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特開2024-75545子宮頸癌Ｅ７タンパク質検出用抗体抗原検出キット及びその検出方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024075545
(43)【公開日】2024-06-04
(54)【発明の名称】子宮頸癌Ｅ７タンパク質検出用抗体抗原検出キット及びその検出方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/543 20060101AFI20240528BHJP
G01N 33/574 20060101ALI20240528BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20240528BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20240528BHJP
【ＦＩ】
G01N33/543 521
G01N33/574 A
C12Q1/686 Z
C12Q1/6869 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023092745
(22)【出願日】2023-06-05
(31)【優先権主張番号】2022114770552
(32)【優先日】2022-11-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(71)【出願人】
【識別番号】523214203
【氏名又は名称】弗雷米徳生物医薬技術（天津）有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＦＡＭＩＤ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｔｉａｎｊｉｎ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．
【住所又は居所原語表記】３０１Ｂ， Ｂｌｄｇ ２，４ Ｈａｉｔａｉ Ｆａｚｈａｎ Ｅｒｌｕ Ｒｏａｄ Ｂｉｎｈａｉ Ｈｉｇｈ－Ｔｅｃｈ Ｈｕａｙｕａｎ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐａｒｋ Ｔｉａｎｊｉｎ， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】100194526
【弁理士】
【氏名又は名称】叶野 徹
(72)【発明者】
【氏名】苗進超
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ08
4B063QQ42
4B063QQ79
4B063QR08
4B063QR42
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS34
4B063QX01
(57)【要約】
【課題】 背景技術に記載の問題を解決する。
【解決手段】
本発明は子宮頸癌Ｅ７タンパク質検出用抗体抗原検出キット及びその検出方法を提供し、揺動ユニットは、エアバッグ、変形層、ライナープレート、支持プレート、回転軸、連接ロッド及びスライドレールをさらに含み、エアバッグはスライダーのケーシングから離れる一端に嵌め込まれ、変形層はエアバッグのスライダーから離れる一端に嵌め込まれ、ライナープレートは変形層のエアバッグから離れる側で揺動し、支持プレートはライナープレートの上端にスライドし、回転軸は支持プレートの下端の両側にヒンジで接続され、自社開発した抗体抗原は遺伝子組換え及びハイブリドーマ技術を応用して、Ｅ７タンパク質を原核生物で発現及び精製し、これを免疫原としてＥ７タンパク質モノクローナル抗体を調製し、且つ最初に同定してサンプルにおけるウイルスを検出し、吸着層は試験紙カードの内部から滴下するサンプルを吸着し、液体サンプルがボトムブラケットの内部に流れて、ボトムブラケットの再利用に影響を与えることを回避し、これにより、このような検出キットは、試験紙カードが使用されていないときに試験紙カードの表面が汚れることを回避することができる。
【選択図】 なし
【解決手段】
本発明は子宮頸癌Ｅ７タンパク質検出用抗体抗原検出キット及びその検出方法を提供し、揺動ユニットは、エアバッグ、変形層、ライナープレート、支持プレート、回転軸、連接ロッド及びスライドレールをさらに含み、エアバッグはスライダーのケーシングから離れる一端に嵌め込まれ、変形層はエアバッグのスライダーから離れる一端に嵌め込まれ、ライナープレートは変形層のエアバッグから離れる側で揺動し、支持プレートはライナープレートの上端にスライドし、回転軸は支持プレートの下端の両側にヒンジで接続され、自社開発した抗体抗原は遺伝子組換え及びハイブリドーマ技術を応用して、Ｅ７タンパク質を原核生物で発現及び精製し、これを免疫原としてＥ７タンパク質モノクローナル抗体を調製し、且つ最初に同定してサンプルにおけるウイルスを検出し、吸着層は試験紙カードの内部から滴下するサンプルを吸着し、液体サンプルがボトムブラケットの内部に流れて、ボトムブラケットの再利用に影響を与えることを回避し、これにより、このような検出キットは、試験紙カードが使用されていないときに試験紙カードの表面が汚れることを回避することができる。
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
トップカバー（１）及びボトムブラケット（１０１）を含む子宮頸癌Ｅ７タンパク質検出用抗体抗原検出キットであって、ボトムブラケット（１０１）とトップカバー（１）は可動に嵌合接続され、前記トップカバー（１）とボトムブラケット（１０１）の中間層の内部に試験紙カード（１０２）が可動に嵌合され、前記ボトムブラケット（１０１）の内側に吸着層（１０４）が可動に貫通される、ことを特徴とする子宮頸癌Ｅ７タンパク質検出用抗体抗原検出キット。
【請求項2】
前記トップカバー（１）の内部に観察口が貫通し、ボトムブラケット（１０１）の内部に穴が貫通し、ボトムブラケット（１０１）のトップカバー（１）に接近する側に凹溝が開けられ、試験紙カード（１０２）は凹溝の内部に可動に嵌合され、ボトムブラケット（１０１）の内側には持ち上げるための揺動ユニットが設けられ、
前記試験紙カード（１０２）の表面にはテストライン及びコントロールラインが設けられ、試験紙カード（１０２）はＥ７タンパク質検出用試験紙カードであり、試験紙カード（１０２）の検出試薬にはサンプルにおけるウイルスを検出するための抗体、抗原が含まれ、試験紙カード（１０２）には試験管（１０３）がマッチングして設けられ、
前記吸着層（１０４）は試験紙カード（１０２）と垂直に密着して設置され、吸着層（１０４）の厚さが０．２～０．８ｃｍである、ことを特徴とする請求項１に記載の子宮頸癌Ｅ７タンパク質検出用抗体抗原検出キット。
前記試験紙カード（１０２）の表面にはテストライン及びコントロールラインが設けられ、試験紙カード（１０２）はＥ７タンパク質検出用試験紙カードであり、試験紙カード（１０２）の検出試薬にはサンプルにおけるウイルスを検出するための抗体、抗原が含まれ、試験紙カード（１０２）には試験管（１０３）がマッチングして設けられ、
前記吸着層（１０４）は試験紙カード（１０２）と垂直に密着して設置され、吸着層（１０４）の厚さが０．２～０．８ｃｍである、ことを特徴とする請求項１に記載の子宮頸癌Ｅ７タンパク質検出用抗体抗原検出キット。
【請求項3】
前記揺動ユニットは、ケーシング（２）、スライダー（２０１）、係止ブロック（２０２）、及び傾斜プレート（２０３）を含み、ケーシング（２）はボトムブラケット（１０１）の両側に設けられ、スライダー（２０１）はボトムブラケット（１０１）にスライド可能に接続されてボトムブラケット（１０１）の内部まで延伸し、係止ブロック（２０２）はトップカバー（１）の両側に設けられ、傾斜プレート（２０３）は係止ブロック（２０２）の両側に嵌め込まれる、ことを特徴とする請求項２に記載の子宮頸癌Ｅ７タンパク質検出用抗体抗原検出キット。
【請求項4】
前記ケーシング（２）は円環状に設置されて、ボトムブラケット（１０１）の内側に嵌め込まれ、ケーシング（２）は係止ブロック（２０２）にスライド可能に嵌合接続され、スライダー（２０１）とマッチングして設置され、
スライダー（２０１）はケーシング（２）の内部にスライド可能に嵌合され、スライダー（２０１）の外壁はケーシング（２）の内壁にスライド可能に密着して設置される、ことを特徴とする請求項３に記載の子宮頸癌Ｅ７タンパク質検出用抗体抗原検出キット。
スライダー（２０１）はケーシング（２）の内部にスライド可能に嵌合され、スライダー（２０１）の外壁はケーシング（２）の内壁にスライド可能に密着して設置される、ことを特徴とする請求項３に記載の子宮頸癌Ｅ７タンパク質検出用抗体抗原検出キット。
【請求項5】
前記係止ブロック（２０２）はケーシング（２）とマッチングして設置され、係止ブロック（２０２）の側面は台形で設置され、トップカバー（１）は係止ブロック（２０２）を介してケーシング（２）にスライド可能に嵌合され、
傾斜プレート（２０３）は１５～３５°で傾斜して設置され、傾斜プレート（２０３）はケーシング（２）の内壁にスライド可能に押し付けられて密着して設置され、傾斜プレート（２０３）は変形可能な材料で製造される、ことを特徴とする請求項３に記載の子宮頸癌Ｅ７タンパク質検出用抗体抗原検出キット。
傾斜プレート（２０３）は１５～３５°で傾斜して設置され、傾斜プレート（２０３）はケーシング（２）の内壁にスライド可能に押し付けられて密着して設置され、傾斜プレート（２０３）は変形可能な材料で製造される、ことを特徴とする請求項３に記載の子宮頸癌Ｅ７タンパク質検出用抗体抗原検出キット。
【請求項6】
前記揺動ユニットは、エアバッグ（３）、変形層（３０１）、ライナープレート（３０２）、支持プレート（４）、回転軸（４０１）、連接ロッド（４０２）、及びスライドレール（４０３）をさらに含み、
エアバッグ（３）はスライダー（２０１）のケーシング（２）から離れる一端に嵌め込まれ、変形層（３０１）はエアバッグ（３）のスライダー（２０１）から離れる一端に嵌め込まれ、ライナープレート（３０２）は変形層（３０１）のエアバッグ（３）から離れる側で揺動し、支持プレート（４）はライナープレート（３０２）の上端にスライドし、回転軸（４０１）は支持プレート（４）の下端の両側にヒンジで接続され、連接ロッド（４０２）は回転軸（４０１）の一端で揺動し、スライドレール（４０３）は支持プレート（４）の下方の両側に設けられる、ことを特徴とする請求項２に記載の子宮頸癌Ｅ７タンパク質検出用抗体抗原検出キット。
エアバッグ（３）はスライダー（２０１）のケーシング（２）から離れる一端に嵌め込まれ、変形層（３０１）はエアバッグ（３）のスライダー（２０１）から離れる一端に嵌め込まれ、ライナープレート（３０２）は変形層（３０１）のエアバッグ（３）から離れる側で揺動し、支持プレート（４）はライナープレート（３０２）の上端にスライドし、回転軸（４０１）は支持プレート（４）の下端の両側にヒンジで接続され、連接ロッド（４０２）は回転軸（４０１）の一端で揺動し、スライドレール（４０３）は支持プレート（４）の下方の両側に設けられる、ことを特徴とする請求項２に記載の子宮頸癌Ｅ７タンパク質検出用抗体抗原検出キット。
【請求項7】
前記エアバッグ（３）、変形層（３０１）、ライナープレート（３０２）、支持プレート（４）、回転軸（４０１）、連接ロッド（４０２）及びスライドレール（４０３）はいずれもボトムブラケット（１０１）の内部に設けられ、エアバッグ（３）の内壁の厚さが０．５～１ｃｍであり、変形層（３０１）の厚さが０．２～０．４ｃｍである、ことを特徴とする請求項６に記載の子宮頸癌Ｅ７タンパク質検出用抗体抗原検出キット。
【請求項8】
前記変形層（３０１）とライナープレート（３０２）はマッチングして設置され、ライナープレート（３０２）は１５～３５°で下方に傾斜して設置され、変形層（３０１）は半円弧状であり、２～４個のライナープレート（３０２）は変形層（３０１）の側面を取り囲み、変形層（３０１）の材質は傾斜プレート（２０３）の材質と同じであり、支持プレート（４）の一端はボトムブラケット（１０１）の内側まで延伸し、支持プレート（４）の他端は吸着層（１０４）の下端まで延伸し、支持プレート（４）は吸着層（１０４）の下端の両側に分布し、ボトムブラケット（１０１）の内側に垂直にスライドする、ことを特徴とする請求項６に記載の子宮頸癌Ｅ７タンパク質検出用抗体抗原検出キット。
【請求項9】
前記連接ロッド（４０２）の回転軸（４０１）から離れる一端はスライドレール（４０３）の内部にスライドし、支持プレート（４）が静止状態にある場合、連接ロッド（４０２）の一端はスライドレール（４０３）の底端にあり、支持プレート（４）全体が上方へスライドするときに、連接ロッド（４０２）はスライドレール（４０３）の内部に上方へスライドし、スライドレール（４０３）は３５～５０°で傾斜して設置され、スライドレール（４０３）の連接ロッド（４０２）に接近する一端に凹溝が開けられる、ことを特徴とする請求項６に記載の子宮頸癌Ｅ７タンパク質検出用抗体抗原検出キット。
【請求項10】
請求項１～９のいずれか１項に記載の子宮頸癌Ｅ７タンパク質検出用抗体抗原検出キットの検出方法であって、
先ずＥ７コード配列を含むＰＥＴ－３２ａ発現プラスミドを構築し、大腸菌発現株ＢＬ２１を形質転換し、菌体を収集し、Ｎｉカラムによって精製してＥ７組換えタンパク質を得て、Ｅ７組換えタンパク質を免疫原として、Ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫し、ＥＬＩＳＡ間接法でマウス血清の力価が１／８Ｋを超えることを検出した後に、免疫マウスの脾臓をマウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０と融合し、ハイブリドーマ細胞をＥＬＩＳＡ間接法でサブクローニングし、抗Ｅ７を分泌するモノクローナルハイブリドーマ細胞を得て、ハイブリドーマ細胞をマウスの腹腔に注射し、腹水を収集して、精製し、抗Ｅ７タンパク質特異的モノクローナル抗体を得るステップＳ１と、
ゲノムが不安定な場合に、Ｅ７はゲノムに混入して細胞を破壊すると、Ｅ７癌タンパク質が生成され、Ｅ７が大量に活性化すると、癌化を引き起こし、Ｅ７遺伝子によってコードされる発がん性タンパク質は子宮頸部上皮の癌化を引き起こす重要な因子であり、該タンパク質は網膜芽細胞腫タンパク質ｐＲｂを阻害することにより感染された細胞を無限に増殖させて悪性に変化させるステップＳ２と、
ｐＲｂは腫瘍抑制タンパク質であり、通常、リン酸化されていないｐＲｂは核転写因子Ｅ２Ｆに特異的に結合し、両者の化合物を形成した後に、Ｅ２Ｆによる標的遺伝子の転写を阻害するため、細胞はＧ１期に留まり、細胞の増殖が停止し、高リスク型ＨＰＶＥ７タンパク質はＣＲ領域の構造を介してｐＲｂの６４９－７２ポケット構造に特異的に結合し、Ｅ２Ｆ因子を放出し、細胞がＧ１期からＳ期に入るのを促進し、Ｅ７はｐＲｂがユビキチン依存性の分解経路に入るのを促進するステップＳ３と、
ＨＰＶが人体に侵入した後に長期間潜伏し大量に複製することができ、これは体の免疫力の低下に関連しており、Ｅ７タンパク質はＨＰＶの主な形質転換タンパク質であり、９８個のアミノ酸のみを有する小さな酸性タンパク質であり、核内にあり又は核マトリックスに付着し、Ｅ７タンパク質は、１領域の１～１５アミノ酸、２領域の１６～３７アミノ酸、３領域の３８～９８アミノ酸、ジンクフィンガー及びＣ末端領域に分けられるステップＳ４と、
Ｅ７タンパク質のマウスＴ細胞エピトープはすべてＣ末端領域及びジンクフィンガー領域にあり、ＨＬＡ－Ａエピトープはジンクフィンガー領域、Ｎ末端領域に存在するステップＳ５と、
組換えベクターの構築とタンパク質の発現プライマーの設計を行い、ＰＣＲ方法でＨＰＶ１６陽性サンプルからＥ７遺伝子配列を増幅し、酵素切断の後にＰＥＴ－３２ａプラスミドを結合し、組換えプラスミドをコンピテント大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、陽性コロニーＰＣＲを選択して同定及び配列決定を行い、配列決定された正しいプラスミドを増幅し、大腸菌発現株ＢＬ２１を形質転換し、シングルコロニーを２ｍｌの液体ＬＢ培地に３７℃ ２２０ｒｐｍでＯＤ値が０．６～０．８になるまで培養し、誘導剤ＩＰＴＧを加え、誘導培養を４時間継続し、遠心分離して菌体を収集し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ同定を行うステップＳ６と、
陽性の高発現株を選択して凍結保存し、拡大培養し、組換え発現株を液体ＬＢ培地に接種し、３７℃ ２２０ｒｐｍで一晩培養し、培養液を１／５０に液体ＬＢ培地に増量し、３７℃ ２２０ｒｐｍでＯＤ値が０．６～０．８になるまで培養し、最終濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌになるように誘導剤ＩＰＴＧを加え、２５℃で一晩誘導し、遠心分離して菌体沈殿物を収集し、ＰＢＳ緩衝液で再懸濁し、氷浴下で菌体を超音波破砕し遠心分離して上清を収集し、０．４５μｍの濾過膜で濾過した後にＮｉカラムで精製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分子量及び純度を同定して測定するステップＳ７と、
動物免疫及び力価測定を行い：組換えＥ７タンパク質を免疫原として調製しＢＡＬｂ／ｃマウスを免疫し、初回に、免疫抗原５０μｇをフロイント完全アジュバントとともに皮下に多点注射して免疫し、２週間後に２回目の免疫を行い、抗原１００ｕｇをフロイント不完全アジュバントとともに皮下に多点注射して免疫し、２週間後に３回目の免疫を行い、用量が２回目の免疫と同じであり、７日後に尾の先端から採血して力価を測定し、力価が最も高いマウスを選択し、１週間後に、抗原１００ｕｇをフロイント不完全アジュバントとともに腹腔内注射して免疫を強化するステップＳ８と、
細胞融合及びクローンのスクリーニングを行い、免疫強化の３日後に融合し、融合の４８時間前に、骨髄腫細胞を拡大培養し、融合の当日に細胞が対数増殖期になるように、融合の２４時間前に培地を１回交換し、融合の２４時間前に空白ＢＡＬｂ／ｃマウス腹腔マクロファージを９６ウェルプレートに１×１０４／ウェルで接種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養し、免疫を完了したマウスを眼球から採血した後に断頭によって屠殺し、マウスの脾臓細胞を分離し、５０％ＰＥＧで融合し、融合後の細胞を１００μｌ／ウェルでフィーダー細胞を敷いた９６ウェル細胞培養プレートに加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養し、細胞が１／２成長したら、培養上清を取り、ＥＬＩＳＡ法で陽性細胞をスクリーニングし、陽性細胞を選択してサブクローニングするステップＳ９と、
腹水の生成とモノクローナル抗体の精製を行い、スクリーニングされたハイブリドーマ細胞を拡大培養し、成体ＢＡＬｂ／ｃマウスの腹腔内に液体パラフィンを１匹あたり０．３～０．５ｍｌ接種し、１週間後に感作マウスの腹腔に５×１０５個／０．２ｍｌで注入し、１週間後にマウスの腹水の発生状況を観察し、腹部が明らかに膨れて、手で触ると皮膚が張った感じがする場合、腹水を採取し、腹水を４℃ １２０００ｒｐｍで１５ｍｉｎ遠心分離し、不純物を除去し、０．４５μｍ濾過膜で濾過した後、ＰｒｏｔｅｉｎＧアフィニティークロマトグラフィーで抗体を精製し、微量紫外分光光度計でＩｇＧ抗体の濃度を測定し、１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥで抗体の純度を分析するステップＳ１０とを含む、ことを特徴とする検出方法。
先ずＥ７コード配列を含むＰＥＴ－３２ａ発現プラスミドを構築し、大腸菌発現株ＢＬ２１を形質転換し、菌体を収集し、Ｎｉカラムによって精製してＥ７組換えタンパク質を得て、Ｅ７組換えタンパク質を免疫原として、Ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫し、ＥＬＩＳＡ間接法でマウス血清の力価が１／８Ｋを超えることを検出した後に、免疫マウスの脾臓をマウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０と融合し、ハイブリドーマ細胞をＥＬＩＳＡ間接法でサブクローニングし、抗Ｅ７を分泌するモノクローナルハイブリドーマ細胞を得て、ハイブリドーマ細胞をマウスの腹腔に注射し、腹水を収集して、精製し、抗Ｅ７タンパク質特異的モノクローナル抗体を得るステップＳ１と、
ゲノムが不安定な場合に、Ｅ７はゲノムに混入して細胞を破壊すると、Ｅ７癌タンパク質が生成され、Ｅ７が大量に活性化すると、癌化を引き起こし、Ｅ７遺伝子によってコードされる発がん性タンパク質は子宮頸部上皮の癌化を引き起こす重要な因子であり、該タンパク質は網膜芽細胞腫タンパク質ｐＲｂを阻害することにより感染された細胞を無限に増殖させて悪性に変化させるステップＳ２と、
ｐＲｂは腫瘍抑制タンパク質であり、通常、リン酸化されていないｐＲｂは核転写因子Ｅ２Ｆに特異的に結合し、両者の化合物を形成した後に、Ｅ２Ｆによる標的遺伝子の転写を阻害するため、細胞はＧ１期に留まり、細胞の増殖が停止し、高リスク型ＨＰＶＥ７タンパク質はＣＲ領域の構造を介してｐＲｂの６４９－７２ポケット構造に特異的に結合し、Ｅ２Ｆ因子を放出し、細胞がＧ１期からＳ期に入るのを促進し、Ｅ７はｐＲｂがユビキチン依存性の分解経路に入るのを促進するステップＳ３と、
ＨＰＶが人体に侵入した後に長期間潜伏し大量に複製することができ、これは体の免疫力の低下に関連しており、Ｅ７タンパク質はＨＰＶの主な形質転換タンパク質であり、９８個のアミノ酸のみを有する小さな酸性タンパク質であり、核内にあり又は核マトリックスに付着し、Ｅ７タンパク質は、１領域の１～１５アミノ酸、２領域の１６～３７アミノ酸、３領域の３８～９８アミノ酸、ジンクフィンガー及びＣ末端領域に分けられるステップＳ４と、
Ｅ７タンパク質のマウスＴ細胞エピトープはすべてＣ末端領域及びジンクフィンガー領域にあり、ＨＬＡ－Ａエピトープはジンクフィンガー領域、Ｎ末端領域に存在するステップＳ５と、
組換えベクターの構築とタンパク質の発現プライマーの設計を行い、ＰＣＲ方法でＨＰＶ１６陽性サンプルからＥ７遺伝子配列を増幅し、酵素切断の後にＰＥＴ－３２ａプラスミドを結合し、組換えプラスミドをコンピテント大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、陽性コロニーＰＣＲを選択して同定及び配列決定を行い、配列決定された正しいプラスミドを増幅し、大腸菌発現株ＢＬ２１を形質転換し、シングルコロニーを２ｍｌの液体ＬＢ培地に３７℃ ２２０ｒｐｍでＯＤ値が０．６～０．８になるまで培養し、誘導剤ＩＰＴＧを加え、誘導培養を４時間継続し、遠心分離して菌体を収集し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ同定を行うステップＳ６と、
陽性の高発現株を選択して凍結保存し、拡大培養し、組換え発現株を液体ＬＢ培地に接種し、３７℃ ２２０ｒｐｍで一晩培養し、培養液を１／５０に液体ＬＢ培地に増量し、３７℃ ２２０ｒｐｍでＯＤ値が０．６～０．８になるまで培養し、最終濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌになるように誘導剤ＩＰＴＧを加え、２５℃で一晩誘導し、遠心分離して菌体沈殿物を収集し、ＰＢＳ緩衝液で再懸濁し、氷浴下で菌体を超音波破砕し遠心分離して上清を収集し、０．４５μｍの濾過膜で濾過した後にＮｉカラムで精製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分子量及び純度を同定して測定するステップＳ７と、
動物免疫及び力価測定を行い：組換えＥ７タンパク質を免疫原として調製しＢＡＬｂ／ｃマウスを免疫し、初回に、免疫抗原５０μｇをフロイント完全アジュバントとともに皮下に多点注射して免疫し、２週間後に２回目の免疫を行い、抗原１００ｕｇをフロイント不完全アジュバントとともに皮下に多点注射して免疫し、２週間後に３回目の免疫を行い、用量が２回目の免疫と同じであり、７日後に尾の先端から採血して力価を測定し、力価が最も高いマウスを選択し、１週間後に、抗原１００ｕｇをフロイント不完全アジュバントとともに腹腔内注射して免疫を強化するステップＳ８と、
細胞融合及びクローンのスクリーニングを行い、免疫強化の３日後に融合し、融合の４８時間前に、骨髄腫細胞を拡大培養し、融合の当日に細胞が対数増殖期になるように、融合の２４時間前に培地を１回交換し、融合の２４時間前に空白ＢＡＬｂ／ｃマウス腹腔マクロファージを９６ウェルプレートに１×１０４／ウェルで接種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養し、免疫を完了したマウスを眼球から採血した後に断頭によって屠殺し、マウスの脾臓細胞を分離し、５０％ＰＥＧで融合し、融合後の細胞を１００μｌ／ウェルでフィーダー細胞を敷いた９６ウェル細胞培養プレートに加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養し、細胞が１／２成長したら、培養上清を取り、ＥＬＩＳＡ法で陽性細胞をスクリーニングし、陽性細胞を選択してサブクローニングするステップＳ９と、
腹水の生成とモノクローナル抗体の精製を行い、スクリーニングされたハイブリドーマ細胞を拡大培養し、成体ＢＡＬｂ／ｃマウスの腹腔内に液体パラフィンを１匹あたり０．３～０．５ｍｌ接種し、１週間後に感作マウスの腹腔に５×１０５個／０．２ｍｌで注入し、１週間後にマウスの腹水の発生状況を観察し、腹部が明らかに膨れて、手で触ると皮膚が張った感じがする場合、腹水を採取し、腹水を４℃ １２０００ｒｐｍで１５ｍｉｎ遠心分離し、不純物を除去し、０．４５μｍ濾過膜で濾過した後、ＰｒｏｔｅｉｎＧアフィニティークロマトグラフィーで抗体を精製し、微量紫外分光光度計でＩｇＧ抗体の濃度を測定し、１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥで抗体の純度を分析するステップＳ１０とを含む、ことを特徴とする検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は抗体抗原検出の技術分野に関し、特に子宮頸癌Ｅ７タンパク質検出用抗体抗原検出キット及びその検出方法に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｅ７は発がん性遺伝子であり、大量の発現によってＥ７癌タンパク質を生成し、癌化するまで細胞内に高度な前がん性病変を引き起こし、前がん病変の正確な処理は子宮頸癌スクリーニングの品質保証のキーであり、子宮頸癌スクリーニングの重要な目的は子宮頸癌を発見することだけでなく、前がん病変をリアルタイムに発見し子宮頸癌への進行を阻止することであるので、前がん病変の正確な処理は子宮頸癌スクリーニングの品質保証のキーである。異なるレベルの前がん病変にはすべて、転帰、持続、進行という３つの発展傾向があり、前がん病変の発展傾向を正確に判定することは、高品質のスクリーニング治療のキーであり、検出キットの技術的示唆となる。
【0003】
検出キットの研究から以下の問題が発見された。
１．子宮頸部ブラシを使用して女性の子宮頸口から分泌物を擦り取って、子宮頸部ブラシが子宮頸部から抽出した分泌物には不純物が多すぎるため、抗原で抽出する必要があり、検出キットに使用される試薬は調製後に希釈後の子宮頸部細胞を検出するため、既存の検出方法は病変細胞を効果的に検出することができない。
１．子宮頸部ブラシを使用して女性の子宮頸口から分泌物を擦り取って、子宮頸部ブラシが子宮頸部から抽出した分泌物には不純物が多すぎるため、抗原で抽出する必要があり、検出キットに使用される試薬は調製後に希釈後の子宮頸部細胞を検出するため、既存の検出方法は病変細胞を効果的に検出することができない。
【0004】
２．検出キットは試験紙カードを内部に配置することにより抗原サンプルを検出し、試験紙カードを検出キットの内部に配置すると、検出キットは試験紙カードの表面が汚れることを回避できず、また、試験紙カードが使い捨て製品であるため、検出キットが再利用する必要があり、抗原サンプルが通常液体サンプルであり、液体サンプルが試験紙カードの内部に滴下すると、余分なサンプルは検出キットの内部に流れやすく、検出キットの内部を汚し、更に検出キットの次回の使用に影響を与え、それにより、このような検出キットは取り付けるときに余分な液体サンプルを容易に吸収することができない。
【0005】
現在、従来技術におけるＣＮ２０１９１１００２４４６．７の早期子宮頸癌検出のための組成物及びキットはキットを開示しており、該発明は感度及び精度を更に向上させ、検出過程全体は非侵襲的で、操作が簡便で、判読しやすく、汎用機器が検出要件を満たすことができ、ＰＣＲ過程は完全密閉の形式を用い、相互汚染の可能性がなくなり、２つのマーカーの３つのセクションを同時に検出するため、結果はより正確になり、上記要因により、該発明は社会的普及性を有し、該検出の高感度は非侵襲性子宮頸癌の早期スクリーニングに適用できる。
【0006】
本発明は、主に検出キットが取り付けるときに余分な液体サンプルを容易に吸収できない問題を解決する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
上記技術的課題を解決するために、本発明は子宮頸癌Ｅ７タンパク質検出用抗体抗原検出キット及びその検出方法を提供することで、上記背景技術に記載の問題を解決する。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明の子宮頸癌Ｅ７タンパク質検出用抗体抗原検出キット及びその検出方法は、以下の具体的な技術的手段で実現され：
本発明は子宮頸癌Ｅ７タンパク質検出用抗体抗原検出キットに関し、トップカバー及びボトムブラケットを含み、ボトムブラケットとトップカバーは可動に嵌合接続され、前記トップカバーとボトムブラケットの中間層の内部に試験紙カードが可動に嵌合され、前記ボトムブラケットの内側に吸着層が可動に貫通される。
本発明は子宮頸癌Ｅ７タンパク質検出用抗体抗原検出キットに関し、トップカバー及びボトムブラケットを含み、ボトムブラケットとトップカバーは可動に嵌合接続され、前記トップカバーとボトムブラケットの中間層の内部に試験紙カードが可動に嵌合され、前記ボトムブラケットの内側に吸着層が可動に貫通される。
【0009】
さらに、前記トップカバーの内部に観察口が貫通し、ボトムブラケットの内部に穴が貫通し、穴の長さがボトムブラケットの長さの半分よりも大きく、ボトムブラケットのトップカバーに接近する側に凹溝が開けられ、試験紙カードは凹溝の内部に可動に嵌合され、ボトムブラケットの内側には迅速に持ち上げるための揺動ユニットが設けられる。
【0010】
さらに、前記試験紙カードの表面にはテストライン及びコントロールラインが設けられ、試験紙カードはＥ７タンパク質検出用試験紙カードであり、試験紙カードの試験試薬にはサンプルにおけるウイルスを検出するための抗体、抗原が含まれ、試験紙カードには試験管がマッチングして設けられる。
【0011】
試験紙カードにおける抗原の由来はサンプル離型剤に含まれる抗原であり、分泌物における検出物を抽出することに用いられ、子宮頸部ブラシが子宮頸部から抽出した分泌物には不純物が多すぎるため、抗原で抽出し、最終的に試験紙カードに入れて検出する必要がある。
【0012】
さらに、前記吸着層は試験紙カードと垂直に密着して設置され、吸着層の厚さが０．２～０．８ｃｍであり、吸着層はスポンジ材料で製造される。
【0013】
さらに、前記揺動ユニットは、ケーシング、スライダー、係止ブロック、及び傾斜プレートを含み、ケーシングはボトムブラケットの両側に設けられ、スライダーはボトムブラケットの内部までスライドして延伸し、係止ブロックはトップカバーの両側に設けられ、傾斜プレートは係止ブロックの両側に嵌め込まれる。
【0014】
さらに、前記ケーシングは円環状に設置されて、ボトムブラケットの内側に嵌め込まれ、ケーシングは係止ブロックにスライド可能に嵌合され、スライダーとマッチングして設置される。
【0015】
さらに、前記スライダーはケーシングの内部にスライド可能に嵌合され、垂直にスライドし、スライダーの外壁はケーシングの内壁にスライド可能に密着される。
【0016】
さらに、前記係止ブロックはケーシングとマッチングして設置され、側面が台形で設置され、トップカバーは係止ブロックを介してケーシングにスライド可能に嵌合される。
【0017】
さらに、前記傾斜プレートは１５～３５°で傾斜して設置され、傾斜プレートはケーシングの内壁にスライド可能に押し付けられて密着され、傾斜プレートと係止ブロックとを組み合わせた直径はケーシングの内径よりも０．５～１ｃｍ大きく、傾斜プレートはゴム等の変形可能な材料で製造される。
【0018】
さらに、前記揺動ユニットは、エアバッグ、変形層、ライナープレート、支持プレート、回転軸、連接ロッド及びスライドレールをさらに含み、エアバッグはスライダーのケーシングから離れる一端に嵌め込まれ、変形層はエアバッグのスライダーから離れる一端に嵌め込まれ、ライナープレートは変形層のエアバッグから離れる側で揺動し、支持プレートはライナープレートの上端にスライドし、回転軸は支持プレートの下端の両側にヒンジで接続され、連接ロッドは回転軸の一端で揺動し、スライドレールは支持プレートの下方の両側に設けられる。
【0019】
さらに、前記エアバッグ、変形層、ライナープレート、支持プレート、回転軸、連接ロッド及びスライドレールはいずれもボトムブラケットの内部に設けられ、エアバッグの内壁の厚さが０．５～１ｃｍであり、変形層の厚さが０．２～０．４ｃｍであり、エアバッグは不規則な形状で設置される。
【0020】
さらに、前記変形層とライナープレートはマッチングして設置され、ライナープレートは１５～３５°で下方に傾斜して設置され、変形層は半円弧状に設置され、半円弧の角度が９０°であり、２～４個のライナープレートは変形層の側面を取り囲み、変形層の材質は傾斜プレートの材質と同じである。
【0021】
さらに、前記支持プレートの一端はボトムブラケットの内側まで延伸し、同時に支持プレートの一端は吸着層の下端まで延伸し、支持プレートは吸着層の下端の両側に分布し、ボトムブラケットの内側に垂直にスライドする。
【0022】
さらに、前記連接ロッドの回転軸から離れる一端はスライドレールの内部にスライドし、支持プレートが静止状態にある場合、連接ロッドの一端はスライドレールの最下端にあり、支持プレート全体が上方へスライドするときに、連接ロッドはスライドレールの内部に上方へスライドする。
【0023】
さらに、前記スライドレールは３５～５０°で傾斜して設置され、スライドレールの連接ロッドに接近する一端に凹溝が開けられ、スライドレールは全体として半円環状に設置される。
【0024】
本発明はさらに前記キットの検出方法に関し、
先ずＥ７コード配列を含むＰＥＴ－３２ａ発現プラスミドを構築し、大腸菌発現株ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、菌体を収集し、Ｎｉカラムで精製して精製されたＥ７組換えタンパク質を得て、調製されたＥ７組換えタンパク質を免疫原としてＢａｌｂ／ｃマウスを免疫し、ＥＬＩＳＡ間接法でマウス血清の力価が１／８Ｋを超えることを検出した後に、免疫マウスの脾臓をマウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０と融合し、ハイブリドーマ細胞をＥＬＩＳＡ間接法でサブクローニングし、抗Ｅ７を分泌するモノクローナルハイブリドーマ細胞を得て、ハイブリドーマ細胞をマウスの腹腔に注射し、腹水を収集して、精製し、抗Ｅ７タンパク質特異的モノクローナル抗体を得るステップＳ１と、
ゲノムが不安定な場合に、Ｅ７はゲノムに混入し、Ｅ７が細胞を破壊すると、Ｅ７癌タンパク質が生成され、Ｅ７が大量に活性化すると、癌化を引き起こし、Ｅ７遺伝子によってコードされる発がん性タンパク質は子宮頸部上皮の癌化を引き起こす重要な因子であり、このようなタンパク質は網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ）を阻害することにより感染された細胞を無限に増殖させて悪性に変化させるステップＳ２と、
ｐＲｂは腫瘍抑制タンパク質であり、通常、リン酸化されていないｐＲｂは核転写因子Ｅ２Ｆに特異的に結合し、両者の化合物を形成した後に、Ｅ２Ｆによる標的遺伝子の転写を阻害するため、細胞はＧ１期に留まり、細胞は増殖できなくなり、高リスク型ＨＰＶＥ７タンパク質はＣＲ領域の構造を介してｐＲｂの６４９－７２ポケット構造に特異的に結合し、それによりＥ２Ｆ因子を放出し、細胞がＧ１期からＳ期に入るのを促進し、同時に、Ｅ７はｐＲｂがユビキチン依存性の分解経路に入るのを促進し、Ｅ７タンパク質は細胞の形質転換と腫瘍の進行において重要な役割を果たしていると考えられるステップＳ３と、
ＨＰＶが人体に侵入した後に長期間潜伏し大量に複製することができ、これは体の免疫力の低下に関連しており、ＨＰＶ感染者は効果的な免疫反応を確立することができず、Ｅ７タンパク質はＨＰＶの主な形質転換タンパク質であり、９８個のアミノ酸のみを有する小さな酸性タンパク質であり、核内にあり又は核マトリックスに付着し、Ｅ７タンパク質は、１領域の１～１５アミノ酸、２領域の１６～３７アミノ酸、３領域の３８～９８アミノ酸、ジンクフィンガー及びＣ末端領域に分けられるステップＳ４と、
Ｅ７免疫エピトープを研究したところ、Ｅ７タンパク質のマウスＴ細胞エピトープはすべてＣ末端領域及びジンクフィンガー領域にあるが、ＨＬＡ－Ａエピトープはジンクフィンガー領域に加えてＮ末端領域にも存在し、Ｅ７タンパク質は形質転換及び発がんの役割を持つだけでなく、ウイルス遺伝子及び細胞遺伝子転写に対するトランス活性化活性もあるステップＳ５と、
組換えベクターの構築とタンパク質の発現プライマーの設計を行い、ＰＣＲ方法でＨＰＶ１６陽性サンプルからＥ７遺伝子配列を増幅し、酵素切断の後にＰＥＴ－３２ａプラスミドを結合し、組換えプラスミドをコンピテント大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、陽性コロニーＰＣＲを選択して同定及び配列決定を行い、配列決定された正しいプラスミドを増幅し、大腸菌発現株ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、シングルコロニーを２ｍｌの液体ＬＢ培地に３７℃ ２２０ｒｐｍでＯＤ値が０．６～０．８になるまで培養し、誘導剤ＩＰＴＧを加え、誘導培養を４時間継続し、遠心分離して菌体を収集し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ同定を行うステップＳ６と、
陽性の高発現株を選択して凍結保存し、同時に拡大培養し、組換え発現株を液体ＬＢ培地に接種し、３７℃ ２２０ｒｐｍで一晩培養し、培養液を１／５０に液体ＬＢ培地に増量し、３７℃ ２２０ｒｐｍでＯＤ値が０．６～０．８になるまで培養し、最終濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌになるように誘導剤ＩＰＴＧを加え、２５℃で一晩誘導し、遠心分離して菌体沈殿物を収集し、ＰＢＳ緩衝液で再懸濁し、氷浴下で菌体を超音波破砕し遠心分離して上清を収集し、０．４５μｍ濾過膜で濾過した後にＮｉカラムで精製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分子量及び純度を同定して測定するステップＳ７と、
動物免疫及び力価測定を行い、組換えＥ７タンパク質を免疫原として調製しＢＡＬｂ／ｃマウスを免疫し、初回に、免疫抗原５０μｇをフロイント完全アジュバントとともに皮下に多点注射して免疫し、２週間後に２回目の免疫を行い、抗原１００ｕｇをフロイント不完全アジュバントとともに皮下に多点注射して免疫し、２週間後に３回目の免疫を行い、用量が２回目の免疫と同じであり、７日後に尾の先端から採血して力価を測定し、力価が最も高いマウスを選択し、１週間後に、抗原１００ｕｇをフロイント不完全アジュバントとともに腹腔内注射して免疫を強化するステップＳ８と、
細胞融合及びクローンのスクリーニングを行い、免疫強化の３日後に融合し、融合の４８時間前に、骨髄腫細胞を拡大培養し、融合の当日に細胞が対数増殖期になるように、融合の２４時間前に培地を１回交換し、融合の２４時間前に、空白ＢＡＬｂ／ｃマウス腹腔マクロファージを９６ウェルプレートに１×１０４／ウェルで接種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養し、免疫を完了したマウスを眼球から採血した後に断頭によって屠殺し、マウスの脾臓細胞を分離し、５０％ＰＥＧで融合し、融合後の細胞を１００μｌ／ウェルでフィーダー細胞を敷いた９６ウェル細胞培養プレートに加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養する。細胞が１／２成長したら、培養上清を取り、ＥＬＩＳＡ法で陽性細胞をスクリーニングし、陽性細胞を選択してサブクローニングするステップＳ９と、
腹水の生成とモノクローナル抗体の精製を行い、スクリーニングされたハイブリドーマ細胞を拡大培養し、成体ＢＡＬｂ／ｃマウスの腹腔内に液体パラフィンを１匹あたり０．３～０．５ｍｌ接種し、１週間後に感作マウスの腹腔に５×１０５個／０．２ｍｌで注入し、１週間後にマウスの腹水の発生状況を観察し、腹部が明らかに膨れて、手で触ると皮膚が張った感じがする場合、腹水を採取し、腹水を４℃ １２０００ｒｐｍで１５ｍｉｎ遠心分離し、不純物を除去し、０．４５μｍ濾過膜で濾過した後、ＰｒｏｔｅｉｎＧアフィニティークロマトグラフィーで抗体を精製し、微量紫外分光光度計でＩｇＧ抗体の濃度を測定し、１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥで抗体の純度を分析するステップＳ１０とを含む。
先ずＥ７コード配列を含むＰＥＴ－３２ａ発現プラスミドを構築し、大腸菌発現株ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、菌体を収集し、Ｎｉカラムで精製して精製されたＥ７組換えタンパク質を得て、調製されたＥ７組換えタンパク質を免疫原としてＢａｌｂ／ｃマウスを免疫し、ＥＬＩＳＡ間接法でマウス血清の力価が１／８Ｋを超えることを検出した後に、免疫マウスの脾臓をマウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０と融合し、ハイブリドーマ細胞をＥＬＩＳＡ間接法でサブクローニングし、抗Ｅ７を分泌するモノクローナルハイブリドーマ細胞を得て、ハイブリドーマ細胞をマウスの腹腔に注射し、腹水を収集して、精製し、抗Ｅ７タンパク質特異的モノクローナル抗体を得るステップＳ１と、
ゲノムが不安定な場合に、Ｅ７はゲノムに混入し、Ｅ７が細胞を破壊すると、Ｅ７癌タンパク質が生成され、Ｅ７が大量に活性化すると、癌化を引き起こし、Ｅ７遺伝子によってコードされる発がん性タンパク質は子宮頸部上皮の癌化を引き起こす重要な因子であり、このようなタンパク質は網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ）を阻害することにより感染された細胞を無限に増殖させて悪性に変化させるステップＳ２と、
ｐＲｂは腫瘍抑制タンパク質であり、通常、リン酸化されていないｐＲｂは核転写因子Ｅ２Ｆに特異的に結合し、両者の化合物を形成した後に、Ｅ２Ｆによる標的遺伝子の転写を阻害するため、細胞はＧ１期に留まり、細胞は増殖できなくなり、高リスク型ＨＰＶＥ７タンパク質はＣＲ領域の構造を介してｐＲｂの６４９－７２ポケット構造に特異的に結合し、それによりＥ２Ｆ因子を放出し、細胞がＧ１期からＳ期に入るのを促進し、同時に、Ｅ７はｐＲｂがユビキチン依存性の分解経路に入るのを促進し、Ｅ７タンパク質は細胞の形質転換と腫瘍の進行において重要な役割を果たしていると考えられるステップＳ３と、
ＨＰＶが人体に侵入した後に長期間潜伏し大量に複製することができ、これは体の免疫力の低下に関連しており、ＨＰＶ感染者は効果的な免疫反応を確立することができず、Ｅ７タンパク質はＨＰＶの主な形質転換タンパク質であり、９８個のアミノ酸のみを有する小さな酸性タンパク質であり、核内にあり又は核マトリックスに付着し、Ｅ７タンパク質は、１領域の１～１５アミノ酸、２領域の１６～３７アミノ酸、３領域の３８～９８アミノ酸、ジンクフィンガー及びＣ末端領域に分けられるステップＳ４と、
Ｅ７免疫エピトープを研究したところ、Ｅ７タンパク質のマウスＴ細胞エピトープはすべてＣ末端領域及びジンクフィンガー領域にあるが、ＨＬＡ－Ａエピトープはジンクフィンガー領域に加えてＮ末端領域にも存在し、Ｅ７タンパク質は形質転換及び発がんの役割を持つだけでなく、ウイルス遺伝子及び細胞遺伝子転写に対するトランス活性化活性もあるステップＳ５と、
組換えベクターの構築とタンパク質の発現プライマーの設計を行い、ＰＣＲ方法でＨＰＶ１６陽性サンプルからＥ７遺伝子配列を増幅し、酵素切断の後にＰＥＴ－３２ａプラスミドを結合し、組換えプラスミドをコンピテント大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、陽性コロニーＰＣＲを選択して同定及び配列決定を行い、配列決定された正しいプラスミドを増幅し、大腸菌発現株ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、シングルコロニーを２ｍｌの液体ＬＢ培地に３７℃ ２２０ｒｐｍでＯＤ値が０．６～０．８になるまで培養し、誘導剤ＩＰＴＧを加え、誘導培養を４時間継続し、遠心分離して菌体を収集し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ同定を行うステップＳ６と、
陽性の高発現株を選択して凍結保存し、同時に拡大培養し、組換え発現株を液体ＬＢ培地に接種し、３７℃ ２２０ｒｐｍで一晩培養し、培養液を１／５０に液体ＬＢ培地に増量し、３７℃ ２２０ｒｐｍでＯＤ値が０．６～０．８になるまで培養し、最終濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌになるように誘導剤ＩＰＴＧを加え、２５℃で一晩誘導し、遠心分離して菌体沈殿物を収集し、ＰＢＳ緩衝液で再懸濁し、氷浴下で菌体を超音波破砕し遠心分離して上清を収集し、０．４５μｍ濾過膜で濾過した後にＮｉカラムで精製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分子量及び純度を同定して測定するステップＳ７と、
動物免疫及び力価測定を行い、組換えＥ７タンパク質を免疫原として調製しＢＡＬｂ／ｃマウスを免疫し、初回に、免疫抗原５０μｇをフロイント完全アジュバントとともに皮下に多点注射して免疫し、２週間後に２回目の免疫を行い、抗原１００ｕｇをフロイント不完全アジュバントとともに皮下に多点注射して免疫し、２週間後に３回目の免疫を行い、用量が２回目の免疫と同じであり、７日後に尾の先端から採血して力価を測定し、力価が最も高いマウスを選択し、１週間後に、抗原１００ｕｇをフロイント不完全アジュバントとともに腹腔内注射して免疫を強化するステップＳ８と、
細胞融合及びクローンのスクリーニングを行い、免疫強化の３日後に融合し、融合の４８時間前に、骨髄腫細胞を拡大培養し、融合の当日に細胞が対数増殖期になるように、融合の２４時間前に培地を１回交換し、融合の２４時間前に、空白ＢＡＬｂ／ｃマウス腹腔マクロファージを９６ウェルプレートに１×１０４／ウェルで接種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養し、免疫を完了したマウスを眼球から採血した後に断頭によって屠殺し、マウスの脾臓細胞を分離し、５０％ＰＥＧで融合し、融合後の細胞を１００μｌ／ウェルでフィーダー細胞を敷いた９６ウェル細胞培養プレートに加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養する。細胞が１／２成長したら、培養上清を取り、ＥＬＩＳＡ法で陽性細胞をスクリーニングし、陽性細胞を選択してサブクローニングするステップＳ９と、
腹水の生成とモノクローナル抗体の精製を行い、スクリーニングされたハイブリドーマ細胞を拡大培養し、成体ＢＡＬｂ／ｃマウスの腹腔内に液体パラフィンを１匹あたり０．３～０．５ｍｌ接種し、１週間後に感作マウスの腹腔に５×１０５個／０．２ｍｌで注入し、１週間後にマウスの腹水の発生状況を観察し、腹部が明らかに膨れて、手で触ると皮膚が張った感じがする場合、腹水を採取し、腹水を４℃ １２０００ｒｐｍで１５ｍｉｎ遠心分離し、不純物を除去し、０．４５μｍ濾過膜で濾過した後、ＰｒｏｔｅｉｎＧアフィニティークロマトグラフィーで抗体を精製し、微量紫外分光光度計でＩｇＧ抗体の濃度を測定し、１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥで抗体の純度を分析するステップＳ１０とを含む。
【発明の効果】
【0025】
１．トップカバーとボトムブラケットが取り付けられていない場合、スライダーはボトムブラケットの内部で移動できず、スライダーの一端がエアバッグに密着しれ設置され、このとき、ボトムブラケットの内側の支持プレートが静止状態にあり、連接ロッドの一端はスライドレールの最下端にあり、このとき、連接ロッドの一端はスライドレールの内側と緊密な当接支持を形成し、支持プレート４が自体の重力によりボトムブラケットの内側で下方にスライドすることを回避し、このとき、試験紙カードは全体としてボトムブラケットの凹溝の内側にあり、試験紙カードの上端とトップカバーの検出口との間に一定の間隔があり、試験紙カードの表面が汚れることを回避することができる。
【0026】
２．試験紙カードと吸着層をボトムブラケットの内側に手動で置き、トップカバーをボトムブラケットに水平に密着すると、ボトムブラケットの側面のケーシングは係止ブロックにスライド可能に嵌合され、係止ブロックはケーシングの内部にスライドした後、係止ブロックの一端がスライダーの一端に押し付けられ、スライダーはボトムブラケットの内部にスライドすることができ、このとき、スライダーはケーシングの外側までスライドして延伸する。
【0027】
３．傾斜プレートと係止ブロックとを組み合わせた直径はケーシングの内径よりも０．５～１ｃｍ大きいため、傾斜プレートがケーシングの内壁に嵌め込まれた後、傾斜プレートが変形可能な材料で製造されるので、ケーシングが傾斜プレートの一側に押し付けることができ、傾斜プレートの側面はケーシングの内壁にスライド可能に押し付けて密着することができ、傾斜プレートは係止ブロックとケーシングとの接続の気密性をさらに高めることができ、トップカバーとボトムブラケットとの迅速な嵌合取り付けを容易にする。
【0028】
４．トップカバー及びボトムブラケットが取り付けられた後、スライダーはボトムブラケットの内部にスライドし、スライダーはエアバッグの一端までスライドして押し付けられ、エアバッグの内壁の厚さが０．５～１ｃｍであり、変形層の厚さが０．２～０．４ｃｍであるため、スライダーがエアバッグの一端に押し付けられるときに、変形層とエアバッグとの厚さの差を利用して、エアバッグの側面での変形層の迅速な変形を容易にすることができ、このとき、エアバッグは全体として変形状態にあり、変形層がエアバッグの変形により全体として変形した後に、ライナープレート自体は１５～３５°で下方に傾斜して設置されるため、ライナープレートは全体として上方へ揺動することができる。
【0029】
５．ライナープレートが全体として上方へ揺動した後、支持プレートがライナープレートの上端にスライドするため、ライナープレートは支持プレートをボトムブラケットの内部に移動駆動することができ、支持プレートが上方へスライドすると、ボトムブラケットの内部の吸着層と試験紙カードは上方へ移動することができ、吸着層を試験紙カードに密着し使用することができ、吸着層は試験紙カードの内部から滴下するサンプルを吸着し、液体サンプルがボトムブラケットの内部に流れて、ボトムブラケットの再利用に影響を与えることを回避し、これにより、このような検出キットは、試験紙カードが使用されていないときに試験紙カードの表面が汚れることを回避することができる。
【0030】
６．ＨＰＶゲノムが不安定な場合に、Ｅ７はゲノムに混入し、Ｅ２が破壊されて機能が失われ、Ｅ７が細胞を破壊すると、Ｅ７癌タンパク質が生成され、Ｅ７が大量に活性化すると、癌化を引き起こし、これは子宮頸癌病変の根本原因であり、Ｅ７は発がん性遺伝子であり、大量の発現によってＥ７癌タンパク質を生成し、癌化するまで細胞内に高度な前がん性病変を引き起こす。子宮頸癌スクリーニングの重要な目的は子宮頸癌を発見することだけでなく、前がん病変をリアルタイムに発見し子宮頸癌への進行を阻止することであるので、前がん病変の正確な処理は子宮頸癌スクリーニングの品質保証のキーであり、異なるレベルの前がん病変にはすべて、転帰、持続、進行という３つの発展傾向があり、前がん病変の発展傾向を正確に判定することは、高品質のスクリーニングのキーであり、不必要な過剰治療を回避できるだけでなく、有病誤診を防止することができる。
【0031】
７．初めてＥ７癌タンパク質を利用して子宮頸癌の標的検出を行い、感度が高く、特異性が強く、子宮頸部病変の傾向を直接反映し、これは抗体に基づいた初の子宮頸癌検出製品であり、偽陽性率を大幅に低減させて、診断の正確性を向上させ、後続の治療を容易にし、Ｅ７癌タンパク質は正常なアポトーシス過程を阻害し、細胞分裂周期の加速を誘導し、子宮頸部上皮細胞の変化が発生し、Ｅ７癌タンパク質の検出により子宮頸癌の癌細胞の変化を明確に判断することができ、Ｅ７癌タンパク質の過剰発現は、子宮頸癌病変及びＣＩＮ予測に理論的根拠を提供し、広く使用されており、子宮頸癌の早期シャントスクリーニング、補助診断及び術後の訪問観察に適し、Ｅ７検出は、検出される標的の精製、逆転写、増幅を必要としないため、ＤＮＡ方法による増幅によって引き起こされる汚染を大幅に軽減し、操作が便利であり、実験条件に対する要求が高くなく、運行コストが低く、各レベルの医療機構の使用に適する。
【図面の簡単な説明】
【0032】
【図1】本発明の全体構成を示す模式図である。
【図2】本発明の試験紙カードの構造模式図である。
【図3】本発明のボトムブラケットの構造模式図である。
【図4】本発明のボトムブラケットの部分構造模式図である。
【図5】本発明のトップカバーの構造模式図である。
【図6】本発明のスライダーユニットの構造模式図である。
【図7】本発明のエアバッグユニットの構造模式図である。
【図8】本発明のエアバッグの変形構造模式図である。
【0033】
図１～９において、部材名称と図面番号との対応関係は以下の通りである。
１ トップカバー
１０１ ボトムブラケット
１０２ 試験紙カード
１０３ 試験管
１０４ 吸着層
２ ケーシング
２０１ スライダー
２０２ 係止ブロック
２０３ 傾斜プレート
３ エアバッグ
３０１ 変形層
３０２ ライナープレート
４ 支持プレート
４０１ 回転軸
４０２ 連接ロッド
４０３ スライドレール。
１ トップカバー
１０１ ボトムブラケット
１０２ 試験紙カード
１０３ 試験管
１０４ 吸着層
２ ケーシング
２０１ スライダー
２０２ 係止ブロック
２０３ 傾斜プレート
３ エアバッグ
３０１ 変形層
３０２ ライナープレート
４ 支持プレート
４０１ 回転軸
４０２ 連接ロッド
４０３ スライドレール。
【発明を実施するための形態】
【0034】
以下、本発明の実施例の図面を参照しながら、本発明の実施例の技術的解決手段を明確で完全に説明し、勿論、説明される実施例は本発明の一部の実施例に過ぎず、全ての実施例ではなく、本発明の実施例に基づいて、当業者が創造的な労働を必要とせずに得られたその他の実施例は、いずれも本発明の保護範囲に属する。
【0035】
実施例：
図１～９に示すように、
実施例１：本実施例は子宮頸癌Ｅ７タンパク質検出用抗体抗原検出キット及び検出方法に関し、該検出キットはトップカバー１及びボトムブラケット１０１を含み、ボトムブラケット１０１とトップカバー１は可動に嵌合接続され、トップカバー１とボトムブラケット１０１の中間層の内部に試験紙カード１０２が可動に嵌合され、ボトムブラケット１０１の内側に吸着層１０４が可動に貫通される。
図１～９に示すように、
実施例１：本実施例は子宮頸癌Ｅ７タンパク質検出用抗体抗原検出キット及び検出方法に関し、該検出キットはトップカバー１及びボトムブラケット１０１を含み、ボトムブラケット１０１とトップカバー１は可動に嵌合接続され、トップカバー１とボトムブラケット１０１の中間層の内部に試験紙カード１０２が可動に嵌合され、ボトムブラケット１０１の内側に吸着層１０４が可動に貫通される。
【0036】
ボトムブラケット１０１及びトップカバー１については、トップカバー１の内部に観察口が貫通し、ボトムブラケット１０１の内部に穴が貫通し、穴の長さがボトムブラケット１０１の長さの半分よりも大きく、ボトムブラケット１０１のトップカバー１に接近する側に凹溝が開けられ、試験紙カード１０２は凹溝の内部に可動に嵌合され、ボトムブラケット１０１の内側には迅速に持ち上げるための揺動ユニットが設けられる。
【0037】
穴の長さがボトムブラケット１０１の長さの半分よりも大きいので、吸着層１０４を穴の内部から取り出すことができる。
【0038】
観察口から試験紙カード１０２のテストライン及びコントロールラインが観察される。
【0039】
試験紙カード１０２については、試験紙カード１０２の表面にはテストライン及びコントロールラインが設けられ、試験紙カード１０２はＥ７タンパク質検出用試験紙カードであり、試験紙カード１０２の検出試薬にはサンプルにおけるウイルスを検出するための抗体、抗原が含まれ、試験紙カード１０２には試験管１０３がマッチングして設けられる。
【0040】
関連する抗体、抗原は遺伝子組換えとハイブリドーマ技術を応用して、Ｅ７タンパク質を原核生物で発現及び精製し、これを免疫原としてＥ７タンパク質モノクローナル抗体を調製し、且つ最初に同定してサンプルにおけるウイルスを検出する。
【0041】
試験管１０３は補助検出のためにサンプル離型剤を試験紙カード１０２の表面に滴下することができる。
【0042】
吸着層１０４については、吸着層１０４は試験紙カード１０２と垂直に密着して設置され、吸着層１０４の厚さが０．２～０．８ｃｍであり、吸着層１０４はスポンジ材料で製造される。
【0043】
被測定サンプル、キット及びその他の使用される機器は、使用する前に１５～３０℃の室温に戻す必要があり、手動で試験紙カード１０２をテーブルに平らに置き、家庭使用者はスポイトを使用してサンプルを処理する試験管からサンプルの上清４～５滴を吸引して試験紙カード１０２に滴下し、サンプル添加１５ｍｉｎの後、テストライン及びコントロールラインの両方が表示されると、検出結果は最初にＥ７タンパク質陽性と診断され、２本のラインのうち一方の色が他方のラインよりも濃いか薄い場合があり、試験紙カード１０２にはコントロールラインの１本の赤いラインのみが表示され、テストラインが表示されないと、結果は陰性とみなされる。
【0044】
試験紙カード１０２のテストライン及びコントロールラインの判断は図２を参照することができる。
【0045】
実施例２：図３～５から分かるように、実施例２の実施例１との相違点は以下の通りであり、揺動ユニットは、ケーシング２、スライダー２０１、係止ブロック２０２、及び傾斜プレート２０３を含み、ケーシング２はボトムブラケット１０１の両側に設けられ、スライダー２０１はボトムブラケット１０１の内部までスライドして延伸し、係止ブロック２０２はトップカバー１の両側に設けられ、傾斜プレート２０３は係止ブロック２０２の両側に嵌め込まれる。
【0046】
ケーシング２については、ケーシング２は円環状に設置されて、ボトムブラケット１０１の内側に嵌め込まれ、ケーシング２は係止ブロック２０２にスライド可能に嵌合され、スライダー２０１とマッチングして設置される。
【0047】
ケーシング２が設けられるため、係止ブロック２０２はボトムブラケット１０１の内部に容易に嵌め込むことができ、更にトップカバー１とボトムブラケット１０１との係接は容易になる。
【0048】
スライダー２０１については、スライダー２０１はケーシング２の内部にスライド可能に嵌合され、垂直にスライドし、スライダー２０１の外壁はケーシング２の内壁にスライド可能に密着される。
【0049】
係止ブロック２０２については、係止ブロック２０２はケーシング２とマッチングして設置され、側面が台形で設置され、トップカバー１は係止ブロック２０２を介してケーシング２にスライド可能に嵌合される。
【0050】
係止ブロック２０２の側面が台形で設置されるため、傾斜プレート２０３の側面がケーシング２の内壁にスライド可能に密着されることが容易になる。
【0051】
傾斜プレート２０３については、傾斜プレート２０３は１５～３５°で傾斜して設置され、傾斜プレート２０３はケーシング２の内壁にスライド可能に押し付けられて密着され、傾斜プレート２０３と係止ブロック２０２とを組み合わせた直径はケーシング２の内径よりも０．５～１ｃｍ大きく、傾斜プレート２０３はゴム等の変形可能な材料で製造される。
【0052】
傾斜プレート２０３と係止ブロック２０２とを組み合わせた直径はケーシング２の内径よりも０．５～１ｃｍ大きいため、傾斜プレート２０３がケーシング２の内壁に嵌め込まれた後、傾斜プレート２０３が変形可能な材料で製造されるので、ケーシング２が傾斜プレート２０３の一側に押し付けることができ、傾斜プレート２０３の側面はケーシング２の内壁にスライド可能に押し付けて密着することができる。
【0053】
試験紙カード１０２と吸着層１０４をボトムブラケット１０１の内側に手動で置き、トップカバー１をボトムブラケット１０１に水平に密着すると、ボトムブラケット１０１の側面のケーシング２は係止ブロック２０２にスライド可能に嵌合され、係止ブロック２０２はケーシング２の内部にスライドした後、係止ブロック２０２の一端がスライダー２０１の一端に押し付けられ、スライダー２０１はボトムブラケット１０１の内部にスライドすることができ、このとき、スライダー２０１はケーシング２の外側までスライドして延伸する。
【0054】
傾斜プレート２０３と係止ブロック２０２とを組み合わせた直径はケーシング２の内径よりも０．５～１ｃｍ大きいため、傾斜プレート２０３がケーシング２の内壁に嵌め込まれた後、傾斜プレート２０３が変形可能な材料で製造されるので、ケーシング２が傾斜プレート２０３の一側に押し付けることができ、傾斜プレート２０３の側面はケーシング２の内壁にスライド可能に押し付けて密着することができ、傾斜プレート２０３は係止ブロック２０２とケーシング２との接続の気密性をさらに高めることができ、トップカバー１とボトムブラケット１０１との迅速な嵌合取り付けを容易にする。
【0055】
実施例３：図４、６～９から分かるように、実施例３の実施例１及び２との相違点は以下の通りであり、揺動ユニットは、エアバッグ３、変形層３０１、ライナープレート３０２、支持プレート４、回転軸４０１、連接ロッド４０２及びスライドレール４０３をさらに含み、エアバッグ３はスライダー２０１のケーシング２から離れる一端に嵌め込まれ、変形層３０１はエアバッグ３のスライダー２０１から離れる一端に嵌め込まれ、ライナープレート３０２は変形層３０１のエアバッグ３から離れる側で揺動し、支持プレート４はライナープレート３０２の上端にスライドし、回転軸４０１は支持プレート４の下端の両側にヒンジで接続され、連接ロッド４０２は回転軸４０１の一端で揺動し、スライドレール４０３は支持プレート４の下方の両側に設けられる。
【0056】
エアバッグ３については、エアバッグ３、変形層３０１、ライナープレート３０２、支持プレート４、回転軸４０１、連接ロッド４０２及びスライドレール４０３はいずれもボトムブラケット１０１の内部に設けられ、エアバッグ３の内壁の厚さが０．５～１ｃｍであり、変形層３０１の厚さが０．２～０．４ｃｍであり、エアバッグ３は不規則な形状で設置され、具体的な形状は図７を参照できる。
【0057】
エアバッグ３の内壁の厚さが０．５～１ｃｍであり、変形層３０１の厚さが０．２～０．４ｃｍであるため、スライダー２０１がエアバッグ３の一端に押し付けられるときに、変形層３０１とエアバッグ３との厚さの差を利用して、エアバッグ３の側面での変形層３０１の迅速な変形を容易にすることができ、変形後の形状は図８を参照できる。
【0058】
変形層３０１及びライナープレート３０２については、変形層３０１とライナープレート３０２はマッチングして設置され、ライナープレート３０２は１５～３５°で下方に傾斜して設置され、変形層３０１は半円弧状に設置され、半円弧の角度が９０°であり、２～４個のライナープレート３０２は変形層３０１の側面を取り囲み、変形層３０１の材質は傾斜プレート２０３の材質と同じである。
【0059】
変形層３０１はエアバッグ３の変形により全体的に変形した後に、ライナープレート３０２自体が１５～３５°で下方に傾斜して設置されるため、ライナープレート３０２全体は上方へ揺動することができる。
【0060】
支持プレート４については、支持プレート４の一端はボトムブラケット１０１の内側まで延伸し、同時に支持プレート４の一端は吸着層１０４の下端まで延伸し、支持プレート４は吸着層１０４の下端の両側に分布し、ボトムブラケット１０１の内側に垂直にスライドする。
【0061】
支持プレート４を設置することにより、支持プレート４が上方へスライドすると、ボトムブラケット１０１の内部の吸着層１０４と試験紙カード１０２は上方へ移動することができ、吸着層１０４を試験紙カード１０２に密着し使用することができ、吸着層１０４は試験紙カード１０２の内部から滴下するサンプルを吸着し、液体サンプルがボトムブラケット１０１の内部に流れて、ボトムブラケット１０１の再利用に影響を与えることを回避する。
【0062】
連接ロッド４０２及び回転軸４０１については、連接ロッド４０２の回転軸４０１から離れる一端はスライドレール４０３の内部にスライドし、支持プレート４が静止状態にある場合、連接ロッド４０２の一端はスライドレール４０３の最下端にあり、支持プレート４全体が上方へスライドするときに、連接ロッド４０２はスライドレール４０３の内部に上方へスライドする。
【0063】
支持プレート４が静止状態にある場合、連接ロッド４０２の一端はスライドレール４０３の最下端にあり、このとき、連接ロッド４０２の一端はスライドレール４０３の内側と緊密な当接支持を形成し、支持プレート４が自体の重力によりボトムブラケット１０１の内側で下方にスライドすることを回避する。
【0064】
スライドレール４０３については、スライドレール４０３は３５～５０°で傾斜して設置され、スライドレール４０３の連接ロッド４０２に接近する一端に凹溝が開けられ、スライドレール４０３は全体として半円環状に設置される。
【0065】
トップカバー１とボトムブラケット１０１が取り付けられていない場合、スライダー２０１はボトムブラケット１０１の内部で移動できず、スライダー２０１の一端がエアバッグ３に密着しれ設置され、このとき、ボトムブラケット１０１の内側の支持プレート４が静止状態にあり、連接ロッド４０２の一端はスライドレール４０３の最下端にあり、このとき、連接ロッド４０２の一端はスライドレール４０３の内側と緊密な当接支持を形成し、支持プレート４が自体の重力によりボトムブラケット１０１の内側で下方にスライドすることを回避し、このとき、試験紙カード１０２は全体としてボトムブラケット１０１の凹溝の内側にあり、試験紙カード１０２の上端とトップカバー１の検出口との間に一定の間隔があり、試験紙カード１０２の表面が汚れることを回避することができる。
【0066】
トップカバー１及びボトムブラケット１０１が取り付けられた後、スライダー２０１はボトムブラケット１０１の内部にスライドし、スライダー２０１はエアバッグ３の一端までスライドして押し付けられ、エアバッグ３の内壁の厚さが０．５～１ｃｍであり、変形層３０１の厚さが０．２～０．４ｃｍであるため、スライダー２０１がエアバッグ３の一端に押し付けられるときに、変形層３０１とエアバッグ３との厚さの差を利用して、エアバッグ３の側面での変形層３０１の迅速な変形を容易にすることができ、このとき、エアバッグ３は全体として変形状態にあり、変形層３０１がエアバッグ３の変形により全体として変形した後に、ライナープレート３０２自体は１５～３５°で下方に傾斜して設置されるため、ライナープレート３０２は全体として上方へ揺動することができる。
【0067】
ライナープレート３０２が全体として上方へ揺動した後、支持プレート４がライナープレート３０２の上端にスライドするため、ライナープレート３０２は支持プレート４をボトムブラケット１０１の内部に移動駆動することができ、支持プレート４が上方へスライドすると、ボトムブラケット１０１の内部の吸着層１０４と試験紙カード１０２は上方へ移動することができ、吸着層１０４を試験紙カード１０２に密着し使用することができ、吸着層１０４は試験紙カード１０２の内部から滴下するサンプルを吸着し、液体サンプルがボトムブラケット１０１の内部に流れて、ボトムブラケット１０１の再利用に影響を与えることを回避し、これにより、このような検出キットは、試験紙カード１０２が使用されていないときに試験紙カード１０２の表面が汚れることを回避することができる。
【0068】
実施例４：前記キットの試験方法は、
先ずＥ７コード配列を含むＰＥＴ－３２ａ発現プラスミドを構築し、大腸菌発現株ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、菌体を収集し、Ｎｉカラムで精製して精製されたＥ７組換えタンパク質を得て、調製されたＥ７組換えタンパク質を免疫原としてＢａｌｂ／ｃマウスを免疫し、ＥＬＩＳＡ間接法でマウス血清の力価が１／８Ｋを超えることを検出した後に、免疫マウスの脾臓をマウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０と融合し、ハイブリドーマ細胞をＥＬＩＳＡ間接法でサブクローニングし、抗Ｅ７を分泌するモノクローナルハイブリドーマ細胞を得て、ハイブリドーマ細胞をマウスの腹腔に注射し、腹水を収集して、精製し、抗Ｅ７タンパク質特異的モノクローナル抗体を得るステップＳ１と、
ゲノムが不安定な場合に、Ｅ７はゲノムに混入し、Ｅ７が細胞を破壊すると、Ｅ７癌タンパク質が生成され、Ｅ７が大量に活性化すると、癌化を引き起こし、Ｅ７遺伝子によってコードされる発がん性タンパク質は子宮頸部上皮の癌化を引き起こす重要な因子であり、このようなタンパク質は網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ）を阻害することにより感染された細胞を無限に増殖させて悪性に変化させるステップＳ２と、
ｐＲｂは腫瘍抑制タンパク質であり、通常、リン酸化されていないｐＲｂは核転写因子Ｅ２Ｆに特異的に結合し、両者の化合物を形成した後に、Ｅ２Ｆによる標的遺伝子の転写を阻害するため、細胞はＧ１期に留まり、細胞は増殖できなくなり、高リスク型ＨＰＶＥ７タンパク質はＣＲ領域の構造を介してｐＲｂの６４９－７２ポケット構造に特異的に結合し、それによりＥ２Ｆ因子を放出し、細胞がＧ１期からＳ期に入るのを促進し、同時に、Ｅ７はｐＲｂがユビキチン依存性の分解経路に入るのを促進し、Ｅ７タンパク質は細胞の形質転換と腫瘍の進行において重要な役割を果たしていると考えられるステップＳ３と、
ＨＰＶが人体に侵入した後に長期間潜伏し大量に複製することができ、これは体の免疫力の低下に関連しており、ＨＰＶ感染者は効果的な免疫反応を確立することができず、Ｅ７タンパク質はＨＰＶの主な形質転換タンパク質であり、９８個のアミノ酸のみを有する小さな酸性タンパク質であり、核内にあり又は核マトリックスに付着し、Ｅ７タンパク質は、１領域の１～１５アミノ酸、２領域の１６～３７アミノ酸、３領域の３８～９８アミノ酸、ジンクフィンガー及びＣ末端領域に分けられるステップＳ４と、
Ｅ７免疫エピトープを研究したところ、Ｅ７タンパク質のマウスＴ細胞エピトープはすべてＣ末端領域及びジンクフィンガー領域にあるが、ＨＬＡ－Ａエピトープはジンクフィンガー領域に加えてＮ末端領域にも存在し、Ｅ７タンパク質は形質転換及び発がんの役割を持つだけでなく、ウイルス遺伝子及び細胞遺伝子転写に対するトランス活性化活性もあるステップＳ５と、
組換えベクターの構築とタンパク質の発現プライマーの設計を行い、ＰＣＲ方法でＨＰＶ１６陽性サンプルからＥ７遺伝子配列を増幅し、酵素切断の後にＰＥＴ－３２ａプラスミドを結合し、組換えプラスミドをコンピテント大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、陽性コロニーＰＣＲを選択して同定及び配列決定を行い、配列決定された正しいプラスミドを増幅し、大腸菌発現株ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、シングルコロニーを２ｍｌの液体ＬＢ培地に３７℃ ２２０ｒｐｍでＯＤ値が０．６～０．８になるまで培養し、誘導剤ＩＰＴＧを加え、誘導培養を４時間継続し、遠心分離して菌体を収集し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ同定を行うステップＳ６と、
陽性の高発現株を選択して凍結保存し、同時に拡大培養し、組換え発現株を液体ＬＢ培地に接種し、３７℃ ２２０ｒｐｍで一晩培養し、培養液を１／５０に液体ＬＢ培地に増量し、３７℃ ２２０ｒｐｍでＯＤ値が０．６～０．８になるまで培養し、最終濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌになるように誘導剤ＩＰＴＧを加え、２５℃で一晩誘導し、遠心分離して菌体沈殿物を収集し、ＰＢＳ緩衝液で再懸濁し、氷浴下で菌体を超音波破砕し遠心分離して上清を収集し、０．４５μｍの濾過膜で濾過した後にＮｉカラムで精製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分子量及び純度を同定して測定するステップＳ７と、
動物免疫及び力価測定を行い、組換えＥ７タンパク質を免疫原として調製しＢＡＬｂ／ｃマウスを免疫し、初回に、免疫抗原５０μｇをフロイント完全アジュバントとともに皮下に多点注射して免疫し、２週間後に２回目の免疫を行い、抗原１００ｕｇをフロイント不完全アジュバントとともに皮下に多点注射して免疫し、２週間後に３回目の免疫を行い、用量が２回目の免疫と同じであり、７日後に尾の先端から採血して力価を測定し、力価が最も高いマウスを選択し、１週間後に、抗原１００ｕｇをフロイント不完全アジュバントとともに腹腔内注射して免疫を強化するステップＳ８と、
細胞融合及びクローンのスクリーニングを行い、免疫強化の３日後に融合し、融合の４８時間前に、骨髄腫細胞を拡大培養し、融合の当日に細胞が対数増殖期になるように、融合の２４時間前に培地を１回交換し、融合の２４時間前に空白ＢＡＬｂ／ｃマウス腹腔マクロファージを９６ウェルプレートに１×１０４／ウェルで接種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養し、免疫を完了したマウスを眼球から採血した後に断頭によって屠殺し、マウスの脾臓細胞を分離し、５０％ＰＥＧで融合し、融合後の細胞を１００μｌ／ウェルでフィーダー細胞を敷いた９６ウェル細胞培養プレートに加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養する。細胞が１／２成長したら、培養上清を取り、ＥＬＩＳＡ法で陽性細胞をスクリーニングし、陽性細胞を選択してサブクローニングするステップＳ９と、
腹水の生成とモノクローナル抗体の精製を行い、スクリーニングされたハイブリドーマ細胞を拡大培養し、成体ＢＡＬｂ／ｃマウスの腹腔内に液体パラフィンを１匹あたり０．３～０．５ｍｌ接種し、１週間後に感作マウスの腹腔に５×１０５個／０．２ｍｌで注入し、１週間後にマウスの腹水の発生状況を観察し、腹部が明らかに膨れて、手で触ると皮膚が張った感じがする場合、腹水を採取し、腹水を４℃ １２０００ｒｐｍで１５ｍｉｎ遠心分離し、不純物を除去し、０．４５μｍ濾過膜で濾過した後、ＰｒｏｔｅｉｎＧアフィニティークロマトグラフィーで抗体を精製し、微量紫外分光光度計でＩｇＧ抗体の濃度を測定し、１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥで抗体の純度を分析するステップＳ１０とを含む。
先ずＥ７コード配列を含むＰＥＴ－３２ａ発現プラスミドを構築し、大腸菌発現株ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、菌体を収集し、Ｎｉカラムで精製して精製されたＥ７組換えタンパク質を得て、調製されたＥ７組換えタンパク質を免疫原としてＢａｌｂ／ｃマウスを免疫し、ＥＬＩＳＡ間接法でマウス血清の力価が１／８Ｋを超えることを検出した後に、免疫マウスの脾臓をマウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０と融合し、ハイブリドーマ細胞をＥＬＩＳＡ間接法でサブクローニングし、抗Ｅ７を分泌するモノクローナルハイブリドーマ細胞を得て、ハイブリドーマ細胞をマウスの腹腔に注射し、腹水を収集して、精製し、抗Ｅ７タンパク質特異的モノクローナル抗体を得るステップＳ１と、
ゲノムが不安定な場合に、Ｅ７はゲノムに混入し、Ｅ７が細胞を破壊すると、Ｅ７癌タンパク質が生成され、Ｅ７が大量に活性化すると、癌化を引き起こし、Ｅ７遺伝子によってコードされる発がん性タンパク質は子宮頸部上皮の癌化を引き起こす重要な因子であり、このようなタンパク質は網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ）を阻害することにより感染された細胞を無限に増殖させて悪性に変化させるステップＳ２と、
ｐＲｂは腫瘍抑制タンパク質であり、通常、リン酸化されていないｐＲｂは核転写因子Ｅ２Ｆに特異的に結合し、両者の化合物を形成した後に、Ｅ２Ｆによる標的遺伝子の転写を阻害するため、細胞はＧ１期に留まり、細胞は増殖できなくなり、高リスク型ＨＰＶＥ７タンパク質はＣＲ領域の構造を介してｐＲｂの６４９－７２ポケット構造に特異的に結合し、それによりＥ２Ｆ因子を放出し、細胞がＧ１期からＳ期に入るのを促進し、同時に、Ｅ７はｐＲｂがユビキチン依存性の分解経路に入るのを促進し、Ｅ７タンパク質は細胞の形質転換と腫瘍の進行において重要な役割を果たしていると考えられるステップＳ３と、
ＨＰＶが人体に侵入した後に長期間潜伏し大量に複製することができ、これは体の免疫力の低下に関連しており、ＨＰＶ感染者は効果的な免疫反応を確立することができず、Ｅ７タンパク質はＨＰＶの主な形質転換タンパク質であり、９８個のアミノ酸のみを有する小さな酸性タンパク質であり、核内にあり又は核マトリックスに付着し、Ｅ７タンパク質は、１領域の１～１５アミノ酸、２領域の１６～３７アミノ酸、３領域の３８～９８アミノ酸、ジンクフィンガー及びＣ末端領域に分けられるステップＳ４と、
Ｅ７免疫エピトープを研究したところ、Ｅ７タンパク質のマウスＴ細胞エピトープはすべてＣ末端領域及びジンクフィンガー領域にあるが、ＨＬＡ－Ａエピトープはジンクフィンガー領域に加えてＮ末端領域にも存在し、Ｅ７タンパク質は形質転換及び発がんの役割を持つだけでなく、ウイルス遺伝子及び細胞遺伝子転写に対するトランス活性化活性もあるステップＳ５と、
組換えベクターの構築とタンパク質の発現プライマーの設計を行い、ＰＣＲ方法でＨＰＶ１６陽性サンプルからＥ７遺伝子配列を増幅し、酵素切断の後にＰＥＴ－３２ａプラスミドを結合し、組換えプラスミドをコンピテント大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、陽性コロニーＰＣＲを選択して同定及び配列決定を行い、配列決定された正しいプラスミドを増幅し、大腸菌発現株ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、シングルコロニーを２ｍｌの液体ＬＢ培地に３７℃ ２２０ｒｐｍでＯＤ値が０．６～０．８になるまで培養し、誘導剤ＩＰＴＧを加え、誘導培養を４時間継続し、遠心分離して菌体を収集し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ同定を行うステップＳ６と、
陽性の高発現株を選択して凍結保存し、同時に拡大培養し、組換え発現株を液体ＬＢ培地に接種し、３７℃ ２２０ｒｐｍで一晩培養し、培養液を１／５０に液体ＬＢ培地に増量し、３７℃ ２２０ｒｐｍでＯＤ値が０．６～０．８になるまで培養し、最終濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌになるように誘導剤ＩＰＴＧを加え、２５℃で一晩誘導し、遠心分離して菌体沈殿物を収集し、ＰＢＳ緩衝液で再懸濁し、氷浴下で菌体を超音波破砕し遠心分離して上清を収集し、０．４５μｍの濾過膜で濾過した後にＮｉカラムで精製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分子量及び純度を同定して測定するステップＳ７と、
動物免疫及び力価測定を行い、組換えＥ７タンパク質を免疫原として調製しＢＡＬｂ／ｃマウスを免疫し、初回に、免疫抗原５０μｇをフロイント完全アジュバントとともに皮下に多点注射して免疫し、２週間後に２回目の免疫を行い、抗原１００ｕｇをフロイント不完全アジュバントとともに皮下に多点注射して免疫し、２週間後に３回目の免疫を行い、用量が２回目の免疫と同じであり、７日後に尾の先端から採血して力価を測定し、力価が最も高いマウスを選択し、１週間後に、抗原１００ｕｇをフロイント不完全アジュバントとともに腹腔内注射して免疫を強化するステップＳ８と、
細胞融合及びクローンのスクリーニングを行い、免疫強化の３日後に融合し、融合の４８時間前に、骨髄腫細胞を拡大培養し、融合の当日に細胞が対数増殖期になるように、融合の２４時間前に培地を１回交換し、融合の２４時間前に空白ＢＡＬｂ／ｃマウス腹腔マクロファージを９６ウェルプレートに１×１０４／ウェルで接種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養し、免疫を完了したマウスを眼球から採血した後に断頭によって屠殺し、マウスの脾臓細胞を分離し、５０％ＰＥＧで融合し、融合後の細胞を１００μｌ／ウェルでフィーダー細胞を敷いた９６ウェル細胞培養プレートに加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養する。細胞が１／２成長したら、培養上清を取り、ＥＬＩＳＡ法で陽性細胞をスクリーニングし、陽性細胞を選択してサブクローニングするステップＳ９と、
腹水の生成とモノクローナル抗体の精製を行い、スクリーニングされたハイブリドーマ細胞を拡大培養し、成体ＢＡＬｂ／ｃマウスの腹腔内に液体パラフィンを１匹あたり０．３～０．５ｍｌ接種し、１週間後に感作マウスの腹腔に５×１０５個／０．２ｍｌで注入し、１週間後にマウスの腹水の発生状況を観察し、腹部が明らかに膨れて、手で触ると皮膚が張った感じがする場合、腹水を採取し、腹水を４℃ １２０００ｒｐｍで１５ｍｉｎ遠心分離し、不純物を除去し、０．４５μｍ濾過膜で濾過した後、ＰｒｏｔｅｉｎＧアフィニティークロマトグラフィーで抗体を精製し、微量紫外分光光度計でＩｇＧ抗体の濃度を測定し、１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥで抗体の純度を分析するステップＳ１０とを含む。
【0069】
実施例５：ＨＰＶゲノムが不安定な場合に、Ｅ７はゲノムに混入し、Ｅ２が破壊されて機能が失われ、Ｅ７が細胞を破壊すると、Ｅ７癌タンパク質が生成され、Ｅ７が大量に活性化すると、癌化を引き起こし、これは子宮頸癌病変の根本原因であり、Ｅ７は発がん性遺伝子であり、大量の発現によってＥ７癌タンパク質を生成し、癌化するまで細胞内に高度な前がん性病変を引き起こす。子宮頸癌スクリーニングの重要な目的は子宮頸癌を発見することだけでなく、前がん病変をリアルタイムに発見し子宮頸癌への進行を阻止することであるので、前がん病変の正確な処理は子宮頸癌スクリーニングの品質保証のキーであり、異なるレベルの前がん病変にはすべて、転帰、持続、進行という３つの発展傾向があり、前がん病変の発展傾向を正確に判定することは、高品質のスクリーニングのキーであり、不必要な過剰治療を回避できるだけでなく、有病誤診を防止することができる。
【0070】
本発明は初めてＥ７癌タンパク質を利用して子宮頸癌の標的検出を行い、感度が高く、特異性が強く、子宮頸部病変の傾向を直接反映し、これは抗体に基づいた初の子宮頸癌検出製品であり、偽陽性率を大幅に低減させて、診断の正確性を向上させ、後続の治療を容易にし、Ｅ７癌タンパク質は正常なアポトーシス過程を阻害し、細胞分裂周期の加速を誘導し、子宮頸部上皮細胞の変化が発生し、Ｅ７癌タンパク質の検出により子宮頸癌の癌細胞の変化を明確に判断することができ、Ｅ７癌タンパク質の過剰発現は、子宮頸癌病変及びＣＩＮ予測に理論的根拠を提供し、広く使用されており、子宮頸癌の早期のシャントスクリーニング、補助診断及び術後の訪問観察に適し、Ｅ７検出は、検出される標的の精製、逆転写、増幅を必要としないため、ＤＮＡ方法による増幅によって引き起こされる汚染を大幅に軽減し、操作が便利であり、実験条件に対する要求が高くなく、運行コストが低く、各レベルの医療機構の使用に適する。
【0071】
以上より、本発明の具体的な実施例は説明されている。本発明は上記特定の実施形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲内において、当業者は本発明の本質に影響を与えない範囲で様々な変形や変更を行うことができるのを理解する必要がある。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
