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特開2024-76253ホルムアルデヒド分解能を有する微生物およびホルムアルデヒドの分解方法。
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024076253
(43)【公開日】2024-06-05
(54)【発明の名称】ホルムアルデヒド分解能を有する微生物およびホルムアルデヒドの分解方法。
(51)【国際特許分類】
C12N 1/20 20060101AFI20240529BHJP
C02F 3/34 20230101ALI20240529BHJP
【ＦＩ】
C12N1/20 A
C12N1/20 F ZNA
C12N1/20 D
C02F3/34 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022187737
(22)【出願日】2022-11-24
(71)【出願人】
【識別番号】304036743
【氏名又は名称】国立大学法人宇都宮大学
(71)【出願人】
【識別番号】500004069
【氏名又は名称】アイオン株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000109
【氏名又は名称】弁理士法人特許事務所サイクス
(72)【発明者】
【氏名】奈須野 恵理
(72)【発明者】
【氏名】加藤 紀弘
(72)【発明者】
【氏名】今泉 好人
(72)【発明者】
【氏名】小船 秀典
【テーマコード（参考）】
4B065
4D040
【Ｆターム（参考）】
4B065AA41X
4B065AC20
4B065BA23
4B065CA56
4D040DD03
4D040DD12
(57)【要約】
【課題】ホルムアルデヒドを分解することができる手段を提供する。
【解決手段】ホルムアルデヒド分解能を有するシュードモナス エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＵＦ１株（受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ－０３７８０）、ＵＦ１株を含むホルムアルデヒド分解用組成物、ならびに、ＵＦ１株を用いる、ホルムアルデヒドの分解方法、および工場排水などのホルムアルデヒド含有水の処理方法。
【選択図】図３
【解決手段】ホルムアルデヒド分解能を有するシュードモナス エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＵＦ１株（受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ－０３７８０）、ＵＦ１株を含むホルムアルデヒド分解用組成物、ならびに、ＵＦ１株を用いる、ホルムアルデヒドの分解方法、および工場排水などのホルムアルデヒド含有水の処理方法。
【選択図】図３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ホルムアルデヒド分解能を有するシュードモナス エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＵＦ１株（受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ－０３７８０）である微生物。
【請求項2】
請求項１に記載の微生物を用いる、ホルムアルデヒドの分解方法。
【請求項3】
ホルムアルデヒド含有水の処理方法であって、請求項１に記載の微生物を用いてホルムアルデヒドの少なくとも一部を分解することを含む処理方法。
【請求項4】
前記ホルムアルデヒド含有水の前記分解前のホルムアルデヒド濃度が１ｇ／Ｌ以上である請求項３に記載の処理方法。
【請求項5】
前記ホルムアルデヒド含有水をｐＨ５．０～９．０に調整する工程、および
ｐＨ調整後の前記ホルムアルデヒド含有水に前記微生物を添加して前記分解を行なう工程を含む請求項３に記載の処理方法。
ｐＨ調整後の前記ホルムアルデヒド含有水に前記微生物を添加して前記分解を行なう工程を含む請求項３に記載の処理方法。
【請求項6】
前記ホルムアルデヒド含有水が工場排水である請求項３～５のいずれか一項に記載の処理方法。
【請求項7】
請求項１に記載の微生物を用いる、ギ酸の分解方法。
【請求項8】
請求項１に記載の微生物を含む、ホルムアルデヒド分解用組成物。
【請求項9】
前記微生物を乾燥菌体として含む、請求項８に記載のホルムアルデヒド分解用組成物。
【請求項10】
さらにリン源を含む、請求項８または９に記載のホルムアルデヒド分解用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ホルムアルデヒド分解能を有する微生物およびこれを用いるホルムアルデヒドの分解方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ホルムアルデヒドは、高い反応性を利用する工業分野での利用、あるいは殺菌力を利用する医療分野での消毒に利用される。その一方で、ホルムアルデヒドは環境汚染物質に指定されているため余剰のホルムアルデヒドは分解除去が求められている。ホルムアルデヒドの分解方法としては、吸着、酸化分解などの化学的な方法と微生物を利用する生物学的分解法が知られている。生物学的分解法においては、殺菌力を有するホルムアルデヒドが高濃度で含まれる排液などの処理では、微生物が死滅する場合がある。また、微生物による分解処理は化学的な方法よりも一般的に長時間を要する。
【0003】
特許文献１においては、真菌を用いた分解処理として、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属する菌を用い、１０００ｐｐｍホルムアルデヒド含有水のホルムアルデヒド濃度を２０時間で１／１０００としたことが開示されている。また、特許文献２においては、ペシロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌、またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ）属に属する菌を用いてホルムアルデヒドを分解したことが開示されている。
【0004】
細菌を用いた報告としては、特許文献３にメチロバクテリウム フジサワエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｕｊｉｓａｗａｅｎｓｅ）に属する微生物が、１．８ｇ／Ｌのホルムアルデヒドを含む廃水において、２４時間で９０％を分解したことについての開示がある。また、非特許文献１に、シュードモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＩＯＦＡ１株による分解試験で０．１ｇ／Ｌのホルムアルデヒドを４０分で分解することが示されている。さらに、非特許文献２および非特許文献３では、土壌サンプルから単離されたシュードモナス プチダＦ６１株がホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性と、ホルムアルデヒドからメタノールおよびギ酸を生成するホルムアルデヒドジスムターゼ活性とを有することについて報告されている。
【0005】
特許文献４では、メチロバクテリウム フジサワエンスに属する微生物を用いる前段処理槽と、シュードモナス プチダに属する微生物を用いる後段処理槽とを有して、被処理水中に含まれるホルムアルデヒドを分解することを特徴とするホルムアルデヒド分解方法が開示されている。特許文献４では、さらに、シュードモナス プチダに属する微生物としてＦＤＲ－１株およびＦＤＲ－２株が開示されており、いずれも、ホルムアルデヒドを効率よく分解可能であるが、０．１％のホルムアルデヒド環境下においては死滅するとの記載がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特開平１１－１９６８５号公報
【特許文献2】特開２００９－５０２０９号公報
【特許文献3】特開２０１４－１５５４６７号公報
【特許文献4】特開２０１９－１８１１８号公報
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Process Biochemistry 51 220-228（2016）
【非特許文献2】Agric. Biol. Chem., 47 (1), 39-46（1983）
【非特許文献3】Eur. J. Biochem., 156, 59-64（1986）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明は、ホルムアルデヒドを分解することができる手段を提供することを課題とする。特に、微生物を利用して水中のホルムアルデヒドを継続的に分解することが可能な手段を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らが上記課題の解決のため、ホルムアルデヒドを排出する工場の排水中の微生物の解析を行なっていたところ、ホルムアルデヒドを短時間で効率良く分解する細菌を発見した。そして、発見された細菌について、さらに検討を重ねて、本発明を完成させた。
具体的には、本発明は以下のとおりである。
具体的には、本発明は以下のとおりである。
【0010】
＜１＞ホルムアルデヒド分解能を有するシュードモナス エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＵＦ１株（受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ－０３７８０）である微生物。
＜２＞＜１＞に記載の微生物を用いる、ホルムアルデヒドの分解方法。
＜３＞ホルムアルデヒド含有水の処理方法であって、＜１＞に記載の微生物を用いてホルムアルデヒドの少なくとも一部を分解することを含む処理方法。
＜４＞上記ホルムアルデヒド含有水の上記分解前のホルムアルデヒド濃度が１ｇ／Ｌ以上である＜３＞に記載の処理方法。
＜５＞上記ホルムアルデヒド含有水をｐＨ５．０～９．０に調整する工程、および
ｐＨ調整後の上記ホルムアルデヒド含有水に上記微生物を添加して上記分解を行なう工程を含む＜３＞または＜４＞に記載の処理方法。
＜６＞上記ホルムアルデヒド含有水が工場排水である＜３＞～＜５＞のいずれかに記載の処理方法。
＜７＞＜１＞に記載の微生物を用いる、ギ酸の分解方法。
＜８＞＜１＞に記載の微生物を含む、ホルムアルデヒド分解用組成物。
＜９＞上記微生物を乾燥菌体として含む、＜８＞に記載のホルムアルデヒド分解用組成物。
＜１０＞さらにリン源を含む、＜８＞または＜９＞に記載のホルムアルデヒド分解用組成物。
＜２＞＜１＞に記載の微生物を用いる、ホルムアルデヒドの分解方法。
＜３＞ホルムアルデヒド含有水の処理方法であって、＜１＞に記載の微生物を用いてホルムアルデヒドの少なくとも一部を分解することを含む処理方法。
＜４＞上記ホルムアルデヒド含有水の上記分解前のホルムアルデヒド濃度が１ｇ／Ｌ以上である＜３＞に記載の処理方法。
＜５＞上記ホルムアルデヒド含有水をｐＨ５．０～９．０に調整する工程、および
ｐＨ調整後の上記ホルムアルデヒド含有水に上記微生物を添加して上記分解を行なう工程を含む＜３＞または＜４＞に記載の処理方法。
＜６＞上記ホルムアルデヒド含有水が工場排水である＜３＞～＜５＞のいずれかに記載の処理方法。
＜７＞＜１＞に記載の微生物を用いる、ギ酸の分解方法。
＜８＞＜１＞に記載の微生物を含む、ホルムアルデヒド分解用組成物。
＜９＞上記微生物を乾燥菌体として含む、＜８＞に記載のホルムアルデヒド分解用組成物。
＜１０＞さらにリン源を含む、＜８＞または＜９＞に記載のホルムアルデヒド分解用組成物。
【発明の効果】
【0011】
本発明により水中のホルムアルデヒドを継続的に分解することができる微生物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】ＵＦ１株の１６Ｓ－ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（配列番号１）を示す図である。
【図2】ＵＦ１株の生菌体による培地中の０．１５％（１．５ｇ／Ｌ）ホルムアルデヒド（ＦＡ）分解試験の結果を示すグラフである。
【図3】ＵＦ１株の生菌体による培地中の０．４％（４ｇ／Ｌ）ホルムアルデヒド（ＦＡ）分解試験の結果を示すグラフである。
【図4】ＵＦ１株の生菌体による工場排水中の０．０９％（０．９ｇ／Ｌ）ホルムアルデヒド（ＦＡ）分解試験の結果を示すグラフである。
【図5】ＵＦ１株の乾燥菌体による工場排水中の０．１１％（１．１ｇ／Ｌ）ホルムアルデヒド（ＦＡ）分解試験の結果を示すグラフである。
【図6】ホルムアルデヒド存在下での菌体濃度（ＯＤ600）の経時変化およびホルムアルデヒド（ＦＡ）濃度の経時変化を、シュードモナス プチダＦ６１株とＵＦ１株とで比較した結果を示すグラフである。
【図7】ホルムアルデヒド存在下でのホルムアルデヒド（ＦＡ）濃度とギ酸濃度の経時変化を、シュードモナス プチダＦ６１株とＵＦ１株とで比較した結果を示すグラフである。
【図8】ＵＦ１株の生菌体によるホルムアルデヒド（ＦＡ）分解の、添加成分による差異を示すグラフである。
【図9】ＵＦ１株の乾燥菌体によるホルムアルデヒド（ＦＡ）分解の、リン源濃度による差異を示すグラフである。
【図10】ＵＦ１株の乾燥菌体によるホルムアルデヒド（ＦＡ）分解の、リン源種による差異を示すグラフである。
【図11】ＵＦ１株の増殖およびＵＦ１株によるホルムアルデヒド（ＦＡ）分解におけるｐＨ依存性評価結果を示すグラフである。図中、点が菌体濃度（ＯＤ600）を示し、棒グラフがＦＡ濃度を示す。
【図12】低温培養におけるＵＦ１株の増殖（Ａ）とＵＦ１株によるホルムアルデヒド（ＦＡ）分解（Ｂ）とを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0013】
以下、本発明を詳細に説明する。
【0014】
＜ホルムアルデヒド分解能を有する微生物＞
本発明者らは、ホルムアルデヒドを使用する工場（日本国茨城県）の排水中の微生物からホルムアルデヒドを短時間で分解する微生物株を見出し「ＵＦ１株」と命名した。
なお、本明細書において、ホルムアルデヒドを分解するとは、後述のように、ホルムアルデヒドから、ギ酸、またはメタノールおよびギ酸を生成させること、ならびに、さらに二酸化炭素等を生成させることを含む意味である。
本発明者らは、ホルムアルデヒドを使用する工場（日本国茨城県）の排水中の微生物からホルムアルデヒドを短時間で分解する微生物株を見出し「ＵＦ１株」と命名した。
なお、本明細書において、ホルムアルデヒドを分解するとは、後述のように、ホルムアルデヒドから、ギ酸、またはメタノールおよびギ酸を生成させること、ならびに、さらに二酸化炭素等を生成させることを含む意味である。
【0015】
ＵＦ１株は、１６Ｓ－ｒＤＮＡが配列表の配列番号１に示す塩基配列を有する。この塩基配列の相同性検索の結果から、ＵＦ１株は、シュードモナス エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）と同定された。また、ＵＦ１株に対して全ゲノムＤＮＡの配列決定を行ったところ、１つの環状ゲノムＤＮＡ（５．７Ｍｂｐ）と１つの環状プラスミドＤＮＡ（１３１ｋｂｐ）の構築に成功した。配列データベースに対して相同性検索を実行すると、相同性が最も高いシュードモナス エスピーＳＫ２の完全長ゲノムＤＮＡ（５．４Ｍｂｐ）に対してわずか７．１９％の相同性しか示さなかったことから、ＵＦ１株は新規であることがわかった。
【0016】
この株は受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ－０３７８０として、２０２２年１１月１１日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室）に、国立大学法人宇都宮大学（日本国栃木県宇都宮市峰町３５０番地）により、寄託されている。
【0017】
本発明の微生物のＵＦ１株は、以下の科学的性質を有する細菌である。
・寒天培地上で通常はクリーム色でドーム状のコロニーを形成する。ただし、－８０℃で保管されているグリセロールストックを爪楊枝または白金耳でかきとって寒天培地上に接種し、一晩３０℃で培養した際に、通常の形状ではなく薄く広がったコロニーを形成することがある。
・ホルムアルデヒドの分解活性・資化性を有する。
・ホルムアルデヒド含有培地で生育可能である。
・以下の培養条件で培養可能である。
培地：酵母エキス０．２５ｇ、ペプトン０．５ｇ、ＮａＣｌ ０．２５ｇ、蒸留水 １Ｌ、必要に応じてアガー１５ｇ
培養温度：３０℃
培養期間：１６～１８時間
培養方法：好気性条件下・振とう培養
・寒天培地上で通常はクリーム色でドーム状のコロニーを形成する。ただし、－８０℃で保管されているグリセロールストックを爪楊枝または白金耳でかきとって寒天培地上に接種し、一晩３０℃で培養した際に、通常の形状ではなく薄く広がったコロニーを形成することがある。
・ホルムアルデヒドの分解活性・資化性を有する。
・ホルムアルデヒド含有培地で生育可能である。
・以下の培養条件で培養可能である。
培地：酵母エキス０．２５ｇ、ペプトン０．５ｇ、ＮａＣｌ ０．２５ｇ、蒸留水 １Ｌ、必要に応じてアガー１５ｇ
培養温度：３０℃
培養期間：１６～１８時間
培養方法：好気性条件下・振とう培養
【0018】
本発明の微生物ＵＦ１株のゲノムＤＮＡにはホルムアルデヒドジスムターゼ（Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ；ＦＤＭ）の遺伝子が存在し、この遺伝子は、非特許文献２および非特許文献３に記載のシュードモナス プチダＦ６１株のホルムアルデヒドジスムターゼ（ＦＤＭ）（EC 1. 2. 99. 4）（Biosci.Biotech.Biochem.,59(2).197-202,1995）遺伝子と同一の塩基配列を有する。
【0019】
ホルムアルデヒドジスムターゼ（ＦＤＭ）は、２分子のホルムアルデヒドからメタノールとギ酸を１分子ずつ生成する不均化反応を触媒する酸化還元酵素である。ホルムアルデヒドの酸化反応と還元反応を連続的に触媒しているため、ホルムアルデヒドを基質とした反応の内部で補酵素を再生することが可能である。また、類縁な酸化還元酵素とは異なり、補酵素と強く結合するため生理的ｐＨ付近ではほとんど解離しないニコチノプロテインであることが知られている。これらの性質から、外因性の電子受容体を必要とすることなく酸化還元反応を進行させることが可能であり、また補酵素の再生サイクルを必要としないため工業利用に有用であると期待されている。しかし、ＦＤＭの工業利用についてはギ酸の生成や補酵素の再生機構に利用するものが報告されているが、依然として少ないのが現状である。
【0020】
なお、シュードモナス プチダに属する複数の菌株は、ホルムアルデヒドを分解するメチロトローフ細菌として報告されている。シュードモナス プチダＩＯＦＡ１はその一例であり、ＦＤＭ活性を有するかどうかは不明であるが、非特許文献１では、ホルムアルデヒド分解能とともにメタノール代謝能を有することが示唆されている。
【0021】
ＵＦ１株のゲノムＤＮＡにはEC1.2.1.46に分類されるホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；ＦＬＤＨ）の遺伝子が３つ存在する。
【0022】
ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＦＬＤＨ）として登録のある酵素としては、グルタチオン依存性のホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（EC1.2.1.1）とグルタチオン非依存性のホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（EC1.2.1.46）の２種類が存在し、それぞれ異なる反応を触媒する酵素である。
【0023】
EC1.2.1.46に分類されているＦＬＤＨの最初の報告は、Ｍ．Ａｎｄｏらによってシュードモナス プチダＣ－８３株から得られたグルタチオン非依存性のホルムアルデヒド脱水素酵素である（J. Biochem. 85, 1165-1172 (1979)）。Ｃ－８３株由来のＦＬＤＨはグルタチオンの外部添加を必要とせず、補酵素としてＮＡＤ+を用いるピンポンメカニズムにより反応を進行させることが示された。この反応ではホルムアルデヒドが直接ギ酸へと酸化されることが特徴であり、反応したホルムアルデヒドと等モルのギ酸が生成する。
【0024】
本発明の微生物ＵＦ１株は上記のＦＤＭおよびＦＬＤＨの活性により、ホルムアルデヒドをギ酸に酸化する機能を有する。実施例で示すように、ＵＦ１株はホルムアルデヒド分解時にギ酸を蓄積していなかった。したがって、ＵＦ１株は、ギ酸を分解する酵素も保有していると考えられる。
【0025】
本発明の微生物ＵＦ１株のホルムアルデヒドの分解能は、実施例で示すように、ＦＤＭ活性を示すＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌として公知のシュードモナス プチダＦ６１株のホルムアルデヒドの分解能よりも高く、本発明の微生物を用いて、より短時間で高効率のホルムアルデヒド分解を実現することができる。
【0026】
また、本発明の微生物ＵＦ１株は、０．１％（１ｇ／Ｌ）以上のホルムアルデヒドを含む水の中でも生育および増殖可能であり、かつホルムアルデヒド分解能を有する。
【0027】
本発明の微生物は生菌体であっても乾燥菌体であってもよい。いずれもホルムアルデヒドの分解に用いることができる。乾燥菌体は、例えば、生菌体を凍結乾燥または減圧乾燥することにより調製することができる。菌体の凍結乾燥については、例えば、Biosci. Biotechnol. Biochem., 80(11), 2264-2270 (2016)に記載がある。
【0028】
＜ホルムアルデヒド分解用組成物＞
本発明の微生物は、これを含むホルムアルデヒド分解用組成物として提供することもできる。
本発明の微生物は培養増殖後、所望の濃度でホルムアルデヒド分解用組成物の調製に用いることができる。
ホルムアルデヒド分解用組成物の形態としては、懸濁液があげられる。また、乾燥菌体を用いる場合において、粉末などの固体形状で提供されていてもよい。ホルムアルデヒド分解用組成物には、本発明の微生物の生育および増殖に好ましい成分の１種または２種以上が添加されていてもよい。このような成分としては、窒素源、リン源などがあげられる。炭素源としては、グルコース、マンノース、マンニット、キシロース、フルクトース、ガラクトース、およびそれらの２種以上の組み合わせ等があげられる。窒素源としては、塩化アンモニウム、各種アミノ酸、トリプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、ペプトン、コーンスティープリカーおよびそれらの２種以上の組み合わせ等があげられる。リン源としては、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ2ＨＰＯ4）およびリン酸二水素カリウム（ＫＨ2ＰＯ4）などがあげられる。
本発明の微生物は、これを含むホルムアルデヒド分解用組成物として提供することもできる。
本発明の微生物は培養増殖後、所望の濃度でホルムアルデヒド分解用組成物の調製に用いることができる。
ホルムアルデヒド分解用組成物の形態としては、懸濁液があげられる。また、乾燥菌体を用いる場合において、粉末などの固体形状で提供されていてもよい。ホルムアルデヒド分解用組成物には、本発明の微生物の生育および増殖に好ましい成分の１種または２種以上が添加されていてもよい。このような成分としては、窒素源、リン源などがあげられる。炭素源としては、グルコース、マンノース、マンニット、キシロース、フルクトース、ガラクトース、およびそれらの２種以上の組み合わせ等があげられる。窒素源としては、塩化アンモニウム、各種アミノ酸、トリプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、ペプトン、コーンスティープリカーおよびそれらの２種以上の組み合わせ等があげられる。リン源としては、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ2ＨＰＯ4）およびリン酸二水素カリウム（ＫＨ2ＰＯ4）などがあげられる。
【0029】
本発明の微生物は炭素源としてはホルムアルデヒドを利用するため、その他の炭素源は不要であるが、必要に応じて、グルコース、マンノース、マンニット、キシロース、フルクトース、ガラクトース、およびそれらの２種以上の組み合わせ等の炭素源を添加してもよい。
【0030】
後述の実施例で示すように、本発明の微生物によるホルムアルデヒドの分解にはリン源を含むことが好ましい。したがって、ホルムアルデヒド分解処理を行なう対象物（工場排水等の被処理水等）がリン源を含まない場合、ホルムアルデヒド分解用組成物は少なくとも一種のリン源を含むことが好ましい。
【0031】
ホルムアルデヒド分解用組成物において、本発明の微生物は、担体に吸着していてもよい。担体としては、公知の有機担体および無機担体を用いることができる。例えば、有機コンポスト、ポリビニルアセタール系スポンジ、フスマ、イナワラ、モミガラ、発泡ケイ酸、ケイソウ土、パーライト、貝化石、石灰石、シリカゲルビーズの単体またはそれらの２種以上の組み合わせをあげることができる。微生物は懸濁液または希釈液として担体と混合するか、または担体に噴霧することで担体に吸着させることができる。
【0032】
＜ホルムアルデヒドの分解方法＞
本発明の微生物はホルムアルデヒドの分解方法に用いることができる。具体的には、本発明の微生物をホルムアルデヒドを含有する水、ホルムアルデヒドを含有する汚泥、ホルムアルデヒドを含有する土壌、ホルムアルデヒドを含有する気体等に接触させることにより、ホルムアルデヒドを分解することができる。
本発明の微生物はホルムアルデヒドの分解方法に用いることができる。具体的には、本発明の微生物をホルムアルデヒドを含有する水、ホルムアルデヒドを含有する汚泥、ホルムアルデヒドを含有する土壌、ホルムアルデヒドを含有する気体等に接触させることにより、ホルムアルデヒドを分解することができる。
【0033】
本発明の微生物は特に水中に溶解するホルムアルデヒドの分解に用いることが好ましい。ホルムアルデヒドを含有する水は、ホルムアルデヒド以外の成分を含む溶液や懸濁液であってもよい。ホルムアルデヒドを含有する水におけるホルムアルデヒド濃度は特に限定されないが、本発明の微生物は、例えば１．０％（１０ｇ／Ｌ）までのホルムアルデヒドを含む水、特に０．６％（６ｇ／Ｌ）までのホルムアルデヒドを含む水の処理に用いることができる。ホルムアルデヒド濃度の下限は特にないが、本発明の微生物は、例えば０．５ｇ／Ｌ～４ｇ／Ｌでホルムアルデヒドを含む水の処理に好ましく用いることができる。ホルムアルデヒドを含有する水の例としては工場や病院などの排水があげられる。本明細書において、いずれかの成分を含有し、本発明の微生物を用いて分解処理対象とする水を「被処理水」ということがある。
【0034】
被処理水に本発明の微生物を添加して懸濁させることにより、被処理水と微生物を接触させることができる。被処理水における本発明の微生物の濃度（初期濃度）はホルムアルデヒド分解活性が維持される濃度である限り特に限定されないが、例えば、被処理水の光学密度（ＯＤ600）が０．０１～１０となる範囲であればよい。微生物の初期濃度の調節によって、分解に要する時間を調整することができる。
なお、光学密度（ＯＤ）は、分光光度計などの光学的手段によって計測された、入射光強度Ｉ0と透過光強度Ｉとの比、ｌｏｇ10（Ｉ0／Ｉ）として定義される。下付き数字６００は測定波長（ｎｍ）を表す。
なお、光学密度（ＯＤ）は、分光光度計などの光学的手段によって計測された、入射光強度Ｉ0と透過光強度Ｉとの比、ｌｏｇ10（Ｉ0／Ｉ）として定義される。下付き数字６００は測定波長（ｎｍ）を表す。
【0035】
被処理水には、ホルムアルデヒドの分解の促進のため、または微生物の生育および増殖のために存在することが好ましい他の成分を加えてもよい。これらの成分を含む上述のホルムアルデヒド分解用組成物を用いてもよい。他の成分としては、上述の窒素源やリン源があげられる。特にリン源を添加することが好ましい。リン源は、被処理水におけるリン元素濃度が１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、好ましくは２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、より好ましくは３０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、さらに好ましくは３５ｍｍｏｌ／Ｌ以上となるように添加すればよい。例えば、増殖能を失った本発明の微生物（乾燥菌体など）を使用する場合であっても、被処理水にリンを含む成分を添加することで微生物由来の酵素活性により一定期間ホルムアルデヒド分解能を維持することができる。
本発明の微生物によるホルムアルデヒドの分解は、上記の好ましい他の成分を既に含んでいる被処理水についても行なうことができる。したがって、成分の添加は、被処理水が含有する成分に応じて行なうことが好ましい。
本発明の微生物によるホルムアルデヒドの分解は、上記の好ましい他の成分を既に含んでいる被処理水についても行なうことができる。したがって、成分の添加は、被処理水が含有する成分に応じて行なうことが好ましい。
【0036】
被処理水はｐＨ４以上であることが好ましい。ｐＨ４以上において、本発明の微生物はホルムアルデヒド分解活性を示すことができる。また処理されるホルムアルデヒドを含有する水はｐＨ５以上であることがより好ましい。ｐＨ５以上において、菌体を増殖させながらホルムアルデヒド分解を進めることができる。また、被処理水は、ｐＨ１０．０以下であることが好ましく、ｐＨ９．５以下であることがより好ましい。
本発明の微生物を用いたホルムアルデヒドの分解方法は、被処理水と微生物を接触させる工程の前に被処理水を所望のｐＨ（例えばｐＨ５．０～９．０）に調整する工程を含むことも好ましい。
本発明の微生物を用いたホルムアルデヒドの分解方法は、被処理水と微生物を接触させる工程の前に被処理水を所望のｐＨ（例えばｐＨ５．０～９．０）に調整する工程を含むことも好ましい。
【0037】
本発明の微生物を用いたホルムアルデヒドの分解方法における温度条件は微生物のホルムアルデヒド分解活性が維持される温度である限り特に限定されず、例えば－１０℃～４５℃の範囲で使用することができる。
【0038】
本発明の微生物が添加された被処理水は静置してもよいが、分解反応を促進するため振とうや曝気などで十分に撹拌することが好ましい。ホルムアルデヒド分解に要する時間は、被処理水のホルムアルデヒド濃度、添加される微生物の濃度、必要とされる分解の程度によって異なるが通常１時間～１日の範囲となるように調整することができる。
【0039】
＜微生物の用途＞
本発明の微生物は、上述のように、ホルムアルデヒドの分解方法に用いることができる。したがって、本発明の微生物は、例えば、ホルムアルデヒドを含有する水の処理に使用することができる。ホルムアルデヒドを含有する水としては、工場もしくは病院などからの排水またはその他の排水があげられる。本明細書においてホルムアルデヒドを含有する水の処理とは、ホルムアルデヒドを少なくとも一部分解して、水中のホルムアルデヒド濃度を低減させることをいう。ホルムアルデヒドを含有する水の処理方法は、ホルムアルデヒドの分解による当該水の浄化方法ということもできる。本発明の微生物を用いることによって、被処理水のホルムアルデヒド濃度は大幅に低減が可能であり、初期ホルムアルデヒド濃度や菌体濃度などに依存するが、ホルムアルデヒド濃度を初期濃度の１０％以下、さらには５％以下とすることも可能である。
本発明の微生物は、例えば、ホルムアルデヒドを排出する工場の排水処理施設における曝気槽に濃密度で存在させ、排水中のホルムアルデヒドの分解に利用することができる。
本発明の微生物は、上述のように、ホルムアルデヒドの分解方法に用いることができる。したがって、本発明の微生物は、例えば、ホルムアルデヒドを含有する水の処理に使用することができる。ホルムアルデヒドを含有する水としては、工場もしくは病院などからの排水またはその他の排水があげられる。本明細書においてホルムアルデヒドを含有する水の処理とは、ホルムアルデヒドを少なくとも一部分解して、水中のホルムアルデヒド濃度を低減させることをいう。ホルムアルデヒドを含有する水の処理方法は、ホルムアルデヒドの分解による当該水の浄化方法ということもできる。本発明の微生物を用いることによって、被処理水のホルムアルデヒド濃度は大幅に低減が可能であり、初期ホルムアルデヒド濃度や菌体濃度などに依存するが、ホルムアルデヒド濃度を初期濃度の１０％以下、さらには５％以下とすることも可能である。
本発明の微生物は、例えば、ホルムアルデヒドを排出する工場の排水処理施設における曝気槽に濃密度で存在させ、排水中のホルムアルデヒドの分解に利用することができる。
【実施例0040】
以下に実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明する。以下の実施例に示す材料、試薬、物質量とその割合、操作等は本発明の趣旨から逸脱しない限り適宜変更することができる。従って、本発明の範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【0041】
＜ＵＦ１株の単離＞
日本国茨城県内のホルムアルデヒドを排出する工場の排水を活性汚泥処理する曝気槽から採取した排水を孔径０．２μｍのセルロースフィルターでろ過した。裁断したフィルターを０．０１％（０．１ｇ／Ｌ）ホルムアルデヒド含有培地（ペプトン：０．５ｇ／Ｌ、酵母エキス：０．２５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ：０．２５ｇ／Ｌ）に浸漬し、３０℃にて２日間振とう培養した。この培養液を適宜希釈し０．０５％（０．５ｇ／Ｌ）ホルムアルデヒド含有寒天培地に塗布し、３０℃で３日間静置培養した。培養の結果、数種類のコロニーが生じた。Ｎａｓｈ法（１９５３年）により培養液中の残留ホルムアルデヒドを定量し、これらの単離した菌株についてホルムアルデヒド分解能を調べた。このうち、コロニーを０．１％（１ｇ／Ｌ）ホルムアルデヒド含有培地に接種して３０℃で振とう培養した条件で最も速くホルムアルデヒドを分解して増殖した１種を「ＵＦ１株」と命名した。
日本国茨城県内のホルムアルデヒドを排出する工場の排水を活性汚泥処理する曝気槽から採取した排水を孔径０．２μｍのセルロースフィルターでろ過した。裁断したフィルターを０．０１％（０．１ｇ／Ｌ）ホルムアルデヒド含有培地（ペプトン：０．５ｇ／Ｌ、酵母エキス：０．２５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ：０．２５ｇ／Ｌ）に浸漬し、３０℃にて２日間振とう培養した。この培養液を適宜希釈し０．０５％（０．５ｇ／Ｌ）ホルムアルデヒド含有寒天培地に塗布し、３０℃で３日間静置培養した。培養の結果、数種類のコロニーが生じた。Ｎａｓｈ法（１９５３年）により培養液中の残留ホルムアルデヒドを定量し、これらの単離した菌株についてホルムアルデヒド分解能を調べた。このうち、コロニーを０．１％（１ｇ／Ｌ）ホルムアルデヒド含有培地に接種して３０℃で振とう培養した条件で最も速くホルムアルデヒドを分解して増殖した１種を「ＵＦ１株」と命名した。
【0042】
＜ＵＦ１株の解析＞
次に、ＵＦ１株に対して全ゲノムＤＮＡの配列決定を行った。まず、菌体より抽出したゲノムＤＮＡを適切な長さに断片化し、各断片の末端に短いタグ配列を付与したゲノムＤＮＡライブラリーを調製した。このライブラリーに含まれるＤＮＡ断片の塩基配列を、次世代シーケンサーを用いて網羅的に決定し、それらの塩基配列情報から完全長ゲノムＤＮＡと１つの環状プラスミドＤＮＡを構築した。これらの塩基配列情報のうち、１６Ｓ－ｒＲＮＡ遺伝子（１５３２ｂｐ）の塩基配列データを図１に示す。
次に、ＵＦ１株に対して全ゲノムＤＮＡの配列決定を行った。まず、菌体より抽出したゲノムＤＮＡを適切な長さに断片化し、各断片の末端に短いタグ配列を付与したゲノムＤＮＡライブラリーを調製した。このライブラリーに含まれるＤＮＡ断片の塩基配列を、次世代シーケンサーを用いて網羅的に決定し、それらの塩基配列情報から完全長ゲノムＤＮＡと１つの環状プラスミドＤＮＡを構築した。これらの塩基配列情報のうち、１６Ｓ－ｒＲＮＡ遺伝子（１５３２ｂｐ）の塩基配列データを図１に示す。
【0043】
上記方法で得られた１６Ｓ－ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列データは、相同性検索ソフト：ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用いてデータベースに登録されている既知の塩基配列に対する相同性検索を実施した。その結果、ＵＦ１株はシュードモナス エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、シュードモナス モンテイリイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｏｎｔｅｉｌｉｉ）、シュードモナス プレコグロッシシダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｌｅｃｏｇｌｏｓｓｉｃｉｄａ）、シュードモナス アシアティカ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｓｉａｔｉｃａ）、シュードモナス シラジカ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｈｉｒａｚｉｃａ）、シュードモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）のゲノムＤＮＡの一部および１６Ｓ－ｒＲＮＡ遺伝子と１００．００％（１５３２ｂｐ／１５３２ｂｐ）の相同性を示した。
以上の結果から、ＵＦ１株をシュードモナス エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）と同定した。
以上の結果から、ＵＦ１株をシュードモナス エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）と同定した。
【0044】
また、上述した方法でＵＦ１株の全ゲノムＤＮＡの配列を決定した結果、１つの環状ゲノムＤＮＡ（５．７Ｍｂｐ）と１つの環状プラスミドＤＮＡ（１３１ｋｂｐ）の構築に成功した。配列データベースに対して相同性検索を実行すると、相同性が最も高いシュードモナス エスピーＳＫ２の完全長ゲノムＤＮＡ（５．４Ｍｂｐ）に対してわずか７．１９％の相同性しか示さなかったことから、ＵＦ１株の新規性が担保された。また、ＵＦ１株のゲノムＤＮＡにはEC1.2.1.46に分類されるＦＬＤＨ（ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ）の遺伝子が３つ見出された。
【0045】
さらに、ＵＦ１株由来ＦＤＭの存在の確認を行なった。ホルムアルデヒド分解活性が知られているシュードモナス プチダＦ６１株（Agric. Biol. Chem., 47 (1), 39-46, 1983;Biosci.Biotech.Biochem.,59(2).197-202,1995）のホルムアルデヒドジスムターゼ（ＦＤＭ）の塩基配列と相同性の高いシュードモナス属細菌由来の既知のホルムアルデヒドジスムターゼの３種の遺伝子ｆｄｍの塩基配列を参考にしてＵＦ１株のＦＤＭをコードする遺伝子を増幅するためのプライマーを設計し、ＰＣＲ増幅した。配列解析を行なった結果、ＵＦ１株のｆｄｍ遺伝子の塩基配列はシュードモナス プチダＦ６１株のホルムアルデヒドジスムターゼ（ＦＤＭ）（EC 1. 2. 99. 4）の遺伝子配列と１００％一致した。ＵＦ１株のｆｄｍ遺伝子についてはＰＣＲ増幅断片を用いてさらにクローニングを行い酵素タンパク質を得て、活性を確認した。
【0046】
＜ＵＦ１株を用いたホルムアルデヒドの分解試験＞
分解試験では、ＵＦ１株として、特に記載の無い場合は、以下の手順で寒天培地に生じたコロニーの菌体またはさらに液体培地で培養した菌体を用いた。
ＵＦ１株をＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）寒天培地に接種し、３０℃で１日間培養し、生じたコロニーの菌体を少量採取した。４ｍＬのＬＢ液体培地に接種し、３０℃にて約１６時間振とう培養した。培養液のＯＤ600が０．１となるように、０．１％（１ｇ／Ｌ）ホルムアルデヒド含有ＬＢ培地に菌体を接種し、３０℃で振とう培養（２４０ｒｐｍ）した。
また、実際の工場排水を用いた分解試験としては、ホルムアルデヒドを排出する工場の中和槽由来実排水（ホルムアルデヒド含有量０．１２％（１．２ｇ／Ｌ），ｐＨ９）を用いた試験を行なった（分解試験例３を除く）。
分解試験では、ＵＦ１株として、特に記載の無い場合は、以下の手順で寒天培地に生じたコロニーの菌体またはさらに液体培地で培養した菌体を用いた。
ＵＦ１株をＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）寒天培地に接種し、３０℃で１日間培養し、生じたコロニーの菌体を少量採取した。４ｍＬのＬＢ液体培地に接種し、３０℃にて約１６時間振とう培養した。培養液のＯＤ600が０．１となるように、０．１％（１ｇ／Ｌ）ホルムアルデヒド含有ＬＢ培地に菌体を接種し、３０℃で振とう培養（２４０ｒｐｍ）した。
また、実際の工場排水を用いた分解試験としては、ホルムアルデヒドを排出する工場の中和槽由来実排水（ホルムアルデヒド含有量０．１２％（１．２ｇ／Ｌ），ｐＨ９）を用いた試験を行なった（分解試験例３を除く）。
【0047】
培養液中のホルムアルデヒド濃度は、Ｎａｓｈ法（１９５３年）により定量した。具体的には、ホルムアルデヒド分解試験の培養液を遠心分離後、上澄み液を超純水で適宜希釈した。培養液希釈液０．５ｍＬに等量のアセチルアセトン溶液（酢酸アンモニウム：１５０ｇ／Ｌ、酢酸：３ｍＬ／Ｌ、アセチルアセトン：２ｍＬ／Ｌを含有）を加え、６０℃で１０分間放置した。反応液中に生じた３，５－ジアセチル－１，４－ジヒドロルチジン（ＤＤＬ）を含む水溶液の４１５ｎｍにおける吸光度Ａ415を分光光度計にて測定することで残留ホルムアルデヒド濃度を算出した。
【0048】
［分解試験例１］
０．１５％（１．５ｇ／Ｌ）ホルムアルデヒド含有ＬＢ培地１Ｌが充填されたジャーファーメンターにＵＦ１株を初期菌体濃度がＯＤ600＝１．０となるように接種し、３０℃にて曝気（１．５Ｌ／分）と撹拌（２００ｒｐｍ）条件で培養した。結果を図２に示す。図２において、ホルムアルデヒドは培養３時間後に９９％が分解された。
０．１５％（１．５ｇ／Ｌ）ホルムアルデヒド含有ＬＢ培地１Ｌが充填されたジャーファーメンターにＵＦ１株を初期菌体濃度がＯＤ600＝１．０となるように接種し、３０℃にて曝気（１．５Ｌ／分）と撹拌（２００ｒｐｍ）条件で培養した。結果を図２に示す。図２において、ホルムアルデヒドは培養３時間後に９９％が分解された。
【0049】
［分解試験例２］
０．４％（４ｇ／Ｌ）ホルムアルデヒド含有ＬＢ培地にＵＦ１株を初期菌体濃度がＯＤ600＝４．８となるように接種し、３０℃にて振とう培養（２４０ｒｐｍ）した。結果を図３に示す。図３において、ホルムアルデヒドは培養２時間で１００％が分解された。
０．４％（４ｇ／Ｌ）ホルムアルデヒド含有ＬＢ培地にＵＦ１株を初期菌体濃度がＯＤ600＝４．８となるように接種し、３０℃にて振とう培養（２４０ｒｐｍ）した。結果を図３に示す。図３において、ホルムアルデヒドは培養２時間で１００％が分解された。
【0050】
［分解試験例３］
実際の工場排水（ｐＨ０．９）をあらかじめ中和しｐＨ７としたものを用いてホルムアルデヒド分解試験を行った。この中和した工場排水にはホルムアルデヒド以外に微生物の分解対象となる他の成分も含まれている。工場排水のホルムアルデヒド濃度は約１ｇ／Ｌ（０．９ｇ／Ｌ）であった。この工場排水１ＬにＵＦ１株を初期菌体濃度がＯＤ600＝１．０となるよう接種し、３０℃、２００ｒｐｍ、曝気量１．５Ｌ／分の条件でジャーファーメンター内で分解試験を実施した（図４）。その結果、排水中のホルムアルデヒドは、培養３時間で９６％が分解された。
実際の工場排水（ｐＨ０．９）をあらかじめ中和しｐＨ７としたものを用いてホルムアルデヒド分解試験を行った。この中和した工場排水にはホルムアルデヒド以外に微生物の分解対象となる他の成分も含まれている。工場排水のホルムアルデヒド濃度は約１ｇ／Ｌ（０．９ｇ／Ｌ）であった。この工場排水１ＬにＵＦ１株を初期菌体濃度がＯＤ600＝１．０となるよう接種し、３０℃、２００ｒｐｍ、曝気量１．５Ｌ／分の条件でジャーファーメンター内で分解試験を実施した（図４）。その結果、排水中のホルムアルデヒドは、培養３時間で９６％が分解された。
【0051】
［分解試験例４］
ＵＦ１株の乾燥粉末を用いたホルムアルデヒドの分解試験を実施した。乾燥粉末は以下の手順で調製した。寒天培地上のＵＦ１株のコロニーをＬＢ液体培地４ｍＬに接種し、３０℃で１８時間振とう培養（２４０ｒｐｍ）した。この培養液を１ＬのＬＢ培地を充填したジャーファーメンターに添加し、３０℃、２００ｒｐｍ、曝気量１．５Ｌ／分の条件で１６時間培養した。培養液を遠心分離し、菌体は蒸留水で３回洗浄してから薬さじでかきとり、ガラス皿に薄く塗り広げてデシケーター内に設置し、１２時間以上減圧乾燥した。ガラス皿から乾燥菌体をかきとって回収し、乳鉢で細粒化して冷蔵庫内で保存した。なお、この調製方法において培養液を遠心分離する操作以降は無菌操作ではない。
ＵＦ１株の乾燥粉末を用いたホルムアルデヒドの分解試験を実施した。乾燥粉末は以下の手順で調製した。寒天培地上のＵＦ１株のコロニーをＬＢ液体培地４ｍＬに接種し、３０℃で１８時間振とう培養（２４０ｒｐｍ）した。この培養液を１ＬのＬＢ培地を充填したジャーファーメンターに添加し、３０℃、２００ｒｐｍ、曝気量１．５Ｌ／分の条件で１６時間培養した。培養液を遠心分離し、菌体は蒸留水で３回洗浄してから薬さじでかきとり、ガラス皿に薄く塗り広げてデシケーター内に設置し、１２時間以上減圧乾燥した。ガラス皿から乾燥菌体をかきとって回収し、乳鉢で細粒化して冷蔵庫内で保存した。なお、この調製方法において培養液を遠心分離する操作以降は無菌操作ではない。
【0052】
約１ｇ／Ｌ（１．１ｇ／Ｌ）ホルムアルデヒド含有工場排水１Ｌに初期菌体濃度がＯＤ600＝１．０となるように上記の方法で粉末化したＵＦ１株の乾燥菌体を接種し、３０℃にて曝気と撹拌をしながらジャーファーメンター内で分解試験を実施した。結果を図５に示す。排水中のホルムアルデヒドは、培養３時間で９２％、６時間で９６％が分解された。
【0053】
［従来株との比較１］
シュードモナス プチダＦ６１株の菌体を理化学研究所微生物材料開発室（ＪＣＭ）から入手し、ＵＦ１株とのホルムアルデヒド存在下での菌体濃度の変化およびホルムアルデヒド分解活性を比較した。初期菌体濃度がＯＤ600＝０．１となるように、シュードモナス プチダＦ６１株とＵＦ１株の前培養液を１ｇ／Ｌホルムアルデヒド含有培地にそれぞれ植菌した。これらを振とう培養し（３０℃、２３４ｒｐｍ）、所定時間後にサンプリングして光学密度（ＯＤ600）と残留ホルムアルデヒド濃度を測定した。結果を図６に示す。なお、ホルムアルデヒドを全く分解できないネガティブコントロールとして、エシェリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の生菌体を用いた結果も示す。図６より明らかであるように、ＵＦ１株はホルムアルデヒド分解速度、増殖速度がシュードモナス プチダＦ６１株より速かった。
シュードモナス プチダＦ６１株の菌体を理化学研究所微生物材料開発室（ＪＣＭ）から入手し、ＵＦ１株とのホルムアルデヒド存在下での菌体濃度の変化およびホルムアルデヒド分解活性を比較した。初期菌体濃度がＯＤ600＝０．１となるように、シュードモナス プチダＦ６１株とＵＦ１株の前培養液を１ｇ／Ｌホルムアルデヒド含有培地にそれぞれ植菌した。これらを振とう培養し（３０℃、２３４ｒｐｍ）、所定時間後にサンプリングして光学密度（ＯＤ600）と残留ホルムアルデヒド濃度を測定した。結果を図６に示す。なお、ホルムアルデヒドを全く分解できないネガティブコントロールとして、エシェリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の生菌体を用いた結果も示す。図６より明らかであるように、ＵＦ１株はホルムアルデヒド分解速度、増殖速度がシュードモナス プチダＦ６１株より速かった。
【0054】
［従来株との比較２］
ホルムアルデヒドジスムターゼ（ＦＤＭ）活性によりホルムアルデヒドの消失にともなってギ酸が生じることがシュードモナス プチダＦ６１株で報告されている（非特許文献２）ことから、ＵＦ１株についてもギ酸の生成を解析した。結果を図７に示す。
ホルムアルデヒドジスムターゼ（ＦＤＭ）活性によりホルムアルデヒドの消失にともなってギ酸が生じることがシュードモナス プチダＦ６１株で報告されている（非特許文献２）ことから、ＵＦ１株についてもギ酸の生成を解析した。結果を図７に示す。
【0055】
Ｆ６１株と同様にＵＦ１株もホルムアルデヒド濃度の減少に伴いギ酸が検出された。しかし、ギ酸濃度はどちらの株においても約１時間で頭うちとなりそれ以上の濃度の増加は確認されなかった。検出されたギ酸は、ホルムアルデヒド消失量の２分の１等量よりも明らかに少ない。これは、両菌株がホルムアルデヒドの分解によって生成したギ酸を二酸化炭素へと酸化する酵素を保有していることを示唆している。ＵＦ１株は培養開始から６時間後にはホルムアルデヒドとギ酸の両方がほぼ完全に消失したことから、Ｆ６１株と比べてギ酸の酸化速度も速いことが示された。
ギ酸も高濃度では細胞毒性を有することから、ＵＦ１株を用いることでギ酸の蓄積なしにホルムアルデヒドを処理可能となることが期待される。
ギ酸も高濃度では細胞毒性を有することから、ＵＦ１株を用いることでギ酸の蓄積なしにホルムアルデヒドを処理可能となることが期待される。
【0056】
［ＵＦ１株の初期菌体濃度とホルムアルデヒドの分解速度・分解上限濃度の関係］
初期菌体濃度をＯＤ600＝１．０となるようにする代わりにＯＤ600＝０．０１とし、初期ホルムアルデヒド濃度を約０．０８％（０．８ｇ／Ｌ）となるようにした以外は分解試験例１と同様の条件でホルムアルデヒド分解試験を行なったところ、０．８ｇ／Ｌのホルムアルデヒドを９５％以上分解するのに要する時間は３０時間であった。分解試験例１の３時間と比較して長時間を要した。また、初期菌体濃度をＯＤ600＝０．１となるようにした以外は分解試験例１と同様の条件でホルムアルデヒド分解試験を行なったところ、完全分解上限ホルムアルデヒド濃度が０．３％（３ｇ／Ｌ）であった。ＯＤ600＝１．０では０．５％（５ｇ／Ｌ）に増加した。
初期菌体濃度をＯＤ600＝１．０となるようにする代わりにＯＤ600＝０．０１とし、初期ホルムアルデヒド濃度を約０．０８％（０．８ｇ／Ｌ）となるようにした以外は分解試験例１と同様の条件でホルムアルデヒド分解試験を行なったところ、０．８ｇ／Ｌのホルムアルデヒドを９５％以上分解するのに要する時間は３０時間であった。分解試験例１の３時間と比較して長時間を要した。また、初期菌体濃度をＯＤ600＝０．１となるようにした以外は分解試験例１と同様の条件でホルムアルデヒド分解試験を行なったところ、完全分解上限ホルムアルデヒド濃度が０．３％（３ｇ／Ｌ）であった。ＯＤ600＝１．０では０．５％（５ｇ／Ｌ）に増加した。
【0057】
［ＵＦ１株生菌体によるホルムアルデヒド分解に必須の成分］
ＬＢ寒天プレートに生えたＵＦ１株のコロニーをＬＢ液体培地４ｍＬに接種し、３０℃で一晩振とう培養（２３４ｒｐｍ，１８時間）し前培養液の光学密度ＯＤ600を測定した。オートクレーブ滅菌した水道水、純水またはＭ９最小塩培地（リン酸水素二ナトリウム：６．８ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム：３ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム：０．５ｇ／Ｌ、塩化アンモニウム：１ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム：０．１２ｇ／Ｌ、塩酸チアミン：０．００１ｇ／Ｌ）を溶媒として、塩化アンモニウム（窒素源）、リン酸水素二ナトリウム（リン源）、リン酸二水素カリウム（リン源）を所定の組成で添加した。そこへそれぞれＯＤ600＝１．０となるようにＵＦ１株の前培養液を植菌し、最後にホルムアルデヒドを終濃度が３ｇ／Ｌとなるように添加した。これらを一晩振とう培養（３０℃，２３４ｒｐｍ，１８時間）した後に培養液をサンプリングし、光学密度（ＯＤ600）とホルムアルデヒド濃度を測定した。結果を図８に示す。
ＬＢ寒天プレートに生えたＵＦ１株のコロニーをＬＢ液体培地４ｍＬに接種し、３０℃で一晩振とう培養（２３４ｒｐｍ，１８時間）し前培養液の光学密度ＯＤ600を測定した。オートクレーブ滅菌した水道水、純水またはＭ９最小塩培地（リン酸水素二ナトリウム：６．８ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム：３ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム：０．５ｇ／Ｌ、塩化アンモニウム：１ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム：０．１２ｇ／Ｌ、塩酸チアミン：０．００１ｇ／Ｌ）を溶媒として、塩化アンモニウム（窒素源）、リン酸水素二ナトリウム（リン源）、リン酸二水素カリウム（リン源）を所定の組成で添加した。そこへそれぞれＯＤ600＝１．０となるようにＵＦ１株の前培養液を植菌し、最後にホルムアルデヒドを終濃度が３ｇ／Ｌとなるように添加した。これらを一晩振とう培養（３０℃，２３４ｒｐｍ，１８時間）した後に培養液をサンプリングし、光学密度（ＯＤ600）とホルムアルデヒド濃度を測定した。結果を図８に示す。
【0058】
約３ｇ／Ｌのホルムアルデヒド（０時間の濃度未測定）を単一炭素源とする最小塩培地（Ｍ９培地）ではホルムアルデヒドがほぼ完全に分解されたのに対して、オートクレーブ滅菌した水道水ではわずかしかホルムアルデヒドは分解されなかった。また、Ｍ９培地組成から２種類のリン源を除いた場合と純水に窒素源のみを添加した場合でもホルムアルデヒドはわずかしか分解されなかったことから、ＵＦ１株のホルムアルデヒド分解には窒素源ではなくリン源が必要である可能性が示された。３ｇ／Ｌのホルムアルデヒドは２種類のリン源濃度が合計３５ｍｍｏｌ／Ｌ以上でほぼ完全に分解されることが示された。
【0059】
本試験ではどの条件下でも菌体濃度の上昇は見られなかったが、これはＵＦ１株が増殖できるほどの栄養が培地に含まれていなかったためであると推察される。なお、中和槽由来実排水（ホルムアルデヒド濃度：１．２ｇ／Ｌ，ｐＨ９）にＵＦ１株を植菌して３０℃で振とう培養した場合でもホルムアルデヒドをほぼ完全に分解可能であった。したがって、排水中にはホルムアルデヒドの分解に必要な成分は十分に含まれていると推察した。
【0060】
［乾燥菌体を用いた実排水ホルムアルデヒド分解試験］
ＵＦ１株生菌体はホルムアルデヒド濃度が１．２ｇ／Ｌである中和槽由来実排水（ｐＨ９）中のホルムアルデヒドを分解できたにも関わらず、乾燥菌体では同じ排水中のホルムアルデヒドを十分に分解できなかった。この違いは、生菌体が増殖する過程でホルムアルデヒドの分解に必要な成分を補給していることに起因すると考えられる。そこで、上記の結果も踏まえて乾燥菌体が排水中のホルムアルデヒドを分解可能なリン源の下限濃度を特定した。
ＵＦ１株生菌体はホルムアルデヒド濃度が１．２ｇ／Ｌである中和槽由来実排水（ｐＨ９）中のホルムアルデヒドを分解できたにも関わらず、乾燥菌体では同じ排水中のホルムアルデヒドを十分に分解できなかった。この違いは、生菌体が増殖する過程でホルムアルデヒドの分解に必要な成分を補給していることに起因すると考えられる。そこで、上記の結果も踏まえて乾燥菌体が排水中のホルムアルデヒドを分解可能なリン源の下限濃度を特定した。
【0061】
リン酸水素二ナトリウムとリン酸二水素カリウムを中和槽から採水したホルムアルデヒド含有実排水（ホルムアルデヒド濃度：１．２ｇ／Ｌ，ｐＨ９）４ｍＬに添加して合計したリン源が０，１７．５，３５，７０ｍｍｏｌ／Ｌになるようそれぞれ調整した。ここに乾燥菌体をＯＤ600＝１．０となるようにそれぞれ添加した。これらを一晩振とう（３０℃，２３４ｒｐｍ，１８時間）し、培養液を１ｍＬずつサンプリングし、光学密度（ＯＤ600）とホルムアルデヒド濃度を測定した。結果を図９に示す。
【0062】
図９より、乾燥菌体でも３５ｍｍｏｌ／Ｌ以上のリンを添加することで１ｇ／Ｌのホルムアルデヒドをほぼ完全に分解可能であることが示された。なお、光学密度（ＯＤ600）が減少していたことから、乾燥菌体に含まれるＵＦ１株はほぼ死滅していると推察される。
【0063】
［乾燥菌体のホルムアルデヒド分解におけるリン源の必要性評価］
Ｍ９最小塩培地は中性付近のｐＨとするために２種類のリン源が添加されているが、ＵＦ１株乾燥菌体によるホルムアルデヒド除去には両方のリン源が必要とは限らない。そこで、中和槽実排水（ホルムアルデヒド濃度：１．２ｇ／Ｌ，ｐＨ９）４ｍＬにリン酸水素二ナトリウムまたはリン酸二水素カリウムを終濃度が５０ｍｍｏｌ／Ｌとなるよう添加した。そこへＵＦ１株乾燥菌体を添加（ＯＤ600＝１．０）して３０℃，１８時間振とうし、１ｍＬをサンプリングしてホルムアルデヒド濃度を測定した。なお、リン酸水素二ナトリウムおよびリン酸二水素カリウムを同時添加した条件、リン酸水素二ナトリウムのみを添加した条件、およびリン酸二水素カリウムのみを添加した条件で、中和槽実排水の初期ｐＨはそれぞれ約７、８、６であった。結果を図１０に示す。
Ｍ９最小塩培地は中性付近のｐＨとするために２種類のリン源が添加されているが、ＵＦ１株乾燥菌体によるホルムアルデヒド除去には両方のリン源が必要とは限らない。そこで、中和槽実排水（ホルムアルデヒド濃度：１．２ｇ／Ｌ，ｐＨ９）４ｍＬにリン酸水素二ナトリウムまたはリン酸二水素カリウムを終濃度が５０ｍｍｏｌ／Ｌとなるよう添加した。そこへＵＦ１株乾燥菌体を添加（ＯＤ600＝１．０）して３０℃，１８時間振とうし、１ｍＬをサンプリングしてホルムアルデヒド濃度を測定した。なお、リン酸水素二ナトリウムおよびリン酸二水素カリウムを同時添加した条件、リン酸水素二ナトリウムのみを添加した条件、およびリン酸二水素カリウムのみを添加した条件で、中和槽実排水の初期ｐＨはそれぞれ約７、８、６であった。結果を図１０に示す。
【0064】
図１０からわかるように、乾燥菌体を用いて１．２ｇ／Ｌのホルムアルデヒドをほぼ完全に分解する上でリン源の種類に制約はなかった。この結果から、例えば、ｐＨ１以下の強酸性実排水に含まれるホルムアルデヒドを分解する場合などにおいては、わずかでも中和効果を有する塩基性のリン酸水素二ナトリウム（Ｎａ2ＨＰＯ4）をリン源として選択することが好ましいと考えられる。
【0065】
［ＵＦ１株のホルムアルデヒド分解活性におけるｐＨ依存性評価］
寒天プレートに生えたＵＦ１株のコロニーをＬＢ液体培地４ｍＬに接種し、３０℃で３時間振とう培養後に終濃度が０．５ｇ／Ｌとなるようホルムアルデヒドを添加してから引き続き３０℃で一晩振とう培養した。前培養液の光学密度（ＯＤ600）を測定し、硫酸によりｐＨ調整したホルムアルデヒド含有（終濃度１ｇ／Ｌ）培地４ｍＬ（ｐＨ＝３，４，５，６，７（Ｃｎｔｒоｌ））にＯＤ600＝１．０となるようそれぞれ植菌した。これらを一晩振とう培養（３０℃，２３４ｒｐｍ，１８時間）した後に培養液をサンプリングし、光学密度（ＯＤ600）とホルムアルデヒド濃度を測定した。結果を図１１に示す。
寒天プレートに生えたＵＦ１株のコロニーをＬＢ液体培地４ｍＬに接種し、３０℃で３時間振とう培養後に終濃度が０．５ｇ／Ｌとなるようホルムアルデヒドを添加してから引き続き３０℃で一晩振とう培養した。前培養液の光学密度（ＯＤ600）を測定し、硫酸によりｐＨ調整したホルムアルデヒド含有（終濃度１ｇ／Ｌ）培地４ｍＬ（ｐＨ＝３，４，５，６，７（Ｃｎｔｒоｌ））にＯＤ600＝１．０となるようそれぞれ植菌した。これらを一晩振とう培養（３０℃，２３４ｒｐｍ，１８時間）した後に培養液をサンプリングし、光学密度（ＯＤ600）とホルムアルデヒド濃度を測定した。結果を図１１に示す。
【0066】
図１１からわかるように、培地の初期ｐＨが４以上で１ｇ／Ｌのホルムアルデヒドが１８時間後にほぼ分解されたのに対して、初期ｐＨが３の場合は１８時間後でもホルムアルデヒドはわずかしか分解されなかった。また、培地の初期ｐＨが５以上で有意な菌体の増殖が確認された。しかし、初期ｐＨが４以下の場合は１８時間が経過しても菌体の増殖は見られなかった。
【0067】
［ＵＦ１株のホルムアルデヒド分解における温度依存性評価］
寒天プレートに生えたＵＦ１株のコロニーをＬＢ液体培地４ｍＬに接種し、３０℃で３時間振とう培養後に終濃度が０．５ｇ／Ｌとなるようにホルムアルデヒドを添加してから引き続き３０℃で一晩振とう培養した。前培養液の光学密度（ＯＤ600）を測定し、ホルムアルデヒド未添加または３ｇ／Ｌホルムアルデヒド含有培地４ｍＬにＯＤ600＝１．０となるよう植菌した。これらを５℃または１０℃の低温条件下で一晩振とう培養（２３４ｒｐｍ，１８時間）した後に培養液をサンプリングし、光学密度（ＯＤ600）とホルムアルデヒド濃度を測定した。結果を図１２に示す。
寒天プレートに生えたＵＦ１株のコロニーをＬＢ液体培地４ｍＬに接種し、３０℃で３時間振とう培養後に終濃度が０．５ｇ／Ｌとなるようにホルムアルデヒドを添加してから引き続き３０℃で一晩振とう培養した。前培養液の光学密度（ＯＤ600）を測定し、ホルムアルデヒド未添加または３ｇ／Ｌホルムアルデヒド含有培地４ｍＬにＯＤ600＝１．０となるよう植菌した。これらを５℃または１０℃の低温条件下で一晩振とう培養（２３４ｒｐｍ，１８時間）した後に培養液をサンプリングし、光学密度（ＯＤ600）とホルムアルデヒド濃度を測定した。結果を図１２に示す。
【0068】
【産業上の利用可能性】
【0069】
本発明により水中のホルムアルデヒドを継続的に分解することができる微生物が提供される。この微生物を用いて、例えば、工場の排水処理を行なうことができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】