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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024079633
(43)【公開日】2024-06-11
(54)【発明の名称】アンチセンス核酸からなる医薬
(51)【国際特許分類】
A61K 31/7088 20060101AFI20240604BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240604BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20240604BHJP
【ＦＩ】
A61K31/7088 ZNA
A61P43/00 105
C12N15/11 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】29
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023201238
(22)【出願日】2023-11-29
(31)【優先権主張番号】P 2022191137
(32)【優先日】2022-11-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】000002912
【氏名又は名称】住友ファーマ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110001195
【氏名又は名称】弁理士法人深見特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】満 智秋
(72)【発明者】
【氏名】浅野 成宏
(72)【発明者】
【氏名】日野 恭介
【テーマコード（参考）】
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZB21
4C086ZC54
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ウェルナー症候群に対する新たな治療薬を提供する。
【解決手段】ヒトＷＲＮ遺伝子の第２６番又は第２８番エクソンのスキップ変異に対して、機能的なヒトＷＲＮタンパク質を発現するオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬である。上記オリゴヌクレオチドの塩基長は、１０～３０ｍｅｒであり、上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、特定の塩基配列における、上記オリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも１つの標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、上記標的領域において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して、相補的な塩基配列、又は、上記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列である。
【選択図】図３
【解決手段】ヒトＷＲＮ遺伝子の第２６番又は第２８番エクソンのスキップ変異に対して、機能的なヒトＷＲＮタンパク質を発現するオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬である。上記オリゴヌクレオチドの塩基長は、１０～３０ｍｅｒであり、上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、特定の塩基配列における、上記オリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも１つの標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、上記標的領域において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して、相補的な塩基配列、又は、上記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列である。
【選択図】図３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒトＷＲＮ遺伝子の第２６番又は第２８番エクソンのスキップ変異に対して、機能的なヒトＷＲＮタンパク質を発現するオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬であって、
前記オリゴヌクレオチドは、各ヌクレオチドがリン酸基及び／又は修飾リン酸基で結合されており、
前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の修飾糖を有する修飾核酸、を含み、
前記オリゴヌクレオチドの塩基長は、１０～３０ｍｅｒであり、
前記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６に記載の塩基配列における、前記オリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも１つの標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、
前記標的領域において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して、相補的な塩基配列、又は、
前記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列、である、オリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。
前記オリゴヌクレオチドは、各ヌクレオチドがリン酸基及び／又は修飾リン酸基で結合されており、
前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の修飾糖を有する修飾核酸、を含み、
前記オリゴヌクレオチドの塩基長は、１０～３０ｍｅｒであり、
前記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６に記載の塩基配列における、前記オリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも１つの標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、
前記標的領域において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して、相補的な塩基配列、又は、
前記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列、である、オリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。
【請求項2】
前記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６に記載の塩基配列における、前記オリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも１つの標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９５％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６に記載の塩基配列における、前記オリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも１つの標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９５％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。
【請求項3】
前記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６に記載の塩基配列における、前記オリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも１つの標的領域に対して相補的な塩基配列である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６に記載の塩基配列における、前記オリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも１つの標的領域に対して相補的な塩基配列である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。
【請求項4】
前記オリゴヌクレオチドの塩基長は、１５～２５ｍｅｒである、請求項１～請求項３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。
【請求項5】
前記オリゴヌクレオチドを構成する糖がＤ－リボフラノースであり、糖の修飾が前記Ｄ－リボフラノースの２’位の水酸基の糖修飾である、請求項１～請求項４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。
【請求項6】
前記オリゴヌクレオチドを構成する糖の修飾が下記の式（Ａ１）で表される基である、請求項１～請求項５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。
（式中、Ｂｘは核酸塩基であり、それぞれ、独立して、アデニン、グアニン、シトシン、５－メチルシトシン、チミン又はウラシルで表される基であり、Ｘはリン酸結合であり、それぞれ、独立して、ホスホジエステル結合、ホスホロチオアート結合、ホスホロジチオアート結合、ホスホアミダート結合、ボラノホスフェート結合又はアルキルホスホナート結合であり、Ｙは、それぞれ、独立して、水素原子、水酸基、フッ素原子、置換されていてもよい炭素数１～６のアルコキシ基、又は置換されていてもよいアミノ基であり、Ｚは、それぞれ、独立して、水素原子であるか、炭素－酸素二重結合若しくは環状構造を有していてもよい炭素数１～５のアルキル基であるか、又は前記アルキル基の一部の炭素原子とＹとが一緒になって環を形成する。）
【化1】
（式中、Ｂｘは核酸塩基であり、それぞれ、独立して、アデニン、グアニン、シトシン、５－メチルシトシン、チミン又はウラシルで表される基であり、Ｘはリン酸結合であり、それぞれ、独立して、ホスホジエステル結合、ホスホロチオアート結合、ホスホロジチオアート結合、ホスホアミダート結合、ボラノホスフェート結合又はアルキルホスホナート結合であり、Ｙは、それぞれ、独立して、水素原子、水酸基、フッ素原子、置換されていてもよい炭素数１～６のアルコキシ基、又は置換されていてもよいアミノ基であり、Ｚは、それぞれ、独立して、水素原子であるか、炭素－酸素二重結合若しくは環状構造を有していてもよい炭素数１～５のアルキル基であるか、又は前記アルキル基の一部の炭素原子とＹとが一緒になって環を形成する。）
【請求項7】
前記オリゴヌクレオチドを構成する糖の修飾が下記の式（Ａ２）又は式（Ａ３）で表される基である、請求項１～請求項６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。
（式中、Ｂｘは核酸塩基であり、それぞれ、独立して、アデニン、グアニン、シトシン、５－メチルシトシン、チミン又はウラシルで表される基であり、Ｘはリン酸結合であり、それぞれ、独立して、ホスホジエステル結合、ホスホロチオアート結合、ホスホロジチオアート結合、ホスホアミダート結合、ボラノホスフェート結合又はアルキルホスホナート結合であり、Ｒ４は、それぞれ、独立して、水素原子、置換されていてもよい炭素数１～６のアルキル基であり、Ｙ’は、酸素原子又は置換されていてもよい窒素原子であり、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ、独立して、水素原子、置換されていてもよい炭素数１～６のアルキル基、又は、Ｒ５及びＲ６が一緒になってカルボニル基又は環を形成しており、ｎは、０又は１である。）
【化2】
（式中、Ｂｘは核酸塩基であり、それぞれ、独立して、アデニン、グアニン、シトシン、５－メチルシトシン、チミン又はウラシルで表される基であり、Ｘはリン酸結合であり、それぞれ、独立して、ホスホジエステル結合、ホスホロチオアート結合、ホスホロジチオアート結合、ホスホアミダート結合、ボラノホスフェート結合又はアルキルホスホナート結合であり、Ｒ４は、それぞれ、独立して、水素原子、置換されていてもよい炭素数１～６のアルキル基であり、Ｙ’は、酸素原子又は置換されていてもよい窒素原子であり、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ、独立して、水素原子、置換されていてもよい炭素数１～６のアルキル基、又は、Ｒ５及びＲ６が一緒になってカルボニル基又は環を形成しており、ｎは、０又は１である。）
【請求項8】
前記オリゴヌクレオチドを構成する糖の修飾が前記式（Ａ２）で表される基であり、前記Ｒ４は、それぞれ、独立して、メチル基、メトキシエチル基、又はＮ－メチルプロパンアミド基である、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。
【請求項9】
前記オリゴヌクレオチドを構成する糖の修飾が前記式（Ａ３）で表される基であり、前記Ｙ’は、酸素原子、又は水素原子、メチル基、メトキシエチル基、若しくはＮ－メチルプロパンアミド基で置換されていてもよい窒素原子であり、前記Ｒ５及びＲ６は、それぞれ、独立して、水素原子、炭素数１～２のアルキル基、又は前記Ｒ５及びＲ６が一緒になってカルボニル基又は炭素数３～６の環を形成しており、ｎは、０又は１である、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。
【請求項10】
前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項１～請求項９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。
【請求項11】
前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチド間結合がホスホジエステル結合である、請求項１～請求項１０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。
【請求項12】
前記オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合がホスホジエステル結合又はホスホロチオエート結合である、請求項１～請求項９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。
【請求項13】
前記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、
前記オリゴヌクレオチドが下記の式（Ａ４）で表されるモルフォリノ核酸で構成され、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６に記載の塩基配列における、前記オリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも１つの標的領域に対して相補的な塩基配列を持つモルフォリノオリゴ核酸である、請求項１～４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。
（式中、Ｂｘは核酸塩基であり、それぞれ、独立して、アデニン、グアニン、シトシン、５－メチルシトシン、チミン又はウラシルで表される基であり、Ｘ’はリン酸結合であり、それぞれ、独立して、ホスホロジアミダート結合、ホスホロジアミドチオアート結合、又はホスホロジアミドジチオアート結合である。）
前記オリゴヌクレオチドが下記の式（Ａ４）で表されるモルフォリノ核酸で構成され、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６に記載の塩基配列における、前記オリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも１つの標的領域に対して相補的な塩基配列を持つモルフォリノオリゴ核酸である、請求項１～４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。
【化3】
（式中、Ｂｘは核酸塩基であり、それぞれ、独立して、アデニン、グアニン、シトシン、５－メチルシトシン、チミン又はウラシルで表される基であり、Ｘ’はリン酸結合であり、それぞれ、独立して、ホスホロジアミダート結合、ホスホロジアミドチオアート結合、又はホスホロジアミドジチオアート結合である。）
【請求項14】
前記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、
配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１番～４０番、４６番、５１番、５６番、若しくは６２番～６３番に位置する塩基から連続した１５～２５ｍｅｒで構成された標的領域、又は配列番号２に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１０８８７３番、１０８８７８番～１０８９１７番、１０８９２３番、１０８９２８番、１０８９３３番、若しくは１０８９３９番～１０８９４０番に位置する塩基から連続した１５～２５ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、
前記標的領域において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して相補的な塩基配列、又は、
前記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列である、請求項１～請求項１３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。
配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１番～４０番、４６番、５１番、５６番、若しくは６２番～６３番に位置する塩基から連続した１５～２５ｍｅｒで構成された標的領域、又は配列番号２に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１０８８７３番、１０８８７８番～１０８９１７番、１０８９２３番、１０８９２８番、１０８９３３番、若しくは１０８９３９番～１０８９４０番に位置する塩基から連続した１５～２５ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、
前記標的領域において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して相補的な塩基配列、又は、
前記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列である、請求項１～請求項１３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。
【請求項15】
前記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１番～３２番、３４番～４０番、４６番、５１番、若しくは６２番～６３番に位置する塩基から連続した１５～２５ｍｅｒで構成された標的領域、又は配列番号２に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１０８８７８番～１０８９０９番、１０８９１１番～１０８９１７番、１０８９２３番、１０８９２８番、若しくは１０８９３９番～１０８９４０番に位置する塩基から連続した１５～２５ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列である、請求項１～請求項１４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。
【請求項16】
前記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１番、３番、５番～１２番、１４番～１９番、２１番、２５番、２９番、３０番、３１番、３４番、４６番、若しくは５１番に位置する塩基から連続した１５～２５ｍｅｒで構成された標的領域、又は配列番号２に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１０８８７８番、１０８８８０番、１０８８８２番～１０８８８９番、１０８８９１番～１０８８９６番、１０８８９８番、１０８９０２番、１０８９０６番～１０８９０８番、１０８９１１番、１０８９２３番、若しくは１０８９２８番に位置する塩基から連続した１５～２５ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列である、請求項１～請求項１５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。
【請求項17】
前記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号９～１４、１６～２６、２８～３９、４１～４２、４４～５０、５２、５５～５６、６９、７３、８０～１０５、１０７～１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８～１３１、１３３、及び１３５の塩基配列からなる群より選ばれる１つの塩基配列である、請求項１～請求項１６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。
【請求項18】
前記オリゴヌクレオチドは、表２－１から表２－７に示す配列名６－２０－Ａ、８－２０－Ａ、８－２０－Ｂ、８－２０－Ｃ、９－２０－Ａ、１０－２０－Ａ、１２－２０－Ａ、１４－２０－Ａ、１６－２０－Ａ、１７－２０－Ａ、１８－２０－Ａ、１９－２０－Ａ、１５－２５－Ａ、１０－１７－Ａ、１０－２０－Ｂ、１２－２０－Ｂ、１４－２０－Ｂ、１５－２０－Ｂ、１６－２０－Ｂ、１９－２０－Ｂ、３１－２０－Ｂ、３４－２０－Ｂ、６－２０－Ｂ、７－２０－Ｂ、８－２０－Ｄ、及び９－２０－Ｂからなる群より選ばれる１つのオリゴヌクレオチドである、請求項１～請求項１７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。
【請求項19】
前記オリゴヌクレオチドは、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１～請求項１８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。
【請求項20】
請求項１９に記載のオリゴヌクレオチドと、
前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズしている第二鎖オリゴヌクレオチドと、を含む二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬であって、
前記第二鎖オリゴヌクレオチドの塩基配列は、前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列である、二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。
前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズしている第二鎖オリゴヌクレオチドと、を含む二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬であって、
前記第二鎖オリゴヌクレオチドの塩基配列は、前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列である、二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。
【請求項21】
請求項１～１９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は請求項２０に記載の二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬と、
前記オリゴヌクレオチド又は前記第二鎖オリゴヌクレオチドに、直接又はリンカー結合を介して結合している付加物質と、を有する、オリゴヌクレオチド複合体又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬であって、
前記付加物質は、ポリエチレングリコール、ペプチド、アルキル鎖、リガンド化合物、抗体、タンパク質、及び糖鎖からなる群より選ばれ、
前記リンカー結合は、それぞれ、独立してホスホジエステル結合、ホスホロチオアート結合、ホスホロジチオアート結合、ホスホアミダート結合、ボラノホスフェート結合、アルキルホスホナート結合、ホスホロジアミダート結合、ホスホロジアミドチオアート結合、又はホスホロジアミドジチオアート結合である、オリゴヌクレオチド複合体又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。
前記オリゴヌクレオチド又は前記第二鎖オリゴヌクレオチドに、直接又はリンカー結合を介して結合している付加物質と、を有する、オリゴヌクレオチド複合体又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬であって、
前記付加物質は、ポリエチレングリコール、ペプチド、アルキル鎖、リガンド化合物、抗体、タンパク質、及び糖鎖からなる群より選ばれ、
前記リンカー結合は、それぞれ、独立してホスホジエステル結合、ホスホロチオアート結合、ホスホロジチオアート結合、ホスホアミダート結合、ボラノホスフェート結合、アルキルホスホナート結合、ホスホロジアミダート結合、ホスホロジアミドチオアート結合、又はホスホロジアミドジチオアート結合である、オリゴヌクレオチド複合体又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。
【請求項22】
請求項１～１９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、請求項２０に記載の二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は請求項２１に記載のオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を有効成分として含む医薬品。
【請求項23】
請求項１～１９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、請求項２０に記載の二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は請求項２１に記載のオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を有効成分として含む、ヒトＷＲＮ遺伝子の第２７番目エクソンのスキッピング剤。
【請求項24】
請求項１～１９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、請求項２０に記載の二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は請求項２１に記載のオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を有効成分として含む、ヒトＷＲＮ遺伝子の第２７番目のエクソンのスキッピングによる核移行シグナルを保有する機能的ＷＲＮ回復剤。
【請求項25】
請求項１～１９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、請求項２０に記載の二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は請求項２１に記載のオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を有効成分として含む、ウェルナー症候群に対する治療剤。
【請求項26】
請求項１～１９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、請求項２０に記載の二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は請求項２１に記載のオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を有効成分として含む、ウェルナー症候群に対する予防剤。
【請求項27】
請求項１～１９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、請求項２０に記載の二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は請求項２１に記載のオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を個体に投与することを含む、ウェルナー症候群の治療方法又は予防方法。
【請求項28】
ウェルナー症候群の治療又は予防に使用するための、請求項１～１９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、請求項２０に記載の二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は請求項２１に記載のオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬。
【請求項29】
ウェルナー症候群の治療剤又は予防剤を製造するために使用する、請求項１～１９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、請求項２０に記載の二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は請求項２１に記載のオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ウェルナー症候群の原因遺伝子のＷＲＮ遺伝子の第２７番目のエクソンのスキッピングを可能にするアンチセンスオリゴヌクレオチド（アンチセンス核酸）からなる医薬及び該オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
ウェルナー症候群は、早期老化をきたす希少疾患であり、若年期に、一般的な老人に見られる特徴、例えば白髪化、禿、糖尿病、心疾患、ガン、皮膚の退縮、皮膚の強皮症様変化、若年性白内障、早老、性腺機能低下などを示すことが知られている。より具体的には、２０～３０歳代から皮膚の萎縮・硬化、白髪や禿頭等の毛髪の変化、白内障等の老化徴候が出現する。さらに、糖尿病、動脈硬化ならびに悪性腫瘍等を高率に合併し、多くは５０歳代で死に至る。また、肘、膝、踵等に好発する難治性皮膚潰瘍の悪化により四肢切断に至り、生活の質が損なわれるケースも多い（非特許文献１）。
【0003】
ウェルナー症候群は常染色体劣性の遺伝性希少疾患であり、第８染色体短腕（８ｐ１２）上に存在するＲｅｃＱ型ＤＮＡ/ＲＮＡヘリカーゼ（ＷＲＮヘリカーゼ）をコードするＷＲＮ遺伝子が原因遺伝子として同定されている（非特許文献２,非特許文献３）。
ＷＲＮタンパク質は１４３２アミノ酸からなり、ＡＴＰ依存性のＤＮＡ／ＲＮＡヘリカーゼ活性、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を持つ。生理機能としては、ＤＮＡ複製、塩基除去修復、ＤＮＡ二重鎖切断修復、転写、テロメアの維持と多様な機能を持ち、遺伝子修復と染色体の安定性の維持に働く。そのためウェルナー症候群では顕著なゲノムの不安定化が認められる。ウェルナー症候群患者由来線維芽細胞は、健常者由来の正常細胞と比べ分裂寿命が短く、増殖速度が顕著に低下する（非特許文献４）。線維芽細胞分裂能の低下は、ウェルナー症候群の皮膚潰瘍の創傷治癒の遅延の一つの要因と考えられる（非特許文献５）。
ＷＲＮタンパク質は１４３２アミノ酸からなり、ＡＴＰ依存性のＤＮＡ／ＲＮＡヘリカーゼ活性、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を持つ。生理機能としては、ＤＮＡ複製、塩基除去修復、ＤＮＡ二重鎖切断修復、転写、テロメアの維持と多様な機能を持ち、遺伝子修復と染色体の安定性の維持に働く。そのためウェルナー症候群では顕著なゲノムの不安定化が認められる。ウェルナー症候群患者由来線維芽細胞は、健常者由来の正常細胞と比べ分裂寿命が短く、増殖速度が顕著に低下する（非特許文献４）。線維芽細胞分裂能の低下は、ウェルナー症候群の皮膚潰瘍の創傷治癒の遅延の一つの要因と考えられる（非特許文献５）。
【0004】
ＷＲＮタンパク質のＣ末端付近には核移行シグナル（ＮＬＳ：Ｎｅｕｃｌｅａｒ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｉｇｎａｌ）が存在し、核移行を誘導することで正常な生理機能を果たす（図１）。しかしながら、スプライシング、ナンセンス、フレームシフトなどの変異に基づく中途ストップコドン（終止コドン）の出現によって核移行シグナルが欠失した不完全なＷＲＮタンパク質が作られた場合、本来核内で機能するべきＷＲＮヘリカーゼが核内へ移行できないため、その機能を果たすことができなくなり、ウェルナー症候群が発症する（図１及び図２）（非特許文献３）。
ウェルナー症候群の日本人患者の約７割において、ヒトＷＲＮ遺伝子の２６番エクソンのスキップ変異ｃ.３１３９－１Ｇ＞Ｃによりアミノ酸の読み枠にズレが生じ（Ｏｕｔ－ｏｆ－Ｆｒａｍｅ）、第２７番エクソン（以下、「エクソン２７」と称することがある。）にストップコドン（終止コドン）が出現する。このためにヒトＷＲＮ遺伝子の第２７番エクソン以降のＣ末端に存在する核移行シグナルを欠失しているＷＲＮタンパク質が作られ、本来の機能を喪失する（図２）（非特許文献３）。
ウェルナー症候群の日本人患者の約７割において、ヒトＷＲＮ遺伝子の２６番エクソンのスキップ変異ｃ.３１３９－１Ｇ＞Ｃによりアミノ酸の読み枠にズレが生じ（Ｏｕｔ－ｏｆ－Ｆｒａｍｅ）、第２７番エクソン（以下、「エクソン２７」と称することがある。）にストップコドン（終止コドン）が出現する。このためにヒトＷＲＮ遺伝子の第２７番エクソン以降のＣ末端に存在する核移行シグナルを欠失しているＷＲＮタンパク質が作られ、本来の機能を喪失する（図２）（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】国際公開第２０１１／０５２４３６号
【特許文献2】国際公開第２０１４／０４６２１２号
【特許文献3】国際公開第２０１５／１２５７８３号
【特許文献4】国際公開第１９９１／００９０３３号
【特許文献5】国際公開第２００９／０６４４７１号
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Ｇｅｒｉａｔｒ Ｇｅｒｏｎｔｏｌ Ｉｎｔ（２０１３）１３：４７５－４８１
【非特許文献2】Ｎａｔｕｒｅ（１９９２）３５５：７３５－７３８
【非特許文献3】Ａｍ. Ｊ. Ｈｕｍ. Ｇｅｎｅｔ．（１９９７）６０：３３０－３４１
【非特許文献4】Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９８１）５８：３１０－３１６
【非特許文献5】皮膚臨床（２０００）４０：１５１２－１５１３
【非特許文献6】Ａｎｎｕ. Ｒｅｖ. Ｐｈａｒｍａｃｏｌ. Ｔｏｘｉｃｏｌ.（２０１０）５０：２５９－２９３
【非特許文献7】Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２０１６）５９：９６４５－９６６７
【非特許文献8】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ（２０１６）１３８：１５６６３－１５６７２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
ウェルナー症候群は、患者の生命と生活の質を脅かす難病であるが、現在のところウェルナー症候群に対する有効な治療法がなく、新たな治療薬の創製が切望されている。
【0008】
近年、新たな治療薬として核酸医薬品が実用化されている。核酸医薬品は、核酸あるいは修飾核酸が十数から数十塩基連結したオリゴ核酸で構成され、タンパク質翻訳に関わるメッセンジャーＲＮＡ又は非翻訳ＲＮＡなどに直接作用するものや、抗体医薬のように標的タンパク質に作用するものが知られており、化学合成により製造される医薬品である。核酸医薬品の一種であるスプライシング制御型アンチセンスオリゴヌクレオチドは、スプライシング因子のｍＲＮＡ前駆体（以下、「ｐｒｅ－ｍＲＮＡ」と称することがある。）への結合を阻害することで、近傍に存在するエクソンのスプライシングをスイッチし（スプライスアウト）、フレームシフトを起こした異常ＲＮＡの読み枠を正常化することができる。この結果、ある遺伝子のエクソンをスプライスアウトさせることにより、機能発現に重要なＮ末端とＣ末端を保持した当該タンパク質を発現させる。このように、スプライシング制御型アンチセンスオリゴヌクレオチドによって標的となるエクソンをスキップすることでＣ末端までが翻訳された機能的なタンパク質を新たに発現させることが可能となり、これによりある疾患の病態を改善する可能性がある。これは、エクソンスキップ療法と呼ばれ、この治療で発現されるタンパク質は正常のものより短くはなるが、変異により欠損していた機能を回復することができる（非特許文献６）。
【0009】
上記のように、ウェルナー症候群において最も高頻度の変異として報告されているのは、ヒトＷＲＮ遺伝子の第２６番エクソンのスキップ変異ｃ.３１３９－１Ｇ＞Ｃである。上記スキップ変異ｃ.３１３９－１Ｇ＞Ｃにより第２７番エクソン内に終止コドンが出現し、Ｃ末端に存在する核移行シグナルを含んだ終止コドン以降のアミノ酸配列を欠失したＷＲＮタンパク質が作られ、本来の生理機能を喪失する。この状態を改善するため、本発明者らは、スプライシング制御型アンチセンスオリゴヌクレオチドに着目し、ヒトＷＲＮ遺伝子のエクソン２７のスキッピングを誘導するアンチセンスオリゴヌクレオチドの創生の検討を行った。
【0010】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、本発明が解決しようとする課題は、ヒトＷＲＮ遺伝子の第２７番エクソンのスキッピングを可能にするオリゴヌクレオチドからなる医薬、及びこれを含むヒトＷＲＮ遺伝子の第２７番エクソンを高効率にスキッピングさせる薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明者らは、ヒトＷＲＮ遺伝子のｍＲＮＡ前駆体のうちエクソン２７及び周辺のヌクレオチドからなる配列をアンチセンスオリゴヌクレオチドでターゲッティングすることにより、高効率にエクソン２７のスキッピングを誘導できることを見出した。本発明者らは、この知見に基づき、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下の通りである。
【0012】
［１］本発明に係るオリゴヌクレオチドからなる医薬は、ヒトＷＲＮ遺伝子の第２６番又は第２８番エクソンのスキップ変異に対して、機能的なヒトＷＲＮタンパク質を発現するオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬であって、
上記オリゴヌクレオチドは、各ヌクレオチドがリン酸基及び／又は修飾リン酸基で結合されており、
上記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の修飾糖を有する修飾核酸、を含み、
上記オリゴヌクレオチドの塩基長は、１０～３０ｍｅｒであり、
上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６に記載の塩基配列における、上記オリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも１つの標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、
上記標的領域において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して、相補的な塩基配列、又は、
上記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列、である、オリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬である。
上記オリゴヌクレオチドは、各ヌクレオチドがリン酸基及び／又は修飾リン酸基で結合されており、
上記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の修飾糖を有する修飾核酸、を含み、
上記オリゴヌクレオチドの塩基長は、１０～３０ｍｅｒであり、
上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６に記載の塩基配列における、上記オリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも１つの標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、
上記標的領域において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して、相補的な塩基配列、又は、
上記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列、である、オリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬である。
【0013】
上記構成を備えるオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬は、ヒトＷＲＮ遺伝子の第２７番エクソンのスキッピングを可能にする。
【0014】
［２］上記［１］において、上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６に記載の塩基配列における、上記オリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも１つの標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９５％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列であることが好ましい。
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６に記載の塩基配列における、上記オリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも１つの標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９５％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列であることが好ましい。
【0015】
［３］上記［１］において、上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６に記載の塩基配列における、上記オリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも１つの標的領域に対して相補的な塩基配列であることが好ましい。
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６に記載の塩基配列における、上記オリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも１つの標的領域に対して相補的な塩基配列であることが好ましい。
【0016】
［４］上記［１］～［３］のいずれかにおいて、上記オリゴヌクレオチドの塩基長は、１５～２５ｍｅｒであることが好ましい。
【0017】
［５］上記［１］～［４］のいずれかにおいて、上記オリゴヌクレオチドを構成する糖がＤ－リボフラノースであり、糖の修飾がＤ－リボフラノースの２’位の水酸基の糖修飾であることが好ましい。
【0018】
［６］上記［１］～［５］のいずれかにおいて、上記オリゴヌクレオチドを構成する糖の修飾が下記の式（Ａ１）で表される基であることが好ましい。
（式中、Ｂｘは核酸塩基であり、それぞれ、独立して、アデニン、グアニン、シトシン、５－メチルシトシン、チミン又はウラシルで表される基であり、Ｘはリン酸結合であり、それぞれ、独立して、ホスホジエステル結合、ホスホロチオアート結合、ホスホロジチオアート結合、ホスホアミダート結合、ボラノホスフェート結合又はアルキルホスホナート結合であり、Ｙは、それぞれ、独立して、水素原子、水酸基、フッ素原子、置換されていてもよい炭素数１～６のアルコキシ基、又は置換されていてもよいアミノ基であり、Ｚは、それぞれ、独立して、水素原子であるか、炭素－酸素二重結合若しくは環状構造を有していてもよい炭素数１～５のアルキル基であるか、又は上記アルキル基の一部の炭素原子とＹとが一緒になって環を形成する。）
【化1】
（式中、Ｂｘは核酸塩基であり、それぞれ、独立して、アデニン、グアニン、シトシン、５－メチルシトシン、チミン又はウラシルで表される基であり、Ｘはリン酸結合であり、それぞれ、独立して、ホスホジエステル結合、ホスホロチオアート結合、ホスホロジチオアート結合、ホスホアミダート結合、ボラノホスフェート結合又はアルキルホスホナート結合であり、Ｙは、それぞれ、独立して、水素原子、水酸基、フッ素原子、置換されていてもよい炭素数１～６のアルコキシ基、又は置換されていてもよいアミノ基であり、Ｚは、それぞれ、独立して、水素原子であるか、炭素－酸素二重結合若しくは環状構造を有していてもよい炭素数１～５のアルキル基であるか、又は上記アルキル基の一部の炭素原子とＹとが一緒になって環を形成する。）
【0019】
［７］上記［１］～［６］のいずれかにおいて、上記オリゴヌクレオチドを構成する糖の修飾が下記の式（Ａ２）又は式（Ａ３）で表される基であることが好ましい。
（式中、Ｂｘは核酸塩基であり、それぞれ、独立して、アデニン、グアニン、シトシン、５－メチルシトシン、チミン又はウラシルで表される基であり、Ｘはリン酸結合であり、それぞれ、独立して、ホスホジエステル結合、ホスホロチオアート結合、ホスホロジチオアート結合、ホスホアミダート結合、ボラノホスフェート結合又はアルキルホスホナート結合であり、Ｒ４は、それぞれ、独立して、水素原子、置換されていてもよい炭素数１～６のアルキル基であり、Ｙ’は、酸素原子又は置換されていてもよい窒素原子であり、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ、独立して、水素原子、置換されていてもよい炭素数１～６のアルキル基、又は、Ｒ５及びＲ６が一緒になってカルボニル基又は環を形成しており、ｎは、０又は１である。）
【化2】
（式中、Ｂｘは核酸塩基であり、それぞれ、独立して、アデニン、グアニン、シトシン、５－メチルシトシン、チミン又はウラシルで表される基であり、Ｘはリン酸結合であり、それぞれ、独立して、ホスホジエステル結合、ホスホロチオアート結合、ホスホロジチオアート結合、ホスホアミダート結合、ボラノホスフェート結合又はアルキルホスホナート結合であり、Ｒ４は、それぞれ、独立して、水素原子、置換されていてもよい炭素数１～６のアルキル基であり、Ｙ’は、酸素原子又は置換されていてもよい窒素原子であり、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ、独立して、水素原子、置換されていてもよい炭素数１～６のアルキル基、又は、Ｒ５及びＲ６が一緒になってカルボニル基又は環を形成しており、ｎは、０又は１である。）
【0020】
［８］上記［７］において、上記オリゴヌクレオチドを構成する糖の修飾が上記式（Ａ２）で表される基であり、上記Ｒ４は、それぞれ、独立して、メチル基、メトキシエチル基、又はＮ－メチルプロパンアミド基であることが好ましい。
【0021】
[９]上記［７］において、上記オリゴヌクレオチドを構成する糖の修飾が上記式（Ａ３）で表される基であり、上記Ｙ’は、酸素原子、又は水素原子、メチル基、メトキシエチル基、若しくはＮ－メチルプロパンアミド基で置換されていてもよい窒素原子であり、上記Ｒ５及びＲ６は、それぞれ、独立して、水素原子、炭素数１～２のアルキル基、又は上記Ｒ５及びＲ６が一緒になってカルボニル基又は炭素数３～６の環を形成しており、ｎは、０又は１であることが好ましい。
【0022】
［１０］上記［１］～［９］のいずれかにおいて、上記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合であることが好ましい。
【0023】
［１１］上記［１］～［１０］のいずれかにおいて、上記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチド間結合がホスホジエステル結合であることが好ましい。
【0024】
［１２］上記［１］～［９］のいずれかにおいて、上記オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合がホスホジエステル結合又はホスホロチオエート結合であることが好ましい。
【0025】
［１３］上記［１］～［４］のいずれかにおいて、上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、
上記オリゴヌクレオチドが下記の式（Ａ４）で表されるモルフォリノ核酸で構成され、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６に記載の塩基配列における、上記オリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも１つの標的領域に対して相補的な塩基配列を持つモルフォリノオリゴ核酸であることが好ましい。
（式中、Ｂｘは核酸塩基であり、それぞれ、独立して、アデニン、グアニン、シトシン、５－メチルシトシン、チミン又はウラシルで表される基であり、Ｘ’はリン酸結合であり、それぞれ、独立して、ホスホロジアミダート結合、ホスホロジアミドチオアート結合、又はホスホロジアミドジチオアート結合である。）
上記オリゴヌクレオチドが下記の式（Ａ４）で表されるモルフォリノ核酸で構成され、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６に記載の塩基配列における、上記オリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも１つの標的領域に対して相補的な塩基配列を持つモルフォリノオリゴ核酸であることが好ましい。
【化3】
（式中、Ｂｘは核酸塩基であり、それぞれ、独立して、アデニン、グアニン、シトシン、５－メチルシトシン、チミン又はウラシルで表される基であり、Ｘ’はリン酸結合であり、それぞれ、独立して、ホスホロジアミダート結合、ホスホロジアミドチオアート結合、又はホスホロジアミドジチオアート結合である。）
【0026】
［１４］上記［１］～［１３］のいずれかにおいて、上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、
配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１番～４０番、４６番、５１番、５６番、若しくは６２番～６３番に位置する塩基から連続した１５～２５ｍｅｒで構成された標的領域、又は配列番号２に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１０８８７３番、１０８８７８番～１０８９１７番、１０８９２３番、１０８９２８番、１０８９３３番、若しくは１０８９３９番～１０８９４０番に位置する塩基から連続した１５～２５ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、
上記標的領域において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して相補的な塩基配列、又は、
上記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列であることが好ましい。
配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１番～４０番、４６番、５１番、５６番、若しくは６２番～６３番に位置する塩基から連続した１５～２５ｍｅｒで構成された標的領域、又は配列番号２に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１０８８７３番、１０８８７８番～１０８９１７番、１０８９２３番、１０８９２８番、１０８９３３番、若しくは１０８９３９番～１０８９４０番に位置する塩基から連続した１５～２５ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、
上記標的領域において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して相補的な塩基配列、又は、
上記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列であることが好ましい。
【0027】
［１５］上記［１］～［１４］のいずれかにおいて、上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１番～３２番、３４番～４０番、４６番、５１番、若しくは６２番～６３番に位置する塩基から連続した１５～２５ｍｅｒで構成された標的領域、又は配列番号２に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１０８８７８番～１０８９０９番、１０８９１１番～１０８９１７番、１０８９２３番、１０８９２８番、若しくは１０８９３９番～１０８９４０番に位置する塩基から連続した１５～２５ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列であることが好ましい。
【0028】
［１６］上記［１］～［１５］のいずれかにおいて、上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１番、３番、５番～１２番、１４番～１９番、２１番、２５番、２９番、３０番、３１番、３４番、４６番、若しくは５１番に位置する塩基から連続した１５～２５ｍｅｒで構成された標的領域、又は配列番号２に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１０８８７８番、１０８８８０番、１０８８８２番～１０８８８９番、１０８８９１番～１０８８９６番、１０８８９８番、１０８９０２番、１０８９０６番～１０８９０８番、１０８９１１番、１０８９２３番、若しくは１０８９２８番に位置する塩基から連続した１５～２５ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列であることが好ましい。
【0029】
［１７］上記［１］～［１６］のいずれかにおいて、上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号９～１４、１６～２６、２８～３９、４１～４２、４４～５０、５２、５５～５６、６９、７３、８０～１０５、１０７～１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８～１３１、１３３、及び１３５の塩基配列からなる群より選ばれる１つの塩基配列であることが好ましい。
【0030】
［１８］上記［１］～［１７］のいずれかにおいて、上記オリゴヌクレオチドは、表２－１から表２－７に示す配列名６－２０－Ａ、８－２０－Ａ、８－２０－Ｂ、８－２０－Ｃ、９－２０－Ａ、１０－２０－Ａ、１２－２０－Ａ、１４－２０－Ａ、１６－２０－Ａ、１７－２０－Ａ、１８－２０－Ａ、１９－２０－Ａ、１５－２５－Ａ、１０－１７－Ａ、１０－２０－Ｂ、１２－２０－Ｂ、１４－２０－Ｂ、１５－２０－Ｂ、１６－２０－Ｂ、１９－２０－Ｂ、３１－２０－Ｂ、３４－２０－Ｂ、６－２０－Ｂ、７－２０－Ｂ、８－２０－Ｄ、及び９－２０－Ｂからなる群より選ばれる１つのオリゴヌクレオチドであることが好ましい。
【0031】
［１９］上記［１］～［１８］のいずれかにおいて、上記オリゴヌクレオチドは、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであることが好ましい。
【0032】
［２０］本発明に係る二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドからなる医薬は、上記［１９］に記載のオリゴヌクレオチドと、
上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズしている第二鎖オリゴヌクレオチドと、を含む二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬であって、
上記第二鎖オリゴヌクレオチドの塩基配列は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列である、二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬である。
上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズしている第二鎖オリゴヌクレオチドと、を含む二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬であって、
上記第二鎖オリゴヌクレオチドの塩基配列は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列である、二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬である。
【0033】
［２１］本発明に係るオリゴヌクレオチド複合体からなる医薬は、上記［１］～［１９］のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は上記［２０］に記載の二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬と、
上記オリゴヌクレオチド又は上記第二鎖オリゴヌクレオチドに、直接又はリンカー結合を介して結合している付加物質と、を有する、オリゴヌクレオチド複合体又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬であって、
上記付加物質は、ポリエチレングリコール、ペプチド、アルキル鎖、リガンド化合物、抗体、タンパク質、及び糖鎖からなる群より選ばれ、
上記リンカー結合は、それぞれ、独立してホスホジエステル結合、ホスホロチオアート結合、ホスホロジチオアート結合、ホスホアミダート結合、ボラノホスフェート結合、アルキルホスホナート結合、ホスホロジアミダート結合、ホスホロジアミドチオアート結合、又はホスホロジアミドジチオアート結合である、オリゴヌクレオチド複合体又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬である。
上記オリゴヌクレオチド又は上記第二鎖オリゴヌクレオチドに、直接又はリンカー結合を介して結合している付加物質と、を有する、オリゴヌクレオチド複合体又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬であって、
上記付加物質は、ポリエチレングリコール、ペプチド、アルキル鎖、リガンド化合物、抗体、タンパク質、及び糖鎖からなる群より選ばれ、
上記リンカー結合は、それぞれ、独立してホスホジエステル結合、ホスホロチオアート結合、ホスホロジチオアート結合、ホスホアミダート結合、ボラノホスフェート結合、アルキルホスホナート結合、ホスホロジアミダート結合、ホスホロジアミドチオアート結合、又はホスホロジアミドジチオアート結合である、オリゴヌクレオチド複合体又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬である。
【0034】
［２２］本発明に係る医薬品は、上記［１］～［１９］のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、上記［２０］に記載の二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は上記［２１］に記載のオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を有効成分として含む、医薬品である。
【0035】
［２３］本発明に係るヒトＷＲＮ遺伝子の第２７番目エクソンのスキッピング剤は、上記［１］～［１９］のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、上記［２０］に記載の二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は上記［２１］に記載のオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を有効成分として含む、ヒトＷＲＮ遺伝子の第２７番目エクソンのスキッピング剤である。
【0036】
［２４］本発明に係る機能的ＷＲＮ回復剤は、上記［１］～［１９］のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、上記［２０］に記載の二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は上記［２１］に記載のオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を有効成分として含む、ヒトＷＲＮ遺伝子の第２７番目のエクソンのスキッピングによる核移行シグナルを保有する機能的ＷＲＮ回復剤である。
【0037】
［２５］本発明に係るウェルナー症候群に対する治療剤は、上記［１］～［１９］のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、上記［２０］に記載の二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は上記［２１］に記載のオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を有効成分として含む、ウェルナー症候群に対する治療剤である。
【0038】
［２６］本発明に係るウェルナー症候群に対する予防剤は、上記［１］～［１９］のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、上記［２０］に記載の二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は上記［２１］に記載のオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を有効成分として含む、ウェルナー症候群に対する予防剤である。
【0039】
［２７］本発明に係るウェルナー症候群の治療方法又は予防方法は、上記［１］～［１９］のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、上記［２０］に記載の二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は上記［２１］に記載のオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を個体に投与することを含む、ウェルナー症候群の治療方法又は予防方法である。
【0040】
［２８］本発明は、ウェルナー症候群の治療又は予防に使用するための、上記［１］～［１９］のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、上記［２０］に記載の二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は上記［２１］に記載のオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を提供する。
【0041】
［２９］本発明は、ウェルナー症候群の治療剤又は予防剤を製造するために使用する、上記［１］～［１９］のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、上記［２０］に記載の二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は上記［２１］に記載のオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を提供する。
【発明の効果】
【0042】
本発明によれば、ヒトＷＲＮ遺伝子の第２７番エクソンのスキッピングを可能にするオリゴヌクレオチドからなる医薬、及びこれを含むヒトＷＲＮ遺伝子の第２７番エクソンを高効率にスキッピングさせる薬剤を提供することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【0043】
【発明を実施するための形態】
【0044】
以下、本発明の一実施形態（以下「本実施形態」と記すことがある。）について説明する。ただし、本実施形態はこれに限定されるものではない。本願明細書において「オリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬」とは、「オリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩を含有する医薬」と同義である。「オリゴヌクレオチド複合体又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬」とは、「オリゴヌクレオチド複合体又はその製薬学的に許容される塩を含有する医薬」と同義である。同様に、「○○に記載のオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬」とは、「○○に記載のオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩を含有する医薬」と同義である。「○○に記載のオリゴヌクレオチド複合体又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬」とは、「○○に記載のオリゴヌクレオチド複合体又はその製薬学的に許容される塩を含有する医薬」と同義である。同様に、「～からなる医薬」は、「～を含有する医薬」と書き換えることもできる。
【0045】
≪ヒトＷＲＮ遺伝子の第２７番エクソンをスキッピングさせるオリゴヌクレオチド≫
本実施形態のオリゴヌクレオチドは、
ヒトＷＲＮ遺伝子の第２６番又は第２８番エクソンのスキップ変異に対して、機能的なヒトＷＲＮタンパク質を発現するオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩であって、
上記オリゴヌクレオチドは、各ヌクレオチドがリン酸基及び／又は修飾リン酸基で結合されており、
上記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の修飾糖を有する修飾核酸、を含み、
上記オリゴヌクレオチドの塩基長は、１０～３０ｍｅｒであり、
上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６に記載の塩基配列における、上記オリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも１つの標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、
上記標的領域において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して、相補的な塩基配列、又は、
上記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列、である、オリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩、である。また、本実施形態は、上記オリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬を提供する。上記オリゴヌクレオチドは、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであることが好ましい。本実施形態において、用語「修飾糖を有する修飾核酸」には、後述するモルフォリノ核酸が含まれるものとする。
本実施形態のオリゴヌクレオチドは、
ヒトＷＲＮ遺伝子の第２６番又は第２８番エクソンのスキップ変異に対して、機能的なヒトＷＲＮタンパク質を発現するオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩であって、
上記オリゴヌクレオチドは、各ヌクレオチドがリン酸基及び／又は修飾リン酸基で結合されており、
上記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の修飾糖を有する修飾核酸、を含み、
上記オリゴヌクレオチドの塩基長は、１０～３０ｍｅｒであり、
上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６に記載の塩基配列における、上記オリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも１つの標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、
上記標的領域において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して、相補的な塩基配列、又は、
上記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列、である、オリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩、である。また、本実施形態は、上記オリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬を提供する。上記オリゴヌクレオチドは、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであることが好ましい。本実施形態において、用語「修飾糖を有する修飾核酸」には、後述するモルフォリノ核酸が含まれるものとする。
【0046】
上記構成を備えるオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩は、ヒトＷＲＮ遺伝子の第２７番エクソンのスキッピングを可能にする。本実施形態の一側面において、上記オリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩は、「ヒトＷＲＮ遺伝子の第２７番エクソンをスキッピングするオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩」と把握することもできる。本発明は、ヒトＷＲＮ遺伝子の第２６番エクソンのスキップ変異ｃ.３１３９－１Ｇ＞Ｃにより生じたスプライシング異常に起因する、アミノ酸読み枠のずれたｍＲＮＡ前駆体に対して、第２７番エクソンのスキッピングを誘導して読み枠のずれを解消することで、難治性皮膚潰瘍をはじめとするウェルナー症候群の症状を改善することができる。また、第２６番エクソンのスキップ変異ｃ.３１３９－１Ｇ＞Ｃ以外として、例えば、第２６番エクソンのスキップ変異ｃ.３２３３＋１Ｇ＞Ｔ、第２６番エクソンのスキップ変異ｃ.３２３３＋１Ｇ＞Ｃ、及び第２８番エクソンのスキップ変異ｃ.ＩＶＳ２８＋２Ｔ＞Ｃを持つウェルナー症候群患者の治療にも応用可能である。以下詳細に説明する。なお、本実施形態に係るオリゴヌクレオチドを便宜上「アンチセンスオリゴヌクレオチド」、「一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド」等で表現している場合があるが、これらに限定することを意図するものではない。
【0047】
＜用語の定義等＞
まず、本明細書において用いられる用語の定義等について以下に説明する。
まず、本明細書において用いられる用語の定義等について以下に説明する。
【0048】
（ＷＲＮ遺伝子）
本実施形態において「ＷＲＮ遺伝子」は、Ｎａｔｕｒｅ（１９９２）３５５：７３５－７３８（非特許文献２）、Ａｍ. Ｊ. Ｈｕｍ. Ｇｅｎｅｔ．（１９９７）６０：３３０－３４１（非特許文献３）により定義することができる。
本実施形態において「ＷＲＮ遺伝子」は、Ｎａｔｕｒｅ（１９９２）３５５：７３５－７３８（非特許文献２）、Ａｍ. Ｊ. Ｈｕｍ. Ｇｅｎｅｔ．（１９９７）６０：３３０－３４１（非特許文献３）により定義することができる。
【0049】
（一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド）
本実施形態において「一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド」又は「アンチセンスオリゴヌクレオチド」（以下、「ＡＳＯ」と称することがある。）とは、標的遺伝子のｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体、又はｎｃＲＮＡ(ノンコ－ディングＲＮＡ)（以下、これら三者をまとめて「標的ＲＮＡ」と称することがある。）に対して相補的なオリゴヌクレオチド又はその薬理学上許容される塩を意味する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はそれらの類似体から構成される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的とするｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体、又はｎｃＲＮＡと二本鎖を形成することにより、標的とするｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体又はｎｃＲＮＡの働きを抑制する。アンチセンスオリゴヌクレオチドには、標的となるｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体、又はｎｃＲＮＡの塩基配列に対して、完全に相補的な塩基配列を有するもの、当該相補的な塩基配列において１個又は数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を有するもの、及びゆらぎ塩基対を形成する塩基をその塩基配列中に含むものが含まれる。
また、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、後述する「糖部が修飾糖である修飾核酸」（糖修飾されている修飾ヌクレオチド）以外の、当該分野で公知の修飾ヌクレオチドを更に含んでいてもよい。当該分野で公知の修飾ヌクレオチドとしては、糖修飾されている修飾ヌクレオチドに加えて、例えば、後述するリン酸基修飾されている修飾ヌクレオチド、核酸塩基修飾されている修飾ヌクレオチド等が挙げられる。
なお、本実施形態におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、その両末端の構造は特に制限されず、例えば、－ＯＨであってもよいし、－ＯＲ（ただし、Ｒはアルキル鎖、リン酸エステル体、又は後述する付加物質を示す。）であってもよい。
また、本実施形態における一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖の形態であってもよいし、後述する第二鎖オリゴヌクレオチドとハイブリダイズして二本鎖の形態をとってもよい。上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズしている第二鎖オリゴヌクレオチドとからなる二本鎖オリゴヌクレオチドを、「二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド」と称することがある。
本実施形態において「一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド」又は「アンチセンスオリゴヌクレオチド」（以下、「ＡＳＯ」と称することがある。）とは、標的遺伝子のｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体、又はｎｃＲＮＡ(ノンコ－ディングＲＮＡ)（以下、これら三者をまとめて「標的ＲＮＡ」と称することがある。）に対して相補的なオリゴヌクレオチド又はその薬理学上許容される塩を意味する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はそれらの類似体から構成される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的とするｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体、又はｎｃＲＮＡと二本鎖を形成することにより、標的とするｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体又はｎｃＲＮＡの働きを抑制する。アンチセンスオリゴヌクレオチドには、標的となるｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体、又はｎｃＲＮＡの塩基配列に対して、完全に相補的な塩基配列を有するもの、当該相補的な塩基配列において１個又は数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を有するもの、及びゆらぎ塩基対を形成する塩基をその塩基配列中に含むものが含まれる。
また、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、後述する「糖部が修飾糖である修飾核酸」（糖修飾されている修飾ヌクレオチド）以外の、当該分野で公知の修飾ヌクレオチドを更に含んでいてもよい。当該分野で公知の修飾ヌクレオチドとしては、糖修飾されている修飾ヌクレオチドに加えて、例えば、後述するリン酸基修飾されている修飾ヌクレオチド、核酸塩基修飾されている修飾ヌクレオチド等が挙げられる。
なお、本実施形態におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、その両末端の構造は特に制限されず、例えば、－ＯＨであってもよいし、－ＯＲ（ただし、Ｒはアルキル鎖、リン酸エステル体、又は後述する付加物質を示す。）であってもよい。
また、本実施形態における一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖の形態であってもよいし、後述する第二鎖オリゴヌクレオチドとハイブリダイズして二本鎖の形態をとってもよい。上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズしている第二鎖オリゴヌクレオチドとからなる二本鎖オリゴヌクレオチドを、「二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド」と称することがある。
【0050】
（オリゴヌクレオチド）
本実施形態において「オリゴヌクレオチド」とは、同一又は異なるヌクレオチドが、リン酸ジエステル結合又はその他の結合で２～３０個連結されたヌクレオチドのポリマーを意味する。上記オリゴヌクレオチドは、以下の構造式で示すように核酸塩基部、リン酸部、及び、糖部又はモルフォリノ環部から構成されていると把握することもできる。
本実施形態において「オリゴヌクレオチド」とは、同一又は異なるヌクレオチドが、リン酸ジエステル結合又はその他の結合で２～３０個連結されたヌクレオチドのポリマーを意味する。上記オリゴヌクレオチドは、以下の構造式で示すように核酸塩基部、リン酸部、及び、糖部又はモルフォリノ環部から構成されていると把握することもできる。
【0051】
【化4】
【0052】
【化5】
【0053】
上記オリゴヌクレオチドは、天然型のオリゴヌクレオチドと非天然型のオリゴヌクレオチドとに大別される。「天然のオリゴヌクレオチド」とは天然に存在しているヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを意味する。「非天然のオリゴヌクレオチド」とは、後述する修飾ヌクレオチドを構成単位として少なくとも１つ含むオリゴヌクレオチドを意味する。「非天然型のオリゴヌクレオチド」としては、好ましくは、糖部が修飾された修飾糖誘導体；リン酸ジエステル結合の非架橋酸素原子が硫黄原子で１つ置き換えられたホスホロチオエート誘導体；リン酸ジエステル結合の非架橋酸素原子が硫黄原子で２つ置き換えられたホスホロジチオエート誘導体；リン酸ジエステル結合がトリエステル化されたエステル誘導体；リン酸ジエステル結合がアミド化されたホスホアミド誘導体；リン酸ジエステル結合がボロン酸エステル化されたボラノホスフェート誘導体；リン酸ジエステル結合の非架橋酸素原子がアルキル基に置換されたアルキルホスホネート（例えば、メチルホスホネート、メトキシプロピルホスホネート等）誘導体；リン酸ジエステル結合がアミド結合に置換されたアミド誘導体：核酸塩基が修飾された修飾塩基誘導体が挙げられる。更に好ましくは、上記非天然のオリゴヌクレオチドは、糖部が修飾された架橋型修飾糖誘導体；リン酸ジエステル結合の非架橋酸素原子が硫黄原子で１つ置き換えられたホスホロチオエート誘導体；リン酸ジエステル結合がエステル化されたエステル誘導体；及び、糖部が後述する修飾糖（例えば、架橋型糖）で修飾され、かつリン酸ジエステル結合の非架橋酸素原子が硫黄原子で１つ置き換えられているか、又はリン酸ジエステル結合の非架橋酸素原子がアルキル基に置換されたアルキルホスホネート化されている誘導体等が挙げられる。
【0054】
（ヌクレオシド）
本実施形態において「ヌクレオシド」とは、プリン塩基又はピリミジン塩基と糖とが結合した化合物を意味する。天然に存在しているヌクレオシドを「天然ヌクレオシド」という場合がある。天然に存在していない修飾されたヌクレオシドを「修飾ヌクレオシド」という場合がある。特に糖部分が修飾された修飾ヌクレオシドを「修飾糖ヌクレオシド」という場合がある。
本実施形態において「ヌクレオシド」とは、プリン塩基又はピリミジン塩基と糖とが結合した化合物を意味する。天然に存在しているヌクレオシドを「天然ヌクレオシド」という場合がある。天然に存在していない修飾されたヌクレオシドを「修飾ヌクレオシド」という場合がある。特に糖部分が修飾された修飾ヌクレオシドを「修飾糖ヌクレオシド」という場合がある。
【0055】
（ヌクレオチド）
本実施形態において「ヌクレオチド」とは、上記ヌクレオシドの糖にリン酸基が結合した化合物を意味する。天然に存在しているヌクレオチドを「天然ヌクレオチド」という場合がある。天然に存在していない修飾されたヌクレオチドを「修飾ヌクレオチド」又は「修飾核酸」という場合がある。「修飾ヌクレオチド」又は「修飾核酸」としては、上記修飾ヌクレオシドの糖部にリン酸基が結合した化合物、及び、天然ヌクレオシドの糖部に後述する修飾リン酸基が結合した化合物等が挙げられる。
本実施形態において「ヌクレオチド」とは、上記ヌクレオシドの糖にリン酸基が結合した化合物を意味する。天然に存在しているヌクレオチドを「天然ヌクレオチド」という場合がある。天然に存在していない修飾されたヌクレオチドを「修飾ヌクレオチド」又は「修飾核酸」という場合がある。「修飾ヌクレオチド」又は「修飾核酸」としては、上記修飾ヌクレオシドの糖部にリン酸基が結合した化合物、及び、天然ヌクレオシドの糖部に後述する修飾リン酸基が結合した化合物等が挙げられる。
【0056】
（糖修飾、修飾糖）
本実施形態において「糖修飾」とは、上記ヌクレオチドの糖部が修飾されていることを意味する。修飾された糖部を特に「修飾糖」という場合がある。糖修飾が施されている修飾ヌクレオチドは修飾核酸として利用可能であり、例えば、２’－Ｏ－アルキル化核酸、２’－Ｆ化核酸、５’－メチル化核酸、２’，４’－ＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ、以下「ＬＮＡ」と称することがある。）、ＡｍＮＡ（アミド架橋型人工核酸、Ａｍｉｄｏ－ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＧｕＮＡ（グアニジン架橋型人工核酸、Ｇｕａｎｉｄｉｎｏ－ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ｓｃｐＢＮＡ（２’－Ｏ，４’－Ｃ－Ｓｐｉｒｏｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’－Ｏ，４’－Ｃ－Ｅｔｈｙｌｅｎｅ－Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、Ｓ－ｃＥｔ（２’，４’－ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ Ｅｔｈｙｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等が挙げられる。
２’－Ｏ－アルキル化核酸としては、例えば、後述する記号「Ａ（Ｍ）」、「Ａ（ｍ）」、「Ｃ（Ｍ）」、「５（ｍ）」、「Ｇ（Ｍ）」、「Ｇ（ｍ）」、「Ｕ（Ｍ）」、「Ｔ（ｍ）」で示される構造を含むものが挙げられる。ＬＮＡとしては、例えば、後述する記号「Ａ（Ｌ）」、「５（Ｌ）」、「Ｇ（Ｌ）」、「Ｔ（Ｌ）」で示される構造を含むものが挙げられる。ＡｍＮＡとしては、例えば、後述する記号「Ａ（Ｙ）」、「５（Ｙ）」、「Ｇ（Ｙ）」、「Ｔ（Ｙ）」で示される構造を含むものが挙げられる。ＧｕＮＡとしては、例えば、後述する記号「Ａ（Ｇｘ）」、「５（Ｇｘ）」、「Ｇ（Ｇｘ）」、「Ｔ（Ｇｘ）」で示される構造を含むものが挙げられる。ｓｃｐＢＮＡとしては、例えば、後述する記号「Ａ（Ｓ）」、「５（Ｓ）」、「Ｇ（Ｓ）」、「Ｔ（Ｓ）」で示される構造を含むものが挙げられる。
本実施形態において「糖修飾」とは、上記ヌクレオチドの糖部が修飾されていることを意味する。修飾された糖部を特に「修飾糖」という場合がある。糖修飾が施されている修飾ヌクレオチドは修飾核酸として利用可能であり、例えば、２’－Ｏ－アルキル化核酸、２’－Ｆ化核酸、５’－メチル化核酸、２’，４’－ＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ、以下「ＬＮＡ」と称することがある。）、ＡｍＮＡ（アミド架橋型人工核酸、Ａｍｉｄｏ－ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＧｕＮＡ（グアニジン架橋型人工核酸、Ｇｕａｎｉｄｉｎｏ－ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ｓｃｐＢＮＡ（２’－Ｏ，４’－Ｃ－Ｓｐｉｒｏｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’－Ｏ，４’－Ｃ－Ｅｔｈｙｌｅｎｅ－Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、Ｓ－ｃＥｔ（２’，４’－ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ Ｅｔｈｙｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等が挙げられる。
２’－Ｏ－アルキル化核酸としては、例えば、後述する記号「Ａ（Ｍ）」、「Ａ（ｍ）」、「Ｃ（Ｍ）」、「５（ｍ）」、「Ｇ（Ｍ）」、「Ｇ（ｍ）」、「Ｕ（Ｍ）」、「Ｔ（ｍ）」で示される構造を含むものが挙げられる。ＬＮＡとしては、例えば、後述する記号「Ａ（Ｌ）」、「５（Ｌ）」、「Ｇ（Ｌ）」、「Ｔ（Ｌ）」で示される構造を含むものが挙げられる。ＡｍＮＡとしては、例えば、後述する記号「Ａ（Ｙ）」、「５（Ｙ）」、「Ｇ（Ｙ）」、「Ｔ（Ｙ）」で示される構造を含むものが挙げられる。ＧｕＮＡとしては、例えば、後述する記号「Ａ（Ｇｘ）」、「５（Ｇｘ）」、「Ｇ（Ｇｘ）」、「Ｔ（Ｇｘ）」で示される構造を含むものが挙げられる。ｓｃｐＢＮＡとしては、例えば、後述する記号「Ａ（Ｓ）」、「５（Ｓ）」、「Ｇ（Ｓ）」、「Ｔ（Ｓ）」で示される構造を含むものが挙げられる。
【0057】
本実施形態の一側面において上記オリゴヌクレオチドを構成する糖の修飾が下記の式（Ａ１）で表される基であることが好ましい。本実施形態の他の側面において、上記オリゴヌクレオチドを構成する修飾糖が下記の式（Ａ１）で表される、と把握することもできる。
【0058】
【化6】
【0059】
上記式中、Ｂｘは核酸塩基であり、それぞれ、独立して、アデニン、グアニン、シトシン、５－メチルシトシン、チミン又はウラシルで表される基であり、Ｘはリン酸結合であり、それぞれ、独立して、ホスホジエステル結合、ホスホロチオアート結合、ホスホロジチオアート結合、ホスホアミダート結合、ボラノホスフェート結合又はアルキルホスホナート結合であり、Ｙは、それぞれ、独立して、水素原子、水酸基、フッ素原子、置換されていてもよい炭素数１～６のアルコキシ基、又は置換されていてもよいアミノ基であり、Ｚは、それぞれ、独立して、水素原子であるか、炭素－酸素二重結合若しくは環状構造を有していてもよい炭素数１～５のアルキル基であるか、又は、上記アルキル基の一部の炭素原子とＹとが一緒になって環を形成する。ここで、「炭素数１～５のアルキル基」は、炭素数１～５のアルキレン基の一部の炭素原子と水素原子とが一緒になって形成される一価の基と把握することもできる。
【0060】
「置換されていてもよい炭素数１～６のアルコキシ基」としては、例えば、置換されていない炭素数１～６のアルコキシ基、並びに、水酸基、フッ素原子、炭素数１～６の直鎖状又は分枝状アルコキシ基、炭素数３～８の環状アルコキシ基、カルバモイル基、及び炭素数１～８のアルキルアミド基（－（ＣＯ）－ＮＲ７Ｒ８で表される基）からなる群より選ばれる置換基で置換されている炭素数１～６のアルコキシ基が挙げられる。ここで、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ、独立して、水素原子、又は炭素数１～８の直鎖状若しくは分枝状アルキル基を示す。
【0061】
「置換されていてもよいアミノ基」としては、例えば、置換されていないアミノ基、並びに、炭素数１～６の直鎖状又は分枝状アルキル基（当該アルキル基は、炭素数１～６の直鎖若しくは分枝状アルコキシ基、又は－（ＣＯ）－ＮＲ９Ｒ１０で表される基で置換されていてもよい）、炭素数３～８の環状アルキル基、炭素数１～６のアシル基、及び炭素数１～６の直鎖状又は分枝状アルキル基で１～３箇所置換されているアミジン基からなる群より選ばれる置換基で置換されているアミノ基が挙げられる。ここで、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ、独立して、水素原子、又は炭素数１～６の直鎖状若しくは分枝状アルキル基を示す。
【0062】
「炭素－酸素二重結合若しくは環状構造を有していてもよい炭素数１～５のアルキル基」としては、例えば、置換されていない炭素数１～５のアルキル基、炭素－酸素二重結合を有している炭素数１～５のアルキル基、及び炭素数３～５のシクロアルキル基（シクロプロピル基等）が挙げられる。ここで、「炭素－酸素二重結合を有している炭素数１～５のアルキル基」における炭素数は、炭素－酸素二重結合を構成している炭素が含まれていてもよい。そのため、本実施形態において「炭素－酸素二重結合を有している炭素数１～５のアルキル基」には、アルデヒド基が含まれうる。Ｚがアルデヒド基であり、Ｙが置換されていてもよいアミノ基である場合、ＹとＺとで一緒に形成される環は、アミド結合を含む構造であってもよい。
【0063】
本実施形態の一側面において、上記オリゴヌクレオチドを構成する糖の修飾が下記の式（Ａ２）又は式（Ａ３）で表される基であることが好ましい。本実施形態の他の側面において、上記オリゴヌクレオチドを構成する修飾糖が下記の式（Ａ２）又は式（Ａ３）で表される、と把握することもできる。
【0064】
【化7】
【0065】
式中、Ｂｘは核酸塩基であり、それぞれ、独立して、アデニン、グアニン、シトシン、５－メチルシトシン、チミン又はウラシルで表される基であり、Ｘはリン酸結合であり、それぞれ、独立して、ホスホジエステル結合、ホスホロチオアート結合、ホスホロジチオアート結合、ホスホアミダート結合、ボラノホスフェート結合又はアルキルホスホナート結合であり、Ｒ４は、それぞれ、独立して、水素原子、置換されていてもよい炭素数１～６のアルキル基であり、Ｙ’は、酸素原子又は置換されていてもよい窒素原子であり、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ、独立して、水素原子、置換されていてもよい炭素数１～６のアルキル基、又は、Ｒ５及びＲ６が一緒になってカルボニル基又は環を形成しており、ｎは、０又は１である。
【0066】
本実施形態の他の側面において、上記オリゴヌクレオチドを構成する糖の修飾が上記式（Ａ２）で表される基であり、上記Ｒ４は、それぞれ、独立して、メチル基、メトキシエチル基、又はＮ－メチルプロパンアミド基（－ＣＨ２ＣＨ２－ＣＯＮＨ－ＣＨ３、メチルイミノカルボニルエチル基）であることが好ましい。
【0067】
本実施形態の他の側面において、上記オリゴヌクレオチドを構成する糖の修飾が上記式（Ａ３）で表される基であり、上記Ｙ’は、酸素原子、又は水素原子、メチル基、メトキシエチル基、若しくはＮ－メチルプロパンアミド基で置換されていてもよい窒素原子であり、上記Ｒ５及びＲ６は、それぞれ、独立して、水素原子、炭素数１～２のアルキル基、又は上記Ｒ５及びＲ６が一緒になってカルボニル基又は炭素数３～６の環を形成しており、ｎは、０又は１であることが好ましい。
【0068】
（糖修飾以外の当該分野で公知のヌクレオチドの修飾）
上記糖修飾以外の当該分野で公知のヌクレオチドの修飾は、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを製造するための修飾核酸として利用可能である。ヌクレオチドの修飾としては、後述するリン酸基修飾、核酸塩基修飾が知られている。このようなヌクレオチドの修飾は、例えば、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２０１６）５９：９６４５－９６６７．（非特許文献５）等に記載されているヌクレオチドの修飾が挙げられる。これらのヌクレオチドの修飾は、上記文献で引用されている文献において述べられている当該分野で公知の方法に基づいて行うことができる。
上記糖修飾以外の当該分野で公知のヌクレオチドの修飾は、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを製造するための修飾核酸として利用可能である。ヌクレオチドの修飾としては、後述するリン酸基修飾、核酸塩基修飾が知られている。このようなヌクレオチドの修飾は、例えば、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２０１６）５９：９６４５－９６６７．（非特許文献５）等に記載されているヌクレオチドの修飾が挙げられる。これらのヌクレオチドの修飾は、上記文献で引用されている文献において述べられている当該分野で公知の方法に基づいて行うことができる。
【0069】
（リン酸基）
本実施形態において「リン酸基」とは、上記ヌクレオチドのリン酸部の結合様式が天然に存在するホスホジエステル結合（後述する記号「－」で示される結合）であるものを意味する。
本実施形態において「リン酸基」とは、上記ヌクレオチドのリン酸部の結合様式が天然に存在するホスホジエステル結合（後述する記号「－」で示される結合）であるものを意味する。
【0070】
（リン酸基修飾、修飾リン酸基）
本実施形態において「リン酸基修飾」とは、上記ヌクレオチドのリン酸部が修飾されていることを意味する。修飾されたリン酸部を特に「修飾リン酸基」という場合がある。上記修飾リン酸基を含む結合様式としては、例えば、ホスホロチオアート結合（後述する記号「∧」で示される結合）、ホスホロジチオアート結合、ホスホアミダート結合、又はボラノホスフェート結合、アルキルホスホナート結合、ホスホロジアミダート結合（後述する記号「＊」で示される結合）、ホスホロジアミドチオアート結合、及びホスホロジアミドジチオアート結合等が挙げられる。
本実施形態において「リン酸基修飾」とは、上記ヌクレオチドのリン酸部が修飾されていることを意味する。修飾されたリン酸部を特に「修飾リン酸基」という場合がある。上記修飾リン酸基を含む結合様式としては、例えば、ホスホロチオアート結合（後述する記号「∧」で示される結合）、ホスホロジチオアート結合、ホスホアミダート結合、又はボラノホスフェート結合、アルキルホスホナート結合、ホスホロジアミダート結合（後述する記号「＊」で示される結合）、ホスホロジアミドチオアート結合、及びホスホロジアミドジチオアート結合等が挙げられる。
【0071】
（核酸塩基修飾、修飾核酸塩基）
本実施形態において「核酸塩基修飾」とは、上記ヌクレオチドの核酸塩基部が修飾されていることを意味する。修飾された核酸塩基部を特に「修飾核酸塩基」という場合がある。修飾核酸塩基としては、例えば、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－プロピニルシトシン等が挙げられる。
本実施形態において「核酸塩基修飾」とは、上記ヌクレオチドの核酸塩基部が修飾されていることを意味する。修飾された核酸塩基部を特に「修飾核酸塩基」という場合がある。修飾核酸塩基としては、例えば、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－プロピニルシトシン等が挙げられる。
【0072】
（ＤＮＡ又はＲＮＡの類似体）
上記ＤＮＡ又はＲＮＡの類似体とは、ＤＮＡ又はＲＮＡに類似の構造を持つ分子を意味する。例えば、ペプチド核酸(ｐＮＡ)、モルフォリノ核酸等が挙げられる。
なお、本発明で用いる核酸は、核酸糖部の修飾に限られず、モルフォリノ核酸やペプチド核酸を用いてもよい。
すなわち、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの別の一態様としては、下記＜一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列＞の欄に記載される配列において、オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡの類似体で構成されてもよい。このＤＮＡ又はＲＮＡの類似体は、ペプチド核酸やモルフォリノ核酸を少なくとも含む。ペプチド核酸やモルフォリノ核酸を含む本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの合成は一般的な定法に従って行う。モルフォリノオリゴ核酸は、例えば、国際公開第１９９１／００９０３３号（特許文献４）、国際公開第２００９／０６４４７１号（特許文献５）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ（２０１６）１３８：１５６６３－１５６７２（非特許文献８）に従って製造することができる。モルフォリノ核酸としては、例えば、後述する記号「Ａ（Ｎ）」、「Ｃ（Ｎ）」、「Ｇ（Ｎ）」、「Ｔ（Ｎ）」で示される構造を含むものが挙げられる。
上記ＤＮＡ又はＲＮＡの類似体とは、ＤＮＡ又はＲＮＡに類似の構造を持つ分子を意味する。例えば、ペプチド核酸(ｐＮＡ)、モルフォリノ核酸等が挙げられる。
なお、本発明で用いる核酸は、核酸糖部の修飾に限られず、モルフォリノ核酸やペプチド核酸を用いてもよい。
すなわち、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの別の一態様としては、下記＜一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列＞の欄に記載される配列において、オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡの類似体で構成されてもよい。このＤＮＡ又はＲＮＡの類似体は、ペプチド核酸やモルフォリノ核酸を少なくとも含む。ペプチド核酸やモルフォリノ核酸を含む本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの合成は一般的な定法に従って行う。モルフォリノオリゴ核酸は、例えば、国際公開第１９９１／００９０３３号（特許文献４）、国際公開第２００９／０６４４７１号（特許文献５）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ（２０１６）１３８：１５６６３－１５６７２（非特許文献８）に従って製造することができる。モルフォリノ核酸としては、例えば、後述する記号「Ａ（Ｎ）」、「Ｃ（Ｎ）」、「Ｇ（Ｎ）」、「Ｔ（Ｎ）」で示される構造を含むものが挙げられる。
【0073】
本実施形態の一側面において、上記オリゴヌクレオチドは、下記の式（Ａ４）で表されるモルフォリノ核酸で構成されるモルフォリノオリゴ核酸であることが好ましい。
【0074】
【化8】
【0075】
式中、Ｂｘは核酸塩基であり、それぞれ、独立して、アデニン、グアニン、シトシン、５－メチルシトシン、チミン又はウラシルで表される基であり、Ｘ’はリン酸結合であり、それぞれ、独立して、ホスホロジアミダート結合、ホスホロジアミドチオアート結合、又はホスホロジアミドジチオアート結合である。
【0076】
（ｎｃＲＮＡ）
本実施形態において「ｎｃＲＮＡ」とは、タンパク質の翻訳には関わらないＲＮＡの総称を意味する。上記ｎｃＲＮＡとしては、例えば、リボソ－ムＲＮＡ、転移ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、Ｎａｔｕｒａｌ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ（ＮＡＴ）等が挙げられる。
本実施形態において「ｎｃＲＮＡ」とは、タンパク質の翻訳には関わらないＲＮＡの総称を意味する。上記ｎｃＲＮＡとしては、例えば、リボソ－ムＲＮＡ、転移ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、Ｎａｔｕｒａｌ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ（ＮＡＴ）等が挙げられる。
【0077】
（オリゴヌクレオチドの核酸塩基部）
上記オリゴヌクレオチドの核酸塩基部としては、チミニル基、シトシニル基、アデニニル基、グアニニル基、５－メチルシトシニル基、ウラシリル基、２－オキソ－４－ヒドロキシ－５－メチル－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－アミノ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、４－アミノ－５－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、及び２－オキソ－４－ヒドロキシ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基等が挙げられる。好ましくは、上記核酸塩基部としては、チミニル基、シトシニル基、アデニニル基、グアニニル基、５－メチルシトシニル基、及びウラシリル基等が挙げられる。当該核酸塩基のうち、ウラシル（Ｕ）とチミン（Ｔ）は、互換性がある。ウラシル（Ｕ）とチミン（Ｔ）のどちらも、相補鎖のアデニン（Ａ）との塩基対を形成することができる。また、アンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基部においても同様である。
上記オリゴヌクレオチドの核酸塩基部としては、チミニル基、シトシニル基、アデニニル基、グアニニル基、５－メチルシトシニル基、ウラシリル基、２－オキソ－４－ヒドロキシ－５－メチル－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－アミノ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、４－アミノ－５－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、及び２－オキソ－４－ヒドロキシ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基等が挙げられる。好ましくは、上記核酸塩基部としては、チミニル基、シトシニル基、アデニニル基、グアニニル基、５－メチルシトシニル基、及びウラシリル基等が挙げられる。当該核酸塩基のうち、ウラシル（Ｕ）とチミン（Ｔ）は、互換性がある。ウラシル（Ｕ）とチミン（Ｔ）のどちらも、相補鎖のアデニン（Ａ）との塩基対を形成することができる。また、アンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基部においても同様である。
【0078】
（標的ＲＮＡ）
本実施形態において「標的ＲＮＡ」とは、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが結合するＲＮＡを指す。言い換えると、本実施形態において標的ＲＮＡとは、ＷＲＮ遺伝子のｍＲＮＡ前駆体を意味する。上記標的ＲＮＡとしては、例えば、配列番号２に記載の塩基配列を有するヒトＷＲＮ遺伝子のｍＲＮＡ前駆体、配列番号３～５のいずれかに記載の塩基配列を有するヒトＷＲＮ遺伝子のエクソン２６スキップ変異を有するｍＲＮＡ前駆体、配列番号６に記載の塩基配列を有するヒトＷＲＮ遺伝子のエクソン２８スキップ変異を有するｍＲＮＡ前駆体が挙げられる。
本実施形態において「標的ＲＮＡ」とは、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが結合するＲＮＡを指す。言い換えると、本実施形態において標的ＲＮＡとは、ＷＲＮ遺伝子のｍＲＮＡ前駆体を意味する。上記標的ＲＮＡとしては、例えば、配列番号２に記載の塩基配列を有するヒトＷＲＮ遺伝子のｍＲＮＡ前駆体、配列番号３～５のいずれかに記載の塩基配列を有するヒトＷＲＮ遺伝子のエクソン２６スキップ変異を有するｍＲＮＡ前駆体、配列番号６に記載の塩基配列を有するヒトＷＲＮ遺伝子のエクソン２８スキップ変異を有するｍＲＮＡ前駆体が挙げられる。
【0079】
（標的ＲＮＡとの結合）
本実施形態において「標的ＲＮＡとの結合」とは、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基が、標的ＲＮＡとの相補性によって、当該標的ＲＮＡの核酸塩基と共に二本鎖核酸を形成することを意味する。上記二本鎖核酸は、上記標的ＲＮＡの少なくとも一部において形成されていればよい。なお、上記標的ＲＮＡとの結合の強さは、例えば、熱安定性の指標により測定することができる。上記熱安定性の指標としては、例えば、上記二本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ値）等が挙げられる。上記Ｔｍ値としては、好ましくは４０～９０℃であり、より好ましくは５０～７０℃である。
本実施形態において「標的ＲＮＡとの結合」とは、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基が、標的ＲＮＡとの相補性によって、当該標的ＲＮＡの核酸塩基と共に二本鎖核酸を形成することを意味する。上記二本鎖核酸は、上記標的ＲＮＡの少なくとも一部において形成されていればよい。なお、上記標的ＲＮＡとの結合の強さは、例えば、熱安定性の指標により測定することができる。上記熱安定性の指標としては、例えば、上記二本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ値）等が挙げられる。上記Ｔｍ値としては、好ましくは４０～９０℃であり、より好ましくは５０～７０℃である。
【0080】
（標的領域）
上記標的領域とは、ＷＲＮ遺伝子のｍＲＮＡ前駆体における、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと結合する領域を意味する。上記標的領域には、示された塩基配列からなる標的領域、及びＷＲＮのｍＲＮＡ前駆体上の領域を含む。
上記標的領域とは、ＷＲＮ遺伝子のｍＲＮＡ前駆体における、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと結合する領域を意味する。上記標的領域には、示された塩基配列からなる標的領域、及びＷＲＮのｍＲＮＡ前駆体上の領域を含む。
【0081】
（ｍＲＮＡ前駆体）
上記ｍＲＮＡ前駆体とは、ＤＮＡから転写されたＲＮＡの一次転写物を意味する。すなわち、上記ｍＲＮＡ前駆体は、エクソン領域、イントロン領域及び非翻訳領域（Ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ：ＵＴＲ）を含むＲＮＡである。上記ｍＲＮＡ前駆体は、転写後スプライシングが行われる前のＲＮＡと把握することもできる。上記ｍＲＮＡ前駆体がスプライシングされるとｍＲＮＡとなる。
上記ｍＲＮＡ前駆体とは、ＤＮＡから転写されたＲＮＡの一次転写物を意味する。すなわち、上記ｍＲＮＡ前駆体は、エクソン領域、イントロン領域及び非翻訳領域（Ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ：ＵＴＲ）を含むＲＮＡである。上記ｍＲＮＡ前駆体は、転写後スプライシングが行われる前のＲＮＡと把握することもできる。上記ｍＲＮＡ前駆体がスプライシングされるとｍＲＮＡとなる。
【0082】
（標的領域との結合）
上記標的領域との結合とは、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的領域と二本鎖を形成することを意味する。ただし、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、必ずしも標的領域全体と二本鎖を形成する必要はなく、標的領域の一部の領域と二本鎖形成するものであればよい。すなわち、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的領域と完全な相補性を有しているものであることが好ましいが、ＷＲＮの標的領域と結合する限りにおいて、標的領域の少なくとも一部の領域と相補的であればよい。
上記標的領域との結合とは、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的領域と二本鎖を形成することを意味する。ただし、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、必ずしも標的領域全体と二本鎖を形成する必要はなく、標的領域の一部の領域と二本鎖形成するものであればよい。すなわち、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的領域と完全な相補性を有しているものであることが好ましいが、ＷＲＮの標的領域と結合する限りにおいて、標的領域の少なくとも一部の領域と相補的であればよい。
【0083】
（標的領域の一部）
上記標的領域の一部とは、標的領域のうち１０～１５ヌクレオチド塩基長の領域を意味する。
上記標的領域の一部とは、標的領域のうち１０～１５ヌクレオチド塩基長の領域を意味する。
【0084】
（標的領域の少なくとも一部と相補的）
上記標的領域の少なくとも一部と相補的とは、標的ＲＮＡ上の標的領域の少なくとも一部の領域の塩基と相補的であることを意味する。ここにおいて、少なくとも一部の領域に対応するｍＲＮＡ前駆体上の領域の塩基と相補的であることも含む。
上記標的領域の少なくとも一部と相補的とは、標的ＲＮＡ上の標的領域の少なくとも一部の領域の塩基と相補的であることを意味する。ここにおいて、少なくとも一部の領域に対応するｍＲＮＡ前駆体上の領域の塩基と相補的であることも含む。
【0085】
本発明者らは、スプライシング制御型アンチセンスオリゴヌクレオチドに着目し、ヒトＷＲＮ遺伝子のエクソン２７のスキッピングを誘導するアンチセンスオリゴヌクレオチドの創生の検討を行った。
【0086】
＜一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの設計＞
フレームシフト等による異常ＲＮＡに対し、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは異常となった読み枠を元に戻すことを可能とし、かつ標的領域であるエクソンをスキッピングさせるための化合物である。そのため、アンチセンスオリゴヌクレオチドの構造としては、標的ＲＮＡの標的領域に結合できるよう設計されており、加えて、ＲＮａｓｅＨ等のヌクレアーゼに認識されないよう糖部修飾核酸が配置されている。
フレームシフト等による異常ＲＮＡに対し、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは異常となった読み枠を元に戻すことを可能とし、かつ標的領域であるエクソンをスキッピングさせるための化合物である。そのため、アンチセンスオリゴヌクレオチドの構造としては、標的ＲＮＡの標的領域に結合できるよう設計されており、加えて、ＲＮａｓｅＨ等のヌクレアーゼに認識されないよう糖部修飾核酸が配置されている。
【0087】
＜一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列＞
本実施形態に係る一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、
（Ａ）配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１番～４０番、４６番、５１番、５６番、若しくは６２番～６３番に位置する塩基から連続した１０～３０ｍｅｒ（好ましくは１５～２５ｍｅｒ）で構成された標的領域、又は配列番号２に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１０８８７３番、１０８８７８番～１０８９１７番、１０８９２３番、１０８９２８番、１０８９３３番、若しくは１０８９３９番～１０８９４０番に位置する塩基から連続した１５～２５ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、
（Ｂ）上記標的領域において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して、相補的な塩基配列、又は、
（Ｃ）上記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列、であることが好ましい。また、本実施形態において、配列表に示されている各塩基配列は核酸塩基部の配列情報のみを示すために用いるものとする。上記核酸塩基部に加えて糖部及びリン酸部を含めたオリゴヌクレオチドの構造情報は、後述する表２－１～表２－８に示される記載形式で示すものとする。
本実施形態に係る一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、
（Ａ）配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１番～４０番、４６番、５１番、５６番、若しくは６２番～６３番に位置する塩基から連続した１０～３０ｍｅｒ（好ましくは１５～２５ｍｅｒ）で構成された標的領域、又は配列番号２に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１０８８７３番、１０８８７８番～１０８９１７番、１０８９２３番、１０８９２８番、１０８９３３番、若しくは１０８９３９番～１０８９４０番に位置する塩基から連続した１５～２５ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、
（Ｂ）上記標的領域において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して、相補的な塩基配列、又は、
（Ｃ）上記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列、であることが好ましい。また、本実施形態において、配列表に示されている各塩基配列は核酸塩基部の配列情報のみを示すために用いるものとする。上記核酸塩基部に加えて糖部及びリン酸部を含めたオリゴヌクレオチドの構造情報は、後述する表２－１～表２－８に示される記載形式で示すものとする。
【0088】
本実施形態において「配列同一性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つの塩基配列をアラインさせた場合の最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方又は両方へのギャップの導入を考慮し得るものである。）における、オーバーラップする全塩基配列に対する同一塩基の割合（％）を意味する。塩基配列の「配列同一性」は、当業者であれば容易に確認することができる。例えば、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用いることができる。
【0089】
本実施形態に係る一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１に記載の塩基配列における上述の所定の標的領域に対して相補的な塩基配列と９５％以上１００％以下の配列同一性を有することが好ましく、９８％以上１００％以下の配列同一性を有することがより好ましく、１００％の配列同一性を有することが更に好ましい。
【0090】
本実施形態において、「１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列」としては、例えば、欠失、置換、挿入又は付加によって、欠失、置換、挿入又は付加される前の塩基配列に対して８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列を挙げることができる。「１又は数個の塩基」の具体的な数としては、上述の欠失、置換、挿入又は付加が、それぞれ独立して、１カ所、２カ所、３カ所、４カ所、又は５カ所に存在してもよいし、複数が組み合わさっておこっていてもよい。
【0091】
本実施形態において「ストリンジェントな条件」とは、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５％ＳＤＳと５×デンハルトと１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡと５０％(ｖ／ｖ)ホルムアミドとを含む溶液中、室温にて１２時間インキュベートし、更に０．５×ＳＳＣで５０℃以上の温度で洗浄する条件をいう。更に、よりストリンジェントな条件、例えば、４５℃又は６０℃にて１２時間インキュベートすること、０．２×ＳＳＣ又は０．１×ＳＳＣで洗浄すること、洗浄に際し６０℃又は６５℃以上の温度条件で洗浄すること等の、より厳しい条件も含む。
【0092】
本実施形態の一側面において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１番～４０番、４６番、５１番、５６番、若しくは６２番～６３番に位置する塩基から連続した１５～２５ｍｅｒで構成された標的領域、又は配列番号２に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１０８８７３番、１０８８７８番～１０８９１７番、１０８９２３番、１０８９２８番、１０８９３３番、若しくは１０８９３９番～１０８９４０番に位置する塩基から連続した１５～２５ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列であることが好ましい。
【0093】
本実施形態の一側面において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１番～３２番、３４番～４０番、４６番、５１番、若しくは６２番～６３番に位置する塩基から連続した１５～２５ｍｅｒで構成された標的領域、又は配列番号２に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１０８８７８番～１０８９０９番、１０８９１１番～１０８９１７番、１０８９２３番、１０８９２８番、若しくは１０８９３９番～１０８９４０番に位置する塩基から連続した１５～２５ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列であることがより好ましい。
【0094】
本実施形態の一側面において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１番、３番、５番～１２番、１４番～１９番、２１番、２５番、２９番、３０番、３１番、３４番、４６番、若しくは５１番に位置する塩基から連続した１５～２５ｍｅｒで構成された標的領域、又は配列番号２に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１０８８７８番、１０８８８０番、１０８８８２番～１０８８８９番、１０８８９１番～１０８８９６番、１０８８９８番、１０８９０２番、１０８９０６番～１０８９０８番、１０８９１１番、１０８９２３番、若しくは１０８９２８番に位置する塩基から連続した１５～２５ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列であることが更に好ましい。
【0095】
上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＲＮ遺伝子の標的領域と結合することができる。本明細書において、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの「ＷＲＮ遺伝子の標的領域との結合」とは、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドのＷＲＮのｍＲＮＡ前駆体への直接結合を包含する。
【0096】
本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの一態様としては、ＷＲＮ遺伝子のエクソン２７をスキッピングできる一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであって、表１－１～表１－５に記載されているいずれかの塩基配列を持ち、当該一本鎖オリゴヌクレオチドは、ヒトＷＲＮ遺伝子のｍＲＮＡ前駆体における標的領域と相補的である。
なお、当該一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、表１－１～表１－５に記載されている塩基配列を含んでいれば３’側及び／又は５’側にそれぞれ１～５塩基延びていてもよい。上記標的領域は、ヒトＷＲＮのｍＲＮＡ前駆体において、特に、ヒトＷＲＮ遺伝子の発現調節に関連する領域（例えば、アンチセンスヌクレオチドが結合しやすいｍＲＮＡの二次構造をもつ領域）と言える。例えば、表１－１において配列番号１の５’末端位置が「５」であり３’末端位置が「２４」である場合、配列番号１（配列番号２のエクソン２７に該当）に記載の塩基配列における５’末端から数えて５番目から２４番目までの連続する２０ｍｅｒの塩基配列が、対応する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列名「５－２０」）が標的とするヒトＷＲＮのエクソン２７における標的領域となる。また、表１－１において配列番号１の５’末端位置が「（－）５」であり３’末端位置が「１５」である場合、配列番号１（配列番号２のエクソン２７に該当）に記載の塩基配列における５’末端に結合するイントロン領域に対してエクソン２７に結合する位置から数えて５番目の塩基からエクソン２７の１５番目までの２０ｍｅｒの塩基配列が、対応する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列名「（－）５－２０」）が標的とするヒトＷＲＮのエクソン２７における標的領域となる。
なお、当該一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、表１－１～表１－５に記載されている塩基配列を含んでいれば３’側及び／又は５’側にそれぞれ１～５塩基延びていてもよい。上記標的領域は、ヒトＷＲＮのｍＲＮＡ前駆体において、特に、ヒトＷＲＮ遺伝子の発現調節に関連する領域（例えば、アンチセンスヌクレオチドが結合しやすいｍＲＮＡの二次構造をもつ領域）と言える。例えば、表１－１において配列番号１の５’末端位置が「５」であり３’末端位置が「２４」である場合、配列番号１（配列番号２のエクソン２７に該当）に記載の塩基配列における５’末端から数えて５番目から２４番目までの連続する２０ｍｅｒの塩基配列が、対応する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列名「５－２０」）が標的とするヒトＷＲＮのエクソン２７における標的領域となる。また、表１－１において配列番号１の５’末端位置が「（－）５」であり３’末端位置が「１５」である場合、配列番号１（配列番号２のエクソン２７に該当）に記載の塩基配列における５’末端に結合するイントロン領域に対してエクソン２７に結合する位置から数えて５番目の塩基からエクソン２７の１５番目までの２０ｍｅｒの塩基配列が、対応する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列名「（－）５－２０」）が標的とするヒトＷＲＮのエクソン２７における標的領域となる。
【0097】
【表1-1】
【0098】
【表1-2】
【0099】
【表1-3】
【0100】
【表1-4】
【0101】
【表1-5】
【0102】
上記表１－１～表１－５において、記号「Ａ’」、記号「Ｃ’」、記号「Ｇ’」及び記号「Ｔ’」は、それぞれ天然ヌクレオシド（後述する、ａ、ｃ、ｇ、及びｔ）又は修飾ヌクレオシド（修飾糖ヌクレオシドを含む）から選択される。なお、修飾糖ヌクレオシドのうち２’－Ｏ－アルキル化核酸としては、記号「Ａ’」は、後述するＡ（Ｍ）、又はＡ（ｍ）から選択され、記号「Ｃ’」は、後述するＣ（Ｍ）、又は５（ｍ）から選択され、記号「Ｇ’」は、後述するＧ（Ｍ）、又はＧ（ｍ）から選択され、記号「Ｔ’」は、後述するＵ（Ｍ）、又はＴ（ｍ）から選択される。架橋型修飾ヌクレオシドとしては、記号「Ａ’」は、後述するＡ（Ｌ）、Ａ（Ｙ）、Ａ（Ｇｘ）、又はＡ（Ｓ）から選択され、記号「Ｃ’」は、後述する５（ｘ）、５（Ｌ）、５（Ｙ）、５（Ｇｘ）、又は５（Ｓ）から選択され、記号「Ｇ’」は、後述するＧ（Ｌ）、Ｇ（Ｙ）、Ｇ（Ｇｘ）、又はＧ（Ｓ）から選択され、記号「Ｔ’」は、後述するＴ（Ｌ）、Ｔ（Ｙ）、Ｔ（Ｇｘ）、又はＴ（Ｓ）から選択される。モルフォリノ核酸としては、記号「Ａ’」は、後述するＡ（Ｎ）であり、記号「Ｃ’」は、後述するＣ（Ｎ）であり、記号「Ｇ’」は、後述するＧ（Ｎ）であり、記号「Ｔ’」は、後述するＴ（Ｎ）である。
【0103】
＜薬理学上許容される塩＞
本実施形態に係る一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、薬理学上許容される塩の形態であってもよい。ここで、「薬理学上許容される塩」とは、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩であって、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの生理学的に許容される塩、すなわち、当該一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの所望される生物学的な活性を保持し、かつ望まれない毒物学的効果を保持しない塩を意味する。なお、後述する二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド及びアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体についても同様である。
本実施形態に係る一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、薬理学上許容される塩の形態であってもよい。ここで、「薬理学上許容される塩」とは、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩であって、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの生理学的に許容される塩、すなわち、当該一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの所望される生物学的な活性を保持し、かつ望まれない毒物学的効果を保持しない塩を意味する。なお、後述する二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド及びアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体についても同様である。
【0104】
＜製薬学的に許容される塩＞
本実施形態の一側面において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、製薬学的に許容される塩の形態であってもよい。ここで「製薬学的に許容される塩」とは、上述の薬理学上許容される塩であってかつ酸付加塩又は塩基付加塩であるものを意味する。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩及びリン酸塩等の無機酸塩、並びに、クエン酸塩、シュウ酸塩、フタル酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、酢酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐａｒａ－トルエンスルホン酸塩及びカンファースルホン酸塩等の有機酸塩が挙げられる。また、塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩及びアルミニウム塩等の無機塩基塩、並びに、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６－ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン］、ｔｅｒｔ－ブチルアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン及びＮ，Ｎ－ジベンジルエチルアミン等の有機塩基塩等が挙げられる。更には、アルギニン、リジン、オルニチン、アスパラギン酸又はグルタミン酸等の塩基性アミノ酸又は酸性アミノ酸との塩（アミノ酸塩）が挙げられる。なお、後述する二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド及びアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体についても同様である。
本実施形態の一側面において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、製薬学的に許容される塩の形態であってもよい。ここで「製薬学的に許容される塩」とは、上述の薬理学上許容される塩であってかつ酸付加塩又は塩基付加塩であるものを意味する。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩及びリン酸塩等の無機酸塩、並びに、クエン酸塩、シュウ酸塩、フタル酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、酢酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐａｒａ－トルエンスルホン酸塩及びカンファースルホン酸塩等の有機酸塩が挙げられる。また、塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩及びアルミニウム塩等の無機塩基塩、並びに、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６－ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン］、ｔｅｒｔ－ブチルアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン及びＮ，Ｎ－ジベンジルエチルアミン等の有機塩基塩等が挙げられる。更には、アルギニン、リジン、オルニチン、アスパラギン酸又はグルタミン酸等の塩基性アミノ酸又は酸性アミノ酸との塩（アミノ酸塩）が挙げられる。なお、後述する二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド及びアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体についても同様である。
【0105】
＜一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの構造＞
本実施形態に係る一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、天然のオリゴヌクレオチド及び／又は非天然のオリゴヌクレオチドで構成されている。
上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖の形態であることが好ましい。本実施形態の一側面において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、後述する第二鎖オリゴヌクレオチドとハイブリダイズして二本鎖の形態（二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド）をとってもよい。上記第二鎖オリゴヌクレオチドの塩基配列は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列であることが好ましい。
本実施形態に係る一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、天然のオリゴヌクレオチド及び／又は非天然のオリゴヌクレオチドで構成されている。
上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖の形態であることが好ましい。本実施形態の一側面において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、後述する第二鎖オリゴヌクレオチドとハイブリダイズして二本鎖の形態（二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド）をとってもよい。上記第二鎖オリゴヌクレオチドの塩基配列は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列であることが好ましい。
【0106】
＜一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドによるエクソンスキッピング機構＞
上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下のメカニズムで、異常スプライスされた標的ＲＮＡの読み枠を元の読み枠に戻し、機能的なＷＲＮタンパク質の発現を誘導する。
エクソンは両方のスプライス部位がスプライソソーム複合体によって認識された場合のみｍＲＮＡに包含されるが、スプライス部位をアンチセンスオリゴヌクレオチドでターゲッティングすることにより、スプライシングが阻害され、エクソンスキッピングを誘導することができる。エクソンスキッピングは、エクソンの５’スプライス部位及び３’スプライス部位のいずれか一方若しくは両方、又はエクソンの内部を標的とする一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが当該エクソンに結合することにより誘導することができる。すなわち、当該一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡの標的領域に結合し、当該エクソンのスプライスを阻害することによって、対象となるエクソンをスキップさせることが可能となり、発現されたｍＲＮＡを基に機能的なタンパク質の翻訳を誘導する。
上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下のメカニズムで、異常スプライスされた標的ＲＮＡの読み枠を元の読み枠に戻し、機能的なＷＲＮタンパク質の発現を誘導する。
エクソンは両方のスプライス部位がスプライソソーム複合体によって認識された場合のみｍＲＮＡに包含されるが、スプライス部位をアンチセンスオリゴヌクレオチドでターゲッティングすることにより、スプライシングが阻害され、エクソンスキッピングを誘導することができる。エクソンスキッピングは、エクソンの５’スプライス部位及び３’スプライス部位のいずれか一方若しくは両方、又はエクソンの内部を標的とする一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが当該エクソンに結合することにより誘導することができる。すなわち、当該一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡの標的領域に結合し、当該エクソンのスプライスを阻害することによって、対象となるエクソンをスキップさせることが可能となり、発現されたｍＲＮＡを基に機能的なタンパク質の翻訳を誘導する。
【0107】
また、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本実施形態においては、上述のようなメカニズムでヒトＷＲＮ遺伝子の第２７番目のエクソンを高効率にスキッピングする（ＷＲＮのｍＲＮＡ前駆体の成熟を調節することを介して作用する場合も含む。）ために好適に用いることが可能である。より具体的には、当該一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡ（ＷＲＮ遺伝子のｍＲＮＡ前駆体）の標的領域であるエクソン２７に結合し（図３上段）、当該エクソン２７のスプライスを阻害する。よって、ウェルナー症候群患者で見られるエクソン２６のスキップ変異で出現したエクソン２７内の終止コドンがスキップされ、エクソン２５とエクソン２８が連結したＷＲＮ ｍＲＮＡ（健常者ＷＲＮ遺伝子の読み枠に修正：イン・フレーム）が生成し（図３中段）、当該ｍＲＮＡを基にエクソン３４に含まれる核移行シグナルを持つ機能的なＷＲＮタンパク質が翻訳される。更に本実施形態によれば、臨床応用時に通常用いられる投与経路である経皮投与、静脈内投与や皮内投与においても、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドによる機能的なＷＲＮ遺伝子の発現を調節する効果が発揮され得る。ここで、「ヒトＷＲＮ遺伝子の第２７番目のエクソンを高効率にスキッピング」とは、ヒトＷＲＮ遺伝子の第２７番目のエクソンを高効率にスキッピングすることを少なくとも意味し、結果として、機能的なＷＲＮタンパク質の発現を回復することを少なくとも意味する。
【0108】
糖部がデオキシリボースである天然ヌクレオチドとしては、例えば、デオキシアデノシン一リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、チミジン一リン酸、デオキシシチジン一リン酸、デオキシ－５－メチルシチジン一リン酸等が挙げられる。言い換えると、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを構成する天然ヌクレオチドとしては、後述する記号ａ、ｇ、t、ｃ及び５（ｘ）それぞれに対応する構造式を含むものが挙げられる。
【0109】
糖部がデオキシリボースである非天然ヌクレオチドとしては、例えば、２－チオ－チミジン－リン酸、２－アミノアデノシン－リン酸、７－デアザグアノシン－リン酸等が挙げられる。
【0110】
本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基長は、１０～３０ｍｅｒであり、好ましくは１５～２５ｍｅｒであり、より好ましくは１８～２２ｍｅｒであり、更に好ましくは１６～２０ｍｅｒであり、特に好ましくは１８～２０ｍｅｒである。本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基長が、１５～２５ｍｅｒ、１８～２２ｍｅｒ、１６～２０ｍｅｒ、１８～２０ｍｅｒである場合、特に、ＷＲＮのｍＲＮＡ前駆体への結合が強く、ヒトＷＲＮ遺伝子の第２７番目のエクソンにおける高効率なスキッピングをより効果的に調節できる。
【0111】
本実施形態において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、各ヌクレオチドがリン酸基及び／又は修飾リン酸基で結合されており、ホスホジエステル結合又はホスホロチオアート結合で結合されていることが好ましい。
【0112】
＜二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド＞
本実施形態に係る二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと、
上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズしている第二鎖オリゴヌクレオチドと、を含む二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩である。また、本実施形態は、上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬を提供する。上記第二鎖オリゴヌクレオチドの塩基配列は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列であることが好ましい。
本実施形態に係る二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと、
上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズしている第二鎖オリゴヌクレオチドと、を含む二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩である。また、本実施形態は、上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬を提供する。上記第二鎖オリゴヌクレオチドの塩基配列は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列であることが好ましい。
【0113】
上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、溶液中で解離して、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと、上記第二鎖オリゴヌクレオチドとに分離することができる。分離した上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、上述した標的ＲＮＡに結合することができる。なお、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、上記第二鎖オリゴヌクレオチドとの関係において、「第一鎖オリゴヌクレオチド」と把握することもできる。なお、上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを構成するオリゴヌクレオチドのうち上記第一鎖オリゴヌクレオチドが上述した標的ＲＮＡに対するアンチセンス鎖を有しているが、上記第一鎖オリゴヌクレオチドと上記第二鎖オリゴヌクレオチドからなる二本鎖オリゴヌクレオチドを便宜上「二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド」と呼ぶことにする。
【0114】
≪一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの製造方法≫
本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロアミダイト法による固相合成により製造することができる。例えば、市販の核酸自動合成機を使用して固相担体上で所定の塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドをまず合成する。次に、塩基性物質等を用いて固相担体から合成した一本鎖オリゴヌクレオチドを切出し、脱保護を行ない、粗体の一本鎖オリゴヌクレオチドを得る。その後、得られた粗体の一本鎖オリゴヌクレオチドを、ＨＰＬＣ等を用いて精製する。上述の製造法に限らず、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当業者に公知の方法に準じて、核酸の塩基配列、修飾部位等を適宜変更することにより製造できる。また、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡについては、それぞれ国際公開第２０１１／０５２４３６号（特許文献１）、国際公開第２０１４／０４６２１２号（特許文献２）、及び国際公開第２０１５／１２５７８３号（特許文献３）に記載の方法により製造することができる。また、モルフォリノオリゴ核酸（ＰＭＯ）は、国際公開第１９９１／００９０３３号（特許文献４）、国際公開公報第２００９／０６４４７１号（特許文献５）又は非特許文献８に記載の方法に従って製造することが可能である。
本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロアミダイト法による固相合成により製造することができる。例えば、市販の核酸自動合成機を使用して固相担体上で所定の塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドをまず合成する。次に、塩基性物質等を用いて固相担体から合成した一本鎖オリゴヌクレオチドを切出し、脱保護を行ない、粗体の一本鎖オリゴヌクレオチドを得る。その後、得られた粗体の一本鎖オリゴヌクレオチドを、ＨＰＬＣ等を用いて精製する。上述の製造法に限らず、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当業者に公知の方法に準じて、核酸の塩基配列、修飾部位等を適宜変更することにより製造できる。また、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡについては、それぞれ国際公開第２０１１／０５２４３６号（特許文献１）、国際公開第２０１４／０４６２１２号（特許文献２）、及び国際公開第２０１５／１２５７８３号（特許文献３）に記載の方法により製造することができる。また、モルフォリノオリゴ核酸（ＰＭＯ）は、国際公開第１９９１／００９０３３号（特許文献４）、国際公開公報第２００９／０６４４７１号（特許文献５）又は非特許文献８に記載の方法に従って製造することが可能である。
【0115】
≪二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの製造方法≫
本発明の二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、まず、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと同様の製造方法を用いて、該一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を基準として所定の配列同一性を有するオリゴヌクレオチド（第二鎖オリゴヌクレオチド）を製造する。その後、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび上記第二鎖オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせることにより製造することができる。
本発明の二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、まず、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと同様の製造方法を用いて、該一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を基準として所定の配列同一性を有するオリゴヌクレオチド（第二鎖オリゴヌクレオチド）を製造する。その後、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび上記第二鎖オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせることにより製造することができる。
【0116】
≪アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体≫
本実施形態に係るアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体は、
上記オリゴヌクレオチド（好ましくは、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド）若しくはその製薬学的に許容される塩、又は上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩と、
上記オリゴヌクレオチド又は上記第二鎖オリゴヌクレオチドに結合している付加物質と、
を有する。上記付加物質は、ポリエチレングリコール、ペプチド、アルキル鎖（例えば、飽和脂肪族炭化水素等）、リガンド化合物、抗体、タンパク質、及び糖鎖（例えば、炭水化物、多糖等）からなる群より選ばれる。
本実施形態に係るアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体は、
上記オリゴヌクレオチド（好ましくは、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド）若しくはその製薬学的に許容される塩、又は上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩と、
上記オリゴヌクレオチド又は上記第二鎖オリゴヌクレオチドに結合している付加物質と、
を有する。上記付加物質は、ポリエチレングリコール、ペプチド、アルキル鎖（例えば、飽和脂肪族炭化水素等）、リガンド化合物、抗体、タンパク質、及び糖鎖（例えば、炭水化物、多糖等）からなる群より選ばれる。
【0117】
本実施形態の一側面において、上記オリゴヌクレオチド複合体は、上記オリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩と、
上記オリゴヌクレオチド又は上記第二鎖オリゴヌクレオチドに、直接又はリンカー結合を介して結合している付加物質と、を有する、オリゴヌクレオチド複合体又はその製薬学的に許容される塩であって、
上記付加物質は、ポリエチレングリコール、ペプチド、アルキル鎖、リガンド化合物、抗体、タンパク質、及び糖鎖からなる群より選ばれ、
上記リンカー結合は、それぞれ、独立してホスホジエステル結合、ホスホロチオアート結合、ホスホロジチオアート結合、ホスホアミダート結合、ボラノホスフェート結合、アルキルホスホナート結合、ホスホロジアミダート結合、ホスホロジアミドチオアート結合、又はホスホロジアミドジチオアート結合である。また、本実施形態は、上記オリゴヌクレオチド複合体又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬を提供する。
上記オリゴヌクレオチド又は上記第二鎖オリゴヌクレオチドに、直接又はリンカー結合を介して結合している付加物質と、を有する、オリゴヌクレオチド複合体又はその製薬学的に許容される塩であって、
上記付加物質は、ポリエチレングリコール、ペプチド、アルキル鎖、リガンド化合物、抗体、タンパク質、及び糖鎖からなる群より選ばれ、
上記リンカー結合は、それぞれ、独立してホスホジエステル結合、ホスホロチオアート結合、ホスホロジチオアート結合、ホスホアミダート結合、ボラノホスフェート結合、アルキルホスホナート結合、ホスホロジアミダート結合、ホスホロジアミドチオアート結合、又はホスホロジアミドジチオアート結合である。また、本実施形態は、上記オリゴヌクレオチド複合体又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬を提供する。
【0118】
本実施形態の一側面において、上記アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体は、
上記オリゴヌクレオチド（好ましくは一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド）又はその製薬学的に許容される塩と、
上記オリゴヌクレオチドに結合している付加物質と、を有し、上記付加物質は、ポリエチレングリコール、ペプチド、アルキル鎖、リガンド化合物、抗体、タンパク質、及び糖鎖からなる群より選ばれる。
上記オリゴヌクレオチド（好ましくは一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド）又はその製薬学的に許容される塩と、
上記オリゴヌクレオチドに結合している付加物質と、を有し、上記付加物質は、ポリエチレングリコール、ペプチド、アルキル鎖、リガンド化合物、抗体、タンパク質、及び糖鎖からなる群より選ばれる。
【0119】
本実施形態の他の側面において、上記アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体は、
上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩と、
上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又は上記第二鎖オリゴヌクレオチドに結合している付加物質と、を有し、上記付加物質は、ポリエチレングリコール、ペプチド、アルキル鎖（例えば、飽和脂肪族炭化水素等）、リガンド化合物、抗体、タンパク質、及び糖鎖（例えば、炭水化物、多糖等）からなる群より選ばれる。
上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩と、
上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又は上記第二鎖オリゴヌクレオチドに結合している付加物質と、を有し、上記付加物質は、ポリエチレングリコール、ペプチド、アルキル鎖（例えば、飽和脂肪族炭化水素等）、リガンド化合物、抗体、タンパク質、及び糖鎖（例えば、炭水化物、多糖等）からなる群より選ばれる。
【0120】
本実施形態において「付加物質」とは、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又は上記第二鎖オリゴヌクレオチドに結合している物質であって、所定の作用を付与するために用いられる物質を意味する。上記付加物質は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端に結合していてもよいし、３’末端に結合していてもよいし、５’末端及び３’末端の両方に結合していてもよい。また、上記付加物質は、上記第二鎖オリゴヌクレオチドの５’末端に結合していてもよいし、３’末端に結合していてもよいし、５’末端及び３’末端の両方に結合していてもよい。本実施形態の一側面において、上記付加物質は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又は上記第二鎖オリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端のいずれか一方に結合していることが好ましい。また、上記付加物質は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又は上記第二鎖オリゴヌクレオチドと直接、共有結合で結合していてもよい。上記付加物質は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又は上記第二鎖オリゴヌクレオチドと、リンカー物質を介して結合していてもよい。上記リンカー物質としては例えば、アルキル、ポリエチレングリコール、ペプチド、ジスルフィド、リン酸結合等及び／又はこれらの組み合わせで構成されたリンカーが挙げられる。上記リンカー物質は、リンカー結合と把握することもできる。
【0121】
上記付加物質として用いられるペプチドとしては、例えば、以下のようなものが挙げられるが、これらに限らない。ＣＰＰｓ（Ｃｅｌｌ Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅs：細胞膜透過性ペプチド）、核移行性ペプチド、ＴＡＴ（Ｔｒａｎｓ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ポリアルギニン、グルカゴン様ペプチド－１ 類縁ペプチド、合成環状ＲＧＤペプチド、皮膚透過性ペプチド。
【0122】
上記付加物質として用いられるリガンド化合物としては、例えば、以下のようなものが挙げられるが、これらに限らない。Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、糖類（グルコース、マンノース等）、脂質類（コレステロール等）、ビタミン類（葉酸、ビタミンＡ、ビタミンＥ等）、アミノ酸。
【0123】
上記付加物質として用いられる抗体としては、例えば、以下のようなものが挙げられるが、これらに限らない。抗インスリン受容体抗体、抗トランスフェリン受容体抗体、抗ＬＤＬ受容体関連タンパク質抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＨＥＲ２抗体。
【0124】
上記付加物質として用いられるタンパク質としては、例えば、以下のようなものが挙げられるが、これに限らない。アルブミン。
【0125】
モルフォリノオリゴ核酸において、上記付加物質と上記リンカー物質の組み合わせとしては、例えば、以下の構造式で示されるものが挙げられるが、これに限らない。
【化9】
【0126】
≪ヒトＷＲＮ遺伝子の第２７番目のエクソンのスキッピング剤≫
本実施形態に係るヒトＷＲＮ遺伝子の第２７番目のエクソンのスキッピング剤は、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又は上記アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体を有効成分として含む。
本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＲＮのｍＲＮＡ前駆体に結合することで、ヒトＷＲＮ遺伝子の第２７番目のエクソンをスキッピングすることができる。上記スキッピング剤の投与方法及び製剤は、当該分野で公知の投与方法及び製剤であれば、いずれも利用可能である。
本実施形態の一側面において、上記ヒトＷＲＮ遺伝子の第２７番目のエクソンのスキッピング剤は、上記オリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は上記オリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を有効成分として含む。
本実施形態に係るヒトＷＲＮ遺伝子の第２７番目のエクソンのスキッピング剤は、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又は上記アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体を有効成分として含む。
本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＲＮのｍＲＮＡ前駆体に結合することで、ヒトＷＲＮ遺伝子の第２７番目のエクソンをスキッピングすることができる。上記スキッピング剤の投与方法及び製剤は、当該分野で公知の投与方法及び製剤であれば、いずれも利用可能である。
本実施形態の一側面において、上記ヒトＷＲＮ遺伝子の第２７番目のエクソンのスキッピング剤は、上記オリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は上記オリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を有効成分として含む。
【0127】
≪機能的ＷＲＮ回復剤≫
本実施形態に係る機能的ＷＲＮ回復剤は、上記オリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は上記オリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を有効成分として含む、ヒトＷＲＮ遺伝子の第２７番目のエクソンのスキッピングによる核移行シグナルを保有する機能的ＷＲＮ回復剤である。本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＲＮのｍＲＮＡ前駆体に結合することで、ヒトＷＲＮ遺伝子の第２７番目のエクソンをスキッピングすることができる。特に、上記ヒトＷＲＮ遺伝子がウェルナー症候群患者で見られるエクソン２６のスキップ変異を有する場合、当該ヒトＷＲＮ遺伝子で出現したエクソン２７内の終止コドンがスキップされ、エクソン２５とエクソン２８が連結したＷＲＮ ｍＲＮＡが生成し、当該ｍＲＮＡを基にエクソン３４に含まれる核移行シグナルを持つ機能的なＷＲＮタンパク質が翻訳される。
本実施形態の一側面において、上記機能的ＷＲＮ回復剤は、上記オリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は上記オリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を有効成分として含む。
本実施形態に係る機能的ＷＲＮ回復剤は、上記オリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は上記オリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を有効成分として含む、ヒトＷＲＮ遺伝子の第２７番目のエクソンのスキッピングによる核移行シグナルを保有する機能的ＷＲＮ回復剤である。本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＲＮのｍＲＮＡ前駆体に結合することで、ヒトＷＲＮ遺伝子の第２７番目のエクソンをスキッピングすることができる。特に、上記ヒトＷＲＮ遺伝子がウェルナー症候群患者で見られるエクソン２６のスキップ変異を有する場合、当該ヒトＷＲＮ遺伝子で出現したエクソン２７内の終止コドンがスキップされ、エクソン２５とエクソン２８が連結したＷＲＮ ｍＲＮＡが生成し、当該ｍＲＮＡを基にエクソン３４に含まれる核移行シグナルを持つ機能的なＷＲＮタンパク質が翻訳される。
本実施形態の一側面において、上記機能的ＷＲＮ回復剤は、上記オリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は上記オリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を有効成分として含む。
【0128】
≪一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド等を有効成分として含有する医薬組成物≫
本実施形態に係る医薬組成物は、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は上記アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を有効成分として含む。本実施形態の医薬組成物の投与方法及び製剤は、当該分野で公知の投与方法及び製剤であれば、いずれも利用可能である。以下、上記医薬組成物を、「アンチセンスオリゴヌクレオチド等の医薬組成物」と表記することがある。
本実施形態に係る医薬組成物は、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は上記アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を有効成分として含む。本実施形態の医薬組成物の投与方法及び製剤は、当該分野で公知の投与方法及び製剤であれば、いずれも利用可能である。以下、上記医薬組成物を、「アンチセンスオリゴヌクレオチド等の医薬組成物」と表記することがある。
【0129】
上記医薬組成物は、ウェルナー症候群の治療又は予防に用いられる。言い方を変えると、上記医薬組成物は、ヒトＷＲＮ遺伝子の第２７番目のエクソンを高効率にスキッピングすることによってウェルナー症候群の症状の改善が期待できる治療又は予防に用いることができる。
【0130】
≪ウェルナー症候群に対する治療剤及び予防剤≫
本実施形態に係るウェルナー症候群に対する治療剤は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は上記アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を有効成分として含む。本実施形態に係るウェルナー症候群に対する予防剤は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は上記アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を有効成分として含む。
本実施形態に係るウェルナー症候群に対する治療剤は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は上記アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を有効成分として含む。本実施形態に係るウェルナー症候群に対する予防剤は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は上記アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を有効成分として含む。
【0131】
＜個体＞
本発明における個体とは、哺乳動物を意味する。好ましくは、ヒト、サル、マーモセット、イヌ、ブタ、ウサギ、モルモット、ラット及びマウスである。より好ましくはヒトである。
本発明における個体とは、哺乳動物を意味する。好ましくは、ヒト、サル、マーモセット、イヌ、ブタ、ウサギ、モルモット、ラット及びマウスである。より好ましくはヒトである。
【0132】
本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその医薬組成物（ウェルナー症候群に対する治療剤及び予防剤を含む）を投与するに当たっては、その投与方法及び剤型は特に限定されない。すなわち、当該分野における公知の投与方法及び製剤であれば、いずれも本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド等の投与方法及び製剤として用いることができる。投与方法としては、例えば、経口投与、非経口投与等が挙げられる。非経口投与としては、点眼投与、腟内投与、直腸内投与、鼻腔内投与、経皮投与、静脈内注射、点滴、皮下投与、腹腔内投与若しくは筋肉内注入、吸引若しくは吸入による肺投与、髄腔内投与、脳室内投与等が挙げられる。
【0133】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド等の製剤には、賦形剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、嬌味剤、芳香剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、安定化剤、保存剤、張剤等の各種医薬用添加剤を必要に応じて混合することができる。
【0134】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド等の医薬組成物を局所投与する場合、例えば、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴下剤、坐剤、噴霧剤、液剤、散剤等の製剤を用いることができる。
【0135】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド等の医薬組成物を経口投与する場合、例えば、散剤、顆粒剤、水若しくは非水性媒体に溶解させた懸濁液又は溶液、カプセル、粉末剤、錠剤等の製剤を用いることができる。
【0136】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド等の医薬組成物を非経口、静脈内投与、皮下投与、又は皮内投与する場合、例えば、無菌水溶液等の製剤を用いることができる。
【0137】
本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの有効投与量は、投与される個体の性別、年齢、体重、症状等により、任意に定めることができる。更に、投与の方法、経路、頻度等に応じても任意に定めることができる。例えば、投与量として０．０１～１００ｍｇ／ｋｇ等が挙げられる。好ましくは０．１～５０ｍｇ／ｋｇであり、更に好ましくは０．１～１０ｍｇ／ｋｇである。
【0138】
≪ヒトＷＲＮ遺伝子の第２７番目のエクソンを高効率にスキッピングする方法≫
本実施形態におけるヒトＷＲＮ遺伝子の第２７番目のエクソンをスキッピングする方法は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は上記アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を有効成分として、上記ＷＲＮ遺伝子を発現している細胞、組織又は個体に投与する工程を含む。
本実施形態におけるヒトＷＲＮ遺伝子の第２７番目のエクソンをスキッピングする方法は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は上記アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を有効成分として、上記ＷＲＮ遺伝子を発現している細胞、組織又は個体に投与する工程を含む。
【0139】
本実施形態において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド等を細胞、組織又は個体に投与する方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行ってもよいし、ｉｎ ｖｉｖｏで行ってもよい。ｉｎ ｖｉｖｏで投与する場合、その投与経路は、上述した投与経路が用いられる。
【0140】
本実施形態において、「ＷＲＮ遺伝子を発現している細胞」としては、線維芽細胞、脂肪細胞、間葉系幹細胞、ケラチノサイト、筋細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞などが挙げられる。
【0141】
本実施形態におけるウェルナー症候群の治療方法又は予防方法は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は上記アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を有効成分として、上記ウェルナー症候群に罹患している個体に投与する工程を含む。
【0142】
以上、本実施形態に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドについて説明した。上述の構成を備える上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトＷＲＮ遺伝子の第２７番目のエクソンを高効率にスキッピングすることが可能になる。
【0143】
≪ヒトＷＲＮ遺伝子の第２７番目のエクソンをスキッピングに対する活性の評価方法≫
＜細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの導入＞
「ＷＲＮ遺伝子を発現している細胞」にリポフェクション法、エレクトロポレーション法又は直接添加による導入等の方法を用いてアンチセンスオリゴヌクレオチドを６時間から１ヶ月間処置することで観察できる。なお処置時間は、４８時間から７日間が好ましい。使用する細胞はＷＲＮ遺伝子が発現している細胞であればよく、例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞、又はウェルナー症候群患者由来の線維芽細胞(以下、「ウェルナー症候群患者線維芽細胞」という。)が挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを処置した細胞は、処置後すぐに回収してもよいし、アンチセンスオリゴヌクレオチドを除去して継続培養してもよい。
＜細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの導入＞
「ＷＲＮ遺伝子を発現している細胞」にリポフェクション法、エレクトロポレーション法又は直接添加による導入等の方法を用いてアンチセンスオリゴヌクレオチドを６時間から１ヶ月間処置することで観察できる。なお処置時間は、４８時間から７日間が好ましい。使用する細胞はＷＲＮ遺伝子が発現している細胞であればよく、例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞、又はウェルナー症候群患者由来の線維芽細胞(以下、「ウェルナー症候群患者線維芽細胞」という。)が挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを処置した細胞は、処置後すぐに回収してもよいし、アンチセンスオリゴヌクレオチドを除去して継続培養してもよい。
【0144】
＜ヒトＷＲＮ遺伝子の第２７番目のエクソンスキッピング評価＞
回収した細胞から抽出した全ＲＮＡに対して逆転写反応を実施し、得られたｃＤＮＡに対してＷＲＮ遺伝子のエクソン２７の周辺領域をＰＣＲにて増幅する。該ＰＣＲ増幅産物に対して、ポリヌクレオチド量の定量またはシークエンス解析を行うことにより、ＷＲＮ遺伝子の第２７番目のエクソンスキッピングが確認できる。スキッピング効率は、エクソン２７がスキップしたＰＣＲ産物のポリヌクレオチド量「Ａ」及びエクソン２７がスキップしなかったＰＣＲ産物のポリヌクレオチド量「Ｂ」を定量し、これら「Ａ」と「Ｂ」の測定値を以下の計算式に従って、スキッピング効率（％）を計算することができる。
スキッピング効率（％）＝１００×Ａ/（Ａ＋Ｂ）
回収した細胞から抽出した全ＲＮＡに対して逆転写反応を実施し、得られたｃＤＮＡに対してＷＲＮ遺伝子のエクソン２７の周辺領域をＰＣＲにて増幅する。該ＰＣＲ増幅産物に対して、ポリヌクレオチド量の定量またはシークエンス解析を行うことにより、ＷＲＮ遺伝子の第２７番目のエクソンスキッピングが確認できる。スキッピング効率は、エクソン２７がスキップしたＰＣＲ産物のポリヌクレオチド量「Ａ」及びエクソン２７がスキップしなかったＰＣＲ産物のポリヌクレオチド量「Ｂ」を定量し、これら「Ａ」と「Ｂ」の測定値を以下の計算式に従って、スキッピング効率（％）を計算することができる。
スキッピング効率（％）＝１００×Ａ/（Ａ＋Ｂ）
【0145】
なお、本発明は、上述の実施形態に限定されない。例えば、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の実施態様を含む。
【0146】
本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの一態様としては、
ヒトＷＲＮ遺伝子の第２６番又は第２８番エクソンのスキップ変異に対して、機能的なヒトＷＲＮタンパク質を発現するオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩であって、
上記オリゴヌクレオチドは、各ヌクレオチドがリン酸基及び／又は修飾リン酸基で結合されており、
上記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の修飾糖を有する修飾核酸、を含み、
上記オリゴヌクレオチドの塩基長は、１０～３０ｍｅｒであり、
上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、
配列番号１に記載の塩基配列における、上記オリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも１つの標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、
上記標的領域において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して、相補的な塩基配列、又は、
上記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列、である、オリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩、である。
ヒトＷＲＮ遺伝子の第２６番又は第２８番エクソンのスキップ変異に対して、機能的なヒトＷＲＮタンパク質を発現するオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩であって、
上記オリゴヌクレオチドは、各ヌクレオチドがリン酸基及び／又は修飾リン酸基で結合されており、
上記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の修飾糖を有する修飾核酸、を含み、
上記オリゴヌクレオチドの塩基長は、１０～３０ｍｅｒであり、
上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、
配列番号１に記載の塩基配列における、上記オリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも１つの標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、
上記標的領域において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して、相補的な塩基配列、又は、
上記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列、である、オリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩、である。
【0147】
本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの別の一態様としては、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６に記載の塩基配列における、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも１つの標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９５％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列である。
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６に記載の塩基配列における、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも１つの標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９５％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列である。
【0148】
本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの別の一態様としては、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６に記載の塩基配列における、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも１つの標的領域に対して相補的な塩基配列である。
【0149】
本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの別の一態様としては、
上記オリゴヌクレオチドを構成する糖がＤ－リボフラノースであり、糖の修飾がＤ－リボフラノースの２’位の水酸基の糖修飾である。
上記オリゴヌクレオチドを構成する糖がＤ－リボフラノースであり、糖の修飾がＤ－リボフラノースの２’位の水酸基の糖修飾である。
【0150】
上記オリゴヌクレオチドの塩基長は、１５～２５ｍｅｒである。
【0151】
本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの別の一態様としては、
上記オリゴヌクレオチドを構成する糖の修飾が下記の式（Ａ１）で表される基である。
（式中、Ｂｘは核酸塩基であり、それぞれ、独立して、アデニン、グアニン、シトシン、５－メチルシトシン、チミン又はウラシルで表される基であり、Ｘはリン酸結合であり、それぞれ、独立して、ホスホジエステル結合、ホスホロチオアート結合、ホスホロジチオアート結合、ホスホアミダート結合、ボラノホスフェート結合又はアルキルホスホナート結合であり、Ｙは、それぞれ、独立して、水素原子、水酸基、フッ素原子、置換されていてもよい炭素数１～６のアルコキシ基、又は置換されていてもよいアミノ基であり、Ｚは、それぞれ、独立して、水素原子であるか、炭素－酸素二重結合若しくは環状構造を有していてもよい炭素数１～５のアルキル基であるか、又は上記アルキル基の一部の炭素原子とＹとが一緒になって環を形成する。）上記炭素数１～５のアルキル基が有する「炭素－酸素二重結合」としては、例えばカルボニル基が挙げられる。上記炭素数１～５のアルキル基が有する「環状構造」としては、例えばシクロプロパン構造が挙げられる。
上記オリゴヌクレオチドを構成する糖の修飾が下記の式（Ａ１）で表される基である。
【化10】
（式中、Ｂｘは核酸塩基であり、それぞれ、独立して、アデニン、グアニン、シトシン、５－メチルシトシン、チミン又はウラシルで表される基であり、Ｘはリン酸結合であり、それぞれ、独立して、ホスホジエステル結合、ホスホロチオアート結合、ホスホロジチオアート結合、ホスホアミダート結合、ボラノホスフェート結合又はアルキルホスホナート結合であり、Ｙは、それぞれ、独立して、水素原子、水酸基、フッ素原子、置換されていてもよい炭素数１～６のアルコキシ基、又は置換されていてもよいアミノ基であり、Ｚは、それぞれ、独立して、水素原子であるか、炭素－酸素二重結合若しくは環状構造を有していてもよい炭素数１～５のアルキル基であるか、又は上記アルキル基の一部の炭素原子とＹとが一緒になって環を形成する。）上記炭素数１～５のアルキル基が有する「炭素－酸素二重結合」としては、例えばカルボニル基が挙げられる。上記炭素数１～５のアルキル基が有する「環状構造」としては、例えばシクロプロパン構造が挙げられる。
【0152】
本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの別の一態様としては、
上記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合である。
上記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合である。
【0153】
本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの別の一態様としては、
上記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチド間結合がホスホジエステル結合である。
上記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチド間結合がホスホジエステル結合である。
【0154】
本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの別の一態様としては、
上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、
配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１番～１２番、１４番～２１番、２４番、２５番、２９番～３１番、３４番、３６番、４１番、４６番、５１番、若しくは６２番に位置する塩基から連続した１５～２５ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、
上記標的領域において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して相補的な塩基配列、又は、
上記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列である。
上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、
配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１番～１２番、１４番～２１番、２４番、２５番、２９番～３１番、３４番、３６番、４１番、４６番、５１番、若しくは６２番に位置する塩基から連続した１５～２５ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、
上記標的領域において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して相補的な塩基配列、又は、
上記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列である。
【0155】
本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの別の一態様としては、
上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、
配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１番～４０番、４６番、５１番、５６番、又は６２番～６３番に位置する塩基から連続した１５～２５ｍｅｒで構成された標的領域、又は配列番号２に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１０８８７３番、１０８８７８番～１０８９１７番、１０８９２３番、１０８９２８番、１０８９３３番、又は１０８９３９番～１０８９４０番に位置する塩基から連続した１５～２５ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、
上記標的領域において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して相補的な塩基配列、又は、
上記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列である。
上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、
配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１番～４０番、４６番、５１番、５６番、又は６２番～６３番に位置する塩基から連続した１５～２５ｍｅｒで構成された標的領域、又は配列番号２に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１０８８７３番、１０８８７８番～１０８９１７番、１０８９２３番、１０８９２８番、１０８９３３番、又は１０８９３９番～１０８９４０番に位置する塩基から連続した１５～２５ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、
上記標的領域において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して相補的な塩基配列、又は、
上記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列である。
【0156】
本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの別の一態様としては、
上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１番、３番～１２番、１４番～１９番、２１番、２５番、２９番、３０番、３１番、３４番、４６番、若しくは５１番に位置する塩基から連続した１５～２５ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列である。
上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１番、３番～１２番、１４番～１９番、２１番、２５番、２９番、３０番、３１番、３４番、４６番、若しくは５１番に位置する塩基から連続した１５～２５ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列である。
【0157】
本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの別の一態様としては、
上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１番～３２番、３４番～４０番、４６番、５１番、又は６２番～６３番に位置する塩基から連続した１５～２５ｍｅｒで構成された標的領域、又は配列番号２に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１０８８７８番～１０８９０９番、１０８９１１番～１０８９１７番、１０８９２３番、１０８９２８番、又は１０８９３９番～１０８９４０番に位置する塩基から連続した１５～２５ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列である。
上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１番～３２番、３４番～４０番、４６番、５１番、又は６２番～６３番に位置する塩基から連続した１５～２５ｍｅｒで構成された標的領域、又は配列番号２に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１０８８７８番～１０８９０９番、１０８９１１番～１０８９１７番、１０８９２３番、１０８９２８番、又は１０８９３９番～１０８９４０番に位置する塩基から連続した１５～２５ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列である。
【0158】
本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの別の一態様としては、
上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１番、３番、６番～１２番、１４番～１９番、２１番、２５番、２９番、３０番、３１番、３４番、４６番、若しくは５１番に位置する塩基から連続した１５～２５ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列である。
上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１番、３番、６番～１２番、１４番～１９番、２１番、２５番、２９番、３０番、３１番、３４番、４６番、若しくは５１番に位置する塩基から連続した１５～２５ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列である。
【0159】
本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの別の一態様としては、
上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１番、３番、５番～１２番、１４番～１９番、２１番、２５番、２９番、３０番、３１番、３４番、４６番、又は５１番に位置する塩基から連続した１５～２５ｍｅｒで構成された標的領域、又は配列番号２に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１０８８７８番、１０８８８０番、１０８８８２番～１０８８８９番、１０８８９１番～１０８８９６番、１０８８９８番、１０８９０２番、１０８９０６番～１０８９０８番、１０８９１１番、１０８９２３番、又は１０８９２８番に位置する塩基から連続した１５～２５ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列である。
上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１番、３番、５番～１２番、１４番～１９番、２１番、２５番、２９番、３０番、３１番、３４番、４６番、又は５１番に位置する塩基から連続した１５～２５ｍｅｒで構成された標的領域、又は配列番号２に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１０８８７８番、１０８８８０番、１０８８８２番～１０８８８９番、１０８８９１番～１０８８９６番、１０８８９８番、１０８９０２番、１０８９０６番～１０８９０８番、１０８９１１番、１０８９２３番、又は１０８９２８番に位置する塩基から連続した１５～２５ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列である。
【0160】
本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの別の一態様としては、
上記オリゴヌクレオチドを構成する糖の修飾が下記の式（Ａ２）又は式（Ａ３）で表される基である。
（式中、Ｂｘは核酸塩基であり、それぞれ、独立して、アデニン、グアニン、シトシン、５－メチルシトシン、チミン又はウラシルで表される基であり、Ｘはリン酸結合であり、それぞれ、独立して、ホスホジエステル結合、ホスホロチオアート結合、ホスホロジチオアート結合、ホスホアミダート結合、ボラノホスフェート結合又はアルキルホスホナート結合であり、Ｒ４は、それぞれ、独立して、水素原子、置換されていてもよい炭素数１～６のアルキル基であり、Ｙ’は、酸素原子又は置換されていてもよい窒素原子であり、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ、独立して、水素原子、置換されていてもよい炭素数１～６のアルキル基、又は、Ｒ５及びＲ６が一緒になってカルボニル基又は環を形成しており、ｎは、０～１である。）
上記オリゴヌクレオチドを構成する糖の修飾が下記の式（Ａ２）又は式（Ａ３）で表される基である。
【化11】
（式中、Ｂｘは核酸塩基であり、それぞれ、独立して、アデニン、グアニン、シトシン、５－メチルシトシン、チミン又はウラシルで表される基であり、Ｘはリン酸結合であり、それぞれ、独立して、ホスホジエステル結合、ホスホロチオアート結合、ホスホロジチオアート結合、ホスホアミダート結合、ボラノホスフェート結合又はアルキルホスホナート結合であり、Ｒ４は、それぞれ、独立して、水素原子、置換されていてもよい炭素数１～６のアルキル基であり、Ｙ’は、酸素原子又は置換されていてもよい窒素原子であり、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ、独立して、水素原子、置換されていてもよい炭素数１～６のアルキル基、又は、Ｒ５及びＲ６が一緒になってカルボニル基又は環を形成しており、ｎは、０～１である。）
【0161】
本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの別の一態様としては、
上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号９、１１、１４～２２、２４～２９、３１、３５、３９～４１、４４、５２、及び５３の塩基配列からなる群より選ばれる１つの塩基配列である。
上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号９、１１、１４～２２、２４～２９、３１、３５、３９～４１、４４、５２、及び５３の塩基配列からなる群より選ばれる１つの塩基配列である。
【0162】
本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの別の一態様としては、
上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号９～１４、１６～２６、２８～３９、４１～４２、４４～５０、５２、５５～５６、６９、７３、８０～１０５、１０７～１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８～１３１、１３３、及び１３５の塩基配列からなる群より選ばれる１つの塩基配列である。
上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号９～１４、１６～２６、２８～３９、４１～４２、４４～５０、５２、５５～５６、６９、７３、８０～１０５、１０７～１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８～１３１、１３３、及び１３５の塩基配列からなる群より選ばれる１つの塩基配列である。
【0163】
本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの別の一態様としては、
上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【実施例0164】
以下、本発明に係る実施例を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【0165】
≪ＷＲＮ遺伝子に対する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの作製≫
以下の手順でＷＲＮ遺伝子に対する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを作製した。
以下の手順でＷＲＮ遺伝子に対する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを作製した。
【0166】
２’－ＯＭｅ（Ｏ－メチル）、２’－ＭＯＥ（Ｏ－メトキシエチル）、ＡｍＮＡ、ｓｃｐＢＮＡ、及びＧｕＮＡを含む一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、核酸自動合成機（ｎＳ－８型、株式会社ジーンデザイン製）を用いて、０．２μｍｏｌスケールで合成した。鎖長の伸長は、標準的なホスホロアミダイトプロトコールにて実施した。このとき固相担体は、ＣＰＧレジンを使用した。また、ホスホロチオエート化（ＰＳ）骨格形成のための硫化はＤＤＴＴ（（（Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ－ｍｅｔｈｙｌｉｄｅｎｅ）ａｍｉｎｏ）－３Ｈ－１，２，４－ｄｉｔｈｉａｚａｏｌｉｎｅ－３－ｔｈｉｏｎｅ）等を使用した。ＡｍＮＡ及びｓｃｐＢＮＡを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、末端の５’位の水酸基がＤＭＴｒ（４，４’－ジメトキシトリチル）基で保護されておらず、かつ３’位が固相に担持されたものとして得た。続いてアルカリ処理することにより、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを固相担体から切り出し、溶液の状態で回収した。その後、回収した溶液から溶媒を留去することで粗生成物を得た。得られた粗生成物を逆相ＨＰＬＣにて精製することにより精製された一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを得た。得られた各一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの純度及び構造をＬＣ－ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ社製）により確認した。モルフォリノ核酸を含むモルフォリノオリゴ核酸は、国際公開第２００９／０６４４７１号（特許文献５）又は、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ（２０１６）１３８：１５６６３－１５６７２（非特許文献８）に従って合成した。
【0167】
下記表２－１～表２－７に、上述の方法で製造した一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを列挙する。また、下記表２－８に列挙された一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを、上述の方法で製造した。
【0168】
【表2-1】
【0169】
【表2-2】
【0170】
【表2-3】
【0171】
【表2-4】
【0172】
【表2-5】
【0173】
【表2-6】
【0174】
【表2-7】
【0175】
【表2-8】
【0176】
本明細書において、下記記号又は表記を用いて、対応する構造を表すことがある。
【0177】
【化12】
【0178】
【化13】
【0179】
【化14】
【0180】
【化15】
【0181】
上に示す構造式において、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、それぞれ独立して、水素原子、又は、直鎖若しくは分岐の炭素数１から６のアルキル基、又は炭素数３から７のシクロアルキル基を示す。ここにおいて、上述の「Ｇｘ」で示されるＧｕＮＡにおけるＲ１及びＲ３が共に水素原子で、かつ、Ｒ２がメチル基の場合は、「Ｇｍ」と示し、Ｒ１が水素原子で、かつ、Ｒ２及びＲ３が共にメチル基の場合は、「Ｇｄｍ」と示し、Ｒ１及びＲ３が水素原子で、かつ、Ｒ２がｔｅｒｔ－ブチル基の場合は、「ＧｔＢ」と示す。
【0182】
≪ヒトＷＲＮ遺伝子の第２７番目のエクソンスキッピング評価≫
ヒトＷＲＮ遺伝子の第２７番目のエクソンスキッピング評価は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞やエクソン２６を欠失したウェルナー症候群患者線維芽細胞におけるエクソン２７スキッピングの誘導を確認することにより行った。
本実施例における遺伝子発現評価とは、逆転写反応によって得られた相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に対してＷＲＮ遺伝子のエクソン２６（正常ＷＲＮ遺伝子を持つＨＥＫ２９３Ｔ）或いは２５(エクソン２６を欠失したウェルナー症候群患者線維芽細胞)から２９にわたる領域を、ＰＣＲ法を用いて増幅した量を測定することでＷＲＮ遺伝子の第２７番目のエクソンの配列構造を評価することを意味する。以下、各発現評価の具体的手順について説明する。
ヒトＷＲＮ遺伝子の第２７番目のエクソンスキッピング評価は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞やエクソン２６を欠失したウェルナー症候群患者線維芽細胞におけるエクソン２７スキッピングの誘導を確認することにより行った。
本実施例における遺伝子発現評価とは、逆転写反応によって得られた相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に対してＷＲＮ遺伝子のエクソン２６（正常ＷＲＮ遺伝子を持つＨＥＫ２９３Ｔ）或いは２５(エクソン２６を欠失したウェルナー症候群患者線維芽細胞)から２９にわたる領域を、ＰＣＲ法を用いて増幅した量を測定することでＷＲＮ遺伝子の第２７番目のエクソンの配列構造を評価することを意味する。以下、各発現評価の具体的手順について説明する。
【0183】
（細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの導入）
「ヒトＷＲＮ遺伝子を発現している細胞」にリポフェクション法或いは直接添加による導入等の方法を用いてアンチセンスオリゴヌクレオチドを２日間処置した。使用する細胞はＷＲＮ遺伝子が発現している細胞（例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞又はエクソン２６を欠失したウェルナー症候群患者線維芽細胞）を用いた。アンチセンスオリゴヌクレオチドを処置した細胞は、処置後すぐに回収するか、又は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを除去して継続培養してから回収した。
「ヒトＷＲＮ遺伝子を発現している細胞」にリポフェクション法或いは直接添加による導入等の方法を用いてアンチセンスオリゴヌクレオチドを２日間処置した。使用する細胞はＷＲＮ遺伝子が発現している細胞（例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞又はエクソン２６を欠失したウェルナー症候群患者線維芽細胞）を用いた。アンチセンスオリゴヌクレオチドを処置した細胞は、処置後すぐに回収するか、又は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを除去して継続培養してから回収した。
【0184】
（ＷＲＮ ｃＤＮＡの解析）
回収した細胞から抽出した全ＲＮＡに対して逆転写反応を実施し、得られたｃＤＮＡに対してＷＲＮ遺伝子のエクソン２６からエクソン２９にわたる領域（正常ＷＲＮ遺伝子を持つＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いた場合）、或いはＷＲＮ遺伝子のエクソン２５からエクソン２９にわたる領域(エクソン２６欠失したウェルナー症候群患者線維芽細胞を用いた場合)を、ＰＣＲ法を用いて増幅した。これらの増幅は、アニーリング温度６０℃を設定した。
回収した細胞から抽出した全ＲＮＡに対して逆転写反応を実施し、得られたｃＤＮＡに対してＷＲＮ遺伝子のエクソン２６からエクソン２９にわたる領域（正常ＷＲＮ遺伝子を持つＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いた場合）、或いはＷＲＮ遺伝子のエクソン２５からエクソン２９にわたる領域(エクソン２６欠失したウェルナー症候群患者線維芽細胞を用いた場合)を、ＰＣＲ法を用いて増幅した。これらの増幅は、アニーリング温度６０℃を設定した。
【0185】
（エクソン２７のスキッピングの確認）
こうして、正常ＷＲＮ遺伝子を持つＨＥＫ２９３Ｔにおいて、ＷＲＮ ｃＤＮＡのエクソン２６から２９の領域を増幅したところ、アンチセンスオリゴヌクレオチドの無添加では２９０塩基対のバンドが得られた。この増幅産物の塩基配列を常法により決定したところ、これがエクソン２６、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９からなることが示された。
こうして、正常ＷＲＮ遺伝子を持つＨＥＫ２９３Ｔにおいて、ＷＲＮ ｃＤＮＡのエクソン２６から２９の領域を増幅したところ、アンチセンスオリゴヌクレオチドの無添加では２９０塩基対のバンドが得られた。この増幅産物の塩基配列を常法により決定したところ、これがエクソン２６、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９からなることが示された。
【0186】
同様に、エクソン２６を欠失したウェルナー症候群患者線維芽細胞においては、ＷＲＮ ｃＤＮＡのエクソン２５からエクソン２９の領域を増幅したところ、アンチセンスオリゴヌクレオチドの無添加では２９０塩基対のバンドが得られた。この増幅産物の塩基配列を常法により決定したところ、これがエクソン２５、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９からなることが示された。この結果は患者の遺伝子解析結果とよく一致していた。
【0187】
一方、アンチセンスオリゴヌクレオチドを導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞のｃＤＮＡでは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを導入しない細胞から得られた増幅産物と同じサイズの増幅産物が得られたのみならず、培養４８時間後、小さなサイズの増幅産物が得られた。この増幅産物の塩基配列を常法により決定したところ、これがエクソン２６、エクソン２８、エクソン２９からなることが示された。この条件で小さなサイズの転写物、すなわちエクソン２７のスキッピングを有するもののみが得られた。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを導入した上述のウェルナー症候群患者線維芽細胞のｃＤＮＡでは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを導入しない細胞から得られた増幅産物より小さなサイズの増幅産物が得られた。この小さなサイズの増幅産物の塩基配列を決定したところ、エクソン２５の配列が直接エクソン２８の配列につながっており、エクソン２６とエクソン２７の欠失が判明した。このことは、アンチセンスオリゴヌクレオチド処理によりエクソン２７がスキッピングしたことを示している。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを導入した上述のウェルナー症候群患者線維芽細胞のｃＤＮＡでは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを導入しない細胞から得られた増幅産物より小さなサイズの増幅産物が得られた。この小さなサイズの増幅産物の塩基配列を決定したところ、エクソン２５の配列が直接エクソン２８の配列につながっており、エクソン２６とエクソン２７の欠失が判明した。このことは、アンチセンスオリゴヌクレオチド処理によりエクソン２７がスキッピングしたことを示している。
【0188】
正常のヒトＷＲＮ遺伝子構造を持つ遺伝子から転写されたｍＲＮＡ前駆体もスプライシング反応において、本発明者らはデザインしたアンチセンスオリゴヌクレオチドがエクソン２７のスキッピングを有効に誘導することを確認した。また、第２６番エクソンのスキップ変異ｃ.３１３９－１Ｇ＞Ｃを持つウェルナー症候群患者線維芽細胞（エクソン２６を欠失したウェルナー症候群患者線維芽細胞）でも、本発明者らはデザインしたアンチセンスオリゴヌクレオチドがエクソン２７のスキッピングを有効に誘導することを確認した。以下、各種の試験に基づいて本発明を更に詳細に説明する。
【0189】
≪ＷＲＮ遺伝子のエクソン２７スキッピングの誘導評価≫
ＷＲＮ遺伝子のエクソン２７スキッピングの誘導評価は、製造した一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドに応じて、ヒト胎児腎細胞ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いた評価と、２６番エクソンのスキップ変異ｃ.３１３９－１Ｇ＞Ｃを持つウェルナー症候群患者線維芽細胞を用いた評価に分けて行った。以下、具体的手順について説明する。
ＷＲＮ遺伝子のエクソン２７スキッピングの誘導評価は、製造した一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドに応じて、ヒト胎児腎細胞ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いた評価と、２６番エクソンのスキップ変異ｃ.３１３９－１Ｇ＞Ｃを持つウェルナー症候群患者線維芽細胞を用いた評価に分けて行った。以下、具体的手順について説明する。
【0190】
＜ヒト胎児腎細胞ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いたエクソン２７スキッピングの誘導評価＞
ヒト胎児腎細胞ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－３２１６ （商標））を、培養培地中、３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養培地としては、以下の組成のものを用いた。
ヒト胎児腎細胞ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－３２１６ （商標））を、培養培地中、３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養培地としては、以下の組成のものを用いた。
【0191】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養培地組成
ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃１１９９５
１０％ ウシ胎児血清（ＦＢＳ）：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃１０４３７０２８
ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃１１９９５
１０％ ウシ胎児血清（ＦＢＳ）：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃１０４３７０２８
【0192】
まず、トランスフェクションの前日に、９６穴プレートにＨＥＫ２９３Ｔ細胞（１２０００ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件で一晩培養した。その後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した各一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（５０ｎＭ）をリポフェクション法にて、上述の細胞にトランスフェクションした。陰性対照群としては、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが溶解していないＰＢＳをトランスフェクションした細胞を用いた。トランスフェクションした細胞を培養培地中で３７℃、５％ＣＯ２の条件で４８時間培養した。その後、上記培養培地を除去し、Ｔａｑｍａｎ Ｆａｓｔ Ｃｅｌｌｓ－ｔｏ－ＣＴ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃４３９９００３）を用いて、抽出した全ＲＮＡに対して逆転写反応を実施した。この逆転写反応から得られた相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を利用して、予め設計された特異的プライマー（下記参照）を用いてＷＲＮ遺伝子のエクソン２５からエクソン２９にわたるＰＣＲを実施した。
【0193】
用いたＰＣＲのプログラムは、以下の通りである。
９４℃、１分間：熱変性
［９８℃、１０秒間；６０℃、５秒間；６８℃、４０秒間］×３５サイクル：ＰＣＲ増幅
９４℃、１分間：熱変性
［９８℃、１０秒間；６０℃、５秒間；６８℃、４０秒間］×３５サイクル：ＰＣＲ増幅
【0194】
遺伝子特異的プライマーはＷＲＮ＿Ｅｘｏｎ２６＿Ｆｗ及びＷＲＮ＿Ｅｘｏｎ２９＿Ｒｖを使用した。
ＷＲＮ＿Ｅｘｏｎ２６＿Ｆｗ： ５’－ＣＴＣＡＧＡＧＣＣＴＣＡＴＣＣＴＴＣＡＡＧＣＴＡＡＴＧ－３’
ＷＲＮ＿Ｅｘｏｎ２９＿Ｒｖ： ５’－ＣＡＡＴＣＴＧＡＧＴＣＴＣＣＴＧＣＴＣＴＴＧＴＧＣ－３’
ＷＲＮ＿Ｅｘｏｎ２６＿Ｆｗ： ５’－ＣＴＣＡＧＡＧＣＣＴＣＡＴＣＣＴＴＣＡＡＧＣＴＡＡＴＧ－３’
ＷＲＮ＿Ｅｘｏｎ２９＿Ｒｖ： ５’－ＣＡＡＴＣＴＧＡＧＴＣＴＣＣＴＧＣＴＣＴＴＧＴＧＣ－３’
【0195】
上記ＰＣＲ反応の反応物を３％アガロースゲール電気泳動によって分離し、ＬＥＤトランスイルミネーターゲルみえーる（Ｗａｋｏ社）とｉＰｈｏｎｅ８(Ａｐｐｌｅ社)とを組み合わせた撮影システムにより、ゲル写真を撮影した。
【0196】
【0197】
正常ＷＲＮ遺伝子を持つＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、ＷＲＮｃＤＮＡのエクソン２６からエクソン２９の領域を増幅したところ、アンチセンスオリゴヌクレオチドを導入しなかったサンプル（図５中、「無添加」と表記）では２９１塩基対のバンドが得られた。この増幅産物の塩基配列をＤＮＡシークエンシングにより決定したところ、このバンドがエクソン２６、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９からなることが示された。
【0198】
一方、各アンチセンスオリゴヌクレオチドを添加したＨＥＫ２９３Ｔ細胞のｃＤＮＡでは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを導入しない細胞から得られた増幅産物と同じサイズの増幅産物が得られたのみならず、培養４８時間後、小さなサイズの増幅産物(２１５塩基対)が得られた。この増幅産物の塩基配列をシークエンスにより決定したところ、当該増幅産物はエクソン２６、エクソン２８、エクソン２９からなることが示された。またこの条件で小さなサイズの増幅産物のみが認められる、すなわち高効率なエクソン２７のスキッピング活性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドも得られた。
【0199】
ＩｍａｇｅＪ(米国ＮＩＨ)により、エクソン２７がスキップしたＰＣＲ産物「２１５ｂｐ、Ａ」と、及びエクソン２７がスキップしなかったＰＣＲ産物「２９１ｂｐ、Ｂ」を定量した。これら「Ａ」と「Ｂ」の測定値を以下の計算式に従って、以下の式を用いてスキッピング効率（％）を求めた。その結果を表３－１～表３－３に示す。
スキッピング効率（％）＝１００×Ａ/（Ａ＋Ｂ）
スキッピング効率（％）＝１００×Ａ/（Ａ＋Ｂ）
【0200】
【表3-1】
【0201】
【表3-2】
【0202】
【表3-3】
【0203】
＜ウェルナー症候群患者線維芽細胞のＷＲＮ遺伝子の変異型の確認＞
ウェルナー症候群患者線維芽細胞（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ、Ｃａｔ＃ＡＧ１２７９５）を、培養培地中、３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養した。ウェルナー症候群患者線維芽細胞の培養培地としては、以下の組成のものを用いた。
ウェルナー症候群患者線維芽細胞（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ、Ｃａｔ＃ＡＧ１２７９５）を、培養培地中、３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養した。ウェルナー症候群患者線維芽細胞の培養培地としては、以下の組成のものを用いた。
【0204】
ウェルナー症候群患者線維芽細胞の培養培地組成
イーグル最少必須培地（ＭＥＭ）：Ｓｉｇｍａ社製、Ｃａｔ＃Ｍ５６５０
１５％ ＦＢＳ：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃１０４３７０２８
イーグル最少必須培地（ＭＥＭ）：Ｓｉｇｍａ社製、Ｃａｔ＃Ｍ５６５０
１５％ ＦＢＳ：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃１０４３７０２８
【0205】
上記のウェルナー症候群患者線維芽細胞におけるＷＲＮ遺伝子の変異型について遺伝子変異の解析を行った。９６穴プレートにウェルナー症候群患者線維芽細胞（１００００ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件で一晩培養した。その後、細胞
のゲノムＤＮＡを抽出し、予め設計された特異的プライマー（下記参照）を用いてＷＲＮ遺伝子のエクソン２５からエクソン２９にわたるＰＣＲを実施した。
のゲノムＤＮＡを抽出し、予め設計された特異的プライマー（下記参照）を用いてＷＲＮ遺伝子のエクソン２５からエクソン２９にわたるＰＣＲを実施した。
【0206】
用いたＰＣＲのプログラムは、以下の通りである。
９４℃、１分間：熱変性
［９８℃、１０秒間；６０℃、５秒間；６８℃、４０秒間］×３５サイクル：ＰＣＲ増幅
９４℃、１分間：熱変性
［９８℃、１０秒間；６０℃、５秒間；６８℃、４０秒間］×３５サイクル：ＰＣＲ増幅
【0207】
遺伝子特異的プライマーはＷＲＮ＿Ｅｘｏｎ２５＿Ｆｗ及びＷＲＮ＿Ｅｘｏｎ２９＿Ｒｖを使用した。
ＷＲＮ＿Ｅｘｏｎ２５＿Ｆｗ：５’－ＣＴＧＧＣＡＡＧＧＡＴＣＡＡＡＣＡＧＡＧＡＧＴＴＧ－３’
ＷＲＮ＿Ｅｘｏｎ２９＿Ｒｖ：５’－ＣＡＡＴＣＴＧＡＧＴＣＴＣＣＴＧＣＴＣＴＴＧＴＧＣ－３’
ＷＲＮ＿Ｅｘｏｎ２５＿Ｆｗ：５’－ＣＴＧＧＣＡＡＧＧＡＴＣＡＡＡＣＡＧＡＧＡＧＴＴＧ－３’
ＷＲＮ＿Ｅｘｏｎ２９＿Ｒｖ：５’－ＣＡＡＴＣＴＧＡＧＴＣＴＣＣＴＧＣＴＣＴＴＧＴＧＣ－３’
【0208】
上記ＰＣＲ反応の反応物を３％アガロースゲール電気泳動として分離し、ＬＥＤトランスイルミネーターゲルみえーる（Ｗａｋｏ社）により、増幅したＰＣＲ断片を検出し、ＰＣＲ断片を含むゲルを切り出した。増幅したＰＣＲ断片を精製しシークエンスによる解析を実施したところ、当該ウェルナー症候群患者線維芽細胞はＷＲＮ遺伝子のｃ.３１３９－１Ｇ＞Ｃのホモ接合体であることが確認された。
【0209】
＜ウェルナー症候群患者線維芽細胞を用いたエクソン２７スキッピングの誘導評価＞
次に、ＷＲＮ遺伝子のｃ.３１３９－１Ｇ＞Ｃのホモ接合体であるウェルナー症候群患者線維芽細胞を用いて、ＷＲＮ遺伝子のエクソン２７スキッピングの誘導評価を行った。トランスフェクションの前日に、９６穴プレートにウェルナー症候群患者線維芽細胞（１００００ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件で一晩培養した。
その後、リポフェクション法による導入方法を用いてアンチセンスオリゴヌクレオチドを４８時間から１０日間処置した。ＰＢＳで希釈した各一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（終濃度１～５０ｎＭ）をリポフェクション法にて、上述の細胞にトランスフェクションした。陰性対照群としては、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが溶解していないＰＢＳをトランスフェクションした細胞を用いた。アンチセンスオリゴヌクレオチドで処置した細胞を培養培地中で３７℃、５％ＣＯ２の条件で４８時間または２４０時間培養した。その後、上記培養培地を除去し、Ｔａｑｍａｎ Ｆａｓｔ Ｃｅｌｌｓ－ｔｏ－ＣＴ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃４３９９００３）を用いて、抽出した全ＲＮＡに対して逆転写反応を実施した。この逆転写反応から得られた相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を利用して、予め設計された特異的プライマー（下記参照）を用いてＷＲＮ遺伝子のエクソン２５からエクソン２９にわたるＰＣＲを実施した。用いたＰＣＲのプログラムは、以下の通りである。
次に、ＷＲＮ遺伝子のｃ.３１３９－１Ｇ＞Ｃのホモ接合体であるウェルナー症候群患者線維芽細胞を用いて、ＷＲＮ遺伝子のエクソン２７スキッピングの誘導評価を行った。トランスフェクションの前日に、９６穴プレートにウェルナー症候群患者線維芽細胞（１００００ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件で一晩培養した。
その後、リポフェクション法による導入方法を用いてアンチセンスオリゴヌクレオチドを４８時間から１０日間処置した。ＰＢＳで希釈した各一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（終濃度１～５０ｎＭ）をリポフェクション法にて、上述の細胞にトランスフェクションした。陰性対照群としては、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが溶解していないＰＢＳをトランスフェクションした細胞を用いた。アンチセンスオリゴヌクレオチドで処置した細胞を培養培地中で３７℃、５％ＣＯ２の条件で４８時間または２４０時間培養した。その後、上記培養培地を除去し、Ｔａｑｍａｎ Ｆａｓｔ Ｃｅｌｌｓ－ｔｏ－ＣＴ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃４３９９００３）を用いて、抽出した全ＲＮＡに対して逆転写反応を実施した。この逆転写反応から得られた相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を利用して、予め設計された特異的プライマー（下記参照）を用いてＷＲＮ遺伝子のエクソン２５からエクソン２９にわたるＰＣＲを実施した。用いたＰＣＲのプログラムは、以下の通りである。
【0210】
９４℃、１分間：熱変性
［９８℃、１０秒間；６０℃、５秒間；６８℃、４０秒間］×３５サイクル：ＰＣＲ増幅
［９８℃、１０秒間；６０℃、５秒間；６８℃、４０秒間］×３５サイクル：ＰＣＲ増幅
【0211】
遺伝子特異的プライマーはＷＲＮ＿Ｅｘｏｎ２５＿Ｆｗ及びＷＲＮ＿Ｅｘｏｎ２９＿Ｒｖを使用した。
ＷＲＮ＿Ｅｘｏｎ２５＿Ｆｗ：５’－ＣＴＧＧＣＡＡＧＧＡＴＣＡＡＡＣＡＧＡＧＡＧＴＴＧ－３’
ＷＲＮ＿Ｅｘｏｎ２９＿Ｒｖ：５’－ＣＡＡＴＣＴＧＡＧＴＣＴＣＣＴＧＣＴＣＴＴＧＴＧＣ－３’
ＷＲＮ＿Ｅｘｏｎ２５＿Ｆｗ：５’－ＣＴＧＧＣＡＡＧＧＡＴＣＡＡＡＣＡＧＡＧＡＧＴＴＧ－３’
ＷＲＮ＿Ｅｘｏｎ２９＿Ｒｖ：５’－ＣＡＡＴＣＴＧＡＧＴＣＴＣＣＴＧＣＴＣＴＴＧＴＧＣ－３’
【0212】
上記ＰＣＲ反応の反応物を３％アガロースゲール電気泳動として分離し、ＬＥＤトランスイルミネーターゲルみえーる（Ｗａｋｏ社）とｉＰｈｏｎｅ８(Ａｐｐｌｅ社)を組み合わせた撮影システムにより、ゲル写真を撮影した。
【0213】
上述の方法で求められた、ヒトＷＲＮ ｍＲＮＡ前駆体に対する各一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドによるヒトＷＲＮ遺伝子のエクソン２７のスキッピング活性測定の実験結果を図６に示す。ウェルナー症候群患者線維芽細胞においては、ＷＲＮｃＤＮＡのエクソン２５からエクソン２９の領域を増幅したところ、アンチセンスオリゴヌクレオチドを導入しなかったサンプル（図６中、「無添加」と表記）では３５２塩基対のバンドが得られた。この増幅産物の塩基配列をシークエンスにより決定したところ、このバンドがエクソン２５、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９からなることが示された。この結果は患者の遺伝子解析結果とよく一致していた。
【0214】
一方、アンチセンスオリゴヌクレオチドを添加したウェルナー症候群患者線維芽細胞のｃＤＮＡでは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを導入しない細胞から得られた産物より小さなサイズの産物(２７６塩基対)が得られた。この小さなサイズの増幅産物の塩基配列をシークエンスにより決定したところ、エクソン２５の配列が直接エクソン２８の配列につながっており、エクソン２６とエクソン２７の欠失が判明した。このことは、アンチセンスオリゴヌクレオチド処理によりエクソン２７がスキッピングしたことを示している。
【0215】
ＩｍａｇｅＪ(米国ＮＩＨ)により、エクソン２７がスキップしたＰＣＲ産物「２７６ｂｐ、Ａ」と、及びエクソン２７がスキップしなかったＰＣＲ産物「３５２ｂｐ、Ｂ」を定量した。これら「Ａ」と「Ｂ」の測定値を以下の計算式に従って、以下の式を用いてスキッピング効率（％）を求めた。その結果を表４－１Ａ～４－１Ｆ、表４－２Ａ～４－２Ｄ、表４－３Ａ～４－３Ｄ、表４－４Ａ～４－４Ｄ及び表４－５に示す。
スキッピング効率（％）＝１００×Ａ/（Ａ＋Ｂ）
スキッピング効率（％）＝１００×Ａ/（Ａ＋Ｂ）
【0216】
【表4-1A】
【0217】
【表4-1B】
【0218】
【表4-1C】
【0219】
【表4-1D】
【0220】
【表4-1E】
【0221】
【表4-1F】
【0222】
【表4-2A】
【0223】
【表4-2B】
【0224】
【表4-2C】
【0225】
【表4-2D】
【0226】
【表4-3A】
【0227】
【表4-3B】
【0228】
【表4-3C】
【0229】
【表4-3D】
【0230】
【表4-4A】
【0231】
【表4-4B】
【0232】
【表4-4C】
【0233】
【表4-4D】
【0234】
【表4-5】
【0235】
＜ウェルナー症候群患者線維芽細胞でのアンチセンスオリゴヌクレオチドによる機能的なＷＲＮタンパク質発現の誘導＞
ＷＲＮ遺伝子のｃ.３１３９－１Ｇ＞Ｃのホモ接合体であるウェルナー症候群患者線維芽細胞を用いて、ＷＲＮ遺伝子のエクソン２７スキッピングによる機能的なＷＲＮタンパク質発現の誘導評価を行った。評価の前日に、９６穴プレートにウェルナー症候群患者線維芽細胞（１００００ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件で一晩培養した。その後、ＰＢＳで希釈した配列番号２８の塩基配列からなる一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（終濃度５０ｎＭ）をリポフェクション法にて、上述の細胞にトランスフェクションした。陰性対照群としては、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが溶解していないＰＢＳをトランスフェクションした細胞を用いた。トランスフェクションした細胞を培養培地中で３７℃、５％ＣＯ２の条件で４８時間培養した。その後、細胞を４％ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ（富士フイルム和光純薬社製、Ｃａｔ＃１６３－２０１４５）にて１５分間で固定し、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ（ナカライテスク社製、Ｃａｔ＃１２９６７－４５）で１０分間インキュベートした。続いて、インキュベートした上記細胞を５％ヤギ血清を含有するＰＢＳで１時間ブロッキングし、抗ＷＲＮ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製、Ｃａｔ＃４６６６）溶液中で一晩インキュベートした。さらに抗マウスＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ａ３２７６６）溶液中で、上記細胞を１時間インキュベートした。最後にＨｏｅｃｈｓｔ（登録商標）３３３４２核酸染色（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃Ｈ３５７０）溶液中で１５分間インキュベートし、蛍光顕微鏡で観察した。
ＷＲＮ遺伝子のｃ.３１３９－１Ｇ＞Ｃのホモ接合体であるウェルナー症候群患者線維芽細胞を用いて、ＷＲＮ遺伝子のエクソン２７スキッピングによる機能的なＷＲＮタンパク質発現の誘導評価を行った。評価の前日に、９６穴プレートにウェルナー症候群患者線維芽細胞（１００００ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件で一晩培養した。その後、ＰＢＳで希釈した配列番号２８の塩基配列からなる一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（終濃度５０ｎＭ）をリポフェクション法にて、上述の細胞にトランスフェクションした。陰性対照群としては、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが溶解していないＰＢＳをトランスフェクションした細胞を用いた。トランスフェクションした細胞を培養培地中で３７℃、５％ＣＯ２の条件で４８時間培養した。その後、細胞を４％ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ（富士フイルム和光純薬社製、Ｃａｔ＃１６３－２０１４５）にて１５分間で固定し、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ（ナカライテスク社製、Ｃａｔ＃１２９６７－４５）で１０分間インキュベートした。続いて、インキュベートした上記細胞を５％ヤギ血清を含有するＰＢＳで１時間ブロッキングし、抗ＷＲＮ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製、Ｃａｔ＃４６６６）溶液中で一晩インキュベートした。さらに抗マウスＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ａ３２７６６）溶液中で、上記細胞を１時間インキュベートした。最後にＨｏｅｃｈｓｔ（登録商標）３３３４２核酸染色（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃Ｈ３５７０）溶液中で１５分間インキュベートし、蛍光顕微鏡で観察した。
【0236】
上述の方法で求められた、ヒトＷＲＮ ｍＲＮＡ前駆体に対する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドによるＷＲＮ遺伝子のエクソン２７のスキッピング活性による機能的なＷＲＮタンパク質発現の誘導結果を図７に示す。図７より、配列番号２８の塩基配列からなる一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクションした細胞（図７における「ＡＳＯ：Ｎｏ．２８」）では上記機能的なＷＲＮタンパク質が核内移行していることが分かった。
【0237】
＜ウェルナー症候群患者線維芽細胞でのアンチセンスオリゴヌクレオチドによる細胞増殖の促進＞
ヒトＷＲＮ遺伝子のｃ.３１３９－１Ｇ＞Ｃのホモ接合体であるウェルナー症候群患者線維芽細胞を用いて、ＷＲＮ遺伝子のエクソン２７スキッピングによる細胞増殖能の評価を行った。評価の前日に、９６穴プレートにウェルナー症候群患者線維芽細胞（１２０００ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件で一晩培養した。その後、ＰＢＳで希釈した各一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（終濃度１０ｎＭ）をリポフェクション法にて、上述の細胞にトランスフェクションした。陰性対照群としては、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが溶解していないＰＢＳをトランスフェクションした細胞を用いた。トランスフェクションした細胞を培養培地中で３７℃、５％ＣＯ２の条件で２８８時間培養した。その後、上記増殖培地にＣｅｌｌｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ ２．０ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｃａｔ＃Ｇ９２４２）を添加して細胞数を測定した。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクションした細胞の細胞数「Ａ」と陰性対照群の細胞数「Ｂ」の測定値を以下の計算式に従って、以下の式を用いて細胞増殖率（％）を求めた。その結果を表５に示す。
細胞増殖率（％）＝１００×(Ａ）/Ｂ
ヒトＷＲＮ遺伝子のｃ.３１３９－１Ｇ＞Ｃのホモ接合体であるウェルナー症候群患者線維芽細胞を用いて、ＷＲＮ遺伝子のエクソン２７スキッピングによる細胞増殖能の評価を行った。評価の前日に、９６穴プレートにウェルナー症候群患者線維芽細胞（１２０００ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件で一晩培養した。その後、ＰＢＳで希釈した各一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（終濃度１０ｎＭ）をリポフェクション法にて、上述の細胞にトランスフェクションした。陰性対照群としては、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが溶解していないＰＢＳをトランスフェクションした細胞を用いた。トランスフェクションした細胞を培養培地中で３７℃、５％ＣＯ２の条件で２８８時間培養した。その後、上記増殖培地にＣｅｌｌｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ ２．０ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｃａｔ＃Ｇ９２４２）を添加して細胞数を測定した。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクションした細胞の細胞数「Ａ」と陰性対照群の細胞数「Ｂ」の測定値を以下の計算式に従って、以下の式を用いて細胞増殖率（％）を求めた。その結果を表５に示す。
細胞増殖率（％）＝１００×(Ａ）/Ｂ
【0238】
【表5】
【0239】
≪一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞毒性評価≫
ヒト肝癌由来細胞株であるＨｅｐＧ２細胞を、増殖培地中、３７℃、５％ＣＯ２条件で培養した。増殖培地としては、以下の組成のものを用いた。
ヒト肝癌由来細胞株であるＨｅｐＧ２細胞を、増殖培地中、３７℃、５％ＣＯ２条件で培養した。増殖培地としては、以下の組成のものを用いた。
【0240】
細胞毒性評価に用いた増殖培地の組成
１０％ ＦＢＳ：ＧＩＢＣＯ社製、ＣＡＴ＃１０２７０－１０６
Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ （Ｌ－グルタミン、フェノールレッド含有） （ＧＩＢＣＯ社製、ＣＡＴ＃１１０９５－０８０）
１０％ ＦＢＳ：ＧＩＢＣＯ社製、ＣＡＴ＃１０２７０－１０６
Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ （Ｌ－グルタミン、フェノールレッド含有） （ＧＩＢＣＯ社製、ＣＡＴ＃１１０９５－０８０）
【0241】
実験前日に９６穴プレートに上記細胞（１．５×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を播種した。播種した細胞を３７℃、５％ＣＯ２の条件で一晩培養した後、その後、ＰＢＳで希釈した各一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（終濃度３～３０ｎＭ）をリポフェクション法にて、上述の細胞にトランスフェクションした。添加後、３７℃、５％ＣＯ２の条件で２４時間上記細胞を培養した。陰性対照群としては、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが溶解していないＰＢＳをトランスフェクションした細胞を用いた。その後、上記増殖培地に、Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ ３／７ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｃａｔ＃Ｇ８０９３）を添加してカスパーゼ活性を評価した。上述の方法で求められた、各一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドにおけるカスパーゼ活性を表６に示す。
【0242】
【表6】
【0243】
以上のように本発明の実施形態及び実施例について説明を行なったが、上述の各実施形態及び各実施例の構成を適宜組み合わせることも当初から予定している。
【0244】
今回開示された実施の形態及び実施例はすべての点で例示であって、制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した実施の形態及び実施例ではなく特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味、及び範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】