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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024074442
(43)【公開日】2024-05-31
(54)【発明の名称】抗体医薬
(51)【国際特許分類】
G01N 33/50 20060101AFI20240524BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240524BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20240524BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20240524BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20240524BHJP
C07K 16/28 20060101ALN20240524BHJP
【ＦＩ】
G01N33/50 Z
A61K39/395 N
A61P37/08
G01N33/15 Z
G01N33/53 N
C07K16/28
【審査請求】未請求
【請求項の数】5
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022185575
(22)【出願日】2022-11-21
(71)【出願人】
【識別番号】502285457
【氏名又は名称】学校法人順天堂
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】平野 隆雄
(72)【発明者】
【氏名】小▲柳▼ 明美
(72)【発明者】
【氏名】葛西 正孝
(72)【発明者】
【氏名】奥村 康
(72)【発明者】
【氏名】吾郷 日出夫
(72)【発明者】
【氏名】山本 雅貴
【テーマコード（参考）】
2G045
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G045CB01
2G045DA37
2G045FA37
4C085AA14
4C085BB11
4C085BB35
4C085CC23
4H045AA11
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
【課題】ＨＭＫ－１２ Ｆａｂが、どのようにしてマスト細胞上のＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）に結合したＩｇＥ分子を解離するのかを解明することによって、新たな抗体医薬の開発手段を提供すること。
【解決手段】標的抗原の活性部位以外の調節部位に結合して活性部位の構造を変化させて標的抗原と標的抗原受容体との親和性を制御する抗体を選択することを特徴とする抗体医薬のスクリーニング方法。
【選択図】なし
【解決手段】標的抗原の活性部位以外の調節部位に結合して活性部位の構造を変化させて標的抗原と標的抗原受容体との親和性を制御する抗体を選択することを特徴とする抗体医薬のスクリーニング方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
標的抗原の活性部位以外の調節部位に結合して活性部位の構造を変化させて標的抗原と標的抗原受容体との親和性を制御する抗体を選択することを特徴とする抗体医薬のスクリーニング方法。
【請求項2】
標的抗原と標的抗原受容体との親和性を制御する抗体が、標的抗原と標的抗原受容体との結合を阻害する抗体である、請求項１記載の抗体医薬のスクリーニング方法。
【請求項3】
標的抗原の結晶構造解析によって、標的抗原の活性部位以外の調節部位を特定する請求項２記載のスクリーニング方法。
【請求項4】
標的抗原がＩｇＥであり、標的抗原受容体がＦｃεＲＩであり、標的抗原の活性部位以外の調節部位が、ＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２のＣε２ホモ二量体の重鎖である請求項１～３のいずれか１項記載のスクリーニング方法。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか１項記載のスクリーニング方法により選択された抗体医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗体医薬のスクリーニング方法及び抗体医薬に関する。
【背景技術】
【0002】
抗体医薬は、病気の原因物質に対して特異的な抗体を投与することにより、その原因物質の働きを阻止する医薬である。通常の抗体は、その原因物質のある特定の部位を認識する。その認識部位は、例えば、生体側のリセプターと反応する標的抗原の特異的な部位が用いられる。その例を、Ｉ型アレルギー疾患治療である抗体医薬を例にとって説明する。
【0003】
近年、日本を含む先進諸国における各種のアレルギー疾患は著しく増加している。特に、花粉症や食物アレルギーに代表されるＩ型（即時型）アレルギーの治療には、アレルゲンを認識するＩｇＥ抗体の働きを抑制することが極めて重要であると考えられている。現在、ＩｇＥとＩｇＥ受容体との結合を阻害する抗ＩｇＥ抗体製剤（Ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ：薬剤名：ゾレア）が難治性喘息などの治療薬として臨床応用されている。しかし、遅効性で治療効果が現れるまでに２～３週間を要するだけでなく、血清中のＩｇＥ値が高いと投与制限がかかることやアナフィラキシーショック等の副作用があることも報告されている。このような観点から、Ｉ型アレルギー疾患を即効的に長期間阻止する抗ＩｇＥ抗体医薬の開発が急務の課題となっている。
【0004】
本発明者は、Ｉ型アレルギー反応を即時に阻止する抗ＩｇＥ抗体（ＨＭＫ－１２ Ｆａｂ）を開発し、その機序が、マスト細胞上のＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）に結合したＩｇＥ分子の解離によることを報告してきた（特許文献１）。またＰＣＡ反応（受身アナフィラキシー反応）による研究によってＨＭＫ－１２ Ｆａｂをアレルゲン刺激前に投与すると、マスト細胞上のＩｇＥを剥がしてＩ型アレルギー反応を抑制することを明らかにした（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特開２００８－２０３６５６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
しかしながら、前記ＨＭＫ－１２ Ｆａｂが、どのようにしてマスト細胞上のＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）に結合したＩｇＥ分子を解離するのかについては、不明であった。
従って、本発明の課題は、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂが、どのようにしてマスト細胞上のＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）に結合したＩｇＥ分子を解離するのかを解明することによって、新たな抗体医薬の開発手段を提供することにある。
従って、本発明の課題は、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂが、どのようにしてマスト細胞上のＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）に結合したＩｇＥ分子を解離するのかを解明することによって、新たな抗体医薬の開発手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者は、抗ｌｇＥ抗体のＦａｂ断片（ＨＭＫ－１２ Ｆａｂ）が、アレルゲン刺激後でも、既成のｌｇＥ－ＦｃεＲＩ複合体を速やかに解離し、ｌｇＥを介したアナフィラキシー反応を阻害することを見出した。
そこで本発明者は、ＨＭＫ－１２ ＦａｂのＩｇＥ結合部位の解析を行い、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂの結合エピトープは、ＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２領域に存在することを見出した。さらに、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂ／ＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２複合体の結晶構造についての解析から、（１）ＨＭＫ－１２ Ｆａｂは、ホモ２量体を成すＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２のＣε２のカルボニル末端が存在する側の表面であって、酵素処理によってＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２化する前のＩｇＥ中ではコンスタント領域のＣε３に近接する表面にあるエピトープを認識すること、（２）ＨＭＫ－１２ Ｆａｂは、ＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２に結合し、ＩｇＥの別の部位であるＦｃドメインの非対称構造を変えること（アロステリック効果）によって受容体に結合したＩｇＥを解離させることを見出した。従って、標的抗原の活性部位以外の調節部位に結合して活性部位の構造を変化させて標的抗原と標的抗原受容体との親和性を制御する抗体を選択することにより、抗体医薬がスクリーニングできることを見出した。
そこで本発明者は、ＨＭＫ－１２ ＦａｂのＩｇＥ結合部位の解析を行い、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂの結合エピトープは、ＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２領域に存在することを見出した。さらに、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂ／ＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２複合体の結晶構造についての解析から、（１）ＨＭＫ－１２ Ｆａｂは、ホモ２量体を成すＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２のＣε２のカルボニル末端が存在する側の表面であって、酵素処理によってＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２化する前のＩｇＥ中ではコンスタント領域のＣε３に近接する表面にあるエピトープを認識すること、（２）ＨＭＫ－１２ Ｆａｂは、ＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２に結合し、ＩｇＥの別の部位であるＦｃドメインの非対称構造を変えること（アロステリック効果）によって受容体に結合したＩｇＥを解離させることを見出した。従って、標的抗原の活性部位以外の調節部位に結合して活性部位の構造を変化させて標的抗原と標的抗原受容体との親和性を制御する抗体を選択することにより、抗体医薬がスクリーニングできることを見出した。
【0008】
すなわち、本発明は、次の発明［１］～［５］を提供するものである。
［１］標的抗原の活性部位以外の調節部位に結合して活性部位の構造を変化させて標的抗原と標的抗原受容体との親和性を制御する抗体を選択することを特徴とする抗体医薬のスクリーニング方法。
［２］標的抗原と標的抗原受容体との親和性を制御する抗体が、標的抗原と標的抗原受容体との結合を阻害する抗体である、［１］記載の抗体医薬のスクリーニング方法。
［３］標的抗原の結晶構造解析によって、標的抗原の活性部位以外の調節部位を特定する［２］記載のスクリーニング方法。
［４］標的抗原がＩｇＥであり、標的抗原受容体がＦｃεＲＩであり、標的抗原の活性部位以外の調節部位が、ＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２のＣε２ホモ二量体の重鎖である［１］～［３］のいずれかに記載のスクリーニング方法。
［５］［１］～［４］のいずれかに記載のスクリーニング方法により選択された抗体医薬。
［１］標的抗原の活性部位以外の調節部位に結合して活性部位の構造を変化させて標的抗原と標的抗原受容体との親和性を制御する抗体を選択することを特徴とする抗体医薬のスクリーニング方法。
［２］標的抗原と標的抗原受容体との親和性を制御する抗体が、標的抗原と標的抗原受容体との結合を阻害する抗体である、［１］記載の抗体医薬のスクリーニング方法。
［３］標的抗原の結晶構造解析によって、標的抗原の活性部位以外の調節部位を特定する［２］記載のスクリーニング方法。
［４］標的抗原がＩｇＥであり、標的抗原受容体がＦｃεＲＩであり、標的抗原の活性部位以外の調節部位が、ＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２のＣε２ホモ二量体の重鎖である［１］～［３］のいずれかに記載のスクリーニング方法。
［５］［１］～［４］のいずれかに記載のスクリーニング方法により選択された抗体医薬。
【発明の効果】
【0009】
本発明のスクリーニング方法によれば、標的抗原の活性部位以外の調節部位に結合して活性部位の構造を変化させて標的抗原と標的抗原受容体との親和性を制御する抗体を選択すれば、従来の抗体とは全く異なる作用機序による、標的抗原に基づく疾患に対する抗体医薬が開発できる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】ＨＭＫ－１２ ＦａｂがＰＴ１８細胞へのＳＰＥ－７ ｌｇＥの結合を用量依存的に阻害することを示す図である。
【図2】ＨＭＫ－１２ Ｆａｂ、６ＨＤ５ Ｆａｂ及び抗ラットλ鎖の還元及び非還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図3】ＨＭＫ－１２ Ｆａｂ、６ＨＤ５ Ｆａｂ及び抗ラットλ鎖のジチオトレイトール（ＤＴＴ：５～２０ｍＭ）の連続希釈物処理後のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図4】ペプシンでＳＰＥ－７ ｌｇＥを消化後、非還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥと、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂとの反応性についてのウエスタンブロット分析結果を示す図である。
【図5】Ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２ １０／３００ ＧＬカラムを用いてＨＭＫ－１２ Ｆａｂ及びＳＰＥ－７ ｌｇＥ Ｆ（ａｂ´）２を精製した結果（Ａ）、精製したＨＭＫ－１２ ＦａｂとｌｇＥ Ｆ（ａｂ´）２の複合体のうちの画分９～１４のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果、及びその分子量を示す図である。
【図6】ＨＭＫ－１２ Ｆａｂ／ｌｇＥ Ｆ（ａｂ´）２複合体の結晶構造を示す図である。
【図7】ＨＭＫ－１２ Ｆａｂのエピトープ解析（１）を示す図である。
【図8】ＨＭＫ－１２ Ｆａｂのエピトープ解析（２）を示す図である。
【図9】ＨＭＫ－１２ Ｆａｂのエピトープ解析（３）を示す図である
【図10】ＨＭＫ－１２ Ｆａｂによる既成のｌｇＥ－ＦｃＥＲＩ複合体の解離効率の温度依存性を示す図である。
【図11】ＳＰＥ－７ ｌｇＥ＋ ＰＴ１８細胞の強度低下がｌｇＥ－ＦｃＥＲＩ複合体の解離によるものであることを示す図である。
【図12】受動的皮膚アナフィラキシー（ＰＣＡ）アッセイを用いてｌｇＥ媒介アナフィラキシー反応に対するＨＭＫ－１２ Ｆａｂのｉｎ ｖｉｖｏ効果を検討した結果を示す（刺激前と刺激後の結果）。
【図13】ｌｇＥのＣε２の受容体複合体のＣε２への重ね合わせ（Ａ）、及びｌｇＥのＣε２と受容体複合体のもう一方のＣε２との重ね合わせ（Ｂ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本発明の一態様は、標的抗原の活性部位以外の調節部位に結合して活性部位の構造を変化させて標的抗原と標的抗原受容体との親和性を制御する抗体を選択することを特徴とする抗体医薬のスクリーニング方法である。
【0012】
抗原とは、動物体内において抗体を産生させて、その抗体と特異的に反応する物質であり、通常、異種タンパク質、多糖、核酸、核蛋白質、リポ蛋白質、合成高分子などが抗原となる。また、抗原には、体内から発生するもの（自己蛋白質）と外部環境から発生するもの（非自己）があり、Ｉ型アレルギーの原因物質であるＩｇＥは、自己蛋白質抗原である。
これらの抗原のうち、抗体を作成しようとする抗原が標的抗原である。
具体的な標的抗原としては、Ｉ型アレルギーの原因ＩｇＥ、ウイルス粒子の表面又はスパイクタンパク質、癌細胞表面抗原などが挙げられる。このうち、Ｉ型アレルギーの原因抗原であるＩｇＥ、ウイルス粒子の表面又はスパイクタンパク質が好ましく、Ｉ型アレルギーの原因抗原であるＩｇＥがより好ましい。
これらの抗原のうち、抗体を作成しようとする抗原が標的抗原である。
具体的な標的抗原としては、Ｉ型アレルギーの原因ＩｇＥ、ウイルス粒子の表面又はスパイクタンパク質、癌細胞表面抗原などが挙げられる。このうち、Ｉ型アレルギーの原因抗原であるＩｇＥ、ウイルス粒子の表面又はスパイクタンパク質が好ましく、Ｉ型アレルギーの原因抗原であるＩｇＥがより好ましい。
【0013】
エピトープとは、抗原決定基とも呼ばれ、抗体、Ｂ細胞、Ｔ細胞によって認識される抗原の一部であって、抗体が結合する部位である。
本発明で得られる抗体が結合する部位、すなわちエピトープは、標的抗原の活性部位以外の調節部位である。ここで、調節部位とは、標的抗原と標的抗原受容体との親和性を制御する部位である。
標的抗原と標的抗原受容体との親和性を制御する抗体としては、標的抗原と標的抗原受容体との結合を阻害する抗体が好ましい。
本発明で得られる抗体が結合する部位、すなわちエピトープは、標的抗原の活性部位以外の調節部位である。ここで、調節部位とは、標的抗原と標的抗原受容体との親和性を制御する部位である。
標的抗原と標的抗原受容体との親和性を制御する抗体としては、標的抗原と標的抗原受容体との結合を阻害する抗体が好ましい。
【0014】
標的抗原の活性部位以外の調節部位に結合して活性部位の構造を変化させて標的抗原と標的抗原受容体との親和性を制御する抗体を選択する手段としては、エピトープマッピング解析、抗原抗体複合体の結晶構造の解析、ＳＰＲ法、ＢＬＩ法、クライオ電子顕微鏡などが挙げられる。
【0015】
エピトープマッピング解析手段としては、例えば、重複ポリペプチドをデザインして合成し、このポリペプチドをネガティブコントロール（関連のないランダムペプチド）やポジティブコントロール（全長タンパク質）と共にガラススライド上に三重にアレイする。アレイをブロッキング後、重複ペプチドアレイに標的蛋白に対する一次抗体、ビオチン標識二次抗体を順次添加してインキュベートする。ウォシュ作業後にエピトープに結合した抗体を蛍光Ｃｙ３結合ストレプトアビジンによって検出する。各ペプチドスポットの蛍光はレーザースキャナーでキャプチャーし、強いシグナルを放つ陽性ペプチドをソフトウェアで更に解析することができる。
エピトープマッピング解析により、標的抗原と標的抗原受容体との親和性を制御する抗体、特に標的抗原と標的抗原受容体との結合を阻害する抗体を選択することができる。
エピトープマッピング解析により、標的抗原と標的抗原受容体との親和性を制御する抗体、特に標的抗原と標的抗原受容体との結合を阻害する抗体を選択することができる。
【0016】
抗原抗体複合体の結晶構造の解析は、抗原抗体複合体の調製、結晶化、結晶化で生じた抗原抗体複合体結晶のＸ線回折実験、Ｘ線回折強度データの解析による構造座標の決定、解析した構造座標の可視化の手順を踏むことで実施できる。抗原抗体複合体の調製は、抗原に対して２倍以上のモル数の抗体を混合した溶液を適切な緩衝液で平衡化したゲル濾過カラムに供し抗原抗体複合体に相当する保持時間の溶出画分を分取することで実施できる。結晶化は、調製後、１０ｍｇ／ｍＬ程度の濃度に濃縮した抗原抗体複合体溶液を適切な沈殿剤溶液と混合した後、別に準備した沈殿剤溶液と蒸気平衡させることで実施できる。適切な沈殿剤溶液の組成が不明な場合には市場から調達できる結晶化条件スクリーニングキットを用いてもよい。結晶化で生じた抗原抗体複合体結晶のＸ線回折実験では、Ｘ線回折計に取り付けた成長した結晶にＸ線を照射し、結晶からの回折Ｘ線をＸ線検出器で記録しＸ線回折強度データとする。Ｘ線回折強度データの解析による構造座標の決定は、抗体の構造がお互いに類似している性質を利用した分子置換法を使って実施できる。構造座標の可視化は適切な分子モデル表示ソフトウエアを用いて実施できる。
標的抗原と抗体の複合体結晶のＸ線結晶構造解析によって、標的抗原の活性部位以外の調節部位を特定することができる。
標的抗原と抗体の複合体結晶のＸ線結晶構造解析によって、標的抗原の活性部位以外の調節部位を特定することができる。
【0017】
前記の標的抗原の機能を変化させる抗体を選出する手段としては、抗原抗体複合体の結晶構造の変化を検出する手段、複数のエピトープに結合したときの標的抗原の特性変化を検出する手段などが挙げられる。
【0018】
前記のＨＭＫ－１２ Ｆａｂは、標的抗原がＩｇＥであり、標的抗原受容体がＦｃεＲＩである、ＩｇＥである。すなわち、標的抗原がＩｇＥであり、標的抗原受容体がＦｃεＲＩである抗体は、ＩｇＥ標的抗原の活性部位以外の調節部位が、抗体が認識するＩｇＥのエピトープであって、ホモ二量体を成すＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２のＣε２（の重鎖）であるのが好ましい。
この結果、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂは、ＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２に結合することにより、標的抗原ＩｇＥが標的抗原受容体ＦｃεＲＩに結合する際に必要なＩｇＥ Ｆｃドメインの非対称構造の構造変化を引き起こし、ＩｇＥをアロステリックな方法で受容体複合体から、解離させることが明らかになった。
この結果、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂは、ＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２に結合することにより、標的抗原ＩｇＥが標的抗原受容体ＦｃεＲＩに結合する際に必要なＩｇＥ Ｆｃドメインの非対称構造の構造変化を引き起こし、ＩｇＥをアロステリックな方法で受容体複合体から、解離させることが明らかになった。
【0019】
本発明によれば、標的抗原に基づく疾患に対する抗体医薬をスクリーニングすることができる。
本発明における標的抗原に基づく疾患としては、Ｉ型アレルギー、ウイルス感染症、がんなどが挙げられる。
本発明における標的抗原に基づく疾患としては、Ｉ型アレルギー、ウイルス感染症、がんなどが挙げられる。
【実施例0020】
次に実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【0021】
（材料及び方法）
（１）動物と細胞
雌Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットを日本のＳＬＣ社から購入した。動物は、動物施設において特定の病原体を含まない（ＳＰＦ）条件下で飼育した。
実験を偏りなく同じ条件で行うために、ＳＰＦ動物はすべて７日間馴化させた後、実験に用いた。動物試験はすべて、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドラインに従って実施した。マウス肥満細胞（ＰＴ－１８）は、Ｄｒ．Ｃ．Ｒａ（日本大学免疫学教室、東京、日本）から譲渡された。ＰＴ－１８細胞を、１０％熱不活性化ＦＣＳ、３ｍＭ Ｌ－グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で培養し、３７℃で加湿したインキュベーター（５％ ＣＯ２）で維持した。
（１）動物と細胞
雌Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットを日本のＳＬＣ社から購入した。動物は、動物施設において特定の病原体を含まない（ＳＰＦ）条件下で飼育した。
実験を偏りなく同じ条件で行うために、ＳＰＦ動物はすべて７日間馴化させた後、実験に用いた。動物試験はすべて、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドラインに従って実施した。マウス肥満細胞（ＰＴ－１８）は、Ｄｒ．Ｃ．Ｒａ（日本大学免疫学教室、東京、日本）から譲渡された。ＰＴ－１８細胞を、１０％熱不活性化ＦＣＳ、３ｍＭ Ｌ－グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で培養し、３７℃で加湿したインキュベーター（５％ ＣＯ２）で維持した。
【0022】
（２）モノクローナル抗体
ＳＰＥ－７ ＩｇＥ（抗ＤＮＰマウスｌｇＥ抗体）及びＳＰＥ－７ ＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２はそれぞれＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ． ＬＬＣ（ＵＳＡ）及びＩｍｍｕｎｏ－Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｃｏ．（Ｇｕｎｍａ， ＪＡＰＡＮ）から購入した。ラットモノクローナル抗体ＨＭＫ－１２（マウスＩｇＥ）は、Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．８５，４７－５４（１９８８）及びＩｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２８，２４－３２（２００２）に記載のものである。ラットＩｇＧ抗マウスＫ抗体及びＨＲＰ標識ヤギ抗ラットＩｇＧは、それぞれＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社（米国ＣＡ社）及びＪａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社（米国ＰＡ社）から購入した。イチジクラテックスから単離したシステインプロテアーゼであるＦｉｃｉｎを用いて、ＨＭＫ－１２の高度に精製したＦａｂ断片を調製した。簡単にのべると、ラット腹水からカプリル酸と硫酸アンモニウム方法を組み合わせて段階的にＨＭＫ－１２を精製した。精製したＨＭＫ－１２を０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に対して透析し、次にｎ－オクチル－１３－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ（ＤＯＴＩＴＥ）とＬ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ（和光）を加え、それぞれ０．５ｍＭ及び２５ｍＭまで濃度を上げた。ＨＭＫ－１２（１ｍｇ／ｍｌ）を固定化フィシン樹脂スラリー（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｐｒｏｄ． ＃ ４４８８１）０．５ｍｌで２５ｍＭシステイン／クエン酸緩衝液の存在下で２回消化した。次に試料を遠心分離し、ビバスピン（１，０００，０００）（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＡＧ）で精製して樹脂または未消化のＩｇＧを除去した。得られたＨＭＫ－１２ Ｆａｂ断片をＰｒｏｔｅｉｎ Ｇカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）でさらに精製した。
ＳＰＥ－７ ＩｇＥ（抗ＤＮＰマウスｌｇＥ抗体）及びＳＰＥ－７ ＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２はそれぞれＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ． ＬＬＣ（ＵＳＡ）及びＩｍｍｕｎｏ－Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｃｏ．（Ｇｕｎｍａ， ＪＡＰＡＮ）から購入した。ラットモノクローナル抗体ＨＭＫ－１２（マウスＩｇＥ）は、Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．８５，４７－５４（１９８８）及びＩｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２８，２４－３２（２００２）に記載のものである。ラットＩｇＧ抗マウスＫ抗体及びＨＲＰ標識ヤギ抗ラットＩｇＧは、それぞれＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社（米国ＣＡ社）及びＪａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社（米国ＰＡ社）から購入した。イチジクラテックスから単離したシステインプロテアーゼであるＦｉｃｉｎを用いて、ＨＭＫ－１２の高度に精製したＦａｂ断片を調製した。簡単にのべると、ラット腹水からカプリル酸と硫酸アンモニウム方法を組み合わせて段階的にＨＭＫ－１２を精製した。精製したＨＭＫ－１２を０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に対して透析し、次にｎ－オクチル－１３－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ（ＤＯＴＩＴＥ）とＬ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ（和光）を加え、それぞれ０．５ｍＭ及び２５ｍＭまで濃度を上げた。ＨＭＫ－１２（１ｍｇ／ｍｌ）を固定化フィシン樹脂スラリー（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｐｒｏｄ． ＃ ４４８８１）０．５ｍｌで２５ｍＭシステイン／クエン酸緩衝液の存在下で２回消化した。次に試料を遠心分離し、ビバスピン（１，０００，０００）（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＡＧ）で精製して樹脂または未消化のＩｇＧを除去した。得られたＨＭＫ－１２ Ｆａｂ断片をＰｒｏｔｅｉｎ Ｇカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）でさらに精製した。
【0023】
（３）ＰＣＡ反応
２匹のラットの剃毛したばかりの皮膚のいくつかの部位に、１μｇ／ｍｌのＳＰＥ－７ ＩｇＥを皮内注射した。２日後、ＤＮＰ－ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）と０．５％エバンスブルーを含む生理食塩水でチャレンジする前に、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂ又は抗κＦａｂの５μｇ／ｍｌを注射した。
ＳＰＥ－７ ＩｇＥの皮内注射の２日後に、ラットに０．５％エバンスブルーを含む生理食塩水と１ｍｇ／ｍｌのＤＮＰ－ＯＶＡを静脈内投与し、１０μｇ／ｍｌのＨＭＫ－１２ Ｆａｂ又は抗κＦａｂを迅速に注射した。いずれの場合も、血管から組織へのエバンスブルーの漏出を波長６２０ｎｍでの吸光度測定により定量した。
２匹のラットの剃毛したばかりの皮膚のいくつかの部位に、１μｇ／ｍｌのＳＰＥ－７ ＩｇＥを皮内注射した。２日後、ＤＮＰ－ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）と０．５％エバンスブルーを含む生理食塩水でチャレンジする前に、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂ又は抗κＦａｂの５μｇ／ｍｌを注射した。
ＳＰＥ－７ ＩｇＥの皮内注射の２日後に、ラットに０．５％エバンスブルーを含む生理食塩水と１ｍｇ／ｍｌのＤＮＰ－ＯＶＡを静脈内投与し、１０μｇ／ｍｌのＨＭＫ－１２ Ｆａｂ又は抗κＦａｂを迅速に注射した。いずれの場合も、血管から組織へのエバンスブルーの漏出を波長６２０ｎｍでの吸光度測定により定量した。
【0024】
（４）フローサイトメトリー分析
ＦｃεＲＩへのＩｇＥの結合に対するＨＭＫ－１２ Ｆａｂの効果を評価するために、最初にＡｌｅｘａ ４８８標識ＳＰＥ－７ ＩｇＥを調製した。まず、Ａｌｅｘａ ４８８ラベルＳＰＥ－７ ＩｇＥの種々の濃度をＨＭＫ－１２ Ｆａｂ又はＩｇＧ２ａ Ｆａｂの超過量（２μＭ）でプレミックスし、３７℃で１５分間インキュベートした。混合物をＰＴ－１８細胞（マウス肥満細胞）に加え、３７℃で２０分間インキュベートした。その後、ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａフローサイトメーター（米国カリフォルニア州ベクトン・ディケンソン）を用いて分析した。
ＨＭＫ－１２ Ｆａｂによる既成のＩｇＥ‐ＦｃεＲＩ複合体の解離効率を調べるために、１ｘ１０7 ＰＴ１８細胞を０．２μＭ Ａｌｅｘａ ４８８標識ＳＰＥ－７ ＩｇＥと３７℃で１５分間プレインキュベートした。過剰な非結合抗体を除去するために細胞を２回洗浄し、種々の温度（２、２５及び３７℃）の条件下でＨＭＫ－１２ Ｆａｂ又はＩｇＧ２ａ Ｆａｂと５，１５及び７５分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａフローサイトメーターを用いて分析した。
ＩｇＥ－ＦｃεＲＩ複合体の解離をさらに確認するために、１ｘ１０7 ＰＴ１８細胞を０．２μＭのＡｌｅｘａ ４８８標識ＳＰＥ－７ ＩｇＥと３７℃で１５分間プレインキュベートした。洗浄段階の後、細胞を３７℃で１５及び６０分間ＨＭＫ－１２ Ｆａｂ又はＩｇＧ２ａ Ｆａｂとインキュベートし、ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａフローサイトメーターを用いてＳＰＥ－７ ＩｇＥ＋ＰＴ１８細胞の頻度を測定した。解離したＳＰＥ－７ ＩｇＥのレベルを測定するために、培養上清をＤＮＰ－ＢＳＡコーティングプレートに加え、ＳＰＥ－７ ＩｇＥ／ ＨＭＫ－１２ Ｆａｂ免疫複合体を捕捉した。免疫複合体はＨＲＰ標識抗ラットＩｇＧ（Ｆａｂ´）２二次抗体を用いてＥＬＩＳＡ法で測定した。
ＦｃεＲＩへのＩｇＥの結合に対するＨＭＫ－１２ Ｆａｂの効果を評価するために、最初にＡｌｅｘａ ４８８標識ＳＰＥ－７ ＩｇＥを調製した。まず、Ａｌｅｘａ ４８８ラベルＳＰＥ－７ ＩｇＥの種々の濃度をＨＭＫ－１２ Ｆａｂ又はＩｇＧ２ａ Ｆａｂの超過量（２μＭ）でプレミックスし、３７℃で１５分間インキュベートした。混合物をＰＴ－１８細胞（マウス肥満細胞）に加え、３７℃で２０分間インキュベートした。その後、ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａフローサイトメーター（米国カリフォルニア州ベクトン・ディケンソン）を用いて分析した。
ＨＭＫ－１２ Ｆａｂによる既成のＩｇＥ‐ＦｃεＲＩ複合体の解離効率を調べるために、１ｘ１０7 ＰＴ１８細胞を０．２μＭ Ａｌｅｘａ ４８８標識ＳＰＥ－７ ＩｇＥと３７℃で１５分間プレインキュベートした。過剰な非結合抗体を除去するために細胞を２回洗浄し、種々の温度（２、２５及び３７℃）の条件下でＨＭＫ－１２ Ｆａｂ又はＩｇＧ２ａ Ｆａｂと５，１５及び７５分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａフローサイトメーターを用いて分析した。
ＩｇＥ－ＦｃεＲＩ複合体の解離をさらに確認するために、１ｘ１０7 ＰＴ１８細胞を０．２μＭのＡｌｅｘａ ４８８標識ＳＰＥ－７ ＩｇＥと３７℃で１５分間プレインキュベートした。洗浄段階の後、細胞を３７℃で１５及び６０分間ＨＭＫ－１２ Ｆａｂ又はＩｇＧ２ａ Ｆａｂとインキュベートし、ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａフローサイトメーターを用いてＳＰＥ－７ ＩｇＥ＋ＰＴ１８細胞の頻度を測定した。解離したＳＰＥ－７ ＩｇＥのレベルを測定するために、培養上清をＤＮＰ－ＢＳＡコーティングプレートに加え、ＳＰＥ－７ ＩｇＥ／ ＨＭＫ－１２ Ｆａｂ免疫複合体を捕捉した。免疫複合体はＨＲＰ標識抗ラットＩｇＧ（Ｆａｂ´）２二次抗体を用いてＥＬＩＳＡ法で測定した。
【0025】
（５）ウエスタンブロット分析法
ＳＰＥ－７ ＩｇＥ（１μｇ）を２．５％の２－メルカプトエタノール（２‐ＭＥ）で還元し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ試料緩衝液の７．５％で泳動し、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ｃｏｒｐ．）に移した。膜をＨＭＫ－１２ Ｆａｂ、６ＨＤ５ Ｆａｂ及び抗ラットλ鎖でプローブし、続いて二次抗体（ＨＭＫ－１２ Ｆａｂ及び６ＨＤ５ ＦａｂについてはＨＲＰ標識抗ラットＩｇＧ、抗ラットλ鎖についてはＨＲＰ標識抗ヤギＩｇＧ）を用いた。Ｐｉｅｒｃｅ ＥＣＬ Ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてシグナルを検出した。Ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙは、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ ４０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で検出した。ＩｇＥの還元過程でＨＭＫ－１２ ＦａｂがＩｇＥとどのように反応するかを調べるために、ＳＰＥ－７ ＩｇＥをジチオトレイトール（ＤＴＴ：５～２０ｍＭ）の連続希釈液で室温で６０分間処理した。
次に試料を１．５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ（ｐＨ８．８）の５μｌとヨードアセトアミド（ＩＡＡ）の１０μｌと氷上で３０分間インキュベートした。透析後、非還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った後、ウエスタンブロット分析法を行った。ＨＭＫ－１２ Ｆａｂによって認識されるＩｇＥ二量体上のエピトープを明らかにするために、ｐＨ３．８またはｐＨ４．５のペプシンで消化したＳＰＥ－７ ＩｇＥについて、非還元条件下のＳＤＳ－ＰＡＧＥとこれに対するウエスタンブロット分析法でＨＭＫ１２ Ｆａｂとペプシンで消化したＳＰＥ－７ ＩｇＥの反応性について分析した。
ＳＰＥ－７ ＩｇＥ（１μｇ）を２．５％の２－メルカプトエタノール（２‐ＭＥ）で還元し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ試料緩衝液の７．５％で泳動し、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ｃｏｒｐ．）に移した。膜をＨＭＫ－１２ Ｆａｂ、６ＨＤ５ Ｆａｂ及び抗ラットλ鎖でプローブし、続いて二次抗体（ＨＭＫ－１２ Ｆａｂ及び６ＨＤ５ ＦａｂについてはＨＲＰ標識抗ラットＩｇＧ、抗ラットλ鎖についてはＨＲＰ標識抗ヤギＩｇＧ）を用いた。Ｐｉｅｒｃｅ ＥＣＬ Ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてシグナルを検出した。Ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙは、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ ４０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で検出した。ＩｇＥの還元過程でＨＭＫ－１２ ＦａｂがＩｇＥとどのように反応するかを調べるために、ＳＰＥ－７ ＩｇＥをジチオトレイトール（ＤＴＴ：５～２０ｍＭ）の連続希釈液で室温で６０分間処理した。
次に試料を１．５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ（ｐＨ８．８）の５μｌとヨードアセトアミド（ＩＡＡ）の１０μｌと氷上で３０分間インキュベートした。透析後、非還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った後、ウエスタンブロット分析法を行った。ＨＭＫ－１２ Ｆａｂによって認識されるＩｇＥ二量体上のエピトープを明らかにするために、ｐＨ３．８またはｐＨ４．５のペプシンで消化したＳＰＥ－７ ＩｇＥについて、非還元条件下のＳＤＳ－ＰＡＧＥとこれに対するウエスタンブロット分析法でＨＭＫ１２ Ｆａｂとペプシンで消化したＳＰＥ－７ ＩｇＥの反応性について分析した。
【0026】
（６）結晶化
ＨＭＫ－１２ Ｆａｂ／ＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２複合体を含むピーク分画を結晶学的研究に用いた。最終濃度０．００１％（ｗ／ｖ）でアジ化ナトリウムを添加した後、ピーク画分をＭｗｃｏ １０，０００のＶｉｖａＳｐｉｎにより１３．３ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。
結晶化はハンギングドロップ蒸気拡散法で行った。０．１μｌの濃縮複合体試料と０．１μｌの結晶化溶液（１４％（ｗ／ｖ） ＰＥＧ３３５０、０．０９Ｍ ＭＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）、０．０９Ｍ酢酸マグネシウム、０．０９％（ｗ／ｖ）β‐オクチルグルコシド、０．１Ｍ ＮＤＳＢ‐２５６）を混合して結晶化液滴を調製した。液滴を４℃で５０μｌの結晶化溶液に平衡化した。
Ｘ線回折実験用結晶凍結に先立ち、０．２μｌ凍結保護溶液（１５％（ｗ／ｖ） ＰＥＧ３３５０、０．１Ｍ ＭＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）、０．１Ｍ酢酸マグネシウム、０．１％（ｗ／ｖ）β－オクチルグルコシド、０．１Ｍ ＮＤＳＢ－２５６，４０％（ｖ／ｖ）エチレングリコールを、長さ数十μｍ、厚さ数μｍの寸法の針状微結晶を含む結晶化液滴に添加した。
ＨＭＫ－１２ Ｆａｂ／ＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２複合体を含むピーク分画を結晶学的研究に用いた。最終濃度０．００１％（ｗ／ｖ）でアジ化ナトリウムを添加した後、ピーク画分をＭｗｃｏ １０，０００のＶｉｖａＳｐｉｎにより１３．３ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。
結晶化はハンギングドロップ蒸気拡散法で行った。０．１μｌの濃縮複合体試料と０．１μｌの結晶化溶液（１４％（ｗ／ｖ） ＰＥＧ３３５０、０．０９Ｍ ＭＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）、０．０９Ｍ酢酸マグネシウム、０．０９％（ｗ／ｖ）β‐オクチルグルコシド、０．１Ｍ ＮＤＳＢ‐２５６）を混合して結晶化液滴を調製した。液滴を４℃で５０μｌの結晶化溶液に平衡化した。
Ｘ線回折実験用結晶凍結に先立ち、０．２μｌ凍結保護溶液（１５％（ｗ／ｖ） ＰＥＧ３３５０、０．１Ｍ ＭＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）、０．１Ｍ酢酸マグネシウム、０．１％（ｗ／ｖ）β－オクチルグルコシド、０．１Ｍ ＮＤＳＢ－２５６，４０％（ｖ／ｖ）エチレングリコールを、長さ数十μｍ、厚さ数μｍの寸法の針状微結晶を含む結晶化液滴に添加した。
【0027】
（７）回折実験と構造解析
ＳＰｒｉｎｇ－８のＢＬ３２ＸＵにおいて、ＺＯＯシステムの多結晶データ収集モードによって自動的にＸ線回折実験と回折画像処理を行った。回折実験に用いたＸ線波長は１．０Åであった。回折像は１００Ｋの窒素ガス気流中に保持した３４８個の結晶から収集した。回折像を処理し、３．００Åから２．９０Åの最高分解能殻でＣＣ0.5が０．８９９の２．９Å分解能の回折強度データを得た。
初期位相計算はプログラムｐｈｅｎｉｘ．ｐｈａｓｅｒを用いた分子置換法を用い、分子置換法で用いる初期モデルとしてＩｇＧ ＦａｂにはＰＤＢ ＩＤ １ｉ９ｉ、ＩｇＥ ＦａｂにはＰＤＢ ＩＤ ２ｖｘｑ、ＩｇＥ Ｃε２にはＰＤＢ ＩＤ １ｏ０ｖを用いた。プログラムｐｈｅｎｉｘ．ｒｅｆｉｎｅ及びプログラムｐｈｅｎｉｘ．ｒｏｓｅｔｔａ＿ｒｅｆｉｎｅによる構造精密化及びプログラムＣＯＯＴを用いた手動モデル修正を、結晶学的Ｒ因子及びＲｆｒｅｅ因子がそれぞれ０．２２６及び０．２６７に収束するまで反復的に行った。
ＳＰｒｉｎｇ－８のＢＬ３２ＸＵにおいて、ＺＯＯシステムの多結晶データ収集モードによって自動的にＸ線回折実験と回折画像処理を行った。回折実験に用いたＸ線波長は１．０Åであった。回折像は１００Ｋの窒素ガス気流中に保持した３４８個の結晶から収集した。回折像を処理し、３．００Åから２．９０Åの最高分解能殻でＣＣ0.5が０．８９９の２．９Å分解能の回折強度データを得た。
初期位相計算はプログラムｐｈｅｎｉｘ．ｐｈａｓｅｒを用いた分子置換法を用い、分子置換法で用いる初期モデルとしてＩｇＧ ＦａｂにはＰＤＢ ＩＤ １ｉ９ｉ、ＩｇＥ ＦａｂにはＰＤＢ ＩＤ ２ｖｘｑ、ＩｇＥ Ｃε２にはＰＤＢ ＩＤ １ｏ０ｖを用いた。プログラムｐｈｅｎｉｘ．ｒｅｆｉｎｅ及びプログラムｐｈｅｎｉｘ．ｒｏｓｅｔｔａ＿ｒｅｆｉｎｅによる構造精密化及びプログラムＣＯＯＴを用いた手動モデル修正を、結晶学的Ｒ因子及びＲｆｒｅｅ因子がそれぞれ０．２２６及び０．２６７に収束するまで反復的に行った。
【0028】
（結果）
（１）ＨＭＫ－１２ Ｆａｂの結合エピトープはＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２領域に存在する
ＩｇＥ－ＦｃεＲＩ複合体に対するＨＭＫ－１２ Ｆａｂの新規活性を探索するために、分子相互作用研究を実施した。ＦｃεＲＩへのＩｇＥの結合に対するＨＭＫ－１２ Ｆａｂの効果を調べるために、種々の濃度のＡｌｅｘａ ４８８標識ＳＰＥ－７ ＩｇＥ （抗ＤＮＰマウスＩｇＥ抗体）を過剰量のＨＭＫ－１２ Ｆａｂ又はＩｇＧ２ａ Ｆａｂとプレミックスした。次に混合物をＰＴ１８細胞（マウス肥満細胞）に加え、３７℃で２０分間インキュベートした。洗浄段階に続いて、細胞をフローサイトメトリー分析に供した。その結果、図１に示すように、ＨＭＫ－１２ ＦａｂがＰＴ１８細胞へのＳＰＥ－７ ＩｇＥの結合を用量依存的に阻害することを示したが、ＩｇＧ２ａ Ｆａｂは無処理と比較して阻害作用を示さなかった。本発明者は以前に、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂが低温下であらかじめ形成されたＩｇＥ－ＦｃεＲＩ複合体と相互作用することを示した（Ｓｃｉ Ｒｅｐ．８，１４２３７（２０１８））。ＨＭＫ－１２ ＦａｂはＰＴ１８細胞表面のＦｃεＲＩへのＳＰＥ‐７ ＩｇＥの結合を妨げた。これらの結果の１つの考えられる説明は、ＨＭＫ－１２ ＦａｂがＦｃεＲＩと相互作用するのに必要なＩｇＥ Ｆｃドメインにある種の変化を引き起こすというものである。
ＨＭＫ－１２ Ｆａｂがどのようにして細胞表面ＦｃεＲＩへのＩｇＥの結合を妨げるかという問題にさらに取り組むため、ＩｇＥ分子上のＨＭＫ－１２ Ｆａｂの結合エピトープを同定することとした。まず、ＳＰＥ－７ ＩｇＥタンパク質を７．５％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で還元及び非還元条件下で泳動させた。次いで、このタンパク質をＰＶＤＦ膜に移し、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂ、６ＨＤ５ Ｆａｂ及び抗ラットλ鎖、続いてＨＲＰヤギ抗ラットＩｇＧで検出した（図２）。還元条件下では、６ＨＤ５ Ｆａｂと抗ラットλ鎖はそれぞれＩｇＥ重鎖（７０ｋＤａ）と軽鎖（２３ｋＤａ）を検出した。しかし驚くべきことに、膜をＨＭＫ－１２ Ｆａｂでプローブした場合、目に見えるバンドがないことを明確に示した。一方、非還元条件下ではすべての抗体が１５０ｋＤａ前後のＩｇＥとその凝集体を検出した。
以上の知見に基づき、これらの抗ＩｇＥ抗体が還元方法に応じてどのようにＩｇＥと反応するかを検討した。最初に、ＳＰＥ－７ ＩｇＥタンパク質をジチオトレイトール（ＤＴＴ：５～２０ｍＭ）の連続希釈物で室温で６０分間処理した。透析後、非還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った後、ウエスタンブロット分析法を行った。その結果、図３に示すように、６ＨＤ５ Ｆａｂが全ＩｇＥ分子（２００ｋＤａ）ならびに部分的に還元したＩｇＥ重鎖（７０ｋＤａ）をＤＴＴの投与量依存的に検出した。同様に、抗ラットλ鎖は、ＩｇＥ分子全体、ＩｇＥ重鎖及び軽鎖（２５ｋＤａ）を検出した。しかし、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂは全ＩｇＥ分子とのみ反応し、還元ＩｇＥ重鎖とは反応しなかったことから、ＨＭＫ‐１２ Ｆａｂの結合エピトープは二量体構造のＩｇＥ上に存在するが、ジスルフィド結合が還元して生じたモノマー上には存在しないことがわかった。
ＨＭＫ－１２ Ｆａｂによって認識されるＩｇＥ二量体上のエピトープを明らかにするために、Ｆ（ａｂ´）２断片を生成するのに用いられるペプシンでＳＰＥ－７ ＩｇＥを消化した試料を非還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥした後、ウエスタンブロット分析法でＨＭＫ－１２ Ｆａｂとの反応性について分析した（図４）。この結果は、ｐＨ３．８で消化を行った場合、抗ラットλ鎖のみがＦａｂ（５０ｋＤａ）を検出できた。一方、ＨＭＫ－１２ ＦａｂはｐＨ ４．５で消化を行った場合、７５ｋＤａから１５０ｋＤａの間の大きな断片を検出できた。とりわけ、ＨＭＫ－１２ ＦａｂはＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２に対応する１５０ｋＤａバンドと最も強く反応し、ＨＭＫ－１２ ＦａｂがＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２上のエピトープを認識することを示した。
これらの結果をさらに確認するため、まずＳｕｐｅｒｏｓｅ １２ １０／３００ ＧＬカラムを用いてＨＭＫ－１２ Ｆａｂ及びＳＰＥ－７ ＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２を精製した（図５Ａ）。精製したＨＭＫ－１２ ＦａｂとＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２をモル比２．１：１で混合し、４℃で８時間インキュベートした。インキュベーション後、ＨｉＰｒｅｐ １６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－３００ ＨＲに試料を適用し、複合体を形成していないＦａｂ及び予想外に短いリテンションタイムを有する粒子を除去した（図５Ｂ）。次に、ピーク画分を非還元条件下でＳＤＳ‐ＰＡＧＥ上で泳動した。その結果、それぞれＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２とＨＭＫ－１２ Ｆａｂに相当する１５０ｋＤａと４５ｋＤａの２つのバンドが明確に示された（図５Ｃ）。
これらの結果から、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂの結合エピトープはＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２領域に存在するという有力な証拠が得られた。
（１）ＨＭＫ－１２ Ｆａｂの結合エピトープはＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２領域に存在する
ＩｇＥ－ＦｃεＲＩ複合体に対するＨＭＫ－１２ Ｆａｂの新規活性を探索するために、分子相互作用研究を実施した。ＦｃεＲＩへのＩｇＥの結合に対するＨＭＫ－１２ Ｆａｂの効果を調べるために、種々の濃度のＡｌｅｘａ ４８８標識ＳＰＥ－７ ＩｇＥ （抗ＤＮＰマウスＩｇＥ抗体）を過剰量のＨＭＫ－１２ Ｆａｂ又はＩｇＧ２ａ Ｆａｂとプレミックスした。次に混合物をＰＴ１８細胞（マウス肥満細胞）に加え、３７℃で２０分間インキュベートした。洗浄段階に続いて、細胞をフローサイトメトリー分析に供した。その結果、図１に示すように、ＨＭＫ－１２ ＦａｂがＰＴ１８細胞へのＳＰＥ－７ ＩｇＥの結合を用量依存的に阻害することを示したが、ＩｇＧ２ａ Ｆａｂは無処理と比較して阻害作用を示さなかった。本発明者は以前に、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂが低温下であらかじめ形成されたＩｇＥ－ＦｃεＲＩ複合体と相互作用することを示した（Ｓｃｉ Ｒｅｐ．８，１４２３７（２０１８））。ＨＭＫ－１２ ＦａｂはＰＴ１８細胞表面のＦｃεＲＩへのＳＰＥ‐７ ＩｇＥの結合を妨げた。これらの結果の１つの考えられる説明は、ＨＭＫ－１２ ＦａｂがＦｃεＲＩと相互作用するのに必要なＩｇＥ Ｆｃドメインにある種の変化を引き起こすというものである。
ＨＭＫ－１２ Ｆａｂがどのようにして細胞表面ＦｃεＲＩへのＩｇＥの結合を妨げるかという問題にさらに取り組むため、ＩｇＥ分子上のＨＭＫ－１２ Ｆａｂの結合エピトープを同定することとした。まず、ＳＰＥ－７ ＩｇＥタンパク質を７．５％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で還元及び非還元条件下で泳動させた。次いで、このタンパク質をＰＶＤＦ膜に移し、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂ、６ＨＤ５ Ｆａｂ及び抗ラットλ鎖、続いてＨＲＰヤギ抗ラットＩｇＧで検出した（図２）。還元条件下では、６ＨＤ５ Ｆａｂと抗ラットλ鎖はそれぞれＩｇＥ重鎖（７０ｋＤａ）と軽鎖（２３ｋＤａ）を検出した。しかし驚くべきことに、膜をＨＭＫ－１２ Ｆａｂでプローブした場合、目に見えるバンドがないことを明確に示した。一方、非還元条件下ではすべての抗体が１５０ｋＤａ前後のＩｇＥとその凝集体を検出した。
以上の知見に基づき、これらの抗ＩｇＥ抗体が還元方法に応じてどのようにＩｇＥと反応するかを検討した。最初に、ＳＰＥ－７ ＩｇＥタンパク質をジチオトレイトール（ＤＴＴ：５～２０ｍＭ）の連続希釈物で室温で６０分間処理した。透析後、非還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った後、ウエスタンブロット分析法を行った。その結果、図３に示すように、６ＨＤ５ Ｆａｂが全ＩｇＥ分子（２００ｋＤａ）ならびに部分的に還元したＩｇＥ重鎖（７０ｋＤａ）をＤＴＴの投与量依存的に検出した。同様に、抗ラットλ鎖は、ＩｇＥ分子全体、ＩｇＥ重鎖及び軽鎖（２５ｋＤａ）を検出した。しかし、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂは全ＩｇＥ分子とのみ反応し、還元ＩｇＥ重鎖とは反応しなかったことから、ＨＭＫ‐１２ Ｆａｂの結合エピトープは二量体構造のＩｇＥ上に存在するが、ジスルフィド結合が還元して生じたモノマー上には存在しないことがわかった。
ＨＭＫ－１２ Ｆａｂによって認識されるＩｇＥ二量体上のエピトープを明らかにするために、Ｆ（ａｂ´）２断片を生成するのに用いられるペプシンでＳＰＥ－７ ＩｇＥを消化した試料を非還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥした後、ウエスタンブロット分析法でＨＭＫ－１２ Ｆａｂとの反応性について分析した（図４）。この結果は、ｐＨ３．８で消化を行った場合、抗ラットλ鎖のみがＦａｂ（５０ｋＤａ）を検出できた。一方、ＨＭＫ－１２ ＦａｂはｐＨ ４．５で消化を行った場合、７５ｋＤａから１５０ｋＤａの間の大きな断片を検出できた。とりわけ、ＨＭＫ－１２ ＦａｂはＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２に対応する１５０ｋＤａバンドと最も強く反応し、ＨＭＫ－１２ ＦａｂがＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２上のエピトープを認識することを示した。
これらの結果をさらに確認するため、まずＳｕｐｅｒｏｓｅ １２ １０／３００ ＧＬカラムを用いてＨＭＫ－１２ Ｆａｂ及びＳＰＥ－７ ＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２を精製した（図５Ａ）。精製したＨＭＫ－１２ ＦａｂとＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２をモル比２．１：１で混合し、４℃で８時間インキュベートした。インキュベーション後、ＨｉＰｒｅｐ １６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－３００ ＨＲに試料を適用し、複合体を形成していないＦａｂ及び予想外に短いリテンションタイムを有する粒子を除去した（図５Ｂ）。次に、ピーク画分を非還元条件下でＳＤＳ‐ＰＡＧＥ上で泳動した。その結果、それぞれＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２とＨＭＫ－１２ Ｆａｂに相当する１５０ｋＤａと４５ｋＤａの２つのバンドが明確に示された（図５Ｃ）。
これらの結果から、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂの結合エピトープはＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２領域に存在するという有力な証拠が得られた。
【0029】
（２）ＨＭＫ－１２ Ｆａｂ／IｇＥ Ｆ（ａｂ´）２複合体の結晶構造
ＨＭＫ－１２ ＦａｂがＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２領域上に存在するエピトープに結合するという知見に基づき、２．９Å分解能で、Ｒ値とＲｆｒｅｅ値がそれぞれ０．２２８及び０．２６７のＨＭＫ－１２ Ｆａｂ／ｌｇＥ Ｆ（ａｂ´）２複合体の結晶構造を決定した（図６）。結晶学的データを表１に要約した。
ＨＭＫ－１２ ＦａｂがＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２領域上に存在するエピトープに結合するという知見に基づき、２．９Å分解能で、Ｒ値とＲｆｒｅｅ値がそれぞれ０．２２８及び０．２６７のＨＭＫ－１２ Ｆａｂ／ｌｇＥ Ｆ（ａｂ´）２複合体の結晶構造を決定した（図６）。結晶学的データを表１に要約した。
【0030】
【表1】
【0031】
複合体の構造から、２つのＨＭＫ－１２ Ｆａｂ断片と１つのＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２分子が複合粒子を形成することが明らかになった。複合体粒子では、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂ断片は、ＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２分子との分子間相互作用のための２つの部位を有する。
１つの部位は、ＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２のＣε２ホモ二量体ドメインと接触するＨＭＫ－１２ Ｆａｂの一般的なエピトープ認識部位である。もう１つの部位は、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂの重鎖のヒンジ領域に存在するクレフトであり、このクレフトはIｇＥ Ｆ（ａｂ´）２の軽鎖のループ構造を収容していた。ＨＭＫ－１２ Ｆａｂのエピトープ認識部位を介する前者の相互作用が、主に複合体形成に寄与した。
ＨＭＫ－１２ ＦａｂのＣα原子の結晶学的原子位置変位因子の平均値は、ＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２のＣε２ドメインのそれとほとんど同じであった（それぞれ４５．６Å2と４７．５Å2）。対照的に、ＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２のＦａｂ部分のＣα原子の平均値は８１．６Å2であった。したがって、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂの原子位置変位因子とＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２のＣε２ドメインの原子位置変位因子の値がほとんど同じであることは、２つの粒子、ＨＭＫ－１２ ＦａｂとIｇＥ Ｆ（ａｂ´）２のＣε２ドメインが結晶中で単一粒子のように振る舞うことを意味する。エピトープ認識部位を介する相互作用が複合体形成の主要因子であると考えられる。
１つの部位は、ＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２のＣε２ホモ二量体ドメインと接触するＨＭＫ－１２ Ｆａｂの一般的なエピトープ認識部位である。もう１つの部位は、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂの重鎖のヒンジ領域に存在するクレフトであり、このクレフトはIｇＥ Ｆ（ａｂ´）２の軽鎖のループ構造を収容していた。ＨＭＫ－１２ Ｆａｂのエピトープ認識部位を介する前者の相互作用が、主に複合体形成に寄与した。
ＨＭＫ－１２ ＦａｂのＣα原子の結晶学的原子位置変位因子の平均値は、ＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２のＣε２ドメインのそれとほとんど同じであった（それぞれ４５．６Å2と４７．５Å2）。対照的に、ＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２のＦａｂ部分のＣα原子の平均値は８１．６Å2であった。したがって、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂの原子位置変位因子とＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２のＣε２ドメインの原子位置変位因子の値がほとんど同じであることは、２つの粒子、ＨＭＫ－１２ ＦａｂとIｇＥ Ｆ（ａｂ´）２のＣε２ドメインが結晶中で単一粒子のように振る舞うことを意味する。エピトープ認識部位を介する相互作用が複合体形成の主要因子であると考えられる。
【0032】
ＨＭＫ－１２ Ｆａｂの重鎖のヒンジ領域に存在するクレフトとIｇＥ Ｆ（ａｂ´）２の軽鎖との相互作用は、結晶形成に関与していると考えられた。IｇＥ Ｆ（ａｂ´）２のＣε２ドメインとＦａｂ部分をつなぐリンカーペプチド鎖は、IｇＥ Ｆ（ａｂ´）２の他の部分との相互作用が少ない長く伸びたペプチド鎖なので、複合体を形成していないIｇＥ Ｆ（ａｂ´）２のＣε２ドメインとＦａｂ部分の間には、相対位置の多様性があると考えられる。複合体を形成することでＨＭＫ－１２ ＦａｂはＣε２ドメインとＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２のＦａｂ部分の間の相対的位置を固定し、構造的多様性の少ない結晶化可能な粒子の形成をもたらすと考えられる。
【0033】
まとめると、結果は、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂ上にＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２と相互作用するための２つの結合部位が存在することを実証した。１つの結合部位はＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２のＣε２をエピトープとして認識する一般的なエピトープ認識部位であった。もう１つの結合部位は、ｌｇＥ Ｆ（ａｂ´）２の軽鎖と相互作用するＨＭＫ－１２ Ｆａｂの重鎖のヒンジ領域のクレフトであった。
【0034】
（３）エピトープ認識
ＨＭＫ－１２ Ｆａｂが認識するエピトープ領域は、ＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２の２つのＣε２ドメインの両方からのアミノ酸残基によって形成されていた。ＨＭＫ－１２ Ｆａｂの相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸残基の原子から６Åより短いかそれに等しい距離に位置するＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２のアミノ酸残基がＨＭＫ－１２ Ｆａｂのエピトープであり、５つの領域（Ｅ２１９－Ｌ２２２、Ｄ２３０*－Ｈ２３５*、Ｄ２５９－Ｄ２６０、Ｅ２９６－Ｋ３０２及びＧ３０７－Ｒ３１５）に分散していた（図７）。
２番目の領域を除く５つの領域のうち４つは同じＣε２モノマー上に存在した。図８で赤色で示した第２の領域Ｄ２３０*－Ｈ２３５*は、前述のＣε２モノマーとホモ二量体を作るもう一つのＣε２モノマー由来のループ構造であった。この結晶学的観察から、エピトープ領域は鎖間ジスルフィド結合によりホモ二量体構造が強化されているＣε２ホモ二量体の両単量体由来のアミノ酸残基からなることが明らかになった。
ＨＭＫ－１２ＦａｂのＶＨの第１及び第３のＣＤＲ領域（Ｇ２６－Ｎ３７及びＨ１００－Ａ１１０）は、Ｃε２ホモ二量体のエピトープ領域の代表的なアミノ酸残基の認識に重要な役割を果たすと考えられる（図９）。ＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２のＣε２ドメインにあってＨＭＫ－１２Ｆａｂとの結合における代表的なアミノ酸残基はＮ２３２*、Ｄ３０９、Ｌ３１１、Ｈ３１３（図９に緑色の炭素原子をもつ棒モデル）で、エピトープ領域の他のアミノ酸に比べ、隣接するＨＭＫ－１２ Ｆａｂの原子がより多く存在する（図７）。最初のＣＤＲ領域はＣε２ドメインの最後のβ鎖の前半と相互作用した。第三のＣＤＲ領域はＣε２ドメインの最後のβ鎖の後半とＣε２ホモ二量体の他のモノマーからのループの先端と相互作用した。より詳細には、最初のＣＤＲ領域の側鎖ヒドロキシル基（Ｙ２７、Ｓ３３及びＹ３４）とＳ３２の主鎖カルボニル基が、Ｄ３０９の主鎖アミド及びカルボニル基、Ｌ３１１の主鎖カルボニル基と水素結合を形成する。第三のＣＤＲ領域はＮ２３２*を囲うような形で多くの水素結合を形成する。Ｙ１０３とＳ１０４の主鎖カルボニル基とＲ１０６の主鎖アミド基はＮ２３２*の極性側鎖と水素結合を形成する。さらに、Ｈ１００の側鎖はＮ２３２*の主鎖カルボニル基と水素結合を形成する。Ｎ２３２*の結合に加えて、３番目のＣＤＲ領域は、Ｇ１０１及びＹ１０２の主鎖カルボニル基を介してＣε２のβ鎖の最後の半分のＨ３１３の側鎖と水素結合を形成する。
まとめると、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂは、第１及び第３のＣＤＲに存在するアミノ酸残基を介して、Ｃε２ホモダイマー中のモノマーの両方に由来するエピトープ領域を認識することができる抗体であった。これらの結果は、ＨＭＫ－１２ ＦａｂがＣε２ドメインのホモ二量体構造を欠く完全に還元されたＩｇＥと反応しないことを示す前記の発明者らの知見と一致した。
ＨＭＫ－１２ Ｆａｂが認識するエピトープ領域は、ＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２の２つのＣε２ドメインの両方からのアミノ酸残基によって形成されていた。ＨＭＫ－１２ Ｆａｂの相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸残基の原子から６Åより短いかそれに等しい距離に位置するＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２のアミノ酸残基がＨＭＫ－１２ Ｆａｂのエピトープであり、５つの領域（Ｅ２１９－Ｌ２２２、Ｄ２３０*－Ｈ２３５*、Ｄ２５９－Ｄ２６０、Ｅ２９６－Ｋ３０２及びＧ３０７－Ｒ３１５）に分散していた（図７）。
２番目の領域を除く５つの領域のうち４つは同じＣε２モノマー上に存在した。図８で赤色で示した第２の領域Ｄ２３０*－Ｈ２３５*は、前述のＣε２モノマーとホモ二量体を作るもう一つのＣε２モノマー由来のループ構造であった。この結晶学的観察から、エピトープ領域は鎖間ジスルフィド結合によりホモ二量体構造が強化されているＣε２ホモ二量体の両単量体由来のアミノ酸残基からなることが明らかになった。
ＨＭＫ－１２ＦａｂのＶＨの第１及び第３のＣＤＲ領域（Ｇ２６－Ｎ３７及びＨ１００－Ａ１１０）は、Ｃε２ホモ二量体のエピトープ領域の代表的なアミノ酸残基の認識に重要な役割を果たすと考えられる（図９）。ＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２のＣε２ドメインにあってＨＭＫ－１２Ｆａｂとの結合における代表的なアミノ酸残基はＮ２３２*、Ｄ３０９、Ｌ３１１、Ｈ３１３（図９に緑色の炭素原子をもつ棒モデル）で、エピトープ領域の他のアミノ酸に比べ、隣接するＨＭＫ－１２ Ｆａｂの原子がより多く存在する（図７）。最初のＣＤＲ領域はＣε２ドメインの最後のβ鎖の前半と相互作用した。第三のＣＤＲ領域はＣε２ドメインの最後のβ鎖の後半とＣε２ホモ二量体の他のモノマーからのループの先端と相互作用した。より詳細には、最初のＣＤＲ領域の側鎖ヒドロキシル基（Ｙ２７、Ｓ３３及びＹ３４）とＳ３２の主鎖カルボニル基が、Ｄ３０９の主鎖アミド及びカルボニル基、Ｌ３１１の主鎖カルボニル基と水素結合を形成する。第三のＣＤＲ領域はＮ２３２*を囲うような形で多くの水素結合を形成する。Ｙ１０３とＳ１０４の主鎖カルボニル基とＲ１０６の主鎖アミド基はＮ２３２*の極性側鎖と水素結合を形成する。さらに、Ｈ１００の側鎖はＮ２３２*の主鎖カルボニル基と水素結合を形成する。Ｎ２３２*の結合に加えて、３番目のＣＤＲ領域は、Ｇ１０１及びＹ１０２の主鎖カルボニル基を介してＣε２のβ鎖の最後の半分のＨ３１３の側鎖と水素結合を形成する。
まとめると、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂは、第１及び第３のＣＤＲに存在するアミノ酸残基を介して、Ｃε２ホモダイマー中のモノマーの両方に由来するエピトープ領域を認識することができる抗体であった。これらの結果は、ＨＭＫ－１２ ＦａｂがＣε２ドメインのホモ二量体構造を欠く完全に還元されたＩｇＥと反応しないことを示す前記の発明者らの知見と一致した。
【0035】
（４）ＨＭＫ－１２ ＦａｂはＩｇＥ－ＦｃεＲＩ複合体を速やかに解離させ、アナフィラキシー反応を阻害する。
ＩｇＥは肥満細胞や好塩基球の表面にあるＦＣεＲＩに高い親和性（解離定数、Ｋｄ ＝１０-10Ｍ）で結合する（Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ ７６，３６２７－３６４１（２０２１））。この親和性は、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲｓ）についてはＩｇＧ、低親和性受容体であるＣＤ２３についてはＩｇＥよりも少なくとも数桁高いと考えられている。ＩｇＥとＦｃεＲＩの間のこのような強固な会合にもかかわらず、ＨＭＫ－１２ ＦａｂがＦｃεＲＩからＩｇＥを解離できるという特異な特性を有することを示した。これらの現象に対するさらなる洞察を得るために、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂによる既成のＩｇＥ－ＦｃＥＲＩ複合体の解離効率を調べた。この目的のために、ＰＴ１８細胞を０．２μＭのＡｌｅｘａ ４８８標識ＳＰＥ‐７ ＩｇＥと３７℃で１５分間プレインキュベートした。過剰な非結合抗体を除去するために細胞を２回洗浄し、種々の温度（２、２５及び３７℃）下で異なる濃度のＨＭＫ－１２ Ｆａｂ又はＩｇＧ２ａ Ｆａｂ （０．０２μＭ、０．２μＭ、２μＭ）と５、１５及び７５分間インキュベートした。各温度条件下で洗浄した後、ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａフローサイトメーターを用いてＳＰＥ－７ ＩｇＥ＋ＰＴ１８細胞の蛍光強度を測定した。
その結果、ＳＰＥ－７ ＩｇＥ＋ＰＴ１８細胞の蛍光強度が、３７℃で２μＭのＨＭＫ－１２ Ｆａｂと５、１５及び７５分間インキュベートした後、それぞれ４６、７３及び８９％劇的に減少した（図１０）。しかし、２℃ではＨＭＫ－１２ Ｆａｂとインキュベートした後にあっても、ＳＰＥ－７ ＩｇＥ＋ＰＴ１８細胞の蛍光強度に変化はなかった。
ＳＰＥ－７ ＩｇＥ＋ＰＴ１８細胞の蛍光強度低下がＩｇＥ－ＦｃＥＲＩ複合体の解離によるものであることをさらに確認するため、ＥＬＩＳＡにより解離したＳＰＥ－７ ＩｇＥの量について培養上清を分析した。Ａｌｅｘａ ４８８標識ＳＰＥ－７ ＩｇＥとプレインキュベートしたＰＴ１８細胞を洗浄し、２μＭのＨＭＫ－１２ Ｆａｂ又はＩｇＧ２ａ Ｆａｂと３７℃でインキュベートした。ＨＭＫ－１２ Ｆａｂを３７℃で１５分間及び６０分間インキュベートした後、フローサイトメトリー解析により、ＳＰＥ－７ ＩｇＥ＋ＰＴ１８細胞の強度がそれぞれ７６％及び８５％低下した（図１１上図）。対照的に、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂと１５分及び６０分間インキュベートした後のＥＬＩＳＡデータから、培養物上清中のＳＰＥ－７ ＩｇＥ／ＨＭＫ－１２ Ｆａｂ免疫複合体の濃度は、それぞれ１．５ｎＭと２ｎＭであった（図１１下図）。しかし、ＳＰＥ－７ ＩｇＥ＋ＰＴ１８細胞をＩｇＧ２ａ Ｆａｂとインキュベートした場合、免疫複合体は検出されなかった。まとめると、少量のＨＭＫ‐１２ Ｆａｂが温度依存的に既成のＩｇＥ－ＦｃＥＲＩ複合体を迅速に解離することが明確に示された。
アレルギー反応におけるＨＭＫ－１２ Ｆａｂフラグメント（ＨＭＫ－１２ Ｆａｂ）の役割にさらに取り組むために、受動的皮膚アナフィラキシー（ＰＣＡ）アッセイを用いてＩｇＥ媒介アナフィラキシー反応に対するＨＭＫ－１２ Ｆａｂのｉｎ ｖｉｖｏ効果を検討した。まず、１μｇ／ｍｌのＳＰＥ－７ ＩｇＥをラットに皮内注射した。２日後、ＨＭＫ‐１２ Ｆａｂ又は抗κ Ｆａｂ ５μｇ／ｍｌを同じ部位に注射した。１５分後、ラットに０．５％エバンスブルーと１ｍｇ／ｍｌのＤＮＰ－ＢＳＡを含む生理食塩水を静脈内注射した。次に、血管から組織へのエバンスブルーの漏出を、６２０ｎｍ波長での吸光度測定により定量した。図１２（刺激前）に示した結果は、少量のＨＭＫ－１２ ＦａｂがＰＣＡ反応を阻害し得るが、抗κ ＦａｂによるＰＣＡ反応の阻害はなかったことを示す。次に、ＳＰＥ－７ ＩｇＥの皮内注射の２日後に、ラットに０．５％エバンスブルーと１ｍｇ／ｍｌのＤＮＰ－ＯＶＡを含む生理食塩水を静脈内投与した。投与後速やかにＨＭＫ－１２ Ｆａｂ又は抗κ Ｆａｂ ５μｇ／ｍｌをラット皮内に注射した。漏出したエバンスブルーの定量的評価は、ＨＭＫ－１２ ＦａｂがＰＣＡ反応を阻害できるが、抗κ Ｆａｂ（刺激後）によるＰＣＡ反応の阻害はないことを明らかにした。これら全ての結果は、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂがアレルゲン刺激後でもアナフィラキシー反応を阻害できることを明確に示している。
ＩｇＥは肥満細胞や好塩基球の表面にあるＦＣεＲＩに高い親和性（解離定数、Ｋｄ ＝１０-10Ｍ）で結合する（Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ ７６，３６２７－３６４１（２０２１））。この親和性は、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲｓ）についてはＩｇＧ、低親和性受容体であるＣＤ２３についてはＩｇＥよりも少なくとも数桁高いと考えられている。ＩｇＥとＦｃεＲＩの間のこのような強固な会合にもかかわらず、ＨＭＫ－１２ ＦａｂがＦｃεＲＩからＩｇＥを解離できるという特異な特性を有することを示した。これらの現象に対するさらなる洞察を得るために、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂによる既成のＩｇＥ－ＦｃＥＲＩ複合体の解離効率を調べた。この目的のために、ＰＴ１８細胞を０．２μＭのＡｌｅｘａ ４８８標識ＳＰＥ‐７ ＩｇＥと３７℃で１５分間プレインキュベートした。過剰な非結合抗体を除去するために細胞を２回洗浄し、種々の温度（２、２５及び３７℃）下で異なる濃度のＨＭＫ－１２ Ｆａｂ又はＩｇＧ２ａ Ｆａｂ （０．０２μＭ、０．２μＭ、２μＭ）と５、１５及び７５分間インキュベートした。各温度条件下で洗浄した後、ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａフローサイトメーターを用いてＳＰＥ－７ ＩｇＥ＋ＰＴ１８細胞の蛍光強度を測定した。
その結果、ＳＰＥ－７ ＩｇＥ＋ＰＴ１８細胞の蛍光強度が、３７℃で２μＭのＨＭＫ－１２ Ｆａｂと５、１５及び７５分間インキュベートした後、それぞれ４６、７３及び８９％劇的に減少した（図１０）。しかし、２℃ではＨＭＫ－１２ Ｆａｂとインキュベートした後にあっても、ＳＰＥ－７ ＩｇＥ＋ＰＴ１８細胞の蛍光強度に変化はなかった。
ＳＰＥ－７ ＩｇＥ＋ＰＴ１８細胞の蛍光強度低下がＩｇＥ－ＦｃＥＲＩ複合体の解離によるものであることをさらに確認するため、ＥＬＩＳＡにより解離したＳＰＥ－７ ＩｇＥの量について培養上清を分析した。Ａｌｅｘａ ４８８標識ＳＰＥ－７ ＩｇＥとプレインキュベートしたＰＴ１８細胞を洗浄し、２μＭのＨＭＫ－１２ Ｆａｂ又はＩｇＧ２ａ Ｆａｂと３７℃でインキュベートした。ＨＭＫ－１２ Ｆａｂを３７℃で１５分間及び６０分間インキュベートした後、フローサイトメトリー解析により、ＳＰＥ－７ ＩｇＥ＋ＰＴ１８細胞の強度がそれぞれ７６％及び８５％低下した（図１１上図）。対照的に、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂと１５分及び６０分間インキュベートした後のＥＬＩＳＡデータから、培養物上清中のＳＰＥ－７ ＩｇＥ／ＨＭＫ－１２ Ｆａｂ免疫複合体の濃度は、それぞれ１．５ｎＭと２ｎＭであった（図１１下図）。しかし、ＳＰＥ－７ ＩｇＥ＋ＰＴ１８細胞をＩｇＧ２ａ Ｆａｂとインキュベートした場合、免疫複合体は検出されなかった。まとめると、少量のＨＭＫ‐１２ Ｆａｂが温度依存的に既成のＩｇＥ－ＦｃＥＲＩ複合体を迅速に解離することが明確に示された。
アレルギー反応におけるＨＭＫ－１２ Ｆａｂフラグメント（ＨＭＫ－１２ Ｆａｂ）の役割にさらに取り組むために、受動的皮膚アナフィラキシー（ＰＣＡ）アッセイを用いてＩｇＥ媒介アナフィラキシー反応に対するＨＭＫ－１２ Ｆａｂのｉｎ ｖｉｖｏ効果を検討した。まず、１μｇ／ｍｌのＳＰＥ－７ ＩｇＥをラットに皮内注射した。２日後、ＨＭＫ‐１２ Ｆａｂ又は抗κ Ｆａｂ ５μｇ／ｍｌを同じ部位に注射した。１５分後、ラットに０．５％エバンスブルーと１ｍｇ／ｍｌのＤＮＰ－ＢＳＡを含む生理食塩水を静脈内注射した。次に、血管から組織へのエバンスブルーの漏出を、６２０ｎｍ波長での吸光度測定により定量した。図１２（刺激前）に示した結果は、少量のＨＭＫ－１２ ＦａｂがＰＣＡ反応を阻害し得るが、抗κ ＦａｂによるＰＣＡ反応の阻害はなかったことを示す。次に、ＳＰＥ－７ ＩｇＥの皮内注射の２日後に、ラットに０．５％エバンスブルーと１ｍｇ／ｍｌのＤＮＰ－ＯＶＡを含む生理食塩水を静脈内投与した。投与後速やかにＨＭＫ－１２ Ｆａｂ又は抗κ Ｆａｂ ５μｇ／ｍｌをラット皮内に注射した。漏出したエバンスブルーの定量的評価は、ＨＭＫ－１２ ＦａｂがＰＣＡ反応を阻害できるが、抗κ Ｆａｂ（刺激後）によるＰＣＡ反応の阻害はないことを明らかにした。これら全ての結果は、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂがアレルゲン刺激後でもアナフィラキシー反応を阻害できることを明確に示している。
【0036】
（考察）
モノクローナル抗ＩｇＥ抗体のＦａｂフラグメント、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂがいくつかの点で新規な作用を有することを実証した。第一に、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂの結合エピトープはＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２領域に存在するが、ＩｇＥ Ｆｃドメインには存在しない。第二に、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂは既成のＩｇＥ－ＦｃεＲＩ複合体を速やかに解離させ、アレルゲン刺激後でもＩｇＥを介したアナフィラキシー反応を阻害することができる。最後に、Ｘ線結晶学的研究により、ＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２上の異なるエピトープをＨＭＫ－１２ Ｆａｂが標的とすることによりＩｇＥ Ｆｃドメインの非対称性の低下を引き起こし、ＩｇＥをアロステリックな方法で受容体複合体から解離させることが明らかになった。
モノクローナル抗ＩｇＥ抗体のＦａｂフラグメント、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂがいくつかの点で新規な作用を有することを実証した。第一に、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂの結合エピトープはＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２領域に存在するが、ＩｇＥ Ｆｃドメインには存在しない。第二に、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂは既成のＩｇＥ－ＦｃεＲＩ複合体を速やかに解離させ、アレルゲン刺激後でもＩｇＥを介したアナフィラキシー反応を阻害することができる。最後に、Ｘ線結晶学的研究により、ＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２上の異なるエピトープをＨＭＫ－１２ Ｆａｂが標的とすることによりＩｇＥ Ｆｃドメインの非対称性の低下を引き起こし、ＩｇＥをアロステリックな方法で受容体複合体から解離させることが明らかになった。
【0037】
ＩｇＥが発見されて以来、治療目的でオマリズマブ、リゲリズマブ、キリズマブなど多くのモノクローナル抗ＩｇＥ抗体が作製されている。しかし、これらの抗体の結合エピトープの大部分は、ＩｇＥ上のＦｃεＲＩ結合部位と重複するＣε３及びＣε４ドメイン内に認められた。したがって、これらの抗体はフリーＩｇＥを中和できるが、あらかじめ形成されたＩｇＥ／ＦｃεＲＩ複合体とは効率的に相互作用しない。一方、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂはあらかじめ形成されたＩｇＥ／ＦｃεＲＩ複合体と相互作用することができるが、競合実験により、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂが肥満細胞上のＦｃεＲＩへのＩｇＥの結合を用量依存的に効果的に遮断することが明らかになった。これらの観察は、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂによって認識されるＩｇＥエピトープの同定を容易にした。還元及び非還元条件下での以下の蛋白質分析から、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂ結合エピトープはＩｇＥ二量体上に存在するが、モノマー上には存在しないことが示された。さらに、ペプシン消化研究では驚くべきことに、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂ結合エピトープがＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２領域上に存在するが、Ｆｃドメイン上には存在しないことを明らかにした。この観察は、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂ断片が１つのＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２分子と相互作用して複合粒子を形成するための２つの部位を提供することを示すＸ線結晶学的研究によって確認された。１つの結合部位は、ＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２のＣε２ホモ二量体ドメインと接触するＨＭＫ－１２ Ｆａｂの従来のエピトープ認識部位であり、もう１つの結合部位は、ＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２の軽鎖と相互作用するＨＭＫ－１２ Ｆａｂの重鎖のヒンジ領域のクレフトであった。
【0038】
リセプター複合体形成の阻害に加えて、今回の研究からのもう一つの驚くべき発見は、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂを介したレセプター複合体からのＩｇＥの除去である。ＨＭＫ－１２ Ｆａｂの役割に関する更なる洞察を得るために、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂ／ＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２複合体をＩｇＥ Ｆｃ／ＦｃＥＲＩ複合体に重ね合わせることにより、ＨＭＫ‐１２ Ｆａｂの機能を調べることを試みた。ＨＭＫ－１２ Ｆａｂ／ＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２複合体の結晶構造は、ＨＭＫ－１２ ＦａｂのＩｇＥへの結合がＣε２とＣε３ドメイン間の空間配置の多様性を減少させることを示唆した。これは、Ｃε２ドメインの下半分に位置するＨＭＫ－１２ Ｆａｂの結合エピトープが、全長のＩｇＥでは短いリンカー領域を介してＣε３ドメインに近接しているという事実に起因する可能性が最も高い。図１３に、ＩｇＥ Ｆｃ－ＦｃεＲＩ 複合体（ＰＤＢ ＩＤ： ２Ｙ７Ｑ）と本研究で決定したＨＭＫ－１２ Ｆａｂ／ＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２複合体の結晶構造の重ね合わせを示す。ＩｇＥ Ｆｃ－ＦｃεＲＩの複合体構造では、２つのＦｃ断片が構造的に非対称な二量体を形成し、それぞれのＣεドメインは異なる空間配置をとる。その結果、２つのＣε３ドメイン間に形成される空間はＦｃεＲＩの結合に適応すると考えられる。この研究におけるＩｇＥのＣε２の受容体複合体のＣε２への重ね合わせ（図１３Ａ）では、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂの軽鎖のＦｖドメインが受容体複合体構造のＣε３ドメインと重なり合っている。この研究におけるＩｇＥのＣε２と受容体複合体のもう一方のＣε２との重ね合わせにおいて（図１３Ｂ）、ＨＭＫ－１２ Ｆａｂの重鎖のＦｖドメインは、受容体複合体構造において他のＣε３ドメインと重複している。ＩｇＥのＣε２ドメインへのＨＭＫ－１２ Ｆａｂ結合は、ＩｇＥのＦｃフラグメントにＦｃとＦｃＥＲＩ複合体の結晶構造で観測されるものとは異なる空間配置を取らせる。
【0039】
結晶構造解析の結果、ジスルフィド結合により連結された１対のIｇＥ重鎖のＣε２ドメインとＨＭＫ‐１２ Ｆａｂが、２回回転対称を示すことが明らかになった。結晶構造は結晶場の影響を受けるが、結晶学的原子変位因子の分析はＨＭＫ－１２ ＦａｂとＣε２ドメインの強固に結合した複合体を示したので、２回回転対称関係は基本的に溶液中でも保たれるであろう。しかし、最近の進展は、IｇＥ－ＦｃεＲＩ複合体の例外的に遅い解離速度（１２，３５，３６）のために、ＩｇＥ Ｆｃドメインの非対称な空間配置の重要性を示した。
したがって、ＨＭＫ－１２結合によって導入されたＩｇＥ重鎖の２回回転対称構造が、ＦｃεＲＩに対するＩｇＥの結合親和性の低下を引き起こす可能性が考えられる。
したがって、ＨＭＫ－１２結合によって導入されたＩｇＥ重鎖の２回回転対称構造が、ＦｃεＲＩに対するＩｇＥの結合親和性の低下を引き起こす可能性が考えられる。
【0040】
上述のように、ＨＭＫ－１２ ＦａｂはＩｇＥのＣε３ドメインと相互作用するのに十分な大きさであったため、２つのＣε２／ＨＭＫ－１２ Ｆａｂ部分に隣接する２つのＣε３ドメインは、Ｃε２ドメインとＨＭＫ‐１２ Ｆａｂの２回回転対称関係によって影響を受け、ＩｇＥ Ｆｃドメインの非対称構造という受容体との結合に必要な特徴の低下をもたらす可能性があった。結果として、受容体複合体からのｌｇＥの除去又は受容体複合体形成の阻害を引き起こす可能性がある。最後に、ＩｇＥ Ｆ（ａｂ´）２に２箇所で結合するＨＭＫ－１２ Ｆａｂは、間接的にＩｇＥ Ｆｃドメインの構造的特徴を変化させ、速やかにＩｇＥ－ＦｃεＲＩ複合体を解離させることを本発明で示した。ＨＭＫ－１２ Ｆａｂの特徴は、この抗体がアレルゲン負荷後でもアナフィラキシー反応を阻害できる理由を説明するかもしれない。ＩｇＥ－ＦｃεＲＩ相互作用のアロステリック調節として知られるこれら全ての知見は、アレルギー疾患の予防と治療のためのより良い治療選択肢を提供する可能性がある。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
