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▶ インテルク ペプチド セラピューティクス リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024075684
(43)【公開日】2024-06-04
(54)【発明の名称】皮膚症状を改善するためのポリペプチドおよび方法
(51)【国際特許分類】
C07K 2/00 20060101AFI20240528BHJP
C07K 7/04 20060101ALI20240528BHJP
A61K 8/64 20060101ALI20240528BHJP
A61Q 17/04 20060101ALI20240528BHJP
A61Q 19/00 20060101ALI20240528BHJP
A61Q 19/08 20060101ALI20240528BHJP
A61K 38/10 20060101ALI20240528BHJP
A61K 38/08 20190101ALI20240528BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20240528BHJP
A61P 17/16 20060101ALI20240528BHJP
A61P 17/18 20060101ALI20240528BHJP
C12N 5/07 20100101ALN20240528BHJP
【ＦＩ】
C07K2/00 ZNA
C07K7/04
A61K8/64
A61Q17/04
A61Q19/00
A61Q19/08
A61K38/10
A61K38/08
A61P17/02
A61P17/16
A61P17/18
C12N5/07
【審査請求】有
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024044194
(22)【出願日】2024-03-19
(62)【分割の表示】P 2021531079の分割
【原出願日】2019-11-29
(31)【優先権主張番号】2018904570
(32)【優先日】2018-11-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】520448360
【氏名又は名称】インテルク ペプチド セラピューティクス リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】アグレズ，マイケル
(57)【要約】 （修正有）
【課題】真皮老化を含む皮膚症状およびＵＶ曝露に関連する皮膚症状を予防および／または処置するためのポリペプチド、組成物および方法を提供する。
【解決手段】配列ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲを含むポリペプチド、およびそのペプチドの対応するデキストロ－レベルソ形（すなわち、ｒｙｌｐｎｋａｋｓｒ）が、ポリアルギニン配列領域（例えば、Ｎ－末端）と隣接する場合、種々の皮膚症状を予防または処置するのに使用することができる。
【選択図】図８
【解決手段】配列ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲを含むポリペプチド、およびそのペプチドの対応するデキストロ－レベルソ形（すなわち、ｒｙｌｐｎｋａｋｓｒ）が、ポリアルギニン配列領域（例えば、Ｎ－末端）と隣接する場合、種々の皮膚症状を予防または処置するのに使用することができる。
【選択図】図８
【特許請求の範囲】
【請求項1】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、真皮老化を含む皮膚症状およびＵＶ曝露に関連する皮膚症状を予防および／または処置するためのポリペプチド、組成物および方法に関する。
【背景技術】
【0002】
皮膚老化、皮膚損傷および皮膚創傷治癒の細胞および分子機構は、完全には理解されていない。
【0003】
皮膚老化は、弾力性の喪失、乾燥、シワおよび色素沈着に関連する。皮膚への紫外線（ＵＶ）照射、および、特に２９０～３２０ｎｍの波長を有するＵＶＢへの曝露は、早期の皮膚老化および皮膚癌の誘発を含む慢性皮膚損傷を引き起こすことが知られている。皮膚癌は、オーストラリアの医療システムに毎年７００百万ドルを超える費用がかかり、２０１８年に診断された新規皮膚癌の事例の推定数は、１３８，０００を超える。
【0004】
ＵＶＢ照射は、ＵＶＢ媒介発癌促進における機能的役割を演じるＣＯＸ－２のアップレギュレーションを伴うシクロオキシゲナーゼ－２（ＣＯＸ－２）の発現を誘導することが示されている。さらに、サイクリックＡＭＰ応答配列結合タンパク質（ＣＲＥＢ）は、リン酸化されており、ＵＶＢ処置で活性化され、ＵＶＢ誘導性ＣＯＸ－２発現の要因である。
【0005】
光損傷ＤＮＡの修復は、損傷ＤＮＡへの修復酵素のアクセスを可能にする、そのコンパクトなクロマチン構造を解いて再構築するために大量の細胞エネルギーを必要とする。細胞内のエネルギーの主源は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）である。皮膚のＵＶ放射への曝露は、皮膚をエネルギーストレスの状態に置き、ＡＴＰの生産は、一部はミトコンドリア機能を阻害する酸化的損傷のために減少する。ＡＴＰ利用可能性の減少は、また、免疫系の有効性も低減し、ＵＶ誘導性免疫抑制をもたらす。ＵＶ曝露後のこのエネルギー欠乏状態において、抗原曝露により活性化されたエフェクターおよびメモリーＴ細胞の数は、低下する。ＵＶＢの免疫抑制効果は、何十年もの間、認識されてきている。
【0006】
紫外線曝露、主にＵＶＢ曝露は、また、活性酸素種（ＲＯＳ）の増加をもたらし、順にＤＮＡなどの細胞および細胞外成分に損傷を与える。ＵＶ光子の吸収は、電子を駆動し、ポルフィリン、ビリルビン、メラニン、およびプテリンなどの細胞の光増感剤から酸素分子にエネルギーを伝達し、ラジカルである一重項Ｏ２アニオンを生成する。したがって、一重項酸素アニオンは、ＤＮＡのグアニン部分の酸化、続いて構造的再配置および８－ヒドロキシ－２－デオキシグアノシン部分（８－ＯＨｄＧ）の形成を誘導する。８－ＯＨｄＧは、最も重要なＤＮＡ付加体の１つであり、細胞老化および発癌に関連する酸化的ＤＮＡ損傷の指示体として使用される。
【0007】
さらに、ＵＶ照射は、ＤＮＡがＵＶＢ放射から光子を吸収する場合、直接ＤＮＡに作用する。これは、結果として、ＤＮＡ鎖にその後欠陥をもたらすヌクレオチドの構造的再配置となる。シクロブタン型ピリミジンダイマー（ＣＰＤ）およびピリミジン（６－４）ピリミドン（６－４光産物、６－４ＰＰ）は、ＵＶＢ誘導性ＤＮＡ損傷の主な生成物である。さらに、ＣＰＤの形状でのＵＶＢ誘導性ＤＮＡ損傷は、癌の進行をもたらす細胞（表皮細胞など）に突然変異を誘導する可能性がある。ＤＮＡ修復酵素の適用を通じたＣＰＤの減少は、ＵＶ誘導性皮膚癌およびアポトーシス性日焼け細胞の危険性を防ぐ。
【0008】
ヒト皮膚組織修復は、負傷後、皮膚（または他の臓器－組織）がそれ自身を修復する複雑なプロセスである創傷治癒として一般的に知られている。正常な皮膚において、表皮（最も外側の層）および真皮（より内側またはより深い層）は、恒常状態均衡にあり、外部環境に対して保護バリアを形成する。保護バリアが破壊されるか損傷を受けると、創傷治癒のプロセスが、すぐに発動し、重なり合う可能性があり、相互に排他的ではない３つまたは４つの連続相に分割することができ、その相は、止血、炎症、増殖および組織修復である。
【0009】
これらの相の中で、増殖因子は、細胞増殖を引き起こし、したがって、可溶性メディエータ、血液細胞、細胞外マトリックスの生産および実質細胞の増殖を含む動的変化の統合をもたらす。
【0010】
易感染性患者は、３ヶ月の期間内で解剖学的および機能的完全性を生じるために適時の修復プロセスをたどることができなかった非治癒性の慢性創傷を頻繁に生じる。そのような創傷は、罹患している患者の生活の質における有意な低下とともに医療システムに相当な経済的負担を提起する。ＵＳＡにおける費用は、約２００億ＵＳドルと推定されており、ＵＫの報告によれば、慢性創傷の処置および看護が先進国における医療費全体の３％を占めることが示唆される。
【0011】
そのため、組織修復、特にヒト創傷治癒を支援することができる薬剤は、必要とされる。
【0012】
特に、抗酸化活性または皮膚ＥＣＭに損傷を与えるプロテアーゼの阻害などの化粧的機能を有するポリペプチド配列を用いる化粧目的のための局所療法は、過去２０年間の間、急成長の分野になってきている。開発された多数のスキンケア製品の中で、多くは、単に、ヒトの皮膚の外観を改善するためのものならびに老化の兆候および症状を処置するためのものである。他の関連製品は、ＵＶ放射を遮断する遮蔽物を提供することにより皮膚を保護するように作用する。
【0013】
皮膚の光老化、皮膚損傷を含む種々の皮膚症状を処置および／または予防することができ、創傷治癒を促進することができる局所用組成物の必要性が残っている。
【発明の概要】
【0014】
本発明者らは、配列ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲを含むポリペプチド、およびそのペプチドの対応するデキストロ－レベルソ形（すなわち、ｒｙｌｐｎｋａｋｓｒ）が、ポリアルギニン配列領域（例えば、Ｎ－末端）と隣接する場合、種々の皮膚症状を予防または処置するのに使用することができることを確認している。
【0015】
したがって、本発明は、ポリアルギニンアミノ酸配列領域に隣接するアミノ酸配列ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号１）、またはそのアミノ酸配列のデキストロ－レベルソ形（すなわち、ｒｙｌｐｎｋａｋｓｒ－配列番号２）を含む単離または精製ポリペプチドを提供する。いくらかの実施形態において、ポリペプチドは、単離または精製される。いくらかの実施形態において、ポリアルギニンアミノ酸配列領域は、アミノ酸配列ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号１）のＣ－末端またはそのアミノ酸配列のデキストロ－レベルソ形（すなわち、ｒｙｌｐｎｋａｋｓｒ－配列番号２）のＮ－末端である。
【0016】
ポリアルギニンアミノ酸配列は、任意の適切な長さであり得る。しかし、いくらかの実施形態において、ポリアルギニンアミノ酸配列領域は、２～２０のアルギニン残基からなる。いくらかの実施形態において、ポリアルギニンアミノ酸配列領域は、４～２０のアルギニン残基からなる。いくらかの実施形態において、ポリアルギニンアミノ酸配列領域は、５～１５のアルギニン残基からなる。いくらかの実施形態において、ポリアルギニンアミノ酸配列領域は、５～１２のアルギニン残基からなる。いくらかの実施形態において、ポリアルギニンアミノ酸配列領域は、５～１０のアルギニン残基からなる。いくらかの実施形態において、ポリアルギニンアミノ酸配列領域は、５～９のアルギニン残基からなる。いくらかの実施形態において、ポリアルギニンアミノ酸配列領域は、６～８のアルギニン残基からなる。いくらかの実施形態において、ポリアルギニンアミノ酸配列領域は、７または８のアルギニン残基からなる。いくらかの実施形態において、ポリアルギニンアミノ酸配列領域は、８のアルギニン残基からなる。
【0017】
いくらかの実施形態において、ポリアルギニンアミノ酸配列領域は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０のアルギニン残基を含む。いくらかの実施形態において、ポリアルギニンアミノ酸配列領域は、８のアルギニン残基を含む。
【0018】
本発明のポリペプチドのＣ－末端の修飾は、ポリペプチドの生物学的活性を変更することができ、より正確には、通常、翻訳後修飾を受ける天然ポリペプチドを反映することができる。そのため、いくらかの実施形態において、ポリペプチドは、Ｃ－末端で修飾され、好ましくは、Ｃ－末端でアミド化される。いくらかの実施形態において、アミノ酸配列のデキストロ－レベルソ形は、Ｃ－末端でアミド化される（すなわち、ｒｙｌｐｎｋａｋｓｒ－ＮＨ２）。いくらかの実施形態において、ポリアルギニンアミノ酸配列領域は、Ｃ－末端でアミド化される。
【0019】
アミノ酸は、カルボキシル基に隣接するアルファ炭素で不斉であり、そのためＬ－およびＤ－異性体として存在する。本発明のいくらかの実施形態において、ポリペプチドは、Ｌアミノ酸を含む。本発明のいくらかの実施形態において、ポリペプチドは、Ｄアミノ酸を含む。
【0020】
上述したように、本発明者らは、本発明のポリペプチドが、創傷治癒を促進することを含む、生物学的活性を有することを確認している。例えば、実施例１は、ポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３－ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲ）およびデキストロ－レベルソ配列ＩＫ２３６７７０（配列番号４－ｒｒｒｒｒｒｒｒｒｙｌｐｎｋａｋｓｒ）が、局所的に適用された場合、未処置対象と比較して、創傷治癒を促進することを示す。
【0021】
したがって、本発明は、創傷治癒を促進するための、本明細書に記載されるようなポリペプチドを提供する。いくらかの実施形態において、創傷治癒を促進するためのポリペプチドは、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号３）を含む（またはそれからなる）。いくらかの実施形態において、創傷治癒を促進するためのポリペプチドは、ｒｒｒｒｒｒｒｒｒｙｌｐｎｋａｋｓｒ（配列番号４）を含む（またはそれからなる）。
【0022】
上述したように、本発明者らは、本発明のポリペプチドが、皮膚症状を処置および／または予防することができることを確認している。したがって、本発明は、皮膚症状を処置または予防するための、本明細書に記載されるようなポリペプチドを提供する。いくらかの実施形態において、皮膚症状を処置または予防するためのポリペプチドは、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号３）を含む（またはそれからなる）。いくらかの実施形態において、皮膚症状を処置または予防するためのポリペプチドは、ｒｒｒｒｒｒｒｒｒｙｌｐｎｋａｋｓｒ（配列番号４）を含む（またはそれからなる）。
【0023】
いくらかの実施形態において、皮膚症状は、皮膚老化；酸化的損傷；直射日光曝露により誘導される損傷；紫外線放射誘導性損傷；ＵＶＢ誘導性損傷；および／またはＤＮＡ損傷の任意の１つまたは複数である。
【0024】
いくらかの実施形態において、上記皮膚症状の１つまたは複数は、ＣＰＤおよび／または８－ＯＨｄＧ形成により特徴づけられ、好ましくは、ＣＰＤおよび／もしくは８－ＯＨｄＧ形成により特徴づけられるＤＮＡ損傷またはＣＰＤおよび／もしくは８－ＯＨｄＧ形成により特徴づけられる紫外線誘導性損傷である。
【0025】
いくらかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、対象の細胞または皮膚において、ＣＲＥＢリン酸化；８－ＯＨｄＧ形成；シクロブタン型ピリミジンダイマー（ＣＰＤ）形成；マトリックスメタロプロテイナーゼ１（ＭＭＰ１）活性；細胞成分または細胞外成分の酸化的損傷；および／またはＤＮＡ損傷の任意の１つまたは複数を阻害する。
【0026】
いくらかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、対象の細胞または皮膚において、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）量；および／または紫外線放射損傷修復の任意の１つまたは複数を向上させる。
【0027】
本発明のポリペプチドは、組成物として配合される場合に有用である。そのため、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドおよび局所的に許容される担体を含む局所使用のための組成物を提供する。本発明は、また、本明細書に記載のポリペプチドおよび局所的に許容される担体を含む局所用組成物も提供する。
【0028】
本発明の組成物は、好ましくは、創傷治癒を促進するためおよび／または皮膚症状を処置または予防するための、１つまたは複数のさらなる活性薬剤を含むことができる。さらに、本発明は、本明細書に記載されるようなポリペプチドおよび化粧品的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む化粧用途のための組成物を提供する。さらに、本発明は、本明細書に記載されるようなポリペプチドおよび化粧品的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む化粧用組成物を提供する。加えて、本発明は、本明細書に記載されるようなポリペプチドおよび医薬的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【0029】
いくらかの実施形態において、組成物は、さらに、１つもしくは複数の脂質および／または１つもしくは複数のさらなる活性薬剤を含む。本明細書に記載されるようなポリペプチドは、抗酸化活性を有すると同定されており、そのため、いくらかの実施形態において、単離または精製ポリペプチドは、１つもしくは複数の脂質および／または１つもしくは複数のさらなる活性薬剤を酸化的損傷から保護する。
【0030】
さらに、局所用組成物、化粧用組成物、および／または医薬組成物の製造のための、本明細書に記載されるようなポリペプチドの使用が、本発明により提供される。
【0031】
本発明は、哺乳動物へ、創傷へ、または皮膚症状の部位へ、有効量の本明細書に記載されるようなポリペプチドまたは本明細書に記載されるような組成物を含むポリペプチドを投与することを含む、創傷治癒を促進する、または対象（哺乳動物など）における皮膚症状の処置または予防のための方法を提供する。好ましくは、ポリペプチドまたは組成物は、対象の皮膚に投与される。方法のいくらかの実施形態において、本発明は、皮膚老化、酸化的損傷；直射日光曝露により誘導される損傷；紫外線放射誘導性損傷；ＵＶＢ誘導性損傷；ＵＶＡ誘導性損傷；および／またはＤＮＡ損傷の１つまたは複数であり得る。
【0032】
方法のいくらかの実施形態において、上記皮膚症状の１つまたは複数は、ＣＰＤおよび／または８－ＯＨｄＧ形成、特にＣＰＤおよび／もしくは８－ＯＨｄＧ形成により特徴づけられるＤＮＡ損傷またはＣＰＤおよび／もしくは８－ＯＨｄＧ形成により特徴づけられる紫外線誘導性損傷により特徴づけられる。
【0033】
本発明は、また、本明細書に記載されるようなポリペプチドまたは組成物を用いて細胞または皮膚を処置することを含む、対象の細胞、または皮膚におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ１（ＭＭＰ１）活性を阻害するための方法も提供する。
【0034】
さらに、細胞におけるＣＲＥＢリン酸化を阻害するための方法が提供され、その方法は、本明細書に記載されるようなポリペプチドまたは組成物を用いて細胞を処置することを含む。加えて、本明細書に記載されるようなポリペプチドまたは組成物を用いて細胞を処置することを含む、細胞における８－ＯＨｄＧ形成を阻害するための方法が提供される。細胞におけるＣＰＤ形成を阻害するための方法がさらに提供され、その方法は、本明細書に記載されるようなポリペプチドまたは組成物を用いて細胞を処置することを含む。
【0035】
特定の実施形態は、以下の図面により説明される。以下の説明が、特定の実施形態を説明する目的のためのものであり、説明に関して限定することを意図していないことが理解される。
【図面の簡単な説明】
【0036】
【図3】図３Ａは、サイクリックＡＭＰ応答配列結合タンパク質（ＣＲＥＢ）のＵＶ照射誘導性リン酸化の予防に対するポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３）の効果を示し、図３Ｂは、ＴＧＦβ受容体ＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩ））のＵＶ誘導性抑制の修復に対するポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３）の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0037】
本明細書に言及されているヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、配列識別番号（配列番号）により表される。配列識別子の要約を表１に与える。配列リストも、本明細書の一部として提供される。
【0038】
【表1】
【0039】
以下により詳細に説明するように、本発明者らは、アミノ酸配列ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号１）、またはそのアミノ酸配列のデキストロ－レベルソ形（すなわち、ｒｙｌｐｎｋａｋｓｒ－配列番号２）、およびポリアルギニンアミノ酸配列領域を含むポリペプチドが、創傷治癒を促進すること、老化を処置または予防することなどの種々の皮膚症状を処置することができ、また、ＵＶ誘導性皮膚変化および細胞損傷の効果を処置および／または予防することもできる。
【0040】
本明細書において使用されるように、用語「ＩＫ３４７２０」、「ＩＫ」または「ＩＫ３」は、配列番号３（ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲ）を指すために交換可能に使用される。
【0041】
本明細書において使用されるように、用語「ＩＫ２３６７７０」は、配列番号４（ｒｒｒｒｒｒｒｒｒｙｌｐｎｋａｋｓｒ）を指すために交換可能に使用される。
【0042】
用語「皮膚」は、本明細書において使用されるように、少なくとも表皮および真皮を指す。したがって、皮膚症状、皮膚損傷または皮膚創傷に関連して使用される場合、この用語は、表皮および真皮に加えて、追加の組織（皮下組織など）を包含する、症状、損傷または創傷を除外しないように解釈されるべきである。
【0043】
用語「ポリペプチド」は、本明細書において使用されるように、通常、アミド結合により結合したアミノ酸モノマーで構成される分子を指す。この用語は、ポリペプチドの「プロドラッグ」、ポリペプチドの荷電形および非荷電形、ポリペプチドの医薬的に許容される塩、ならびに本開示の方法および使用において、機能的な活性を保持する、ポリペプチドの骨格および／または末端への修飾を含むポリペプチド任意の他の変異体、誘導体または修飾を含む。
【0044】
さらに、用語ポリペプチドは、本明細書において使用されるように、分子を形成することができるアミノ酸の数の最大長さを暗に特定するように解釈されるべきではない。しかし、いくらかの実施形態において、特定される場合、ポリペプチドの最大長さは、５０のアミノ酸である。いくらかの実施形態において、最大長さは、４５のアミノ酸である。いくらかの実施形態において、ポリペプチドの最大長さは、４０のアミノ酸である。いくらかの実施形態において、最大長さは、３５のアミノ酸である。いくらかの実施形態において、最大長さは、３０のアミノ酸である。いくらかの実施形態において、最大長さは、２５のアミノ酸である。いくらかの実施形態において、最大長さは、２０のアミノ酸である。いくらかの実施形態において、最大長さは、１８のアミノ酸である。
【0045】
いくらかの実施形態において、ポリペプチドは、単離または精製ポリペプチドである。
【0046】
天然または組換え技術により生産されたポリペプチドの「単離」および「精製」の方法は、当技術分野において、例えば、Ｃ－Ｈ Ｌｅｅ、タンパク質の単離および精製のための方法の簡単な概要、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ；２０１７年３月；３２（１）：１８において、既知である。さらに、用語「単離」または「精製」は、合成および他の人工的に生産されたポリペプチドを含む。ポリペプチドを合成するための方法は、当技術分野において既知である。一般に、ポリペプチドは、１つのアミノ酸のカルボキシル基の、他方のアミノ基への縮合反応により化学的に合成される。ポリペプチドの化学合成は、溶液相技術または固相技術を使用して実行することができる。合成技術は、非天然アミノ酸ポリペプチドを組み込むポリペプチドの生産、骨格修飾およびＤ－異性体の合成を可能にすることができる。
【0047】
本明細書において使用されるように、用語ポリアルギニンは、隣接するアルギニンアミノ酸の配列を指す。いくらかの実施形態において、ポリアルギニンアミノ酸配列領域は、２～２０のアルギニン残基からなる。いくらかの実施形態において、ポリアルギニンアミノ酸配列領域は、４～２０のアルギニン残基からなる。いくらかの実施形態において、ポリアルギニンアミノ酸配列領域は、５～１５のアルギニン残基からなる。いくらかの実施形態において、ポリアルギニンアミノ酸配列領域は、５～１２のアルギニン残基からなる。いくらかの実施形態において、ポリアルギニンアミノ酸配列領域は、５～１０のアルギニン残基からなる。いくらかの実施形態において、ポリアルギニンアミノ酸配列領域は、５～９のアルギニン残基からなる。いくらかの実施形態において、ポリアルギニンアミノ酸配列領域は、６～８のアルギニン残基からなる。いくらかの実施形態において、ポリアルギニンアミノ酸配列領域は、７～８のアルギニン残基からなる。いくらかの実施形態において、ポリアルギニンアミノ酸配列領域は、８のアルギニン残基からなる。
【0048】
本明細書に記載の単離または精製ポリペプチドの一態様において、アミノ酸配列ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号１）、またはそのアミノ酸配列のデキストロ－レベルソ形ｒｙｌｐｎｋａｋｓｒ（配列番号２）は、ポリアルギニンアミノ酸配列領域と隣接する。
【0049】
本明細書に記載の単離または精製ポリペプチドの別の態様において、単離または精製ポリペプチドは、さらに、アミノ酸配列ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号１）、またはそのアミノ酸配列のデキストロ－レベルソ形（ｒｙｌｐｎｋａｋｓｒ；配列番号２）と、ポリアルギニンアミノ酸配列領域との間にリンカー領域を含む。ポリペプチドリンカーなどのリンカーは、当分野において既知である。
【0050】
いくらかの実施形態において、ポリアルギニンアミノ酸配列領域は、アミノ酸配列ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号１）、またはそのアミノ酸配列のデキストロ－レベルソ形（すなわち、ｒｙｌｐｎｋａｋｓｒ－配列番頭２）のＮ－末端および／またはＣ－末端である。例えば、いくらかの実施形態において、ポリアルギニンアミノ酸配列領域は、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号１）のＣ－末端である。いくらかの実施形態において、ポリアルギニンアミノ酸配列領域は、ｒｙｌｐｎｋａｋｓｒ（配列番号２）のＮ－末端である。
【0051】
いくらかの実施形態において、ポリペプチドは、アミノ酸配列ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号３）を含む。いくらかの実施形態において、ポリペプチドは、アミノ酸配列ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号３）からなる。
【0052】
いくらかの実施形態において、ポリペプチドは、アミノ酸配列ｒｒｒｒｒｒｒｒｒｙｌｐｎｋａｋｓｒ（配列番号４）を含む。いくらかの実施形態において、ポリペプチドは、アミノ酸配列ｒｒｒｒｒｒｒｒｒｙｌｐｎｋａｋｓｒ（配列番号４）からなる。
【0053】
いくらかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、修飾される。いくらかの実施形態において、修飾は、ポリペプチドの薬理学的特性を変更する修飾であり得る。いくらかの実施形態において、修飾は、本発明の組成物またはポリペプチドの半減期を増大する。いくらかの実施形態において、修飾は、ポリペプチド（および／または本発明の組成物）の生物活性を増大することができる。いくらかの実施形態において、修飾は、本発明のポリペプチドまたは組成物の選択性を増加する修飾であり得る。
【0054】
一実施形態において、修飾は、保護基の付加である。保護基は、Ｎ－末端保護基、Ｃ－末端保護基または側鎖保護基であり得る。本発明のポリペプチドは、１つまたは複数のこれらの保護基を有することができる。当業者は、アミノ酸をこれらの保護基と反応させる適切な技術の認識がある。これらの基は、当技術分野において既知の調製方法により付加させることができる。基は、ポリペプチドに対して残る可能性があるか、使用または投与の前に除去される可能性がある。保護基は、合成中に付加され得る。
【0055】
いくらかの実施形態において、ポリペプチドは、そのＣ－末端でアミド化される。アミド化は、連続する細胞内および細胞外タンパク質分解による、グリシン延長基質のＮ－酸化的開裂のプロセスを指す。インビトロでアミド化ポリペプチドを生産するための方法、例えば：酵素的アミド化；組換え生産されたポリペプチドおよびタンパク質のＣ－末端の化学的修飾；固相ポリペプチド合成におけるアミド樹脂の使用；アンモニアの存在下でのカルボキシペプチダーゼの使用；ならびにメチルエステルへのポリペプチドのＣ－末端の変換および低温でのアンモニアの付加は、当技術分野において既知である。適切な技術の開示の例は、ＤＪ Ｍｅｒｋｌｅｒ、Ｃ－末端アミド化ポリペプチド：グリシン延長ポリペプチドのインビトロの酵素的アミド化による生産および生物活性に対するアミドの重要性、Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９４年６月；１６（６）：４５０－６およびＶ ＣｅｒｏｖｓｋｙおよびＭ－Ｒ Ｋｕｌａ オレンジフラベドポリペプチドアミダーゼにより触媒されたＣ－末端ポリペプチドアミド化；Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ、１９９８年８月；３７（１３－１４）：１８８５を含む。
【0056】
Ｃ－末端のアミド化は、結果として、電荷を持たないＣ－末端となり、そのため、修飾ポリペプチドは、天然タンパク質をより忠実に模倣する。これにより、ポリペプチドが細胞に入る能力を強化すること；インビボでのポリペプチドの代謝安定性における改善；アミノペプチダーゼ（aminopetidases）、エキソペプチダーゼ、およびシンセターゼによるポリペプチドのインビボでの酵素的分解における低下；ならびにポリペプチドの貯蔵安定性の改善を含む一連の利点を有することができる。
【0057】
当技術分野において既知であるように、アルファアミノ酸は、アルファ位置で不斉炭素を含む。したがって、すべてのアルファアミノ酸は、グリシンを除いて、Ｌ－またはＤ－異性体である２つのエナンチオマーのいずれかで存在することができる。一般に、Ｌ－アミノ酸のみが、哺乳動物細胞中で製造され、タンパク質に取り込まれる。Ｄ－アミノ酸は、人工的に合成することができるか、細菌タンパク質中で認めることができる。ＬおよびＤの表示は、アミノ酸の立体化学を直接指す場合には使用されないが、むしろ、アミノ酸を合成することができるグリセルアルデヒドの異性体の光学活性を直接指す場合に使用される（Ｄ－グリセルアルデヒドは、右旋性である；Ｌ－グリセルアルデヒドは、左旋回である）。
【0058】
いくらかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、Ｌ－アミノ酸を含む。いくらかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、Ｌ－アミノ酸のみを含む。いくらかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、Ｄ－アミノ酸を含む。いくらかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、Ｄ－アミノ酸のみを含む。いくらかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、Ｌ－アミノ酸およびＤ－アミノ酸を含む。
組成物
組成物
【0059】
ポリペプチドの適用を容易にするため、ポリペプチドは、組成物に配合することができる。本明細書において定義されるように、組成物は、成分の任意の混合物をポリペプチドと一緒に含む。いくらかの形態において、組成物は、ポリペプチドを安定化させるように、および／または、ポリペプチドを保護するように、および／または、ポリペプチドの適用を改善するように構成される。いくらかの実施形態において、ポリペプチドは、組成物の別の成分を安定化する、および／または組成物の別の成分を保護する、および／または組成物の別の成分の適用を改善するのを支援することができる。
【0060】
多くの組成物は、脂質、酵素、タンパク質、ポリペプチド、エラスチン、コラーゲンおよびフィブリンなどの生体成分を含む。さらに、組成物は、一般に、水性溶媒を含む。生体成分は、水の存在下で、水の加水分解活性の結果として時間経過とともに典型的に酸化される。これにより、生体成分の分解がもたらされ、組成物内でのそれらの機能を縮小させる。そのため、本発明のポリペプチドなどの、これらの生体成分の酸化を低減することができる追加の成分を組成物中に含むことが好都合であり得る。
【0061】
問題は、スキンケア組成物中で最も一般的に使用される水中油型担体において特に悪化する。これらの組成物において、水－油界面での酸素のかなりの拡散があり、結果として生物活性成分、特に油相にカプセル封入された感受性化合物の深刻な分解となる可能性がある。
【0062】
したがって、本発明のポリペプチドを含む組成物が提供される。いくらかの実施形態において、組成物は、本発明のポリペプチドおよび少なくとも１つの生体成分または酸化性の成分を含む。いくらかの実施形態において、生体成分または酸化性の成分は、脂質、酵素、タンパク質、ポリペプチド、エラスチン、コラーゲンおよびフィブリンからなる群より選択される。いくらかの実施形態において、組成物は、１つもしくは複数の脂質または１つもしくは複数のさらなる活性化合物を含む。組成物のいくらかの実施形態において、本発明によるポリペプチドは、１つもしくは複数の脂質および／または１つもしくは複数のさらなる活性薬剤、または成分を酸化的損傷から保護する。
【0063】
組成物は、任意の適切な組成物であり得、その特定の使用のために当業者により適合される。例えば、組成物は、インビトロ実験またはインビボ投与における使用のために配合することができる。いくらかの好ましい実施形態において、組成物は、局所用組成物である。いくらかの実施形態において、組成物は、医薬組成物、好ましくは、局所用医薬組成物である。いくらかの実施形態において、組成物は、化粧用組成物、好ましくは、局所化粧用組成物である。
局所用組成物
局所用組成物
【0064】
重要なことに、本発明者らは、ポリペプチドが局所的に適用される場合に活性があることが示されている。例えば、本発明者らは、本明細書に記載のポリペプチドが、皮膚にインビボまたはエクスビボで局所的に適用される場合、創傷治癒を促進することができ、皮膚損傷を低下させることができることを示した。したがって、一態様において、本発明は、局所使用のための組成物、または本発明によるポリペプチドおよび局所的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む、局所用組成物を提供する。別の態様において、本発明は、局所使用のための組成物の製造のための本発明によるポリペプチドの使用、または局所用組成物を提供する。好ましくは、局所使用のための組成物は、本明細書に記載のような皮膚症状を処置するために使用される。
【0065】
用語「局所用組成物」または「局所使用のための組成物」は、ケラチン組織、主に皮膚に主に適用されるが、毛髪および爪を含む場合もある、局所投与用に配合される組成物を指す。局所的とは、一般に、皮膚に送達させることを指すが、例えば、唇、口などの粘膜組織のように上皮細胞で裏打ちされたルーメン空間への送達を意味する可能性がある。
【0066】
局所送達用の製剤は、Ｄ ＯｓｂｏｒｎｅおよびＡ Ａｍａｎ（編）、１９９０年、局所薬剤送達製剤、ＣＲＣ ｐｒｅｓｓ Ｔａｙｌｏｒ＆ＦｒａｎｃｉｓならびにＤ Ｂｈｏｗｍｉｋら（２０１２）、新規局所薬剤送達システムにおける近年の進歩、ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａ ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ、１：９、１２－３１において説明されている。治療用途のための許容される担体または希釈剤は、医薬技術では周知であり、例えば、Ｔａｒｕｎ Ｇａｒｇ、Ｇｏｕｔａｍ Ｒａｔｈ ＆ Ａｍｉｔ Ｋ．Ｇｏｙａｌ（２０１５）薬剤送達のための局所用剤形の添加物に対する包括的レビュー、Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、２２：８、９６９－９８７において説明されている。
【0067】
局所投与のための適切な形状は、液体、軟膏、クリーム、ゲル、ヒドロゲル、ポマード、塗布剤、ローション、乳濁液、スプレー、エアロゾル、点滴薬または粉末を含む。軟膏およびクリームは、例えば、水性または油性ベースを用いて適切な増粘剤および／またはゲル化剤の添加を用いて配合することができる。ローションは、水性または油性ベースを用いて配合することができ、一般に、乳化剤、安定化剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、または着色剤の１つまたは複数も含む。
【0068】
点滴薬または液体スプレーは、水性、または非水性のベース中、本発明のポリペプチドを用いて配合することができ、また、分散剤、可溶化剤または懸濁剤の１つまたは複数を含む。点滴薬は、単純点眼スポイトキャップボトルを介して、液体内容物を液滴で送達するのに適したプラスチックボトルを介して、または特別に成形されたクロージャを介して送達することができる。液体スプレーは、ポンプで送ることができ、加圧エアロゾルから好都合に送達し、操作可能なチューブなどの対象となるスプレー口を介して送達することができるか、液体を均一領域に広げるスプレー開口を介して送達することができる。さらに、ポリペプチドの可溶化された形状は、吸収媒体に含ませることができ、その後、皮膚の上に載せることができたり、擦ったりすることができる（例えば、可溶化ポリペプチドを含むファブリックワイプ）。
【0069】
本発明のいくらかの形状において、本発明のポリペプチドは、経皮投与のためのパッチ、膏薬、湿布または包帯を介して送達することができる。代わりに、ポリペプチドは、ポリアクリレートまたはアクリレート／ビニルアセテートコポリマーなどの接着性ポリマーの一部であるように配合することができる。
【0070】
局所用組成物は、任意で、水、油、塩、香料、芳香剤、着色剤、安定化剤、乳化剤、高圧ガス、添加剤、防腐剤または保存料、抗酸化剤、界面活性剤、増粘剤および局所用組成物において通常使用される他の賦形剤などの原料を含む。
【0071】
いくらかの実施形態において、局所使用のための組成物または局所用組成物は、創傷治癒を促進するため、または皮膚症状を処置もしくは予防するための１つまたは複数のさらなる活性薬剤を含む。
【0072】
本明細書において使用されるような用語「処置」および関連用語は、本質的に治療である、所望の薬理効果および／または生理効果を得ることを指す。例えば、効果は、対象における病状を改善する、対象における１つまたは複数の症状の改善、緩和および／またはその進行の遅延、対象の部分的または完全な安定化、または対象における治癒に関して治療的であり得る。
【0073】
本明細書において使用されるような用語「予防」および関連用語は、本質的に予防である、所望の薬理効果および／または生理効果を得ることを指す。例えば、効果は、対象における疾患、病状、状態または症状の完全な、もしくは部分的な予防、または対象における症状または病理の進行もしくは発生の完全な、もしくは部分的な予防であり得る。
【0074】
本発明による局所用組成物は、化粧用組成物（または単に化粧用途を意図した組成物）、および医薬組成物（または特に疾患、不快または病状の予防または処置のために使用されることを意図した組成物）に分割することができる。
化粧用組成物
化粧用組成物
【0075】
用語「化粧用組成物」は、本明細書において使用される場合、化粧目的、パーソナルケアおよび／または衛生目的のために使用することができる組成物に関する。組成物が化粧目的の１つより多くを有することができ、同時にこれらの目的の１つより多くのために使用することができることが理解される。用語「化粧用組成物」は、本明細書において使用される場合、限定されないが、モイスチャライジングクリーム、フェイシャルパウダーおよびボディパウダーなどを含むことができる。さらに、化粧用組成物は、マニキュア液、コンパクト、ソリッド、ペンシル、リップスティック、マスカラ、ルージュ、ファンデーション、ブラシ、アイライナーなどを含むことができる。
【0076】
米国食品医薬品局（ＦＤＡ）が考える化粧品組成物は、それらの用途により、「洗浄する、美化する、魅力を高める、または外見を変更するために、人体を擦る、それに注ぐ、振りかける、またはスプレーする、導入する、または他の方法で適用することを目的とした製品」として化粧品を定義する連邦食品・医薬品・化粧品法（ＦＤ＆Ｃ Ａｃｔ）により定義される［ＦＤ＆Ｃ Ａｃｔ、ｓｅｃ．２０１（ｉ）］。この定義に含まれる製品の中には、皮膚保湿剤、香水、リップスティック、マニキュア液、アイメイク用品および化粧品、クレンジングシャンプー、パーマネントウェーブ、ヘアカラー、および脱臭剤、ならびに、化粧製品の成分として使用することを意図する任意の物質である。
【0077】
いくらかの製品は、それらの使用目的に応じて化粧品および医薬品の両方として考えることができる。そのような状況において、用語「化粧品」は、組成物の医薬的または治療的用途を排除するために取られるべきである。
【0078】
化粧用途のための許容される担体または希釈剤は、当技術分野において既知であり、例えば、ＡＯ Ｂａｒｅｌ、Ｍ ＰａｙｎｅおよびＨＩ Ｍａｉｌｂａｃｈ（編）（２０１４）化粧品化学および技術のハンドブック、第４版、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ Ｇｒｏｕｐ、ＵＳＡにおいて説明される。
【0079】
本明細書の全体を通じた「非治療的」、または「化粧的」な方法および組成物への言及は、任意の潜在的な治療法または用途を排除するために取られるべきであり、そうでなければ特許請求の範囲に含まれ得る。いくらかの実施形態において、「非治療的」または「化粧的」方法組成物への言及は、ヒトに対して実行される療法による処置の方法、またはヒトの治療的処置のための組成物の特定排除を可能にすることができる。本出願の組成物および方法が、光老化の低減またはプロテアーゼもしくは他の酵素の分泌の低減などの生物活性があり得、これらは、治療の兆候または関連する病状がないため、治療の方法または治療のための組成物と見なされるべきではないと理解される。
医薬組成物
医薬組成物
【0080】
一態様において、本発明は、本発明によるポリペプチドおよび医薬的に許容される担体または希釈剤を含む、医薬的使用のための、または医薬組成物を提供する。別の実施形態において、本発明は、局所使用のための薬剤、または医薬組成物の製造のための本発明によるポリペプチドの使用を提供する。
【0081】
米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、連邦食品・医薬品・化粧品法（ＦＤ＆Ｃ Ａｃｔ）により、一部はそれらの使用目的により、「疾患の診断、治癒、緩和、処置、または予防における使用を意図する物品」および「ヒトまたは他の動物の体の構造または任意の機能に影響を及ぼすことが意図された物品（食品以外）」と定義されるような医薬品とみなす［ＦＤ＆Ｃ Ａｃｔ、ｓｅｃ．２０１（ｇ）（１）］。
【0082】
組成物は、また、医薬的に許容される担体、賦形剤または希釈剤も含む。成句「医薬的に許容される」は、健全な医学的判断の範囲内で、合理的な利益／リスク比に見合った、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症のない人類、または、場合によっては、動物の組織と接触して使用するのに適している、それらの化合物、物質、組成物、および／または剤形を指すために本明細書において使用される。
【0083】
適切な担体は、限定されないが、実質的に不活性な固体、半固体または液体充填剤、希釈剤、賦形剤、カプセル封じ材料または任意の種類の配合補助剤を含む。医薬的に許容される担体の例は、生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。他の生理学的に許容される担体およびそれらの製剤は、当技術分野において既知である。医薬的に許容される担体または賦形剤として機能することもできる物質のいくらかの例は、ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖類；コーンスターチおよび馬鈴薯澱粉などの澱粉類；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよびセルロースアセテートなどのセルロースおよびその誘導体；トラガカント末；モルト；ゼラチン；タルク；カカオ脂および坐剤用ワックスなどの賦形剤；ピーナツ油、綿実油などの油；サフラワー油；ごま油；オリーブ油；コーン油および大豆油；プロピレングリコールなどのグリコール類；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル類；寒天；ＴＷＥＥＮ ８０などの界面活性剤；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；パイロジェンフリーの水；等張食塩水液；リンガー溶液；エチルアルコール；およびリン酸緩衝液を含み、同様に、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの他の非毒性の相溶性潤滑剤、ならびに着色剤、放出剤、塗工剤、甘味料、香味料および芳香剤、防腐剤および抗酸化剤、懸濁剤（複数可）および可溶化剤も、存在することができる。適切なバインダーの例は、澱粉、ゼラチン、グルコース、無水ラクトース、自由流動性ラクトース、ベータ－ラクトース、コーン甘味料などの天然糖類、アカシア、トラガカントまたはアルギン酸ナトリウムなどの天然および合成ガム、カルボキシメチルセルロースおよびポリエチレングリコールを含む。適切な潤滑剤の例は、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどを含む。一実施形態において、本発明は、防腐剤および／または安定化剤を提供する。防腐剤の例は、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸およびｐ－ヒドロキシ安息香酸のエステルを含む。抗酸化剤および懸濁剤も使用することができる。
【0084】
許容される担体は、さらに当技術分野において、例えば、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（編）２０１５年、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１４版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．において説明される。医薬担体、賦形剤または希釈剤の選択は、意図された投与のルートおよび標準薬務に関して選択することができる。
【0085】
「医薬組成物」は、１つまたは複数の医薬的に許容される希釈剤、賦形剤または担体と組み合わせた本発明のポリペプチドの混合物を指す。いくらかの形状において、混合物の成分は、インターワーキング関係を形成し、有効成分（複数可）（本発明のポリペプチドなど）の機能性は、強化される。例えば、混合物は、表皮、真皮または創傷などの作用部位との接触を改善するか、延長することにより；医薬組成物の蒸発を低減することにより；ポリペプチドの安定性を改善することにより；ポリペプチドの酵素的分解または酸化を防止することにより；および／またはポリペプチドと相互作用して相乗的関係を作ることによりポリペプチドの生物学的利用能を向上させることができ、それによって、要素の相互作用が、組み合わせられたときに個々の要素の合計よりも大きい全体的効果を生じる。典型的に、この相乗的関係は、単独で投与された２つの成分の合計により達成することができるよりも、より大きい生物学的効果において明らかにされる。
【0086】
医薬組成物は、人間医学および獣医学におけるヒトまたは動物の使用のためのものであり得る。種々の異なる形状の本明細書に記載の医薬組成物のためのそのような適切な賦形剤の例は、ＰＪ Ｓｈｅｓｋｅｙ、ＷＧ ＣｏｏｋおよびＣＧ Ｃａｂｌｅ（編）２０１７年、医薬品賦形剤のハンドブック、第８版、ＡＰｈＡ／Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ、ＵＳＡにおいて認めることができる。
【0087】
本明細書において使用されるような用語「有効量」（例えば「治療的有効量」または「化粧的有効量」）は、意図される終了、すなわち、創傷の治癒、ＵＶ関連損傷における低下および光老化における低下の達成を可能にする量を指す。前記「有効量」は、個体の年齢および全身状態に応じて、また処置される特定の状態、処置の期間、以前の処置および病状の性質および存在する期間（例えば、急性対慢性の創傷）などの要因を用いて対象ごとに変更される。
【0088】
特に、薬剤の有効量は、過度または耐えられない毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なしで対象に投与することができ、合理的な利益/リスク比に見合った量であるが、本明細書全体に開示されるような適切な技術により評価されるように、所望の効果を提供するのに充分である量を定義する。したがって、正確な有効量を特定することができないが、当業者は、日常的な実験および背景一般知識を使用して、任意の個別の場合において適切な「有効」量を決定することができる。この状況における治療結果は、症状の根絶または低減を含む。治療結果は、病状の完全な改善（すなわち、治癒）を必要としない。
【0089】
本発明のポリペプチドは、医薬的に許容される塩の形状で投与することができるか、組成物に配合することができる。本発明の医薬的に許容される塩は、従来の化学的方法により塩基性、酸性または金属性の部分を含む親ペプチドから派生させることができる。一般に、そのような塩は、ポリペプチドの酸性または塩基性形状を適切な対塩基または酸の化学量と水性または有機溶媒中で反応させることにより調製することができる。一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルなどの非水性溶媒が好ましい。酸付加塩の例は、酢酸、乳酸、パルモイン（palmoic）酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、パルミチン酸、スベリン酸、サリチル酸、酒石酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、またはトリフルオロ酢酸などのような有機酸；タンニン酸、カルボキシメチルセルロースなどのようなポリマー酸；ならびに塩酸、臭化水素酸、硫酸リン酸などのような無機酸を含む。金属錯体は、亜鉛、鉄などを含む。他の医薬的に許容される塩が考えられる。適切な塩のリストは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、イーストン、Ｐａ．、ＵＳ、１９８５年、ｐ．１４１８、およびＳｔａｈｌら編、「医薬品塩の特性の選択と使用のハンドブック」、Ｖｅｒｌａｇ Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ、２００２年において認められる。
皮膚症状
皮膚症状
【0090】
上で議論したように、本発明者らは、本発明のポリペプチドおよび組成物が、皮膚症状の処置において有用であることを示した。特に、ポリペプチドおよび組成物は、一般に皮膚への傷害の結果として、皮膚への損傷に関連する皮膚症状の予防または処置において有用である。特に例示される皮膚症状は、創傷治癒、皮膚へのＵＶ損傷の処置または予防、光老化を含む皮膚老化の処置または予防、皮膚細胞における酸化ストレスおよび活性酸素種の処置または予防、皮膚の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）への損傷の処置または予防ならびに皮膚の細胞へのＤＮＡ損傷の処置または予防を含む。
【0091】
例えば、実施例１は、ポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３－ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲ）およびデキストロ－レベルソ配列ＩＫ２３６７７０（配列番号４－ｒｒｒｒｒｒｒｒｒｙｌｐｎｋａｋｓｒ）が、局所的に適用された場合、未処置対照と比較して創傷治癒を促進することを示す。実施例２は、ポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３）が、太陽光模擬ＵＶ照射へのケラチノサイトの曝露後に適用された場合、初代ケラチノサイトのＣＲＥＢの１３３位（ＣＲＥＢ Ｓ－１３３）のセリンのＵＶ誘導性リン酸化を阻害することを示す。実施例２は、また、ＵＶ処置が、ＴＧＦβＲＩＩ量を抑制し、ポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３）が、ＵＶ処置細胞におけるＴＧＦβＲＩＩ発現を修復することも示す。実施例３は、ポリペプチドＩＫ３４７２０（「ＩＫ」、配列番号３）が、太陽光模擬ＵＶへの曝露後、初代ケラチノサイトにおけるＡＴＰ量をカルシトリオールと類似の量まで高めることを示す。実施例４は、ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲが、ＵＶ照射後の皮膚に局所的に適用された場合、ＵＶ照射により誘導される皮膚細胞における酸化ストレスを低減することを示す。実施例５は、ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲが、ＵＶ照射後の皮膚に局所的に適用された場合、ＵＶ照射により誘導される皮膚細胞におけるＣＰＤ核の形成により測定されるようにＤＮＡ損傷を低下させることを示す。実施例６は、ポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３）の局所適用が、ＵＶ照射後のアポトーシスケラチノサイトの数を低減することを示す。実施例７は、ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲが、ＵＶ照射後の皮膚に局所的に適用された場合、照射後３時間で急性ＵＶ照射後のヒト皮膚外植片におけるＣＰＤの形成を低減することができることを示す。実施例８は、ポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３）が、ＭＭＰ－１活性化を用量依存様式で阻害し、ＵＶ照射後の皮膚に局所的に適用された場合、ＵＶ照射により誘導されるＭＭＰ１発現を低下させることを示し、ポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３）が経時的に光老化を低減するのに使用することができることを示唆する。実施例９は、ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲが、真皮皮膚線維芽細胞溶解物中の細胞由来脂質のＵＶ誘導性酸化的損傷を低下させることを示す。実施例１０は、ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲが、ＵＶＢによるメラニン誘導を低下させることを示す。
【0092】
したがって、本発明は、有効量の本明細書に記載されるようなポリペプチドまたは組成物を皮膚、または皮膚の細胞に投与することを含む、皮膚症状を処置するための方法を提供する。
【0093】
本明細書において使用されるように、用語「投与」または「提供」は、ポリペプチドを投与すること、またはプロドラッグ、もしくはポリペプチドの誘導体、もしくは前述のポリペプチドのいずれか１つを含む組成物を投与し、結果として対象の体内、または標的細胞の内部への有効量の活性ポリペプチドの送達となることを含む。
創傷治癒
創傷治癒
【0094】
上で議論したように、本発明者らは、本発明のポリペプチドが、創傷の治癒の促進において有用であることを示した。したがって、本発明の一態様において、創傷治癒を促進するための本発明によるポリペプチドが提供される。本発明の別の態様において、哺乳動物に、有効量の本発明によるポリペプチドまたは組成物を投与することを含む、哺乳動物における創傷治癒を促進するための方法が提供される。
【0095】
本明細書において、用語「創傷治癒」は、創傷の治癒に関与するすべての異なるステップを説明するために使用され、創傷の治癒の増強および加速を含む。そのため、傷を塞ぐ血餅の形成、炎症細胞による血餅の浸潤ならびに創縁を一緒に引き寄せる収縮性肉芽組織を形成するためのその後の線維芽細胞および毛細血管への浸潤、ならびに露出した創傷表面を覆うために切断された表皮端の前方への移動のステップを含む。
【0096】
本明細書において使用されるような用語「創傷」は、体の組織への任意の創傷を指す。好ましい形状において、用語「創傷」は、皮膚が破壊され、動物の皮膚に裂け目、切り傷、穿刺、切開、挫裂創、擦過傷、裂傷、長い切り傷、かすり傷、細長い裂け目、火傷、破裂または潰瘍を形成する皮膚創傷を指す。
【0097】
そのような創傷は、急性または慢性として分類することができる。慢性創傷は、少なくとも３ヶ月の期間、タイムリーで規則的な修復のプロセスにおいて修復に失敗した創傷として定義される。慢性創傷は、膨隆した過剰増殖性ではあるが非進行性の創縁の存在により識別され得る。種々の病因の慢性創傷の創傷床に由来する線維芽細胞は、老化、早期、または分化の表現型を表し、正常な刺激メッセージに応答しないか、非効率的に応答する。
【0098】
すべての創傷の種類は、慢性化する潜在性を有する。慢性創傷は、伝統的に病因学的に分割され、慢性創傷の処置に情報提供することができる。さらに、慢性創傷の処置は、また、静脈不全、動脈灌流、糖尿病、緩和されていない圧力ならびに栄養状態（Ｉ型またはＩＩ型糖尿病）、免疫抑制および感染などの全身性要因などの創傷の形成を生じさせることができるか、その要因となり得る基礎疾患の処置を伴うこともできる。
【0099】
一般的な慢性創傷は、静脈性潰瘍であり、通常、脚で生じ、主に、慢性創傷の別の主な原因である高齢者の糖尿病性潰瘍、通常、かかと、肩甲骨および仙骨などの一般に圧力を受ける体の部位の動きを阻害する麻痺などの病状を有する人々に生じる褥瘡、細菌、ウイルス、真菌類またはアメーバによる感染により最も一般的に引き起こされる角膜潰瘍に作用する。他の種類の慢性創傷は、虚血および放射能中毒などの原因によるものであり得る。
【0100】
急性創傷は、慢性創傷の分類に合致しない任意の創傷として分類することができる。したがって、急性創傷は、創傷部位の誘因から３ヶ月未満の創傷として定義することができ、多くの場合、誘因から最初の４週間以内に創傷治癒の兆候を示す。
【0101】
急性創傷は、創傷の原因となる物体により、異なる種類に分類することができる。例えば、切開または切創、挫裂創、擦過傷およびかすり傷、火傷、穿刺または穿通創。
【0102】
種々の実施形態において、本発明のポリペプチドまたは組成物は、補助療法とともに使用することができ、また、本発明の方法は、それをさらに含むことができる。補助療法は、パパインまたは当技術分野において既知の創面切除剤の使用、湿潤創傷床の適用、または抗生物質もしくは抗真菌剤を介した微生物負荷の管理などの創面切除処置を含むことができる。
【0103】
当技術分野において既知の、創傷治癒を測定するための種々の技術がある。これらは、以下を含むが、それらに限定されない。
【0104】
ルーラー技術－創傷の表面積は、最大長さおよび垂直方向の幅の測定値を掛け合わせることにより概算することができる。この技術は、ほとんどの創傷の形状の不均一性により制限され、したがって、この技術は、大きいまたは深い不規則な形状を有する創傷の面積を正確には予測しない。この技術の変更は、また、全創傷体積を予測するために創傷の深さを測定することである。しかし、この技術の正確性は、上で議論したように、同じ理由のために制限される。
【0105】
酢酸塩追跡および面積測定－創傷面積を推定するための代替方法は、酢酸塩追跡および接触面積測定である。この技術は、透明シートを創傷表面全体に配置すること、およびその後その縁を追跡することを含む。創傷の面積は、その後、グリッド上にトレーシングを配置して区切られた領域内の正方形の数を計数することにより手動で、または正確に面積を定量するためにコンピュータ画像解析を使用することにより、決定される。
【0106】
創傷面積推定は、また、非接触面積測定などの非接触様式で推定することもできる。この技術において、標的プレートまたはスケールゲージは、創傷と同じ平面に配置され、画像を捕捉する。デジタル画像解析は、標的プレート／スケールに関連して創傷の面積を推定するために行われる。
【0107】
創傷の三次元推定－創傷のより複雑な三次元形状測定は、立体照明またはレーザ光を使用して実行することができる。当技術分野において既知であるこれらの技術は、デジタルカメラおよび創傷面の曲率および深さに応じて歪む射影レーザビームを使用する。
皮膚損傷および皮膚症状
皮膚損傷および皮膚症状
【0108】
重要なことに、本発明者らは、本発明のポリペプチドが、皮膚への損傷（非電離放射線損傷、例えば、ＵＶ損傷など）により、または皮膚の健康状態により、皮膚に引き起こされた損傷を予防または処置するために使用することができることをさらに示した。したがって、一態様において、皮膚症状を処置または予防するための本発明によるポリペプチドが提供される。別の態様において、皮膚症状を処置または予防するための組成物が提供される。別の態様において、哺乳動物に有効量の本明細書に記載されるようなポリペプチド、または組成物を投与することを含む、哺乳動物における皮膚症状を処置または予防するための方法が提供される。
【0109】
さらに、別の態様において、細胞における損傷を処置または予防するための方法が提供され、その方法は、本明細書に記載されるようなポリペプチドを用いて細胞を処置することを含む。
【0110】
いくらかの実施形態において、皮膚症状は、皮膚損傷である。いくらかの実施形態において、損傷は、直射日光曝露により誘導される。いくらかの実施形態において、皮膚症状は、紫外線（ＵＶ）放射誘導性損傷である。いくらかの実施形態において、ＵＶ放射は、ＵＶＢ放射であり、損傷は、ＵＶＢ誘導性損傷である。いくらかの実施形態において、ＵＶ放射は、ＵＶＡ放射であり、損傷は、ＵＶＡ誘導性損傷である。いくらかの実施形態において、皮膚症状は、ＤＮＡ損傷である。いくらかの実施形態において、ＤＮＡ損傷は、ＵＶＢまたはＵＶＡ放射などのＵＶ放射により誘導される。いくらかの実施形態において、ＤＮＡ損傷は、ＵＶＢ放射により引き起こされる。いくらかの実施形態において、ＤＮＡ損傷は、ＵＶＡ放射により引き起こされる。
【0111】
いくらかの実施形態において、皮膚症状は、酸化的損傷である。いくらかの実施形態において、損傷は、増加した細胞アポトーシスである。いくらかの実施形態において、損傷は、皮膚の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）への損傷である。いくらかの実施形態において、ＥＣＭはコラーゲン、エラスチン、ラミニンまたはデルマタン硫酸およびヒアルノナンなどのプロテオグリカンである。
【0112】
いくらかの実施形態において、本明細書に記載のポリペプチド、組成物および方法（複数可）は、ＤＮＡ損傷を阻害する。いくらかの実施形態において、本明細書に記載のポリペプチド、組成物および方法（複数可）は、紫外線放射誘導性損傷の修復を向上させる。
【0113】
損傷（ＵＶ曝露により誘導される損傷など）の観点での用語「処置」は、障害（例えば、ＵＶ照射）の後、本明細書に記載されるようなポリペプチドまたは組成物を適用するか、本明細書に記載されるような方法を実行する場合、損傷を引き起こした傷害の結果として、細胞、または組織において引き起こされる任意の有害な変化の相対レベルを低減することを指す。さらに、損傷の観点での用語「予防」は、障害の前、または障害の結果として細胞または組織に引き起こされる有害な変化の誘導の前に、本明細書に記載されるようなポリペプチドまたは組成物を適用するか、本明細書に記載されるような方法を実行する場合、損傷を引き起こした障害の結果として、細胞、または組織において引き起こされる任意の有害な変化の相対レベルを低減することを指す。
ＵＶ損傷
ＵＶ損傷
【0114】
本発明者らは、配列ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号３）などの本発明によるポリペプチドが、ＵＶ照射後の皮膚に局所的に適用された場合、ＤＮＡ損傷を低減することを示した。
【0115】
紫外線放射は、典型的に、１０ｎｍ～４００ｎｍの波長を有する電磁放射として定義される。環境的ＵＶ放射の最も一般的な源は、太陽からであり、全光量の１０％を占め、そのほとんどが地球の大気により濾過されるため、地上では太陽からの電磁放射の約３％がＵＶ放射である。
【0116】
主に太陽から放出されるＵＶは、ＵＶＡ、ＵＶＢおよびＵＶＣ放射に分割することができる。ＵＶＡは、３１５ｎｍ～４００ｎｍの波長を有するものとして分類され；ＵＶＢは、２８０ｎｍ～３１５ｎｍの波長を有するものとして分類され；ＵＶＣは、１００ｎｍ～２８０ｎｍの波長を有するものとして分類される。海面では、ＵＶ放射の約９５％がＵＶＡであり、約５％がＵＶＢであり、ＵＶＣ放射は、大気により濾過される。
【0117】
ＵＶＢおよびＵＶＡが、光損傷を皮膚に誘導し、ＵＶＡがＵＶＢよりも深く浸透することが、動物モデルおよびヒト皮膚外植片において示されている。ＵＶ誘導性ＤＮＡ光産物は、感受性遺伝子において特定の突然変異（ＵＶ署名）を引き起こすことができ、したがって、基底細胞癌および黒色腫を含む種々の皮膚癌の誘発における原因物質である。
【0118】
したがって、上で議論したように、本発明は、皮膚、特に皮膚細胞または皮膚のＥＣＭにおけるＵＶ損傷を処置または予防するためのポリペプチド、組成物および方法を提供する。
【0119】
ＵＶ曝露により引き起こされる損傷の種類は、当技術分野において既知であり、（限定されないが）ＤＮＡ損傷、細胞のアポトーシス、ｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質（ＣＲＥＢ）などの細胞シグナル伝達分子のリン酸化による細胞内シグナル伝達経路の活性化および活性酸素種（ＲＯＳ）の生成を含む。
ＤＮＡ損傷およびＣＰＤ形成
ＤＮＡ損傷およびＣＰＤ形成
【0120】
細胞内のＤＮＡ損傷を評価するために当技術分野において既知の種々の技術がある。これらは、（限定されないが）ＣｏｍｅｔＡｓｓａｙ（登録商標）、ＰＡＲＰ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａｙ、細胞内のリン酸化Ｈ２ＡＸのスーパーオキシドディスムターゼアッセイ分析、シクロブタン型ピリミジンダイマー（ＣＰＤ）の生産を含む。
【0121】
ケラチノサイトのＵＶ放射への曝露中、ＤＮＡ損傷の２つの形状は、シクロブタン型ピリミジンダイマー（ＣＰＤ）、およびピリミジン光産物ＤＮＡ損傷を含む。ＣＰＤは、高度に変異原性であり、ＵＶ放射、特にＵＶＢ放射によりかなりの量が生産される。これらのダイマーは、任意の２つの隣接するピリミジン間で形成することができ、チミジン、シトシン、または５－メチルシトシンを含むことができる。ＣＰＤの変異原性は、皮膚細胞におけるそれらの長期持続性に関する。このことにより、ＣＰＤの脱アミノ化のための時間が確保され、脱アミノ化ＣＰＤは、ＤＮＡポリメラーゼによりバイパスされる場合、結果として変異原性イベントとなる。
【0122】
本発明者らは、配列ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号３）などの本発明によるポリペプチドが、ＵＶ照射後の皮膚に局所的に適用された場合、ＣＰＤ形成を低下させることを示した。そのため、いくらかの実施形態において、細胞におけるＣＰＤ形成により特徴づけられる損傷、特にＵＶ誘導性損傷を低減するためのポリペプチド、組成物（複数可）および方法を提供する。さらに、いくらかの実施形態において、細胞におけるＣＰＤ形成により特徴づけられる損傷、特にＵＶ誘導性損傷を予防するためのポリペプチド、組成物（複数可）および方法を提供する。
【0123】
いくらかの実施形態において、損傷は、細胞におけるＣＰＤ形成である。したがって、いくらかの実施形態において、本明細書に記載のポリペプチド、組成物および方法は、特にＵＶ曝露後の細胞におけるＣＰＤ形成を低減する。さらに、いくらかの実施形態において、本明細書に記載のポリペプチド、組成物および方法は、特にＵＶ曝露後の細胞におけるＣＰＤ形成の増加を予防する。したがって、本発明によるポリペプチドまたは組成物を用いて細胞を処置することを含む、細胞（皮膚細胞など）におけるＣＰＤ形成を阻害するための方法が提供される。
酸化的損傷
酸化的損傷
【0124】
酸化ストレスは、活性酸素種（ＲＯＳ）形成と酵素的および非酵素的抗酸化剤との間の不均衡の結果である。正味の不均衡は、結果として細胞内、および細胞から分泌されるＲＯＳの蓄積となり得る。ＲＯＳにおける増加は、種々の損傷を細胞ならびにＤＮＡ損傷（例えば、二本鎖ＤＮＡ破壊）を含む組織（皮膚など）の細胞外マトリックスへの損傷、ならびに脂質およびコラーゲンなどの細胞および細胞外成分の両方への酸化的損傷を引き起こすことができる。
【0125】
本発明者らは、配列ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号３）などの本発明によるポリペプチドが、ＵＶ照射された皮膚に適用された場合、細胞内の酸化ストレスを低下させることを示した。特に、配列ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号３）などの本発明によるポリペプチドが、ＵＶ照射後の皮膚に局所的に適用された場合、皮膚における８－ＯＨｄＧ形成を阻害する。
【0126】
したがって、本発明は、細胞における酸化ストレス、または皮膚への酸化的損傷を処置または予防するための、本明細書に記載されるようなポリペプチドおよび組成物を提供する。さらなる態様において、本発明は、有効量の本発明によるポリペプチドまたは組成物を対象に（好ましくは、局所的に）投与することを含む、対象の皮膚への酸化的損傷を処置または予防するための方法を提供する。いくらかの実施形態において、酸化的損傷は、ＵＶ照射誘導性酸化的損傷である。方法のいくらかの実施形態において、ポリペプチドまたは組成物は、ＵＶ照射前に投与される。方法のいくらかの実施形態において、ポリペプチドまたは組成物は、ＵＶ照射後に投与される。
【0127】
本発明は、また、細胞内のＲＯＳにおける増加を処置および／または予防するための、本明細書に記載されるようなポリペプチドおよび組成物も提供する。さらなる態様において、本発明は、有効量の本発明によるポリペプチドまたは組成物を対象に（好ましくは、局所的に）投与することを含む、対象の皮膚におけるＲＯＳ濃度の増加を処置または予防するための方法を提供する。いくらかの実施形態において、ＲＯＳの増加は、皮膚または細胞のＵＶ照射に続く。方法のいくらかの実施形態において、ポリペプチドまたは方法は、ＵＶ照射前に投与される。方法のいくらかの実施形態において、ポリペプチドまたは組成物は、ＵＶ照射後に投与される。
【0128】
細胞における酸化的損傷を評価するための方法および技術は、当技術分野において、例えば、Ｉ．Ｍａｒｒｏｃｃｏら、ヒトにおける酸化ストレスのバイオマーカーの測定および臨床的意義、Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ、２０１７年、記事ＩＤ ６５０１０４６において既知である。これらの技術は、限定されないが、ＲＯＳおよびＲＯＳ誘導窒素種（例えば、ＤＨＲ１２３、ＤＣＦＨ－ＤＡ、ＨＥおよびＣ１１－ＢＯＤＩＰＹ）の検出のための蛍光プローブ；脂質酸化（例えば、ＨＮＥ、Ｆ２－ＩｓｏＰｓ、ＭＤＡ、アルケナールおよびアルカジエナール）、ＤＮＡの酸化（例えば、８－ＯＨｄＧ、５－クロロシトシン、５－クロロウラシル、εｄＡおよびεｄＣ）ならびに脂質の酸化（例えば、カルボニル（carbonils）、３－ＮＯ－Ｔｙｒ、ＡＯＰＰ、ＡＬＥ、ＡＧＥおよびｏｘＬＤＬ）などのＲＯＳ誘導性修飾に基づくマーカーを含む。
【0129】
上で議論したように、本発明者らは、本発明によるポリペプチドが、ＵＶ曝露後の細胞における８－ＯＨｄＧの濃度およびＵＶ誘導性損傷を低減することができることを示した。そのため、本発明は、細胞における８－ＯＨｄＧを低減するための、本明細書に記載されるようなポリペプチドまたは組成物を提供する。いくらかの実施形態において、８－ＯＨｄＧは、細胞のＵＶ照射（紫外線ストレス）により誘導される。さらに、本明細書に記載されるようなポリペプチドまたは組成物を用いて細胞を処置することを含む、細胞における８－ＯＨｄＧを低減するための方法が提供される。方法のいくらかの実施形態において、ポリペプチドまたは組成物は、ＵＶ照射前に投与される。方法のいくらかの実施形態において、ポリペプチドまたは組成物は、ＵＶ照射後に投与される。いくらかの実施形態において、方法は、８－ＯＨｄＧにより特徴づけられる、ＵＶＢ誘導性損傷を阻害または低減する。いくらかの実施形態において、方法は、ＵＶＡ誘導性損傷を阻害または低減する。
ＤＮＡ損傷および細胞アポトーシス
ＤＮＡ損傷および細胞アポトーシス
【0130】
本発明者らは、配列ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号３）などの本発明によるポリペプチドが、ＵＶ照射後の、ヒト皮膚を含む皮膚に局所的に適用された場合、アポトーシス日焼け細胞の数を低減することを示した。
【0131】
ＵＶ照射などの障害に続く細胞に引き起こされる損傷は、細胞がアポトーシスを介してプログラム細胞死を起こすことに繋がる可能性がある。ＵＶ照射および活性酸素種などの障害により引き起こされるＤＮＡ損傷は、ｐ５３、Ｋｕ７０およびＫｕ８６（Ｋｕ複合体）ならびにＭＮＲ複合体などの複数のアポトーシス因子の機能および活性を調節することができる。これは、同様に細胞におけるアポトーシスを誘導することができ、増加したアポトーシスは、皮膚老化と相関する。
【0132】
したがって、一態様において、本発明は、皮膚における（例えば、１つまたは複数の皮膚の細胞における）アポトーシスを低減するか、細胞におけるアポトーシスを予防するための、本明細書に記載されるようなポリペプチド、組成物を提供する。さらなる態様において、本発明は、有効量の本発明によるポリペプチドまたは組成物を対象に（好ましくは、局所的に）投与することを含む、皮膚におけるアポトーシスを低減するか、細胞におけるアポトーシスを予防する方法を提供する。
【0133】
細胞におけるアポトーシスを評価するための方法は、当技術分野、例えば、Ｇ Ｂａｎｆａｌｖｉ、アポトーシス細胞死を検出する方法、Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ、２０１７年２月；２２（２）：３０６－３２３において既知である。これらは、限定されないが、膜変化、ＤＮＡ断片化、細胞毒性および細胞増殖ならびにミトコンドリア損傷の分析を含む。さらなる技術は、光散乱フローサイトメトリー、経時的顕微鏡灌流アッセイおよび遺伝子毒性に特異的なクロマチン変化の分析を含む。
細胞エネルギーおよびＤＮＡ修復
細胞エネルギーおよびＤＮＡ修復
【0134】
本発明者らは、配列ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号３）などの本発明によるポリペプチドが、ＵＶ照射後の、ヒト皮膚を含む皮膚に局所的に適用された場合、細胞におけるＡＴＰの量を増加させることを示した。
【0135】
ＵＶ照射後の細胞において生産されるビタミンＤは、局所的にヒドロキシル化され、ＵＶ誘導性損傷に対して細胞を保護する。さらに、ビタミンＤステロイドホルモン１アルファ，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３（１，２５（ＯＨ）２Ｄ３；カルシトリオール）は、種々のモデルにおいて、ビタミンＤの保護効果を向上させることおよびＤＮＡ損傷を低減すること、およびＤＮＡ修復を改善することを示している。
【0136】
さらに、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３が、解糖を促進して、エネルギー節約プロセスをもたらすことが、近年示されている。決定的に、ＤＮＡ修復は、エネルギー依存性であり、そのため、増加したアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を介する細胞内エネルギーにおける増加は、結果としてＣＰＤの修復を向上させ、酸化的損傷を低下させることになる可能性がある。そのため、ＵＶ照射後の細胞におけるＡＴＰ濃度を増加させる能力は、改善されたＤＮＡ修復を円滑にする必要がある。
【0137】
したがって、一態様において、本発明は、細胞におけるＡＴＰ量を増加させるための、本明細書に記載されるようなポリペプチドおよび組成物を提供する。いくらかの実施形態において、細胞内のＡＴＰにおける増加は、ＵＶ曝露後である。さらに、本明細書に記載されるようなポリペプチドまたは組成物を用いて細胞を処置することを含む、細胞におけるＡＴＰ量を増加させる方法が提供される。いくらかの実施形態において、細胞は、ＵＶ放射への曝露前に処置される。いくらかの実施形態において、細胞は、ＵＶ放射への曝露後に処置される。
ＣＲＥＢ活性化
ＣＲＥＢ活性化
【0138】
本発明者らは、配列ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号３）などの本発明によるポリペプチドが、太陽光模擬ＵＶ照射へのケラチノサイトの曝露後に適用された場合、初代ケラチノサイトにおけるリン酸化ｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質（ｐＣＲＥＢ）の形成を阻害することを示した。
【0139】
ＣＲＥＢは、細胞転写因子である。それは、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）と呼ばれる特定のＤＮＡ配列と結合し、それによって、遺伝子の転写を増加または低下させ、細胞増殖、細胞周期進行、代謝、ＤＮＡ修復、細胞分化および細胞生存を含む種々の細胞経路の役割を有する。ＣＲＥＢ活性化は、１３３位でのセリンのリン酸化により示唆される。１３３位でのリン酸化は、ＵＶ照射の結果として増加し、細胞へのＵＶ誘導性損傷のマーカーおよび寄与因子としてみなされる。したがって、ＣＲＥＢリン酸化の阻害は、ケラチノサイトへのＵＶ誘導性損傷を低下させることができ、したがって、皮膚へのＵＶ損傷を低下させる。
【0140】
したがって、一態様において、本発明は、ＣＲＥＢリン酸化を低減するための本発明によるポリペプチドおよび組成物を提供する。さらに、本発明によるポリペプチドまたは組成物を用いて細胞を処置することを含む、細胞におけるＣＲＥＢリン酸化を阻害するための方法が提供される。
ＴＧＦベータＲＩＩおよびプロコラーゲン合成
ＴＧＦベータＲＩＩおよびプロコラーゲン合成
【0141】
日焼け止め保護をＴＧＦＢ／Ｓｍａｄシグナル伝達およびプロコラーゲン合成の刺激と関連付ける多くの報告（Ｒｉｔｔｉｅ Ｌ ＆ Ｆｉｓｈｅｒ ＧＪ、Ａｇｅｉｎｇ Ｒｅｓ Ｒｅｖｉｅｗｓ、２００２年、１（４）：７０５－７２０；Ｃｈｏｉ ＭＳら、Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｓｃｉ、２００７年、１４６（２）：１２７－１３７；Ｂｏｒａ ＮＳら、Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ、２０１８年、１２７：２６１－２７５）がある。
【0142】
さらに、ＵＶ照射後８時間で、ＴＧＦＢ２およびＴＧＦＢＲＩＩの両方が低減され、これは、同じ期間中のプロコラーゲン合成量の減少と一致しており、少なくとも一部が、ＴＧＦＢ２－ＴＧＦＢＲＩＩ－Ｓｍａｄ経路において観察された変更により、低減されたプロコラーゲン合成が媒介となっている可能性が上昇していることも報告されている（Ｑｕａｎ ＴＨら、Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ、２００２年、１１９（２）：４９９－５０６）。したがって、太陽紫外線照射は、ＴＧＦ－ベータタイプＩＩ受容体をダウンレギュレートすること（Ｑｕａｎ Ｔら、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ、２００４年、１６５（３）：７４１－５１）により、光老化したヒト皮膚においてコラーゲンを低減し、酸化ストレスは、また、ＴＧＦＢタイプＩＩ受容体の減少を介して、ＴＧＦベータ経路も害する（Ｈｅ Ｔら、Ａｇｅ（Ｄｏｒｄｒ）、２０１４年ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１１３５７－０１４－９６２３－６）。特に、ＴＧＦＢ２とは対照的に、ＴＧＦＢ１およびＴＧＦＢ３発現は、ＵＶ曝露で増加する（Ｑｕａｎ ＴＨら、上記参照）。同様に、ＴＧＦ－ベータタイプＩＩ受容体の損失は、ＴＧＦ－ベータによりＳｍａｄ２／３の下流活性化を予防し、それによってタイプＩプロコラーゲンの発現を低減する（Ｈｅ Ｔら、上記参照）。
【0143】
本発明者らは、ＴＧＦＢＲＩＩ発現が、ＵＶ照射で明らかに抑制され、初代線維芽細胞（ＦＥＲＡＴＯＮＩＣ－ｐ５）においてＩＫ３４７２０（配列番号３；ＩＫ）を用いてＵＶ処置後５時間で復元されたことを示した。
【0144】
したがって、プロコラーゲン合成を増加させるため、および／または、ＴＧＦβＲＩＩのＵＶ誘導性抑制を修復するために、本明細書に記載されるようなポリペプチドおよび組成物（複数可）が提供される。
老化
老化
【0145】
正味の皮膚老化は、２つの同時に生じるプロセスの結果である。「先天性」または「内因性」の老化を指すことができる第１のものは、皮膚にゆっくりと影響を及ぼし、結合組織の部分的に可逆的な変性を誘導する。「外因性の老化」または「光老化」を指すことができる第２のプロセスは、主に、皮膚の早期老化に大きく寄与する紫外線放射によるものである。これらの２つの経路の独立性は、ＵＶ放射への曝露がない場合であっても、皮膚が依然として時間の経過とともに老化することを示す動物モデルにより例示される。真皮老化のプロセスは複雑であり、無数の細胞内変化、およびＥＣＭへの変化を含み、その結果、とりわけ、皮膚の弾力性、色調および色素の損失となる。皮膚老化の主な原因の２つは、蓄積された細胞損傷および皮膚のＥＣＭの破壊である。
【0146】
ＵＶ照射は、表皮および真皮に損傷を誘導し、その結果、光老化のような長期的な影響となる。光老化皮膚は、真皮における無秩序なエラスチンおよびフィブリンの増加および蓄積を伴う、細胞成分および細胞外マトリックスにおける変更を示す。さらに、光老化は、結果として、皮膚結合組織の主な構造タンパク質である介在性コラーゲンの損失となる可能性がある。
【0147】
したがって、皮膚老化を処置または予防するための、本明細書に記載されるようなポリペプチドおよび組成物が提供される。本発明は、さらに、有効量の本明細書に記載されるようなポリペプチドまたは組成物を哺乳動物に（好ましくは、局所的に）投与することを含む、哺乳動物における皮膚老化を処置および／または予防のための方法を提供する。いくらかの実施形態において、老化は、内因性の老化である。いくらかの実施形態において、老化は、外因性の老化である。いくらかの実施形態において、外因性の老化は、光老化である。
【0148】
本発明は、皮膚の細胞成分または細胞外成分の損傷を阻害するための、本明細書に記載されるようなポリペプチドまたは組成物を提供する。いくらかの実施形態において、損傷は、結果として皮膚の光老化となる可能性がある、（上で議論したように）ＲＯＳにより引き起こされる損傷などの酸化的損傷である。いくらかの実施形態において、損傷は、ＵＶ照射により誘導される。
【0149】
いくらかの実施形態において、損傷は、ＥＣＭの酵素的分解である。したがって、本発明は、ＥＣＭの分解および／または皮膚の光老化、特に細胞のＵＶ放射への曝露後の分解を低減するための、本明細書に記載されるようなペプチドおよび組成物を提供する。さらに、皮膚、または皮膚内の細胞を、本明細書に記載されるようなペプチドまたは組成物を用いて処置することを含む、ＥＣＭの分解および／または皮膚の光老化を阻害する方法が提供される。
【0150】
本明細書において使用されるように、「皮膚老化」は、哺乳動物の皮膚の老化の外観を意味する。これは、内因性の老化および主に皮膚のＵＶ曝露により引き起こされる外因性の老化の両方を含む。そのため、老化を「処置および／または予防すること」または「抗老化」は、皮膚老化の鈍化または阻害、および／または皮膚老化の外観の反転を指す。
【0151】
これらの変化を誘導する基礎となる薬剤は、活性酸素種（ＲＯＳ）、主にＵＶ生成ＲＯＳである。これらのＲＯＳは、皮膚の非酵素的および酵素的抗酸化防御システムの両方を枯渇および損傷させる。したがって、枯渇ＲＯＳ防御システムの存在下、抗酸化剤は、主に細胞膜、脂質、ならびにエラスチンおよびコラーゲンなどの構造タンパク質に細胞損傷を引き起こす。さらに、基礎となる薬剤は、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を含む。
ＭＭＰ
ＭＭＰ
【0152】
マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、コラーゲン、フィブロネクチン、エラスチン、およびプロテオグリカンなどの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質の種々の成分を分解することができる亜鉛含有エンドペプチダーゼである。ＵＶ照射は、皮膚におけるＭＭＰの発現および分泌を増加することが示されており、ＥＣＭのそれらの分解を介して、光老化に寄与することができる。
【0153】
本発明者らは、配列ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号３）などの本発明によるポリペプチドが、細胞マトリックスメタロプロテイナーゼ１（ＭＭＰ１）の活性化を低減することができることを示した。
【0154】
したがって、本発明は、細胞のＵＶ放射への曝露後のＭＭＰの濃度を低減するための、本明細書に記載されるようなポリペプチドおよび組成物を提供する。さらに、本明細書に記載されるようなポリペプチドまたは組成物を用いて細胞または組織を（好ましくは、局所的に）処置することを含む、細胞または組織内のＭＭＰ活性を阻害するための方法が提供される。いくらかの実施形態において、ＭＭＰは、ＭＭＰ１である。
【0155】
皮膚におけるＭＭＰの活性を低減することにより、皮膚のＥＣＭの分解、および皮膚の光老化を低減することができる。
老化の測定
老化の測定
【0156】
老化の兆候は、限定されないが、鼻、頬および首のクモ状静脈、そばかす、日光性黒子などの色素斑（加齢性シミまたは肝斑として既知）、ならびに不均一な肌色；肌の色調の一般的な喪失；シワの数の増加；シワの深さの増大；シワの長さの増大；額の眉間シワ線などの線の増加；良性光線性角化症の存在を含む。したがって、これらの真皮の特徴の評価は、老化を評価するために使用することができる。
【0157】
理論に縛られることを望むことなく、いくらかの実施形態において、本発明のポリペプチドおよび方法は、上で与えられた老化の兆候の１つの形成を予防または低減するために使用することができた。いくらかの実施形態において、いくらかの実施形態において、本発明のポリペプチド、組成物および方法は、鼻、頬および首のクモ状静脈の形成を予防または低減する。いくらかの実施形態において、本発明のポリペプチド、組成物および方法は、色素斑の形成を予防または低減する。いくらかの実施形態において、本発明のポリペプチド、組成物および方法は、そばかすの形成を予防または低減する。いくらかの実施形態において、本発明のポリペプチド、組成物および方法は、日光性黒子の形成を予防または低減する。いくらかの実施において、本発明のポリペプチド、組成物および方法は、不均一な肌色の形成を予防または低減する。いくらかの実施において、本発明のポリペプチド、組成物および方法は、肌の色調の一般的な喪失の形成を予防または低減する。いくらかの実施形態において、本発明のポリペプチド、組成物および方法は、シワを予防またはその数を低減する。いくらかの実施形態において、本発明のポリペプチド、組成物および方法は、シワの増加を予防するか、その深さを低減する。いくらかの実施形態において、本発明のポリペプチド、組成物および方法は、シワの長さの増加を予防または低減する。いくらかの実施形態において、本発明のポリペプチド、組成物および方法は、額の眉間シワ線における増加を予防または低減する。いくらかの実施形態において、本発明のポリペプチド、組成物および方法は、良性光線性角化症の形成を予防または低減する。
【0158】
さらに、異なる皮膚の種類について皮膚老化を評価するための方法は、当技術分野において既知である。例えば、Ｒ Ｂａｚｉｎ、Ｅ Ｄｏｕｂｌｅｔ、Ｓｋｉｎ Ａｇｉｎｇ Ａｔｌａｓ．第１巻．白人型．Ｍｅｄ’Ｃｏｍ；２００７年；Ｒ ＢａｚｉｎおよびＦ Ｆｌａｍｅｎｔ ２０１０ Ｓｋｉｎ Ａｇｉｎｇ Ａｔｌａｓ．第２巻．アジア型．Ｅｄｉｔｉｏｎｓ Ｍｅｄ’Ｃｏｍ、フランス；Ｒ Ｂａｚｉｎ、Ｆ ＦｌａｍｅｎｔおよびＦ Ｇｉｒｏｎ ２０１２ Ｓｋｉｎ Ａｇｉｎｇ Ａｔｌａｓ．第３巻．アフリカ系アメリカ人型．Ｅｄｉｔｉｏｎｓ Ｍｅｄ’Ｃｏｍ、フランス；Ｒ Ｂａｚｉｎ、Ｆ ＦｌａｍｅｎｔおよびＶ Ｒｕｂｅｒｔ、２０１５年、Ｓｋｉｎ Ａｇｉｎｇ Ａｔｌａｓ．第４巻．アジア型、Ｅｄｉｔｉｏｎｓ Ｍｅｄ’Ｃｏｍ、フランス；Ｒ Ｂａｚｉｎ、Ｆ ＦｌａｍｅｎｔおよびＨ Ｑｉｕ、２０１７年、Ｓｋｉｎ Ａｇｉｎｇ Ａｔｌａｓ．第５巻：Ｐｈｏｔｏ－ａｇｉｎｇ Ｆａｃｅ＆Ｂｏｄｙ Ｅｄｉｔｉｏｎｓ Ｍｅｄ’Ｃｏｍ、フランス。
【0159】
本開示を、さらに以下の実施例により説明する。以下の説明が、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、上記説明に関して限定することを意図するものではないことが理解される。
実施例１：ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲおよびｒｒｒｒｒｒｒｒｒｙｌｐｎｋａｋｓｒは、創傷治癒を促進する。
実施例１：ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲおよびｒｒｒｒｒｒｒｒｒｙｌｐｎｋａｋｓｒは、創傷治癒を促進する。
【0160】
図１および図２は、以下のプロトコルにしたがって、ポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３－ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲ）（図１）およびデキストロ－レベルソ配列ＩＫ２３６７７０（配列番号４－ｒｒｒｒｒｒｒｒｒｙｌｐｎｋａｋｓｒ）（図２）の１０日間にわたるマウス創傷モデルにおける創傷治癒に対する効果を説明する。
【0161】
平均体重が２２ｇ（±２ｇ）の８匹のオスＩＣＲマウスの３群を、本研究に使用した。研究中、動物を個々のケージに収容した。イソフルランガス麻酔下、各動物の肩および背中の領域の毛を刈り、シャープパンチ（ＩＤ１２ｍｍ）を使用して、１日目に皮幹筋および接着性組織を含む皮膚を除去することにより創傷を誘導させた。
【0162】
創傷の誘導後、ポリペプチドＩＫ３４７２０およびＩＫ２３６７７０を、動物あたり１０μｇの用量で創傷の部位に局所的に投与した。さらに、陽性対照群にアルファ２Ａアゴニスト（ＣＧＳ－２１６８０）１０μｇを投与し、創傷治癒を改善することが示された（Ｍｏｎｔｅｓｉｎｏｓ ＭＣら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９７年、１８６：１６１５－１６２０）。ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の投与を含む追加の群を、陰性対照として使用した。
【0163】
創傷の周囲を透明なプラスチックシートにトレースし、画像分析器ＰｒｏＰｌｕｓ（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、バージョン４．５．０．２９により算出される創傷面積を用いて創傷治癒を５日目、７日目、９日目および１１日目に分析した。創傷の閉鎖割合（％）を算出した。創傷の閉鎖割合を、５、７、９および１１に測定した。ＡＮＯＶＡおよびＤｕｎｎｅｔｔの検定を適用して、測定の各時点で、処置群（ペプチドおよび陽性対照群）と陰性対照群との間の有意差を検定した。差は、Ｐ＜０．０５で統計的に有意であると見なされ、＊で示される。
【0164】
図１に示すように、１０日間連続して毎日マウス１匹あたりＩＫ３４７２０（配列番号３－ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲ）１０ｕｇの局所適用では、創傷の閉鎖割合が５日目から１１日目まで、統計的に有意な増加（Ｐ＜０．０５）と関連していた。さらに、予想通り、１０μｇ／マウスのアデノシンＡ２ａアゴニストＣＧＳ－２１６８０（陽性対照）の局所適用では、同じ研究期間中、陰性対照と比較して向上した創傷治癒と関連していた。
【0165】
図２に示すように、１０日間連続して毎日マウス１匹あたりポリペプチドＩＫ２３６７７０（配列番号４）１０ｕｇの局所適用では、陰性対照と比較して５日目に創傷治癒において（創傷閉鎖％割合により測定されたように）統計的に有意な増加と関連していた。
【0166】
【0167】
このデータから、ポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３－ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲ）およびデキストロ－レベルソ配列ＩＫ２３６７７０（配列番号４－ｒｒｒｒｒｒｒｒｒｙｌｐｎｋａｋｓｒ）が、局所的に適用された場合、未処置対照と比較して創傷治癒を促進することが説明される。
実施例２：ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲは、太陽光模擬ＵＶ照射へのケラチノサイトの曝露後に適用された場合、初代ケラチノサイトにおけるｐＣＲＥＢ形成を阻害し、ＴＧＦβ受容体（ＴＧＦβＲＩＩ）のＵＶ誘導性抑制を修復する。
実施例２：ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲは、太陽光模擬ＵＶ照射へのケラチノサイトの曝露後に適用された場合、初代ケラチノサイトにおけるｐＣＲＥＢ形成を阻害し、ＴＧＦβ受容体（ＴＧＦβＲＩＩ）のＵＶ誘導性抑制を修復する。
【0168】
ＣＲＥＢは、ＵＶ照射への細胞の曝露に応じて１３３位でのセリン（Ｓｅｒ－１３３）でリン酸化される。ＣＲＥＢリン酸化における増加は、細胞増殖、細胞周期、代謝、ＤＮＡ修復、分化、炎症、血管新生、免疫応答および細胞生存を含む種々の機能に関連する。したがって、異常なＣＲＥＢリン酸化は、腫瘍成長、悪性腫瘍および生存に関連する（Ｓｔｅｖｅｎ．ＡおよびＳｅｌｉｇｅｒ Ｂ．、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ、２０１６年６月７日；７（２３）：３５４５４－３５４６５）。
【0169】
ポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３）のＣＲＥＢリン酸化に対する影響を、以下のプロトコルを使用して評価した。
【0170】
ケラチノサイトを、以前説明したように（Ｇｕｐｔａら、Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ、２００７年、１２７（３）：７０７－２１５）、採取して培養した。３つの独立したドナーからのケラチノサイト（継代１～５）を、図３で説明した実験において使用した。
【0171】
陽性対照処置（図３において「Ｄ」と表示）を、カルシトリオール（１，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３（１，２５（ＯＨ）２Ｄ３）－Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｍｌ、ＵＳＡ）を１００％分光用エタノール（メルク、ダルムシュタット、ドイツ）に可溶化することにより調製し、最終濃度を分光法（ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００、サーモフィッシャーサイエンティフィック、ＭＡ、ＵＳＡ）により測定した。ポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３）を、ｐＨ７．２で１ｍＭの濃度までリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に可溶化した。０．１％（ｖ／ｖ）分光用エタノールおよび０．１％（ｖ／ｖ）ＰＢＳで構成される媒体（図３において「Ｖ」と表示）を陰性対照として使用するために調製した。
【0172】
Ｏｒｉｅｌ １０００Ｗキセノンアークランプ（ストラトフォード、ＣＴ、ＵＳＡ）を使用して、培養した細胞を太陽光模擬ＵＶ照射（ｓｓＵＶ）により照射した。ＯＬ７５４線量計（オプトロニックラボラトリーズ社、オーランド、ＦＬ）により測定して、ＵＶＢについては４００ｍＪ／ｃｍ２およびＵＶＡについては３６００ｍＪ／ｃｍ２のエネルギー量（全４０００ｍＪ／ｃｍ２）で照射を行った。この線量は、シドニー、オーストラリアで１０月の正午１２時での太陽の約４分間の照射に相当する。非照射対照細胞、（ＳＨＡＭ）は、照射された細胞と同時に処理されたが、ｓｓＵＶからは保護された。照射溶液は、５ｍＭ Ｄ－グルコースを含むＰＢＳであった。ケラチノサイトを６ウェルプレートに播種した。
【0173】
照射直後、１ｎＭの１，２５（ＯＨ）２Ｄ３、陰性対照（媒体）または０．１μＭ、１μＭおよび５μＭのＩＫ３４７２０（図３において「ＩＫ」、配列番号３）を細胞培養に加えた。続いて、細胞を溶解し、（Ｒｙｂｃｈｙｎら、上記参照、２０１７年、Ｒｙｂｃｈｙｎら、ＪＢＣ、２０１１年：２８６（２７）：２３７７１－９において以前説明したように）ウエスタンブロットを使用して、ＥＲＫ１／２－Ｔ２０２／Ｙ２０４、ＧＳＫ３α／β－Ｓ２１／９、ｍＴＯＲ－Ｓ２４４８、ＣＲＥＢ－Ｓ１３３およびａ－チューブリン（ローディングコントロール）のリン酸化を分析した。ウエスタンブロットにおいて使用したすべての抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＭＡ、ＵＳＡ）からであった。
【0174】
図３Ａは、サイクリックＡＭＰ応答配列結合タンパク質（ＣＲＥＢ）のＵＶ照射誘導性リン酸化の予防に対するポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３）の効果を説明する。図３から確認することができるように、ポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３）は、太陽光模擬ＵＶ照射へのケラチノサイトの曝露後に適用された場合、初代ケラチノサイトのＣＲＥＢの１３３位でのセリン（ＣＲＥＢ Ｓ－１３３）のＵＶ誘導性リン酸化を阻害する。
【0175】
内因性の皮膚老化およびＵＶ誘導性皮膚老化は、両方とも、タイプ１プロコラーゲン合成に必要なＴＧＦβＲＩＩの低減をもたらす。さらに、日焼け止め保護によるプロコラーゲン合成の刺激は、ＴＧＦβシグナル伝達と関連する。
【0176】
ポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３）のＴＧＦβＲＩＩリン酸化に対する影響を、以下のプロトコルを使用して評価した。
【0177】
ヒト皮膚真皮線維芽細胞を、健康な成人の皮膚の角膜切開生検から培養した。細胞は、３～６の継代の間であった。ＵＶ照射のため、サブコンフルエントの細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄し、ＵＶで照射した。照射直後、陰性対照（媒体）または１μＭ、２．５μＭ、５μＭおよび１０μＭのＩＫ３４７２０（図３Ｂににおいて「ＩＫ」、配列番号３）を細胞培養に加えた。
【0178】
ウエスタン分析のため、核抽出物を調製し、膜画分を調製し、８％ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分解し、ポリビニリデンジフルオリド膜に移し、一次抗体と反応させた。ブロットを可視化し、定量した。
【0179】
図３Ｂは、ＴＧＦβ受容体（ＴＧＦβＲＩＩ））のＵＶ誘導性抑制の修復に対するポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３）の効果を説明する。図３Ｂから確認することができるように、ＵＶ処置は、ＴＧＦβＲＩＩ量を抑制し、ポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３）は、ＵＶ処置細胞においてＴＧＦβＲＩＩ発現を修復する。ＴＧＦＢＲＩＩ発現は、明らかに、ＵＶ照射で抑制され、初代線維芽細胞（ＦＥＲＡＴＯＮＩＣ－ｐ５）においてＩＫ３４７２０（配列番号３；ＩＫ）を用いてＵＶ処置後５時間で復元された。
【0180】
これにより、ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲが、ＵＶ照射後に適用された場合、ＴＧＦβＲＩＩのＵＶ誘導性抑制を修復することが示唆される。
実施例３：ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲは、太陽光模擬ＵＶ照射に曝露された初代線維芽細胞においてＡＴＰ量を増加する。
実施例３：ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲは、太陽光模擬ＵＶ照射に曝露された初代線維芽細胞においてＡＴＰ量を増加する。
【0181】
図４は、ポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３）の、太陽光模擬ＵＶ照射に曝露された初代線維芽細胞におけるＡＴＰ量に対する効果を説明する。ＵＶ曝露後の不適切に修復されたＤＮＡ損傷は、皮膚癌進行における原因となる因子であることが示されている。ＤＮＡ修復は、エネルギーを必要とするが、ＵＶ曝露後、皮膚細胞は、一次エネルギー源であるＡＴＰを生産する能力の限界を有する。
【0182】
ポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３）の、ＵＶ曝露後の細胞内ＡＴＰに対する影響を、以下のプロトコルを使用して評価した。
【0183】
初代線維芽細胞を実施例２において上述したように採取し、実施例２において説明した濃度で、カルシトリオール（陽性対照）またはポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３；ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲ）の存在下または不在下で、実施例２において上述したように、ｓｓＵＶ照射（ＵＶＲ）に曝露するか、照射しなかった（ＳＨＡＭ）。カルシトリオール（１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３）は、種々のモデルにおいてＵＶ誘導性ＤＮＡ損傷および光発癌を低減することが示されている。
【0184】
以前説明したように（Ｒｙｂｃｈｙｎら、上記参照、２０１７年）、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）２．０アッセイ（プロメガ、ＷＩ、ＵＳＡ）を使用してＵＶＲ後１．５時間、ＡＴＰ量を測定した。図４のデータはすべて、平均±ＳＤとして示される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。細胞を調製し、上述したように照射した。
【0185】
図４から確認することができるように、ポリペプチドＩＫ３４７２０（「ＩＫ」、配列番号３）は、太陽光模擬ＵＶに曝露後の初代ケラチノサイトにおいてＡＴＰ量をカルシトリオールの場合と類似の量まで高めた。ＡＴＰ量における増加は、ＵＶ誘導性損傷後のＤＮＡの修復を支援するために提案されている。
【0186】
これにより、ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲが、ＵＶ照射後に適用された場合、太陽光模擬ＵＶへの曝露後にＡＴＰ量を増加させることが示唆される。
実施例４：ＵＶ照射後の皮膚に局所的に適用された場合、ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲは、皮膚における酸化ストレスを低下させる。
実施例４：ＵＶ照射後の皮膚に局所的に適用された場合、ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲは、皮膚における酸化ストレスを低下させる。
【0187】
【0188】
８－ヒドロキシ－２’－デオキシグアノシンまたは８－オキソ－７，８－ジヒドロ－２’－デオキシグアノシン（８－ＯＨｄＧ／８－ｏｘｏｄＧ）は、酸化ストレスの測定値である細胞内の８－ＯＨｄＧの濃度を用いて酸化病変においてフリーラジカル誘導の主要な形状の１つである。ＵＶ誘導性酸化ストレスにおけるポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３）の役割を、以下のプロトコルを使用して評価した。
【0189】
６つのＵＶＡチューブ（日立４０Ｗ Ｆ４０Ｔ １０／ＢＬ、東京、日本）と組み合わせた１つの蛍光ＵＶＢチューブ（Ｐｈｉｌｉｐｓ ＴＬ４０Ｗ １２Ｒ／Ｓ、アイントホーフェン、オランダ）に曝露することにより、メスＳｋｈ：ｈｒ１無毛マウスを太陽光模擬ＵＶ照射（ＵＶＲ）に曝露した。ＵＶＡおよびＵＶＢ照射は、以前説明したように（Ｄｉｘｏｎ ＫＭら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２００７年、１０３（３－５）：４５１－６）、０．１２５ｍｍセルロースアセテートシート（Ｇｒａｆｉｘ Ｐｌａｓｔｉｃｓ、クリーブランド、ＯＨ）に通して濾過した。ＵＶ照射マウスをＵＶＲ（３．９８ｋＪ／ｍ２のＵＶＢおよび６３．８ｋＪ／ｍ２のＵＶＡ）の最小紅斑線量（ＭＥＤ）の３倍に等しい単回曝露に供した。照射された動物を、５つの処置群（１群あたりｎ＝３）に無作為に分配した。
【0190】
照射直後、酸化ストレスを評価するための各処置群のマウスを、媒体（エタノール、プロピレングリコールおよび水を、それぞれ最終溶媒比２：１：１で含むベースローション）、１１．４ｐｍｏｌ／ｃｍ２のカルシトリオール（“１，２５（ＯＨ）２Ｄ３）のいずれかで背面に対して局所的に処置したか、または１００ｕＬの水性溶液中、２０μｇ、１００μｇもしくは２００μｇのポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３）の処置であった。
【0191】
ＵＶＲ後３時間でＵＶ照射背部皮膚から生検を採取し、Ｈｉｓｔｏｃｈｏｉｃｅ固定剤（Ａｍｒｅｓｃｏ、ソロンＯＨ）中で６時間固定した。皮膚試料をパラフィン包埋し、すべての分析のために、５μｍの切片を切断した。切片は、４０×倍率で日焼け細胞の可視化のために慣例のヘマトキシリンおよびエオシン染色に供し、皮膚切片の線形ミリメートルあたりの日焼け細胞の数を記録した。
【0192】
酸化ストレスを示唆する８－オキソ－２’－デオキシグアノシン（８ｏｘｏｄＧ）の量を、以下に示すように免疫組織化学的検査および画像解析（Ｄｉｘｏｎ ＫＭら、Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｖ Ｒｅｓ ２０１１、４（９）：１４８５－９４）により検出した。
【0193】
スライドを脱パラフィンし、一連の段階的なエタノール溶液中で再水和した。プロテイナーゼＫを３７℃で３０分間使用して抗原賦活化を実行し、続いて２Ｎ ＨＣｌ（７０％エタノール中）を用いて１５分間、続いて５０ｍＭのトリス緩衝液でさらに１５分間切片の処置を行った。８ｏｘｏｄＧについては、さらに２００μｇ／ｍｌでＲＮａｓｅ Ａ（Ａｍｒｅｓｃｏ、オハイオ、ＵＳＡ）を用いて３７℃で３０分間スライドを処置した。メーカー（Ｄａｋｏ、グロストルプ、デンマーク）により定められた方法を使用するＤａｋｏアニマルリサーチキットを使用して後続ステップを実行した。抗チミンダイマー抗体（シグマ－アルドリッチ、ミズーリ、ＵＳＡ）を１０μｇ／ｍＬで使用して、ＣＰＤの形成におけるＤＮＡ損傷を示唆し、その間、８ｏｘｏｄＧ抗体（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ、メリーランド、ＵＳＡ）を２．５μｇ／ｍＬで使用して、酸化ストレスを可視化した。
【0194】
図５で提示され、図６で定量化された免疫組織学において確認することができるように、ポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３）は、急性ＵＶ照射後のＳｋｈ：ｈｒ１マウスの皮膚における８－ＯＨｄＧ形成を阻害する。図５において、核内の暗い染色は、８－ｏｘｏ－ｄＧの存在を示唆する。
【0195】
８ｏｘｏｄＧについての免疫組織学的データの定量化は、媒体（陰性）対照と比較してＵＶ照射に曝露されたすべての処置群において統計的に有意な低下があった（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．０００１）ことを示した。アイソタイプ染色対照として使用されたモノクローナルマウスＩｇＧアイソタイプでは、有意な染色は観察されなかった（データを示さず）。
【0196】
これにより、ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲが、ＵＶ照射後の皮膚に局所的に適用された場合、ＵＶ照射により誘導される皮膚細胞における酸化ストレスを低下させることが示唆される。
実施例５：ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲが、ＵＶ照射後の皮膚に局所的に適用された場合、ＤＮＡ損傷を低下させる。
実施例５：ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲが、ＵＶ照射後の皮膚に局所的に適用された場合、ＤＮＡ損傷を低下させる。
【0197】
【0198】
ＵＶ放射への曝露は、化学反応のカスケードを誘発し、ポリメラーゼを阻害することができる多くの分子生成物（光障害）が形成され、ＤＮＡの転写または複製中にミスリードを引き起こすか、複製の停止をもたらす。シクロブタン型ピリミジンダイマー（ＣＰＤ）は、ＵＶ曝露の一般的な生成物であり、それらの濃度は、ＤＮＡ損傷を定量化することができる。
【0199】
以下のプロトコルにしたがって、ＵＶ照射後３時間のケラチノサイトにおけるＩＨＣによるＣＰＤ検出のデンシトメトリー分析を可能にするインビトロアッセイを実行した。
【0200】
ケラチノサイトを、実施例２で上述したように、採取して培養した。試料を、ＵＶ照射（ＵＶＲ）および非ＵＶ照射（ＳＨＡＭ）である２群に分割した。また、実施例２で上述したように、細胞について太陽光模擬ＵＶ照射により、ＵＶ照射を実行した。照射溶液は、５ｍＭ Ｄ－グルコースを含むＰＢＳであった。
【0201】
照射後、ケラチノサイトをカルシトリオール、媒体対照（Ｖｅｈ）または０．５μＭ、１μＭ、２．５μＭまたは５μＭのポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３；「ＩＫ」）のいずれかで処置した。
【0202】
採取したケラチノサイトを、９６ウェルプレートのポリ－Ｄ－リジンコートカバーガラス上に播種し、実施例２で上述したように、５ｍＭ Ｄ－グルコースを含むＰＢＳ中で照射した（または偽処置した）。ケラチノサイトをＵＶ照射後３時間で固定した。以前説明したように（Ｇｏｒｄｏｎ－Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ Ｓｃｉ、２０１２年、１１（１２）：１８３７－４７；Ｇｕｐｔａら、上記参照、Ｒｙｂｃｈｙｎ ＭＳら、Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ、２０１８年；１３８（５）：１１４６－１１５６）、免疫組織化学的検査および画像解析を実行した。以前説明したように（Ｄｏｕｋｉ ＴおよびＣａｄｅｔ Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００１年、４０（８）：２４９５－５０１）、抗チミンダイマー抗体（シグマ－アルドリッチ、ミズーリ、ＵＳＡ）を１０μｇ／ｍＬで使用して、チミジンダイマーを検出し、ＣＰＤの指数として定量した。
【0203】
図７および図８に示すように、ポリペプチドＩＫ３４７２０（それぞれ配列番号３；－「ＩＫ」）は、太陽光模擬ＵＶ照射に曝露された初代ケラチノサイトにおけるＣＰＤレベルを用量依存様式で低下させる。５μＭのポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３）で処置されたケラチノサイトは、カルシトリオールで処置されたケラチノサイトに匹敵するＣＰＤ量の低減があり、媒体処置ＵＶ照射ケラチノサイトと比較してＣＰＤ量における統計的に有意な（＊ｐ＜０．０５）低減があった。
【0204】
このデータから、ポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３；「ＩＫ」）が、ＵＶ照射に曝露後の初代ケラチノサイトにおけるＤＮＡ損傷を低減することが示される。
【0205】
図８Ｂにおいて、ＣＰＤは、ＣＰＤ染色の平均強度に関して算出された。重要なことに、図８Ｂは、１０ｕＭでポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３；「ＩＫ」）が、陽性対照１，２５ＤよりもＣＰＤ形成の阻害に対してより効果的であることを示す。
【0206】
図９および図１０は、以下のプロトコルにしたがって、インビトロでのシクロブタン型ピリミジンダイマー（ＣＰＤ）の形成により示されるような、ＵＶ誘導性ＤＮＡ損傷に対するポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３；「ＩＫ」）の効果を説明する。
【0207】
メスＳｋｈ：ｈｒ１無毛マウスを、実施例４で上述したように、太陽光模擬ＵＶ照射に曝露した。照射直後、また実施例４で説明したように、マウスを、背面に対して局所的に処置した。続いて、皮膚をＵＶＲ後３時間で固定し、上述したチミジンダイマー（ＣＰＤ）に対して向けられる抗体を１０μｇ／ｍＬで使用する免疫組織化学染色に供した。モノクローナルマウスＩｇＧアイソタイプ対照では、有意な染色が観察されなかった（図示せず）。図９において、核内の暗い染色は、チミジンダイマー（ＣＰＤ）の存在を示唆し、染色された％面積を表す。免疫組織学は、実施例４により定量化された。
【0208】
図９Ａで提示され、図１０で定量化された免疫組織学において確認することができるように、ポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３）は、急性ＵＶ照射後のＳｋｈ：ｈｒ１マウスの皮膚におけるＣＰＤ形成を阻害する。
【0209】
ＣＰＤ核についての免疫組織学的データの定量化は、媒体（陰性）対照と比較してＵＶ照射に曝露されたすべての処置群において統計的に有意な減少があった（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）ことを示した。アイソタイプ染色対照として使用されたモノクローナルマウスＩｇＧアイソタイプでは、有意な染色は観察されなかった（データを示さず）。
【0210】
これにより、ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲが、ＵＶ照射後の皮膚に局所的に適用された場合、ＵＶ照射により誘導される皮膚細胞におけるＣＰＤ核の形成により測定されるように、ＤＮＡ損傷を低下させることが示唆される。
実施例６：ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲは、ＵＶ照射後の皮膚に局所的に適用された場合、アポトーシス細胞の数を減少させる。
実施例６：ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲは、ＵＶ照射後の皮膚に局所的に適用された場合、アポトーシス細胞の数を減少させる。
【0211】
図１１は、ＵＶ照射後の細胞アポトーシスに対するポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３）の効果を説明する。
【0212】
上昇したＣＰＤの形状でのＵＶ誘導性ＤＮＡ損傷は、癌細胞の進行をもたらす表皮細胞における突然変異を誘導することができる。ＤＮＡ修復酵素の適用を通じたＣＰＤの低減は、ＵＶ誘導性皮膚癌の危険性を防ぎ、ＵＶ誘導性損傷後のアポトーシス細胞の量を低減する。ＵＶ照射後のアポトーシス皮膚細胞の数を、以下のプロトコルにしたがって評価した。
【0213】
実施例４の方法にしたがって、メスＳｋｈ：ｈｒ１無毛マウスを調製して照射し、生検した。生検の前で照射の直後、マウスをベースローション媒体（陰性対照）、媒体中の１１．４ｐｍｏｌ／ｃｍ２のカルシトリオール（陽性対照）、水中、２０ｕｇ、１００ｕｇまたは２００ｕｇで全量１００ｕＬのポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３）のいずれかで処置した。
【0214】
ＵＶＲ後３時間でＵＶ照射背部皮膚から生検を採取し、Ｈｉｓｔｏｃｈｏｉｃｅ固定剤（Ａｍｒｅｓｃｏ、ソロンＯＨ）中で６時間固定した。皮膚試料をパラフィン包埋し、すべての分析のために、５μｍの切片を切断した。切片（ＵＶ後２４時間）を、日焼け細胞の可視化のために慣例のヘマトキシリンおよびエオシン染色に供した。染色した切片を、Ｚｅｉｓｓ－Ａｘｉｏｐｌａｎ光学顕微鏡下、４０×倍率で調べ、皮膚切片の線形ミリメートルあたりの日焼け細胞の数を記録した。
【0215】
図１１に示すように、ポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３）の局所適用により、ＵＶ照射後のアポトーシスケラチノサイトの数が低減された。
【0216】
このデータから、ポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３）が、ＵＶ照射に曝露後のケラチノサイトアポトーシスを低減することが示される。
実施例７：ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲが、ＵＶ照射損傷後のヒト皮膚に局所的に適用された場合、ＤＮＡ損傷を低下させ、アポトーシス日焼け細胞の数を低減する。
実施例７：ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲが、ＵＶ照射損傷後のヒト皮膚に局所的に適用された場合、ＤＮＡ損傷を低下させ、アポトーシス日焼け細胞の数を低減する。
【0217】
【0218】
待機的手術で除去されたヒト皮膚を洗浄し、切開して約５ｍｍ×５ｍｍの小片に切断した。各小片を、各プレートが処置後３時間の効果を評価するように調製された９６ウェルプレートのウェルに置いた。すべての試料は、各処置につき三連で実行された。皮膚を１．５時間、太陽光模擬ＵＶ源からのＵＶ放射に供した（ＵＶＲ）か、非照射（ＳＨＡＭ）とした。ヒト皮膚は、マウス皮膚よりも厚みがあることを考えると、ヒト皮膚外植片は、マウス皮膚について使用したよりも３倍高い放射線量、すなわち、それぞれ２０Ｊ／ｃｍ２対７Ｊ／ｃｍ２に曝露し、研究用太陽シミュレータの出力スペクトルは、以前報告されており（Ｒｙｂｃｈｙｎ ＭＳら、Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２０１８年５月；１３８（５）：１１４６－１１５６）、直後に媒体対照、カルシトリオール（１ｎＭ）または５０μＭ、２５０μＭもしくは５００ｕＭの濃度でのポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３）を用いて処置した。
【0219】
３時間で採取した試料を、実施例５において説明したように、固定し、切片化し、染色し、定量した。
【0220】
図１２で提示された免疫組織学において確認することができるように、ＵＶ照射は、照射／処置後３時間で、すべての照射群においてＣＰＤを有する細胞（黒点として説明される）の数を増加させ、カルシトリオールまたは種々の濃度のポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３）を用いて処置した試料の場合、染色された細胞が少ない。このデータは、５００μＭのポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３）を用いて処置された場合、ＣＰＤ陽性細胞の割合が統計的に有意に低減した２つの個体について、図１３Ａおよび図１３Ｂにおいて定量化される。
【0221】
これにより、ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲが、ＵＶ照射後の皮膚に局所的に適用された場合、照射後３時間で急性ＵＶ照射後のヒト皮膚外植片におけるＣＰＤの形成を低減することができることが示唆される。これは、また、図９および図１０で提示されたマウスの結果を追認する。
【0222】
【0223】
皮膚外植片は、ＣＰＤについて上述したように、培養、照射および処置され、処置に続いて、例６について説明されるように染色して定量化した。
【0224】
図１４は、種々の処置群におけるＵＶ照射後３時間のヒト皮膚外植片の表皮１ｍｍあたりの日焼け細胞の数を示す。図１５は、種々の処置群におけるＵＶ照射後２４時間のヒト皮膚外植片の表皮１ｍｍあたりの日焼け細胞の数を示す。
【0225】
【0226】
このデータから、ポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３）が、ＵＶ照射後の皮膚に局所的に適用された場合、アポトーシス日焼け細胞の数を低減することが示唆される。
実施例８：ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲは、インビトロおよびヒト皮膚外植片でマトリックスメタロプロテイナーゼ－１（ＭＭＰ－１）活性を阻害する。
実施例８：ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲは、インビトロおよびヒト皮膚外植片でマトリックスメタロプロテイナーゼ－１（ＭＭＰ－１）活性を阻害する。
【0227】
ＵＶ誘導性皮膚損傷は、ヒト皮膚細胞において、光老化の特徴であるコラーゲンの破壊をもたらす可能性があるＭＭＰ－１の上昇を開始する。コラーゲンＩの消化の原因である主要な酵素、マトリックスメタロプロテイナーゼ１（ＭＭＰ－１）は、日光への曝露にゆり誘導される（Ｄｏｎｇ ＫＫら、Ｅｘｐ Ｄｅｒｍａｔｏｌ、２００８年、１７（１２）：１０３７－４４）ことが既知である。
【0228】
ポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３）のＭＭＰ－１活性に対する効果を、以下のプロトコルを使用して評価した。
【0229】
ＡＰＭＡを用いて３７℃で６０分間活性化させたヒトリウマチ滑膜線維芽細胞ＭＭＰ－１プロ酵素を活性化酵素として使用した。５μＭ、１０μＭ８００μＭおよび１０００μＭの濃度でポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３）を、改変ＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ７．２中、８ｎＭ活性化酵素と３７℃で６０分間プレインキュベートした。４ｍＭ Ｍｃａ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｄａｐ－Ａｌａ－Ａｒｇの添加により反応を開始し、２時間のインキュベーション期間が続いた。形成したＭｃａ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙの量の測定は、３４０ｎｍ／４００ｎｍで分光蛍光分析的に読み取った。
【0230】
図１６は、インビトロでのＭＭＰ－１の活性に対するポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３）の効果を説明し、図１７および図１８は、ＵＶ誘導性皮膚損傷後のヒト皮膚外植片におけるポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３）の効果を説明する。
【0231】
図１６において確認することができるように、ポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３）は、用量依存様式でＭＭＰ－１活性化を阻害する。このデータから、ポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３）が、経時的に光老化を低減するために使用することができることが示唆される。
【0232】
ヒト皮膚におけるＭＭＰ－１活性に対するポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３）の効果を、以下のプロトコルを使用して評価した。
【0233】
【0234】
待機的手術で除去されたヒト皮膚（２×ヒト外植片組織）を洗浄し、切開して約５ｍｍ×５ｍｍの小片に切断した。各小片を、各プレートが処置後３時間の効果を評価するように調製された９６ウェルプレートのウェルに置いた。皮膚を１．５時間、太陽光模擬ＵＶ源からのＵＶ放射に供した（ＵＶＲ）か、非照射（ＳＨＡＭ）とし、直後に媒体対照、カルシトリオール（１ｎＭ）または５０μＭ、２５０μＭもしくは５００ｕＭの濃度でのポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３）を用いて処置した。図１７において、μＭ濃度としてのＩＫ５０、ＩＫ２５０およびＩＫ５００は、それぞれ培養培地／外植片１２０μＬあたり１５μｇ、７５μｇおよび１５０μｇのＩＫ３４７２０を指す。
【0235】
３時間で採取した試料を固定し、切片化し、ＭＭＰ１について免疫組織化学的に染色し、調べた全表皮面積の関数としてＭＭＰ１について染色された表皮面積を表すことによりＭＭＰ１発現について定量化した。
【0236】
図１７で提示された免疫組織学において確認することができるように、ＵＶ照射は、照射／処置後３時間で、すべての照射群においてＭＭＰ－１活性について染色される細胞（黒点として説明される）の数を増加させ、カルシトリオールまたは種々の濃度のポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３）を用いて処置した試料の場合、染色された細胞が少ない。アイソタイプ染色対照として使用されたモノクローナルマウスＩｇＧアイソタイプでは、有意な染色は観察されなかった（データを示さず）。
【0237】
このデータは、５００μＭのポリペプチドＩＫ３４７２０（配列番号３）を用いて処置された場合、ＭＭＰ１陽性細胞の割合が統計的に有意に低減した外植片について、図１８において定量化される。これにより、ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲが、ＵＶ照射後の皮膚に局所的に適用された場合、ＵＶ照射により誘導されるＭＭＰ１発現を低下させることが示唆される。
実施例９：ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲは、真皮皮膚線維芽細胞溶解物におけるＵＶ誘導性脂質過酸化を阻害する。
実施例９：ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲは、真皮皮膚線維芽細胞溶解物におけるＵＶ誘導性脂質過酸化を阻害する。
【0238】
飽和脂質とは対照的に皮膚の自然な油バリアを維持するのに役立つので、多価不飽和脂肪酸（脂質）は、石鹸、スキンケアローションおよびクリーム、アフターシェーブ、メイク落としなどとして化粧品に高頻度で使用される。さらに、脂質の飽和が少ないと、脂質の流動性が高くなる。しかし、不飽和脂質は、ＵＶ照射などの薬剤からの酸化をより受けやすいので、抗酸化剤、例えば、ビタミンは、スキンケア配合物に添加されることが多い。
【0239】
酸化剤は、脂質構造を変更することができ、結果として、チオバルビツール酸反応性物質（ＴＢＡＲＳ）として測定することができるマロンジアルデヒドの形成となる脂質過酸化物を生成する。
【0240】
実施例４に示されるように、ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲは、ＵＶ照射後の皮膚に局所的に適用された場合、皮膚におけるＵＶ誘導性酸化ストレスを低減する。
【0241】
細胞由来脂質のＵＶ誘導性酸化的損傷を変更するポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲの能力を、ＴＢＡＲＳチオバルビツール酸反応性物質（ＴＢＡＲＳ）脂質過酸化アッセイを使用して調べた。
【0242】
真皮線維芽細胞の照射後または偽照射後、上清（９００μＬ）を回収した。つまり、９０μＬのブチル化ヒドロキシトルエン（エタノール中２％ｗ／ｗ）を加え、ＴＢＡＲＳアッセイまで、試料を凍結（－２０℃）したままにした。ペトリ皿を１ｍＬのＨＢＳＳで２回洗浄し、細胞を６００μＬの水中でこすり取り、６０μＬの０．５％水性Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００をこの溶液に加え、タンパク質測定のためにローリー法（Ｌｏｗｒｙ ＯＨら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９５１年、１９３：２６５－２７５）により実行した。ＴＢＡＲＳは、説明したように（Ｍｏｒｌｉｅｒｅ Ｐら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１９９１年、１０８４：２６１－２６８）、蛍光定量的アッセイであった。手短に言うと、酸性条件でチオバルビツール酸の存在下、解凍した試料を加熱し、ＴＢＡＲＳを１－ブタノールで抽出し、蛍光定量的に定量した（λｅｘｃ＝５１５ｎｍおよびλｅｍ＝５５０ｎｍ）。アッセイ条件下でマロンジアルデヒド－チオバルビツール酸付加物を定量的に生じるテトラエトキシプロパンを、校正のために使用した。マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）当量で表されるＴＢＡＲＳ値は、各ペトリ皿について細胞タンパク質に対して正規化された。各ＴＢＡＲＳ測定を三連（例えば、データポイントあたり３つのペトリ皿）で実行した。
【0243】
図１９において確認することができるように、ＵＶ照射は、照射／処置後のすべての照射群においてＴＢＡ反応性物質（ＴＲＳ）の数を増加させる。Ｓｈａｍと処置がないＵＶ照射との間のＴＲＳにおける有意差は、最小用量のＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲと比較して、１，２５Ｄまたは最大濃度（５μＭ）でのＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（「ＩＫ－３」）のいずれかの存在下では確認されない。
【0244】
これにより、ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲが、真皮皮膚線維芽細胞溶解物における細胞由来脂質のＵＶ誘導性酸化的損傷を低下させることが示唆される。
実施例１０：メラニン生産に対するＩＫ１４８００の効果。
実施例１０：メラニン生産に対するＩＫ１４８００の効果。
【0245】
ＵＶＡによる黒色腫誘導は、メラニン色素を必要とし、ＵＶＢ照射は、黒色腫を開始する。スキンケア製品の望ましい効果は、直射日光曝露から生じる皮膚色素沈着を低減することである。
【0246】
実施例２は、ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲが、ケラチノサイトの太陽光模擬ＵＶ照射への曝露後に適用される場合、初代ケラチノサイトにおけるｐＣＲＥＢ形成を阻害することを示す。リン酸化ＣＲＥＢは、ｍｙｃ様のマスター転写制御因子であり、メラノサイトにおいては、チロシナーゼおよび他の色素生合成酵素の発現を促進する、小眼球症（ＭＩＴＦ）転写因子の活性化を誘導する。
【0247】
メラニン生産を変更するポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲの能力を調べた。
【0248】
つまり、ＭＭ１４１８－Ｃ１のわずかに色素沈着した黒色腫細胞を、２４ウェル培養プレートで増殖させ、２ｋＪ／ｃｍ２のＵＶＢ放射に曝露する前２４時間、１０μＭのＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（「ＩＫ－３」）を用いて処置した。「Ｃｏｎ」と標識された対照（ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲで処置されていない）および「ＵＶＢ」を、それぞれ０または２ｋＪ／ｃｍ２のＵＶＢ放射のいずれかに曝露した。細胞群を２４時間インキュベータに戻し、その後、細胞中のメラニンおよびタンパク質の量を、分光光度的に測定した。各実験において、三連の試料を測定した。図１９に示すデータは、ＵＶＢ放射に曝露される前２４時間、０または１０μＭのＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲを用いて前処置された、０または２ｋＪ／ｃｍ２のＵＶＢに曝露された平均値±ＳＥＭ（μｇメラニン／ｍｇ細胞タンパク質）を示唆する。ｔ－検定（両側）を使用して、統計的有意性、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１を決定した。
【0249】
図２０において確認することができるように、ＵＶＢ照射は、細胞のメラニン含量を有意に増加させる。重要なことに、ＵＶＢ処置の前にＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲを用いて処置された細胞は、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲを用いて処置されなかった細胞と比較してメラニン含量の有意な低下を示す。
【0250】
これにより、ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲは、ＵＶＢによるメラニン誘導を低下させることが示唆される。
【0251】
本明細書に記載のすべての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈により明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実行することができる。本明細書において提供される任意またはすべての実施例または典型的な言語（例えば、「など」）の使用は、例の実施形態をよりよく明らかにすることを単に意図するだけであり、別段の主張がない限り、特許請求の範囲に記載の本発明の制限を課すわけではない。明細書におけるすべての言語は、あらゆる非主張の要素を必須として示すものとして解釈されるべきではない。
【0252】
本明細書において提供される説明は、共通の特徴および主要点を共有することができるいくらかの実施形態に関連する。一実施形態の１つまたは複数の主要点が、他の実施形態の１つまたは複数の主要点と組み合わせ可能であり得ることが理解される。加えて、実施形態の１つの主要点または主要点の組み合わせは、追加の実施形態を構成することができる。
【0253】
当業者は、本明細書に記載の本発明が、具体的に記載されているもの以外の変更および修正を受けやすいことを理解するであろう。本発明が、そのようなすべての変更および修正を含むことが理解される。本発明は、また、本明細書において個々にまたは集合的に言及または示唆されるすべてのステップ、主要点、組成物および化合物、ならびにそのステップまたは主要点の任意の２つ以上の任意およびすべての組み合わせを含む。
【0254】
本明細書において使用される見出し語は、読者の参照を容易にするためにのみ含まれており、本開示または特許請求の範囲全体で認められる主題を制限するために使用されるべきではない。見出し語は、特許請求の範囲または特許請求の制限の解釈に使用されるべきではない。
【0255】
また、本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈がすでに他のことを規定しない限り、複数の態様を含むことに留意する。したがって、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つまたは複数」、および「少なくとも１つ」は、本明細書において交換可能に使用される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【手続補正書】
【提出日】2024-04-17
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
哺乳動物における創傷治癒を促進するための、または皮膚症状を予防および／もしくは処置するための薬剤の製造における、アミノ酸配列ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号１）、または前記アミノ酸配列のデキストロ－レベルソ形（ｒｙｌｐｎｋａｋｓｒ；配列番号２）、およびポリアルギニンアミノ酸配列領域を含む単離または精製ポリペプチドの使用であって、前記皮膚症状が、酸化的損傷、ＤＮＡ損傷、直射日光曝露により誘発される損傷、紫外線放射誘導性損傷、ＣＰＤおよび／または８－ＨｄＧ形成により特徴づけられる皮膚状態、皮膚の老化、ならびに皮膚のシワからなる群から選択される、使用。
【請求項2】
前記紫外線放射誘導性損傷が、ＵＶＢ誘導性損傷またはＵＶＡ誘導性損傷である、請求項１に記載の使用。
【請求項3】
創傷治癒を促進するための、または皮膚症状を予防および／もしくは処置するための医薬組成物であって、前記医薬組成物が、アミノ酸配列ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号１）、または前記アミノ酸配列のデキストロ－レベルソ形（ｒｙｌｐｎｋａｋｓｒ；配列番号２）、およびポリアルギニンアミノ酸配列領域を含むポリペプチドの有効量を含み、前記皮膚症状が、酸化的損傷、ＤＮＡ損傷、直射日光曝露により誘発される損傷、紫外線放射誘導性損傷、ＣＰＤおよび／または８－ＨｄＧ形成により特徴づけられる皮膚状態、皮膚の老化、ならびに皮膚のシワからなる群から選択される、医薬組成物。
【請求項4】
前記紫外線放射誘導性損傷が、ＵＶＢ誘導性損傷またはＵＶＡ誘導性損傷である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項5】
細胞におけるＣＲＥＢリン酸化を阻害するためのインビトロの方法であって、アミノ酸配列ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号１）、または前記アミノ酸配列のデキストロ－レベルソ形（ｒｙｌｐｎｋａｋｓｒ；配列番号２）を含む単離または精製ポリペプチドの有効量により細胞をインビトロで処置することを含む、インビトロの方法。
【請求項6】
細胞における８－ＯＨｄＧ形成を阻害するためのインビトロの方法であって、アミノ酸配列ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号１）、または前記アミノ酸配列のデキストロ－レベルソ形（ｒｙｌｐｎｋａｋｓｒ；配列番号２）を含む単離または精製ポリペプチドの有効量により細胞をインビトロで処置することを含む、インビトロの方法。
【請求項7】
細胞におけるＣＰＤ形成を阻害するためのインビトロの方法であって、アミノ酸配列ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号１）、または前記アミノ酸配列のデキストロ－レベルソ形（ｒｙｌｐｎｋａｋｓｒ；配列番号２）を含む単離または精製ポリペプチドの有効量により細胞をインビトロで処置することを含む、インビトロの方法。