特開 2024-75765 イムノグロブリンを除去又は減少させるための遺伝子治療ベクターの形質導入を増加または増強するための組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024075765

(43)【公開日】2024-06-04

(54)【発明の名称】イムノグロブリンを除去又は減少させるための遺伝子治療ベクターの形質導入を増加または増強するための組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/47 20060101AFI20240528BHJP

   A61K 38/48 20060101ALI20240528BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240528BHJP

   A61P 7/04 20060101ALI20240528BHJP

   A61P 7/06 20060101ALI20240528BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240528BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240528BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240528BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20240528BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20240528BHJP

   A61K 31/711 20060101ALI20240528BHJP

   C12N 15/867 20060101ALN20240528BHJP

   C12N 15/864 20060101ALN20240528BHJP

   C12N 15/861 20060101ALN20240528BHJP

【ＦＩ】

A61K38/47

A61K38/48 ZNA

A61K48/00

A61P7/04

A61P7/06

A61P43/00 111

A61K35/76

A61K31/7088

A61K31/7105

A61K31/713

A61K31/711

C12N15/867 Z

C12N15/864 100Z

C12N15/861 Z

【審査請求】有

【請求項の数】15

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2024051529

(22)【出願日】2024-03-27

(62)【分割の表示】P 2021502435の分割

【原出願日】2019-07-17

(31)【優先権主張番号】18305971.6

(32)【優先日】2018-07-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】62/768,731

(32)【優先日】2018-11-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】591100596

【氏名又は名称】アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル

(71)【出願人】

【識別番号】503197304

【氏名又は名称】ジェネトン

(71)【出願人】

【識別番号】518059934

【氏名又は名称】ソルボンヌ・ユニヴェルシテ

【氏名又は名称原語表記】ＳＯＲＢＯＮＮＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ

(71)【出願人】

【識別番号】520053762

【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・パリ・シテ

【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＰＡＲＩＳ ＣＩＴＥ

(71)【出願人】

【識別番号】518138077

【氏名又は名称】スパーク セラピューティクス インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＳＰＡＲＫ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】110001508

【氏名又は名称】弁理士法人 津国

(72)【発明者】

【氏名】ラクロワ－デスマゼス，セバスチャン

(72)【発明者】

【氏名】ミンゴッツィ，フェデリコ

(72)【発明者】

【氏名】ディミトロフ，ヨルダン

(72)【発明者】

【氏名】レボルニュ，クリスティアン

(72)【発明者】

【氏名】アーマー，ショーン

(57)【要約】      （修正有）

【課題】ＡＡＶのような組換えウイルスベクターの投与によって引き起こされる免疫応答（例えば、体液性免疫応答）の予防または治療における使用のための医薬組成物を提供する。
【解決手段】Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの免疫グロブリンＧ分解酵素ポリペプチド（ＩｄｅＳ）を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの投与によって引き起こされる体液性免疫応答の予防または治療における使用のための医薬組成物であって、体液性免疫応答が、前記組換えＡＡＶベクターに結合するＩｇＧ抗体を含み、予防または治療において処置される患者が、前記組換えＡＡＶベクターの投与前７２時間以内に前記ＩｄｅＳポリペプチドを投与される、医薬組成物による。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

タンパク質の機能または活性の喪失によって引き起こされる疾患の処置を必要とする対象を処置する方法であって、（ａ）タンパク質の機能または活性を提供または補足するタンパク質またはペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む組換えウイルスベクターを前記対象に投与すること；及び（ｂ）前記組換えウイルスベクターおよび／または異種ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質またはペプチドに結合する抗体のエフェクター機能を分解または消化および／または阻害または低減するのに有効な量のプロテアーゼまたはグリコシダーゼを前記対象に投与することを含む、前記方法。

【請求項2】

機能活性または発現の獲得によって引き起こされる疾患の処置を必要とする対象を処置する方法であって、（ａ）前記タンパク質の機能、活性、または発現の獲得の発現を阻害、減少または減少させる核酸に転写される異種ポリヌクレオチドを含む組換えウイルスベクターを前記対象に投与すること；および（ｂ）前記組換えウイルスベクターに結合する抗体のエフェクター機能を分解または消化および／または阻害または低減するのに有効なプロテアーゼまたはグリコシダーゼを前記対象に投与することを含む、前記方法

【請求項3】

タンパク質の機能または活性の喪失によって引き起こされる疾患の処置を必要とする対象を処置する方法であって、（ａ）ウイルスベクター結合抗体のエフェクター機能を分解または消化および／または阻害または低減するのに有効なプロテアーゼまたはグリコシダーゼを前記対象に投与すること;および（ｂ）前記タンパク質の機能または活性を提供または補足するタンパク質またはペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む組換えウイルスベクターを前記対象に投与することを含む、前記方法。

【請求項4】

タンパク質の機能活性または発現の獲得によって引き起こされる疾患の処置を必要とする対象を処置する方法であって、（ａ）ウイルスベクター結合抗体のエフェクター機能を分解または消化および／または阻害または低下させるのに有効なプロテアーゼまたはグリコシダーゼを前記対象に投与すること；および（ｂ）前記対象に、前記タンパク質の機能獲得、活性または発現の発現を阻害、減少または低減させる核酸に転写される異種ポリヌクレオチドを含む組換えウイルスベクターを投与することを含む、前記方法。

【請求項5】

ステップ（ａ）が実行された後、約９０日以内にステップ（ｂ）が実行される、請求項１または２に記載の方法。

【請求項6】

前記プロテアーゼが、システインプロテアーゼまたはチオールプロテアーゼを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記プロテアーゼが、ストレプトコッカスピオゲネス、ストレプトコッカス・エクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）、またはマイコプラズマ・カニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃａｎｉｓ）からのプロテアーゼを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記プロテアーゼが、配列番号３～１８、２３または４８のいずれかに記載のＩｄｅＳまたはその改変変異体を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記グリコシダーゼが、エンドグリコシダーゼを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記エンドグリコシダーゼが、配列番号４４～４７のいずれかに記載の配列を含む、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記プロテアーゼまたはグリコシダーゼが、ヒト抗体のエフェクター機能を分解または消化および／または阻害または低減する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記レンチウイルスベクターが、抗体が結合するエンベロープタンパク質を含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記ＡＡＶベクターが、抗体が結合するキャプシドタンパク質を含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項15】

前記ＡＡＶベクターが、抗体が結合するＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質を含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項16】

前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ－２ｉ８、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、配列番号１および配列番号２ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質からなる群より選択されるＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質に対して６０％以上の配列同一性を有するＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質を含む、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ－２ｉ８、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、配列番号１および配列番号２ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質からなる群より選択されるＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質に対して１００％の配列同一性を有するＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質を含む、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記対象が、前記ウイルスベクターに結合する抗体を有する、請求項１、３および５～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記ウイルスベクターに結合する抗体が、前記対象に存在しない、請求項１、３および５～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記対象が、異種ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質またはペプチドに結合する抗体を有する、請求項１、３および５～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記抗体が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよび／またはＩｇＥを含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

ステップ（ａ）を実施する前、ステップ（ａ）を実施した後でステップ（ｂ）を実行する前、および／またはステップ（ａ）および（ｂ）を実行した後に、前記対象に存在するウイルスベクター結合抗体の存在を決定し、その量またはエフェクター機能を定量化することをさらに含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。。

【請求項23】

ステップ（ａ）を実行する前、ステップ（ａ）を実行した後でステップ（ａ）を実行する前、ステップ（ｂ）を実行する前、および／またはステップ（ａ）および（ｂ）を実行した後に、前記サンプルに存在するウイルスベクター結合抗体の存在、量、またはエフェクター機能について前記対象からの生物学的サンプルを分析することをさらに含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記対象からの前記生物学的サンプルが、血液製剤である、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記方法が、前記ウイルスベクター結合抗体の２０～５０％、５０～７５％、７５～９０％、９０～９５％、または９５％以上の減少をもたらす、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記対象からの前記生物学的サンプルまたは血液製剤中に存在する前記ウイルスベクター結合抗体が、１部の前記生物学的サンプルまたは血液製剤を１００，０００部の緩衝液で希釈されるところの約１：１００，０００未満であり、５０％のウイルスベクター中和をもたらす、請求項２３または２４に記載の方法。

【請求項27】

前記対象からの前記生物学的サンプルまたは血液製剤中に存在する前記ウイルスベクター結合抗体が、１部の前記生物学的サンプルまたは血液製剤を５０，０００部の緩衝液で希釈されるところの約１：５０，０００未満であり、５０％のウイルスベクター中和をもたらす、請求項２３または２４に記載の方法。

【請求項28】

前記対象からの前記生物学的サンプルまたは血液製剤中に存在する前記ウイルスベクター結合抗体が、１部の前記生物学的サンプルまたは血液製剤を１０，０００部の緩衝液で希釈されるところの約１：１０，０００未満であり、５０％のウイルスベクター中和をもたらす、請求項２３または２４に記載の方法。

【請求項29】

前記対象からの前記生物学的サンプルまたは血液製剤中に存在する前記ウイルスベクター結合抗体が、１部の前記生物学的サンプルまたは血液製剤を１，０００部の緩衝液で希釈されるところの約１：１，０００未満であり、５０％のウイルスベクター中和をもたらす、請求項２３または２４に記載の方法。

【請求項30】

前記対象からの前記生物学的サンプルまたは血液製剤中に存在する前記ウイルスベクター結合抗体が、１部の前記生物学的サンプルまたは血液製剤を１００部の緩衝液で希釈されるところの約１：１００未満であり、５０％のウイルスベクター中和をもたらす、請求項２３または２４に記載の方法。

【請求項31】

前記対象からの前記生物学的サンプルまたは血液製剤中に存在する前記ウイルスベクター結合抗体が、１部の前記生物学的サンプルまたは血液製剤を１０部の緩衝液で希釈されるところの約１：１０未満であり、５０％のウイルスベクター中和をもたらす、請求項２３または２４に記載の方法。

【請求項32】

前記対象からの前記生物学的サンプルまたは血液製剤中に存在する前記ウイルスベクター結合抗体が、１部の前記生物学的サンプルまたは血液製剤を５部の緩衝液で希釈されるところの約１：５未満であり、５０％のウイルスベクター中和をもたらす、請求項２３または２４に記載の方法。

【請求項33】

前記対象からの前記生物学的サンプルまたは血液製剤中に存在する前記ウイルスベクター結合抗体が、１部の前記生物学的サンプルまたは血液製剤を４部の緩衝液で希釈されるところの約１：４未満であり、５０％のウイルスベクター中和をもたらす、請求項２３または２４に記載の方法。

【請求項34】

前記対象からの前記生物学的サンプルまたは血液製剤中に存在する前記ウイルスベクター結合抗体が、１部の前記生物学的サンプルまたは血液製剤を３部の緩衝液で希釈されるところの約１：３未満であり、５０％のウイルスベクター中和をもたらす、請求項２３または２４に記載の方法。

【請求項35】

前記対象からの前記生物学的サンプルまたは血液製剤中に存在する前記ウイルスベクター結合抗体が、１部の前記生物学的サンプルまたは血液製剤を２部の緩衝液で希釈されるところの約１：２未満であり、５０％のウイルスベクター中和をもたらす、請求項２３または２４に記載の方法。

【請求項36】

前記対象からの前記生物学的サンプルまたは血液製剤中に存在する前記ウイルスベクター結合抗体が、１部の前記生物学的サンプルまたは血液製剤を１部の緩衝液で希釈されるところの約１：１未満であり、５０％のウイルスベクター中和をもたらす、請求項２３または２４に記載の方法。

【請求項37】

ステップ（ａ）を実施した後でステップ（ｂ）を実施する前、および／またはステップ（ａ）および（ｂ）を実行した後に、前記異種ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドまたはペプチドに結合する抗体の存在を決定または定量することをさらに含む、請求項１、３および５～３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

ステップ（ａ）を実行した後でステップ（ｂ）を実行する前、および／またはステップ（ａ）および（ｂ）を実行した後に、前記核酸に結合する抗体の存在を決定または定量することをさらに含む、請求項２および４～３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の前後約６０日以内に実施される、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の前後約４５日以内に実施される、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の前後約３０日以内に実施される、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の前後約２１日以内に実施される、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の前後約１４日以内に実施される、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の前後約７日以内に実施される、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の前後約７２時間以内に実施される、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の前後約４８時間以内に実施される、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の前後約２４時間以内に実施される、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項48】

ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の前後約１２時間以内に実施される、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の前後約６時間以内に実施される、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

前記対象が、肺疾患（例えば、嚢胞性線維症）、出血性障害（例えば、阻害剤を伴うまたは伴わない血友病Ａまたは血友病Ｂ）、サラセミア、血液障害（例えば、貧血）、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、てんかん、リソソーム蓄積症（例えば、アスパルチルグルコサミン尿症、バッテン病、後期乳児神経セロイドリポフスチン症２型（ＣＬＮ２）、シスチン症、ファブリー、ゴーチャー病タイプＩ、ＩＩ、およびＩＩＩ、グリコーゲン蓄積症ＩＩ（ポンペ病）、ＧＭ２－ガングリオシドーシスＩ型（テイサックス病）、ＧＭ２－ガングリオシドーシスＩＩ型（サンドホフ病）、ムコリピドーシスＩ型（シアリドーシスＩ型およびＩＩ型））、ＩＩ（Ｉ細胞病）、ＩＩＩ（疑似ハーラー病）およびＩＶ、ムコ多糖蓄積症（ハーラー病および変異体、ハンター、サンフィリッポタイプＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、モルキオタイプＡおよびＢ、マロトーラミーおよびスライ病）、ニーマンピック病タイプＡ／Ｂ、Ｃ１およびＣ２、およびＳチンドラー病Ｉ型およびＩＩ型）、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）、銅または鉄蓄積障害（例えば、ウィルソン病またはメンケス病）、リソソーム酸性リパーゼ欠損症、神経障害または神経変性障害、癌、１型または２型糖尿病、アデノシンデアミナーゼ欠損症、代謝障害（例えば、糖原病）、固形臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓、心臓）の疾患、または感染性ウイルス（例えば、ＢおよびＣ型肝炎、ＨＩＶなど）、細菌性または真菌性疾患を有する、請求項１～４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

対象が、血液凝固障害を有する、請求項１～４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項52】

対象が、血友病Ａ、血友病Ａと阻害抗体、血友病Ｂ、血友病Ｂと阻害抗体、任意の凝固因子：ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、Ｖ、ＸＩＩ、ＩＩ、フォンウィルブランド因子または組み合わせのＦＶ／ＦＶＩＩＩ欠損症、サラセミア、ビタミンＫエポキシドレダクターゼＣ１欠損症、またはガンマカルボキシラーゼ欠損症の欠損を有する、請求項１～４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

疾患が、貧血、外傷に関連する出血、損傷、血栓症、血小板減少症、脳卒中、凝固障害、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）；ヘパリン、低分子量ヘパリン、五糖、ワルファリン、小分子抗血栓薬（すなわち、ＦＸａ阻害剤）、またはベルナール・スリエ症候群、グランツマン血小板無力症、または貯蔵プール欠乏症などの血小板障害に関連する過剰抗凝固である、請求項１～４９のいずれか一項に記載の方法。。

【請求項54】

異種ポリヌクレオチドが、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、アンギオポイエチン、アンギオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長因子α（ＴＧＦα）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン成長因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ－ＩおよびＩＧＦ－ＩＩ）、ＴＧＦβ、アクチビン、インヒビン、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ－３およびＮＴ４／５、繊毛神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来の神経栄養的事実または（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アグリン、ネトリン－１およびネトリン－２、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグおよびチロシンヒドロキシラーゼからなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項１または３～５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

異種ポリヌクレオチドが、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ－１からＩＬ－３６）、単球化学誘引物質タンパク質、白血病阻害因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子αおよびβ、インターフェロンα、β、およびγ、幹細胞因子、ｆｌｋ－２／ｆｌｔ３リガンド、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、一本鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、一本鎖Ｔ細胞受容体、クラスＩおよびクラスＩＩＭＨＣ分子からなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項１または３～５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項56】

異種ポリヌクレオチドが、ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質）、血液凝固（クロッテイング）因子（第ＸＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、プロテインＣなど）機能獲得血液凝固因子、抗体、網膜色素上皮特異的６５ｋＤａタンパク質（ＲＰＥ６５）、エリスロポエチン、ＬＤＬ受容体、リポプロテインリパーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、β－グロビン、α－グロビン、スペクトリン、α－アンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、金属トランスポーター（ＡＴＰ７ＡまたはＡＴＰ７）、スルファミダーゼ、リソソーム蓄積症（ＡＲＳＡ）に関与する酵素、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、β－２５グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼ、分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ、ホルモン、成長因子、インスリン様成長因子１または２、血小板由来成長因子、表皮成長因子、神経成長因子、神経栄養因子－３および－４、脳由来ｎユーロトロフィック因子、グリア由来成長因子、形質転換成長因子αおよびβ、サイトカイン、α－インターフェロン、β－インターフェロン、インターフェロン－γ、インターロイキン－２、インターロイキン－４、インターロイキン１２、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシン、自殺遺伝子産物、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、チトクロームＰ４５０、デオキシシチジンキナーゼ、腫瘍壊死因子、薬剤耐性タンパク質、腫瘍抑制タンパク質（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、Ｗｔ－１、ＮＦ１、Ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ-Ｌｉｎｄａｕ（ＶＨＬ）、腺腫性ポリポーシスコリ（ＡＰＣ））、免疫調節特性を持つペプチド、寛容原性または免疫原性ペプチドまたはタンパク質ＴｒｅｇｉｔｏｐｅまたはｈＣＤＲ１、インスリン、グルコキナーゼ、グアニル酸シクラーゼ２Ｄ（ＬＣＡ－ＧＵＣＹ２Ｄ）、Ｒａｂエスコートタンパク質１（脈絡膜血症）、ＬＣＡ ５（ＬＣＡ－レベルシリン）、オルニチンケト酸アミノトランスフェラーゼ（ジャイレート萎縮）、レチノスキシン１（Ｘ連鎖網膜分離症）、ＵＳＨ１Ｃ（アッシャー症候群１Ｃ）、Ｘ連鎖網膜色素変性症ＧＴＰａｓｅ（ＸＬＲＰ）、ＭＥＲＴＫ（ＡＲ型ＲＰ：網膜色素変性症）、Ｄ ＦＮＢ１（コネキシン２６難聴）、ＡＣＨＭ ２、３および４（色覚異常）、ＰＫＤ－１またはＰＫＤ－２（多発性嚢胞腎）、ＴＰＰ１、ＣＬＮ２、スルファターゼ、Ｎ－アセチルグルコサミン－１－リン酸トランスフェラーゼ、カテプシンＡ、ＧＭ２－ＡＰ、ＮＰＣ１、ＶＰＣ２、スフィンゴ脂質活性化タンパク質、ゲノム編集用の１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼ、およびゲノム編集用の修復テンプレートとして使用される１つ以上のドナー配列をコードする、請求項１または３～５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

前記異種ポリヌクレオチドが、阻害性核酸をコードする、請求項２、４～４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

前記阻害性核酸が、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス分子、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、リボザイム、およびｓｈＲＮＡからなる群から選択される、請求項５７に記載の方法。

【請求項59】

前記阻害性核酸が、ハンチンチン（ＨＴＴ）遺伝子、歯状鱗翅目萎縮に関連する遺伝子（アトロフィン１、ＡＴＮ１）、脊髄延髄筋萎縮のＸ染色体上のアンドロゲン受容体、ヒトアタキシン－１、－２、－３、および－７、Ｃａｖ２．１Ｐ／Ｑ電位依存性カルシウムチャネル（ＣＡＣＮＡ１Ａ）、ＴＡＴＡ結合タンパク質、アタキシン８反対鎖（ＡＴＸＮ８ＯＳ）、脊髄小脳性運動失調におけるセリン／スレオニンタンパク質ホスファターゼ２Ａ５５ｋＤａ調節サブユニットＢベータアイソフォーム（タイプ１、２、３、６、７、８、１２ １７）、脆弱Ｘ症候群のＦＭＲ１（脆弱Ｘ精神遅滞１）、脆弱Ｘ関連振戦／運動失調症候群のＦＭＲ１（脆弱Ｘ精神遅滞１）、脆弱ＸＥのＦＭＲ１（脆弱Ｘ精神遅滞２）またはＡＦ４／ＦＭＲ２ファミリーメンバー２精神遅滞；筋緊張性ジストロフィーにおけるミオトニンタンパク質キナーゼ（ＭＴ－ＰＫ）；フリードライヒ運動失調症のフラタキシン；筋萎縮性側索硬化症におけるスーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）遺伝子の変異体；パーキンソン病および／またはアルツハイマー病の病因に関与する遺伝子、アポリポタンパク質Ｂ（ＡＰＯＢ）およびプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）、高コレステロール血症；ＨＩＶ感染における転写遺伝子のヒト免疫不全ウイルストランス活性化因子であるＨＩＶＴａｔ；ＨＩＶ感染におけるＨＩＶＴＡＲ、ＨＩＶ ＴＡＲ、ヒト免疫不全ウイルストランス活性化因子応答要素遺伝子、ＨＩＶ感染症におけるＣ－Ｃケモカイン受容体（ＣＣＲ５）、ＲＳＶ感染におけるラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ヌクレオカプシドタンパク質、Ｃ型肝炎ウイルス感染における肝臓特異的マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－１２２）、ｐ５３、急性腎障害または移植片機能の遅延腎移植または腎障害急性腎不全；進行再発性または転移性の固形悪性腫瘍のプロテインキナーゼＮ３（ＰＫＮ３）；ＬＭＰ２、プロテアソームサブユニットベータタイプ９（ＰＳＭＢ ９）としても知られるＬＭＰ２、転移性黒色腫；プロテアソームサブユニットベータタイプ８（ＰＳＭＢ ８）としても知られるＬＭＰ７、転移性黒色腫；プロテアソームサブユニットベータタイプ１０（ＰＳＭＢ １０）としても知られるＭＥＣＬ１、転移性黒色腫；固形腫瘍における血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；固形腫瘍におけるキネシン紡錘体タンパク質、慢性骨髄性白血病におけるアポトーシス抑制因子Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫（ＢＣＬ－２）；固形腫瘍におけるリボヌクレオチドレダクターゼＭ２（ＲＲＭ２）；固形腫瘍におけるフューリン；肝腫瘍のポロ様キナーゼ１（ＰＬＫ１）、Ｃ型肝炎感染のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ１（ＤＧＡＴ１）、家族性大腸腺腫症のベータカテニン、ベータ２アドレナリン受容体、緑内障；糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）または加齢性黄斑変性症におけるＤＮＡ損傷誘発性転写物４タンパク質としても知られるＲＴＰ８０１／Ｒｅｄｄ１；加齢性黄斑変性症または脈絡膜血管新生における血管内皮増殖因子受容体Ｉ（ＶＥＧＦＲ１）、非動脈炎性虚血性視神経症におけるカスパーゼ２；先天性厚硬膜のケラチン６ＡＮ１７Ｋ変異タンパク質；インフルエンザ感染におけるインフルエンザＡウイルスのゲノム／遺伝子配列；ＳＡＲＳ感染における重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルスゲノム／遺伝子配列；呼吸器合胞体ウイルス感染における呼吸器合胞体ウイルスゲノム／遺伝子配列；エボラ感染におけるエボラフィロウイルスゲノム／遺伝子配列；Ｂ型およびＣ型肝炎感染におけるＢ型およびＣ型肝炎ウイルスのゲノム／遺伝子配列；ＨＳＶ感染における単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ゲノム／遺伝子配列、コクサッキーウイルスＢ３感染におけるコクサッキーウイルスＢ３ゲノム／遺伝子配列。原発性ジストニアにおけるトルシンＡ（ＴＯＲ１Ａ）、汎クラスＩおよび移植に特異的なＨＬＡ対立遺伝子のような遺伝子の病原性対立遺伝子のサイレンシング（対立遺伝子特異的サイレンシング）；常染色体優性遺伝性網膜色素変性症（ａｄＲＰ）の変異ロドプシン遺伝子（ＲＨＯ）からなる群から選択されるポリヌクレオチド反復疾患に関連する、遺伝子、遺伝子の転写物または遺伝子の転写物に結合する、請求項５７に記載の方法。

【請求項60】

異種ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、遺伝子編集ヌクレアーゼを含む、請求項１、３および５～５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項61】

遺伝子編集ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を含む、請求項６０に記載の方法。

【請求項62】

遺伝子編集ヌクレアーゼが、機能的なタイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を含む、請求項６１に記載の方法。

【請求項63】

ステップ（ａ）および／またはステップ（ｂ）が、２回以上実行される、請求項１から６２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項64】

対象が、ヒトである、請求項１～６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項65】

（ａ）タンパク質またはペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む組換えウイルスベクター；
（ｂ）抗体を分解または消化するプロテアーゼまたはグリコシダーゼ、および
（ｃ）（ａ）および（ｂ）が別個のまたは同じ容器に入っている、請求項１～６４のいずれか一項に記載の方法を実施するための説明書が記載されたラベル
をその中に備えるパッケージ。

【請求項66】

（ａ）タンパク質の発現を阻害、減少、または減少させる核酸に転写される異種ポリヌクレオチドを含む組換えウイルスベクター；
（ｂ）抗体を分解または消化するプロテアーゼまたはグリコシダーゼ、および
（ｃ）（ａ）および（ｂ）が別個のまたは同じ容器に入っている、請求項１～６４のいずれか一項に記載の方法を実施するための説明書が記載されたラベル
をその中に備えるパッケージ。

【請求項67】

それを必要とする患者において遺伝子治療ベクターによって治療される疾患の処置における使用のための、免疫グロブリンＧ分解酵素ポリペプチド。

【請求項68】

前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターである、請求項６７に記載の使用のための免疫グロブリンＧ分解酵素ポリペプチド。

【請求項69】

前記ベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２変異体、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３変異体、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ３Ｂ変異体からなる群から選択されるキャプシドタンパク質を含むＡＡＶベクター、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６変異体、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｃｙ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｄｊ、ＡＡＶ－Ａｎｃ８０、配列番号１、配列番号２またはＡＡＶ２ｉ８である、請求項６８に記載の使用のための免疫グロブリンＧ分解酵素ポリペプチド。

【請求項70】

免疫グロブリンＧ分解酵素ポリペプチドが、配列番号３～１８、２３、または４８のいずれか１つの配列を含む、請求項６７～６９に記載の使用のための免疫グロブリンＧ分解酵素ポリペプチド。

【請求項71】

前記免疫グロブリンＧ分解酵素ポリペプチドが、配列番号４９～５１のいずれか１つの非天然シグナル配列をさらに含む、請求項７０に記載の使用のための免疫グロブリンＧ分解酵素ポリペプチド。

【請求項72】

遺伝子治療ベクターによって治療される疾患が、増殖性疾患（癌、腫瘍、異形成など）、クリグラー・ナジャールおよびクリグラー・ナジャール肝臓の代謝性疾患、フリードライヒ運動失調、感染症、（例えば、タバコ、アルコール、または薬物の）中毒、てんかん、カナバン病、副腎白質ジストロフィー、（例えば、Ｂ型またはＣ型肝炎ウイルス、ＨＩＶによって誘発される）ウイルス性疾患、ヘルペス、レトロウイルスなど）、遺伝性疾患（嚢胞性線維症、ジストログリカノパチー、デュシェンヌ筋ミオパチーまたはジストロフィーなどのミオパチー、筋管ミオパチー、血友病Ａ、血友病Ｂ、鎌状細胞貧血、鎌状細胞疾患、ファンコニ貧血、糖尿病、筋萎縮症側方硬化症（ＡＬＳ）、ミオチューブラリンミオパチー、脊髄筋萎縮症（ＳＭＡ）などの運動ニューロン疾患、脊髄延髄筋萎縮症、またはシャルコット－マリー－歯病、関節炎、重度の組み合わせ免疫不全症（ＲＳ－ＳＣＩＤ、ＡＤＡ－ＳＣＩＤ、Ｘ－ＳＣＩＤなど）、ウィスコット・アルドリッチ症候群、Ｘ連鎖性血小板減少症、Ｘ連鎖性先天性好中球減少症、慢性肉芽腫症など）、凝固因子欠損症、心血管疾患（網膜色素変性症）、虚血、脂質異常症、ホモ接合性家族性高コレステロール血症など）、網膜色素変性症、リーバー先天性黒内障、リーバー遺伝性視神経症、スターガルト病などの眼疾患；サンフィリッポ症候群などのリソソーム蓄積症；ＣＮタイプＩまたはＩＩなどの高ビリルビン血症またはジルベール症候群；ファブリー病、ＧＳＤＩ、ＧＳＤＩＩ（ポンペ病）、ＧＳＤＩＩＩ、ＧＳＤＩＶ、ＧＳＤＶ、ＧＳＤＶＩ、ＧＳＤＶＩＩ、ＧＳＤＶＩＩＩなどのグリコーゲン蓄積症および心臓の致死的な先天性グリコーゲン蓄積症からなる群から選択される、請求項６７～７１に記載の使用のための免疫グロブリンＧ分解酵素ポリペプチド。

【請求項73】

前記ベクターが、請求項７２に記載の疾患を治療するのに適切な治療用ポリヌクレオチドを含む、請求項６７～７２に記載の使用のための免疫グロブリンＧ分解酵素ポリペプチド。

【請求項74】

それを必要とする患者において遺伝子治療ベクターによって治療される疾患の治療に使用するための免疫グロブリンG分解酵素ポリペプチドをコードする、核酸配列。

【請求項75】

それを必要とする患者において遺伝子治療ベクターによって治療される疾患の治療に使用するための免疫グロブリンＧ分解酵素ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、発現ベクター。

【請求項76】

配列番号３～１８、２３または４８のいずれかの配列を含む免疫グロブリンＧ分解酵素ポリペプチド、配列番号３～１８、２３または４８のいずれかの配列を含む免疫グロブリンＧ分解酵素ポリペプチドをコードする核酸配列、または、配列番号３～１８、２３または４８のいずれかの配列を含む免疫グロブリンＧ分解酵素ポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターを含む、それを必要とする患者の遺伝子治療ベクターによって処置される疾患の治療における使用のための治療用組成物。

【請求項77】

治療有効量の免疫グロブリンＧ分解酵素ポリペプチドを、それを必要とする対象に投与することを含む、遺伝子治療ベクターによって治療される疾患を処置するための方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は、２０１８年７月１７日に出願された欧州特許出願ＥＰ１８３０５９７１．６号、および２０１８年１１月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／７６７８３１号の優先権を主張しており、これらの出願の内容全体は、全てのテキスト、表、配列番号及び図面を含み、参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）および他のウイルスベクター、ならびに脂質、ポリマー、およびタンパク質ベースのナノ粒子遺伝子治療アプローチは、適応免疫システムによって標的化され得、鈍化された効力をもたらし、患者が治療介入に対して完全に抵抗性になる可能性を導く。適応免疫系は、抗原特異的免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ））抗体であって、標的分子の阻害またはクリアランスにつながる抗体の開発に依存する。ヒトは自然に野生型ＡＡＶに曝されるので、ＡＡＶ遺伝子治療は、既存の抗ＡＡＶ抗体の存在によって阻害され得る。さらに、ＡＡＶ遺伝子導入後の抗ＡＡＶ抗体の開発は、同じまたは交差反応性ベクターでの再投与を防止することができる。

【0003】

出生後の野生型ＡＡＶへの曝露は、人生の最初の２年内でウイルスキャプシドに向けられた抗体を誘導する(caledo et al.(2011) Clin Vaccine Immunol. 18, 1586-8；Erles et al.(1999)J Med Virol. 59, 406-1；Li et al (2012) Gene Ther. 19, 288-94)。ＡＡＶ血清型および個体の年齢に応じて、抗ＡＡＶ抗体に対する陽性対象の割合は６０％に達することができる。いくつかの抗ＡＡＶ抗体は、比較的低い力価で存在する場合であっても、細胞エントリに重要なウイルスエピトープを標的化し、ウイルス感染性を中和する。重要なことに、抗ＡＡＶ抗体は、異なるＡＡＶ血清型との高度の交差反応性を示す(Boutin et al.(2010) Hum Gene Ther. 21, 704-12)。いくつかの臨床研究および臨床研究において実証されているように、このような中和抗体は、特に、ベクターが血流中に直接送達される場合、形質導入効率を劇的に減少させる(Manno et al. (2006) Nat Med. 12, 342-7; Masat et al. (2013) Discov Med. 15, 379-89; Arruda et al. (2010) Blood. 115, 4678-88; Haurigot et al. (2010) Mol Ther. 18, 1318-29; Jiang et al. (2006) Blood. 108, 3321-8; Scallan et al. (2006) Blood. 107, 1810-7).

【0004】

中和抗ＡＡＶ抗体の高い予備価は、ＡＡＶベクターによる遺伝子導入試験における登録から特定の対象を除外し、特定の患者を承認されたＡＡＶ遺伝子治療から除外し、可能な生命を節約する治療にアクセスすることなく特定の患者を放置する。さらに、ＡＡＶ遺伝子導入に続いて、中和抗ＡＡＶ抗体が誘導され、これは、同じ個体の再投与の際の形質導入効率を阻害する。例えば、血友病Ｂは、凝固因子ＩＸ（ＦＩＸ）の欠乏または機能不全に起因する希少でＸ結合性出血性障害であり、重度（正常な１％未満の循環ＦＩＸレベル）の場合、頻繁な出血エピソード、関節障害の発生および早期死のリスクをもたらす(Manucci e tal(2001) N Engl J Med。344、1773-9)。出血を予防または治療するための外因性ＦＩＸ投与の現在の処置は理想的ではない。この分子の半減期は、高コストに関連する頻繁な静脈内注射、および阻害性抗体の開発の危険性を規定する。血友病Ｂの一遺伝子性は、遺伝子治療を、連続的な内因性ＦＩＸ発現を回復させるための魅力的な選択を行い、現在の治療の制限を回避する。この点に関して、重症患者における血友病Ｂの長期的な補正のためのＡＡＶ媒介性遺伝子導入は、非常に有望である( Nathwani et al. (2011) N Engl J Med. 365, 2357-65; George et al. (2017) N Engl J Med. 377, 2215-2227)。しかし、既存の抗ＡＡＶ抗体の存在は、ＡＡＶ媒介遺伝子治療を有する特定の血友病Ｂ患者を治療するための障害物を提示する。同様に、ＡＡＶ媒介遺伝子導入は、血友病Ａ、脊髄性筋萎縮症(Mendell et al. (2017)、N Engl J. Med、377：1713-1722)および多くの他の疾患の治療に非常に有望であることが示されているが、抗ＡＡＶ抗体の存在の存在は、同様に、これらの疾患および障害を有する特定の患者を処置するための障害物を提示する。

【0005】

免疫グロブリンのタンパク質分解は、宿主防御システムを回避するために病原体によって使用される一般的なメカニズムである（Travis et al.（2000）Biochim Biophys Acta. 1477、35-50; Travis et al.（1995）Trends Microbiol。3、 405-7）。たとえば、ＩｄｅＳは、他のいくつかの種に加えて、ヒトＩｇＧに見られる標的配列に特異性を示す病原性細菌Streptococcus pyogenesによって発現される、天然に存在する３５ｋＤａシステインプロテアーゼ、具体的にはエンドペプチダーゼである。ＩｄｅＳはヒンジ領域の下でＩｇＧを切断することができ（von Pawel-Rammingen et al.（2003）Curr Opin Microbiol.6, 50-5）、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｃ／２フラグメントの生成をもたらす（Ryan et al。（2008）Mol Immunol。45、1837-46）。

【0006】

さらなる例として、ＥｎｄｏＳは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の天然に存在するグリコシダーゼ、具体的にはエンドグリコシダーゼであり、ヒトＩｇＧからのグリカンを特異的に加水分解し、Ｆｃ受容体結合を含む抗体エフェクター機能を変化させる。

【0007】

本明細書に記載されるのは、とりわけ、免疫グロブリンに存在するペプチド結合を切断するプロテアーゼを投与することによって、または炭水化物残基を切断するグリコシダーゼを投与することによって、遺伝子治療ベクターに対する中和抗体を開発するかまたは既に有する可能性がある患者を治療するための方法である。免疫グロブリン、またはインビボでの免疫グロブリンの他の同様の酵素的切断に存在する。本明細書には、とりわけ、切断するプロテアーゼを投与することにより、異種ポリヌクレオチド、または遺伝子治療ベクターによってキャプシド形成された異種ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質またはペプチドに結合する既存の抗体を開発または既に有する可能性がある患者を治療するための方法も記載される。免疫グロブリンに存在するペプチド結合、または免疫グロブリンに存在する炭水化物残基を切断するグリコシダーゼの投与、またはインビボでの免疫グロブリンの他の同様の酵素的切断による。

【0008】

要約
本明細書に開示されるのは、ＩｄｅＳなどのプロテアーゼを利用して、ヒト血漿中の抗体（例えば、ＩｇＧ）レベルを低下させるための方法である。本発明による方法は、とりわけ、遺伝子治療ベクターに対する既存の中和抗体を有する患者を治療するために、および遺伝子治療ベクターで以前に治療された患者を再投与するために使用され得る。

【0009】

特定の実施態様において、タンパク質の機能または活性の喪失によって引き起こされる疾患の治療を必要とする対象を治療する方法は、以下を含む：（ａ）対象に、タンパク質の機能または活性を提供または補足するタンパク質またはペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む組換えウイルスベクターを投与すること：及び（ｂ）前記組換えウイルスベクターおよび/または異種ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質またはペプチドに結合する抗体のエフェクター機能を分解または消化および/または阻害または低減するのに有効な量のプロテアーゼまたはグリコシダーゼを対象に投与すること。

【0010】

特定の実施態様において、タンパク質の機能活性または発現の獲得によって引き起こされる疾患の治療を必要とする対象を治療する方法は、以下を含む：（ａ）前記タンパク質の機能、活性、または発現の獲得の発現を阻害、減少、または減少させる核酸に転写される、異種ポリヌクレオチドを含む組換えウイルスベクターを対象に投与すること；及び（ｂ）前記組換えウイルスベクターに結合する抗体のエフェクター機能を分解または消化および/または阻害または低減するのに有効なプロテアーゼまたはグリコシダーゼを対象に投与すること。

【0011】

特定の実施態様において、タンパク質の機能または活性の喪失によって引き起こされる疾患の治療を必要とする対象を治療する方法は、以下を含む：（ａ）分解または消化および/またはウイルスベクター結合抗体のエフェクター機能を阻害または低減するのに有効なプロテアーゼまたはグリコシダーゼを対象に投与すること；及び（ｂ）前記タンパク質の機能または活性を提供または補足するタンパク質またはペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む組換えウイルスベクターを対象に投与すること。

【0012】

特定の実施態様において、タンパク質の機能活性または発現の獲得によって引き起こされる疾患の治療を必要とする対象を治療する方法は、以下を含む：（ａ）分解するのに有効なプロテアーゼまたはグリコシダーゼを対象に投与する、または ウイルスベクター結合抗体のエフェクター機能を消化および/または阻害または低減すること; （ｂ）前記タンパク質の機能獲得、活性または発現の発現を阻害、減少または減少させる核酸に転写される異種ポリヌクレオチドを含む組換えウイルスベクターを対象に投与すること。

【0013】

特定の実施態様では、対象のステップ（ｂ）を治療する方法において、ステップ（ａ）が実行された後、約９０日以内に実行される。特定の実施態様では、ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）の前または後の約６０日以内に実行される。特定の実施態様では、ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）の前または後の約４５日以内に実行される。特定の実施態様では、ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）の前または後の約３０日以内に実行される。特定の実施態様では、ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）の前または後の約２１日以内に実行される。特定の実施態様では、ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）の前または後の約１４日以内に実行される。特定の実施態様では、ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）の前または後の約７日以内に実行される。特定の実施態様では、ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）の前または後の約７２時間以内に実行される。特定の実施態様では、ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）の前または後の約４８時間以内に実行される。特定の実施態様では、ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）の前または後の約２４時間以内に実行される。特定の実施態様では、ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）の前または後の約１２時間以内に実行される。特定の実施態様では、ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）の前または後の約６時間以内に実行される。

【0014】

特定の実施態様において、プロテアーゼは、システインプロテアーゼまたはチオールプロテアーゼを含む。特定の実施態様において、プロテアーゼは、Streptococcus pyogenes（ストレプトコッカス・ピオゲネス）、Streptococcus equi（ストレプトコッカス・エクイ）またはMycoplasma canis（マイコプラズマ・カニス）からのプロテアーゼを含む。特定の実施態様において、プロテアーゼは、配列番号３～１８、２３または４８のいずれかに記載されるＩｄｅＳまたはその改変変異体を含む。

【0015】

特定の実施態様において、グリコシダーゼは、エンドグリコシダーゼを含む。特定の実施態様において、エンドグリコシダーゼは、配列番号４４～４７のいずれかに示される配列を含む。

【0016】

特定の実施態様において、プロテアーゼまたはグリコシダーゼは、ヒト抗体のエフェクター機能を分解または消化し、および／または阻害または低減する。

【0017】

特定の実施態様において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。

【0018】

特定の実施態様において、レンチウイルスベクターは、抗体が結合するエンベロープタンパク質を含む。

【0019】

特定の実施態様において、ＡＡＶベクターは、抗体が結合するキャプシドタンパク質を含む。

【0020】

特定の実施態様において、ＡＡＶベクターは、抗体が結合するＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質を含む。

【0021】

特定の実施態様において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ－２ｉ８、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、配列番号１および配列番号２ ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質からなる群から選択されるＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質に対して６０％以上の配列同一性を有するＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質を含む。

【0022】

特定の実施態様において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ－２ｉ８、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、配列番号１および配列番号２のＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質からなる群から選択されるＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質に対して１００％の配列同一性を有するＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質を含む。

【0023】

特定の実施態様において、対象は、前記ウイルスベクターに結合する抗体を有する。

【0024】

特定の実施態様において、ウイルスベクターに結合する抗体は、対象に存在しない。

【0025】

特定の実施態様において、対象は、異種ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質またはペプチドに結合する抗体を有する。

【0026】

特定の実施態様において、抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよび／またはＩｇＥを含む。

【0027】

特定の実施態様では、方法は、ステップ（ａ）を実行する前、ステップ（ａ）を実行した後しかしステップ（ｂ）を実行する前、および／またはステップ（ａ）および（ｂ）を実行した後に、前記対象に存在するウイルスベクター結合抗体の存在を決定し、その量またはエフェクター機能を定量化することを含む。

【0028】

特定の実施態様では、方法は、ステップ（ａ）を実行する前、ステップ（ａ）を実行した後、しかしステップ（b）を実行する前に、および/またはステップ（a）および（b）を実行した後に前記サンプルに存在するウイルスベクター結合抗体の存在、量、またはエフェクター機能について、前記対象からの生物学的サンプルを分析することを含む。

【0029】

特定の実施態様では、対象からの生物学的サンプルは血液製剤である。特定の実施態様において、血液製剤は、血漿または血清を含む。

【0030】

特定の実施態様において、方法は、前記ウイルスベクター結合抗体の２０～５０％、５０～７５％、７５～９０％、９０～９５％、または９５％以上の減少をもたらす。

【0031】

特定の実施態様において、対象からの生物学的サンプルまたは血液製剤中に存在するウイルスベクター結合抗体は、約１：１００，０００未満であり、ここで、１００，０００部の緩衝液で希釈された前記生物学的サンプルまたは血液製剤の１部は、５０％ウイルスベクターの中和をもたらす。

【0032】

特定の実施態様において、前記対象からの前記生物学的サンプルまたは血液製剤中に存在するウイルスベクター結合抗体は、約１：５０，０００未満であり、ここで、５０，０００部の緩衝液で希釈された１部の生物学的サンプルまたは血液製剤は、５０％ウイルスベクター中和をもたらす。

【0033】

特定の実施態様において、対象からの生物学的サンプルまたは血液製剤中に存在するウイルスベクター結合抗体は、約１：１０，０００未満であり、ここで、１０，０００部の緩衝液で希釈された生物学的サンプルまたは血液製剤の１部は、５０％ウイルスベクター中和をもたらす。

【0034】

特定の実施態様において、対象からの生物学的サンプルまたは血液製剤中に存在するウイルスベクター結合抗体は、約１：１，０００未満であり、ここで、１０００部の緩衝液で希釈された生物学的サンプルまたは血液製剤の１部は、５０％ウイルスベクター中和をもたらす。

【0035】

特定の実施態様において、対象からの生物学的サンプルまたは血液製剤に存在するウイルスベクター結合抗体は、約１：１００未満であり、１００部の緩衝液で希釈された１部の生物学的サンプルまたは血液製剤は、５０％ウイルスベクター中和をもたらす。

【0036】

特定の実施態様において、対象からの生物学的サンプルまたは血液製剤中に存在するウイルスベクター結合抗体は、約１：１０未満であり、ここで、１０部の緩衝液で希釈された１部の生物学的サンプルまたは血液製剤は、５０％ウイルスベクター中和をもたらす。

【0037】

特定の実施態様において、生物学的サンプルまたは血液製剤中に存在するウイルスベクター結合抗体は、約１：５未満であり、ここで、生物学的サンプルまたは血液製剤の１部を５部の緩衝液で希釈すると、５０％のウイルスベクター中和が得られる。

【0038】

特定の実施態様において、生物学的サンプルまたは血液製剤中に存在するウイルスベクター結合抗体の比率は、約１：４未満であり、ここで、４部の緩衝液で希釈された１部の生物学的サンプルまたは血液製剤は、ウイルスベクターの中和５０％をもたらす。

【0039】

特定の実施態様において、生物学的サンプルまたは血液製剤中に存在するウイルスベクター結合抗体の比率は、約１：３未満であり、３部の緩衝液で希釈された１部の生物学的サンプルまたは血液製剤は、５０％ウイルスベクターの中和をもたらす。

【0040】

特定の実施態様において、対象、生物学的サンプルまたは血液製剤に存在するウイルスベクター結合抗体の比率は、約１：２未満であり、ここで、生物学的サンプルまたは血液製剤の１部が２部の緩衝液で希釈されると、５０％のウイルスベクター中和をもたらす。

【0041】

特定の実施態様において、対象、生物学的サンプルまたは血液製剤に存在するウイルスベクター結合抗体の比率は、約１：１未満であり、ここで、生物学的サンプルまたは血液製剤の１部が、緩衝液の１部で希釈されると、５０％のウイルスベクター中和をもたらす。

【0042】

特定の実施態様において、方法は、ステップ（ａ）を実行した後しかしステップ（ｂ）を実行する前および／またはステップ（ａ）および（ｂ）を実行した後に、異種ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドまたはペプチドに結合する抗体の存在を決定または定量することを含む。

【0043】

特定の実施態様において、方法は、ステップ（ａ）を実行した後しかしステップ（ｂ）を実行する前、および／またはステップ（ａ）および（ｂ）を実行した後に、核酸に結合する抗体の存在を決定するか、またはその量を定量化することを含む。

【0044】

特定の実施態様において、対象は、肺疾患（例えば、嚢胞性線維症）、出血性障害（例えば、インヒビターを伴うまたは伴わない血友病Ａまたは血友病Ｂ）、サラセミア、血液障害（例えば、貧血）、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、てんかん、リソソーム蓄積症（例えば、アスパルチルグルコサミン尿症、バッテン病、後期乳児神経セロイドリポフスチン症２型（ＣＬＮ２）、シスチン症、ファブリー病、ゴーチャー病Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ、グリコーゲン蓄積症ＩＩ（ポンペ病）、ＧＭ２－ガングリオシドーシスＩ型（テイサックス病）、ＧＭ２－ガングリオシドーシスＩＩ型（サンドホフ病）、ムコリピドーシスＩ型（シアリドーシスＩ型およびＩＩ型）、ＩＩ（Ｉ細胞疾患）、ＩＩＩ（疑似ハーラー病）およびＩＶ、ムコ多糖蓄積症（ハーラー病および変異体、ハンター、サンフィリッポタイプＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、モルキオタイプＡおよびＢ、マロトー－ラミーおよびスライ病）、ニーマンピック病タイプＡ／Ｂ、Ｃ１およびＣ２、およびシンドラー病タイプＩおよびＩＩ）、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）、銅または鉄の蓄積障害（例えば、ウィルソン病またはメンケス病）、リソソーム酸性リパーゼ欠損症、神経障害または神経変性障害、癌、１型または２型糖尿病、アデノシンデアミナーゼ欠損症、代謝障害（例えば、糖原病）、固形臓器の疾患（例えば、脳、肝臓、腎臓、心臓）、または感染性ウイルス（例えば、Ｂ型およびＣ型肝炎、ＨＩＶなど）、細菌性または真菌性疾患を有する。特定の実施態様において、対象は、血液凝固障害を有する。特定の実施態様において、対象は、血友病Ａ、阻害性抗体を伴う血友病Ａ、血友病Ｂ、阻害性抗体を伴う血友病Ｂ、任意の凝固因子の欠損：ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、Ｖ、ＸＩＩ、ＩＩ、フォンウィルブランド因子、またはＦＶ／ＦＶＩＩＩ欠損症、サラセミア、ビタミンＫエポキシドレダクターゼＣ１欠損症、またはガンマカルボキシラーゼ欠損症の組み合わせを有する。

【0045】

特定の実施態様において、対象は、貧血、外傷に関連する出血、損傷、血栓症、血小板減少症、脳卒中、凝固障害、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）；ヘパリン、低分子量ヘパリン、五糖、ワルファリン、小分子抗血栓薬（すなわち、ＦＸａ阻害剤）、またはベルナール・スリエ症候群、グランツマン血小板無力症、または貯蔵プール欠乏症などの血小板障害に関連する過剰抗凝固を有する。

【0046】

特定の実施態様では、対象は、中枢神経系（ＣＮＳ）に影響を与えるか、または中枢神経系（ＣＮＳ）に起因する疾患を有する。特定の実施態様では、疾患は神経変性疾患である。特定の実施態様では、ＣＮＳまたは神経変性疾患は、アルツハイマー病、ハンチントン病、ＡＬＳ、遺伝性痙性片麻痺、原発性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、ケネディ病、ポリグルタミン反復病、またはパーキンソン病である。特定の実施態様において、ＣＮＳまたは神経変性疾患は、ポリグルタミン反復疾患である。特定の実施態様において、ポリグルタミン反復性疾患は、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ１、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３、ＳＣＡ６、ＳＣＡ７、またはＳＣＡ１７）である。

【0047】

特定の実施態様において、異種ポリヌクレオチドは、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）からなる群から選択されるタンパク質、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、アンギオポイエチン、アンギオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、基本的な線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長因子α（ＴＧＦα）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン成長因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ－ＩおよびＩＧＦ－ＩＩ））、ＴＧＦβ、アクチビン、インヒビン、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ－３およびＮＴ４／５、繊毛神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株派生神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アグリｎ、ネトリン－１およびネトリン－２、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグおよびチロシンヒドロキシラーゼをコードする。。

【0048】

特定の実施態様において、異種ポリヌクレオチドは、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ１からＩＬ－３６）、単球化学誘引物質タンパク質、白血病阻害因子、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンドからなる群から選択されるタンパク質、腫瘍壊死因子αおよびβ、インターロイキンα、β、およびγ、幹細胞因子、ｆｌｋ－２／ｆｌｔ３リガンド、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、単球Ｔ細胞受容体、クラスＩおよびクラスＩＩＭＨＣ分子をコードする。

【0049】

特定の実施態様において、異種ポリヌクレオチドは、ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質）、血液凝固（凝固）因子（因子ＸＩＩＩ、因子ＩＸ、因子ＶＩＩＩ、因子Ｘ、因子ＶＩＩ、因子ＶＩＩａ、タンパク質Ｃなど）、機能獲得血液凝固因子、抗体、網膜色素上皮特異的６５ｋＤａタンパク質（ＲＰＥ６５）、エリスロポエチン、ＬＤＬ受容体、リポタンパク質リパーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、β－グロビン、α－グロビン、スペクトリン、α－アンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、金属トランスポーター（ＡＴＰ７ＡまたはＡＴＰ７）、スルファミダーゼ、リソソーム蓄積症（ＡＲＳＡ）に関与する酵素、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、β－２５グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼ、分岐鎖ケト、ホルモン、成長因子、インスリン様成長因子１または２、血小板由来成長因子、表皮成長因子、神経成長因子、神経栄養因子－３および－４、脳由来神経栄養因子、グリア派生成長因子、形質転換成長因子αおよびβ、サイトカイン、α－インターフェロン、β－インターフェロン、インターフェロン－γ、インターロイキン－２、インターロイキン－４、インターロイキン１２、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシン、自殺遺伝子産物、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、チトクロームＰ４５０、デオキシシチジンキナーゼ、腫瘍壊死因子、薬剤耐性タンパク質、腫瘍抑制タンパク質（例、ｐ５３、Ｒｂ、Ｗｔ－１、ＮＦ１、フォンヒッペル－リンダウ（ＶＨＬ）、腺腫性ポリポーシスコリ（ＡＰＣ））、免疫調節特性を有するペプチド、寛容原性または免疫原性ペプチドまたはタンパク質トレギトープまたはｈＣＤＲ１、インスリン、グルコキナーゼ、グアニル酸シクラーゼ２Ｄ（ＬＣＡ－ＧＵＣＹ２Ｄ）、Ｒａｂエスコートタンパク質１（Ｃｈｏｒｏｉｄｅｒｅｍｉａ）、ＬＣＡ５（ＬＣＡ－レベルシリン）、オルニチンケト酸アミノトランスフェラーゼ（ジャイレート萎縮）、レチノスキシン１（Ｘ連鎖網膜分離症）、ＵＳＨ１Ｃ（アッシャー症候群１Ｃ）、Ｘ連鎖網膜色素変性症ＧＴＰａｓｅ（ＸＬＲＰ）、ＭＥＲＴＫ（ＡＲ型ＲＰ：網膜色素変性症））、ＤＦＮＢ１（Ｃｏｎｎｅｘｉｎ ２６ ｄｅａｆｎｅｓｓ）、ＡＣＨＭ２、３および４（色覚異常）、ＰＫＤ－１またはＰＫＤ－２（多発性嚢胞腎）、ＴＰＰ１、ＣＬＮ２、スルファターゼ、Ｎ－アセチルグルコサミン－１－リン酸トランスフェラーゼ、カテプシンＡ、ＧＭ２－ＡＰ、ＮＰＣ１、ＶＰＣ２、スフィンゴ脂質活性化タンパク質、ゲノム編集用の１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼ、およびゲノム編集用の修復テンプレートとして使用される１つ以上のドナー配列をコードする。。

【0050】

特定の実施態様において、異種ポリヌクレオチドは、阻害性核酸をコードする。特定の実施態様において、阻害性核酸は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス分子、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、リボザイム、およびｓｈＲＮＡからなる群から選択される。特定の実施態様において、阻害性核酸は、またはハンチンチン（ＨＴＴ）遺伝子、歯状パリドルイジアン萎縮に関連する（アトロフィン１、ＡＴＮ１）、脊髄延髄筋萎縮症のＸ染色体上のアンドロゲン受容体、ヒトアタキシン－１、－２、－３、および－７、Ｃａｖ２．１ Ｐ ／ Ｑ電位依存性カルシウムチャネル（ＣＡＣＮＡ１Ａ）、ＴＡＴＡ－結合タンパク質、アタキシン８反対鎖（ＡＴＸＮ８ＯＳ）、脊髄小脳性運動失調におけるセリン／スレオニンタンパク質ホスファターゼ２Ａ ５５ｋＤａ調節サブユニットＢベータアイソフォーム（タイプ１、２、３、６、７、８、１２、１７）、ＦＭＲ１（脆弱Ｘ精神遅滞１）脆弱Ｘ症候群、脆弱Ｘ関連振戦／運動失調症候群のＦＭＲ１（脆弱Ｘ精神遅滞１）、脆弱ＸＥ精神遅滞のＦＭＲ１（脆弱Ｘ精神遅滞２）またはＡＦ４／ＦＭＲ２ファミリーメンバー２；筋緊張性ジストロフィーにおけるミオトニンタンパク質キナーゼ（ＭＴ－ＰＫ）；フリードライヒ運動失調症のフラタキシン；筋萎縮性側索硬化症におけるスーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）遺伝子の変異体；パーキンソン病および／またはアルツハイマー病の病因に関与する遺伝子。アポリポタンパク質Ｂ（ＡＰＯＢ）およびプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）、高コレステロール血症；ＨＩＶ感染における転写遺伝子のヒト免疫不全ウイルストランス活性化因子であるＨＩＶＴａｔ；ＨＩＶ感染におけるＨＩＶＴＡＲ、ＨＩＶ ＴＡＲ、ヒト免疫不全ウイルストランス活性化因子応答要素遺伝子ｍＨＩＶ感染症におけるＣ－Ｃケモカイン受容体（ＣＣＲ５）、ＲＳＶ感染におけるラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ヌクレオカプシドタンパク質、Ｃ型肝炎ウイルス感染における肝臓特異的マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－１２２）、ｐ５３、急性腎障害または移植片機能の遅延腎移植または腎障害急性腎不全；事前に再発性または転移性の固形悪性腫瘍のプロテインキナーゼＮ３（ＰＫＮ３）、ＬＭＰ２、プロテアソームサブユニットベータタイプ９（ＰＳＭＢ ９）としても知られるＬＭＰ２、転移性黒色腫、ＬＭＰ７、転移性黒色腫としても知られているプロテアソームサブユニットベータタイプ８（ＰＳＭＢ ８）、ＭＥＣＬ１、転移性黒色腫としても知られているプロテアソームサブユニットベータタイプ１０（ＰＳＭＢ １０）、固形腫瘍における血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；固形腫瘍におけるキネシン紡錘体タンパク質、慢性骨髄性白血病におけるアポトーシス抑制因子Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫（ＢＣＬ－２）。固形腫瘍におけるリボヌクレオチドレダクターゼＭ２（ＲＲＭ２）；固形腫瘍におけるフューリン；肝腫瘍のポロ様キナーゼ１（ＰＬＫ１）、Ｃ型肝炎感染のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ１（ＤＧＡＴ１）、家族性大腸腺腫症のベータカテニン。ベータ２アドレナリン受容体、緑内障；糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）または加齢性黄斑変性症におけるＤＮＡ損傷誘発性転写物４タンパク質としても知られているＲＴＰ８０１／Ｒｅｄｄ１、加齢性黄斑変性症または脈絡膜血管新生における血管内皮増殖因子受容体Ｉ（ＶＥＧＦＲ１）、非動脈炎性虚血性視神経症におけるカスパーゼ２、先天性厚硬膜のケラチン６ＡＮ１７Ｋ変異タンパク質、インフルエンザ感染におけるインフルエンザＡウイルスのゲノム／遺伝子配列；ＳＡＲＳ感染における重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルスゲノム／遺伝子配列；呼吸器合胞体ウイルス感染における呼吸器合胞体ウイルスゲノム／遺伝子配列；エボラ感染におけるエボラフィロウイルスゲノム／遺伝子配列；Ｂ型およびＣ型肝炎感染におけるＢ型およびＣ型肝炎ウイルスのゲノム／遺伝子配列、ＨＳＶ感染における単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ゲノム／遺伝子配列、コクサッキーウイルスＢ３感染におけるコクサッキーウイルスＢ３ゲノム／遺伝子配列；原発性ジストニアにおけるトルシンＡ（ＴＯＲ１Ａ）、汎クラスＩおよび移植に特異的なＨＬＡ対立遺伝子のような遺伝子の病原性対立遺伝子のサイレンシング（対立遺伝子特異的サイレンシング）、常染色体優性遺伝性網膜色素変性症（ａｄＲＰ）の変異ロドプシン遺伝子（ＲＨＯ）からなる群から選択される遺伝子、遺伝子の転写物、ポリヌクレオチド反復疾患に関連する遺伝子の転写物に結合する。

【0051】

特定の実施態様において、異種ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、遺伝子編集ヌクレアーゼを含む。特定の実施態様において、遺伝子編集ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を含む。特定の実施態様において、遺伝子編集ヌクレアーゼは、機能的なタイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を含む。

【0052】

特定の実施態様では、本発明による方法のステップ（ａ）および／またはステップ（ｂ）は、２回以上実行される。

【0053】

特定の実施態様では、対象は哺乳動物である。特定の実施態様では、対象はヒトである。

【0054】

本発明による方法を実施するために使用することができる構成要素を有する組成物、例えば、これらに限定されないパッケージおよびキットも本明細書に開示される。

【0055】

特定の実施態様において、パッケージまたはキットは、その中に配置されている：（ａ）タンパク質またはペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む組換えウイルスベクター；（b）抗体を分解または消化するプロテアーゼまたはグリコシダーゼ；（c）本明細書に開示される方法を実行するための指示が記載されたラベル；特定の実施態様では、（ａ）および（ｂ）は、別個のまたは同じ容器内にある。

【0056】

特定の実施態様において、パッケージまたはキットは、その中に配置されている：（ａ）タンパク質の発現を阻害、減少または減少させる核酸に転写される異種ポリヌクレオチドを含む組換えウイルスベクター；（ｂ）抗体を分解または消化するプロテアーゼまたはグリコシダーゼ；（ｃ）本明細書に開示される方法を実行するための指示が記載されたラベル。特定の実施態様では、（ａ）および（ｂ）は、別個のまたは同じ容器内にある。

【0057】

特定の実施態様において、それを必要とする対象に治療有効量の免疫グロブリンＧ分解酵素ポリペプチドを投与することを含む、ベクターを使用する遺伝子治療によって治療される疾患を治療するための方法。

【図面の簡単な説明】

【0058】

【図1】図１は、ＩＶＩｇで再構成されたマウスにおけるヒトＩｇＧの加水分解を示すグラフである。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスをヒトＩｇＧ（ＩＶＩｇ、９ｍｇ／マウス）で再構成し、３０分後にＩｄｅＳ（２５０ＩＵ／マウス、３マウス）またはＰＢＳ（２マウス）を注射した。ＩｄｅＳの注射前、および１、６、１０時間後に採血した。無傷のヒトＩｇＧは、ＥＬＩＳＡによってマウス血清で測定され、ＩＶＩｇを標準として使用してμｇ／ｍＬとして表す。

【図2】図２は、抗ＡＡＶ ＩｇＧのインビボ中和のための実験プロトコルのスキームである。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス（グループあたり６匹のマウス）または血友病Ｂ（ＨＢ）マウス（グループあたり４匹のマウス）をヒトＩｇＧ（ＩＶＩｇ、９ｍｇ／マウス、日（Ｄ）マイナス１（Ｄ－１））で再構成し、そして３０分（分、分）後にＩｄｅＳ（２５０、５００または１２５０ＩＵ／マウス、Ｄ－１＋３０分）を注射した。３０時間（ｈｒ、ｈ）後（Ｄ０）、マウスにＡＡＶ８ベクター（２ｘ１０１０ｖｇ／マウス）を注射した。ＩＶＩｇ注射の１５分後、ＩｄｅＳ注射の２４時間後、およびＤ－７、Ｄ７、Ｄ１４、Ｄ２８で採血した。安楽死（Ｄ２８）で、ベクターゲノムコピー数（ＶＧＣＮ）評価のために肝臓を収集した。対照マウスは、ＡＡＶベクター注射の前にＩＶＩｇのみ、ＩｄｅＳのみ、またはＰＢＳのみを投与された。

【図3A-B】図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ、および３Ｆは、受動免疫マウスにおける、それぞれヒト抗ＡＡＶ８ ＩｇＧ、抗ＡＡＶ８中和抗体（ＮＡｂ）、抗ＡＡＶ２ ＩｇＧ、抗ＡＡＶ２ ＮＡｂ、抗ＡＡＶ９ＩｇＧおよび抗ＡＡＶ９ＮＡｂに対するＩｄｅＳの効果を示すグラフである。Ｄ－１＋１５分およびＤ－１＋２４で、ＩＶＩｇおよびＩｄｅＳ（ＩＶＩｇ／ＩｄｅＳ）またはＩＶＩｇのみ（ＩＶＩｇ／ＰＢＳ）を注射したマウス（６マウス／グループ）から血液を採取した（図２のスキームを参照）。ＩｄｅＳの用量は、図３Ａ、３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄで２５０ＩＵ／マウス、そして、３Ｅおよび３Ｆで、５００ＩＵ／マウスであった。抗ＡＡＶＩｇＧのレベルはＥＬＩＳＡによって測定され、ＡＡＶＮＡｂのレベルは中和アッセイによって測定された。それぞれ、抗ＡＡＶ８、抗ＡＡＶ２、および抗ＡＡＶ９ＩｇＧのレベルを図１および２に示した。３Ａ、３Ｃ、および３Ｅの抗ＡＡＶ８、抗ＡＡＶ２および抗ＡＡＶ９ ＮＡｂのレベルは、それぞれμｇ／ｍＬで表した。３Ｂ、３Ｄおよび３Ｆの抗ＡＡＶ８、抗ＡＡＶ２および抗ＡＡＶ９ ＮＡｂのレベルは、力価（１／ｘ）で表した。データは平均±ＳＤとして表した。統計的差異は、ノンパラメトリックな両側マンホイットニー検定を使用して評価した（ｎｓ：有意ではない）。

【図3C-D】図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ、および３Ｆは、受動免疫マウスにおける、それぞれヒト抗ＡＡＶ８ ＩｇＧ、抗ＡＡＶ８中和抗体（ＮＡｂ）、抗ＡＡＶ２ ＩｇＧ、抗ＡＡＶ２ ＮＡｂ、抗ＡＡＶ９ＩｇＧおよび抗ＡＡＶ９ＮＡｂに対するＩｄｅＳの効果を示すグラフである。Ｄ－１＋１５分およびＤ－１＋２４で、ＩＶＩｇおよびＩｄｅＳ（ＩＶＩｇ／ＩｄｅＳ）またはＩＶＩｇのみ（ＩＶＩｇ／ＰＢＳ）を注射したマウス（６マウス／グループ）から血液を採取した（図２のスキームを参照）。ＩｄｅＳの用量は、図３Ａ、３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄで２５０ＩＵ／マウス、そして、３Ｅおよび３Ｆで、５００ＩＵ／マウスであった。抗ＡＡＶＩｇＧのレベルはＥＬＩＳＡによって測定され、ＡＡＶＮＡｂのレベルは中和アッセイによって測定された。それぞれ、抗ＡＡＶ８、抗ＡＡＶ２、および抗ＡＡＶ９ＩｇＧのレベルを図１および２に示した。３Ａ、３Ｃ、および３Ｅの抗ＡＡＶ８、抗ＡＡＶ２および抗ＡＡＶ９ ＮＡｂのレベルは、それぞれμｇ／ｍＬで表した。３Ｂ、３Ｄおよび３Ｆの抗ＡＡＶ８、抗ＡＡＶ２および抗ＡＡＶ９ ＮＡｂのレベルは、力価（１／ｘ）で表した。データは平均±ＳＤとして表した。統計的差異は、ノンパラメトリックな両側マンホイットニー検定を使用して評価した（ｎｓ：有意ではない）。

【図3E-F】図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ、および３Ｆは、受動免疫マウスにおける、それぞれヒト抗ＡＡＶ８ ＩｇＧ、抗ＡＡＶ８中和抗体（ＮＡｂ）、抗ＡＡＶ２ ＩｇＧ、抗ＡＡＶ２ ＮＡｂ、抗ＡＡＶ９ＩｇＧおよび抗ＡＡＶ９ＮＡｂに対するＩｄｅＳの効果を示すグラフである。Ｄ－１＋１５分およびＤ－１＋２４で、ＩＶＩｇおよびＩｄｅＳ（ＩＶＩｇ／ＩｄｅＳ）またはＩＶＩｇのみ（ＩＶＩｇ／ＰＢＳ）を注射したマウス（６マウス／グループ）から血液を採取した（図２のスキームを参照）。ＩｄｅＳの用量は、図３Ａ、３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄで２５０ＩＵ／マウス、そして、３Ｅおよび３Ｆで、５００ＩＵ／マウスであった。抗ＡＡＶＩｇＧのレベルはＥＬＩＳＡによって測定され、ＡＡＶＮＡｂのレベルは中和アッセイによって測定された。それぞれ、抗ＡＡＶ８、抗ＡＡＶ２、および抗ＡＡＶ９ＩｇＧのレベルを図１および２に示した。３Ａ、３Ｃ、および３Ｅの抗ＡＡＶ８、抗ＡＡＶ２および抗ＡＡＶ９ ＮＡｂのレベルは、それぞれμｇ／ｍＬで表した。３Ｂ、３Ｄおよび３Ｆの抗ＡＡＶ８、抗ＡＡＶ２および抗ＡＡＶ９ ＮＡｂのレベルは、力価（１／ｘ）で表した。データは平均±ＳＤとして表した。統計的差異は、ノンパラメトリックな両側マンホイットニー検定を使用して評価した（ｎｓ：有意ではない）。

【図4A-B】図４Ａ、４Ｂ、４Ｃおよび４Ｄは、ＩｄｅＳ処置が、受動的に免疫されたマウスにおいてＡＡＶ８ベクターで導入遺伝子発現を救済することを示すグラフである。ＩＶＩｇまたはＰＢＳで受動免疫し、ＩｄｅＳ（２５０ＩＵ／マウス（図４Ａおよび４Ｂ）または１２５０ＩＵ／マウス（図４Ｃおよび４Ｄ））またはＰＢＳを注射したマウス（６匹のマウス／グループ）を２ｘ１０１０ｖｇ／で処理した。ヒト第ＩＸ因子（ｈＦＩＸ）（図４Ａおよび４Ｂ）またはガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）（図４Ｃおよび４Ｄ）をコードするマウスＡＡＶ８ベクター。図４Ａ：ｈＦＩＸ血漿レベルは、特定の抗ｈＦＩＸ ＥＬＩＳＡを使用して測定された。ｈＦＩＸレベルは、精製されたｈＦＩＸを標準として使用してμｇ／ｍＬとして表す。図４Ｃ：血漿中のガウシアルシフェラーゼ活性は、発光アッセイを使用して測定された。ＧＬｕｃアクティビティは、ＲＬＵ（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｌｉｇｈｔ Ｕｎｉｔｓ）として表す。図４Ｂおよび４Ｄ：犠牲時のｑＰＣＲによるマウスの肝臓における二倍体ゲノムあたりのベクターゲノムコピー数。データは平均±ＳＤとして表す。統計分析は、ダネット検定を使用した二元配置分散分析によって実行された。

【図4C-D】図４Ａ、４Ｂ、４Ｃおよび４Ｄは、ＩｄｅＳ処置が、受動的に免疫されたマウスにおいてＡＡＶ８ベクターで導入遺伝子発現を救済することを示すグラフである。ＩＶＩｇまたはＰＢＳで受動免疫し、ＩｄｅＳ（２５０ＩＵ／マウス（図４Ａおよび４Ｂ）または１２５０ＩＵ／マウス（図４Ｃおよび４Ｄ））またはＰＢＳを注射したマウス（６匹のマウス／グループ）を２ｘ１０１０ｖｇ／で処理した。ヒト第ＩＸ因子（ｈＦＩＸ）（図４Ａおよび４Ｂ）またはガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）（図４Ｃおよび４Ｄ）をコードするマウスＡＡＶ８ベクター。図４Ａ：ｈＦＩＸ血漿レベルは、特定の抗ｈＦＩＸ ＥＬＩＳＡを使用して測定された。ｈＦＩＸレベルは、精製されたｈＦＩＸを標準として使用してμｇ／ｍＬとして表す。図４Ｃ：血漿中のガウシアルシフェラーゼ活性は、発光アッセイを使用して測定された。ＧＬｕｃアクティビティは、ＲＬＵ（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｌｉｇｈｔ Ｕｎｉｔｓ）として表す。図４Ｂおよび４Ｄ：犠牲時のｑＰＣＲによるマウスの肝臓における二倍体ゲノムあたりのベクターゲノムコピー数。データは平均±ＳＤとして表す。統計分析は、ダネット検定を使用した二元配置分散分析によって実行された。

【図5A-B】図５Ａおよび５Ｂは、ＩｄｅＳによるヒトおよび非ヒト霊長類抗ＡＡＶ８ ＩｇＧのインビトロ消化のアッセイを示すグラフである。ＩＶＩｇ（２００μｇ）、ＡＡＶ８血清陽性ヒトの血清、およびＡＡＶ８血清陽性サルの血清を、ＩｄｅＳ（１００ＩＵ）またはＰＢＳとともに３７°Ｃで２２時間インキュベートした。図５Ａは、ＥＬＩＳＡによって測定された抗ＡＡＶ８ ＩｇＧのレベルを示している。図５Ｂは、ＡＡＶ中和アッセイの結果（左Ｙ軸）および希釈で観察された中和活性の％（右Ｙ軸、黒い星）を示す。データは平均±ＳＤとして表す。

【図6A-B】図６Ａおよび６Ｂは、ＩｄｅＳ治療が、受動的に免疫された血友病Ｂ（ＨＢ）マウスにおいてＡＡＶ８ベクターによる効率的な遺伝子治療を可能にすることを示すグラフである。ＨＢマウス（グループあたり４匹のマウス）をヒトＩｇＧ（ＩＶＩｇ、９ｍｇ／マウス、Ｄ－１）で再構成し、３０分後にＩｄｅＳ（１２５０ＩＵ／マウス、Ｄ－１＋３０分）を注射した。２４時間後（Ｄ０）、マウスに、ｈＦＩＸ導入遺伝子（２ｘ１０１０ｖｇ／マウス）を運ぶＡＡＶ８ベクターを注射した。ＩｄｅＳ注射の２４時間後、およびＤ７とＤ１４で採血した。専用のＥＬＩＳＡを使用して血漿中のｈＦＩＸのレベルを測定した（図６Ａ）。Ｄ２１で、ＨＢマウスにおける遺伝子治療の有効性は、テールクリップ出血アッセイを使用して評価され、２０分間にわたる失血が推定された（図６Ｂ）。データは平均±ＳＤとして表す。統計分析は、ｈＦＩＸ ＥＬＩＳＡのダネット検定を使用した二元配置分散分析とテールクリップアッセイのダネット検定を使用した一元配置分散分析によって実行された（＊：ｐ＜０．０５；＊＊＊：ｐ＜０．００１）

【図7】図７は、ＮＨＰにおける実験プロトコルのスキームである。ＡＡＶ８（ＮＡｂ力価１：１７．２）に対して血清陽性の２匹のオスのカニクイザルに２ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ８－ｈＦＩＸベクター（Ｄ０）を注入した。ベクター注射の前に、ＮＨＰ２はＤ－２日目とＤ－１日目（ＮＨＰ処理）にＩｄｅＳ（５００μｇ／ｋｇ）の二重注射（ｉ．ｖ．）を受けた。ＮＨＰ１は前治療を受けていない（対照ＮＨＰ）。血液サンプルは、ＩｄｅＳ注射の前後、およびＤ０、Ｄ１、Ｄ４、Ｄ７、Ｄ１３、Ｄ２１、Ｄ２８、Ｄ３５、およびＤ５０で収集された。安楽死（Ｄ５０）で、ＶＧＣＮ評価のために４つの葉から肝生検が収集された。

【図8A-B】図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃは、ＡＡＶ８血清陽性サルにおけるＩｇＧに対するＩｄｅＳ処置の効果を示すグラフである。図８Ａ：血清中の無傷のＩｇＧレベルをＥＬＩＳＡで測定し、精製サルＩｇＧを標準として使用してｍｇ／ｍＬとして表す。図８Ｂ：血清中の抗ＡＡＶ８ＩｇＧレベルをＥＬＩＳＡによるＩｄｅＳ処理の前後に測定した。治療を受けたサル（ＮＨＰ２）では、ＩｄｅＳの注射後に抗ＡＡＶ８ ＩｇＧレベルが２．７分の１に減少した（２．８６から１．０５μｇ／ｍＬ）。図８Ｃ：中和アッセイを使用して、ＩｄｅＳ処理の前後に抗ＡＡＶ８ＮＡｂレベルを測定した。処理されたサル（ＮＨＰ２）では、抗ＡＡＶ８ ＮＡｂ力価が３分の１に減少しました（力価は１７．２から５．４に）。データは平均±ＳＤとして表す。統計分析は、Ｔｕｋｅｙ検定を使用した双方向ＡＮＯＶＡによって実行された（ｎｓ：有意ではない；＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１；＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１）。

【図8C】図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃは、ＡＡＶ８血清陽性サルにおけるＩｇＧに対するＩｄｅＳ処置の効果を示すグラフである。図８Ａ：血清中の無傷のＩｇＧレベルをＥＬＩＳＡで測定し、精製サルＩｇＧを標準として使用してｍｇ／ｍＬとして表す。図８Ｂ：血清中の抗ＡＡＶ８ＩｇＧレベルをＥＬＩＳＡによるＩｄｅＳ処理の前後に測定した。治療を受けたサル（ＮＨＰ２）では、ＩｄｅＳの注射後に抗ＡＡＶ８ ＩｇＧレベルが２．７分の１に減少した（２．８６から１．０５μｇ／ｍＬ）。図８Ｃ：中和アッセイを使用して、ＩｄｅＳ処理の前後に抗ＡＡＶ８ＮＡｂレベルを測定した。処理されたサル（ＮＨＰ２）では、抗ＡＡＶ８ ＮＡｂ力価が３分の１に減少しました（力価は１７．２から５．４に）。データは平均±ＳＤとして表す。統計分析は、Ｔｕｋｅｙ検定を使用した双方向ＡＮＯＶＡによって実行された（ｎｓ：有意ではない；＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１；＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１）。

【図9A-B】図９Ａおよび９Ｂは、ＩｄｅＳで処理されたＡＡＶ８血清陽性サルにおけるより高い導入遺伝子発現を示すグラフである。図９Ａ：ｈＦＩＸ血漿レベルは、特定の抗ｈＦＩＸ ＥＬＩＳＡを使用して測定された。ｈＦＩＸレベルは、精製されたｈＦＩＸを標準として使用してｎｇ／ｍＬとして表す。図９Ｂ：犠牲時のｑＰＣＲによる肝臓の二倍体ゲノムあたりのベクターゲノムコピー数（ＶＧＣＮ）。ＶＧＣＮ評価は、４つの葉の異なる部位（右、左、尾状（尾状）、および方形（方形））で行われた４つのウェッジ生検から行われた。データは平均±ＳＤとして表す。統計分析は、Ｓｉｄａｋの多重比較検定を使用した二元配置分散分析によって実行された（＊＊＊：ｐ＜０．００１；＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１）。対照サル（ＮＨＰ１）と比較して、ＩｄｅＳ治療を受けたサル（ＮＨＰ２）は、血漿中のｈＦＩＸのレベルが高く、ＡＡＶ肝臓への形質導入がより効率的であった。

【図10A-B】図１０Ａおよび１０Ｂは、ＩｄｅＳで処置されたＡＡＶ８血清陽性サルにおける、それぞれ、抗ＡＡＶ８ ＩｇＧおよび抗ＡＡＶ８ ＮＡｂのレベルを示すグラフである。抗ＡＡＶ８ＩｇＧのレベルはＥＬＩＳＡで測定され、μｇ／ｍＬで表す（図１０Ａ）。抗ＡＡＶ８ＮＡｂは中和アッセイで測定され、力価（１：ｘ）で表す（図１０Ｂ）。データは平均±ＳＤとして表す。統計分析は、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を使用した二元配置分散分析によって実行された（＊＊＊＊：ｐ ＜０．０００１）。

【図11】図１１は、ＮＨＰにおけるＡＡＶ８再投与のための実験プロトコルのスキームである。ＡＡＶ８（ＮＡｂ力価１：３１．６）に対して血清陽性の２匹のオスのカニクイザルに５ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ８－ｈＦＩＸベクター（Ｄ０）を注入した。ベクター注射の前に、ＮＨＰ４はＤ－１日目にＩｄｅＳ（５００μｇ／ｋｇ）の単回静脈内（ＩＶ）注射を受けた（ＮＨＰ処理）。ＮＨＰ３は前治療を受けていない（対照ＮＨＰ）。その後、両方のサルは、Ｄ８０日とＤ８１日にＩｄｅＳ（５００μｇ／ｋｇ）を２回ＩＶ注射し、Ｄ８２に５ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ８－ｈＦＩＸベクターを注射した。血液サンプルは、実験中のさまざまな時点で収集された。安楽死（Ｄ１０５）で、ＶＧＣＮ評価のために４つの葉から肝生検が収集された。

【図12A-B】図１２Ａおよび１２Ｂは、ＩｄｅＳ処理が、ＡＡＶ８血清陽性サルにおいて効率的なＡＡＶベクターの再投与を可能にし、導入遺伝子発現の増加をもたらすことを示すグラフである。図１２Ａ：ｈＦＩＸ血漿レベルは、特定の抗ｈＦＩＸ ＥＬＩＳＡを使用して測定された。ｈＦＩＸレベルは、精製されたｈＦＩＸを標準として使用してｎｇ／ｍＬとして表す。図１２Ｂ：肝臓における二倍体ゲノムあたりのベクターゲノムコピー数（ＶＧＣＮ）は、犠牲の時にｑＰＣＲによって決定された。ＶＧＣＮ評価は、４つの葉の異なる部位（左、右、尾状（尾状）、および方形（方形））で行われた４つのウェッジ生検から行われた。データは平均±ＳＤとして表す。統計分析は、Ｓｉｄａｋの多重比較検定を使用した二元配置分散分析によって実行された（＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１）。

【図13A-B】図１３Ａおよび１３Ｂは、ＡＡＶ８ベクターの再投与時にＩｄｅＳで処理されたＡＡＶ８血清陽性サルにおける、それぞれ、抗ＡＡＶ８ ＩｇＧおよび抗ＡＡＶ８ ＮＡｂのレベルを示すグラフである。図１３Ａ：抗ＡＡＶ８ＩｇＧレベルをＥＬＩＳＡで測定した。図１３Ｂ：中和アッセイを使用して抗ＡＡＶ８ ＮＡｂ力価を測定した。データは平均±ＳＤとして表す。

【図14A-B】図１４Ａ、１４Ｂおよび１４Ｃは、ＩｄｅＳの量を増やしながらインキュベートしたヒト患者血清（図１４Ａ）、非ヒト霊長類（アカゲザル）血漿（図１４Ｂ）およびハムスター血漿（図１４Ｃ）のサンプルにおけるＩｄｅＳによるＩｇＧの切断のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。サンプルは、ＩｄｅＳなしで、またはＩｄｅＳの濃度を上げながら、３７°Ｃで１時間インキュベートした。サンプル緩衝液の添加により反応を停止させた。サンプルは、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびクーマシー染色によって分析された。

【図14C】図１４Ａ、１４Ｂおよび１４Ｃは、ＩｄｅＳの量を増やしながらインキュベートしたヒト患者血清（図１４Ａ）、非ヒト霊長類（アカゲザル）血漿（図１４Ｂ）およびハムスター血漿（図１４Ｃ）のサンプルにおけるＩｄｅＳによるＩｇＧの切断のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。サンプルは、ＩｄｅＳなしで、またはＩｄｅＳの濃度を上げながら、３７°Ｃで１時間インキュベートした。サンプル緩衝液の添加により反応を停止させた。サンプルは、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびクーマシー染色によって分析された。

【図15】図１５は、ＩｄｅＺの有無にかかわらず前処理された様々な量のＩＶＩｇで免疫化された動物におけるＡＡＶ－Ｓｐｋ１－ＧＡＡベクターの注入後のマウス血漿中のＧＡＡ活性レベルを示すグラフである。ＡＡＶ－Ｓｐｋ１－ＧＡＡベクターはＩＶＩｇ免疫の１日後に注入された。導入遺伝子活性は、ベクター投与の２週間後にＧＡＡ活性アッセイによって評価された。ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍＬで表したＧＡＡ活性は、各グループの各マウスについてプロットされた。対照マウスには、ＩＶＩｇの非存在下でベクターのみを投与した。

【図16】図１６は、ＩｄｅＳ注入前後のマウス血漿における抗Ｓｐｋ１中和抗体（ＮＡｂ）力価レベルを示す。この研究における相対的なＮＡｂ力価レベルは、低力価（＜１：１、１：１－１：２．５）（太字）、中程度（１：２．５－１：５）（太字のイタリック体）、および高力価（太字）として指定されている。＞１：５－１：１０）（イタリック）。

【図17】図１７は、ＩｄｅＳ注入前後のマウス血漿中の抗Ｓｐｋ１ ＩｇＧ ＮＡｂレベル（ｎｇ／ｍＬ）を示している。陰性対照動物は、ＩＶＩｇまたはＩｄｅＳのいずれでも治療されなかった。ＩｄｅＳ Ｌｏｗは、研究で使用された０．４ｍｇ／ｋｇＩｄｅＳを指し、ＩｄｅＳＨｉｇｈは４ｍｇ／ｋｇＩｄｅＳを指す。

【図18】図１８は、ＩＶＩｇで免疫され、次いでＩｄｅＳで処置された動物におけるＡＡＶ－Ｓｐｋ１－ＧＡＡベクターの注入後のマウス血漿中のＧＡＡ活性レベル（ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍＬ）を示す。すべての動物に２ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇＡＡＶ－Ｓｐｋ１－ＧＡＡベクターを投与した。導入遺伝子活性は、ＩＶＩｇで免疫され、ＩｄｅＳの有無にかかわらず処理され、最後にベクターで投与されたマウスの血漿サンプルで測定された。導入遺伝子活性は、ベクター投与の１週間後にＧＡＡ活性アッセイによって評価された。ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍＬで表したＧＡＡ活性は、各グループの各マウスについてプロットされている。

【図19】図１９は、以前にＩＶＩｇ（０、３００、８００、または１６００）を注入された動物におけるＡＡＶ－Ｓｐｋ１－ＧＡＡベクター（２×１０１２ｖｇ／ｋｇ）の注入の２週間後のＧＡＡ活性レベル（ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍＬ）を示す。ｍｇ／ｋｇ）およびＩｄｅＳ（０、０．４、１．０または２．０ｍｇ／ｋｇ）で処理。ＧＡＡ活動は、各グループの各マウスについてプロットされた。対応する抗Ｓｐｋ１ＮＡｂ力価を発現しなかった（すなわち、ＮＡｂ力価＜１：１または１：１－１：２．５ｐｒｅ－ＩｄｅＳ治療を有する）ＩＶＩｇ投与群のマウスは除外された。

【図20】図２０は、ＩｄｅＳの異なる調製物（ロット＃１およびロット＃２）を測定した、ヒト抗キャプシド中和ＩｇＧの人工力価を有する、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの血漿中の抗Ｓｐｋ１ ＮＡｂ力価レベルを示す。

【図21】図２１は、投与前、およびＡＡＶ－Ｓｐｋ１－ｈＦＶＩＩＩの投与後１週間および２週間での、ヒト抗キャプシド中和ＩｇＧの人工力価を有する、Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの血漿中のヒト第ＶＩＩＩ因子のレベルを示すグラフである。

【図22】図２２は、ＩｄｅＳ注入前後のマウス血漿中の抗Ｓｐｋ１キャプシドＩｇＧレベル（ｎｇ／ｍＬ）を示すグラフである。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＩＶＩｇを投与して、ヒト抗キャプシド中和ＩｇＧの人工力価を誘導した。陰性対照動物は、ＩＶＩｇまたはＩｄｅＳのいずれでも治療されなかった。低ＩＶＩｇは研究で使用された３００ｍｇ／ｋｇＩＶＩｇを指し、中ＩＶＩｇは８００ｍｇ／ｋｇを指し、高ＩＶＩｇは１６００ｍｇ／ｋｇを指す。各ＩＶＩｇグループ内で、動物はＩｄｅＳの用量を増やして治療された（０、０．４、１．０、２．０ｍｇ／ｋｇＩｄｅＳ）。ＩＶＩｇで治療されたが、抗キャプシドＩｇＧ応答を示さなかった動物は、グラフから除外されました。

【0059】

本明細書で提供されるのは、抗体を分解または消化する、および／または抗体のエフェクター機能を阻害または低減する薬剤の投与を含む、遺伝子治療の利益または有効性を改善するための方法である。組換えウイルスベクターなどのウイルスベクターに結合する抗体を分解または消化する方法、および／または核酸によってキャプシド形成された異種ポリヌクレオチドによってコードされる核酸またはタンパク質またはペプチドに結合する抗体を分解または消化する方法も本明細書に提供される。組換えウイルスベクターおよび／または組換えウイルスベクターに結合する抗体のエフェクター機能、および／または組換えウイルスベクターによってキャプシド形成された異種ポリヌクレオチドによってコードされる核酸またはタンパク質またはペプチドを阻害または低減する。遺伝子治療ベクターが以前に投与された対象に遺伝子治療ベクターを再投与または再投与する方法も本明細書に提供され、対象は、遺伝子治療ベクターに結合および／または中和する抗体を開発した。

【0060】

特定の実施態様において、方法は、抗体を分解または消化するのに有効な量のプロテアーゼ、または組換えウイルスベクター、および／または核酸、および／またはおよび／または異種ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質またはペプチドに結合する抗体のエフェクター機能を阻害または低減するのに有効なグリコシダーゼを対象に投与することを含む。特定の実施態様において、方法は、抗体を分解または消化するのに有効な量のエンドペプチダーゼ、または組換えウイルスベクターおよび／または核酸／または異種ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質またはペプチドに結合する抗体のエフェクター機能を阻害または低減するのに有効なエンドグリコシダーゼを対象に投与することを含む。

【0061】

特定の実施態様において、方法は、組換えウイルスベクター、および／または核酸、および／または異種ポリヌクレオチドによりコードされたタンパク質またはペプチドに結合する抗体のＦｃ受容体結合を低減するのに有効な量のグリコシダーゼを対象に投与することを含む。特定の実施態様において、方法は、組換えウイルスベクター、および／または核酸、および／または異種ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質またはペプチドに結合する抗体のＦｃ受容体結合を低減するのに有効な量のエンドグリコシダーゼを対象に投与することを含む。

【0062】

特定の実施態様において、本発明は、それを必要とする患者においてベクターを使用する遺伝子治療によって治療される疾患の治療において使用するための免疫グロブリンＧ分解酵素ポレプチドに関する。

【0063】

特定の実施態様において、本発明は、ｉ）免疫グロブリンＧ分解酵素ポリペプチド、およびｉｉ）それを必要とする患者における前記ベクターを使用する遺伝子治療によって治療される疾患の治療における同時、別個、または連続使用のための組み合わせ調製物としてのベクターに関する。

【0064】

特定の実施態様において、本発明は、免疫グロブリンＧ分解酵素ポリペプチドと、それを必要とする患者において前記ベクターを使用する遺伝子治療によって治療される疾患の治療に使用するためのベクターとの組み合わせに関する。

【0065】

特定の実施態様において、免疫グロブリンＧ分解酵素ポリペプチドは、前記ベクターの前に、同時に（同時に）、または後に投与される。

【0066】

本明細書で使用される場合、「ベクターを使用する遺伝子治療によって治療される疾患」という用語は、ポリヌクレオチド（少なくとも１つのポリペプチドまたは阻害性核酸をコードする）が上記の病気を治療する（遺伝子治療）薬物として患者の細胞に送達される疾患を意味する。

【0067】

特定の実施態様において、ベクターは、疾患を治療するのに有用な少なくとも１つの特定のポリペプチドまたは阻害性核酸をコードする。特定の実施態様において、ベクターは、疾患を治療するのに適切な治療用ポリヌクレオチドをコードする／含む。

【0068】

特定の実施態様では、ベクターは、遺伝子治療を使用して疾患を治療するのに適切な治療用ポリヌクレオチドをコードする／含む。

【0069】

特定の実施態様において、患者は、ベクター血清陽性患者である。

【0070】

特定の実施態様において、患者は、ベクター血清陰性患者である。

【0071】

本明細書で使用される場合、「免疫グロブリンＧ分解酵素ポリペプチド」という用語は、免疫グロブリンＧを分解するプロテアーゼであるポリペプチドを意味する。特定の実施態様では、免疫グロブリンＧ分解酵素ポリペプチドは、パパイン、ペプシンまたは免疫グロブリンＧ分解である。Ｓ． ｙｏｇｅｎｅｓ（ＩｄｅＳ）の酵素ポリペプチド、または他の細菌または微生物からの変異体、またはそれらの操作されたバージョン。 特定の実施態様において、免疫グロブリンＧ分解酵素ポリペプチドは、免疫グロブリンＧを特異的に分解する。特定の実施態様において、免疫グロブリンＧ分解酵素ポリペプチドは、配列番号３～４３または４８のいずれかから選択される配列を含む。

【0072】

本明細書で使用される場合、「患者」および「対象」という用語は、動物、典型的には、げっ歯類、ネコ、イヌ、および霊長類などの哺乳動物を交換可能に指す。特に、本発明による対象または患者はヒトである。

【0073】

本明細書で使用される場合、「治療」または「治療」という用語は、遺伝子療法のような予防的または予防的治療、ならびに疾患にかかるリスクがあるまたは発症した疑いのある対象の治療を含む、治癒的または疾患修飾的治療の両方を指す。 病気、ならびに病気または病状に苦しんでいると診断された対象、および臨床的再発の抑制を含む。 治療は、障害または再発性障害の１つまたは複数の症状を予防、治癒、発症を遅らせる、重症度を軽減する、または改善するために、または、そのような治療がない場合に予想されるよりも対象の生存を延長するために、的障害を有する、または最終的に障害を獲得する可能性がある対象に投与することができる。

【0074】

本明細書にさらに提供される組成物は、例えばパッケージまたはキットとして提供され、（ａ）タンパク質またはペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドまたは異種ポリヌクレオチドからなる組換えウイルスベクター；（ｂ）抗体を分解または消化するプロテアーゼまたはグリコシダーゼ；および（ｃ）本明細書に記載される方法を実行するための指示書を有するラベルを有し、ここで（ａ）および（ｂ）は別個の容器または同じ容器に入っている。特定の実施態様において、本明細書において使用され得るウイルスベクターは、例えば、限定されないが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。 特定の実施態様において、本発明において使用され得るウイルスベクターは、例えば、限定されずに、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルパー依存性アデノウイルス、ハイブリッドアデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、エプスタインバーウイルス、ワクシニアウイルス、およびヒトサイトメガロウイルスベクター（それらの組換えバージョンを含む）を含む。

【0075】

本明細書で限定無く使用されるように、「組換え」という用語は、組換えＡＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターのようなウイルスベクターの改変体として、また組換えポリヌクレオチドおよびポリペプチドのような配列の改変体として、組成物が、一般に自然界では発生しない方法で操作された（すなわち、工学的に操作された）ものであることを意味する。組換えＡＡＡＶベクターの特定の例は、野生型ＡＡＡＶゲノム中に通常存在しない核酸（異種ポリヌクレオチド）がウイルスゲノム内に挿入されるところであろう。その例は、治療用タンパク質またはポリヌクレオチド配列をコードする核酸（例えば、遺伝子）が、その遺伝子がＡＡＶゲノム内で通常関連する５'、３'および／またはイントロン領域を有するか否かを問わず、ベクターにクローニングされるところであろう。組換え体」という用語は、ＡＡＡＶベクター、ポリヌクレオチドなどの配列に関連して本明細書では必ずしも使用されないが、ＡＡＡＶベクター、ポリヌクレオチドなどを含む組換え体の形態は、そのような省略にもかかわらず、明示的に含まれる。

【0076】

「ｒＡＡＶベクター」は、例えば、分子法を用いて野生型ＡＡＶゲノムの全部または一部を除去し、治療用タンパク質またはポリヌクレオチド配列をコードする核酸などの非ネイティブ（異種）核酸で置換することにより、ＡＡＶの野生型ゲノムに由来する。典型的には、ｒＡＡＶベクターでは、ＡＡＶゲノムの１つまたは両方の倒立末端リピート（ＩＴＲ）配列が保持される。ｒＡＡＶは、ＡＡＶゲノムの全部または一部が、治療用タンパク質またはポリヌクレオチド配列をコードする異種核酸など、ＡＡＶゲノム核酸に関して非ネイティブ配列で置換されているので、ＡＡＶゲノムとは区別される。非ネイティブ（異種）配列の組み込みは、したがって、“組換え”ＡＡＶベクターとしてＡＡＶを定義し、これは“ｒＡＡＶベクター”と呼ばれることができる。

【0077】

組換えＡＡＶベクター配列は、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏでの細胞のその後の感染（導入）のための「粒子」として本明細書で言及されるようにパッケージ化され得る。組換えベクター配列がＡＡＶ粒子にカプセル化またはパッケージ化される場合、粒子はまた、“ｒＡＡＶ”、“ｒＡＡＶ粒子”および／または“ｒＡＡＶビリオン”と呼ばれ得る。そのようなｒＡＡＶ、ｒＡＡＶ粒子およびｒＡＡＶビリオンは、ベクターゲノムをカプセル化またはパッケージ化するタンパク質を含む。特に例としては、ＡＡＶの場合には、キャプシドタンパク質が挙げられる。

【0078】

「ベクターゲノム」（「ｖｇ」と略記されることがある）とは、最終的にパッケージ化またはカプセル化されてｒＡＡＶ粒子を形成する組換えプラスミド配列の部分を指す。組換えプラスミドを用いて組換えＡＡＡＶベクターを構築または製造する場合、ＡＡＡＶベクターゲノムには、組換えプラスミドのベクターゲノム配列に対応しない「プラスミド」の部分が含まれる。組換えプラスミドのこの非ベクターゲノム部分は、「プラスミドバックボーン」と呼ばれ、これは、増殖および組換えＡＡＡＶベクターの製造に必要なプロセスであるプラスミドのクローニングおよび増幅のために重要であるが、それ自体はｒＡＡＶ粒子にパッケージ化またはカプセル化されていない。したがって、「ベクターゲノム」とは、ｒＡＡＶによってパッケージ化またはカプセル化された核酸を指す。

【0079】

本明細書で使用されるように、ＡＡＡＶベクターに関する用語「血清型」は、他のＡＡＶ血清型と血清学的に区別されるキャピシドを意味する。血清学的に区別できるかどうかは、他のＡＡＶと比較して、あるＡＡＶに対する抗体間の交差反応性の欠如に基づいて決定される。交差反応性の違いは、通常、キャプシドタンパク質配列／抗原性決定因子の違いに起因する（例えば、ＡＡＡＶ血清型のＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３配列の違いに起因する）。あるＡＡＶに対する抗体は、キャピシドタンパク質配列の相同性に起因して、１つ以上の他のＡＡＶ血清型と交差反応することがある。

【0080】

従来の定義の下では、血清型とは、関心のあるウイルスが、中和活性のために、既存の特徴的なすべての血清型に特異的な血清に対して試験され、関心のあるウイルスを中和する抗体が発見されていないことを意味する。より多くの天然に存在するウイルス単離体が発見され、および／またはカプシド変異体が生成されるにつれて、現在存在するいずれかの血清型との血清学的差異が存在する場合もあれば、存在しない場合もある。したがって、新しいウイルス（例えば、ＡＡＶ）が血清学的差異を有さない場合、この新しいウイルス（例えば、ＡＡＶ）は、対応する血清型のサブグループまたはバリアントであろう。多くの場合、中和活性のための血清学的検査は、従来の血清型の定義に従って別の血清型であるかどうかを決定するために、キャピキシド配列の改変を有する変異ウイルスに対してまだ実施されていない。したがって、便宜上、および繰り返しを避けるために、「血清型」という用語は、血清学的に区別されたウイルス（例えば、ＡＡＶ）および血清学的に区別されていないウイルス（例えば、ＡＡＶ）の両方を広く指すが、これらは、ある血清型のサブグループ内にあるかもしれないし、または所定の血清型のバリアント内にあるかもしれない。

【0081】

ｒＡＡＶベクターは、任意のウイルス株または血清型を含む。例えば、限定することなく、ｒＡＡＶベクターのゲノムまたは粒子（キャプシド、例えばＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３）は、例えばＡＡＶ－１、－２、－３、－４、－５、－５、－６、－７、－８、－９、－１０、－１１、－１２、－ｒｈ７４、－ｒｈ１０またはＡＡＶ－２ｉ８などの任意のＡＡＶ血清型に基づくことができる。そのようなベクターは、同一の株または血清型（またはサブグループまたはバリアント）に基づくか、または互いに異なるものであり得る。例えば、限定することなく、１つの血清型ゲノムに基づくｒＡＡＶプラスミドまたはベクターゲノムまたは粒子（キャプシド）は、ベクターをパッケージ化するキャプシドタンパク質の１つ以上と同一であり得る。さらに、ｒＡＡＶプラスミドまたはベクターゲノムは、ベクターゲノムをパッケージ化するキャプシドタンパク質の１つ以上とは異なるＡＡＶ血清型ゲノムに基づくことができ、その場合、３つのキャプシドタンパク質のうちの少なくとも１つは、異なるＡＡＶ血清型、例えば、以下のようなものであり得る。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、－ｒｈ７４、－ｒｈ１０、ＡＡＶ－２ｉ８、ＳＰＫ１（配列番号１）、ＳＰＫ２（配列番号２）、またはその変種、例えば。より具体的には、ｒＡＡＶ２ベクターゲノムは、ＡＡＶ２ ＩＴＲを含むが、異なる血清型、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、－ｒｈ７４、－ｒｈ１０、ＡＡＶ－２ｉ８、ＳＰＫ１（配列番号１）、ＳＰＫ２（配列番号２）、またはそれらの変種からのカプシドを含むことができる。従って、ｒＡＡＶベクターは、特定の血清型に特徴的な遺伝子／タンパク質配列と同一の遺伝子／タンパク質配列、および“混合された”血清型を含み、これは“シュードタイプ”とも呼ばれ得る。

【0082】

特定の実施態様では、ベクターは、ＡＡＶベクター、レンチウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターである。

【0083】

特定の実施態様では、用語ベクターはまた、最初の投与後に中和免疫グロブリンＧを誘導する組換えベクターを含む。

【0084】

特定の実施態様では、ベクターはＡＡＶベクターである。特定の実施態様において、ベクターは、ヒトＦＩＸをコードするＡＡＶ８ベクターである（ヒトＦＩＸをコードする治療用ポリヌクレオチドからなる）。特定の実施態様において、ベクターは、血友病の治療に有用なヒトＦＩＸをコードするＡＡＶ８ベクターである

【0085】

特定の実施態様において、ｒＡＡＶプラスミドまたはベクターゲノムまたは粒子は、爬虫類または無脊椎動物のＡＡＶ変異体、たとえば、トカゲパルボウイルス(Penzes et al., 2015, J. Gen. Virol., 96:2769-2779)または昆虫およびエビパルボウイルス(Roekring et al., 2002, Virus Res., 87:79-87)である。

【0086】

特定の実施態様では、組換えプラスミドまたはベクターゲノムまたは粒子は、ボカウイルスバリアントに基づく。ヒトボカウイルスバリアントは、例えば、Guido et al., 2016, World J. Gastroenterol., 22: 8684-8697に記載されている。

【0087】

特定の実施態様では、ｒＡＡＶベクターは、少なくとも７０％以上のカプシド配列を含むか、またはそれからなる（例えば、以下のようなものがある。７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％）１つ以上のＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、－ｒｈ７４、－ｒｈ１０ ＡＡＶ－２ｉ８、ＳＰＫ１（配列番号１）、ＳＰＫ２（配列番号２）キャプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３配列）と同一である。特定の実施態様では、ｒＡＡＶベクターは、少なくとも７０％以上の配列（例えば７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など）、１つ以上のＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、－ｒｈ７４、－ｒｈ１０またはＡＡＶ－２ｉ８、ＩＴＲ（ｓ）と同一の配列を含むか、またはそれからなる。）

【0088】

特定の実施態様において、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、およびＡＡＶ－２ｉ８バリアント（例えば。アミノ酸の挿入、追加、置換および欠失などのＩＴＲおよびカプシド変種）、それらの変種は、例えば、ＷＯ２０１３／１５８８７９（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３７１７０）、ＷＯ２０１５／０１３３１３（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４７６７０）およびＵＳ２０１３／０５９７３２（米国特許出願第１３／５９４，７７３号）に記載されているようなものである。

【0089】

ｒＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、－ｒｈ７４、－ｒｈ１０、ＡＡＶ－２ｉ８、ＳＰＫ１（配列番号１）、ＳＰＫ２（配列番号２）およびその変異体、ハイブリッドおよびキメラ配列は、当業者に知られている技術を使用して構築することができ、１つまたは複数の機能的なＡＡＶ ＩＴＲ配列でフランキングされた１つまたは複数の異種ポリヌクレオチド配列（トランスジェーン）を含むように構築することができる。そのようなＡＡＶベクターは、典型的には、組換えベクターのｒＡＡＶベクター粒子へのレスキュー、複製、およびパッケージングに必要な、少なくとも１つの機能的フランキングＩＴＲ配列（複数可）を保持する。従って、ｒＡＡＶベクターゲノムは、複製およびパッケージングに必要な配列（例えば、機能的ＩＴＲ配列）をシスで含むであろう。機能的ＩＴＲ配列）を含む）。特定の実施態様において、本発明で使用されるレンチウイルスは、ヒト免疫不全－１（ＨＩＶ－１）、ヒト免疫不全－２（ＨＩＶ－２）、シミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ジェンブラナ病ウイルス（ＪＤＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、またはカプリン関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）であってもよい。レンチウイルスベクターは、インビトロおよびインビボの両方で、異種ポリヌクレオチド配列の非分裂細胞への効率的な送達、統合および長期発現を提供することができる。様々なレンチウイルスベクターが当技術分野で知られている、Naldini et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:11382-11388 (1996); Science, 272: 263-267 (1996)), Zufferey et al., (Nat. Biotechnol., 15:871-875, 1997), Dull et al., (J Virol. 1998 Nov;72(11):8463-71, 1998)を参照。米国特許６，０１３，５１６および５，９９４，１３６のいずれかが、本発明における使用に適したウイルスベクターであり得る。体液性免疫などの免疫応答は、野生型ウイルスに曝露された被験体において、野生型ウイルスに対して発達し得る。そのような曝露は、そのようなウイルスベクターを採用する遺伝子治療法による治療の前であっても、野生型ウイルスに基づくウイルスベクターに結合する被験体中の既存の抗体を生じさせることができる。

【0090】

本明細書で使用されるように、用語「ＡＡＶベクター」は、当技術分野での一般的な意味を有し、ＡＡＶ１を含むがこれらに限定されないアデノ随伴ウイルス血清型に由来するベクターを指す。ＡＡＶ２、変種ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、変種ＡＡＶ３、変種ＡＡＶ３Ｂ、変種ＡＡＶ３Ｂ、変種ＡＡＶ４、変種ＡＡＶ５、変種ＡＡＶ６、変種ＡＡＶ６、変種ＡＡＶ７、変種ＡＡＶ８、変種ＡＡＶ９、ＡＡＶｃｙ１０およびＡＡＶｒｈ１０のようなＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶＤＪ、ＡＡＶ－Ａｎｃ８０；ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ２ｉ８およびブタＡＡＶ、例えばＡＡＶｐｏ４およびＡＡＶｐｏ６カプシドを有するか、またはキメラカプシドを有するか、またはヒト、サルまたは他の種に感染することができるＡＡＶの任意の他の天然に存在する血清型、およびシャッフリング、ペプチド挿入、エラーが発生しやすいＰＣＲ、合理的設計、または機械学習およびＡＡＶＬＫ０３、ＡＡＶＤＪ、Ａｎｃ８０、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ－ＰＨＰ－Ｂのような他の技術を使用して工学的に設計された他のすべての血清型。ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ野生型遺伝子の全部または一部、好ましくはｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子の１つ以上を欠失させてもよいが、機能的フランキング倒立末端リピート（ＩＴＲ）配列を保持する。機能的なＩＴＲ配列は、ＡＡＡＶウイルスのレスキュー、複製およびパッケージングに必要である。したがって、ＡＡＶベクターは、本明細書において、ウイルスの複製およびパッケージングのためにシスで必要とされる配列（例えば、機能的ＩＴＲ）を少なくとも含むように定義される。ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、配列が機能的なレスキュー、複製およびパッケージングを提供する限り、例えばヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって改変されてもよい。ＡＡＶ発現ベクターは、少なくとも転写方向に操作的に連結された構成要素として、転写開始領域、即ち本発明の核酸分子、および転写終結領域を含む制御要素を提供するために、公知の技術を用いて構築される。制御要素は、哺乳動物細胞において機能的であるように選択される。手術的に連結された構成要素を含む結果として得られるコンストラクトは、機能的なＡＡＶ ＩＴＲ配列で結合されている（５’および３’）。

【0091】

「アデノ随伴ウイルス倒立末端リピート」または「ＡＡＶ ＩＴＲｓ」とは、ＡＡＶゲノムの各末端に見られる、ＤＮＡ複製の起源として、またウイルスのパッケージングシグナルとしてシスで一緒に機能する、技術的に認知された領域を意味する。ＡＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＡＶの複製コード領域とともに、２つの隣接するＩＴＲの間に介在するヌクレオチド配列の哺乳類細胞ゲノムへの効率的な切除およびレスキュー、および統合を提供する。ＡＡＶ ＩＴＲ領域のヌクレオチド配列は既知である。ＡＡＶ－２配列については、例えば、Kotin, 1994; Berns, KI "Parvoviridae and their Replication" in Fundamental Virology, 2nd Edition, (B. N. Fields and D. M. Knipe, eds.）を参照されたい。本明細書で使用されるように、「ＡＡＶ ＩＴＲ」は、必ずしも野生型ヌクレオチド配列を構成するものではなく、例えばヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって改変されてもよい。さらに、ＡＡＶ ＩＴＲは、限定されないが、ＡＡＡＶ－１、ＡＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６などを含むいくつかのＡＡＶ血清型のいずれかに由来するものであってもよい。さらに、ＡＡＶベクター中の選択されたヌクレオチド配列をフランキングする５’および３’ＩＴＲは、それらが意図された通りに機能する限り、すなわち、宿主細胞ゲノムまたはベクターからの関心のある配列の切除およびレスキューを可能にし、ＡＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子産物が細胞内に存在する場合に、異種配列のレシピエント細胞ゲノムへの統合を可能にするために、必ずしも同一であるか、同一のＡＡＡＶ血清型または単離物に由来する必要はない。特定の実施態様において、本発明のＡＡＶベクターは、哺乳類の中枢神経系および末梢神経系の細胞、特にニューロン、ニューロン前駆細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイトおよびグリア細胞の細胞に対してトロピズムを有し、かつ高い導入効率を有するＡＡＶ血清型に由来するベクターから選択される。特定の実施態様において、ＡＡＶベクターは、脳細胞、特にニューロンを良好にトランスフェクションすることが記載されているＡＡＶ４、ＡＡＶ９またはＡＡＶｒｈ１０である。特定の実施態様において、本発明のＡＡＶベクターは、二本鎖、自己相補性ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターである。一本鎖ＡＡＶベクターの使用の代替として、自己相補性ベクターを使用することができる。トランスダクションに必要なゲノム含有粒子の数という点でのＡＡＡＶベクターの効率は、発現前に一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ゲノムを二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に変換する必要性によって妨げられる。このステップは、ＤＮＡ合成または複数のベクターゲノム間の塩基対合を必要とせずにｄｓＤＮＡに折りたたむことができる逆リピートゲノムをパッケージ化した自己相補的ベクターの使用によって回避することができる。自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターは、結果としてトランスジーンの発現を増加させることができる。ＡＡＶ生物学、ＩＴＲ機能、およびｓｃＡＡＶコンストラクトの概要については、McCarty D M. Self-complementary ＡＡＶベクター；進歩と応用を参照。このように、本研究では、自己相補的なＡＡＶベクターの開発を目指している。Ther. 2008 October; 16 (10): at pages 1648-51, first full paragraph, incorporated by reference to disclosure of AAV and scAAV constructs, ITR function, and role of ΔTRS ITR in scAAV constructs.ΔＴＲＳ ＩＴＲを構成するｒＡＡＶベクターは、複製サイクル中に正しくニックネームされることができず、したがって、自己相補的な二本鎖ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ゲノムを生成し、これは感染性ＡＡＶ粒子に効率的にパッケージングすることができる。種々のｒＡＡＶ、ｓｓＡＡＶ、およびｓｃＡＡＶベクター、ならびに特定の用途のための各クラスのベクターの利点および欠点、ならびに遺伝子導入用途においてそのようなベクターを使用する方法は、当技術分野の当業者にはよく知られている（例えば、Choi et al. 2005年、J. Virol. 79(11):6801-7;McCartyら、2004年、Annu Rev Genet. 38:819-45;McCartyら、2001年、Gene Ther. 8(16):1248-54；およびMcCarty 2008年、Mol. Ther.、16(10):1648-56；引用されたすべての参考文献は、ＡＡＶ、ｒＡＡＶ、およびｓｃＡＡＶベクターの開示のために参照により本明細書に組み込まれる）。）

【0092】

本発明のＡＡＶベクターは、主要なＡＡＶオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）を切除したＡＡＶゲノムに選択された配列を直接挿入することにより構築することができる。ＡＡＶゲノムの他の部分は、複製およびパッケージング機能を可能にするために十分な部分のＩＴＲが残っている限り、削除することもできる。そのような構築物は、当技術分野でよく知られている技術を用いて設計することができる。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号および第５，１３９，９４１号；国際公開第ＷＯ ９２／０１０７０号およびＷＯ ９３／０３７６９号を参照のこと。あるいは、ＡＡＶのＩＴＲは、ウイルスゲノムから、または標準的なライゲーション技術を用いて、別のベクターに存在する選択された核酸構築物の５’および３’と同じで融合したものを含むＡＡＶベクターから切除することができる。ＩＴＲを含むＡＡＶベクターは、例えば、米国特許第５，１３９，９４１号に記載されている。特に、いくつかのＡＡＶベクターは、Accession Number 53222、53223、53224、53225および53226の下でAmerican Type Culture Collection（「ＡＴＣＣ」）から入手可能である、そこに記載されている。さらに、キメラ遺伝子は、１つ以上の選択された核酸配列の５’および３’に配列されたＡＡＶ ＩＴＲ配列を含むように、合成的に作製することができる。哺乳類ＣＮＳおよびＰＮＳ細胞におけるキメラ遺伝子配列の発現のための好ましいコドンを使用することができる。完全なキメラ配列は、標準的な方法で調製されたオーバーラップオリゴヌクレオチドから組み立てられる。ＡＡＶビリオンを産生するために、ＡＡＶ発現ベクターを、トランスフェクションなどの公知の技術を用いて、適当な宿主細胞に導入する。多くのトランスフェクション技術が当技術分野で一般に知られている。例えば、Grahamら(1973);Sambrookら(1989)Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York、Davisら(1986)Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier、およびChuら(1981)を参照のこと。特に好適なトランスフェクション方法としては、リン酸カルシウム共沈法（Ｇｒａｈａｍら、１９７３）、培養細胞への直接マイクロインジェクション（Ｃａｐｅｃｃｈｉ、１９８０）、エレクトロポレーション（Ｓｈｉｇｅｋａｗａら、１９８８）、リポソーム媒介遺伝子導入（Ｍａｎｎｉｎｏら、１９８８）、脂質媒介導入（Ｆｅｌｇｎｅｒら、１９８７）、および高速マイクロプロジェクタイルを用いた核酸送達（Ｋｌｅｉｎら、１９８７）などが挙げられる。

【0093】

典型的には、本発明のベクターは発現カセットからなる。本明細書で使用されるように、「発現カセット」という用語は、本発明の核酸分子を発現させるのに十分な核酸エレメントからなる核酸構築物を指す。典型的には、発現カセットは、プロモーター配列にオペレーショナルに連結された本発明の核酸分子からなる。オペレーショナルに連結されている」という用語は、一方の機能が他方の機能によって影響を受けるように、単一の核酸フラグメント上に２つ以上の核酸フラグメントを関連付けることを意味する。例えば、プロモーターは、そのコーディング配列の発現に影響を与えることができる場合（例えば、コーディング配列がプロモーターの転写制御下にある場合）、コーディング配列とオペレーショナルに連結される。符号化配列は、センス配向またはアンチセンス配向で調節配列にオペレーショナルに連結され得る。特定の実施態様では、プロモーターは異種プロモーターである。本明細書で使用されるように、「異種プロモーター」という用語は、自然界では、所与のコード化配列にオペレーショナルに連結されていることが見出されないプロモーターを指す。特定の実施態様では、発現カセットは、追加の要素、例えば、イントロン、エンハンサー、ポリアデニル化部位、ウッドチャック応答要素（ＷＲＥ）、および／またはエンコード配列の発現レベルに影響を与えることが知られている他の要素を含んでいてもよい。本明細書で使用されるように、用語「プロモーター」は、コード化配列または機能性ＲＮＡの発現を制御することが可能なヌクレオチド配列を指す。一般に、本発明の核酸分子は、プロモーター配列の３’に位置する。特定の実施態様では、プロモーター配列は、近位およびより遠位の上流要素からなり、エンハンサー要素を含むことができる。エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激し得るヌクレオチド配列であり、プロモーターの生得的な要素であってもよく、プロモーターのレベルまたは組織特異性を高めるために挿入された異種要素であってもよい。特定の実施態様では、プロモーターは、その全体がネイティブ遺伝子に由来する。特定の実施態様では、プロモーターは、異なる天然に存在するプロモーターに由来する異なる要素からなる。特定の実施態様では、プロモーターは合成ヌクレオチド配列からなる。異なるプロモーターが、異なる組織または細胞型において、または異なる発生段階において、または異なる環境条件に応答して、または薬物または転写コファクターの存在または非存在に応答して、遺伝子の発現を指示することは、当技術分野に熟練した者によって理解されるであろう。ユビキタスプロモーター、細胞型特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、発生段階特異的プロモーター、および条件付きプロモーター、例えば、薬物応答性プロモーター（例えば、テトラサイクリン応答性プロモーター）は、当技術分野の当業者にはよく知られている。プロモーターの例としては、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＫＧ）プロモーター、ＣＡＧ（ＣＭＶエンハンサー、チキンβアクチンプロモーター（ＣＢＡ）およびウサギβグロビンイントロンの複合体）、ＮＳＥ（神経特異的エノラーゼ）、シナプシンまたはＮｅｕＮプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスＬＴＲプロモーター；アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、ＣＭＶ即時初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）などのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＦＦＶプロモーター、ルス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、合成プロモーター、ハイブリッドプロモーターなどが挙げられる。他のプロモーターは、ヒト由来のものであってもよいし、マウス由来のものを含む他の種由来のものであってもよい。一般的なプロモーターとしては、例えば、以下のものが挙げられる。ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ルス肉腫ウイルス長末端リピート、［β］－アクチン、ラットインスリンプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、ヒトα－１抗トリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーター、トランススチレチンプロモーター、ＴＢＧプロモーターおよび他の肝臓特異的プロモーター、デスミンプロモーターおよび同様の筋肉特異的プロモーターなどが挙げられる。ＥＦ１－αプロモーター、ＣＡＧプロモーターおよび他の構成プロモーター、マルチ組織特異性を有するハイブリッドプロモーター、シナプシンおよびグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターのようなニューロンに特異的なプロモーター、これらはすべて、当技術分野の当業者によく知られており、かつ容易に入手可能なプロモーターであり、関心のあるコード化配列の高レベル発現を得るために使用することができる。さらに、マウスメタロチオネイン遺伝子のような非ウイルス遺伝子に由来する配列もまた、本明細書において使用を見出すであろう。そのようなプロモーター配列は、例えば、Stratagene（サンディエゴ、カリフォルニア州）から市販されている。

【0094】

特定の実施態様では、発現カセットは、本発明の瞬間核酸分子によってコードされるポリペプチドの分泌を可能にする適切な分泌シグナル配列からなる。本明細書で使用されるように、用語「分泌シグナル配列」またはそのバリエーションは、ネイティブポリペプチドで見られる分泌のレベルと比較して、細胞からの操作可能に連結されたポリペプチドの分泌を（上記で定義したように）増強するように機能するアミノ酸配列を指すことが意図される。上記で定義したように、「強化された」分泌によって、細胞から分泌される細胞によって合成されたポリペプチドの相対的な割合が増加することを意味する；分泌されたタンパク質の絶対量もまた増加することは必要ではない。特定の実施態様では、ポリペプチドの本質的にすべて（すなわち、少なくとも９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）が分泌される。しかしながら、分泌のレベルがネイティブポリペプチドと比較して増強される限り、ポリペプチドの本質的にすべてまたはさらに大部分が分泌されることは必要ではない。一般に、分泌シグナル配列は小胞体内で切断され、特定の実施態様では、分泌シグナル配列は分泌に先立って切断される。しかしながら、細胞からのポリペプチドの分泌が増強され、ポリペプチドが機能的である限り、分泌シグナル配列が切断される必要はない。したがって、特定の実施態様では、分泌シグナル配列は部分的にまたは全体的に保持される。分泌シグナル配列は、全体または部分的に、分泌されたポリペプチドの分泌シグナル（すなわち、前駆体からの）に由来することができ、および／または全体または部分的に合成されたものであることができる。分泌シグナル配列の長さは重要ではなく、一般に、既知の分泌シグナル配列は、約１０～１５から約５０～６０アミノ酸の長さである。さらに、分泌されたポリペプチドからの既知の分泌シグナル配列は、結果として得られる分泌シグナル配列が操作可能に連結されたポリペプチドの分泌を増強するように機能する限り、（例えば、アミノ酸の置換、欠失、切り捨てまたは挿入によって）改変または改変され得る。即ち、本発明の分泌シグナル配列は、天然に存在する分泌シグナル配列またはその改変物（上述のように）から構成され得るか、本質的に構成され得るか、または構成され得る。細胞からの分泌を指示する多数の分泌タンパク質および配列が当技術分野で知られている。即ち、本発明の分泌シグナル配列は、その全部または一部が合成または人工的であることがさらに可能である。合成または人工の分泌シグナルペプチドは、当技術分野で知られており、例えば、Barashら、Biochem.Biophys. Res. Comm. 294:835-42 (2002)を参照のこと。

【0095】

特定の実施態様において、本発明は、ベクターを用いた遺伝子治療により疾患を治療する方法を含み、その方法は、治療上有効な量の免疫グロブリンＧ分解酵素ポリペプチドを必要とする被験者に投与することからなる。

【0096】

核酸、ベクター、組換え宿主細胞およびその用途
特定の実施態様において、本発明は、必要とする患者においてベクターを用いた遺伝子治療によって治療された疾患の治療において使用するための免疫グロブリンＧ分解酵素ポリペプチドをコードする核酸配列に関するものであり、本発明は、免疫グロブリンＧ分解酵素ポリペプチドをコードする核酸配列に関するものである。

【0097】

特定の実施態様において、本発明は、ｉ）免疫グロブリンＧ分解酵素ポリペプチドをコードする核酸配列、およびｉｉ）ベクターを含み、それを必要とする患者において、前記ベクターを用いた遺伝子治療によって治療された疾患の治療において、同時、分離または逐次的に使用するための組み合わせの調製物としてのベクターを含む。

【0098】

特定の実施態様において、本発明は、免疫グロブリンＧ分解酵素ポリペプチドをコードする核酸配列と、それを必要とする患者において前記ベクターを使用して遺伝子治療によって治療された疾患の治療に使用するためのベクターとの組み合わせを含む。

【0099】

特定の実施態様において、本発明は、本明細書に記載されているように、配列番号４のＩｄｅＳポリペプチドまたはその機能保存的変異体をコードする核酸配列を含む。

【0100】

特定の実施態様において、配列番号４のＩｄｅＳポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号５２を含むか、またはそれからなる。

【0101】

特定の実施態様では、核酸配列は、配列番号５２の配列に対して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％の同一性を構成する。

【0102】

特定の実施態様では、本発明の核酸のｍＲＮＡを使用することができる。

【0103】

本発明の核酸は、単独または組み合わせで、限定されないが、任意の化学的、生物学的、遺伝学的または酵素学的手法など、当技術分野でそれ自体知られている任意の技術によって製造することができる。

【0104】

特定の実施態様において、本発明は、必要とする患者におけるベクターを用いた遺伝子治療によって治療された疾患の治療における使用のために、免疫グロブリンＧ分解酵素ポリペプチドをコードする核酸配列からなる発現ベクターを含む。

【0105】

特定の実施態様では、発現ベクターは、配列番号５２を含むアミノ配列をコードする核酸配列、または上述の機能保存的変異体を含む核酸配列を含む。

【0106】

特定の実施態様では、配列番号５２またはその機能保存的変異体からなるベクターはＡＡＶベクターではない。

【0107】

本発明で使用することができる発現ベクターは、核酸配列に操作的に連結された少なくとも１つの発現制御要素を含んでいてもよい。発現制御要素は、核酸配列の発現を制御し、調節するためにベクターに挿入される。発現制御要素の例としては、これらに限定されないが、ファージラムダ、酵母プロモーター、およびポリマウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスまたはＳＶ４０に由来するプロモーターのＬＡＣシステム、オペレーターおよびプロモーター領域が挙げられる。追加の好ましいまたは必須の操作要素には、リーダー配列、末端コドン、ポリアデニル化シグナル、および宿主系における核酸配列の適切な転写およびその後の翻訳に必要または好ましい他の任意の配列が含まれるが、これらに限定されるものではない。必要とされるまたは好ましい発現制御要素の正しい組み合わせは、選択された宿主系に依存することが、当技術分野に熟練した者によって理解されるであろう。発現ベクターは、宿主系における核酸配列を含む発現ベクターのトランスファーおよびその後の複製に必要な要素をさらに含むべきであることが、当業者にはさらに理解されるであろう。そのような要素の例は、複製の起源および選択可能なマーカーを含むが、これらに限定されない。そのようなベクターは、従来の方法を用いて、または市販のものを用いて容易に構築されることが、当技術分野に熟練した者によってさらに理解されるであろう。

【0108】

特定の実施態様では、本発明の瞬間は、上述のような発現ベクターからなる宿主細胞を含む。

【0109】

特定の実施態様において、宿主細胞は、例えば、限定されないが、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞などの真核生物細胞、および大腸菌などの原核生物細胞であってもよい。遺伝子を担持するベクターを細胞に導入する手段としては、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、トランスダクション、またはＤＥＡＥ－デキストラン、リポフェクション、リン酸カルシウム、または当業者に知られている他の手順を用いたトランスフェクションが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0110】

特定の実施態様では、真核細胞で機能する真核細胞発現ベクターが使用される。そのようなベクターの例としては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルスなどのウイルスベクター；レンチウイルス、細菌発現ベクター、プラスミド、例えばｐｃＤＮＡ３またはバキュロウイルストランスフェクションベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい真核細胞株としては、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、２９３細胞（ＡＴＣＣ＃ ＣＲＬ１５７３）、Ｔ２細胞、樹状細胞、または単球が挙げられるが、これらに限定されない。

【0111】

体液性免疫などの免疫応答もまた、組換えウイルスベクター、および／または異種ポリヌクレオチド、またはウイルスベクターによってカプセル化された異種ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質またはペプチドに対して発現することができる。ウイルスベクターの細胞導入、異種ポリヌクレオチドの発現もしくは機能、または異種ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質もしくはペプチドの機能もしくは活性の阻害もしくは低下をもたらす、該ウイルスベクターが投与される被験体における、該ウイルスベクターの細胞導入、異種ポリヌクレオチドの発現もしくは機能、または異種ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質もしくはペプチドの機能もしくは活性の阻害もしくは低下をもたらす。

【0112】

本発明において使用されるウイルスベクター、例えば「中和」抗体と称することができる組換えウイルスベクターに結合する抗体は、遺伝子治療に有用なウイルスベクターの細胞導入を減少させるか、または阻害することができる。その結果、理論に拘束されないが、細胞導入が減少または阻害されることにより、ウイルスパッケージ化異種ポリヌクレオチドの細胞内への導入、およびその後の発現、ならびに適切には、タンパク質またはペプチドへのその後の翻訳が減少する。さらに、ウイルスベクターによってカプセル化された異種ポリヌクレオチドまたは異種ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質またはペプチドに結合する抗体は、異種ポリヌクレオチドの発現、異種ポリヌクレオチドの機能または活性、または異種ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質またはペプチドの機能または活性を阻害することができる。

【0113】

従って、組換えウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）に結合する抗体が存在し得、および／または被験体中の異種ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質またはペプチドに結合する抗体が存在し得、この抗体は、被験体中の異種ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質またはペプチドに結合する。さらに、組換えウイルスベクターによってカプセル化された異種ポリヌクレオチドに結合する抗体が存在し得る。

【0114】

組換えウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）に結合する抗体、または異種ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質またはペプチドに結合する抗体は、それらが産生されるべきであるが、本明細書に記載されているように、プロテアーゼによって分解または消化され得る。組換えウイルスベクター（例えば、ＡＡＡＶ）に結合する抗体、または異種ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質またはペプチドに結合する抗体は、それらが産生されるべきであるが、本明細書に記載されるように、そのエフェクター機能を低下させるかまたは阻害することもできる。

【0115】

本明細書で使用されるように、抗体に関する「エフェクター機能」とは、抗体の通常の機能的属性を意味する。抗体の機能的属性の非限定的な例としては、例えば、抗原への結合；補体カスケードの活性化（補体依存性細胞毒性と呼ばれる）；マクロファージ、単球、ナチュラルキラー細胞、好酸球などのエフェクター細胞上のＦｃ受容体に結合して、抗体－依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）に関与すること；および食細胞や樹状細胞などの免疫細胞による結合抗原／病原体の摂取のためのシグナルとしての機能が挙げられる。抗体エフェクター機能の減少または阻害は、したがって、前記の非限定的な機能的属性のうちの任意の１つ以上を指すことができる。エフェクター機能アッセイは、例えばＷＯ２０１６０１２２８５に記載されているように、当技術分野で知られている。

【0116】

「Ｆｃ受容体」とは、任意のＦｃ受容体を指す。Ｆｃ受容体の特に非限定的な例としては、細胞上に存在するＦｃγ免疫グロブリン受容体（ＦｃγＲ）が挙げられる。ヒトにおいて、ＦｃγＲは、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）およびＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）からなるＦｃ受容体ファミリーの１つ、一部または全部を指す。ＦｃγＲは、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）およびＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）の天然に存在する多型を含む。

【0117】

特定の実施態様では、ウイルスベクターへの抗体結合は、プロテアーゼの方法で減少または阻害される。

【0118】

特定の実施態様では、マクロファージ、単球、ナチュラルキラー細胞または好酸球などのエフェクター細胞上のFc受容体への抗体の結合は、グリコシダーゼを介して減少または阻害される。特定の実施態様では、エンドグリコシダーゼは、抗体のFc相互作用ドメイン上のグリカン構造を加水分解する。特定の実施態様では、エンドグリコシダーゼは、ＩｇＧのＦｃ相互作用ドメイン上のグリカン構造、例えば、位置Ａｓｎ-２９７（Ｋａｂａｔナンバリング）のＮ-連結バイ-アンテンナリー・グリカンのようなグリカン構造を加水分解する。

【0119】

特定の実施態様では、補体カスケードの抗体活性化は、プロテアーゼを介して減少または阻害される。

【0120】

特定の実施態様では、食細胞または樹状細胞などの免疫細胞による抗体刺激または摂取の減少は、プロテアーゼまたはグリコシダーゼを介して減少または阻害される。

【0121】

特定の実施態様では、プロテアーゼおよび／またはグリコシダーゼは、組換えウイルス（例えば、ＡＡＶ）ベクターの投与前に被験者に投与される。特定の実施態様では、プロテアーゼおよび／またはグリコシダーゼは、組換えウイルス（例えば、ＡＡＡＶ）ベクターの投与後に被験者に投与される。特定の実施態様では、組換えウイルス（例えば、ＡＡＡＶ）ベクターとプロテアーゼおよび／またはグリコシダーゼは、実質的に同時期に、またはほぼ同時に投与される。

【0122】

抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよび／またはＩｇＥのいずれかからなる。従って、本発明は、これらの５つのクラスの抗体のうちの１つ、これらの５つのクラスの抗体のうちの任意の２つ、これらの５つのクラスの抗体のうちの任意の３つ、これらの５つのクラスの抗体のうちの任意の４つ、またはこれらの５つのクラスの抗体のすべてのうちの任意の１つのエフェクター機能を消化、分解、または還元もしくは阻害することに向けられている。

【0123】

被験体中の抗体のレベルは、組換えウイルスベクターの投与の前および／または後に分析、測定または決定することができる。被験者中の抗体のレベルはまた、プロテアーゼまたはグリコシダーゼの投与の前および／または後に分析、測定または決定することができる。被験体中の抗体のレベルはまた、プロテアーゼまたはグリコシダーゼの投与前および／または投与後と同様に、組換えウイルスベクターの投与前および／または投与後に、複数回分析または測定してもよい。

【0124】

被験体中の抗体のエフェクター機能は、組換えウイルスベクターの投与の前および／または後に分析、測定または決定することができる。被験者中の抗体のエフェクター機能はまた、プロテアーゼまたはグリコシダーゼの投与の前および／または後に分析、測定または決定することができる。被験体中の抗体のエフェクター機能は、プロテアーゼまたはグリコシダーゼの投与前および／または投与後と同様に、組換えウイルスベクターの投与前および／または投与後に、複数回分析または測定してもよい。

【0125】

平衡結合定数の増加は、ＩｇＧとＦｃ受容体間の結合の減少に対応する。したがって、グリコシダーゼ活性の結果として抗体のＦｃ受容体結合が減少すると、ＩｇＧ：ＦｃＲ相互作用の平衡結合定数が増加する可能性がある。抗体のＦｃ受容体結合の減少は、ＩｇＧ：ＦｃＲ相互作用の平衡結合定数を、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、または少なくとも４、または少なくとも５、または少なくとも６、または少なくとも７、または少なくとも８のファクターで増加させる結果となり得る。

【0126】

特定の実施態様では、野生型ウイルスへの曝露によって引き起こされる被験体における免疫応答（例えば、体液性免疫応答）は、被験体への組換えウイルスベクターの投与に先立って、野生型ウイルスに基づく組換えウイルスベクターに結合する抗体を分解または消化するのに有効な量のプロテアーゼおよび／またはグリコシダーゼを投与することによって処置される。

【0127】

特定の実施態様において、ＡＡＶのような組換えウイルスベクターの投与によって引き起こされる免疫応答（例えば、体液性免疫応答）は、組換えウイルスベクターに結合する抗体を分解または消化するのに有効なプロテアーゼおよび／またはグリコシダーゼ、または異種ポリヌクレオチド、またはウイルスベクターによってカプセル化された異種ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質またはペプチドに結合する抗体の量を投与することによって処置される。

【0128】

特定の実施態様では、被験体への組換えウイルスベクターの投与は、組換えウイルスベクターに対する免疫応答（例えば、体液性免疫応答）、または異種ポリヌクレオチドまたはウイルスベクターによってカプセル化された異種ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質またはペプチドに結合する抗体を阻害または防止するためのプロテアーゼおよび／またはグリコシダーゼの投与に先立って行われる。

【0129】

特定の実施態様では、プロテアーゼおよび／またはグリコシダーゼは、免疫応答（例えば、体液性免疫応答）の前、例えば中和抗体の発現前、または異種ポリヌクレオチドまたはウイルスベクターによってカプセル化された異種ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質またはペプチドに結合する抗体の発現前に、被験体に投与される。

【0130】

プロテアーゼは、タンパク質を分解または消化する酵素である。本明細書で使用されるように、プロテアーゼはまた、ペプチダーゼ、プロテイナーゼ、ペプチドヒドロラーゼ、またはタンパク質分解酵素と称される。

【0131】

本発明において使用され得るプロテアーゼは、その基質特異性に基づいて２つの広範なグループに細分化され得る。プロテアーゼは、Ｎ末端またはＣ末端に向かって位置するペプチド結合を加水分解するエキソ型（エキソプロテアーゼまたはエキソペプチダーゼ）であってもよい。エキソプロテアーゼまたはエキソペプチダーゼの非限定的な例としては、例えば、フラボザイム（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、プロテアックス（Ａｍａｎｎｏ）、およびブタ膵臓由来のパンクレアチンが挙げられる。

【0132】

本発明で用いることができるプロテアーゼは、ポリペプチド鎖中のペプチド結合を内部で加水分解するエンド型（エンドプロテアーゼまたはエンドペプチダーゼ）であってもよい。エンドプロテアーゼの例としては、例えば、ＩｄｅＳ、ＩｄｅＺ、ＩｄｅｄＥ、ＩｄｅＭＣ、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、ペプシンなどが挙げられる。

【0133】

本発明において使用され得るプロテアーゼの例は、例えば、限定されないが、Streptococcus pyogenes、Streptococcus equi、Mycoplasma canis、S. agalactiae、S. pseudoporcinusまたはPseudomonas putida由来のシステインプロテアーゼを含む。特定の実施態様において、プロテアーゼは、Streptococcus pyogenes由来のエンドペプチダーゼＩｄｅＳ、または配列番号３～１８のいずれかに記載のその改変体を含む。特定の実施態様では、プロテアーゼは、配列番号19または配列番号20に記載のプロテアーゼまたはその改変体を含む。特定の実施態様では、プロテアーゼは、Streptococcus equi由来のエンドペプチダーゼＩｄｅＺ、または配列番号２１～４３のいずれかに記載のその改変体を含む。

【0134】

本発明で使用され得る他のプロテアーゼには、例えば、限定されず、ＷＯ２０１７／１３４２７４に記載されたＳ．ｓｕｉｓ，Ｓ．ｐｏｒｃｉｎｕｓ，Ｓ．ｅｑｕｉからのＩｇｄＥ酵素が含まれる。本発明で使用され得る他のプロテアーゼは、例えば、限定されず、ＷＯ２０１８／０９３８６８に記載されているＩｄｅＭＣおよびホモログを含む。本発明で使用され得る他のエンドペプチダーゼは、例えば、限定されずに、ＷＯ２０１６／１２８５５９に記載された、Ｎ末端メチオニンおよびシグナルペプチドを有するＩｄｅＺおよびシグナルペプチドを有さないＩｄｅＳ／ＩｄｅＺハイブリッドタンパク質を含む。本発明で使用され得る他のプロテアーゼは、例えば、限定されず、Jordanら(N Engl. J Med. 377;5, 2017)、LannergardおよびGuss(FEMS Microbiol Lett. 262(2006); 230-235)、およびHultingら(FEMS Microbiol Lett. 298(2009), 44-50)に記載されているプロテアーゼを含む。

【0135】

グリコシダーゼとは、複合糖に含まれるグリコシド結合を加水分解する酵素のことである。一般的には、エクソグリコシダーゼとエンドグリコシダーゼの2つのグループに大別される。グリコシダーゼは、抗体などの糖タンパク質から糖鎖／オリゴ糖を切断して放出する。

【0136】

本発明のインスタントで使用することができるエキソグリコシダーゼとしては、例えば、これらに限定されず、Ｎ-アセチルグルコサミニダーゼ、フコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、ノイラミニダーゼ、およびキシロシダーゼが挙げられる。 本発明で用いることができるエンドグリコシダーゼとしては、例えば、限定されないが、ＥｎｄｏＳ、Ｅｎｄｏ Ｄ、Ｅｎｄｏｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ－Ｈ、Ｅｎｄｏ Ｆ１、Ｅｎｄｏ Ｆ２、Ｅｎｄｏ Ｆ３などが挙げられる。

【0137】

したがって、特定の実施態様では、グリコシダーゼはエンドグリコシダーゼからなる。特定の実施態様では、グリコシダーゼはエキソグリコシダーゼからなる。

【0138】

エンドグリコシダーゼの例としては、例えば、ＥｎｄｏＳが挙げられるが、これに限定されるものではない。特定の実施態様では、エンドグリコシダーゼは、配列番号４４－４７のいずれかに記載の配列、またはその改変体からなる。

【0139】

特定の実施態様において、ＥｎｄｏＳポリペプチドは、ＥｎｄｏＳポリペプチド、ＥｎｄｏＳポリペプチドのフラグメント、ＥｎｄｏＳポリペプチドのバリアント、またはＥｎｄｏＳポリペプチドのフラグメントのバリアントを含み、前記ポリペプチド、フラグメント、バリアント、またはフラグメントのバリアントは、免疫グロブリン（Ｉｇ）エンドグリコシダーゼ活性を有することを条件とする。

【0140】

特定の実施態様では、EndoSポリペプチドは、S. pyogenes EndoSである。EndoSポリペプチドのバリアントは、別の細菌などの別の生物由来のEndoSポリペプチドであってもよい。特定の実施態様では、細菌は、ストレプトコッカス・エクイ（Streptococcus equi）、ストレプトコッカス・ズーエピデミックス（Streptococcus zooepidemicus）またはストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）などのストレプトコッカス（Streptococcus）である。あるいは、変異体は、例えばCorynebacterium pseudotuberculosis、例えばＣＰ４０タンパク質；Enterococccus faecalis、例えばＥｎｄｏＥタンパク質；またはＥｎｄｏＦ２タンパク質のようなElestrabocterium meningosepticum（旧Flavobacterium meningosepticum）由来であってもよい。

【0141】

ＥｎｄｏＳポリペプチドは、（ａ）配列番号ｓ：４４－４７のいずれか１つのアミノ酸配列；または（ｂ）Ｉｇエンドグリコシダーゼ活性を有する（ａ）のフラグメント；または（ｃ）配列番号ｓ：４４－４７のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有し、かつＩｇエンドグリコシダーゼ活性を有する（ａ）の変異体からなるか、または（ｃ）からなることができる。４４－４７のいずれか１つの配列番号４４－４７のアミノ酸配列の対応する部分と少なくとも５０％の同一性を有し、かつＩｇエンドグリコシダーゼ活性を有する、（ｂ）の変形体；または（ｄ）配列番号４４－４７のいずれか１つの配列番号４４－４７のアミノ酸配列の対応する部分と少なくとも５０％の同一性を有し、かつＩｇエンドグリコシダーゼ活性を有する。

【0142】

特定の実施態様では、バリアントポリペプチドは、配列番号ｓ：４４－４７の任意の１つのアミノ酸配列、またはＩｇエンドグリコシダーゼ活性を有するそのフラグメントに対して、少なくとも約６０％以上の同一性（例えば、６０～７０％、７０～８０％、または８０～９０％の同一性）を有する。特定の実施態様では、バリアントポリペプチドは、配列番号ｓ：４４－４７のいずれか１つのアミノ酸配列、またはＩｇエンドグリコシダーゼ活性を有するそのフラグメントに対して９０～１００％の同一性を有する。

【0143】

プロテアーゼは、（ａ） 配列番号３－４３または４８のいずれかのアミノ酸配列；または（ｂ） プロテアーゼ活性を有する（ａ）のフラグメント；または（ｃ） 配列番号． ３－４３または４８のいずれか１つの配列番号ｓ：３－４３または４８のいずれか１つのアミノ酸配列の対応する部分と少なくとも５０％の同一性を有し、かつプロテアーゼ活性を有する、（ｂ）の変種；または（ｄ）の変種。特定の実施態様では、バリアントポリペプチドは、配列番号ｓ：３－４３または４８のいずれか１つのアミノ酸配列、またはプロテアーゼ活性を有するその断片に対して、少なくとも約６０％以上の同一性（例えば、６０～７０％、７０～８０％または８０～９０％の同一性）を有する。特定の実施態様では、バリアントポリペプチドは、配列番号ｓ：３－４３もしくは４８のいずれか１つのアミノ酸配列、またはプロテアーゼ活性を有するそのフラグメントに対して９０～１００％の同一性を有する。

【0144】

特定の実施態様では、プロテアーゼまたはグリコシダーゼは、そのネイティブシグナル配列のデボイドであり、追加のＮ末端メチオニンを有するものであり、例えば、Ｓ． ｐｙｏｇｅｎｅｓのＩｄｅＳの成熟形態である配列番号４８（シグナル配列を有さないが、追加のＮ末端メチオニンを有する）のようなものである。本発明の方法で使用される任意のプロテアーゼまたはグリコシダーゼは、ネイティブシグナル配列の代わりに付加されたＮ末端メチオニンを含むことができる。

【0145】

特定の実施態様では、プロテアーゼまたはグリコシダーゼは、そのネイティブシグナル配列の代わりに、非ネイティブＮ末端シグナル配列またはリーダーペプチド配列を有する。本発明の方法で使用される任意のプロテアーゼまたはグリコシダーゼは、ネイティブシグナル配列の代わりに非ネイティブＮ末端シグナル配列を含むことができる。特定の実施態様では、非ネイティブＮ末端シグナル配列は、配列番号４９～５１、またはその機能保存的変種から選択される。

【0146】

特定の実施態様では、免疫グロブリンＧ分解酵素ポリペプチドは、患者に存在するアデノウイルス中和抗体を分解することができる。

【0147】

特定の実施態様では、免疫グロブリンＧ分解酵素ポリペプチドは、患者に存在するＡＡＶ中和抗体を分解することができる。

【0148】

特定の実施態様において、免疫グロブリンＧ分解酵素ポリペプチドは、Ｓ． ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＩｄｅＳ）ポリペプチドの免疫グロブリンＧ分解酵素である。

【0149】

特定の実施態様において、免疫グロブリンＧ分解酵素ポリペプチドは、患者に存在するアデノウイルス中和抗体を分解するために投与される、Ｓ.ピオゲネス（ＩｄｅＳ）ポリペプチドの免疫グロブリンＧ分解酵素である。

【0150】

特定の実施態様において、免疫グロブリンＧ分解酵素ポリペプチドは、患者に存在するＡＡＶ中和抗体を分解するために投与される、Ｓ.ピオゲネス（ＩｄｅＳ）ポリペプチドの免疫グロブリンＧ分解酵素である。

【0151】

したがって、特定の実施態様において、本発明は、遺伝子治療ベクターを必要とする患者に投与することによって治療された疾患の治療における、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＩｄｅＳ）ポリペプチドの免疫グロブリンＧ分解酵素の使用に関する。

【0152】

このように、特定の実施態様において、本発明は、遺伝子治療ベクターを必要とする患者に投与することによって治療される疾患の治療における、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＩｄｅＳ）ポリペプチドの免疫グロブリンＧ分解酵素の使用に関するものであり、ここで、ＩｄｅＳは、患者に存在する中和抗ＡＡＶ抗体を分解するために患者に投与される。

【0153】

特定の実施態様では、患者はベクター血清陽性患者であり、本発明は、ＡＡＶ血清陽性患者の治療に使用するためのＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＩｄｅＳ）ポリペプチドの免疫グロブリンＧ分解酵素に関する。

【0154】

特定の実施態様では、患者はベクターセロネガティブ患者であり、本発明は、ＡＡＶセロネガティブ患者の治療に使用するためのＳ． ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＩｄｅＳ）ポリペプチドの免疫グロブリンＧ分解酵素に関する。

【0155】

特定の実施態様において、本発明によるＩｄｅＳポリペプチドは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＩｄｅＳ、またはシステインプロテアーゼ活性を保持するＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＩｄｅＳのバリアントまたはフラグメントである。変異体は、別の生物、例えば別の細菌からのＩｄｅＳポリペプチドであってもよい。好ましくは、この細菌はストレプトコッカス属である。好ましくは、ストレプトコッカスは、Ａ群ストレプトコッカス、Ｃ群ストレプトコッカス、またはＧ群ストレプトコッカスである。特に、バリアントは、Ｓ．ｅｑｕｉまたはＳ．ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓのようなＣ群ストレプトコッカスからのＩｄｅＳポリペプチドであってもよい。あるいは、バリアントは、シュードモナス・プティダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）由来のものであってもよいし、他の細菌株由来の組換えバリアントであってもよい。特定の実施態様では、本発明に従ったＩｄｅＳポリペプチドは、配列番号ｓ：３－４３または４８のいずれかの配列を含む。

【0156】

特定の実施態様において、ポリペプチドのシステインプロテアーゼ活性は、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥアイソタイプを切断することなく、ＩｇＧ重鎖の下側ヒンジ領域のグリシン残基２３７でＩｇＧの４つのヒトサブクラスのすべてを切断する能力を有する。

【0157】

特定の実施態様では、ＩｄｅＳポリペプチドは、配列番号３～１８、２３または４８のいずれかのアミノ酸配列、またはその機能保存的バリアントを含むか、またはそれからなる。

【0158】

特定の実施態様では、本発明に従ったポリペプチドは、配列番号３～１８、２３、または４８のいずれかの配列から１、２、３、４、または５個のアミノ酸で異なっていてもよい。

【0159】

特定の実施態様では、本発明は、配列番号３～１８、２３または４８のいずれかのポリペプチドの機能保存的変異体であるポリペプチドを含む。

【0160】

特定の実施態様において、本発明のポリペプチドは、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または１００％の、配列番号３～１８、２３、または４８のいずれかの配列と同一性があり、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥアイソタイプを切断することなくＩｇＧ重鎖の下部ヒンジ領域のグリシン残基２３７でＩｇＧの４つのヒトサブクラスすべてを切断することができる。

【0161】

特定の実施態様において、本発明のポリペプチドは、配列番号３～１８、２３または４８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるか、または配列番号３～１８、２３または４８のいずれかの配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の同一性を含むその変異体からなり、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥアイソタイプを切断することなく、ＩｇＧ重鎖の下部ヒンジ領域のグリシン残基２３７でＩｇＧの４つのヒトサブクラスすべてを切断することができる。

【0162】

特定の実施態様において、本発明のポリペプチドは、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥアイソタイプを切断することなく、ＩｇＡ重鎖の下側ヒンジ領域のグリシン残基２３７でＩｇＧの４つのヒトサブクラスのすべてを切断することが依然として可能である、配列番号３～１８、２３または４８のいずれかのポリペプチドのフラグメントである。

【0163】

特定の実施態様において、本発明の即席ポリペプチドは、配列番号３～１８、２３または４８のいずれかのアミノ酸残基に対応する残基Ｌｙｓ－５５および／またはＣｙｓ－６５および／またはＨｉｓ－２３３および／またはＡｓｐ－２５５および／またはＡｓｐ－２５７を含む。特定の実施態様では、本発明のポリペプチドは、配列番号４のＬｙｓ－５５、Ｃｙｓ－６５、Ｈｉｓ－２３３、Ａｓｐ－２５５およびＡｓｐ－２５７に対応する残基のそれぞれを含む。特定の実施態様では、本発明のインスタントポリペプチドは、配列番号４のＬｙｓ－５５、Ｃｙｓ－６５、Ｈｉｓ－２３３、Ａｓｐ－２５５およびＡｓｐ－２５７に対応する残基のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、またはすべての５つの残基を含む。

【0164】

本発明のポリペプチドまたはフラグメントが、ヒトＩｇＧの４つのサブクラスを切断することができるかどうかを検証するために、各ポリペプチドまたはフラグメントを用いて試験を行ってもよい。例えば、試験されたポリペプチドまたはフラグメントをヒトＩｇＧとインキュベートした後、消化フラグメントの研究はウェスタンブロットによって行われる。インタクトなＩｇＧの検出の欠如およびヒトＩｇＧの消化フラグメントの検出は、試験されたポリペプチドまたはフラグメントが、ＩｇＧの４つのヒトサブクラスすべてを切断する能力を有することを示すであろう。

【0165】

本明細書で使用されるように、用語「機能保存的バリアント」とは、ペプチドの全体的なコンフォメーションおよび機能を変化させることなく、タンパク質または酵素中の所定のアミノ酸残基が変更（挿入、欠失または置換）されたものを指す。このようなバリアントには、欠失、挿入および／または置換のようなアミノ酸の変化を有するタンパク質が含まれる。「欠失」とは、タンパク質中の１個以上のアミノ酸の欠失を意味する。「挿入」とは、タンパク質中の1つ以上のアミノ酸の付加を意味する。「置換」とは、タンパク質中の別のアミノ酸残基による１個以上のアミノ酸の置換を意味する。典型的には、所与のアミノ酸は、類似の特性（例えば、極性、水素結合能、酸性、塩基性、疎水性、芳香族など）を有するアミノ酸によって置換される。この所定のアミノ酸は、天然アミノ酸であってもよいし、非天然アミノ酸であってもよい。保存されていると示されたアミノ酸以外のアミノ酸は、類似した機能の任意の２つのタンパク質間のパーセントのタンパク質またはアミノ酸配列の類似度が変化してもよく、例えば、類似度がＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づいているクラスタ法などのアラインメントスキームに従って決定されるように、７０％から９９％の間であるように、タンパク質中で異なっていてもよい。機能保存的バリアント」はまた、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムによって決定される少なくとも６０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有し、比較対象のネイティブまたは親タンパク質と同じまたは実質的に類似した特性または機能を有するポリペプチドを含む。つのアミノ酸配列は、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上のアミノ酸が同一であり、または約９０％以上、より好ましくは９５％以上のアミノ酸が、短い方の配列の全長にわたって類似（機能的に同一）している場合、「実質的に相同」または「実質的に類似」である。好ましくは、類似または相同な配列は、例えば、ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｌｏｕｐｅｒ、Ｐｒｏｇｒａｍｉｎａｌ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ＧＣＧパッケージ、バージョン７、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）のパイルアッププログラム、またはＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどの配列比較アルゴリズムのいずれかを用いたアラインメントによって同定される。

【0166】

特定の実施態様において、本発明のポリペプチドは、１つ以上の残基が機能的に類似した残基で保存的に置換されている配列番号４または配列番号４８の配列からなり、本明細書に記載されているような配列番号４または配列番号４８のポリペプチドの機能的側面を表示する。

【0167】

特定の実施態様において、本発明のポリペプチドは、１つ以上の残基が機能的に類似した残基で保存的に置換されており、本明細書に記載されているような配列番号３－１８、２３または４８のポリペプチドの機能的側面を表示する配列番号３－１８、２３または４８のいずれかの配列からなる。

【0168】

保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンのような１つの非極性（疎水性）残基を別の残基に置換すること、アルギニンとリジンの間のような１つの極性（親水性）残基を別の残基に置換することが挙げられる。グルタミンとアスパラギンの間、グリシンとセリンの間、リジン、アルギニンまたはヒスチジンのような１つの塩基性残基の別のものへの置換、またはアスパラギン酸またはグルタミン酸のような１つの酸性残基の別のものへの置換。

【0169】

「保存的置換」という用語は、非誘導体化残基の代わりに化学的に誘導体化された残基を使用することも含む。"化学的誘導体化 "とは、官能性側基の反応により化学的に誘導体化された１つ以上の残基を有する対象ペプチドを指す。このような誘導体化された分子の例としては、例えば、遊離アミノ基が誘導体化されてアミン塩酸塩、ｐ-トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ-ブチロキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成している分子が挙げられる。遊離カルボキシル基は、塩、メチルおよびエチルエステル、または他のタイプのエステルまたはヒドラジドを形成するために誘導体化されていてもよい。遊離ヒドロキシル基は、Ｏ-アシルまたはＯ-アルキル誘導体を形成するために誘導体化されてもよい。ヒスチジンのイミダゾール窒素は、Ｎ-イム-ベンジルヒスチジンを形成するように誘導体化されてもよい。化学的誘導体はまた、２０の標準アミノ酸の１種以上の天然に存在するアミノ酸誘導体を含むペプチドを含む。例としては、４-ヒドロキシプロリンが挙げられる。4-ヒドロキシプロリンがプロリンに置換されてもよく、5-ヒドロキシリジンがリジンに置換されてもよく、3-メチルヒスチジンがヒスチジンに置換されてもよく、ホモセリンがセリンに置換されてもよく、オルニチンがリジンに置換されてもよい。用語「保存的置換」はまた、ペプチドまたはタンパク質の二次構造を制御し安定化することを目的とした非天然アミノ酸の使用を含む。これらの非天然アミノ酸は、以下に記載するように、プロリノアミノ酸、β-アミノ酸、Ｎ-メチルアミノ酸、シクロプロピルアミノ酸、α，α置換アミノ酸などの化学的に修飾されたアミノ酸である。これらの非天然アミノ酸には、フッ素化、塩素化、臭素化またはヨウ素化された修飾アミノ酸も含まれていてもよい。

【0170】

特定の実施態様において、本発明のポリペプチドは、配列番号の少なくとも１、２、５、１０、２０、３０、５０またはそれ以上の突然変異（アミノ酸の置換、欠失または挿入であり得る）によって異なる。配列番号４または配列番号３～１８、２３または４８の配列のいずれか。例えば、１～５０、２～３０、３～２０または５～１０アミノ酸の置換、欠失または挿入を行うことができる。修飾されたポリペプチドは、一般に、ＩｇＧ特異的システインプロテアーゼとしての活性を保持している。 特定の実施態様では、アミノ酸置換は保存的置換である。

【0171】

特定の実施態様において、本発明のポリペプチドは、シグナル配列をさらに含み得る。

【0172】

特定の実施態様において、シグナル配列は、アミノ酸配列：配列番号４９、配列番号５０または配列番号５１またはそれらの機能保存的変異体を含むか、またはそれらからなる。

【0173】

特定の実施態様において、本発明のポリペプチドは、タグを含み得る。タグは、ペプチドの精製に役立つタグを含む配列であり、免疫標識技術を使用する細胞または組織サンプル内の前記ペプチドまたはポリペプチドの局在化、イムノブロッティングによる前記ペプチドまたはポリペプチドの検出などのために、アフィニティークロマトグラフィーなどの様々な技術によって取り付けられる。本技術で一般的に用いられるタグは、ＧＳＴ（グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ）タグ、ＦＬＡＧ（商標）タグ、Ｓｔｒｅｐタグ（商標）、Ｖ５タグ、ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグなどである。

【0174】

特定の実施態様において、本発明のポリペプチドは、蛍光色素によって標識され得る。色素標識蛍光ペプチドは、細胞研究における重要なツールでである。ペプチドは、Ｎ末端側またはＣ末端側で標識することができる。

【0175】

アミン反応性蛍光色素を使用するＮ末端ペプチド標識：アミン反応性蛍光プローブは、Ｎ末端またはリジン残基でペプチドを修飾するために広く使用されている。さまざまなペプチドを標識するために多くの蛍光アミノ反応性色素が開発されており、得られたコンジュゲートは生物学的用途で広く使用されている。アミン反応性蛍光試薬の３つの主要なクラスは、現在、ペプチドの標識に使用されている。スクシンイミジルエステル（ＳＥ）、イソチオシアネート、および塩化スルホニルである。

【0176】

アミン含有蛍光色素を使用するＣ末端標識であるアミン含有色素を使用して、水溶性カルボジイミド（ＥＤＣなど）を使用してペプチドを修飾し、ペプチドのカルボキシ基をアミド基に変換する。ＮＨＳまたはＮＨＳＳのいずれかを使用して、ＥＤＣを介したタンパク質－カルボン酸コンジュゲーションのカップリング効率を向上させることができる。

【0177】

特定の実施態様において、本発明による治療方法において使用されるポリペプチドは、それらの治療効果を改善するために改変され得る。治療用化合物のそのような修飾は、毒性を減少させ、循環時間を増加させ、生体内分布を修飾し、または免疫原性を低下させるために使用され得る。例えば、潜在的に重要な治療用化合物の毒性は、生体内分布を改変する様々な薬物担体ビヒクルと組み合わせることによって大幅に減少させることができる。

【0178】

薬物の生存能力を改善するための戦略は、水溶性ポリマーの利用である。さまざまな水溶性ポリマーが生体内分布を変化させ、細胞取り込みのモードを改善し、生理学的障壁を通過する透過性を変化させ、体からのクリアランス率を変更することが示されている。ターゲティング効果または徐放効果のいずれかを達成するために、末端基として、骨格の一部として、またはポリマー鎖上のペンダント基として薬物部分を含む水溶性ポリマーが合成されてきた。

【0179】

ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、その高度の生体適合性および改変の容易さを考慮して、薬物担体として広く使用されてきた。さまざまな薬物、タンパク質、およびリポソームへの付着は、滞留時間を改善し、毒性を減少させることが示されている。ＰＥＧは、鎖の末端にあるヒドロキシル基を介して、および他の化学的方法を介して、活性剤に結合することができる。ただし、ＰＥＧ自体は１分子あたり最大２つの活性剤に制限されている。別のアプローチでは、ＰＥＧとアミノ酸の共重合体が、ＰＥＧの生体適合性を保持するが、分子あたりの多数の付着点（より多くの薬物負荷を提供する）という追加の利点があり、合成的に可能である新規生体材料として検討され、さまざまなアプリケーションに適合するように設計されている。

【0180】

当業者は、薬物の効果的な修飾のためのペグ化技術を知っている。たとえば、ＰＥＧとリジンなどの三官能性モノマーの交互ポリマーからなるドラッグデリバリーポリマーは、ＶｅｃｔｒａＭｅｄ（Ｐｌａｉｎｓｂｏｒｏ、Ｎ．Ｊ。）によって使用されてきた。ＰＥＧ鎖（通常２０００ダルトン以下）は、安定したウレタン結合を介してリジンのａ－およびｅ－アミノ基に結合している。このようなコポリマーは、ポリマー鎖に沿って厳密に制御された所定の間隔で反応性ペンダント基（リジンのカルボン酸基）を提供しながら、ＰＥＧの望ましい特性を保持する。反応性ペンダント基は、誘導体化、架橋、または他の分子との結合に使用できる。これらのポリマーは、ポリマーの分子量、ＰＥＧセグメントの分子量、および薬物とポリマーの間の切断可能な結合を変化させることにより、安定した長期循環プロ薬物を製造するのに有用である。ＰＥＧセグメントの分子量は、薬物／結合基複合体の間隔とコンジュゲートの分子量あたりの薬物の量に影響する（ＰＥＧセグメントが小さいほど、薬物の負荷が大きくなる）。一般に、ブロックコポリマーコンジュゲートの全体的な分子量を増加させると、コンジュゲートの循環半減期が増加する。それにもかかわらず、コンジュゲートは、容易に分解可能であるか、または閾値を制限する糸球体濾過よりも低い分子量（例えば、４５ｋＤａ未満）を有していなければならない。

【0181】

さらに、循環半減期および生体内分布を維持するのに重要なポリマー骨格に加えて、リンカーを使用して、特定のトリガー、典型的には酵素によって骨格ポリマーから放出されるまで治療薬をプロドラッグ形態に維持することができる。標的組織における活動。例えば、このタイプの組織活性化薬物送達は、生体内分布の特定の部位への送達が必要であり、治療薬が病状の部位またはその近くで放出される場合に特に有用である。活性化薬物送達で使用するための連結グループライブラリーは当業者に知られており、酵素反応速度論、活性酵素の有病率、および選択された疾患特異的酵素の切断特異性に基づくことができる（例えば、ＶｅｃｔｒａＭｅｄによって確立された技術を参照）。、プレーンズボロ、ニュージャージー州）。 そのようなリンカーは、治療的送達のために本明細書に記載のペプチド由来を修飾する際に使用することができる。

【0182】

本発明によれば、ポリペプチドは、従来の自動化ペプチド合成法によって、または組換え発現によって産生され得る。タンパク質を設計および製造するための一般的な原理は、当業者によく知られている。

【0183】

本発明のポリペプチドは、従来の技術に従って、溶液中または固体支持体上で合成することができる。さまざまな自動シンセサイザーが市販されており、Stewart and Young; Tam et al。、1983; Merrifield、1986およびBaranyおよびMerrifield、GrossおよびMeienhofer、1979で説明されている既知のプロトコルに従って使用できる。本発明のペプチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＩｎｃ。のモデル４３３Ａなどの例示的なペプチドシンセサイザーを使用する固相技術によって合成することもできる。自動ペプチド合成または組換え法によって生成されたものは、逆相ＨＰＬＣ分析を使用して決定できる。各ペプチドの化学的真正性は、当業者に周知の任意の方法によって確立することができる。

【0184】

自動ペプチド合成の代替として、選択したタンパク質をコードするヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、適切な宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトし、そして以下のような発現に適した条件下で培養する組換えＤＮＡ技術を使用することができる。より長いポリペプチドを産生するためには、組換え法が特に好ましい。

【0185】

ペプチドまたはタンパク質コード配列を含み、発現するために、様々な発現ベクター／宿主システムを利用することができる。これらには、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物が含まれるが、これらに限定されない。酵母発現ベクターで形質転換された酵母（Giga-Hama et al.、1999）；ウイルス発現ベクターに感染した昆虫細胞系（例えば、バキュロウイルス、Ghosh et al.、2002を参照）。ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）でトランスフェクトされた、または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド；例えば、Babe et al.、2000を参照）で形質転換された植物細胞系；または動物細胞システム。当業者は、タンパク質の哺乳動物発現を最適化するための様々な技術を知っている。例えば、Kaufman, 2000; Colosimo et al., 2000を参照されたい。組換えタンパク質産生に有用な哺乳動物細胞には、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ＣＯＳ細胞（ＣＯＳ－７など）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２および２９３細胞が含まれるが、これらに限定されない。細菌、酵母および他の無脊椎動物におけるペプチド基質または融合ポリペプチドの組換え発現のための例示的なプロトコールは、当業者に知られており、本明細書で以下に簡単に説明する。米国特許米国特許第６，５６９，６４５号；米国特許米国特許第６，０４３，３４４号；米国特許米国特許第６，０７４，８４９号；および米国特許第５，０５９，０５９号。米国特許第６，５７９，５２０号は、ペプチドの組換え生産のための特定の例を提供し、これらの特許は、それらの教示の参照により本明細書に明示的に組み込まれる。組換えタンパク質の発現のための哺乳動物宿主システムもまた、当業者によく知られている。宿主細胞株は、発現されたタンパク質を処理するか、またはタンパク質活性を提供するのに有用である特定の翻訳後修飾を生成する特定の能力のために選択され得る。ポリペプチドのそのような修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化が含まれるが、これらに限定されない。タンパク質の「プレプロ」型を切断する翻訳後プロセシングも、正しい挿入、折り畳み、および／または機能にとって重要である可能性がある。ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８などの異なる宿主細胞は、そのような翻訳後活性のための特定の細胞機構および特徴的なメカニズムを有し、導入された外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にするために選択され得る。

【0186】

本発明のポリペプチド由来の組換え生産において、ペプチド由来をコードするためのポリヌクレオチド分子を含むベクターを使用することが必要であろう。そのようなベクターを調製する方法、ならびにそのようなベクターで形質転換された宿主細胞を産生する方法は、当業者によく知られている。そのような試みで使用されるポリヌクレオチド分子は、宿主における増殖のために、一般に選択可能なマーカーおよび複製起点を含むベクターに結合され得る。発現構築物のこれらの要素は、当業者によく知られている。一般に、発現ベクターは、哺乳動物、微生物、ウイルス、または昆虫の遺伝子に由来するものなど、適切な転写または翻訳調節配列に作動可能に連結されている所与のタンパク質をコードするＤＮＡを含む。調節配列の例には、転写プロモーター、オペレーター、またはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、および転写および翻訳を制御する適切な配列が含まれる。

【0187】

「発現ベクター」、「発現構築物」または「発現カセット」という用語は、本明細書全体で交換可能に使用され、遺伝子産物をコードする核酸を含む任意のタイプの遺伝子構築物を含み、その一部または全部が 核酸をコードする配列は転写することができる。

【0188】

本発明のペプチドまたはポリペプチドの発現のための適切な発現ベクターの選択は、もちろん、使用される特定の宿主細胞に依存し、そして通常の職人の技術の範囲内である。 哺乳動物発現ベクターの構築方法は、例えば、岡山ら、1983; Cosman et al。、1986; Cosman et al。、1984; EP-A-0367566; およびWO91 / 18982に記載されている。発現ベクターを作製するための他の考慮事項は、例えば、Makrides et al。、1999; Kost et al。、1999。Wurm et al。、1999に詳述されており、組換えタンパク質生産のための哺乳動物細胞における大規模な一過性発現を考慮するための教育因子として本明細書に組み込まれる。

【0189】

発現は、宿主細胞における目的の核酸の発現を駆動するために使用され得るウイルスおよび哺乳動物の両方の供給源からのエンハンサー/プロモーターなどの適切なシグナルがベクターにおいて提供されることを必要とする。通常、発現されている核酸はプロモーターの転写制御下にある。「プロモーター」は、遺伝子の特定の転写を開始するために必要とされる、細胞の合成機構によって認識される、または導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列を含む。ヌクレオチド配列は、調節配列が目的のペプチド（すなわち、４Ｎ１Ｋ、変異体など）をコードするＤＮＡに機能的に関連している場合に作動可能に連結されている。したがって、プロモーターヌクレオチド配列が配列の転写を指示する場合、プロモーターヌクレオチド配列は、所与のＤＮＡ配列に作動可能に連結されている。

【0190】

同様に、「転写制御下」という語句は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼの開始および遺伝子の発現を制御するために、核酸に対して正しい位置および配向にあることを意味する。核酸の発現を駆動する任意のプロモーターを使用することができる。目的の核酸配列の発現を制御するために使用される特定のプロモーターは、それが標的細胞における核酸の発現を指示することができる限り、重要であるとは考えられていない。したがって、ヒト細胞が標的とされる場合、ヒト細胞で発現することができるプロモーターに隣接し、その制御下に核酸コード領域を配置することが好ましい。一般的に言えば、そのようなプロモーターは、ヒトまたはウイルスのプロモーターのいずれかを含み得る。一般的なプロモーターには、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ルース肉腫ウイルスロングターミナルリピート、β－アクチン、ラットインスリンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、ヒトアルファ－１が含まれる。抗トリプシンプロモーター、トランスチレチンプロモーター、ＴＢＧプロモーターおよび他の肝臓特異的プロモーター、デスミンプロモーターおよび類似の筋肉特異的プロモーター、ＥＦ１－アルファプロモーター、ＣＡＧプロモーターおよび他の構成的プロモーター、多組織特異性を有するハイブリッドプロモーター、プロモーターシナプシンおよびグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターのようなニューロンに特異的であり、これらはすべて、周知のプロモーターであり、当業者に容易に利用可能であり、目的のコード配列の高レベルの発現を得るために使用することができる。目的のコード配列の発現を達成するために当技術分野で周知である他のウイルスまたは哺乳動物の細胞または細菌ファージプロモーターの使用もまた、発現のレベルがタンパク質の回収可能な収量を生み出すのに十分であるという条件で企図される。興味。よく知られている特性を持つプロモーターを使用することにより、トランスフェクションまたは形質転換後の目的のタンパク質の発現レベルとパターンを最適化することができる。誘導性プロモーターも使用することができる。

【0191】

タンパク質発現において使用される別の調節エレメントは、エンハンサーである。これらは、ＤＮＡの同じ分子上の離れた位置にあるプロモーターからの転写を増加させる遺伝的要素である。発現構築物がｃＤＮＡインサートを使用する場合、遺伝子転写物の適切なポリアデニル化をもたらすために、通常、ポリアデニル化シグナル配列を含めることが望まれるであろう。選択されたトランスジェニック動物種の細胞によって認識される任意のポリアデニル化シグナル配列は、ヒトまたはウシ成長ホルモンおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルなどの本発明での使用に適している。

【0192】

上記で説明したように、Ｉｄｅｓのような免疫グロブリンＧ分解酵素ポリペプチドの使用は、ＡＡＶベクターを使用する遺伝子治療によって治療される疾患の治療に適し得る。

【0193】

治療組成物
特定の実施態様において、本発明は、それを必要とする患者においてベクターを使用する遺伝子治療によって治療される疾患の治療に使用するための本発明による免疫グロブリンＧ分解酵素ポリペプチドまたは免疫グロブリンＧ分解酵素ポリペプチドをコードする核酸を含む治療組成物、または免疫グロブリンＧ分解酵素ポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターに関する。

【0194】

本発明の任意の治療薬は、薬学的に許容される賦形剤、および任意選択で生分解性ポリマーなどの徐放性マトリックスと組み合わせて、治療用組成物を形成することができる。

【0195】

薬学的に」または「薬学的に許容される」は、必要に応じて、哺乳動物、特にヒトに投与されたときに有害、アレルギーまたは他の有害な反応を生じない分子実体および組成物を指す。薬学的に許容される担体または賦形剤とは、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料、または任意のタイプの製剤補助剤を指す。

【0196】

医薬組成物の形態、投与経路、投与量およびレジメンは、当然、治療される状態、疾患の重症度、患者の年齢、体重、および性別などに依存する。

【0197】

本発明の医薬組成物は、局所、経口、鼻腔内、非経口、眼内、静脈内、筋肉内または皮下投与などのために処方され得る。

【0198】

本発明の医薬組成物は、注射することができる製剤に薬学的に許容されるビヒクルを含み得る。これらは、特に等張性、滅菌、生理食塩水（リン酸一ナトリウムまたは二ナトリウム、ナトリウム、カリウム、カルシウムまたはマグネシウムなど、またはそのような塩の混合物）、または乾燥した、特に凍結乾燥した組成物であり得、添加時に、滅菌水または生理食塩水の場合は、注射液の構成が可能である。投与に使用される用量は、様々なパラメーターの関数として、特に、使用される投与様式、関連する病状、あるいは所望の治療期間のモードの機能として適合させることができる。

【0199】

さらに、他の薬学的に許容される形態には、例えば、経口投与用の錠剤または他の固体、徐放性カプセル; 現使用することができる他のフォームが含まれる。

【0200】

本発明の医薬組成物は、さらなる治療的に活性な薬剤を含み得る。

【0201】

プロテアーゼまたはグリコシダーゼは、任意の適切な用量で対象に投与することができる。例えば、適切な投与量は、対象の約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ体重、または対象の約０．１ｍｇ／ｋｇから約４ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。

【0202】

特定の実施態様において、ＩｄｅＺは、対象の約０．０１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ体重の投薬量で投与される。例えば、適切な投与量は、対象の約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ体重、または対象の約０．１ｍｇ／ｋｇから約４ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。

【0203】

特定の実施態様において、ＩｄｅＳは、対象の約０．０１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ体重の投薬量で投与される。例えば、適切な投与量は、対象の約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ体重、または対象の約０．１ｍｇ／ｋｇから約４ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。

【0204】

特定の実施態様において、ＥｎｄｏＳは、対象の約０．０１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ体重の投薬量で投与される。例えば、適切な投与量は、対象の約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ体重、または対象の約０．１ｍｇ／ｋｇから約４ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。

【0205】

本発明による方法は、本明細書に別段の記載がない限り、任意の適切な順序で実施することができる。特定の実施態様では、方法は、最初に（ａ）中和抗体を分解または消化するのに有効なプロテアーゼおよび／またはグリコシダーゼを対象に投与することを含み得る。次に（ｂ）組換えウイルスベクターを対象に投与する。特定の実施態様において、（ｂ）組換えウイルスベクターを対象に投与することは、（ａ）中和抗体を分解または消化するのに有効なプロテアーゼおよび／またはグリコシダーゼを対象に投与した後、約１分から約９０日の間に行われる。特定の実施態様において、（ａ）中和抗体を分解または消化するのに有効なプロテアーゼおよび／またはグリコシダーゼを対象に投与すること、および（ｂ）組換えウイルスベクターを対象に投与することは、ほぼ同時に行われる。

【0206】

特定の実施態様において、方法は、最初に（ａ）異種ポリヌクレオチドを保有する組換えウイルスベクターを対象に投与し、次に（ｂ）組換えウイルスベクターおよび／または異種ポリヌクレオチドまたは異種ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質またはペプチドに結合する抗体を分解または消化するのに有効な量のプロテアーゼおよび／またはグリコシダーゼを対象に投与することを含み得る。特定の実施態様において、（ａ）異種ポリヌクレオチドを有する組換えウイルスベクターを対象に投与した後、約１分から約９０日の間に、（ｂ）組換えウイルスベクターおよび／または異種ポリヌクレオチドまたは異種ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質またはペプチドに結合する抗体を分解または消化するのに有効な量のプロテアーゼおよび／またはグリコシダーゼを対象に投与することが行われる。特定の実施態様において、（ａ）異種ポリヌクレオチドまたは異種ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質またはペプチドを対象に投与すること、および／または（ｂ）組換えウイルスベクターに結合する抗体を分解または消化するのに有効な量のプロテアーゼおよび／またはグリコシダーゼを対象に投与することは、ほぼ同時に実行される。

【0207】

中和抗体などの抗体は、既存のものであり得、そしてウイルスベクターの投与前でさえ、組換えウイルスベクター細胞の形質導入を阻害または低減するレベルで対象に存在し得る。あるいは、抗体は、組換えウイルスベクターが基づいているウイルスへの曝露後に対象において発生し得る。さらに、中和抗体などの抗体、または異種ポリヌクレオチドに結合する抗体、またはウイルスベクターによってキャプシド形成された異種ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質またはペプチドは、組換えウイルスベクターの投与後に対象において発生し得る。

【0208】

したがって、本明細書の方法は、既存の抗体を有する対象および既存の抗体を有さない対象に適用可能である。本明細書に記載されるように、そのような対象には、野生型ウイルスに曝露され、野生型ウイルスに基づくウイルスベクターに対する既存の抗体を開発した対象、ならびにウイルスベクター遺伝子治療治療を受け、抗体を開発した対象が含まれる。続いて、同じウイルスベクター遺伝子治療の１つまたは複数の追加用量で治療するか（再投与と呼ばれる）、または同じウイルスベクターを使用して遺伝子治療を提供するために異なる遺伝子治療処置（例えば、異なる異種ポリヌクレオチド）で治療することができる。

【0209】

対象は、ウイルスベクター投与の前および／またはプロテアーゼグリコシダーゼの投与の前に抗体について試験され得る。試験する抗体の非限定的な例には、中和抗体、本明細書に記載のプロテアーゼまたはグリコシダーゼに結合する抗体、異種ポリヌクレオチドに結合する抗体、および異種ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質またはペプチドに結合する抗体が含まれる。したがって、対象は、組換えウイルスベクターおよび／またはプロテアーゼグリコシダーゼの投与前の投与前に、中和抗体、本明細書に記載のプロテアーゼまたはグリコシダーゼに結合する抗体、異種ポリヌクレオチドに結合する抗体、または異種ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質またはペプチドに結合する抗体についてスクリーニングすることができる。。

【0210】

本明細書に記載のプロテアーゼまたはグリコシダーゼに結合する既存の抗体（例えば、ＩｇＧ）を有する対象は、任意選択で、本発明による方法による初期治療から除外することができる。しかしながら、プロテアーゼまたはグリコシダーゼに結合する抗体を有するまたは開発するすべての対象が、本発明による治療方法から除外される必要があるわけではない。例えば、力価が１５ｍｇ／リットル未満である検出可能な抗ＩｄｅＳ ＩｇＧを有する対象は、依然として、本発明による方法を使用して治療することができる。

【0211】

対象はまた、中和抗体、異種ポリヌクレオチドに結合する抗体、または組換えウイルスベクターの投与後に異種ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質またはペプチドに結合する抗体についてスクリーニングすることができる。そのような対象は、場合により、既存の抗体が検出されていない対象において、そのような抗体が発生するか、または発生が妨げられるかどうかを決定するために、または、既存の抗体を有する対象において、プロテアーゼおよび／またはグリコシダーゼがそのような既存の抗体を減少または排除するかどうかを決定するために、組換えウイルスベクターの投与後一定期間モニターすることができる。

【0212】

特定の実施態様において、プロテアーゼおよび／またはグリコシダーゼは、中和抗体、本明細書に記載のプロテアーゼまたはグリコシダーゼに結合する抗体、異種ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質またはペプチドに結合する異種ポリヌクレオチドまたは抗体に結合する抗体の存在について陽性であると試験した後、対象に投与される。特定の実施態様において、プロテアーゼおよび／またはグリコシダーゼは、中和抗体、本明細書に記載のプロテアーゼまたはグリコシダーゼに結合する抗体、または異種ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質またはペプチド異種ポリヌクレオチドに結合する抗体である。

【0213】

特定の実施態様において、対象は、プロテアーゼおよび／またはグリコシダーゼの投与の前または後に抗体について試験されない。したがって、中和抗体、本明細書に記載のプロテアーゼまたはグリコシダーゼに結合する抗体、異種ポリヌクレオチドに結合する抗体、またはプロテアーゼおよび／またはグリコシダーゼの投与後に異種ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質またはペプチドに結合する抗体について試験する。または、組換えウイルスベクターの投与は、本発明による治療方法において任意である。

【0214】

プロテアーゼまたはグリコシダーゼは、対象に何度でも投与することができる。例えば、プロテアーゼおよび／またはグリコシダーゼは、対象に２～５回、２～１０回、２～１５回投与することができる。

【0215】

プロテアーゼまたはグリコシダーゼは、連続日、隔日、または不規則な基準などの定期的に、任意の期間、対象に投与することができる。特定の実施態様において、プロテアーゼおよび／またはグリコシダーゼは、約１～１２週間、または約１～０週間、または約１～８週間、または約１～６週間、または約１～４週間、または組換えウイルスベクターの投与後約１～２週間、または約２週間投与される。

【0216】

特定の実施態様において、組換えウイルスベクターは、プロテアーゼまたはグリコシダーゼが対象に投与される前または後に投与される。特定の実施態様において、組換えウイルスベクターは、例えば、プロテアーゼまたはグリコシダーゼを対象に投与してから、１～１２、１２～２４、または２４～４８時間、または２～４、４～６、６～８、８～１０、１０～１４、１４～２０、２０～２５、２５～３０、３０～５０、または５０日以上で対象に投与される。特定の実施態様において、プロテアーゼまたはグリコシルは、例えば、組換えウイルスベクターを対象に投与してから、１～１２、１２～２４、または２４～４８時間、または２～４、４～６、６～８、８～１０、１０～１４、１４～２０、２０～２５、２５～３０、３０～５０、または５０日以上で対象に投与される。

【0217】

組換えウイルスベクター、プロテアーゼおよび／またはグリコシダーゼは、単独でまたは組み合わせて投与することができる。特定の実施態様において、組換えウイルスベクターは、プロテアーゼおよび／またはグリコシダーゼとは別に対象に投与される。特定の実施態様において、組換えウイルスベクターは、プロテアーゼおよび／またはグリコシダーゼと組み合わせて対象に投与される。

【0218】

特定の実施態様において、プロテアーゼおよびグリコシダーゼの混合物は、対象に１回または複数回投与される。特定の実施態様において、２つ以上のプロテアーゼまたはグリコシダーゼが、対象に１回以上投与される。

【0219】

特定の実施態様において、少なくとも１つの免疫抑制剤は、組換えウイルスベクター、プロテアーゼまたはグリコシダーゼの対象への投与の前に、実質的に同時に、または後に、対象に投与される。特定の実施態様において、免疫抑制剤は、ステロイドなどの抗炎症剤である。特定の実施態様において、免疫抑制剤は、プレドニゾン、シクロスポリン（例えば、シクロスポリンＡ）、ミコフェノール酸、リツキシマブ、ラパマイシンまたはそれらの誘導体である。

【0220】

体液性免疫を低下させるための追加の戦略には、抗体を除去、枯渇、捕捉、および／または不活性化する方法が含まれ、一般にアフェレーシス、より具体的には、血液製剤が関与する血漿交換と呼ばれる。アフェレーシスまたはプラズマフェレーシスは、患者に戻る前に、コンポーネントの追加、削除、および／または交換によってプラズマを変更するデバイスを介して、被験者の血漿をエクスビボ（体外）で循環させるプロセスである。血漿交換は、血液製剤（例えば、血漿）からヒト免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ）を除去するために使用することができる。この手順は、組換えウイルスベクターに結合し、異種ポリヌクレオチドに結合し、異種ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質またはペプチドに結合し、プロテアーゼに結合し、および／またはそれにより、グリコシダーゼは、例えば、ウイルスベクターの中和に寄与する可能性がある、治療された対象における抗体の力価を低下させる。例として、ＡＡＶキャプシドアフィニティーマトリックスカラムで構成されるデバイスがある。このようなＡＡＶキャプシドアフィニティーマトリックスに血液製剤（血漿など）を通過させると、ＡＡＶ抗体のみ、およびすべてのアイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＭなどを含む）が結合する。免疫吸着（米国特許出願公開米国特許出願公開第２００８／０１６９２７３Ａ１号）もまた、免疫グロブリン、より具体的には抗ＡＡＶ抗体を枯渇させるために使用することができる。親和性リガンド（国際特許出願公開ＷＯ／２０１８／１５８３９７）もまた、免疫グロブリン、より具体的には抗ＡＡＶ抗体を枯渇させるために使用することができる。前述の戦略のいずれも、組換えウイルスベクター、プロテアーゼまたはグリコシダーゼを対象に投与する前、実質的に同時に、または投与後に使用することができる。

【0221】

全身遺伝子導入におけるＡＡＶに対する体液性免疫を低減（克服）または回避するための追加の戦略には、抗ＡＡＶ抗体を吸着するためのおとりとしてのＡＡＶ空キャプシド粒子および／またはキャプシドタンパク質の使用が含まれる。さらにさらなる戦略は、Mingozzi et al。、2013、Blood、122：23-36に記載されている。

【0222】

本発明によれば、プロテアーゼおよび／またはグリコシダーゼは、リポソーム、ナノ粒子、脂質ナノ粒子、ポリマー、微粒子、マイクロカプセル、ミセル、または細胞外小胞とカプセル化または複合体化され得る。

【0223】

本発明によれば、ウイルス粒子は、リポソーム、ナノ粒子、脂質ナノ粒子、ポリマー、微粒子、マイクロカプセル、ミセル、または細胞外小胞とカプセル化または複合体化され得る。

【0224】

特定の実施態様において、リポソーム、ナノ粒子、脂質ナノ粒子、ポリマー、微粒子、マイクロカプセル、ミセル、または細胞外小胞は、遺伝子治療核酸の非ウイルス送達のために本発明において使用され得る。

【0225】

「脂質ナノ粒子」または「ＬＮＰ」は、組換えウイルスベクターおよび／またはプロテアーゼおよび／またはグリコシダーゼの送達に有用であり、ナノスケール、すなわち約１０ｎｍから約、または約５０から約５００ｎｍ、または約７５から約１２７ｎｍの寸法を有する脂質ベースの小胞を指す。理論に拘束されることなく、ＬＮＰは、プロテアーゼ、グリコシダーゼ、または組換えウイルスベクターに免疫系からの部分的または完全なシールドを提供すると考えられている。シールドは、プロテアーゼ、グリコシダーゼ、または組換えウイルスベクターに対する実質的な免疫応答をインビボで誘導することを回避しながら、プロテアーゼ、グリコシダーゼ、または組換えウイルスベクターの組織または細胞への送達を可能にする。シールドはまた、インビボで（例えば、ヒトなどの対象において）、プロテアーゼ、グリコシダーゼ、または組換えウイルスベクターに対する実質的な免疫応答を誘導することなく、反復投与を可能にし得る。シールドはまた、送達効率、治療効果の持続時間、および／またはインビボでの治療効果を改善または増加させ得る。

【0226】

ＡＡＶのｐＩ（等電点）は、約６から約６．５の範囲にある。したがって、ＡＡＶ表面はわずかに負の電荷を帯びている。したがって、ＬＮＰが、例えば、アミノ脂質などのカチオン性脂質を含むことが有益である可能性がある。例示的なアミノ脂質は、米国特許第９，３５２，０４２号、第９，２２０，６８３号、第９，１８６，３２５号、第９，１３９，５５４号、第９，１２６，９６６号第９，０１８，１８７号、第８，９９９，３５１号、第８，７２２，０８２号、第８，６４２，０７６号、第８，５６９，２５６号、第８，４６６，１２２号、および第７，７４５，６５１号ならびに米国特許公開第２０１６／０２１３７８５号、２０１６／０１９９４８５号、２０１５／０２６５７０８号、２０１４／０２８８１４６号、２０１３／０１２３３３８号、２０１３／０１１６３０７号、２０１３／００６４８９４号、２０１２／０１７２４１１号、および２０１０／０１１７１２５号に記載されている。。

【0227】

「カチオン性脂質」および「アミノ脂質」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の脂肪酸または脂肪アルキル鎖およびｐＨ滴定可能なアミノ基（例えば、アルキルアミノまたはジアルキルアミノ基）を含む。カチオン性脂質は、典型的には、カチオン性脂質のｐＫａより低いｐＨでプロトン化され（すなわち、正に帯電し）、ｐＫａより高いｐＨで実質的に中性である。カチオン性脂質はまた、滴定可能なカチオン性脂質であり得る。特定の実施態様において、カチオン性脂質は、以下を含む：プロトン化可能な第三級アミン（例えば、ｐＨ滴定可能な）基、各アルキル鎖が独立して０から３（例えば、０、１、２、または３）の二重結合を有するＣ１８アルキル鎖；頭部基とアルキル鎖の間のエーテル、エステル、またはケタール結合。

【0228】

カチオン性脂質は、限定されないが、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ、Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ、Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２－ジ－γ－リノレニルオキシ－Ｎ、Ｎ－ジメチルアミノプロパン（γ－ＤＬｅｎＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｃ２Ｋ－ＤＭＡ、ＸＴＣ２、およびＣ２Ｋとしても知られる）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、ジリノレイルメチル－３－ジメチルアミノプロピオネート（ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ２－ＤＭＡ、ＭＣ２としても知られる）、（６Ｚ、９Ｚ、２８Ｚ、３１ Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ３－ＤＭＡ、ＭＣ３としても知られる）、塩その、およびそれらの混合物を含み得る。他のカチオン性脂質には、これらに限定されないが、１，２－ジステアリルオキシ－Ｎ、Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ、Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、 ２，２－ジリノレイル－４－（３－ジメチルアミノプロピル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ３－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（３－ジメチルアミノブチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ４－ＤＭＡ）、ＤＬｅｎ－Ｃ２Ｋ－ＤＭＡ、γ－ＤＬｅｎ－Ｃ２Ｋ－ＤＭＡ、および（ＤＬｉｎ－ＭＰ－ＤＭＡ）（１－Ｂ１１とも呼ばれる）を含む。

【0229】

さらなるカチオン性脂質は、限定されないが、２，２－ジリノレイル－５－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキサン（ＤＬｉｎ－Ｋ６－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－Ｎ－メチルペピアジノ－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＭＰＺ）、１，２－ジリノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレオキシ－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＣ）、１，２－ジリノレオキシ－３－モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ）、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃｌ））、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ－ＭＰＺ）、３－（Ｎ、Ｎ－ジリノレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３－（Ｎ、Ｎ－ジオレイルアミノ）－１，２－プロパンジオ（ＤＯＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキソ－３－（２－Ｎ、Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）、Ｎ、Ｎ－ジオレイル－Ｎ、Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ、Ｎ、Ｎ－トリメット塩化ヒラモニウム（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ、Ｎ－ジステアリル－Ｎ、Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ、Ｎ、Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、３－（Ｎ－（Ｎ’、Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロパン－３－イル）－Ｎ、Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミン－カルボキサミド）エチル］－Ｎ、Ｎ－ジメチル－１－プロパンミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、３－ジメチルアミノ－２－（コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシブタン－４－オキシ）－１－（シス、シス－９，１２－オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、２－［５’－（コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシ）－３’－オキサペントキシ）－３－ジメチル－１－（シス、シス－９’、１－２’－オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ、Ｎ－ジメチル－３，４－ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）、１、２－Ｎ、Ｎ’－ジオレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＯｃａｒｂＤＡＰ）、１，２－Ｎ、Ｎ’－ジリノレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ）、デキサメタゾン－スペリミン（ＤＳ）および二置換スペルミン（Ｄ２Ｓ）またはそれらの混合物を含み得る。

【0230】

ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能なＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥを含む）、およびＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能なＤＯＳＰＡおよびＤＯＰＥを含む）などのカチオン性脂質の多くの市販の調製物を使用することができる。

【0231】

特定の実施態様において、カチオン性脂質は、ＬＮＰの約１０重量％から脂質ナノ粒子の約８５重量％まで、またはＬＮＰの約５０重量％から約７５重量％までの量で存在し得る。

【0232】

ステロールは、ＬＮＰに流動性を与える可能性がある。本明細書で使用される場合、「ステロール」は、植物（植物ステロール）または動物（動物ステロール）由来の任意の天然に存在するステロール、ならびに非天然に存在する合成ステロールを指し、これらはすべて、ステロイドＡリングの３－位にヒドロキシル基が存在することを特徴とする。ステロールは、リポソーム、脂質小胞または脂質粒子調製物の分野で従来から使用されている任意のステロール、最も一般的にはコレステロールであり得る。植物ステロールには、カンペステロール、シトステロール、およびスチグマステロールが含まれる場合がある。ステロールには、米国特許出願公開第２０１１／０１７７１５６号に記載されているようなステロール修飾脂質も含まれる。特定の実施態様において、ステロールは、ＬＮＰの約５重量％から脂質ナノ粒子の約５０重量％まで、またはＬＮＰの約１０重量％からＬＮＰの約２５重量％までの量で存在し得る。

【0233】

ＬＮＰは中性脂質を含むことができる。中性脂質は、生理学的ｐＨで非荷電または中性の双性イオン形態のいずれかで存在する任意の脂質種を含み得る。そのような脂質には、これらに限定されないが、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリン、およびセレブロシドが含まれる。中性脂質の選択は、一般に、とりわけ粒子サイズと必要な安定性を考慮して導かれる。特定の実施態様において、中性脂質成分は、２つのアシル基（例えば、ジアシルホスファチジルコリンおよびジアシルホスファチジルエタノールアミン）を有する脂質であり得る。

【0234】

様々な鎖長および飽和度の様々なアシル鎖基を有する脂質が利用可能であるか、または周知の技術によって単離または合成され得る。特定の実施態様では、Ｃ１４からＣ２２の範囲の炭素鎖長を有する飽和脂肪酸を含む脂質を使用することができる。特定の実施態様において、Ｃ１４からＣ２２の範囲の炭素鎖長を有する一酸または二不飽和脂肪酸を有する脂質が使用される。さらに、飽和および不飽和脂肪酸鎖の混合物を有する脂質を使用することができる。例示的な中性脂質には、限定されないが、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、または関連するホスファチジルコリンが含まれる。中性脂質は、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、またはセリンやイノシトールなどの他のヘッドグループを持つリン脂質で構成されている場合もある。

【0235】

特定の実施態様において、中性脂質は、脂質ナノ粒子の約０．１重量％からＬＮＰの約７５重量％まで、またはＬＮＰの約５重量％から約１５重量％までの量で存在し得る。

【0236】

ＬＮＰカプセル化プロテアーゼ、グリコシダーゼ、または組換えウイルスベクターは、医薬組成物、例えば、医薬的に許容される担体または賦形剤に組み込むことができる。そのような医薬組成物は、とりわけ、ＬＮＰカプセル化プロテアーゼ、グリコシダーゼ、または組換えウイルスベクターの、インビボまたはエクスビボでの対象への投与および送達に有用である。

【0237】

ＬＮＰの調製物は、例えば、これらに限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびステロールを含み得る追加の成分と組み合わせることができる。

【0238】

「ＰＥＧ」という用語は、２つの末端ヒドロキシル基を有するエチレンＰＥＧ繰り返し単位の線状の水溶性ポリマーであるポリエチレングリコールを指す。ＰＥＧは分子量によって分類される。たとえば、ＰＥＧ２０００の平均分子量は約２，０００ダルトンであり、ＰＥＧ５０００の平均分子量は約５，０００ダルトンである。ＰＥＧは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．および他の会社から市販されており、例えば、以下の機能性ＰＥＧが含まれる：モノメトキシポリエチレングリコール（ＭｅＰＥＧ－ＯＨ）、モノメトキシポリエチレングリコール－コハク酸塩（ＭｅＰＥＧ－Ｓ）、モノメトキシポリエチレングリコール－スクシンイミジルコハク酸塩（ＭｅＰＥＧ－Ｓ－ＮＨＳ）、モノメトキシポリエチレングリコール－アミン（ＭｅＰＥＧ－ＮＨ２）、モノメトキシポリエチレングリコール－トレシル酸塩（ＭｅＰＥＧ－ＴＲＥＳ）、およびモノメトキシポリエチレングリコール－イミダゾリル－カルボニル（ＭｅＰＥＧ－ＩＭ）。

【0239】

特定の実施態様において、ＰＥＧは、約５５０から約１０，０００ダルトンの平均分子量を有するポリエチレングリコールであり得、そして任意選択で、アルキル、アルコキシ、アシルまたはアリールによって置換される。特定の実施態様において、ＰＥＧは、末端ヒドロキシル位置においてメチルで置換され得る。特定の実施態様では、ＰＥＧは、約７５０から約５０００ダルトン、または約１，０００から約５０００ダルトン、または約１５００から約３０００ダルトン、または約２０００ダルトンまたは約７５０ダルトンの平均分子量を有し得る。ＰＥＧは、必要に応じて、アルキル、アルコキシ、アシルまたはアリールで置換することができる。特定の実施態様において、末端ヒドロキシル基は、メトキシ基またはメチル基で置換され得る。

【0240】

ＰＥＧ修飾脂質には、米国特許第８，９３６，９４２号および第７，８０３，３９７号に記載されているＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピルコンジュゲート（ＰＥＧ－ＤＡＡ）が含まれる。有用なＰＥＧ修飾脂質（または脂質－ポリオキシエチレンコンジュゲート）は、脂質小胞の表面にＰＥＧ部分を固定するための様々な「固定」脂質部分を有し得る。適切なＰＥＧ修飾脂質の例には、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジン酸、米国特許第５，８２０，８７３号に記載されているＰＥＧ－セラミドコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ－ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ－ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミンおよびＰＥＧ修飾１、２－ジアシルオキシプロパン－３－アミンが含まれる。特定の実施態様において、ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロールおよびジアルキルグリセロールであり得る。特定の実施態様では、ＰＥＧは、ＬＮＰの約０．５重量％からＬＮＰの約２０重量％、またはＬＮＰの約５重量％からＬＮＰの約１５重量％の量であり得る。

【0241】

さらに、ＬＮＰは、ＰＥＧ修飾およびステロール修飾ＬＮＰであり得る。追加のコンポーネントと組み合わせたＬＮＰは、同じＬＮＰでも別々のＬＮＰであることができる。言い換えれば、同じＬＮＰをＰＥＧ修飾およびステロール修飾することができ、あるいは、第１のＬＮＰをＰＥＧ修飾し、第２のＬＮＰをステロール修飾することができる。場合により、１番目と２番目の変更されたＬＮＰを組み合わせることができる。

【0242】

特定の実施態様では、ＬＮＰをカプセル化する前に、約１０ｎｍから５００ｎｍ、または約５０ｎｍから約２００ｎｍ、または７５ｎｍから約１２５ｎｍの範囲のサイズを有し得る。特定の実施態様において、ＬＮＰカプセル化プロテアーゼ、グリコシダーゼ、または組換えウイルスベクターは、約１０ｎｍから５００ｎｍの範囲のサイズを有し得る。

【0243】

「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書では互換的に使用され、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）を含むすべての形態の核酸、オリゴヌクレオチドを指す。核酸には、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびアンチセンスＤＮＡ、およびスプライシングまたはスプライシングされていないｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ ｔＲＮＡおよび阻害性ＤＮＡまたはＲＮＡ（ＲＮＡｉ、例えば、スモールまたはショートヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、スモールまたはショート干渉（ｓｉ）ＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡ）が含まれる。

【0244】

核酸には、天然に存在する、合成の、および意図的に修飾または改変されたポリヌクレオチドが含まれる。核酸は、単一、二重、または三重、線形または円形であり得、任意の長さであり得る。核酸を議論する際に、特定のポリヌクレオチドの配列または構造は、５’から３’方向に配列を提供するという慣習に従って本明細書に記載され得る。

【0245】

「異種」核酸配列は、細胞へのポリヌクレオチドのベクター媒介性の移入／送達の目的でプラスミドまたはベクターに挿入されたポリヌクレオチドを指す。異種核酸配列は、ウイルス核酸とは異なり、すなわち、ウイルス核酸に関して非天然である。細胞に移入／送達されると、ベクター内に含まれる異種核酸配列を発現させることができる（例えば、必要に応じて転写および翻訳される）。あるいは、ベクター内に含まれる、細胞内で移入／送達された異種ポリヌクレオチドを発現させる必要はない。「異種」という用語は、本明細書では核酸配列およびポリヌクレオチドに関して常に使用されるわけではないが、修飾因子「異種」がなくても、核酸配列またはポリヌクレオチドへの言及は、省略にもかかわらず、異種核酸配列およびポリヌクレオチドを含むことを意図する。

【0246】

「導入遺伝子」は、本明細書では、細胞または生物に意図されているかまたは導入されている核酸を都合よく指すために使用される。導入遺伝子には、異種ポリヌクレオチド配列またはタンパク質またはペプチドをコードする異種核酸などの任意の核酸が含まれる。導入遺伝子および異種核酸／ポリヌクレオチド配列という用語は、本明細書では交換可能に使用される。

【0247】

特定の実施態様において、異種ポリヌクレオチドは、ポンペ病の治療のためのＧＡＡ（酸性α－グルコシダーゼ）；ウィルソン病の治療のためのＡＴＰ７Ｂ（銅輸送ＡＴＰａｓｅ２）ファブリー病の治療のためのアルファガラクトシダーゼ；シトルリン血症１型の治療のためのＡＳＳ１（アルギノコハク酸シンターゼ）；ゴーシェ病１型の治療のためのベータグルコセレブロシダーゼ；テイサックス病の治療のためのベータヘキソサミニダーゼＡ；Ｃ１阻害剤欠乏症Ｉ型およびＩＩ型としても知られる、遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）の治療のためのＳＥＲＰＩＮＧ１（Ｃ１プロテアーゼ阻害剤またはＣ１エステラーゼ阻害剤）；および糖原病Ｉ型（ＧＳＤＩ）の治療のためのグルコース－６－ホスファターゼからなる群から選択されるタンパク質をコードする。

【0248】

特定の実施態様において、異種ポリヌクレオチドは、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、アンギオポイエチン、アンギオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、基本線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長因子α（ＴＧＦα）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン成長因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ－ＩおよびＩＧＦ－ＩＩ））、ＴＧＦβ、アクチビン、インヒビン、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ－３およびＮＴ４／５、繊毛神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株派生神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アグリン、ネトリン－１およびネトリン－２、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグおよびチロシンヒドロキシラーゼからなる群から選択されるタンパク質をコードする。

【0249】

特定の実施態様において、異種ポリヌクレオチドは、酸性α－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）をコードする。ポンペ病または別のグリコーゲン蓄積症の対象へのＧＡＡをコードする異種ポリヌクレオチドを含む組換えウイルスベクターの投与は、ＧＡＡタンパク質の発現をもたらす可能性がある。患者におけるＧＡＡタンパク質の発現は、グリコーゲンの蓄積を抑制、阻害、または低減し、グリコーゲンの蓄積を防止し、またはグリコーゲンを分解するのに役立ち、ポンペ病または別のグリコーゲン貯蔵疾患の１つまたは複数の有害作用を低減または低減することができる。

【0250】

特定の実施態様において、異種ポリヌクレオチドは、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ－１からＩＬ－３６など）、単球化学誘引物質タンパク質、白血病阻害因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子αおよびβ、インターロイキンα、β、およびγ、幹細胞因子、ｆｌｋ－２／ｆｌｔ３リガンド、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、単一鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、単球Ｔ細胞受容体、クラスＩおよびクラスＩＩＭＨＣ分子からなる群から選択されるタンパク質をコードする。

【0251】

特定の実施態様において、異種ポリヌクレオチドは、ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質）、血液凝固（clotting）因子（因子ＸＩＩＩ、因子ＩＸ、因子ＶＩＩＩ、因子Ｘ、因子ＶＩＩ、因子ＶＩＩａ、タンパク質Ｃなど）機能獲得血液凝固因子、抗体、網膜色素上皮特異的６５ｋＤａタンパク質（ＲＰＥ６５）、エリスロポエチン、ＬＤＬ受容体、リポタンパク質リパーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、β－グロビン、α－グロビン、スペクトリン、α－アンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、金属輸送体（ＡＴＰ７ＡまたはＡＴＰ７）、スルファミダーゼ、リソソーム蓄積症（ＡＲＳＡ）に関与する酵素、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、β－２５グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼ、分岐鎖ケト酸ホルモン、成長因子、インスリン様成長因子１または２、血小板由来成長因子、表皮成長因子、神経成長因子、神経栄養因子－３および－４、脳由来神経栄養因子、グリア由来成長因子、形質転換成長因子αおよびβ、サイトカイン、α－インターフェロン、β－インターフェロン、インターフェロン－γ、インターロイキン－２、インターロイキン－４、インターロイキン１２、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシン、自殺遺伝子産物、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、チトクロームＰ４５０、デオキシシチジンキナーゼ、腫瘍壊死因子、薬剤耐性タンパク質、腫瘍抑制タンパク質（例、ｐ５３、Ｒｂ、Ｗｔ－１、ＮＦ１、フォンヒッペル－リンダウ（ＶＨＬ）、腺腫性ポリポーシスコリ（ＡＰＣ））、免疫調節特性を有するペプチド、寛容原性または免疫原性ペプチドまたはタンパク質トレギトープまたはｈＣＤＲ１、インスリン、グルコキナーゼ、グアニル酸シクラーゼ２Ｄ（ＬＣＡ－ＧＵＣＹ２Ｄ）、Ｒａｂエスコートタンパク質１（Ｃｈｏｒｏｉｄｅｒｅｍｉａ）、ＬＣＡ ５（ＬＣＡ－レベルシリン）、オルニチンケト酸アミノトランスフェラーゼ（ジャイレート萎縮）、レチノスキシン１（Ｘ連鎖網膜分離症）、ＵＳＨ１Ｃ（アッシャー症候群１Ｃ）、Ｘ連鎖網膜色素変性症ＧＴＰａｓｅ（ＸＬＲＰ）、ＭＥＲＴＫ（ＡＲ型ＲＰ：網膜色素変性症））、ＤＦＮＢ１（コネキシン２６難聴）、ＡＣＨＭ ２、３および４（色覚異常）、ＰＫＤ－１またはＰＫＤ－２（多発性嚢胞腎）、ＴＰＰ１、ＣＬＮ２、スルファターゼ、Ｎ－アセチルグルコサミン－１－リン酸トランスフェラーゼ、カテプシンＡ、ＧＭ２－ＡＰ、ＮＰＣ１、ＶＰＣ２、スフィンゴ脂質活性化タンパク質、ゲノム編集用の１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはゲノム編集用の修復テンプレートとして使用される１つ以上のドナー配列をコードする。

【0252】

特定の実施態様において、異種ポリヌクレオチドは、貧血の治療のためにエリスロポエチン（ＥＰＯ）、さまざまな免疫障害、ウイルス感染症、および癌の治療のためのインターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、およびインターフェロンガンマ、様々な炎症性疾患または免疫不全の治療のための、ＩＬ－１からＩＬ－３６のいずれか１つを含むインターロイキン（ＩＬ）、および対応する受容体、免疫障害の治療のためのケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド５（ＣＸＣＬ５）を含むケモカイン；クローン病などの免疫障害の治療のための顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、さまざまなヒト炎症性疾患の治療のための顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、さまざまなヒト炎症性疾患の治療のためのマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、上皮組織損傷の治療のためのケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）；再発性流産、ＨＩＶ関連合併症、およびインスリン抵抗性の治療のための単球走化性タンパク質－１（ＭＣＰ－１）などのケモカイン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびさまざまな免疫障害の治療のための受容体；肺気腫または慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の治療のためのα１－アンチトリプシン；ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ Ｉ）の治療のためのα－Ｌ－イズロニダーゼ；ＯＴＣ欠乏症の治療のためのオルニチントランスカルバモイラーゼ（ＯＴＣ）；フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）の治療のためのフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）またはフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、リポタンパク質リパーゼ欠損症の治療のためのリポタンパク質リパーゼ；アポリポタンパク質（Ａｐｏ）Ａ－Ｉ欠損症の治療のためのアポリポタンパク質；家族性高コレステロール血症（ＦＨ）の治療のための低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬ－Ｒ）。低アルブミン血症の治療のためのアルブミン；レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）；カルバモイルシンテターゼＩ；アルギニノコハク酸シンテターゼ；アルギニノコハク酸リアーゼ；アルギナーゼ；フマリルアセトアセタートヒドロラーゼ；ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ；ホモシスチン尿症の治療のためのシスタチオニンベータシンターゼ；分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼ；イソバレリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ；プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ；メチルマロニルＣｏＡムターゼ；グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ；インスリン；ピルビン酸カルボキシラーゼ；肝ホスホリラーゼ；ホスホリラーゼキナーゼ；グリシンデカルボキシラーゼ；Ｈタンパク質；Ｔタンパク質；嚢胞性線維症膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）；スターガルト病の治療のためのＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＡ（ＡＢＣ１）、メンバー４（ＡＢＣＡ４）。またはジストロフィンをコードする。

【0253】

「ポリペプチド」、「タンパク質」および「ペプチド」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。「ポリペプチド」、「タンパク質」、および「ポリヌクレオチド配列」によってコードされる「ペプチド」には、天然に存在するタンパク質と同様に、完全長の天然配列、ならびに部分配列、改変された形態または変異体は、天然の完全長タンパク質のある程度の機能性を保持している。本発明において、ポリヌクレオチド配列によってコードされるそのようなポリペプチド、タンパク質およびペプチドは、欠陥があるか、またはその発現が不十分であるか、または処置された哺乳動物において不十分である内因性タンパク質と同一であり得るが、同一である必要はない。

【0254】

特定の実施態様において、異種ポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス分子、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、リボザイム、およびｓｈＲＮＡからなる群から選択される阻害性核酸をコードする。

【0255】

特定の実施態様において、阻害性核酸は、ハンチンチン（ＨＴＴ）遺伝子、歯状鱗翅目萎縮（アトロフィン１、ＡＴＮ１）、脊髄延髄筋萎縮のＸ染色体上のアンドロゲン受容体、ヒトアタキシン－１、－２、－３、および－７、Ｃａｖ２．１ Ｐ／Ｑ電位依存性カルシウムチャネル（ＣＡＣＮＡ１Ａ）、ＴＡＴＡ結合タンパク質、アタキシン８反対鎖（ＡＴＸＮ８ＯＳ）、脊髄小脳性運動失調におけるセリン／スレオニンタンパク質ホスファターゼ２Ａ ５５ｋＤａ調節サブユニットＢベータアイソフォーム（タイプ１、２、３、６、７、８、１２ １７）、ＦＭＲ１（脆弱Ｘ精神遅滞１）脆弱Ｘ症候群、ＦＭＲ１（脆弱Ｘ精神遅滞１）脆弱Ｘ関連振戦／運動失調症候群、ＦＭＲ１（脆弱Ｘ精神遅滞２）またはＡＦ４／ＦＭＲ２ファミリーメンバー２脆弱ＸＥ精神遅滞；筋緊張性ジストロフィーにおけるミオトニンタンパク質キナーゼ（ＭＴ－ＰＫ）；フリードライヒ運動失調症のフラタキシン；筋萎縮性側索硬化症におけるスーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）遺伝子の変異体；パーキンソン病および／またはアルツハイマー病の病因に関与する遺伝子。アポリポタンパク質Ｂ（ＡＰＯＢ）およびプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）、高コレステロール血症；ＨＩＶ感染における転写遺伝子のヒト免疫不全ウイルストランス活性化因子であるＨＩＶＴａｔ；ＨＩＶ感染におけるＨＩＶＴＡＲ、ＨＩＶ ＴＡＲ、ヒト免疫不全ウイルストランス活性化因子応答要素遺伝子、ＨＩＶ感染症におけるＣ－Ｃケモカイン受容体（ＣＣＲ５）、ＲＳＶ感染におけるラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ヌクレオカプシドタンパク質、Ｃ型肝炎ウイルス感染における肝臓特異的マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－１２２）、ｐ５３、急性腎障害または移植片機能の遅延腎移植または腎障害急性腎不全；事前に再発性または転移性の固形悪性腫瘍のプロテインキナーゼＮ３（ＰＫＮ３）、ＬＭＰ２、プロテアソームサブユニットベータタイプ９（ＰＳＭＢ ９）としても知られるＬＭＰ２、転移性黒色腫、プロテアソームサブユニットベータタイプ８（ＰＳＭＢ ８）としても知られるＬＭＰ７、転移性黒色腫、プロテアソームサブユニットベータタイプ１０（ＰＳＭＢ １０）としても知られるＭＥＣＬ１、固形腫瘍における血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；固形腫瘍におけるキネシン紡錘体タンパク質、慢性骨髄性白血病におけるアポトーシス抑制因子Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫（ＢＣＬ－２）、固形腫瘍におけるリボヌクレオチドレダクターゼＭ２（ＲＲＭ２）；固形腫瘍におけるフューリン；肝腫瘍のポロ様キナーゼ１（ＰＬＫ１）、Ｃ型肝炎感染のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ１（ＤＧＡＴ１）、家族性大腸腺腫症のベータカテニン、ベータ２アドレナリン受容体、緑内障；糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）または加齢性黄斑変性症におけるＤＡＮ損傷誘発性転写物４タンパク質としても知られるＲＴＰ８０１／Ｒｅｄｄ１、加齢性黄斑変性症または脈絡膜血管新生における血管内皮増殖因子受容体Ｉ（ＶＥＧＦＲ１）、非動脈炎性虚血性視神経症におけるカスパーゼ２。先天性厚硬膜のケラチン６ＡＮ１７Ｋ変異タンパク質。インフルエンザ感染におけるインフルエンザＡウイルスのゲノム／遺伝子配列；ＳＡＲＳ感染における重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルスゲノム／遺伝子配列；呼吸器合胞体ウイルス感染における呼吸器合胞体ウイルスゲノム／遺伝子配列；エボラ感染におけるエボラフィロウイルスゲノム／遺伝子配列；Ｂ型およびＣ型肝炎感染におけるＢ型およびＣ型肝炎ウイルスのゲノム／遺伝子配列、ＨＳＶ感染における単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ゲノム／遺伝子配列、コクサッキーウイルスＢ３感染におけるコクサッキーウイルスＢ３ゲノム／遺伝子配列。原発性ジストニアにおけるトルシンＡ（ＴＯＲ１Ａ）、汎クラスＩおよび移植に特異的なＨＬＡ対立遺伝子のような遺伝子の病原性対立遺伝子のサイレンシング（対立遺伝子特異的サイレンシング）、常染色体優性遺伝性網膜色素変性症（ａｄＲＰ）の変異ロドプシン遺伝子（ＲＨＯ）に関連する遺伝子からなる群から選択されるポリヌクレオチド反復疾患に関連する遺伝子、遺伝子の転写物、または遺伝子の転写物に結合する。

【0256】

組換えウイルスベクター用量は、任意の適切な用量で投与することができる。一般に、用量は少なくとも１×１０^８、またはそれ以上の範囲であり、例えば、１×１０^９、１×１０^１０、１×１０^１１、１×１０^１２、１×１０^１３または１×１０^１４、またはそれ以上の、キログラムあたりのベクターゲノム（治療効果を達成するための、対象の体重のｖｇ／ｋｇ）。マウスでは１×１０^１０－１×１０^１１ｖｇ／ｋｇ、犬では１×１０^１２－１×１０^１３ｖｇ／ｋｇの範囲のＡＡＶ用量が有効であった。より具体的には、約１ｘ１０^１１ｖｇ／ｋｇから約５ｘ１０^１４ｖｇ／ｋｇまで、または約５ｘ１０^１１ｖｇ／ｋｇから約１ｘ１０^１４ｖｇ／ｋｇまで、または約５ｘ１０^１１ｖｇ／ｋｇから約５ｘ１０^１３ｖｇ／ｋｇまでの用量、または約５ｘ１０^１１ｖｇ／ｋｇから約１ｘ１０^１３ｖｇ／ｋｇまで、または約５ｘ１０^１１ｖｇ／ｋｇまたは約５ｘ１０^１２ｖｇ／ｋｇまで、または約５ｘ１０^１１ｖｇ／ｋｇから約１ｘ１０^１２ｖｇ／ｋｇまで。用量は、例えば、約５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、例えば、約２×１０^１１から約２×１０^１４ｖｇ／ｋｇまでの用量、特に、例えば、約２×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約６ｘ１０^１２ｖｇ／ｋｇ、または約２ｘ１０^１３ｖｇ／ｋｇであり得る。。

【0257】

特定の実施態様において、プロテアーゼおよび／またはグリコシダーゼの対象への投与は、対象の治療に有効であることが必要とされる異種ポリヌクレオチドを含む組換えウイルスベクターの用量を減少させる。特定の実施態様において、プロテアーゼおよび／またはグリコシダーゼの対象への投与は、異種ポリヌクレオチドを含む組換えウイルスベクターの増加した用量の投与を可能にする。

【0258】

用量は変化する可能性があり、治療が向けられる疾患のタイプ、発症、進行、重症度、頻度、期間、または確率、所望の臨床エンドポイント、以前または同時の治療、一般的な健康、年齢、性別、対象の人種または免疫学的能力、および熟練した職人によって評価される他の要因に依存する。投与量、数、頻度または期間は、治療または治療の有害な副作用、合併症または他の危険因子、ならびに対象の状態によって示されるように、比例して増加または減少し得る。当業者は、治療的または予防的利益を提供するのに十分な量を提供するために必要な投薬量およびタイミングに影響を及ぼし得る要因を理解するであろう。

【0259】

治療効果を達成するための用量、例えば、ベクターゲノム中の用量／体重１キログラム当たり（ｖｇ／ｋｇ）は、投与経路、投与レベルを含むがこれらに限定されないいくつかの要因：
治療効果を達成するために必要な異種ポリヌクレオチド発現、治療される特定の疾患、組換えウイルスベクターに対する任意の宿主免疫応答、異種ポリヌクレオチドまたは発現産物（タンパク質またはペプチド）に対する宿主免疫応答、および発現されたタンパク質またはペプチドの安定性
に基づいて変化する。当業者は、前述の因子ならびに他の因子に基づいて、特定の疾患または障害を有する患者を治療するための組換えウイルスベクターゲノム用量範囲を決定することができる。

【0260】

「有効量」または「十分な量」は、単回または複数回の用量で、単独で、または１つまたは複数の他の組成物、治療、プロトコール、または治療レジメン剤と組み合わせて、検出可能な応答を提供する量、任意の期間（長期または短期）、測定可能または検出可能な程度の対象における期待されるまたは望ましい結果または利益、または任意の期間（例えば、分、時間、日、月、年、または治癒）を指す。治療（例えば、改善する、または治療上の利益または改善を提供するため）のための「有効量」または「十分な量」の用量は、通常、1つ、複数、またはすべての有害な症状、結果または合併症に対する応答を提供するのに効果的である。疾患、例えば、疾患によって引き起こされるか、または疾患に関連する、1つまたは複数の有害な症状、障害、病気、病状、または合併症、ただし、病気の進行または悪化の減少、減少、阻害、抑制、制限または制御は満足のいく転帰である。

【0261】

有効量または十分な量は、単回投与で提供することもできるが、単回投与でする必要はなく、複数回投与を必要とする場合があり、単独で、または別の組成物（例えば、薬剤）プロトコールまたは治療レジメンと組み合わせて投与することもできるが、そうである必要はない。例えば、量は、対象の必要性、治療される疾患の種類、状態および重症度、または治療の副作用（もしあれば）によって示されるように、比例して増加され得る。さらに、有効量または十分な量は、追加の用量、量または期間のため、第２の組成物（例えば、別の薬物または薬剤）、治療、プロトコルまたは治療レジメンなしで単回または複数回の用量で与えられる場合、有効または十分である必要はない。所与の対象において効果的または十分であると見なされるために、そのような用量、または追加の組成物（例えば、薬物または薬剤）、治療、プロトコルまたは治療レジメンを超えて含まれ得る。有効と見なされる量には、リソソーム蓄積症（ポンペ病など）の治療のための組換えＧＡＡの投与、または凝固障害（例、血友病Ａ（ＨｅｍＡ）または血友病Ｂ（ＨｅｍＢ））の治療のためのタンパク質（例、ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸ）組換え凝固因子の投与など、別の治療、治療レジメンまたはプロトコルの使用の削減をもたらす量も含まれる。

【0262】

ポンペ病の場合、有効量は、例えばグリコーゲンの産生または蓄積を阻害または低減する、グリコーゲンの分解または除去を増強または増加させる、対象の体の組織におけるリソソームの変化を低減する、または対象の筋肉の緊張および／または対象の筋力および／または呼吸機能を改善するＧＡＡの量である。有効量は、例えば、血漿からの筋芽細胞によるＧＡＡ取り込みの動態を確認することによって決定することができる。約１４１～１４７ｎＭの筋芽細胞ＧＡＡ取り込み速度（Ｋ取り込み）が効果的であるように見える場合がある（たとえば、Maga et al。、J。Biol。Chem。2012を参照）。動物モデルでは、血漿中のＧＡＡ活性レベルが約１，０００ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍＬ、たとえば、約１，０００～約２，０００ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍＬは、治療上有効であることが観察されている。

【0263】

ＨｅｍＡおよびＨｅｍＢについて、一般的に言えば、治療効果を達成するためには、正常な個体に見られる因子濃度の１％を超える血液凝固因子濃度が、重篤な疾患を変化させるために必要であると考えられている。中程度の表現型。重度の表現型は、関節の損傷と生命を脅かす出血を特徴とする。中等度の疾患表現型を軽度の表現型に変換するには、正常の５％を超える血液凝固因子濃度が必要であると考えられている。

【0264】

正常なヒトにおけるＦＶＩＩＩおよびＦＩＸレベルは、約１５０～２００ｎｇ／ｍＬの血漿であるが、より少ない（例えば、約１００～１５０ｎｇ／ｍＬの範囲）またはより高い（例えば、約２００～３００ｎｇ／ｍＬの範囲）可能性がある。）であり、たとえば活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）１段階凝固アッセイによって決定される機能的凝固のため、依然として正常と見なされる。したがって、対象／ヒトにおけるＦＶＩＩＩまたはＦＩＸの総量が、正常な対象／ヒトに存在するＦＶＩＩＩまたはＦＩＸの１％を超える、例えば、１００～３００ｎｇ／ｍＬの１％であるような治療効果を達成することができる。。

【0265】

組成物は、組み合わせ組成物として対象に投与するか、または異種ポリヌクレオチドを含む組換えウイルスベクターの同時または連続または連続（前または後）の送達または投与など、別々に投与することができる。本発明は、本発明の方法または使用が、本明細書に記載されるか、または当業者に知られている任意の化合物、薬剤、薬物、治療レジメン、治療プロトコール、プロセス、治療薬または組成物と組み合わせられる組み合わせを提供する。化合物、薬剤、薬物、治療レジメン、治療プロトコール、プロセス、治療薬または組成物は、異種ポリヌクレオチドを含む組換えウイルスベクターの投与前、投与と同時に、または投与後に、対象に投与または実施することができる。

【0266】

したがって、本発明は、とりわけ、別の化合物、薬剤、薬物、治療レジメン、治療プロトコル、プロセス、または治療の必要性または使用の減少をもたらす方法および使用を含む。例えば、血液凝固疾患の場合、本発明による治療方法は、所与の対象において、（異常または変異）対象の内因性凝固因子の欠乏または欠陥を補うための組換え凝固因子タンパク質のより少ない頻度または減少した用量または投与の排除である場合、治療上の利益を有する。別の例では、ポンペ病などのリソソーム蓄積症の場合、本発明による治療方法は、ＧＡＡを含む組換えウイルスベクターのより少ない頻度または減量が以前に投与された、または継続したとしても、治療上の利益を有する。被験者に投与される。したがって、別の治療または療法の必要性または使用を減らすことは、本発明に含まれる。

【0267】

有効量または十分な量は、治療されるすべての対象において有効である必要はなく、所与のグループまたは集団における治療対象の大多数においても有効である必要はない。有効量または十分な量とは、グループや一般集団ではなく、特定の対象における有効性または十分性を意味する。そのような方法に典型的であるように、一部の被験者は、所与の治療方法または使用に対して、より大きな反応を示すか、またはより少ないまたは全く反応を示さないであろう。

【0268】

「改善する」という用語は、対象の疾患またはその症状、あるいは根底にある細胞応答における検出可能または測定可能な改善を意味する。検出可能または測定可能な改善には、疾患の発生、頻度、重症度、進行、または期間の主観的または客観的な減少、減少、抑制、抑制、制限または制御、または疾患によって引き起こされるまたは疾患に関連する合併症、または改善が含まれる病気の症状または根本的な原因または結果、または病気の逆転。ポンペ病の場合、有効量は、例えば、グリコーゲンの産生または蓄積を阻害または低減し、グリコーゲンの分解または除去を増強または増加させ、筋緊張および／または筋力および／または呼吸機能を改善する量であろう。ＨｅｍＡまたはＨｅｍＢの場合、有効量は、例えば、対象における急性出血エピソードの頻度または重症度を減少させる量、または例えば、凝固アッセイによって測定される凝固時間を減少させる量であろう。

【0269】

したがって、本発明の医薬組成物は、意図された治療目的を達成するために有効成分が有効量で含まれる組成物を含む。治療上有効な用量を決定することは、当技術分野で知られている技術およびガイダンスを使用し、本明細書で提供される教示を使用して、熟練した開業医の能力の範囲内である。

【0270】

治療用量は、他の要因の中でも、対象の年齢および全身状態、異常な表現型の重症度、および発現レベルを調節する制御配列の強度に依存するであろう。したがって、ヒトにおける治療上有効な量は、ベクターベースの治療に対する個々の患者の反応に基づいて開業医によって決定され得る比較的広い範囲に入るであろう。そのような用量は、単独で、または免疫抑制剤または薬物と組み合わせて使用することができる。

【0271】

導入遺伝子の発現および任意選択でコードされたタンパク質の産生を可能にするために、医薬組成物などの組成物を対象に送達することができる。特定の実施態様では、対象が治療有効量の血液凝固因子を産生して対象の止血を改善することを可能にするのに十分な遺伝物質を含む医薬組成物。特定の実施態様において、対象が治療有効量のＧＡＡを産生することを可能にするのに十分な異種ポリヌクレオチドを含む医薬組成物。

【0272】

特定の実施態様において、対象における治療効果は、ある期間、例えば、２～４、４～６、６～８、８～１０、１０～１４、１４～２０、２０～２５、２５～３０日、または３０～５０日以上、たとえば、５０～７５、７５～１００、１００～１５０、１５０～２００日以上の間持続される。したがって、特定の実施態様において、組換えウイルスベクターは、治療効果を提供する。

【0273】

特定の実施態様において、組換えウイルスベクターは、免疫抑制剤なしで治療効果を提供する。特定の実施態様において、少なくとも１つの免疫抑制剤は、組換えウイルスベクターの対象への投与の前に、実質的に同時に、または後に、対象に投与される。

【0274】

特定の実施態様において、免疫抑制剤は、抗炎症剤である。特定の実施態様において、免疫抑制剤はステロイドである。特定の実施態様において、免疫抑制剤は、プレドニゾン、シクロスポリン（例えば、シクロスポリンＡ）、ミコフェノール酸、リツキシマブ、ラパマイシンまたはそれらの誘導体である。追加の特定の薬剤には、安定化化合物が含まれる。本発明による方法で使用することができる他の免疫抑制剤には、例えば、限定されないが、Ｂ細胞標的化抗体、例えば、リツキシマブプロテアソーム阻害剤、例えば、ボルテゾミブ；ラパマイシン（ｍＴＯＲ）阻害剤の哺乳類標的、例えば、ラパマイシン；チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブ；Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）の阻害剤；および増殖誘導リガンドの阻害剤（ＡＰＲＩＬ）が含まれる。

【0275】

組成物は、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、および水を含むがこれらに限定されない、任意の無菌の生体適合性医薬担体で投与することができる。組成物は、単独で、または投与量、投与頻度、および／または治療効果に影響を与える他の薬剤と組み合わせて、患者に投与することができる。

【0276】

本発明の方法および使用は、全身的、局所的または局所的に、または任意の経路、例えば注射または注入による送達および投与を含む。インビボでの医薬組成物の送達は、対流増強送達などの他の送達方法が想定されているが、一般に、従来の注射器を使用する注射を介して達成され得る（例えば、米国特許第５，７２０，７２０号を参照のこと）。例えば、組成物は、皮下、表皮、皮内、髄腔内、眼窩内、粘膜内、腹腔内、静脈内、胸膜内、動脈内、経口、肝内、門脈を介して、または筋肉内に送達され得る。他の投与様式には、経口および肺投与、坐剤、および経皮適用が含まれる。血液凝固障害のある患者の治療を専門とする臨床医は、患者の状態および治療の目的（例えば、ＧＡＡの増加、血液凝固の強化など）を含むがこれらに限定されない多くの基準に基づいて、アデノウイルス関連ベクターの投与のための最適な経路を決定することができる。

【0277】

本発明による治療の方法は、所望の治療的、有益な、相加的、相乗的または補完的な活性または効果を有する任意の化合物、薬剤、薬物、治療または他の治療レジメンまたはプロトコルの追加の使用を含む併用療法を含む。例示的な組み合わせ組成物および治療には、生物学的製剤（タンパク質）、薬剤（例えば、免疫抑制剤）および薬物などの第２の活性物質が含まれる。そのような生物学的製剤（タンパク質）、薬剤、薬物、治療および治療は、本発明による他の治療方法、例えば、ポンペ病などのリソソーム貯蔵病、またはＨｅｍＡやＨｅｍＢなどの血液凝固病の対象を治療する治療法の対象を治療する治療方法の前に、実質的に同時に、または後に投与または実施することができる。

【0278】

化合物、薬剤、薬物、治療または他の治療レジメンまたはプロトコールは、組み合わせ組成物として投与するか、または核酸、ベクター、組換えベクター（例えば、組換えウイルスベクター）、または組換えウイルス粒子の送達または投与を同時にまたは連続してまたは連続して（前または後に）など、別々に投与することができる。したがって、本発明は、本発明による治療方法が、本明細書に記載されているか、または当業者に知られている任意の化合物、薬剤、薬物、治療レジメン、治療プロトコール、プロセス、治療薬または組成物と組み合わせている組み合わせを提供する。当業者。化合物、薬剤、薬物、治療レジメン、治療プロトコール、プロセス、治療薬または組成物は、核酸、ベクター、組換えベクター（例えば、組換えウイルスベクター）または本発明に従って患者に投与される組換えウイルス粒子の投与前、投与と同時に、または投与後に投与または実施することができる。

【0279】

特定の実施態様において、対象へのプロテアーゼおよび／またはグリコシダーゼの投与は、中和抗体、異種ポリヌクレオチドに結合する抗体、および／または異種ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質またはペプチドに結合する抗体の発生の防止につながる可能性がある。本明細書に記載のように、そのような対象へのプロテアーゼおよび／またはグリコシダーゼの投与は、ウイルスベクターの投与前、ウイルスベクターの投与時に実質的に同時に、またはウイルスベクターの対象への投与後に行うことができる。

【0280】

特定の実施態様において、既存の抗体を有する対象へのプロテアーゼおよび／またはグリコシダーゼの投与は、中和抗体、異種ポリヌクレオチドに結合する抗体、および／または異種ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質またはペプチドに結合する抗体の減少をもたらす。プロテアーゼおよび／またはグリコシダーゼの投与後、そのような対象は、本明細書の方法に従って組換えウイルスベクターを投与することができる。そのような対象は、組換えウイルスベクターの投与後に残っている既存の抗体の存在について任意選択で評価され得る。あるいは、そのような対象は、プロテアーゼおよび／またはグリコシダーゼが対象におけるそのような既存の抗体を減少または排除する所定の時間が経過した後に、組換えウイルスベクターを投与することができる。

【0281】

特定の実施態様において、組換えウイルスベクターを投与された対象から得られた生物学的サンプル中のそのような抗体の測定によって反映されるように、対象へのプロテアーゼおよび／またはグリコシダーゼの投与は、少なくとも２０％から５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の中和抗体、異種ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質またはペプチドに結合する異種ポリヌクレオチドおよび／または抗体の分解または消化をもたらし得る。特定の実施態様において、本発明による方法は、中和抗体、および／または異種ポリヌクレオチドに結合する抗体、および／または異種ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質またはペプチドに結合する抗体の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％を分解または消化する。

【0282】

分析され得る対象からの生物学的サンプルの非限定的な例には、全血、血清、血漿など、およびそれらの組み合わせが含まれる。生物学的サンプルは、細胞を欠いている場合もあれば、細胞（例えば、赤血球、血小板、および／またはリンパ球）を含む場合もある。

【0283】

特定の実施態様において、対象の生物学的サンプルに存在する中和抗体は、約１：２５未満に分解または消化され得、ここで、２５の緩衝液で希釈された生物学的サンプルの１部は、５０％の組換えウイルスベクター中和をもたらす。特定の実施態様において、対象の生物学的サンプル中に存在する中和抗体は、約１：２０未満、約１：１５未満、約１：１０未満、約１：５未満、約１：４未満、約１：３未満、約１：２未満、または約１：１未満に分解または消化され得、ここで、１部の生物学的サンプルは、それぞれ、２０、１５、１０、５、４、３、２、１部で希釈され、５０％の組換えウイルスベクター中和をもたらす。

【0284】

生物学的サンプル中のＡＡＶ中和抗体の例示的な分析および測定は、本明細書に開示されており、米国特許出願公開第２０１６／０１２３９９０にも記載されている。Ｆｃ受容体への抗体の結合は、平衡結合定数を決定することによって測定できる。抗体のＦｃ受容体結合の減少は、ＩｇＧ：ＦｃＲ相互作用の平衡結合定数の増加によって決定される。

【0285】

本発明による方法は、機能の喪失および獲得および機能の遺伝的欠陥の両方に適用可能である。本明細書で使用される遺伝的欠陥に関する「機能喪失」という用語は、前記遺伝子によってコードされるタンパク質（すなわち、突然変異タンパク質）が通常、野生型タンパク質に関連する機能を部分的または完全な喪失を示す遺伝子の任意の突然変異を指す。本明細書で使用される遺伝的欠陥に関する「機能獲得」という用語は、前記遺伝子によってコードされるタンパク質（すなわち、変異タンパク質）が、通常はタンパク質（すなわち、野生型タンパク質）に関連しない機能を獲得する遺伝子の任意の突然変異を指し、病気または障害を引き起こすか、またはその一因となる。機能獲得型変異は、遺伝子内の１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、追加、または置換である可能性があり、これにより、コードされたタンパク質の機能に変化が生じる。特定の実施態様において、機能獲得型突然変異は、突然変異タンパク質の機能を変化させるか、または他のタンパク質との相互作用を引き起こす。特定の実施態様において、機能獲得型突然変異は、例えば、改変された突然変異タンパク質と前記正常な野生型タンパク質との相互作用によって、正常な野生型タンパク質の減少または除去を引き起こす。

【0286】

本発明による方法によって治療され得る疾患および障害には、例えば、限定されないが、肺疾患（例えば、嚢胞性線維症）、出血性障害（例えば、阻害剤を伴うまたは伴わない血友病Ａまたは血友病Ｂ）、サラセミア、血液障害（例、貧血）、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、てんかん、リソソーム蓄積症（例、アスパルチルグルコサミン尿症、バッテン病、後期乳児神経セロイドリポフスチン症２型（ＣＬＮ２）、シスチン症、ファブリー病、ゴーチャー病タイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、グリコーゲン蓄積症ＩＩ（ポンペ病）、ＧＭ２－ガングリオシドーシスＩ型（テイサックス病）、ＧＭ２－ガングリオシドーシスＩＩ型（サンドホフ病）、ムコリピドーシスタイプＩ（シアリドーシスＩ型およびＩＩ型）、ＩＩ（Ｉ細胞病）、ＩＩＩ（疑似ハーラー病）およびＩＶ、ムコ多糖蓄積症（ハーラー病および変異体、ハンター、サンフィリッポ型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、モルキオ型ＡとＢ、マロトー－ラミー病およびスライ病）、ニーマンピック病タイプＡ／Ｂ、Ｃ１およびＣ２、シンドラー病タイプＩおよびＩＩ）、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）、銅または鉄の蓄積障害（例、ウィルソン病またはメンケス病）、リソソーム酸性リパーゼ欠損症、神経障害または神経変性障害、癌、１型または２型糖尿病、アデノシンデアミナーゼ欠損症、代謝障害（例、グリコーゲン蓄積症）、固形臓器の疾患（例、脳、肝臓、腎臓、心臓）、または感染性ウイルス（例えば、Ｂ型およびＣ型肝炎、ＨＩＶなど）、細菌性または真菌性疾患が含まれる。

【0287】

ポンペ病とも呼ばれるグリコーゲン蓄積症タイプＩＩは、本発明による方法によって治療することができる。ポンペ病は、グリコーゲンの分解を触媒するリソソーム酵素であるα－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）をコードする遺伝子の変異によって引き起こされる常染色体劣性疾患でである。結果として生じる酵素の欠乏は、体のすべての組織におけるグリコーゲンの病理学的蓄積とリソソームの変化を引き起こし、心臓、呼吸器、および骨格筋の機能障害を引き起こす（van der Ploeg&Reuser、2008）。

【0288】

本発明による方法によって治療され得る血液凝固障害には、例えば、これらに限定されないが、血友病Ａ、阻害抗体を伴う血友病Ａ、血友病Ｂ、阻害抗体を伴う血友病Ｂ、任意の凝固因子：ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、Ｖ、ＸＩＩ、ＩＩ、フォンウィルブランド因子、またはＦＶ／ＦＶＩＩＩ欠損症、サラセミア、ビタミンＫエポキシドレダクターゼＣ１欠損症またはガンマカルボキシラーゼ欠損症の組み合わせの欠損が含まれる。

【0289】

本発明による方法によって治療され得る他の疾患および障害には、例えば、これらに限定されないが、貧血、外傷に関連する出血、損傷、血栓症、血小板減少症、脳卒中、凝固障害、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、ヘパリン、低分子量ヘパリン、五糖、ワルファリン、小分子抗血栓薬（すなわち、ＦＸａ阻害剤）、またはベルナール・スリエ症候群、グランツマン血小板無力症、または貯蔵プール欠乏症などの血小板障害に関連する過剰抗凝固が含まれる。

【0290】

特定の実施態様において、対象は、中枢神経系（ＣＮＳ）に影響を与えるか、またはそれに起因する疾患を有する。特定の実施態様では、疾患は神経変性疾患である。ＣＮＳまたは神経変性疾患の非限定的な例には、アルツハイマー病、ハンチントン病、ＡＬＳ、遺伝性痙性片麻痺、原発性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、ケネディ病、ポリグルタミン反復病、またはパーキンソン病が含まれる。特定の実施態様では、疾患は、精神疾患、追加（例えば、タバコ、アルコール、または薬物への）、てんかん、カナバン病、または副腎白質ジストロフィーである。特定の実施態様において、ＣＮＳまたは神経変性疾患は、例えば、これらに限定されないが、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ１、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３、ＳＣＡ６、ＳＣＡ７、またはＳＣＡ１７）などのポリグルタミン反復疾患である。

【0291】

本発明は、ヒトおよび獣医学的用途において使用され得る。したがって、適切な対象には、ヒトなどの哺乳動物、ならびにヒト以外の哺乳動物が含まれる。「対象」という用語は、動物、典型的にはヒトなどの哺乳動物、ヒト以外の霊長類（類人猿、ギボン、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、マカク）、家畜（犬および猫）、家畜（家禽ニワトリやアヒル、馬、牛、山羊、羊、豚など）、実験動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモット）を指す。人間の対象には、胎児、新生児、乳児、若年および成人の被験者が含まれる。対象はまた、動物疾患モデル、例えば、ポンペ病（ＧＡＡの喪失）、およびグリコーゲン貯蔵疾患（ＧＳＤ）および当業者に知られている他のタンパク質／酵素欠損症のマウスおよび他の動物モデルを含む。

【0292】

本発明は、包装材料およびその中の１つまたは複数の構成要素を含むキットなどの組成物を提供する。キットは、典型的には、構成要素の説明またはその中の構成要素のインビトロ、インビボ、またはエクスビボで使用するための説明書を含むラベルまたは包装挿入物を含む。キットは、そのような成分のコレクション、例えば、核酸、組換えベクター、ウイルス（例えば、ＡＡＶ、レンチウイルス）ベクター、またはウイルス粒子、ならびに抗体を分解または消化するプロテアーゼおよび／またはグリコシダーゼを含むことができる。

【0293】

キットは、キットの１つまたは複数の構成要素を収容する物理的構造を指す。包装材料は、コンポーネントを無菌的に維持することができ、そのような目的に一般的に使用される材料（例えば、紙、段ボール、ガラス、プラスチック、ホイル、アンプル、バイアル、チューブなど）で作ることができる。

【0294】

標識または挿入物は、その中の１つまたは複数の成分の識別情報、用量量、作用機序を含む有効成分の臨床薬理学、薬物動態学および薬力学を含むことができる。ラベルまたは挿入物には、製造業者、ロット番号、製造場所と日付、有効期限を識別する情報を含めることができる。ラベルまたは挿入物には、製造業者情報、ロット番号、製造業者の場所および日付を識別する情報を含めることができる。ラベルまたは挿入物には、キットコンポーネントが使用される可能性のある疾患に関する情報を含めることができる。ラベルまたは挿入物は、方法、使用、または治療プロトコルまたは治療レジメンにおいて１つまたは複数のキット構成要素を使用するための臨床医または対象に対する指示を含むことができる。指示には、投与量、頻度または期間、および本明細書に記載の方法、使用、治療プロトコル、または予防的または治療的レジームのいずれかを実施するための指示を含めることができる。

【0295】

ラベルまたは挿入物は、予防的または治療的利益など、構成要素が提供し得る任意の利益に関する情報を含むことができる。ラベルまたは挿入物には、特定の組成物を使用することが適切でない状況に関する被験者または臨床医への警告など、潜在的な有害な副作用、合併症または反応に関する情報を含めることができる。有害な副作用または合併症は、対象が組成物と適合しない可能性のある１つまたは複数の他の薬物を服用している、服用している、または服用している場合、または対象が別の治療プロトコールまたは治療レジメンを服用している、服用している、または服用している場合にも発生する可能性がある。組成物と互換性がないため、指示にはそのような非互換性に関する情報が含まれる可能性がある。

【0296】

ラベルまたは挿入物は、「印刷物」、例えば、紙またはボール紙、または別個であるか、構成要素、キットまたは梱包材（例えば、箱）に貼り付けられるか、またはキット成分を含むアンプル、チューブまたはバイアルに取り付けられることを含む。

【0297】

本発明のいくつかの実施態様が記載されている。それにもかかわらず、当業者は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明を様々な使用法および条件に適合させるために、本発明の様々な変更および修正を行うことができる。したがって、以下の実施例は、いかなる方法でも特許請求される本発明の範囲を説明することを意図しているが、限定することを意図していない。

【実施例0298】

材料と方法
ＡＡＶベクター
ＡＡＶベクターは、以前に記載されたように調製された（Ayuso et al.ら(2010)Gene Ther.17、503-10）。ゲノム含有ベクターは、塩化セシウム勾配精製によるトリプルトランスフェクションプロトコルに従ってローラーボトルで生成された（Ayuso et al.(2010)）。ＡＡＶベクターの滴定は、ＡＢＩＰＲＩＳＭ７９００ＨＴシーケンス検出器でＡｂｓｏｌｕｔｅＲＯＸミックス（Ｔａｑｍａｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、マサチューセッツ州）を使用して実行されるリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって実行された。ただし、空のキャプシドはＳＤＳ－ＰＡＧＥとそれに続く滴定によって滴定された。標準として使用されるＡＡＶキャプシドに対するデンシトメトリーによる銀染色および定量化。インビトロ中和アッセイでは、ルシフェラーゼをコードするＡＡＶ８ベクター（ＡＡＶ８－Ｌｕｃ）を、以前に記載されているようにレポーターとして使用した（Miao et al.(2006)Blood。108,19-27）。インビボ実験で使用されたＡＡＶベクターは、肝臓特異的プロモーターの制御下で、ヒトＦＩＸまたはガウシアルシフェラーゼを発現した（Manno et al.(2006);Mingozzi et al.(2013)Gene Ther. 20、417-24）。

【0299】

ＩｄｅＳエンドペプチダーゼの設計と製造
ＩｄｅＳコーディング配列（ＣＤＳ）を、ｐＥＸ－Ｎ－Ｈｉｓタグ付きクローニングベクター（ＯｒｉＧｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ。、Ｒｏｘｖｉｌｌｅ ＭＤ）にクローン化し、これをメーカーの指示に従いＢＬ２１コンピテントＥ．ｃｏｌｉ（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）に形質転換した。細菌培養物にＩＰＴＧ０．５ｍＭを添加することにより、３７°Ｃで４時間タンパク質発現を誘導した。タンパク質の検出と精製は、それぞれ抗ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ抗体Ａ３－ＡＦ１－０１０（Ｇｅｎｏｖｉｓ）とニッケルアフィニティーカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して行った。エンドトキシンの除去は、ポリ（ε－リジン）樹脂スピンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して実行し、残留エンドトキシン濃度は、Ｅｎｄｏｓａｆｅ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用したＬＡＬテストによって製造元の指示に従って評価した。ＩｄｅＳエンドペプチダーゼは、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２５％ヒトアルブミン、ｐＨ６．６で構成される注射液バッファーで希釈した。

【0300】

細胞培養
２Ｖ６．１１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２７８４）は、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カリフォルニア州カールズバッド）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）において３７℃、５％ＣＯ２条件下で維持され、ＡＡＶ中和アッセイに使用された。

【0301】

ＩｄｅＳによるＩｇＧのｉｎ ｖｉｔｒｏ消化
ＡＡＶ８血清陽性ヒト（ＮＡｂ力価：１：３１．６）およびサル（ＮＡｂ力価：１：１００）またはＩＶＩｇ（ＮＡｂ力価：１：３１６）からの血清を、ＰＢＳで４－４．５ｍｇ／ｍＬＩｇＧに希釈した。５０マイクロリットルの希釈ＩｇＧ（２００μｇ）をＩｄｅＳ（１００ＩＵ、５０ＩＵ／μＬ）またはＰＢＳとともに３７℃で２２時間インキュベートした。抗ＡＡＶ８ＩｇＧは、ＥＬＩＳＡおよび中和アッセイによって測定された。サルＩｇＧの場合、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合したサルＩｇＧのガンマ鎖に特異的な抗体（フィッツジェラルド、米国マサチューセッツ州アクトン）を使用した。

【0302】

抗ヒトＩｇＧＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートをヤギ抗ヒトカッパ抗体（ＰＢＳ中２．５μｇ ｍＬ）でコーティングし、ＰＢＳ－１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックした。市販のＩＶＩｇ調製物を標準として使用して、ＩｇＧサンプルを１／１０希釈でインキュベートした。次に、二次ＨＲＰ標識マウス抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ抗体とｏ－フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）基質を使用して、無傷のＩｇＧを明らかにした。

【0303】

ＡＡＶ抗体アッセイ
抗ＡＡＶ ＩｇＧ捕捉アッセイは、以前に記載されたように実施された（Mingozziら(2013)Sci Transl Med.5、194ra92）。簡単に説明すると、組換えＡＡＶ空キャプシドをコーティングバッファー（３５ｍＭ重炭酸塩、１３ｍＭ炭酸塩、ｐＨ＞９．２）で希釈して、１ｍＬあたり２ｘ１０１０ベクター粒子の最終濃度にした。９６ウェルＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＵＳＡ）の各ウェルに５０マイクロリットルを追加した。精製したヒトＩｇＧ（Ｔｅｇｅｌｉｎｅ、ＬＦＢ、フランス）から作成した標準曲線をプレートに直接加えた。プレートを４°Ｃで一晩コーティングした。翌日、プレートを洗浄バッファー（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０）で３回洗浄し、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ、６％無脂肪ミルク）で室温で２時間ブロックした。プレートを再度洗浄バッファー（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０）で３回洗浄し、ブロッキングバッファーで希釈した血清と３７°Ｃで１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ＨＲＰと結合したヒトＩｇＧの重鎖に特異的な抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＵＳＡ）を３７°Ｃで１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを洗浄バッファーで３回洗浄し、ＯＰＤ基質（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、米国）で明らかにした。反応をＨ２ＳＯ４３Ｍ溶液で停止し、マイクロプレートリーダー（ＥＮＳＰＩＲＥＴＭ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、ウォルサム、米国）を使用して４９２ｎｍで光学密度（ＯＤ）測定を行いた。抗ＡＡＶＩｇＧ濃度は、４パラメーター回帰を使用して特定の標準曲線に対して決定され、結果はＩｇＧのμｇ／ｍＬとして表された。ＮＨＰ研究の場合、標準曲線用の精製サルＩｇＧと、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、Ａｃｔｏｎ、ＭＡ ＵＳＡ）と結合したサルＩｇＧのガンマ鎖に特異的な抗体を使用した。

【0304】

ＡＡＶ中和アッセイ
ＮＡｂアッセイは、以前に記載されたように実施された（Melianiら(2015)Hum Gene Ther Methods.26、45-53）。簡単に説明すると、１日目に、９６ウェルプレートに２ｘ１０４の２Ｖ６．１１細胞／ウェルをポナステロンＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＵＳＡ）の存在下で２４時間播種した。組換えＡＡＶ８－ＣＭＶ－ルシフェラーゼを無血清ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＵＳＡ）で希釈し、血清サンプルの片対数倍段階希釈液とインキュベートした後、３７℃で１時間インキュベートした。続いて、血清－ベクター混合物を細胞に加えた。各希釈は、２回または３回テストされた。２４時間後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性をルミノメーター（ＥＮＳＰＩＲＥＴＭ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、米国ウォルサム）で測定した。形質導入効率は、１秒あたりの相対光単位（ＲＬＵ）として測定された。中和力価は、血清を含まない対照（１００％形質導入）と比較して、ＡＡＶ形質導入を５０％以上阻害した最高の血清希釈として報告された。

【0305】

マウスの研究
マウス研究は、動物の世話および実験に関するフランスおよびヨーロッパの法律（２０１０／６３／ＥＵおよびＣＥ１２－０３７）に従って実施され、地域の制度的倫理委員会によって承認された（プロトコルｎ ２００７－０１４－Ｂ）。

【0306】

６～８週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６マウス、または雄および雌の第ＩＸ因子（ＦＩＸ）欠損血友病Ｂ（ＨＢ）マウスを使用した。すべての実験において、動物は、最終容量１００μＬの９ｍｇのＩＶＩｇ（ＰＲＩＶＩＧＥＮ、ＣＳＬＢｅｈｒｉｎｇ、ＵＳ－ＰＡ）の静脈内注射によって受動免疫された。３０分後、マウスは眼窩後方注射により２５０ＵＩ、５００ＵＩ、または１２５０ＵＩのＩｄｅＳ（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ＵＳ－ＷＩ）を受け取りた。翌日、ＩｄｅＳ注射の３０時間後、すべてのマウスに１ｘ１０^１２ｖｇ／ｋｇ（２ｘ１０^１０ｖｇ／マウス）の用量のＡＡＶ８ベクターを尾静脈経路で注射した。血液サンプル（Ｄ－７、Ｄ＋７、Ｄ＋１４、およびＤ＋２８）は、ヘパリンでコーティングされた毛細管（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、Ｎｕｅｍｂｒｅｃｈｔ、ドイツ）の眼窩後神経叢から、またはサンプルＤ－１＋１５ｍｎの下顎道から収集された。およびＤ０。安楽死時に、肝臓全体が収集され、その後のベクターゲノムコピー数評価のために急速冷凍された。

【0307】

ＮＨＰ研究
ＮＨＰを使用するすべての手順は、施設の動物管理および使用委員会（プロトコル番号２０１８１２０４０９５６５６３７、ＡＰＡＦＩＳ１８０９２）によって承認され、ナント獣医学校（オニリス、ナント、フランス）で実施された。２匹のカニクイザル（Ｍａｃａｃａｆａｃｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ、２～３歳）を、抗ＡＡＶ８中和抗体価（１：１０～１：３１．６）に基づいて選択した。－２日目に、１匹の動物（ＮＨＰ２）にＩｄｅＳ（５００μｇ／ｋｇ）をゆっくりと静脈内注入した。２４時間後（Ｄ－１）、同じプロトコルに従ってＩｄｅＳの２回目の注射を繰り返した。翌日、２回目のＩｄｅＳ注射の２４時間後、２匹のサル（ＮＨＰ１、対照動物、ＮＨＰ２処理動物）に２ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇの用量でＡＡＶ８－ｈＦＩＸベクターを注入した。血液サンプルをＤ－７、Ｄ－２、Ｄ－２＋１０ｈ、Ｄ－１、Ｄ－１＋１０ｈ、Ｄ０で収集し、ＩｇＧ抗体の分解に対するＩｄｅＳ治療の有効性を評価した（Ｄ－２）。治療中およびＡＡＶ投与前（Ｄ０）。Ｄ４、Ｄ７、Ｄ１３、Ｄ２１、Ｄ２８、Ｄ３５、Ｄ５０日目の抗ＡＡＶ８体液性応答と導入遺伝子発現を追跡するために、他の血液サンプルを収集した。安楽死（Ｄ５０）で、肝臓の４つの葉から採取された４つのウェッジ生検が収集され、その後のベクターゲノムコピー数調査のために急速冷凍された。

【0308】

再投与研究のために、２匹のＡＡＶ８血清陽性サルに５ｘ１０^１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ８－ｈＦＩＸベクター（Ｄ０）を注入した。ベクター注射の前に、１匹のサルがＤ－１日目にＩｄｅＳ（５００μｇ／ｋｇ）を１回注射された。その後、両方のサルは、Ｄ８０日とＤ８１日にＩｄｅＳ（５００μｇ／ｋｇ）を二重注射し、Ｄ８２に５ｘ１０^１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ８－ｈＦＩＸベクターを注射した。血液サンプルは、実験中のさまざまな時点で収集された。安楽死（Ｄ１０５）で、ＶＧＣＮ評価のために４つの葉から肝生検が収集された。

【0309】

抗モンキーＩｇＧＥＬＩＳＡ
サルＩｇＧレベルは、サンドイッチ酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定された。簡単に説明すると、捕捉抗体と検出抗体として、それぞれヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とヤギ抗モンキーＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）を使用した。ＯＰＤペルオキシダーゼ基質システム（ＳＩＧＭＡＦＡＳＴＴＭ－ＯＰＤ、Ｓｉｇｍａ）が啓示に使用された。

【0310】

ヒトＦＩＸ ＥＬＩＳＡ
マウス血漿中のヒトＦＩＸ（ｈＦＩＸ）タンパク質レベルは、製造業者の指示に従って測定された。ＥＬＩＳＡアッセイ用の捕捉および二次ＨＲＰ抗体は、Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（Ａｎｃａｓｔｅｒ、Ｃａｎａｄａ）から購入した。 ＮＨＰサンプルでは、抗ｈＦＩＸ抗体（ＭＡＩ－４３０１２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）と抗ｈＦＩＸ－ＨＲＰ抗体（ＣＬ２００４０ＡＰＨＰ、Ｔｅｂｕ－ｂｉｏ、フランス）をそれぞれコーティングと検出に使用した。ｈＦＩＸ抗原レベルは、ＳＩＧＭＡＦＡＳＴ（商標）ＯＰＤ基質（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を製造元の指示に従って追加し、４９２ｎｍの吸光度でＯＤを測定することによって決定された。

【0311】

ベクターゲノムコピー数（ＶＧＣＮ）
肝臓ベクターゲノムコピー数は、肝臓プロモーターおよびマウスのＴｉｔｉｎまたはｅＧｌｏｂｉｎ遺伝子に特異的なプライマーおよびプローブを用いたｑＰＣＲアッセイを使用して決定された。プロモーター特異的プライマーとプローブはＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）によって合成された。マウスチチンとｅＧｌｏｂｉｎは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（米国マサチューセッツ州ウォルサム）によって合成された、マウスとＮＨＰの研究でそれぞれ正規化遺伝子として使用された。ＦａｓｔＰｒｅｐマシン（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）およびＧｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎ Ｂｌｏｏｄ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ｒｅｆ１５８４６７）を使用して、全臓器（マウス）または生検（ＮＨＰ）をホモジナイズした後、組織からＤＮＡを抽出した。各サンプルを３回テストし、２倍体ゲノムあたりのゲノムコピー数を線形化プラスミドで作成した標準曲線に対して決定した。

【0312】

ガウシアルシフェラーゼアッセイ
ＰＢＳ（１：５０）で希釈した５０μＬの血漿サンプルを、白色の９６ウェルマイクロプレート（ＯｐｔｉＰｌａｔｅ－９６ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、米国ウォルサム）にロードした。 ガウシアルシフェラーゼ活性は、ルミノメーター（ENSPIRETM、パーキンエルマー、ウォルサム、米国）で測定された。５０μＬの基質溶液（セレンテラジン、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を自動注入した後、１秒かけて測定を行った。シグナルバックグラウンドは各値から差し引かれた。Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ活性はＲＬＵ／秒として表され、値は繰り返しアッセイからの重複の平均＋／－ＳＤである。

【0313】

テールクリップ出血アッセイ
動物を、ＩＰ送達されたケタミンおよびキシラジンの混合物で麻酔し、腹臥位に置いた。尾の遠位３ｍｍセグメントをメスで切断した。尾は、３７℃に予熱した等張食塩水を含む５０ｍＬ Ｆａｌｃｏｎチューブにすぐに浸した。尾の位置は垂直で、先端は体の水平線から約２ｃｍ下に配置されていた。再出血を検出するために、出血が止まったとしても、各動物を２０分間モニターした。出血時間はストップクロックを使用して決定された。出血のオン／オフサイクルが発生した場合は、２０分の期間内の出血時間の合計が使用された。実験の終わりに、動物は頸椎脱臼によって犠牲にされた。

【実施例0314】

ＡＡＶ８での結果
本発明者らは、最初に、野生型マウスの受動免疫に続いて、すなわち、内因性マウスＩｇＧが存在する状況において、ＩｄｅＳがインビボでヒトＩｇＧを加水分解するかどうかを調査した。野生型マウスにヒトＩｇＧ（ＩＶＩｇ）を注射し、３０分後にＩｄｅＳを注射した。次に、無傷のヒトＩｇＧを、１、６、および２４時間後に収集した血清でテストした（図１）。未処理のマウスにおけるヒトＩｇＧのレベルは、０時間での９．９±１．２ｍｇ／ｍＬ（平均±ＳＤ）から２４時間での３．７±０．６ｍｇ／ｍＬへの時間とともに進行性の低下を示し、マウスにおけるヒトＩｇＧの半減期と一致した（Roopenian et al. (2003) J Immunol. 170, 3528-33）。対照的に、ＩｄｅＳ処理マウスのヒトＩｇＧは、０時間で１１．１±１．０ｍｇ／ｍＬから２４時間で０．７±０．０３ｍｇ／ｍＬへの急速な消失を示した。したがって、ＩｄｅＳによる治療は、注射後６時間と２４時間の両方でヒトＩｇＧの濃度を５分の１に減少させた。

【0315】

インビボで抗ＡＡＶ８ ＩｇＧのレベルを低下させるＩｄｅＳの能力を調査するために、我々は以前に記載された受動免疫モデルを使用した（Ｓｃａｌｌａｎら（２００６））。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに９ｍｇのＩＶＩｇを注射した。３０分後、マウスに未処理の対照群としてＩｄｅＳ（２５０ＵＩ）またはＰＢＳを注射した。ＩｄｅＳ注射の３０時間後、マウスにヒトＦＩＸ導入遺伝子をコードするＡＡＶ８ベクターを注射した。これは１ｘ１０^１２ｖｇ／ｋｇの用量で投与された（図２）。次の治療コホートの表に概説されているように、マウスを４つのグループ（ｎ＝６マウス／グループ）に割り当てた。

【表0】

【0316】

動物をベクター送達後４週間追跡し、ＦＩＸ導入遺伝子発現レベルを測定するために、７、７、１４、２８日目に血漿を収集した（図２）。抗ＡＡＶ８ＩｇＧおよびＮＡｂは、ヒトＩｇＧによる再構成後（Ｄ－１＋１５分）およびＩｄｅＳまたはＰＢＳの注射後（Ｄ０）に採取された血液からの血清で測定された。以前に公開されたように（Scallan et al. (2006)）、ＥＬＩＳＡの両方で検出されたように、ＩＶＩｇにはかなりのレベルの機能的に関連する抗ＡＡＶ８ＩｇＧが含まれていた（図３Ａ、２．５６±０．２１μｇ／ｍＬおよび２．８３±０．２２μｇ／ｍＬ、平均±ＳＤ、それぞれグループ１および２）および中和アッセイ（図３Ｂ、それぞれ１：２２．６［範囲：１：１０～３１．６］力価および１：１９［範囲：１：１０～３１．６］）。ＩｄｅＳの注射により、抗ＡＡＶ８ＩｇＧの循環レベルが大幅に低下した。抗ＡＡＶ８ＩｇＧ（グループ１および２でそれぞれ０．３９±０．１０μｇ／ｍＬおよび１．６７±０．４２μｇ／ｍＬ）およびＡＡＶ８ＮＡｂの減少は、２４時間後にそれぞれ４．３倍および１０倍でした。ＰＢＳで治療したマウス（グループ２）での抗ＡＡＶ８ＩｇＧの経時的なレベルの低下は、マウスでのヒトＩｇＧの自然な除去を表している。

【0317】

次に、ＩＶＩｇまたはＰＢＳで再構成され、ＩｄｅＳまたはＰＢＳで処理された野生型マウスに、ｈＦＩＸをコードするＡＡＶ８ベクターを注射し、ｈＦＩＸ血漿レベルを７、１４および２８日後に測定した。予想通り、抗ＡＡＶ８ ＩｇＧを欠く再構成されていないマウスは、４週間にわたって血中のｈＦＩＸの一定の産生と蓄積を示した（図４Ａ）。これは、マウスの肝臓における実質的な遺伝子コピー数を伴っていた（図４Ｂ）。対照的に、抗ＡＡＶ８中和ＩｇＧを含むヒトＩｇＧで再構成されたマウス（図３Ａ）は、ｈＦＩＸを産生できなかった。興味深いことに、ＩｄｅＳを使用したヒトＩｇＧ再構成マウスの治療は、遺伝子治療後のｈＦＩＸ産生を回復させることができた。曲線下面積を測定することにより評価した場合、ＩｄｅＳ処理マウスで産生されたｈＦＩＸのレベルは、対照の非再構成マウスで産生されたレベルの５０．３１％に相当した（図４Ａ）。したがって、遺伝子コピー数は、ヒトＩｇＧ再構成ＩｄｅＳ処理マウスの肝臓では２．０１６±０．６２０ｖｇ／二倍体細胞であったが（図４Ｂ）、ＩｄｅＳを受け取らないヒトＩｇＧ再構成マウスでは０．００５±０．００２ｖｇ／二倍体細胞であった（Ｐ＝０．００２）。

【0318】

ＩｄｅＳは、非ヒト霊長類を含む異なる種からのＩｇＧを加水分解する。したがって、ＩｄｅＳとＡＡＶ８血清陽性のヒトおよび非ヒト霊長類（ＮＨＰ、サル）の血清サンプルとのインキュベーションが中和抗ＡＡＶ８ＩｇＧを加水分解するかどうかを調査した。図５Ａに示すように、ＩｄｅＳは実際にヒト血清とサル血清の両方で抗ＡＡＶ８ ＩｇＧを加水分解し、２２時間のインキュベーションでサル血清中の抗ＡＡＶ８ ＩｇＧレベルが１５分の１に減少した（０．４２±０．０１μｇ／ＩｄｅＳまたはＰＢＳで処理した場合、それぞれｍＬおよび６．２９±０．１０μｇ／ｍＬ）。抗ＡＡＶ８ＮＡｂ力価は、ＩｄｅＳとインキュベートしたヒト血清でも低下した（図５Ｂ）。サル血清をＩｄｅＳとインキュベートしても、抗ＡＡＶ８ ＮＡｂ力価の低下は観察されませんでしたが、ＩｄｅＳインキュベーション後にこれらの抗体の中和能が７６％から６４％に低下した（図５Ｂ）。抗ＡＡＶＮＡｂ力価の低下が見られないのは、高親和性サル抗ＡＡＶ８ ＩｇＧの機能的なＦ（ａｂ’）２フラグメントがインキュベーション混合物に残っているためである可能性がある。