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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024077685
(43)【公開日】2024-06-10
(54)【発明の名称】遺伝子解析方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6869 20180101AFI20240603BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALI20240603BHJP
C12Q 1/686 20180101ALN20240603BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20240603BHJP
C12N 15/63 20060101ALN20240603BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6869 Z ZNA
C12Q1/6876 Z
C12Q1/686 Z
C12N15/11 Z
C12N15/63 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】6
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022189772
(22)【出願日】2022-11-29
(71)【出願人】
【識別番号】301022471
【氏名又は名称】国立研究開発法人情報通信研究機構
(74)【代理人】
【識別番号】110001195
【氏名又は名称】弁理士法人深見特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】佐藤 耕世
(72)【発明者】
【氏名】山元 大輔
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA13
4B063QQ53
4B063QR48
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS34
4B063QX02
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ｍＲＮＡが少量であっても十分な精度で解析可能な遺伝子解析方法を提供する。
【解決手段】改変体リボソームと該リボソームに結合している対象ｍＲＮＡとを含む、分析対象細胞に由来する細胞溶解物を準備する工程と、細胞溶解物において、改変体リボソームと第一結合タンパク質とを接触させ、リボソームを回収する、第一回収工程と、回収されたリボソームと第二結合タンパク質とを接触させ、リボソームを回収する、第二回収工程と、回収されたリボソームに結合している対象ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅する工程と、増幅したｃＤＮＡを解析する工程とを含む遺伝子解析方法であって、改変体リボソームは、改変体ＲｐＬ１０ａを含み、ＲｐＬ１０ａは、リボソームタンパク質Ｌ１０ａ領域と、第一結合タンパク質に特異的に認識される第一タグ領域と、第二結合タンパク質に特異的に認識される第二タグ領域とを含む、遺伝子解析方法。
【選択図】図２
【解決手段】改変体リボソームと該リボソームに結合している対象ｍＲＮＡとを含む、分析対象細胞に由来する細胞溶解物を準備する工程と、細胞溶解物において、改変体リボソームと第一結合タンパク質とを接触させ、リボソームを回収する、第一回収工程と、回収されたリボソームと第二結合タンパク質とを接触させ、リボソームを回収する、第二回収工程と、回収されたリボソームに結合している対象ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅する工程と、増幅したｃＤＮＡを解析する工程とを含む遺伝子解析方法であって、改変体リボソームは、改変体ＲｐＬ１０ａを含み、ＲｐＬ１０ａは、リボソームタンパク質Ｌ１０ａ領域と、第一結合タンパク質に特異的に認識される第一タグ領域と、第二結合タンパク質に特異的に認識される第二タグ領域とを含む、遺伝子解析方法。
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
改変体リボソームと前記改変体リボソームに結合している対象ｍＲＮＡとを含む、分析対象細胞に由来する細胞溶解物を準備する、準備工程と、
前記細胞溶解物において、前記改変体リボソームと第一結合タンパク質とを接触させ、前記改変体リボソームを回収する、第一回収工程と、
回収された前記改変体リボソームと第二結合タンパク質とを接触させ、前記改変体リボソームを回収する、第二回収工程と、
回収された前記改変体リボソームに結合している前記対象ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅する、増幅工程と、
増幅した前記ｃＤＮＡを解析する、解析工程とを含む、遺伝子解析方法であって、
前記改変体リボソームは、改変体ＲｐＬ１０ａを含み、
前記改変体ＲｐＬ１０ａは、リボソームタンパク質Ｌ１０ａ領域と、前記第一結合タンパク質に特異的に認識される第一タグ領域と、前記第二結合タンパク質に特異的に認識される第二タグ領域とを含む、遺伝子解析方法。
前記細胞溶解物において、前記改変体リボソームと第一結合タンパク質とを接触させ、前記改変体リボソームを回収する、第一回収工程と、
回収された前記改変体リボソームと第二結合タンパク質とを接触させ、前記改変体リボソームを回収する、第二回収工程と、
回収された前記改変体リボソームに結合している前記対象ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅する、増幅工程と、
増幅した前記ｃＤＮＡを解析する、解析工程とを含む、遺伝子解析方法であって、
前記改変体リボソームは、改変体ＲｐＬ１０ａを含み、
前記改変体ＲｐＬ１０ａは、リボソームタンパク質Ｌ１０ａ領域と、前記第一結合タンパク質に特異的に認識される第一タグ領域と、前記第二結合タンパク質に特異的に認識される第二タグ領域とを含む、遺伝子解析方法。
【請求項2】
前記第一タグ領域及び前記第二タグ領域は、それぞれ独立に、ＧＦＰ、ＨＡ、ＦＬＡＧ、ＭＹＣ、ＡｌＦＡ－ｔａｇ及びこれらの改変体からなる群より選ばれ、
前記第一タグ領域及び前記第二タグ領域は、互いに異なる、請求項１に記載の遺伝子解析方法。
前記第一タグ領域及び前記第二タグ領域は、互いに異なる、請求項１に記載の遺伝子解析方法。
【請求項3】
前記第一結合タンパク質及び前記第二結合タンパク質は、それぞれ独立に、抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、アルパカＶＨＨ抗体、及びＮａｎｏｂｏｄｙからなる群より選ばれる、請求項１又は請求項２に記載の遺伝子解析方法。
【請求項4】
前記第二回収工程の後であって、かつ前記増幅工程の前に、回収された前記改変体リボソームと第三結合タンパク質とを接触させ、前記改変体リボソームを回収する、第三回収工程を更に含み、
前記改変体ＲｐＬ１０ａは、前記第三結合タンパク質に特異的に認識される第三タグ領域を更に含む、請求項１又は請求項２に記載の遺伝子解析方法。
前記改変体ＲｐＬ１０ａは、前記第三結合タンパク質に特異的に認識される第三タグ領域を更に含む、請求項１又は請求項２に記載の遺伝子解析方法。
【請求項5】
前記分析対象細胞の数は、１０以上１５００以下である、請求項１又は請求項２に記載の遺伝子解析方法。
【請求項6】
請求項１又は請求項２に記載の遺伝子解析方法に用いられるキットであって、
前記改変体ＲｐＬ１０ａをコードする塩基配列を含む発現ベクターと、
オリゴ（ｄＴ）プライマーと、
を含む、キット。
前記改変体ＲｐＬ１０ａをコードする塩基配列を含む発現ベクターと、
オリゴ（ｄＴ）プライマーと、
を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、遺伝子解析方法に関する。
【背景技術】
【0002】
リボソームは、約８０種類のリボソーム構成タンパク質と数本のリボソームＲＮＡが集まってできたタンパク質－ＲＮＡ複合体である。上記リボソームは、細胞内でメッセンジャーＲＮＡ（以下、「ｍＲＮＡ」と表記する場合がある。）に結合して、結合したｍＲＮＡの塩基配列に基づいてタンパク質を合成する。このタンパク質の合成は、「翻訳」とも呼ばれる。興味のある細胞の中でどのようなｍＲＮＡがタンパク質に翻訳されているかを知るためには、その細胞内でリボソームに結合しているｍＲＮＡを選択的に取り出す手法が有効である。この手法が、リボソーム親和性精製（Ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，略称ＴＲＡＰ）である。ＴＲＡＰによって、細胞中に含まれるリボソーム－ｍＲＮＡ複合体（ポリソーム）を抽出した後、抽出したポリソームを用いて今まさにタンパク質へと翻訳中のｍＲＮＡを次世代シーケンサー（ＮＧＳ）によってトランスクリプトーム解析する手法がＴＲＡＰ－ｓｅｑである。ＴＲＡＰ及びＴＲＡＰ－ｓｅｑは、遺伝子発現解析手法のひとつとして、基礎分野、応用分野を問わず、さまざまな生物種の組織又は器官を対象として使用されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0003】
【非特許文献1】Ｋｅｌｖｉｎ Ｘｉ Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｒａｐｉｄ Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｏｍｅ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ Ｇｒｏｗｔｈ Ｃｏｎｅｓ ｔｏ Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｔｅｒｍｉｎａｌｓ，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１６，ｖｏｌ．１４，１２５８－１２７１．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
ＴＲＡＰおよび、それを用いたＴＲＡＰ－ｓｅｑは、Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ大学のＨｅｉｍａｎらによってマウスで開発された。Ｈｅｉｍａｎらは、リボソーム構成タンパク質のひとつであるリボソームタンパク質Ｌ１０ａ（以下、「ＲｐＬ１０ａ」と表記する場合がある。）に改良型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を融合させた人工タンパク質（改変体ＲｐＬ１０ａ）を、興味のある細胞に限定して異所発現させ、当該改変体ＲｐＬ１０ａを取り込んだリボソーム－ｍＲＮＡ複合体、すなわちポリソームを組織抽出液中から抗ＧＦＰ抗体を用いて回収し、回収したポリソームに含まれるｍＲＮＡをトランスクリプトーム解析に供した。その後この手法は、ショウジョウバエ（例えば、非特許文献１）、アフリカツメガエル、ゼブラフィッシュ、及びシロイヌナズナ等のモデル生物種、並びに、ヒト人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ：ｉＰＳ細胞）から作られたオルガノイドにも用いられた。
【0005】
しかし、従来のＴＲＡＰ及びＴＲＡＰ－ｓｅｑでは、少数の細胞を用いて、トランスクリプトーム解析等の遺伝子解析を行うことには不向きであった。例えば、ある生体中又はある組織中に少数しか存在しない特定の細胞を用いて、従来のＴＲＡＰ及びＴＲＡＰ－ｓｅｑによってトランスクリプトーム解析を行うには、解析に必要なｍＲＮＡの量を確保するために、多くの生体又は組織を準備する必要があった。このような事情のもと、解析対象のｍＲＮＡが少量であっても（解析対象の細胞が少数であっても）、十分な精度で解析可能な遺伝子解析方法が望まれていた。
【0006】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、解析対象のｍＲＮＡが少量であっても、十分な精度で解析可能な遺伝子解析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、ＴＲＡＰ－ｓｅｑを行うに際して、（１）リボソーム－ｍＲＮＡ複合体を回収する工程を複数回行うこと、（２）回収されたリボソームに結合しているｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅すること、によって、解析対象のｍＲＮＡが少量であっても、十分な精度で遺伝子解析が可能になることを見いだし本発明を完成した。すなわち、本発明は以下の通りである。
【0008】
［１］ 本実施形態に係る遺伝子解析方法は、
改変体リボソームと前記改変体リボソームに結合している対象ｍＲＮＡとを含む、分析対象細胞に由来する細胞溶解物を準備する、準備工程と、
前記細胞溶解物において、前記改変体リボソームと第一結合タンパク質とを接触させ、前記改変体リボソームを回収する、第一回収工程と、
回収された前記改変体リボソームと第二結合タンパク質とを接触させ、前記改変体リボソームを回収する、第二回収工程と、
回収された前記改変体リボソームに結合している前記対象ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅する、増幅工程と、
増幅した前記ｃＤＮＡを解析する、解析工程とを含む、遺伝子解析方法であって、
前記改変体リボソームは、改変体ＲｐＬ１０ａを含み、
前記改変体ＲｐＬ１０ａは、リボソームタンパク質Ｌ１０ａ領域と、前記第一結合タンパク質に特異的に認識される第一タグ領域と、前記第二結合タンパク質に特異的に認識される第二タグ領域とを含む。
改変体リボソームと前記改変体リボソームに結合している対象ｍＲＮＡとを含む、分析対象細胞に由来する細胞溶解物を準備する、準備工程と、
前記細胞溶解物において、前記改変体リボソームと第一結合タンパク質とを接触させ、前記改変体リボソームを回収する、第一回収工程と、
回収された前記改変体リボソームと第二結合タンパク質とを接触させ、前記改変体リボソームを回収する、第二回収工程と、
回収された前記改変体リボソームに結合している前記対象ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅する、増幅工程と、
増幅した前記ｃＤＮＡを解析する、解析工程とを含む、遺伝子解析方法であって、
前記改変体リボソームは、改変体ＲｐＬ１０ａを含み、
前記改変体ＲｐＬ１０ａは、リボソームタンパク質Ｌ１０ａ領域と、前記第一結合タンパク質に特異的に認識される第一タグ領域と、前記第二結合タンパク質に特異的に認識される第二タグ領域とを含む。
【0009】
［２］ ［１］に記載の遺伝子解析方法において、前記第一タグ領域及び前記第二タグ領域は、それぞれ独立に、ＧＦＰ、ＨＡ、ＦＬＡＧ、ＭＹＣ、ＡｌＦＡ－ｔａｇ及びこれらの改変体からなる群より選ばれ、
前記第一タグ領域及び前記第二タグ領域は、互いに異なっていてもよい。
前記第一タグ領域及び前記第二タグ領域は、互いに異なっていてもよい。
【0010】
［３］ ［１］又は［２］に記載の遺伝子解析方法において、前記第一結合タンパク質及び前記第二結合タンパク質は、それぞれ独立に、抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、アルパカＶＨＨ抗体、及びＮａｎｏｂｏｄｙからなる群より選ばれてもよい。
【0011】
［４］ ［１］から［３］のいずれかに記載の遺伝子解析方法において、前記第二回収工程の後であって、かつ前記増幅工程の前に、回収された前記改変体リボソームと第三結合タンパク質とを接触させ、前記改変体リボソームを回収する、第三回収工程を更に含み、
前記改変体ＲｐＬ１０ａは、前記第三結合タンパク質に特異的に認識される第三タグ領域を更に含んでいてもよい。
前記改変体ＲｐＬ１０ａは、前記第三結合タンパク質に特異的に認識される第三タグ領域を更に含んでいてもよい。
【0012】
［５］ ［１］から［４］のいずれかに記載の遺伝子解析方法において、前記分析対象細胞の数は、１０以上１５００以下であってもよい。
【0013】
［６］ 本実施形態に係るキットは、
［１］から［５］のいずれか一項に記載の遺伝子解析方法に用いられるキットであって、
前記改変体ＲｐＬ１０ａをコードする塩基配列を含む発現ベクターと、
オリゴ（ｄＴ）プライマーと、
を含む。
［１］から［５］のいずれか一項に記載の遺伝子解析方法に用いられるキットであって、
前記改変体ＲｐＬ１０ａをコードする塩基配列を含む発現ベクターと、
オリゴ（ｄＴ）プライマーと、
を含む。
【発明の効果】
【0014】
本発明によれば、解析対象のｍＲＮＡが少量であっても、十分な精度で解析可能な遺伝子解析方法を提供することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【発明を実施するための形態】
【0016】
以下、本発明の一実施形態（以下「本実施形態」と記す。）について説明する。ただし、本実施形態はこれに限定されるものではない。本明細書において「Ａ～Ｚ」という形式の表記は、範囲の上限下限（すなわちＡ以上Ｚ以下）を意味し、Ａにおいて単位の記載がなく、Ｚにおいてのみ単位が記載されている場合、Ａの単位とＺの単位とは同じである。
【0017】
≪遺伝子解析方法≫
本実施形態に係る遺伝子解析方法は、
改変体リボソームと前記改変体リボソームに結合している対象ｍＲＮＡとを含む、分析対象細胞に由来する細胞溶解物を準備する、準備工程と、
前記細胞溶解物において、前記改変体リボソームと第一結合タンパク質とを接触させ、前記改変体リボソームを回収する、第一回収工程と、
回収された前記改変体リボソームと第二結合タンパク質とを接触させ、前記改変体リボソームを回収する、第二回収工程と、
回収された前記改変体リボソームに結合している前記対象ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅する、増幅工程と、
増幅した前記ｃＤＮＡを解析する、解析工程とを含む、遺伝子解析方法であって、
前記改変体リボソームは、改変体ＲｐＬ１０ａを含み、
前記改変体ＲｐＬ１０ａは、リボソームタンパク質Ｌ１０ａ領域と、前記第一結合タンパク質に特異的に認識される第一タグ領域と、前記第二結合タンパク質に特異的に認識される第二タグ領域とを含む、遺伝子解析方法である。以下、各工程について説明する。
本実施形態に係る遺伝子解析方法は、
改変体リボソームと前記改変体リボソームに結合している対象ｍＲＮＡとを含む、分析対象細胞に由来する細胞溶解物を準備する、準備工程と、
前記細胞溶解物において、前記改変体リボソームと第一結合タンパク質とを接触させ、前記改変体リボソームを回収する、第一回収工程と、
回収された前記改変体リボソームと第二結合タンパク質とを接触させ、前記改変体リボソームを回収する、第二回収工程と、
回収された前記改変体リボソームに結合している前記対象ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅する、増幅工程と、
増幅した前記ｃＤＮＡを解析する、解析工程とを含む、遺伝子解析方法であって、
前記改変体リボソームは、改変体ＲｐＬ１０ａを含み、
前記改変体ＲｐＬ１０ａは、リボソームタンパク質Ｌ１０ａ領域と、前記第一結合タンパク質に特異的に認識される第一タグ領域と、前記第二結合タンパク質に特異的に認識される第二タグ領域とを含む、遺伝子解析方法である。以下、各工程について説明する。
【0018】
＜準備工程＞
本工程では、改変体リボソームと上記改変体リボソームに結合している対象ｍＲＮＡとを含む、分析対象細胞に由来する細胞溶解物を準備する。
本工程では、改変体リボソームと上記改変体リボソームに結合している対象ｍＲＮＡとを含む、分析対象細胞に由来する細胞溶解物を準備する。
【0019】
本実施形態において「分析対象細胞」とは、遺伝子解析の対象となっている細胞を意味する。上記分析対象細胞は、改変体リボソームと上記改変体リボソームに結合している対象ｍＲＮＡとを含む。上記分析対象細胞は、株化された細胞であってもよいし、生体から採取された細胞であってもよいし、多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞等）から分化誘導された細胞であってもよい。上記分析対象細胞は、単一の細胞であってもよいし、生体組織のように細胞の集合体であってもよい。
【0020】
上記分析対象細胞の由来となる生物は、特に制限はなく、例えば、哺乳動物（マウス等）、昆虫（ショウジョウバエ等）、両生類（アフリカツメガエル等）、水生生物（ゼブラフィッシュ等）、植物（シロイヌナズナ等）が挙げられる。本実施形態の一側面において、上記分析対象細胞の由来となる生物は、ショウジョウバエであってもよい。
【0021】
本実施形態において、改変体リボソームを含む分析対象細胞は、公知の遺伝子工学的手法を用いて、上記改変体ＲｐＬ１０ａをコードする遺伝子（例えば、配列番号１の塩基配列を有する遺伝子）を、発現可能なように宿主細胞に導入することで得ることができる。本実施形態において、上記改変体ＲｐＬ１０ａを構成する遺伝子断片の取得及び上記プラスミドベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ １９８９”）。プラスミドベクターの調製に用いられる宿主細胞は、例えば、当該技術分野で通常用いられる大腸菌が挙げられる。
【0022】
本実施形態において「細胞溶解物」とは、上記分析対象細胞を溶解した後の成分を含む組成物を意味する。上記細胞溶解物は、細胞溶解液であることが好ましい。本実施形態において、上記細胞溶解物は、改変体リボソームと上記改変体リボソームに結合している対象ｍＲＮＡとを含む。
【0023】
上記細胞溶解物を得る方法は、特に制限はなく、公知の方法によって上記分析対象細胞を破砕又は溶解すればよい。例えば、上記分析対象細胞をバイオマッシャーを用いて破砕することで細胞溶解物を得てもよい。上記分析対象細胞をｌｙｓｉｓバッファーに懸濁させて超音波処理によって破砕することで細胞溶解物を得てもよい。又、後述する実施例に記載の方法によって、細胞溶解物を得てもよい。
【0024】
本実施形態の一側面において、上記細胞溶解物を得るために用いられる上記分析対象細胞の数は、１０以上１５００以下であってもよく、１０以上１５０以下であってもよく、１０以上５０以下であってもよい。
【0025】
本実施形態に係る改変体リボソームは、改変体ＲｐＬ１０ａを含むリボソームであって、翻訳の対象となるｍＲＮＡに結合可能なリボソームである。上記改変体ＲｐＬ１０ａは、リボソームタンパク質Ｌ１０ａ領域と、第一結合タンパク質に特異的に認識される第一タグ領域と、第二結合タンパク質に特異的に認識される第二タグ領域とを含む。本実施形態において「リボソームタンパク質Ｌ１０ａ領域」とは、リボソームタンパク質Ｌ１０ａ又はその改変体のアミノ酸配列を含む領域を意味する。リボソームタンパク質Ｌ１０ａのアミノ酸配列は、分析対象細胞が本来有するアミノ酸配列であってもよいし、異種生物に由来するリボソームタンパク質Ｌ１０ａのアミノ酸配列であってもよい。「第一タグ領域」とは、第一結合タンパク質に特異的に認識されるアミノ酸配列を含む領域を意味する。「第二タグ領域」とは、第二結合タンパク質に特異的に認識されるアミノ酸配列を含む領域を意味する。
【0026】
本実施形態において、上記第一タグ領域及び上記第二タグ領域は、公知のタンパク質タグ又はペプチドタグであれば特に制限されず、あらゆるタグが使用可能である。上記第一タグ領域及び上記第二タグ領域は、それぞれ独立に、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ＨＡ（ヘマグルチニン）、ＦＬＡＧ、ＭＹＣ、ＡｌＦＡ－ｔａｇ及びこれらの改変体からなる群より選ばれ、上記第一タグ領域及び上記第二タグ領域は、互いに異なっていてもよい。上記ＧＦＰは、ＥＧＦＰ（改良型緑色蛍光タンパク質）であってもよい。
【0027】
本実施形態の一側面において、上記改変体ＲｐＬ１０ａは、プロテアーゼ認識領域（ＴＥＶプロテアーゼに特異的に認識されるアミノ酸配列を含む領域など）、スペーサー領域を更に含んでいてもよい。
【0028】
本実施形態の他の側面において、改変体ＲｐＬ１０ａは、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含んでいてもよいし、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなっていてもよい。配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１番目から２３９番目のアミノ酸配列がＥＧＦＰのアミノ酸配列（第一タグ領域）に対応する。２４７番目から２５３番目のアミノ酸配列がＴＥＶプロテアーゼに特異的に認識されるアミノ酸配列（プロテアーゼ認識領域）に対応する。２５５番目から２７６番目のアミノ酸配列がＦＬＡＧを３回繰り返したアミノ酸配列（第二タグ領域）に対応する。２７７番目から４２５番目のアミノ酸配列がリボソームタンパク質Ｌ１０ａのアミノ酸配列（リボソームタンパク質Ｌ１０ａ領域）に対応する。４２６番から４３４番目のアミノ酸配列がＨＡのアミノ酸配列（第三タグ領域）に対応する。
【0029】
本実施形態において、「対象ｍＲＮＡ」とは、遺伝子解析の対象となるｍＲＮＡであって、改変体リボソームに結合しているｍＲＮＡを意味する。
【0030】
＜第一回収工程＞
本工程では、上記細胞溶解物において、上記改変体リボソームと第一結合タンパク質とを接触させ、上記改変体リボソームを回収する。このとき、上記第一結合タンパク質は、上記改変体ＲｐＬ１０ａにおける第一タグ領域に結合する。このようにして上記改変体リボソームを回収することで、対象ｍＲＮＡも同時に回収できる。
本工程では、上記細胞溶解物において、上記改変体リボソームと第一結合タンパク質とを接触させ、上記改変体リボソームを回収する。このとき、上記第一結合タンパク質は、上記改変体ＲｐＬ１０ａにおける第一タグ領域に結合する。このようにして上記改変体リボソームを回収することで、対象ｍＲＮＡも同時に回収できる。
【0031】
上記第一結合タンパク質は、第一タグ領域を特異的に認識できる（結合できる）タンパク質であれば特に制限されない。上記第一結合タンパク質は、抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、アルパカＶＨＨ抗体、及びＮａｎｏｂｏｄｙからなる群より選ばれてもよい。
【0032】
上記第一結合タンパク質は、そのままの状態で用いてもよいし、担体に固定化された状態で用いてもよい。上記担体としては、例えば、アガロース担体、ポリアクリルアミド担体、磁性ビーズ等が挙げられる。
【0033】
第一結合タンパク質が結合した上記改変体リボソームを回収する方法は、特に制限はなく公知の方法を用いることができる。例えば、上記第一結合タンパク質を担体等に固定化することなく、そのままの状態で上記改変体リボソームと結合させた場合、上記第一結合タンパク質を特異的に認識するタンパク質が固定化された担体を、上記第一結合タンパク質と上記改変体リボソームとの複合体に結合させることで、担体ごと回収すればよい。上記第一結合タンパク質が抗体である場合、「第一結合タンパク質を特異的に認識するタンパク質」としては、例えば、プロテインＧ、プロテインＡが挙げられる。
【0034】
また、上記第一結合タンパク質が担体に固定された状態で用いられた場合、上記第一結合タンパク質と上記改変体リボソームとの複合体を担体ごと回収すればよい。
【0035】
回収した担体から上記改変体リボソームを遊離させる方法は、特に制限はなく、公知の方法を用いることができる。具体的には、第一結合タンパク質と競合するペプチド等を加えて、第一結合タンパク質と第一タグ領域との結合を解離させることで上記改変体リボソームを遊離させてもよい。また、酵素処理などによって、改変体ＲｐＬ１０ａから第一タグ領域を切断することで上記改変体リボソームを遊離させてもよい。遊離させた改変体リボソームは、対象ｍＲＮＡを結合した状態であり、次の第二回収工程に用いられる。
【0036】
＜第二回収工程＞
本工程では、回収された上記改変体リボソームと第二結合タンパク質とを接触させ、上記改変体リボソームを回収する。このとき、上記第二結合タンパク質は、上記改変体ＲｐＬ１０ａにおける第二タグ領域に結合する。このようにして上記改変体リボソームを回収することで、対象ｍＲＮＡも同時に回収できる。本実施形態に係る遺伝子解析方法では、第一回収工程の後に第二回収工程を行うことで、回収される対象ｍＲＮＡの純度が向上している。
本工程では、回収された上記改変体リボソームと第二結合タンパク質とを接触させ、上記改変体リボソームを回収する。このとき、上記第二結合タンパク質は、上記改変体ＲｐＬ１０ａにおける第二タグ領域に結合する。このようにして上記改変体リボソームを回収することで、対象ｍＲＮＡも同時に回収できる。本実施形態に係る遺伝子解析方法では、第一回収工程の後に第二回収工程を行うことで、回収される対象ｍＲＮＡの純度が向上している。
【0037】
上記第二結合タンパク質は、第二タグ領域を特異的に認識できる（結合できる）タンパク質であれば特に制限されない。上記第二結合タンパク質は、抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、アルパカＶＨＨ抗体、及びＮａｎｏｂｏｄｙからなる群より選ばれてもよい。本実施形態の一側面において、上記第一結合タンパク質及び上記第二結合タンパク質は、それぞれ独立に、抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、アルパカＶＨＨ抗体、及びＮａｎｏｂｏｄｙからなる群より選ばれてもよい。
【0038】
上記第二結合タンパク質は、そのままの状態で用いてもよいし、担体に固定化された状態で用いてもよい。上記担体としては、上述の＜第一回収工程＞において挙げられたものが適用されうる。
【0039】
第二結合タンパク質が結合した上記改変体リボソームを回収する方法は、特に制限はなく公知の方法を用いることができる。例えば、上述の＜第一回収工程＞において挙げられたものが適用されうる。回収した担体から上記改変体リボソームを遊離させる方法は、特に制限はなく、公知の方法を用いることができる。例えば、上述の＜第一回収工程＞において挙げられたものが適用されうる。
【0040】
＜増幅工程＞
本工程では、回収された上記改変体リボソームに結合している上記対象ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅する。上記対象ｍＲＮＡは、予め精製を行ってもよい。
本工程では、回収された上記改変体リボソームに結合している上記対象ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅する。上記対象ｍＲＮＡは、予め精製を行ってもよい。
【0041】
対象ｍＲＮＡからｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）を得る方法は、特に制限はなく公知の方法を用いることができる。例えば、市販のキット（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社製のＳＭＡＲＴ－Ｓｅｑ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ＰＬＵＳ Ｋｉｔ等）を用いてもよい。当該ｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅する場合、５’キャップ構造に結合するＰＣＲプライマー及びｐｏｌｙ(Ａ)配列に結合するＰＣＲプライマー（例えば、オリゴ（ｄＴ）プライマー）が用いられる。これらのＰＣＲプライマーは、ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡに特異的に結合する。そのため、解析の対象外のＤＮＡ又はＲＮＡを増幅させることなく、上記対象ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡのみを効率よく増幅させることができる。
【0042】
上記ＰＣＲを行う際の「熱変性反応」における処理温度は、９３℃以上９８℃以下であってもよいし、９４℃以上９７℃以下であってもよいし、９５℃以上９６℃以下であってもよい。「熱変性反応」における処理時間は、１０秒以上３０秒以下であってもよいし、１０秒以上２０秒以下であってもよい。
【0043】
上記ＰＣＲを行う際の「アニーリング反応」における処理温度は、６２℃以上６８℃以下であってもよいし、６３℃以上６７℃以下であってもよいし、６４℃以上６５℃以下であってもよい。「アニーリング反応」における処理時間は、３０秒以上６０秒以下であってもよいし、３０秒以上４５秒以下であってもよい。
【0044】
上記ＰＣＲを行う際の「伸張反応」における処理温度は、６５℃以上７１℃以下であってもよいし、６６℃以上７０℃以下であってもよいし、６７℃以上６８℃以下であってもよい。「伸張反応」における処理時間は、３分以上５分以下であってもよいし、３分以上４分以下であってもよい。
【0045】
上記ＰＣＲを行う際の「熱変性反応」、「アニーリング反応」及び「伸張反応」のサイクル数は、上記対象ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡの収量が所定の量（例えば、１２００ｐｇ以上１５００ｐｇ未満）となるように設定すればよい。具体的には、上記サイクル数は、５サイクル以上２０サイクル以下であってもよいし、５サイクル以上１０サイクル以下であってもよいし、１１サイクル以上２０サイクル以下であってもよい。
【0046】
上記ＰＣＲを行う際のその他の条件は、特に制限は無く適宜設定が可能である。例えば、後述する実施例に記載の条件が用いられる。本実施形態の一側面において、上記ＰＣＲは、Ｌｏｎｇ－Ｄｉｓｔａｎｃｅ（ＬＤ） ＰＣＲであってもよい。
【0047】
従来のＴＲＡＰ及びＴＲＡＰ－ｓｅｑでは、第一回収工程の後に、第二回収工程、増幅工程を経ることなくそのまま解析工程が行われていた。そのため、少数の細胞を用いて、トランスクリプトーム解析等の遺伝子解析を行うことには不向きであった。例えば、ある生体中又はある組織中に少数しか存在しない特定の細胞を用いて、従来のＴＲＡＰ及びＴＲＡＰ－ｓｅｑによってトランスクリプトーム解析を行うには、解析に必要なｍＲＮＡの量を確保するために、多くの生体又は組織を準備する必要があった。
【0048】
実際、ショウジョウバエにおいて解析対象となったのは、胚の全神経細胞、胚由来の培養細胞株Ｓ２、成虫の全神経細胞、成虫の全グリア細胞、及び成虫の複眼に存在する光受容細胞である。この中で細胞数が最も少ない光受容細胞であっても、成虫の頭部に１，５００細胞以上あるうえに、スタートサンプルとして５００個体以上のショウジョウバエが使用されていた。解析対象の細胞がこれよりも少数の場合には、より多くの動物を準備する必要があり、それには多大な時間と労力が必要であった。
【0049】
しかし、本実施形態に係る遺伝子解析方法では、第一回収工程の後に第二回収工程を行うことで、回収される対象ｍＲＮＡの純度が向上している。また、その後に増幅工程を行うことで、回収される対象ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡの量を、分析可能な量（例えば、ＮＧＳライブラリの作成に必要な１００～３００ｐｇ）にまで増幅させている。そのため、解析の対象外のＤＮＡ又はＲＮＡに由来するノイズを大幅に抑制することができ、解析対象のｍＲＮＡが少量（例えば、１ｐｇ以下）であっても（解析対象の細胞が少数であっても）、十分な精度で遺伝子解析を行うことができる。
【0050】
＜解析工程＞
本工程では、増幅した上記ｃＤＮＡを解析する。解析の方法としては、例えば、リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、ＤＮＡマイクロアレイ、次世代シーケンス解析（例えば、ＴＲＡＰ－ｓｅｑ）、及びサザンブロットなどが挙げられる。
本工程では、増幅した上記ｃＤＮＡを解析する。解析の方法としては、例えば、リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、ＤＮＡマイクロアレイ、次世代シーケンス解析（例えば、ＴＲＡＰ－ｓｅｑ）、及びサザンブロットなどが挙げられる。
【0051】
＜第三回収工程＞
本実施形態の一側面において、上記遺伝子解析方法は、上記第二回収工程の後であって、かつ上記増幅工程の前に、回収された上記改変体リボソームと第三結合タンパク質とを接触させ、上記改変体リボソームを回収する、第三回収工程を更に含んでもよい。上記改変体ＲｐＬ１０ａは、上記第三結合タンパク質に特異的に認識される第三タグ領域を更に含んでもよい。
本実施形態の一側面において、上記遺伝子解析方法は、上記第二回収工程の後であって、かつ上記増幅工程の前に、回収された上記改変体リボソームと第三結合タンパク質とを接触させ、上記改変体リボソームを回収する、第三回収工程を更に含んでもよい。上記改変体ＲｐＬ１０ａは、上記第三結合タンパク質に特異的に認識される第三タグ領域を更に含んでもよい。
【0052】
上記第三回収工程において、上記第三結合タンパク質は、上記改変体ＲｐＬ１０ａにおける第三タグ領域に結合する。このようにして上記改変体リボソームを回収することで、対象ｍＲＮＡも同時に回収できる。上記第三タグ領域は、上述の第一タグ領域として挙げられたものが適用されうる。上記第一タグ領域、上記第二タグ領域及び上記第三タグ領域は、互いに異なることが好ましい。
【0053】
上記第三結合タンパク質は、第三タグ領域を特異的に認識できる（結合できる）タンパク質であれば特に制限されない。上記第三結合タンパク質は、抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、アルパカＶＨＨ抗体、及びＮａｎｏｂｏｄｙからなる群より選ばれてもよい。本実施形態の一側面において、上記第一結合タンパク質、上記第二結合タンパク質及び上記第三結合タンパク質は、それぞれ独立に、抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、アルパカＶＨＨ抗体、及びＮａｎｏｂｏｄｙからなる群より選ばれてもよい。
【0054】
上記第三結合タンパク質は、そのままの状態で用いてもよいし、担体に固定化された状態で用いてもよい。上記担体としては、上述の＜第一回収工程＞において挙げられたものが適用されうる。
【0055】
第三結合タンパク質が結合した上記改変体リボソームを回収する方法は、特に制限はなく公知の方法を用いることができる。例えば、上述の＜第一回収工程＞において挙げられたものが適用されうる。回収した担体から上記改変体リボソームを遊離させる方法は、特に制限はなく、公知の方法を用いることができる。例えば、上述の＜第一回収工程＞において挙げられたものが適用されうる。
【0056】
≪キット≫
本実施形態に係るキットは、上記遺伝子解析方法に用いられるキットであって、
上記改変体ＲｐＬ１０ａをコードする塩基配列を含む発現ベクターと、
オリゴ（ｄＴ）プライマーと、
を含む。本実施形態の一側面において、「上記遺伝子解析方法に用いられるキット」は、上記遺伝子解析方法に用いられる試薬、器具、使用者に対する取扱説明書等のセットと把握することもできる。
本実施形態に係るキットは、上記遺伝子解析方法に用いられるキットであって、
上記改変体ＲｐＬ１０ａをコードする塩基配列を含む発現ベクターと、
オリゴ（ｄＴ）プライマーと、
を含む。本実施形態の一側面において、「上記遺伝子解析方法に用いられるキット」は、上記遺伝子解析方法に用いられる試薬、器具、使用者に対する取扱説明書等のセットと把握することもできる。
【0057】
本実施形態において「発現ベクター」とは、宿主細胞内において発現可能なように、目的の組換えタンパク質（例えば、改変体ＲｐＬ１０ａ）をコードする遺伝子が導入されているＤＮＡ構築物を意味する。上記発現ベクターは、特に制限されず、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクターであってもよい。上記改変体ＲｐＬ１０ａをコードする塩基配列としては、例えば、配列番号１の塩基配列が挙げられる。
【0058】
上記キットは、５’キャップ構造に結合するＰＣＲプライマーを更に含んでもよい。また、上記キットは、細胞溶解バッファー、ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、逆転写酵素、ＤＮＡ合成酵素、緩衝溶液、抗体、抗体を固定する担体、競合ペプチド、ＴＥＶプロテアーゼ、核酸精製試薬、サンプルチューブ、及びキット使用者に対する取扱説明書からなる群より選ばれる１種以上を更に含んでいてもよい。
【0059】
以上、本実施形態に係る遺伝子解析方法について説明した。本実施形態に係る遺伝子解析方法は、スタートサンプルとして用いる生物の数を１個体にまで減らすことができる。また、解析対象となる細胞の数を、例えば、１００細胞未満（単一神経クラスター）にまで減らすことができる。そのため、例えば、ショウジョウバエ等の生物の神経活動を解析する場合、神経活動を解析する（１）電気生理学的手法や（２）蛍光イメージング手法と、本実施形態に係る遺伝子解析方法とを組み合わせることによって、個体の行動と、ニューロン活動の記録、その細胞のトランスクリプトーム解析とを１つの個体を使って完結させる、一連の解析システムを創出できる。
【実施例0060】
以下、本発明に係る実施例を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【0061】
≪改変体リボソームを含むショウジョウバエの作製≫
＜１．改変体リボソームをコードする塩基配列を含むベクターの作製及び形質転換＞
ＥＧＦＰ－ＴＥＶ－３ｘＦＬＡＧ－ＲｐＬ１０Ａｂ－ＨＡをコードする塩基配列（配列番号１）を有するＤＮＡ断片を公知の方法によって作製した。このとき、ＥＧＦＰをコードするＤＮＡ断片は、ｐＥＧＦＰ－１ベクター（ＧｅｎＢａｎｋ、Ｕ５５７６１）からＰＣＲ法によって増幅した。ＲｐＬ１０ＡｂをコードするＤＮＡ断片は、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＢＤＧＰ）のｃＤＮＡクローンＲＨ０６３６６からＰＣＲ法によって増幅した。なお、「ＥＧＦＰ－ＴＥＶ－３ｘＦＬＡＧ－ＲｐＬ１０Ａｂ－ＨＡ」は、Ｎ末端側から順に、ＥＧＦＰ（改良型緑色蛍光タンパク質）、ＴＥＶ（ＴＥＶプロテアーゼの認識配列）、３ｘＦＬＡＧ（ＦＬＡＧタグの３回繰り返し配列）、ＲｐＬ１０Ａｂ（ショウジョウバエ由来のＲｐＬ１０ａ）及びＨＡ（ヘマグルチニン）がタンデムに結合した改変ＲｐＬ１０ａ（図２参照）であることを意味している。
＜１．改変体リボソームをコードする塩基配列を含むベクターの作製及び形質転換＞
ＥＧＦＰ－ＴＥＶ－３ｘＦＬＡＧ－ＲｐＬ１０Ａｂ－ＨＡをコードする塩基配列（配列番号１）を有するＤＮＡ断片を公知の方法によって作製した。このとき、ＥＧＦＰをコードするＤＮＡ断片は、ｐＥＧＦＰ－１ベクター（ＧｅｎＢａｎｋ、Ｕ５５７６１）からＰＣＲ法によって増幅した。ＲｐＬ１０ＡｂをコードするＤＮＡ断片は、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＢＤＧＰ）のｃＤＮＡクローンＲＨ０６３６６からＰＣＲ法によって増幅した。なお、「ＥＧＦＰ－ＴＥＶ－３ｘＦＬＡＧ－ＲｐＬ１０Ａｂ－ＨＡ」は、Ｎ末端側から順に、ＥＧＦＰ（改良型緑色蛍光タンパク質）、ＴＥＶ（ＴＥＶプロテアーゼの認識配列）、３ｘＦＬＡＧ（ＦＬＡＧタグの３回繰り返し配列）、ＲｐＬ１０Ａｂ（ショウジョウバエ由来のＲｐＬ１０ａ）及びＨＡ（ヘマグルチニン）がタンデムに結合した改変ＲｐＬ１０ａ（図２参照）であることを意味している。
【0062】
次に、ｐＵＡＳＴａｔｔＢベクター（ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＦ３６２４０９．１）をＮｏｔＩ制限酵素およびＸｈｏＩ制限酵素で切断した。上記ベクターの切断箇所に、上述のＥＧＦＰ－ＴＥＶ－３ｘＦＬＡＧ－ＲｐＬ１０Ａｂ－ＨＡをコードするＤＮＡ断片（配列番号１）をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製、製品番号：６３９６４８）を用いて挿入し、ｐＵＡＳＴ－ＥＧＦＰ－ＴＥＶ－３ｘＦＬＡＧ－ＲｐＬ１０Ａｂ－ＨＡベクター（図１）を作製した。作製したベクターをＳＵＲＥ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ－Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌ （Ａｇｉｌｅｎｔ社製、製品番号：２００２２７）を用いて増幅し、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ社製、製品番号：１２１２３）により精製、回収した。回収した上記ベクターをキイロショウジョウバエのＰ｛ＣａｒｙＰ｝ａｔｔＰ４０系統（Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ、系統番号：７９６０４）の受精卵にマイクロインジェクションすることによって、このショウジョウバエ系統が持つ第二染色体のａｔｔＰ４０サイトに上記のベクター配列を導入した。ＥＧＦＰ－ＴＥＶ－３ｘＦＬＡＧ－ＲｐＬ１０Ａｂ－ＨＡタンパク質（以下、「改変体ＲｐＬ１０ａ」と表記する場合がある。）をショウジョウバエの脳神経系に発現させるため、ｄｓｘ－ＧＡＬ４系統（Ｒｉｄｅｏｕｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２０１０）を、上記ベクターを導入したショウジョウバエとの交配に使用した。以上の操作によって、改変体リボソームを脳神経系の一群の脳細胞に含むショウジョウバエの成虫を作製した。上記改変体リボソームは、改変体ＲｐＬ１０ａを含んでいる。
【0063】
＜２．改変体リボソームを含むショウジョウバエの飼育＞
卵から蛹になるまでの飼育は、公知の方法に従って行った。蛹から羽化したばかりのショウジョウバエの雄成虫を１匹又は１０匹の集団にして、それぞれ円筒形のプラスチック容器（直径１６．５ｍｍ、長さ９５ｍｍ、ＳＡＲＳＴＥＤＴ社製、製品場号：５８．４９１）の中で、１週間飼育した（図４）。餌として、酵母、コーンミール、ブドウ糖、寒天を含む標準的なショウジョウバエ用培地を与えた。１２時間の明暗周期を繰り返す２５℃の恒温器（ＰＨＣ株式会社製、製品名：ＭＩＲ－１５４－ＰＪ）内で飼育した。以下、１匹で飼育した群を「単独飼育群」と呼び、１０匹の集団で飼育した群を「集団飼育群」と呼ぶ場合がある。また、羽化直後の群を「羽化直後群」と呼ぶ場合がある。以上の操作によって、改変体リボソームを含むショウジョウバエを作製した。
卵から蛹になるまでの飼育は、公知の方法に従って行った。蛹から羽化したばかりのショウジョウバエの雄成虫を１匹又は１０匹の集団にして、それぞれ円筒形のプラスチック容器（直径１６．５ｍｍ、長さ９５ｍｍ、ＳＡＲＳＴＥＤＴ社製、製品場号：５８．４９１）の中で、１週間飼育した（図４）。餌として、酵母、コーンミール、ブドウ糖、寒天を含む標準的なショウジョウバエ用培地を与えた。１２時間の明暗周期を繰り返す２５℃の恒温器（ＰＨＣ株式会社製、製品名：ＭＩＲ－１５４－ＰＪ）内で飼育した。以下、１匹で飼育した群を「単独飼育群」と呼び、１０匹の集団で飼育した群を「集団飼育群」と呼ぶ場合がある。また、羽化直後の群を「羽化直後群」と呼ぶ場合がある。以上の操作によって、改変体リボソームを含むショウジョウバエを作製した。
【0064】
≪改変体リボソームを含むショウジョウバエにおける脳の免疫組織化学染色≫
上述のショウジョウバエの脳神経系に発現させた改変体リボソームを検出するため、上記ショウジョウバエから脳を採取して、上記脳を抗ＧＦＰ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製、製品番号：Ａ－６４５５、希釈倍率：１：５００）とＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製、製品番号：Ａ－１１００８、希釈倍率：１：５００）を用いて免疫組織化学染色した。脳標本をマルチスペクトル超解像レーザー顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ社製、製品名：ＬＳＭ ９８０ Ａｉｒｙｓｃａｎ ２）で、倍率２０倍の対物レンズを用いて観察した。結果を図３に示す。図３において、黒色の部分が検出された改変体リボソームである。この黒色の部分を計数したところ、１５０個の脳細胞に改変体リボソームが発現していた。
上述のショウジョウバエの脳神経系に発現させた改変体リボソームを検出するため、上記ショウジョウバエから脳を採取して、上記脳を抗ＧＦＰ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製、製品番号：Ａ－６４５５、希釈倍率：１：５００）とＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製、製品番号：Ａ－１１００８、希釈倍率：１：５００）を用いて免疫組織化学染色した。脳標本をマルチスペクトル超解像レーザー顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ社製、製品名：ＬＳＭ ９８０ Ａｉｒｙｓｃａｎ ２）で、倍率２０倍の対物レンズを用いて観察した。結果を図３に示す。図３において、黒色の部分が検出された改変体リボソームである。この黒色の部分を計数したところ、１５０個の脳細胞に改変体リボソームが発現していた。
【0065】
≪改変体リボソームに結合するｍＲＮＡの回収≫
＜１．細胞破砕液の準備＞
単独飼育群、集団飼育群及び羽化直後群それぞれにおいて、改変体リボソームを含むショウジョウバエの頭部１０個に、Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒを５０μＬ加え、ホモジェナイザー（ｎｉｐｐｉ社製、ＢｉｏＭａｓｈｅｒ ＩＩ、製品番号：３２０１０３）を用いて、上記頭部の細胞（分析対象細胞）を破砕した。破砕した細胞を含む懸濁液に対して遠心処理（２，０００Ｇ、４℃、１０分間）を行い、上清を新しい１．５ｍＬチューブに回収した。上記Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒの組成は、以下の通りである。
＜１．細胞破砕液の準備＞
単独飼育群、集団飼育群及び羽化直後群それぞれにおいて、改変体リボソームを含むショウジョウバエの頭部１０個に、Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒを５０μＬ加え、ホモジェナイザー（ｎｉｐｐｉ社製、ＢｉｏＭａｓｈｅｒ ＩＩ、製品番号：３２０１０３）を用いて、上記頭部の細胞（分析対象細胞）を破砕した。破砕した細胞を含む懸濁液に対して遠心処理（２，０００Ｇ、４℃、１０分間）を行い、上清を新しい１．５ｍＬチューブに回収した。上記Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒの組成は、以下の通りである。
【0066】
（Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒの組成）
１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）： ０．２ｍＬ（ｆｉｎａｌ ２０ｍＭ）
１Ｍ ＫＣｌ： １．５ｍＬ（ｆｉｎａｌ １５０ｍＭ）
１Ｍ ＭｇＣｌ２： ０．０５ｍＬ（ｆｉｎａｌ ５ｍＭ）
蒸留水（ＤＷ）： ８．２５ｍＬ
Ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ（１００ｍｇ／ｍＬ）：１０μＬ（ｆｉｎａｌ １００μｇ／ｍＬ）
ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０Ｕ／μＬ）：２５μＬ（ｆｉｎａｌ １００Ｕ／５００μＬ）
Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ（Ｒｏｃｈｅ社製、製品番号：４６９３１２４００１）：１ｔａｂｌｅｔ
１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）： ０．２ｍＬ（ｆｉｎａｌ ２０ｍＭ）
１Ｍ ＫＣｌ： １．５ｍＬ（ｆｉｎａｌ １５０ｍＭ）
１Ｍ ＭｇＣｌ２： ０．０５ｍＬ（ｆｉｎａｌ ５ｍＭ）
蒸留水（ＤＷ）： ８．２５ｍＬ
Ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ（１００ｍｇ／ｍＬ）：１０μＬ（ｆｉｎａｌ １００μｇ／ｍＬ）
ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０Ｕ／μＬ）：２５μＬ（ｆｉｎａｌ １００Ｕ／５００μＬ）
Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ（Ｒｏｃｈｅ社製、製品番号：４６９３１２４００１）：１ｔａｂｌｅｔ
【0067】
回収した上清に、１０％ ＮＰ－４０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製、製品番号：８５１２４）を５．５μＬ（回収した上清に対して、体積比で１／９量）加えた。その後、チューブを上下反転させて両溶液を混合した。得られた混合液に１，２－ｄｉｈｅｐｔａｎｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ（ＤＨＰＣ）（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社製，製品番号：８５０３０６Ｐ）（濃度：３００ｍＭになるようにＮｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒに溶解させたもの）を６．２μＬ（得られた混合液に対して、体積比で１／９量）加えた。その後、溶液の入ったチューブを５分間、氷上で静置した。
【0068】
氷上で静置した溶液に対して、遠心処理（２０，０００Ｇ、４℃、１５分間）を行い、得られた上清（細胞破砕液）を新しい１．５ｍＬチューブに回収した。以上の操作により、細胞破砕液（分析対象細胞に由来する細胞溶解物）を準備した（準備工程）。
【0069】
＜２．抗ＧＦＰ抗体による第１回目の免疫沈降＞
準備した細胞破砕液に、抗ＧＦＰ抗体（Ｎｅｕｒｏｍａｂ社製、Ｃｌｏｎｅ Ｎ８６／３８、濃度：１μｇ／μＬ）を１μＬ加えて、抗原抗体反応を行った（４℃、１時間）。この抗原抗体反応によって、改変体ＲｐＬ１０ａにおけるＥＧＦＰ領域（第一タグ領域）に上記抗ＧＦＰ抗体（第一結合タンパク質）が結合し、改変体リボソームと抗ＧＦＰ抗体との抗原抗体複合体が形成される。
準備した細胞破砕液に、抗ＧＦＰ抗体（Ｎｅｕｒｏｍａｂ社製、Ｃｌｏｎｅ Ｎ８６／３８、濃度：１μｇ／μＬ）を１μＬ加えて、抗原抗体反応を行った（４℃、１時間）。この抗原抗体反応によって、改変体ＲｐＬ１０ａにおけるＥＧＦＰ領域（第一タグ領域）に上記抗ＧＦＰ抗体（第一結合タンパク質）が結合し、改変体リボソームと抗ＧＦＰ抗体との抗原抗体複合体が形成される。
【0070】
一方で、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製、製品名：ＤＢ１０００３）を１０μＬ採取して新しい１．５ｍＬチューブに加えた。次に、上記チューブにＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒを１００μＬ加えて、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇを洗浄した。洗浄後、ＤｙｎａＭａｇ２－Ｍａｇｎｅｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、製品番号：１２３２１Ｄ）を用いた磁気分離によって、上清とＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇとに分けて、上清を除去した。
【0071】
細胞破砕液と抗ＧＦＰ抗体との混合液を、洗浄したＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇが入っているチューブに加え、低温で静置した（４℃、１時間）。
【0072】
その後、この混合液を上記の磁気分離によって、改変体リボソームを結合させたＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇと上清とに分けて、上清を除去した。このチューブに、Ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ ＃１を５００μＬ加えて、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇを洗浄した。洗浄後、磁気分離によって、上清とＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇとに分けて、上清を除去した。この洗浄操作を合計３回行った。上記Ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ ＃１の組成は、以下の通りである。
【0073】
（Ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ ＃１の組成）
１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）： ０．２ｍＬ（ｆｉｎａｌ ２０ｍＭ）
１Ｍ ＫＣｌ： １．５ｍＬ（ｆｉｎａｌ １５０ｍＭ）
１Ｍ ＭｇＣｌ２： ０．０５ｍＬ（ｆｉｎａｌ ５ｍＭ）
１０％ ＮＰ４０： １ｍＬ（ｆｉｎａｌ １％）
ＤＷ： ７．２５ ｍＬ
１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）： ０．２ｍＬ（ｆｉｎａｌ ２０ｍＭ）
１Ｍ ＫＣｌ： １．５ｍＬ（ｆｉｎａｌ １５０ｍＭ）
１Ｍ ＭｇＣｌ２： ０．０５ｍＬ（ｆｉｎａｌ ５ｍＭ）
１０％ ＮＰ４０： １ｍＬ（ｆｉｎａｌ １％）
ＤＷ： ７．２５ ｍＬ
【0074】
洗浄したＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇが入っているチューブに、ＩＰ ｂｕｆｆｅｒを１００μＬ加えて、懸濁液を得た。得られた懸濁液に対して、ＴＥＶ ｐｒｏｔｅａｓｅ（ａｂｃａｍ社製、製品番号：Ｅ０２７）を１μＬ加えて、定温で静置した（１時間、室温（２５℃））。その後、上記懸濁液に対して磁気分離を行い、得られた上清（改変体リボソームが含まれている）を新しい１．５ｍＬチューブに回収した。以上の操作により第一回収工程を行った。上記ＩＰ ｂｕｆｆｅｒの組成は、以下の通りである。
【0075】
（ＩＰ ｂｕｆｆｅｒの組成）
Ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ ＃１： １０ｍＬ
Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ（Ｒｏｃｈｅ社製、製品番号：４６９３１２４００１）：１ｔａｂｌｅｔ
ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０Ｕ／μＬ）：５μＬ（ｆｉｎａｌ １００Ｕ／５００μＬ）
Ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ ＃１： １０ｍＬ
Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ（Ｒｏｃｈｅ社製、製品番号：４６９３１２４００１）：１ｔａｂｌｅｔ
ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０Ｕ／μＬ）：５μＬ（ｆｉｎａｌ １００Ｕ／５００μＬ）
【0076】
＜３．抗ＦＬＡＧ抗体又は抗ＨＡ抗体による第２回目の免疫沈降＞
ＥＺｖｉｅｗ Ｒｅｄ 抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体アフィニティーゲル（Ｍｅｒｃｋ社製、製品番号：Ｆ２４２６）又は抗ＨＡ Ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓ（Ｍｅｒｃｋ社製、製品番号：ＳＡＥ０９７）を１０μＬ新しい１．５ｍＬチューブに分取し、Ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ ＃１を１００μＬ更に加えて、アフィニティーゲル又はビーズを洗浄した。洗浄後、遠心処理（３０００ｒｐｍ、４℃、５分間）によって、上清とアフィニティーゲル又はビーズとに分けて、上清を除去した。
ＥＺｖｉｅｗ Ｒｅｄ 抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体アフィニティーゲル（Ｍｅｒｃｋ社製、製品番号：Ｆ２４２６）又は抗ＨＡ Ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓ（Ｍｅｒｃｋ社製、製品番号：ＳＡＥ０９７）を１０μＬ新しい１．５ｍＬチューブに分取し、Ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ ＃１を１００μＬ更に加えて、アフィニティーゲル又はビーズを洗浄した。洗浄後、遠心処理（３０００ｒｐｍ、４℃、５分間）によって、上清とアフィニティーゲル又はビーズとに分けて、上清を除去した。
【0077】
第一回収工程で回収した上清を、洗浄したアフィニティーゲル又は洗浄したビーズに加えて、定温で静置した（４℃、１時間）。この操作によって、改変体ＲｐＬ１０ａにおける３ｘＦＬＡＧ領域（又はＨＡ領域）（第二タグ領域）に上記抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（又は抗ＨＡ抗体）（第二結合タンパク質）が結合し、改変体リボソームと抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（又は抗ＨＡ抗体）との複合体が形成される。その後、上記チューブにＷａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ ＃２を１００μＬ加えて、上記アフィニティーゲル又は上記ビーズを洗浄した。洗浄後、遠心処理（３０００ｒｐｍ、４℃、５分間）によって、上清とアフィニティーゲル又はビーズとに分けて、上清を除去した。この洗浄操作を合計３回行った。上記Ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ ＃２の組成は、以下の通りである。
【0078】
（Ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ ＃２の組成）
１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）： ０．２ｍＬ（ｆｉｎａｌ ２０ｍＭ）
１Ｍ ＫＣｌ： ３ｍＬ（ｆｉｎａｌ ３００ｍＭ）
１Ｍ ＭｇＣｌ２： ０．０５ｍＬ（ｆｉｎａｌ ５ｍＭ）
１０％ ＮＰ４０： １ｍＬ（ｆｉｎａｌ １％）
ＤＷ： ５．７５ｍＬ
１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）： ０．２ｍＬ（ｆｉｎａｌ ２０ｍＭ）
１Ｍ ＫＣｌ： ３ｍＬ（ｆｉｎａｌ ３００ｍＭ）
１Ｍ ＭｇＣｌ２： ０．０５ｍＬ（ｆｉｎａｌ ５ｍＭ）
１０％ ＮＰ４０： １ｍＬ（ｆｉｎａｌ １％）
ＤＷ： ５．７５ｍＬ
【0079】
後述する第３回目の免疫沈降を行わない場合は、次の操作を行った。洗浄したアフィニティーゲル又は洗浄したビーズが入っているチューブに、ＲＬＴ ｂｕｆｆｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ社製、製品番号：７９２１６）を３５０μＬ加えて、懸濁液として定温で静置した（５分間、４℃）。その後、ＲＬＴ ｂｕｆｆｅｒを含む上記懸濁液を回収した。
【0080】
第３回目の免疫沈降を行う場合は、次の操作を行った。洗浄したアフィニティーゲル又は洗浄したビーズが入っているチューブに、３ｘＦＬＡＧ ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、製品番号：Ｆ４７９９）又はＨＡ ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、製品番号：Ｉ２１４９）（５ｍｇ／ｍｌ）を５μＬ加えてインキュベートした（室温、５分間）。インキュベート後の懸濁液に対して遠心処理（３０００ｒｐｍ、４℃、５分間）又は磁気分離を行い、得られた上清（改変体リボソームが含まれている）を新しい１．５ｍＬチューブに回収した。以上の操作により第二回収工程を行った。
【0081】
＜４．抗ＨＡ抗体又は抗ＦＬＡＧ抗体による第３回目の免疫沈降＞
抗ＨＡ Ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓ（Ｍｅｒｃｋ社製、製品名：ＳＡＥ０９７）又はＥＺｖｉｅｗ Ｒｅｄ 抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体アフィニティーゲル（Ｍｅｒｃｋ社製、製品名：Ｆ２４２６）を１０μＬ新しい１．５ｍＬチューブに分取し、Ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ ＃１を１００μＬ更に加えて、ビーズ又はアフィニティーゲルを洗浄した。洗浄後、磁気分離又は遠心処理（３０００ｒｐｍ、４℃、５分間）によって、上清とビーズ又はアフィニティーゲルとに分けて、上清を除去した。
抗ＨＡ Ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓ（Ｍｅｒｃｋ社製、製品名：ＳＡＥ０９７）又はＥＺｖｉｅｗ Ｒｅｄ 抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体アフィニティーゲル（Ｍｅｒｃｋ社製、製品名：Ｆ２４２６）を１０μＬ新しい１．５ｍＬチューブに分取し、Ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ ＃１を１００μＬ更に加えて、ビーズ又はアフィニティーゲルを洗浄した。洗浄後、磁気分離又は遠心処理（３０００ｒｐｍ、４℃、５分間）によって、上清とビーズ又はアフィニティーゲルとに分けて、上清を除去した。
【0082】
第二回収工程で回収した上清を、洗浄したビーズ又は洗浄したアフィニティーゲルに加えて、定温で静置した（４℃、１時間）。この操作によって、改変体ＲｐＬ１０ａにおけるＨＡ領域（又は３ｘＦＬＡＧ領域）（第三タグ領域）に抗ＨＡ抗体（又は上記抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体）（第三結合タンパク質）が結合し、改変体リボソームと抗ＨＡ抗体（又は抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体）との複合体が形成される。その後、上記チューブにＷａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ ＃２を１００μＬ加えて、上記ビーズ又は上記アフィニティーゲルを洗浄した。洗浄後、磁気分離又は遠心処理（３０００ｒｐｍ、４℃、５分間）によって、上清とビーズ又はアフィニティーゲルとに分けて、上清を除去した。この洗浄操作を合計３回行った。
【0083】
洗浄したビーズ又は洗浄したアフィニティーゲルが入っているチューブに、ＲＬＴ ｂｕｆｆｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ社製、製品番号：７９２１６）を３５０μＬ加えて、懸濁液として定温で静置した（５分間、４℃）。その後、ＲＬＴ ｂｕｆｆｅｒを含む上記懸濁液を回収した。以上の操作により第三回収工程を行った。
【0084】
＜５．ＲＮＡのクリーンアップ（精製）＞
上述の第二回収工程又は第三回収工程において回収した「ＲＬＴ ｂｕｆｆｅｒを含む懸濁液」から、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ社製、製品番号：７４００４）を用いて、ＲＮＡを精製した。精製したＲＮＡは、１４μＬのＲＮａｓｅを含まない水に溶解した状態で回収した。精製したＲＮＡには、改変体リボソームに結合していたｍＲＮＡが含まれている。以上より、改変体リボソームに結合するｍＲＮＡ（対象ｍＲＮＡ）を回収した。
上述の第二回収工程又は第三回収工程において回収した「ＲＬＴ ｂｕｆｆｅｒを含む懸濁液」から、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ社製、製品番号：７４００４）を用いて、ＲＮＡを精製した。精製したＲＮＡは、１４μＬのＲＮａｓｅを含まない水に溶解した状態で回収した。精製したＲＮＡには、改変体リボソームに結合していたｍＲＮＡが含まれている。以上より、改変体リボソームに結合するｍＲＮＡ（対象ｍＲＮＡ）を回収した。
【0085】
≪対象ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡの合成及び増幅≫
ＳＭＡＲＴ－Ｓｅｑ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ＰＬＵＳ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社製、製品番号：Ｒ４００７５０）に添付の試薬を使用して、以下の手順で対象ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡを合成及び増幅した。
ＳＭＡＲＴ－Ｓｅｑ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ＰＬＵＳ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社製、製品番号：Ｒ４００７５０）に添付の試薬を使用して、以下の手順で対象ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡを合成及び増幅した。
【0086】
＜ｃＤＮＡの合成＞
以下の配合組成で１０ｘＲｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを調製した。
（１０ｘＲｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒの組成）
１０ｘＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ： １９μＬ
ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ： １μＬ
以下の配合組成で１０ｘＲｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを調製した。
（１０ｘＲｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒの組成）
１０ｘＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ： １９μＬ
ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ： １μＬ
【0087】
以下の配合組成でｍＲＮＡ溶液を調製した。調製したｍＲＮＡ溶液を７２℃、３分間の条件で熱処理し、その後、すぐに氷上で２分間、静置した。
（ｍＲＮＡ溶液の組成）
上述の精製したＲＮＡの溶液： ２μＬ
１０ｘＲｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ： １μＬ
Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ： ８．５μＬ
３’ＳＭＡＲＴ－Ｓｅｑ ＣＤＳ ｐｒｉｍｅｒ ＩＩＡ： １μＬ
（ｍＲＮＡ溶液の組成）
上述の精製したＲＮＡの溶液： ２μＬ
１０ｘＲｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ： １μＬ
Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ： ８．５μＬ
３’ＳＭＡＲＴ－Ｓｅｑ ＣＤＳ ｐｒｉｍｅｒ ＩＩＡ： １μＬ
【0088】
以下の配合組成のＲｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＲＴ） ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘを調製した。
（ＲＴ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘの組成）
ＳＭＡＲＴ－Ｓｅｑ ｓｃ ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｂｕｆｆｅｒ： ４μＬ
ＳＭＡＲＴ－Ｓｅｑ ｓｃ ＴＳＯ： １μＬ
ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０Ｕ／ｍＬ） ０．５μＬ
ＳＭＡＲＴＳｃｒｉｂｅ ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ tｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ：２μＬ
（ＲＴ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘの組成）
ＳＭＡＲＴ－Ｓｅｑ ｓｃ ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｂｕｆｆｅｒ： ４μＬ
ＳＭＡＲＴ－Ｓｅｑ ｓｃ ＴＳＯ： １μＬ
ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０Ｕ／ｍＬ） ０．５μＬ
ＳＭＡＲＴＳｃｒｉｂｅ ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ tｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ：２μＬ
【0089】
その後、以下の配合組成でＲＴ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘと、上記ｍＲＮＡ溶液とを混合して、ｃＤＮＡ合成反応液を得た。得られたｃＤＮＡ合成反応液を、ＰＣＲサーマルサイクラーを用いて、４２℃で１８０分間処理した後に７０℃で１０分間処理した。以上の操作によって、対象ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡを合成した。
（ｃＤＮＡ合成反応液の組成）
ｍＲＮＡ溶液： １２．５μＬ
ＲＴ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ： ７．５μＬ
（ｃＤＮＡ合成反応液の組成）
ｍＲＮＡ溶液： １２．５μＬ
ＲＴ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ： ７．５μＬ
【0090】
＜Ｌｏｎｇ－ｄｉｓｔａｎｃｅ（ＬＤ） ＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅＞
以下の配合組成でｃＤＮＡ増幅反応液を調製した。ここで下記「ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ」は、５’キャップ構造に結合するＰＣＲプライマーおよびｐｏｌｙ（Ａ）配列に結合するＰＣＲプライマーを含んでいる。
（ｃＤＮＡ増幅反応液の組成）
ｃＤＮＡ合成反応液： ２０μＬ
ＳｅｑＡｍｐ ＣＢ ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ： ２５μＬ
ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ： １μＬ
ＳｅｑＡｍｐ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ： １μＬ
Ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ： ３μＬ
以下の配合組成でｃＤＮＡ増幅反応液を調製した。ここで下記「ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ」は、５’キャップ構造に結合するＰＣＲプライマーおよびｐｏｌｙ（Ａ）配列に結合するＰＣＲプライマーを含んでいる。
（ｃＤＮＡ増幅反応液の組成）
ｃＤＮＡ合成反応液： ２０μＬ
ＳｅｑＡｍｐ ＣＢ ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ： ２５μＬ
ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ： １μＬ
ＳｅｑＡｍｐ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ： １μＬ
Ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ： ３μＬ
【0091】
上記ｃＤＮＡ増幅反応液を、ＰＣＲサーマルサイクラーを用いて以下のサイクル条件で処理した。なお、「（２）Ｘサイクル」におけるサイクル数は、定量性を維持するために、後述する「増幅済みｃＤＮＡの定量」においてｃＤＮＡの収量が１，５００ｐｇ未満になるように決定した。以上の操作によって、対象ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡを増幅した（増幅工程）。
（ＰＣＲのサイクル条件）
（１）９５℃ １分間
（２）Ｘサイクル：
９８℃ １０秒間
６５℃ ３０秒間
６８℃ ３分間
（３）７０℃ １０分間
（４）４℃ Ｆｏｒｅｖｅｒ
（ＰＣＲのサイクル条件）
（１）９５℃ １分間
（２）Ｘサイクル：
９８℃ １０秒間
６５℃ ３０秒間
６８℃ ３分間
（３）７０℃ １０分間
（４）４℃ Ｆｏｒｅｖｅｒ
【0092】
＜増幅済みｃＤＮＡの精製＞
増幅工程を行った後のｃＤＮＡ増幅反応液に、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製、製品番号：Ａ６３８８０）を４０μＬを加えて混合液として、静置した（室温、８分間）。
増幅工程を行った後のｃＤＮＡ増幅反応液に、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製、製品番号：Ａ６３８８０）を４０μＬを加えて混合液として、静置した（室温、８分間）。
【0093】
上記混合液をＳＭＡＲＴｅｒ－Ｓｅｑ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ－ＰＣＲ Ｓｔｒｉｐ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社製、製品番号：６３５０１１）にセットして、静置した（室温又は２５℃、５分間）。その後、上清を除去して、残ったビーズを８０％エタノール水溶液（２００μＬ、２回）で洗浄した。洗浄後、８０％エタノール水溶液を除去して、ビーズを乾燥させた（室温又は２５℃、２～２．５分間）。
【0094】
乾燥させたビーズをＥｌｕｓｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（１７μＬ）に懸濁させて静置した（室温又は２５℃、２分間）。この懸濁液をＳＭＡＲＴｅｒ－Ｓｅｑ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ－ＰＣＲ Ｓｔｒｉｐ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社製、製品名：６３５０１１）にセットして、静置した（室温、５分間）。その後、増幅済みｃＤＮＡを含む上清を新しい１．５ｍＬチューブに回収した。回収した増幅済みｃＤＮＡは、従来法と比較して、純度が高く、後述する遺伝子解析に影響を与える不純物（対象外のＤＮＡ、ＲＮＡ等）をほとんど含まない。そのため、回収した増幅済みｃＤＮＡは、リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、ＤＮＡマイクロアレイ、次世代シーケンス解析（例えば、ＴＲＡＰ－ｓｅｑ）、及びサザンブロットなど、様々なアプリケーションに好適に使用できる。
【0095】
なお、比較例として、第二回収工程及び増幅工程を行うことなく、第一回収工程で得られた対象ｍＲＮＡから直接ｃＤＮＡを合成してサンプルを得ることを試みたが、ＮＧＳライブラリーを作製するために十分な量のｃＤＮＡを得ることができなかった（図９）。
【0096】
≪ＮＧＳライブラリーの作製≫
回収した増幅済みｃＤＮＡを用いて、以下の手順でＮＧＳライブラリーを作製した。ここで用いたｃＤＮＡは、上述の第二回収工程まで行ったｍＲＮＡから作製したものである（第一回収工程のタグ：ＥＧＦＰ、第二回収工程のタグ：ＦＬＡＧ）。
回収した増幅済みｃＤＮＡを用いて、以下の手順でＮＧＳライブラリーを作製した。ここで用いたｃＤＮＡは、上述の第二回収工程まで行ったｍＲＮＡから作製したものである（第一回収工程のタグ：ＥＧＦＰ、第二回収工程のタグ：ＦＬＡＧ）。
【0097】
＜増幅済みｃＤＮＡの定量＞
回収した増幅済みｃＤＮＡを、Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ社製、製品番号：Ｑ３２５８１）を用いて定量した。
回収した増幅済みｃＤＮＡを、Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ社製、製品番号：Ｑ３２５８１）を用いて定量した。
【0098】
＜増幅済みｃＤＮＡのサイズ分布の確認＞
回収した増幅済みｃＤＮＡのサイズ分布を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ＤＮＡ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製、商品番号：５０６７－４６２６）及びＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて解析した。
回収した増幅済みｃＤＮＡのサイズ分布を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ＤＮＡ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製、商品番号：５０６７－４６２６）及びＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて解析した。
【0099】
＜ＮＧＳライブラリーの作製＞
ＳＭＡＲＴ－Ｓｅｑ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ＰＬＵＳ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社製、製品名：Ｒ４００７５０）に添付の試薬を使用して、以下のプロトコルでＮＧＳライブラリーを作製した。
ＳＭＡＲＴ－Ｓｅｑ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ＰＬＵＳ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社製、製品名：Ｒ４００７５０）に添付の試薬を使用して、以下のプロトコルでＮＧＳライブラリーを作製した。
【0100】
Ｅｌｕｓｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを用いて、上記で定量したｃＤＮＡを濃度１００ｐｇ／μＬ、容量８μＬとなるように調製した。得られた溶液に対して、Ｓｔｅｍ－Ｌｏｏｐ Ａｄａｐｔｅｒｓを４μＬ加えて、ｃＤＮＡ－Ｓｔｅｍ－Ｌｏｏｐ Ａｄａｐｔｅｒｓ混合溶液を得た。
【0101】
以下の配合組成をそれぞれ有する１ｘＦＥ溶液及びＬｉｂｒａｒｙ ｐｒｅｐ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘを作製した。
（１ｘＦＥの組成）
１０ｘＦＥ： ０．１μＬ
ＦＥ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ： ０．９μＬ
（１ｘＦＥの組成）
１０ｘＦＥ： ０．１μＬ
ＦＥ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ： ０．９μＬ
【0102】
（Ｌｉｂｒａｒｙ ｐｒｅｐ ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘの組成）
Ｌｉｂｒａｒｙ ｐｒｅｐ ｂｕｆｆｅｒ： ４μＬ
Ｒｘｎ ｅｎｈａｎｃｅｒ： ３．５μＬ
Ｌｉｂｒａｒｙ ｐｒｅｐ ｅｎｚｙｍｅ： ２μＬ
１ｘＦＥ： １μＬ
Ｌｉｂｒａｒｙ ｐｒｅｐ ｂｕｆｆｅｒ： ４μＬ
Ｒｘｎ ｅｎｈａｎｃｅｒ： ３．５μＬ
Ｌｉｂｒａｒｙ ｐｒｅｐ ｅｎｚｙｍｅ： ２μＬ
１ｘＦＥ： １μＬ
【0103】
上記ｃＤＮＡ－Ｓｔｅｍ－Ｌｏｏｐ Ａｄａｐｔｅｒｓ混合溶液（１２μＬ）に、上記Ｌｉｂｒａｒｙ ｐｒｅｐ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（１０．５μＬ）を加えた。得られた混合液を、ＰＣＲサーマルサイクラーを用いて以下の条件で処理した。
（処理条件）
２０℃ ４０分間
８５℃ １０分間
（処理条件）
２０℃ ４０分間
８５℃ １０分間
【0104】
処理した後の上記混合液（２２．５μＬ）に、以下の配合組成を有するＬｉｂｒａｒｙ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（２２．５μＬ）を加えた。
（Ｌｉｂｒａｒｙ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘの組成）
Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ： ２１．５μＬ
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／ｍＬ）： １μＬ
（Ｌｉｂｒａｒｙ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘの組成）
Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ： ２１．５μＬ
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／ｍＬ）： １μＬ
【0105】
得られた混合液（４５μL）に、Ｉｎｄｅｘ溶液（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社製、製品番号：Ｒ４００７５１）を５μＬ加えた。
【0106】
得られた混合液を、ＰＣＲサーマルサイクラーを用いて以下のサイクル条件で処理した。
（ＰＣＲのサイクル条件）
（１）７２℃ ３分間
（２）８５℃ ２分間
（３）９８℃ ２分間
（４）１５ ｃｙｃｌｅｓ：
９８℃ ２０秒間
６０℃ ７５秒間
（５）６８℃ ５分間
（ＰＣＲのサイクル条件）
（１）７２℃ ３分間
（２）８５℃ ２分間
（３）９８℃ ２分間
（４）１５ ｃｙｃｌｅｓ：
９８℃ ２０秒間
６０℃ ７５秒間
（５）６８℃ ５分間
【0107】
＜ＮＧＳライブラリーの精製＞
上述のＰＣＲを行った後の混合液に、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製、製品番号：Ａ６３８８０）を３０μＬを加えて混合液として、静置した（室温又は２５℃、５分間）。
上述のＰＣＲを行った後の混合液に、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製、製品番号：Ａ６３８８０）を３０μＬを加えて混合液として、静置した（室温又は２５℃、５分間）。
【0108】
上記混合液をＳＭＡＲＴｅｒ－Ｓｅｑ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ－ＰＣＲ Ｓｔｒｉｐ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社製、製品番号：６３５０１１）にセットして、静置した（室温又は２５℃、２分間）。その後、上清を除去して、残ったビーズを８０％エタノール水溶液（２００μＬ、２回）で洗浄した。洗浄後、８０％エタノール水溶液を除去して、ビーズを乾燥させた（室温又は２５℃、２～２．５分間）。
【0109】
乾燥させたビーズをＥｌｕｓｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（１８μＬ）に懸濁させて静置した（室温、５分間）。この懸濁液をＳＭＡＲＴｅｒ－Ｓｅｑ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ－ＰＣＲ Ｓｔｒｉｐ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社製、製品名：６３５０１１）にセットして、静置した（室温又は２５℃、５分間）。その後、ＮＧＳライブラリーを含む上清を新しい１．５ｍＬチューブに回収した。以上の操作により、ＮＧＳライブラリーを作製した。
【0110】
≪次世代シーケンス解析（解析工程）≫
得られたＮＧＳライブラリーを、ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＮｏｖａｓｅｑ６０００シーケンサーシステムを使用して、公知の方法でシーケンスした。
得られたＮＧＳライブラリーを、ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＮｏｖａｓｅｑ６０００シーケンサーシステムを使用して、公知の方法でシーケンスした。
【0111】
得られたデータは、ＦａｓｔｐソフトウェアでＡｄａｐｔｏｒ ｔｒｉｍｍｉｎｇを行い、ＳＴＡＲソフトウェアでＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ｇｅｎｏｍｅ（Ｒｅｌｅａｓｅ ６）にＭａｐｐｉｎｇした。また得られたデータは、ＳｔｒｉｎｇＴｉｅソフトウェアで遺伝子発現量を定量した。主成分分析（ＰＣＡ解析）（図５）、差次的発現遺伝子の解析（図６、図８）、及びネットワーク解析（図７）は、Ｒソフトウェアを使用した。
【0112】
解析を行った結果、単独飼育群と集団飼育群とでは、発現する遺伝子に差異があることが分かった。
【0113】
以上のように本発明の実施形態及び実施例について説明を行なったが、上述の各実施形態及び各実施例の構成を適宜組み合わせることも当初から予定している。
【0114】
今回開示された実施の形態及び実施例はすべての点で例示であって、制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した実施の形態及び実施例ではなく特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味、及び範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】