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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024007395
(43)【公開日】2024-01-18
(54)【発明の名称】生体物質固定化材料
(51)【国際特許分類】
G01N 33/543 20060101AFI20240110BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20240110BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20240110BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20240110BHJP
C12Q 1/6813 20180101ALI20240110BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20240110BHJP
【ＦＩ】
G01N33/543 525U
G01N33/543 525E
G01N33/53 M
G01N33/53 D
C12M1/00 A ZNA
C12M1/34 Z
C12Q1/6813 Z
C12N15/09 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】15
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023102166
(22)【出願日】2023-06-22
(31)【優先権主張番号】P 2022106352
(32)【優先日】2022-06-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】000183484
【氏名又は名称】日本製紙株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】504180239
【氏名又は名称】国立大学法人信州大学
(74)【代理人】
【識別番号】110002147
【氏名又は名称】弁理士法人酒井国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】天野 良彦
(72)【発明者】
【氏名】水野 正浩
(72)【発明者】
【氏名】田川 聡美
(72)【発明者】
【氏名】中内 宙弥
(72)【発明者】
【氏名】金野 晴男
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B029AA07
4B029BB15
4B029BB20
4B029CC03
4B029FA12
4B029FA15
4B063QA01
4B063QA13
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR32
4B063QR55
4B063QS34
4B063QS36
(57)【要約】
【課題】本発明は、生体物質を固定化できる新規な材料を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明は、以下を提供する：末端カルボキシル基含有セルロースを含む変性パルプに、生体物質が固定化されている、生体物質固定化材料；末端カルボキシル基含有セルロースを含む変性パルプと生体物質とを、トリアジン系縮合剤等の縮合剤の存在下反応させることを含む、前記材料の製造方法；被検体から採取済みのサンプルに前記材料を添加し、サンプル中の被検物質を前記材料に固定化された生体物質と特異的に結合させて、結合した被検物質の有無を確認及び／又は定量する方法、又は結合した被験物質を回収方法、又は、結合し、集積させる方法。
【選択図】なし
【解決手段】本発明は、以下を提供する：末端カルボキシル基含有セルロースを含む変性パルプに、生体物質が固定化されている、生体物質固定化材料；末端カルボキシル基含有セルロースを含む変性パルプと生体物質とを、トリアジン系縮合剤等の縮合剤の存在下反応させることを含む、前記材料の製造方法；被検体から採取済みのサンプルに前記材料を添加し、サンプル中の被検物質を前記材料に固定化された生体物質と特異的に結合させて、結合した被検物質の有無を確認及び／又は定量する方法、又は結合した被験物質を回収方法、又は、結合し、集積させる方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
末端カルボキシル基含有セルロースを含む変性パルプに、生体物質が固定化されている、生体物質固定化材料。
【請求項2】
固定化は、アミド結合を含む結合を介する固定化である、請求項１に記載の材料。
【請求項3】
アミド結合を含む結合は、エチニル基とアジ基間の付加環化反応により形成される基さらに含む結合である、請求項２に記載の材料。
【請求項4】
生体物質が、核酸、アミノ酸又はタンパク質である、請求項１又は２に記載の材料。
【請求項5】
変性パルプが、酸化パルプ又はカルボキシメチル化パルプである、請求項１又は２に記載の材料。
【請求項6】
末端カルボキシル基含有セルロースを含む変性パルプに生体物質を固定化する反応を含み、少なくとも一部の反応を縮合剤の存在下で行う、請求項１又は２に記載の材料の製造方法。
【請求項7】
アミノ化修飾された生体物質のアミノ基と変性パルプの末端カルボキシル基とを縮合剤の存在下で反応させアミド結合を形成させることを含む、請求項６に記載の製造方法。
【請求項8】
生体物質にエチニル基を導入し、変性パルプにアミド結合及びアジ基を導入するか、又は、
生体物質にアジ基を導入し、変性パルプにアミド結合及びエチニル基を導入してから、エチニル基とアジ基間の付加環化反応を生じさせることを含む、請求項６に記載の方法。
生体物質にアジ基を導入し、変性パルプにアミド結合及びエチニル基を導入してから、エチニル基とアジ基間の付加環化反応を生じさせることを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項9】
縮合剤が、トリアジン系縮合剤である、請求項６～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
原料パルプを酸化又はカルボキシメチル化して、末端カルボキシル基含有セルロースを含む変性パルプを得ることをさらに含む、請求項６～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
被検体から採取済みのサンプルに請求項１又は２に記載の材料を添加し、サンプル中の被検物質を前記材料に固定化された生体物質と特異的に結合させること、及び
結合した被検物質の有無を確認及び／又は定量することを含む、被検物質の検出方法。
結合した被検物質の有無を確認及び／又は定量することを含む、被検物質の検出方法。
【請求項12】
被検体から採取済みのサンプルに請求項１又は２に記載の材料を添加し、サンプル中の被検物質を前記材料に固定化された生体物質と特異的に結合させること、
結合した被検物質を請求項１又は２に記載の材料から分離し、回収することを含む、サンプルからの被検物質の回収方法。
結合した被検物質を請求項１又は２に記載の材料から分離し、回収することを含む、サンプルからの被検物質の回収方法。
【請求項13】
被検体から採取済みのサンプルに請求項１又は２に記載の材料を添加し、サンプル中の被検物質を前記材料に固定化された生体物質と特異的に結合させ、集積させることを含む、集積化材料の製造方法。
【請求項14】
被検物質は、核酸、アミノ酸、ペプチド、又はタンパク質である、請求項１１～１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
酸化パルプ及び縮合剤を含む、請求項１又は２に記載の材料を製造するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生体物質固定化材料に関する。
【0002】
ＤＮＡマイクロアレイは、検出用の既知のＤＮＡ断片が基板上に固定化された、ＤＮＡ固定化材料の１つである。すなわち、固定化されたＤＮＡ断片と、サンプル中のこれと相補的な配列を有するＤＮＡ断片とをハイブリダイゼーションさせることにより、サンプルに含まれる遺伝子情報、遺伝子発現レベルを検出できる。このため、ヘルスサイエンス、バイオロジーの幅広い分野で活用されてきた。
【0003】
近年、新たなマイクロアレイとして、ＤＮＡコロイド、ＤＮＡハイドロゲルが報告さあれている。ＤＮＡコロイドは、ＤＮＡ断片を担持したコロイド（例えば、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、シリカ、それらの誘導体等の高分子コロイド、金コロイド：非特許文献１、２）である。ＤＮＡハイドロゲルは、ペプチド核酸とＤＮＡリンカーを集合させて調製したハイドロゲルである（非特許文献３）。担持したＤＮＡ断片、ＤＮＡリンカーとサンプル中のこれと相補的な配列を有するＤＮＡ断片とがハイブリダイゼーションすると、コロイド、ハイドロゲルが凝集する。そのため、凝集の有無によりサンプルの遺伝子解析を容易に行うことができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Ｗ．Ｙｕ ｅｔ ａｌ（２０１５）Ｎａｔ．Ｃｏｍ．ｖｏｌ．６，７２５３
【非特許文献2】Ｃ．Ｍｉｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ｖｏｌ．３８２，ｐ６０７－６０９
【非特許文献3】Ｙ．Ｓｈａｏ ｅｔ ａｌ（２０１７）Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．ｖｏｌ．５０，ｐ６５９－６６８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
従来のマイクロアレイは、検出時に輸液装置が必要である。また、チップ状の場合樹脂製、金属製の基材を使用しているため廃棄が困難であり、コロイド、ハイドロゲルの場合、ゲル状、液状等水分を含むため、廃棄だけでなく運搬も困難であった。
【0006】
本発明は、生体物質を固定化できる新規な材料を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明は、以下の〔１〕～〔１５〕を提供する。
〔１〕末端カルボキシル基含有セルロースを含む変性パルプに、生体物質が固定化されている、生体物質固定化材料。
〔２〕固定化は、アミド結合を含む結合を介する固定化である、〔１〕に記載の材料。
〔３〕アミド結合を含む結合は、エチニル基とアジ基間の付加環化反応により形成される基さらに含む結合である、〔２〕に記載の材料。
〔４〕生体物質が、核酸、アミノ酸又はタンパク質である、〔１〕～〔３〕のいずれか１項に記載の材料。
〔５〕変性パルプが、酸化パルプ又はカルボキシメチル化パルプである、〔１〕～〔４〕のいずれか１項に記載の材料。
〔６〕末端カルボキシル基含有セルロースを含む変性パルプに生体物質を固定化する反応を含み、少なくとも一部の反応を縮合剤の存在下で行う、〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載の材料の製造方法。
〔７〕アミノ化修飾された生体物質のアミノ基と変性パルプの末端カルボキシル基とを縮合剤の存在下で反応させアミド結合を形成させることを含む、〔６〕に記載の製造方法。
〔８〕生体物質にエチニル基を導入し、変性パルプにアミド結合及びアジ基を導入してから、又は、
生体物質にアジ基を導入し、変性パルプにアミド結合及びエチニル基を導入してから、
エチニル基とアジ基間の付加環化反応を生じさせることを含む、〔６〕に記載の方法。
〔９〕縮合剤が、トリアジン系縮合剤である、〔６〕～〔８〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１０〕原料パルプを酸化又はカルボキシメチル化して、末端カルボキシル基含有セルロースを含む変性パルプを得ることをさらに含む、〔６〕～〔９〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１１〕被検体から採取済みのサンプルに〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載の材料を添加し、サンプル中の被検物質を前記材料に固定化された生体物質と特異的に結合させること、及び
結合した被検物質の有無を確認及び／又は定量することを含む、被検物質の検出方法。
〔１２〕被検体から採取済みのサンプルに〔１〕～〔５〕に記載の材料を添加し、サンプル中の被検物質を〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載の材料に固定化された生体物質と特異的に結合させること、
結合した被検物質を〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載の材料から分離し、回収することを含む、サンプルからの被検物質の回収方法。
〔１３〕被検体から採取済みのサンプルに〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載の材料を添加し、サンプル中の被検物質を〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載の材料に固定化された生体物質と特異的に結合させ、集積させることを含む、集積化材料の製造方法。
〔１４〕被検物質は、核酸、アミノ酸、ペプチド、又はタンパク質である、〔１１〕～〔１３〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１５〕酸化パルプ及び縮合剤を含む、〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載の材料を製造するためのキット。
〔１〕末端カルボキシル基含有セルロースを含む変性パルプに、生体物質が固定化されている、生体物質固定化材料。
〔２〕固定化は、アミド結合を含む結合を介する固定化である、〔１〕に記載の材料。
〔３〕アミド結合を含む結合は、エチニル基とアジ基間の付加環化反応により形成される基さらに含む結合である、〔２〕に記載の材料。
〔４〕生体物質が、核酸、アミノ酸又はタンパク質である、〔１〕～〔３〕のいずれか１項に記載の材料。
〔５〕変性パルプが、酸化パルプ又はカルボキシメチル化パルプである、〔１〕～〔４〕のいずれか１項に記載の材料。
〔６〕末端カルボキシル基含有セルロースを含む変性パルプに生体物質を固定化する反応を含み、少なくとも一部の反応を縮合剤の存在下で行う、〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載の材料の製造方法。
〔７〕アミノ化修飾された生体物質のアミノ基と変性パルプの末端カルボキシル基とを縮合剤の存在下で反応させアミド結合を形成させることを含む、〔６〕に記載の製造方法。
〔８〕生体物質にエチニル基を導入し、変性パルプにアミド結合及びアジ基を導入してから、又は、
生体物質にアジ基を導入し、変性パルプにアミド結合及びエチニル基を導入してから、
エチニル基とアジ基間の付加環化反応を生じさせることを含む、〔６〕に記載の方法。
〔９〕縮合剤が、トリアジン系縮合剤である、〔６〕～〔８〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１０〕原料パルプを酸化又はカルボキシメチル化して、末端カルボキシル基含有セルロースを含む変性パルプを得ることをさらに含む、〔６〕～〔９〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１１〕被検体から採取済みのサンプルに〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載の材料を添加し、サンプル中の被検物質を前記材料に固定化された生体物質と特異的に結合させること、及び
結合した被検物質の有無を確認及び／又は定量することを含む、被検物質の検出方法。
〔１２〕被検体から採取済みのサンプルに〔１〕～〔５〕に記載の材料を添加し、サンプル中の被検物質を〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載の材料に固定化された生体物質と特異的に結合させること、
結合した被検物質を〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載の材料から分離し、回収することを含む、サンプルからの被検物質の回収方法。
〔１３〕被検体から採取済みのサンプルに〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載の材料を添加し、サンプル中の被検物質を〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載の材料に固定化された生体物質と特異的に結合させ、集積させることを含む、集積化材料の製造方法。
〔１４〕被検物質は、核酸、アミノ酸、ペプチド、又はタンパク質である、〔１１〕～〔１３〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１５〕酸化パルプ及び縮合剤を含む、〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載の材料を製造するためのキット。
【発明の効果】
【0008】
本発明によれば、様々な生体物質を固定化できる生体物質固定化材料が提供される。本発明の材料は、基材がパルプであることから運搬性、廃棄性に優れ、また、毛細現象を駆動力とすることができるため、ポンプ等の輸液装置も不要である。そのため、次世代のマイクロアレイとして、サンプル中のターゲット物質の検出、分離、集積に広く活用することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【発明を実施するための形態】
【0010】
［１．生体物質固定化材料］
生体物質固定化材料は、変性パルプと生体物質を含む。
生体物質固定化材料は、変性パルプと生体物質を含む。
【0011】
［変性パルプ］
変性パルプは、パルプ原料に末端カルボキシ基が導入されたパルプである。末端カルボキシル基を導入する処理を変性処理と言う。
変性パルプは、パルプ原料に末端カルボキシ基が導入されたパルプである。末端カルボキシル基を導入する処理を変性処理と言う。
【0012】
－パルプ原料－
パルプ原料としては、例えば、植物（例えば、木材、非木材（例、竹、麻、ジュート、ケナフ、イネ））、動物（例えばホヤ類）、藻類、微生物（例えば酢酸菌（アセトバクター））、微生物産生物が挙げられ、植物が好ましく、木材がより好ましい。パルプとしては、例えば、クラフトパルプ（例、針葉樹未漂白クラフトパルプ（ＮＵＫＰ）、針葉樹漂白クラフトパルプ（ＮＢＫＰ）等の針葉樹クラフトパルプ；広葉樹未漂白クラフトパルプ（ＬＵＫＰ）、広葉樹漂白クラフトパルプ（ＬＢＫＰ）等の広葉樹クラフトパルプ）、サルファイトパルプ（例、針葉樹未漂白サルファイトパルプ（ＮＵＳＰ）、針葉樹漂白サルファイトパルプ（ＮＢＳＰ）等の針葉樹サルファイトパルプ）等の化学パルプ、サーモメカニカルパルプ（ＴＭＰ）等のメカニカルパルプ、再生パルプが挙げられる。パルプは、セルロース以外の成分（例えば、ヘミセルロース、リグニン）を含んでいてもよいが、セルロースを主成分とすることが好ましい。
パルプ原料としては、例えば、植物（例えば、木材、非木材（例、竹、麻、ジュート、ケナフ、イネ））、動物（例えばホヤ類）、藻類、微生物（例えば酢酸菌（アセトバクター））、微生物産生物が挙げられ、植物が好ましく、木材がより好ましい。パルプとしては、例えば、クラフトパルプ（例、針葉樹未漂白クラフトパルプ（ＮＵＫＰ）、針葉樹漂白クラフトパルプ（ＮＢＫＰ）等の針葉樹クラフトパルプ；広葉樹未漂白クラフトパルプ（ＬＵＫＰ）、広葉樹漂白クラフトパルプ（ＬＢＫＰ）等の広葉樹クラフトパルプ）、サルファイトパルプ（例、針葉樹未漂白サルファイトパルプ（ＮＵＳＰ）、針葉樹漂白サルファイトパルプ（ＮＢＳＰ）等の針葉樹サルファイトパルプ）等の化学パルプ、サーモメカニカルパルプ（ＴＭＰ）等のメカニカルパルプ、再生パルプが挙げられる。パルプは、セルロース以外の成分（例えば、ヘミセルロース、リグニン）を含んでいてもよいが、セルロースを主成分とすることが好ましい。
【0013】
－変性処理－
パルプ原料への末端カルボキシル基の導入は、変性処理によることができる。末端カルボキシル基は、例えば、末端カルボキシル基又はこれを含む置換基（例えば、カルボキシル基、カルボキシアルキル基）として導入できる。変性処理としては、例えば、酸化処理、カルボキシアルキル化処理が挙げられる。
パルプ原料への末端カルボキシル基の導入は、変性処理によることができる。末端カルボキシル基は、例えば、末端カルボキシル基又はこれを含む置換基（例えば、カルボキシル基、カルボキシアルキル基）として導入できる。変性処理としては、例えば、酸化処理、カルボキシアルキル化処理が挙げられる。
【0014】
－酸化（カルボキシル化）処理（変性処理の例）－
酸化処理により得られる変性パルプ（本明細書において、酸化パルプと言う）は、通常、セルロース分子鎖を構成するグルコピラノース単位に含まれる１級水酸基を有する炭素原子の少なくとも１つ（例えば、Ｃ６位の１級水酸基を有する炭素原子）が酸化されている（カルボキシル基を有する）構造を有する。
酸化処理により得られる変性パルプ（本明細書において、酸化パルプと言う）は、通常、セルロース分子鎖を構成するグルコピラノース単位に含まれる１級水酸基を有する炭素原子の少なくとも１つ（例えば、Ｃ６位の１級水酸基を有する炭素原子）が酸化されている（カルボキシル基を有する）構造を有する。
【0015】
カルボキシル化セルロース繊維は、未変性のセルロース繊維（セルロース原料：例えば、パルプ）をカルボキシル化（酸化）して製造できる。カルボキシル化（酸化）方法の一例として、セルロース原料を、Ｎ－オキシル化合物と、臭化物、ヨウ化物若しくはこれらの混合物からなる群から選択される化合物と、の存在下で酸化剤を用いて水中で酸化する方法を挙げることができる。この酸化反応により、セルロース表面のグルコピラノース環のＣ６位の一級水酸基を有する炭素原子が選択的に酸化され、表面にアルデヒド基と、カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）又はカルボキシレート基（－ＣＯＯ－）と、を有する化学変性セルロースを得ることができる。反応時のセルロース原料の濃度は、特に限定されないが、５質量％以下が好ましい。
【0016】
Ｎ－オキシル化合物とは、ニトロキシラジカルを発生しうる化合物をいう。Ｎ－オキシル化合物としては、目的の酸化反応を促進する化合物であれば、いずれの化合物も使用できる。例えば、２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシラジカル（ＴＥＭＰＯ）及びその誘導体（例えば、４－ヒドロキシＴＥＭＰＯ）が挙げられる。
【0017】
Ｎ－オキシル化合物の使用量は、セルロース原料を酸化できる触媒量であればよく、特に制限されない。例えば、絶乾１ｇのセルロース原料に対して、０．０１～１０ｍｍｏｌが好ましく、０．０１～１ｍｍｏｌがより好ましく、０．０５～０．５ｍｍｏｌがさらに好ましい。また、反応系に対し０．１～４ｍｍｏｌ／Ｌ程度がよい。
【0018】
臭化物とは、臭素を含む化合物であり、例えば、水中で解離してイオン化可能なアルカリ金属の臭化物が挙げられる。また、ヨウ化物とは、ヨウ素を含む化合物であり、例えば、アルカリ金属のヨウ化物が挙げられる。臭化物またはヨウ化物の使用量は、酸化反応を促進できる範囲で選択できる。臭化物およびヨウ化物の合計量は、例えば、絶乾１ｇのセルロース原料に対して、０．１～１００ｍｍｏｌが好ましく、０．１～１０ｍｍｏｌがより好ましく、０．５～５ｍｍｏｌがさらに好ましい。
【0019】
酸化剤としては、公知のものを使用でき、例えば、ハロゲン、次亜ハロゲン酸、亜ハロゲン酸、過ハロゲン酸またはそれらの塩、ハロゲン酸化物、過酸化物などを使用できる。中でも、安価で環境負荷の少ない次亜塩素酸ナトリウムが好ましい。酸化剤の適切な使用量は、例えば、絶乾１ｇのセルロース原料に対して、０．５～５００ｍｍｏｌが好ましく、０．５～５０ｍｍｏｌがより好ましく、１～２５ｍｍｏｌがさらに好ましく、３～１０ｍｍｏｌがさらにより好ましい。また、例えば、Ｎ－オキシル化合物１ｍｏｌに対して１～４０ｍｏｌが好ましい。
【0020】
セルロース原料の酸化工程は、比較的温和な条件であっても反応は効率よく進行する。よって、反応温度は、４～４０℃が好ましく、また１５～３０℃程度の室温であってもよい。反応の進行に伴ってセルロース中にカルボキシル基が生成するため、反応液のｐＨの低下が認められる。酸化反応を効率よく進行させるためには、水酸化ナトリウム水溶液などのアルカリ性溶液を添加して、反応液のｐＨを８～１２、好ましくは１０～１１程度に維持することが好ましい。反応媒体は、取扱い性の容易さや、副反応が生じにくいこと等から、水が好ましい。
【0021】
酸化反応における反応時間は、酸化の進行の程度に従って適宜設定することができ、通常は０．５～６時間、例えば、０．５～４時間程度である。
【0022】
酸化反応は、２段階に分けて実施してもよい。例えば、１段目の反応終了後に濾別して得られた酸化セルロースを、再度、同一または異なる反応条件で酸化させることにより、１段目の反応で副生する食塩による反応阻害を受けることなく、効率よく酸化させることができる。
【0023】
カルボキシル化（酸化）方法の別の例として、オゾンを含む気体とセルロース原料とを接触させることにより酸化する方法を挙げることができる。この酸化反応により、グルコピラノース環の少なくとも２位及び６位の水酸基が酸化されると共に、セルロース鎖の分解が起こる。オゾンを含む気体中のオゾン濃度は、５０～２５０ｇ／ｍ３が好ましく、５０～２２０ｇ／ｍ３がより好ましい。セルロース原料に対するオゾン添加量は、セルロース原料の固形分を１００質量部とした際に、０．１～３０質量部が好ましく、５～３０質量部がより好ましい。オゾン処理温度は、０～５０℃が好ましく、２０～５０℃がより好ましい。オゾン処理時間は、特に限定されないが、１～３６０分程度であり、３０～３６０分程度が好ましい。オゾン処理の条件がこれらの範囲内であると、セルロース原料が過度に酸化及び分解されることを防ぐことができ、酸化セルロースの収率が良好となる。
【0024】
オゾン処理を施した後に、酸化剤を用いて、追酸化処理を行ってもよい。追酸化処理に用いる酸化剤は、特に限定されないが、二酸化塩素、亜塩素酸ナトリウム等の塩素系化合物や、酸素、過酸化水素、過硫酸、過酢酸などが挙げられる。例えば、これらの酸化剤を水またはアルコール等の極性有機溶媒中に溶解して酸化剤溶液を作製し、溶液中に酸化セルロースを浸漬させることにより追酸化処理を行うことができる。
【0025】
－カルボキシアルキル化（変性処理の例）－
カルボキシアルキル化により得られる変性パルプ（本明細書において、カルボキシアルキル化パルプと言う）は、通常、セルロース分子鎖を構成する炭素原子の少なくとも１つ（例えば、グルコピラノース単位を構成するＣ６位の１級水酸基を有する炭素原子）がカルボキシアルキル化されている（カルボキシアルキル基を有する）構造を有する。
カルボキシアルキル化により得られる変性パルプ（本明細書において、カルボキシアルキル化パルプと言う）は、通常、セルロース分子鎖を構成する炭素原子の少なくとも１つ（例えば、グルコピラノース単位を構成するＣ６位の１級水酸基を有する炭素原子）がカルボキシアルキル化されている（カルボキシアルキル基を有する）構造を有する。
【0026】
カルボキシアルキル化セルロースの無水グルコース単位当たりのカルボキシアルキル置換度（ＤＳ、好ましくはカルボキシメチル置換度）は、０．０１以上、０．０２以上又は０．０５以上が好ましく、０．１０以上がより好ましく、０．１５以上がさらに好ましく、０．２０以上がさらにより好ましく、０．２５以上がとりわけ好ましい。これにより、化学変性による効果を得るための置換度を確保できる。当該置換度の上限は、０．５０以下が好ましく、０．４５以下、０．４０以下又は０．３５以下がより好ましい。これにより、セルロース繊維の水への溶解が起こりにくくなり、水中で繊維形態を維持できる。従って、カルボキシアルキル置換度は、０．０１～０．５０が好ましく、０．０１～０．４５がより好ましく、０．０２～０．４０、０．１０～０．３５又は０．２０～０．３０がさらに好ましい。
【0027】
カルボキシアルキル置換度を、カルボキシメチル化の場合のカルボキシメチル置換度を例にとって説明する。カルボキシメチル化パルプ（絶乾）約２．０ｇを精秤して、３００ｍＬ共栓付き三角フラスコに入れる。メタノール１，０００ｍＬに特級濃硝酸１００ｍＬを加えた液１００ｍＬを加え、３時間振とうして、塩型のカルボキシメチル化パルプ（以下、「塩型ＣＭ化パルプ」ともいう）を酸型のカルボキシメチル化パルプ（以下、「酸型ＣＭ化パルプ」ともいう）に変換する。酸型ＣＭ化パルプ（絶乾）を１．５～２．０ｇ精秤し、３００ｍＬ共栓付き三角フラスコに入れる。８０％メタノール１５ｍＬで酸型ＣＭ化セルロースを湿潤し、０．１ＮのＮａＯＨを１００ｍＬ加え、室温で３時間振とうする。指示薬として、フェノールフタレインを用いて、０．１ＮのＨ2ＳＯ4で過剰のＮａＯＨを逆滴定し、次式によってカルボキシメチル置換度（ＤＳ）を算出し得る：
Ａ＝［（１００×Ｆ－（０．１ＮのＨ2ＳＯ4（ｍＬ））×Ｆ’）×０．１］／（酸型ＣＭ化パルプの絶乾質量（ｇ））
ＤＳ＝０．１６２×Ａ／（１－０．０５８×Ａ）
Ａ：酸型ＣＭ化パルプを１ｇ中和するのに要する１ＮのＮａＯＨ量（ｍＬ）
Ｆ’：０．１ＮのＨ2ＳＯ4のファクター
Ｆ：０．１ＮのＮａＯＨのファクター
Ａ＝［（１００×Ｆ－（０．１ＮのＨ2ＳＯ4（ｍＬ））×Ｆ’）×０．１］／（酸型ＣＭ化パルプの絶乾質量（ｇ））
ＤＳ＝０．１６２×Ａ／（１－０．０５８×Ａ）
Ａ：酸型ＣＭ化パルプを１ｇ中和するのに要する１ＮのＮａＯＨ量（ｍＬ）
Ｆ’：０．１ＮのＨ2ＳＯ4のファクター
Ｆ：０．１ＮのＮａＯＨのファクター
【0028】
カルボキシアルキル置換度は、反応させるカルボキシアルキル化剤の添加量、マーセル化剤の量、水と有機溶媒の組成比率等の反応条件をコントロールすることにより調整できる。
【0029】
カルボキシアルキル化の方法としては例えば、出発原料（発底原料）としてのセルロース系原料をマーセル化し、その後エーテル化する方法が挙げられる。カルボキシメチル化を例に取り以下説明する。
【0030】
未変性のセルロース繊維（セルロース原料：例えばパルプ）を出発原料にし、３～２０質量倍の溶媒の存在下でマーセル化処理を行った後、エーテル化反応を行うことでカルボキシメチル化したセルロースを製造し得る。溶媒としては、例えば、水、低級アルコール（例、メタノール、エタノール、ｎ－プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ｎ－ブチルアルコール、イソブチルアルコール、第３級ブタノール）を１種単独で、又は２種以上の混合溶媒を使用し得る。なお、低級アルコールを混合する場合、低級アルコールの混合割合は、好ましくは６０～９５質量％である。
【0031】
マーセル化剤としては、出発原料の無水グルコース残基当たり、モル換算で、０．５～２０倍のアルカリ金属の水酸化物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム）を使用する。
【0032】
出発原料と溶媒、マーセル化剤を混合し、反応温度０～７０℃、好ましくは１０～６０℃、かつ反応時間１５分～８時間、好ましくは３０分～７時間、マーセル化処理を行う。その後、カルボキシメチル化剤（例えば、モノクロロ酢酸ナトリウム）をグルコース残基当たり、モル換算で、０．０５～１０．０倍添加し、反応温度３０～９０℃、好ましくは４０～８０℃、かつ反応時間３０分～１０時間、好ましくは１時間～４時間、エーテル化反応を行うことでカルボキシメチル化したセルロースを製造し得る。
【0033】
－セルロースのサイズ－
変性パルプに含まれるセルロースは、通常繊維状であり、そのサイズ（例えば、平均繊維径、平均繊維長、アスペクト比）は、特に制限されないが、一例をあげると以下のとおりである。
変性パルプに含まれるセルロースは、通常繊維状であり、そのサイズ（例えば、平均繊維径、平均繊維長、アスペクト比）は、特に制限されないが、一例をあげると以下のとおりである。
【0034】
平均繊維径は、通常、５００ｎｍ以上、好ましくは７００ｎｍ以上、好ましくは９００ｎｍ以上である。これにより、パルプに生体物質を固定化させる際、未反応の生体物質をメンブランフィルター等を用いて容易に分離できる。上限は特に制限ないが、通常は６０μｍ以下、好ましくは５０μｍ以下である。
【0035】
平均繊維長は、通常、５００μｍ以上、好ましくは７００μｍ以上、より好ましくは８００μｍ以上である。上限は、特に限定されないが、通常、３，０００μｍ以下、好ましくは２，８００μｍ以下、より好ましくは２，５００μｍ以下である。
【0036】
セルロースのアスペクト比は、通常、３０以上、好ましくは５０以上、より好ましくは６０以上である。アスペクト比の上限は特に限定されないが、通常１０００以下、好ましくは５００以下、より好ましくは１００以下である。
【0037】
セルロースのサイズは、化学変性処理、機械的処理（リファイナー、ビーター等の離解機による処理）の条件により調製できる。
【0038】
－末端カルボキシル基量－
変性パルプに含まれるセルロースの末端カルボキシル基量は、好ましくは０．６～３．０ｍｍｏｌ／ｇ、より好ましくは１．０～２．０ｍｍｏｌ／ｇがより好ましい。末端カルボキシル基量は、酸化処理の条件（例えば、酸化剤の添加量、反応時間）をコントロールして調整できる。末端カルボキシル基量は、電気伝導度の変動から算出できる。
変性パルプに含まれるセルロースの末端カルボキシル基量は、好ましくは０．６～３．０ｍｍｏｌ／ｇ、より好ましくは１．０～２．０ｍｍｏｌ／ｇがより好ましい。末端カルボキシル基量は、酸化処理の条件（例えば、酸化剤の添加量、反応時間）をコントロールして調整できる。末端カルボキシル基量は、電気伝導度の変動から算出できる。
【0039】
［生体物質］
生体物質としては、例えば、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質が挙げられ、固定化材料の用途に応じて選択すればよい。核酸としては、例えば、ＤＮＡ（２本鎖又は１本鎖）、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、ＰＮＡが挙げられる。核酸は、遺伝子、アプタマー、それらの一部でもよい。アミノ酸は、Ｌ体、Ｄ体、ラセミ体のいずれでもよく、人工アミノ酸、天然アミノ酸でもよい。ペプチド及びタンパク質は、酵素、抗体、ホルモン、アプタマーのいずれでもよい。生体物質は、生物（例えば、微生物（細菌、ウイルス、真菌）、原生動物、植物、動物）のいずれに由来してもよく、人工物でもよい。生体物質の構造・サイズ（例えば、分子量（鎖長、三次元構造）、アミノ酸配列、塩基配列）は限定されないが、例えば核酸の場合、通常７０塩基以下、６５塩基以下、又は６０塩基以下、好ましくは、５５塩基以下、５０塩基以下、又は４５塩基以下、より好ましくは４０塩基以下、３５塩基以下、又は３０塩基以下である。下限は、通常３塩基以上、４塩基以上、又は５塩基以上、好ましくは６塩基以上、７塩基以上、又は８塩基以上、より好ましくは９塩基以上、１０塩基以上又は１１塩基以上、更に好ましくは１２塩基以上、１３塩基以上、１４塩基以上、又は１５塩基以上である。
生体物質としては、例えば、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質が挙げられ、固定化材料の用途に応じて選択すればよい。核酸としては、例えば、ＤＮＡ（２本鎖又は１本鎖）、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、ＰＮＡが挙げられる。核酸は、遺伝子、アプタマー、それらの一部でもよい。アミノ酸は、Ｌ体、Ｄ体、ラセミ体のいずれでもよく、人工アミノ酸、天然アミノ酸でもよい。ペプチド及びタンパク質は、酵素、抗体、ホルモン、アプタマーのいずれでもよい。生体物質は、生物（例えば、微生物（細菌、ウイルス、真菌）、原生動物、植物、動物）のいずれに由来してもよく、人工物でもよい。生体物質の構造・サイズ（例えば、分子量（鎖長、三次元構造）、アミノ酸配列、塩基配列）は限定されないが、例えば核酸の場合、通常７０塩基以下、６５塩基以下、又は６０塩基以下、好ましくは、５５塩基以下、５０塩基以下、又は４５塩基以下、より好ましくは４０塩基以下、３５塩基以下、又は３０塩基以下である。下限は、通常３塩基以上、４塩基以上、又は５塩基以上、好ましくは６塩基以上、７塩基以上、又は８塩基以上、より好ましくは９塩基以上、１０塩基以上又は１１塩基以上、更に好ましくは１２塩基以上、１３塩基以上、１４塩基以上、又は１５塩基以上である。
【0040】
［固定化］
固定化材料において、生体物質は、変性パルプに固定化されている。固定化は、変性パルプに含まれるセルロースの末端カルボキシル基に由来する結合であればよく、例えば、アミド結合を有する基が挙げられる。アミド結合を有する基は、アミド結合そのものでもよいが、アミド結合以外の部分（スペーサー）を含む基でもよい。スペーサーとしては、例えば、エチニル基とアジ基間の付加環化反応により形成される基、アルキル基、オキシアルキレン基が挙げられ、固定化効率がより高い点で、エチニル基とアジ基間の付加環化反応により形成される基を含む結合が好ましい。
固定化材料において、生体物質は、変性パルプに固定化されている。固定化は、変性パルプに含まれるセルロースの末端カルボキシル基に由来する結合であればよく、例えば、アミド結合を有する基が挙げられる。アミド結合を有する基は、アミド結合そのものでもよいが、アミド結合以外の部分（スペーサー）を含む基でもよい。スペーサーとしては、例えば、エチニル基とアジ基間の付加環化反応により形成される基、アルキル基、オキシアルキレン基が挙げられ、固定化効率がより高い点で、エチニル基とアジ基間の付加環化反応により形成される基を含む結合が好ましい。
【0041】
アミド結合は、変性パルプの末端カルボキシル基と、生体物質のアミノ基（好ましくは、アミノ化修飾された生体物質のアミノ基）との間に少なくとも形成されることが好ましく、このほかに第２のアミド結合が他の部分に形成されていてもよい。
【0042】
アミド結合を含む結合は、アミド結合をその一部に含めばよく、そのほかの部分（例えば、オキシエチレン基、アミド結合、アルキル基等のスペーサーとしての基）を含んでいてもよい。例えば、一般式（１）で表される結合が好ましい。
一般式（１）中のｐは、０～１０の整数であり、１～８が好ましく、１～６がより好ましい。一般式（１）中、カルボニル結合（－Ｃ（＝Ｏ）－）は、変性パルプが有するカルボキシル基に由来する結合である。Ａ，Ｂは、それぞれ変性パルプ、生体物質を表す。一般式（１）中、Ａに隣接するカルボニル結合（－Ｃ（＝Ｏ）－）は、変性パルプが有するカルボキシル基に由来する結合である。生体物質が核酸の場合、通常、スペーサーの末端と核酸のリン酸基又は水酸基とが結合している。
【化1】
【0043】
エチニル基とアジ基間の付加環化反応により形成される基を含む結合は、変性パルプに（好ましくは、カルボキシル基に）導入されたエチニル基（－Ｃ≡Ｃ－）と生体物質に導入されたアジ基（－Ｎ＝Ｎ＋＝Ｎ－）との間に、又は、変性パルプに（好ましくは、カルボキシル基に）導入されたアジ基と生体物質に導入されたエチニル基との間に形成される。エチニル基とアジ基間の付加環化反応により形成される基としては、例えば、下記の式（２－１）、（２－２）、（２－３）で表される、トリアジン残基を少なくともその一部に含む結合が挙げられる。
【化2】
【0044】
アミド基と、スペーサーとしてのエチニル基とアジ基間の付加環化反応により形成される基を含む結合は、上記基を含めばよく、そのほかの部分（例えば、オキシエチレン基、アミド結合、アルキル基等のスペーサーとしての基）を有していてもよい。例えば、一般式（２－４）で表される結合が挙げられる。
一般式（２－４）中、Ａ、Ｂは、それぞれ変性パルプ、生体物質を表す。Ｒは、上記式（２－１）～（２－３）のいずれかで表される基であり、結合手がどちらであってもよい。Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立してスペーサー基（例えば、オキシアルキレン基、アミド結合、アルキレン基、から選ばれる１つ、又は２つ以上の組み合わせ）か又は直接結合を表す。オキシアルキレン基としては、オキシエチレン基、オキシプロピレン基等のオキシアルキレン単位が少なくとも１つ（例えば、１０以下、８以下、６以下又は４以下）含む基が好ましい。アルキレン基の炭素原子数は、例えば、１０以下、８以下、６以下、４以下又は２以下である。
【化3】
【0045】
一般式（２－４）で表される結合としては、一般式（２－５）で表される結合が好ましい。
【化4】
【0046】
一般式（２－５）中、Ａ１Ｏ、Ａ２Ｏは、それぞれ独立してオキシエチレン基又はオキシプロピレン基を表し、オキシエチレン基が好ましい。ｍ１は、１～１０の整数を表し、１～８が好ましく、１～６がより好ましく、１～４が更に好ましい。ｍ２、ｍ３は、それぞれ独立して０～１０の整数を表し、０～８が好ましく、０～６がより好ましく、０～４が更に好ましい（０の場合、直接結合を表す）。ｎ１、ｎ２は、それぞれ独立して０～５０の整数を表し、０～４０、０～３０、０～２０が好ましく、０～１５がより好ましい（０の場合、直接結合を表す）。ｑ、ｒ、ｓは、０又は１を表し、０、ｑは０が好ましく、ｒ、ｓは１が好ましい（０の場合、直接結合を表す）。Ａ，Ｂは、それぞれ変性パルプ、生体物質を表す。Ｒは、上記式（２－１）～（２－３）のいずれかで表される基であり、結合手がどちらであってもよい。一般式（２－５）中、Ａに隣接するカルボニル結合（－Ｃ（＝Ｏ）－）は、変性パルプが有するカルボキシル基に由来する結合である。生体物質が核酸の場合、通常、スペーサーの末端と核酸のリン酸基又は水酸基とが結合している。
【0047】
固定化材料における、変性材料の末端カルボキシル基に対する生体物質の重量比率は、通常０．０２以上、好ましくは０．０３以上、より好ましくは０．０４以上である。上限は特にないが、通常は０．１以下、０．９以下、又は０．８以下である。
【0048】
［任意成分］
固定化材料は、変性パルプ及び生体物質以外の任意成分を含んでもよい。任意成分としては、例えば、識別物質が挙げられる。識別物質は、通常、生体物質に結合している。識別物質としては、例えば、蛍光・発光マーカー、識別用酵素、放射性同位体、補欠分子族、金属粒子、タンパク質－タンパク質間結合ペア、及びタンパク質－抗体間結合ペア、酵素基質、アフィニティ分子、リガンド、レセプター、ビオチン分子、アビジン分子、ストレプトアビジン分子、消光剤が挙げられる。蛍光マーカーとしては、例えば、フルオレセイン（ＦＡＭ）、５－カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン－５－イソチオシアネート（５－ＦＩＴＣ）、６－カルボキシ－４'，５'－ジクロロ－２'，７'－ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、テトラクロロ－６－カルボキシフルオレセイン等のフルオレセイン系色素、Ｃｙ－３、Ｃｙ－５等のスルホン化／非スルホン化シアニン色素、ローダミン、ローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、ローダミン１２３、スルホローダミンＢ（ＳＲ）等のローダミン系色素、ピロニンＢ、ピロニンＧ等のピロニン系色素、アクリジンオレンジ、９－アミノアクリジン、Ａｔｔ４９５等のアクリジン系色素、オキサジン１、ナイルレッド、ナイルブルー等のオキサジン系色素が挙げられる。発光マーカーとしては、例えば、ルシフェリン、及びイクオリンが挙げられる。識別用酵素としては、例えば、ガラクトースオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、グルクロニダーゼ、アルカリホスファターゼ等のホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ等のペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、及びコリンエステラーゼが挙げられる。放射性同位体としては、例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉが挙げられる。消光剤としては、例えば、テオフィリン、ジニトロアニリンとのジニトロフェニル基を有する化合物、ＤＡＢＣＹＬ（４－（（－４－（ジメチルアミノ）－フェニル）－アゾ）－安息香酸）、ＢＨＱ－１、ＢＨＱ－２等のＢＨＱ類が挙げられる。
固定化材料は、変性パルプ及び生体物質以外の任意成分を含んでもよい。任意成分としては、例えば、識別物質が挙げられる。識別物質は、通常、生体物質に結合している。識別物質としては、例えば、蛍光・発光マーカー、識別用酵素、放射性同位体、補欠分子族、金属粒子、タンパク質－タンパク質間結合ペア、及びタンパク質－抗体間結合ペア、酵素基質、アフィニティ分子、リガンド、レセプター、ビオチン分子、アビジン分子、ストレプトアビジン分子、消光剤が挙げられる。蛍光マーカーとしては、例えば、フルオレセイン（ＦＡＭ）、５－カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン－５－イソチオシアネート（５－ＦＩＴＣ）、６－カルボキシ－４'，５'－ジクロロ－２'，７'－ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、テトラクロロ－６－カルボキシフルオレセイン等のフルオレセイン系色素、Ｃｙ－３、Ｃｙ－５等のスルホン化／非スルホン化シアニン色素、ローダミン、ローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、ローダミン１２３、スルホローダミンＢ（ＳＲ）等のローダミン系色素、ピロニンＢ、ピロニンＧ等のピロニン系色素、アクリジンオレンジ、９－アミノアクリジン、Ａｔｔ４９５等のアクリジン系色素、オキサジン１、ナイルレッド、ナイルブルー等のオキサジン系色素が挙げられる。発光マーカーとしては、例えば、ルシフェリン、及びイクオリンが挙げられる。識別用酵素としては、例えば、ガラクトースオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、グルクロニダーゼ、アルカリホスファターゼ等のホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ等のペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、及びコリンエステラーゼが挙げられる。放射性同位体としては、例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉが挙げられる。消光剤としては、例えば、テオフィリン、ジニトロアニリンとのジニトロフェニル基を有する化合物、ＤＡＢＣＹＬ（４－（（－４－（ジメチルアミノ）－フェニル）－アゾ）－安息香酸）、ＢＨＱ－１、ＢＨＱ－２等のＢＨＱ類が挙げられる。
【0049】
［２．固定化材料の製造方法］
上述の生体物質固定化材料は、変性パルプに生体物質を固定化させることにより製造できる。
上述の生体物質固定化材料は、変性パルプに生体物質を固定化させることにより製造できる。
【0050】
［アミド結合の形成］
固定化を、アミド結合を含む結合を介して行う場合の固定化方法としては、例えば、生体物質と、変性パルプの末端カルボキシル基との間にアミド結合を含む結合を形成させる方法が挙げられる。第一の例としては、生体物質にあらかじめアミノ修飾を行い、これに変性パルプのセルロースの末端カルボキシル基を反応させ、アミド結合を形成させる方法が挙げられる。これにより、固定化効率を高めることができる。アミノ修飾は、例えば、アミノ基を含む基（例えば、アルキルアミノ基等の、末端にアミノ基を含む基）を生体物質に導入することによることができる。アルキルアミノ基としては、例えば、炭素原子数１０以下、好ましくは８以下のアルキル基を含むアルキルアミノ基が好ましい。
固定化を、アミド結合を含む結合を介して行う場合の固定化方法としては、例えば、生体物質と、変性パルプの末端カルボキシル基との間にアミド結合を含む結合を形成させる方法が挙げられる。第一の例としては、生体物質にあらかじめアミノ修飾を行い、これに変性パルプのセルロースの末端カルボキシル基を反応させ、アミド結合を形成させる方法が挙げられる。これにより、固定化効率を高めることができる。アミノ修飾は、例えば、アミノ基を含む基（例えば、アルキルアミノ基等の、末端にアミノ基を含む基）を生体物質に導入することによることができる。アルキルアミノ基としては、例えば、炭素原子数１０以下、好ましくは８以下のアルキル基を含むアルキルアミノ基が好ましい。
【0051】
［エチニル基とアジ基間の付加環化反応により形成される基を含む結合の形成］
一方、第二の例としては、アジ基を含む基及びアミド結合、並びにエチニル基を含む基を、それぞれ変性パルプと生体物質とに導入して、又は、エチニル基を含む基及びアミド結合、並びにアジ基を含む基を、それぞれ変性パルプと生体物質とに導入して、両者をクリック反応させてエチニル基とアジ基の間に付加環化反応を生じさせ、トリアゾール環を形成させる方法が挙げられる。エチニル基を含む基、アジ基を含む基としては、その構造中（通常は末端に）にエチニル基、アジ基を含めばよく、他の部分（例えば、オキシエチレン基、アミド結合、アルキル基等のスペーサー）を含み得る。エチニル基を含む基としては、例えば、ジベンジルシクロオキシル残基、ジシクロノニン残基が挙げられる。これらが導入された変性パルプ、生体物質の構造を下記一般式（４－１）、（４－２）に示す。
Ｒ１－Ｂ （４－２）
一般式（４－１）および（４－２）中のＲ１は、アジ基、アルキニル基（例えば、炭素原子数１０以下のモノアルキニル基）又は下記式（４－３）、（４－４）で表される基のいずれかであり、それ以外の置換基の定義は前述のとおりである。
一方、第二の例としては、アジ基を含む基及びアミド結合、並びにエチニル基を含む基を、それぞれ変性パルプと生体物質とに導入して、又は、エチニル基を含む基及びアミド結合、並びにアジ基を含む基を、それぞれ変性パルプと生体物質とに導入して、両者をクリック反応させてエチニル基とアジ基の間に付加環化反応を生じさせ、トリアゾール環を形成させる方法が挙げられる。エチニル基を含む基、アジ基を含む基としては、その構造中（通常は末端に）にエチニル基、アジ基を含めばよく、他の部分（例えば、オキシエチレン基、アミド結合、アルキル基等のスペーサー）を含み得る。エチニル基を含む基としては、例えば、ジベンジルシクロオキシル残基、ジシクロノニン残基が挙げられる。これらが導入された変性パルプ、生体物質の構造を下記一般式（４－１）、（４－２）に示す。
【化5】
一般式（４－１）および（４－２）中のＲ１は、アジ基、アルキニル基（例えば、炭素原子数１０以下のモノアルキニル基）又は下記式（４－３）、（４－４）で表される基のいずれかであり、それ以外の置換基の定義は前述のとおりである。
【0052】
【化6】
【0053】
一般式（４－１）および（４－２）の化合物は、好ましくはそれぞれ一般式（４－５）および（４－６）で表される化合物である。
【化7】
【0054】
一般式（４－５）および（４－６）中の置換基の定義は前述のとおりである。アミド結合及びエチニル基、又は、アミド結合及びアジ基が導入された変性パルプの製法は特に限定されないが、例えば、アミノ基とエテニル基を末端に有する化合物、又は、アミノ基とアジ基を末端に有する化合物(例えば、式の、アミノ結合を、変性パルプに結合する反応が挙げられる。この反応において、アミノ基とエチニル基を末端に有する化合物、又は、アミノ基とアジ基を末端に有する化合物（例えば、一般式：ＮＨ２－Ｒａ－Ｒ１で表される化合物；置換基の定義は上述のとおり）の、変性パルプのカルボキシル基に対する重量比は、好ましくは３以上、より好ましくは７以上、更に好ましくは９以上である。上限は、好ましくは２０以下、より好ましくは１５以下、更に好ましくは１２以下である。エチニル基、又はアジ基が導入された生体物質は、常法により調製できる。
【0055】
クリック反応の際、必要に応じて触媒（例えば、Ｃｕ（Ｉ）等の銅触媒、Ｒｂ（ＩＩ）等）を介在させてもよいが、生体物質の劣化抑制の観点から、触媒不使用が好ましい。
【0056】
－縮合剤－
変性パルプに生体物質を固定化する際には、縮合剤を、少なくとも一部の反応において用いることが好ましく、変性パルプにアミド結合する際に用いることがより好ましい。縮合剤としては、例えば、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）、トリフルオロメタンスルホン酸（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－(２－オクトキシ－２－オキソエチル）ジメチルアンモニウム、２－クロロ－４，６－ジメトキシトリアジン（ＣＤＭＴ）等のトリアジン系縮合剤；１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、塩酸１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＷＳＣＤ・ＨＣｌ）、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、Ｎ－シクロヘキシル－Ｎ’－（２－モルホリノエチル）カルボジイミドメト－ｐ－トルエンスルホン酸塩（ＣＭＥ－カルボジイミド）等のカルボジイミド系縮合剤；Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）等のスクシンイミド系縮合剤が挙げられる。これらのうち、トリアジン系縮合剤が好ましく、ＤＭＴ－ＭＭがより好ましい。トリアジン系縮合剤を用いることにより、反応終了後に、未反応の生体物質を系内から容易に分離し得る。
変性パルプに生体物質を固定化する際には、縮合剤を、少なくとも一部の反応において用いることが好ましく、変性パルプにアミド結合する際に用いることがより好ましい。縮合剤としては、例えば、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）、トリフルオロメタンスルホン酸（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－(２－オクトキシ－２－オキソエチル）ジメチルアンモニウム、２－クロロ－４，６－ジメトキシトリアジン（ＣＤＭＴ）等のトリアジン系縮合剤；１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、塩酸１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＷＳＣＤ・ＨＣｌ）、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、Ｎ－シクロヘキシル－Ｎ’－（２－モルホリノエチル）カルボジイミドメト－ｐ－トルエンスルホン酸塩（ＣＭＥ－カルボジイミド）等のカルボジイミド系縮合剤；Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）等のスクシンイミド系縮合剤が挙げられる。これらのうち、トリアジン系縮合剤が好ましく、ＤＭＴ－ＭＭがより好ましい。トリアジン系縮合剤を用いることにより、反応終了後に、未反応の生体物質を系内から容易に分離し得る。
【0057】
－緩衝液－
縮合剤を用いる反応の際、必要に応じて緩衝液を用いることができる。緩衝液としては、例えば、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３－［Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）アミノ］－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－（２－ヒドロキシプロパン－３－スルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳ）、ピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、ピペラジン－１，４－ビス（２－ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）が挙げられ、ＭＥＳ緩衝液が好ましい。緩衝液のｐＨは、通常、中性付近、好ましくは６．５～７．５、６．９～７．５又は７．０～７．５である。
縮合剤を用いる反応の際、必要に応じて緩衝液を用いることができる。緩衝液としては、例えば、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３－［Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）アミノ］－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－（２－ヒドロキシプロパン－３－スルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳ）、ピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、ピペラジン－１，４－ビス（２－ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）が挙げられ、ＭＥＳ緩衝液が好ましい。緩衝液のｐＨは、通常、中性付近、好ましくは６．５～７．５、６．９～７．５又は７．０～７．５である。
【0058】
生体物質の使用量（仕込み量）の、変性パルプの末端カルボキシル基量（仕込み量）に対する比率は、通常０．００１以上、０．００５以上、好ましくは０．０１以上、０．０２以上、又は０．０３以上である。上限は特に限定されないが、通常０．１以下、好ましくは０．０９以下又は０．０８以下である。上記範囲であることにより、変性パルプに生体物質を効率的に固定化できる。
【0059】
縮合剤の使用量（仕込み量）は、変性パルプの末端カルボキシル基量（仕込み量）に対する比率が、通常５以上、好ましくは１０以上、１５以上又は２０以上である。上限は特になく、通常１５０以下、１４０以下、１３０以下又は１２０以下である。上記範囲であることにより、変性パルプに生体物質を効率的に固定化できる。
【0060】
生体物質と変性パルプを固定化させる際の反応条件は、用いる材料などによって適宜選択できるが、一例を挙げると以下のとおりである。まず変性パルプと縮合剤を反応系に添加した後、生体物質を添加し、２０～３０時間程度インキュベーションする。固定化したか否かの確認は、ＩｍａｇｅＪ等の画像処理ソフトを用いた画像解析により、例えば実施例で説明する手順で行うことができる。
【0061】
［３．生体物質固定化材料の用途］
本発明の生体物質固定化材料は、ペーパー分析デバイスとして利用できる。すなわち、サンプルに含まれる、固定化された生体物質に選択的に結合するターゲット物質の検出、集積、分離、定量のために利用できる。これにより、例えば、サンプルに含まれる遺伝子の発現量、遺伝子変異又は多型（例えば、ＳＮＰ）の解析、特定の現象にかかわる遺伝子群、分子等の候補の選抜、集積、定量、分離、発現プロファイルの分析等に利用でき、医学、薬学、農学、生物学等の幅広い分野において、基礎研究、創薬、機能性食品の開発、疾病診断法又は予防法の開発、農業技術開発、エネルギーや環境問題対策に利用できる。
本発明の生体物質固定化材料は、ペーパー分析デバイスとして利用できる。すなわち、サンプルに含まれる、固定化された生体物質に選択的に結合するターゲット物質の検出、集積、分離、定量のために利用できる。これにより、例えば、サンプルに含まれる遺伝子の発現量、遺伝子変異又は多型（例えば、ＳＮＰ）の解析、特定の現象にかかわる遺伝子群、分子等の候補の選抜、集積、定量、分離、発現プロファイルの分析等に利用でき、医学、薬学、農学、生物学等の幅広い分野において、基礎研究、創薬、機能性食品の開発、疾病診断法又は予防法の開発、農業技術開発、エネルギーや環境問題対策に利用できる。
【0062】
［サンプル（検体）］
サンプルとしては、被検体から採取済みの、ターゲット物質が含まれる可能性のあるサンプルであればよく、例えば、全血、血漿、血清、唾液、尿、リンパ液、脳脊髄液、関節液、鼻汁、腹水、眼房水、涙液、体液、喀痰、生検試料が挙げられる。被検体は、生物（例えば、微生物（細菌、ウイルス、真菌）、原生動物、植物、動物）又は生物の一部（例えば、組織、細胞）である。被検体としての動物は、通常、ヒトであるが、ヒト以外の動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、サルなどの哺乳類、ニワトリなどの鳥類）でもよい。
サンプルとしては、被検体から採取済みの、ターゲット物質が含まれる可能性のあるサンプルであればよく、例えば、全血、血漿、血清、唾液、尿、リンパ液、脳脊髄液、関節液、鼻汁、腹水、眼房水、涙液、体液、喀痰、生検試料が挙げられる。被検体は、生物（例えば、微生物（細菌、ウイルス、真菌）、原生動物、植物、動物）又は生物の一部（例えば、組織、細胞）である。被検体としての動物は、通常、ヒトであるが、ヒト以外の動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、サルなどの哺乳類、ニワトリなどの鳥類）でもよい。
【0063】
［ターゲット物質］
ターゲット物質は、固定化された生体物質に選択的に結合する物質であればよく、例えば、核酸、タンパク質、分子が挙げられる。ＤＮＡを固定化した場合、そのＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列を含むＤＮＡのほか、ＤＮＡと結合し得る分子もターゲット物質であり得る。アプタマーを固定化した場合、アプタマーに結合する核酸、ペプチド、タンパク質、分子がターゲット物質であり得る。
ターゲット物質は、固定化された生体物質に選択的に結合する物質であればよく、例えば、核酸、タンパク質、分子が挙げられる。ＤＮＡを固定化した場合、そのＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列を含むＤＮＡのほか、ＤＮＡと結合し得る分子もターゲット物質であり得る。アプタマーを固定化した場合、アプタマーに結合する核酸、ペプチド、タンパク質、分子がターゲット物質であり得る。
【0064】
［生体物質固定化材料の使用方法の例］
生体物質固定化担体の使用方法は、通常のマイクロアレイを用いた検出方法に準じて、識別物質、解析ソフト等を利用して行えばよい。例えば、固定化担体にサンプルを添加してインキュベーションすることにより、生体物質とサンプル中のターゲット物質を選択的に結合し、ターゲット物質結合生体物質固定化担体が得られる。ターゲット物質結合生体物質固定化担体を、生体物質の融点以上に加熱することにより、ターゲット物質を分離し、回収でき、定量が可能である。また、生体物質にあらかじめ蛍光物質を結合し、ターゲット未結合の状態では消光されるようにしておき（例えば、消光ＤＮＡ等の消光剤を結合させる）、サンプル中のターゲット物質が結合して蛍光強度を発揮させ（例えば、消光ＤＮＡが外れることにより蛍光が強まる）、ターゲット物質を分離せずとも検出、定量が可能である。
生体物質固定化担体の使用方法は、通常のマイクロアレイを用いた検出方法に準じて、識別物質、解析ソフト等を利用して行えばよい。例えば、固定化担体にサンプルを添加してインキュベーションすることにより、生体物質とサンプル中のターゲット物質を選択的に結合し、ターゲット物質結合生体物質固定化担体が得られる。ターゲット物質結合生体物質固定化担体を、生体物質の融点以上に加熱することにより、ターゲット物質を分離し、回収でき、定量が可能である。また、生体物質にあらかじめ蛍光物質を結合し、ターゲット未結合の状態では消光されるようにしておき（例えば、消光ＤＮＡ等の消光剤を結合させる）、サンプル中のターゲット物質が結合して蛍光強度を発揮させ（例えば、消光ＤＮＡが外れることにより蛍光が強まる）、ターゲット物質を分離せずとも検出、定量が可能である。
【0065】
［４．生体物質固定化材料を製造するためのキット］
生体物質固定化材料を製造するためのキットは、酸化パルプ、縮合剤を少なくとも含み、必要に応じて他の構成要素（たとえば、クリック反応用試薬、器具、容器、説明書）を含んでもよい。キットを用いることにより、所望の生体物質を酸化パルプへ固定化し、上記生体物質固定化材料を簡便に製造できる。
生体物質固定化材料を製造するためのキットは、酸化パルプ、縮合剤を少なくとも含み、必要に応じて他の構成要素（たとえば、クリック反応用試薬、器具、容器、説明書）を含んでもよい。キットを用いることにより、所望の生体物質を酸化パルプへ固定化し、上記生体物質固定化材料を簡便に製造できる。
【実施例0066】
製造例１（ＴＥＭＰＯ酸化パルプの製造方法）
針葉樹由来の漂白済み未叩解クラフトパルプ（ＮＢＫＰ、白色度８５％）５００ｇ（絶乾）を、ＴＥＭＰＯ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社）７８０ｍｇと臭化ナトリウム７５．５ｇとを溶解した水溶液５００ｍｌに加え、パルプが均一に分散されるまで撹拌した。反応系に次亜塩素酸ナトリウム水溶液を６．０ｍｍｏｌ／ｇになるように添加し、酸化反応を開始した。反応中は系内のｐＨが低下するが、３Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を逐次添加し、ｐＨ１０に調整した。次亜塩素酸ナトリウムを消費し、系内のｐＨが変化しなくなった時点で反応を終了した。反応後の混合物に１０％塩酸を加えｐＨ３に調整し、ガラスフィルターで濾過してパルプ分離し、パルプを十分に水洗することで、ＴＥＭＰＯ酸化パルプ（カルボキシル基量：１．４ｍｍｏｌＣＯＯＨ／ｇ、セルロースの平均繊維径２９．６μｍ、平均繊維長１．９９６ｍｍ、アスペクト比６７．４）を得た。この時のパルプ収率は９０％であり、酸化反応に要した時間は９０分であった。
針葉樹由来の漂白済み未叩解クラフトパルプ（ＮＢＫＰ、白色度８５％）５００ｇ（絶乾）を、ＴＥＭＰＯ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社）７８０ｍｇと臭化ナトリウム７５．５ｇとを溶解した水溶液５００ｍｌに加え、パルプが均一に分散されるまで撹拌した。反応系に次亜塩素酸ナトリウム水溶液を６．０ｍｍｏｌ／ｇになるように添加し、酸化反応を開始した。反応中は系内のｐＨが低下するが、３Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を逐次添加し、ｐＨ１０に調整した。次亜塩素酸ナトリウムを消費し、系内のｐＨが変化しなくなった時点で反応を終了した。反応後の混合物に１０％塩酸を加えｐＨ３に調整し、ガラスフィルターで濾過してパルプ分離し、パルプを十分に水洗することで、ＴＥＭＰＯ酸化パルプ（カルボキシル基量：１．４ｍｍｏｌＣＯＯＨ／ｇ、セルロースの平均繊維径２９．６μｍ、平均繊維長１．９９６ｍｍ、アスペクト比６７．４）を得た。この時のパルプ収率は９０％であり、酸化反応に要した時間は９０分であった。
【0067】
カルボキシル基量は、以下の方法で測定した。サンプルの０．５質量％水分散体６０ｍｌを調製し、０．１Ｍ塩酸水溶液を加えてｐＨ２．５とした。その後、０．０５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を滴下してｐＨが１１になるまで電気伝導度を測定した。電気伝導度の変化が緩やかな弱酸の中和段階において消費された水酸化ナトリウム量（ａ）から、下式を用いて算出した：
カルボキシル基量〔ｍｍｏｌ／ｇカルボキシル化セルロース〕＝ａ〔ｍｌ〕×０．０５／カルボキシル化セルロース質量〔ｇ〕。
カルボキシル基量〔ｍｍｏｌ／ｇカルボキシル化セルロース〕＝ａ〔ｍｌ〕×０．０５／カルボキシル化セルロース質量〔ｇ〕。
【0068】
微細セルロース繊維の平均繊維径、繊維長は、ファイバーテスター（Ｌｏｒｅｎｔｚｅｎ＆Ｗｅｔｔｒｅ社）を用いて測定した。微細セルロース繊維の平均アスペクト比は、式：平均アスペクト比＝平均繊維長／平均繊維径により算出した。
【0069】
実施例１（ＤＮＡの仕込み量がＴ15－Ｃｙ３の修飾量に及ぼす影響）
（１）ＴＯＰ－Ｔ15－Ｃｙ３の調製
製造例１で調製したＴＥＭＰＯ酸化パルプをＭＥＳ（ｐＨ７．４、ナカライテスク社製）に溶解し、縮合剤ＤＭＴ－ＭＭ（富士フィルム和光純薬社製）を添加し反応させた。次いで、５´末端側にアミノヘキシル基を有し３´末端側が蛍光標識されたＤＮＡサンプルＴ15－Ｃｙ３（ＮＨ2－（ＣＨ2）6－ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ－Ｃｙ３：配列番号１）とＮａＣｌ（ナカライテスク社製）を添加して２４時間インキュベーションし、ＴＯＰ－Ｐｒｏｂｅ－ｓ１５を得た。ＤＮＡサンプルの仕込み量（ＴＯＰのカルボキシル基量に対する比率）は、表１に示す範囲で調整した。縮合剤の仕込み量（ＴＯＰのカルボキシル基量に対する比率）、反応系中のＮａＣｌ濃度は、表１に示す数値とした。なお、以下の実施例も含め、ＤＮＡサンプルに用いた合成オリゴＤＮＡは、つくばオリゴサービス株式会社より購入した。購入時に滅菌水に溶かし－２０℃で保管し、使用直前に溶解して使用した。
（１）ＴＯＰ－Ｔ15－Ｃｙ３の調製
製造例１で調製したＴＥＭＰＯ酸化パルプをＭＥＳ（ｐＨ７．４、ナカライテスク社製）に溶解し、縮合剤ＤＭＴ－ＭＭ（富士フィルム和光純薬社製）を添加し反応させた。次いで、５´末端側にアミノヘキシル基を有し３´末端側が蛍光標識されたＤＮＡサンプルＴ15－Ｃｙ３（ＮＨ2－（ＣＨ2）6－ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ－Ｃｙ３：配列番号１）とＮａＣｌ（ナカライテスク社製）を添加して２４時間インキュベーションし、ＴＯＰ－Ｐｒｏｂｅ－ｓ１５を得た。ＤＮＡサンプルの仕込み量（ＴＯＰのカルボキシル基量に対する比率）は、表１に示す範囲で調整した。縮合剤の仕込み量（ＴＯＰのカルボキシル基量に対する比率）、反応系中のＮａＣｌ濃度は、表１に示す数値とした。なお、以下の実施例も含め、ＤＮＡサンプルに用いた合成オリゴＤＮＡは、つくばオリゴサービス株式会社より購入した。購入時に滅菌水に溶かし－２０℃で保管し、使用直前に溶解して使用した。
【0070】
（２）ＴＯＰ－Ｔ15－Ｃｙ３の蛍光観察と蛍光強度の定量
各条件で得たＴＯＰ－Ｔ15－Ｃｙ３について、以下の要領でＧｒａｙ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙを算出した。ＴＯＰ－Ｔ15－Ｃｙ３を水とともにスライドグラス上に滴下し、カバーグラスをかけて標本を作製し、光学顕微鏡で観察し、パルプが収まるように観察範囲を選択した。その後、蛍光顕微鏡にて標本の同じ範囲を観察して撮影し（ＩＳＯ４００、ＳＳ１／２５、Ｇ励起）、８ｂｉｔ化して画像処理ソフトＩｍａｇｅＪを用いて単位面積当たりのＧｒａｙ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（バックグラウンドの強度を差し引いた値）の平均値を算出した（Ｎ＝５、図１）。
各条件で得たＴＯＰ－Ｔ15－Ｃｙ３について、以下の要領でＧｒａｙ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙを算出した。ＴＯＰ－Ｔ15－Ｃｙ３を水とともにスライドグラス上に滴下し、カバーグラスをかけて標本を作製し、光学顕微鏡で観察し、パルプが収まるように観察範囲を選択した。その後、蛍光顕微鏡にて標本の同じ範囲を観察して撮影し（ＩＳＯ４００、ＳＳ１／２５、Ｇ励起）、８ｂｉｔ化して画像処理ソフトＩｍａｇｅＪを用いて単位面積当たりのＧｒａｙ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（バックグラウンドの強度を差し引いた値）の平均値を算出した（Ｎ＝５、図１）。
【0071】
実施例２（縮合剤の仕込み量がＴ15－Ｃｙ３の修飾量に及ぼす影響）
縮合剤の仕込み量を表１に示す範囲で調整し、ＤＮＡサンプルの仕込み量及び反応系中のＮａＣｌ濃度を表１に示す数値としたほかは、実施例１と同様に行った（Ｎ＝５、図２）。
縮合剤の仕込み量を表１に示す範囲で調整し、ＤＮＡサンプルの仕込み量及び反応系中のＮａＣｌ濃度を表１に示す数値としたほかは、実施例１と同様に行った（Ｎ＝５、図２）。
【0072】
実施例３（反応系中のＮａＣｌ濃度がＴ15－Ｃｙ３の修飾量に及ぼす影響）
反応系中のＮａＣｌ濃度を表１に示す範囲で調整し、ＤＮＡサンプルの仕込み量及び縮合剤を表１に示す数値としたほかは、実施例１と同様に行った（Ｎ＝５、図３）。
反応系中のＮａＣｌ濃度を表１に示す範囲で調整し、ＤＮＡサンプルの仕込み量及び縮合剤を表１に示す数値としたほかは、実施例１と同様に行った（Ｎ＝５、図３）。
【0073】
【表1】
【0074】
ＤＮＡの仕込み量が多いと、Ｇｒａｙ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙも上昇し、仕込み量０．０５のときのＧｒａｙ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙは７０μｍ-2に達した（図１）。また、縮合剤の仕込み量が多いほどＧｒａｙ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙが上昇した（図２）。一方で、ＮａＣｌ濃度は０～５００ｍＭの間でＧｒａｙ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙに影響を与えていないようであった（図３）。すなわち、ＤＮＡの仕込み量、縮合剤の仕込み量が多いほどパルプへのＴ15－Ｃｙ３の固定化量が高まり、一方、ＮａＣｌ濃度は固定化量への影響は低いことが示された。
【0075】
実施例４（ＴＯＰ－Ｐｒｏｂｅ－ｓ１５のハイブリダイゼーション試験）
（１）ＴＯＰ－Ｐｒｏｂｅ－ｓ１５の調製
ＴＥＭＰＯ－ｏｘｉｄｉｚｅｄ ＮＢＫＰ（ＴＯＰ）（カルボキシル基量：１．４ｍｍｏｌＣＯＯＨ／ｇ）をＭＥＳ（ｐＨ７．４）に溶解し、縮合剤ＤＭＴ－ＭＭを作用させた。次いで、５´末端側にアミノヘキシル基を有するＤＮＡサンプルＰｒｏｂｅ－ｓ１５（ＮＨ2－（ＣＨ2）6－ＴＡＧ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＧＣ ＴＣＣ：配列番号２）を添加して２４時間インキュベーションし、ＴＯＰ－Ｐｒｏｂｅ－ｓ１５を得た。縮合剤の、仕込み量［ＤＭＴ－ＭＭ］／［ＣＯＯＨ］＝１００、ＤＮＡの仕込み量［Ｐｒｏｂｅ－ｓ１５］／［ＣＯＯＨ］＝０．０５とした。系内にＮａＣｌは添加しなかった。
（１）ＴＯＰ－Ｐｒｏｂｅ－ｓ１５の調製
ＴＥＭＰＯ－ｏｘｉｄｉｚｅｄ ＮＢＫＰ（ＴＯＰ）（カルボキシル基量：１．４ｍｍｏｌＣＯＯＨ／ｇ）をＭＥＳ（ｐＨ７．４）に溶解し、縮合剤ＤＭＴ－ＭＭを作用させた。次いで、５´末端側にアミノヘキシル基を有するＤＮＡサンプルＰｒｏｂｅ－ｓ１５（ＮＨ2－（ＣＨ2）6－ＴＡＧ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＧＣ ＴＣＣ：配列番号２）を添加して２４時間インキュベーションし、ＴＯＰ－Ｐｒｏｂｅ－ｓ１５を得た。縮合剤の、仕込み量［ＤＭＴ－ＭＭ］／［ＣＯＯＨ］＝１００、ＤＮＡの仕込み量［Ｐｒｏｂｅ－ｓ１５］／［ＣＯＯＨ］＝０．０５とした。系内にＮａＣｌは添加しなかった。
【0076】
（２）ハイブリダイゼーション処理
ＴＯＰ－Ｐｒｏｂｅ－ｓ１５を５００ｍＭ ＮａＣｌ １０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ７．４）に添加した系を２つ用意し、それぞれに２種類の検体を添加した。２種類の検体は、Ｃｏｍｐ－ＦＡＭ（ＦＡＭ－ＧＧＡ ＧＣＴ ＧＧＴ ＧＧＣ ＣＴＡ：配列番号３）、ＮＣＴ－ＦＡＭ（ＦＡＭ－ＴＡＧ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＧＣ ＴＣＣ：配列番号２）であり、それぞれの有する塩基配列は、Ｐｒｏｂｅ－ｓ１５のＤＮＡに対する相補鎖及び非相補鎖である。各検体の添加量は、１０-10～１０-5Ｍの範囲で調整した。各検体を添加した後、２５℃で１時間インキュベーションした後、ハイブリダイゼーション時に用いたのと同じ緩衝液（すなわち、５００ｍＭ ＮａＣｌ １０ｍＭ ＭＥＳ）にて３回洗浄して、観察用試料（ＴＯＰ－Ｐｒｏｂｅ－ｓ１５＋Ｃｏｍｐ－ＦＡＭ、ＴＯＰ－Ｐｒｏｂｅ－ｓ１５＋ＮＣＴ－ＦＡＭ）を得た。
ＴＯＰ－Ｐｒｏｂｅ－ｓ１５を５００ｍＭ ＮａＣｌ １０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ７．４）に添加した系を２つ用意し、それぞれに２種類の検体を添加した。２種類の検体は、Ｃｏｍｐ－ＦＡＭ（ＦＡＭ－ＧＧＡ ＧＣＴ ＧＧＴ ＧＧＣ ＣＴＡ：配列番号３）、ＮＣＴ－ＦＡＭ（ＦＡＭ－ＴＡＧ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＧＣ ＴＣＣ：配列番号２）であり、それぞれの有する塩基配列は、Ｐｒｏｂｅ－ｓ１５のＤＮＡに対する相補鎖及び非相補鎖である。各検体の添加量は、１０-10～１０-5Ｍの範囲で調整した。各検体を添加した後、２５℃で１時間インキュベーションした後、ハイブリダイゼーション時に用いたのと同じ緩衝液（すなわち、５００ｍＭ ＮａＣｌ １０ｍＭ ＭＥＳ）にて３回洗浄して、観察用試料（ＴＯＰ－Ｐｒｏｂｅ－ｓ１５＋Ｃｏｍｐ－ＦＡＭ、ＴＯＰ－Ｐｒｏｂｅ－ｓ１５＋ＮＣＴ－ＦＡＭ）を得た。
【0077】
（３）ＴＯＰ－Ｔ15－Ｃｙ３の蛍光観察と蛍光強度の定量
各観察用試料（ＴＯＰ－Ｐｒｏｂｅ－ｓ１５＋Ｃｏｍｐ－ＦＡＭ、ＴＯＰ－Ｐｒｏｂｅ－ｓ１５＋ＮＣＴ－ＦＡＭ）について、撮影条件をＩＳＯ４００、ＳＳ１／５、Ｂ励起に変更したほかは実施例１（２）に示したのと同様の方法で、Ｇｒａｙ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙを算出した（図４、Ｎ＝７）。
検体の添加量が１０-8～１０-5Ｍにおいて、ＴＯＰ－Ｐｒｏｂｅ－ｓ１５＋Ｃｏｍｐ－ＦＡＭ（相補鎖）のＧｒａｙ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙが上昇していたのに対し、ＴＯＰ－Ｐｒｏｂｅ－ｓ１５＋ＮＣＴ－ＦＡＭ（非相補鎖）においてはＧｒａｙ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙは観察されなかった。すなわち、ＴＯＰ－Ｐｒｏｂｅ－ｓ１５は、１０-8Ｍ（１０ｎＭ）以上の検体濃度において、検体中の相補鎖ＤＮＡと配列特異的に二重鎖を形成できることが示された。
各観察用試料（ＴＯＰ－Ｐｒｏｂｅ－ｓ１５＋Ｃｏｍｐ－ＦＡＭ、ＴＯＰ－Ｐｒｏｂｅ－ｓ１５＋ＮＣＴ－ＦＡＭ）について、撮影条件をＩＳＯ４００、ＳＳ１／５、Ｂ励起に変更したほかは実施例１（２）に示したのと同様の方法で、Ｇｒａｙ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙを算出した（図４、Ｎ＝７）。
検体の添加量が１０-8～１０-5Ｍにおいて、ＴＯＰ－Ｐｒｏｂｅ－ｓ１５＋Ｃｏｍｐ－ＦＡＭ（相補鎖）のＧｒａｙ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙが上昇していたのに対し、ＴＯＰ－Ｐｒｏｂｅ－ｓ１５＋ＮＣＴ－ＦＡＭ（非相補鎖）においてはＧｒａｙ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙは観察されなかった。すなわち、ＴＯＰ－Ｐｒｏｂｅ－ｓ１５は、１０-8Ｍ（１０ｎＭ）以上の検体濃度において、検体中の相補鎖ＤＮＡと配列特異的に二重鎖を形成できることが示された。
【0078】
実施例５及び６
（１）ＴＯＰ－ＰＥＧ－ＤＮＡ－Ｃｙ３（実施例５）の調製
製造例１で調製したＴＥＭＰＯ酸化パルプを、縮合剤ＤＭＴ－ＭＭの存在下、両末端機能化ＰＥＧであるＮ3－ＰＥＧ11－ＮＨ2とアミド縮合させ（反応Ｉ）、ＴＥＭＰＯ酸化パルプにＰＥＧをリンカーとしてアジドが固定されたＴＯＰ－ＰＥＧ－Ｎ3を調製した。続いて、ＤＮＡの３’末端にＣｙ３、５’末端にＤＢＣＯをあらかじめ結合させた状態のＤＢＣＯ－ＴＥＧ修飾ＤＮＡ（５’－ＴＡＧ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＧＣ ＴＣＣ－３’：配列番号２）を添加し、クリック反応により、ＴＯＰ－ＰＥＧ－Ｎ3末端のアジド基とＤＢＣＯ基中の－Ｃ≡Ｃ－基とを連結させ（反応ＩＩ）、ＴＯＰ－ＰＥＧ－ＤＮＡ－Ｃｙ３を調製した。一連の反応は、脱イオン水中で行い、ＮａＣｌは添加しなかった。上記反応Ｉにおいて、［ＤＭＴ－ＭＭ］／［ＣＯＯＨ］＝１００、［Ｎ3－ＰＥＧ11－ＮＨ2］／［ＣＯＯＨ］＝１０、反応温度６０℃、反応時間２４時間とした。上記反応ＩＩにおいて、［ＤＢＣＯ－ＴＥＧ修飾ＤＮＡ］／［ＣＯＯＨ］＝０．０３、反応温度６０℃、反応時間２４時間とした。
（１）ＴＯＰ－ＰＥＧ－ＤＮＡ－Ｃｙ３（実施例５）の調製
製造例１で調製したＴＥＭＰＯ酸化パルプを、縮合剤ＤＭＴ－ＭＭの存在下、両末端機能化ＰＥＧであるＮ3－ＰＥＧ11－ＮＨ2とアミド縮合させ（反応Ｉ）、ＴＥＭＰＯ酸化パルプにＰＥＧをリンカーとしてアジドが固定されたＴＯＰ－ＰＥＧ－Ｎ3を調製した。続いて、ＤＮＡの３’末端にＣｙ３、５’末端にＤＢＣＯをあらかじめ結合させた状態のＤＢＣＯ－ＴＥＧ修飾ＤＮＡ（５’－ＴＡＧ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＧＣ ＴＣＣ－３’：配列番号２）を添加し、クリック反応により、ＴＯＰ－ＰＥＧ－Ｎ3末端のアジド基とＤＢＣＯ基中の－Ｃ≡Ｃ－基とを連結させ（反応ＩＩ）、ＴＯＰ－ＰＥＧ－ＤＮＡ－Ｃｙ３を調製した。一連の反応は、脱イオン水中で行い、ＮａＣｌは添加しなかった。上記反応Ｉにおいて、［ＤＭＴ－ＭＭ］／［ＣＯＯＨ］＝１００、［Ｎ3－ＰＥＧ11－ＮＨ2］／［ＣＯＯＨ］＝１０、反応温度６０℃、反応時間２４時間とした。上記反応ＩＩにおいて、［ＤＢＣＯ－ＴＥＧ修飾ＤＮＡ］／［ＣＯＯＨ］＝０．０３、反応温度６０℃、反応時間２４時間とした。
【0079】
【化8】
【0080】
（２）ＴＯＰ－ＤＮＡ－Ｃｙ３（実施例６）の調製
製造例１で調製したＴＥＭＰＯ酸化パルプを、縮合剤ＤＭＴ－ＭＭのもと、実施例６のＤＢＣＯ－ＴＥＧ修飾ＤＮＡと同じ塩基配列（配列番号４）のＤＮＡの５´末端をアミノ基で修飾し、３´末端にＣｙｓを導入したＮＨ2－（ＣＨ2）6－ＤＮＡとアミド縮合し、ＴＯＰ－ＤＮＡ－Ｃｙ３を調製した。反応は、脱イオン水中で６０℃、２４時間行い、［ＤＭＴ－ＭＭ］／［ＣＯＯＨ］＝１００、［ＮＨ2－ＤＮＡ］／［ＣＯＯＨ］＝０．０３とした。
製造例１で調製したＴＥＭＰＯ酸化パルプを、縮合剤ＤＭＴ－ＭＭのもと、実施例６のＤＢＣＯ－ＴＥＧ修飾ＤＮＡと同じ塩基配列（配列番号４）のＤＮＡの５´末端をアミノ基で修飾し、３´末端にＣｙｓを導入したＮＨ2－（ＣＨ2）6－ＤＮＡとアミド縮合し、ＴＯＰ－ＤＮＡ－Ｃｙ３を調製した。反応は、脱イオン水中で６０℃、２４時間行い、［ＤＭＴ－ＭＭ］／［ＣＯＯＨ］＝１００、［ＮＨ2－ＤＮＡ］／［ＣＯＯＨ］＝０．０３とした。
【0081】
（３）ＴＯＰ－ＰＥＧ－ＤＮＡ－Ｃｙ３及びＴＯＰ－ＤＮＡ－Ｃｙ３の蛍光観察と蛍光強度の定量
ＴＯＰ－ＰＥＧ－ＤＮＡ－Ｃｙ３及びＴＯＰ－ＤＮＡ－Ｃｙ３のＧｒａｙ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙを、実施例１と同様の条件で測定し算出したところ（Ｎ＝５）、両方とも蛍光顕微鏡で検出できる程度の蛍光を発していた。中でも、ＴＯＰ－ＰＥＧ－ＤＮＡ－Ｃｙ３のＧｒａｙ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙは、８４．４μｍ-2に達し、ＴＯＰ－ＤＮＡ－Ｃｙｓと比較して約４．５倍の値であったことから、ＤＮＡ結合効率がより高いことが明らかであった（図５）。
ＴＯＰ－ＰＥＧ－ＤＮＡ－Ｃｙ３及びＴＯＰ－ＤＮＡ－Ｃｙ３のＧｒａｙ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙを、実施例１と同様の条件で測定し算出したところ（Ｎ＝５）、両方とも蛍光顕微鏡で検出できる程度の蛍光を発していた。中でも、ＴＯＰ－ＰＥＧ－ＤＮＡ－Ｃｙ３のＧｒａｙ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙは、８４．４μｍ-2に達し、ＴＯＰ－ＤＮＡ－Ｃｙｓと比較して約４．５倍の値であったことから、ＤＮＡ結合効率がより高いことが明らかであった（図５）。
【0082】
（４）赤外線吸収スペクトルの測定
ＴＯＰ－ＰＥＧ－ＤＮＡ、ＴＯＰ－ＰＥＧ－Ｎ3（実施例５のＤＮＡをクリック結合する前のもの）、及びＴＥＭＰＯ酸化パルプ（製造例１：ＴＯＰ）について、ＦＴ－ＩＲによる赤外線吸収スペクトルの測定を行った。その結果ＴＯＰ－ＰＥＧ－Ｎ3では、２６００ｃｍ-1付近にアジド由来のピークと、２８７０ｃｍ-1付近にＰＥＧ中のＣ－Ｈ由来のピークが確認でき、また、１６６０ｃｍ-1付近および１５４０ｃｍ-1付近にアミド結合由来のピークが確認できることから（図６、７）、ＴＯＰがアミド結合を介してアジドが固定されていることが確認できた。そして、ＴＯＰ－ＰＥＧ－ＤＮＡでは、１６００ｃｍ-1付近にＤＮＡの核酸塩基に含まれるＣ＝Ｏ、Ｃ＝Ｎ由来のピークが、また、１２００ｃｍ-1付近にＤＮＡのリン酸骨格（－ＰＯ-2－）由来のピークが確認できた（図７の矢印）。このことから、クリック反応を利用することによりＤＮＡの固定化量をより高めることができ、エチニル基とアジ基間の付加環化反応により形成される基を含む結合を有するＤＮＡ結合パルプを利用することにより、分光学的手法による反応の進行追跡が可能であることが分かった。
ＴＯＰ－ＰＥＧ－ＤＮＡ、ＴＯＰ－ＰＥＧ－Ｎ3（実施例５のＤＮＡをクリック結合する前のもの）、及びＴＥＭＰＯ酸化パルプ（製造例１：ＴＯＰ）について、ＦＴ－ＩＲによる赤外線吸収スペクトルの測定を行った。その結果ＴＯＰ－ＰＥＧ－Ｎ3では、２６００ｃｍ-1付近にアジド由来のピークと、２８７０ｃｍ-1付近にＰＥＧ中のＣ－Ｈ由来のピークが確認でき、また、１６６０ｃｍ-1付近および１５４０ｃｍ-1付近にアミド結合由来のピークが確認できることから（図６、７）、ＴＯＰがアミド結合を介してアジドが固定されていることが確認できた。そして、ＴＯＰ－ＰＥＧ－ＤＮＡでは、１６００ｃｍ-1付近にＤＮＡの核酸塩基に含まれるＣ＝Ｏ、Ｃ＝Ｎ由来のピークが、また、１２００ｃｍ-1付近にＤＮＡのリン酸骨格（－ＰＯ-2－）由来のピークが確認できた（図７の矢印）。このことから、クリック反応を利用することによりＤＮＡの固定化量をより高めることができ、エチニル基とアジ基間の付加環化反応により形成される基を含む結合を有するＤＮＡ結合パルプを利用することにより、分光学的手法による反応の進行追跡が可能であることが分かった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】