特開 2024-75707 タンパク質発現効率が向上した宿主細胞およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024075707

(43)【公開日】2024-06-04

(54)【発明の名称】タンパク質発現効率が向上した宿主細胞およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/16 20060101AFI20240528BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240528BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20240528BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20240528BHJP

   C12N 15/63 20060101ALN20240528BHJP

【ＦＩ】

C12N5/16 ZNA

C12P21/08

C12P21/02

C12N15/113 Z

C12N15/63 Z

【審査請求】有

【請求項の数】6

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2024045619

(22)【出願日】2024-03-21

(62)【分割の表示】P 2020556221の分割

【原出願日】2018-09-29

(31)【優先権主張番号】62/610,918

(32)【優先日】2017-12-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】523276223

【氏名又は名称】タイワン バイオマニュファクチュアリング コーポレーション

(74)【代理人】

【識別番号】100116850

【弁理士】

【氏名又は名称】廣瀬 隆行

(74)【代理人】

【識別番号】100165847

【弁理士】

【氏名又は名称】関 大祐

(72)【発明者】

【氏名】ルー シン－リン

(72)【発明者】

【氏名】リン チィエン－イ

(72)【発明者】

【氏名】テン チャオ－イ

(57)【要約】      （修正有）

【課題】タンパク質（例えば、抗体）産生効率が改善された新しいタイプの宿主細胞を提供する。
【解決手段】タンパク質発現のための宿主細胞は、野生型細胞と比較して遺伝子の低い発現レベルを有し、遺伝子はＨＤＡＣ８、Ｄａｂ２、Ｃａｓｐａｓｅ３、Ｓｙｓ１、Ｅｒｇｉｃ３、Ｇｒａｓｐ、Ｔｒｉｍ２３、またはそれらの組合せから選択される。宿主細胞はＣＨＯ細胞である。遺伝子の低い発現レベルは、ＲＮＡ干渉に起因し、これは、遺伝子を標的とするｓｈＲＮＡを含むベクターをトランスフェクトすることによって達成され得る。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

タンパク質発現のための宿主細胞であって、前記宿主細胞は、野生型細胞と比較して遺伝子のより低い発現レベルを含み、前記遺伝子は、Ｄａｂ２、Ｃａｓｐａｓｅ３、Ｓｙｓ１、Ｅｒｇｉｃ３、Ｇｒａｓｐ及びＴｒｉｍ２３からなる群から選択され、
前記宿主細胞は、６０世代以上にわたって生存率約１００％の細胞株（stable cell line）であり、
前記宿主細胞は、前記遺伝子を標的としたショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞にトランスフェクションすることにより産生され、
前記遺伝子のより低い発現レベルは、コントロールと比べて８５％以下のレベルであり、
前記コントロールは、野生型細胞における発現レベルであり、
前記宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、
宿主細胞。

【請求項2】

前記遺伝子が、Ｄａｂ２及びＣａｓｐａｓｅ３からなる群から選択される、
請求項１に記載の宿主細胞。

【請求項3】

前記遺伝子がＣａｓｐａｓｅ３である、
請求項１に記載の宿主細胞。

【請求項4】

請求項１から３のいずれか一項に記載の宿主細胞に前記タンパク質をコードする発現ベクターをトランスフェクトすることと、
トランスフェクトされた前記宿主細胞を培養することと、を含む、
請求項１から３のいずれか一項に記載の宿主細胞を使用してタンパク質を産生する方法。

【請求項5】

前記タンパク質が抗体である、
請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記抗体がＨｅｒ２に対する抗体、メソセリン（ＭＳＬＮ）に対する抗体、またはＴ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有－３（Ｔｉｍ３）に対する抗体である、
請求項５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、タンパク質産生のための宿主細胞、特に野生型細胞と比較してより高いレベルでタンパク質を産生することができるＣＨＯ細胞などの操作された宿主細胞に関する。

【背景技術】

【0002】

タンパク質製剤は、通常、適切な宿主細胞での発現によって生成される。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、タンパク薬製造に最も広く使用されている宿主細胞である。宿主細胞の最適化（例えば、宿主細胞の遺伝子改変による）または下流工程の最適化は、タンパク薬産生効率を高めるために検討されている。現在、例えば化学試薬を使用することによって、または細胞の遺伝子改変によって、タンパク質発現および／または分泌を向上させるための多くの戦略が利用可能である。

【0003】

遺伝子改変では、通常、転写、転写後調節、翻訳、翻訳後イベントに関与する遺伝子を標的にする。例えば、転写後調節エレメント（ＰＴＲＥ）は、タンパク質発現を向上させるための操作の標的になってきた（Ｍａｒｉａｔｉら、「Ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．、２０１２、８０１：１２５－３５を参照）。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

タンパク質発現宿主細胞を改変するための従来技術は有用であるが、宿主細胞におけるタンパク質発現を向上させるための他の方法が依然として必要である。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明の実施形態は、タンパク質（例えば、抗体）産生効率が改善された新しいタイプの宿主細胞に関する。新しいタイプの宿主細胞は、タンパク質発現または分泌に影響を与えることが予期せず発見された１つ以上の遺伝子を改変するように遺伝子操作されている。そのような遺伝子は、タンパク質発現を向上させるための操作の標的であった、転写後調節エレメントなどの以前から知られている遺伝子とは異なる。本発明において操作される遺伝子は、転写、転写後調節、翻訳、または翻訳後イベントとは関係がない。したがって、これらの遺伝子の発現を抑制することがタンパク質発現／分泌の向上をもたらすことができることは予想外であった。

【0006】

本発明の実施形態によれば、宿主細胞の遺伝子工学は、ＨＤＡＣ８、Ｄａｂ２、Ｃａｓｐａｓｅ３、Ｓｙｓ１、Ｅｒｇｉｃ３、Ｇｒａｓｐ、およびＴｒｉｍ２３から選択される１つ以上の遺伝子のノックダウンを含み得る。遺伝子ノックダウンは、標的遺伝子とのＲＮＡ干渉など、当該技術分野で公知の任意の適切な遺伝子工学技術によって達成することができる。これらの遺伝子を標的とするＲＮＡｉは、適切な構築物を細胞にトランスフェクトして、これらの標的遺伝子をノックダウンして、操作された宿主細胞を産生することにより行われ得る。

【0007】

好ましい実施形態において、宿主細胞はＣＨＯ細胞であり、標的遺伝子は、ＨＤＡＣ８、ＤＡＢ２、またはＣａｓｐａｓｅ３遺伝子、あるいはそれらの組合せであり得る。ショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはｓｉＲＮＡによるこれらの遺伝子の１つ以上の阻害または抑制は、向上したタンパク質発現および／または分泌を支援できる宿主細胞を産生する。例えば、Ｃａｓｐａｓｅ３のｓｈＲＮＡ阻害は、宿主細胞のアポトーシスの減少につながることができる。したがって、短期的な阻害または長期的な阻害のいずれかによるｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡによるＣａｓｐａｓｅ３遺伝子の阻害は、タンパク質（抗体など）の産生を増加させることができる。

【0008】

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＨＤＡＣ８、ＤＡＢ２、またはＣａｓｐａｓｅ３のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ阻害は、安定細胞株をもたらし得る。これらの安定細胞株は、それらのトランスフェクション効率、抗体発現の増加、乳酸代謝、成長率、新しい培地への適応性、および／または長期経時（例えば６０世代以上）での安定性を評価した後に選択され得る。より多くのタンパク質（抗体など）を産生／分泌できることに加えて、これらの安定細胞はまた、より高い安定性と新しい培地に適応できるという特徴を有する。したがって、これらは下流のプロセス開発に適している。

【0009】

本発明の一態様は、タンパク質発現のための宿主細胞に関する。本発明の一実施形態によれば、宿主細胞は、野生型細胞と比較して、ＨＤＡＣ８、Ｄａｂ２、Ｃａｓｐａｓｅ３、Ｓｙｓ１、および／またはＴｒｉｍ２３遺伝子のより低い発現レベルを含む。例えば、操作された宿主細胞は、遺伝子ノックダウンとして現れる発現レベルが１５％以上低いことがある。すなわち、ノックダウン細胞は、野生型細胞と比較して、８５％以下のレベルで特定の遺伝子を発現し得る。

【0010】

本発明の好ましい実施形態によれば、より低い発現レベルを有する遺伝子は、ＨＤＡＣ８、Ｄａｂ２、Ｃａｓｐａｓｅ３、またはそれらの組合せである。遺伝子のいくつかの実施形態によれば、宿主細胞はＣＨＯ細胞である。本発明のいくつかの実施形態によれば、転写後調節遺伝子またはアポトーシス遺伝子のより低い発現レベルは、ＲＮＡ干渉に起因する。

【0011】

本発明の他の態様は、以下の説明、図面、および添付の特許請求の範囲によって明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】１Ｃ９細胞における様々な遺伝子のノックダウン後のタンパク質産生レベルを示す。１Ｃ９は低ＩｇＧ産生細胞株である（バッチ培養６日目で１．２８ｍｇ／Ｌ）。１Ｃ９細胞を使用して、様々な遺伝子のｓｉＲＮＡ阻害によってＩｇＧ分泌を増加できるか否かを確認した。

【0013】

【図2】ＮｉｍｂｌｅＧｅｎｅおよびＡｇｉｌｅｎｔからの遺伝子アレイを使用する高および低産生細胞の分析から選択されたノックダウンのための候補遺伝子を示す。

【0014】

【図3】標的遺伝子のノックダウンを伴う様々な細胞株におけるタンパク質（アバスチンおよびハーセプチン）発現レベルを示す。

【0015】

【図4】ｓｈＲＮＡ構築物に適した非レンチウイルスベクター（プラスミド）を示す。

【0016】

【図5】ｓｈＲＮＡの構築のためのレンチウイルスに由来するプラスミドを示す。

【0017】

【図6】ｓｈＲＮＡの配列フォーマットの例を示す。

【0018】

【図7】様々な濃度でピューロマイシンを使用する細胞プールの選択を示す。

【0019】

【図8】図７に記載されるように、ピューロマイシンを用いて選択された様々なトランスフェクタント細胞におけるタンパク質発現レベルを示す。

【0020】

【図9】操作された細胞の単一クローンを単離するための手順を図示する概略図を示す。

【0021】

【図10】Ｃａｓｐａｓｅ３ノックダウンを有する上位５つの単一クローンにおけるタンパク質発現レベル（一過性発現）を示す。

【0022】

【図11A】長期培養（最大６週間）における上位５つの単一クローンの特性（集団倍加時間、乳酸レベル、Ｃａｓｐａｓｅ３遺伝子発現レベル）に関する上位５つの単一クローンの分析結果を示す。

【0023】

【図11B】長期培養中の異なる時点での上位５つの単一クローンにおけるＣａｓｐａｓｅ３ノックダウンレベルを示す。

【0024】

【図12】上位５つの単一クローンの長期安定性を示し、倍加時間と生細胞の割合を時間の関数として図示する（最大１００世代）。

【0025】

【図13】時間の関数としての上位３つの単一クローンを使用したタンパク質発現レベルを示す（０週、３週および６週）。

【0026】

【図14A】上位３つの単一クローンに由来する第２世代細胞の特性を示す。

【0027】

【図14B】本発明の実施形態によるＣＨＯ細胞のトランスフェクション率を示す。

【0028】

【図14C】第２世代細胞におけるＣａｓｐａｓｅ３発現レベルを示す。

【0029】

【図15】第１世代細胞および親細胞と比較した、第２世代細胞におけるタンパク質発現レベルを示す。

【0030】

【図16】本発明のＣＨＯ細胞で産生されたハーセプチンのグリカンプロファイルを示し、主要なグリカンが、市販のハーセプチンのものと同様のＧ０Ｆ、Ｇ１Ｆａ、Ｇ１Ｆｂ、およびＧ２Ｆを含むことを示す。

【発明を実施するための形態】

【0031】

本発明の実施形態は、タンパク質産生のための新しい細胞株の開発に関する。タンパク質（抗体など）の産生および／または分泌効率が向上したこれらの新しい宿主細胞。これらの細胞において操作される遺伝子は、転写、転写後調節、翻訳、または翻訳後イベントに直接関連していないため、これらの遺伝子の発現を抑制することがタンパク質発現／分泌の向上をもたらすことができることは予想外であった。

【0032】

本発明の発明者らは、ＣＨＯ細胞ゲノムおよびトランスクリプトームを分析することにより、ＨＤＡＣ８、Ｄａｂ２、Ｃａｓｐａｓｅ３、Ｓｙｓ１、Ｅｒｇｉｃ３、Ｇｒａｓｐ、およびＴｒｉｍ２３遺伝子の１つ以上の抑制が、タンパク質発現および／または分泌が改善されたＣＨＯ細胞をもたらすことができることを見出した。ＨＤＡＣ８は、細胞分裂中の染色体の構造および組織の調節に関与している。Ｄａｂ２は、選択された積み荷タンパク質のクラスリン媒介エンドサイトーシスに必要なクラスリン関連選別タンパク質（ＣＬＡＳＰ）として機能するアダプタータンパク質である。Ｃａｓｐａｓｅ３は、アポトーシスの実行に関与するＣａｓｐａｓｅの活性化カスケードに関与している。アポトーシスの開始時に、Ｃａｓｐａｓｅ３はタンパク質分解によりポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）を切断する。Ｓｙｓ１はＧｏｌｇｉ－ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｉｎｔｅｇｒａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇであり、ゴルジ輸送に関与している。Ｔｒｉｍ２３（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ ｍｏｔｉｆ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ２３）は、細胞内輸送小胞の形成、あるコンパートメントから別のコンパートメントへのそれらの移動に役割を果たす。Ｅｒｇｉｃ３は、このタンパク質ファミリの他のメンバと相互作用して代謝回転を増加させる小胞体－ゴルジ中間コンパートメント（ＥＲＧＩＣ）タンパク質であるサイクリング膜タンパク質をコードする。Ｇｒａｓｐは、分子足場として機能するタンパク質をコードし、グループ１代謝型グルタミン酸受容体を含む受容体を神経タンパク質に結合する。これらの遺伝子はいずれも、転写または翻訳の調節に直接関与していない。したがって、これらの遺伝子の抑制がタンパク質発現および／または分泌の向上につなげることができるという事実は予想外である。

【0033】

本発明の実施形態によれば、ＣＨＯ染色体およびトランスクリプトームを分析して、操作する標的遺伝子を選択した。要するに、ＣＨＯ共同体によって提供される遺伝子チップが分析された。一例では、導入遺伝子を含まない合計４つのＣＨＯ細胞株を分析した。１つの株はＣＨＯ－Ｓ産生細胞株で、他の３つの株は実験室で栽培化された浮遊ＣＨＯ細胞株である。

【0034】

さらに、高収量特性または低収率特性を持つ３組のＣＨＯ細胞を分析した。高収量ＣＨＯ細胞では低レベルで発現されるが、低収量ＣＨＯ細胞では高レベルで発現される遺伝子は、タンパク質の高レベルの発現につながらない可能性がある遺伝子である。したがって、そのような遺伝子は、宿主細胞でのタンパク質発現を改善するためのＲＮＡｉ介入の候補標的となり得る。そのような遺伝子が実際にタンパク質発現／分泌効率に影響を与えるか否かを調査するために、これらの標的遺伝子の発現レベルは、ＲＮＡ干渉によって減少された。これらの遺伝子との干渉のための様々なＲＮＡｉ構築物が調製された。これらの構築物を一時的にＣＨＯ細胞にトランスフェクトして、タンパク質発現ならびに細胞の増殖および安定性への影響をスクリーニングすることができる。

【0035】

図１に示されるように、ＨＤＡＣ８、Ｔｒｉｍ２３、Ｓｙｓ１、Ｅｒｇｉｃ３、Ｄａｂ２、およびＧｒａｓｐ遺伝子のノックダウンは、改変された細胞におけるタンパク質発現および／または分泌の向上をもたらした。さらに、ＨＤＡＣ８とＤａｂ２ノックダウンの組合せは、タンパク質発現の改善に最も効果をもたらすことが分かった。具体的には、ＨＤＡＣ８とＤａｂ２の両方の遺伝子のノックダウンは、１．６５倍～１．８倍のタンパク質を発現できる細胞をもたらした。

【0036】

同様のアプローチを使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ（カリフォルニア州サンタクララ）から１つとＲｏｃｈｅ ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ（ウィスコンシン州マディソン）から１つの、２つの追加のＣＨＯ細胞遺伝子配列を分析した。低収量の細胞株で高度に発現するこれらの遺伝子は、干渉の標的として同定された。これらの分析から、図２に示すように、２つの追加の遺伝子、ＢＡＸおよびＣａｓｐａｓｅ３がノックダウン候補として同定された。

【0037】

これらの標的遺伝子に基づいて、ＲＮＡ干渉への様々なアプローチを使用して、それらの機能を抑制できる。例えば、標的配列（ＨＤＡＣ８＋Ｄａｂ２、Ｃａｓｐａｓｅ３、ＢＡＸ、およびＣａｓｐａｓｅ３＋ＢＡＸ）を含むｓｈＲＮＡプラスミドが構築され得る。本発明の実施形態では、任意の適切なプラスミドまたはベクターを使用し得る。例えば、レンチウイルスプラスミドまたはｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターは、ｓｈＲＮＡによく使用される。Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（マサチューセッツ州Ｗａｌｔｈａｍ）のＢＬＯＣＫ－ｉＴ（商標）レンチウイルスＲＮＡｉ発現システムなどの市販のキットを使用できる。

【0038】

これらのプラスミドはバクテリア内で増幅される。次に、ｓｈＲＮＡを含むプラスミドが目的の細胞株（ＤＸＢ１１－Ｓ１など）にトランスフェクトされた。（プラスミド中の抗生物質耐性に基づいて、例えば０．５～１０μｇ／ｍｌピューロマイシンを使用して死滅曲線を判定することによって）トランスフェクタントのトランスフェクション効率を評価し、遺伝子抑制の長期的な効果を分析し得る。これらの細胞株における標的遺伝子の遺伝子抑制は、リアルタイムＰＣＲを使用して分析できる。最後に、これらの細胞を生化学的、細胞または分子生物学的アッセイで分析し、これらの遺伝子の機能を調査した。

【0039】

これらの遺伝子に個別に干渉することに加えて、これらの標的遺伝子の組合せノックダウンもまた調査された。図３に示すように、ＨＤＡＣ８とＤａｂ２のノックダウンの組合せにより、ほとんどの細胞株（１Ｃ９、１Ｇ９、１Ｇ７、１Ｅ３、および３Ｃ８）において、タンパク質発現レベルが１．２８倍～１．８８倍増加した。産生の向上は、高産生細胞（１Ｅ３、３Ｃ８、および３Ｇ７）と比較して、低産生細胞（１Ｃ９、１Ｇ９、および１Ｇ７）でより顕著である。これらの向上は、これらの細胞で発現した様々な抗体（アバスチンおよびハーセプチン）で見られ、産生の向上が特定のタンパク質に限らず、一般的なタンパク質産生に適用できることを示している。

【0040】

２つの標的遺伝子の同時のノックダウンの組合せは、相乗効果を生み得る。例えば、ＨＤＡＣ８とＤａｂ２のそれぞれのノックダウンは、１Ｃ９細胞中でアバスチンが１．２８倍および１．３２倍生成されたのに対し、ＨＤＡＣ８とＤａｂ２のノックダウンの組合せは、同じ細胞中で１．６５倍の発現が生成された。同様に、ＨＤＡＣ８とＤａｂ２のそれぞれのノックダウンは、１Ｇ９細胞中でアバスチンが０．７８倍および１．３２倍生成されたのに対し、ＨＤＡＣ８とＤａｂ２のノックダウンの組合せは、同じ細胞中で１．８８倍の発現が生成され、相乗効果を示す。

【0041】

一過性で安定したトランスフェクション、および宿主細胞へのｓｈＲＮＡ発現カセットの安定した送達を可能にする様々なｓｈＲＮＡベクターが利用できる。本発明の実施形態によると、ＣＨＯ細胞へのｓｈＲＮＡ構築物のトランスフェクションは、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（図４、マサチューセッツ州ＷａｌｔｈａｍにあるＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから入手可能）およびｐＧＦＰ－Ｃ－ＳｈＬｅｎｔｉ（図５、メリーランド州ＲｏｃｋｖｉｌｌｅにあるＯｒｉＧｅｎｅから入手可能）などの市販のベクターを含む任意の適切なベクターを使用し得る。当技術分野で知られている他の適切なベクターも使用し得る。

【0042】

レンチウイルスベクターはｓｈＲＮＡ構築物を細胞ゲノムに送達および統合するための便利な方法を提供し得るが、レンチウイルス要素を使用せずに医薬用タンパク質を産生することが好ましいことがある。次の例は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ（マサチューセッツ州Ｗａｌｔｈａｍ）のｐｃＤＮＡ３．１（＋）の使用を示している。

【0043】

例としてｐｃＤＮＡ３．１（＋）（図４）プラスミドを使用して、図６に示される構造を有するステムループ配列／フレームワークをプラスミドに挿入し得る。図６のオリゴは、典型的なステムループ構造構築物を示している。これらのプラスミドを用いて、標的遺伝子の配列を含むいくつかの構築物が調製された。これらのプラスミドの構築が成功したことは、正しいサイズの断片を生成するための制限酵素消化物で確認し得る。

【0044】

これらの構築物を使用して、ＤＸＢ１１細胞などのＣＨＯ細胞をトランスフェクトした。次に、トランスフェクトされた細胞を、標的遺伝子の阻害について評価した。図７に示すように、様々なトランスフェクトされた細胞株（ＤＸＢ１１ ｓｈ－ＨＤＡＣ８＋Ｄａｂ２、ＤＸＢ１１ ｓｈ－Ｃａｓｐａｓｅ３、ＤＸＢ１１ ｓｈ－ＢＡＸ－ｐｏｏｌおよびＤＸＢ１１ ｓｈ－ＢＡＸ＋Ｃａｓｐａｓｅ３）は選択可能なマーカー（例えば、ピューロマイシン耐性）に基づいて選択されてもよく、次いで標的遺伝子のより良い阻害のためにスクリーニングされてもよい。要するに、これらのトランスフェクトされた細胞株は、様々な濃度の抗生物質（例えば、ピューロマイシン）でスクリーニングされ、標的遺伝子の抑制がリアルタイムＰＣＲで評価された。これらのスクリーニングに基づいて、最良の候補宿主細胞が同定された。これらの最良の細胞株には、例えば、５０μｇ／ｍｌピューロマイシンを用いて選択されたＤＸＢ１１ ｓｈ－ＨＤＡＣ８＋Ｄａｂ２（ＨＤ５０Ｐ）、１０μｇ／ｍｌピューロマイシンを用いて選択されたＤＸＢ１１ ｓｈ－Ｃａｓｐａｓｅ３（Ｃ１０Ｐ）、７．５μｇ／ｍｌピューロマイシンを用いて選択されたＤＸＢ１１ ｓｈ－ＢＡＸ（Ｂ７．５Ｐ）、および１０μｇ／ｍｌピューロマイシンを用いて選択されたＤＸＢ１１ ｓｈ－ＢＡＸ＋Ｃａｓｐａｓｅ３（ＢＣ１０Ｐ）が含まれる。

【0045】

最良の候補宿主細胞は、タンパク質産生の向上を支援する能力についてさらに評価された。これらの細胞は、ＳＥＡＰ（分泌型アルカリホスファターゼ）、ハーセプチン、アバスチンなどの様々なタンパク質の産生でテストされた。図８に示されるように、これらの細胞株のほとんどは、様々な培養条件下でより多くのタンパク質を産生した。

【0046】

安定細胞株を得るために、これらの細胞は段階的に希釈され、単一クローン用に選択されてもよい。例として１０μｇ／ｍｌピューロマイシンを用いて選択されたＤＸＢ１１ ｓｈ－Ｃａｓｐａｓｅ３（Ｃ１０Ｐ）細胞を使用し、ＣｌｏｎｅＰｉｘまたは他の適切な機器／プロトコルを使用して、図９に示す手順を用いて単一クローンを単離する。図９は、単一クローンの単離のための１つのプロトコルを図示する。要するに、細胞のトランスフェクション後、細胞は増幅およびスクリーニングされ、その後サブクローニングされる。細胞株は、無血清の化学的に定義された培地での懸濁培養に適合され得る。次に、トランスフェクタントの安定したプールを生成して特徴付けてから、高産生の安定した単一クローンを生成する。当業者は、これが単に例示のためであり、単一クローンの単離を達成するための他の手順も使用され得ることを理解するであろう。

【0047】

図９に示すように、これらの細胞における遺伝子発現の抑制は、リアルタイムＰＣＲを使用して確認され得る。これらの分析から、異なる標的遺伝子（例えば、ｃａｓｐａｓｅ３）のノックダウンパーセンテージを持つ細胞を得ることができる。次に、これらの細胞を６ウェルプレートに適切な濃度で播種し（例えば、各５ｍｌウェル中に３×１０^５細胞／ｍｌ）、適切な期間培養する。生細胞密度（ＶＣＤ）、集団倍加時間（ＰＤＴ）、およびこれらの細胞の乳酸レベルを測定して、細胞の健康状態を評価した。

【0048】

次に、これらの細胞中の標的遺伝子ノックダウンがタンパク質産生に及ぼす影響を、タンパク質遺伝子（ＩｇＧなど）を担持する発現ベクターの一過性トランスフェクションを用いて調査され得る。これらの細胞が高レベルのタンパク質発現を支援することが確認されると、培地に選択薬（例えば、ジェネティシンまたはピューロマイシン）を加えることにより、安定細胞プールを選択し得る。最初に使用する適切な薬物濃度を滴定し、次に、選択された薬剤耐性マーカーを持つトランスフェクタントのみが生存可能であり、妥当な速度で増殖できるように、選択した薬物濃度で細胞を増殖させる。

【0049】

細胞の安定したプールが選択された後、これらの細胞プールはさらに希釈され、それらの安定性がテストされ得る。例えば、これらの安定細胞プールは、制限された希釈を受け、その安定性が評価され得るサブクローンを選択し得る。

【0050】

最後に、必要に応じて、安定したトランスフェクタントの単一クローンを単離して研究細胞バンク（ＲＣＢ）を確立し、そこからマスター細胞バンク（ＭＣＢ）または作業細胞バンク（ＷＣＢ）が取得され低温保存され得る。具体的には、単一クローンはそれらの特性（例えば、クローン安定性およびタンパク質産生効率）に基づいて評価され、ＲＣＢの作成のために最適なクローンが選択される。ＲＣＢ細胞は、ＭＣＢとして低温保存する前に、さらにテストおよび特性評価され得る。

【0051】

例として、ＤＸＢ１１－ｓｈ－Ｃａｓｐａｓｅ ３トランスフェクタントの上位５つの単一クローンを使用して、タンパク質発現を支援するこれらの細胞の効率を調査した。図１０に示すように、５つすべてのクローン（ＣＩ－１Ｂ、ＣＩ－１Ｈ、ＣＩＩ－１Ｈ、ＣＩＩ－４Ｇ、およびＣＩＩ－３Ｂ）は、親ＤＸＢ１１－Ｊ１．０細胞と比較して、ハーセプチンまたはアバスチンを含むベクターの一過性トランスフェクション後にタンパク質発現の向上を示した。向上は１．５倍～２．４倍の範囲である。これらの結果は、Ｃａｓｐａｓｅ３の抑制がより高いタンパク質産生宿主細胞につなげることができることを示す。Ｃａｓｐａｓｅ－１の抑制は、バキュロウイルス昆虫細胞（ｓｆ９細胞）発現系において、タンパク質の折りたたみの改善をもたらすが、タンパク質の産生または蓄積の向上をもたらさないことが判明したため、この発見は予想外であった（Ｘ Ｚｈａｎｇら、ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０１８ ５月２日、１８（１）：２４；ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ１２８９６－０１８－０４３４－１）。

【0052】

これらの上位５つのクローンは、長期的な挙動についてさらに調査された。図１１Ａに示すように、０週から６週まで、これらの５つのクローンの細胞密度には、播種密度に関係なく、大きな変化はなかった（Ｄ０、Ｄ４、およびＤ５、０．３～２５×１０^６細胞／ｍｌ）。細胞数の長期安定性は、これらの細胞が長期生存能力を持っていることを示し、これは、アポトーシスの抑制が原因である可能性がある。

【0053】

これらの細胞の集団倍加時間（ＰＤＴ）は１６～１９時間の範囲であり、時間の経過に伴う大きな変化は見られなかった。これらの集団倍加時間は、同じ条件下でトランスフェクトされていないＣＨＯ細胞に匹敵する。ここでも、これらの結果は、Ｃａｓｐａｓｅ３抑制細胞が親ＣＨＯ細胞と実質的に同じ生物学的特性を持っていることを示している。

【0054】

流加プロセスにおいて、長時間の培養により、培地中に乳酸およびアンモニアが著しく蓄積し得る。高レベルの乳酸は、細胞増殖および産生品質に有害である。ＣＨＯ細胞はまた、培地の酸性化または望ましくないモル浸透圧濃度の変化を引き起こす可能性のある高い乳酸産生に関連する調節解除されたグルコース代謝を示す。したがって、乳酸産生は、細胞の健康の指標として使用することができる。

【0055】

図１１Ａに示されるように、これらの細胞培養物中の乳酸レベルは、６週間の期間にわたって著しい変化を有さなかった。乳酸レベルおよび乳酸／細胞数は比較的低かった。これらの上位クローンの低い乳酸レベルは、これらの細胞がエネルギー源（グルコース）を効率的に利用できることを示唆している。

【0056】

図１１Ｂは、Ｃａｓｐａｓｅ３遺伝子の発現レベルを示す。５つのクローンすべてでｃａｓｐａｓｅ３の発現が低く、６週間の期間にわたってレベルに大きな変化はなかった。これらの結果は、ｃａｓｐａｓｅ３遺伝子の抑制が比較的安定していることを示している。

【0057】

図１２に示すように、これらの細胞は、１００％近くの生存率を長期間（１００世代以上）維持した。さらに、これらの細胞の集団倍加時間（ＰＤＴ）は比較的一定であった。これらの結果はすべて、これらのトランスフェクタント細胞が長期間（例えば、１００世代以上）非常に安定していることを示している。

【0058】

これらの細胞は長期にわたって安定しているだけでなく、向上したタンパク質発現を支援するこれらの細胞の能力もまた非常に安定している。図１３に示されるように、アバスチンおよびハーセプチンの両方の発現レベルは、６週目に発現レベルにいくらかの減少を示したＣＩＩ－４Ｇクローンを除いて、実質的に同じレベルに維持された。

【0059】

これらの細胞の長期的な健康状態をさらに調査するために、これらの細胞の第２世代は、上記のように連続希釈および単一クローンを選択することによって生成された。これらの第２世代細胞はまた、様々な特性について評価された。

【表1】

【0060】

表１は、第１世代細胞ＣＩ－１Ｂ由来の４つの第２世代細胞（ＣＩ－１Ｂ－Ｄ３、ＣＩ－１Ｂ－Ｅ２、ＣＩ－１Ｂ－Ｆ６、およびＣＩ－１Ｂ－Ｇ５）と、第１世代細胞ＣＩＩ－４Ｇ由来の２つの第２世代細胞（ＣＩＩ－４Ｇ－Ｆ６およびＣＩＩ－４Ｇ－Ｇ６）の分析結果を示している。これらの第２世代細胞の集団倍加時間（ＰＤＴ）は、第１世代細胞のものと類似しており、第２世代細胞の増殖率がわずかに低いことを示している。ただし、その差はごくわずかである。さらに、乳酸レベルと細胞あたりの乳酸レベルも、第２世代細胞でわずかに高かった。

【0061】

図１４Ａは、３つの例示的な第２世代クローン、Ｃ１－１Ｂ－Ｄ３、ＣＩＩ－４Ｇ－Ｇ５、およびＣＩＩ－４Ｇ－Ｇ６の特性を示す。これらの第２世代クローンの長期安定性は、９週間の培養後、ほぼ１００％の生存率によって証明される。さらに、これらの細胞は長期にわたって一貫したトランスフェクション効率を維持する。図１４Ｂに示されるように、ＣＨＯ－Ｃ（すなわち、ＣＩＩ－４Ｇ－Ｇ６）およびＣＩ－１Ｂ－Ｇ５細胞は、０～９週間まで同様のトランスフェクション率（約１５％）を維持した。

【0062】

これらの第２世代細胞におけるＣａｓｐａｓｅ３遺伝子発現レベルは、リアルタイムＰＣＲで評価すると、第１世代細胞よりも変化する（図１４Ｃ）。例えば、ＣＩ－１Ｂ－Ｄ３およびＣＩ－１Ｂ－Ｅ２細胞は、Ｃａｓｐａｓｅ３遺伝子の非常に優れた抑制を示しているが、ＣＩ－１Ｂ－Ｆ６およびＣＩＩ－４Ｇ－Ｆ６は、第１世代からの変化がほとんどない。興味深いことに、ＣＩＩ－４Ｇ－Ｇ６細胞はＣａｓｐａｓｅ３遺伝子の抑制が著しく改善されているが、ＣＩ－１Ｂ－Ｆ６細胞はＣａｓｐａｓｅ３の発現を抑制する能力を失っている。

【0063】

図１５は、抗体（アバスチンおよびハーセプチン）の向上した発現を支援するための第２世代細胞の評価からの結果を示す。示されているように、これらの第２世代細胞は、対照細胞（ＤＸＢ－１１）のものと比較して、これらの抗体の発現レベルが１．２１～２．４倍を示す。

【0064】

上記の結果は、Ｃａｓｐａｓｅ３ならびにＨａｓｐ８、Ｄａｂ２、Ｓｙｓ１、Ｔｒｉｍ２３のノックダウンが、向上した産生能力を持つＣＨＯ細胞を産生できることを明確に示す。これらの向上した能力は、ＣＨＯ－ＤＸＢ１１、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－Ｋ１、およびＣＨＯＣ細胞を含む様々なＣＨＯ細胞株で発見されている。さらに、これらの細胞では、Ｈｅｒ２、メソセリン（ＭＳＬＮ）、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有－３（Ｔｉｍ３）に対する抗体を含む様々なタンパク質が発現している。一般に、これらの細胞は約２００ｍｇ／Ｌ以上のレベルでタンパク質（抗体）を産生できる。

【0065】

これらの細胞で発現するタンパク質には、翻訳後改変を含む通常の特性がある。例として、ＤＸＢ１１およびＣＨＯＣ細胞において発現されたハーセプチンは市販のハーセプチンと比較され、類似の分子量（約１４５ＫＤａ）を有していることが分かった。ＲＰ－ＨＰＬＣ（還元型および非還元型）は、市販のハーセプチン／トラスツズマブと比較して、これらの細胞で産生されたハーセプチンの同様のバンディングパターンを示した。図１６は、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｇｌｙｃａｎカラム（１．７μｍ、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．、米国マサチューセッツ州Ｍｉｌｆｏｒｄ）で分析され、アセトニトリルおよび５０ｍＭギ酸アンモニウムの勾配で溶出された、ＣＨＯＣ細胞において産生されたハーセプチンのＮ－結合型グリカンプロファイル（ＰＮＧａｓｅ Ｆ解放後）を示す。グリカン分析により、このタンパク質には主にＧ０Ｆ、Ｇ１Ｆａ、Ｇ１Ｆｂ、およびＧ２Ｆグリカンが含まれていることが明らかになった。

【0066】

上記の説明は、本発明の実施形態を明確に示している。タンパク質産生と直接関係のない遺伝子が、タンパク質発現および／または分泌に影響を与えることが予期せず分かった。本発明の実施形態によれば、これらの遺伝子は、ＲＮＡｉの標的として選択される。これらの遺伝子を標的とするＲＮＡｉは、適切な構築物を細胞にトランスフェクトして、これらの標的遺伝子をノックダウンして、宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）を操作することにより行われる。

【0067】

本発明の実施形態は、短期的阻害または長期的阻害のいずれかにより、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡによる選択された標的遺伝子（例えば、ＨＤＡＣ８、Ｄａｂ２、およびＣａｓｐａｓｅ３遺伝子）の阻害により、増強されたタンパク質発現および／または分泌を支援できる細胞を産生できることを示す。これらの結果は、選択された遺伝子阻害宿主細胞が、タンパク薬産生のための新しい宿主として大きな可能性を秘めていることを示している。特定の例ではＣａｓｐａｓｅ３を使用して本発明の実施形態を説明しているが、他の遺伝子（特に、ＨＤＡＣ８、Ｄａｂ２、およびＨＤＡＣ８＋Ｄａｂ２）もまた、タンパク質産生および／または分泌を改善するためにノックダウンの標的になり得る。

【0068】

様々な手順の方法が当技術分野で知られている。以下の説明は、本発明の実施形態を示すための例示的な手順および様々な例を提供する。当業者は、これらの特定の例が単に例示のためであり、本発明の範囲から逸脱することなく他の変形および修正が可能であることを理解するであろう。例えば、以下では、ＨＤＡＣ８、Ｄａｂ２、ＢＡＸ、およびＣａｓｐａｓｅ３を例として使用して、本発明の実施形態を説明している。しかしながら、本発明の範囲から逸脱することなく、他の遺伝子を使用し得る。

【0069】

細胞培養および培地
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株ＤＸＢ１１はコロンビア大学Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｃｈａｓｉｎ博士から取得した。細胞培養は、温度３７℃、湿度９５％で、５％ＣＯ_２のインキュベータ内で行われた。細胞培養用の培地は、Ｈｙｃｌｏｎｅおよび混合培地（５０％ＣＤＦｏｒｔｉＣＨＯおよび５０％ＡｃｔｉＣＨＯ）を含む。自動細胞計数器ＴＣ１０（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、米国）を使用してトリパンブルーで染色した後、細胞計数および生存率分析を行った。

【0070】

トランスフェクション構築物にはピューロマイシン耐性遺伝子が含まれる。ピューロマイシン耐性に基づいて、安定したプールが選択された。単一クローンになれば、選択する必要はない。

【0071】

ベクター構造
この例では、ＨＤＡＣ８、Ｄａｂ２、ＢＡＸ、Ｃａｓｐａｓａｅ３がＲＮＡ干渉の標的遺伝子として選択された。ＲＮＡ干渉のために選択されたこれらの遺伝子からの特定の配列断片を表２に示す。

【表2】

【0072】

これらの標的配列をｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（図５）にクローニングして、これらの遺伝子を抑制して操作された宿主細胞を生成するために使用するｓｈＲＮＡプラスミドを生成した。

【0073】

プラスミドの構造は次のように、５’’末端にＭｆｅｉ制限部位、３’末端にＫｐｎＩ制限部位を含むように別々のプライマーを設計する。テンプレートとしてｐＧＦＰ－Ｃ－Ｄａｂ２およびｐＧＦＰ－Ｃ－ＢＡＸを使用してＰＣＲを行い、Ｕ６プロモータおよびピューロマイシン選択遺伝子を含む望ましい断片（望ましいＲＮＡ配列に対応）を増幅した。ＧＦＰ－Ｃ－Ｄａｂ２およびｐ－ＧＦＰ－Ｃ－ＢＡＸは、望ましいＲＮＡ配列に対応するポリヌクレオチドをｐＧＦＰ－Ｃ－ｓｈＬｅｎｔｉベクターにクローニングすることによってＯｒｉＧｅｎｅによって構築されたＨｕＳＨ ｓｈＲＮＡプラスミドである（図６）。

【0074】

５’末端にＥｃｏＲＩ制限部位と３’末端にＸｍａＩ制限部位を有する同様のプライマーを別々に設計した。同様に、ｐＧＦＰ－ＨＤＡＣ８およびｐＧＦＰ－Ｃ－Ｃａｓｐａｓｅ３をテンプレートとして使用してＰＣＲを行い、Ｕ６プロモータおよびピューロマイシン選択遺伝子を含む望ましい断片（望ましいＲＮＡ配列に対応）を増幅した。表３に、様々なプライマー配列を示す。

【表3】

【0075】

ＰＣＲ断片を一時的にｐＪＥＴ１．２ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）にクローニングし、配列を確認した。制限酵素ＭｆｅＩ／ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩ／ＸｍａＩをそれぞれ使用して、一時的なｐＪＥＴ１．２ベクターからＨＤＡＣ８、Ｄａｂ２、ＢＡＸ、およびＣａｓｅｐａｓｅ３断片を切断する。

【0076】

ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｍａＩで切断する。次に、ＨＤＡＣ８およびＣａｓｐａｓｅ３断片をそれぞれベクターにクローニングして、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ＨＤＡＣ８およびｐｃＤＮＡ３．１（＋）－Ｃａｓｐａｓｅ３ベクターを得る。

【0077】

ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ＨＤＡＣ８ベクターを制限酵素ＭｆｅＩおよびＫｐｎＩで切断し、Ｄａｂ２断片を切断ベクターに構築してｐｃＤＮＡ３．１（＋）－Ｄａｂ２－ＨＤＡＣ８ベクターを得る。

【0078】

さらに、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）およびｐｃＤＮＡ３．１（＋）－Ｃａｓｐａｓｅ３ベクターは、制限酵素ＭｆｅＩおよびＫｐｎＩを使用して切断された。次に、ＢＡＸ断片を切断ベクターにライゲーションして、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ＢＡＸおよびｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ＢＡＸ－Ｃａｓｐａｓｅ３を得た。これらのベクターの構築後、制限酵素消化によって適切な構築を確認して適切な断片（すなわち適切なサイズ）がベクターに構築されたことを確認した。

【0079】

ＣＨＯ細胞のトランスフェクション
ＤＸＢ１１細胞を６ウェルプレート中で培養した。各ウェルは、８ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）を含む３ｍＬのＨｙｃｌｏｎｅ（商標）ＨｙＣｅｌｌ（商標）ＣＨＯ培地（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に３×１０^６細胞を有している。

【0080】

ｓｈＲＮＡ構築物を含むベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３．１）のトランスフェクションは、親油性剤ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）などの当技術分野で知られている任意の適切な試薬を使用して実行し得る。例えば、ＲＮＡｉ／ｓｈＲＮＡベクターとトランスフェクション試薬ＦｒｅｅｓｔｙｌｅＭＡＸ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）を別々にＯｐｔｉＰＲＯ（商標）ＳＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）に加えて、表４に示すようにベクター溶液を調製した。これらの溶液を５分間放置した後、トランスフェクション試薬に添加してよく混合した。得られた溶液を２０分間放置した後、細胞にトランスフェクトした。次に、トランスフェクションの３日後に細胞を評価した。

【表4】

【0081】

タンパク質発現
試験ＣＨＯ細胞におけるタンパク質／抗体産生のために、抗体／タンパク質発現構築物は、商業的供給源から入手するか、または当技術分野で既知の手順に基づいて調製し、抗体またはタンパク質の一過性発現のために試験ＣＨＯ細胞にトランスフェクトし得る。トランスフェクトされたＣＨＯ細胞を適切な期間（例えば、３日間）培養して、抗体を産生した。

【0082】

タンパク質発現レベルは、任意の適切な方法を使用して評価し得る。例えば、ＧｒｅａｔＥｓｃＡＰｅ（商標）化学発光キットはＣｌｏｎｔｅｃｈから入手した。５Ｘ希釈緩衝剤をｄｄＨ_２Ｏで１：５に希釈して、１Ｘ希釈緩衝剤を準備する。

【0083】

タンパク質発現レベルを評価するには、２５μｌの細胞培地を、トランスフェクションされた細胞または模擬のトランスフェクションされた細胞から９６ウェル・マイクロタイタ・プレートに移す。必要に応じて、プレートを密封して、後の分析のために－２０℃で凍結することができる。９６ウェル・マイクロタイタ・プレート内の各サンプルに７５μｌの１Ｘ希釈緩衝剤を加える。プレートを粘着性のアルミホイルまたは通常の９６ウェル蓋で密封し、ヒートブロックまたはウォーターバスを使用して、希釈したサンプルを６５℃で３０分間インキュベートする。

【0084】

サンプルを氷上で２～３分間冷却してから、室温に戻す。各サンプルに１００μｌのＳＥＡＰ基質溶液を加える。読み取る前に、室温で３０分間インキュベートする。９６ウェル・プレート・リーダ照度計（ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒ（登録商標）など）を使用して、化学発光信号を検出および記録する。

【0085】

リアルタイムＰＣＲを使用したノックダウン分析
標的遺伝子の発現レベルは、ＱＰＣＲで評価され得る。要するに、細胞からのＲＮＡは、ＲＮＡ精製試薬（Ｑｉａｇｅｎから）を使用して抽出され、ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００を使用して定量化された。ＱＰＣＲ反応は、以下の条件を使用して実行された（表５）。

【表5】

ＳｔｅｐＯｎｅリアルタイムＰＣＲマシンを使用して、次のプロトコルでＱＰＣＲを実行する（表６）。

【表6】

アポトーシス遺伝子（Ｃａｓｐａｓｅ３およびＢＡＸ）およびその他の遺伝子（ＨＤＡＣ８およびＤＡＢ２など）の発現レベルを評価するために、以下のプライマーを使用した（表７）。

【表7】

【0086】

本発明の実施形態を限られた数の例で説明したが、当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく他の修正および変更が可能であることを理解するであろう。したがって、本発明の保護の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11A】

【図11B】

【図12】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図15】

【図16】

【配列表】

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