(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024078049
(43)【公開日】2024-06-10
(54)【発明の名称】自家和合性を有するアブラナ科植物の作出方法
(51)【国際特許分類】
A01H 1/00 20060101AFI20240603BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20240603BHJP
A01H 6/20 20180101ALI20240603BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20240603BHJP
【ＦＩ】
A01H1/00 A
C12N15/113 Z ZNA
A01H6/20
C12N15/09 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】20
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022190368
(22)【出願日】2022-11-29
(71)【出願人】
【識別番号】504143441
【氏名又は名称】国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】和田 七夕子
(72)【発明者】
【氏名】小林 利紗
(72)【発明者】
【氏名】押井 夏海
(72)【発明者】
【氏名】伊藤 寿朗
(72)【発明者】
【氏名】高山 誠司
(72)【発明者】
【氏名】片岡 修
【テーマコード（参考）】
2B030
【Ｆターム（参考）】
2B030AA02
2B030AB03
2B030AD20
2B030CA17
2B030CA19
(57)【要約】
【課題】自家不和合性のアブラナ科植物を自家和合性に変換する方法を提供すること。
【解決手段】自家不和合性アブラナ科植物に、ＳＩＩハプロタイプのＳＰ１１を不活性化する低分子ＲＮＡをコードする配列を含む核酸を導入する。
【選択図】なし
【解決手段】自家不和合性アブラナ科植物に、ＳＩＩハプロタイプのＳＰ１１を不活性化する低分子ＲＮＡをコードする配列を含む核酸を導入する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
自家和合性アブラナ科植物を製造する方法であって、
自家不和合性アブラナ科植物に低分子ＲＮＡをコードする配列を含む核酸を導入する工程を含み、
前記低分子ＲＮＡが、ＳＩＩハプロタイプの花粉因子ＳＰ１１を不活性化させるＲＮＡであり、
前記自家不和合性アブラナ科植物が、自家不和合性遺伝子座において、
ＳＩハプロタイプを有さず、
Ｓ４４ハプロタイプを有する、
製造方法。
自家不和合性アブラナ科植物に低分子ＲＮＡをコードする配列を含む核酸を導入する工程を含み、
前記低分子ＲＮＡが、ＳＩＩハプロタイプの花粉因子ＳＰ１１を不活性化させるＲＮＡであり、
前記自家不和合性アブラナ科植物が、自家不和合性遺伝子座において、
ＳＩハプロタイプを有さず、
Ｓ４４ハプロタイプを有する、
製造方法。
【請求項2】
花粉因子ＳＰ１１の不活性化が、ＳＰ１１発現調節領域のＤＮＡメチル化及び／又はＳＰ１１転写産物の蓄積量の減少である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項3】
ＳＩＩハプロタイプが、Ｓ４４ハプロタイプである、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項4】
ＳＩＩハプロタイプの花粉因子ＳＰ１１を不活性化させる低分子ＲＮＡが、以下の（ｉ）又は（ｉｉ）の塩基配列を含む、請求項１又は２に記載の製造方法。
（ｉ）５’－ＡＵＡＣＡＣＣＵＵＵＵＵＣＧＵＧＵＡＵＡＵＣＵＵ－３’（配列番号１）
（ｉｉ）塩基配列（ｉ）において、１、２又は３個の塩基が、置換、欠失、もしくは付加された塩基配列
（ｉ）５’－ＡＵＡＣＡＣＣＵＵＵＵＵＣＧＵＧＵＡＵＡＵＣＵＵ－３’（配列番号１）
（ｉｉ）塩基配列（ｉ）において、１、２又は３個の塩基が、置換、欠失、もしくは付加された塩基配列
【請求項5】
自家和合性アブラナ科植物の植物体であって、
自家不和合性遺伝子座において、
ＳＩハプロタイプを有さず、
Ｓ４４ハプロタイプを有し、
低分子ＲＮＡをコードする配列を含む外因性の核酸配列を有し、
前記低分子ＲＮＡが、ＳＩＩハプロタイプの花粉因子ＳＰ１１を不活性化させるＲＮＡである、
植物体。
自家不和合性遺伝子座において、
ＳＩハプロタイプを有さず、
Ｓ４４ハプロタイプを有し、
低分子ＲＮＡをコードする配列を含む外因性の核酸配列を有し、
前記低分子ＲＮＡが、ＳＩＩハプロタイプの花粉因子ＳＰ１１を不活性化させるＲＮＡである、
植物体。
【請求項6】
花粉因子ＳＰ１１の不活性化が、ＳＰ１１発現調節領域のＤＮＡメチル化及び／又はＳＰ１１転写産物の蓄積量の減少である、請求項５に記載の植物体。
【請求項7】
ＳＩＩハプロタイプが、Ｓ４４ハプロタイプである、請求項５又は６に記載の植物体。
【請求項8】
ＳＩＩハプロタイプの花粉因子ＳＰ１１を不活性化させる低分子ＲＮＡが、以下の（ｉ）又は（ｉｉ）の塩基配列を含む、請求項５又は６に記載の植物体。
（ｉ）５’－ＡＵＡＣＡＣＣＵＵＵＵＵＣＧＵＧＵＡＵＡＵＣＵＵ－３’（配列番号１）
（ｉｉ）塩基配列（ｉ）において、１、２又は３個の塩基が、置換、欠失、もしくは付加された塩基配列。
（ｉ）５’－ＡＵＡＣＡＣＣＵＵＵＵＵＣＧＵＧＵＡＵＡＵＣＵＵ－３’（配列番号１）
（ｉｉ）塩基配列（ｉ）において、１、２又は３個の塩基が、置換、欠失、もしくは付加された塩基配列。
【請求項9】
請求項５又は６に記載の自家和合性アブラナ科植物の植物体から、自殖又は他殖により自家不和合性アブラナ科植物の植物体を得る方法。
【請求項10】
請求項７に記載の自家和合性アブラナ科植物の植物体を、
ＳＩハプロタイプを有さず、ＳＩＩハプロタイプを有する自家不和合性アブラナ科植物と交配する工程を含む、
前記自家不和合性アブラナ科植物を自家和合化する方法。
ＳＩハプロタイプを有さず、ＳＩＩハプロタイプを有する自家不和合性アブラナ科植物と交配する工程を含む、
前記自家不和合性アブラナ科植物を自家和合化する方法。
【請求項11】
自家和合性アブラナ科植物を製造する方法であって、
自家不和合性遺伝子座においてＳＩハプロタイプ及びＳ４４ハプロタイプを有さず、Ｓ４４ハプロタイプ以外のＳＩＩハプロタイプを有する自家不和合性アブラナ科植物に、低分子ＲＮＡをコードする配列を含む核酸を導入する工程、並びに、
前記低分子ＲＮＡをコードする核酸を導入した自家不和合性アブラナ科植物を、Ｓ４４ハプロタイプをホモで有する自家不和合性アブラナ科植物と交配する工程
を含み、
前記低分子ＲＮＡが、Ｓ４４ハプロタイプの花粉因子ＳＰ１１を不活性化させるＲＮＡである、製造方法。
自家不和合性遺伝子座においてＳＩハプロタイプ及びＳ４４ハプロタイプを有さず、Ｓ４４ハプロタイプ以外のＳＩＩハプロタイプを有する自家不和合性アブラナ科植物に、低分子ＲＮＡをコードする配列を含む核酸を導入する工程、並びに、
前記低分子ＲＮＡをコードする核酸を導入した自家不和合性アブラナ科植物を、Ｓ４４ハプロタイプをホモで有する自家不和合性アブラナ科植物と交配する工程
を含み、
前記低分子ＲＮＡが、Ｓ４４ハプロタイプの花粉因子ＳＰ１１を不活性化させるＲＮＡである、製造方法。
【請求項12】
花粉因子ＳＰ１１の不活性化が、ＳＰ１１発現調節領域のＤＮＡメチル化及び／又はＳＰ１１転写産物の蓄積量の減少である、請求項１１に記載の製造方法。
【請求項13】
Ｓ４４ハプロタイプの花粉因子ＳＰ１１を不活性化させる低分子ＲＮＡが、以下の（ｉ）又は（ｉｉ）の塩基配列を含む、請求項１１又は１２に記載の製造方法。
（ｉ）５’－ＡＵＡＣＡＣＣＵＵＵＵＵＣＧＵＧＵＡＵＡＵＣＵＵ－３’（配列番号１）
（ｉｉ）塩基配列（ｉ）において、１、２又は３個の塩基が、置換、欠失、もしくは付加された塩基配列
（ｉ）５’－ＡＵＡＣＡＣＣＵＵＵＵＵＣＧＵＧＵＡＵＡＵＣＵＵ－３’（配列番号１）
（ｉｉ）塩基配列（ｉ）において、１、２又は３個の塩基が、置換、欠失、もしくは付加された塩基配列
【請求項14】
請求項１１又は１２に記載の製造方法によって得られた自家和合性アブラナ科植物の植物体から、自殖又は他殖により自家不和合性アブラナ科植物の植物体を得る方法。
【請求項15】
アブラナ科植物のＳＩＩハプロタイプの花粉因子ＳＰ１１を不活性化させる低分子ＲＮＡをコードする配列を含む核酸の製造方法であって、
前記低分子ＲＮＡは特定の２４塩基を含み、かつ、当該特定の２４塩基は以下の条件を満たす、製造方法。
（ａ）ＳＰ１１遺伝子座のＣｉｓ標的配列に対するミスペアスコアが５．５以下であり、かつ５’末端側から１０番目の塩基がＣｉｓ標的配列中の対応する塩基と相補的塩基である。
前記低分子ＲＮＡは特定の２４塩基を含み、かつ、当該特定の２４塩基は以下の条件を満たす、製造方法。
（ａ）ＳＰ１１遺伝子座のＣｉｓ標的配列に対するミスペアスコアが５．５以下であり、かつ５’末端側から１０番目の塩基がＣｉｓ標的配列中の対応する塩基と相補的塩基である。
【請求項16】
前記低分子ＲＮＡに含まれる特定の２４塩基が、さらに以下の条件を満たす、請求項１５に記載の製造方法。
（ｂ）ＳＰ１１遺伝子座のＲＥＰ Ｃ標的配列に対するミスペアスコアが６．０以下である。
（ｂ）ＳＰ１１遺伝子座のＲＥＰ Ｃ標的配列に対するミスペアスコアが６．０以下である。
【請求項17】
前記低分子ＲＮＡが、以下の（ｉ）又は（ｉｉ）の塩基配列を含む、請求項１５又は１６に記載の製造方法。
（ｉ）５’－ＡＵＡＣＡＣＣＵＵＵＵＵＣＧＵＧＵＡＵＡＵＣＵＵ－３’（配列番号１）
（ｉｉ）塩基配列（ｉ）において、１、２又は３個の塩基が、置換、欠失、もしくは付加された塩基配列。
（ｉ）５’－ＡＵＡＣＡＣＣＵＵＵＵＵＣＧＵＧＵＡＵＡＵＣＵＵ－３’（配列番号１）
（ｉｉ）塩基配列（ｉ）において、１、２又は３個の塩基が、置換、欠失、もしくは付加された塩基配列。
【請求項18】
アブラナ科植物のＳＩＩハプロタイプの花粉因子ＳＰ１１を不活性化させる低分子ＲＮＡをコードする配列を含む核酸であって、
前記低分子ＲＮＡは特定の２４塩基を含み、かつ、当該特定の２４塩基は以下の条件を満たす、核酸（ただし、前記アブラナ科植物の内因性低分子ＲＮＡをコードする核酸を除く）。
（ａ）ＳＰ１１遺伝子座のＣｉｓ標的配列に対するミスペアスコアが５．５以下であり、かつ５’末端側から１０番目の塩基がＣｉｓ標的配列中の対応する塩基と相補的塩基である。
前記低分子ＲＮＡは特定の２４塩基を含み、かつ、当該特定の２４塩基は以下の条件を満たす、核酸（ただし、前記アブラナ科植物の内因性低分子ＲＮＡをコードする核酸を除く）。
（ａ）ＳＰ１１遺伝子座のＣｉｓ標的配列に対するミスペアスコアが５．５以下であり、かつ５’末端側から１０番目の塩基がＣｉｓ標的配列中の対応する塩基と相補的塩基である。
【請求項19】
前記低分子ＲＮＡに含まれる特定の２４塩基が、さらに以下の条件を満たす、請求項１８に記載の核酸。
（ｂ）ＳＰ１１遺伝子座のＲＥＰ Ｃ標的配列に対するミスペアスコアが６．０以下である。
（ｂ）ＳＰ１１遺伝子座のＲＥＰ Ｃ標的配列に対するミスペアスコアが６．０以下である。
【請求項20】
前記低分子ＲＮＡが、以下の（ｉ）又は（ｉｉ）の塩基配列を含む、請求項１８又は１９に記載の核酸。
（ｉ）５’－ＡＵＡＣＡＣＣＵＵＵＵＵＣＧＵＧＵＡＵＡＵＣＵＵ－３’（配列番号１）
（ｉｉ）塩基配列（ｉ）において、１、２又は３個の塩基が、置換、欠失、もしくは付加された塩基配列。
（ｉ）５’－ＡＵＡＣＡＣＣＵＵＵＵＵＣＧＵＧＵＡＵＡＵＣＵＵ－３’（配列番号１）
（ｉｉ）塩基配列（ｉ）において、１、２又は３個の塩基が、置換、欠失、もしくは付加された塩基配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、自家和合性を有するアブラナ科植物の作出方法等に関する。
【背景技術】
【0002】
アブラナ科植物は、中近東や地中海沿岸を起源とする植物種である。アブラナ科ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）属植物にはアブラナ、ハクサイ、コマツナ、カブ、チンゲンサイ、ケール、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、ダイコン、カラシナ等が含まれる。上記植物は野菜や香辛料として食用されるほか、アブラナの種子はナタネ油の原料となる。ナタネ油はバイオディーゼルの原料として地球温暖化対策の観点から近年注目されている。このように、アブラナ科植物には産業的利用価値の高い植物が多く含まれる。
【0003】
アブラナ科植物の多くは、柱頭に付着した花粉が遺伝的に同一の個体由来か、遺伝的に異なる個体由来かを識別し、遺伝的に同一な個体との受精を回避している。このような機構は、自家不和合性と呼ばれる。自家不和合性を有する植物は、自殖を回避し他殖を促すことで、近交弱勢を回避し、遺伝的多様性を保持しているものと考えられている。
【0004】
アブラナ科植物のなかでも、西洋アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）は自家和合性（すなわち、自殖が可能）であり、特に欧州や北米でバイオディーゼルの原料として広く栽培されている。しかし、低緯度の高温多湿地域においては、西洋アブラナの生育及び生産効率は良好とはいえない。したがって、栽培地域に応じた品種改良が必要とされるが、西洋アブラナは遺伝的多様性に乏しいため、交雑によって優良な形質を得る育種は困難である。
【0005】
一方、日本に古来より生育するアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ）は、遺伝的多様性に富むため、交雑によって優良な形質（例えば環境適合性や種子生産性の向上等）を有する株を作出できる可能性を有している。その一例として、ハクサイ、カブ、コマツナ、チンゲンサイ等の葉物野菜に広く用いられるＦ１ハイブリッド法が挙げられ、異なる純系の親同士を交配することで親の有用形質を受け継ぐ、あるいは親を超えて優れた形質を示すＦ１ハイブリッドが得られる技術である。有用形質として、例えば早生、多収、味やサイズの均質性等が挙げられる。アブラナが有する自家不和合性は、自殖種子の混入をなくしＦ１ハイブリッド種子の純度を挙げるために有用である。しかし、アブラナはこの自家不和合性のために単独系統で種子をつけることがなく、集団で栽培し自然交配に頼って系統を維持する必要があり、単独の系統を安定的に維持することが困難であるという問題も有している。
【0006】
このような背景から、アブラナ等の自家不和合性のアブラナ科植物を自家和合性に変換し、その遺伝的多様性を利用して効率的に優良品種を作出、維持する技術が検討されている。
【0007】
ここで、植物の自家不和合性について詳述する。自家不和合性の植物においては、自己の花粉が柱頭に付着しても、花粉の発芽や花粉管の伸長が阻害され、受精に至らないため種子が形成されない。アブラナ科植物の自家不和合性機構は、自家不和合性遺伝子座（Ｓ遺伝子座）上に連鎖して存在する一連の複対立遺伝子群（Ｓ１、Ｓ２、・・・Ｓｎハプロタイプ）によって制御されている。アブラナ科植物において、各Ｓハプロタイプにはリガンドとして機能する花粉因子ＳＰ１１と、レセプターとして機能する雌ずい因子ＳＲＫがコードされている。同一ＳハプロタイプにコードされたＳＰ１１とＳＲＫが特異的に相互作用することで、雌ずいは自己花粉を認識して自家不和合反応を誘起し、その結果自殖が回避される（非特許文献１、非特許文献２、図１）。
【0008】
なお、本開示において、遺伝子、核酸、又はタンパク質が由来するＳハプロタイプを「ＳＸ－」を用いて示すことがある。例えば、ＳＸ－ＳＰ１１はＳＸハプロタイプに由来するＳＰ１１を指すものとする。
【0009】
アブラナ科植物には１００以上ものＳハプロタイプが存在する。ヘテロ個体においては、花粉は２種類のＳハプロタイプ特性を示すことが予測される。しかし実際には、Ｓハプロタイプ間にはしばしば顕性潜性の関係が認められる。すなわち、ヘテロ個体の花粉が、片方のＳハプロタイプの特性しか示さない場合が存在する。アブラナ科植物のＳハプロタイプは、顕性を示すクラスＩハプロタイプと、クラスＩハプロタイプとのヘテロ体においては常に潜性を示すクラスＩＩハプロタイプとに大別される。本開示において、クラスＩのＳハプロタイプをＳＩハプロタイプ又は単にＳＩ、クラスＩＩのＳハプロタイプをＳＩＩハプロタイプ又は単にＳＩＩと表記することがある。ＳＩハプロタイプとＳＩＩハプロタイプとを有するヘテロ個体の花粉は、常にＳＩハプロタイプの特性を示す。また、ＳＩＩハプロタイプ同士のヘテロ個体の花粉は、直線的な顕性潜性の関係（Ｓ４４＞Ｓ６０＞Ｓ４０＞Ｓ２９）を示すことが明らかとなっている。すなわち、ＳＩハプロタイプとＳ４４ハプロタイプとを有するヘテロ個体の花粉は、ＳＩハプロタイプの特性を示し、Ｓ４４ハプロタイプとＳ６０ハプロタイプとを有するヘテロ個体の花粉は、Ｓ４４ハプロタイプの特性を示す（非特許文献１）。
【0010】
自家不和合性のアブラナ科植物を自家和合性に変換する技術として、例えば特許文献１には、アブラナ科植物の自家和合性変異株における、自家不和合性遺伝子座（Ｓ遺伝子座）において、クラスＩに属する顕性側Ｓハプロタイプ上の逆位反復配列（ＳＭＩ）を保持しつつ、花粉因子ＳＰ１１を欠失したＳ０ハプロタイプを見出し、この活用により、自家不和合性のアブラナ科植物を自家和合性に変換する技術が開示されている。特許文献１に開示された方法では、クラスＩのＳハプロタイプにおいて、逆位反復配列（ＳＭＩ）を保持したまま花粉因子ＳＰ１１を欠失したＳ0ハプロタイプを持つ株（Ｓ0株）と、クラスＩＩのＳハプロタイプを有する自家不和合性アブラナ科植物を交配させることにより、Ｆ１後代は花粉因子ＳＰ１１を発現しない自家和合性株となる（図２、３）。
【0011】
しかしながら、特許文献１に開示された方法において自家和合化できるのは、Ｓ０ハプロタイプをホモ（Ｓ０Ｓ０）もしくはヘテロ（Ｓ０ＳＩＩ）で有する株のみであった。すなわち特許文献１に開示された方法はＳＩＩＳＩＩ株の自家和合化には適用できないため、自家和合化できる栽培品種が制限される問題があった。また、交配する親系統が自家和合性であるため、Ｆ１ハイブリッド法による育種が困難という問題があった。なお、本開示において、あるアブラナ科植物の植物体の、自家不和合性遺伝子座（Ｓ遺伝子座）の遺伝子型を、ＳＸＳＸと表記することがある。例えば、ＳＩＳＩは、クラスＩのＳハプロタイプ（ＳＩ）を２つ有することを示す。このとき、ＳＩＳＩ株は、同一のクラスＩのＳハプロタイプを有しても（すなわちホモ）、異なるクラスＩのＳハプロタイプを有しても（すなわちヘテロ）、どちらでもよい。また、例えば、Ｓ４４Ｓ４４は、クラスＩＩのＳハプロタイプであるＳ４４ハプロタイプを、ホモで有することを示す。
【0012】
さらに、特許文献１に開示された方法においては、Ｓ０ハプロタイプ上の逆位反復配列（ＳＭＩ）に由来する低分子ＲＮＡを用いて自家不和合性のアブラナ科植物を自家和合化するため、自家和合化した株を再度自家不和合化するという可逆的な操作が不可能であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0013】
【特許文献1】国際公開第２０１４／１１５６８０号
【非特許文献】
【0014】
【非特許文献1】Yasuda, S. et al. A complex dominance hierarchy is controlled by polymorphism of small RNAs and their targets. Nat. Plants 3, 16206 (2016)
【非特許文献2】Tarutani, Y. et al. Trans -acting small RNA determines dominance relationships in Brassica self-incompatibility. Nature 466, 983-986 (2010)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0015】
本発明者らは、Ｓ０株を用いずに、自家不和合性のアブラナ科植物を自家和合性に変換する方法を提供することを主な目的とした。また、油脂生産に適した自家和合性株をＦ１ハイブリッド法により得るために、親系統では自家不和合性を保持し、Ｆ１ハイブリッドではじめて自家和合性を付与する方法を提供することも主な目的とした。また、自家和合性に変換したアブラナ科植物から、再度自家不和合性のアブラナ科植物を得る方法を提供することを主な目的とした。さらに、任意のＳＩＩハプロタイプのＳＰ１１を不活性化する低分子ＲＮＡの設計方法を提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【0016】
本発明者らは、自家不和合性アブラナ科植物に低分子ＲＮＡをコードする配列を含む核酸を導入することで、自家不和合性アブラナ科植物を自家和合性に変換できる可能性を見出した。そして、さらに改良を重ねて本開示を完成させるに至った。また、自家和合性に変換したアブラナ科植物から、自殖又は他殖により自家不和合性アブラナ科植物が得られる可能性、及び、任意のＳＩＩハプロタイプを有するアブラナ科植物を、自家和合性に変換する低分子ＲＮＡをコードする配列を含む核酸の設計方法を見出し、さらに改良を重ねて本開示を完成させるに至った。
【0017】
本開示は例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
自家和合性アブラナ科植物を製造する方法であって、
自家不和合性アブラナ科植物に低分子ＲＮＡをコードする配列を含む核酸を導入する工程を含み、
前記低分子ＲＮＡが、ＳＩＩハプロタイプの花粉因子ＳＰ１１を不活性化させるＲＮＡであり、
前記自家不和合性アブラナ科植物が、自家不和合性遺伝子座において、
ＳＩハプロタイプを有さず、
Ｓ４４ハプロタイプを有する、
製造方法。
項２．
花粉因子ＳＰ１１の不活性化が、ＳＰ１１発現調節領域のＤＮＡメチル化及び／又はＳＰ１１転写産物の蓄積量の減少である、項１に記載の製造方法。
項３．
ＳＩＩハプロタイプが、Ｓ４４ハプロタイプである、項１又は２に記載の製造方法。
項４．
ＳＩＩハプロタイプの花粉因子ＳＰ１１を不活性化させる低分子ＲＮＡが、以下の（ｉ）又は（ｉｉ）の塩基配列を含む、項１～３のいずれかに記載の製造方法。
（ｉ）５’－ＡＵＡＣＡＣＣＵＵＵＵＵＣＧＵＧＵＡＵＡＵＣＵＵ－３’（配列番号１）
（ｉｉ）塩基配列（ｉ）において、１、２又は３個の塩基が、置換、欠失、もしくは付加された塩基配列
項５．
自家和合性アブラナ科植物の植物体であって、
自家不和合性遺伝子座において、
ＳＩハプロタイプを有さず、
Ｓ４４ハプロタイプを有し、
低分子ＲＮＡをコードする配列を含む外因性の核酸配列を有し、
前記低分子ＲＮＡが、ＳＩＩハプロタイプの花粉因子ＳＰ１１を不活性化させるＲＮＡである、
植物体。
項６．
花粉因子ＳＰ１１の不活性化が、ＳＰ１１発現調節領域のＤＮＡメチル化及び／又はＳＰ１１転写産物の蓄積量の減少である、項５に記載の植物体。
項７．
ＳＩＩハプロタイプが、Ｓ４４ハプロタイプである、項５又は６に記載の植物体。
項８．
ＳＩＩハプロタイプの花粉因子ＳＰ１１を不活性化させる低分子ＲＮＡが、以下の（ｉ）又は（ｉｉ）の塩基配列を含む、項６又は７に記載の植物体。
（ｉ）５’－ＡＵＡＣＡＣＣＵＵＵＵＵＣＧＵＧＵＡＵＡＵＣＵＵ－３’（配列番号１）
（ｉｉ）塩基配列（ｉ）において、１、２又は３個の塩基が、置換、欠失、もしくは付加された塩基配列。
項９．
項５～８のいずれかに記載の自家和合性アブラナ科植物の植物体から、自殖又は他殖により自家不和合性アブラナ科植物の植物体を得る方法。
項１０．
項７に記載の自家和合性アブラナ科植物の植物体を、
ＳＩハプロタイプを有さず、ＳＩＩハプロタイプを有する自家不和合性アブラナ科植物と交配する工程を含む、
前記自家不和合性アブラナ科植物を自家和合化する方法。
項１１．
自家和合性アブラナ科植物を製造する方法であって、
自家不和合性遺伝子座においてＳＩハプロタイプ及びＳ４４ハプロタイプを有さず、Ｓ４４ハプロタイプ以外のＳＩＩハプロタイプを有する自家不和合性アブラナ科植物に、低分子ＲＮＡをコードする配列を含む核酸を導入する工程、並びに、
前記低分子ＲＮＡをコードする核酸を導入した自家不和合性アブラナ科植物を、Ｓ４４ハプロタイプをホモで有する自家不和合性アブラナ科植物と交配する工程
を含み、
前記低分子ＲＮＡが、Ｓ４４ハプロタイプの花粉因子ＳＰ１１を不活性化させるＲＮＡである、製造方法。
項１２．
花粉因子ＳＰ１１の不活性化が、ＳＰ１１発現調節領域のＤＮＡメチル化及び／又はＳＰ１１転写産物の蓄積量の減少である、項１１に記載の製造方法。
項１３．
Ｓ４４ハプロタイプの花粉因子ＳＰ１１を不活性化させる低分子ＲＮＡが、以下の（ｉ）又は（ｉｉ）の塩基配列を含む、項１１又は１２に記載の製造方法。
（ｉ）５’－ＡＵＡＣＡＣＣＵＵＵＵＵＣＧＵＧＵＡＵＡＵＣＵＵ－３’（配列番号１）
（ｉｉ）塩基配列（ｉ）において、１、２又は３個の塩基が、置換、欠失、もしくは付加された塩基配列
項１４．
項１１～１３のいずれかに記載の製造方法によって得られた自家和合性アブラナ科植物の植物体から、自殖又は他殖により自家不和合性アブラナ科植物の植物体を得る方法。
項１５．
アブラナ科植物のＳＩＩハプロタイプの花粉因子ＳＰ１１を不活性化させる低分子ＲＮＡをコードする配列を含む核酸の製造方法であって、
前記低分子ＲＮＡは特定の２４塩基を含み、かつ、当該特定の２４塩基は以下の条件を満たす、製造方法。
（ａ）ＳＰ１１遺伝子座のＣｉｓ標的配列に対するミスペアスコアが５．５以下であり、かつ５’末端側から１０番目の塩基がＣｉｓ標的配列中の対応する塩基と相補的塩基である。
項１６．
前記低分子ＲＮＡに含まれる特定の２４塩基が、さらに以下の条件を満たす、項１５に記載の製造方法。
（ｂ）ＳＰ１１遺伝子座のＲＥＰ Ｃ標的配列に対するミスペアスコアが６．０以下である。
項１７．
前記低分子ＲＮＡが、以下の（ｉ）又は（ｉｉ）の塩基配列を含む、項１５又は１６に記載の製造方法。
（ｉ）５’－ＡＵＡＣＡＣＣＵＵＵＵＵＣＧＵＧＵＡＵＡＵＣＵＵ－３’（配列番号１）
（ｉｉ）塩基配列（ｉ）において、１、２又は３個の塩基が、置換、欠失、もしくは付加された塩基配列。
項１８．
アブラナ科植物のＳＩＩハプロタイプの花粉因子ＳＰ１１を不活性化させる低分子ＲＮＡをコードする配列を含む核酸であって、
前記低分子ＲＮＡは特定の２４塩基を含み、かつ、当該特定の２４塩基は以下の条件を満たす、核酸（ただし、前記アブラナ科植物の内因性低分子ＲＮＡをコードする核酸を除く）。
（ａ）ＳＰ１１遺伝子座のＣｉｓ標的配列に対するミスペアスコアが５．５以下であり、かつ５’末端側から１０番目の塩基がＣｉｓ標的配列中の対応する塩基と相補的塩基である。
項１９．
前記低分子ＲＮＡに含まれる特定の２４塩基が、さらに以下の条件を満たす、項１８に記載の核酸。
（ｂ）ＳＰ１１遺伝子座のＲＥＰ Ｃ標的配列に対するミスペアスコアが６．０以下である。
項２０．
前記低分子ＲＮＡが、以下の（ｉ）又は（ｉｉ）の塩基配列を含む、項１８又は１９に記載の核酸。
（ｉ）５’－ＡＵＡＣＡＣＣＵＵＵＵＵＣＧＵＧＵＡＵＡＵＣＵＵ－３’（配列番号１）
（ｉｉ）塩基配列（ｉ）において、１、２又は３個の塩基が、置換、欠失、もしくは付加された塩基配列。
項２１．
前記アブラナ科植物が、Ｂｒａｓｓｉｃａ属植物である、項１～４、１１～１３及び１５～１７のいずれかに記載の製造方法。
項２２．
前記アブラナ科植物が、Ｂｒａｓｓｉｃａ属植物である、項５～８のいずれかに記載の植物体。
項２３．
前記アブラナ科植物が、Ｂｒａｓｓｉｃａ属植物である、項９、１０及び１４のいずれかに記載の方法。
項２４．
前記アブラナ科植物が、Ｂｒａｓｓｉｃａ属植物である、項１８～２０のいずれかに記載の核酸。
項１．
自家和合性アブラナ科植物を製造する方法であって、
自家不和合性アブラナ科植物に低分子ＲＮＡをコードする配列を含む核酸を導入する工程を含み、
前記低分子ＲＮＡが、ＳＩＩハプロタイプの花粉因子ＳＰ１１を不活性化させるＲＮＡであり、
前記自家不和合性アブラナ科植物が、自家不和合性遺伝子座において、
ＳＩハプロタイプを有さず、
Ｓ４４ハプロタイプを有する、
製造方法。
項２．
花粉因子ＳＰ１１の不活性化が、ＳＰ１１発現調節領域のＤＮＡメチル化及び／又はＳＰ１１転写産物の蓄積量の減少である、項１に記載の製造方法。
項３．
ＳＩＩハプロタイプが、Ｓ４４ハプロタイプである、項１又は２に記載の製造方法。
項４．
ＳＩＩハプロタイプの花粉因子ＳＰ１１を不活性化させる低分子ＲＮＡが、以下の（ｉ）又は（ｉｉ）の塩基配列を含む、項１～３のいずれかに記載の製造方法。
（ｉ）５’－ＡＵＡＣＡＣＣＵＵＵＵＵＣＧＵＧＵＡＵＡＵＣＵＵ－３’（配列番号１）
（ｉｉ）塩基配列（ｉ）において、１、２又は３個の塩基が、置換、欠失、もしくは付加された塩基配列
項５．
自家和合性アブラナ科植物の植物体であって、
自家不和合性遺伝子座において、
ＳＩハプロタイプを有さず、
Ｓ４４ハプロタイプを有し、
低分子ＲＮＡをコードする配列を含む外因性の核酸配列を有し、
前記低分子ＲＮＡが、ＳＩＩハプロタイプの花粉因子ＳＰ１１を不活性化させるＲＮＡである、
植物体。
項６．
花粉因子ＳＰ１１の不活性化が、ＳＰ１１発現調節領域のＤＮＡメチル化及び／又はＳＰ１１転写産物の蓄積量の減少である、項５に記載の植物体。
項７．
ＳＩＩハプロタイプが、Ｓ４４ハプロタイプである、項５又は６に記載の植物体。
項８．
ＳＩＩハプロタイプの花粉因子ＳＰ１１を不活性化させる低分子ＲＮＡが、以下の（ｉ）又は（ｉｉ）の塩基配列を含む、項６又は７に記載の植物体。
（ｉ）５’－ＡＵＡＣＡＣＣＵＵＵＵＵＣＧＵＧＵＡＵＡＵＣＵＵ－３’（配列番号１）
（ｉｉ）塩基配列（ｉ）において、１、２又は３個の塩基が、置換、欠失、もしくは付加された塩基配列。
項９．
項５～８のいずれかに記載の自家和合性アブラナ科植物の植物体から、自殖又は他殖により自家不和合性アブラナ科植物の植物体を得る方法。
項１０．
項７に記載の自家和合性アブラナ科植物の植物体を、
ＳＩハプロタイプを有さず、ＳＩＩハプロタイプを有する自家不和合性アブラナ科植物と交配する工程を含む、
前記自家不和合性アブラナ科植物を自家和合化する方法。
項１１．
自家和合性アブラナ科植物を製造する方法であって、
自家不和合性遺伝子座においてＳＩハプロタイプ及びＳ４４ハプロタイプを有さず、Ｓ４４ハプロタイプ以外のＳＩＩハプロタイプを有する自家不和合性アブラナ科植物に、低分子ＲＮＡをコードする配列を含む核酸を導入する工程、並びに、
前記低分子ＲＮＡをコードする核酸を導入した自家不和合性アブラナ科植物を、Ｓ４４ハプロタイプをホモで有する自家不和合性アブラナ科植物と交配する工程
を含み、
前記低分子ＲＮＡが、Ｓ４４ハプロタイプの花粉因子ＳＰ１１を不活性化させるＲＮＡである、製造方法。
項１２．
花粉因子ＳＰ１１の不活性化が、ＳＰ１１発現調節領域のＤＮＡメチル化及び／又はＳＰ１１転写産物の蓄積量の減少である、項１１に記載の製造方法。
項１３．
Ｓ４４ハプロタイプの花粉因子ＳＰ１１を不活性化させる低分子ＲＮＡが、以下の（ｉ）又は（ｉｉ）の塩基配列を含む、項１１又は１２に記載の製造方法。
（ｉ）５’－ＡＵＡＣＡＣＣＵＵＵＵＵＣＧＵＧＵＡＵＡＵＣＵＵ－３’（配列番号１）
（ｉｉ）塩基配列（ｉ）において、１、２又は３個の塩基が、置換、欠失、もしくは付加された塩基配列
項１４．
項１１～１３のいずれかに記載の製造方法によって得られた自家和合性アブラナ科植物の植物体から、自殖又は他殖により自家不和合性アブラナ科植物の植物体を得る方法。
項１５．
アブラナ科植物のＳＩＩハプロタイプの花粉因子ＳＰ１１を不活性化させる低分子ＲＮＡをコードする配列を含む核酸の製造方法であって、
前記低分子ＲＮＡは特定の２４塩基を含み、かつ、当該特定の２４塩基は以下の条件を満たす、製造方法。
（ａ）ＳＰ１１遺伝子座のＣｉｓ標的配列に対するミスペアスコアが５．５以下であり、かつ５’末端側から１０番目の塩基がＣｉｓ標的配列中の対応する塩基と相補的塩基である。
項１６．
前記低分子ＲＮＡに含まれる特定の２４塩基が、さらに以下の条件を満たす、項１５に記載の製造方法。
（ｂ）ＳＰ１１遺伝子座のＲＥＰ Ｃ標的配列に対するミスペアスコアが６．０以下である。
項１７．
前記低分子ＲＮＡが、以下の（ｉ）又は（ｉｉ）の塩基配列を含む、項１５又は１６に記載の製造方法。
（ｉ）５’－ＡＵＡＣＡＣＣＵＵＵＵＵＣＧＵＧＵＡＵＡＵＣＵＵ－３’（配列番号１）
（ｉｉ）塩基配列（ｉ）において、１、２又は３個の塩基が、置換、欠失、もしくは付加された塩基配列。
項１８．
アブラナ科植物のＳＩＩハプロタイプの花粉因子ＳＰ１１を不活性化させる低分子ＲＮＡをコードする配列を含む核酸であって、
前記低分子ＲＮＡは特定の２４塩基を含み、かつ、当該特定の２４塩基は以下の条件を満たす、核酸（ただし、前記アブラナ科植物の内因性低分子ＲＮＡをコードする核酸を除く）。
（ａ）ＳＰ１１遺伝子座のＣｉｓ標的配列に対するミスペアスコアが５．５以下であり、かつ５’末端側から１０番目の塩基がＣｉｓ標的配列中の対応する塩基と相補的塩基である。
項１９．
前記低分子ＲＮＡに含まれる特定の２４塩基が、さらに以下の条件を満たす、項１８に記載の核酸。
（ｂ）ＳＰ１１遺伝子座のＲＥＰ Ｃ標的配列に対するミスペアスコアが６．０以下である。
項２０．
前記低分子ＲＮＡが、以下の（ｉ）又は（ｉｉ）の塩基配列を含む、項１８又は１９に記載の核酸。
（ｉ）５’－ＡＵＡＣＡＣＣＵＵＵＵＵＣＧＵＧＵＡＵＡＵＣＵＵ－３’（配列番号１）
（ｉｉ）塩基配列（ｉ）において、１、２又は３個の塩基が、置換、欠失、もしくは付加された塩基配列。
項２１．
前記アブラナ科植物が、Ｂｒａｓｓｉｃａ属植物である、項１～４、１１～１３及び１５～１７のいずれかに記載の製造方法。
項２２．
前記アブラナ科植物が、Ｂｒａｓｓｉｃａ属植物である、項５～８のいずれかに記載の植物体。
項２３．
前記アブラナ科植物が、Ｂｒａｓｓｉｃａ属植物である、項９、１０及び１４のいずれかに記載の方法。
項２４．
前記アブラナ科植物が、Ｂｒａｓｓｉｃａ属植物である、項１８～２０のいずれかに記載の核酸。
【発明の効果】
【0018】
本開示によれば、Ｓ０株を用いずとも、自家不和合性のアブラナ科植物を自家和合性に変換する技術が提供される。本開示により、従来技術では不可能であったＳＩＩＳＩＩ株の自家和合化が可能となるため、自家和合化できる栽培品種が飛躍的に多くなる。本開示の技術を遺伝的多様性に富む自家不和合性のアブラナ科植物に適用することで、交雑によって優良な形質（例えば環境適合性や種子生産性の向上等）を有する株を作出し、維持することができる。例えば、本開示の技術を用いてアブラナを自家和合化し、その中から低緯度の高温多湿地域において生育が良好で、かつ種子生産性の高いアブラナを選抜することができる。こうして得られたアブラナは、食用及びバイオディーゼルの原料用に従来よりも少ない労力で、効率良くナタネ種子を提供できる観点から特に有用であるといえる。
【0019】
さらに、本開示の技術により自家和合性に変換したアブラナ科植物を、Ｆ１ハイブリッド作物の親株の育種に用いれば、純系の作出において蕾受粉等の受粉作業を要しないため、効率的な育種が可能となる。また、選抜した親株は自家和合性であるため、自殖により単独系統を安定的に維持することが可能である。
【0020】
また、雑種強勢を目的として選抜した親株同士を交配し、Ｆ１ハイブリッド種子を作成する場面においては、親株は自家不和合性であることが望まれる。すなわち、２つの系統を用いて交配を行うとき、親株が自家和合性であれば得られる種子には自殖による種子と他殖による種子の両方が混在することとなる。しかし、親株が自家不和合性であれば、得られる種子は他殖によるもののみとなる。したがって、得られる種子の遺伝子型を均一にする観点から、Ｆ１ハイブリッド種子を作成する場面においては、親株は自家不和合性であることが望ましい。
【0021】
特許文献１に開示された方法においては、自家和合化したアブラナ科植物から、再度自家不和合性の植物体を得ることはできなかった。一方本開示の技術によれば、自家和合性に変換したアブラナ科植物から、自殖又は他殖により、自家不和合性の植物体を得ることができる。したがって本開示の技術によれば、アブラナ科植物を自家和合性に変換し、Ｆ１ハイブリッド作物の親株の育種を効率的に行った後に、Ｆ１ハイブリッド種子を作成する場面においては、親株を自家不和合性とすることで、均一な遺伝子型のＦ１ハイブリッド種子を得ることができる。
【0022】
本開示の技術は上述したような効果を有するため、例えばカブ、コマツナ、ハクサイ、チンゲンサイといったアブラナ科に属する葉物野菜の育種においても有用である。
【0023】
さらに、本開示によれば、任意のＳＩＩハプロタイプを有する自家不和合性アブラナ科植物を自家和合性に変換するための、低分子ＲＮＡをコードする配列を含む核酸を設計する技術が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【図1】アブラナ科植物の自家不和合性機構を示す。同一ＳハプロタイプにコードされたＳＰ１１とＳＲＫが特異的に相互作用することで、雌ずいは自己花粉を認識して自家不和合反応を誘起し、自殖が回避される。
【図2】特許文献１に開示された、Ｓ０株を用いたアブラナ科植物の自家和合化の推定メカニズム。
【図3】特許文献１に開示された、Ｓ０株を用いた自家和合性を有するアブラナ科植物の作出方法。
【図4】在来ナタネのＳ４４ハプロタイプのＳＰ１１遺伝子の塩基配列（配列番号２）を示す。下線を付した配列は、上から順にＲＥＰ Ａ領域、ＲＥＰ Ｂ領域、ＲＥＰ Ｃ領域、及びＣｉｓ領域である。太字で示した配列は、上から順に第一エキソン及び第二エキソンである。
【図5】在来ナタネのＳ６０ハプロタイプのＳＰ１１遺伝子の塩基配列（配列番号３）を示す。下線を付した配列は、上から順にＲＥＰ Ａ領域、ＲＥＰ Ｂ領域、ＲＥＰ Ｃ領域、及びＣｉｓ領域である。太字で示した配列は、上から順に第一エキソン及び第二エキソンである。
【図6】在来ナタネのＳ４０ハプロタイプのＳＰ１１遺伝子の塩基配列（配列番号４）を示す。下線を付した配列は、上から順にＲＥＰ Ａ領域、ＲＥＰ Ｂ領域、ＲＥＰ Ｃ領域、及びＣｉｓ領域である。太字で示した配列は、上から順に第一エキソン及び第二エキソンである。
【図7】在来ナタネのＳ２９ハプロタイプのＳＰ１１遺伝子の塩基配列（配列番号５）を示す。下線を付した配列は、上から順にＲＥＰ Ａ領域、ＲＥＰ Ｂ領域、ＲＥＰ Ｃ領域、及びＣｉｓ領域である。太字で示した配列は、上から順に第一エキソン及び第二エキソンである。
【図8】ＳＩＩハプロタイプのＳＰ１１発現調節領域の模式図。ＳＰ１１遺伝子の転写開始点を＋１で示し、負の値は転写開始点よりも上流であることを示す。横軸の単位はｂｐである。
【図9】Ｓ６０－ＳＭＩ２前駆体及びＳ６０－ＳＭＩ２－ｍ６前駆体の推定される構造。赤線は、プロセシングを受けて２４塩基長の低分子ＲＮＡとなり機能すると推定される部分を示す。
【図10】Ｓ４４Ｓ４４、Ｓ６０Ｓ６０、Ｓ４０Ｓ４０、及びＳ２９Ｓ２９在来ナタネを遺伝的背景としてＳ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６コンストラクトを導入した各形質転換体、並びに、形質転換を行っていない野生型の在来ナタネを用いた、Ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ ＲＴ－ＰＣＲの結果を示す。内部標準はｃｌａｓｓ－ＩＩ－Ｓｍｉである。グラフ縦軸は、内部標準の発現量を１としたときの、各低分子ＲＮＡの相対的な発現量を示す。Ｓ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６コンストラクト「－」はＳ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６コンストラクトを導入していない（すなわち野生型株である）ことを、Ｓ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６コンストラクト「＋」はＳ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６コンストラクトを導入した（すなわち形質転換体である）ことを示す。Ｎ．Ｄ．は検出限界以下であったことを示す。
【図11】試験例１－３（図１０）で用いた各植物体について、ＳＰ１１の定量的発現解析の結果を示す。縦軸は、同じＳハプロタイプの遺伝子型を有する野生型株におけるＳＰ１１の転写産物量を１としたときの、各形質転換体の相対的なＳＰ１１転写産物量を示す。
【図12】Ｓ４４Ｓ４４野生型株及びＳ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６／Ｓ４４Ｓ４４株を自家受粉させた結果を示す。
【図13a】Ｓ４４Ｓ４４野生型株及びＳ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６／Ｓ４４Ｓ４４株について、バイサルファイトシーケンス法によりＳＰ１１発現調節領域のＤＮＡメチル化状態を解析した結果を示す。縦軸は、メチル化されたシトシンの割合（％）を示す。
【図13b】Ｓ４４Ｓ６０野生型株について、バイサルファイトシーケンス法により、Ｓ４４ハプロタイプ及びＳ６０ハプロタイプそれぞれのＳＰ１１発現調節領域のＤＮＡメチル化状態を解析した結果を示す。縦軸は、メチル化されたシトシンの割合（％）を示す。
【図13c】Ｓ４４Ｓ４０野生型株について、バイサルファイトシーケンス法により、Ｓ４４ハプロタイプ及びＳ４０ハプロタイプそれぞれのＳＰ１１発現調節領域のＤＮＡメチル化状態を解析した結果を示す。縦軸は、メチル化されたシトシンの割合（％）を示す。
【図14】試験例１より推定される、Ｓ４４Ｓ４４株が自家和合化されたメカニズムを図示する。
【図15】Ｓ４４Ｓ２９野生型株及びＳ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６／Ｓ４４Ｓ２９株を自家受粉させた結果を示す。
【図16】Ｓ４４Ｓ２９野生型株及びＳ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６／Ｓ４４Ｓ２９株を用いた、Ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ ＲＴ－ＰＣＲの結果を示す。内部標準はｃｌａｓｓ－ＩＩ－Ｓｍｉである。グラフ縦軸は、内部標準の発現量を１としたときの、各低分子ＲＮＡの相対的な発現量を示す。
【図17】蕾のステージ４及び５におけるＳ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６／Ｓ４４Ｓ２９株、Ｓ４４Ｓ２９野生型株、Ｓ４４Ｓ４４野生型株、及び、Ｓ２９Ｓ２９野生型株について、Ｓ４４－ＳＰ１１又はＳ２９－ＳＰ１１の定量的発現解析の結果を示す。縦軸は、Ｓ４４－ＳＰ１１の転写産物量については、Ｓ４４Ｓ４４野生型株におけるＳ４４－ＳＰ１１の転写産物量を１としたときの、Ｓ２９－ＳＰ１１の転写産物量については、Ｓ２９Ｓ２９野生型株におけるＳ２９－ＳＰ１１の転写産物量を１としたときの、相対的なＳＰ１１転写産物量を示す。
【図18】試験例２より推定される、Ｓ４４ＳＩＩ株が自家和合化されたメカニズムを図示する。
【図19】本開示の技術を用いた、自家不和合性アブラナ科植物を自家和合化する方法、自家和合化したアブラナ科植物を自家不和合化する方法、及び、これらを活用した育種方法を示す。
【図20】本開示の技術を用いた、自家不和合性アブラナ科植物を両親系統として用いＦ１ハイブリッド法による育種法及びそのＦ１ハイブリッドを自家和合化する方法、自家和合化したアブラナ科植物を自家不和合化する方法、及び、これらを活用した育種方法を示す。
【図21】Ｓｍｉ、Ｓｍｉ２配列と、各ＳＩＩハプロタイプのＣｉｓ標的配列、ＲＥＰ Ａ標的配列、ＲＥＰ Ｂ標的配列、及びＲＥＰ Ｃ標的配列との間のミスペアスコアを示す。ミスペアスコアに（）がついている組み合わせは、Ｓｍｉ又はＳｍｉ２の５’末端側から１０番目の塩基が、標的配列中の対応する塩基と相補的でない（ミスマッチである）ことを示す。また、Ｓｍｉ又はＳｍｉ２がＳＰ１１の発現を抑制するハプロタイプの組み合わせを、四角で囲んで示す。
【図22a】クラスＩハプロタイプのＳｍｉ（Ｃｌａｓｓ－Ｉ Ｓｍｉ）と、各ＳＩＩハプロタイプのＲＥＰ領域中の配列とを比較した図である。図中、５’末端から１０番目の塩基を星印で示す（以降、図２２ａ～ｇにおいて同様である）。
【図22b】クラスＩＩハプロタイプのＳｍｉ（Ｃｌａｓｓ－ＩＩ Ｓｍｉ）と、各ＳＩＩハプロタイプのＲＥＰ領域中の配列とを比較した図である。
【図22c】Ｓ４４ハプロタイプのＳｍｉ２（Ｓ４４－Ｓｍｉ２）と、各ＳＩＩハプロタイプのＲＥＰ領域中の配列とを比較した図である。
【図22d】Ｓ６０ハプロタイプのＳｍｉ２（Ｓ６０－Ｓｍｉ２）と、各ＳＩＩハプロタイプのＲＥＰ領域中の配列とを比較した図である。
【図22e】Ｓ４０ハプロタイプのＳｍｉ２（Ｓ４０－Ｓｍｉ２）と、各ＳＩＩハプロタイプのＲＥＰ領域中の配列とを比較した図である。
【図22f】Ｃｌａｓｓ－Ｉ－Ｓｍｉ及びＣｌａｓｓ－ＩＩ－Ｓｍｉ配列と、各ＳＩＩハプロタイプのＣｉｓ標的配列とを比較した図である。
【図22g】Ｓｍｉ２と、各ＳＩＩハプロタイプのＣｉｓ標的配列とを比較した図である。
【図23】Ｓ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６低分子ＲＮＡ配列と、Ｓ４４ハプロタイプのＣｉｓ標的配列及びＲＥＰ Ｃ標的配列との間のミスペアスコアを示す。
【発明を実施するための形態】
【0025】
以下、本開示について、さらに詳細に説明する。なお、本明細書において、本開示についての各態様を説明するにあたり、例えば「一態様において」「別の態様において」などといった説明を行う場合があるが、かかる説明は、各態様の特徴を２以上併せ持つことを妨げるものではなく、本開示は、これらの説明に係る各態様の特徴を１又は２以上併せ持つものを全て包含する。
【0026】
本開示は、自家和合性アブラナ科植物を製造する方法、自家和合性アブラナ科植物の植物体、自家和合性アブラナ科植物の植物体から再度自家不和合性アブラナ科植物の植物体を得る方法、自家不和合性アブラナ科植物を自家和合性に変換するための低分子ＲＮＡをコードする配列を含む核酸の製造方法、及び、自家不和合性アブラナ科植物を自家和合性に変換するための低分子ＲＮＡをコードする配列を含む核酸等を好ましく包含するが、これらに限定されるわけではなく、本開示は本明細書に開示され当業者が認識できる全てを包含する。
【0027】
本開示に包含される自家和合性アブラナ科植物を製造する方法は、自家不和合性アブラナ科植物に低分子ＲＮＡをコードする配列を含む核酸を導入する工程を含み、前記低分子ＲＮＡは、ＳＩＩハプロタイプの花粉因子ＳＰ１１を不活性化させるＲＮＡである。また、本開示に包含される自家和合性アブラナ科植物を製造する方法において、自家和合化される自家不和合性アブラナ科植物は、自家不和合性遺伝子座において、ＳＩハプロタイプを有さず、Ｓ４４ハプロタイプを有する。
【0028】
以下、前記ＳＩＩハプロタイプの花粉因子ＳＰ１１を不活性化させる低分子ＲＮＡを「本開示の低分子ＲＮＡ」ということがある。なお、本開示において「内因性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）低分子ＲＮＡ」とは、遺伝子操作されていない（野生型の）アブラナ科植物体内で発現する低分子ＲＮＡを指すものとする。反対に、「外因性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）低分子ＲＮＡ」とは、遺伝子操作されていないアブラナ科植物体内では発現しない低分子ＲＮＡであって、本開示の技術の遺伝子操作を経て初めてアブラナ科植物体内で発現する低分子ＲＮＡを指すものとする。ある低分子ＲＮＡが「内因性低分子ＲＮＡ」であるか否かは、例えばＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、ＵＳ）等の公知の遺伝子データベースにおいて、対象の野生型アブラナ科植物体内で低分子ＲＮＡとして機能するものとして登録されているか否かにより判別することができる。したがって、仮にある低分子ＲＮＡと１００％の相同性を示す配列が遺伝子データベースに登録されていたとしても、当該配列が低分子ＲＮＡとして機能しない（例えば構造遺伝子の一部である等）場合には、当該低分子ＲＮＡは内因性低分子ＲＮＡではなく、外因性低分子ＲＮＡであると判断される。
【0029】
また、本開示に包含される自家和合性アブラナ科植物の植物体は、自家不和合性遺伝子座において、ＳＩハプロタイプを有さず、Ｓ４４ハプロタイプを有する。さらに、前記植物体は、ＳＩＩハプロタイプの花粉因子ＳＰ１１を不活性化させる低分子ＲＮＡをコードする配列を含む外因性の核酸配列を有する。
【0030】
本開示においてアブラナ科植物（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）とは、双子葉植物、離弁花類に分類され、４枚の花弁が十字状に並ぶことを特徴とする植物を指す。アブラナ科植物としては、例えばＢｒａｓｓｉｃａ（アブラナ）属植物、Ｒａｐｈａｎｕｓ（ダイコン）属植物、Ｗａｓａｂｉａ（ワサビ）属植物、Ｎａｓｔｕｒｔｉｕｍ（オランダガラシ）属植物等が挙げられ、なかでもＢｒａｓｓｉｃａ属植物が好ましく例示される。
【0031】
Ｂｒａｓｓｉｃａ属植物としては、例えばアブラナ（在来ナタネ）、ハクサイ、カブ、コマツナ、ミズナ、チンゲンサイ、ノザワナ、パクチョイ等のＢｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ；ケール、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、メキャベツ等のＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ；セイヨウカラシナ、タカナ等のＢｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａが挙げられる。また、Ｒａｐｈａｎｕｓ属植物としては、ダイコン、ハツカダイコン等が例示され、Ｗａｓａｂｉａ属植物としてはワサビ等が例示され、Ｎａｓｔｕｒｔｉｕｍ属植物としてはクレソン等が例示される。
【0032】
上記アブラナ科植物のなかでも、遺伝的多様性に富むことからＢｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａがより好ましく、アブラナ（在来ナタネ）が特に好ましい。
【0033】
本開示のアブラナ科植物としては、植物全体、花粉、種子；葉、茎、根、花器、成長点、種子、胚芽等の器官；表皮、師部、柔組織、木部、維管束等の組織；プロトプラスト、カルス等の植物培養細胞又は組織等のいずれもが包含される。
【0034】
花粉因子ＳＰ１１は葯タペート組織に発現し、レセプターである雌ずい因子ＳＲＫによって認識される。両者が同一のＳハプロタイプに由来する場合には、花粉の発芽や花粉管伸長が抑制され、種子が形成されない（すなわち、不和合となる）。花粉因子ＳＰ１１をコードする遺伝子のＳ遺伝子座上の位置や転写方向は各Ｓハプロタイプによって異なっており、明確に特定されていないものが多いが、例えば、在来ナタネのＳ４４、Ｓ６０、Ｓ４０、Ｓ２９ハプロタイプについてはＳＰ１１遺伝子のＳ遺伝子座上における位置及び転写方向が特定されている。Ｓ４４、Ｓ６０、Ｓ４０、Ｓ２９ハプロタイプのＳＰ１１遺伝子は、いずれも雌ずい因子ＳＲＫの上流に位置し、ＳＲＫとは逆向きに転写される（非特許文献１）。ＳＰ１１遺伝子の各Ｓハプロタイプの塩基配列は既に特定されている。例えば、在来ナタネのＳ６０ハプロタイプについてはアクセッション番号：ＡＢ０６７４４６．１として、ＮＣＢＩに登録されている。また、在来ナタネのＳ４４ハプロタイプを配列番号２、Ｓ４０ハプロタイプを配列番号３、Ｓ４０ハプロタイプを配列番号４、Ｓ２９ハプロタイプを配列番号５として、図４～７に示す。なお、本開示において、あるＳハプロタイプのＳＰ１１を、ＳＸ－ＳＰ１１と表記することがある。例えば、ＳＩＩ－ＳＰ１１はいずれかのＳＩＩハプロタイプのＳＰ１１を示し、Ｓ４４－ＳＰ１１はＳ４４ハプロタイプのＳＰ１１を示す。
【0035】
上述の通り、アブラナ科植物のＳハプロタイプは、顕性を示すクラスＩハプロタイプ（ＳＩハプロタイプ）と、クラスＩとのヘテロ体において潜性を示すクラスＩＩハプロタイプ（ＳＩＩハプロタイプ）とに大別される。ＳＩハプロタイプとＳＩＩハプロタイプとを有するヘテロ個体の花粉は、常にＳＩハプロタイプの特性を示す。また、ＳＩＩハプロタイプとして、Ｓ４４ハプロタイプ、Ｓ６０ハプロタイプ、Ｓ４０ハプロタイプ、Ｓ２９ハプロタイプ等が知られている。さらに、ＳＩＩハプロタイプには、直線的な顕性潜性の関係（Ｓ４４＞Ｓ６０＞Ｓ４０＞Ｓ２９）が存在することが明らかとなっている。
【0036】
本開示において自家和合化される自家不和合性のアブラナ科植物は、自家不和合性遺伝子座（Ｓ遺伝子座）において、ＳＩハプロタイプを有さず、Ｓ４４ハプロタイプを有する。すなわち、本開示において自家和合化される自家不和合性のアブラナ植物は、Ｓ４４ハプロタイプをホモで有するか（Ｓ４４Ｓ４４）、あるいは、Ｓ４４ハプロタイプと他のＳＩＩハプロタイプ（例えばＳ６０、Ｓ４０、又はＳ２９ハプロタイプ）とをヘテロで有するか（Ｓ４４ＳＩＩ）、のいずれかである。
【0037】
本開示の技術において、前記自家不和合性のアブラナ科植物には、ＳＩＩハプロタイプの花粉因子ＳＰ１１を不活性化させる低分子ＲＮＡをコードする配列を含む核酸が導入される。
【0038】
花粉因子ＳＰ１１の不活性化の態様は、ＳＰ１１がＳＲＫに認識されない態様である限り特に限定されないが、例えば、ＳＰ１１遺伝子の発現抑制や、ＳＰ１１タンパク質の発現抑制等が挙げられる。より具体的には、例えばＳＰ１１遺伝子の発現調節領域のＤＮＡメチル化（すなわち転写前（ｐｒｅ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ）調節）や、ＳＰ１１転写産物の蓄積量の減少、ＳＰ１１遺伝子のサイレンシング（すなわち転写後（ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ）調節）等が挙げられ、なかでもＳＰ１１遺伝子の発現調節領域のＤＮＡメチル化及び／又はＳＰ１１転写産物の蓄積量の減少が好ましい。
【0039】
花粉因子ＳＰ１１の不活性化は、公知の方法により確認することができる。例えば、定量的逆転写ＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ；ＲＴ－ｑＰＣＲ）によりＳＰ１１遺伝子の転写産物量を評価してもよく、あるいは、バイサルファイトシークエンス法（Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によりＳＰ１１遺伝子の発現調節領域のＤＮＡメチル化の程度を評価してもよい。なお、上述の通りＳＰ１１は葯タペート組織に発現するため、転写産物量の評価においては特に葯を単離して用いることと、ＤＮＡメチル化の程度の評価においては葯タペート細胞を単離して用いることが望ましい。
【0040】
本開示において低分子ＲＮＡとは５０塩基長以下のＲＮＡを指す。低分子ＲＮＡは１５～４０塩基長であることが好ましく、２０～３０塩基長であることがより好ましく、２１～２４塩基長であることがさらに好ましく、２４塩基長であることが最も好ましい。
【0041】
本開示においてＳＩＩハプロタイプの花粉因子ＳＰ１１を不活性化させる低分子ＲＮＡは、ＳＩＩハプロタイプの花粉因子ＳＰ１１を不活性化させる作用が損なわれない限り特に制限されないが、例えば以下の（ｉ）又は（ｉｉ）の塩基配列を含むことが好ましい：
（ｉ）５’－ＡＵＡＣＡＣＣＵＵＵＵＵＣＧＵＧＵＡＵＡＵＣＵＵ－３’（配列番号１）；
（ｉｉ）塩基配列（ｉ）において、１、２又は３つの塩基が、置換、欠失、もしくは付加された塩基配列。
前記低分子ＲＮＡは（ｉ）の塩基配列を含むことがより好ましく、（ｉ）の塩基配列からなることが特に好ましい。
（ｉ）５’－ＡＵＡＣＡＣＣＵＵＵＵＵＣＧＵＧＵＡＵＡＵＣＵＵ－３’（配列番号１）；
（ｉｉ）塩基配列（ｉ）において、１、２又は３つの塩基が、置換、欠失、もしくは付加された塩基配列。
前記低分子ＲＮＡは（ｉ）の塩基配列を含むことがより好ましく、（ｉ）の塩基配列からなることが特に好ましい。
【0042】
低分子ＲＮＡをコードする配列を含む核酸は、公知の方法により得たものを用いることができる。例えばある生物から抽出したゲノムＤＮＡ又はＲＮＡを鋳型として、ＰＣＲ又は逆転写ＰＣＲを行うことにより、所望の核酸断片を得てもよい。このときに用いるプライマーを種々改変することにより、前記ゲノムＤＮＡ又はＲＮＡには存在しない配列の（すなわち、前記ゲノムＤＮＡ又はＲＮＡ中の配列から一部の塩基が置換、欠失、挿入された）核酸断片を得ることができる。また、化学的に合成した核酸断片を用いることもできる。
【0043】
本開示においては、前記低分子ＲＮＡを植物体内で発現させるために、低分子ＲＮＡをコードする配列を含む核酸は、任意のベクターに結合されていてもよい。ここで、ベクターとは、遺伝子組換え技術において用いられる、組換え核酸を増幅し、維持し、導入するための核酸分子である。ベクターには、前記低分子ＲＮＡをコードする配列を含む核酸を、植物体内で発現させるためのプロモーター配列がコードされていることが好ましい。なお、本開示において、低分子ＲＮＡをコードする配列を含む核酸配列がベクターに結合した全体を、コンストラクトと称する場合がある。すなわち、本開示においてコンストラクトには、少なくとも低分子ＲＮＡをコードする核酸配列が含まれ、任意に、低分子ＲＮＡをコードする核酸を植物体内で発現させるためのプロモーター配列や、形質転換体識別マーカー、ターミネーター配列、その他ベクターに含まれ得る公知の配列等が含まれ得る。ベクター及びコンストラクトは直鎖状であっても、環状であってもよく、環状であることが好ましい。
【0044】
低分子ＲＮＡをコードする核酸を植物体内で発現させるためのプロモーターは、特に制限されず公知のものを用いることができるが、少なくとも葯タペート組織において発現を誘導するプロモーターであることが望ましい。さらに、ＳＰ１１は蕾のステージ４から５において発現しており、低分子ＲＮＡはそれに先立ちステージ２から３において発現しているため、ステージ２から３において発現するプロモーターであることが望ましい。なお、本開示においてTakayama et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 1920--1925, 2000に記載の方法で５つに分類した蕾の発達段階を、単に「ステージＸ（Ｘは１～５のいずれかの整数）」と表記することがある。
【0045】
入手可能な組換え用ベクターに、低分子ＲＮＡをコードする核酸を公知の方法により連結することができる。組換え用ベクターは、所望の効果を達成できるものであれば特に限定されず、例えば、ｐＢＩ系のベクター、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系のベクター、ｐＵＣ系のベクター等が挙げられる。ｐＢＩ系のベクターとしては、例えば、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩ２２１などが挙げられる。ｐＢＩ系ベクター等のバイナリーベクターは、アグロバクテリウムを介して植物に目的の核酸を導入できるという点で好ましい。また、ｐＣＡＭＢＩＡシリーズ、ｐＧｒｅｅｎシリーズ、ｐＬＣシリーズなどのバイナリーベクターも好ましく使用することができる。さらに、それらの部分を組み合わせて作ったベクターも好ましく使用することができる。
【0046】
前記ベクターは、さらに形質転換体識別マーカーを含んでいてもよい。形質転換体識別マーカーとしては、例えば、公知の薬剤選抜マーカー遺伝子が挙げられる。特に制限されないが、具体的には、ゲンタマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【0047】
前記ベクターは、さらに転写ターミネーター配列を含んでもよい。転写ターミネーター配列は、転写終結部位としての機能を有していれば特に制限されない。前記ベクターにおいて転写ターミネーター配列を適当な位置に配置することにより、前記コンストラクトが植物体内に導入された後に、転写産物が不必要に長くなることを抑制できる。
【0048】
また、前記ベクターは、さらにＴ－ＤＮＡ領域を有していてもよい。Ｔ－ＤＮＡ領域を有するベクターは、アグロバクテリウムを用いて形質転換を行う場合に、遺伝子導入効率の向上が期待されるため好ましい。
【0049】
前記コンストラクトの長さは、植物体内に導入され、低分子ＲＮＡをコードする核酸が植物体内で発現され得る限り、特に限定されない。
【0050】
特に制限されないが、「低分子ＲＮＡをコードする配列を含む核酸」が上記コンストラクトである態様においては、以下の過程を経て花粉因子ＳＰ１１の不活性化が行われると推定される：植物体内に導入されたコンストラクトから、転写産物が生じる；転写産物がプロセシングを受け、低分子ＲＮＡとなる；低分子ＲＮＡが、花粉因子ＳＰ１１を不活性化する。なお、前記転写産物は、ステム－ループ構造を取ることがある。また、前記転写産物がステム－ループ構造を取るまでに、プロセシングを受ける場合がある。つまり、転写産物がプロセシングを受けてステム－ループ構造を取るようになり、その後さらにプロセシングを受けて低分子ＲＮＡとなる場合がある。本開示においては、ステム－ループ構造を取る転写産物を、特に低分子ＲＮＡ前駆体と称することがある。なお、ある転写産物がステム－ループ構造を取るか否かは、公知の核酸の二次構造予測ツールを用いて判別することができる。
【0051】
以上の通り、本開示における「低分子ＲＮＡをコードする配列を含む核酸」は、上記コンストラクト、コンストラクトから転写された転写産物、前記転写産物がプロセシングを受けたプロセシング産物、低分子ＲＮＡ前駆体、低分子ＲＮＡ自体、のいずれもを好ましく包含する。
【0052】
自家不和合性のアブラナ科植物に核酸を導入する方法は、特に制限されず、公知の遺伝子工学的手法を用いることができる。例えば、アグロバクテリウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、リポソーム法、マイクロインジェクション法、ウィスカー法、プラズマ法、レーザーインジェクション法等が挙げられる。
【0053】
本開示の作出方法により得られる自家和合性アブラナ科植物は、公知の方法により生育させることができ、使用する土壌、肥料等については植物の種類や生育状況等に応じて適宜選択することができる。
【0054】
アブラナ科植物を生育させる条件としては、例えば、温度４～３０℃、好ましくは２０～２３℃；光量４００～１００，０００Ｌｕｘ、好ましくは１，０００～５０，０００Ｌｕｘ；照射時間８～２４時間、好ましくは１２～１４時間；生育日数２０～１５０日、好ましくは３０～９０日が挙げられる。
【0055】
また、アブラナ科植物の種子を播種する前に、種子に対して消毒、予備吸水等の前処理を行ってもよい。消毒処理は、公知の方法で行うことができ、例えば５％次亜塩素酸ナトリウム溶液中に、１８～２５℃で１０～３０分間浸漬することにより行うことができる。予備給水処理についても公知の方法で行うことができ、例えば、１８～２５℃において水に１～２４時間浸漬する方法が挙げられる。予備給水は、種子に水分を散布することにより行ってもよく、１８～２５℃の水を種子１００粒当たり１０～１００ｍｌ散布し、１～２４時間放置してもよい。また、消毒処理と予備吸水を同時に行ってもよく、例えば１～５℃の環境下で、種子をＰＬＡＮＴ ＰＲＥＳＥＲＶＡＴＩＶＥ ＭＩＸＴＵＲＥ（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）に３～４日間浸漬させてもよい。さらに、必要に応じて低温処理（春化処理）を行ってもよい。低温処理の条件として、例えば、種子を発芽後に土に植え替え、植物体を十分生育させた後に、１～５℃の環境下で３週間～１か月間生育させることが挙げられる。前記低温処理により、アブラナ科植物の開花が誘導され得る。
【0056】
また、本開示に包含される、アブラナ科植物のＳＩＩハプロタイプの花粉因子ＳＰ１１を不活性化させる低分子ＲＮＡをコードする配列を含む核酸において、前記低分子ＲＮＡは特定の２４塩基を含み、かつ、当該特定の２４塩基は以下の条件を満たす：
（ａ）ＳＰ１１遺伝子座のＣｉｓ標的配列に対するミスペアスコアが５．５以下であり、かつ５’末端側から１０番目の塩基がＣｉｓ標的配列中の対応する塩基と相補的塩基である。
（ａ）ＳＰ１１遺伝子座のＣｉｓ標的配列に対するミスペアスコアが５．５以下であり、かつ５’末端側から１０番目の塩基がＣｉｓ標的配列中の対応する塩基と相補的塩基である。
【0057】
また、前記低分子ＲＮＡに含まれる特定の２４塩基は、上記条件（ａ）に加えてさらに、
（ｂ）ＳＰ１１遺伝子座のＲＥＰ Ｃ標的配列に対するミスペアスコアが６．０以下である、
との条件を満たすことがより好ましい。
（ｂ）ＳＰ１１遺伝子座のＲＥＰ Ｃ標的配列に対するミスペアスコアが６．０以下である、
との条件を満たすことがより好ましい。
【0058】
以下、本開示に包含される当該核酸を「本開示の核酸」ということがある。
【0059】
本開示において、ミスペアスコアとは、Fahlgren & Carrington, Methods Mol. Biol. 592, 51-57 (2010)に開示された計算式により得られるスコアを指すものとする。なお、Fahlgren & Carrington, 2010におけるミスペアスコアは、植物のｍｉＲＮＡの標的配列を予測する指標として開示されている。ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ等のＲＮＡを認識して分解に導く作用を有している。したがって、Fahlgren & Carrington, 2010における「標的配列」とはＲＮＡ配列であり、ミスペアスコアはｍｉＲＮＡと対象のＲＮＡ配列との相同性を示すものである。一方本開示においてのミスペアスコアは、後述するように低分子ＲＮＡと、ＳＰ１１発現調節領域中の標的配列（すなわちＤＮＡ配列）との相同性を示すものである。
【0060】
ミスペアスコアは、具体的には以下の通り計算される：
ある低分子ＲＮＡが標的配列との間に、
１．ミスマッチ（相補的でない塩基）を有していれば、１塩基につき１点加算する（ただし、ミスマッチがＧ：Ｕミスマッチである場合を除く）；
２．ミスマッチがＧ：Ｕ間のミスマッチであれば、１塩基につき０．５点加算する；
３．低分子ＲＮＡの５’末端側から２～１３番目の塩基については、１．及び２．の加算を２倍とする。
ある低分子ＲＮＡが標的配列との間に、
１．ミスマッチ（相補的でない塩基）を有していれば、１塩基につき１点加算する（ただし、ミスマッチがＧ：Ｕミスマッチである場合を除く）；
２．ミスマッチがＧ：Ｕ間のミスマッチであれば、１塩基につき０．５点加算する；
３．低分子ＲＮＡの５’末端側から２～１３番目の塩基については、１．及び２．の加算を２倍とする。
【0061】
すなわち、ミスペアスコアが大きいほど、低分子ＲＮＡと標的配列間の相同性が低く、ミスペアスコアが小さいほど、低分子ＲＮＡと標的配列間の相同性が高いといえる。
【0062】
アブラナ科植物では、顕性潜性の関係が生じる全てのＳハプロタイプの組み合わせにおいて、潜性となるＳハプロタイプのＳＰ１１の発現が抑制されていることが明らかとなっている。ＳＩハプロタイプとＳＩＩハプロタイプとのヘテロ個体においては、ＳＩハプロタイプ上の逆位反復配列（ＳＭＩ）に由来する２４塩基の低分子ＲＮＡ（Ｓｍｉ）が、ＳＩＩハプロタイプのＳＰ１１発現調節領域をメチル化することにより、ＳＩＩ－ＳＰ１１の発現が抑制されることが示唆されている（非特許文献１）。一方、ＳＩＩハプロタイプ同士のヘテロ個体においては、顕性側のＳＩＩハプロタイプ上の逆位反復配列（ＳＭＩ２）に由来する２４塩基の低分子ＲＮＡ（Ｓｍｉ２）が、潜性側のＳＩＩハプロタイプのＳＰ１１発現調節領域をメチル化し、潜性側のＳＩＩ－ＳＰ１１の発現が抑制されることが示唆されている（非特許文献２）。なお、ＳＭＩはＳＩハプロタイプとＳＩＩハプロタイプの両方に存在するが、ＳＭＩ２はＳＩＩハプロタイプにのみ存在すると考えられている。本開示において、あるＳハプロタイプのＳｍｉ２を、ＳＸ－Ｓｍｉ２と表記することがある。例えば、ＳＩＩ－Ｓｍｉ２はいずれかのＳＩＩハプロタイプのＳｍｉ２を示し、Ｓ４４－Ｓｍｉ２はＳ４４ハプロタイプのＳｍｉ２を示す。
【0063】
ＳＭＩ２の各Ｓハプロタイプの塩基配列は既に特定されており、公知のデータベースに登録されている。例えば、在来ナタネのＳ４４ハプロタイプについてはアクセッション番号：ＬＣ１７７３５５．１、Ｓ６０ハプロタイプについてはアクセッション番号：ＬＣ１７７３５５．１、Ｓ４０ハプロタイプについてはアクセッション番号：ＬＣ１７７３５４．、Ｓ２９ハプロタイプについてはアクセッション番号：ＬＣ１７７３５３．１として、ＮＣＢＩに登録されている。したがって、これらの登録されている配列に基づいてＳＭＩ２のＳ遺伝子座上の位置等を特定することができる。
【0064】
また、ＳｍｉはＳＩハプロタイプ間、ＳＩＩハプロタイプ間でそれぞれ高度に保存されている。本開示においては、ＳＩハプロタイプ間で保存されたＳｍｉをｃｌａｓｓ－Ｉ Ｓｍｉと、ＳＩＩハプロタイプ間で保存されたＳｍｉをｃｌａｓｓ－ＩＩ Ｓｍｉと、それぞれ表記することがある。ｃｌａｓｓ－Ｉ Ｓｍｉ及びｃｌａｓｓ－ＩＩ Ｓｍｉの配列を以下に示す。
class-I Smi: 5’-AUGUUUACGUGUAAAAUAGUUACA-3’（配列番号６）
class-II Smi: 5’-AUGUUUACGAGUAAAAUAGUUACA-3’（配列番号７）
class-I Smi: 5’-AUGUUUACGUGUAAAAUAGUUACA-3’（配列番号６）
class-II Smi: 5’-AUGUUUACGAGUAAAAUAGUUACA-3’（配列番号７）
【0065】
アブラナ科植物のＳＩＩハプロタイプのＳＰ１１発現調節領域内には、ＳＰ１１翻訳開始点の上流１００～３００ｂｐ付近に、Ｓｍｉ２によって認識されてＤＮＡメチル化される領域が存在することが示唆されている（非特許文献２）。本開示において、当該領域をＣｉｓ領域と称することがある。また、Ｃｉｓ領域の中で特にＳｍｉ２との塩基配列の相同性が高い配列を、Ｃｉｓ標的配列と称することがある。
【0066】
Ｃｉｓ標的配列のさらに上流にも、Ｃｉｓ標的配列に似た３回の繰り返し配列が存在することが報告されており、ＲＥＰ領域と名付けられていた（Kakizaki et al., Gene Genet Sys, 81, pp.64-67, 2006）。この３回の繰り返し配列は、上流側から順にＲＥＰ Ａ領域、ＲＥＰ Ｂ領域、ＲＥＰ Ｃ領域と名付けられた（図８）。なお、本開示において、ＲＥＰ Ｘ領域の中で特にＳｍｉ２との塩基配列の相同性が高い配列を、ＲＥＰ Ｘ標的配列と称することがある。例えば、ＲＥＰ Ｃ標的配列とは、ＲＥＰ Ｃ領域の中で特にＳｍｉ２との塩基配列の相同性が高い配列を示す。
【0067】
なお、本明細書において「含む」とは、「本質的にからなる」と、「からなる」をも包含する（The term “comprising” includes “consisting essentially of” and ”consisting of.“）。また、本開示は、本明細書に説明した構成要件の任意の組み合わせを全て包含する。
【0068】
また、上述した本開示の各実施形態について説明した各種特性（性質、構造、機能等）は、本開示に包含される主題を特定するにあたり、どのように組み合わせられてもよい。すなわち、本開示には、本明細書に記載される組み合わせ可能な各特性のあらゆる組み合わせからなる主題が全て包含される。
【実施例0069】
以下、例を示して本開示の実施形態をより具体的に説明するが、本開示の実施形態は下記の例に限定されるものではない。
＜試験例１＞Ｓ ４４ Ｓ ４４ 在来ナタネの自家和合化
１－１．Ｓ ４４ ハプロタイプのＳＰ１１を不活性化させる低分子ＲＮＡをコードする配列を含む核酸（Ｓ ６０ －Ｓｍｉ２－ｍ６コンストラクト）の作成
常法により、在来ナタネ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ）Ｓ６０ホモ株からゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡの抽出にはＤＮｅａｓｙ（登録商標） Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いた。抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、Ｓ６０ハプロタイプのＳＭＩ２前駆体（以下、Ｓ６０－ＳＭＩ２前駆体と称することがある）をコードする配列を含む２８６０ｂｐの領域を増幅するプライマーセット（ＨＳ６０－ＴＦ－Ｆ４＋ＨｉｎｄＩＩＩ及びＨＳ６０－ＴＦ－ＲＩ＋ＢａｍＨＩ）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲにはＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲｅａｄｙＭｉｘ（Ｒｏｃｈｅ社）を用いた。前記ＰＣＲにより増幅したゲノム断片を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩ（タカラバイオ社）を用いて消化した後、常法によりバイナリーベクターｐＣＡＭＢＩＡ１３００（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＦ２３４２９６．１）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩサイトに挿入した。作成したベクターをＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩ（タカラバイオ社）を用いて消化した後、常法によりバイナリーベクターｐＢＩ１２１（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＦ４８５７８３．１）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｃＩサイトに挿入した。上記方法で得たコンストラクトを、Ｓ６０－Ｓｍｉ２コンストラクトと称することがある。
＜試験例１＞Ｓ ４４ Ｓ ４４ 在来ナタネの自家和合化
１－１．Ｓ ４４ ハプロタイプのＳＰ１１を不活性化させる低分子ＲＮＡをコードする配列を含む核酸（Ｓ ６０ －Ｓｍｉ２－ｍ６コンストラクト）の作成
常法により、在来ナタネ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ）Ｓ６０ホモ株からゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡの抽出にはＤＮｅａｓｙ（登録商標） Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いた。抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、Ｓ６０ハプロタイプのＳＭＩ２前駆体（以下、Ｓ６０－ＳＭＩ２前駆体と称することがある）をコードする配列を含む２８６０ｂｐの領域を増幅するプライマーセット（ＨＳ６０－ＴＦ－Ｆ４＋ＨｉｎｄＩＩＩ及びＨＳ６０－ＴＦ－ＲＩ＋ＢａｍＨＩ）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲにはＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲｅａｄｙＭｉｘ（Ｒｏｃｈｅ社）を用いた。前記ＰＣＲにより増幅したゲノム断片を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩ（タカラバイオ社）を用いて消化した後、常法によりバイナリーベクターｐＣＡＭＢＩＡ１３００（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＦ２３４２９６．１）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩサイトに挿入した。作成したベクターをＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩ（タカラバイオ社）を用いて消化した後、常法によりバイナリーベクターｐＢＩ１２１（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＦ４８５７８３．１）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｃＩサイトに挿入した。上記方法で得たコンストラクトを、Ｓ６０－Ｓｍｉ２コンストラクトと称することがある。
【0070】
Ｓ６０－Ｓｍｉ２コンストラクトを鋳型として、バイナリーベクターｐＢＩ１２１に挿入されたＳ６０－ＳＭＩ２前駆体をコードする配列を含む配列の、５’末端側領域を増幅するプライマーセット（ＨＳ６０－ＴＦ－Ｆ４＋ＨｉｎｄＩＩＩ及びＨＳ６０－ｍ６－Ｒ）、並びに、３’末端側を増幅するプライマーセット（ＨＳ６０－ｍ６－Ｆ及びＨＳ６０－ＴＦ－ＲＩ＋ＢａｍＨＩ）を用いて、それぞれ別反応系でＰＣＲを行った。各反応系において得られた核酸断片を混合したものを鋳型として、ＨＳ６０－ＴＦ－Ｆ４＋ＨｉｎｄＩＩＩとＨＳ６０－ＴＦ－ＲＩ＋ＢａｍＨＩをプライマーに用いてＰＣＲを行った。前記ＰＣＲにより得られた核酸断片を、Ｓ６０－Ｓｍｉ２コンストラクトと同様の方法でバイナリーベクターｐＢＩ１２１のＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｃＩサイトに挿入した。上記方法で得たコンストラクトを、Ｓ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６コンストラクトと称することがある。
【0071】
ＰＣＲに用いた各プライマーの配列を以下に示す。
HS60-TF-F4+HindIII: 5’- CCATGTCGATCATTGAAGCTTGGTAA -3’ （配列番号８）
HS60-TF-RI+BamHI: 5’- CTAGGCCCGTCAGTATCACCGCTATTTTG -3’ （配列番号９）
HS60-m6-F: 5’-CAAATGTATACATGTAAAAGGTGTATTTC-3’ （配列番号１０）
HS60-m6-R: 5’-GAAATACACCTTTTACATGTATACATTTG-3’ （配列番号１１）
HS60-TF-F4+HindIII: 5’- CCATGTCGATCATTGAAGCTTGGTAA -3’ （配列番号８）
HS60-TF-RI+BamHI: 5’- CTAGGCCCGTCAGTATCACCGCTATTTTG -3’ （配列番号９）
HS60-m6-F: 5’-CAAATGTATACATGTAAAAGGTGTATTTC-3’ （配列番号１０）
HS60-m6-R: 5’-GAAATACACCTTTTACATGTATACATTTG-3’ （配列番号１１）
【0072】
Ｓ６０－Ｓｍｉ２コンストラクトとＳ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６コンストラクトを比較すると、Ｓ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６コンストラクトにおいては一部の塩基がゲノム配列と異なる塩基に置換されている。置換された塩基はＨＳ６０－ｍ６－Ｒプライマー及びＨＳ６０－ｍ６－Ｆプライマーに由来する。植物体内に導入されたＳ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６コンストラクトは、転写された後（当該転写産物をＳ６０－ＳＭＩ２－ｍ６前駆体と称することがある）、プロセシングを受けて２４塩基長の低分子ＲＮＡとなり（当該２４塩基長の低分子ＲＮＡをＳ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６低分子ＲＮＡと称することがある）、機能するものと推定される。
【0073】
推定されるＳ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６低分子ＲＮＡの配列を以下に示す。下記配列中、Ｓ６０－Ｓｍｉ２低分子ＲＮＡから置換された塩基を下線で示す。
S60-Smi2-m6低分子RNA: 5’-AUACACCUUUUUCGUGUAUAUCUU-3’ （配列番号１）
S60-Smi2-m6低分子RNA: 5’-AUACACCUUUUUCGUGUAUAUCUU-3’ （配列番号１）
【0074】
Ｓ６０－ＳＭＩ２前駆体及びＳ６０－ＳＭＩ２－ｍ６前駆体の推定される構造を、図９に示す。Ｓ６０－ＳＭＩ２前駆体及びＳ６０－ＳＭＩ２－ｍ６前駆体は、ステム－ループ構造を取ると推定される。図９中、プロセシングを受けて２４塩基長の低分子ＲＮＡとなり機能すると推定される部分を赤線で示す。また、図９中、Ｓ６０－ＳＭＩ２－ｍ６前駆体においてＳ６０－ＳＭＩ２前駆体と異なる塩基（すなわち、上記Ｓ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６コンストラクト作成操作において、ゲノム配列から置換された塩基）を矢印で示す。太い矢印で示された塩基は、Ｓ４４ハプロタイプのＳＰ１１遺伝子（Ｓ４４－ＳＰ１１と称することがある）の発現調節領域中の、２か所の標的領域に対する相同性を高めるために置換された塩基である。すなわち、Ｓ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６低分子ＲＮＡは、Ｓ４４－ＳＰ１１発現調節領域中の２か所の標的領域に対する相同性が、Ｓ６０－Ｓｍｉ２低分子ＲＮＡよりも高い。また、細い矢印で示された塩基は、Ｓ６０－ＳＭＩ２－ｍ６前駆体がステム－ループ構造を取ったときに、太い矢印で示された塩基と対になる塩基であり、ステム－ループ構造の安定性を高めるために、太い矢印で示された塩基と相補的になるように置換された塩基である。
【0075】
１－２．Ｓ
４４
Ｓ
４４
野生型在来ナタネへのＳ
６０
－Ｓｍｉ２－ｍ６コンストラクトの導入
アグロバクテリウムを用いた公知の形質転換法により、作成したＳ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６コンストラクトをＳ５２Ｓ６０野生型在来ナタネ（すなわち、Ｓ５２ハプロタイプとＳ６０ハプロタイプをヘテロで有する自家不和合性の在来ナタネ、タキイ種苗株式会社）に導入した。具体的には、以下のようにして形質転換体を得た：Ｓ５２Ｓ６０野生型在来ナタネの種子を発芽させた後、胚軸片を切り出した；前記胚軸片を、Ｓ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６コンストラクトを保持するアグロバクテリウムと共存培養し、アグロバクテリウムを感染させた；アグロバクテリウムが感染した胚軸片をカルス化した後シュートを誘導し、Ｓ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６コンストラクトを保持する形質転換体を得た（本開示において当該形質転換体を、Ｓ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６／Ｓ５２Ｓ６０株と称することがある）。得られた形質転換体を、Ｓ４４Ｓ４４在来ナタネ、Ｓ６０Ｓ６０在来ナタネ、Ｓ４０Ｓ４０在来ナタネ、及びＳ２９Ｓ２９在来ナタネと二回交配することでＳ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６コンストラクトを有する株を作出した。なお、各遺伝子型の在来ナタネにＳ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６コンストラクトが導入されたことは、各形質転換体から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、導入遺伝子に特異的なプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことで確認した。
アグロバクテリウムを用いた公知の形質転換法により、作成したＳ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６コンストラクトをＳ５２Ｓ６０野生型在来ナタネ（すなわち、Ｓ５２ハプロタイプとＳ６０ハプロタイプをヘテロで有する自家不和合性の在来ナタネ、タキイ種苗株式会社）に導入した。具体的には、以下のようにして形質転換体を得た：Ｓ５２Ｓ６０野生型在来ナタネの種子を発芽させた後、胚軸片を切り出した；前記胚軸片を、Ｓ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６コンストラクトを保持するアグロバクテリウムと共存培養し、アグロバクテリウムを感染させた；アグロバクテリウムが感染した胚軸片をカルス化した後シュートを誘導し、Ｓ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６コンストラクトを保持する形質転換体を得た（本開示において当該形質転換体を、Ｓ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６／Ｓ５２Ｓ６０株と称することがある）。得られた形質転換体を、Ｓ４４Ｓ４４在来ナタネ、Ｓ６０Ｓ６０在来ナタネ、Ｓ４０Ｓ４０在来ナタネ、及びＳ２９Ｓ２９在来ナタネと二回交配することでＳ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６コンストラクトを有する株を作出した。なお、各遺伝子型の在来ナタネにＳ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６コンストラクトが導入されたことは、各形質転換体から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、導入遺伝子に特異的なプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことで確認した。
【0076】
１－３．Ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ ＲＴ－ＰＣＲ法による低分子ＲＮＡの発現解析
Ｓ４４Ｓ４４、Ｓ６０Ｓ６０、Ｓ４０Ｓ４０、及びＳ２９Ｓ２９在来ナタネを遺伝的背景とする各形質転換体、並びに、形質転換を行っていない野生型の在来ナタネを、公知の方法で栽培して花成誘導した。各植物体から、長径が３ｍｍ以下の蕾を採取し、蕾から葯を取り出した。なお、長径が３ｍｍ以下の蕾は、Takayama et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 1920-1925, 2000に記載の方法で蕾の発達段階を５つに分類したときに、ステージ１～３に該当する。ステージ１～３では、低分子ＲＮＡが発現し、２４塩基長にプロセシングされることが明らかとなっている。
Ｓ４４Ｓ４４、Ｓ６０Ｓ６０、Ｓ４０Ｓ４０、及びＳ２９Ｓ２９在来ナタネを遺伝的背景とする各形質転換体、並びに、形質転換を行っていない野生型の在来ナタネを、公知の方法で栽培して花成誘導した。各植物体から、長径が３ｍｍ以下の蕾を採取し、蕾から葯を取り出した。なお、長径が３ｍｍ以下の蕾は、Takayama et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 1920-1925, 2000に記載の方法で蕾の発達段階を５つに分類したときに、ステージ１～３に該当する。ステージ１～３では、低分子ＲＮＡが発現し、２４塩基長にプロセシングされることが明らかとなっている。
【0077】
取り出した葯から公知の方法により低分子ＲＮＡ画分を含むｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出して、以下の解析に用いた。
【0078】
Chen et al., Nucleic Acids Res. 33, e179, 2005に開示された Ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ ＲＴ－ＰＣＲ法に従って、上記ｔｏｔａｌ ＲＮＡに含まれる２４塩基量の低分子ＲＮＡを解析した。具体的には、上記ｔｏｔａｌ ＲＮＡを鋳型として、ヘアピン構造を有し低分子ＲＮＡを特異的に増幅するプライマー（ステム－ループプライマー）を用いて、逆転写反応を行った。逆転写反応には、ＴａｑＭａｎ（登録商標） ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いた。前記逆転写産物を鋳型として、低分子ＲＮＡ中の配列と相補的なフォワードプライマーと、ステム－ループプライマー中の配列と相補的なリバースプライマーを用いて、定量的ＰＣＲを行った。なお、内部標準としてｃｌａｓｓ－ＩＩ Ｓｍｉを用いた。結果を図１０に示す。
【0079】
Ｓ４４Ｓ４４、Ｓ６０Ｓ６０、Ｓ４０Ｓ４０、及びＳ２９Ｓ２９在来ナタネを遺伝的背景とする形質転換体のいずれにおいても、葯において２４塩基長のＳ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６低分子ＲＮＡが発現していることが確認された。一方、形質転換を行っていない野生型の在来ナタネにおいては、２４塩基長のＳ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６低分子ＲＮＡの発現が検出されなかった。当該結果より、Ｓ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６コンストラクトを導入した形質転換体はいずれも、葯においてＳ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６低分子ＲＮＡを発現していることが確認された。また、Ｓ４４Ｓ４４野生型株においてはＳ４４－Ｓｍｉ２が、Ｓ６０Ｓ６０野生型株においてはＳ６０－Ｓｍｉ２が、Ｓ４０Ｓ４０野生型株においてはＳ４０－Ｓｍｉ２が２４塩基長の低分子ＲＮＡとして検出された。一方で、Ｓ２９Ｓ２９野生型株においてはｃｌａｓｓ－ＩＩ Ｓｍｉは検出されたが、Ｓ２９－Ｓｍｉ２は検出されなかった。この結果はＳ２９－ＳＭＩ２前駆体は、その構造の異常によって２４塩基長の低分子ＲＮＡとしてプロセシングされないという過去の報告と一致した（非特許文献１）。
【0080】
１－４．ＳＰ１１遺伝子の発現解析
１－３で用いた各植物体について、ＳＰ１１の定量的発現解析を行った。１－３と同様にして在来ナタネの形質転換体と野生型株を花成誘導し、長径が３ｍｍより大きく、５ｍｍ以下の蕾を採取した。なお、長径が３ｍｍより大きく５ｍｍ以下の蕾は、Takayama et al., 2000の分類法でステージ４～５に該当する。ステージ４～５の蕾は開花直前であり、ＳＰ１１遺伝子が強く発現することが明らかとなっている。また、ＳＰ１１発現調節領域内のＣｉｓ標的配列のＤＮＡメチル化は、葯のタペート細胞においてステージ２の後期から開始され、ステージ４及び５で最も高頻度となることが明らかとなっている（Shiba et al., Nat. Genet. 38, 297-299, 2006）。採取した蕾から葯を取り出し、葯から公知の方法によりｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出して、定量的逆転写ＰＣＲに供した。なお、内部標準としてＧＡＰＤＨを用いた。結果を図１１に示す。
１－３で用いた各植物体について、ＳＰ１１の定量的発現解析を行った。１－３と同様にして在来ナタネの形質転換体と野生型株を花成誘導し、長径が３ｍｍより大きく、５ｍｍ以下の蕾を採取した。なお、長径が３ｍｍより大きく５ｍｍ以下の蕾は、Takayama et al., 2000の分類法でステージ４～５に該当する。ステージ４～５の蕾は開花直前であり、ＳＰ１１遺伝子が強く発現することが明らかとなっている。また、ＳＰ１１発現調節領域内のＣｉｓ標的配列のＤＮＡメチル化は、葯のタペート細胞においてステージ２の後期から開始され、ステージ４及び５で最も高頻度となることが明らかとなっている（Shiba et al., Nat. Genet. 38, 297-299, 2006）。採取した蕾から葯を取り出し、葯から公知の方法によりｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出して、定量的逆転写ＰＣＲに供した。なお、内部標準としてＧＡＰＤＨを用いた。結果を図１１に示す。
【0081】
野生型株ではＳＰ１１の転写産物の蓄積が認められた。Ｓ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６コンストラクトを導入したＳ６０Ｓ６０、Ｓ４０Ｓ４０、Ｓ２９Ｓ２９株においては、Ｓ６０－ＳＰ１１、 Ｓ４０－ＳＰ１１、Ｓ２９－ＳＰ１１の発現量は野生型株とほぼ同等であった。一方で、Ｓ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６／Ｓ４４Ｓ４４株では、Ｓ４４Ｓ４４野生型株と比較してＳ４４－ＳＰ１１の転写産物量は約３０００分の１に減少した。以上の結果から、Ｓ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６低分子ＲＮＡはＳ４４－ＳＰ１１の発現を抑制する一方、Ｓ４４以外のＳＩＩハプロタイプのＳＰ１１の発現は抑制しないことが示唆された。
【0082】
１－５．Ｓ
６０
－Ｓｍｉ２－ｍ６／Ｓ
４４
Ｓ
４４
株の自家和合性の確認
１－２で得たＳ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６／Ｓ４４Ｓ４４株を、公知の方法で栽培し、自家受粉させた。また、Ｓ４４Ｓ４４野生型株も同様に自家受粉させた。結果を図１２に示す。
１－２で得たＳ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６／Ｓ４４Ｓ４４株を、公知の方法で栽培し、自家受粉させた。また、Ｓ４４Ｓ４４野生型株も同様に自家受粉させた。結果を図１２に示す。
【0083】
上述の通り、Ｓ４４Ｓ４４野生型株は自家不和合性であるため、自家受粉による種子は作られなかった。一方で、Ｓ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６／Ｓ４４Ｓ４４株においては、自家受粉によって種子が形成され、開花後に顕著な莢の伸長と、莢の中に発達した種子が観察された。すなわち、Ｓ４４Ｓ４４株は、Ｓ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６コンストラクトを導入したことにより自家和合化した。
【0084】
１－６．ＳＰ１１発現調節領域のＤＮＡメチル化解析
Ｓ４４Ｓ４４野生型株及びＳ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６／Ｓ４４Ｓ４４株について、ＳＰ１１発現調節領域のＤＮＡメチル化状態を解析した。具体的には、ステージ２～３あるいはステージ４～５の蕾から単離した葯タペート組織よりＤＮＡを抽出し、バイサルファイトシーケンス法によりメチル化されたシトシンの割合を算出した。結果を図１３ａに示す。Ｓ４４Ｓ４４野生型株においては、Ｓ４４－ＲＥＰ領域のうち、ＲＥＰ Ｃ領域付近で高頻度のＤＮＡメチル化が観察されたが、Ｓ４４－Ｃｉｓ領域にはメチル化は認められなかった。一方で、Ｓ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６／Ｓ４４Ｓ４４株においては、Ｓ４４－Ｃｉｓ領域及びＲＥＰ全域にメチル化が観察された。以上の結果より、葯タペート細胞において、Ｓ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６低分子ＲＮＡがＳ４４－ＳＰ１１発現調節領域のＤＮＡメチル化を促進したことが示唆された。
Ｓ４４Ｓ４４野生型株及びＳ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６／Ｓ４４Ｓ４４株について、ＳＰ１１発現調節領域のＤＮＡメチル化状態を解析した。具体的には、ステージ２～３あるいはステージ４～５の蕾から単離した葯タペート組織よりＤＮＡを抽出し、バイサルファイトシーケンス法によりメチル化されたシトシンの割合を算出した。結果を図１３ａに示す。Ｓ４４Ｓ４４野生型株においては、Ｓ４４－ＲＥＰ領域のうち、ＲＥＰ Ｃ領域付近で高頻度のＤＮＡメチル化が観察されたが、Ｓ４４－Ｃｉｓ領域にはメチル化は認められなかった。一方で、Ｓ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６／Ｓ４４Ｓ４４株においては、Ｓ４４－Ｃｉｓ領域及びＲＥＰ全域にメチル化が観察された。以上の結果より、葯タペート細胞において、Ｓ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６低分子ＲＮＡがＳ４４－ＳＰ１１発現調節領域のＤＮＡメチル化を促進したことが示唆された。
【0085】
１－７．小括
特に拘束される訳ではないが、試験例１の結果から、Ｓ４４Ｓ４４株の自家和合化は、以下のメカニズムに基づく可能性が考えられる：自家不和合性アブラナ科植物に導入された低分子ＲＮＡをコードする配列を含む核酸（コンストラクト）から、ステム－ループ構造を取る低分子ＲＮＡ前駆体が転写される；低分子ＲＮＡ前駆体はプロセシングを受けて２４塩基長の低分子ＲＮＡとなる；低分子ＲＮＡは葯タペート組織においてＳ４４－ＳＰ１１発現調節領域をＤＮＡメチル化する；Ｓ４４－ＳＰ１１の発現が抑制される；したがって、花粉因子Ｓ４４－ＳＰ１１と雌ずい因子Ｓ４４－ＳＲＫとの特異的相互作用が生じず、自家不和合反応が誘起されない；その結果、自家受粉により種子が形成される。
上記推定メカニズムの概要を、図１４に示す。
特に拘束される訳ではないが、試験例１の結果から、Ｓ４４Ｓ４４株の自家和合化は、以下のメカニズムに基づく可能性が考えられる：自家不和合性アブラナ科植物に導入された低分子ＲＮＡをコードする配列を含む核酸（コンストラクト）から、ステム－ループ構造を取る低分子ＲＮＡ前駆体が転写される；低分子ＲＮＡ前駆体はプロセシングを受けて２４塩基長の低分子ＲＮＡとなる；低分子ＲＮＡは葯タペート組織においてＳ４４－ＳＰ１１発現調節領域をＤＮＡメチル化する；Ｓ４４－ＳＰ１１の発現が抑制される；したがって、花粉因子Ｓ４４－ＳＰ１１と雌ずい因子Ｓ４４－ＳＲＫとの特異的相互作用が生じず、自家不和合反応が誘起されない；その結果、自家受粉により種子が形成される。
上記推定メカニズムの概要を、図１４に示す。
【0086】
＜試験例２＞Ｓ
４４
Ｓ
ＩＩ
在来ナタネの自家和合化
本発明者らは、Ｓ４４ハプロタイプとＳ４４以外のＳＩＩハプロタイプをヘテロで有する株についても、Ｓ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６コンストラクトの導入により自家和合化することを試みた。
本発明者らは、Ｓ４４ハプロタイプとＳ４４以外のＳＩＩハプロタイプをヘテロで有する株についても、Ｓ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６コンストラクトの導入により自家和合化することを試みた。
【0087】
２－１．Ｓ
６０
－Ｓｍｉ２－ｍ６／Ｓ
４４
Ｓ
２９
株の作成
１－１で作成したＳ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６コンストラクトを、１－２と同様のアグロバクテリウムを用いた形質転換法により、Ｓ４４Ｓ２９野生型在来ナタネ（すなわち、Ｓ４４ハプロタイプとＳ２９ハプロタイプをヘテロで有する自家不和合性の在来ナタネ）に導入した。当該形質転換体をＳ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６／Ｓ４４Ｓ２９株と称することがある。なお、コンストラクトの導入は、１－２と同様に導入遺伝子特異的なプライマーセットを用いたＰＣＲにより確認した。
１－１で作成したＳ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６コンストラクトを、１－２と同様のアグロバクテリウムを用いた形質転換法により、Ｓ４４Ｓ２９野生型在来ナタネ（すなわち、Ｓ４４ハプロタイプとＳ２９ハプロタイプをヘテロで有する自家不和合性の在来ナタネ）に導入した。当該形質転換体をＳ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６／Ｓ４４Ｓ２９株と称することがある。なお、コンストラクトの導入は、１－２と同様に導入遺伝子特異的なプライマーセットを用いたＰＣＲにより確認した。
【0088】
２－２．Ｓ
６０
－Ｓｍｉ２－ｍ６／Ｓ
４４
Ｓ
２９
株の自家和合性の確認
２－１で得たＳ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６／Ｓ４４Ｓ２９株を、公知の方法で栽培し、自家受粉させた。また、Ｓ４４Ｓ２９野生型株も同様に自家受粉させた。結果を図１５に示す。
２－１で得たＳ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６／Ｓ４４Ｓ２９株を、公知の方法で栽培し、自家受粉させた。また、Ｓ４４Ｓ２９野生型株も同様に自家受粉させた。結果を図１５に示す。
【0089】
Ｓ４４Ｓ２９野生型株は自家不和合性であるため、自家受粉による種子は作られなかった。一方で、Ｓ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６／Ｓ４４Ｓ２９株においては、自家受粉によって種子が形成され、開花後に顕著な莢の伸長と、莢の中に発達した種子が観察された。すなわち、Ｓ４４Ｓ２９株は、Ｓ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６コンストラクトを導入したことにより自家和合化した。
【0090】
２－３．Ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ ＲＴ－ＰＣＲ法による低分子ＲＮＡの発現解析
１－３と同様にして、Ｓ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６／Ｓ４４Ｓ２９株及びＳ４４Ｓ２９野生型株のステージ１～３の蕾から取り出した葯を用いて、低分子ＲＮＡの発現をＳｔｅｍ－ｌｏｏｐ ＲＴ－ＰＣＲ法により解析した。Ｃｌａｓｓ－ＩＩ－Ｓｍｉを内部標準とした。結果を図１６に示す。
１－３と同様にして、Ｓ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６／Ｓ４４Ｓ２９株及びＳ４４Ｓ２９野生型株のステージ１～３の蕾から取り出した葯を用いて、低分子ＲＮＡの発現をＳｔｅｍ－ｌｏｏｐ ＲＴ－ＰＣＲ法により解析した。Ｃｌａｓｓ－ＩＩ－Ｓｍｉを内部標準とした。結果を図１６に示す。
【0091】
Ｓ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６／Ｓ４４Ｓ２９株においてのみ、２４塩基長のＳ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６低分子ＲＮＡが発現していることが確認された。また、Ｓ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６／Ｓ４４Ｓ２９株及びＳ４４Ｓ２９野生型株のいずれにおいても、２４塩基長のＳ４４－Ｓｍｉ２の発現が確認され、Ｓ２９－Ｓｍｉ２は検出されなかった。当該結果は、前述したＳ２９－ＳＭＩ２前駆体構造の異常により２４塩基長の低分子ＲＮＡとしてプロセシングされないという過去の報告と一致した（非特許文献１）。
【0092】
２－４．ＳＰ１１遺伝子の発現解析
Ｓ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６／Ｓ４４Ｓ２９株、Ｓ４４Ｓ２９野生型株、Ｓ４４Ｓ４４野生型株、及び、Ｓ２９Ｓ２９野生型株を用い、ＳＰ１１の定量的発現解析を行った。１－４と同様に、各植物体からステージ４～５の蕾を採取し、葯を取り出した。取り出した葯からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、定量的逆転写ＰＣＲに供した。なお、内部標準としてＧＡＰＤＨを用いた。結果を図１７に示す。
Ｓ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６／Ｓ４４Ｓ２９株、Ｓ４４Ｓ２９野生型株、Ｓ４４Ｓ４４野生型株、及び、Ｓ２９Ｓ２９野生型株を用い、ＳＰ１１の定量的発現解析を行った。１－４と同様に、各植物体からステージ４～５の蕾を採取し、葯を取り出した。取り出した葯からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、定量的逆転写ＰＣＲに供した。なお、内部標準としてＧＡＰＤＨを用いた。結果を図１７に示す。
【0093】
Ｓ４４Ｓ２９野生型株におけるＳ４４－ＳＰ１１の発現量は、Ｓ４４Ｓ４４野生型株と比較して約２分の１であった。当該結果は、Ｓ４４Ｓ４４野生型株がＳ４４ハプロタイプを２つ有しているのに対して、Ｓ４４Ｓ２９野生型株は１つしか有していないことを反映していると考えられる。また、Ｓ４４Ｓ２９野生型株におけるＳ２９－ＳＰ１１の発現量は、Ｓ２９Ｓ２９野生型株と比較して約２５０分の１であった。当該結果は、Ｓ２９－ＳＰ１１の発現がＳ４４－Ｓｍｉ２により抑制されたためであると考えられる。
【0094】
Ｓ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６／Ｓ４４Ｓ２９株におけるＳ４４－ＳＰ１１の発現量は、Ｓ４４Ｓ４４野生型株と比較して約５００分の１に減少していた。また、Ｓ２９－ＳＰ１１の発現量も、Ｓ２９Ｓ２９野生型株の約１０００分の１に減少していた。
【0095】
以上の結果より、Ｓ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６／Ｓ４４Ｓ２９株において、Ｓ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６がＳ４４－ＳＰ１１の発現を抑制し、Ｓ４４－Ｓｍｉ２がＳ２９－ＳＰ１１の発現を抑制することで、ＳＰ１１が発現しない共潜性となる機構が示唆された。
【0096】
２－５．小括
特に拘束される訳ではないが、試験例２の結果から、Ｓ４４Ｓ２９株の自家和合化は、以下のメカニズムに基づく可能性が考えられる：自家不和合性アブラナ科植物に導入された低分子ＲＮＡをコードする配列を含む核酸（コンストラクト）から、ステム－ループ構造を取る低分子ＲＮＡ前駆体が転写される；低分子ＲＮＡ前駆体はプロセシングを受けて２４塩基長の低分子ＲＮＡとなる；低分子ＲＮＡは葯タペート組織においてＳ４４－ＳＰ１１発現調節領域をＤＮＡメチル化する；Ｓ４４－ＳＰ１１の発現が抑制される；さらに、Ｓ４４－Ｓｍｉ２によってＳ２９－ＳＰ１１の発現が抑制される；すなわち、Ｓ４４ハプロタイプ及びＳ２９ハプロタイプのいずれにおいてもＳＰ１１発現が抑制されるため、花粉因子ＳＰ１１と雌ずい因子ＳＲＫとの特異的相互作用が生じず、自家不和合反応が誘起されない；その結果、自家受粉により種子が形成される。
特に拘束される訳ではないが、試験例２の結果から、Ｓ４４Ｓ２９株の自家和合化は、以下のメカニズムに基づく可能性が考えられる：自家不和合性アブラナ科植物に導入された低分子ＲＮＡをコードする配列を含む核酸（コンストラクト）から、ステム－ループ構造を取る低分子ＲＮＡ前駆体が転写される；低分子ＲＮＡ前駆体はプロセシングを受けて２４塩基長の低分子ＲＮＡとなる；低分子ＲＮＡは葯タペート組織においてＳ４４－ＳＰ１１発現調節領域をＤＮＡメチル化する；Ｓ４４－ＳＰ１１の発現が抑制される；さらに、Ｓ４４－Ｓｍｉ２によってＳ２９－ＳＰ１１の発現が抑制される；すなわち、Ｓ４４ハプロタイプ及びＳ２９ハプロタイプのいずれにおいてもＳＰ１１発現が抑制されるため、花粉因子ＳＰ１１と雌ずい因子ＳＲＫとの特異的相互作用が生じず、自家不和合反応が誘起されない；その結果、自家受粉により種子が形成される。
【0097】
当該推定メカニズムの概要を、図１８に示す。
【0098】
上述した通り、アブラナ科植物のＳＩＩハプロタイプ間には、直線的な顕性潜性の関係（Ｓ４４＞Ｓ６０＞Ｓ４０＞Ｓ２９）が存在することが明らかとなっている。そのメカニズムとして、顕性側Ｓハプロタイプ上の逆位転写配列がトランスに機能し、潜性側Ｓハプロタイプ上のＳＰ１１発現調整領域がＤＮＡメチル化されることによって、潜性側ＳハプロタイプのＳＰ１１の発現が抑制されることが示唆されている（非特許文献１）。
【0099】
非特許文献１の開示と試験例２の結果から、ＳＩハプロタイプを有さず、少なくとも１つのＳ４４ハプロタイプを有する（すなわち、Ｓ４４ハプロタイプをホモで有するか（Ｓ４４Ｓ４４）、あるいは、Ｓ４４ハプロタイプと他のＳＩＩハプロタイプとをヘテロで有する（Ｓ４４ＳＩＩ））自家不和合性のアブラナ科植物において、Ｓ４４－ＳＰ１１を不活性化させる低分子ＲＮＡをコードする配列を含む核酸を導入することによって、花粉因子ＳＰ１１と雌ずい因子ＳＲＫとの特異的相互作用が生じなくなり、自家和合化されることが示唆される（図１８）。
【0100】
また、Ｓ４４－ＳＰ１１を不活性化させる低分子ＲＮＡをコードする配列を含む核酸を導入することにより自家和合化したＳ４４Ｓ４４株を、ＳＩハプロタイプを有さず、任意のＳＩＩハプロタイプを有する株と交配すれば、後代は自家和合性となる（図１９）。
【0101】
さらに、アブラナ科植物に導入された低分子ＲＮＡをコードする配列は、ほとんどの場合においてＳハプロタイプとは連鎖せずに（Ｓハプロタイプから独立して）後代に遺伝する。このため、自家和合化したアブラナ科植物から、自家受粉によりＳ４４－ＳＰ１１を不活性化させる低分子ＲＮＡをコードする配列を有さない株も取得できる。すなわち、自家和合化したアブラナ科植物の植物体から、自殖又は他殖により自家不和合性アブラナ科植物の植物体を得ることができる（図１９）。
【0102】
前述の方法では、Ｓ４４Ｓ４４株にＳ４４－ＳＰ１１を不活性化させる低分子ＲＮＡを導入していたが、ＳＩハプロタイプを有さず、Ｓ４４以外のＳＩＩハプロタイプを有する株にＳ４４－ＳＰ１１を不活性化させる低分子ＲＮＡを導入し、Ｓ４４Ｓ４４株と交配する方法でも後代は自家和合性となる（図２０）。このとき、Ｓ４４－ＳＰ１１を不活性化させる低分子ＲＮＡは、Ｓ４４以外のＳＩＩ－ＳＰ１１を不活性化させず、野生型Ｓ４４Ｓ４４株は自家不和合性であるため、両親系統は自家不和合性を保持している。この両親系統を交配して得られたＦ１ハイブリッドではじめて自家和合性となる。Ｆ１ハイブリッドの作出には自家不和合性を利用しながら、得られたＦ１ハイブリッドは油脂生産に適した自家和合性を付与することが可能である。また、交配により低分子ＲＮＡを持たない株も得ることができる（図２０）。
＜試験例３＞Ｓ ＩＩ －ＳＰ１１を不活性化させる低分子ＲＮＡの設計
本発明者らは、Ｓ４４に限られない任意のＳＩＩハプロタイプのＳＰ１１を不活性化させる低分子ＲＮＡの設計を試みた。
＜試験例３＞Ｓ ＩＩ －ＳＰ１１を不活性化させる低分子ＲＮＡの設計
本発明者らは、Ｓ４４に限られない任意のＳＩＩハプロタイプのＳＰ１１を不活性化させる低分子ＲＮＡの設計を試みた。
【0103】
上述の通り、アブラナ科植物では、顕性潜性の関係が生じる全てのＳハプロタイプの組み合わせにおいて、潜性となるＳハプロタイプのＳＰ１１の発現が抑制されていることが明らかとなっている。ＳＩハプロタイプとＳＩＩハプロタイプとのヘテロ個体においては、ＳＩハプロタイプ上の逆位反復配列（ＳＭＩ）に由来する２４塩基の低分子ＲＮＡ（ｃｌａｓｓ－Ｉ Ｓｍｉ）が、ＳＩＩハプロタイプのＳＰ１１発現調節領域をメチル化することにより、ＳＩＩ－ＳＰ１１の発現が抑制されることが示唆されている（非特許文献１）。一方、ＳＩＩハプロタイプ同士のヘテロ個体においては、顕性側のＳＩＩハプロタイプ上の逆位反復配列（ＳＭＩ２）に由来する２４塩基の低分子ＲＮＡ（Ｓｍｉ２）が、潜性側のＳＩＩハプロタイプのＳＰ１１発現調節領域をメチル化し、潜性側のＳＩＩ－ＳＰ１１の発現が抑制されることが示唆されている（非特許文献２）。なお、ＳＭＩはＳＩハプロタイプとＳＩＩハプロタイプの両方に存在するが、ＳＭＩ２はＳＩＩハプロタイプにのみ存在する。
【0104】
潜性側ハプロタイプのＳｍｉ２は、顕性側ハプロタイプのＳＰ１１発現を抑制しない。また、Ｓｍｉ２は、同一ハプロタイプのＳＰ１１発現も抑制しない。このような、Ｓｍｉ２が潜性側ハプロタイプのＳＰ１１発現のみを抑制する機構には、Ｓｍｉ２と、ＳＰ１１発現調節領域内の配列との相同性が関与している可能性が示唆されている（非特許文献１）。すなわち、Ｓｍｉ２は、潜性側ハプロタイプのＳＰ１１発現調節領域内の配列とより高い相同性を有する一方、顕性側ハプロタイプのＳＰ１１発現調節領域内の配列とは比較的相同性が低いため、潜性側ハプロタイプのＳＰ１１発現のみを抑制すると考えられている。また、ｃｌａｓｓ－Ｉ ＳｍｉがＳＩＩハプロタイプのＳＰ１１発現を抑制する機構においても、ｃｌａｓｓ－Ｉ Ｓｍｉと、ＳＩＩハプロタイプのＳＰ１１発現調節領域内の配列との相同性が関与している可能性が示唆されている（非特許文献２）。
【0105】
しかしながら、ＳＰ１１発現調節領域は、ＳＰ１１の転写開始点から上流の１０００～２０００ｂｐ程度までの広がりを有するものと予測されており、ＳＰ１１発現調節領域の中のどの配列と、Ｓｍｉ又はＳｍｉ２との相同性が、ＳＰ１１発現抑制に重要かについては、未解明な点が多い。
【0106】
本発明者らは、上記の知見に基づいて、任意のＳＩＩハプロタイプのＳＰ１１発現調節領域内の配列と高い相同性を有する低分子ＲＮＡをコードする配列を含む核酸を、当該ＳＩＩハプロタイプを有する自家不和合性アブラナ科植物に導入することにより、当該ＳＩＩハプロタイプのＳＰ１１発現を抑制し、自家不和合性アブラナ科植物を自家和合化する技術を検討した。
【0107】
３－１．低分子ＲＮＡとＳＰ１１発現調節領域配列の相同性の解析
上述の通り、アブラナ科植物のＳＩＩハプロタイプのＳＰ１１発現調節領域内には、ＳＰ１１翻訳開始点の上流１００～３００ｂｐ付近に、Ｓｍｉ２と塩基配列の相同性が高く、ＤＮＡメチル化の頻度が高い領域（Ｃｉｓ標的配列）が存在することが示唆されている（非特許文献１）。
上述の通り、アブラナ科植物のＳＩＩハプロタイプのＳＰ１１発現調節領域内には、ＳＰ１１翻訳開始点の上流１００～３００ｂｐ付近に、Ｓｍｉ２と塩基配列の相同性が高く、ＤＮＡメチル化の頻度が高い領域（Ｃｉｓ標的配列）が存在することが示唆されている（非特許文献１）。
【0108】
Ｃｉｓ標的配列のさらに上流に、Ｃｉｓ配列と似た３回の繰り返し配列が存在することが報告されており、ＲＥＰ領域と名付けられていた（Kakizaki et al., 2006）。この３回の繰り返し配列は、上流側から順にＲＥＰ Ａ領域、ＲＥＰ Ｂ領域、ＲＥＰ Ｃ領域と名付けられていた（図８）。本発明者らはＲＥＰ配列にも着目し、Ｓｍｉ、Ｓｍｉ２配列と、各ＳＩＩハプロタイプのＣｉｓ標的配列、ＲＥＰ Ａ標的配列、ＲＥＰ Ｂ標的配列、及びＲＥＰ Ｃ標的配列との間のミスペアスコアを算出した。結果を図２１及び図２２ａ～ｇに示す。なお、本開示において、ＲＥＰ Ｘ領域の中で特にＳｍｉ２と塩基配列の相同性が高い配列を、ＲＥＰ Ｘ標的配列と称することがある。例えば、ＲＥＰ Ｃ標的配列とは、ＲＥＰ Ｃ領域の中で特にＳｍｉ２と塩基配列の相同性が高い配列を示す。
【0109】
図２２ａ～ｇに示すように、Ｓｍｉ又はＳｍｉ２がＳＰ１１の発現を抑制するハプロタイプの組み合わせにおいては、Ｓｍｉ又はＳｍｉ２と、Ｃｉｓ標的配列との間のミスペアスコアが５．５以下であった。また、図２１に示すように、Ｓｍｉ又はＳｍｉ２がＳＰ１１の発現を抑制するハプロタイプの組み合わせにおいては、Ｓｍｉ又はＳｍｉ２の５’末端側から１０番目の塩基が、Ｃｉｓ標的配列中の対応する塩基と相補的な塩基であった。
【0110】
以上の結果から、本発明者らは、（ａ）ＳＰ１１遺伝子座のＣｉｓ標的配列に対するミスペアスコアが５．５以下であり、かつ５’末端側から１０番目の塩基がＣｉｓ標的配列中の対応する塩基と相補的塩基である、との条件を満たす、特定の２４塩基を含む低分子ＲＮＡを植物体内で発現させることにより、アブラナ科植物の任意のＳＩＩハプロタイプの花粉因子ＳＰ１１を不活性化できる蓋然性が高いことを見出した。
【0111】
また、Ｓ４４Ｓ４４野生型株において、ＲＥＰ Ｃ領域のＤＮＡメチル化が確認された（図１３ａ）。当該ＤＮＡメチル化は、Ｓ４４－Ｓｍｉ２によって引き起こされたものであると考えられる。Ｓ４４－Ｓｍｉ２とＳ４４－ＲＥＰ Ｃ標的配列との間のミスペアスコアは５．５であった（図２１）。さらに、Ｓ４４Ｓ６０野生型株及びＳ４４Ｓ４０野生型株においても、各ハプロタイプのＲＥＰ Ｃ領域のＤＮＡメチル化が確認された（図１３ｂ及びｃ）。Ｓ４４－Ｓｍｉ２とＳ６０－ＲＥＰ Ｃ標的配列との間のミスペアスコアは７．５であった一方、Ｓ６０－Ｓｍｉ２とＳ６０－ＲＥＰ Ｃ標的配列との間のミスペアスコアは６．０であった（図２１）。上述の通り、ミスペアスコアの値が小さいほど配列間の相同性が高いといえる。また、低分子ＲＮＡと標的配列間の相同性の高さが遺伝子の不活性化に関与する可能性が、これまでの研究で示唆されている。以上より、Ｓ４４Ｓ６０野生型株において確認されたＳ６０－ＲＥＰ Ｃ標的配列のメチル化は、ミスペアスコアがより小さい（相同性がより高い）Ｓ６０－Ｓｍｉ２によって引き起こされたものであると考えられる。Ｓ４４Ｓ４０野生型株についても同様に、Ｓ４４－Ｓｍｉ２とＳ４０－ＲＥＰ Ｃ標的配列との間のミスペアスコアは４．５であった一方、Ｓ４０－Ｓｍｉ２とＳ４０－ＲＥＰ Ｃ標的配列との間のミスペアスコアは３．０であった（図２１）。したがって、Ｓ４４Ｓ４０野生型株において確認されたＳ４０－ＲＥＰ Ｃ標的配列のメチル化は、ミスペアスコアがより小さいＳ４０－Ｓｍｉ２によって引き起こされたものであるか、あるいはこれらのミスペアスコアはいずれも比較的小さいため、Ｓ４４－Ｓｍｉ２及びＳ４０－Ｓｍｉ２両方によって引き起こされた可能性が、考えられる。また、Ｓ６０Ｓ６０野生型株及びＳ４０Ｓ４０野生型株においても同様に、ＲＥＰ Ｃ領域のＤＮＡメチル化が示唆されている。
【0112】
以上の結果から、本発明者らは、Ｓｍｉ２とＲＥＰ Ｃ標的配列との間のミスペアスコアが６．０以下である場合に、ＲＥＰ Ｃ領域がメチル化される可能性を見出した。また、この場合においては、Ｓｍｉ２の５’末端側から１０番目の塩基は、ＲＥＰ Ｃ標的配列中の対応する塩基と相補的でなくてもよい（ミスマッチを許容する）ことが示唆された。
【0113】
以上より、ＳＰ１１の不活性化において前記低分子ＲＮＡは、条件（ａ）に加えてさらに、（ｂ）ＳＰ１１遺伝子座のＲＥＰ Ｃ標的配列に対するミスペアスコアが６．０以下である、との条件を満たすことが好ましいことを見出した。
【0114】
なお、試験例１及び２において在来ナタネに導入したＳ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６コンストラクトから生じると推定される、Ｓ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６低分子ＲＮＡは、２４塩基長であり、（ａ）Ｓ４４－ＳＰ１１遺伝子座のＲＥＰ Ｃ標的配列に対するミスペアスコアが４．０であり、（ｂ）Ｓ４４－ＳＰ１１遺伝子座のＣｉｓ標的配列に対するミスペアスコアが２．０であり、かつ、５’末端側から１０番目の塩基がＣｉｓ標的配列中の対応する塩基と相補的塩基である（図２３）。また、Ｓ６０－Ｓｍｉ２－ｍ６低分子ＲＮＡの５’末端側から１０番目の塩基は、Ｓ４４－ＳＰ１１遺伝子座のＲＥＰ Ｃ標的配列中の対応する塩基とは相補的でない（ミスマッチである）。
【0115】
以上、試験例１～３の結果から、（ａ）ＳＰ１１遺伝子座のＣｉｓ標的配列に対するミスペアスコアが５．５以下であり、かつ５’末端側から１０番目の塩基がＣｉｓ標的配列中の対応する塩基と相補的塩基である、との条件を満たす特定の２４塩基を含む低分子ＲＮＡを植物体内で発現させることにより、アブラナ科植物の任意のＳＩＩハプロタイプの花粉因子ＳＰ１１を不活性化できること、及び、さらに（ｂ）ＳＰ１１遺伝子座のＲＥＰ Ｃ標的配列に対するミスペアスコアが６．０以下である、との条件を満たすことがより好ましいことが示された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13a】
【図13b】
【図13c】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22a】
【図22b】
【図22c】
【図22d】
【図22e】
【図22f】
【図22g】
【図23】
【配列表】