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特開2024-75641次世代シーケンシングサンプルにおける汚染検出のためのシステムおよび方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024075641
(43)【公開日】2024-06-04
(54)【発明の名称】次世代シーケンシングサンプルにおける汚染検出のためのシステムおよび方法
(51)【国際特許分類】
G16B 30/00 20190101AFI20240528BHJP
【ＦＩ】
G16B30/00
【審査請求】有
【請求項の数】18
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024039966
(22)【出願日】2024-03-14
(62)【分割の表示】P 2022529498の分割
【原出願日】2020-11-20
(31)【優先権主張番号】62/938,807
(32)【優先日】2019-11-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】591003013
【氏名又は名称】エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100138759
【弁理士】
【氏名又は名称】大房 直樹
(72)【発明者】
【氏名】カムネワ，オルガ・コンスタンチノフナ
(72)【発明者】
【氏名】ワーン，シュオ
(57)【要約】 （修正有）
【課題】汚染を検出し、液体生検サンプルの点推定値および信頼区間の双方として汚染レベルを報告するためのベータ混合モデリングに基づく統計的方法及びシステムを提供する。
【解決手段】方法は、被験者由来のシーケンシングされたサンプルからのバリアントのリストを含む電子ファイルを受信することと、頻度範囲内のバリアントのセットに対する代替対立遺伝子頻度のセットを計算することと、前記代替対立遺伝子頻度のセットの分析に基づいて前記サンプルが汚染されているかどうかを判定することと、前記サンプルが汚染されていない場合、前記バリアントのリストに少なくとも部分的に基づいて薬物を投与することと、前記サンプルが汚染されている場合、バリアントの第２のリストを含む汚染されていないシーケンシングされたサンプルを取得し、前記バリアントの第２のリストに少なくとも部分的に基づいて薬物を投与することと、を含む。
【選択図】なし
【解決手段】方法は、被験者由来のシーケンシングされたサンプルからのバリアントのリストを含む電子ファイルを受信することと、頻度範囲内のバリアントのセットに対する代替対立遺伝子頻度のセットを計算することと、前記代替対立遺伝子頻度のセットの分析に基づいて前記サンプルが汚染されているかどうかを判定することと、前記サンプルが汚染されていない場合、前記バリアントのリストに少なくとも部分的に基づいて薬物を投与することと、前記サンプルが汚染されている場合、バリアントの第２のリストを含む汚染されていないシーケンシングされたサンプルを取得し、前記バリアントの第２のリストに少なくとも部分的に基づいて薬物を投与することと、を含む。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
汚染を検出する方法であって、
被験者由来のシーケンシングされたサンプルからのバリアントのリストを含む電子ファイルを受信することと、
頻度範囲内のバリアントのセットに対する代替対立遺伝子頻度のセットを計算することと、
前記代替対立遺伝子頻度のセットの分析に基づいて前記サンプルが汚染されているかどうかを判定することと、
前記サンプルが汚染されていない場合、前記バリアントのリストに少なくとも部分的に基づいて薬物を投与することと、
前記サンプルが汚染されている場合、バリアントの第２のリストを含む汚染されていないシーケンシングされたサンプルを取得し、前記バリアントの第２のリストに少なくとも部分的に基づいて薬物を投与することと
を含む、方法。
被験者由来のシーケンシングされたサンプルからのバリアントのリストを含む電子ファイルを受信することと、
頻度範囲内のバリアントのセットに対する代替対立遺伝子頻度のセットを計算することと、
前記代替対立遺伝子頻度のセットの分析に基づいて前記サンプルが汚染されているかどうかを判定することと、
前記サンプルが汚染されていない場合、前記バリアントのリストに少なくとも部分的に基づいて薬物を投与することと、
前記サンプルが汚染されている場合、バリアントの第２のリストを含む汚染されていないシーケンシングされたサンプルを取得し、前記バリアントの第２のリストに少なくとも部分的に基づいて薬物を投与することと
を含む、方法。
【請求項2】
前記頻度範囲が０から０．２５の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記頻度範囲が０から０．１の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記代替対立遺伝子頻度のセットの前記分析が、前記代替対立遺伝子頻度をクラスタリングモデルに当てはめることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記クラスタリングモデルが混合モデルである、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記代替対立遺伝子頻度のいずれかが外れ値であるかどうかを判定することと、前記代替対立遺伝子頻度の前記分析の前に、前記代替対立遺伝子頻度のセットから任意の外れ値を除去することと、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記代替対立遺伝子頻度のいずれかが外れ値であるかどうかを判定するステップが、局所外れ値因子計算を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記代替対立遺伝子頻度の前記分析から汚染レベルを判定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記汚染レベルを判定するステップが、前記代替対立遺伝子頻度を混合モデルに当てはめることを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記汚染レベル付近の信頼性レベルを判定するステップをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
信頼性レベルを判定することが、前記バリアントおよび対応する前記代替対立遺伝子頻度をブートストラップすることを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記薬物ががん薬物である、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
前記がん薬物が、特定のバリアントを有しない患者よりも、前記特定のバリアントを有する患者に対して良好に機能する、請求項１０に記載の方法。
【請求項14】
前記サンプルが、少なくとも１０００ｘの平均シーケンシング深度にシーケンシングさ
れる、請求項１に記載の方法。
れる、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
前記サンプルが、少なくとも２０００ｘの平均シーケンシング深度にシーケンシングされる、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
汚染を検出する方法であって、
被験者由来のシーケンシングされたサンプルからのバリアントのリストを含む電子ファイルを受信することと、
頻度範囲内のバリアントのセットに対する代替対立遺伝子頻度のセットを計算することと、
前記代替対立遺伝子頻度のセットの分析に基づいて前記サンプルが汚染されているかどうかを判定することと
を含む、方法。
被験者由来のシーケンシングされたサンプルからのバリアントのリストを含む電子ファイルを受信することと、
頻度範囲内のバリアントのセットに対する代替対立遺伝子頻度のセットを計算することと、
前記代替対立遺伝子頻度のセットの分析に基づいて前記サンプルが汚染されているかどうかを判定することと
を含む、方法。
【請求項17】
上記の方法のいずれかの動作を実行するようにコンピュータシステムを制御するための複数の命令を記憶するコンピュータ可読媒体を含む、コンピュータ製品。
【請求項18】
システムであって、
請求項１７に記載のコンピュータ製品と、
前記コンピュータ可読媒体に記憶された命令を実行するための１つ以上のプロセッサとを備える、システム。
請求項１７に記載のコンピュータ製品と、
前記コンピュータ可読媒体に記憶された命令を実行するための１つ以上のプロセッサとを備える、システム。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【0001】
なし
【0002】
参照による組み込み
本明細書で述べられる全ての刊行物および特許出願は、それぞれの個々の刊行物または特許出願が参照によって組み込まれることが具体的且つ個別に示されるかのように同程度に参照によって本明細書に組み込まれる。
本明細書で述べられる全ての刊行物および特許出願は、それぞれの個々の刊行物または特許出願が参照によって組み込まれることが具体的且つ個別に示されるかのように同程度に参照によって本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【0003】
本発明の実施形態は、一般に、次世代シーケンシングのためのシステムおよび方法に関し、より詳細には、次世代シーケンシングサンプルにおける汚染検出のためのシステムおよび方法に関する。
【背景技術】
【0004】
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）は、キャリアスクリーニング、感染症、ならびにがんの検出および／または分析などの様々な用途における診断アッセイに使用されることができる点まで進歩している。特定の用途では、例えばがんにおける突然変異（すなわち、バリアント）であり得るシーケンシング標的は、サンプル中に非常に少量存在することができる。サンプル中にこのような少量の標的が存在すると、偽陽性と判定されるリスクが高くなる。
【0005】
偽陽性の１つの潜在的な原因は、シーケンシングエラーによるものである。例えば、９０％の生の読み取り精度を有するシーケンサーは、１回のパスで決定された配列に対して多くのエラーを生成することが予想され、エラーを実際の突然変異と区別することを困難にする。このシーケンシングエラーを低減する１つの方法は、標的を何度もシーケンシングすることによってコンセンサス配列を決定し、それによって所望のコンセンサス配列精度（すなわち、例えば、９９％、９９．９％、または９９．９９％）を達成することである。
【0006】
偽陽性の別の原因は、サンプル汚染（すなわち、サンプルの交差汚染）に由来することができる。しかしながら、サンプル間汚染を検出するための従来技術に記載されている方法は非常に少ない。したがって、偽陽性のリスクを低減するために、システムおよび方法がＮＧＳサンプルの汚染を検出することができることが望ましいであろう。
【発明の概要】
【0007】
本発明は、一般に、次世代シーケンシングのためのシステムおよび方法に関し、より詳細には、次世代シーケンシングサンプルにおける汚染検出のためのシステムおよび方法に関する。
【0008】
いくつかの実施形態では、汚染を検出する方法が提供される。本方法は、被験者由来のシーケンシングされたサンプルからのバリアントのリストを含む電子ファイルを受信することと、頻度範囲内のバリアントのセットに対する代替対立遺伝子頻度のセットを計算することと、代替対立遺伝子頻度のセットの分析に基づいてサンプルが汚染されているかどうかを判定することと、サンプルが汚染されていない場合、バリアントのリストに少なくとも部分的に基づいて薬物を投与することと、サンプルが汚染されている場合、バリアントの第２のリストを含む汚染されていないシーケンシングされたサンプルを取得し、バリ
アントの第２のリストに少なくとも部分的に基づいて薬物を投与することと、を含むことができる。
アントの第２のリストに少なくとも部分的に基づいて薬物を投与することと、を含むことができる。
【0009】
いくつかの実施形態では、頻度範囲は、０から０．２５の間である。いくつかの実施形態では、頻度範囲は、０から０．１の間である。
【0010】
いくつかの実施形態では、代替対立遺伝子頻度のセットの分析は、代替対立遺伝子頻度をクラスタリングモデルに当てはめることを含む。いくつかの実施形態では、クラスタリングモデルは、混合モデルである。いくつかの実施形態では、混合モデルは、ベータ混合モデルである。
【0011】
いくつかの実施形態では、本方法は、代替対立遺伝子頻度のいずれかが外れ値であるかどうかを判定することと、代替対立遺伝子頻度の分析の前に、代替対立遺伝子頻度のセットから任意の外れ値を除去することと、をさらに含む。
【0012】
いくつかの実施形態では、代替対立遺伝子頻度のいずれかが外れ値であるかどうかを判定するステップは、局所外れ値因子計算を含む。
【0013】
いくつかの実施形態では、本方法は、代替対立遺伝子頻度の分析から汚染レベルを判定することをさらに含む。
【0014】
いくつかの実施形態では、汚染レベルを判定するステップは、代替対立遺伝子頻度を混合モデルに当てはめることを含む。
【0015】
いくつかの実施形態では、本方法は、汚染レベル付近の信頼性レベルを判定することをさらに含む。
【0016】
いくつかの実施形態では、信頼性レベルを判定することは、バリアントおよび対応する代替対立遺伝子頻度をブートストラップすることを含む。
【0017】
いくつかの実施形態では、薬物は、がん薬物である。
【0018】
いくつかの実施形態では、がん薬物は、特定のバリアントを有しない患者よりも、特定のバリアントを有する患者に対して良好に機能する。
【0019】
いくつかの実施形態では、サンプルは、少なくとも１０００ｘの平均シーケンシング深度にシーケンシングされる。いくつかの実施形態では、サンプルは、少なくとも２０００ｘの平均シーケンシング深度にシーケンシングされる。
【0020】
いくつかの実施形態では、汚染を検出するシステムが提供される。システムは、本明細書に記載の方法のいずれかに記載のステップを実行するようにプログラムされたプロセッサを含む。
【0021】
いくつかの実施形態では、汚染を検出する方法が提供される。本方法は、被験者由来のシーケンシングされたサンプルからのバリアントのリストを含む電子ファイルを受信することと、頻度範囲内のバリアントのセットに対する代替対立遺伝子頻度のセットを計算することと、代替対立遺伝子頻度のセットの分析に基づいて、サンプルが汚染されているかどうかを判定することと、を含むことができる。
【0022】
いくつかの実施形態では、コンピュータ製品が提供される。コンピュータ製品は、上述
した方法のいずれかの動作を実行するようにコンピュータシステムを制御するための複数の命令を記憶するコンピュータ可読媒体を含む。
した方法のいずれかの動作を実行するようにコンピュータシステムを制御するための複数の命令を記憶するコンピュータ可読媒体を含む。
【0023】
いくつかの実施形態では、上述したコンピュータ製品と、コンピュータ可読媒体に記憶された命令を実行するための１つ以上のプロセッサとを含むシステムが提供される。
【図面の簡単な説明】
【0024】
本発明の新規の特徴は、以下の特許請求の範囲に具体的に記載されている。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明、およびその添付の図面を参照することによって得られるであろう：
【0025】
【図1】本発明の１つ以上の態様を実施するように構成されたコンピュータシステムの一実施形態を示すブロック図である。
【図2A】純粋な汚染されていないサンプルにおける代替対立遺伝子頻度が以下の３つのレベル付近に集中する傾向があることを示している：０．０（ＡＡ）、０．５（Ａａ）、１．０（ａａ）。
【図2B】純粋な汚染されていないサンプルにおける代替対立遺伝子頻度が以下の３つのレベル付近に集中する傾向があることを示している：０．０（ＡＡ）、０．５（Ａａ）、１．０（ａａ）。
【図3A】純粋なサンプルに対する低範囲の代替対立遺伝子頻度における頻度分布を示している。
【図3B】純粋なサンプルに対する低範囲の代替対立遺伝子頻度における頻度分布を示している。
【図3C】純粋なサンプルに対する低範囲の代替対立遺伝子頻度における頻度分布を示している。
【図4A】汚染されたサンプルに対する低範囲の代替対立遺伝子頻度における頻度分布を示している。
【図4B】汚染されたサンプルに対する低範囲の代替対立遺伝子頻度における頻度分布を示している。
【図4C】汚染されたサンプルに対する低範囲の代替対立遺伝子頻度における頻度分布を示している。
【図4D】汚染されたサンプルに対する低範囲の代替対立遺伝子頻度における頻度分布を示している。
【図5A】標的キットパネルのシミュレーションの結果を示している。
【図5B】標的キットパネルのシミュレーションの結果を示している。
【図5C】標的キットパネルのシミュレーションの結果を示している。
【図5D】拡張キットパネルのシミュレーションの結果を示している。
【図5E】拡張キットパネルのシミュレーションの結果を示している。
【図5F】拡張キットパネルのシミュレーションの結果を示している。
【図5G】監視キットパネルのシミュレーションの結果を示している。
【図5H】監視キットパネルのシミュレーションの結果を示している。
【図5I】監視キットパネルのシミュレーションの結果を示している。
【図6】汚染されたサンプルに対する低範囲の代替対立遺伝子頻度の分布を示すヒストグラムを示している。
【図7A】予測された汚染レベルの平均を示している。
【図7B】１０００個のブートストラップを使用した信頼性レベルを示している。
【図8A】典型的なカバレッジ深度にシーケンシングされた単一の汚染源を有する１０００個の合成サンプルからの性能を示している。
【図8B】低い汚染レベル（１％未満の汚染）における１０，０００個のサンプルのシーケンシングカバレッジを増加させる効果を示している。
【図8C】低い汚染レベル（１％未満の汚染）における１０，０００個のサンプルのシーケンシングカバレッジを増加させる効果を示している。
【図8D】低い汚染レベル（１％未満の汚染）における１０，０００個のサンプルのシーケンシングカバレッジを増加させる効果を示している。
【図8E】低い汚染レベル（１％未満の汚染）における１０，０００個のサンプルのシーケンシングカバレッジを増加させる効果を示している。
【図8F】低い汚染レベル（１％未満の汚染）における１０，０００個のサンプルのシーケンシングカバレッジを増加させる効果を示している。
【図9A】典型的なカバレッジ深度にシーケンシングされた５つの汚染源を有する方法の性能を示している。
【図9B】５つの汚染源の汚染の合計が１％未満である１００００個の合成サンプルに対するシーケンシング深度の変化の効果を示している。
【図9C】５つの汚染源の汚染の合計が１％未満である１００００個の合成サンプルに対するシーケンシング深度の変化の効果を示している。
【図9D】５つの汚染源の汚染の合計が１％未満である１００００個の合成サンプルに対するシーケンシング深度の変化の効果を示している。
【図9E】５つの汚染源の汚染の合計が１％未満である１００００個の合成サンプルに対するシーケンシング深度の変化の効果を示している。
【図9F】５つの汚染源の汚染の合計が１％未満である１００００個の合成サンプルに対するシーケンシング深度の変化の効果を示している。
【図10】予測された汚染レベルが指定された汚染レベルに十分に対応し、０．９４のピアソン相関係数を有することを示している。
【発明を実施するための形態】
【0026】
サンプルの交差汚染の特定は、全ての次世代シーケンシング（ＮＧＳ）用途、特に、がん検出および／または分析などの様々な用途のための液体生検のように、低頻度でサンプル中に存在する体細胞変異または任意の他のバリアントの検出を目的とするものにおいて重要である。そのような用途では、汚染は、例えば、患者が不必要な処置を受けたり、非有効性もしくは準最適な薬物を処方されたりすることをもたらすことにより、重要な突然変異の偽陽性結果をもたらし、患者に害をもたらす可能性がある。しかしながら、サンプル間汚染を検出する方法は、パブリックドメインではほとんど利用できない。ここでは、本発明者らは、汚染を検出し、液体生検サンプルの点推定値および信頼区間の双方として汚染レベルを報告するためのベータ混合モデリングに基づく統計的手法を説明する。本発明者らは、インシリコシミュレーションおよびインビトロ汚染スパイクサンプルの双方によって本発明者らの方法を検証する。本発明者らは、液体生検サンプルに焦点を当てているが、任意の一般的なＮＧＳ用途に対して僅かな変更を除けば同じ戦略が適用可能である。例えば、生検からの組織サンプルは、本明細書に記載のシステムおよび方法にしたがって使用されることができる。
【0027】
Ｉ．次世代シーケンシング技術
上に示したように、調製された目的の核酸分子（例えば、シーケンシングライブラリ）は、複数のマイクロサテライト遺伝子座のシーケンシングリードを決定するための手順の一部として、シーケンシングアッセイを使用してシーケンシングされる。多くのシーケンシング技術またはシーケンシングアッセイのいずれかが利用されることができる。本明細書で使用される「次世代シーケンシング（ＮＧＳ）」という用語は、クローンで増幅された分子および単一の核酸分子の超並列シーケンシングを可能にするシーケンシング方法を指す。
上に示したように、調製された目的の核酸分子（例えば、シーケンシングライブラリ）は、複数のマイクロサテライト遺伝子座のシーケンシングリードを決定するための手順の一部として、シーケンシングアッセイを使用してシーケンシングされる。多くのシーケンシング技術またはシーケンシングアッセイのいずれかが利用されることができる。本明細書で使用される「次世代シーケンシング（ＮＧＳ）」という用語は、クローンで増幅された分子および単一の核酸分子の超並列シーケンシングを可能にするシーケンシング方法を指す。
【0028】
本明細書に開示される方法での使用に適した配列アッセイの非限定的な例は、ナノポアシーケンシング（米国特許出願公開第２０１３／０２４４３４０号明細書、第２０１３／
０２６４２０７号明細書、第２０１４／０１３４６１６号明細書、第２０１５／０１１９２５９号明細書および第２０１５／０３３７３６６号明細書）、サンガーシーケンシング、キャピラリーアレイシーケンシング、熱サイクルシーケンシング（Ｓｅａｒｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１３：６２６－６３３（１９９２））、固相シーケンシング（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，３：３９－４２（１９９２））、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ；Ｆｕら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１６：３８１－３８４（１９９８））などの質量分析によるシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング（Ｄｒｍａｎａｃら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１６：５４－５８（１９９８）、限定されないが、合成によるシーケンシング（例えば、ＨｉＳｅｑ（商標）、ＭｉＳｅｑ（商標）、またはＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ、それぞれＩｌｌｕｍｉｎａより入手可能）を含むＮＧＳ法、ライゲーションによるシーケンシング（例えば、ＳＯＬｉＤ（商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、イオン半導体シーケンシング（例えば、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびＳＭＲＴ（登録商標）シーケンシング（例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含む。
０２６４２０７号明細書、第２０１４／０１３４６１６号明細書、第２０１５／０１１９２５９号明細書および第２０１５／０３３７３６６号明細書）、サンガーシーケンシング、キャピラリーアレイシーケンシング、熱サイクルシーケンシング（Ｓｅａｒｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１３：６２６－６３３（１９９２））、固相シーケンシング（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，３：３９－４２（１９９２））、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ；Ｆｕら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１６：３８１－３８４（１９９８））などの質量分析によるシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング（Ｄｒｍａｎａｃら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１６：５４－５８（１９９８）、限定されないが、合成によるシーケンシング（例えば、ＨｉＳｅｑ（商標）、ＭｉＳｅｑ（商標）、またはＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ、それぞれＩｌｌｕｍｉｎａより入手可能）を含むＮＧＳ法、ライゲーションによるシーケンシング（例えば、ＳＯＬｉＤ（商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、イオン半導体シーケンシング（例えば、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびＳＭＲＴ（登録商標）シーケンシング（例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含む。
【0029】
市販のシーケンシング技術は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サニーベール）のハイブリダイゼーションによるシーケンシングプラットフォーム、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａ（カリフォルニア州サンディエゴ）およびＨｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）の合成によるシーケンシングプラットフォーム、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州フォスターシティ）のライゲーションによるシーケンシングプラットフォームを含む。他のシーケンシング技術は、限定されないが、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ技術（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、およびナノポアシーケンシング（カリフォルニア州サンタクララのＲｏｃｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＳｏｌｕｔｉｏｎｓのＧｅｎｉａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（英国オックスフォード）を含む。
【0030】
ＩＩ．アルゴリズムを実装するための例示的なコンピュータシステム
本明細書に記載のアルゴリズムは、コンピュータシステム上に実装されることができる。例えば、図１は、本発明の１つ以上の態様を実装するように構成されたコンピュータシステム１００の一実施形態を示すブロック図である。図示のように、コンピュータシステム１００は、限定されないが、メモリブリッジ１０５および通信経路１１３を介して並列処理サブシステム１１２に結合された中央処理装置（ＣＰＵ）１０２およびシステムメモリ１０４を含む。メモリブリッジ１０５は、通信経路１０６を介してＩ／Ｏ（入力／出力）ブリッジ１０７にさらに結合され、Ｉ／Ｏブリッジ１０７は、スイッチ１１６に結合される。
本明細書に記載のアルゴリズムは、コンピュータシステム上に実装されることができる。例えば、図１は、本発明の１つ以上の態様を実装するように構成されたコンピュータシステム１００の一実施形態を示すブロック図である。図示のように、コンピュータシステム１００は、限定されないが、メモリブリッジ１０５および通信経路１１３を介して並列処理サブシステム１１２に結合された中央処理装置（ＣＰＵ）１０２およびシステムメモリ１０４を含む。メモリブリッジ１０５は、通信経路１０６を介してＩ／Ｏ（入力／出力）ブリッジ１０７にさらに結合され、Ｉ／Ｏブリッジ１０７は、スイッチ１１６に結合される。
【0031】
動作中、Ｉ／Ｏブリッジ１０７は、入力装置１０８（例えば、キーボード、マウス、ビデオ／画像キャプチャ装置など）からユーザ入力情報を受信し、通信経路１０６およびメモリブリッジ１０５を介して処理するために入力情報をＣＰＵ１０２に転送するように構成される。いくつかの実施形態では、入力情報は、物体検出動作が実行されるデジタル記憶媒体に記憶されたカメラ／画像キャプチャ装置からのライブフィードまたはビデオデータである。スイッチ１１６は、Ｉ／Ｏブリッジ１０７と、ネットワークアダプタ１１８ならびに様々なアドインカード１２０および１２１などのコンピュータシステム１００の他の構成要素との間の接続を提供するように構成される。
【0032】
同様に示されるように、Ｉ／Ｏブリッジ１０７は、ＣＰＵ１０２および並列処理サブシステム１１２によって使用されるコンテンツおよびアプリケーションおよびデータを記憶
するように構成され得るシステムディスク１１４に結合される。一般的な問題として、システムディスク１１４は、アプリケーションおよびデータのための不揮発性記憶装置を提供し、固定または取り外し可能なハードディスクドライブ、フラッシュメモリ装置、およびＣＤ－ＲＯＭ（コンパクトディスク読み出し専用メモリ）、ＤＶＤ－ＲＯＭ（デジタル多用途ディスク－ＲＯＭ）、ブルーレイ、ＨＤ－ＤＶＤ（高精細ＤＶＤ）、または他の磁気、光学、もしくは固体記憶装置を含むことができる。最後に、明示的に示されていないが、ユニバーサルシリアルバスまたは他のポート接続、コンパクトディスクドライブ、デジタル多用途ディスクドライブ、フィルム記録装置などの他の構成要素もＩ／Ｏブリッジ１０７に接続され得る。
するように構成され得るシステムディスク１１４に結合される。一般的な問題として、システムディスク１１４は、アプリケーションおよびデータのための不揮発性記憶装置を提供し、固定または取り外し可能なハードディスクドライブ、フラッシュメモリ装置、およびＣＤ－ＲＯＭ（コンパクトディスク読み出し専用メモリ）、ＤＶＤ－ＲＯＭ（デジタル多用途ディスク－ＲＯＭ）、ブルーレイ、ＨＤ－ＤＶＤ（高精細ＤＶＤ）、または他の磁気、光学、もしくは固体記憶装置を含むことができる。最後に、明示的に示されていないが、ユニバーサルシリアルバスまたは他のポート接続、コンパクトディスクドライブ、デジタル多用途ディスクドライブ、フィルム記録装置などの他の構成要素もＩ／Ｏブリッジ１０７に接続され得る。
【0033】
様々な実施形態では、メモリブリッジ１０５は、ノースブリッジチップであってもよく、Ｉ／Ｏブリッジ１０７は、サウスブリッジチップであってもよい。さらに、通信経路１０６および１１３、ならびにコンピュータシステム１００内の他の通信経路は、限定されないが、ＡＧＰ（Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｐｏｒｔ）、ＨｙｐｅｒＴｒａｎｓｐｏｒｔ、または当該技術分野で知られている任意の他のバスもしくはポイントツーポイント通信プロトコルを含む、任意の技術的に適切なプロトコルを使用して実装されてもよい。
【0034】
いくつかの実施形態では、並列処理サブシステム１１２は、任意の従来の陰極線管、液晶ディスプレイ、発光ダイオードディスプレイなどとすることができる表示装置１１０に画素を供給するグラフィックスサブシステムを含む。そのような実施形態では、並列処理サブシステム１１２は、例えばビデオ出力回路を含む、グラフィックおよびビデオ処理に最適化された回路を組み込む。そのような回路は、並列処理サブシステム１１２内に含まれる１つ以上の並列処理ユニット（ＰＰＵ）にわたって組み込まれてもよい。他の実施形態では、並列処理サブシステム１１２は、汎用および／または計算処理に最適化された回路を組み込む。同様に、そのような回路は、そのような汎用および／または計算動作を実行するように構成された並列処理サブシステム１１２内に含まれる１つ以上のＰＰＵにわたって組み込まれてもよい。さらに他の実施形態では、並列処理サブシステム１１２内に含まれる１つ以上のＰＰＵは、グラフィックス処理、汎用処理、および計算処理動作を実行するように構成されてもよい。システムメモリ１０４は、並列処理サブシステム１１２内の１つ以上のＰＰＵの処理動作を管理するように構成された少なくとも１つのデバイスドライバ１０３を含む。システムメモリ１０４はまた、ＣＰＵ１０２上で実行され、ＰＰＵの動作を制御するコマンドを発行することができるソフトウェアアプリケーション１２５を含む。
【0035】
様々な実施形態では、並列処理サブシステム１１２は、図１の１つ以上の他の要素と統合されて単一のシステムを形成してもよい。例えば、並列処理サブシステム１１２は、単一チップ上のＣＰＵ１０２および他の接続回路と統合されて、システムオンチップ（ＳｏＣ）を形成することができる。
【0036】
本明細書に示されるシステムは例示的なものであり、変形および変更が可能であることが理解されよう。ブリッジの数および配置、ＣＰＵ１０２の数、および並列処理サブシステム１１２の数を含む接続トポロジは、必要に応じて変更されてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、システムメモリ１０４は、メモリブリッジ１０５を介さずに直接ＣＰＵ１０２に接続することができ、他の装置は、メモリブリッジ１０５およびＣＰＵ１０２を介してシステムメモリ１０４と通信する。他の代替的なトポロジでは、並列処理サブシステム１１２は、Ｉ／Ｏブリッジ１０７に、またはメモリブリッジ１０５ではなくＣＰＵ１０２に直接接続されてもよい。さらに他の実施形態では、Ｉ／Ｏブリッジ１０７およびメモリブリッジ１０５は、１つ以上の個別の装置として存在する代わりに、単一チップに統合されてもよい。最後に、特定の実施形態では、図１に示す１つ以上の構成要素は存在
しなくてもよい。例えば、スイッチ１１６は排除することができ、ネットワークアダプタ１１８およびアドインカード１２０、１２１は、Ｉ／Ｏブリッジ１０７に直接接続する。
しなくてもよい。例えば、スイッチ１１６は排除することができ、ネットワークアダプタ１１８およびアドインカード１２０、１２１は、Ｉ／Ｏブリッジ１０７に直接接続する。
【0037】
ＩＩＩ．汚染検出
いくつかの実施形態では、サンプル汚染は、以下によって検出されることができる：（１）特定のバリアントベースのアッセイのための共通の一塩基バリアント（ＳＮＶ）のセットを識別すること、（２）識別された共通のＳＮＶのセットに対する代替対立遺伝子頻度を計算すること、（３）局所外れ値因子（ＬＯＦ）を有する外れ値部位（例えば、シーケンシングエラーおよび体細胞変異）を除去すること、（４）代替対立遺伝子頻度にクラスタリングモデル（すなわち、ベータ混合モデル）を当てはめて、背景サンプルおよび前景汚染をモデル化すること、および（５）当てはめられたクラスタリングモデルから汚染レベルの点推定値を推論し、非パラメトリックブートストラップから信頼区間を取得すること。
いくつかの実施形態では、サンプル汚染は、以下によって検出されることができる：（１）特定のバリアントベースのアッセイのための共通の一塩基バリアント（ＳＮＶ）のセットを識別すること、（２）識別された共通のＳＮＶのセットに対する代替対立遺伝子頻度を計算すること、（３）局所外れ値因子（ＬＯＦ）を有する外れ値部位（例えば、シーケンシングエラーおよび体細胞変異）を除去すること、（４）代替対立遺伝子頻度にクラスタリングモデル（すなわち、ベータ混合モデル）を当てはめて、背景サンプルおよび前景汚染をモデル化すること、および（５）当てはめられたクラスタリングモデルから汚染レベルの点推定値を推論し、非パラメトリックブートストラップから信頼区間を取得すること。
【0038】
本明細書に記載の結果は、ベータ混合モデルを使用しているが、他のクラスタリングモデルも同様に使用されることができる。例えば、接続性モデル、セントロイドモデル、分布モデル（すなわち、混合モデル）、部分空間モデル、群モデル、グラフベースモデル、署名グラフモデル、およびニューラルモデルもまた使用されることができる。
【0039】
ヒトは二倍体であることから、純粋な汚染されていないサンプルにおける代替対立遺伝子頻度は、以下の３つのレベル付近に集中する傾向がある：図２Ａおよび図２Ｂに示すように、０．０（ＡＡ）、０．５（Ａａ）、１．０（ａａ）。標的被験者からのサンプルが非標的被験者からのサンプルによって汚染されている場合（すなわち、汚染物質被験者）、汚染被験者からのＡａおよびａａ ＳＮＶは、０．０の予想レベルを有するＡＡ遺伝子座について標的被験者の代替対立遺伝子頻度を０よりも上にシフトさせる。要するに、０からのこれらの偏差は、汚染を検出することを可能にする。
【0040】
いくつかの実施形態では、図３Ａ～図３Ｃおよび図４Ａ～図４Ｄに示すように、汚染されたサンプルから純粋な汚染されていないサンプルを識別するために、低範囲の代替対立遺伝子頻度（すなわち、約２５、２０、１５、１０、または５％未満）が分析されることができる。図３Ａ～図３Ｃは、純粋なサンプルに対する低範囲の代替対立遺伝子頻度における頻度分布を示している。図３Ａ～図３Ｃに見られるように、低頻度範囲のごく僅かなＳＮＶしか純粋なサンプルの予想される０．０値から逸脱していない。対照的に、汚染されたサンプルについて図４Ａ～図４Ｄに示すように、低頻度範囲のＳＮＶは、予想される０．０値から著しく多く逸脱している。
【0041】
他の実施形態では、高範囲の代替対立遺伝子頻度（すなわち、約７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％よりも大きい）が分析されることができる。他の実施形態では、中間範囲の代替対立遺伝子頻度（すなわち、約２５％から７５％、３０％から７０％、３５％から６５％、４０％から６０％、または４５％から５５％）が分析されることができる。他の実施形態では、汚染されたサンプルから純粋な汚染されていないサンプルを識別するために、低範囲、中間範囲、および高範囲の代替対立遺伝子頻度の任意の組み合わせが分析されることができる。換言すれば、いくつかの実施形態では、０から１００％の全頻度範囲、または全頻度範囲の任意の部分または部分の組み合わせが使用されることができる。
【0042】
モデルを構築するために、本発明者らは、１０００個のゲノムプロジェクト（ＴＧＰ）データを使用して、０．５％を超えるが９９．５％未満の集団代替対立遺伝子頻度を有する共通のＳＮＶを識別および選択した。その結果、本発明者らは、Ｔａｒｇｅｔｅｄ，Ｅｘｐａｎｄｅｄ ａｎｄ Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ Ａｖｅｎｉｏ（登録商標） ｃｔ
ＤＮＡ分析キット液体生検パネル内の２８５、８６８、および７０７個の共通のＳＮＶを選択した。６２５人の関連する被験者がモデルのＴＧＰから選択され、その選択は、以下の米国人口を反映するように行われた：白人（６８．２％）、ヒスパニックまたはラテン系人（１５．４％）、黒人（１１．９％）、およびアジア人（４．５％）。他の実施形態では、モデルのために選択された人口は、国、州、郡、省、地域、大陸などの人口を表すことができる。選択のために考慮される要因は、例えば、人種、民族、性別、年齢、および／または場所を含むことができる。いくつかの実施形態では、モデルに対して少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００個のＳＮＶが選択される。いくつかの実施形態では、モデルに対して最大１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００個のＳＮＶが選択される。いくつかの実施形態では、より多くの遺伝子をカバーするより多くのシーケンシングデータを提供するより大きなパネルは、モデルに対して選択されることができるより多くのＳＮＶをもたらす。いくつかの実施形態では、パネルは、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００個の遺伝子をカバーする。いくつかの実施形態では、パネルは、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００個までの遺伝子をカバーする。いくつかの実施形態では、より大きなパネルは、ＳＮＶの選択基準を厳しくすることを可能にする。例えば、５から９５％、１０から９０％、１５から８５％、２０から８０％、２５から７５％、３０から７０％、３５から６５％、４０から６０％、または４５から５５％の集団代替対立遺伝子頻度を有する共通のＳＮＶがモデルのために選択され、十分な数のＳＮＶをもたらすことができる。いくつかの実施形態では、集団代替頻度範囲は、パネルのサイズに基づいて決定されることができる。
ＤＮＡ分析キット液体生検パネル内の２８５、８６８、および７０７個の共通のＳＮＶを選択した。６２５人の関連する被験者がモデルのＴＧＰから選択され、その選択は、以下の米国人口を反映するように行われた：白人（６８．２％）、ヒスパニックまたはラテン系人（１５．４％）、黒人（１１．９％）、およびアジア人（４．５％）。他の実施形態では、モデルのために選択された人口は、国、州、郡、省、地域、大陸などの人口を表すことができる。選択のために考慮される要因は、例えば、人種、民族、性別、年齢、および／または場所を含むことができる。いくつかの実施形態では、モデルに対して少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００個のＳＮＶが選択される。いくつかの実施形態では、モデルに対して最大１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００個のＳＮＶが選択される。いくつかの実施形態では、より多くの遺伝子をカバーするより多くのシーケンシングデータを提供するより大きなパネルは、モデルに対して選択されることができるより多くのＳＮＶをもたらす。いくつかの実施形態では、パネルは、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００個の遺伝子をカバーする。いくつかの実施形態では、パネルは、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００個までの遺伝子をカバーする。いくつかの実施形態では、より大きなパネルは、ＳＮＶの選択基準を厳しくすることを可能にする。例えば、５から９５％、１０から９０％、１５から８５％、２０から８０％、２５から７５％、３０から７０％、３５から６５％、４０から６０％、または４５から５５％の集団代替対立遺伝子頻度を有する共通のＳＮＶがモデルのために選択され、十分な数のＳＮＶをもたらすことができる。いくつかの実施形態では、集団代替頻度範囲は、パネルのサイズに基づいて決定されることができる。
【0043】
いくつかの実施形態では、本方法は、有益な遺伝子座をモデル化するために、液体生検サンプルにおいて検出されたより低範囲の代替対立遺伝子頻度（≦２５％）を使用する。ランダムな標的被験者およびランダムな汚染被験者が選択された各パネルの１０，０００のシミュレーションに基づいて、本発明者らは、平均して、３つのパネルのそれぞれを使用して処理された単一の汚染源を有するサンプルにおいて２１個（標的キット）、７０個（拡張キット）、および５４個（監視キット）の有益なＳＮＶを予想することを示している。５Ａ～図５Ｃは、標的キットパネルのシミュレーションの結果を示している。図５Ｄ～図５Ｆは、拡張キットパネルのシミュレーションの結果を示している。図５Ｇ～図５Ｉは、監視キットパネルのシミュレーションの結果を示している。いくつかの実施形態では、単一の汚染源を有するサンプルにおける分析のために選択されたＳＮＶの総数のうち、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００個の有益なＳＮＶが存在する。
【0044】
次いで、本発明者らは、有益なＳＮＶの代替対立遺伝子頻度を判定し、汚染検出のために３成分ベータ混合モデルを使用してそれらをモデル化する。一般的なベータ混合モデル確率密度関数は、以下の形式を有する：
【0045】
ｆ（ｘ｜π１，π２，α０，β０，α１，β１，α２，β２）＝（１－π１－π２）Ｂｅｔａ（ｘ｜α０，β０）＋π１Ｂｅｔａ（ｘ｜α１，β１）＋π２Ｂｅｔａ（ｘ｜α２，β２）
【0046】
低代替対立遺伝子頻度範囲のヒストグラムプロットは、純粋なサンプルについては０．０（図示せず）に単一のピークのみを有するが、汚染されたサンプルは、単一の汚染源を
仮定すると、図６に示すように、０．０（ＡＡ）のピークを含む２から３つのピークを有することになる。ＳＮＶが独立しており、ただ１つの汚染源であると仮定すると、モデルは、合計で以下の３つのベータ成分を有することになる：（１）背景ＡＡ＋汚染（ＡＡ）、（２）背景ＡＡ＋汚染Ａａ、および（３）背景ＡＡ＋汚染ａａ。
仮定すると、図６に示すように、０．０（ＡＡ）のピークを含む２から３つのピークを有することになる。ＳＮＶが独立しており、ただ１つの汚染源であると仮定すると、モデルは、合計で以下の３つのベータ成分を有することになる：（１）背景ＡＡ＋汚染（ＡＡ）、（２）背景ＡＡ＋汚染Ａａ、および（３）背景ＡＡ＋汚染ａａ。
【0047】
各ＳＮＶは独立しており、各ＳＮＶは同じ深度（Ｎ、選択された部位にわたる平均シーケンシング深度として計算される）でシーケンシングされ、１つの汚染源しか存在しないと仮定する。したがって、以下の簡略化が使用されて、モデル内のパラメータの数を減らすことができる：（１）図６に０．０の代替対立遺伝子頻度（すなわち、汚染ＡＡを伴う背景ＡＡ）において示される第１のベータ成分は、α０＝１、β０＝１０４によって直接パラメータ化される。本発明者らは、ディラックデルタ分布の代理として、鋭いスパイク（β０＝１０４）を有する厳密に減少する分布（α０＝１）を予想するが、シーケンシング誤差も可能にする。（２）第２のベータ成分は、背景ＡＡおよび汚染Ａａに対応する。この成分に属する各ＳＮＶについて予想される代替対立遺伝子の数は、α１としてパラメータ化され、部位あたりの対立遺伝子の総数は、選択された全てのＳＮＰの平均カバレッジ深度Ｎに設定される。各ＳＮＶは、同じ深度でシーケンシングされる。同様に、α１＋β１＝α２＋β２＝Ｎであり、Ｎは、サンプルごとに選択された全てのＳＮＶにわたる平均カバレッジ深度として計算される。（３）第３のベータ成分は、背景ＡＡおよび汚染ａａに対応する。ａａは、２つの代替対立遺伝子を有するため、この成分に属する各ＳＮＰについて予想される代替対立遺伝子の数は２α１であり、部位あたりの対立遺伝子の総数は、Ｎのままである。最尤推定が使用されて、ベータ混合モデルを代替対立遺伝子頻度に当てはめる。換言すれば、ホモ接合汚染分布（ａａ）の中心は、ヘテロ接合汚染分布（Ａａ）の中心の２倍であり、または２つの代替対立遺伝子のためにα２＝２１である。
【0048】
上記の簡略化により、自由パラメータの数は、８から３に減少し、一般的なベータ混合モデルは、以下の式に簡略化される：
【0049】
ｆ（ｘ｜π１，π２，α１）＝（１－π１－π２）Ｂｅｔａ（ｘ｜１，１０４）＋π１Ｂｅｔａ（ｘ｜α１，Ｎ－α１）＋π２Ｂｅｔａ（ｘ｜２α１，Ｎ－２α１）ｆ（ｘ｜π１，π２，α１）＝（１－π１－π２）Ｂｅｔａ（ｘ｜１，１０４）＋π１Ｂｅｔａ（ｘ｜α１，Ｎ－α１）＋π２Ｂｅｔａ（ｘ｜２α１，Ｎ－２α１）
【0050】
尤度関数
が使用されて、準ニュートン法（すなわち、束縛制約を有する限られたメモリのブロイデン・フレッチャー・ゴールドファーブ・シャンノアルゴリズム）を使用して、最大尤度を有するベータ混合モデルのパラメータπ１、π２、α１を推定または決定することができる。複数の初期化が使用されて、極大値を回避することができる。
【数1】
【0051】
最尤推定方法は、外れ値（例えば、シーケンシングエラーおよび体細胞変異）に敏感であるため、本発明者らは、モデル当てはめの前に局所外れ値因子（ＬＯＦ）を使用して外れ値を除去し、汚染レベルのより堅牢な推定をもたらす。ＬＯＦは、そのｋ個の最近傍と比較した点の局所密度（ｌｒｄ）を測定する。
【0052】
【数2】
【0053】
ＬＯＦ＞１は、点Ａの局所密度がその近傍の平均局所密度よりも小さく、Ａが潜在的に外れ値であることを示すことを意味する。本発明者らは、ｋ＝５およびＬＯＦのカットオフ＝３を使用する。
【0054】
いくつかの実施形態では、外れ値検出の他の方法が可能である。例えば、いくつかの実施形態では、外れ値検出方法は、単変量または多変量とすることができる。いくつかの実施形態では、外れ値検出方法は、パラメトリックまたは非パラメトリックとすることができる。いくつかの実施形態では、外れ値検出方法は、ｚスコアまたは極値解析（パラメトリック）、確率的および統計的モデリング（パラメトリック）、線形回帰モデル、近接ベースモデル、情報理論モデル、高次元外れ値検出方法、ニューラルネットワーク、ベイジアンネットワーク、隠れマルコフモデル、ファジー論理ベース方法、および／またはアンサンブル技術とすることができる。
【0055】
次いで、汚染レベルの点推定値は、２α１／Ｎ（すなわち、第３のベータ成分の平均、ホモ接合汚染分布ａａ）と推定される。図７Ａは、この例では、指定された汚染レベル（０．５％）が予測された汚染レベル（０．５４％）と一致することを示している。汚染レベルの信頼区間は、ＳＮＶ部位（すなわち、非パラメトリックブートストラップ）およびそれらの対応する代替対立遺伝子頻度をブートストラップすることによって構築される。図７Ｂは、１０００個のブートストラップによって、この例の汚染レベルの９０％信頼区間が（０．４９％，０．６３％）であることを示している。シーケンシングエラーが存在する場合、本発明者らの方法の検出の理論的限界は、少なくとも２／Ｎ（または部位あたり最大１つのシーケンシングエラーの場合、α１＝１）である。この限界は、部位あたりのシーケンシングエラーの数が大きくなると大きくなる（すなわち、シーケンシング誤り率がより大きくなる）。より保守的で偽陽性の結果を少なくするために、本発明者らは、４／Ｎよりも大きい予測汚染レベルのみを報告する。いくつかの実施形態では、少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、または１００００個のブートストラップが信頼区間を生成するために使用される。
【0056】
ＴＧＰからの３０，０００個のインシリコ合成サンプルの包括的シミュレーション研究は、シーケンシング深度が増加するにつれて方法の性能が増加し、拡張Ａｖｅｎｉｏキットからの深くシーケンシングされたサンプルについて、それぞれ０．０２％および０．０９％という低い偽陽性率および検出限界を達成することを実証している（表１）。標的個体および汚染個体（１つの汚染源）は、ここでも１０００個のゲノムプロジェクトからの選択された集団からのサンプルである。本発明者らは、二項分布を有する各ＳＮＶの代替対立遺伝子の数（ｎ）を合成する。
【0057】
【数3】
【0058】
ここで、Ｎは、全ての部位の平均シーケンシング深度であり、ｐは、汚染レベルおよび
特定の部位に基づく理論的な代替対立遺伝子頻度である。ｐ＝０または１について、本発明者らは、シーケンシングエラーを説明するために、ｐ＝２×１０－５または１－２×１０－５に調整する。次いで、各部位の代替対立遺伝子頻度が計算される。より一般的には、シーケンシングエラーを説明するために、ｐは、システムの予想されるシーケンシングエラーの大きさに対応する量だけ調整されることができる。いくつかの実施形態では、これは、コンセンサスシーケンシングエラーとすることができる。
特定の部位に基づく理論的な代替対立遺伝子頻度である。ｐ＝０または１について、本発明者らは、シーケンシングエラーを説明するために、ｐ＝２×１０－５または１－２×１０－５に調整する。次いで、各部位の代替対立遺伝子頻度が計算される。より一般的には、シーケンシングエラーを説明するために、ｐは、システムの予想されるシーケンシングエラーの大きさに対応する量だけ調整されることができる。いくつかの実施形態では、これは、コンセンサスシーケンシングエラーとすることができる。
【0059】
いくつかの実施形態では、シーケンシング深度カバレッジは、２５ｘ未満、５０ｘ未満、７５ｘ未満、１００ｘ未満、２００ｘ未満、３００ｘ未満、４００ｘ未満、５００ｘ未満、６００ｘ未満、７００ｘ未満、８００ｘ未満、９００ｘ未満、１０００ｘ未満、２０００ｘ未満、３０００ｘ未満、４０００ｘ未満、５０００ｘ未満、６０００ｘ未満、７０００ｘ未満、８０００ｘ未満、９０００ｘ未満、または１００００ｘ未満である。いくつかの実施形態では、カバレッジは、少なくとも２５ｘ、５０ｘ、７５ｘ、１００ｘ、２００ｘ、３００ｘ、４００ｘ、５００ｘ、６００ｘ、７００ｘ、８００ｘ、９００ｘ、１０００ｘ、２０００ｘ、３０００ｘ、４０００ｘ、５０００ｘ、６０００ｘ、７０００ｘ、８０００ｘ、９０００ｘ、または１００００ｘである。
【0060】
いくつかの実施形態では、合成データは、０から５０％の汚染の間の様々な汚染レベルのサンプルを含む。５０％を超える汚染では、背景汚染が前景になるため、５０％を超える汚染レベルをシミュレートする必要はない。いくつかの実施形態では、シミュレートされた汚染レベルは、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満である。図８Ａは、典型的なカバレッジ深度にシーケンシングされた単一の汚染源を有する１０００個の合成サンプルからの性能を示している。
【0061】
汚染レベルが低い場合（すなわち、１％未満）、図８Ｂ～図８Ｆに示すように、シーケンシングカバレッジが約２０００ｘ未満になると性能が低下し始める。図８Ｂ～図８Ｆは、低い汚染レベル（１％未満の汚染）における１０，０００個のサンプルのシーケンシングカバレッジを増加させる効果を示している。
【0062】
複数の汚染源の場合、モデルの１つの仮定（すなわち、１つの汚染源）に違反しているが、本方法は、予測される汚染レベルよりも低い汚染サンプルにさらにフラグを立てることができる。複数の汚染源に対する本方法の性能を評価するために、５つの汚染源を有する１０００個の合成サンプルデータが生成され、各汚染源からの汚染レベルがランダム化され、５つの汚染源からの総汚染レベルを合計０から５０％とした。図９Ａは、典型的なカバレッジ深度にシーケンシングされた５つの汚染源を有する方法の性能を示している。図９Ｂ～図９Ｆは、５つの汚染源の汚染の合計が１％未満である１００００個の合成サンプルに対するシーケンシング深度の変化の効果を示している。ここでも、シーケンシングカバレッジが２０００ｘ未満になると、性能が低下し始める。
【0063】
本発明者らの提案する方法は、サンノゼのＣＬＩＡ ｌａｂの拡張Ａｖｅｎｉｏキットを使用して処理した１０３個のインビトロスパイク血漿サンプル（１つの汚染源、０～８％の汚染レベル）によってさらに評価される。予測された汚染レベルは、図１０に示すように、０．９４のピアソン相関係数を有する指定された汚染レベルによく対応する。
【0064】
【表1】
【0065】
本明細書に記載の統計的方法は、シーケンシングパネル内の多数の部位について代替対立遺伝子頻度を生成する任意のパイプライン内に統合されることができる。これは、汚染されたサンプルの適切な取り扱いを特定して可能にするのに役立ち、分析結果の信頼性を大幅に高める。
【0066】
ＩＶ．処置方法
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のシステムおよび方法が使用されて、サンプル汚染からのバリアントに基づくのではなく、バリアントの正確な識別に基づいて患者の処置を導くことができる。例えば、がん薬物の投与などのがん治療は、識別されたバリアントに基づいて選択されることができる。いくつかの実施形態では、バリアントがサンプル汚染に由来するかまたは潜在的に由来すると識別されているため、特定の処置が除外されることができる。いくつかの実施形態では、サンプル汚染が検出されたときに患者が再検査され（すなわち、サンプルが再シーケンシングされる）、サンプルが汚染されていないことを再検査および／または確認した後にのみ適切な治療が選択されて与えられる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のシステムおよび方法が使用されて、サンプル汚染からのバリアントに基づくのではなく、バリアントの正確な識別に基づいて患者の処置を導くことができる。例えば、がん薬物の投与などのがん治療は、識別されたバリアントに基づいて選択されることができる。いくつかの実施形態では、バリアントがサンプル汚染に由来するかまたは潜在的に由来すると識別されているため、特定の処置が除外されることができる。いくつかの実施形態では、サンプル汚染が検出されたときに患者が再検査され（すなわち、サンプルが再シーケンシングされる）、サンプルが汚染されていないことを再検査および／または確認した後にのみ適切な治療が選択されて与えられる。
【0067】
特徴または要素が本明細書で別の特徴または要素「上」にあると言及される場合、それは、他の特徴または要素上に直接存在することができ、または介在する特徴および／または要素も存在してもよい。対照的に、特徴または要素が別の特徴または要素に「直接」あると言及される場合、介在する特徴または要素は存在しない。特徴または要素が別の特徴または要素に「接続され」、「取り付けられ」または「結合され」と言及される場合、それは他の特徴または要素に直接接続され、取り付けられ、または結合されることも可能であり、または介在する特徴または要素が存在し得ることも理解されよう。対照的に、特徴または要素が別の特徴または要素に「直接接続されている」、「直接接続されている」、または「直接結合されている」と言及される場合、介在する特徴または要素は存在しない。一実施形態に関して説明または示されているが、そのように説明または示されている特徴および要素は、他の実施形態に適用することができる。別の特徴に「隣接して」配置された構造または特徴への言及は、隣接する特徴と重複するか、またはその下にある部分を有することができることも当業者には理解されるであろう。
【0068】
本明細書に使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、本発明を限定することは意図されていない。例えば、本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数形も含むことを意図している。本明細書で使用される場合、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および／または「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、記載された特徴、ステップ、動作、要素、および／またはコンポーネントの存在を指定するが、１つ以上
の他の特徴、ステップ、動作、要素、構成要素、および／またはそれらのグループの存在または追加を排除するものではないことがさらに理解される。本明細書で使用される場合、「および／または」という用語は、関連するリストされた項目の１つ以上のありとあらゆる組み合わせを含み、「／」と省略されることができる。
の他の特徴、ステップ、動作、要素、構成要素、および／またはそれらのグループの存在または追加を排除するものではないことがさらに理解される。本明細書で使用される場合、「および／または」という用語は、関連するリストされた項目の１つ以上のありとあらゆる組み合わせを含み、「／」と省略されることができる。
【0069】
「下（ｕｎｄｅｒ）」、「下（ｂｅｌｏｗ）」、「下（ｌｏｗｅｒ）」、「上（ｏｖｅｒ）」、「上（ｕｐｐｅｒ）」などのような空間的に相対的な用語は、説明を容易にするために、ある要素または特徴と別の要素または図に示されている特徴との関係を説明するために本明細書において使用されることができる。空間的に相対的な用語は、図に示されている方向に加えて、使用中または動作中の装置の異なる方向を包含することを意図していることが理解されよう。例えば、図の装置が裏返されている場合、他の要素または特徴の「下」または「下方」として記述されている要素は、他の要素または特徴の「上」になる。したがって、「下」という例示的な用語は、上と下の双方の方向を包含することができる。装置は、他の方法で方向付けられてもよく（例えば、９０度回転または他の方向に）、本明細書で使用される空間的に相対的な記述子がそれに応じて解釈されてもよい。同様に、「上向き」、「下向き」、「垂直」、「水平」などの用語は、特に明記しない限り、説明の目的でのみ本明細書で使用される。
【0070】
「第１」および「第２」という用語は、本明細書では様々な特徴／要素（ステップを含む）を説明するために使用されることができるが、文脈が別段の指示をしない限り、これらの特徴／要素はこれらの用語によって制限されるべきではない。これらの用語は、ある特徴／要素を別の特徴／要素から区別するために使用される場合がある。したがって、以下に記載される第１の特徴／要素は、第２の特徴／要素と呼ぶことができ、同様に、以下に記載される第２の特徴／要素は、本発明の教示から逸脱することなく、第１の特徴／要素と呼ぶことができる。
【0071】
本明細書および以下の特許請求の範囲を通じて、文脈上別段の定めがない限り、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、および「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変異は、方法および物品（例えば、組成物ならびに装置および方法を含む装置）において共同で使用されることができることを意味する。例えば、用語「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、ここに記されるいずれの要素またはステップを含むことを暗示するが、いずれの他の要素またはステップを除外することを含まない、と理解される。
【0072】
実施例で使用されるものを含め、本明細書で本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、特に明示的に指定されない限り、全ての数は、その用語が明示的に表示されない場合でも、「約」または「およそ」という単語で始まるかのように読むことができる。「約」または「およそ」という句は、大きさおよび／または位置を説明するときに使用されて、説明される値および／または位置が値および／または位置の合理的な予想範囲内にあることを示すことができる。例えば、数値は、記載された値（または値の範囲）の＋／－０．１％、記載された値（または値の範囲）の＋／－１％、記載された値（または値の範囲）の＋／－２％、記載された値（または値の範囲）の＋／－５％、記載された値（または値の範囲）の＋／－１０％などの値を有することができる。本明細書に示された任意の数値はまた、文脈上別段の指示がない限り、その値をほぼ含むと理解されるべきである。例えば、値「１０」が開示されている場合、「約１０」も開示されている。本明細書に記載されている任意の数値範囲は、そこに含まれる全てのサブ範囲を含むことを意図している。また、当業者が適切に理解するように、値が「以下」であると開示される場合、「値以上」および値間の可能な範囲も開示されることも理解される。例えば、値「Ｘ」が開示される場合、「Ｘ以下」ならびに「Ｘ以上」（例えば、Ｘは数値である）も開示される。また、本特許出願全体で、データは多くの様々な形式で提供され、このデータは、終了点
と開始点、およびデータポイントの任意の組み合わせの範囲を表すことも理解される。例えば、特定のデータポイント「１０」および特定のデータポイント「１５」が開示される場合、１０および１５よりも大きい、それ以上、それよりも小さい、それ以下、およびそれに等しいことが、１０から１５の間とともに開示されていると見なされることが理解される。２つの特定のユニット間の各ユニットもまた開示されていることも理解される。例えば、１０と１５が開示されている場合、１１、１２、１３、および１４も開示される。
と開始点、およびデータポイントの任意の組み合わせの範囲を表すことも理解される。例えば、特定のデータポイント「１０」および特定のデータポイント「１５」が開示される場合、１０および１５よりも大きい、それ以上、それよりも小さい、それ以下、およびそれに等しいことが、１０から１５の間とともに開示されていると見なされることが理解される。２つの特定のユニット間の各ユニットもまた開示されていることも理解される。例えば、１０と１５が開示されている場合、１１、１２、１３、および１４も開示される。
【0073】
様々な例示的な実施形態が上に記載されているが、特許請求の範囲に記載されているように、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な実施形態にいくつかの変更を加えることができる。例えば、記載された様々な方法ステップが実行される順序は、代替の実施形態ではしばしば変更されることがあり、他の代替の実施形態では、１つ以上の方法ステップが完全にスキップされることがある。様々な装置およびシステムの実施形態の任意の特徴は、いくつかの実施形態には含めてもよく、他の実施形態には含めなくてもよい。したがって、前述の説明は、主に例示的な目的で提供されており、特許請求の範囲に記載されているように、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【0074】
本明細書に含まれる例および図は、限定ではなく例示として、主題が実施され得る特定の実施形態を示している。前述のように、他の実施形態を利用してそこから導き出すことができ、その結果、本開示の範囲から逸脱することなく、構造的および論理的な置換および変更を行うことができる。本発明の主題のそのような実施形態は、複数のものが実際に開示されている場合、単に便宜のために、そして本特許出願の範囲を任意の単一の発明または発明の概念に自発的に限定することを意図することなく、本明細書において個別にまたは集合的に「発明」という用語によって言及されることができる。したがって、特定の実施形態が本明細書で例示および説明されてきたが、同じ目的を達成するために計算された任意の構成を、示された特定の実施形態の代わりに使用することができる。本開示は、様々な実施形態のありとあらゆる適応または変形をカバーすることを意図している。上記の実施形態、および本明細書に具体的に記載されていない他の実施形態の組み合わせは、上記の説明を検討すると、当業者にとって明らかであろう。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図5G】
【図5H】
【図5I】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図8E】
【図8F】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図9E】
【図9F】
【図10】
