスの心筋細胞も
同様に再生率が低い２。Ｈｉｐｐｏ経路は進化的に保存されたキナーゼカスケードであり
、Ｌａｒｇｅ Ｔｕｍｏｒ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ（Ｌａｔｓ）１および２キナーゼによ
る転写コアクチベーターＹａｐのリン酸化及び阻害をもたらす３。Ｈｉｐｐｏ経路の構成
要素を出生後に除去すると、セリン（Ｓ）からアラニン（Ａ）への単一の突然変異をもつ
活性型Ｙａｐを発現できるように、ＣＭの再生を適度に増加させることができる４～７。
【0005】
Ｌａｔｓ１／２は、５つの共通するＮＤＲ（核Ｄｂｆ２関連）キナーゼファミリーモチ
ーフＨＸＲＸＸＳのＳ残基のリン酸化によりＹａｐを阻害する。ｉｎ ｖｉｔｒｏレポー
ターアッセイでは、Ｈｉｐｐｏ阻害の多くはＳ１２７のリン酸化（ヒトにおいてはＳ１２
７、マウスにおいてはＳ１１２）によるものであるが、Ｙａｐの阻害には他のＳリン酸化
事象も寄与することが示されている８。
ーフＨＸＲＸＸＳのＳ残基のリン酸化によりＹａｐを阻害する。ｉｎ ｖｉｔｒｏレポー
ターアッセイでは、Ｈｉｐｐｏ阻害の多くはＳ１２７のリン酸化（ヒトにおいてはＳ１２
７、マウスにおいてはＳ１１２）によるものであるが、Ｙａｐの阻害には他のＳリン酸化
事象も寄与することが示されている８。
【0006】
本開示は、心臓修復を含めた心筋細胞再生の技術分野で長年にわたり切望されたニーズ
を満たす。
を満たす。
【発明の概要】
【0007】
本開示の実施形態には、例えば心臓、網膜、中枢神経系のニューロン、及び耳の有毛細
胞におけるものを含めた、あらゆる種類の組織再生のための方法及び組成物を含む。本開
示の実施形態には、ヒト、イヌ、ネコ、ウマなどの哺乳動物個体における１つ以上の病態
の治療に対するものを含めた、細胞の再生に関連する方法及び組成物を含む。本開示の実
施形態には、細胞を再生することを必要とする１つ以上の個体において細胞を再生するた
めの方法及び組成物を含む。個体は、細胞再生を必要とする何らかの種類の病態を有する
場合があるか、あるいはその病態に罹患しやすい、または罹患のリスクがある。具体的な
実施形態では、哺乳動物個体における１つ以上の病態の治療に対するものを含めた、心筋
細胞、網膜細胞、中枢神経系のニューロン、または耳（内耳または外耳を含む）の有毛細
胞の再生に関連する方法及び組成物が提供される。網膜での具体的な事例では、ミュラー
グリア細胞にＹａｐ突然変異体を曝露させ、それによりこの細胞を網膜のニューロンへと
分化させる。心筋細胞の再生の事例では、個体は心臓の病態を有しているか、またはその
リスクがある場合がある。個体は、個人歴及び／または家族歴、喫煙者、肥満または過体
重であるために、またはそれらの組み合わせなどのために、心臓病態のリスクが生じる場
合がある。
胞におけるものを含めた、あらゆる種類の組織再生のための方法及び組成物を含む。本開
示の実施形態には、ヒト、イヌ、ネコ、ウマなどの哺乳動物個体における１つ以上の病態
の治療に対するものを含めた、細胞の再生に関連する方法及び組成物を含む。本開示の実
施形態には、細胞を再生することを必要とする１つ以上の個体において細胞を再生するた
めの方法及び組成物を含む。個体は、細胞再生を必要とする何らかの種類の病態を有する
場合があるか、あるいはその病態に罹患しやすい、または罹患のリスクがある。具体的な
実施形態では、哺乳動物個体における１つ以上の病態の治療に対するものを含めた、心筋
細胞、網膜細胞、中枢神経系のニューロン、または耳（内耳または外耳を含む）の有毛細
胞の再生に関連する方法及び組成物が提供される。網膜での具体的な事例では、ミュラー
グリア細胞にＹａｐ突然変異体を曝露させ、それによりこの細胞を網膜のニューロンへと
分化させる。心筋細胞の再生の事例では、個体は心臓の病態を有しているか、またはその
リスクがある場合がある。個体は、個人歴及び／または家族歴、喫煙者、肥満または過体
重であるために、またはそれらの組み合わせなどのために、心臓病態のリスクが生じる場
合がある。
【0008】
具体的な実施形態では、方法及び組成物は、１つ以上のＹａｐ突然変異体に関連する。
ある特定の実施形態では、１つ以上のＹａｐ突然変異体は、関連する医学的病態の改善に
つながる、細胞（心筋細胞、網膜細胞、中枢神経系のニューロン、または耳の有毛細胞を
含む）再生を促進する活性を有する。代替的実施形態では、１つ以上のＹａｐ突然変異体
は、医学的病態は改善するが、細胞再生を検出可能に促進しない。しかしながら、具体的
な実施形態では、１つ以上のＹａｐ突然変異体は、クロマチンの全体的な再編成を刺激し
て細胞再生を促進する。具体的な事例では、突然変異体は１個、２個、３個、４個、５個
、６個、またはそれ以上のアミノ酸置換を有するＹａｐ突然変異体である。置換はセリン
に対してであってもなくてもよく、場合によってはアミノ酸のセリンのアラニンへの置換
である。特定の態様では、一例として、Ｌａｔｓキナーゼでの主要なリン酸化部位に、セ
リンからアラニンへの５つの置換を有する突然変異体Ｙａｐ５ＳＡは、成体心筋細胞にお
いてクロマチンの全体的な再編成を刺激して心筋細胞の再生を促進する。そのようなＹａ
ｐ突然変異体または他のＹａｐ突然変異体を、網膜細胞または有毛細胞の再生の促進にも
類似的に使用することができる。Ｙａｐ突然変異体は、ポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドとして個体に提供することができる。
ある特定の実施形態では、１つ以上のＹａｐ突然変異体は、関連する医学的病態の改善に
つながる、細胞（心筋細胞、網膜細胞、中枢神経系のニューロン、または耳の有毛細胞を
含む）再生を促進する活性を有する。代替的実施形態では、１つ以上のＹａｐ突然変異体
は、医学的病態は改善するが、細胞再生を検出可能に促進しない。しかしながら、具体的
な実施形態では、１つ以上のＹａｐ突然変異体は、クロマチンの全体的な再編成を刺激し
て細胞再生を促進する。具体的な事例では、突然変異体は１個、２個、３個、４個、５個
、６個、またはそれ以上のアミノ酸置換を有するＹａｐ突然変異体である。置換はセリン
に対してであってもなくてもよく、場合によってはアミノ酸のセリンのアラニンへの置換
である。特定の態様では、一例として、Ｌａｔｓキナーゼでの主要なリン酸化部位に、セ
リンからアラニンへの５つの置換を有する突然変異体Ｙａｐ５ＳＡは、成体心筋細胞にお
いてクロマチンの全体的な再編成を刺激して心筋細胞の再生を促進する。そのようなＹａ
ｐ突然変異体または他のＹａｐ突然変異体を、網膜細胞または有毛細胞の再生の促進にも
類似的に使用することができる。Ｙａｐ突然変異体は、ポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドとして個体に提供することができる。
【0009】
上記は、以降の本発明の詳細な説明をよりよく理解できるように、本発明の特徴及び技
術的利点をかなり大まかに概説したものである。本発明の特許請求の範囲の主題を形成す
る本発明のさらなる特徴及び利点を以下に説明する。開示される概念及び具体的な実施形
態は、本発明の同じ目的を実施するために、それらに変更を加えるか、または他の構造を
設計するための基礎として容易に利用できることが当業者には理解されるはずである。ま
た、そのような等価な構造が、添付の特許請求の範囲に記載される本発明の趣旨及び範囲
から逸脱しないことも当業者には認識されているはずである。本発明の特徴であると考え
られる新規の特徴は、その構成及び動作方法の両方に関して、さらなる目的及び利点も合
わせ、添付の図面と関連付けて考察すると、以下の説明からよりよく理解されるであろう
。しかしながら、各図は例示及び説明のみを目的として提供され、本発明の限定を規定す
る意図はないことを明確に理解されるべきである。
術的利点をかなり大まかに概説したものである。本発明の特許請求の範囲の主題を形成す
る本発明のさらなる特徴及び利点を以下に説明する。開示される概念及び具体的な実施形
態は、本発明の同じ目的を実施するために、それらに変更を加えるか、または他の構造を
設計するための基礎として容易に利用できることが当業者には理解されるはずである。ま
た、そのような等価な構造が、添付の特許請求の範囲に記載される本発明の趣旨及び範囲
から逸脱しないことも当業者には認識されているはずである。本発明の特徴であると考え
られる新規の特徴は、その構成及び動作方法の両方に関して、さらなる目的及び利点も合
わせ、添付の図面と関連付けて考察すると、以下の説明からよりよく理解されるであろう
。しかしながら、各図は例示及び説明のみを目的として提供され、本発明の限定を規定す
る意図はないことを明確に理解されるべきである。
【0010】
本発明をより完全に理解するために、ここで添付の図面と併せて下記の説明が考慮され
る。
また、本開示は、以下の実施形態を含む。
＜１＞
治療有効量の突然変異型Ｙａｐ変異体を個体に供給する工程を含む、個体において細胞
を再生する方法。
＜２＞
再生される前記細胞が、心筋細胞、網膜細胞、または耳の有毛細胞である、＜１＞に記
載の方法。
＜３＞
前記突然変異型変異体が、セリンに１つ以上のアミノ酸置換を含む、＜１＞または＜２
＞に記載の方法。
＜４＞
２個、３個、４個、５個、６個、７個、またはそれ以上のアミノ酸置換がセリンに存在
する、＜１＞～＜３＞のいずれか１に記載の方法。
＜５＞
Ｌａｔｓキナーゼによりリン酸化されるセリンに、１個、２個、３個、４個、または５
個のアミノ酸置換が存在する、＜１＞～＜３＞のいずれか１に記載の方法。
＜６＞
１つ以上のアミノ酸置換がアラニンへの置換である、＜１＞～＜５＞のいずれか１に記
載の方法。
＜７＞
前記突然変異型Ｙａｐ変異体がＫ２６５Ｒ突然変異を含む、＜１＞～＜６＞のいずれか
１に記載の方法。
＜８＞
前記個体が、心臓病態、網膜病態、または耳の病態を有する、＜１＞～＜７＞のいずれ
か１に記載の方法。
＜９＞
前記個体における前記心臓病態により、前記個体が心筋細胞の再生を必要とする、＜８
＞に記載の方法。
＜１０＞
前記個体の心臓が心筋細胞のアポトーシス、ネクローシス、及び／またはオートファジ
ーを有する、＜８＞または＜９＞に記載の方法。
＜１１＞
前記心臓病態が、心臓疾患、心筋症、心臓弁の問題、心膜炎、不整脈、心停止、先天性
心障害、心不全、心疾患、心毒性、うっ血性心不全、虚血性心疾患、急性心筋梗塞、心房
細動、冠動脈疾患、虚血性心疾患、心臓弁膜症、高血圧性心疾患、及び不整脈からなる群
から選択される、＜８＞～＜１０＞のいずれか１に記載の方法。
＜１２＞
前記個体がデュシェンヌ型筋ジストロフィーを有する、＜１＞～＜１１＞のいずれか１
に記載の方法。
＜１３＞
前記個体に組成物が複数回供給される、＜１＞～＜１２＞のいずれか１に記載の方法。
＜１４＞
前記組成物が前記個体の全身に供給される、＜１＞～＜１３＞のいずれか１に記載の方
法。
＜１５＞
前記組成物が前記個体の局所に供給される、＜１＞～＜１４＞のいずれか１に記載の方
法。
＜１６＞
前記突然変異型Ｙａｐ変異体をｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に曝露させて、ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ由来細胞を作製する、＜１＞～＜１５＞のいずれか１に記載の方法。
＜１７＞
有効量の前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ由来細胞を前記個体に供給する、＜１６＞に記載の方法
。
＜１８＞
病態の追加療法を前記個体に提供する、＜５＞～＜１５＞のいずれか１に記載の方法。
＜１９＞
個体の医学的病態を治療する方法であって、治療有効量の突然変異型Ｙａｐ変異体を前
記個体に供給する工程を含む、前記方法。
＜２０＞
前記突然変異型Ｙａｐ変異体が、セリンに１つ以上のアミノ酸置換を含む、＜１９＞に
記載の方法。
＜２１＞
２個、３個、４個、５個、６個、７個、またはそれ以上のアミノ酸置換がセリンに存在
する、＜１９＞または＜２０＞に記載の方法。
＜２２＞
Ｌａｔｓキナーゼによりリン酸化されるセリンに、１個、２個、３個、４個、または５
個のアミノ酸置換が存在する、＜１９＞～＜２１＞のいずれか１に記載の方法。
＜２３＞
セリンに５つのアミノ酸置換が存在する、請求項１９～２２のいずれか一項に記載の方
法。
＜２４＞
１つ以上のアミノ酸置換がアラニンへの置換である、＜１９＞～＜２３＞のいずれか１
に記載の方法。
＜２５＞
前記突然変異型Ｙａｐ変異体がＫ２６５Ｒ突然変異を含む、＜１９＞～＜２４＞のいず
れか１に記載の方法。
＜２６＞
前記医学的病態が心臓病態である、＜１９＞～＜２５＞のいずれか１に記載の方法。
＜２７＞
前記個体における前記心臓病態により、前記個体が心筋細胞の再生を必要とする、＜２
６＞に記載の方法。
＜２８＞
前記個体の心臓が心筋細胞のアポトーシス、ネクローシス、及び／またはオートファジ
ーを有する、＜１９＞～＜２７＞のいずれか１に記載の方法。
＜２９＞
前記医学的病態が、心臓疾患、心筋症、心臓弁の問題、心膜炎、不整脈、心停止、先天
性心障害、心不全、心疾患、心毒性、うっ血性心不全、虚血性心疾患、急性心筋梗塞、心
房細動、冠動脈疾患、虚血性心疾患、心臓弁膜症、高血圧性心疾患、及び不整脈からなる
群から選択される心臓病態である、＜１９＞～＜２８＞のいずれか１に記載の方法。
＜３０＞
前記個体がデュシェンヌ型筋ジストロフィーを有する、＜１９＞～＜２９＞のいずれか
１に記載の方法。
＜３１＞
前記個体に前記組成物が複数回供給される、＜１９＞～＜３０＞のいずれか１に記載の
方法。
＜３２＞
前記組成物が前記個体の全身に供給される、＜１９＞～＜３１＞のいずれか１に記載の
方法。
＜３３＞
前記組成物が前記個体の局所に供給される、＜１９＞～＜３２＞のいずれか１に記載の
方法。
＜３４＞
前記突然変異型Ｙａｐ変異体をｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に曝露させて、ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ由来細胞を作製する、＜１９＞～＜３３＞のいずれか１に記載の方法。
＜３５＞
有効量の前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ由来細胞を前記個体に供給する、＜３４＞に記載の方法
。
＜３６＞
前記医学的病態の追加療法を前記個体に提供する、＜１９＞～＜３５＞のいずれか１に
記載の方法。
る。
また、本開示は、以下の実施形態を含む。
＜１＞
治療有効量の突然変異型Ｙａｐ変異体を個体に供給する工程を含む、個体において細胞
を再生する方法。
＜２＞
再生される前記細胞が、心筋細胞、網膜細胞、または耳の有毛細胞である、＜１＞に記
載の方法。
＜３＞
前記突然変異型変異体が、セリンに１つ以上のアミノ酸置換を含む、＜１＞または＜２
＞に記載の方法。
＜４＞
２個、３個、４個、５個、６個、７個、またはそれ以上のアミノ酸置換がセリンに存在
する、＜１＞～＜３＞のいずれか１に記載の方法。
＜５＞
Ｌａｔｓキナーゼによりリン酸化されるセリンに、１個、２個、３個、４個、または５
個のアミノ酸置換が存在する、＜１＞～＜３＞のいずれか１に記載の方法。
＜６＞
１つ以上のアミノ酸置換がアラニンへの置換である、＜１＞～＜５＞のいずれか１に記
載の方法。
＜７＞
前記突然変異型Ｙａｐ変異体がＫ２６５Ｒ突然変異を含む、＜１＞～＜６＞のいずれか
１に記載の方法。
＜８＞
前記個体が、心臓病態、網膜病態、または耳の病態を有する、＜１＞～＜７＞のいずれ
か１に記載の方法。
＜９＞
前記個体における前記心臓病態により、前記個体が心筋細胞の再生を必要とする、＜８
＞に記載の方法。
＜１０＞
前記個体の心臓が心筋細胞のアポトーシス、ネクローシス、及び／またはオートファジ
ーを有する、＜８＞または＜９＞に記載の方法。
＜１１＞
前記心臓病態が、心臓疾患、心筋症、心臓弁の問題、心膜炎、不整脈、心停止、先天性
心障害、心不全、心疾患、心毒性、うっ血性心不全、虚血性心疾患、急性心筋梗塞、心房
細動、冠動脈疾患、虚血性心疾患、心臓弁膜症、高血圧性心疾患、及び不整脈からなる群
から選択される、＜８＞～＜１０＞のいずれか１に記載の方法。
＜１２＞
前記個体がデュシェンヌ型筋ジストロフィーを有する、＜１＞～＜１１＞のいずれか１
に記載の方法。
＜１３＞
前記個体に組成物が複数回供給される、＜１＞～＜１２＞のいずれか１に記載の方法。
＜１４＞
前記組成物が前記個体の全身に供給される、＜１＞～＜１３＞のいずれか１に記載の方
法。
＜１５＞
前記組成物が前記個体の局所に供給される、＜１＞～＜１４＞のいずれか１に記載の方
法。
＜１６＞
前記突然変異型Ｙａｐ変異体をｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に曝露させて、ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ由来細胞を作製する、＜１＞～＜１５＞のいずれか１に記載の方法。
＜１７＞
有効量の前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ由来細胞を前記個体に供給する、＜１６＞に記載の方法
。
＜１８＞
病態の追加療法を前記個体に提供する、＜５＞～＜１５＞のいずれか１に記載の方法。
＜１９＞
個体の医学的病態を治療する方法であって、治療有効量の突然変異型Ｙａｐ変異体を前
記個体に供給する工程を含む、前記方法。
＜２０＞
前記突然変異型Ｙａｐ変異体が、セリンに１つ以上のアミノ酸置換を含む、＜１９＞に
記載の方法。
＜２１＞
２個、３個、４個、５個、６個、７個、またはそれ以上のアミノ酸置換がセリンに存在
する、＜１９＞または＜２０＞に記載の方法。
＜２２＞
Ｌａｔｓキナーゼによりリン酸化されるセリンに、１個、２個、３個、４個、または５
個のアミノ酸置換が存在する、＜１９＞～＜２１＞のいずれか１に記載の方法。
＜２３＞
セリンに５つのアミノ酸置換が存在する、請求項１９～２２のいずれか一項に記載の方
法。
＜２４＞
１つ以上のアミノ酸置換がアラニンへの置換である、＜１９＞～＜２３＞のいずれか１
に記載の方法。
＜２５＞
前記突然変異型Ｙａｐ変異体がＫ２６５Ｒ突然変異を含む、＜１９＞～＜２４＞のいず
れか１に記載の方法。
＜２６＞
前記医学的病態が心臓病態である、＜１９＞～＜２５＞のいずれか１に記載の方法。
＜２７＞
前記個体における前記心臓病態により、前記個体が心筋細胞の再生を必要とする、＜２
６＞に記載の方法。
＜２８＞
前記個体の心臓が心筋細胞のアポトーシス、ネクローシス、及び／またはオートファジ
ーを有する、＜１９＞～＜２７＞のいずれか１に記載の方法。
＜２９＞
前記医学的病態が、心臓疾患、心筋症、心臓弁の問題、心膜炎、不整脈、心停止、先天
性心障害、心不全、心疾患、心毒性、うっ血性心不全、虚血性心疾患、急性心筋梗塞、心
房細動、冠動脈疾患、虚血性心疾患、心臓弁膜症、高血圧性心疾患、及び不整脈からなる
群から選択される心臓病態である、＜１９＞～＜２８＞のいずれか１に記載の方法。
＜３０＞
前記個体がデュシェンヌ型筋ジストロフィーを有する、＜１９＞～＜２９＞のいずれか
１に記載の方法。
＜３１＞
前記個体に前記組成物が複数回供給される、＜１９＞～＜３０＞のいずれか１に記載の
方法。
＜３２＞
前記組成物が前記個体の全身に供給される、＜１９＞～＜３１＞のいずれか１に記載の
方法。
＜３３＞
前記組成物が前記個体の局所に供給される、＜１９＞～＜３２＞のいずれか１に記載の
方法。
＜３４＞
前記突然変異型Ｙａｐ変異体をｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に曝露させて、ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ由来細胞を作製する、＜１９＞～＜３３＞のいずれか１に記載の方法。
＜３５＞
有効量の前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ由来細胞を前記個体に供給する、＜３４＞に記載の方法
。
＜３６＞
前記医学的病態の追加療法を前記個体に提供する、＜１９＞～＜３５＞のいずれか１に
記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】図１Ａ～１Ｅ。Ｙａｐ５ＳＡ導入遺伝子の設計及び発現。図１Ａ．（上）条件付きＹａｐ５ＳＡ対立遺伝子の構造。（下）下線のセリン残基がアラニンに変異している過剰発現されたＹａｐ変異体のヒトタンパク質配列。図１Ｂ．発達期の心臓にＧＦＰ発現を有する代表的なｅ９．５ Ｔｇ（Ｊｏｊｏ＿Ｆｌａｇ：：Ｙａｐ５ＳＡ）５ＪＦＭマウス。図１Ｃ．Ｐ０新生児から採取した対照及びトランスジェニック心臓でのＧＦＰ蛍光の画像。図１Ｄ．（左上）成体ＣＭでＹａｐ５ＳＡを発現させるための生殖及び誘導戦略。（左下）ＦｌａｇＹａｐ５ＳＡ発現を示すウェスタンブロット。左側に分子量マーカーを示す。（右）ウェスタンブロットによるＹａｐ発現の定量化を平均＋／－ＳＥＭとして示す。ｎ＝３マウス／遺伝子型。図１Ｅ．抗Ｙａｐ抗体及びＤＡＰＩで染色された、単離した対照及びＹａｐ５ＳＡ ＯＥ心筋細胞の免疫蛍光画像。（右）平均＋／－ＳＥＭとして示されるＹａｐ免疫蛍光の核／サイトゾル比の定量化。分散分析とＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定による全統計。対照ｎ＝３（心臓）、６０（細胞）。Ｙａｐ５ＳＡ ｎ＝３（心臓）、６７（細胞）。
【図2】図２Ａ～２Ｊ。Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥマウスの求心性心不全及び死亡。図２Ａ．対照（ｎ＝８）及びＹａｐ５ＳＡ ＯＥ（ｎ＝７）マウスを表すカプランマイヤー生存分析。Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ検定により算出された統計。図２Ｂ．対照及び瀕死状態のＹａｐ５ＳＡ心臓から得たマッソンのトリクローム染色（７日目）。図２Ｃ．４回目のタモキシフェン注射の前及び１日後での同じ動物の左心室の代表的なＢモード画像。図２Ｄ～２Ｅ．収縮期（図２Ｄ）及び拡張期（図２Ｅ）における左心室後自由壁の厚さ。図２Ｄ～２Ｅは、平均＋／－ＳＥＭとして示され（注射前Ｙａｐ５ＳＡ ｎ＝７、注射前対照ｎ＝６、注射後Ｙａｐ５ＳＡ ｎ＝１０、注射後対照ｎ＝９）、分散分析とＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定により統計を算出した。図２Ｆ．４回目のタモキシフェン注射の前及び１日後での対照及びＹａｐ５ＳＡ ＯＥ心臓の代表的なＭモード心エコー検査。図２Ｇ．収縮終期の左心室腔直径。図２Ｈ．拡張終期の左心室腔直径。図２Ｉ．内径短縮率。図２Ｊ．駆出率。図２Ｇ～２Ｊのデータは、平均＋／－ＳＥＭとして示され（注射前Ｙａｐ５ＳＡ ｎ＝４、注射前対照ｎ＝３、注射後Ｙａｐ５ＳＡ ｎ＝７、注射後対照ｎ＝７）、分散分析とＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定により統計を算出した。
【図3】図３Ａ～３Ｋ．分化した心筋細胞の増殖。図３Ａ．単離ＣＭの面積を示すヒストグラム。ｎ＝３マウス／群。約１００細胞／心臓。図３Ｂ．異なる組織深度でのＬＶの切片及び面積、ｎ＝６／群。平均＋／－ＳＥＭ。＊はＰ＜０．０５を示す。図３Ｃ．ＬＶ容積。図３Ｄ．ＬＶ腔容積ｎ＝６／群。平均＋／－ＳＥＭ。図３Ｅ．ＬＶの重量と体重との比（ｎ＝６／条件）。平均＋／－ＳＥＭ。図３Ｆ．（左）ＬＶの筋細胞数。（ｎ＝５／群）平均＋／－ ＳＥＭ。（右）ＰＣＭ１（＋）ＣＭ核（黄色の矢印で例を示した）。図３Ｇ．ＣＭ核形成。６心臓／群。４００～５００ＣＭ／心臓。平均＋／－ＳＥＭ。図３Ｈ．（左）ＥｄＵを含むＣＭの例。（右）誘導／ＥｄＵ標識戦略及びＥｄＵ取り込みの定量化。平均＋／－ＳＥＭ。ｎ＝４心臓／群。２００～３００ＣＭ／心臓。図３Ｉ．代表的なＡｕｒｏｒａＢ染色切片（陽性細胞を黄色の矢印で示した）。（右）ＡｕｒｏｒａＢ（＋）ＣＭの定量化。平均＋／－ＳＥＭ。ｎ＝３マウス／群。２００～３００ＣＭ／心臓。図３Ｊ．ＰＨＨ３染色切片の例（陽性細胞を黄色の矢印で示した）。（右）ＰＨＨ３（＋）ＣＭの定量化。平均＋／－ＳＥＭ。ｎ＝３マウス／群。２００～３００ＣＭ／心臓。図３Ａ～３Ｊは、分散分析とＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定による統計である。図３Ａ～３Ｊは、タモキシフェンプロトコルの２日後のマウスによるものである。図３Ｋ．異なる時点での１回の低用量タモキシフェン投与後のＹａｐ５ＳＡ ＯＥ ｌａｃｚ（＋）ＣＭの数をｌｏｇ２形式（左）及び生データ（右）で示す。平均＋／－ＳＥＭ。Ｎ（ｔ）＝ｌａｃｚ（＋）細胞数／心筋層面積。ｔ＝時間（日）。ｔＤ＝倍加時間。ｎ＝３マウス／時点。ｌｏｇ２変換後の線形フィットＲ２＝０．９６。
【図4】図４Ａ～４Ｇ。ＣＭ増殖遺伝子プログラムのエピジェネティックな活性化。図４Ａ．（上）ＣＭ核濃縮プロトコル。（左下）対照と比較したＹａｐ５ＳＡ ＲＮＡ－ｓｅｑのボルケーノプロット。１，３５２個の遺伝子が上昇、７４８個が下降（調整Ｐ値＜０．１）。（右下）対照と比較したＹａｐ５ＳＡ ＡＴＡＣ－ｓｅｑのボルケーノプロット。Ｙａｐ５ＳＡの大幅なｌｏｇ２倍数変化により、１６，１８９個のピークが上昇、１３，３５３個が下降。２試料／遺伝子型。図９に再現性。図４Ｂ．（左）Ｙａｐ５ＳＡが濃縮した上位のＡＴＡＣ－ｓｅｑモチーフ。（右）すべてのＴＥＡＤモチーフピークのヌクレオソームシグナル。これを０～１に標準化した（図４Ｃ）。以下のエンハンサーとプロモーターの比率：遺伝子間ＡＴＡＣ－ｓｅｑピークの合計（図１２）；Ｙａｐ５ＳＡが濃縮した遺伝子間ＡＴＡＣ－ｓｅｑピーク；及びＹａｐ５ＳＡ ＣｈＩＰ－Ｓｅｑピーク。＊Ｐ＜０．００１、対照の比率と比較した、カイ二乗検定、イエーツの補正。図４Ｄ．対照またはＹａｐ５ＳＡ ＯＥ ＣＭそれぞれの上位ＡＴＡＣ－ｓｅｑピーク（調整済みｐ０．０３５）を中心とした、発達期及び成体の心臓からのＨ３Ｋ２７Ａｃ断片のカバレッジ。ｎは調査したピークの数。図４Ｅ．（左）Ｙａｐ５ＳＡ上方制御ＡＴＡＣ－ｓｅｑピーク（調整ｐ値＜１ｅ－５）及びＹａｐ５ＳＡ ＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク（ＨＯＭＥＲのピークスコアカットオフが２０）に対応する、高信頼度のＹａｐ５ＳＡ ＯＥ上方制御遺伝子（ＲＮＡ－ｓｅｑ調整ｐ値＜０．０１）。（右）カテゴリーごとの高度に濃縮されたＧＯ期。図４Ｆ．Ｙａｐ５ＳＡ上方制御遺伝子にわたるＡＴＡＣ－ｓｅｑシグナル（ＴはＴＥＡＤモチーフの目印；ＹはＹａｐ ＣｈＩＰ－ｓｅｑピークの目印）。図４Ｇ．Ｙａｐ５ＳＡ上方制御遺伝子のプロモーターにおけるＣｈＩＰ－ｓｅｑ及びＡＴＡＣ－ｓｅｑシグナル。プロモーターのＣｈｉｐ－ｓｅｑピークを緑色の矢印で示した。
【図5】図５Ａ～５Ｄ．Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ筋細胞は正常な生理機能をもち、導入遺伝子を発現しないＣＭに結合する。図５Ａ．タモキシフェン前後の対照及びＹａｐ５ＳＡ ＯＥマウスからの代表的なＥＣＧトレース。Ｔ波の逆転を示す。図５Ｂ．（上）Ｔ波逆転したマウスの割合。＊Ｐ＝．０２８６（フィッシャーの正確確率検定）。（下）Ｔ波の曲線下の相対面積。平均＋／－ＳＥＭ。分散分析とＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定により算出した統計。対照ｎ＝３、Ｙａｐ５ＳＡ ｎ＝４。図５Ｃ．β－ガラクトシダーゼ（淡青緑）及びコネキシン４３（赤）の免疫染色は、再結合したβ－ｇａｌ（＋）ＣＭと、再結合しなかったＣＭ（染色なし、黒）とのギャップジャンクションによる結合を示している。黄色の矢印は、Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ ＣＭをもつシンシチウムのβ－ｇａｌ（－）ＣＭを示す。挿入図は拡大図である。図５Ｄ．（左）サルコメア短縮の代表的なプロット。（中）安静時のＣＭサルコメア長。平均で示す。（右）サルコメア短縮率。
【図6】図６Ａ～６Ｃ．細胞周期段階のフローサイトメトリー分析。図６Ａ．ＤＡＰＩで染色した、対照心臓及びＹａｐ５ＳＡ ＯＥ心臓から単離された心臓核のフローサイトメトリーから得た代表的なヒストグラム。円グラフの対照ｎ＝４、Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ ｎ＝４。円グラフのデータは平均を示す。Ｐ値は、分散分析後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定をして算出した。Ｐ＜．０５をアスタリスクで示す。図６Ｂ．Ａで参照したＦＡＣＳによるＣＭ ＤＮＡ含量から得た代表的なドットプロット。図６Ｃ．ＦＡＣＳ ＤＮＡ含量分析、平均及びＳＥＭ、ｎ＝４／遺伝子型。分散分析後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定をして算出した統計。
【図7】Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ ＣＭの細胞アポトーシスの増加は認められない。ＴＵＮＥＬ染色は、対照心臓とＹａｐ５ＳＡ ＯＥ心臓との間に有意差を示していない（ｎ＝４心臓／遺伝子型）。ペアワイズ分散分析後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定をして算出した統計を平均＋／－ＳＥＭで示す。
【図8】Ｙａｐ ５ＳＡ ＯＥ心臓には線維化が認められない。ピクロシリウスレッド染色は、Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ心臓も対照も線維化表現型をもたないことを示している。比較のために線維性損傷のある代表的な心臓も示す。
【図9】シーケンシングの品質管理。（上）両方のＡＴＡＣ－ｓｅｑセットに高再現性。（下）ＲＮＡ－ｓｅｑセット間に高再現性。示された各実験からのリードを、正規化された対数変換で変換し、散布図として表し、複製データセットの関係を示した。注：データセットの試料は一致している（例：対照－１ ＡＴＡＣ－ｓｅｑと対照－１核ＲＮＡは同じ生物学的試料に由来する）。
【図10A】Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ心臓での上方制御遺伝子及び下方制御遺伝子の遺伝子オントロジー分析（ｐ＜０．０１）。
【図10B】ＲＮＡ－ｓｅｑから選択した遺伝子のヒートマップ
【図11】図１１Ａ～１１Ｂ．Ｙａｐ５ＳＡは、無益な負のフィードバックループを誘発する。図１１Ａ．ＲＮＡ－ｓｅｑで示されたＹａｐ５ＳＡ ＯＥ ＣＭで上方制御される遺伝子の経路濃縮分析。強調表示はＨｉｐｐｏ経路である。（経路分析はｇ：Ｐｒｏｆｉｌｅｒを用いて実施）図１１Ｂ．（左）Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ心臓における内因性Ｙａｐリン酸化の増加を示すウェスタンブロット。（右）平均＋／－ＳＥＭとして示される、バンド強度の定量化（対照ｎ＝４、Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ ｎ＝３、分散分析とＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定によるＰ＜．０１）。
【図12】図１２Ａ～１２Ｂ．ＴＳＳに対する遺伝子間ＡＴＡＣ－ｓｅｑピークの幾何学ドットプロット。図１２Ａ．両方の遺伝子型にわたる、遺伝子間ＡＴＡＣ－ｓｅｑピークのＴＳＳまでの距離の合計（対照：３４７３８ピーク；Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ：４０，３３３ピーク）。図１２Ｂ．上方制御された遺伝子間ＡＴＡＣ－ｓｅｑ及びＣｈＩＰ－ｓｅｑピークのＴＳＳまでの距離。
【図13】図１３Ａ．１～１３Ａ．３及び図１３Ｂ～１３Ｄ．高信頼度のＹａｐ５ＳＡ標的（図１３Ａ１～１３Ａ３）（左）クロマチンがすでに開いている領域でＹａｐ５ＳＡによって直接上方制御された９７個の遺伝子のリスト。（中）新たなオープンクロマチンと上方制御されたＲＮＡをもつ１０６個の遺伝子のリスト。（右）オープンクロマチンが増加した、Ｙａｐ５ＳＡによって直接上方制御された７６個の遺伝子のリスト。図Ｂ．Ａのリストで最も濃縮がみられた遺伝子オントロジー期。図Ｃ．オープンクロマチンの増加を示す７６個のＹａｐ標的遺伝子のＴＳＳを中心としたＡＴＡＣ－ｓｅｑリード及びＲＮＡ－ｓｅｑリードの平均。図Ｃ．オープンクロマチンの増加を示す７６個のＹａｐ標的遺伝子に対応するＡＴＡＣ－ｓｅｑピークを中心としたＨ３Ｋ２７Ａｃ ＣＨＩＰ－ｓｅｑ断片のカバレッジ。
【図14】図１４Ａ～１４Ｃ．心筋細胞増殖を活性化するＹａｐ５ＳＡのモデル。図１４Ａ．ある特定の事例では、Ｙａｐが標的遺伝子のオープンプロモーターに直接結合し、転写を増加させる。そのようなプロセスでは、新たなオープンクロマチンのリードは生じない。図１４Ｂ．主に、Ｙａｐ５ＳＡはエンハンサー領域に結合し、標的遺伝子のゲノム近傍を開く、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体などのクロマチンリモデリング因子を動員する。次に、Ｙａｐ自体または他の転写因子が自由に転写を促進する。図１４Ｃ．（左パネル）これら２つの直接的な活性化スキームの間に、Ｙａｐ５ＳＡは次の３つのプロセスによって増殖を促進する：１．Ｋｒｕｐｐｅｌ様因子、Ｅ２Ｆ転写因子、サイクリン、及びＰｏｌｏ様キナーゼを介した細胞周期の活性化。２．フォルミン、プロテインキナーゼＣイオタ、Ｅｃｔ２、Ｉｎｃｅｎｐ、及びＥｐｈｅｘｉｎ４による細胞骨格の再配列及び細胞質分裂の促進。３．プロテインキナーゼＤ１、Ａｌｃａｍ、及びＤｉｓａｂｌｅｄ ｈｏｍｏｌｏｇ ２などの胎児の心臓発達に関連する遺伝子の再出現。（右パネル）これら３つのプロセスは、最小限のまたは有害な機能を独立して有する。簡略化のため、色で示す直接のＣｈＩＰ－ｓｅｑ標的のみが左パネルに含まれている。右パネルには、直接的な上方制御遺伝子に加え、色で示す間接的に（上方または下方）制御された転写物（図４Ａ及び図４Ｄに従って含まれる遺伝子）を含む。
【図15】図１５Ａ～１５Ｂ．Ｙａｐ Ｋ２６５ＲはＷＴ Ｙａｐよりも安定性が低い。図１５Ａ．２０ｕｇ／ｍｌシクロヘキシミドで０時間、２時間、４時間、及び６時間処理し、０．５％ＮＰ４０溶解緩衝液で回収した、ＷＴ Ｐ１９細胞及びＹａｐＫ２６５Ｒ突然変異を有するＰ１９細胞（番号１３）。示されている抗体をイムノブロットした。図１５Ｂ．Ｐ１９細胞、及びＹａｐＫ２６５Ｒ突然変異を有する２つの異なるＰ１９コロニーからの溶解物を示されている抗体でイムノブロット分析した。
【図16】Ｙａｐ突然変異体タンパク質の安定性の決定を実証する。２０ｕｇ／ｍｌシクロヘキシミドで０時間、２時間、４時間、及び８時間処理し、０．５％ＮＰ４０溶解緩衝液で回収した、ＷＴ Ｐ１９細胞及びＹａｐＫ２６５Ｒ突然変異を有するＰ１９細胞。示されている抗体をイムノブロットした。
【図17】図１７Ａ～１７Ｂ．Ｙａｐ突然変異体タンパク質の安定性の決定。図１７Ａ．２０ｕｇ／ｍｌシクロヘキシミドで０時間、２時間、４時間、及び８時間処理し、０．５％ＮＰ４０溶解緩衝液で回収した、ＷＴ Ｐ１９細胞及びＹａｐＫ２６５Ｒ突然変異を有するＰ１９細胞（番号１１）。示されている抗体をイムノブロットした。図１７Ｂ．Ｙａｐの相対量をデンシトメトリーで定量化し、ＧＡＰＤＨで標準化してプロットした。
【0012】
長年にわたる特許法の慣例に従って、「ａ」及び「ａｎ」という語は、特許請求の範囲
を含め、構成している用語と合わせて本明細書で使用される場合、「１つ以上」を意味す
る。本開示のいくつかの実施形態は、本開示の１つ以上の要素、方法ステップ、及び／ま
たは方法からなるか、または本質的になる場合がある。本明細書に記載の任意の方法また
は組成物は、本明細書に記載の任意の他の方法または組成物と関連付けて実施できると考
えられる。
を含め、構成している用語と合わせて本明細書で使用される場合、「１つ以上」を意味す
る。本開示のいくつかの実施形態は、本開示の１つ以上の要素、方法ステップ、及び／ま
たは方法からなるか、または本質的になる場合がある。本明細書に記載の任意の方法また
は組成物は、本明細書に記載の任意の他の方法または組成物と関連付けて実施できると考
えられる。
【0013】
本明細書で使用される場合、用語「約」または「ほぼ」とは、定量、レベル、値、数、
頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量、または長さが、基準とする定量、レベル、値、数
、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量、または長さに対して、３０％、２５％、２０％
、２５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％程度
変動することを意味する。特定の実施形態では、用語「約」または「ほぼ」が数値に先行
する場合、上下１５％、１０％、５％、または１％の範囲の値を示す。
頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量、または長さが、基準とする定量、レベル、値、数
、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量、または長さに対して、３０％、２５％、２０％
、２５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％程度
変動することを意味する。特定の実施形態では、用語「約」または「ほぼ」が数値に先行
する場合、上下１５％、１０％、５％、または１％の範囲の値を示す。
【0014】
本明細書全体を通して、文脈上、特に必要がない限り、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）
」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、指定
されたステップもしくは要素、またはステップ群もしくは要素群を包含するが、いかなる
他のステップもしくは要素、またはステップ群もしくは要素群も除外しないことを意味す
るものと理解されよう。「からなる」とは、語句「からなる」に続くものはすべて含むこ
と、かつそれに限定されることを意味する。したがって、語句「からなる」は、列挙され
た要素が必要または必須であり、他の要素はいっさい存在し得ないことを示す。「から本
質的になる」とは、語句の後ろに列挙された任意の要素に加え、列挙された要素に関して
本開示で指定された挙動または作用を妨害しないか、またはそれらに寄与しない他の要素
に限って含むことを意味する。したがって、語句「から本質的になる」は、列挙された要
素は必要または必須であることを示すが、他の要素は任意選択ではなく、かつ列挙された
要素の挙動または作用に影響を及ぼすかどうかに応じて存在する場合もあれば存在しない
場合もあることを示す。
」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、指定
されたステップもしくは要素、またはステップ群もしくは要素群を包含するが、いかなる
他のステップもしくは要素、またはステップ群もしくは要素群も除外しないことを意味す
るものと理解されよう。「からなる」とは、語句「からなる」に続くものはすべて含むこ
と、かつそれに限定されることを意味する。したがって、語句「からなる」は、列挙され
た要素が必要または必須であり、他の要素はいっさい存在し得ないことを示す。「から本
質的になる」とは、語句の後ろに列挙された任意の要素に加え、列挙された要素に関して
本開示で指定された挙動または作用を妨害しないか、またはそれらに寄与しない他の要素
に限って含むことを意味する。したがって、語句「から本質的になる」は、列挙された要
素は必要または必須であることを示すが、他の要素は任意選択ではなく、かつ列挙された
要素の挙動または作用に影響を及ぼすかどうかに応じて存在する場合もあれば存在しない
場合もあることを示す。
【0015】
本明細書全体を通して、「一実施形態」、「ある実施形態」、「特定の実施形態」、「
関連する実施形態」、「ある特定の実施形態」、「追加実施形態」、もしくは「さらなる
実施形態」、またはそれらの組み合わせに対する言及は、その実施形態に関連して記載さ
れた特定の特徴、構造、または特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれるこ
とを意味する。したがって、本明細書全体の様々な箇所に出現する前述の語句が、必ずし
もすべて同じ実施形態を指しているとは限らない。さらに、特定の特徴、構造、または特
性を、１つ以上の実施形態において好適な任意の方法で組み合わせてもよい。
関連する実施形態」、「ある特定の実施形態」、「追加実施形態」、もしくは「さらなる
実施形態」、またはそれらの組み合わせに対する言及は、その実施形態に関連して記載さ
れた特定の特徴、構造、または特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれるこ
とを意味する。したがって、本明細書全体の様々な箇所に出現する前述の語句が、必ずし
もすべて同じ実施形態を指しているとは限らない。さらに、特定の特徴、構造、または特
性を、１つ以上の実施形態において好適な任意の方法で組み合わせてもよい。
【0016】
本明細書で使用される場合、用語「治療有効量」は、「治療有効用量」または「有効用
量」と同義語であり、それを必要とする個体において医師が求める生物学的応答または臨
床的応答を誘発するであろうＹａｐ突然変異体タンパク質またはポリペプチドの量を指す
。非限定的な例として、有効量は、細胞または組織を再生するのに十分な量である。
量」と同義語であり、それを必要とする個体において医師が求める生物学的応答または臨
床的応答を誘発するであろうＹａｐ突然変異体タンパク質またはポリペプチドの量を指す
。非限定的な例として、有効量は、細胞または組織を再生するのに十分な量である。
【0017】
Ｉ．Ｙａｐ突然変異体の例
本開示の実施形態は、Ｙａｐの１つ以上の突然変異体、ならびに臨床目的及び／または
研究目的でのそれらの使用を含む。突然変異体（複数可）は、例えば以下：アミノ酸の置
換（複数可）；欠失（複数可）；挿入（複数可）；それらの組み合わせなどの１つ以上を
含み得る。具体的な実施形態では、Ｙａｐの１つ以上のアミノ酸が、別の１つ以上のアミ
ノ酸で置換されている。１つ以上の特定の突然変異を用いて、突然変異体Ｙａｐの生物学
的活性を減少させることができる。そのような突然変異を別の突然変異と組み合わせて、
同じ突然変異型Ｙａｐタンパク質に使用する場合もあればしない場合もある。本開示に包
含される任意の突然変異型Ｙａｐタンパク質は非天然であってもよい。Ｙａｐ突然変異体
に関連する任意のタンパク質またはＤＮＡは、自然界から単離されたものでもよい。
本開示の実施形態は、Ｙａｐの１つ以上の突然変異体、ならびに臨床目的及び／または
研究目的でのそれらの使用を含む。突然変異体（複数可）は、例えば以下：アミノ酸の置
換（複数可）；欠失（複数可）；挿入（複数可）；それらの組み合わせなどの１つ以上を
含み得る。具体的な実施形態では、Ｙａｐの１つ以上のアミノ酸が、別の１つ以上のアミ
ノ酸で置換されている。１つ以上の特定の突然変異を用いて、突然変異体Ｙａｐの生物学
的活性を減少させることができる。そのような突然変異を別の突然変異と組み合わせて、
同じ突然変異型Ｙａｐタンパク質に使用する場合もあればしない場合もある。本開示に包
含される任意の突然変異型Ｙａｐタンパク質は非天然であってもよい。Ｙａｐ突然変異体
に関連する任意のタンパク質またはＤＮＡは、自然界から単離されたものでもよい。
【0018】
Ｙａｐ突然変異体タンパク質は、タンパク質中の１つ以上のセリンに置換を有してもよ
い。具体的な事例では、Ｌａｔｓキナーゼの主要なリン酸化部位である１個、２個、３個
、４個、または５個のセリンが置換される。どのセリンも他のどのアミノ酸でも置換でき
るが、具体的な事例ではアラニンで置換される。
い。具体的な事例では、Ｌａｔｓキナーゼの主要なリン酸化部位である１個、２個、３個
、４個、または５個のセリンが置換される。どのセリンも他のどのアミノ酸でも置換でき
るが、具体的な事例ではアラニンで置換される。
【0019】
本明細書で使用される場合、具体的な実施形態では、突然変異型ヒトＹａｐ変異体は、
少なくとも以下のこの野生型配列で下線が引かれたセリンの１つに突然変異を含む。これ
らの下線が引かれたセリン残基は、Ｌａｔｓによってリン酸化されることが公知であるか
、またはリン酸化されると予測されるものである。（配列番号１）：
少なくとも以下のこの野生型配列で下線が引かれたセリンの１つに突然変異を含む。これ
らの下線が引かれたセリン残基は、Ｌａｔｓによってリン酸化されることが公知であるか
、またはリン酸化されると予測されるものである。（配列番号１）：
【0020】
上記の配列内の１つ以上のセリンに対する１つ以上の突然変異に加えて、またはその代
わりに、セリンに対してではない１つ以上の突然変異が配列内に存在してもよい。そのよ
うな突然変異は、アミノ酸の置換（保存的であるかどうかを問わない）、欠失、及び／ま
たは逆位などであり得る。具体的な実施形態では、突然変異型のＹａｐは、単一のアミノ
酸置換として、５つの突然変異をそれぞれセリンに有する。具体的な事例では、１つ以上
のセリンがアラニンに突然変異されるが、セリン（複数可）は、ヒスチジン、イソロイシ
ン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、
バリン、アルギニン、システイン、グルタミン、グリシン、プロリン、チロシン、アラニ
ン、アスパラギン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸などの異なるアミノ酸に突然変異
されていてもよい。いずれの場合も、単一の突然変異体Ｙａｐタンパク質において、１個
、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上のセリン
が変異していてもよい。
わりに、セリンに対してではない１つ以上の突然変異が配列内に存在してもよい。そのよ
うな突然変異は、アミノ酸の置換（保存的であるかどうかを問わない）、欠失、及び／ま
たは逆位などであり得る。具体的な実施形態では、突然変異型のＹａｐは、単一のアミノ
酸置換として、５つの突然変異をそれぞれセリンに有する。具体的な事例では、１つ以上
のセリンがアラニンに突然変異されるが、セリン（複数可）は、ヒスチジン、イソロイシ
ン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、
バリン、アルギニン、システイン、グルタミン、グリシン、プロリン、チロシン、アラニ
ン、アスパラギン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸などの異なるアミノ酸に突然変異
されていてもよい。いずれの場合も、単一の突然変異体Ｙａｐタンパク質において、１個
、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上のセリン
が変異していてもよい。
【0021】
突然変異体Ｙａｐタンパク質の一例は以下の通りである（下線はセリンがアラニンで置
換された部位を示し、太字はＬａｔｓ認識配列を示す）。
換された部位を示し、太字はＬａｔｓ認識配列を示す）。
【0022】
配列番号２には、Ｆｌａｇタグなどの任意の型のタグは含まれない。
【0023】
Ｆｌａｇタグを有するＹａｐ突然変異体タンパク質の一例（配列番号３）は以下の通り
である：
である：
【0024】
Ｙａｐ突然変異体タンパク質をコードするＤＮＡの一例（配列番号４）は以下の通りで
ある：
ある：
【0025】
いくつかの実施形態では、Ｙａｐ突然変異体は１つ以上の突然変異を有することで、そ
のような１つ以上の突然変異がない場合に比べ安定性が低い。
のような１つ以上の突然変異がない場合に比べ安定性が低い。
【0026】
一実施形態では、Ｙａｐ突然変異体は２６５位に突然変異を有し、２６５位がリジンな
どである（ヒトでは２８０位のリジン）。具体的な実施形態では、２６５位のリジン（ヒ
トでは２８０位）が、任意の他のアミノ酸であり得る別のアミノ酸に突然変異されるが、
具体的な事例では、この突然変異はＫ２６５Ｒであり、これはヒト配列における２８０位
のリジンと同様である。
どである（ヒトでは２８０位のリジン）。具体的な実施形態では、２６５位のリジン（ヒ
トでは２８０位）が、任意の他のアミノ酸であり得る別のアミノ酸に突然変異されるが、
具体的な事例では、この突然変異はＫ２６５Ｒであり、これはヒト配列における２８０位
のリジンと同様である。
【0027】
本開示は、突然変異型Ｙａｐ変異体を含む、タンパク質及びそれをコードする核酸を包
含する。場合によっては、突然変異体Ｙａｐタンパク質（複数可）はポリペプチド形態で
送達され、場合によっては、突然変異体Ｙａｐタンパク質（複数可）はタンパク質をコー
ドするポリヌクレオチドとして送達される。ポリヌクレオチド形態で送達される場合、ポ
リヌクレオチドは、好適なベクターに発現構築物を含んでいてもよい。ベクターは、非ウ
イルス性またはウイルス性などの任意の好適な種類のものであり得る。ベクターが非ウイ
ルス性である場合、ベクターはプラスミドまたはＲＮＡの線状配列であり得る。ベクター
がウイルス性である場合、ベクターはアデノウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴、レ
トロウイルスなどであり得る。発現構築物中のプロモーターによって制御される場合、プ
ロモーターは、例えば構成的、誘導性、または組織特異的であり得る。特定の実施形態で
は、突然変異型Ｙａｐ変異体は、アデノ随伴ウイルス構築物で、または修飾ＲＮＡとして
送達される９。
含する。場合によっては、突然変異体Ｙａｐタンパク質（複数可）はポリペプチド形態で
送達され、場合によっては、突然変異体Ｙａｐタンパク質（複数可）はタンパク質をコー
ドするポリヌクレオチドとして送達される。ポリヌクレオチド形態で送達される場合、ポ
リヌクレオチドは、好適なベクターに発現構築物を含んでいてもよい。ベクターは、非ウ
イルス性またはウイルス性などの任意の好適な種類のものであり得る。ベクターが非ウイ
ルス性である場合、ベクターはプラスミドまたはＲＮＡの線状配列であり得る。ベクター
がウイルス性である場合、ベクターはアデノウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴、レ
トロウイルスなどであり得る。発現構築物中のプロモーターによって制御される場合、プ
ロモーターは、例えば構成的、誘導性、または組織特異的であり得る。特定の実施形態で
は、突然変異型Ｙａｐ変異体は、アデノ随伴ウイルス構築物で、または修飾ＲＮＡとして
送達される９。
【0028】
ＩＩ．使用方法の例
本開示の実施形態には、少なくとも心臓、網膜、及び耳の有毛細胞におけるものを含め
た、対象となる組織での組織再生の方法を含む。特定の実施形態では、細胞再生または組
織再生の必要性がある個体に、有効量の１つ以上の突然変異型Ｙａｐ変異体を提供する。
本開示の実施形態には、少なくとも心臓、網膜、及び耳の有毛細胞におけるものを含め
た、対象となる組織での組織再生の方法を含む。特定の実施形態では、細胞再生または組
織再生の必要性がある個体に、有効量の１つ以上の突然変異型Ｙａｐ変異体を提供する。
【0029】
成体哺乳動物の心筋細胞（ＣＭ）の再生は非効率的である。損傷したＣＭは増殖できず
、代わりに倍数性を増加させる核内倍加を活性化する。結果として、心臓はヒトの主たる
死因である機能不全を起こしやすい。特定の実施形態では、本発明者らは、Ｈｉｐｐｏ阻
害の影響を受けない成体ＣＭにおいて、Ｙａｐ５ＳＡと呼ぶＨｉｐｐｏエフェクターＹａ
ｐ型を発現させた。Ｙａｐ５ＳＡは、倍加時間３３時間でのＣＭの増殖、心室壁の肥厚、
１５％を超えるＣＭでの有糸分裂の再開を誘発した。クロマチンアクセシビリティのゲノ
ムワイド特性解析により、Ｙａｐ５ＳＡが遠位エンハンサーの開放と強力な有糸分裂遺伝
子プログラムの発現を促進することが明らかになった。本明細書で明らかにされた、ＣＭ
増殖を促進する遺伝子及びエンハンサーは、心臓再生の刺激に有用である。したがって、
本開示の実施形態には、Ｈｉｐｐｏ経路を標的とすることによるものを含めた、心筋細胞
の再生のための方法及び組成物を含む。特定の実施形態では、心筋細胞再生の必要性があ
る個体に、有効量の１つ以上の突然変異型Ｙａｐ変異体を提供する。ある特定の実施形態
では、個体の望ましい場所で細胞を再生する方法があり、これには、有効量のＹａｐ突然
変異体タンパク質（複数可）及び／またはＹａｐ突然変異体タンパク質をコードするポリ
ヌクレオチド（複数可）をその場所に送達するステップを含む。
、代わりに倍数性を増加させる核内倍加を活性化する。結果として、心臓はヒトの主たる
死因である機能不全を起こしやすい。特定の実施形態では、本発明者らは、Ｈｉｐｐｏ阻
害の影響を受けない成体ＣＭにおいて、Ｙａｐ５ＳＡと呼ぶＨｉｐｐｏエフェクターＹａ
ｐ型を発現させた。Ｙａｐ５ＳＡは、倍加時間３３時間でのＣＭの増殖、心室壁の肥厚、
１５％を超えるＣＭでの有糸分裂の再開を誘発した。クロマチンアクセシビリティのゲノ
ムワイド特性解析により、Ｙａｐ５ＳＡが遠位エンハンサーの開放と強力な有糸分裂遺伝
子プログラムの発現を促進することが明らかになった。本明細書で明らかにされた、ＣＭ
増殖を促進する遺伝子及びエンハンサーは、心臓再生の刺激に有用である。したがって、
本開示の実施形態には、Ｈｉｐｐｏ経路を標的とすることによるものを含めた、心筋細胞
の再生のための方法及び組成物を含む。特定の実施形態では、心筋細胞再生の必要性があ
る個体に、有効量の１つ以上の突然変異型Ｙａｐ変異体を提供する。ある特定の実施形態
では、個体の望ましい場所で細胞を再生する方法があり、これには、有効量のＹａｐ突然
変異体タンパク質（複数可）及び／またはＹａｐ突然変異体タンパク質をコードするポリ
ヌクレオチド（複数可）をその場所に送達するステップを含む。
【0030】
特定の実施形態では、治療有効量の１つ以上の突然変異型Ｙａｐ変異体を個体に送達す
ることにより、医学的病態を治療する方法がある。任意の医学的病態の少なくとも１つの
症状を、１つ以上の突然変異体Ｙａｐタンパク質（複数可）及び／またはそれをコードす
る核酸（複数可）を投与して改善することができる。
ることにより、医学的病態を治療する方法がある。任意の医学的病態の少なくとも１つの
症状を、１つ以上の突然変異体Ｙａｐタンパク質（複数可）及び／またはそれをコードす
る核酸（複数可）を投与して改善することができる。
【0031】
本開示のある特定の実施形態は、治療有効量の１つ以上の突然変異型Ｙａｐ変異体を個
体に提供することにより、個体において心筋細胞を再生する方法を含む。少なくともいく
つかの場合、突然変異型変異体は、セリンに１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個
、８個、９個、１０個、またはそれ以上のアミノ酸置換を含むが、この置換はアラニンへ
の置換であってもなくてもよい。突然変異型Ｙａｐに他のセリン以外の突然変異が含まれ
ていてもよい。ある特定の方法は、心筋細胞の再生を必要とする１つ以上の個体、例えば
心臓に損傷があるか、または心臓への損傷リスクがある個体に実施することができる。個
体は、心筋細胞の再生を必要とする損傷した心筋組織を有する場合がある。特定の実施形
態では、１つ以上の突然変異型Ｙａｐタンパク質及び／またはそれをコードする核酸（複
数可）の投与により、個体の既存の心筋細胞から心筋細胞の再生を生じさせる。
体に提供することにより、個体において心筋細胞を再生する方法を含む。少なくともいく
つかの場合、突然変異型変異体は、セリンに１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個
、８個、９個、１０個、またはそれ以上のアミノ酸置換を含むが、この置換はアラニンへ
の置換であってもなくてもよい。突然変異型Ｙａｐに他のセリン以外の突然変異が含まれ
ていてもよい。ある特定の方法は、心筋細胞の再生を必要とする１つ以上の個体、例えば
心臓に損傷があるか、または心臓への損傷リスクがある個体に実施することができる。個
体は、心筋細胞の再生を必要とする損傷した心筋組織を有する場合がある。特定の実施形
態では、１つ以上の突然変異型Ｙａｐタンパク質及び／またはそれをコードする核酸（複
数可）の投与により、個体の既存の心筋細胞から心筋細胞の再生を生じさせる。
【0032】
本開示の実施形態は、例えば心筋の再生及び心筋の虚血性傷害の回復のための方法及び
／または組成物を含む。特定の実施形態では、例えば急性虚血性傷害などの心臓病態を有
していた哺乳動物の心臓に存在する成体心臓前駆細胞または心筋細胞の増殖を刺激する方
法がある。ある特定の実施形態では、そのような方法は、１つ以上の突然変異型Ｙａｐ変
異体を含む組成物を用いて、個体に実行される。
／または組成物を含む。特定の実施形態では、例えば急性虚血性傷害などの心臓病態を有
していた哺乳動物の心臓に存在する成体心臓前駆細胞または心筋細胞の増殖を刺激する方
法がある。ある特定の実施形態では、そのような方法は、１つ以上の突然変異型Ｙａｐ変
異体を含む組成物を用いて、個体に実行される。
【0033】
本開示の実施形態は、１つ以上の心臓病態の治療及び／または予防に関連する方法及び
／または組成物を対象とする。本開示の実施形態は、心筋組織などの筋組織を含む組織の
再生に関連する。ある特定の実施形態は、心臓病態の逆転（またはその少なくとも１つの
症状の改善）に関連し、心臓病態には、少なくとも心臓疾患、心筋症、心臓弁の問題、心
膜炎、不整脈、心停止、先天性心障害、心不全、心疾患、心毒性、うっ血性心不全、虚血
性心疾患、急性心筋梗塞、心房細動、冠動脈疾患、虚血性心疾患、心臓弁膜症、高血圧性
心疾患、及び不整脈が含まれる。冠動脈疾患（冠動脈性心疾患及び虚血性心疾患としても
知られる）；心筋症（心筋の疾患）；心不全；肺性心；心律動異常；炎症性心疾患；心内
膜炎；炎症性心肥大；心筋炎；心臓弁膜症；脳血管疾患；末梢動脈疾患；先天性心疾患；
及びリウマチ性心疾患などの、特定の種類の心血管疾患を治療または予防することができ
る。特定的であるが例示的に示される本開示の実施形態には、少なくとも、１）うっ血性
心不全；２）心室リモデリングまたは心筋梗塞の動脈瘤の予防；及び／または３）心筋症
の用途を含む。具体的な実施形態では、本開示の方法及び組成物は、確定された心臓病態
の逆転、または心臓病態の予防、または発症の遅延、または重症度の軽減に十分である心
筋細胞の再生を提供する。
／または組成物を対象とする。本開示の実施形態は、心筋組織などの筋組織を含む組織の
再生に関連する。ある特定の実施形態は、心臓病態の逆転（またはその少なくとも１つの
症状の改善）に関連し、心臓病態には、少なくとも心臓疾患、心筋症、心臓弁の問題、心
膜炎、不整脈、心停止、先天性心障害、心不全、心疾患、心毒性、うっ血性心不全、虚血
性心疾患、急性心筋梗塞、心房細動、冠動脈疾患、虚血性心疾患、心臓弁膜症、高血圧性
心疾患、及び不整脈が含まれる。冠動脈疾患（冠動脈性心疾患及び虚血性心疾患としても
知られる）；心筋症（心筋の疾患）；心不全；肺性心；心律動異常；炎症性心疾患；心内
膜炎；炎症性心肥大；心筋炎；心臓弁膜症；脳血管疾患；末梢動脈疾患；先天性心疾患；
及びリウマチ性心疾患などの、特定の種類の心血管疾患を治療または予防することができ
る。特定的であるが例示的に示される本開示の実施形態には、少なくとも、１）うっ血性
心不全；２）心室リモデリングまたは心筋梗塞の動脈瘤の予防；及び／または３）心筋症
の用途を含む。具体的な実施形態では、本開示の方法及び組成物は、確定された心臓病態
の逆転、または心臓病態の予防、または発症の遅延、または重症度の軽減に十分である心
筋細胞の再生を提供する。
【0034】
心筋症の事例では、（アドリアマイシンのような）化学療法薬またはモノクローナル抗
体などの薬剤によって病態が誘発される場合がある１０、１１。心筋症は、虚血性または
非虚血性の心筋症であり得る。心筋症は、長期の高血圧、心臓弁の問題、以前の心臓発作
による心臓組織の損傷、慢性の高心拍数、代謝障害、栄養不良、妊娠、アルコール乱用、
薬物乱用、化学療法薬、ウイルス感染、ヘモクロマトーシス、遺伝的病態、コレステロー
ル値の上昇、肺高血圧症、またはそれらの組み合わせによって引き起こされる場合がある
。
体などの薬剤によって病態が誘発される場合がある１０、１１。心筋症は、虚血性または
非虚血性の心筋症であり得る。心筋症は、長期の高血圧、心臓弁の問題、以前の心臓発作
による心臓組織の損傷、慢性の高心拍数、代謝障害、栄養不良、妊娠、アルコール乱用、
薬物乱用、化学療法薬、ウイルス感染、ヘモクロマトーシス、遺伝的病態、コレステロー
ル値の上昇、肺高血圧症、またはそれらの組み合わせによって引き起こされる場合がある
。
【0035】
本開示の特定の態様は、組織内のある特定の細胞の増殖、細胞死（アポトーシス）の阻
害、及び／または分化を目的とした、ある特定の組織へのＹａｐ突然変異体のポリヌクレ
オチド、タンパク質、ペプチド、またはそれらの混合物の送達に関連する。組織はどの種
類であってもよいが、具体的な事例では、心臓組織、網膜組織、または耳の有毛細胞を含
む筋組織である。特定の実施形態では、本開示の方法及び組成物は、既存の成体心筋細胞
の再生を可能にする。場合によっては、本発明の組成物（複数可）の送達により、病理学
的リモデリングに対して細胞はより抵抗性になり、初期損傷以降のさらなる損傷が阻止さ
れる。
害、及び／または分化を目的とした、ある特定の組織へのＹａｐ突然変異体のポリヌクレ
オチド、タンパク質、ペプチド、またはそれらの混合物の送達に関連する。組織はどの種
類であってもよいが、具体的な事例では、心臓組織、網膜組織、または耳の有毛細胞を含
む筋組織である。特定の実施形態では、本開示の方法及び組成物は、既存の成体心筋細胞
の再生を可能にする。場合によっては、本発明の組成物（複数可）の送達により、病理学
的リモデリングに対して細胞はより抵抗性になり、初期損傷以降のさらなる損傷が阻止さ
れる。
【0036】
本開示の実施形態には、細胞（心筋細胞を含む筋細胞など）及び／または組織（心臓組
織を含む）の再生を刺激する１つ以上のＹａｐ突然変異体ポリヌクレオチド及び／または
ポリペプチドの送達を含む。そのような実施形態の特定の態様は、１つ以上の心臓関連の
医学的病態の逆転をもたらす。そのような実施形態のある特定の態様は、心臓関連の医学
的病態、眼の医学的病態、または耳の医学的病態などの医学的病態の少なくとも１つの症
状の改善をもたらす。
織を含む）の再生を刺激する１つ以上のＹａｐ突然変異体ポリヌクレオチド及び／または
ポリペプチドの送達を含む。そのような実施形態の特定の態様は、１つ以上の心臓関連の
医学的病態の逆転をもたらす。そのような実施形態のある特定の態様は、心臓関連の医学
的病態、眼の医学的病態、または耳の医学的病態などの医学的病態の少なくとも１つの症
状の改善をもたらす。
【0037】
具体的な実施形態では、Ｙａｐ突然変異体のポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチド
、またはそれらの混合物は、例えば心臓組織などの筋組織を含めた、対象となる特定の組
織を標的とする。
、またはそれらの混合物は、例えば心臓組織などの筋組織を含めた、対象となる特定の組
織を標的とする。
【0038】
場合によっては、本開示の方法及び組成物は、１つ以上の心臓関連の医学的病態の予防
、または１つ以上の心臓関連の医学的病態の発症の遅延、または１つ以上の心臓関連の医
学的病態の１つ以上の症状の程度の軽減のために使用される。特定の事例では、そのよう
な予防、発症の遅延、または１つ以上の症状の程度の軽減は、心臓関連の医学的病態のリ
スクがある個体において起こる。例示的な危険因子には、年齢、性別（男性、ただし女性
にも発生する）、高血圧、高血清コレステロール値、喫煙、過度のアルコール消費、糖消
費、家族歴、肥満、運動不足、心理社会的要因、糖尿病（真性）、過体重、遺伝的素因、
及び／または大気汚染への曝露のうち１つ以上が含まれる。
、または１つ以上の心臓関連の医学的病態の発症の遅延、または１つ以上の心臓関連の医
学的病態の１つ以上の症状の程度の軽減のために使用される。特定の事例では、そのよう
な予防、発症の遅延、または１つ以上の症状の程度の軽減は、心臓関連の医学的病態のリ
スクがある個体において起こる。例示的な危険因子には、年齢、性別（男性、ただし女性
にも発生する）、高血圧、高血清コレステロール値、喫煙、過度のアルコール消費、糖消
費、家族歴、肥満、運動不足、心理社会的要因、糖尿病（真性）、過体重、遺伝的素因、
及び／または大気汚染への曝露のうち１つ以上が含まれる。
【0039】
治療される任意の個体は、成人、青年、小児、幼児であってよく、または子宮内で処置
される場合もある。
される場合もある。
【0040】
突然変異体Ｙａｐタンパク質（複数可）及び／またはそれをコードする核酸（複数可）
の個体への送達は、全身的であっても局所的であってもよい。具体的な例では、Ｙａｐ突
然変異体タンパク質またはポリヌクレオチドの使用法に従って、ｉｎ ｖｉｔｒｏ由来の
心筋細胞が個体に送達される。他の事例では、Ｙａｐ突然変異体タンパク質またはポリヌ
クレオチドは心臓内にｉｎ ｖｉｖｏ送達される。これは、例えば、Ｙａｐを使用して、
患者由来（または非患者由来）の人工多能性幹細胞由来の心筋細胞（または胚性幹細胞由
来の心筋細胞）を培養で拡張した後、患者に移植すること；またはＹａｐを使用して、幹
細胞由来の心筋細胞を拡張した後、小分子駆動プロモーターを使用して患者に移植するか
、もしくは幹細胞由来の心筋細胞に操作を加える他のＹａｐ誘導スキームを用いることに
より機能させることができる。
の個体への送達は、全身的であっても局所的であってもよい。具体的な例では、Ｙａｐ突
然変異体タンパク質またはポリヌクレオチドの使用法に従って、ｉｎ ｖｉｔｒｏ由来の
心筋細胞が個体に送達される。他の事例では、Ｙａｐ突然変異体タンパク質またはポリヌ
クレオチドは心臓内にｉｎ ｖｉｖｏ送達される。これは、例えば、Ｙａｐを使用して、
患者由来（または非患者由来）の人工多能性幹細胞由来の心筋細胞（または胚性幹細胞由
来の心筋細胞）を培養で拡張した後、患者に移植すること；またはＹａｐを使用して、幹
細胞由来の心筋細胞を拡張した後、小分子駆動プロモーターを使用して患者に移植するか
、もしくは幹細胞由来の心筋細胞に操作を加える他のＹａｐ誘導スキームを用いることに
より機能させることができる。
【0041】
本明細書に包含される治療を受ける個体は、例えば心臓の医学的病態を含め、医学的病
態と診断されていてもいなくてもよい。個体は、例えば以前の診断がなくても心臓の医学
的病態を有する１つ以上の症状を示していてもいなくてもよい。
態と診断されていてもいなくてもよい。個体は、例えば以前の診断がなくても心臓の医学
的病態を有する１つ以上の症状を示していてもいなくてもよい。
【0042】
ＩＩＩ．医薬製剤
本発明の医薬組成物は、有効量の１つ以上のＹａｐ突然変異体タンパク質及び／または
それをコードするポリヌクレオチド、または薬学的に許容される担体に溶解もしくは分散
された追加薬剤を含む。語句「薬学的または薬理学的に許容される」とは、例えばヒトな
どの動物に必要に応じて投与したときに、副作用、アレルギー反応、または他の有害反応
を生じさせない分子実体及び組成物を指す。少なくとも１つのＹａｐ突然変異体タンパク
質及び／またはそれをコードするポリヌクレオチド、または追加活性成分を含有する医薬
組成物の調製は、参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄ．Ｌ
ｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５により例示
されているように、本開示に照らして当業者に公知であろう。さらに、動物（例えばヒト
）投与の場合、製剤はＦＤＡ生物基準局が要求する無菌性、発熱性、一般的安全性、及び
純度の基準を満たす必要があるものと理解される。
本発明の医薬組成物は、有効量の１つ以上のＹａｐ突然変異体タンパク質及び／または
それをコードするポリヌクレオチド、または薬学的に許容される担体に溶解もしくは分散
された追加薬剤を含む。語句「薬学的または薬理学的に許容される」とは、例えばヒトな
どの動物に必要に応じて投与したときに、副作用、アレルギー反応、または他の有害反応
を生じさせない分子実体及び組成物を指す。少なくとも１つのＹａｐ突然変異体タンパク
質及び／またはそれをコードするポリヌクレオチド、または追加活性成分を含有する医薬
組成物の調製は、参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄ．Ｌ
ｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５により例示
されているように、本開示に照らして当業者に公知であろう。さらに、動物（例えばヒト
）投与の場合、製剤はＦＤＡ生物基準局が要求する無菌性、発熱性、一般的安全性、及び
純度の基準を満たす必要があるものと理解される。
【0043】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」には、当業者に公知であろう
ような、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤（例え
ば抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、薬物、薬物安定剤、ゲル、結
合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤、色素、同様の材料、及びそれらの組み
合わせを含む（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐ
ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎ
ｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０，ｐｐ．１２８９－１３２９を参照）。任意の従来
の担体が活性成分と適合しない場合を除いて、医薬組成物におけるその使用が企図される
。
ような、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤（例え
ば抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、薬物、薬物安定剤、ゲル、結
合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤、色素、同様の材料、及びそれらの組み
合わせを含む（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐ
ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎ
ｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０，ｐｐ．１２８９－１３２９を参照）。任意の従来
の担体が活性成分と適合しない場合を除いて、医薬組成物におけるその使用が企図される
。
【0044】
Ｙａｐ突然変異体タンパク質及び／またはそれをコードするポリヌクレオチドは、固体
、液体、またはエアロゾルの形態で投与されるかどうか、及び注射のような投与経路の場
合に滅菌性である必要があるかどうかに応じて、種類の異なる担体を含み得る。本発明は
、当業者に公知であろうような、静脈内に、皮内に、経皮に、髄腔内に、動脈内に、腹腔
内に、鼻腔内に、膣内に、直腸内に、局所に、筋肉内に、皮下に、粘膜に、口腔に、局所
に、局部に、吸入（例えばエアロゾル吸入）、注射、注入、連続注入、標的細胞を直接浸
漬させる局所灌流により、カテーテルを介して、洗浄を介して、クリームで、脂質組成物
（例えばリポソーム）で、または他の方法もしくは前述の任意の組み合わせにより投与す
ることができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉ
ｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０を参照）。
、液体、またはエアロゾルの形態で投与されるかどうか、及び注射のような投与経路の場
合に滅菌性である必要があるかどうかに応じて、種類の異なる担体を含み得る。本発明は
、当業者に公知であろうような、静脈内に、皮内に、経皮に、髄腔内に、動脈内に、腹腔
内に、鼻腔内に、膣内に、直腸内に、局所に、筋肉内に、皮下に、粘膜に、口腔に、局所
に、局部に、吸入（例えばエアロゾル吸入）、注射、注入、連続注入、標的細胞を直接浸
漬させる局所灌流により、カテーテルを介して、洗浄を介して、クリームで、脂質組成物
（例えばリポソーム）で、または他の方法もしくは前述の任意の組み合わせにより投与す
ることができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉ
ｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０を参照）。
【0045】
Ｙａｐ突然変異体タンパク質及び／またはそれをコードするポリヌクレオチドは、遊離
塩基、中性、または塩形態で組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩に
は、酸付加塩、例えばタンパク質組成物の遊離アミノ基で形成されるもの、または例えば
塩酸もしくはリン酸などの無機酸、もしくは酢酸、シュウ酸、酒石酸、もしくはマンデル
酸のような有機酸で形成されるものを含む。遊離カルボキシル基で形成される塩を、例え
ば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、もしく
は水酸化第二鉄などの無機塩基；またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチ
ジン、もしくはプロカインのような有機塩基から誘導することもできる。製剤化されると
、溶液は投与製剤に適合する方法で、かつ治療に有効であるような量で投与される。製剤
は、注射溶液、もしくは肺への送達のためのエアロゾルなどの非経口投与用に製剤化され
た剤形、または薬物放出カプセルなどのような栄養投与用に製剤化された剤形など、さま
ざまな剤形で容易に投与される。
塩基、中性、または塩形態で組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩に
は、酸付加塩、例えばタンパク質組成物の遊離アミノ基で形成されるもの、または例えば
塩酸もしくはリン酸などの無機酸、もしくは酢酸、シュウ酸、酒石酸、もしくはマンデル
酸のような有機酸で形成されるものを含む。遊離カルボキシル基で形成される塩を、例え
ば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、もしく
は水酸化第二鉄などの無機塩基；またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチ
ジン、もしくはプロカインのような有機塩基から誘導することもできる。製剤化されると
、溶液は投与製剤に適合する方法で、かつ治療に有効であるような量で投与される。製剤
は、注射溶液、もしくは肺への送達のためのエアロゾルなどの非経口投与用に製剤化され
た剤形、または薬物放出カプセルなどのような栄養投与用に製剤化された剤形など、さま
ざまな剤形で容易に投与される。
【0046】
さらに、本発明によれば、投与に適した本発明の組成物は、不活性希釈剤を含むかまた
は含まない薬学的に許容される担体で提供される。担体は吸収可能でなければならず、こ
れには液体、半固体（すなわちペースト）、または固体の担体を含む。任意の従来の媒体
、薬剤、希釈剤、または担体がレシピエントにとって、またはそこに含有される組成物の
治療効果にとって有害である場合を除き、本発明の方法を実施する際に使用する投与可能
な組成物におけるその使用は適切である。担体または希釈剤の例としては、脂肪、油、水
、生理食塩水、脂質、リポソーム、樹脂、結合剤、充填剤など、またはそれらの組み合わ
せが挙げられる。組成物はまた、１つ以上の成分の酸化を遅らせるために様々な抗酸化剤
を含んでもよい。さらに、微生物の作用の防止は、さまざまな抗菌剤及び抗真菌剤などの
防腐剤によってもたらすことができ、これにはパラベン（例えばメチルパラベン、プロピ
ルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、またはそれ
らの組み合わせを含むがこれらに限定されない。
は含まない薬学的に許容される担体で提供される。担体は吸収可能でなければならず、こ
れには液体、半固体（すなわちペースト）、または固体の担体を含む。任意の従来の媒体
、薬剤、希釈剤、または担体がレシピエントにとって、またはそこに含有される組成物の
治療効果にとって有害である場合を除き、本発明の方法を実施する際に使用する投与可能
な組成物におけるその使用は適切である。担体または希釈剤の例としては、脂肪、油、水
、生理食塩水、脂質、リポソーム、樹脂、結合剤、充填剤など、またはそれらの組み合わ
せが挙げられる。組成物はまた、１つ以上の成分の酸化を遅らせるために様々な抗酸化剤
を含んでもよい。さらに、微生物の作用の防止は、さまざまな抗菌剤及び抗真菌剤などの
防腐剤によってもたらすことができ、これにはパラベン（例えばメチルパラベン、プロピ
ルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、またはそれ
らの組み合わせを含むがこれらに限定されない。
【0047】
本開示によれば、組成物は、任意の便利なかつ実用的な方法、すなわち溶解、懸濁、乳
化、混合、被包化、吸収などによって担体と混合される。そのような手順は、当業者には
慣例となっている。
化、混合、被包化、吸収などによって担体と混合される。そのような手順は、当業者には
慣例となっている。
【0048】
本開示の具体的な実施形態では、組成物は、半固体担体または固体担体と混合されるか
、または完全に混和される。混和は、粉砕などの任意の便利な方法で実施することができ
る。治療活性の損失、すなわち胃での変性から組成物を保護するために、混和プロセスに
安定剤を加えることもできる。組成物に使用する安定剤の例として、緩衝液、グリシン及
びリジンなどのアミノ酸、デキストロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、
ラクトース、スクロース、マルトース、ソルビトール、マンニトールなどの炭水化物が挙
げられる。
、または完全に混和される。混和は、粉砕などの任意の便利な方法で実施することができ
る。治療活性の損失、すなわち胃での変性から組成物を保護するために、混和プロセスに
安定剤を加えることもできる。組成物に使用する安定剤の例として、緩衝液、グリシン及
びリジンなどのアミノ酸、デキストロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、
ラクトース、スクロース、マルトース、ソルビトール、マンニトールなどの炭水化物が挙
げられる。
【0049】
さらなる実施形態では、本発明は、Ｙａｐ突然変異体タンパク質及び／またはそれをコ
ードするポリヌクレオチド、１つ以上の脂質、及び水性溶媒を含む、医薬脂質ビヒクル組
成物の使用に関連する場合がある。本明細書で使用される場合、用語「脂質」は、特性上
、水に不溶性であり、有機溶媒で抽出可能である広範囲にわたる物質のいずれかを含むも
のと規定されることになる。この広範なクラスの化合物は当業者に周知されており、また
用語「脂質」が本明細書で使用される場合、任意の特定の構造に限定されない。例として
、長鎖脂肪族炭化水素及びその誘導体を含有する化合物が挙げられる。脂質は、天然であ
っても合成（すなわち人間が設計または作製したもの）であってもよい。ただし、脂質は
通常、生物学的物質である。生物学的脂質は当技術分野で周知されており、例えば中性脂
肪、リン脂質、ホスホグリセリド、ステロイド、テルペン、リゾ脂質、スフィンゴ糖脂質
、糖脂質、スルファチド、エーテル及びエステル結合脂肪酸を有する脂質、ならびに重合
可能な脂質、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。当然ながら、本明細書に具体的に
記載されるもの以外の、当業者が脂質と認識している化合物も、本発明の組成物及び方法
に包含される。
ードするポリヌクレオチド、１つ以上の脂質、及び水性溶媒を含む、医薬脂質ビヒクル組
成物の使用に関連する場合がある。本明細書で使用される場合、用語「脂質」は、特性上
、水に不溶性であり、有機溶媒で抽出可能である広範囲にわたる物質のいずれかを含むも
のと規定されることになる。この広範なクラスの化合物は当業者に周知されており、また
用語「脂質」が本明細書で使用される場合、任意の特定の構造に限定されない。例として
、長鎖脂肪族炭化水素及びその誘導体を含有する化合物が挙げられる。脂質は、天然であ
っても合成（すなわち人間が設計または作製したもの）であってもよい。ただし、脂質は
通常、生物学的物質である。生物学的脂質は当技術分野で周知されており、例えば中性脂
肪、リン脂質、ホスホグリセリド、ステロイド、テルペン、リゾ脂質、スフィンゴ糖脂質
、糖脂質、スルファチド、エーテル及びエステル結合脂肪酸を有する脂質、ならびに重合
可能な脂質、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。当然ながら、本明細書に具体的に
記載されるもの以外の、当業者が脂質と認識している化合物も、本発明の組成物及び方法
に包含される。
【0050】
当業者は、脂質ビヒクルに組成物を分散させるために使用できる技術の範囲を熟知して
いるであろう。例えば、Ｙａｐ突然変異体タンパク質及び／またはそれをコードするポリ
ヌクレオチドを、脂質を含有する溶液に分散する、脂質で溶解する、脂質で乳化する、脂
質と混和する、脂質と混合する、脂質と共有結合させる、脂質に懸濁液として含有する、
ミセルもしくはリポソームと含有するもしくは複合体化する、またはそれ以外の当業者に
公知の任意の手段により脂質もしくは脂質構造と会合することができる。分散により、リ
ポソームが形成されてもされなくてもよい。
いるであろう。例えば、Ｙａｐ突然変異体タンパク質及び／またはそれをコードするポリ
ヌクレオチドを、脂質を含有する溶液に分散する、脂質で溶解する、脂質で乳化する、脂
質と混和する、脂質と混合する、脂質と共有結合させる、脂質に懸濁液として含有する、
ミセルもしくはリポソームと含有するもしくは複合体化する、またはそれ以外の当業者に
公知の任意の手段により脂質もしくは脂質構造と会合することができる。分散により、リ
ポソームが形成されてもされなくてもよい。
【0051】
動物患者に投与される本発明の組成物の実際の投与量は、体重、病態の重症度、治療さ
れる疾患の種類、過去または同時期の治療介入、患者の特発性疾患、及び投与経路などの
物理的及び生理学的要因によって決定することができる。投与量及び投与経路に応じて、
好ましい投与量及び／または有効量の投与回数を、対象の反応に従って変更してもよい。
いずれの場合も、投与を担当する医師が、組成物中の活性成分（複数可）の濃度及び個々
の対象の適切な用量（複数可）を決定することになる。
れる疾患の種類、過去または同時期の治療介入、患者の特発性疾患、及び投与経路などの
物理的及び生理学的要因によって決定することができる。投与量及び投与経路に応じて、
好ましい投与量及び／または有効量の投与回数を、対象の反応に従って変更してもよい。
いずれの場合も、投与を担当する医師が、組成物中の活性成分（複数可）の濃度及び個々
の対象の適切な用量（複数可）を決定することになる。
【0052】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、例えば少なくとも約０．１％の活性化合物を
含み得る。他の実施形態では、活性化合物は、例えば単位重量の約２％～約７５％、また
は約２５％～約６０％、及びそれ以内で推論可能な任意の範囲を含み得る。必然的に、各
治療上有用な組成物中の活性化合物（複数可）の量は、化合物の任意の所与の単位用量に
おいて適切な投与量が得られるような方法で調製することができる。溶解度、バイオアベ
イラビリティ、生物学的半減期、投与経路、製品の有効期間などの要因、ならびに他の薬
理学的考慮事項は、そのような医薬製剤を調製する当業者が検討することになり、したが
って様々な投与量及び治療レジメンが望ましい場合がある。
含み得る。他の実施形態では、活性化合物は、例えば単位重量の約２％～約７５％、また
は約２５％～約６０％、及びそれ以内で推論可能な任意の範囲を含み得る。必然的に、各
治療上有用な組成物中の活性化合物（複数可）の量は、化合物の任意の所与の単位用量に
おいて適切な投与量が得られるような方法で調製することができる。溶解度、バイオアベ
イラビリティ、生物学的半減期、投与経路、製品の有効期間などの要因、ならびに他の薬
理学的考慮事項は、そのような医薬製剤を調製する当業者が検討することになり、したが
って様々な投与量及び治療レジメンが望ましい場合がある。
【0053】
他の非限定的な例において、用量はまた、投与あたり約１マイクログラム／ｋｇ／体重
、約５マイクログラム／ｋｇ／体重、約１０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５０マイク
ログラム／ｋｇ／体重、約１００マイクログラム／ｋｇ／体重、約２００マイクログラム
／ｋｇ／体重、約３５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５００マイクログラム／ｋｇ／
体重、約１ミリグラム／ｋｇ／体重、約５ミリグラム／ｋｇ／体重、約１０ミリグラム／
ｋｇ／体重、約５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約１００ミリグラム／ｋｇ／体重、約２０
０ミリグラム／ｋｇ／体重、約３５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５００ミリグラム／ｋ
ｇ／体重～約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重またはそれ以上、及びそれ以内で推論可能な任意
の範囲を含み得る。本明細書に列挙される数から推論可能な範囲の非限定的な例では、上
記の数値に基づいて、約５ｍｇ／ｋｇ／体重～約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５マイクロ
グラム／ｋｇ／体重～約５００ミリグラム／ｋｇ／体重などの範囲を投与することができ
る。
、約５マイクログラム／ｋｇ／体重、約１０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５０マイク
ログラム／ｋｇ／体重、約１００マイクログラム／ｋｇ／体重、約２００マイクログラム
／ｋｇ／体重、約３５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５００マイクログラム／ｋｇ／
体重、約１ミリグラム／ｋｇ／体重、約５ミリグラム／ｋｇ／体重、約１０ミリグラム／
ｋｇ／体重、約５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約１００ミリグラム／ｋｇ／体重、約２０
０ミリグラム／ｋｇ／体重、約３５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５００ミリグラム／ｋ
ｇ／体重～約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重またはそれ以上、及びそれ以内で推論可能な任意
の範囲を含み得る。本明細書に列挙される数から推論可能な範囲の非限定的な例では、上
記の数値に基づいて、約５ｍｇ／ｋｇ／体重～約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５マイクロ
グラム／ｋｇ／体重～約５００ミリグラム／ｋｇ／体重などの範囲を投与することができ
る。
【0054】
Ａ．栄養組成物及び製剤
本発明の好ましい実施形態では、Ｙａｐ突然変異体タンパク質及び／またはそれをコー
ドするポリヌクレオチドは、栄養経路を介して投与されるように製剤化される。栄養経路
には、組成物が消化管と直接接触する可能性のあるすべての投与経路が含まれる。具体的
には、本明細書に開示される医薬組成物は、口腔、頬側、直腸、または舌下に投与するこ
とができる。したがって、これらの組成物は、不活性希釈剤または吸収可能な食用担体と
製剤化することも、硬質または軟質のシェルゼラチンカプセルに封入することも、錠剤に
圧縮することも、食事の食物とともに直接摂取することもできる。
本発明の好ましい実施形態では、Ｙａｐ突然変異体タンパク質及び／またはそれをコー
ドするポリヌクレオチドは、栄養経路を介して投与されるように製剤化される。栄養経路
には、組成物が消化管と直接接触する可能性のあるすべての投与経路が含まれる。具体的
には、本明細書に開示される医薬組成物は、口腔、頬側、直腸、または舌下に投与するこ
とができる。したがって、これらの組成物は、不活性希釈剤または吸収可能な食用担体と
製剤化することも、硬質または軟質のシェルゼラチンカプセルに封入することも、錠剤に
圧縮することも、食事の食物とともに直接摂取することもできる。
【0055】
ある特定の実施形態では、活性化合物を賦形剤と混合して、経口摂取用錠剤、バッカル
錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、カシェ剤などの形態
で使用することができる１２、１３（米国特許第５，６４１，５１５号；同第５，５８０
，５７９号及び同第５，７９２，４５１号。それぞれ、その全体が参照により本明細書に
明確に組み込まれる）。錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセルなどはまた、以下を含有して
もよい：例えばトラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチ、ゼラチン、またはそ
れらの組み合わせなどの結合剤；例えばリン酸二カルシウム、マンニトール、ラクトース
、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグ
ネシウム、またはそれらの組み合わせなどの賦形剤；例えばコーンスターチ、ジャガイモ
デンプン、アルギン酸、またはそれらの組み合わせなどの崩壊剤；例えばステアリン酸マ
グネシウムなどの滑沢剤；例えばスクロース、ラクトース、サッカリン、またはそれらの
組み合わせなどの甘味剤；例えばペパーミント、ウィンターグリーン油、チェリー香料、
オレンジ香料などの香味剤。投与単位剤形がカプセル剤である場合、上記の種類の材料に
加えて液体担体を含有してもよい。コーティング剤として、またはそれ以外で投与単位の
物理的形態を変更する、他の様々な材料が存在していてもよい。例えば錠剤、丸剤、また
はカプセルを、セラック、糖、またはその両方でコーティングしてもよい。剤形がカプセ
ル剤である場合、上記の種類の材料に加えて液体担体などの担体を含有してもよい。ゼラ
チンカプセル、錠剤、または丸剤は腸溶性コーティングされていてもよい。腸溶性コーテ
ィングは、ｐＨが酸性である胃または上腸での組成物の変性を防止する。例えば米国特許
第５，６２９，００１号を参照のこと。小腸に到達すると、小腸内の塩基性ｐＨによりコ
ーティングが溶解されて、組成物が放出され、特殊な細胞、例えば腸管上皮細胞及びパイ
エル板Ｍ細胞による吸収が可能になる。エリキシルのシロップは、活性化合物、甘味剤と
してのスクロース、防腐剤としてのメチルパラベン及びプロピルパラベン、色素、及びチ
ェリー香料またはオレンジ香料などの香味剤を含有してもよい。当然ながら、任意の投与
単位剤形の調製に使用される任意の材料は、薬学的に純粋であり、使用量において実質的
に非毒性であるべきである。さらに活性化合物は、徐放性の調製物及び製剤に配合されて
いてもよい。
錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、カシェ剤などの形態
で使用することができる１２、１３（米国特許第５，６４１，５１５号；同第５，５８０
，５７９号及び同第５，７９２，４５１号。それぞれ、その全体が参照により本明細書に
明確に組み込まれる）。錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセルなどはまた、以下を含有して
もよい：例えばトラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチ、ゼラチン、またはそ
れらの組み合わせなどの結合剤；例えばリン酸二カルシウム、マンニトール、ラクトース
、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグ
ネシウム、またはそれらの組み合わせなどの賦形剤；例えばコーンスターチ、ジャガイモ
デンプン、アルギン酸、またはそれらの組み合わせなどの崩壊剤；例えばステアリン酸マ
グネシウムなどの滑沢剤；例えばスクロース、ラクトース、サッカリン、またはそれらの
組み合わせなどの甘味剤；例えばペパーミント、ウィンターグリーン油、チェリー香料、
オレンジ香料などの香味剤。投与単位剤形がカプセル剤である場合、上記の種類の材料に
加えて液体担体を含有してもよい。コーティング剤として、またはそれ以外で投与単位の
物理的形態を変更する、他の様々な材料が存在していてもよい。例えば錠剤、丸剤、また
はカプセルを、セラック、糖、またはその両方でコーティングしてもよい。剤形がカプセ
ル剤である場合、上記の種類の材料に加えて液体担体などの担体を含有してもよい。ゼラ
チンカプセル、錠剤、または丸剤は腸溶性コーティングされていてもよい。腸溶性コーテ
ィングは、ｐＨが酸性である胃または上腸での組成物の変性を防止する。例えば米国特許
第５，６２９，００１号を参照のこと。小腸に到達すると、小腸内の塩基性ｐＨによりコ
ーティングが溶解されて、組成物が放出され、特殊な細胞、例えば腸管上皮細胞及びパイ
エル板Ｍ細胞による吸収が可能になる。エリキシルのシロップは、活性化合物、甘味剤と
してのスクロース、防腐剤としてのメチルパラベン及びプロピルパラベン、色素、及びチ
ェリー香料またはオレンジ香料などの香味剤を含有してもよい。当然ながら、任意の投与
単位剤形の調製に使用される任意の材料は、薬学的に純粋であり、使用量において実質的
に非毒性であるべきである。さらに活性化合物は、徐放性の調製物及び製剤に配合されて
いてもよい。
【0056】
経口投与の場合、その代わりに本発明の組成物は、洗口剤、歯磨剤、バッカル錠、経口
スプレー、または舌下経口投与製剤の形態で１種以上の賦形剤と混合されていてもよい。
例えば、洗口剤は、ホウ酸ナトリウム溶液（ドーベル液）などの適切な溶媒に、必要量の
活性成分を配合して調製することができる。あるいは、活性成分を、ホウ酸ナトリウム、
グリセリン、及び重炭酸カリウムを含有するものなどの経口溶液に配合しても、または歯
磨剤に分散させても、または水、結合剤、研磨剤、香味剤、発泡剤、及び湿潤剤を含み得
る組成物に治療有効量で添加してもよい。あるいは、組成物を、舌下に置くか、またはそ
の他の方法で口腔内で溶解できるような錠剤または溶液形態にしてもよい。
スプレー、または舌下経口投与製剤の形態で１種以上の賦形剤と混合されていてもよい。
例えば、洗口剤は、ホウ酸ナトリウム溶液（ドーベル液）などの適切な溶媒に、必要量の
活性成分を配合して調製することができる。あるいは、活性成分を、ホウ酸ナトリウム、
グリセリン、及び重炭酸カリウムを含有するものなどの経口溶液に配合しても、または歯
磨剤に分散させても、または水、結合剤、研磨剤、香味剤、発泡剤、及び湿潤剤を含み得
る組成物に治療有効量で添加してもよい。あるいは、組成物を、舌下に置くか、またはそ
の他の方法で口腔内で溶解できるような錠剤または溶液形態にしてもよい。
【0057】
他の栄養投与様式に適した追加の製剤として坐剤が挙げられる。坐剤は、直腸に挿入す
るためのさまざまな重量及び形状である、通常は薬用の固体剤形である。挿入後、坐剤は
体腔液で軟化、融解、または溶解する。一般に、坐剤の場合の従来の担体には、例えばポ
リアルキレングリコール、トリグリセリド、またはそれらの組み合わせを含み得る。ある
特定の実施形態では、坐剤は、例えば約０．５％～約１０％、好ましくは約１％～約２％
の範囲の活性成分を含有する混合物から形成され得る。
るためのさまざまな重量及び形状である、通常は薬用の固体剤形である。挿入後、坐剤は
体腔液で軟化、融解、または溶解する。一般に、坐剤の場合の従来の担体には、例えばポ
リアルキレングリコール、トリグリセリド、またはそれらの組み合わせを含み得る。ある
特定の実施形態では、坐剤は、例えば約０．５％～約１０％、好ましくは約１％～約２％
の範囲の活性成分を含有する混合物から形成され得る。
【0058】
Ｂ．非経口組成物及び製剤
さらなる実施形態では、Ｙａｐ突然変異体タンパク質及び／またはそれをコードするポ
リヌクレオチドは、非経口経路を介して投与することができる。本明細書で使用される場
合、用語「非経口」には、消化管を経由しない経路を含む。具体的には、本明細書に開示
される医薬組成物は、例えば静脈内、皮内、筋肉内、動脈内、髄腔内、皮下、または腹腔
内に投与できるが、これらに限定されない。米国特許第６，７５３７，５１４号、同第６
，６１３，３０８号、同第５，４６６，４６８号、同第５，５４３，１５８号；同第５，
６４１，５１５号；及び同第５，３９９，３６３号（それぞれ、その全体が参照により本
明細書に明確に組み込まれる）。
さらなる実施形態では、Ｙａｐ突然変異体タンパク質及び／またはそれをコードするポ
リヌクレオチドは、非経口経路を介して投与することができる。本明細書で使用される場
合、用語「非経口」には、消化管を経由しない経路を含む。具体的には、本明細書に開示
される医薬組成物は、例えば静脈内、皮内、筋肉内、動脈内、髄腔内、皮下、または腹腔
内に投与できるが、これらに限定されない。米国特許第６，７５３７，５１４号、同第６
，６１３，３０８号、同第５，４６６，４６８号、同第５，５４３，１５８号；同第５，
６４１，５１５号；及び同第５，３９９，３６３号（それぞれ、その全体が参照により本
明細書に明確に組み込まれる）。
【0059】
遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、水中でヒドロキ
シプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混和して調製することができる。グリセ
ロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中、ならびに油中で分散液を
調製することもできる。通常の保管条件及び使用条件下では、これらの調製物に微生物の
増殖を防止する防腐剤が含有される。注射使用に適した医薬形態には、滅菌水溶液または
分散液、及び滅菌注射溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末を含む（米国特許第５，
４６６，４６８号、その全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる）。いかなる場
合にも、形態は滅菌性でなければならず、注射しやすい程度に流動性でなければならない
。形態は製造条件及び保管条件下で安定していなければならず、細菌及び真菌などの微生
物の汚染作用から保護されていなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリ
オール（すなわちグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコー
ルなど）、それらの好適な混合物、及び／または植物油を含有する溶媒または分散媒であ
り得る。適切な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングの使用、必要な粒子サイズ
の維持（分散液の場合）、及び界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の
作用の防止は、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサ
ールなどの、様々な抗菌剤及び抗真菌剤によってもたらすことができる。多くの場合、等
張剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましいと考えられる。注射用組成物
の持続的吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンといった吸収遅延剤
を組成物に使用することによりもたらすことができる。
シプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混和して調製することができる。グリセ
ロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中、ならびに油中で分散液を
調製することもできる。通常の保管条件及び使用条件下では、これらの調製物に微生物の
増殖を防止する防腐剤が含有される。注射使用に適した医薬形態には、滅菌水溶液または
分散液、及び滅菌注射溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末を含む（米国特許第５，
４６６，４６８号、その全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる）。いかなる場
合にも、形態は滅菌性でなければならず、注射しやすい程度に流動性でなければならない
。形態は製造条件及び保管条件下で安定していなければならず、細菌及び真菌などの微生
物の汚染作用から保護されていなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリ
オール（すなわちグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコー
ルなど）、それらの好適な混合物、及び／または植物油を含有する溶媒または分散媒であ
り得る。適切な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングの使用、必要な粒子サイズ
の維持（分散液の場合）、及び界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の
作用の防止は、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサ
ールなどの、様々な抗菌剤及び抗真菌剤によってもたらすことができる。多くの場合、等
張剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましいと考えられる。注射用組成物
の持続的吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンといった吸収遅延剤
を組成物に使用することによりもたらすことができる。
【0060】
例えば水溶液での非経口投与の場合、必要に応じて溶液を適切に緩衝液処理し、液体希
釈剤を最初に十分な生理食塩水またはグルコースで等張にする必要がある。このような特
定の水溶液は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、及び腹腔内投与に特に適している。
これに関連して、使用可能である滅菌水性媒体は、本開示の観点から当業者には公知であ
ろう。例えば１回の投与量を等張ＮａＣｌ溶液に溶解して、皮下注射液を追加するか、ま
たは予定する注入部位に注入することができる（例えば、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐ
ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ” １５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ページ
１０３５－１０３８及び１５７０－１５８０を参照）。必然的に、治療される対象の病態
に応じて投与量に多少の変動が生じることになる。いずれの場合も、投与を担当する者が
、個々の対象に適した用量を決定することになる。さらに、ヒト投与の場合、製剤はＦＤ
Ａ生物基準局が要求する無菌性、発熱性、一般的安全性、及び純度の基準を満たす必要が
ある。
釈剤を最初に十分な生理食塩水またはグルコースで等張にする必要がある。このような特
定の水溶液は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、及び腹腔内投与に特に適している。
これに関連して、使用可能である滅菌水性媒体は、本開示の観点から当業者には公知であ
ろう。例えば１回の投与量を等張ＮａＣｌ溶液に溶解して、皮下注射液を追加するか、ま
たは予定する注入部位に注入することができる（例えば、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐ
ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ” １５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ページ
１０３５－１０３８及び１５７０－１５８０を参照）。必然的に、治療される対象の病態
に応じて投与量に多少の変動が生じることになる。いずれの場合も、投与を担当する者が
、個々の対象に適した用量を決定することになる。さらに、ヒト投与の場合、製剤はＦＤ
Ａ生物基準局が要求する無菌性、発熱性、一般的安全性、及び純度の基準を満たす必要が
ある。
【0061】
滅菌注射溶液は、必要量の活性化合物を、必要に応じて上記に列挙した様々な他の成分
とともに適切な溶媒に配合した後、濾過滅菌することにより調製される。一般に、分散液
は、様々な滅菌活性成分を、基礎分散媒と、上記に列挙したもののうち必要とされる他の
成分とを含有する滅菌ビヒクルに配合することにより調製される。滅菌注射溶液の調製用
の滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分に加え任意の追加の目的成分である粉
末を、それらの事前に滅菌濾過した溶液から得る真空乾燥及び凍結乾燥技術である。粉末
化組成物は、安定剤の有無にかかわらず、例えば水または生理食塩水などの液体担体と混
合される。
とともに適切な溶媒に配合した後、濾過滅菌することにより調製される。一般に、分散液
は、様々な滅菌活性成分を、基礎分散媒と、上記に列挙したもののうち必要とされる他の
成分とを含有する滅菌ビヒクルに配合することにより調製される。滅菌注射溶液の調製用
の滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分に加え任意の追加の目的成分である粉
末を、それらの事前に滅菌濾過した溶液から得る真空乾燥及び凍結乾燥技術である。粉末
化組成物は、安定剤の有無にかかわらず、例えば水または生理食塩水などの液体担体と混
合される。
【0062】
Ｃ．多種多様な医薬組成物及び製剤
本発明の他の好ましい実施形態では、活性化合物Ｙａｐ突然変異体タンパク質及び／ま
たはそれをコードするポリヌクレオチドを、例えば局所（すなわち経皮）投与、粘膜投与
（鼻腔内、膣内など）、及び／または吸入といった多種多様な経路を介する投与用に製剤
化することができる。
本発明の他の好ましい実施形態では、活性化合物Ｙａｐ突然変異体タンパク質及び／ま
たはそれをコードするポリヌクレオチドを、例えば局所（すなわち経皮）投与、粘膜投与
（鼻腔内、膣内など）、及び／または吸入といった多種多様な経路を介する投与用に製剤
化することができる。
【0063】
局所投与用の医薬組成物には、軟膏、ペースト、クリーム、または粉末など、薬用塗布
用に製剤化された活性化合物を含み得る。軟膏には、局所塗布用のあらゆる油性、吸着性
、エマルジョン、及び水溶性ベースの組成物が含まれ、対してクリーム及びローションは
、エマルジョン基剤のみを含むそのような組成物である。局所投与される医薬品には、皮
膚からの活性成分の吸着を促進する浸透促進剤が含有される場合がある。好適な浸透促進
剤として、グリセリン、アルコール、アルキルメチルスルホキシド、ピロリドン、及びラ
ウロカプラムが挙げられる。局所塗布用の組成物の可能な基剤として、ポリエチレングリ
コール、ラノリン、コールドクリーム、及びワセリン、ならびに任意の他の好適な吸収性
、エマルジョン、または水溶性の軟膏基剤が挙げられる。局所製剤はまた、活性成分を保
存し、均一な混合物を提供するために必要とされる乳化剤、ゲル化剤、及び抗菌性防腐剤
を含んでもよい。本発明の経皮投与は、「パッチ」の使用も含み得る。例えばパッチは、
１つ以上の活性物質を所定の速度で、かつ一定期間にわたって持続的に供給することがで
きる。
用に製剤化された活性化合物を含み得る。軟膏には、局所塗布用のあらゆる油性、吸着性
、エマルジョン、及び水溶性ベースの組成物が含まれ、対してクリーム及びローションは
、エマルジョン基剤のみを含むそのような組成物である。局所投与される医薬品には、皮
膚からの活性成分の吸着を促進する浸透促進剤が含有される場合がある。好適な浸透促進
剤として、グリセリン、アルコール、アルキルメチルスルホキシド、ピロリドン、及びラ
ウロカプラムが挙げられる。局所塗布用の組成物の可能な基剤として、ポリエチレングリ
コール、ラノリン、コールドクリーム、及びワセリン、ならびに任意の他の好適な吸収性
、エマルジョン、または水溶性の軟膏基剤が挙げられる。局所製剤はまた、活性成分を保
存し、均一な混合物を提供するために必要とされる乳化剤、ゲル化剤、及び抗菌性防腐剤
を含んでもよい。本発明の経皮投与は、「パッチ」の使用も含み得る。例えばパッチは、
１つ以上の活性物質を所定の速度で、かつ一定期間にわたって持続的に供給することがで
きる。
【0064】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、点眼剤、鼻腔内スプレー、吸入剤、及び／ま
たは他のエアロゾル送達ビヒクルによって送達される場合がある。経鼻エアロゾルスプレ
ーによる組成物の肺への直接送達方法は、例えば米国特許第５，７５６，３５３号及び同
第５，８０４，２１２号（それぞれ、その全体が参照により本明細書に明確に組み込まれ
る）に記載されている。同様に、鼻腔内微粒子樹脂１４及びリゾホスファチジル－グリセ
ロール化合物（米国特許第５，７２５，８７１号、その全体が参照により本明細書に明確
に組み込まれる）を使用した薬物の送達もまた製薬業界では周知されている。同様に、ポ
リテトラフルオロエチレン担持マトリックスの形態での経粘膜薬物送達が、米国特許第５
，７８０，０４５号（その全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる）に記載され
ている。
たは他のエアロゾル送達ビヒクルによって送達される場合がある。経鼻エアロゾルスプレ
ーによる組成物の肺への直接送達方法は、例えば米国特許第５，７５６，３５３号及び同
第５，８０４，２１２号（それぞれ、その全体が参照により本明細書に明確に組み込まれ
る）に記載されている。同様に、鼻腔内微粒子樹脂１４及びリゾホスファチジル－グリセ
ロール化合物（米国特許第５，７２５，８７１号、その全体が参照により本明細書に明確
に組み込まれる）を使用した薬物の送達もまた製薬業界では周知されている。同様に、ポ
リテトラフルオロエチレン担持マトリックスの形態での経粘膜薬物送達が、米国特許第５
，７８０，０４５号（その全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる）に記載され
ている。
【0065】
エアロゾルという用語は、微粉化固体の液体粒子が液化ガスまたは加圧ガス噴射剤中に
分散されたコロイド系を指す。吸入用の本発明の典型的なエアロゾルは、液体噴射剤中ま
たは液体噴射剤と好適な溶媒との混合物中の活性成分の懸濁液からなる。好適な噴射剤と
して、炭化水素及び炭化水素エーテルが挙げられる。好適な容器は、噴射剤の加圧要件に
応じて異なることになる。エアロゾルの投与は、対象の年齢、体重、ならびに症状の重症
度及び反応に応じて異なることになる。
分散されたコロイド系を指す。吸入用の本発明の典型的なエアロゾルは、液体噴射剤中ま
たは液体噴射剤と好適な溶媒との混合物中の活性成分の懸濁液からなる。好適な噴射剤と
して、炭化水素及び炭化水素エーテルが挙げられる。好適な容器は、噴射剤の加圧要件に
応じて異なることになる。エアロゾルの投与は、対象の年齢、体重、ならびに症状の重症
度及び反応に応じて異なることになる。
【0066】
ＩＶ．本開示のキット
本明細書に記載のいずれの組成物も、キットに含むことができる。非限定的な例におい
て、突然変異体Ｙａｐポリペプチド及び／またはポリヌクレオチド（またはその生成のた
めのオリゴヌクレオチド）をキットに含むことができる。
本明細書に記載のいずれの組成物も、キットに含むことができる。非限定的な例におい
て、突然変異体Ｙａｐポリペプチド及び／またはポリヌクレオチド（またはその生成のた
めのオリゴヌクレオチド）をキットに含むことができる。
【0067】
水性媒体または凍結乾燥形態のいずれかでキットの成分をパッケージ化してもよい。キ
ットの収容手段には一般に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、注
射器、または他の収容手段を含み、その中に成分を入れることができ、好ましくは好適に
アリコートできるものである。キットに複数の成分が存在する場合、キットは一般に、追
加成分を個別に入れることができる第２、第３、または他の追加容器も含むことになる。
ただし、１つのバイアルに成分の様々な組み合わせが含まれる場合がある。本開示のキッ
トはまた、典型的には、市販用に厳重に密閉して１つ以上の組成物を収容するための手段
を含むと考えられる。そのような容器には、その中に目的とするバイアルが保持される、
射出成形またはブロー成形されたプラスチック容器を含み得る。
ットの収容手段には一般に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、注
射器、または他の収容手段を含み、その中に成分を入れることができ、好ましくは好適に
アリコートできるものである。キットに複数の成分が存在する場合、キットは一般に、追
加成分を個別に入れることができる第２、第３、または他の追加容器も含むことになる。
ただし、１つのバイアルに成分の様々な組み合わせが含まれる場合がある。本開示のキッ
トはまた、典型的には、市販用に厳重に密閉して１つ以上の組成物を収容するための手段
を含むと考えられる。そのような容器には、その中に目的とするバイアルが保持される、
射出成形またはブロー成形されたプラスチック容器を含み得る。
【0068】
組成物は注射可能な組成物に製剤化される場合がある。その場合、収容手段はそれ自体
が注射器、ピペット、及び／または他の同様の器具であり得、そこから製剤を身体の感染
領域に適用する、動物に注射する、及び／またはさらにキットの他の成分に加える及び／
またはそれと混合することもできる。ただし、キットの成分が乾燥粉末（複数可）として
提供されてもよい。試薬及び／または成分が乾燥粉末として提供される場合、好適な溶媒
の添加により粉末を再構成することができる。溶媒を別の収容手段で提供することも想定
される。
が注射器、ピペット、及び／または他の同様の器具であり得、そこから製剤を身体の感染
領域に適用する、動物に注射する、及び／またはさらにキットの他の成分に加える及び／
またはそれと混合することもできる。ただし、キットの成分が乾燥粉末（複数可）として
提供されてもよい。試薬及び／または成分が乾燥粉末として提供される場合、好適な溶媒
の添加により粉末を再構成することができる。溶媒を別の収容手段で提供することも想定
される。
【0069】
本開示のキットはまた、典型的には、市販用に厳重に密閉したバイアルを収容するため
の手段を含むと考えられ、例えば、その中に目的とするバイアルが保持される、射出成形
またはブロー成形されたプラスチック容器などである。
の手段を含むと考えられ、例えば、その中に目的とするバイアルが保持される、射出成形
またはブロー成形されたプラスチック容器などである。
【0070】
特定の実施形態では、キットは、個体が心臓関連の医学的病態を有することを判断する
ための試薬及び／またはツールを含む。いくつかの実施形態では、キットは、心臓関連の
医学的病態の１つ以上の追加療法、例えばＡＣＥ阻害剤、アルドステロン阻害剤、アンジ
オテンシンＩＩ受容体遮断薬（ＡＲＢ）；ベータ遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、コ
レステロール低下薬、ジゴキシン、利尿薬、強心剤療法、カリウム、マグネシウム、血管
拡張剤、抗凝固薬、アスピリン、及びそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む。
ための試薬及び／またはツールを含む。いくつかの実施形態では、キットは、心臓関連の
医学的病態の１つ以上の追加療法、例えばＡＣＥ阻害剤、アルドステロン阻害剤、アンジ
オテンシンＩＩ受容体遮断薬（ＡＲＢ）；ベータ遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、コ
レステロール低下薬、ジゴキシン、利尿薬、強心剤療法、カリウム、マグネシウム、血管
拡張剤、抗凝固薬、アスピリン、及びそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む。
【実施例0071】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために記載する。以下に示す実
施例に開示される技術は、本発明の実施において十分に機能することが本発明者によって
発見された技術を代表するものであり、したがってその実施にとって好ましい形態を構成
するとみなし得ることを当業者は理解されたい。しかしながら、当業者は、本開示に照ら
して、開示された具体的な実施形態に多数の変更を加えることができ、それでもなお本発
明の趣旨及び範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を得ることができるものと
理解されたい。
施例に開示される技術は、本発明の実施において十分に機能することが本発明者によって
発見された技術を代表するものであり、したがってその実施にとって好ましい形態を構成
するとみなし得ることを当業者は理解されたい。しかしながら、当業者は、本開示に照ら
して、開示された具体的な実施形態に多数の変更を加えることができ、それでもなお本発
明の趣旨及び範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を得ることができるものと
理解されたい。
【0072】
（実施例１）
（優性活性型ＹＡＰはクロマチンアクセシビリティ及び心筋細胞の再生を誘発する）
ＹａｐＳ１２７Ａ突然変異がＬａｔｓ依存性Ｙａｐ阻害をすべて説明できるわけではな
いことを特性から明らかにし、かつＨｉｐｐｏ活性をもたない心臓をモデリングするため
に、５つすべてのＬａｔｓ１／２リン酸化部位をＡに突然変異させたＹａｐ５ＳＡを条件
付きで過剰発現するトランスジェニックマウス系統を作製した８。
（優性活性型ＹＡＰはクロマチンアクセシビリティ及び心筋細胞の再生を誘発する）
ＹａｐＳ１２７Ａ突然変異がＬａｔｓ依存性Ｙａｐ阻害をすべて説明できるわけではな
いことを特性から明らかにし、かつＨｉｐｐｏ活性をもたない心臓をモデリングするため
に、５つすべてのＬａｔｓ１／２リン酸化部位をＡに突然変異させたＹａｐ５ＳＡを条件
付きで過剰発現するトランスジェニックマウス系統を作製した８。
【0073】
ＣＡＧ駆動型誘導性Ｙａｐ５ＳＡ導入遺伝子には、ＬｏｘＰに挟まれたＳＴＯＰとｅＧ
ＦＰがあり、その後ろにＦｌａｇタグ付きＹａｐ５ＳＡ及びＩＲＥＳ ＬａｃＺを含んで
いた（図１Ａ）。この導入遺伝子は、組換え前の胚及び出生後の心臓にｅＧＦＰ発現を誘
導した（図１Ｂ、図１Ｃ）。本発明者らは、Ｙａｐ５ＳＡマウスをタモキシフェン誘導性
心筋細胞特異的ＣｒｅドライバーであるαＭｙＨＣ－Ｃｒｅ－ＥＲＴ２（図１Ｄ）１５と
交配させて、Ｙａｐ５ＳＡ過剰発現（ＯＥ）マウスを作製した。タモキシフェンを４日間
連続して注入（４０μｇ／ｇ）することにより、成体ＣＭに組換えを誘導した。成体心臓
抽出物に対するウェスタンブロットは、Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ心臓においてＹａｐレベルが
５倍に増加することを示した（図１Ｄ）。免疫蛍光試験により、Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ Ｃ
Ｍのサイトゾルに対するＹａｐの核濃縮は２．５倍であることが明らかになった。対照Ｃ
Ｍは、サイトゾルと核の両方にＹａｐを発現した（図１Ｅ）。
ＦＰがあり、その後ろにＦｌａｇタグ付きＹａｐ５ＳＡ及びＩＲＥＳ ＬａｃＺを含んで
いた（図１Ａ）。この導入遺伝子は、組換え前の胚及び出生後の心臓にｅＧＦＰ発現を誘
導した（図１Ｂ、図１Ｃ）。本発明者らは、Ｙａｐ５ＳＡマウスをタモキシフェン誘導性
心筋細胞特異的ＣｒｅドライバーであるαＭｙＨＣ－Ｃｒｅ－ＥＲＴ２（図１Ｄ）１５と
交配させて、Ｙａｐ５ＳＡ過剰発現（ＯＥ）マウスを作製した。タモキシフェンを４日間
連続して注入（４０μｇ／ｇ）することにより、成体ＣＭに組換えを誘導した。成体心臓
抽出物に対するウェスタンブロットは、Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ心臓においてＹａｐレベルが
５倍に増加することを示した（図１Ｄ）。免疫蛍光試験により、Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ Ｃ
Ｍのサイトゾルに対するＹａｐの核濃縮は２．５倍であることが明らかになった。対照Ｃ
Ｍは、サイトゾルと核の両方にＹａｐを発現した（図１Ｅ）。
【0074】
Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥマウスは、最後のタモキシフェン注射の７２時間後に死亡した（図
２Ａ）。組織学により、左心室壁の厚さが増加するとともに、左心室腔が筋肉でほぼ閉塞
されていることが明らかになった（図２Ｂ）。タモキシフェンの注入前と注入から１日後
の心エコー検査では、ｉｎ ｖｉｖｏでのＹａｐ５ＳＡ ＯＥ心臓の心室壁の肥厚、心腔
サイズの縮小、及び駆出率の増加を示した（図２Ｃ～２Ｊ及び複数の動画）。この表現型
は、タモキシフェン後の対照αＭＨＣ－ｍｅｒＣｒｅｍｅｒマウスにおける心毒性心室拡
張とは対照的である１６。
２Ａ）。組織学により、左心室壁の厚さが増加するとともに、左心室腔が筋肉でほぼ閉塞
されていることが明らかになった（図２Ｂ）。タモキシフェンの注入前と注入から１日後
の心エコー検査では、ｉｎ ｖｉｖｏでのＹａｐ５ＳＡ ＯＥ心臓の心室壁の肥厚、心腔
サイズの縮小、及び駆出率の増加を示した（図２Ｃ～２Ｊ及び複数の動画）。この表現型
は、タモキシフェン後の対照αＭＨＣ－ｍｅｒＣｒｅｍｅｒマウスにおける心毒性心室拡
張とは対照的である１６。
【0075】
不整脈を監視するために、遠隔測定装置を同腹子対照及びＹａｐ５ＳＡＯＥマウスに埋
め込んだ。Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥマウスでは不整脈の検出はなく、むしろ試験したすべての
αＭｙＨＣ－Ｃｒｅ－ＥＲＴ２マウスに観察されたタモキシフェン誘発性不整脈（Ｔ波逆
転）を防いだ（図５Ａ、５Ｂ；ｎ＝３）。さらに、コネキシン４３免疫蛍光（図５Ｃ）に
よって示されるように、Ｙａｐ５ＳＡを発現する（β－ガラクトシダーゼ陽性）心筋細胞
はギャップジャンクションによって対照ＣＭと結合しており、Ｙａｐ５ＳＡを発現するＣ
Ｍが野生型ＣＭと電気的に結合することが示唆された。最後のタモキシフェン注射の２４
時間後に心筋細胞を単離し、個々の細胞レベルでＣＭの収縮性を調べた。タモキシフェン
投与対照ＣＭと比較して、Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ ＣＭは小さかったが、安静時サルコメア
長及び電場刺激に対する収縮性は同様であった（図３Ａ、図５Ｄ）。
め込んだ。Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥマウスでは不整脈の検出はなく、むしろ試験したすべての
αＭｙＨＣ－Ｃｒｅ－ＥＲＴ２マウスに観察されたタモキシフェン誘発性不整脈（Ｔ波逆
転）を防いだ（図５Ａ、５Ｂ；ｎ＝３）。さらに、コネキシン４３免疫蛍光（図５Ｃ）に
よって示されるように、Ｙａｐ５ＳＡを発現する（β－ガラクトシダーゼ陽性）心筋細胞
はギャップジャンクションによって対照ＣＭと結合しており、Ｙａｐ５ＳＡを発現するＣ
Ｍが野生型ＣＭと電気的に結合することが示唆された。最後のタモキシフェン注射の２４
時間後に心筋細胞を単離し、個々の細胞レベルでＣＭの収縮性を調べた。タモキシフェン
投与対照ＣＭと比較して、Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ ＣＭは小さかったが、安静時サルコメア
長及び電場刺激に対する収縮性は同様であった（図３Ａ、図５Ｄ）。
【0076】
立体解析によってＣＭ数を決定するために、拡張期に固定した心臓を、タモキシフェン
注射の２日後に、心尖から大動脈へ７μｍ刻みで切片化し、本発明者らが自ら、左心室面
積を異なる組織深度で測定した。左心室面積を心臓内の位置の関数としてプロットし、曲
線下面積を積分することにより、基準となる左心室の容積を算出した。ＣＭを明確に識別
することは困難な可能性があるため、本発明者らは中心体周辺物質１（ＰＣＭ－１）マー
カーを使用して、左心室のＣＭ核を識別した１。Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥの心臓は、対照の心
臓と比較して、左心室壁面積が増加し、心筋の容積が増加し、心腔の容積が減少した（図
３Ｂ～３Ｄ）。Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ心臓は、体重に対する左心室の重量比も増加した（図
３Ｅ）。
注射の２日後に、心尖から大動脈へ７μｍ刻みで切片化し、本発明者らが自ら、左心室面
積を異なる組織深度で測定した。左心室面積を心臓内の位置の関数としてプロットし、曲
線下面積を積分することにより、基準となる左心室の容積を算出した。ＣＭを明確に識別
することは困難な可能性があるため、本発明者らは中心体周辺物質１（ＰＣＭ－１）マー
カーを使用して、左心室のＣＭ核を識別した１。Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥの心臓は、対照の心
臓と比較して、左心室壁面積が増加し、心筋の容積が増加し、心腔の容積が減少した（図
３Ｂ～３Ｄ）。Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ心臓は、体重に対する左心室の重量比も増加した（図
３Ｅ）。
【0077】
左心室ＣＭの総数を評価するために、本発明者らは、ＰＣＭ－１陽性ＣＭ核の密度を、
対照（７２，１００＋／－２３００ＣＭ核／ｍｍ^３）及びＹａｐ５ＳＡ ＯＥ心臓（７
０，６００＋／－１３００ＣＭ核／ｍｍ^３）において算出した１、１７。ＣＭ核の密度
は、Ａｌｋａｓｓらの最近のマウス立体解析データと一致していた（図１Ｂを参照１７）
。ＣＭ数を得るために、本発明者らは、ＣＭ密度に総心臓容積を乗じ、ＣＭの核形成につ
いて補正した（以下を参照）１、１７。Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥの左心室は、対照と比較して
ＣＭ数が大幅に増加した（対照：１，８８０，０００＋／－７８，０００対Ｙａｐ５ＳＡ
：２，６８０，０００＋／－５４，０００；分散分析とＢｏｎｆｅｒｏｎｉの事後分析ｐ
＜．０００１；図３Ｆ）。対照のＣＭ数データも以前に公開されたマウスのデータと一致
している１８。
対照（７２，１００＋／－２３００ＣＭ核／ｍｍ^３）及びＹａｐ５ＳＡ ＯＥ心臓（７
０，６００＋／－１３００ＣＭ核／ｍｍ^３）において算出した１、１７。ＣＭ核の密度
は、Ａｌｋａｓｓらの最近のマウス立体解析データと一致していた（図１Ｂを参照１７）
。ＣＭ数を得るために、本発明者らは、ＣＭ密度に総心臓容積を乗じ、ＣＭの核形成につ
いて補正した（以下を参照）１、１７。Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥの左心室は、対照と比較して
ＣＭ数が大幅に増加した（対照：１，８８０，０００＋／－７８，０００対Ｙａｐ５ＳＡ
：２，６８０，０００＋／－５４，０００；分散分析とＢｏｎｆｅｒｏｎｉの事後分析ｐ
＜．０００１；図３Ｆ）。対照のＣＭ数データも以前に公開されたマウスのデータと一致
している１８。
【0078】
フローサイトメトリーにより、単離されたＰＣＭ－１陽性ＣＭ核のＤＮＡ含量を定量化
すると、Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ ＣＭは４Ｎ核でわずかな増加を示したが、４Ｎを超える核
に有糸分裂カタストロフのモデル１９で見られるようなＤＮＡ含量の増加はなかった（図
６）。Ｇ２／Ｍの２倍体細胞は、４Ｎ ＤＮＡ含量が４倍体細胞と同じであるため、Ｙａ
ｐ５ＳＡの４Ｎ核の増加が高倍数化ではなく正常な細胞周期進行によることをデータは示
唆している２０。単離したＣＭでＣＭ核の数を測定したところ、Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ心臓
において単核ＣＭの増加はあったが、二核ＣＭに変化はなかった（図３Ｇ）。また、Ｙａ
ｐ５ＳＡ心臓では、核が４つのＣＭの比率が減少しており、非生産的な核分裂が少ないこ
とを示唆した（図３Ｇ）。
すると、Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ ＣＭは４Ｎ核でわずかな増加を示したが、４Ｎを超える核
に有糸分裂カタストロフのモデル１９で見られるようなＤＮＡ含量の増加はなかった（図
６）。Ｇ２／Ｍの２倍体細胞は、４Ｎ ＤＮＡ含量が４倍体細胞と同じであるため、Ｙａ
ｐ５ＳＡの４Ｎ核の増加が高倍数化ではなく正常な細胞周期進行によることをデータは示
唆している２０。単離したＣＭでＣＭ核の数を測定したところ、Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ心臓
において単核ＣＭの増加はあったが、二核ＣＭに変化はなかった（図３Ｇ）。また、Ｙａ
ｐ５ＳＡ心臓では、核が４つのＣＭの比率が減少しており、非生産的な核分裂が少ないこ
とを示唆した（図３Ｇ）。
【0079】
本発明者らは、Ｙａｐ５ＳＡ誘導後の２日間に、ＥｄＵを飲料水で適宜供給して、単離
ＣＭのＥｄＵを染色し、非損傷成体ＣＭにおけるＳ期進入を試験した（図３Ｈ）。以前の
観察と同様に、非損傷対照ＣＭへのＥｄＵの取り込みは検出されなかった（図３Ｈ）２。
対照的に、Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ ＣＭのうち約１６％はＥｄＵ陽性であった（図３Ｈ）。
さらに、Ｙａｐ５ＳＡ ＣＭは有糸分裂マーカーを発現し、Ｙａｐ５ＳＡ ＣＭの約１１
％がＡｕｒｋｂ陽性、６％がＰＨＨ３陽性であった（図３Ｉ～３Ｊ）。ＣＭの倍加時間（
ｔＤ）を算出するために、１回の低用量タモキシフェンで低頻度の組換えを誘導し、異な
る時点でＬａｃＺ陽性ＣＭを計数した。本発明者らは、対数式に変換した後、Ｙａｐ５Ｓ
Ａ ＯＥ ＣＭでは、ｔＤが１．３７日であることを見出した（図３Ｋ）。重要な点とし
て、Ｙａｐ５ＳＡはＣＭアポトーシスまたは間質性線維症を誘発しなかった（図７、図８
）。合わせて、データによると、Ｙａｐ５ＳＡは新しいＣＭの発生とともに成体ＣＭの増
殖を誘発することを示している。
ＣＭのＥｄＵを染色し、非損傷成体ＣＭにおけるＳ期進入を試験した（図３Ｈ）。以前の
観察と同様に、非損傷対照ＣＭへのＥｄＵの取り込みは検出されなかった（図３Ｈ）２。
対照的に、Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ ＣＭのうち約１６％はＥｄＵ陽性であった（図３Ｈ）。
さらに、Ｙａｐ５ＳＡ ＣＭは有糸分裂マーカーを発現し、Ｙａｐ５ＳＡ ＣＭの約１１
％がＡｕｒｋｂ陽性、６％がＰＨＨ３陽性であった（図３Ｉ～３Ｊ）。ＣＭの倍加時間（
ｔＤ）を算出するために、１回の低用量タモキシフェンで低頻度の組換えを誘導し、異な
る時点でＬａｃＺ陽性ＣＭを計数した。本発明者らは、対数式に変換した後、Ｙａｐ５Ｓ
Ａ ＯＥ ＣＭでは、ｔＤが１．３７日であることを見出した（図３Ｋ）。重要な点とし
て、Ｙａｐ５ＳＡはＣＭアポトーシスまたは間質性線維症を誘発しなかった（図７、図８
）。合わせて、データによると、Ｙａｐ５ＳＡは新しいＣＭの発生とともに成体ＣＭの増
殖を誘発することを示している。
【0080】
成体ＣＭ再生に関連してＹａｐ５ＳＡ標的遺伝子に対する考察を得るために、タモキシ
フェン注射の４８時間後にＣＭ特異的核のＲＮＡ－ｓｅｑを実施した２１、２２。Ｙａｐ
５ＳＡ ＣＭにおいて、合計１，３５２個の遺伝子が大幅に上方制御され、７４８個が下
方制御された（調整ｐ値＜０．０１）（図４Ａ、図９）。無作為の遺伝子オントロジー分
析により、遺伝子発現の変化が増殖性ＣＭ表現型と一致することが明らかになった（図１
０Ａ）。上方制御された転写産物には、セントロメア遺伝子Ｃｅｎｐｅ及びＣｅｎｐｆ、
ならびにサイクリンＣｃｎｄ１及びＣｃｎａ２が含まれていた。他の遺伝子には、細胞骨
格のリモデリング及び細胞増殖を促進する、Ｒｈｏファミリーのグアニンヌクレオチド交
換因子であるＤｏｃｋ２が含まれていた２３。下方制御された遺伝子には、分化したＣＭ
表現型の特徴であるミオシン及びイオンチャネルをコードする遺伝子が含まれていた（図
１０Ｂ）。興味深いことに、Ｈｉｐｐｏ経路遺伝子は、Ｙａｐ５ＳＡ ＣＭで最も顕著に
増加した転写産物の１つであった（図１１）。コアＨｉｐｐｏ経路遺伝子Ｌａｔｓ２及び
Ｋｉｂｒａ（Ｗｗｃ１）は、Ｙａｐ阻害因子Ｃｒｂ２、Ａｍｏｔ、及びＶｇｌｌ２～４を
コードする遺伝子と同様に上方制御された（図１０Ｂ、図１１）。
フェン注射の４８時間後にＣＭ特異的核のＲＮＡ－ｓｅｑを実施した２１、２２。Ｙａｐ
５ＳＡ ＣＭにおいて、合計１，３５２個の遺伝子が大幅に上方制御され、７４８個が下
方制御された（調整ｐ値＜０．０１）（図４Ａ、図９）。無作為の遺伝子オントロジー分
析により、遺伝子発現の変化が増殖性ＣＭ表現型と一致することが明らかになった（図１
０Ａ）。上方制御された転写産物には、セントロメア遺伝子Ｃｅｎｐｅ及びＣｅｎｐｆ、
ならびにサイクリンＣｃｎｄ１及びＣｃｎａ２が含まれていた。他の遺伝子には、細胞骨
格のリモデリング及び細胞増殖を促進する、Ｒｈｏファミリーのグアニンヌクレオチド交
換因子であるＤｏｃｋ２が含まれていた２３。下方制御された遺伝子には、分化したＣＭ
表現型の特徴であるミオシン及びイオンチャネルをコードする遺伝子が含まれていた（図
１０Ｂ）。興味深いことに、Ｈｉｐｐｏ経路遺伝子は、Ｙａｐ５ＳＡ ＣＭで最も顕著に
増加した転写産物の１つであった（図１１）。コアＨｉｐｐｏ経路遺伝子Ｌａｔｓ２及び
Ｋｉｂｒａ（Ｗｗｃ１）は、Ｙａｐ阻害因子Ｃｒｂ２、Ａｍｏｔ、及びＶｇｌｌ２～４を
コードする遺伝子と同様に上方制御された（図１０Ｂ、図１１）。
【0081】
Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ ＣＭのクロマチンランドスケープを調べるために、ＰＣＭ－１単
離ＣＭ核で、トランスポザーゼの接近可能なクロマチン（ＡＴＡＣ）－ｓｅｑについてア
ッセイを実施した２４。合計して、Ｙａｐ５ＳＡ ＣＭにおいて１６，１８９個のピーク
がアクセシビリティの増加を示したが、対照ＣＭと比較してＡＴＡＣピークは１３，３５
３個減少した（図４Ａ、図９）。ｄｅ ｎｏｖｏモチーフの発見により、Ｙａｐ５ＳＡ
ＯＥ ＣＭにおいて、新たに明らかになったＡＴＡＣピークのうち上位３つの濃縮モチー
フすべてが、周知のＹａｐインタラクター２５である転写因子ＴＥＡＤ（図４Ｂ）に属し
ていることが明らかになった。他の濃縮モチーフは、以前のＹａｐ ＣｈＩＰ－ｓｅｑデ
ータと一致するＡＰ－１要素と、病理学的心臓リモデリングを防止する役割を有するＡｔ
ｆ３であった２６～２８。Ｎｕｃｌｅｏ－ＡＴＡＣアルゴリズムを適用して、ＴＥＡＤ
ＤＮＡ結合モチーフに対するクロマチンの開放状態を示し、ＴＥＡＤモチーフでのヌクレ
オソームの除去を見出した。これは転写因子占有率の増加と一致していた２９（図４Ｂ）
。
離ＣＭ核で、トランスポザーゼの接近可能なクロマチン（ＡＴＡＣ）－ｓｅｑについてア
ッセイを実施した２４。合計して、Ｙａｐ５ＳＡ ＣＭにおいて１６，１８９個のピーク
がアクセシビリティの増加を示したが、対照ＣＭと比較してＡＴＡＣピークは１３，３５
３個減少した（図４Ａ、図９）。ｄｅ ｎｏｖｏモチーフの発見により、Ｙａｐ５ＳＡ
ＯＥ ＣＭにおいて、新たに明らかになったＡＴＡＣピークのうち上位３つの濃縮モチー
フすべてが、周知のＹａｐインタラクター２５である転写因子ＴＥＡＤ（図４Ｂ）に属し
ていることが明らかになった。他の濃縮モチーフは、以前のＹａｐ ＣｈＩＰ－ｓｅｑデ
ータと一致するＡＰ－１要素と、病理学的心臓リモデリングを防止する役割を有するＡｔ
ｆ３であった２６～２８。Ｎｕｃｌｅｏ－ＡＴＡＣアルゴリズムを適用して、ＴＥＡＤ
ＤＮＡ結合モチーフに対するクロマチンの開放状態を示し、ＴＥＡＤモチーフでのヌクレ
オソームの除去を見出した。これは転写因子占有率の増加と一致していた２９（図４Ｂ）
。
【0082】
遺伝子間ＡＴＡＣピークを、直近の転写開始部位（ＴＳＳ）に対してプロットすると、
対照とＹａｐ５ＳＡ ＯＥ ＣＭ両方においてプロモーター領域（ＴＳＳから１ｋｂ未満
）及び遠位遺伝子座（１０ｋｂ超）で構成される二峰性分布があった（図１２Ａ）。Ｙａ
ｐ５ＳＡ ＯＥ ＣＭにおいて、上方制御された、新たに接近可能なＡＴＡＣのピーク（
調整ｐ値＜１ｅ－５）は、推定エンハンサー内の主に遠位に位置していた２４。同様に、
活発に転写される遺伝子にマップするＡＴＡＣピークも遠位領域に濃縮された（図４Ｃ、
図１２Ｂ）。以前の研究により、Ｙａｐ－Ｔｅａｄ結合部位は、活性クロマチンのマーカ
ーであるＨ３Ｋ２７Ａｃに濃縮されることが明らかになった５。ＡＴＡＣ－ｓｅｑデータ
と、発達中及び成体の心臓からの既存のＨ３Ｋ２７Ａｃ ＣｈＩＰ－ｓｅｑデータとの比
較により、Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ ＣＭからのＡＴＡＣ－ｓｅｑピーク（調整ｐ値≦０．０
３５）が胚Ｈ３Ｋ２７Ａｃクロマチンマークに濃縮されていることが明らかになった。対
照的に、対照ＣＭからのＡＴＡＣ－ｓｅｑピーク（調整ｐ値≦０．０３５）は、成体Ｈ３
Ｋ２７Ａｃクロマチンマークに濃縮を示した３０（図４Ｄ）。これらのデータは、Ｙａｐ
５ＳＡが発生促進因子に対するクロマチンアクセシビリティを促進したことを示唆してい
る。
対照とＹａｐ５ＳＡ ＯＥ ＣＭ両方においてプロモーター領域（ＴＳＳから１ｋｂ未満
）及び遠位遺伝子座（１０ｋｂ超）で構成される二峰性分布があった（図１２Ａ）。Ｙａ
ｐ５ＳＡ ＯＥ ＣＭにおいて、上方制御された、新たに接近可能なＡＴＡＣのピーク（
調整ｐ値＜１ｅ－５）は、推定エンハンサー内の主に遠位に位置していた２４。同様に、
活発に転写される遺伝子にマップするＡＴＡＣピークも遠位領域に濃縮された（図４Ｃ、
図１２Ｂ）。以前の研究により、Ｙａｐ－Ｔｅａｄ結合部位は、活性クロマチンのマーカ
ーであるＨ３Ｋ２７Ａｃに濃縮されることが明らかになった５。ＡＴＡＣ－ｓｅｑデータ
と、発達中及び成体の心臓からの既存のＨ３Ｋ２７Ａｃ ＣｈＩＰ－ｓｅｑデータとの比
較により、Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ ＣＭからのＡＴＡＣ－ｓｅｑピーク（調整ｐ値≦０．０
３５）が胚Ｈ３Ｋ２７Ａｃクロマチンマークに濃縮されていることが明らかになった。対
照的に、対照ＣＭからのＡＴＡＣ－ｓｅｑピーク（調整ｐ値≦０．０３５）は、成体Ｈ３
Ｋ２７Ａｃクロマチンマークに濃縮を示した３０（図４Ｄ）。これらのデータは、Ｙａｐ
５ＳＡが発生促進因子に対するクロマチンアクセシビリティを促進したことを示唆してい
る。
【0083】
Ｙａｐ５ＳＡ Ｆｌａｇエピトープに対する抗体を使用してＣｈＩＰ－ｓｅｑを実施し
、Ｙａｐ５ＳＡ結合クロマチンを沈降させた。ＡＴＡＣ－ｓｅｑデータと一貫して、Ｙａ
ｐ５ＳＡのＣｈＩＰ－ｓｅｑにより、Ｙａｐ５ＳＡが約６．３対１の比で遠位エンハンサ
ー領域に優先的に結合したことが明らかになった（図４Ｃ）２６、３１。Ｙａｐはまた、
接近可能なプロモーターと結合し、通常はサイレントな遺伝子の転写を正に制御した３１
。
、Ｙａｐ５ＳＡ結合クロマチンを沈降させた。ＡＴＡＣ－ｓｅｑデータと一貫して、Ｙａ
ｐ５ＳＡのＣｈＩＰ－ｓｅｑにより、Ｙａｐ５ＳＡが約６．３対１の比で遠位エンハンサ
ー領域に優先的に結合したことが明らかになった（図４Ｃ）２６、３１。Ｙａｐはまた、
接近可能なプロモーターと結合し、通常はサイレントな遺伝子の転写を正に制御した３１
。
【0084】
Ｙａｐ５ＳＡ ＣＭにおいて転写的に上方制御された遺伝子をＹａｐ５ＳＡ ＣｈＩＰ
－ｓｅｑデータと比較すると、１７３個の遺伝子がＹａｐ５ＳＡの直接標的遺伝子であっ
た。Ｙａｐ５ＳＡの直接標的遺伝子座のうち、７６個の遺伝子座はまた、ＡＴＡＣ－ｓｅ
ｑによって決定されたようにクロマチンアクセシビリティが増加したが、他のＹａｐ５Ｓ
Ａ標的遺伝子座はオープンクロマチンシグネチャーを既に有していた（図４Ｅ、図１３Ａ
）。各遺伝子のＴＳＳを中心とした周辺１ｋｂ域のＲＮＡ－ｓｅｑとＡＴＡＣ－ｓｅｑ両
方の平均断片深度をプロットして、これらの遺伝子座での高いプロモーターアクセシビリ
ティ及び転写増加のパターンを明らかにした（図１３Ｃ）。
－ｓｅｑデータと比較すると、１７３個の遺伝子がＹａｐ５ＳＡの直接標的遺伝子であっ
た。Ｙａｐ５ＳＡの直接標的遺伝子座のうち、７６個の遺伝子座はまた、ＡＴＡＣ－ｓｅ
ｑによって決定されたようにクロマチンアクセシビリティが増加したが、他のＹａｐ５Ｓ
Ａ標的遺伝子座はオープンクロマチンシグネチャーを既に有していた（図４Ｅ、図１３Ａ
）。各遺伝子のＴＳＳを中心とした周辺１ｋｂ域のＲＮＡ－ｓｅｑとＡＴＡＣ－ｓｅｑ両
方の平均断片深度をプロットして、これらの遺伝子座での高いプロモーターアクセシビリ
ティ及び転写増加のパターンを明らかにした（図１３Ｃ）。
【0085】
Ｙａｐ５ＳＡによって直接制御される７６個の遺伝子の中にはＨｉｐｐｏ経路の構成要
素があり、これはＹａｐが負のフィードバックループを直接活性化してＣＭの増殖を妨げ
ることを示している（図４Ｇ、図１１Ａ～１１Ｂ）。Ｈｉｐｐｏ経路遺伝子は、Ｌａｔｓ
２、Ｖｇｌｌ２、Ｖｇｌｌ３、及びＷｗｃ１を含んでいた８、３２（図４Ｆ；図１３Ａ）
。ウェスタンブロットにより、内因性の低分子量Ｙａｐが、Ｈｉｐｐｏ活性の上方制御を
示す、セリン１１２のリン酸化を増加させたことが明らかになった（図１１）。Ｙａｐ５
ＳＡが直接制御する他の遺伝子には、Ｐｋｃｉなどの有糸分裂及び細胞質分裂遺伝子を含
んでいた３３。接近可能なＹａｐ５ＳＡ標的の主要カテゴリーは、エンドソーム選別構成
要素をコードする遺伝子であった。このカテゴリーには、レトロマー構成要素をコードす
るＳｎｘ２、Ｓｎｘ７を含んでいた。エンドサイトーシスアダプタータンパク質をコード
するＤａｂ２はＷｎｔ阻害因子として機能するが、Ｗｎｔリガンドのエンドソーム輸送に
はＷｌｓが不可欠である３４、３５（図１３Ａ１～１３Ａ３、図１３Ｂ）。
素があり、これはＹａｐが負のフィードバックループを直接活性化してＣＭの増殖を妨げ
ることを示している（図４Ｇ、図１１Ａ～１１Ｂ）。Ｈｉｐｐｏ経路遺伝子は、Ｌａｔｓ
２、Ｖｇｌｌ２、Ｖｇｌｌ３、及びＷｗｃ１を含んでいた８、３２（図４Ｆ；図１３Ａ）
。ウェスタンブロットにより、内因性の低分子量Ｙａｐが、Ｈｉｐｐｏ活性の上方制御を
示す、セリン１１２のリン酸化を増加させたことが明らかになった（図１１）。Ｙａｐ５
ＳＡが直接制御する他の遺伝子には、Ｐｋｃｉなどの有糸分裂及び細胞質分裂遺伝子を含
んでいた３３。接近可能なＹａｐ５ＳＡ標的の主要カテゴリーは、エンドソーム選別構成
要素をコードする遺伝子であった。このカテゴリーには、レトロマー構成要素をコードす
るＳｎｘ２、Ｓｎｘ７を含んでいた。エンドサイトーシスアダプタータンパク質をコード
するＤａｂ２はＷｎｔ阻害因子として機能するが、Ｗｎｔリガンドのエンドソーム輸送に
はＷｌｓが不可欠である３４、３５（図１３Ａ１～１３Ａ３、図１３Ｂ）。
【0086】
Ｎｅｃｔｉｎ１、Ｐｌｅｋｈａ７、Ｍｔｓｓ１、及びＣｔｎｎｄ１などの、アドヘレン
スジャンクションのアセンブリを促進する遺伝子もＹａｐ５ＳＡの接近可能な標的であり
、新しいＣＭが機能的に心臓に統合されるという知見をさらに裏づけた３６。アクチン細
胞骨格を制御する複数の遺伝子も、Ｙａｐ５ＳＡの接近可能な標的に見いだされた。Ｅｐ
ｈｅｘｉｎ及びＰａｋ３は、Ｒｈｏ活性の増強にとって重要なタンパク質をコードする。
他の遺伝子は、コードアクチン核形成因子をコードするＣｏｂｌ、及び創傷治癒中のスト
レスファイバーの形成に重要であるＣｎｎ３などである（図１３Ａ１～１３Ａ３、図１３
Ｂ）。
スジャンクションのアセンブリを促進する遺伝子もＹａｐ５ＳＡの接近可能な標的であり
、新しいＣＭが機能的に心臓に統合されるという知見をさらに裏づけた３６。アクチン細
胞骨格を制御する複数の遺伝子も、Ｙａｐ５ＳＡの接近可能な標的に見いだされた。Ｅｐ
ｈｅｘｉｎ及びＰａｋ３は、Ｒｈｏ活性の増強にとって重要なタンパク質をコードする。
他の遺伝子は、コードアクチン核形成因子をコードするＣｏｂｌ、及び創傷治癒中のスト
レスファイバーの形成に重要であるＣｎｎ３などである（図１３Ａ１～１３Ａ３、図１３
Ｂ）。
【0087】
図１４Ｃに、細胞周期に直接関与する、Ｙａｐ５ＳＡによって差次的に制御される遺伝
子をまとめるとともに、成体の心筋細胞での細胞周期の開始について記述された、または
試みられた以前の文献をまとめる。キー（記号）は、ＲＮＡ－ｓｅｑによって決定される
、Ｙａｐ５ＳＡ心筋細胞で差次的に上方または下方に制御される遺伝子；Ｙａｐ５ＳＡク
ロマチン免疫沈降と、それに続くシーケンシングによって決定されるＹａｐ５ＳＡの直接
的な標的である遺伝子（すなわちＣｈＩＰ－ｓｅｑ（＋））；及びトランスポザーゼが接
近可能なクロマチンについてのアッセイで決定される、対照の心筋細胞ではエピジェネテ
ィックに抑制されたが、Ｙａｐ５ＳＡの存在下では抑制されない遺伝子（すなわち、ＡＴ
ＡＣ－ｓｅｑ（上方））を示す。
子をまとめるとともに、成体の心筋細胞での細胞周期の開始について記述された、または
試みられた以前の文献をまとめる。キー（記号）は、ＲＮＡ－ｓｅｑによって決定される
、Ｙａｐ５ＳＡ心筋細胞で差次的に上方または下方に制御される遺伝子；Ｙａｐ５ＳＡク
ロマチン免疫沈降と、それに続くシーケンシングによって決定されるＹａｐ５ＳＡの直接
的な標的である遺伝子（すなわちＣｈＩＰ－ｓｅｑ（＋））；及びトランスポザーゼが接
近可能なクロマチンについてのアッセイで決定される、対照の心筋細胞ではエピジェネテ
ィックに抑制されたが、Ｙａｐ５ＳＡの存在下では抑制されない遺伝子（すなわち、ＡＴ
ＡＣ－ｓｅｑ（上方））を示す。
【0088】
この知見は、分化したＣＭの増殖能力が、遠位制御要素の除去によって効果的に妨害さ
れることを明らかにしている。Ｙａｐ５ＳＡを過剰発現させることにより、Ｙａｐが有糸
分裂を介した進行を促進する遺伝的プログラムを活性化できることを確認した。重要な点
として、Ｙａｐ５ＳＡ標的遺伝子には、細胞周期遺伝子が含まれるが、生産的な細胞分裂
に重要であるエンドソーム選別タンパク質をコードする遺伝子も含まれる。
れることを明らかにしている。Ｙａｐ５ＳＡを過剰発現させることにより、Ｙａｐが有糸
分裂を介した進行を促進する遺伝的プログラムを活性化できることを確認した。重要な点
として、Ｙａｐ５ＳＡ標的遺伝子には、細胞周期遺伝子が含まれるが、生産的な細胞分裂
に重要であるエンドソーム選別タンパク質をコードする遺伝子も含まれる。
【0089】
本発明者らによって作成された動画は、タモキシフェン投与前のＹａｐ５ＳＡ ＯＥ心
臓、ならびに同じ心臓であるがタモキシフェン投与の１日後及び４日後の短軸Ｂモード心
エコー検査を示す。また、動画は、最後のタモキシフェン投与の２日後、及びその動物が
死亡する２４時間前の、Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ心臓の短軸Ｂモード心エコー検査を示してい
る。心室腔は縮小した。タモキシフェン前のＹａｐ５ＳＡ ＯＥ心臓、ならびに同じ心臓
であるがタモキシフェン２日後、及びさらに５日後の長軸Ｂモード心エコー検査。心筋層
の肥厚が明らかであった。
臓、ならびに同じ心臓であるがタモキシフェン投与の１日後及び４日後の短軸Ｂモード心
エコー検査を示す。また、動画は、最後のタモキシフェン投与の２日後、及びその動物が
死亡する２４時間前の、Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ心臓の短軸Ｂモード心エコー検査を示してい
る。心室腔は縮小した。タモキシフェン前のＹａｐ５ＳＡ ＯＥ心臓、ならびに同じ心臓
であるがタモキシフェン２日後、及びさらに５日後の長軸Ｂモード心エコー検査。心筋層
の肥厚が明らかであった。
【0090】
（補足資料）
（材料及び方法）
（実験用動物）
マウス試験は、Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅの施設内動物
管理使用委員会に従って実施された。本発明者らは、例として、Ｋｕｎｌｉａｎｇ Ｇｕ
ａｎ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号２７３７１）由来のｐＣＭＶ－ｆｌａｇ ＹＡＰ２
５ＳＡを利用して、ＣＡＧ－ｌｏｘＰ－ｅＧＦＰ－Ｓｔｏｐ－ｌｏｘＰ－ＩＲＥＳ－β
Ｇａｌ発現構築物にクローニングした。この構築物は、５つの標準的なＬａｔｓ依存性リ
ン酸化モチーフに、アラニンに変異された８つのセリン残基（Ｓ６１Ａ、Ｓ１０９Ａ、Ｓ
１２７Ａ、Ｓ１２８Ａ、Ｓ１３１Ａ、Ｓ１６３Ａ、Ｓ１６４Ａ、Ｓ３８１Ａ）をもつヒト
Ｙａｐ変異体をコードする。導入遺伝子をコードする線状ＤＮＡ（図１Ａ）をＦＶＢ／Ｎ
マウス由来受精卵母細胞へ前核注入した後、これを偽妊娠ＩＣＲマウスに移植することで
、Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ（Ｔｇ（Ｊｏｊｏ－Ｆｌａｇ：：Ｙａｐ５ＳＡ）５ＪＦＭ）マウス
を作製した。Ｃ５７Ｂ１／６のバックグラウンドが保持された、ホモ接合αＭｙＨＣ－Ｃ
ｒｅ－ＥＲＴ２マウスと単交配を実施した。対照動物はすべて同腹仔または同齢の同胞で
あった。尾部皮膚におけるｅＧＦＰ発現、及びＰＣＲジェノタイピングの両方により、視
覚的に遺伝子型を決定した（Ｆ：ＡＡＧＣＣＴＴＧＡＣＴＴＧＡＧＧＴＴＡＧ（配列番号
５）、Ｒ：ＣＧＴＣＡＴＣＧＴＣＴＴＴＧＴＡＧＴＣＣ；配列番号６）。成体実験はすべ
て、７～１０週齢の雌雄マウスで実施した。Ｃｒｅのタモキシフェン誘導は、Ｈｅａｌｌ
ｅｎらによる以前の刊行物と同様に、腹腔内注射（４０ｍｇ／ｋｇ）、４日間毎日４）で
行った。
（材料及び方法）
（実験用動物）
マウス試験は、Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅの施設内動物
管理使用委員会に従って実施された。本発明者らは、例として、Ｋｕｎｌｉａｎｇ Ｇｕ
ａｎ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号２７３７１）由来のｐＣＭＶ－ｆｌａｇ ＹＡＰ２
５ＳＡを利用して、ＣＡＧ－ｌｏｘＰ－ｅＧＦＰ－Ｓｔｏｐ－ｌｏｘＰ－ＩＲＥＳ－β
Ｇａｌ発現構築物にクローニングした。この構築物は、５つの標準的なＬａｔｓ依存性リ
ン酸化モチーフに、アラニンに変異された８つのセリン残基（Ｓ６１Ａ、Ｓ１０９Ａ、Ｓ
１２７Ａ、Ｓ１２８Ａ、Ｓ１３１Ａ、Ｓ１６３Ａ、Ｓ１６４Ａ、Ｓ３８１Ａ）をもつヒト
Ｙａｐ変異体をコードする。導入遺伝子をコードする線状ＤＮＡ（図１Ａ）をＦＶＢ／Ｎ
マウス由来受精卵母細胞へ前核注入した後、これを偽妊娠ＩＣＲマウスに移植することで
、Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ（Ｔｇ（Ｊｏｊｏ－Ｆｌａｇ：：Ｙａｐ５ＳＡ）５ＪＦＭ）マウス
を作製した。Ｃ５７Ｂ１／６のバックグラウンドが保持された、ホモ接合αＭｙＨＣ－Ｃ
ｒｅ－ＥＲＴ２マウスと単交配を実施した。対照動物はすべて同腹仔または同齢の同胞で
あった。尾部皮膚におけるｅＧＦＰ発現、及びＰＣＲジェノタイピングの両方により、視
覚的に遺伝子型を決定した（Ｆ：ＡＡＧＣＣＴＴＧＡＣＴＴＧＡＧＧＴＴＡＧ（配列番号
５）、Ｒ：ＣＧＴＣＡＴＣＧＴＣＴＴＴＧＴＡＧＴＣＣ；配列番号６）。成体実験はすべ
て、７～１０週齢の雌雄マウスで実施した。Ｃｒｅのタモキシフェン誘導は、Ｈｅａｌｌ
ｅｎらによる以前の刊行物と同様に、腹腔内注射（４０ｍｇ／ｋｇ）、４日間毎日４）で
行った。
【0091】
（超音波心エコー検査）
Ｍモード及びＢモード心エコー検査は、ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ ７７０システムの
３０ＭＨｘスキャンヘッド（ＲＭＶ７００７Ｂ）を使用して、Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅ
ｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｍｏｕｓｅ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ｃｏｒｅの確立
されたプロトコルに従って実施した。
Ｍモード及びＢモード心エコー検査は、ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ ７７０システムの
３０ＭＨｘスキャンヘッド（ＲＭＶ７００７Ｂ）を使用して、Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅ
ｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｍｏｕｓｅ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ｃｏｒｅの確立
されたプロトコルに従って実施した。
【0092】
（１細胞の形態学的及び生理学的測定）
４回目のタモキシフェン注射の翌日、他の箇所に記載されているような、コラゲナーゼ
Ａ（Ｒｏｃｈｅ）の逆行性灌流により心筋細胞を単離した３７。細胞の一部を固定し（１
０％ホルマリン、１０分）、細胞サイズを定量化した。この定量化は、プレーティングし
た細胞の静止画像を撮影して（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ８０ｉ顕微鏡、Ｎｉｋｏｎ
ＤＳＦｉ１カメラに装備）、これをｉｍａｇｅＪ（ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，
ＵＳＡ）でアウトライン処理し、ＣＭ ２Ｄプロファイル領域を定量化することにより行
った。画像を定量化する者には、遺伝子型を知らせなかった。ＩｏｎＯｐｔｉｘ Ｍｙｏ
ｃｙｔｅ Ｃａｌｃｉｕｍ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｉｔｙ Ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ
Ｓｙｓｔｅｍ（ＩｏｎＯｐｔｉｘ，Ｗｅｓｔｗｏｏｄ，ＭＡ）を使用して、生理学的ラ
イブイメージングを実施した。１．８ｍＭ Ｃａ２＋を含有するタイロード溶液（ＨＥＰ
ＥＳ緩衝処理、ｐＨ７．４）中で心筋細胞を平板培養し、（組換え後）ＧＦＰが非存在ま
たは最小であるものを選別し、ＭｙｏＰａｃｅｒ（ＩｏｎＯｐｔｉｘ，Ｗｅｓｔｗｏｏｄ
，ＭＡ）を使用して２０Ｖ／ｃｍで電界刺激した。２分間、１Ｈｚのペーシングプロトコ
ルの最後２０秒間、Ｉｏｎｏｐｔｉｘ ＩｏｎＷｉｚａｒｄソフトウェアを使用してサル
コメア周期のフーリエ変換によりサルコメアの短縮を定量化した。
４回目のタモキシフェン注射の翌日、他の箇所に記載されているような、コラゲナーゼ
Ａ（Ｒｏｃｈｅ）の逆行性灌流により心筋細胞を単離した３７。細胞の一部を固定し（１
０％ホルマリン、１０分）、細胞サイズを定量化した。この定量化は、プレーティングし
た細胞の静止画像を撮影して（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ８０ｉ顕微鏡、Ｎｉｋｏｎ
ＤＳＦｉ１カメラに装備）、これをｉｍａｇｅＪ（ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，
ＵＳＡ）でアウトライン処理し、ＣＭ ２Ｄプロファイル領域を定量化することにより行
った。画像を定量化する者には、遺伝子型を知らせなかった。ＩｏｎＯｐｔｉｘ Ｍｙｏ
ｃｙｔｅ Ｃａｌｃｉｕｍ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｉｔｙ Ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ
Ｓｙｓｔｅｍ（ＩｏｎＯｐｔｉｘ，Ｗｅｓｔｗｏｏｄ，ＭＡ）を使用して、生理学的ラ
イブイメージングを実施した。１．８ｍＭ Ｃａ２＋を含有するタイロード溶液（ＨＥＰ
ＥＳ緩衝処理、ｐＨ７．４）中で心筋細胞を平板培養し、（組換え後）ＧＦＰが非存在ま
たは最小であるものを選別し、ＭｙｏＰａｃｅｒ（ＩｏｎＯｐｔｉｘ，Ｗｅｓｔｗｏｏｄ
，ＭＡ）を使用して２０Ｖ／ｃｍで電界刺激した。２分間、１Ｈｚのペーシングプロトコ
ルの最後２０秒間、Ｉｏｎｏｐｔｉｘ ＩｏｎＷｉｚａｒｄソフトウェアを使用してサル
コメア周期のフーリエ変換によりサルコメアの短縮を定量化した。
【0093】
（光学マッピング）
マウスをイソフルランで麻酔して手術レベルの麻酔下にし、ヘパリンを腹腔内に注射（
１００単位）した後、頸部を脱臼する。次に、心臓を摘出し、酸素添加した（９５％Ｏ２
、５％ＣＯ２）冷タイロード溶液で洗浄した。次に、大動脈に２１ゲージのカニューレを
挿入した。カニューレ挿入後、大動脈圧を８０～１２０ｍｍＨｇに維持して、心臓にタイ
ロード溶液を逆行性に灌流させた。電極（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ，ＭＡ，
ＵＳＡ）を右心房の表面に配置し、ＰｏｗｅｒＬａｂ ２６Ｔ（ＡＤ Ｉｎｓｔｒｕｍｅ
ｎｔｓ，Ｓｙｄｎｅｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）によって生成されたペーシング刺激（１０
Ｈｚ、１２Ｈｚ、及び１４Ｈｚ）を与えた。収縮アーチファクトを除去するために、心臓
にブレビスタチン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂ０５６０－５ｍｇ、ＤＭＳＯ中２．
５ｍｇ／ｍｌを５０ｕｌ）を供給した。次に本発明者らは、電圧感受性色素であるジ－４
－ＡＮＥＰＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｄ－１１９９、ＤＭＳＯ中２．５ｍｇ／ｍｌを２
０ｕｌ）で心臓を灌流した。励起にはＬＥＤライトを使用した（波長：５３０ｎｍ）。Ｖ
ｍを示す蛍光発光をロングパスフィルターで処理し（＞５９０ｎｍ、５９０ＦＧ０５－５
０、Ａｎｄｏｖｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｆｉｌｔｅｒ）、Ｍｉ
ＣＡＭＯ ＣＭＯＳカメラ（ＳｃｉＭｅｄｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）で測定した。実験中、Ｌ
ａｂＣｈａｒｔを使用して体表面ＥＣＧ（ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）をモニターした
。伝導速度及び活性化マップをＲｈｙｔｈｍソフトウェアで算出した３８。
マウスをイソフルランで麻酔して手術レベルの麻酔下にし、ヘパリンを腹腔内に注射（
１００単位）した後、頸部を脱臼する。次に、心臓を摘出し、酸素添加した（９５％Ｏ２
、５％ＣＯ２）冷タイロード溶液で洗浄した。次に、大動脈に２１ゲージのカニューレを
挿入した。カニューレ挿入後、大動脈圧を８０～１２０ｍｍＨｇに維持して、心臓にタイ
ロード溶液を逆行性に灌流させた。電極（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ，ＭＡ，
ＵＳＡ）を右心房の表面に配置し、ＰｏｗｅｒＬａｂ ２６Ｔ（ＡＤ Ｉｎｓｔｒｕｍｅ
ｎｔｓ，Ｓｙｄｎｅｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）によって生成されたペーシング刺激（１０
Ｈｚ、１２Ｈｚ、及び１４Ｈｚ）を与えた。収縮アーチファクトを除去するために、心臓
にブレビスタチン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂ０５６０－５ｍｇ、ＤＭＳＯ中２．
５ｍｇ／ｍｌを５０ｕｌ）を供給した。次に本発明者らは、電圧感受性色素であるジ－４
－ＡＮＥＰＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｄ－１１９９、ＤＭＳＯ中２．５ｍｇ／ｍｌを２
０ｕｌ）で心臓を灌流した。励起にはＬＥＤライトを使用した（波長：５３０ｎｍ）。Ｖ
ｍを示す蛍光発光をロングパスフィルターで処理し（＞５９０ｎｍ、５９０ＦＧ０５－５
０、Ａｎｄｏｖｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｆｉｌｔｅｒ）、Ｍｉ
ＣＡＭＯ ＣＭＯＳカメラ（ＳｃｉＭｅｄｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）で測定した。実験中、Ｌ
ａｂＣｈａｒｔを使用して体表面ＥＣＧ（ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）をモニターした
。伝導速度及び活性化マップをＲｈｙｔｈｍソフトウェアで算出した３８。
【0094】
（組織学、免疫蛍光、凍結切片、及びＥｄＵイメージング）
新たに摘出した胚及び出生後心臓を、Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＣａｍ Ｈｒｃを搭載した
Ｚｅｉｓｓ ＳｔｅＲＥＯ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．Ｖ１２で内因性蛍光について解析し、
画像化した。固定のため、心停止用の２０ｍＭ ＫＣｌ－ＰＢＳで心臓を逆行性に灌流し
た後、１０％中性緩衝ホルマリンを灌流させ、その後パラフィンで包埋した。７ミクロン
の横断切片に切断し、帯電したポリリジンスライド（Ｄｅｎｖｉｌｌｅ ＵｌｔｒａＣｌ
ｅａｒ Ｐｌｕｓ、白色つや消し加工）にマウントした。一部はマッソンのトリクローム
染色で染色し、一部はピクロシリウスレッドで染色した。免疫組織化学は、最初に切片を
脱パラフィンし、再水和した後、抗原賦活化して実施した。切片をブロッキング（ＰＢＳ
中１０％ロバ血清、０．１％ｔｗｅｅｎ－２０）し、さらに一晩（個別、順次）染色した
後、イメージングした（一次：抗ＣＸ４３、Ｓｉｇｍａウサギ１：２００；抗β－ｇａｌ
、Ａｂｃａｍニワトリ１：２００）（二次：標準的な蛍光色素コンジュゲートＬｉｆｅ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ａｌｅｘａ抗体）。核はＤＡＰＩで染色した。ＤｅａｄＥｎ
ｄ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ ＴＵＮＥＬシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、パ
ラフィン包埋組織にＴＵＮＥＬ染色を実施した。画像を定量化する者には、遺伝子型を知
らせなかった。イメージングはすべて、Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉ
ｃｉｎｅのＯｐｔｉｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｖｉｔａｌ Ｍｉｃｏｒｓｃｏｐ
ｙ ｃｏｒｅにて、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７８０共焦点顕微鏡で実施した。
新たに摘出した胚及び出生後心臓を、Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＣａｍ Ｈｒｃを搭載した
Ｚｅｉｓｓ ＳｔｅＲＥＯ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．Ｖ１２で内因性蛍光について解析し、
画像化した。固定のため、心停止用の２０ｍＭ ＫＣｌ－ＰＢＳで心臓を逆行性に灌流し
た後、１０％中性緩衝ホルマリンを灌流させ、その後パラフィンで包埋した。７ミクロン
の横断切片に切断し、帯電したポリリジンスライド（Ｄｅｎｖｉｌｌｅ ＵｌｔｒａＣｌ
ｅａｒ Ｐｌｕｓ、白色つや消し加工）にマウントした。一部はマッソンのトリクローム
染色で染色し、一部はピクロシリウスレッドで染色した。免疫組織化学は、最初に切片を
脱パラフィンし、再水和した後、抗原賦活化して実施した。切片をブロッキング（ＰＢＳ
中１０％ロバ血清、０．１％ｔｗｅｅｎ－２０）し、さらに一晩（個別、順次）染色した
後、イメージングした（一次：抗ＣＸ４３、Ｓｉｇｍａウサギ１：２００；抗β－ｇａｌ
、Ａｂｃａｍニワトリ１：２００）（二次：標準的な蛍光色素コンジュゲートＬｉｆｅ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ａｌｅｘａ抗体）。核はＤＡＰＩで染色した。ＤｅａｄＥｎ
ｄ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ ＴＵＮＥＬシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、パ
ラフィン包埋組織にＴＵＮＥＬ染色を実施した。画像を定量化する者には、遺伝子型を知
らせなかった。イメージングはすべて、Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉ
ｃｉｎｅのＯｐｔｉｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｖｉｔａｌ Ｍｉｃｏｒｓｃｏｐ
ｙ ｃｏｒｅにて、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７８０共焦点顕微鏡で実施した。
【0095】
凍結切片を切断する際は、心臓を抽出して、３０％スクロース、２０ｍＭ ＫＣｌ－Ｐ
ＢＳで灌流し、次いでＴｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ（登録商標）Ｏ．Ｃ．Ｔ．化合物に入れた後
、ドライアイスで凍結した。次に１６ミクロンの切片を切り出し、スライドガラスにマウ
ントした。免疫蛍光染色の際は、切片を４２℃に温めてから－２０℃のアセトン中に２０
分間静置した後、ロバ血清でブロッキングすることにより抗原賦活化を実施し、次に、一
次抗体（ＰＨＨ３、ウサギＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎ１：４００；ＡｕｒｏｒａＢ、ウ
サギＡｂｃａｍ１：２００；ｃＴｎＴ、マウスＴｈｅｒｍｏ１：２００）と４℃で一晩、
続いて、二次（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ａｌｅｘａ抗ウサギ；抗マウスＶ
ｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓビオチン化１：２００、続いてＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－Ａｌｅｘａ）抗体と室温にて３０分間、インキュベート
した。核はＤＡＰＩで染色した。画像を定量化する者には、遺伝子型を知らせなかった。
イメージングはすべて、Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ ＭｅｄｉｃｉｎｅのＯｐ
ｔｉｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｖｉｔａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｃｏｒｅに
て、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７８０共焦点顕微鏡で実施した。
ＢＳで灌流し、次いでＴｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ（登録商標）Ｏ．Ｃ．Ｔ．化合物に入れた後
、ドライアイスで凍結した。次に１６ミクロンの切片を切り出し、スライドガラスにマウ
ントした。免疫蛍光染色の際は、切片を４２℃に温めてから－２０℃のアセトン中に２０
分間静置した後、ロバ血清でブロッキングすることにより抗原賦活化を実施し、次に、一
次抗体（ＰＨＨ３、ウサギＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎ１：４００；ＡｕｒｏｒａＢ、ウ
サギＡｂｃａｍ１：２００；ｃＴｎＴ、マウスＴｈｅｒｍｏ１：２００）と４℃で一晩、
続いて、二次（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ａｌｅｘａ抗ウサギ；抗マウスＶ
ｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓビオチン化１：２００、続いてＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－Ａｌｅｘａ）抗体と室温にて３０分間、インキュベート
した。核はＤＡＰＩで染色した。画像を定量化する者には、遺伝子型を知らせなかった。
イメージングはすべて、Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ ＭｅｄｉｃｉｎｅのＯｐ
ｔｉｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｖｉｔａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｃｏｒｅに
て、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７８０共焦点顕微鏡で実施した。
【0096】
免疫細胞化学法標準プロトコルを用いて実施した。簡潔には、ランゲンドルフ摘出ＣＭ
を１０％ホルマリン中で室温にて１０分間固定した。０．５％トリトン－１００で２０分
間透過処理し、２％ＦＢＳ及び２％ＢＳＡでブロッキングした後、抗体を一晩（個別、順
次）インキュベートしてからイメージングした（抗Ｙａｐ、ウサギＮｏｖｕｓ１：２００
、ｃＴｎＴ、マウスＴｈｅｒｍｏ１：２００）（二次：標準的な蛍光色素コンジュゲート
Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ａｌｅｘａ抗体）。ＥｄＵ染色は、Ｌｉｆｅ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＣｌｉｃｋ－ｉｔ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７イメージ
ングキット（Ｃ１０３４０）によるＣｌｉｃｋ－ｉｔテクノロジーを用いて実施した。個
々の心筋細胞に存在する実際のＥｄＵは、共焦点ｚスタックによって決定した。ＤＡＰＩ
で染色し、共焦点Ｚスタックにより細胞あたりの核の数を計数することにより、この単離
した心筋細胞の核数を定量化した。画像を定量化する者には、遺伝子型を知らせなかった
。イメージングはすべて、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７８０共焦点顕微鏡で実施した。
を１０％ホルマリン中で室温にて１０分間固定した。０．５％トリトン－１００で２０分
間透過処理し、２％ＦＢＳ及び２％ＢＳＡでブロッキングした後、抗体を一晩（個別、順
次）インキュベートしてからイメージングした（抗Ｙａｐ、ウサギＮｏｖｕｓ１：２００
、ｃＴｎＴ、マウスＴｈｅｒｍｏ１：２００）（二次：標準的な蛍光色素コンジュゲート
Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ａｌｅｘａ抗体）。ＥｄＵ染色は、Ｌｉｆｅ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＣｌｉｃｋ－ｉｔ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７イメージ
ングキット（Ｃ１０３４０）によるＣｌｉｃｋ－ｉｔテクノロジーを用いて実施した。個
々の心筋細胞に存在する実際のＥｄＵは、共焦点ｚスタックによって決定した。ＤＡＰＩ
で染色し、共焦点Ｚスタックにより細胞あたりの核の数を計数することにより、この単離
した心筋細胞の核数を定量化した。画像を定量化する者には、遺伝子型を知らせなかった
。イメージングはすべて、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７８０共焦点顕微鏡で実施した。
【0097】
（ウェスタンブロッティング）
ＨＥＰＥＳ、ＥＤＴＡ、トリトン緩衝液中の心臓をビーズでホモジナイズして、ウェス
タンブロッティングを実施した。次に、溶解物に還元ｔｒｉｓ系ＳＤＳ試料緩衝液（８０
μｇ／ウェル）を充填し、ＰＶＤＡ膜に転写し、Ｌｉ－Ｃｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙイメージ
ングシステムを使用してイメージングした。一次抗体：Ｎｏｖｕｓウサギ抗Ｙａｐ（１：
１０００）；Ｓｉｇｍａマウス抗Ｍ２ｆｌａｇ（１：１０００）；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅマ
ウス抗ＧＡＰＤＨ（１：５０００）；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ抗Ｐ－Ｙａｐ（Ｓ１２７－マウスホモログＳ１１２））、（１：１０００）。Ｌ
ｉ－Ｃｏｒ蛍光二次抗体：ヤギ抗ウサギＩｇＧ、ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：５０００）。
定量化はＦｉｊｉ（ＩｍａｇｅＪ）のゲル分析機能を使用して実施した。
ＨＥＰＥＳ、ＥＤＴＡ、トリトン緩衝液中の心臓をビーズでホモジナイズして、ウェス
タンブロッティングを実施した。次に、溶解物に還元ｔｒｉｓ系ＳＤＳ試料緩衝液（８０
μｇ／ウェル）を充填し、ＰＶＤＡ膜に転写し、Ｌｉ－Ｃｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙイメージ
ングシステムを使用してイメージングした。一次抗体：Ｎｏｖｕｓウサギ抗Ｙａｐ（１：
１０００）；Ｓｉｇｍａマウス抗Ｍ２ｆｌａｇ（１：１０００）；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅマ
ウス抗ＧＡＰＤＨ（１：５０００）；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ抗Ｐ－Ｙａｐ（Ｓ１２７－マウスホモログＳ１１２））、（１：１０００）。Ｌ
ｉ－Ｃｏｒ蛍光二次抗体：ヤギ抗ウサギＩｇＧ、ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：５０００）。
定量化はＦｉｊｉ（ＩｍａｇｅＪ）のゲル分析機能を使用して実施した。
【0098】
（ｉｎ ｖｉｖｏ電気生理学）
以前に記載されたように３９、Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ誘導プロトコルにわたる５日間、連
続して心電図を記録した。歩行可能なマウスの腹腔に遠隔測定送信機（Ｄａｔａ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を埋め込んだ。ｓ．ｃ．電極をリード線ＩＩ
配置に取り付け、バージョン４．１のＤａｔａｑｕｅｓｔソフトウェアを使用して記録し
た。Ｔ波測定は、曲線下面積を算出することにより実施した。
以前に記載されたように３９、Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ誘導プロトコルにわたる５日間、連
続して心電図を記録した。歩行可能なマウスの腹腔に遠隔測定送信機（Ｄａｔａ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を埋め込んだ。ｓ．ｃ．電極をリード線ＩＩ
配置に取り付け、バージョン４．１のＤａｔａｑｕｅｓｔソフトウェアを使用して記録し
た。Ｔ波測定は、曲線下面積を算出することにより実施した。
【0099】
（ＬＶサイズ及び筋細胞の総数の定量化）
左心室の心筋細胞の総数を決定するにあたり、本発明者らは、最初に心臓を切除し、そ
れをＫＣｌ、続いて１０％ホルマリンでの逆行性灌流、さらに１０％ホルマリンで滴下固
定して、拡張期に固定した。心臓をパラフィンで包埋し、心尖から大動脈へ７ミクロン刻
みで切片化した。次に本発明者らは、顕微鏡スライド上のＬＶ心筋層の面積を組織深度の
関数としてプロットし、さらに次いでその曲線下面積を積分することにより、各心臓の左
心室の容積を算出した。その容積から、１．０５３ｇ／ｍＬの筋肉密度を用いて容積を質
量に変換することにより、ＬＶ重量と体重との比を算出した４０。次に、さまざまな組織
深度の７ミクロン切片を抗ＰＣＭ１、ＤＡＰＩ、及びＷＧＡで染色して、ＣＭ核、すべて
の核、及び細胞境界を標識した。共焦点顕微鏡を使用して各切片の厚さ全体にわたり画像
化した後、本発明者らがイメージングフレーム内のＰＣＭ１（＋）核の数を計数した。フ
レームの下端と左端の部分核は計数しなかったが、上端と右端の部分核は計数した。Ｚス
タックは、異なる組織深度から得た切片にわたってランダムに取得した（４０Ｚスタック
／心臓）。ＰＣＭ１とＤＡＰＩの両方が陽性であり、ＰＣＭ１がＤＡＰＩを包囲している
場合のみ、核を計数した（図３Ｆ）。ＣＭの総数を検出するため、容積あたりの計数され
た核の数から、核形成密度を算出し、さらにこれを心筋層の全体容積に外挿し、次に、他
の箇所に記載するように、各遺伝子型の筋細胞の平均核形成で補正した（対照：２．０４
核／ＣＭ；Ｙａｐ５ＳＡ：１．９２核／ＣＭ、図３Ｇ）４１。画像を定量化する者には、
遺伝子型を知らせなかった。
左心室の心筋細胞の総数を決定するにあたり、本発明者らは、最初に心臓を切除し、そ
れをＫＣｌ、続いて１０％ホルマリンでの逆行性灌流、さらに１０％ホルマリンで滴下固
定して、拡張期に固定した。心臓をパラフィンで包埋し、心尖から大動脈へ７ミクロン刻
みで切片化した。次に本発明者らは、顕微鏡スライド上のＬＶ心筋層の面積を組織深度の
関数としてプロットし、さらに次いでその曲線下面積を積分することにより、各心臓の左
心室の容積を算出した。その容積から、１．０５３ｇ／ｍＬの筋肉密度を用いて容積を質
量に変換することにより、ＬＶ重量と体重との比を算出した４０。次に、さまざまな組織
深度の７ミクロン切片を抗ＰＣＭ１、ＤＡＰＩ、及びＷＧＡで染色して、ＣＭ核、すべて
の核、及び細胞境界を標識した。共焦点顕微鏡を使用して各切片の厚さ全体にわたり画像
化した後、本発明者らがイメージングフレーム内のＰＣＭ１（＋）核の数を計数した。フ
レームの下端と左端の部分核は計数しなかったが、上端と右端の部分核は計数した。Ｚス
タックは、異なる組織深度から得た切片にわたってランダムに取得した（４０Ｚスタック
／心臓）。ＰＣＭ１とＤＡＰＩの両方が陽性であり、ＰＣＭ１がＤＡＰＩを包囲している
場合のみ、核を計数した（図３Ｆ）。ＣＭの総数を検出するため、容積あたりの計数され
た核の数から、核形成密度を算出し、さらにこれを心筋層の全体容積に外挿し、次に、他
の箇所に記載するように、各遺伝子型の筋細胞の平均核形成で補正した（対照：２．０４
核／ＣＭ；Ｙａｐ５ＳＡ：１．９２核／ＣＭ、図３Ｇ）４１。画像を定量化する者には、
遺伝子型を知らせなかった。
【0100】
（フローサイトメトリーによるＤＮＡ含量分析）
心筋細胞をランゲンドルフ灌流により単離した後、１０％ホルマリンで固定した。以前
に記載されたように核を単離した４２。細胞を懸濁し、ＨＢ緩衝液（ｐＨ７．４ １５ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、０．３４Ｍスクロース、１５ｍＭ ＮａＣｌ、６０ｍＭ ＫＣｌ
、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２ｍＭ ＥＧＴＡ、プロテイナーゼ阻害剤を含む）中で、
３０回ダウンス型でホモジナイズした。次に、ＰＢＴＢ緩衝液（０．１％Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ－１００、ＰＢＳ中５％ＢＳＡ）中で、１８－Ｇ針により１５回穿刺して核を放出させ
た。ＣＭ特異的核を標識するため、核をＰＣＭ１抗体（１：１０００、Ｓｉｇｍａ；二次
：Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ａｌｅｘａ抗ウサギ５４６）とインキュベート
し、ＤＮＡをＤＡＰＩで標識した。次に、核をセルソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃ
ｅｓ ＦＡＣＳＡＲＩＡ ＩＩ ＳＯＲＰ）に通し、ＰＣＭ１（＋）心筋細胞核のＤＮＡ
含量をＤＡＰＩ蛍光強度として定量化し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａ
ｒ）を使用して細胞周期段階について分析した。
心筋細胞をランゲンドルフ灌流により単離した後、１０％ホルマリンで固定した。以前
に記載されたように核を単離した４２。細胞を懸濁し、ＨＢ緩衝液（ｐＨ７．４ １５ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、０．３４Ｍスクロース、１５ｍＭ ＮａＣｌ、６０ｍＭ ＫＣｌ
、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２ｍＭ ＥＧＴＡ、プロテイナーゼ阻害剤を含む）中で、
３０回ダウンス型でホモジナイズした。次に、ＰＢＴＢ緩衝液（０．１％Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ－１００、ＰＢＳ中５％ＢＳＡ）中で、１８－Ｇ針により１５回穿刺して核を放出させ
た。ＣＭ特異的核を標識するため、核をＰＣＭ１抗体（１：１０００、Ｓｉｇｍａ；二次
：Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ａｌｅｘａ抗ウサギ５４６）とインキュベート
し、ＤＮＡをＤＡＰＩで標識した。次に、核をセルソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃ
ｅｓ ＦＡＣＳＡＲＩＡ ＩＩ ＳＯＲＰ）に通し、ＰＣＭ１（＋）心筋細胞核のＤＮＡ
含量をＤＡＰＩ蛍光強度として定量化し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａ
ｒ）を使用して細胞周期段階について分析した。
【0101】
（ＬａｃＺレポーター倍加時間分析）
心臓を摘出し、２０ｍＭ ＫＣｌ中２０％グリセロールで灌流し、Ｏ．Ｃ．Ｔ．化合物
に包埋し、ドライアイスで凍結した。次に、それらを１６μｍの切片に切断し、ＰＢＳ中
０．０２％グルタルアルデヒドで１５分間固定した。ｘ－ｇａｌとの反応を３７℃で４８
時間進行させた。
心臓を摘出し、２０ｍＭ ＫＣｌ中２０％グリセロールで灌流し、Ｏ．Ｃ．Ｔ．化合物
に包埋し、ドライアイスで凍結した。次に、それらを１６μｍの切片に切断し、ＰＢＳ中
０．０２％グルタルアルデヒドで１５分間固定した。ｘ－ｇａｌとの反応を３７℃で４８
時間進行させた。
【0102】
細胞分裂により生じる細胞数は、Ｎ（ｔ）＝Ｎ０２２ｔ／ｔＤで表すことができる。こ
こで、Ｎ（ｔ）は所与の時点での細胞数であり、Ｎ０は開始時の細胞数であり、ｔはＮ０
からＮ（ｔ）に移行するまでに要した時間量であり、ｔＤは倍加時間である。１回の低用
量（１０μｇ／ｇ）タモキシフェンの注射を実施した後、Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥマウスを時
間依存的に屠殺した。次に、本発明者らは、心臓を切片化し、切片あたりのＬａｃＺ（＋
）細胞の数を定量化した。次に、その合計を切片の面積で除算した。次に、本発明者らは
、これらの値のｌｏｇ２をプロットし、
で表される線形関数にデータを当てはめた。Ｎ０及びＮ（ｔ）のデータを挿入して整列し
直し、ｔＤを求めることにより、倍加時間（ｔＤ）を決定した。イメージングは、Ｎｉｋ
ｏｎ ＤＳＦｉ１カメラを装備したＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ８０ｉ顕微鏡で実施し
た。画像を定量化する者には、どの時点かを知らせなかった。
こで、Ｎ（ｔ）は所与の時点での細胞数であり、Ｎ０は開始時の細胞数であり、ｔはＮ０
からＮ（ｔ）に移行するまでに要した時間量であり、ｔＤは倍加時間である。１回の低用
量（１０μｇ／ｇ）タモキシフェンの注射を実施した後、Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥマウスを時
間依存的に屠殺した。次に、本発明者らは、心臓を切片化し、切片あたりのＬａｃＺ（＋
）細胞の数を定量化した。次に、その合計を切片の面積で除算した。次に、本発明者らは
、これらの値のｌｏｇ２をプロットし、
【数1】
直し、ｔＤを求めることにより、倍加時間（ｔＤ）を決定した。イメージングは、Ｎｉｋ
ｏｎ ＤＳＦｉ１カメラを装備したＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ８０ｉ顕微鏡で実施し
た。画像を定量化する者には、どの時点かを知らせなかった。
【0103】
（ＡＴＡＣ－ｓｅｑ及びＲＮＡ－ｓｅｑのためのＰＣＭ１の核単離：）
核単離は、以下の変更を加え、Ｍｏ ｅｔ ａｌ．に従って実施した４３。簡潔には、
氷上で新鮮な心臓組織を採取し、直ちにＢｉｏｇｅｎ Ｓｅｒｉｅｓ ＰＲＯ２００（Ｐ
ＲＯ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でホモジナイズした後、ダウンス型でホモジナイズした。
オプティプレップ密度勾配培地（Ｓｉｇｍａ）を用いた密度勾配遠心分離により、核を単
離した。３０～４０％の界面から単離された核はすべて、Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｇ Ｄｙｎａ
ｂｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で事前に清澄化した。次に、核を抗
ＰＣＭ１（Ｓｉｇｍａ、ＨＰＡ０２３３７０）抗体及びＰｒｏｔｅｉｎ－Ｇ Ｄｙｎａｂ
ｅａｄｓと免疫沈降し、心筋細胞核を濃縮した２１。
核単離は、以下の変更を加え、Ｍｏ ｅｔ ａｌ．に従って実施した４３。簡潔には、
氷上で新鮮な心臓組織を採取し、直ちにＢｉｏｇｅｎ Ｓｅｒｉｅｓ ＰＲＯ２００（Ｐ
ＲＯ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でホモジナイズした後、ダウンス型でホモジナイズした。
オプティプレップ密度勾配培地（Ｓｉｇｍａ）を用いた密度勾配遠心分離により、核を単
離した。３０～４０％の界面から単離された核はすべて、Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｇ Ｄｙｎａ
ｂｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で事前に清澄化した。次に、核を抗
ＰＣＭ１（Ｓｉｇｍａ、ＨＰＡ０２３３７０）抗体及びＰｒｏｔｅｉｎ－Ｇ Ｄｙｎａｂ
ｅａｄｓと免疫沈降し、心筋細胞核を濃縮した２１。
【0104】
（ＡＴＡＣ－ｓｅｑ）
約５０，０００個のビーズに結合したＰＣＭ１＋核をＡＴＡＣ－ｓｅｑのインプットと
して使用した。ＡＴＡＣ－ｓｅｑライブラリーを（Ｂｕｅｎｒｏｓｔｒｏ ｅｔ ａｌ，
２０１３）２４に従って作成した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｅｘｔｓｅｑ装置（ＤＮＡ Ｌ
ｉｎｋ）でペアエンドの２ｘ７５ｂｐシーケンシングを実施した。デフォルトのペアエン
ド設定でＢｏｗｔｉｅ２を使用して、リードをマウスゲノム（ｍｍ１０）にマッピングし
た４４。次に、核以外のすべてのリード、及び不適切にペアになったリードを破棄した。
次に、重複したリードをｐｉｃａｒｄ ＭａｒｋＤｕｐｌｉｃａｔｅｓで除去した。ＭＡ
ＣＳ２（ｃａｌｌｐｅａｋ－ｎｏｍｏｄｅｌ－ｂｒｏａｄ）でピークコールを実行した。
ブラックリスト領域をｍｍ９からマウスゲノムｍｍ１０へ変換し、シーケンシング品質の
低いピーク（ｑ３０超が必要）とともにこれを除去した。ｂｅｄｔｏｏｌｓ（ｍｕｌｔｉ
ｃｏｖモジュール）を使用して、包括的なピークファイル（Ｙａｐ５ＳＡ及び対照の複製
物がマージされたもの）から条件ごとにリードを計数した４５。ＡＴＡＣ－ｓｅｑデータ
セットの分位点標準化をＣＱＮ４６で実施し、オフセットをＤＥＳｅｑ２に供給して、ア
クセシビリティ差を定量化した４７。ヌクレオソームのコールは、ＮｕｃｌｅｏＡＴＡＣ
２９で実施した。モチーフ濃縮分析は、Ｈｏｍｅｒ（ｆｉｎｄＭｏｔｉｆｓＧｅｎｏｍｅ
．ｐｌ）を使用して実施した。
約５０，０００個のビーズに結合したＰＣＭ１＋核をＡＴＡＣ－ｓｅｑのインプットと
して使用した。ＡＴＡＣ－ｓｅｑライブラリーを（Ｂｕｅｎｒｏｓｔｒｏ ｅｔ ａｌ，
２０１３）２４に従って作成した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｅｘｔｓｅｑ装置（ＤＮＡ Ｌ
ｉｎｋ）でペアエンドの２ｘ７５ｂｐシーケンシングを実施した。デフォルトのペアエン
ド設定でＢｏｗｔｉｅ２を使用して、リードをマウスゲノム（ｍｍ１０）にマッピングし
た４４。次に、核以外のすべてのリード、及び不適切にペアになったリードを破棄した。
次に、重複したリードをｐｉｃａｒｄ ＭａｒｋＤｕｐｌｉｃａｔｅｓで除去した。ＭＡ
ＣＳ２（ｃａｌｌｐｅａｋ－ｎｏｍｏｄｅｌ－ｂｒｏａｄ）でピークコールを実行した。
ブラックリスト領域をｍｍ９からマウスゲノムｍｍ１０へ変換し、シーケンシング品質の
低いピーク（ｑ３０超が必要）とともにこれを除去した。ｂｅｄｔｏｏｌｓ（ｍｕｌｔｉ
ｃｏｖモジュール）を使用して、包括的なピークファイル（Ｙａｐ５ＳＡ及び対照の複製
物がマージされたもの）から条件ごとにリードを計数した４５。ＡＴＡＣ－ｓｅｑデータ
セットの分位点標準化をＣＱＮ４６で実施し、オフセットをＤＥＳｅｑ２に供給して、ア
クセシビリティ差を定量化した４７。ヌクレオソームのコールは、ＮｕｃｌｅｏＡＴＡＣ
２９で実施した。モチーフ濃縮分析は、Ｈｏｍｅｒ（ｆｉｎｄＭｏｔｉｆｓＧｅｎｏｍｅ
．ｐｌ）を使用して実施した。
【0105】
（ＲＮＡ－ｓｅｑ）
ＲＮＥａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｃｒｏキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ビーズに結
合したＰＣＭ１＋核からＲＮＡを回収した。カスタムのＹ字型アダプターを備えたＳｔｒ
ａｎｄｅｄ ＲＮＡ－ｓｅｑ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ Ｒｉｂｏ Ｅｒａｓｅ（Ｋａｐａ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で核ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーを構築した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ
Ｎｅｘｔｓｅｑ装置（ＤＮＡ Ｌｉｎｋ）でＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーに対してペアエ
ンドの２ｘ７５ｂｐシーケンシングを実施した。ＳＴＡＲ４８を使用して、最初にリード
をマウスゲノム（ｍｍ１０）にマッピングした。次に、ＤＥＳｅｑ２４７を用いて発現差
解析を実施した。Ｍｅｔａｓｃａｐｅを使用して遺伝子オントロジーを実施した。ｇ：Ｐ
ｒｏｆｉｌｅｒ４９、５０を使用してｄｅ ｎｏｖｏ経路分析を実施した。
ＲＮＥａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｃｒｏキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ビーズに結
合したＰＣＭ１＋核からＲＮＡを回収した。カスタムのＹ字型アダプターを備えたＳｔｒ
ａｎｄｅｄ ＲＮＡ－ｓｅｑ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ Ｒｉｂｏ Ｅｒａｓｅ（Ｋａｐａ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で核ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーを構築した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ
Ｎｅｘｔｓｅｑ装置（ＤＮＡ Ｌｉｎｋ）でＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーに対してペアエ
ンドの２ｘ７５ｂｐシーケンシングを実施した。ＳＴＡＲ４８を使用して、最初にリード
をマウスゲノム（ｍｍ１０）にマッピングした。次に、ＤＥＳｅｑ２４７を用いて発現差
解析を実施した。Ｍｅｔａｓｃａｐｅを使用して遺伝子オントロジーを実施した。ｇ：Ｐ
ｒｏｆｉｌｅｒ４９、５０を使用してｄｅ ｎｏｖｏ経路分析を実施した。
【0106】
Ｈ３Ｋ２７ＡｃのＣｈＩＰ－ｓｅｑ
公開データ：ＧＳＭ１２６４３７０、ＧＳＭ１２６４３７２、ＧＳＭ１２６４３７２、
及びＧＳＭ１２６４３７２を、ｂｏｗｔｉｅ２のデフォルトパラメーターを用いてマウス
ゲノム（ビルドｍｍ１０）にマッピングした。マッピング後、心臓Ｅ１１．５ Ｈ３Ｋ２
７Ａｃの複製物ＧＳＭ１２６４３７０及びＧＳＭ１２６４３７２をマージして分析した。
遺伝子トラックはＵＣＳＣゲノムブラウザーを使用して表示した。
公開データ：ＧＳＭ１２６４３７０、ＧＳＭ１２６４３７２、ＧＳＭ１２６４３７２、
及びＧＳＭ１２６４３７２を、ｂｏｗｔｉｅ２のデフォルトパラメーターを用いてマウス
ゲノム（ビルドｍｍ１０）にマッピングした。マッピング後、心臓Ｅ１１．５ Ｈ３Ｋ２
７Ａｃの複製物ＧＳＭ１２６４３７０及びＧＳＭ１２６４３７２をマージして分析した。
遺伝子トラックはＵＣＳＣゲノムブラウザーを使用して表示した。
【0107】
ＹａｐのＣｈＩＰ－ｓｅｑ
心室を摘出して冷ＤＰＢＳに入れ、血液を除去した後、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１０
０を補充したＰＢＳ中で細砕した。次に、ＢｉｏＧｅｎ Ｐｒｏ２００及び５ｍｍジェネ
レーターで迅速にホモジナイズした。ローテーター上で１％ホルムアルデヒド中にて室温
で１０分間架橋させ、１５０ｍＭグリシンにより室温で１０分間クエンチした。細胞をペ
レット化し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－ＰＢＳで２回すすいだ。次に、５ｍＬの細胞溶解緩
衝液（５ｎＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０
％グリセロール、０．５％ＮＰ－４０、０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、０．５％Ｉ
ｇｅｐａｌ ＣＡ－６３０、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｃＯｍｐｌｅｔｅ ＥＤＴＡ－Ｆｒ
ｅｅ Ｒｏｃｈｅプロテアーゼ阻害剤）中にて、氷上で２０分間インキュベートすること
により溶解させた後、ダウンス型でホモジナイズした。溶解物をペレット化し、細胞溶解
緩衝液に再懸濁し、超音波処理した。次に、本発明者らは細胞及び核を４℃で１０分間、
２ｋＧでペレット化した後、６００ｕＬ核溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、０．５ｍＭ ＥＧＴＡ、０．３％ＳＤＳ、完全ＥＤＴＡフリーＲｏｃｈｅプロテ
アーゼ阻害剤）に再懸濁し、超音波処理した。１５ｕｇにせん断したクロマチンを使用し
て、Ｆｌａｇ抗体（Ｓｉｇｍａ、Ｆ１８０４）またはＩｇＧ（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ １２－
３７１）及びプロテインＧ磁気ビーズ（Ｐｅｉｒｃｅ）と、ローテーター上で、４℃で一
晩ＣｈＩＰ処理した。ローテーター上で、４℃で５分間ビーズを洗浄し、洗浄して、脱架
橋し、ＤＮＡを精製した。Ｋａｐｐａ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉ
ｔ（Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ、ＫＫ８３０１）を使用して、シーケンシングライブラリー
を作成した。Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｎで配列決定したＹＡＰ５ＳＡ－ＦＬ
ＡＧ ＣｈＩＰ－ｓｅｑライブラリーを、Ｔｏｒｒｅｎｔ ＳｕｉｔｅアライナーＴｍａ
ｐ（０．２．３）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してｍｍ１０マウスゲ
ノムアセンブリにマッピングした。３つの生物学的複製を実施し、一意にマッピングされ
たリードのみを保持した。複合ＹＡＰ５ＳＡ ＣｈＩＰ－ｓｅｑデータセットからピーク
をコールし、ＨＯＭＥＲ（ｆｉｎｄＰｅａｋｓ及びａｎｎｏｔａｔｅＰｅａｋｓ．ｐｌ）
を用いてアノテーションした。遺伝子トラックはＵＣＳＣゲノムブラウザーを使用して表
示した。
心室を摘出して冷ＤＰＢＳに入れ、血液を除去した後、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１０
０を補充したＰＢＳ中で細砕した。次に、ＢｉｏＧｅｎ Ｐｒｏ２００及び５ｍｍジェネ
レーターで迅速にホモジナイズした。ローテーター上で１％ホルムアルデヒド中にて室温
で１０分間架橋させ、１５０ｍＭグリシンにより室温で１０分間クエンチした。細胞をペ
レット化し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－ＰＢＳで２回すすいだ。次に、５ｍＬの細胞溶解緩
衝液（５ｎＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０
％グリセロール、０．５％ＮＰ－４０、０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、０．５％Ｉ
ｇｅｐａｌ ＣＡ－６３０、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｃＯｍｐｌｅｔｅ ＥＤＴＡ－Ｆｒ
ｅｅ Ｒｏｃｈｅプロテアーゼ阻害剤）中にて、氷上で２０分間インキュベートすること
により溶解させた後、ダウンス型でホモジナイズした。溶解物をペレット化し、細胞溶解
緩衝液に再懸濁し、超音波処理した。次に、本発明者らは細胞及び核を４℃で１０分間、
２ｋＧでペレット化した後、６００ｕＬ核溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、０．５ｍＭ ＥＧＴＡ、０．３％ＳＤＳ、完全ＥＤＴＡフリーＲｏｃｈｅプロテ
アーゼ阻害剤）に再懸濁し、超音波処理した。１５ｕｇにせん断したクロマチンを使用し
て、Ｆｌａｇ抗体（Ｓｉｇｍａ、Ｆ１８０４）またはＩｇＧ（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ １２－
３７１）及びプロテインＧ磁気ビーズ（Ｐｅｉｒｃｅ）と、ローテーター上で、４℃で一
晩ＣｈＩＰ処理した。ローテーター上で、４℃で５分間ビーズを洗浄し、洗浄して、脱架
橋し、ＤＮＡを精製した。Ｋａｐｐａ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉ
ｔ（Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ、ＫＫ８３０１）を使用して、シーケンシングライブラリー
を作成した。Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｎで配列決定したＹＡＰ５ＳＡ－ＦＬ
ＡＧ ＣｈＩＰ－ｓｅｑライブラリーを、Ｔｏｒｒｅｎｔ ＳｕｉｔｅアライナーＴｍａ
ｐ（０．２．３）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してｍｍ１０マウスゲ
ノムアセンブリにマッピングした。３つの生物学的複製を実施し、一意にマッピングされ
たリードのみを保持した。複合ＹＡＰ５ＳＡ ＣｈＩＰ－ｓｅｑデータセットからピーク
をコールし、ＨＯＭＥＲ（ｆｉｎｄＰｅａｋｓ及びａｎｎｏｔａｔｅＰｅａｋｓ．ｐｌ）
を用いてアノテーションした。遺伝子トラックはＵＣＳＣゲノムブラウザーを使用して表
示した。
【0108】
（実施例２）
ＹＡＰＫ２６５Ｒの安定性
本発明者らは、Ｙａｐ Ｋ２６５Ｒ（Ｙａｐの２６５位アミノ酸のリジンがアルギニン
へ変異したもの）ホモ接合突然変異を有する２つのＰ１９細胞株（番号１１及び番号１３
）を作製した。ＹａｐＫ２６５Ｒ突然変異体の半減期を確認するために、６ウェルプレー
ト中のＷＴ Ｐ１９細胞及びＰ１９細胞にＹａｐ Ｋ２６５Ｒ突然変異体（番号１３）を
播種した。翌日、細胞の集密度が約６０％～７０％に達したら、２０ｕｇ／ｍｌシクロヘ
キシミド（ＣＨＸ）で２時間、４時間、または６時間、細胞を処理した（ＤＭＳＯで処理
した細胞は０時間とする）。処理後、細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、次いで０．５％Ｎ
Ｐ４０溶解緩衝液１００ｕｌ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０
．５％ＮＰ４０、ならびにプロテアーゼ阻害剤及びリン酸化阻害剤）で回収した。Ｙａｐ
、Ｓ１２７リン酸化を伴うＹａｐ（ｐ－Ｙａｐ）、及びβ－カテニンの発現を試験するた
めに、細胞溶解物をウェスタンブロッティングで分析した。ＧＡＰＤＨの発現を内部対照
として利用した（図１５Ａ）。ＣＨＸはタンパク質合成を阻害することができる。これは
、処理後に新生タンパク質が補充されず、Ｙａｐ、ｐ－Ｙａｐ、及びβ－カテニンのタン
パク質レベルが経時的に減少するためである。ＷＴ Ｙａｐと比較して、ＹａｐＫ２６５
Ｒはより急速に減少した。これはＫ２６５Ｒ突然変異をもつＹａｐの安定性が低いことを
意味する（図１５Ａ）。ｐ－Ｙａｐ及びβ－カテニンもまた、ＹａｐＫ２６５Ｒ突然変異
体Ｐ１９細胞では安定性が低い（図１５Ａ）。ＣＨＸ処理しない場合、Ｙａｐ及びｐ－Ｙ
ａｐの基底レベルはＷＴ Ｐ１９細胞と比較してＹａｐＫ２６５Ｒ突然変異体Ｐ１９細胞
でわずかに低い（図１Ｂ）。興味深いことに、β－カテニンの発現は、ＹａｐＫ２６５Ｒ
突然変異をもつＰ１９細胞で増加した（図１Ａ及び図１Ｂ）。
ＹＡＰＫ２６５Ｒの安定性
本発明者らは、Ｙａｐ Ｋ２６５Ｒ（Ｙａｐの２６５位アミノ酸のリジンがアルギニン
へ変異したもの）ホモ接合突然変異を有する２つのＰ１９細胞株（番号１１及び番号１３
）を作製した。ＹａｐＫ２６５Ｒ突然変異体の半減期を確認するために、６ウェルプレー
ト中のＷＴ Ｐ１９細胞及びＰ１９細胞にＹａｐ Ｋ２６５Ｒ突然変異体（番号１３）を
播種した。翌日、細胞の集密度が約６０％～７０％に達したら、２０ｕｇ／ｍｌシクロヘ
キシミド（ＣＨＸ）で２時間、４時間、または６時間、細胞を処理した（ＤＭＳＯで処理
した細胞は０時間とする）。処理後、細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、次いで０．５％Ｎ
Ｐ４０溶解緩衝液１００ｕｌ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０
．５％ＮＰ４０、ならびにプロテアーゼ阻害剤及びリン酸化阻害剤）で回収した。Ｙａｐ
、Ｓ１２７リン酸化を伴うＹａｐ（ｐ－Ｙａｐ）、及びβ－カテニンの発現を試験するた
めに、細胞溶解物をウェスタンブロッティングで分析した。ＧＡＰＤＨの発現を内部対照
として利用した（図１５Ａ）。ＣＨＸはタンパク質合成を阻害することができる。これは
、処理後に新生タンパク質が補充されず、Ｙａｐ、ｐ－Ｙａｐ、及びβ－カテニンのタン
パク質レベルが経時的に減少するためである。ＷＴ Ｙａｐと比較して、ＹａｐＫ２６５
Ｒはより急速に減少した。これはＫ２６５Ｒ突然変異をもつＹａｐの安定性が低いことを
意味する（図１５Ａ）。ｐ－Ｙａｐ及びβ－カテニンもまた、ＹａｐＫ２６５Ｒ突然変異
体Ｐ１９細胞では安定性が低い（図１５Ａ）。ＣＨＸ処理しない場合、Ｙａｐ及びｐ－Ｙ
ａｐの基底レベルはＷＴ Ｐ１９細胞と比較してＹａｐＫ２６５Ｒ突然変異体Ｐ１９細胞
でわずかに低い（図１Ｂ）。興味深いことに、β－カテニンの発現は、ＹａｐＫ２６５Ｒ
突然変異をもつＰ１９細胞で増加した（図１Ａ及び図１Ｂ）。
【0109】
これらの試験を２回繰り返し、一貫した結果を得た（図１６及び図１７）。統計結果を
図１７Ｂに示す。Ｙａｐのタンパク質の代謝回転率を試験するために、プロテアソーム阻
害剤であるＭｇ１３２、２０ｕｍ／ｍｌで細胞を処理した。分解ができないため、タンパ
ク質レベルは経時的に増加した。ＹａｐＫ２６５Ｒ突然変異体Ｐ１９細胞でのＹａｐタン
パク質の蓄積の増加は、ＷＴ Ｙａｐと比較してＹａｐＫ２６５Ｒの代謝回転率が高いこ
とを示している。言い換えれば、ＹａｐＫ２６５ＲはＷＴ Ｙａｐよりも安定性が低い（
図１８Ａ及び図１８Ｂ）。しかしながら、β－カテニンの代謝回転率はＹａｐＫ２６５Ｒ
突然変異体細胞では変化しなかった（図１８Ａ及び図１８Ｃ）。
図１７Ｂに示す。Ｙａｐのタンパク質の代謝回転率を試験するために、プロテアソーム阻
害剤であるＭｇ１３２、２０ｕｍ／ｍｌで細胞を処理した。分解ができないため、タンパ
ク質レベルは経時的に増加した。ＹａｐＫ２６５Ｒ突然変異体Ｐ１９細胞でのＹａｐタン
パク質の蓄積の増加は、ＷＴ Ｙａｐと比較してＹａｐＫ２６５Ｒの代謝回転率が高いこ
とを示している。言い換えれば、ＹａｐＫ２６５ＲはＷＴ Ｙａｐよりも安定性が低い（
図１８Ａ及び図１８Ｂ）。しかしながら、β－カテニンの代謝回転率はＹａｐＫ２６５Ｒ
突然変異体細胞では変化しなかった（図１８Ａ及び図１８Ｃ）。
【0110】
Ｙａｐは、核内のＤＮＡ結合パートナーと協働して遺伝子発現を制御する転写補助因子
である。ＹａｐＫ２６５Ｒ突然変異体の核局在化を試験するために、Ｐ１９細胞を溶解し
、核画分及びサイトゾル画分を回収してウェスタンブロット分析を行った。Ｙａｐタンパ
ク質の量は、ＹａｐＫ２６５Ｒ突然変異体細胞の核画分では少ないが、サイトゾル画分で
は変化しないことから、ＹａｐＫ２６５Ｒの核局在化が少ないことが示唆される（図１９
）。この実験を合計３つの複製物で２回実施した（図１９Ａ及び図１９Ｂ）。統計結果を
図１９Ｃ及び図１９Ｄに示す。
である。ＹａｐＫ２６５Ｒ突然変異体の核局在化を試験するために、Ｐ１９細胞を溶解し
、核画分及びサイトゾル画分を回収してウェスタンブロット分析を行った。Ｙａｐタンパ
ク質の量は、ＹａｐＫ２６５Ｒ突然変異体細胞の核画分では少ないが、サイトゾル画分で
は変化しないことから、ＹａｐＫ２６５Ｒの核局在化が少ないことが示唆される（図１９
）。この実験を合計３つの複製物で２回実施した（図１９Ａ及び図１９Ｂ）。統計結果を
図１９Ｃ及び図１９Ｄに示す。
【0111】
抗体の例：Ｙａｐ（１：１０００、Ｎｏｖａｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ＮＢ１１Ｏ
－５８３５８）；β－カテニン（１：１０００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ－７９６３
）；ｐ－Ｙａｐ（Ｓ１２７）（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃４９１
１）；ｐ－Ｙａｐ（Ｓ３８１）（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃１３
６１９）；ＧＡＰＤＨ（１：３０００、Ａｂｅａｍ、ａｂ９４８５）；ＨＤＡＣ２（１：
５０００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＰＡ１－８６１）
－５８３５８）；β－カテニン（１：１０００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ－７９６３
）；ｐ－Ｙａｐ（Ｓ１２７）（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃４９１
１）；ｐ－Ｙａｐ（Ｓ３８１）（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃１３
６１９）；ＧＡＰＤＨ（１：３０００、Ａｂｅａｍ、ａｂ９４８５）；ＨＤＡＣ２（１：
５０００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＰＡ１－８６１）
【0112】
（参考文献）
本明細書で引用するすべての特許、特許出願、及び刊行物は、それらの全体が参照によ
り本明細書に組み込まれる。
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13 Hwang SJI,P.H.,Park K.Gastric retentive drug-delivery systems.Critical revi
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14 Mitsuko Takenaga*,Y.S.,Yasutaka Azechi,Akira Ochiai,Yasuo Kosaka,& Rie Igar
ashi,Y.M.Microparticle resins as a potential nasal drug delivery system for insu
lin.Journal of controlled release 52,81-87(1996).
15 Sohal,D.S.et al.Temporally regulated and tissue-specific gene manipulations
in the adult and embryonic heart using a tamoxifen-inducible Cre protein.Circul
ation research 89,20-25(2001).
16 Bersell,K.et al.Moderate and high amounts of tamoxifen in alphaMHC-MerCreMe
r mice induce a DNA damage response,leading to heart failure and death.Disease m
odels & mechanisms 6,1459-1469,doi:10.1242/dmm.010447(2013).
17 Alkass,K.et al.No Evidence for Cardiomyocyte Number Expansion in Preadolesc
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18 Bersell,K.,Arab,S.,Haring,B.& Kuhn,B.Neuregulinl/ErbB4 signaling induces ca
rdiomyocyte proliferation and repair of heart injury.Cell 138,257-270,doi:10.101
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19 Castedo,M.et al.Cell death by mitotic catastrophe:a molecular definition.On
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20 Baildam,A.D.et al.DNA analysis by flow cytometry,response to endocrine trea
tment and prognosis in advanced carcinoma of the breast.British journal of cance
r 55,553-559(1987).
21 Gilsbach,R.et al.Dynamic DNA methylation orchestrates cardiomyocyte develop
ment,maturation and disease.Nature communications 5,5288,doi:10.1038/ncomms6288(
2014).
22 Preissl,S.et al.Deciphering the Epigenetic Code of Cardiac Myocyte Transcri
ption.Circulation research 117,413-423,doi:10.1161/circresaha.ll5.306337(2015).
23 Guo,X.& Chen,S.Y.Dedicator of Cytokinesis 2 in Cell Signaling Regulation an
d Disease Development.Journal of cellular physiology,doi:10.1002/jcp.25512(2016)
.
24 Buenrostro,J.D.,Giresi,P.G.,Zaba,L.C.,Chang,H.Y.& Greenleaf,W.J.Transpositi
on of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chrom
atin,DNA-binding proteins and nucleosome position.Nature methods 10,1213- 1218,d
oi:10.1038/nmeth.2688(2013).
25 Halder,G.& Johnson,R.L.Hippo signaling:growth control and beyond.Developmen
t 138,9-22,doi:10.1242/dev.045500(2011).
26 Zanconato,F.et al.Genome-wide association between YAP/TAZ/TEAD and AP-1 at
enhancers drives oncogenic growth.Nature cell biology 17,1218-1227,doi:10.1038/n
cb3216(2015).
27 Stein,C.et al.YAP1 Exerts Its Transcriptional Control via TEAD-Mediated Act
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28 Kalfon,R.et al.ATF3 expression in cardiomyocytes preserves homeostasis in t
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34-146,doi:10.1093/cvr/cvw228(2017).
29 Schep,A.N.et al.Structured nucleosome fingerprints enable high-resolution m
apping of chromatin architecture within regulatory regions.Genome research 25,17
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30 Nord,A.S.et al.Rapid and pervasive changes in genome-wide enhancer usage du
ring mammalian development.Cell 155,1521-1531,doi:10.1016/j.cell.2013.11.033(201
3).
31 Galli,G.G.et al.YAP Drives Growth by Controlling Transcriptional Pause Rele
ase from Dynamic Enhancers.Molecular cell 60,328-337,doi:10.1016/j.molcel.2015.0
9.001(2015).
32 Lin,Z.et al.Acetylation of VGLL4 Regulates Hippo-YAP Signaling and Postnata
l Cardiac Growth.Developmental cell 39,466-479,doi:10.1016/j.devcel.2016.09.005(
2016).
33 Passer,D.,van de Vrugt,A.,Atmanli,A.& Domian,I.J.Atypical Protein Kinase C-
Dependent Polarized Cell Division Is Required for Myocardial Trabeculation.Cell
reports 14,1662-1672,doi:10.1016/j.celrep.2016.01.030(2016).
34 Hofsteen,P.,Robitaille,A.M.,Chapman,D.P.,Moon,R.T.& Murry,C.E.Quantitative
proteomics identify DAB2 as a cardiac developmental regulator that inhibits WNT/
beta-catenin signaling.Proc Natl Acad Sci USA 113,1002-1007,doi:10.1073/pnas.152
3930113(2016).
35 Hausmann,G.,Banziger,C.& Basler,K.Helping Wingless take flight:how WNT prot
eins are secreted.Nature reviews.Molecular cell biology 8,331-336,doi:10.1038/nr
m2141(2007).
36 Saarikangas,J.et al.Missing-in-metastasis MIM/MTSS1 promotes actin assembly
at intercellular junctions and is required for integrity of kidney epithelia.Jo
urnal of cell science 124,1245-1255,doi:10.1242/jcs.082610(2011).
37 Reynolds,J.O.et al.Junctophilin-2 gene therapy rescues heart failure by nor
malizing RyR2-mediated Ca(2+)release.Int J Cardiol 225,371-380,doi:10.1016/j.ijc
ard.2016.10.021(2016).
38 Laughner,J.I.,Ng,F.S.,Sulkin,M.S.,Arthur,R.M.& Efimov,I.R.Processing and an
alysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes.Am J Ph
ysiol Heart Circ Physiol 303,H753-765,doi:10.1152/ajpheart.00404.2012(2012).
39 Wang,J.et al.Pitx2-microRNA pathway that delimits sinoatrial node developme
nt and inhibits predisposition to atrial fibrillation.Proc Natl Acad Sci USA 111
,9181-9186,doi:10.1073/pnas.1405411111(2014).
40 Vinnakota,K.C.& Bassingthwaighte,J.B.Myocardial density and composition:a b
asis for calculating intracellular metabolite concentrations.American Journal of
Physiology-Heart and Circulatory Physiology 286,doi:10.1152/ajpheart.00478.2003
(2004).
41 BrUel,A.& Nyengaard,J.R.Design-based stereological estimation of the total
number of cardiac myocytes in histological sections.Basic research in cardiology
100,311-319,doi:10.1007/s00395-005-0524-9(2005).
42 Bonn,S.et al.Cell type-specific chromatin immunoprecipitation from multicel
lular complex samples using BiTS-ChlP.Nature protocols 7,978-994,doi:10.1038/npr
ot.2012.049(2012).
43 Mo,A.et al.Epigenomic Signatures of Neuronal Diversity in the Mammalian Bra
in.Neuron 86,1369-1384,doi:10.1016/j.neuron.2015.05.018(2015).
44 Langmead,B.,Trapnell,C.,Pop,M.& Salzberg,S.L.Ultrafast and memory-efficient
alignment of short DNA sequences to the human genome.Genome Biology 10,1-10,doi
:10.1186/gb-2009- 10-3-r25(2009).
45 Quinlan,A.R.BEDTools:the Swiss army tool for genome feature analysis.Curren
t protocols in bioinformatics,doi:10.1002/0471250953.billl2s47(2014).
46 Hansen,K.D.,Irizarry,R.A.& Wu,Z.Removing technical variability in RNA-seq d
ata using conditional quantile normalization.Biostatistics(Oxford,England)13,204
-216,doi:10.1093/biostatistics/kxr054(2012).
47 Love,M.I.,Huber,W.& Anders,S.Moderated estimation of fold change and disper
sion for RNA-seq data with DESeq2.Genome biology 15,550,doi:10.1186/sl3059-014-
0550-8(2014).
48 Dobin,A.et al.STAR:ultrafast universal RNA-seq aligner.Bioinformatics(Oxfor
d,England)29,15-21,doi:10.1093/bioinformatics/bts635(2013).
49 Reimand,J.,Kull,M.,Peterson,H.,Hansen,J.& Vilo,J.g:Profiler-a web-based too
lset for functional profiling of gene lists from large-scale experiments.Nucleic
acids research 35,200,doi:10.1093/nar/gkm226(2007).
50 Reimand,J.et al.g:Profiler-a web server for functional interpretation of ge
ne lists(2016 update).Nucleic acids research 44,9,doi:10.1093/nar/gkwl99(2016).
本明細書で引用するすべての特許、特許出願、及び刊行物は、それらの全体が参照によ
り本明細書に組み込まれる。
1 Bergmann,O.et al.Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart
.Cell 161,1566-1575,doi:10.1016/j.cell.2015.05.026(2015).
2 Soonpaa,M.H.& Field,L.J.Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal
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3 Yu,F.X.,Zhao,B.& Guan,K.L.Hippo Pathway in Organ Size Control,TissueHomeosta
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4 Heallen,T.et al.Hippo signaling impedes adult heart regeneration.Development
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5 Morikawa,Y.et al.Actin cytoskeletal remodeling with protrusion formation is
essential for heart regeneration in Hippo deficient mice,submitted(2015).
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rvival in an experimental murine MI model.Circulation research 115,354-363,doi:1
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8 Zhao,B.,Li,L.,Tumaneng,K.,Wang,C.Y.& Guan,K.L.A coordinated phosphorylation
by Lats and CK1 regulates YAP stability through SCF(beta-TRCP).Genes & developme
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10 Chatterjee,K.,Zhang,J.,Honbo,N.& Karliner,J.S.Doxorubicin cardiomyopathy.Ca
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11 Florido,R.,Smith,K.L.,Cuomo,K.K.& Russell,S.D.Cardiotoxicity From Human Epi
dermal Growth Factor Receptor-2(HER2)Targeted Therapies.J Am Heart Assoc 6,doi:1
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12 Mathiowitz El,J.J.,Jong YS,Carino GP,Chickering DE,Chaturvedi P,Santos CA,V
ijayaraghavan K,Montgomery S,Bassett M,Morrell C.Biologically erodable microsphe
res as potential oral drug delivery systems.Nature 386,410-414,doi:10.1038/38641
0a0(1997).
13 Hwang SJI,P.H.,Park K.Gastric retentive drug-delivery systems.Critical revi
ews in therapeutic drug carrier systems 15,243-284(1998).
14 Mitsuko Takenaga*,Y.S.,Yasutaka Azechi,Akira Ochiai,Yasuo Kosaka,& Rie Igar
ashi,Y.M.Microparticle resins as a potential nasal drug delivery system for insu
lin.Journal of controlled release 52,81-87(1996).
15 Sohal,D.S.et al.Temporally regulated and tissue-specific gene manipulations
in the adult and embryonic heart using a tamoxifen-inducible Cre protein.Circul
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16 Bersell,K.et al.Moderate and high amounts of tamoxifen in alphaMHC-MerCreMe
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17 Alkass,K.et al.No Evidence for Cardiomyocyte Number Expansion in Preadolesc
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18 Bersell,K.,Arab,S.,Haring,B.& Kuhn,B.Neuregulinl/ErbB4 signaling induces ca
rdiomyocyte proliferation and repair of heart injury.Cell 138,257-270,doi:10.101
6/j.cell.2009.04.060(2009).
19 Castedo,M.et al.Cell death by mitotic catastrophe:a molecular definition.On
cogene 23,2825-2837,doi:10.1038/sj.onc,1207528(2004).
20 Baildam,A.D.et al.DNA analysis by flow cytometry,response to endocrine trea
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r 55,553-559(1987).
21 Gilsbach,R.et al.Dynamic DNA methylation orchestrates cardiomyocyte develop
ment,maturation and disease.Nature communications 5,5288,doi:10.1038/ncomms6288(
2014).
22 Preissl,S.et al.Deciphering the Epigenetic Code of Cardiac Myocyte Transcri
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d Disease Development.Journal of cellular physiology,doi:10.1002/jcp.25512(2016)
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24 Buenrostro,J.D.,Giresi,P.G.,Zaba,L.C.,Chang,H.Y.& Greenleaf,W.J.Transpositi
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atin,DNA-binding proteins and nucleosome position.Nature methods 10,1213- 1218,d
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26 Zanconato,F.et al.Genome-wide association between YAP/TAZ/TEAD and AP-1 at
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27 Stein,C.et al.YAP1 Exerts Its Transcriptional Control via TEAD-Mediated Act
ivation of Enhancers.PLoS genetics 11,el005465,doi:10.1371/joumal.pgen.1005465(2
015).
28 Kalfon,R.et al.ATF3 expression in cardiomyocytes preserves homeostasis in t
he heart and controls peripheral glucose tolerance.Cardiovascular research 113,1
34-146,doi:10.1093/cvr/cvw228(2017).
29 Schep,A.N.et al.Structured nucleosome fingerprints enable high-resolution m
apping of chromatin architecture within regulatory regions.Genome research 25,17
57-1770,doi:10.1101/gr.192294.115(2015).
30 Nord,A.S.et al.Rapid and pervasive changes in genome-wide enhancer usage du
ring mammalian development.Cell 155,1521-1531,doi:10.1016/j.cell.2013.11.033(201
3).
31 Galli,G.G.et al.YAP Drives Growth by Controlling Transcriptional Pause Rele
ase from Dynamic Enhancers.Molecular cell 60,328-337,doi:10.1016/j.molcel.2015.0
9.001(2015).
32 Lin,Z.et al.Acetylation of VGLL4 Regulates Hippo-YAP Signaling and Postnata
l Cardiac Growth.Developmental cell 39,466-479,doi:10.1016/j.devcel.2016.09.005(
2016).
33 Passer,D.,van de Vrugt,A.,Atmanli,A.& Domian,I.J.Atypical Protein Kinase C-
Dependent Polarized Cell Division Is Required for Myocardial Trabeculation.Cell
reports 14,1662-1672,doi:10.1016/j.celrep.2016.01.030(2016).
34 Hofsteen,P.,Robitaille,A.M.,Chapman,D.P.,Moon,R.T.& Murry,C.E.Quantitative
proteomics identify DAB2 as a cardiac developmental regulator that inhibits WNT/
beta-catenin signaling.Proc Natl Acad Sci USA 113,1002-1007,doi:10.1073/pnas.152
3930113(2016).
35 Hausmann,G.,Banziger,C.& Basler,K.Helping Wingless take flight:how WNT prot
eins are secreted.Nature reviews.Molecular cell biology 8,331-336,doi:10.1038/nr
m2141(2007).
36 Saarikangas,J.et al.Missing-in-metastasis MIM/MTSS1 promotes actin assembly
at intercellular junctions and is required for integrity of kidney epithelia.Jo
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37 Reynolds,J.O.et al.Junctophilin-2 gene therapy rescues heart failure by nor
malizing RyR2-mediated Ca(2+)release.Int J Cardiol 225,371-380,doi:10.1016/j.ijc
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38 Laughner,J.I.,Ng,F.S.,Sulkin,M.S.,Arthur,R.M.& Efimov,I.R.Processing and an
alysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes.Am J Ph
ysiol Heart Circ Physiol 303,H753-765,doi:10.1152/ajpheart.00404.2012(2012).
39 Wang,J.et al.Pitx2-microRNA pathway that delimits sinoatrial node developme
nt and inhibits predisposition to atrial fibrillation.Proc Natl Acad Sci USA 111
,9181-9186,doi:10.1073/pnas.1405411111(2014).
40 Vinnakota,K.C.& Bassingthwaighte,J.B.Myocardial density and composition:a b
asis for calculating intracellular metabolite concentrations.American Journal of
Physiology-Heart and Circulatory Physiology 286,doi:10.1152/ajpheart.00478.2003
(2004).
41 BrUel,A.& Nyengaard,J.R.Design-based stereological estimation of the total
number of cardiac myocytes in histological sections.Basic research in cardiology
100,311-319,doi:10.1007/s00395-005-0524-9(2005).
42 Bonn,S.et al.Cell type-specific chromatin immunoprecipitation from multicel
lular complex samples using BiTS-ChlP.Nature protocols 7,978-994,doi:10.1038/npr
ot.2012.049(2012).
43 Mo,A.et al.Epigenomic Signatures of Neuronal Diversity in the Mammalian Bra
in.Neuron 86,1369-1384,doi:10.1016/j.neuron.2015.05.018(2015).
44 Langmead,B.,Trapnell,C.,Pop,M.& Salzberg,S.L.Ultrafast and memory-efficient
alignment of short DNA sequences to the human genome.Genome Biology 10,1-10,doi
:10.1186/gb-2009- 10-3-r25(2009).
45 Quinlan,A.R.BEDTools:the Swiss army tool for genome feature analysis.Curren
t protocols in bioinformatics,doi:10.1002/0471250953.billl2s47(2014).
46 Hansen,K.D.,Irizarry,R.A.& Wu,Z.Removing technical variability in RNA-seq d
ata using conditional quantile normalization.Biostatistics(Oxford,England)13,204
-216,doi:10.1093/biostatistics/kxr054(2012).
47 Love,M.I.,Huber,W.& Anders,S.Moderated estimation of fold change and disper
sion for RNA-seq data with DESeq2.Genome biology 15,550,doi:10.1186/sl3059-014-
0550-8(2014).
48 Dobin,A.et al.STAR:ultrafast universal RNA-seq aligner.Bioinformatics(Oxfor
d,England)29,15-21,doi:10.1093/bioinformatics/bts635(2013).
49 Reimand,J.,Kull,M.,Peterson,H.,Hansen,J.& Vilo,J.g:Profiler-a web-based too
lset for functional profiling of gene lists from large-scale experiments.Nucleic
acids research 35,200,doi:10.1093/nar/gkm226(2007).
50 Reimand,J.et al.g:Profiler-a web server for functional interpretation of ge
ne lists(2016 update).Nucleic acids research 44,9,doi:10.1093/nar/gkwl99(2016).
【0113】
本発明及びその利点を詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲に規定されるよう
な本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変更、置換、及び改変が本明細書
でなされ得るものと理解されるべきである。さらに、本出願の範囲は、本明細書に記載の
プロセス、機械、製造、物質の組成、手段、方法、及び工程に関する特定の実施形態に限
定されることを意図しない。当業者であれば本発明の開示から容易に理解されるであろう
が、本明細書に記載の対応する実施形態と実質的に同じ機能を実行するか、または実質的
に同じ結果を達成する、現存するまたは今後開発されるプロセス、機械、製造、物質の組
成、手段、方法、または工程を本発明に従って利用することができる。したがって、添付
の特許請求の範囲は、そのようなプロセス、機械、製造、物質の組成、手段、方法、また
は工程をその範囲内に包含することを意図する。
な本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変更、置換、及び改変が本明細書
でなされ得るものと理解されるべきである。さらに、本出願の範囲は、本明細書に記載の
プロセス、機械、製造、物質の組成、手段、方法、及び工程に関する特定の実施形態に限
定されることを意図しない。当業者であれば本発明の開示から容易に理解されるであろう
が、本明細書に記載の対応する実施形態と実質的に同じ機能を実行するか、または実質的
に同じ結果を達成する、現存するまたは今後開発されるプロセス、機械、製造、物質の組
成、手段、方法、または工程を本発明に従って利用することができる。したがって、添付
の特許請求の範囲は、そのようなプロセス、機械、製造、物質の組成、手段、方法、また
は工程をその範囲内に包含することを意図する。
【図1-1】
【図1-2】
【図2-1】
【図2-2】
【図3-1】
【図3-2】
【図3-3】
【図4-1】
【図4-2】
【図4-3】
【図5-1】
【図5-2】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図11】
【図12】
【図13-1】
【図13-2】
【図13-3】
【図13-4】
【図14-1】
【図14-2】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【配列表】