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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024078693
(43)【公開日】2024-06-11
(54)【発明の名称】細胞培養方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20240604BHJP
C12N 5/0735 20100101ALI20240604BHJP
C12N 5/074 20100101ALI20240604BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10
C12N5/0735
C12N5/074
【審査請求】未請求
【請求項の数】6
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022191188
(22)【出願日】2022-11-30
(71)【出願人】
【識別番号】000003768
【氏名又は名称】東洋製罐グループホールディングス株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100154184
【弁理士】
【氏名又は名称】生富 成一
(74)【代理人】
【識別番号】100105795
【弁理士】
【氏名又は名称】名塚 聡
(74)【代理人】
【識別番号】100187377
【弁理士】
【氏名又は名称】芳野 理之
(72)【発明者】
【氏名】西山 喬晴
(72)【発明者】
【氏名】田中 郷史
(72)【発明者】
【氏名】小関 修
(72)【発明者】
【氏名】戸谷 貴彦
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC20
4B065BA01
4B065BB04
4B065BC50
4B065CA60
(57)【要約】
【課題】 細胞を未分化の状態でスフェアの形態により増殖させる場合において、スフェアの崩壊を抑制することの可能な細胞培養方法を提供する。
【解決手段】 細胞を未分化の状態で増殖させる細胞培養方法であって、培地への細胞の播種時にＲＯＣＫ阻害剤を培地に添加した後、前記細胞からなるスフェアを形成させ、培地に対して新たな培地の追加又は培地交換を行うにあたり、培地におけるＲＯＣＫ阻害剤の濃度を２μＭ以上に維持する。また、培地におけるＲＯＣＫ阻害剤の濃度を、２μＭ以上、１０μＭ以下に維持することが好ましい。さらに、ＲＯＣＫ阻害剤がＹ－２７６３２であることが好ましい。
【選択図】 図４
【解決手段】 細胞を未分化の状態で増殖させる細胞培養方法であって、培地への細胞の播種時にＲＯＣＫ阻害剤を培地に添加した後、前記細胞からなるスフェアを形成させ、培地に対して新たな培地の追加又は培地交換を行うにあたり、培地におけるＲＯＣＫ阻害剤の濃度を２μＭ以上に維持する。また、培地におけるＲＯＣＫ阻害剤の濃度を、２μＭ以上、１０μＭ以下に維持することが好ましい。さらに、ＲＯＣＫ阻害剤がＹ－２７６３２であることが好ましい。
【選択図】 図４
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞を未分化の状態で増殖させる細胞培養方法であって、
培地への前記細胞の播種時にＲＯＣＫ阻害剤を前記培地に添加した後、前記細胞からなるスフェアを形成させ、前記培地に対して新たな培地の追加又は培地交換を行うにあたり、前記培地における前記ＲＯＣＫ阻害剤の濃度を２μＭ以上に維持する
ことを特徴とする細胞培養方法。
培地への前記細胞の播種時にＲＯＣＫ阻害剤を前記培地に添加した後、前記細胞からなるスフェアを形成させ、前記培地に対して新たな培地の追加又は培地交換を行うにあたり、前記培地における前記ＲＯＣＫ阻害剤の濃度を２μＭ以上に維持する
ことを特徴とする細胞培養方法。
【請求項2】
前記培地における前記ＲＯＣＫ阻害剤の濃度を、２μＭ以上、１０μＭ以下に維持する
ことを特徴とする請求項１記載の細胞培養方法。
ことを特徴とする請求項１記載の細胞培養方法。
【請求項3】
前記ＲＯＣＫ阻害剤が、ＡＺＤ－５３６３，Ｆａｓｕｄｉｌ，ＧＳＫ－４２９２８６Ａ，Ｈ８９，Ｐａｎｔｏｐｒａｚｏｌｅ，Ｐａｎｔｏｐｒａｚｏｌｅ Ｓｏｄｉｕｍ Ｓｅｓｑｕｉｈｙｄｒａｔｅ，ＲＫＩ－１４４７，Ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ，Ｙ－２７６３２のうち、一つ以上から選択されることを特徴とする請求項１又は２記載の細胞培養方法。
【請求項4】
前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ－２７６３２であることを特徴とする請求項１又は２記載の細胞培養方法。
【請求項5】
前記細胞が、ｉＰＳ細胞、又はＥＳ細胞であることを特徴とする請求項１又は２記載の細胞培養方法。
【請求項6】
前記細胞の培養を、バイオリアクター、軟包材からなる培養バッグ、又は培養プレートを用いて行うことを特徴とする請求項１又は２記載の細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞培養技術に関し、特にスフェアの形態で細胞を培養する技術に関する。
【背景技術】
【0002】
近年、細胞の大量培養の手段として、バイオリアクターなどを用いて、細胞をスフェアの形態で培養することが盛んに行なわれている。
しかし、スフェアを長期間培養していると、その形状が崩れて培養効率が落ちるという現象が生じていた。
しかし、スフェアを長期間培養していると、その形状が崩れて培養効率が落ちるという現象が生じていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】国際公開第２０１６／０９３３５９号パンフレット
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells（NATURE BIOTECHNOLOGY VOLUME 25 NUMBER 6 JUNE 2007）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
具体的には、例えば、３０ｍＬバイオリアクターにｉＰＳ細胞を２５０万個播種して培養を行うことによって細胞凝集塊（スフェア）を作成した。培養１日目に２／３の培地交換を１回行い、次いで培養４日目に２／３の培地交換を１回行い、培養５日目と培養６日目に２／３の培地交換を２回行い、培養７日目まで培養を行った。
その結果、一般的に綺麗な形状のスフェアは、図１（Ａ）に示すように球状になっているところ、培養５日目のスフェアは、図１（Ｂ）に示すようにやや角張っており、培養７日目のスフェアは、図１（Ｃ）に示すように大きく崩壊した形状となっていることが観察された。
その結果、一般的に綺麗な形状のスフェアは、図１（Ａ）に示すように球状になっているところ、培養５日目のスフェアは、図１（Ｂ）に示すようにやや角張っており、培養７日目のスフェアは、図１（Ｃ）に示すように大きく崩壊した形状となっていることが観察された。
【0006】
本発明者らは、その原因について鋭意研究し、細胞と基材の間、又は細胞と細胞の間の接着を失って単個の細胞（シングルセル）になった当該細胞が細胞死を起こすのを阻害するためにその細胞の播種時にのみ培地に添加する試薬であるＲＯＣＫ阻害剤の濃度が、培地交換を重ねるごとに低下して、ある一定以下の濃度になったときにスフェアが崩れるのではないかと推測した。
そして、細胞の播種時にＲＯＣＫ阻害剤を培地に添加した後、培地交換を行うにあたり、培地におけるＲＯＣＫ阻害剤の濃度を、一定以上に制御することによって、スフェアの崩壊を抑制できることを見いだした。
そして、細胞の播種時にＲＯＣＫ阻害剤を培地に添加した後、培地交換を行うにあたり、培地におけるＲＯＣＫ阻害剤の濃度を、一定以上に制御することによって、スフェアの崩壊を抑制できることを見いだした。
【0007】
ここで、特許文献１には、幹細胞を分化誘導するための分化誘導培地にＲＯＣＫ阻害剤を含有させてスフェアを製造することが開示されている。
また、非特許文献１には、ＥＳ細胞を分化誘導させるために、分化誘導の初期６日間にＲＯＣＫ阻害剤を入れ続けることによって、細胞の生存率、増殖率が上昇したことが開示されている。
しかしながら、これらの文献には、細胞を未分化の状態で増殖させる場合に、ＲＯＣＫ阻害剤の濃度を制御することによって、スフェアの崩壊を抑制することについては、記載も示唆もされていない。
また、非特許文献１には、ＥＳ細胞を分化誘導させるために、分化誘導の初期６日間にＲＯＣＫ阻害剤を入れ続けることによって、細胞の生存率、増殖率が上昇したことが開示されている。
しかしながら、これらの文献には、細胞を未分化の状態で増殖させる場合に、ＲＯＣＫ阻害剤の濃度を制御することによって、スフェアの崩壊を抑制することについては、記載も示唆もされていない。
【0008】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、細胞を未分化の状態でスフェアの形態により増殖させる場合において、スフェアの崩壊を抑制することの可能な細胞培養方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
上記目的を達成するため、本発明の細胞培養方法は、細胞を未分化の状態で増殖させる細胞培養方法であって、培地への前記細胞の播種時にＲＯＣＫ阻害剤を前記培地に添加した後、前記細胞からなるスフェアを形成させ、前記培地に対して新たな培地の追加又は培地交換を行うにあたり、前記培地における前記ＲＯＣＫ阻害剤の濃度を２μＭ以上に維持する方法としてある。
【0010】
また、本発明の細胞培養方法は、前記培地における前記ＲＯＣＫ阻害剤の濃度を、２μＭ以上、１０μＭ以下に維持する方法とすることが好ましい。
また、本発明の細胞培養方法は、前記ＲＯＣＫ阻害剤が、ＡＺＤ－５３６３，Ｆａｓｕｄｉｌ，ＧＳＫ－４２９２８６Ａ，Ｈ８９，Ｐａｎｔｏｐｒａｚｏｌｅ，Ｐａｎｔｏｐｒａｚｏｌｅ Ｓｏｄｉｕｍ Ｓｅｓｑｕｉｈｙｄｒａｔｅ，ＲＫＩ－１４４７，Ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ，Ｙ－２７６３２のうち、一つ以上から選択される方法とすることが好ましい。
また、本発明の細胞培養方法は、前記ＲＯＣＫ阻害剤が、ＡＺＤ－５３６３，Ｆａｓｕｄｉｌ，ＧＳＫ－４２９２８６Ａ，Ｈ８９，Ｐａｎｔｏｐｒａｚｏｌｅ，Ｐａｎｔｏｐｒａｚｏｌｅ Ｓｏｄｉｕｍ Ｓｅｓｑｕｉｈｙｄｒａｔｅ，ＲＫＩ－１４４７，Ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ，Ｙ－２７６３２のうち、一つ以上から選択される方法とすることが好ましい。
【0011】
また、本発明の細胞培養方法は、前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ－２７６３２である方法とすることが好ましい。
また、本発明の細胞培養方法は、前記細胞が、ｉＰＳ細胞、又はＥＳ細胞である方法とすることが好ましい。
また、本発明の細胞培養方法は、前記細胞が、ｉＰＳ細胞、又はＥＳ細胞である方法とすることが好ましい。
【0012】
また、本発明の細胞培養方法は、前記細胞の培養を、バイオリアクター、軟包材からなる培養バッグ、又は培養プレートを用いて行う方法とすることが好ましい。
さらに、本発明の細胞培養方法は、上記の細胞培養方法を様々に組み合わせた方法とすることも好ましい。
さらに、本発明の細胞培養方法は、上記の細胞培養方法を様々に組み合わせた方法とすることも好ましい。
【発明の効果】
【0013】
本発明によれば、細胞を未分化の状態でスフェアの形態により増殖させる場合において、スフェアの崩壊を抑制することの可能な細胞培養方法の提供が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】綺麗な球状のスフェア（Ａ）、培養５日目のやや角張ったスフェア（Ｂ）、及び培養７日目の大きく崩壊した形状のスフェア（Ｃ）を示す説明図である。
【図2】試験１におけるＲＯＣＫ阻害剤の濃度制御を示すグラフを表した図である。
【図3】試験１の結果、得られたスフェアの形状、全生細胞数、及び増殖率を示す図である。
【図4】試験２の結果、得られたスフェアの形状を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0015】
以下、本発明の細胞培養方法の実施形態について説明する。ただし、本発明は、以下の実施形態及び後述する実施例の具体的な内容に限定されるものではない。
本実施形態の細胞培養方法は、細胞を未分化の状態で増殖させる細胞培養方法であって、培地への細胞の播種時にＲＯＣＫ阻害剤を培地に添加した後、細胞からなるスフェアを形成させ、培地に対して新たな培地の追加又は培地交換を行うにあたり、培地におけるＲＯＣＫ阻害剤の濃度を２μＭ以上に維持することを特徴とする。
本実施形態の細胞培養方法は、細胞を未分化の状態で増殖させる細胞培養方法であって、培地への細胞の播種時にＲＯＣＫ阻害剤を培地に添加した後、細胞からなるスフェアを形成させ、培地に対して新たな培地の追加又は培地交換を行うにあたり、培地におけるＲＯＣＫ阻害剤の濃度を２μＭ以上に維持することを特徴とする。
【0016】
本実施形態の細胞培養方法において、培養する細胞としては、未分化の状態で増殖可能なものであれば特に限定されないが、例えば、ｉＰＳ細胞、又はＥＳ細胞を好適に用いることができる。
また、本実施形態の細胞培養方法において、ＲＯＣＫ阻害剤として、ＡＺＤ－５３６３，Ｆａｓｕｄｉｌ，ＧＳＫ－４２９２８６Ａ，Ｈ８９，Ｐａｎｔｏｐｒａｚｏｌｅ，Ｐａｎｔｏｐｒａｚｏｌｅ Ｓｏｄｉｕｍ Ｓｅｓｑｕｉｈｙｄｒａｔｅ，ＲＫＩ－１４４７，Ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ，Ｙ－２７６３２のうち、少なくともいずれかを用いることが好ましく、Ｙ－２７６３２を用いることが特に好ましい。
また、本実施形態の細胞培養方法において、ＲＯＣＫ阻害剤として、ＡＺＤ－５３６３，Ｆａｓｕｄｉｌ，ＧＳＫ－４２９２８６Ａ，Ｈ８９，Ｐａｎｔｏｐｒａｚｏｌｅ，Ｐａｎｔｏｐｒａｚｏｌｅ Ｓｏｄｉｕｍ Ｓｅｓｑｕｉｈｙｄｒａｔｅ，ＲＫＩ－１４４７，Ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ，Ｙ－２７６３２のうち、少なくともいずれかを用いることが好ましく、Ｙ－２７６３２を用いることが特に好ましい。
【0017】
また、本実施形態の細胞培養方法において、培地におけるＲＯＣＫ阻害剤の濃度を、２μＭ以上、１０μＭ以下に維持することが好ましく、２μＭ以上、５μＭ以下に維持することがより好ましく、２μＭ以上、３．３μＭ以下に維持することがさらに好ましい。
さらに、本実施形態の細胞培養方法において、細胞の培養を、バイオリアクター、軟包材からなる培養バッグ、又は培養プレートを用いて行うことが好ましい。
さらに、本実施形態の細胞培養方法において、細胞の培養を、バイオリアクター、軟包材からなる培養バッグ、又は培養プレートを用いて行うことが好ましい。
【0018】
このような本実施形態の細胞培養方法によれば、細胞を未分化の状態でスフェアの形態により増殖させる場合において、スフェアの崩壊を抑制することが可能である。
【実施例0019】
以下、本発明の細胞培養方法の効果を確認するために行った試験について説明する。
［試験１］
まず、細胞を未分化の状態でスフェアの形態により増殖させる場合において、培地のＲＯＣＫ阻害剤の濃度が一定以上になるように制御すれば、スフェアの崩壊を抑制できることを確認するための試験を行った。
［試験１］
まず、細胞を未分化の状態でスフェアの形態により増殖させる場合において、培地のＲＯＣＫ阻害剤の濃度が一定以上になるように制御すれば、スフェアの崩壊を抑制できることを確認するための試験を行った。
【0020】
具体的には、接着細胞用の組織培養用マイクロプレート（イワキ株式会社）を用いて、ｉＰＳ細胞（１２３１Ａ３株）の接着培養を７日間行った。
次に、培養されたｉＰＳ細胞をTrypLE（Thermo Fisher Scientific社）の酵素処理によってマイクロプレートから剥離し、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ－２７６３２，富士フイルム和光純薬株式会社）を終濃度１０μＭとなるように添加したStemFit培地（味の素株式会社）に懸濁することによって、ｉＰＳ細胞のシングルセルを調製した。
次に、培養されたｉＰＳ細胞をTrypLE（Thermo Fisher Scientific社）の酵素処理によってマイクロプレートから剥離し、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ－２７６３２，富士フイルム和光純薬株式会社）を終濃度１０μＭとなるように添加したStemFit培地（味の素株式会社）に懸濁することによって、ｉＰＳ細胞のシングルセルを調製した。
【0021】
さらに、調製されたシングルセル２５０万cells分をＲＯＣＫ阻害剤を終濃度１０μＭとなるように添加したStemFit培地３０ｍＬに入れることによって得られた細胞懸濁液を、３０ｍＬシングルユースバイオリアクター（エイブル株式会社）に充填した。このようにして細胞懸濁液を充填した３０ｍＬシングルユースバイオリアクターを３個準備した。
その後、インキュベーター内（３７℃、５％ＣＯ２)に配置した６チャンネルマグネチックスターラー（エイブル株式会社)）に、これらのバイオリアクターをセットして、４０ｒｐｍの回転速度で培養を開始した。
その後、インキュベーター内（３７℃、５％ＣＯ２)に配置した６チャンネルマグネチックスターラー（エイブル株式会社)）に、これらのバイオリアクターをセットして、４０ｒｐｍの回転速度で培養を開始した。
【0022】
図２に示すように、培養開始から７日目において、ＲＯＣＫ阻害剤の濃度が１０μＭのもの（系列１）、３．３μＭのもの（系列２）、及び０.０１μＭのもの（系列３）の３種類の系列を以下のように作成した。
そして、培養開始から７日目の各培地におけるスフェアの形状を観察すると共に、スフェアをシングルセルにして全生細胞数を計数した。シングルセルは上述した方法と同様の方法で調製した。また、計数は、細胞計数装置（NC-200，ChemoMetec社）、及び計数用カセット（Via1-Cassette，ChemoMetec社）を用いて常法により行った。
そして、培養開始から７日目の各培地におけるスフェアの形状を観察すると共に、スフェアをシングルセルにして全生細胞数を計数した。シングルセルは上述した方法と同様の方法で調製した。また、計数は、細胞計数装置（NC-200，ChemoMetec社）、及び計数用カセット（Via1-Cassette，ChemoMetec社）を用いて常法により行った。
【0023】
系列１については、培養を開始してから１日目、４日目に、２０ｍＬ分の培地を抜き、ＲＯＣＫ阻害剤を終濃度１０μＭとなるように添加したStemFit培地を２０ｍＬ分入れる動作（２／３量交換）を行い、５日目、６日目には、この２／３量交換を１日の中で２回ずつ行った。
これにより、系列１の培養開始から７日目の培地におけるＲＯＣＫ阻害剤の濃度を１０μＭとした。
これにより、系列１の培養開始から７日目の培地におけるＲＯＣＫ阻害剤の濃度を１０μＭとした。
【0024】
系列２については、培養を開始してから１日目に、２０ｍＬ分の培地を抜き、ＲＯＣＫ阻害剤を含まない新しいStemFit培地を２０ｍＬ分入れる動作を行った。次に、バイオリアクターでの培養を開始してから４日目に、２０ｍＬ分の培地を抜き、ＲＯＣＫ阻害剤を終濃度３．３μＭとなるように添加したStemFit培地を２０ｍＬ分入れる動作を行った。５日目、６日目には、４日目に行った２／３量交換を１日の中で２回ずつ行った。
これにより、系列２の培養開始から７日目の培地におけるＲＯＣＫ阻害剤の濃度を３．３μＭとした。
これにより、系列２の培養開始から７日目の培地におけるＲＯＣＫ阻害剤の濃度を３．３μＭとした。
【0025】
系列３については、培養を開始してから１日目、４日目に、２０ｍＬ分の培地を抜き、ＲＯＣＫ阻害剤を含まない新しいStemFit培地を２０ｍＬ分入れる動作（２／３量交換）を行い、５日目、６日目はこの２／３量交換を１日の中で２回ずつ行った。
これにより、系列３の培養開始から７日目の培地におけるＲＯＣＫ阻害剤の濃度を０.０１μＭとした。
これにより、系列３の培養開始から７日目の培地におけるＲＯＣＫ阻害剤の濃度を０.０１μＭとした。
【0026】
その結果、図３に示すように、培養開始から７日目の培地におけるＲＯＣＫ阻害剤の濃度が、１０μＭである系列１の培地と３．３μＭである系列２の培地では、スフェアの形状は損なわれておらず、綺麗な球状であった。
一方、培養開始から４日目におけるＲＯＣＫ阻害剤の濃度が１．１μＭであり、培養開始から５日目におけるＲＯＣＫ阻害剤の濃度が０．１２μＭであり、培養開始から７日目におけるＲＯＣＫ阻害剤の濃度が０.０１μＭである系列３の培地では、スフェアの形状が大きく崩壊していた。
一方、培養開始から４日目におけるＲＯＣＫ阻害剤の濃度が１．１μＭであり、培養開始から５日目におけるＲＯＣＫ阻害剤の濃度が０．１２μＭであり、培養開始から７日目におけるＲＯＣＫ阻害剤の濃度が０.０１μＭである系列３の培地では、スフェアの形状が大きく崩壊していた。
【0027】
また、系列１の培地における全生細胞数は３３７２万個、増殖率は１３．５倍であり、系列２の培地における全生細胞数は４１８９万個、増殖率は１６．８倍であったのに対し、系列３の培地における全生細胞数は２６４６万個、増殖率は１０．６倍であった。
このように、スフェアの形状が損なわれていない系列１と２は、スフェアの形状が崩壊していた系列３に比べて、増殖効率が高いことが明らかとなった。なお、スフェアの形状が損なわれていない系列１と２は、未分化維持率が９０％以上保たれていることも別途確認されている。
このように、スフェアの形状が損なわれていない系列１と２は、スフェアの形状が崩壊していた系列３に比べて、増殖効率が高いことが明らかとなった。なお、スフェアの形状が損なわれていない系列１と２は、未分化維持率が９０％以上保たれていることも別途確認されている。
【0028】
［試験２］
次に、細胞を未分化の状態でスフェアの形態により増殖させる場合において、スフェアの崩壊を抑制するのに最適なＲＯＣＫ阻害剤の濃度範囲を確認するための試験を行った。
また、この試験において、バイオリアクターを用いた培養のみならず、静置型の容器を用いた培養でも、スフェアの崩壊を抑制できるかを確認した。
次に、細胞を未分化の状態でスフェアの形態により増殖させる場合において、スフェアの崩壊を抑制するのに最適なＲＯＣＫ阻害剤の濃度範囲を確認するための試験を行った。
また、この試験において、バイオリアクターを用いた培養のみならず、静置型の容器を用いた培養でも、スフェアの崩壊を抑制できるかを確認した。
【0029】
具体的には、試験１と同様に、接着細胞用の組織培養用マイクロプレート（イワキ株式会社）を用いて、ｉＰＳ細胞（１２３１Ａ３株）の接着培養を７日間行った。
次に、培養されたｉＰＳ細胞をTrypLE（Thermo Fisher Scientific社）の酵素処理によってマイクロプレートから剥離し、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ－２７６３２，富士フイルム和光純薬株式会社）を終濃度１０μＭとなるように添加したStemFit培地（味の素株式会社）に懸濁することによって、ｉＰＳ細胞のシングルセルを調製した。
次に、培養されたｉＰＳ細胞をTrypLE（Thermo Fisher Scientific社）の酵素処理によってマイクロプレートから剥離し、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ－２７６３２，富士フイルム和光純薬株式会社）を終濃度１０μＭとなるように添加したStemFit培地（味の素株式会社）に懸濁することによって、ｉＰＳ細胞のシングルセルを調製した。
【0030】
次に、３次元培養用プレートのPrimeSurface（96well，住友ベークライト株式会社）を７個使用して、それぞれの培養用プレートに調製されたシングルセルを１００cells／wellとなるように播種すると共に、培養用プレートにおけるStemFit培地のＲＯＣＫ阻害剤の終濃度が１０μＭとなるように調製した。
さらに、培養開始から１日目に、６個の培養用プレートのＲＯＣＫ阻害剤の濃度が、それぞれ０．１μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭになるように、培地交換を行った。また、１個の培養用プレートについては、培地交換を行うことなく、ＲＯＣＫ阻害剤の濃度を１０μＭに維持した。
さらに、培養開始から１日目に、６個の培養用プレートのＲＯＣＫ阻害剤の濃度が、それぞれ０．１μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭになるように、培地交換を行った。また、１個の培養用プレートについては、培地交換を行うことなく、ＲＯＣＫ阻害剤の濃度を１０μＭに維持した。
【0031】
そして、培養開始から３日目に、各培養用プレートにおけるスフェアの形状を確認した。
その結果、図４に示すように、ＲＯＣＫ阻害剤の濃度が０．１μＭと１μＭのものでは、スフェアの形状が崩壊していた。
これに対して、ＲＯＣＫ阻害剤の濃度が２μＭ以上のものでは、スフェアの形状は、綺麗な球状であることが観察された。
その結果、図４に示すように、ＲＯＣＫ阻害剤の濃度が０．１μＭと１μＭのものでは、スフェアの形状が崩壊していた。
これに対して、ＲＯＣＫ阻害剤の濃度が２μＭ以上のものでは、スフェアの形状は、綺麗な球状であることが観察された。
【0032】
本発明は、以上の実施形態及び実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、実施例ではｉＰＳ細胞を使用しているが、ＥＳ細胞などその他の未分化細胞の培養に適用してもよい。また、細胞を軟包材からなる培養バッグを用いて培養する場合に適用するなど適宜変更することが可能である。
例えば、実施例ではｉＰＳ細胞を使用しているが、ＥＳ細胞などその他の未分化細胞の培養に適用してもよい。また、細胞を軟包材からなる培養バッグを用いて培養する場合に適用するなど適宜変更することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【0033】
本発明は、ｉＰＳ細胞などを未分化の状態で拡大培養する場合などに、好適に利用することが可能である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
