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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024075570
(43)【公開日】2024-06-04
(54)【発明の名称】タガトースの酵素的製造
(51)【国際特許分類】
C12P 19/02 20060101AFI20240528BHJP
C12N 9/90 20060101ALI20240528BHJP
C12N 9/16 20060101ALI20240528BHJP
C12N 9/12 20060101ALI20240528BHJP
C12N 9/10 20060101ALI20240528BHJP
C12N 9/26 20060101ALI20240528BHJP
C12N 15/61 20060101ALI20240528BHJP
C12N 15/55 20060101ALN20240528BHJP
【ＦＩ】
C12P19/02 ZNA
C12N9/90
C12N9/16 B
C12N9/12
C12N9/10
C12N9/26
C12N15/61
C12N15/55
【審査請求】有
【請求項の数】17
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024026360
(22)【出願日】2024-02-26
(62)【分割の表示】P 2021521105の分割
【原出願日】2019-10-18
(31)【優先権主張番号】62/747,877
(32)【優先日】2018-10-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/790,788
(32)【優先日】2019-01-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】518059587
【氏名又は名称】ボヌモーズ、インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ウィチェレキー、ダニエル、ジョセフ
(57)【要約】 （修正有）
【課題】糖をＤ‐タガトースに酵素的に変換することができる改良されたＤ‐タガトース調製方法を提供する。
【解決手段】フルクトース‐６‐リン酸エピメラーゼ（Ｆ６ＰＥ）によって触媒される、フルクトース‐６‐リン酸（Ｆ６Ｐ）をタガトース６‐リン酸（Ｔ６Ｐ）に変換するステップ；及びタガトースを製造するプロセスで以前に使用されたＦ６ＰＥ及びタガトース‐６‐リン酸ホスファターゼ（Ｔ６ＰＰ）と比較してより高い活性を持つ酵素を使用して、Ｔ６ＰＰによって触媒されるＴ６Ｐをタガトースに変換するステップを含む、タガトースを製造するための改良されたプロセスである。
【選択図】なし
【解決手段】フルクトース‐６‐リン酸エピメラーゼ（Ｆ６ＰＥ）によって触媒される、フルクトース‐６‐リン酸（Ｆ６Ｐ）をタガトース６‐リン酸（Ｔ６Ｐ）に変換するステップ；及びタガトースを製造するプロセスで以前に使用されたＦ６ＰＥ及びタガトース‐６‐リン酸ホスファターゼ（Ｔ６ＰＰ）と比較してより高い活性を持つ酵素を使用して、Ｔ６ＰＰによって触媒されるＴ６Ｐをタガトースに変換するステップを含む、タガトースを製造するための改良されたプロセスである。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
糖からタガトースを製造するための改良されたプロセスであって、この改良はフルクトース‐６‐リン酸エピメラーゼ（Ｆ６ＰＥ）を使用してフルクトース‐６‐リン酸（Ｆ６Ｐ）をタガトース６‐リン酸（Ｔ６Ｐ）に変換することを含み、Ｆ６ＰＥは配列番号１、配列番号２、又は配列番号７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、上記プロセス。
【請求項2】
糖からタガトースを製造するための改良されたプロセスであって、この改良はタガトース‐６‐リン酸ホスファターゼ（Ｔ６ＰＰ）を使用してＴ６Ｐをタガトースに変換することを含み、Ｔ６ＰＰは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、上記プロセス。
【請求項3】
フルクトース６‐リン酸エピメラーゼ（Ｆ６ＰＥ）を使用してフルクトース‐６‐リン酸（Ｆ６Ｐ）をタガトース６‐リン酸（Ｔ６Ｐ）に変換するステップをさらに含み、Ｆ６ＰＥが配列番号１、配列番号２、又は配列番号７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のプロセス。
【請求項4】
グルコース６‐リン酸（Ｇ６Ｐ）をＦ６Ｐに変換するステップをさらに含み、このステップがホスホグルコースイソメラーゼ（ＰＧＩ）によって触媒される、請求項１～３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項5】
グルコース１‐リン酸（Ｇ１Ｐ）をＧ６Ｐに変換するステップをさらに含み、このステップがホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される、請求項４に記載のプロセス。
【請求項6】
糖をＧ１Ｐに変換するステップをさらに含み、このステップが少なくとも１つの酵素によって触媒され、糖がデンプン又はその誘導体、セルロース又はその誘導体及びスクロースからなる群から選択される、請求項５に記載のプロセス。。
【請求項7】
少なくとも１つの酵素が、α‐グルカンホスホリラーゼ（αＧＰ）、マルトースホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、セロデキストリンホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ、及びセルロースホスホリラーゼからなる群から選択される、請求項６に記載のプロセス。
【請求項8】
糖が、アミロース、アミロペクチン、可溶性デンプン、アミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトース、マルトトリオース、及びグルコースからなる群から選択されるデンプン又はその誘導体である、請求項６に記載のプロセス。
【請求項9】
デンプンをデンプン誘導体に変換するステップをさらに含み、デンプン誘導体がデンプンの酵素的加水分解又はデンプンの酸加水分解によって調製される、請求項８に記載のプロセス。
【請求項10】
４‐グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）がプロセスに追加される、請求項９に記載のプロセス。
【請求項11】
デンプン誘導体が、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、αアミラーゼ、又はそれらの組み合わせによって触媒されるデンプンの酵素的加水分解によって調製される、請求項９に記載のプロセス。
【請求項12】
少なくとも１つの酵素によって触媒されるフルクトースをＦ６Ｐに変換するステップ、及び
任意選択で、少なくとも１つの酵素によって触媒されるスクロースをフルクトースに変換するステップをさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のプロセス。
任意選択で、少なくとも１つの酵素によって触媒されるスクロースをフルクトースに変換するステップをさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項13】
少なくとも１つの酵素によって触媒されるグルコースをＧ６Ｐに変換するステップ、及び
任意選択で、少なくとも１つの酵素によって触媒されるスクロースをグルコースに変換するステップをさらに含む、請求項４に記載のプロセス。
任意選択で、少なくとも１つの酵素によって触媒されるスクロースをグルコースに変換するステップをさらに含む、請求項４に記載のプロセス。
【請求項14】
前記プロセスが、タガトースを製造するための酵素的プロセスであり、以下のステップを含む、請求項２に記載のプロセス：
（ｉ）１つ又は複数の酵素を使用して糖をグルコース１‐リン酸（Ｇ１Ｐ）に変換するステップ、ここで、糖は、デンプン、デンプンの１つ又は複数の誘導体、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される；
（ｉｉ）ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）を使用してＧ１Ｐをグルコース６‐リン酸（Ｇ６Ｐ）に変換するステップ；
（ｉｉｉ）ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）を使用してＧ６Ｐをフルクトース６‐リン酸（Ｆ６Ｐ）に変換するステップ；
（ｉｖ）フルクトース６‐リン酸エピメラーゼ（Ｆ６ＰＥ）を使用してＦ６Ｐをタガトース６‐リン酸（Ｔ６Ｐ）に変換するステップ；及び
（ｖ）タガトース６‐リン酸ホスファターゼ（Ｔ６ＰＰ）を使用してＴ６Ｐをタガトースに変換するステップ、ここで、Ｔ６ＰＰは、配列番号３又は４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む；
ここで、プロセスステップ（ｉ）～（ｖ）は、単一の反応容器内で実施される。
（ｉ）１つ又は複数の酵素を使用して糖をグルコース１‐リン酸（Ｇ１Ｐ）に変換するステップ、ここで、糖は、デンプン、デンプンの１つ又は複数の誘導体、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される；
（ｉｉ）ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）を使用してＧ１Ｐをグルコース６‐リン酸（Ｇ６Ｐ）に変換するステップ；
（ｉｉｉ）ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）を使用してＧ６Ｐをフルクトース６‐リン酸（Ｆ６Ｐ）に変換するステップ；
（ｉｖ）フルクトース６‐リン酸エピメラーゼ（Ｆ６ＰＥ）を使用してＦ６Ｐをタガトース６‐リン酸（Ｔ６Ｐ）に変換するステップ；及び
（ｖ）タガトース６‐リン酸ホスファターゼ（Ｔ６ＰＰ）を使用してＴ６Ｐをタガトースに変換するステップ、ここで、Ｔ６ＰＰは、配列番号３又は４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む；
ここで、プロセスステップ（ｉ）～（ｖ）は、単一の反応容器内で実施される。
【請求項15】
Ｆ６ＰＥが、配列番号１、配列番号２、又は配列番号７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載のプロセス。
【請求項16】
プロセスステップが、以下のプロセス条件のうちの少なくとも１つの下で実施される、請求項１４又は１５に記載のプロセス：
約３７℃から約８５℃の範囲の温度で、
約５．０から約９．０の範囲のｐＨで、又は
約１時間から約４８時間で。
約３７℃から約８５℃の範囲の温度で、
約５．０から約９．０の範囲のｐＨで、又は
約１時間から約４８時間で。
【請求項17】
プロセスステップが、以下のプロセス条件のうちの少なくとも１つの下で実施される、請求項１４～１６のいずれか一項に記載のプロセス：
リン酸源としてのアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）なしで、
ニコチンアミドアデノシンジヌクレオチドなしで、
約０．１ｍＭから約１５０ｍＭのリン酸塩濃度で、
約０．１ｍＭから５０ｍＭのＭｇ２＋濃度で、
ここで、リン酸塩はリサイクルされ、及び
プロセスの少なくとも１つのステップは、エネルギー的に好ましい化学反応を伴う。
リン酸源としてのアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）なしで、
ニコチンアミドアデノシンジヌクレオチドなしで、
約０．１ｍＭから約１５０ｍＭのリン酸塩濃度で、
約０．１ｍＭから５０ｍＭのＭｇ２＋濃度で、
ここで、リン酸塩はリサイクルされ、及び
プロセスの少なくとも１つのステップは、エネルギー的に好ましい化学反応を伴う。
【請求項18】
リン酸がリサイクルされ、Ｔ６ＰのＴ６ＰＰ脱リン酸化によって生成されたリン酸イオンが、糖をＧ１Ｐに変換するプロセスステップで使用される、請求項１７に記載のプロセス。
【請求項19】
Ｔ６Ｐをタガトースに変換するステップが、エネルギー的に有利な、不可逆的なホスファターゼ反応である、請求項１７に記載のプロセス。
【請求項20】
生成されたタガトースを分離回収するステップをさらに含み、分離回収がクロマトグラフィー分離を介さない、請求項１４～１９のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項21】
デンプンの誘導体が、アミロース、アミロペクチン、可溶性デンプン、アミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトトリオース、マルトース、及びグルコースからなる群から選択される、請求項１４又は１５に記載のプロセス。
【請求項22】
請求項１～２１のいずれか一項に記載のプロセスから製造されたタガトース。
【請求項23】
請求項１～２１のいずれか一項に記載のプロセスから製造されたタガトースを含む消耗品。
【請求項24】
Ｆ６ＰＥがディクチオグロムス・テルモフィルム（Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｂ５ＹＢＤ７）からのＦ６ＰＥの活性と比較してより高い活性を有する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項25】
Ｔ６ＰＰがアルケオグロブス・フルギヅス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｏ２９８０５）からのＴ６ＰＰの活性と比較してより高い活性を有する、請求項２に記載のプロセス。
【請求項26】
Ｆ６ＰＥがディクチオグロムス・テルモフィルム（Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｂ５ＹＢＤ７）からのＦ６ＰＥの活性と比較して少なくとも１０％高い活性を有する、請求項２４に記載のプロセス。
【請求項27】
Ｔ６ＰＰがアルケオグロブス・フルギヅス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｏ２９８０５）からのＴ６ＰＰの活性と比較して少なくとも１０％高い活性を有する、請求項２５に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１８年１０月１９日に出願された米国出願第６２／７４７，８７７号及び２０１９年１月１０日に出願された米国出願第６２／７９０，７８８号への優先権を主張し、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる。
この出願は、２０１８年１０月１９日に出願された米国出願第６２／７４７，８７７号及び２０１９年１月１０日に出願された米国出願第６２／７９０，７８８号への優先権を主張し、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
発明の分野
本発明は、Ｄ‐タガトース製造に関係するバイオテクノロジーの分野に関する。より具体的には、本発明は、糖（例えば、多糖類、オリゴ糖、二糖類、スクロース、Ｄ‐グルコース、及びＤ‐フルクトース）をＤ‐タガトースに酵素的に変換することができる改良されたＤ‐タガトース調製方法を提供する。
本発明は、Ｄ‐タガトース製造に関係するバイオテクノロジーの分野に関する。より具体的には、本発明は、糖（例えば、多糖類、オリゴ糖、二糖類、スクロース、Ｄ‐グルコース、及びＤ‐フルクトース）をＤ‐タガトースに酵素的に変換することができる改良されたＤ‐タガトース調製方法を提供する。
【背景技術】
【0003】
Ｄ‐タガトース（以下、タガトース）は、スクロースの９２％の甘味を有するが、カロリーは３８％にすぎない、低カロリーの天然甘味料である。販売価格が高いため、甘味料としての使用は制限されている。タガトースは無数の健康上の利点を誇り：非齲蝕原性であり；低カロリーであり；グリセミック指数は３と非常に低くなっており；グルコースのグリセミック指数を２０％減衰させ；平均血糖値を下げることができ；高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールを促進することにより、心血管疾患、脳卒中、その他の血管疾患の予防に役立ち；そして検証されたプレバイオティクスであり、抗酸化剤である。Lu et al., Tagatose, a New Antidiabetic and Obesity Control Drug, Diabetes Obes. Metab. 10(2): 109-34 (2008)（タガトース、新しい抗糖尿病及び肥満管理薬）。そのため、タガトースは明らかに、消耗品や、製薬、バイオテクノロジー、学術、食品、飲料、栄養補助食品、食料品業界などのさまざまな業界でさまざまな用途がある。
【0004】
タガトースは、主に、ラクターゼによるラクトースの加水分解によって生成され、Ｄ‐グルコース及びＤ‐ガラクトースを形成する（ＷＯ２０１１／１５０５５６、ＣＮ１０３０２５８９４、ＵＳ５，００２，６１２、ＵＳ６，０５７，１３５、及びＵＳ８，８０２，８４３を参照）。次に、Ｄ‐ガラクトースは、アルカリ性条件下で水酸化カルシウムによって化学的に、又はｐＨ中性条件下でＬ‐アラビノースイソメラーゼによって酵素的にＤ‐タガトースに異性化される。最終生成物は、ろ過とイオン交換クロマトグラフィーの組み合わせによって分離される。この方法は、Ｄ‐グルコースとＤ‐ガラクトースの分離にコストがかかり、生成物の収率が低いために問題がある。微生物細胞発酵によるいくつかの方法が開発されているが、高価な原料（ガラクチトールやＤ‐プシコースなど）に依存し、生成物の収量が少なく、分離に費用がかかるため、実用的な代替手段として証明されたものはない。タガトースを調製するための他のプロセスも報告されている。たとえば、Lee et al., Scientific Reports | 7: 1934 | DOI:10.1038/s41598-017-02211-3, pp. 1-8；米国特許公開番号２０１８／００２３０７３；国際特許出願公開番号ＷＯ２０１４／１９６８１１、ＷＯ２０１８／００４３１０、ＷＯ２０１８／０２１８９４、ＷＯ２０１８／１８２３４４、ＷＯ２０１８／１８２３４５、ＷＯ２０１８／１８２３５４、ＷＯ２０１８／１８２３５５、及びＷＯ２０１６／０６４１４６を参照のこと。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
国際特許出願公開第ＷＯ２０１７／０５９２７８号は、エピメラーゼ、フルクトース６‐リン酸エピメラーゼによって触媒される、フルクトース６‐リン酸（Ｆ６Ｐ）をタガトース６‐リン酸（Ｔ６Ｐ）に変換するステップ、及びホスファターゼ、タガトース６‐リン酸ホスファターゼによって触媒される、Ｔ６Ｐをタガトースに変換するステップを含むプロセスにおけるタガトースの酵素的合成を最近記載した。しかしながら、酵素的タガトース製造の改良にもかかわらず、例えば、より少ない量の酵素でより高い収量を提供することができる、タガトースを製造するさらに改良されたプロセスを提供することへの要望及び必要性が依然としてある。タガトース製造のコストを削減することに強い産業的及び商業的関心があり、この削減には、酵素の使用量の削減及び以前に使用された酵素よりも効果的な酵素の組み合わせの使用が含まれる。
【課題を解決するための手段】
【0006】
発明の概要
本発明は、糖（例えば、多糖類、オリゴ糖、二糖類、スクロース、Ｄ‐グルコース、及びＤ‐フルクトース）をタガトースに酵素的に変換することができる改良されたタガトース調製方法を提供する。一態様では、糖からタガトースを製造するための本発明の改良されたプロセスは、フルクトース６‐リン酸エピメラーゼ（Ｆ６ＰＥ）を使用してフルクトース‐６‐リン酸（Ｆ６Ｐ）をタガトース６‐リン酸（Ｔ６Ｐ）に変換するステップを含み、Ｆ６ＰＥは、配列番号１、配列番号２、又は配列番号７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の態様において、糖からのタガトースの製造のための本発明による改良されたプロセスは、タガトース‐６‐リン酸ホスファターゼ（Ｔ６ＰＰ）を使用してＴ６Ｐをタガトースに変換するステップを含み、Ｔ６ＰＰは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。本発明のいくつかの実施形態において、改良されたプロセスは、フルクトース６‐リン酸エピメラーゼ（Ｆ６ＰＥ）を使用してフルクトース‐６‐リン酸（Ｆ６Ｐ）をタガトース６‐リン酸（Ｔ６Ｐ）に変換するステップを含み、ここで、Ｆ６ＰＥが配列番号１、配列番号２、又は配列番号７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及びタガトース‐６‐リン酸ホスファターゼ（Ｔ６ＰＰ）を使用してＴ６Ｐをタガトースに変換するステップを含み、ここで、Ｔ６ＰＰは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本発明は、糖（例えば、多糖類、オリゴ糖、二糖類、スクロース、Ｄ‐グルコース、及びＤ‐フルクトース）をタガトースに酵素的に変換することができる改良されたタガトース調製方法を提供する。一態様では、糖からタガトースを製造するための本発明の改良されたプロセスは、フルクトース６‐リン酸エピメラーゼ（Ｆ６ＰＥ）を使用してフルクトース‐６‐リン酸（Ｆ６Ｐ）をタガトース６‐リン酸（Ｔ６Ｐ）に変換するステップを含み、Ｆ６ＰＥは、配列番号１、配列番号２、又は配列番号７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の態様において、糖からのタガトースの製造のための本発明による改良されたプロセスは、タガトース‐６‐リン酸ホスファターゼ（Ｔ６ＰＰ）を使用してＴ６Ｐをタガトースに変換するステップを含み、Ｔ６ＰＰは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。本発明のいくつかの実施形態において、改良されたプロセスは、フルクトース６‐リン酸エピメラーゼ（Ｆ６ＰＥ）を使用してフルクトース‐６‐リン酸（Ｆ６Ｐ）をタガトース６‐リン酸（Ｔ６Ｐ）に変換するステップを含み、ここで、Ｆ６ＰＥが配列番号１、配列番号２、又は配列番号７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及びタガトース‐６‐リン酸ホスファターゼ（Ｔ６ＰＰ）を使用してＴ６Ｐをタガトースに変換するステップを含み、ここで、Ｔ６ＰＰは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0007】
本発明のいくつかの改良されたプロセスにおいて、タガトースを調製するためのプロセスはまた、グルコース６‐リン酸（Ｇ６Ｐ）をＦ６Ｐに変換するステップを含み、このステップは、ホスホグルコースイソメラーゼ（ＰＧＩ）によって触媒される。本発明によるいくつかのプロセスは、ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒されるグルコース１‐リン酸（Ｇ１Ｐ）をＧ６Ｐに変換するステップをさらに含む。本発明のいくつかのプロセスは、少なくとも１つの酵素によって触媒される、糖をＧ１Ｐに変換するステップをさらに含む。
【0008】
任意のプロセスで使用される糖は、デンプン又はその誘導体、セルロース又はその誘導体、及びスクロースからなる群から選択することができる。デンプン又はその誘導体は、アミロース、アミロペクチン、可溶性デンプン、アミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトース、マルトトリオース、又はグルコースであり得る。本発明のいくつかの改良されたプロセスにおいて、タガトースを調製するためのプロセスは、酵素加水分解又はデンプンの酸加水分解によってデンプンをデンプン誘導体に変換することを含む。他のプロセスでは、デンプン誘導体は、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、α‐アミラーゼ、又はこれらの酵素の２つ以上の組み合わせによって触媒されるデンプンの酵素的加水分解によって調製される。本発明のいくつかのプロセスは、さらに、４‐グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）を加えることを含み得る。
【0009】
タガトースを調製するための本発明の他のプロセスは、少なくとも１つの酵素によって触媒される、フルクトースをＦ６Ｐに変換するステップをさらに含む。本発明の他のプロセスは、少なくとも１つの酵素によって触媒される、スクロースをフルクトースに変換するステップをさらに含む。タガトースを調製するためのいくつかのプロセスで使用されるＧ６Ｐは、少なくとも１つの酵素によって触媒される、グルコースをＧ６Ｐに変換することによって生成することもできる。次に、グルコースは、少なくとも１つの酵素によって触媒される、スクロースをグルコースに変換することによって製造することができる。
【0010】
本発明の方法は、約３７℃から約８５℃の範囲の温度で、約５．０から約９．０の範囲のｐＨで、及び／又は約１時間から約４８時間を含む反応条件下で、又は連続反応として実施される。いくつかの実施形態において、タガトースを調製するためのプロセスのステップは、１つのバイオリアクターにおいてそれらの反応条件下で実施される。他の実施形態では、これらのステップは、これらの反応条件下で、直列に配置された複数のバイオリアクター内で実施される。
【0011】
本発明のいくつかのプロセスにおいて、タガトースを調製するためのステップは、ＡＴＰフリー、ＮＡＤ（Ｈ）フリーで、約０．１ｍＭから約１５０ｍＭのリン酸塩濃度で行われ、リン酸塩はリサイクルされ、及び／又はＴ６Ｐをタガトースに変換するステップには、エネルギー的に有利な化学反応が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【0013】
【0014】
【0015】
【0016】
【0017】
【0018】
【発明を実施するための形態】
【0019】
詳細な説明
本発明は、一般に、糖をタガトースに変換するための改良された酵素プロセスに関する。例えば、本発明は、無細胞酵素カクテルを使用して、デンプン、セルロース、スクロース、グルコース、及びフルクトースなどの糖及びそれらの誘導生成物をタガトースに変換するための改良されたプロセスに関する。細胞ベースの製造方法とは対照的に、本発明はタガトースの無細胞調製を含み、細胞膜の除去により比較的高い反応速度を有し、これはしばしば細胞内外への基質／生成物の輸送を遅くする。本発明のプロセスはまた、栄養豊富な発酵培地／細胞代謝産物を含まない最終生成物をもたらす。
本発明は、一般に、糖をタガトースに変換するための改良された酵素プロセスに関する。例えば、本発明は、無細胞酵素カクテルを使用して、デンプン、セルロース、スクロース、グルコース、及びフルクトースなどの糖及びそれらの誘導生成物をタガトースに変換するための改良されたプロセスに関する。細胞ベースの製造方法とは対照的に、本発明はタガトースの無細胞調製を含み、細胞膜の除去により比較的高い反応速度を有し、これはしばしば細胞内外への基質／生成物の輸送を遅くする。本発明のプロセスはまた、栄養豊富な発酵培地／細胞代謝産物を含まない最終生成物をもたらす。
【0020】
一態様では、本発明は、Ｆ６ＰＥによって触媒される、Ｆ６ＰをＴ６Ｐに変換するステップ；及びタガトースを製造するプロセスで以前に使用されたＦ６ＰＥ及び／又はＴ６ＰＰと比較して改良された活性を有する酵素を使用して、Ｔ６ＰＰによって触媒される、Ｔ６Ｐをタガトースに変換するステップを含む、タガトースを製造するための改良されたプロセスに関する。例えば、Ｆ６ＰＥ類及びＴ６ＰＰ類：Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ ＵＮＩ‐１からのＦ６ＰＥ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｅ８Ｎ０Ｎ６）；Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｋｒｏｎｏｔｓｋｙｅｎｓｉｓからのＦ６ＰＥ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｅ４ＳＥＨ３）；Ｃａｌｄｉｌｉｎｅａ ａｅｒｏｐｈｉｌａからのＦ６ＰＥ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｉ０Ｉ５０７）；Ｃａｌｄｉｔｈｒｉｘ ａｂｙｓｓｉからのＦ６ＰＥ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｈ１ＸＲＧ１）；及びＤｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍからのＦ６ＰＥ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｂ５ＹＢＤ７）；Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓからのＴ６ＰＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｏ２９８０５）；Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｐｒｏｆｕｎｄｕｓからのＴ６ＰＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｄ２ＲＨＶ２＿ＡＲＣＰＡ）；Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｖｅｎｅｆｉｃｕｓからのＴ６ＰＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｆ２ＫＭＫ２＿ＡＲＣＶＳ）を開示している国際特許出願公開ＷＯ２０１７／０５９２７８を参照されたい。より高い活性を持つ酵素を使用すると、より少ない量の酵素を使用できるため、プロセス全体のコストを削減できる。
【0021】
本発明の改良されたプロセスにおいて、Ｆ６ＰＥは、以前に開示されたディクチオグロムス・サーモフィラム（Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）からの好熱性Ｆ６ＰＥ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｂ５ＹＢＤ７）の活性と比較して、より高い活性を有する。国際特許出願公開ＷＯ２０１７／０５９２７８を参照のこと。好ましくは、本発明のプロセスで使用されるＦ６ＰＥは、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍからの好熱性Ｆ６ＰＥ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｂ５ＹＢＤ７）の活性と比較して、少なくとも１０％、少なくとも３０％、少なくとも８０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも１８０％又は少なくとも２００％改良された酵素活性を有する。たとえば、例１に示すように、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｔｈｒｉｘ ｄａｘｅｎｓｉｓからの好熱性Ｆ６ＰＥ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ａ０Ａ０Ｐ６ＸＮ５０）は、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍからの好熱性Ｆ６ＰＥ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｂ５ＹＢＤ７）と比較して酵素活性が約１５０％向上しており、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｔｈｅｒｍｏｆｏｎｓｉａ Ｃｌａｄｅ ３からの好熱性Ｆ６ＰＥ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ａ０Ａ２Ｍ８ＱＢＲ９）は、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍからの好熱性Ｆ６ＰＥ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｂ５ＹＢＤ７）と比較して約１２０％酵素活性が向上し、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍからの好熱性Ｆ６ＰＥ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ａ０Ａ２２３ＨＶＪ３）は、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍからの好熱性Ｆ６ＰＥ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｂ５ＹＢＤ７）と比較して酵素活性が約１７８％向上している。以下の例は、酵素をその基質と共にインキュベートし、次いでＨＰＬＣを介して反応物及び生成物の量を測定することを含む、Ｆ６ＰＥの活性を決定するためのプロトコルを当業者に提供する。任意の２つの酵素の相対的活性の測定は、緩衝液、ｐＨ、温度などの同一の反応条件下で実行される。
【0022】
本発明のプロセスで使用されるＦ６ＰＥは、Ｆ６Ｐ及びＴ６Ｐに特異的である。Ｆ６ＰＥによって触媒されるエピマー化は可逆反応である。特定のとは、反応中に存在する他のリン酸化単糖よりもＦ６Ｐ／Ｔ６Ｐに対してより高い活性を有することを意味する。たとえば、Ｆ６ＰＥは、たとえばＧ６ＰよりもＦ６Ｐ／Ｔ６Ｐで高いエピマー化活性を示す。
【0023】
本発明の改良されたプロセスで使用するためのＦ６ＰＥの例には、以下のタンパク質が含まれるが、これらに限定されない：配列番号１に記載されているアミノ酸配列を有するＴｈｅｒｍａｎａｅｒｏｔｈｒｉｘ ｄａｘｅｎｓｉｓからの好熱性Ｆ６ＰＥ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ０Ｐ６ＸＮ５０）；配列番号２に記載されているアミノ酸配列を有するＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍからの好熱性Ｆ６ＰＥ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ２２３ＨＶＪ３）；配列番号７に記載されているアミノ酸配列を有するＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｔｈｅｒｍｏｆｏｎｓｉａ Ｃｌａｄｅ ３からの好熱性Ｆ６ＰＥ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ２Ｍ８ＱＢＲ９）；及び配列番号１、配列番号２、又は配列番号７に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するＦ６ＰＥ。本発明による、糖からタガトースを製造するための改良されたプロセスは、Ｆ６ＰＥを使用したフルクトース‐６‐リン酸（Ｆ６Ｐ）をタガトース６‐リン酸（Ｔ６Ｐ）に変換するステップを含み、ここで、Ｆ６ＰＥは、配列番号１、配列番号２、又は配列番号７に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0024】
本発明のプロセスで使用されるＦ６ＰＥは、Ｆ６ＰをＴ６Ｐに変換することができるエピメラーゼである。Ｆ６ＰＥは、マグネシウム、マンガン、コバルト、又は亜鉛、好ましくはマグネシウムなどの二価金属補因子を利用する。本発明のプロセスで使用するためのＦ６ＰＥは、配列番号１、配列番号２、又は配列番号７に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはアルドラーゼ型ＴＩＭバレルを含む。Wichelecki et al.,(2015) J. Biol. Chem., v290, pp. 28963-76を参照のこと。
【0025】
本発明の改良されたプロセスにおいて、Ｔ６ＰＰは、以前に開示されたＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ（アルカエオグロブス・フルギダス）からのＴ６ＰＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｏ２９８０５）の活性と比較して、より高い活性を有する。国際特許出願公開ＷＯ２０１７／０５９２７８を参照のこと。好ましくは、本発明のプロセスで使用されるＴ６ＰＰは、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓからのＴ６ＰＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｏ２９８０５）の活性に対して、少なくとも１０％、少なくとも３０％、少なくとも８０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも３００％、少なくとも５００％、少なくとも６００％、少なくとも９００％、少なくとも１２００％、少なくとも１５００％、少なくとも１８００％、又は少なくとも２１００％改良された酵素活性を有する。たとえば、例２に示すように、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ ＣＨＴＩ‐５５からのＴ６ＰＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ０Ｅ３ＮＣＨ４）は、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓからのＴ６ＰＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｏ２９８０５）と比較して酵素活性が約６１４％向上し、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｓｐｏｒａ ｂｉｓｐｏｒａ株ＡＴＣＣ１９９９３からのＴ６ＰＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｄ６ＹＢＫ５）は、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓからのＴ６ＰＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｏ２９８０５）と比較して酵素活性が約１３２８％向上し、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ ＡＴＣＣ ４９９７２からのＴ６ＰＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｅ０ＲＴ７０）は、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓからのＴ６ＰＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤＯ２９８０５）と比較して酵素活性が約２０７５％向上し、Ｓｐｈａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＳＭ ２０７４５からのＴ６ＰＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｄ１Ｃ７Ｇ９）は、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓからのＴ６ＰＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｏ２９８０５）と比較して酵素活性が約８１４％向上している。以下の例は、酵素をその基質と共にインキュベートし、次いでＨＰＬＣを介して反応物及び生成物の量を測定することを含む、Ｔ６ＰＰの活性を決定するためのプロトコルを当業者に提供する。任意の２つの酵素の相対的活性の測定は、緩衝液、ｐＨ、温度などの同一の反応条件下で実行される。
【0026】
本発明のプロセスで使用されるＴ６ＰＰは、Ｔ６Ｐに特異的である。Ｔ６ＰＰの場合、特定のとは、プロセス内の他のリン酸化単糖よりもＴ６Ｐに対してより高い脱リン酸化活性を有することを意味する。例えば、Ｔ６ＰＰは、例えば、Ｇ１Ｐ、Ｇ６Ｐ、及びＦ６ＰよりもＴ６Ｐに対してより高い脱リン酸化活性を有する。
【0027】
本発明のプロセスで使用するためのＴ６ＰＰの例には、以下のタンパク質が含まれるが、これらに限定されない：配列番号３に記載されているアミノ酸配列を有するＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｔｈｅｒｍｏｆｉｌａ ＣＨＴＩ‐５５からのＴ６ＰＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ０Ｅ３ＮＣＨ４）；配列番号４に記載されているアミノ酸配列を有するＴｈｅｒｍｏｂｉｓｐｏｒａ ｂｉｓｐｏｒａ株ＡＴＣＣ１９９９３からのＴ６ＰＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｄ６ＹＢＫ５）；配列番号５に記載されているアミノ酸配列を有するＳｐｉｒｏｃｈａｅｔａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ株ＡＴＣＣ４９９７２からのＴ６ＰＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｅ０ＲＴ７０）；配列番号６に記載されているアミノ酸配列を有するＳｐｈａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＤＳＭ２０７４５からのＴ６ＰＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｄ１Ｃ７Ｇ９）；配列番号３、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するＴ６ＰＰ。糖からタガトースを製造するための本発明によるプロセスは、フルクトース６‐リン酸エピメラーゼ（Ｆ６ＰＥ）を使用してフルクトース‐６‐リン酸（Ｆ６Ｐ）をタガトース６‐リン酸（Ｔ６Ｐ）に変換すること、及びタガトース‐６‐リン酸ホスファターゼ（Ｔ６ＰＰ）を使用して生成されたＴ６Ｐをタガトースに変換することを含み、ここで、Ｔ６ＰＰは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0028】
本発明のプロセスにおいて、Ｔ６ＰＰは、Ｔ６Ｐをタガトースに変換するホスファターゼである。Ｔ６ＰＰは、亜鉛、マンガン、コバルト、又はマグネシウム、好ましくはマグネシウムなどの二価金属補因子を利用する。本発明のプロセスにおいて、Ｔ６ＰＰは、配列番号３、配列番号４、配列番号番号５、又は配列番号６に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する；そして、好ましくは、触媒作用のためのロスマノイドフォールドドメイン、及びさらに、基質特異性のためのＣ１キャッピングドメイン；マグネシウムを配位するためのロスマノイドフォールドの最初のβストランドのＤｘＤシグネチャー、ここで、２番目のＡｓｐは一般的な酸／塩基触媒である；反応中間体の安定性を助けるロスマノイドフォールドの２番目のβストランドの端にあるＴｈｒ又はＳｅｒ；反応中間体の安定性を助けるロスマノイドフォールドの３番目のβストランドに対するαヘリックスＣ末端のＮ末端のＬｙｓ；及びマグネシウムなどの二価金属カチオンを配位するためのロスマノイドフォールドの４番目のβストランドの端にあるＥ（Ｄ／Ｎ）シグネチャを含む。たとえば、Burroughs et al。、Evolutionary Genomics of the HAD Superfamily：Understanding the Structural Adaptations and Catalytic Diversity in a Superfamily of Phosphoesterases and Allied Enzymes J. Mol. Biol, 2006; 361; 1003-1034（ＨＡＤスーパーファミリーの進化ゲノミクス：ホスホエステラーゼと関連酵素のスーパーファミリーにおける構造適応と触媒的多様性の理解）を参照のこと。
【0029】
本発明による好ましい酵素プロセスは、フルクトース６‐リン酸エピメラーゼ（Ｆ６ＰＥ）を使用して、フルクトース‐６‐リン酸（Ｆ６Ｐ）をタガトース６‐リン酸（Ｔ６Ｐ）に変換するステップを含み、ここで、Ｆ６ＰＥは、配列番号１、配列番号２、又は配列番号７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、及びタガトース‐６‐リン酸ホスファターゼ（Ｔ６ＰＰ）を使用してＴ６Ｐをタガトースに変換するステップを含む、ここでＴ６ＰＰは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、Ｆ６ＰＥは、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及びＴ６ＰＰは、配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。最も好ましくは、Ｆ６ＰＥは、配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有し、Ｔ６ＰＰは配列番号５に記載されているアミノ酸配列を有する。
【0030】
本発明による糖からタガトースを調製するためのプロセスはまた、グルコース６‐リン酸（Ｇ６Ｐ）をＦ６Ｐに酵素的に変換するステップを含み、このステップは、ホスホグルコースイソメラーゼ（ＰＧＩ）によって触媒される。使用できる例示的なＰＧＩには、国際特許出願公開ＷＯ２０１７／０５９２７８に開示されているもの：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ（クロストリジウム・サーモセラム）からのＰＧＩ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ３ＤＢＸ９）及びＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（サーマス・サーモフィルス）からのＰＧＩ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ５ＳＬＬ６）が含まれる。
【0031】
本発明によるタガトースを調製するためのプロセスは、グルコース１‐リン酸（Ｇ１Ｐ）をＧ６Ｐに変換するステップをさらに含み、このステップは、ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される。ＰＧＭの例は、国際特許出願公開ＷＯ２０１７／０５９２７８に開示されている、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ（サーモコッカス・コダカラエンシス）からのＰＧＭ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ６８ＢＪ６）である。
【0032】
さらに、本発明によるプロセスは、糖をＧ１Ｐに変換するステップをさらに含むことができ、このステップは、少なくとも１つの酵素によって触媒され、糖は、デンプン又はその誘導体（図１）、セルロース又はその誘導体（図２）、フルクトース（図３）、グルコース（図４）、及びスクロース（図５）からなる群から選択される。本発明によるプロセスにおいて糖をＧ１Ｐに変換するステップで使用される酵素（単数又は複数）は、アルファ‐グルカンホスホリラーゼ（αＧＰ）、マルトースホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、セロデキストリンホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ、及び／又はセルロースホスホリラーゼ及びそれらの混合物であり得る。Ｆ６Ｐに到達するための酵素又は酵素の組み合わせの選択は、プロセスで使用される糖に依存する。
【0033】
セルロースは最も豊富な生物資源であり、植物細胞壁の主成分である。非食品リグノセルロース系バイオマスには、セルロース、ヘミセルロース、リグニン、及びその他の微量成分が含まれている。アビセル（微結晶性セルロース）、再生アモルファスセルロース、バクテリアセルロース、ろ紙などを含む純粋なセルロースは、一連の処理によって調製できる。部分的に加水分解されたセルロース基質には、重合度が７を超える水不溶性セロデキストリン、重合度３～６の水溶性セロデキストリン、セロビオース、グルコース、及びフルクトースが含まれる。
【0034】
本発明による特定のプロセスにおいて、セルロース及びその誘導生成物は、一連のステップを介してタガトースに変換することができる。図２を参照されたい。例えば、本発明によるプロセスは、以下のステップを含む経路を提供する：セロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ）及びセロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）によってそれぞれ触媒されるセロデキストリン及びセロビオース並びに遊離リン酸イオン（遊離ホスフェート）からＧ１Ｐを生成するステップ；ＰＧＭによって触媒されるＧ１ＰをＧ６Ｐに変換するステップ；ＰＧＩによって触媒されるＧ６ＰをＦ６Ｐに変換するステップ；上記のようにＦ６Ｐをタガトースに変換するステップ；リン酸イオン（ホスフェート）は、セロデキストリンとセロビオースをＧ１Ｐに変換するステップでリサイクルできる。
【0035】
いくつかの酵素を使用して、固体セルロースを水溶性セロデキストリン及びセロビオースに加水分解することができる。このような酵素には、エンドグルカナーゼ及びセロビオヒドロラーゼが含まれるが、ベータ‐グルコシダーゼ（セロビアーゼ）は含まれない。セルロースの加水分解とＧ１Ｐの生成の前に、セルロースとバイオマスを前処理して、それらの反応性を高め、セルロース鎖の重合度を下げることができる。セルロース及びバイオマスの前処理方法には、希酸前処理、セルロース溶媒ベースのリグノセルロース分画、アンモニア繊維膨張、アンモニア水性浸漬、イオン液体処理が含まれ、塩酸、硫酸、リン酸及びそれらの組み合わせを含む濃酸を使用して部分的に加水分解される。
【0036】
糖がセロビオースを含み、酵素がセロビオースホスホリラーゼを含む場合、Ｇ１Ｐは、セロビオースホスホリラーゼによってセロビオースから生成される。糖がセロデキストリンを含み、酵素がセロデキストリンホスホリラーゼを含む場合、Ｇ１Ｐはセロデキストリンホスホリラーゼによってセロデキストリンから生成される。糖がセルロースを含み、酵素がセルロースホスホリラーゼを含む場合、Ｇ１Ｐはセルロースホスホリラーゼによってセルロースから生成される。
【0037】
糖がマルトースを含み、酵素がマルトースホスホリラーゼを含む場合、Ｇ１Ｐは、マルトースホスホリラーゼによってマルトースから生成される。糖がスクロースを含み、酵素がスクロースホスホリラーゼを含む場合、Ｇ１Ｐはスクロースホスホリラーゼによってスクロースから生成される。
【0038】
糖がデンプン又はデンプン誘導体である場合、誘導体は、アミロース、アミロペクチン、可溶性デンプン、アミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトース、マルトトリオース、及びグルコース、並びにそれらの混合物からなる群から選択され得る。本発明の特定のプロセスにおいて、糖をＧ１Ｐに変換するために使用される酵素は、αＧＰを含む。このステップでは、糖がデンプンを含む場合、Ｇ１ＰはαＧＰによってデンプンから生成される。糖が可溶性デンプン、アミロデキストリン、又はマルトデキストリンを含む場合、Ｇ１Ｐは可溶性デンプン、アミロデキストリン、又はマルトデキストリンからαＧＰによって生成される。αＧＰの例は、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａからのαＧＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｇ４ＦＥＨ８）であり、国際特許出願公開ＷＯ２０１７／０５９２７８に開示されている。
【0039】
本発明によるいくつかのプロセスは、デンプンをデンプン誘導体に変換するステップをさらに含むことができ、ここで、デンプン誘導体は、デンプンの酵素的加水分解又はデンプンの酸加水分解によって調製される。本発明の特定のプロセスにおいて、マルトースホスホリラーゼ（ＭＰ）を使用して、分解生成物マルトースをＧ１Ｐ及びグルコースにリン酸分解的に切断することにより、タガトース収量を増加させることができる。あるいは、４‐グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）を使用して、分解生成物であるグルコース、マルトース、及びマルトトリオースを、より長いマルトオリゴ糖にリサイクルすることにより、タガトースの収量を増やすことができる。これはαＧＰによってリン酸分解的に切断されてＧ１Ｐを生成することができる。４ＧＴの例は、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓからの４ＧＴ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｏ３２４６２）であり、国際特許出願公開ＷＯ２０１７／０５９２７８に開示されている。本発明のいくつかのプロセスにおいて、ポリリン酸及びポリリン酸グルコキナーゼ（ＰＰＧＫ）をプロセスに加えることができ、したがって、分解生成物グルコースをＧ６Ｐにリン酸化することによってタガトースの収量を増加させることができる。
【0040】
デンプンは、自然界で最も広く使用されているエネルギー貯蔵化合物であり、ほとんどが植物の種子に貯蔵されている。天然デンプンには、線状アミロースと分岐アミロペクチンが含まれている。デンプン誘導体の例には、アミロース、アミロペクチン、可溶性デンプン、アミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトース、フルクトース、及びグルコースが含まれる。セルロース誘導体の例には、前処理されたバイオマス、再生アモルファスセルロース、セロデキストリン、セロビオース、フルクトース、及びグルコースが含まれる。スクロース誘導体には、フルクトースとグルコースが含まれる。
【0041】
プロセスがデンプン誘導体を使用する場合、デンプン誘導体は、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、α‐アミラーゼ、又はそれらの組み合わせによって触媒されるデンプンの酵素的加水分解によって調製することができる。コーンスターチには、αＧＰの作用を妨げる多くの枝が含まれている。イソアミラーゼを使用してデンプンを枝切りし、線状アミロデキストリンを生成することができる。イソアミラーゼで前処理されたデンプンは、最終生成物のＦ６Ｐ濃度をより高くする可能性がある。イソアミラーゼとプルラナーゼはα‐１，６‐グリコシド結合を切断し、α‐グルカンホスホリラーゼによるデンプンのより完全な分解を可能にする。α‐アミラーゼはα‐１，４‐グリコシド結合を切断するため、α‐アミラーゼを使用してデンプンをフラグメントに分解し、タガトースにすばやく変換する。
【0042】
タガトースはまた、フルクトースから製造することができる。図３を参照されたい。本発明によるプロセスはまた、フルクトースをＦ６Ｐに変換するステップを含むことができ、このステップは、少なくとも１つの酵素によって触媒され、任意選択で、スクロースをフルクトースに変換するステップを含み、このステップは、少なくとも１つの酵素によって触媒される。たとえば、このプロセスには、ポリリン酸フルクトキナーゼ（ＰＰＦＫ）によって触媒されるフルクトースとポリリン酸からＦ６Ｐを生成することが含まれる。Ｆ６Ｐのタガトースへの変換は上記のとおりである。フルクトースは、例えば、スクロースの酵素的変換によって製造することができる。Ｔ６Ｐがタガトースに変換されるときに生成されるリン酸イオンは、次いでスクロースをＧ１Ｐに変換するステップでリサイクルできる。
【0043】
タガトースはまた、グルコースから製造することができる。図４を参照されたい。本発明によるプロセスはまた、少なくとも１つの酵素によって触媒されるグルコースをＧ６Ｐに変換するステップ、及び任意選択で、スクロースをフルクトースに変換するステップを含むことができ、このステップは、少なくとも１つの酵素によって触媒される。たとえば、このプロセスには、ポリリン酸グルコキナーゼ（ＰＰＧＫ）によって触媒されるグルコースとポリリン酸からＧ６Ｐを生成することが含まれる。グルコースは、例えば、スクロースの酵素的変換によって製造することができる。図５を参照されたい。
【0044】
本発明のいくつかの方法において、Ｔ６Ｐがタガトースに変換されるときに生成されるリン酸イオンは、デンプン誘導体をＧ１Ｐに変換するステップ（例えば、図１を参照）、セルロース誘導体をＧ１Ｐに変換するステップ（例えば、図２を参照）、又は特にプロセスが単一の反応容器内で行われる場合、スクロースをＧ１Ｐに変換するステップ（図５を参照）においてリサイクルされる。さらに、ＰＰＦＫとポリリン酸塩を使用して、ＳＰによるスクロースのリン酸分解切断によって生成されたフルクトースからＦ６Ｐを製造することにより、タガトースの収量を増やすことができる。
【0045】
例えば、糖からタガトースを調製するためのプロセスは、以下のステップを含む：（ｉ）１つ又は複数の酵素を使用して、糖をグルコース１‐リン酸（Ｇ１Ｐ）に変換するステップ；（ｉｉ）ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ、ＥＣ ５．４．２．２）を使用してＧ１ＰをＧ６Ｐに変換するステップ；（ｉｉｉ）ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ、ＥＣ ５．３．１．９）を使用してＧ６ＰをＦ６Ｐに変換するステップ；（ｉｖ）フルクトース６‐リン酸エピメラーゼ（Ｆ６ＰＥ）を介してＦ６ＰをＴ６Ｐに変換するステップ；及び（ｖ）タガトース６‐リン酸ホスファターゼ（Ｔ６ＰＰ）を介してＴ６Ｐをタガトースに変換するステップ。本発明の改良されたプロセスにおいて、Ｆ６ＰＥは、配列番号１、配列番号２、又は配列番号７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び／又はＴ６ＰＰは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そのようなプロセスにおいて、例えば、ステップ（ｉ）の酵素はαＧＰである。通常、プロセスで使用される酵素ユニットの比率は１：１：１：１：１（αＧＰ：ＰＧＭ：ＰＧＩ：Ｆ６ＰＥ：Ｔ６ＰＰ）である。酵素単位は、１μｍｏｌの基質を１分間に生成物に変換するために必要な酵素の量である。したがって、より高い活性を有する酵素は、同じ反応を触媒するより低い活性を有する酵素と比較して、１つの酵素単位あたりの酵素のｍｇに関して、より少ない量の酵素を有するであろう。生成物の歩留まりを最適化するために、これらの比率は任意の数の組み合わせで調整できる。例えば、特定の酵素は、他の酵素の量と比較して、約２倍、３倍、４倍、５倍などの量で存在し得る。
【0046】
本発明によるタガトースを調製するためのプロセスは、以下の追加のステップを含むことができる：酵素加水分解又は酸加水分解による多糖及びオリゴ糖からグルコースを生成するステップ、少なくとも１つの酵素によって触媒されるグルコースをＧ６Ｐに変換するステップ、酵素加水分解又は酸加水分解により多糖及びオリゴ糖からフルクトースを生成するステップ、及び少なくとも１つの酵素によって触媒されるフルクトースをＧ６Ｐに変換するステップ。多糖類及びオリゴ糖の例は上に列挙されている。
【0047】
本発明によるタガトースを調製するためのプロセスは、単一のバイオリアクター又は反応容器内で実施することができる。あるいは、ステップは、直列に配置された複数のバイオリアクター又は反応容器内で実施することもできる。好ましいプロセスでは、タガトースの酵素的生成は単一の反応容器内で行われる。
【0048】
本発明で使用される酵素は、可溶性、固定化、集合、又は凝集したタンパク質の形態をとることができる。これらの酵素は、当技術分野で知られているように、機能性を改良するために一般的に使用される不溶性の有機又は無機支持体に吸着することができる。これらには、アガロース、メタクリレート、ポリスチレン、又はデキストランなどの高分子支持体、並びにガラス、金属、又は炭素ベースの材料などの無機支持体が含まれる。これらの材料は、固定化酵素の付着と活性を促進する大きな表面対体積比と特殊な表面で製造されることがよくある。酵素は、共有結合、イオン結合、又は疎水性相互作用を介してこれらの固体支持体に付着している可能性がある。酵素はまた、固体支持体に親和性を有する別のタンパク質又はペプチド配列、ほとんどの場合、ポリヒスチジン配列への共有結合融合などの遺伝子操作された相互作用を介して固定することができる。酵素は、表面又は表面コーティングに直接付着する場合もあれば、表面又は表面コーティングにすでに存在する他のタンパク質に付着する場合もある。酵素は、すべて１つの担体、個々の担体、又は２つの組み合わせに固定化できる（たとえば、担体ごとに２つの酵素を混合してからそれらの担体を混合する）。これらのバリエーションは、連続反応器でのターンオーバーを最適化するために、均等に又は定義された層で混合することができる。例えば、反応器の始まりは、高い初期Ｇ１Ｐ増加を確実にするためにａＧＰの層を有し得る。酵素は、すべて１つの担体に、個々の担体に、又はグループで固定化することができる。これらの酵素は、ターンオーバーを最適化するために、均一に、又は定義された層又はゾーンで混合することができる。
【0049】
当技術分野で知られている任意の適切な生物学的緩衝液、例えば、ＨＥＰＥＳ、ＰＢＳ、ＢＩＳ‐ＴＲＩＳ、ＭＯＰＳ、ＤＩＰＳＯ、Ｔｒｉｚｍａなどを本発明のプロセスで使用することができる。すべての実施形態の反応緩衝液は、５．０から９．０までの範囲のｐＨを有することができる。より好ましくは、反応緩衝液のｐＨは、約６．０から約７．３の範囲であり得る。例えば、反応緩衝液のｐＨは、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、又は７．３であり得る。
【0050】
本発明のいくつかの改良されたプロセスにおいて、反応緩衝液は、二価の金属カチオンを含む。例には、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｍｇ２＋及びＺｎ２＋など、好ましくはＭｇ２＋が含まれる。二価金属カチオンの濃度は、約０ｍＭから約１５０ｍＭ、約０ｍＭから約１００ｍＭ、約１ｍＭから約５０ｍＭ、好ましくは約５ｍＭから約５０ｍＭ、又はより好ましくは約１０ｍＭから約５０ｍＭの範囲であり得る。例えば、二価金属カチオン濃度は、約０．１ｍＭ、約０．５ｍＭ、約１ｍＭ、約１．５ｍＭ、約２ｍＭ、約２．５ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、又は約５５ｍＭであり得る。
【0051】
プロセスステップが実施される反応温度は、３７～８５℃の範囲であり得る。より好ましくは、ステップは、約３７℃から約８５℃の範囲の温度で実施することができる。温度は、例えば、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、又は約６０℃であり得る。好ましくは、反応温度は約５０℃である。本発明のいくつかのプロセスにおいて、反応温度は一定であり、プロセス中に変化しない。
【0052】
開示されたプロセスの反応時間は、必要に応じて調整することができ、約１時間から約４８時間の範囲であり得る。例えば、反応時間は、約１６時間、約１８時間、約２０時間、約２２時間、約２４時間、約２６時間、約２８時間、約３０時間、約３２時間、約３４時間、約３６時間、約３８時間、約４０時間、約４２時間、約４４時間、約４６時間、又は約４８時間であり得る。より好ましくは、反応時間は約２４時間である。
【0053】
反応は、充填床反応器又は同様の装置を使用して、バッチ又は連続プロセスで実行することができる。連続プロセスでは、溶液マルトデキストリンは、溶液が下流の処理のためにカラムを離れるときにタガトースへの変換が完了するような速度で、固定化酵素の床を通してポンプで送られる。たとえば、２００ｇ／Ｌのマルトデキストリンを固定化酵素（たとえば５０℃に維持）が充填されたカラムにポンプで送り、マルトデキストリンがカラムを離れるときに最大のタガトース収量が達成されるようにすることができる。この方法論は、バッチ法よりも優れた体積生産性を提供する。これにより、生成物がカラム及び反応条件と接触する時間が制限され、生成物の分解（ヒドロキシメチルフルフラール形成の可能性など）の可能性が減少する。バッチモードであろうと連続モードであろうと、本発明のプロセスの様々なステップは、他のステップと同じ反応条件を使用して実施することができる。例えば、単一のバイオリアクター又は反応容器を使用する本発明の特定のプロセスにおいて、ｐＨ及び温度などの反応条件、並びに反応緩衝液は、プロセスのすべてのステップにわたって一定に保たれる。
【0054】
次に、Ｔ６ＰのＴ６ＰＰ脱リン酸化によって生成されたリン酸イオンは、特にすべてのプロセスステップが単一のバイオリアクター又は反応容器内で行われる場合、糖をＧ１Ｐに変換するプロセスステップでリサイクルすることができる。開示されたプロセスでリン酸塩をリサイクルする能力は、非化学量論量のリン酸塩を使用することを可能にし、それは反応リン酸塩濃度を低く保つ。これは、全体的な経路とプロセスの全体的な速度に影響を与えるが、個々の酵素の活性を制限することはなく、タガトース製造プロセスの全体的な効率を可能にする。
【0055】
例えば、反応リン酸塩濃度は、約０ｍＭから約３００ｍＭ、約０ｍＭから約１５０ｍＭ、約１ｍＭから約５０ｍＭ、好ましくは約５ｍＭから約５０ｍＭ、より好ましくは、約１０ｍＭから約５０ｍＭの範囲である。例えば、反応リン酸濃度は、約０．１ｍＭ、約０．５ｍＭ、約１ｍＭ、約１．５ｍＭ、約２ｍＭ、約２．５ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、又は約５５ｍＭであり得る。
【0056】
したがって、リン酸塩濃度が低いと、総リン酸塩が少ないために製造コストが減少し、したがってリン酸塩除去のコストが減少する。また、それは、高濃度の遊離リン酸イオン（遊離ホスフェート）によるＴ６ＰＰの阻害を防ぎ、リン酸塩汚染の可能性を減らす。
【0057】
さらに、本明細書に開示されるプロセスは、リン酸塩の供給源としてＡＴＰを添加することなく、すなわち、ＡＴＰを含まずに実施することができる。このプロセスは、ＮＡＤ（Ｈ）を追加する必要性なしにに、つまりＮＡＤ（Ｈ）を含まずに実行することもできる。他の利点はまた、タガトースを製造するための開示されたプロセスの少なくとも１つのステップがエネルギー的に好ましい化学反応を伴うという事実を含む。図６。より高い活性を持つ酵素の使用は全体的なエネルギーに影響を与えないが、改良されたプロセスでより少ない量の酵素を使用する能力は有利である。利点は、生成物の総製造コストにおける酵素の総コストの削減である。
【0058】
本発明によるプロセスは、反応全体に対して非常に好ましい平衡定数のために、高収率を達成することができる。理論的には、出発物質が完全に中間体に変換された場合、最大９９％の収率を達成することができる。また、本発明によるＴ６Ｐをタガトースに変換するステップは、供給原料に関係なく、不可逆的なホスファターゼ反応である。したがって、タガトースは非常に高い収率で製造される。
【0059】
本発明のプロセスは、低コストの出発材料を使用し、原料及び生成物の分離に関連するコストを削減することによって製造コストを削減する。デンプン、セルロース、スクロース及びそれらの誘導体は、例えば、ラクトースよりも安価な原料である。タガトースが乳糖から製造される場合、グルコースとガラクトース及びタガトースはクロマトグラフィーによって分離されるため、製造コストが高くなる。
【0060】
本発明によるプロセスは、タガトースの容易な回収を可能にし、分離コストが最小限に抑えられる。好ましくは、本発明のプロセスにおいて、タガトースの回収は、クロマトグラフィー分離によるものではない。連続反応でタガトースを生成した後、生成物は代わりに精密ろ過、イオン交換（陽イオン、次に陰イオン、混合床ではない）、濃縮、結晶化、結晶分離、及び乾燥を通過する。タガトースの収率が高いため、タガトースを精製するために必要なのは結晶化ステップだけである。結晶化の前にタガトースをさらに精製するためには、ナノ濾過を使用して、結晶化プロセスに酵素が存在するリスクを排除し、タガトースと共結晶化する可能性のある未変換のデキストリンを除去するか、母液（マルトデキストリン、マルトテトラオース、マルトトリオース、マルトースなど）のリサイクル性を制限することができる。
【0061】
本発明によるタガトースを調製するための改良されたプロセスは、以下のステップを含む：（ｉ）一つ又は複数の酵素を使用して糖をグルコース‐1‐リン酸（Ｇ１Ｐ）に変換するステップ；（ｉｉ）ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ、ＥＣ ５．４．２．２）を使用してＧ１ＰをＧ６Ｐに変換するステップ；（ｉｉｉ）ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ、ＥＣ ５．３．１．９）を使用してＧ６ＰをＦ６Ｐに変換するステップ；（ｉｖ）フルクトース６‐リン酸エピメラーゼ（Ｆ６ＰＥ）を介してＦ６ＰをＴ６Ｐに変換するステップ；及び（ｖ）タガトース６‐リン酸ホスファターゼ（Ｔ６ＰＰ）を介してＴ６Ｐをタガトースに変換するステップ、ここで、Ｆ６ＰＥは配列番号１、配列番号２、又は配列番号７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、及び／又はＴ６ＰＰは配列番号３、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。このプロセスは、好ましくは、単一のバイオリアクター又は反応容器内で実施される。
【0062】
好ましくは、本発明によるタガトースを調製するための改良されたプロセスは、以下のステップを含む：（ｉ）αＧＰを使用して糖をグルコース１‐リン酸（Ｇ１Ｐ）に変換するステップ、ここで、糖は、デンプン、１つ又は複数のデンプンの誘導体、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される；（ｉｉ）ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ、ＥＣ ５．４．２．２）を使用してＧ１ＰをＧ６Ｐに変換するステップ；（ｉｉｉ）ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ、ＥＣ５．３．１．９）を使用してＧ６ＰをＦ６Ｐに変換するステップ；（ｉｖ）フルクトース６‐リン酸エピメラーゼ（Ｆ６ＰＥ）を介してＦ６ＰをＴ６Ｐに変換するステップ；及び（ｖ）タガトース６‐リン酸ホスファターゼ（Ｔ６ＰＰ）を介してＴ６Ｐをタガトースに変換するステップ、ここで、Ｆ６ＰＥは配列番号１、配列番号２、又は配列番号７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、及び／又はＴ６ＰＰは配列番号３、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。このプロセスは、好ましくは、単一の反応器容器内で実施され、上記の様々なプロセス条件のうちの１つ又は複数を組み込むことができる。
【実施例0063】
例
【0064】
材料及び方法
【0065】
グルコース１‐リン酸、塩化マグネシウム、リン酸ナトリウム（一塩基性及び二塩基性）を含むすべての化学物質は、特に明記されていない限り、試薬グレード以上であり、シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ）（セントルイス、ミズーリ州、米国）又はフィッシャーサイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（ピッツバーグ、ペンシルバニア州、ＵＳＡ）から購入する。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州、米国）を組換えタンパク質発現の宿主細胞として使用した。５０ｍｇのＬ‐１カナマイシンを含むＺＹＭ‐５０５２培地を大腸菌細胞の増殖と組換えタンパク質の発現に使用した。
【0066】
組換え酵素の産生及び精製
【0067】
タンパク質発現プラスミド（ｐＥＴ２８ａ）を保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）株を、１Ｌ エーレンマイヤーフラスコ中で、５０ｍｇのＬ‐１カナマイシンを含む１００ｍＬのＺＹＭ‐５０５２培地と共にインキュベートした。細胞を３７℃で２２０ｒｐｍで１６～２４時間回転振とうしながら増殖させた。細胞を１２℃での遠心分離により回収し、５０ｍＭ ＮａＣｌ及び５ｍＭ ＭｇＣｌ２（熱沈殿）を含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）又は３００ｍＭ ＮａＣｌ及び５ｍＭイミダゾール（Ｎｉ精製）を含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）のいずれかで１回洗浄した。細胞ペレットを同じ緩衝液に再懸濁し、超音波処理によって溶解した。遠心分離後、上清中の標的タンパク質を精製した。Ｈｉｓタグ付きタンパク質は、Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ ＩＭＡＣ Ｎｉ‐Ｃｈａｒｇｅｄ Ｒｅｓｉｎ（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって精製された。熱安定性酵素を精製するために、５０～８０℃で５～３０分間の熱沈殿を使用した。組換えタンパク質の純度は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ）によって調べた。
【0068】
例１：より高い活性を有するＦ６ＰＥ
【0069】
異なるＦ６ＰＥの相対的活性を、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ＭｎＣｌ２、３８．５ｍＭ Ｇ１Ｐ、０．０５ｇ／Ｌ ＰＧＭ、０．０５ｇ／Ｌ ＰＧＩ、０．０５ｇ／Ｌ Ｆ６ＰＥ、及びＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ ＣＨＴＩ‐５５からの０．０７５ｇ／Ｌ Ｔ６ＰＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ０Ｅ３ＮＣＨ４）を含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中で、５０°Ｃで１時間測定した。Ｖｉｖａｓｐｉｎ２濃縮器（１０，０００ＭＷＣＯ）で酵素を濾過することにより反応を停止させた。生成物のタガトースは、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｈｉ‐ＰｌｅｘＨカラムと屈折率検出器を使用して評価した。サンプルは、６５℃で１５分間、０．６ｍＬ／ｍｉｎで５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４中で分析した。表１は、本発明の改良されたプロセスで使用されるＦ６ＰＥが、以前に開示されたＤｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ（ディクチオグロムス・サーモフィラム）からのＦ６ＰＥ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｂ５ＹＢＤ７）と比較してより高い活性を有することを示している。国際特許出願公開ＷＯ２０１７／０５９２７８を参照のこと。
【表1】
【0070】
例２：より高い活性を有するＴ６ＰＰ
【0071】
Ｔ６ＰＰの相対的活性は、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ＭｎＣｌ２、３８．５ｍＭ Ｇ１Ｐ、０．０５ｇ／Ｌ ＰＧＭ、０．０５ｇ／Ｌ ＰＧＩ、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｔｈｒｉｘ ｄａｘｅｎｓｉｓからの０．２５ｇ／Ｌ Ｆ６ＰＥ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ０Ｐ６ＸＮ５０）、及び０．０５ｇ／Ｌ Ｔ６ＰＰを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中で、５０°Ｃで１時間測定された。Ｖｉｖａｓｐｉｎ２濃縮器（１０，０００ＭＷＣＯ）で酵素を濾過することにより反応を停止させた。生成物のタガトースは、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｈｉ‐ＰｌｅｘＨカラムと屈折率検出器を使用して評価した。サンプルは、６５℃で１５分間、０．６ｍＬ／ｍｉｎの５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４で分析した。表２は、本発明の改良されたプロセスで使用されるＴ６ＰＰが、以前に開示されたＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ（アルカエオグロブス・フルギダス）からのＴ６ＰＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｏ２９８０５）と比較してより高い活性を有することを示している。国際特許出願公開ＷＯ２０１７／０５９２７８を参照のこと。
【表2】
【0072】
例３：Ｆ６Ｐからの改良されたタガトース製造
【0073】
以前に開示された酵素、Ｆ６ＰＥ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｂ５ＹＢＤ７）及びＴ６ＰＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｏ２９８０５）を使用するＦ６Ｐのタガトースへの変換を、本発明の改良されたプロセスに有用な酵素、Ｆ６ＰＥ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ０Ｐ６ＸＮ５０）及びＴ６ＰＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｄ６ＹＢＫ５）によるＦ６Ｐのタガトースへの変換と比較した。３８．５ｍＭ Ｆ６Ｐ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．１ｇ／Ｌ Ｆ６ＰＥ、及び０．０３３ｇ／Ｌ Ｔ６ＰＰを含む０．２０ｍＬの反応混合物を５０℃で２時間インキュベートした。
【0074】
Ｖｉｖａｓｐｉｎ２濃縮器（１０，０００ＭＷＣＯ）での酵素の濾過により反応を停止し、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｈｉ‐Ｐｌｅｘ Ｈカラム及び屈折率検出器を使用するＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズ）により分析した。サンプルは、５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４中で、０．６ｍＬ／ｍｉｎで、１５．５分間、６５℃で分析した。結果は、以前に開示された酵素よりも改良されたプロセスの酵素によるタガトース製造の４．４倍の改良を示している（図７）。改良されたプロセスの酵素との反応には、わずかな量のフルクトース（図７、肩、５、ピーク４を参照）が存在する。これは、Ｔ６ＰＰが最初にここでの反応のＴ６Ｐと比較して大量のＦ６Ｐを確認したことによるアーティファクトである可能性があり、全体の経路では問題ではない。
【0075】
配列表
α‐グルカンホスホリラーゼ
テルモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｇ４ＦＥＨ８）‐配列番号８
α‐グルカンホスホリラーゼ
テルモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｇ４ＦＥＨ８）‐配列番号８
【化1】
【0076】
ホスホグルコムターゼ
テルモコッカス・コダカラエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ６８ＢＪ６）‐配列番号９
テルモコッカス・コダカラエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ６８ＢＪ６）‐配列番号９
【化2】
【0077】
フルクトース６‐リン酸４‐エピメラーゼ
（比較）ディクチオグロムス・テルモフィルム（Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｂ５ＹＢＤ７）‐配列番号１０
（比較）ディクチオグロムス・テルモフィルム（Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｂ５ＹＢＤ７）‐配列番号１０
【化3】
【0078】
テルマナエロトリクス・ダキセンシス（Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｔｈｒｉｘ ｄａｘｅｎｓｉｓ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ０Ｐ６ＸＮ５０）‐配列番号１
【化4】
【0079】
テルモアナエロバクテリウム・テルモサッカロリチウム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ２２３ＨＶＪ３）‐配列番号２
【化5】
【0080】
カンジダツス・テルモフォンシア クラド３バクテリウム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｔｈｅｒｍｏｆｏｎｓｉａ Ｃｌａｄｅ ３ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ２Ｍ８ＱＢＲ９）‐配列番号７
【化6】
【0081】
タガトース６‐リン酸ホスファターゼ
（比較）アルケオグロブス・フギジス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｇｉｄｉｓ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｏ２９８０５）‐配列番号１１
（比較）アルケオグロブス・フギジス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｇｉｄｉｓ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｏ２９８０５）‐配列番号１１
【化7】
【0082】
メタノザルシナ・テルモフィラ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）ＣＨＴＩ－５５ （Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ０Ｅ３ＮＣＨ４）‐配列番号３
【化8】
【0083】
テルモビスポラ・ビスポラ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｓｐｏｒａ ｂｉｓｐｏｒａ）株 ＡＴＣＣ １９９９３ （Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｄ６ＹＢＫ５）‐配列番号４
【化9】
【0084】
スピロヘータ・テルモフィラ（Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）ＡＴＣＣ ４９９７２ （Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｅ０ＲＴ７０）‐配列番号５
【化10】
【0085】
スフェロバクター・テルモフィルス（Ｓｐｈａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＳＭ ２０７４５ （Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｄ１Ｃ７Ｇ９）‐配列番号６
【化11】
【0086】
４‐グルカントランスフェラーゼ
テルモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｏ３２４６２）‐配列番号１２
テルモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｏ３２４６２）‐配列番号１２
【化12】
【図1-1】
【図1-2】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-03-27
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
糖からタガトースを製造するための改良されたプロセスであって、この改良されたプロセスは
フルクトース‐６‐リン酸エピメラーゼ（Ｆ６ＰＥ）を使用してフルクトース‐６‐リン酸（Ｆ６Ｐ）をタガトース６‐リン酸（Ｔ６Ｐ）に変換すること、及び
タガトース‐６‐リン酸ホスファターゼ（Ｔ６ＰＰ）を使用してＴ６Ｐをタガトースに変換すること
を含み、ここでＴ６ＰＰは、配列番号５、配列番号３、配列番号４、又は配列番号６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
上記プロセス。
フルクトース‐６‐リン酸エピメラーゼ（Ｆ６ＰＥ）を使用してフルクトース‐６‐リン酸（Ｆ６Ｐ）をタガトース６‐リン酸（Ｔ６Ｐ）に変換すること、及び
タガトース‐６‐リン酸ホスファターゼ（Ｔ６ＰＰ）を使用してＴ６Ｐをタガトースに変換すること
を含み、ここでＴ６ＰＰは、配列番号５、配列番号３、配列番号４、又は配列番号６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
上記プロセス。
【請求項2】
Ｆ６ＰＥが配列番号１、配列番号２、又は配列番号７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項3】
グルコース６‐リン酸（Ｇ６Ｐ）をＦ６Ｐに変換するステップをさらに含み、このステップがホスホグルコースイソメラーゼ（ＰＧＩ）によって触媒される、請求項１又は２に記載のプロセス。
【請求項4】
グルコース１‐リン酸（Ｇ１Ｐ）をＧ６Ｐに変換するステップをさらに含み、このステップがホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される、請求項３に記載のプロセス。
【請求項5】
糖をＧ１Ｐに変換するステップをさらに含み、このステップが少なくとも１つの酵素によって触媒され、糖がデンプン又はその誘導体、セルロース又はその誘導体及びスクロースからなる群から選択される、請求項４に記載のプロセス。
【請求項6】
少なくとも１つの酵素が、α‐グルカンホスホリラーゼ（αＧＰ）、マルトースホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、セロデキストリンホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ、及びセルロースホスホリラーゼからなる群から選択される、請求項５に記載のプロセス。
【請求項7】
糖が、アミロース、アミロペクチン、可溶性デンプン、アミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトース、マルトトリオース、及びグルコースからなる群から選択されるデンプン又はその誘導体である、請求項５に記載のプロセス。
【請求項8】
デンプンをデンプン誘導体に変換するステップをさらに含み、デンプン誘導体がデンプンの酵素的加水分解又はデンプンの酸加水分解によって調製される、請求項７に記載のプロセス。
【請求項9】
４‐グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）がプロセスに追加される、請求項８に記載のプロセス。
【請求項10】
デンプン誘導体が、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、αアミラーゼ、又はそれらの組み合わせを使用してデンプンの酵素的加水分解によって調製される、請求項８に記載のプロセス。
【請求項11】
少なくとも１つの酵素によって触媒されるフルクトースをＦ６Ｐに変換するステップ、及び
任意選択で、少なくとも１つの酵素によって触媒されるスクロースをフルクトースに変換するステップをさらに含む、請求項１又は２に記載のプロセス。
任意選択で、少なくとも１つの酵素によって触媒されるスクロースをフルクトースに変換するステップをさらに含む、請求項１又は２に記載のプロセス。
【請求項12】
少なくとも１つの酵素によって触媒されるグルコースをＧ６Ｐに変換するステップ、及び
任意選択で、少なくとも１つの酵素によって触媒されるスクロースをグルコースに変換するステップをさらに含む、請求項３に記載のプロセス。
任意選択で、少なくとも１つの酵素によって触媒されるスクロースをグルコースに変換するステップをさらに含む、請求項３に記載のプロセス。
【請求項13】
プロセスステップが、以下のプロセス条件のうちの少なくとも１つの下で実施される、請求項１又は２に記載のプロセス：
単一の反応容器内で
約３７℃から約８５℃の範囲の温度で、
約５．０から約９．０の範囲のｐＨで、
約１時間から約４８時間で、又は
上記の任意の組み合わせ。
単一の反応容器内で
約３７℃から約８５℃の範囲の温度で、
約５．０から約９．０の範囲のｐＨで、
約１時間から約４８時間で、又は
上記の任意の組み合わせ。
【請求項14】
プロセスステップが、以下のプロセス条件のうちの少なくとも１つの下で実施される、請求項１又は２に記載のプロセス：
リン酸源としてのアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）なしで、
ニコチンアミドアデノシンジヌクレオチドなしで、
約０．１ｍＭから約１５０ｍＭのリン酸塩濃度で、
約０．１ｍＭから５０ｍＭのＭｇ２＋濃度で、
Ｔ６ＰのＴ６ＰＰ脱リン酸化によって生成されたリン酸イオンが、糖をＧ１Ｐに変換するプロセスステップで使用される、
プロセスの少なくとも１つのステップは、エネルギー的に好ましい化学反応を伴う、又は
上記の任意の組み合わせ。
リン酸源としてのアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）なしで、
ニコチンアミドアデノシンジヌクレオチドなしで、
約０．１ｍＭから約１５０ｍＭのリン酸塩濃度で、
約０．１ｍＭから５０ｍＭのＭｇ２＋濃度で、
Ｔ６ＰのＴ６ＰＰ脱リン酸化によって生成されたリン酸イオンが、糖をＧ１Ｐに変換するプロセスステップで使用される、
プロセスの少なくとも１つのステップは、エネルギー的に好ましい化学反応を伴う、又は
上記の任意の組み合わせ。
【請求項15】
生成されたタガトースを分離回収するステップをさらに含み、分離回収がクロマトグラフィー分離を介さない、請求項１又は２に記載のプロセス。
【請求項16】
Ｆ６ＰＥがディクチオグロムス・テルモフィルム（Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｂ５ＹＢＤ７）からのＦ６ＰＥの活性と比較して、改良されたプロセスにおいて、より高い活性を有する、請求項２に記載のプロセス。
【請求項17】
Ｔ６ＰＰがアルケオグロブス・フルギヅス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｏ２９８０５）からのＴ６ＰＰの活性と比較して、改良されたプロセスにおいて、より高い活性を有する、請求項１に記載のプロセス。
【手続補正書】
【提出日】2024-04-15
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
【外国語明細書】