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特開2024-79669脱エポキシ化エポチロンＢを生産する組換え菌及びその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024079669
(43)【公開日】2024-06-11
(54)【発明の名称】脱エポキシ化エポチロンＢを生産する組換え菌及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 1/21 20060101AFI20240604BHJP
C12P 17/08 20060101ALI20240604BHJP
C12N 15/31 20060101ALN20240604BHJP
C12N 15/52 20060101ALN20240604BHJP
【ＦＩ】
C12N1/21 ZNA
C12P17/08
C12N15/31
C12N15/52 Z
【審査請求】有
【請求項の数】11
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024018206
(22)【出願日】2024-02-08
(62)【分割の表示】P 2022537248の分割
【原出願日】2021-07-23
(31)【優先権主張番号】202010725297.3
(32)【優先日】2020-07-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(71)【出願人】
【識別番号】522239258
【氏名又は名称】北京華昊中天生物医薬股▲ふん▼有限公司
(71)【出願人】
【識別番号】522239269
【氏名又は名称】成都華昊中天薬業有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】唐莉
(72)【発明者】
【氏名】邱栄国
(57)【要約】 （修正有）
【課題】エポチロンのエポキシ化対応物質より毒性がはるかに低い、非エポキシ化の脱エポキシ化エポチロンＢを生産する生産菌株および生産方法を提供する。
【解決手段】組換え菌におけるエポチロン生合成遺伝子クラスター中のｅｐｏＫ遺伝子は不活性化されたものであり、ｅｐｏＫ遺伝子は、相同組換え方法により指向性挿入によって不活性化される、脱エポキシ化エポチロンＢを発酵生産するための組換え菌であるソランギウム・セルロサム（Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ）を提供する。
【選択図】図５
【解決手段】組換え菌におけるエポチロン生合成遺伝子クラスター中のｅｐｏＫ遺伝子は不活性化されたものであり、ｅｐｏＫ遺伝子は、相同組換え方法により指向性挿入によって不活性化される、脱エポキシ化エポチロンＢを発酵生産するための組換え菌であるソランギウム・セルロサム（Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ）を提供する。
【選択図】図５
【特許請求の範囲】
【請求項1】
組換え菌におけるエポチロン生合成遺伝子クラスター中のｅｐｏＫ遺伝子は不活性化されたものである、脱エポキシ化エポチロンＢを発酵生産するための組換え菌であるソランギウム・セルロサム（Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ）。
【請求項2】
前記ｅｐｏＫ遺伝子は、点突然変異、挿入、欠失又は置換によって不活性化される請求項１に記載の組換え菌。
【請求項3】
前記組換え菌は、ソランギウム・セルロサムＳｏ ｃｅ９０（Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ Ｓｏ ｃｅ９０）由来のものである請求項１又は２に記載の組換え菌。
【請求項4】
前記ｅｐｏＫ遺伝子は、挿入によって不活性化され、前記ｅｐｏＫ遺伝子は、ヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１を含み、挿入配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のヌクレオチド基のうちの２９１位から１９６０位である請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の組換え菌。
【請求項5】
前記菌株は、脱エポキシ化エポチロンＢを主要代謝産物として生産する高収量菌株である請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の組換え菌。
【請求項6】
培地中で請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の組換え菌を培養するステップを含む脱エポキシ化エポチロンＢを生産する方法。
【請求項7】
前記培地は、水溶性培地であり、例えば、種培地ＢＣＦは、０．８～１．０％大豆ペプトン、０．５～０．７％フルクトース、０．０５％～０．１％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ及び２５～５０ｍＭのＨＥＰＥＳを含み、ｐＨが７．２～７．６であり、生産発酵培地ＦＢＣＦは、０．６～０．７％大豆ペプトン、０．５～０．７％フルクトース、０．０５～０．１％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ及び微量元素溶液５～１０ｍｇ／Ｌを含み、且つｐＨが７．１±０．３である請求項６に記載の方法。
【請求項8】
生産発酵培地にＸＡＤ－１６樹脂、例えば２％～５％のＸＡＤ－１６樹脂を加えて発酵生産を行うステップを含む請求項６又は７に記載の方法。
【請求項9】
前記発酵過程において１日に回分添加する請求項６から請求項８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
ＰＣカラム及びＣカラムにより脱エポキシ化エポチロンＢを精製するステップをさらに含み、前記精製は６２～８０％メタノール溶液を使用して溶出する請求項６から請求項９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本願は、組換え菌及びその使用に関し、特に、脱エポキシ化エポチロンＢを生産する組換えソランギウム・セルロサム及びその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
エポチロン（Ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）は、土壌微生物によって産生された、チューブリンに作用して抗腫瘍活性を有するマクロライド系抗生素であり、２０世紀の９０年代初頭にまず粘液細菌であるソランギウム・セルロサム（Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ）から分離され、主にＡとＢの２種類の産物があり、その構造は、以下の通りである。
【0003】
ソランギウム・セルロサム由来のエポチロン生合成遺伝子クラスター中の遺伝子に対するクローニング解析から、エポチロンポリケチド合成酵素（ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅｓ）は、アシルコエンザイムＡを単位として重合して微生物の二次代謝産物である脱エポキシ化エポチロンＡ及びＢを２：１の比率で形成し、前記脱エポキシ化エポチロンＡ及びＢは、中間代謝産物として、さらにｅｐｏＫ遺伝子産物－シトクロムＰ４５０酸化酵素の作用によって、最終的にエポキシ型のエポチロンＡ及びＢをそれぞれ形成することが示された。天然産生菌であるソランギウム・セルロサムにおいて、脱エポキシ化エポチロンＡ及びＢは、微量にしか存在せず、最終産物であるエポチロンＡ及びＢの生産量よりはるかに低く、且つ、ソランギウム・セルロサム発酵液中には少なくとも３５種類の他のエポチロン類縁物質（Ｈａｒｄｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎａｔ Ｐｒｏｄ ６４：８４７－８５６，２００１）がさらに存在する。米国のＤａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ研究グループは、脱エポキシ化エポチロンＢに対して化学的全合成試験を成功に行ったが、この全合成過程は、複雑で制御が困難であり、生産量が低く、コストが高いので、その医薬用開発価値を大幅に低下させる。
【0004】
非エポキシ化の脱エポキシ化エポチロンＢは、その毒性がエポチロンのエポキシ化対応物質よりはるかに低いので、脱エポキシ化エポチロンＢの生産量を向上させて臨床治療に使用させるように、脱エポキシ化エポチロンＢを効率的に生産する生産菌株を開発する必要がある。
【0005】
米国特許ＵＳ５８４３７１８及びＵＳ６０３３８８３には、組換え宿主細胞内においてｍｏｄｕｌａｒ ＰＫＳ遺伝子を組換えることにより新規なポリケチド化合物を生産する方法、及び宿主細胞内において例えばストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び粘液細菌（Ｍｙｘｏｂａｃｔｅｒｉａｌ）に異種ＰＫＳ遺伝子を導入してポリケチド化合物を生産するという組換え方法が記載されており、エポチロンを生産できない宿主細胞内において例えばストレプトマイセスＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ及び粘液細菌Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓｘａｎｔｈｕｓに異種エポチロン遺伝子を導入してエポチロンＡ及びＢを生産することが報告されている（Ｔａｎｇ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：６４０－６４２；Ｊｕｌｉｅｎ＆Ｓｈａｈ，２００２，Ａｍｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ａｇｅｎｔ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４６（９）：２７７２－２７７８を参照）。
【発明の概要】
【0006】
第１態様により、脱エポキシ化エポチロンＢを発酵生産するための組換え菌であるソランギウム・セルロサム（Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ）を提供し、前記組換え菌におけるエポチロン生合成遺伝子クラスター中のｅｐｏＫ遺伝子は、不活性化されたものである。
【0007】
いくつかの具体的な実施形態において、前記ｅｐｏＫ遺伝子は、点突然変異、挿入、欠失又は置換によって不活性化される。
【0008】
いくつかの具体的な実施形態において、前記組換え菌は、ソランギウム・セルロサムＳｏ ｃｅ９０（Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ Ｓｏ ｃｅ９０）由来のものである。
【0009】
いくつかの具体的な実施形態において、前記ｅｐｏＫ遺伝子は、挿入によって不活性化され、前記ｅｐｏＫ遺伝子は、ヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１を含み、挿入配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のヌクレオチド基のうちの２９１位から１９６０位である。より具体的に、前記組換え菌は、ソランギウム・セルロサムＢＧ０３－０９Ｋである。
【0010】
本発明に係る組換え遺伝子工学的菌株は、エポチロン生合成遺伝子の改変を含み、改変された遺伝子は、ＤＮＡ組換え技術によって、産生菌の宿主細胞におけるエポチロン生合成遺伝子クラスター中のｅｐｏＫ遺伝子のＤＮＡ配列をＤＮＡ断片の挿入により不活性化させることにより、宿主細胞におけるエポチロン生合成遺伝子を改変させる。
【0011】
本発明に係る組換え菌は、組換え技術により取得されてもよく、この技術は、相同組換え方法により改変すべき遺伝子又は機能性基の隣接する両端領域を自殺ベクターにクローニングして、接合伝達性のプラスミドベクターを得て、自殺ベクターにおける遺伝子と宿主細胞核に含まれるゲノムにおける相同遺伝子とのダブルハイブリダイゼーション組換えを行うことにより、エポチロンの生合成に関与する１つ又は複数の遺伝子又は機能性基が挿入によって不活性化又は置換されて、遺伝子工学的組換え生産菌株を得る。例えば、１つ又は２つの抗生素耐性遺伝子を改変すべき遺伝子の両端領域に挿入し、挿入された抗生素耐性遺伝子の両側のｅｐｏＫ遺伝子相同配列を介して宿主細胞内でＤＮＡ組換えを行うことにより、宿主細胞における野生型の遺伝子を置換し、抗生素耐性遺伝子がｅｐｏＫ基に挿入されてその機能が失われた組換株を得る。このような不活性化作用は、ランダム又は点突然変異、欠失又は置換によって達することもできる。これによって得た組換え生合成遺伝子は、天然産生菌における遺伝子と異なることにより、組換え宿主細胞においてエポチロン誘導体又は中間産物を主要産物として産生し、例えば、エポチロン合成遺伝子を含む宿主細胞は、エポチロンＢを主要産物として産生することができ、その中のエポチロン生合成遺伝子におけるｅｐｏＫ遺伝子ＤＮＡ配列は、他のＤＮＡ配列の挿入によって不活性化されて、この組換え菌株は、脱エポキシ化エポチロンＢを主要産物として生産する。
【0012】
本発明に係る組換え菌、例えばＢＧ０３－０９Ｋは、長期保存が可能であり、且つ安定性能が良好である。例えば、ＢＣＦ培地中で３±１日培養した後のＢＧ０３－０９Ｋ培養液３０～５０ｍＬと９０％～１００％滅菌グリセリン１０～２０ｍＬとを滅菌瓶中で混合し、１～１．５ｍＬの混合液を標識された滅菌細胞凍結保存用チューブに分注して生産菌の細胞バンクを製造し、且つ直ちに－７０℃以下の超低温で冷凍保存し、この菌の長期保存安定性能が良好である。
【0013】
本発明は、組換えソランギウム・セルロサム菌株ＢＧ０３－０９Ｋのハウスキーピング遺伝子に対するＰＣＲ解析及び遺伝子シーケンシング解析（１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、ＥｐｏＤ－ＭＴ機能領域、グリセリンアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子）により菌種の遺伝学的同定を行う。３対のｏｌｉｇｏプライマーを設計してＰＣＲ増幅を行い、且つ得られたＰＣＲ産物に対してＤＮＡシーケンシング及び分析を行う。データベースでＢＧ０３－０９Ｋのハウスキーピング遺伝子の部分配列を比較したところ、ＢＧ０３－０９ＫのＤＮＡ配列とソランギウム・セルロサム（Ｓ．ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ）における当該配列の間の進化距離は、ヌクレオチドレベルであまり違いがないことを見出し、ＢＧ０３－０９Ｋがソランギウム・セルロサム（Ｓ．ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ）と同種であることが証明された。
【0014】
第２態様により、培地中で第１態様に記載の組換えソランギウム・セルロサムを培養するステップを含む脱エポキシ化エポチロンＢを生産する方法を提供する。
【0015】
いくつかの具体的な実施形態において、前記生産方法で使用される培地は、水溶性培地であり、例えば、種培地ＢＣＦは、０．８～１．０％大豆ペプトン、０．５～０．７％フルクトース、０．０５％～０．１％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ及び２５～５０ｍＭのＨＥＰＥＳを含み、ｐＨが７．２～７．６である。生産発酵培地ＦＢＣＦは、０．６～０．７％大豆ペプトン、０．５～０．７％フルクトース、０．０５～０．１％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ及び微量元素溶液５～１０ｍｇ／Ｌを含み、且つｐＨが７．１±０．３である。
【0016】
いくつかの具体的な実施形態において、前記生産方法は、発酵培地にＸＡＤ－１６樹脂、例えば２％～５％のＸＡＤ－１６樹脂を加えて発酵生産を行うステップを含む。
【0017】
いくつかの具体的な実施形態において、前記生産方法の発酵過程において１日に回分添加する。いくつかの具体的な実施形態において、前記生産方法は、ＰＣカラム及びＣカラムにより脱エポキシ化エポチロンＢを精製し、前記精製は、６２～８０％メタノール溶液、例えば６２％、６７％、７２％、７７％、８０％のメタノールで溶出させるステップをさらに含む。
【0018】
より具体的に、脱エポキシ化エポチロンＢ高収量菌株ＢＧ０３－０９Ｋで脱エポキシ化エポチロンＢを発酵生産する具体的な操作は、以下の通りである。
【0019】
－７０℃以下の超低温冷蔵庫で保存した菌種細胞凍結保存用チューブを所定時間培養した後、種培地に接種して培養し、培養の特徴が要件を満足する種液を５±１％の接種率で発酵培地を含む発酵タンクに滅菌接種し、下記のプロセスパラメータに従ってバッチ的添加して１４±２日培養する。
【0020】
発酵培養プロセスパラメータは、培養温度を３４℃とし、その許容範囲が３４±１℃であり、ｐＨを７．１とし、その許容範囲が７．１±０．３であり、酸アルカリ溶液で調整し、溶解酸素の設置値を３０％～５０％に製御し、吸気量及び撹拌回転数により協働的に製御し、消泡剤で泡をフィードバック制御する。発酵過程においてバッチ的添加し、３±１日目の午後から１日に２±１回ずつ補給し、毎回に大豆ペプトン溶液及びフルクトース溶液を補給する。
【0021】
発酵６日目から発酵終了まで、１日毎にサンプリングして含有量を検出するとともに菌体の成長状態及び純粋菌の状況を検鏡する。ＸＡＤ樹脂のメタノール抽出液をＨＰＬＣで検出した後、発酵生産量を分析及び計算する（図１参照）。発酵生産量≧２４０ｍｇ／Ｌであり、５００ｍｇ／Ｌ以上に達することができる。
【0022】
具体的に、前記方法において、種培養及び発酵培養の条件は、好ましくは３４℃であり、その許容範囲が３４±１℃である。
【0023】
具体的に、前記方法において、発酵培養の条件は、ｐＨを７．１とし、その許容範囲を７．１±０．３とすることが好ましい。
【0024】
具体的に、前記方法において、発酵培養の条件は、発酵時間３±１日から１日に２±１回ずつ補給し、大豆ペプトン溶液及びフルクトース溶液を補給することが好ましい。
【0025】
具体的に、前記方法において、発酵培養の条件は、好ましくはバッチ的流加補給により発酵培養時間を１４日±２日まで延長させることにより、より高い生産量を得ることができる。
【0026】
発酵培養終了後、フィード液を１００～２００メッシュの篩にかけてＸＡＤ樹脂と菌体／菌液とを分離し、篩上のＸＡＤを同量の水でリンスした後、ＸＡＤ樹脂カラムに装填し、＞９０％のメタノールでＸＡＤ樹脂を溶出し、製品を含むメタノール溶出液をＸＡＤ溶出液として収集する。
【0027】
ＸＡＤ溶出液を脱脂綿製フィルタに通し、水を加えてメタノール濃度が約５０％±５％（ｖ／ｖ）のサンプル溶液を調製してＰＣカラム（Ｃ１８フィラー）にロードし、６２～８０％メタノール溶液で溶出し、製品成分を収集する。
【0028】
上記のＰＣカラム処理後に基準を満たす収集液に精製水を加えてメタノール濃度が約５０％±５（ｖ／ｖ）のサンプル溶液を調製し、Ｃカラム（Ｃ１８フィラー）にロードし、６２～８０％メタノール溶液で溶出し、製品成分を収集する。Ｃカラム処理後に基準を満たす収集液中の脱エポキシ化エポチロンＢのＨＰＬＣ純度は、９８％に達することができ、その他の単一の不純物のピーク面積は、１．０％を超えてはならず、ＰＣカラム及びＣカラム処理後の総収率は、７０％を超える。
【0029】
前記方法において、Ｃカラム処理後に基準を満たす収集液中の脱エポキシ化エポチロンＢのＨＰＬＣ純度は、９８％に達し、その他の単一の不純物のピーク面積は、１．０％以下である。
【図面の簡単な説明】
【0030】
【図1】ＢＧ０３－０９Ｋ発酵により得られた製品のＨＰＬＣパターンである。ここで、脱エポキシ化エポチロンＡは、４．４分間付近の位置にあり、脱エポキシ化エポチロンＢは、５．１分間付近の位置にある。（分析方法：６５％アセトニトリル：０．１％氷酢酸でアイソクラティック溶出）。
【図2A】ＢＧ０３－０９Ｋ菌株の継代前後の脱エポキシ化エポチロンＢの収率（４１０ｍｇ／Ｌ～４８０ｍｇ／Ｌ）及び不純物成分を分析及び比較する図である。ここで、脱エポキシ化エポチロンＡは、３２分間付近の位置にあり、脱エポキシ化エポチロンＢは、３４分間付近の位置にある。
【図2B】ＢＧ０３－０９Ｋ菌株の継代前後の菌種を３～６日培養した後の菌体の形態を顕微鏡で比較する図である。左の２つの小図は、３日培養した後の新鮮なサンプルを示し、右の２つの小図は、培養液を６日放置した後のサンプルを示す。
【図3】ｅｐｏＫ遺伝子の不活性化領域に挿入されたＤＮＡ配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１を示し、斜体字がｅｐｏＫ遺伝子配列であり、正体字が挿入されたＤＮＡ配列である。
【図4A】発酵後のＸＡＤ溶出液のＨＰＬＣパターンである。
【図4B】Ｃカラム処理後のＨＰＬＣパターンである。ＢＧ０３－０９Ｋ菌株の発酵収集液中の脱エポキシ化エポチロンＢのＨＰＬＣ純度は、９８％に達し、その他の単一の不純物のピーク面積は、１．０％以下である。
【図5】接合伝達性プラスミド（ｐＢＧＳ２－４）の図である。
【発明を実施するための形態】
【0031】
実施例１：ＥｐｏＫ遺伝子が不活性化された遺伝子工学的菌株を構築する
本実施例において、１株のＥｐｏＫ遺伝子が挿入により不活性化された遺伝子工学的菌株及びその構築を説明する。
本実施例において、１株のＥｐｏＫ遺伝子が挿入により不活性化された遺伝子工学的菌株及びその構築を説明する。
【0032】
ＤＮＡ抽出キット（江蘇康為世紀バイオテクノロジー株式会社）でエポチロンを生産する天然野生型菌株であるソランギウム・セルロサムＳｏ ｃｅ９０から総ＤＮＡを製造し、その方法は、文献Ｊａｏｎａ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｌａｓｍｉｄ２８：１５７－１６５を参照する。ＰＣＲ方法によりエポチロン生合成遺伝子クラスター中のＥｐｏＫ遺伝子の両側の隣接する領域のＤＮＡ配列をクローニングし、プライマーは、以下の通りである。ＱＫ－Ｆ，５′－ＧＣＡＡＧＣＴＴＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＡＡＴＣＴＣＧＣ－３′（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）；ＱＫ－Ｒ，５′－ＣＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＡＡＣＧＡＣＧＧＧＴＴＧＡＣＧＡ－３′（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）；ＨＫ－Ｆ，５′－ＣＧＴＣＴＡＧＡＧＴＡＴＡＣＧＴＣＡＣＧＣＧＣＣＡＴＣＧＡＣＣ－３′（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４）、ＨＫ－Ｒ，５′－ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＡＡＡＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣ－３′（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５）。得られた２つのＰＣＲ産物をＡｐｈＩＩ及びＢｌｍｔ抗生素耐性遺伝子（１．６７ｋｂ）の両側に連結して挿入配列を含むｅｐｏＫ遺伝子断片を取得し、この断片を接合伝達性ベクター（ｐＵＣ１８－ｏｒｉＴ、北京北進縁テクノロジー株式会社）に連結してｐＢＧＳ２－４接合伝達性プラスミド（図５におけるＢｌｍｔ及びＡｐｈＩＩの両側の灰色の断片は、ｅｐｏＫ相同ＤＮＡ配列である）を取得した。
【0033】
接合伝達性方法によって、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ１７－１を介して構築されたｐＢＧＳ２－４接合伝達性プラスミドをソランギウム・セルロサムＳｏ ｃｅ９０に導入した。この後、３０μｇ／ｍＬのフレオマイシンを含有するＳ４２固体培地からフレオマイシン耐性菌を採取した。Ｓ４２培地は、０．０５％トリプトン、０．１５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．２％ＨＥＰＥＳ（ＰＨ＝７．４）及び１．２％寒天を含み、高圧滅菌後、Ｓ４２培地１リットルあたり１０ｍＬの濾過滅菌後の１０％ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１ｍＬの６％Ｋ２ＨＰＯ４、１ｍＬのＥＤＴＡ－Ｆｅ／亜硫酸水素ナトリウム溶液、８ｍＬの４０％濾過滅菌後のグルコース、１０ｍＬの５％硫酸アミン及び３５ｍＬの高圧滅菌後の培養液を加えた。約５００個の耐性コロニーをそれぞれ採取してＤＮＡを製造し、プライマーであるＢＧ－Ｋ１：５－ＡＴＣＡＴＡＴＧＡＣＡＣＡＧＧＡＧＣＡＡＧＣＧＡＡＴＣＡＧＡＧＴ－３′（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６）及びＢＫ－Ｒ：５－ＧＡＧＴＴＣＴＡＣＣＧＧＣＡＧＴＧＣＡＡＡＴＣ－３′（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７）によりＰＣＲを行ったところ、約０．５９ｋｂのＰＣＲ産物を得る菌株は、ｅｐｏＫ不活性菌株であり、非不活性菌株からこのＰＣＲ産物が得られない。
【0034】
上記のｅｐｏＫ不活性化のソランギウム・セルロサム組換え菌株を５ｍＬのＢＣＦ種培地（０．８～１．０％大豆ペプトン、０．５～０．７％フルクトース、０．０５％～０．１％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ及び２５～５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２～７．６）を含むガラス試験管に接種した。菌株を３４℃、２００ｒｐｍのシェーカーで４日培養し、その後、５０ｍＬのＦＢＣＦ培地（０．６～０．７％大豆ペプトン、０．５～０．７％フルクトース、０．０５～０．１％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ及び微量元素溶液５～１０ｍｇ／Ｌ、ｐＨが７．１±０．３であり、且つＸＡＤ－１６（Ｒｏｈｍ ＆ Ｈａａｓ）樹脂２～５％を加える）に接種し、７日培養した。培養液からＸＡＤ－１６を収集し、且つ１０ｍＬのメタノールでＸＡＤからエポチロン系代謝産物を溶出した。ＨＰＬＣにより発酵産物を分析し、ＢＧ０３－０９Ｋと命名され、脱エポキシ化エポチロンＢを産生可能な組換え菌を取得し、この菌は、脱エポキシ化エポチロンＡ／Ｂを主代謝産物とし、エポチロンＡ／Ｂを産生することができない（結果を図１に示す）。
【0035】
実施例２：菌株ＢＧ０３－０９Ｋの保存性能
適量のＢＧ０３－０９Ｋ培養液をＳ４２寒天プレートに塗布し、３２℃で８日培養した。その後、このプレートから単一のコロニーを採取し、それぞれ３ｍＬの滅菌ＢＣＦ種培地を含む試験管に接種し、３４℃、２００ｒｐｍのシェーカーで４日培養した。その中の菌体が活発に増殖した試験管を選択して菌体の雑菌の有無を顕微鏡で検出し、且つ５０ｍＬのＢＣＦ種培地（２５０ｍＬの三角フラスコ）に接種し、引き続き３日培養した。菌体の雑菌の有無を顕微鏡で検出した。適量のＢＣＦ培養液と９０％グリセリンとを滅菌瓶中で混合し、１～１．５ｍＬの混合液を標識された滅菌細胞凍結保存用チューブに分注し、且つ直ちに－７０℃以下の超低温で冷凍保存した。
適量のＢＧ０３－０９Ｋ培養液をＳ４２寒天プレートに塗布し、３２℃で８日培養した。その後、このプレートから単一のコロニーを採取し、それぞれ３ｍＬの滅菌ＢＣＦ種培地を含む試験管に接種し、３４℃、２００ｒｐｍのシェーカーで４日培養した。その中の菌体が活発に増殖した試験管を選択して菌体の雑菌の有無を顕微鏡で検出し、且つ５０ｍＬのＢＣＦ種培地（２５０ｍＬの三角フラスコ）に接種し、引き続き３日培養した。菌体の雑菌の有無を顕微鏡で検出した。適量のＢＣＦ培養液と９０％グリセリンとを滅菌瓶中で混合し、１～１．５ｍＬの混合液を標識された滅菌細胞凍結保存用チューブに分注し、且つ直ちに－７０℃以下の超低温で冷凍保存した。
【0036】
－７０℃以下の超低温で長期冷凍保存したＢＧ０３－０９Ｋ菌株及びその継代安定性を調べた。ソランギウム・セルロサムの繁殖周期は、約１６時間である。このため、バッチ的流加補給の発酵培養プロセスにより発酵培養し、細胞凍結保存用チューブから１００Ｌで１４日発酵生産した後にサンプリングして、菌株を３５代継代することができる。細胞凍結保存用チューブから３０ｍＬのＢＣＦ培地中で３０日連続継代培養し（１日に１回接種した）、菌株を４５代継代することができる。ＢＧ０３－０９Ｋ細胞バンクによって、－７０℃以下の超低温で１年以上冷凍保存した凍結保存用チューブ菌株と、ＢＧ０３－０９Ｋの種から１００Ｌで発酵生産した後に収集した菌株又はＢＧ０３－０９Ｋ凍結保存用チューブをＢＣＦ種培地中で３０日連続継代した菌株とを発酵生産で比較した結果から分かるように、ＢＧ０３－０９Ｋ菌株の継代前後の脱エポキシ化エポチロンＢの収率（４１０ｍｇ／Ｌ～４８０ｍｇ／Ｌ）、不純物成分（図２Ａ、分析方法は実施例４と同じである）及び菌体の形態的特徴は、いずれも一致し（図２Ｂ）、ＢＧ０３－０９Ｋ菌株の継代又は長期保存安定性が極めて良好であることが示された。
【0037】
ＢＧ０３－０９Ｋ菌種を超低温で１年以上冷凍保存した元の細胞バンク及び上記の連続継代（３５代、４５代）後の菌種培養液から、菌体ＤＮＡをそれぞれ抽出し、ＮｏｔＩでＤＮＡサンプルを切断して０．８％アガロースゲルで電気泳動した。標準的なプロトコルに従ってゲルを帯電したナイロン膜にブロットした。ブロット及びエポチロン生合成遺伝子クラスターＤＮＡで標識されたプローブに対して分子ハイブリダイゼーションを行って（サザンブロッティング解析）分析した結果から分かるように、すべてのサンプルは、同じＤＮＡ断片パターンを有し、この菌の細胞バンクを－７０℃以下の超低温で冷凍保存又は３５代又はそれ以上連続継代する場合、その微生物の遺伝的性能が相対的に安定し、製品の収率が相対的に安定し、菌種の保存及び生産において復帰突然変異が起こらず、産業化生産用サンプルの一致性を確保することができることが示された。
【0038】
実施例３、ＢＧ０３－０９Ｋ菌株の分子遺伝学的同定
ＢＧ０３－０９Ｋの培養液（１０ｍＬ）を遠心分離して菌体を得た後、速やかに細胞の沈殿を３ｍＬのＳＴＥ（２５％ショ糖、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁させ、その後、０．６ｍＬのＲＬＭ（５％ＳＤＳ、０．５Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、１２５ｍＭ ＥＤＴＡ）を加え、ＤＮＡを鋳型として抽出し、ＯｌｉｇｏプライマーでＰＣＲ増幅を行い、且つＰＣＲ産物をシーケンシング解析し、具体的に以下の通りである。
ＢＧ０３－０９Ｋの培養液（１０ｍＬ）を遠心分離して菌体を得た後、速やかに細胞の沈殿を３ｍＬのＳＴＥ（２５％ショ糖、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁させ、その後、０．６ｍＬのＲＬＭ（５％ＳＤＳ、０．５Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、１２５ｍＭ ＥＤＴＡ）を加え、ＤＮＡを鋳型として抽出し、ＯｌｉｇｏプライマーでＰＣＲ増幅を行い、且つＰＣＲ産物をシーケンシング解析し、具体的に以下の通りである。
【0039】
４．１ ｅｐｏＫ遺伝子の不活性化領域のＤＮＡ配列解析
ＢＧ－Ｋ１及びＢＧ－Ｋ２をプライマーとして、ＢＧ０３－０９ＫのゲノムＤＮＡでＰＣＲを行い、約２．８ｋｂのＰＣＲ断片を取得した後、シーケンシング解析を行い、ｅｐｏＫ遺伝子がＤＮＡ挿入により不活性化されることが証明された。
ＢＧ－Ｋ１：ＡＴＣＡＴＡＴＧＡＣＡＣＡＧＧＡＧＣＡＡＧＣＧＡＡＴＣＡＧＡＧＴ－３′（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６）ＢＧ－Ｋ２：ＣＧＣＣＴＣＧＡＧＧＣＧＡＧＣＡＡＧＧＧＡＣＡＣＣＣＣＧＧＧＧ－３′（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８）
ＢＧ－Ｋ１及びＢＧ－Ｋ２をプライマーとして、ＢＧ０３－０９ＫのゲノムＤＮＡでＰＣＲを行い、約２．８ｋｂのＰＣＲ断片を取得した後、シーケンシング解析を行い、ｅｐｏＫ遺伝子がＤＮＡ挿入により不活性化されることが証明された。
ＢＧ－Ｋ１：ＡＴＣＡＴＡＴＧＡＣＡＣＡＧＧＡＧＣＡＡＧＣＧＡＡＴＣＡＧＡＧＴ－３′（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６）ＢＧ－Ｋ２：ＣＧＣＣＴＣＧＡＧＧＣＧＡＧＣＡＡＧＧＧＡＣＡＣＣＣＣＧＧＧＧ－３′（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８）
【0040】
ＤＮＡ配列解析の結果を図３に示し、ＢＧ０３－０９Ｋ菌株のＥｐｏＫ遺伝子の３４２位のヌクレオチドにＤＮＡ挿入が生じて（挿入配列１．６７ｋｂ）この遺伝子の機能が不活性化されることが確認された。ＢＧ０３－０９Ｋにおけるエポチロン生合成遺伝子ｅｐｏＫ部分配列とデータベース中の野生型ソランギウム・セルロサムｓｏ ｃｅ９０のｅｐｏＫの当該ＤＮＡ配列とを比較したところ、ヌクレオチドレベルでこの２つの菌株間でｅｐｏＫ遺伝子部分のＤＮＡ配列に違いがなく、相同性が１００％であることが示され、ＢＧ０３－０９Ｋにおいて挿入により不活性化される以外にｅｐｏＫ遺伝子断片に他の変異が生じないことが証明された。
【0041】
４．２菌株ＢＧ０３－０９Ｋハウスキーピング遺伝子のＰＣＲ解析及び遺伝子シーケンシング解析
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を選択し、エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）の生合成遺伝子クラスター中の特殊な機能を担う遺伝子であるメチルトランスフェラーゼ（ＭＴ構造ドメイン）及びグリセリンアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を選択して菌種の遺伝学的同定を行った。３対のｏｌｉｇｏプライマーを設計してＰＣＲ増幅を行い、且つ得られたＰＣＲ産物に対してＤＮＡシーケンシング及び分析を行った。
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を選択し、エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）の生合成遺伝子クラスター中の特殊な機能を担う遺伝子であるメチルトランスフェラーゼ（ＭＴ構造ドメイン）及びグリセリンアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を選択して菌種の遺伝学的同定を行った。３対のｏｌｉｇｏプライマーを設計してＰＣＲ増幅を行い、且つ得られたＰＣＲ産物に対してＤＮＡシーケンシング及び分析を行った。
【0042】
４．２．１ １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の増幅は、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のユニバーサルプライマーである２７Ｆ及び１４９５Ｒを使用し、具体的な配列は、以下の通りである。
２７Ｆ：５′－ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ－３′（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９）
１４９５Ｒ：５′－ＣＴＡＣＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡ－３′（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０）
結果：ＰＣＲで得られたＤＮＡ産物（１．４５ｋｂ）に対してシーケンシングを行った結果、ＢＧ０３－０９Ｋ菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列は以下の通りであることが示された。
２７Ｆ：５′－ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ－３′（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９）
１４９５Ｒ：５′－ＣＴＡＣＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡ－３′（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０）
結果：ＰＣＲで得られたＤＮＡ産物（１．４５ｋｂ）に対してシーケンシングを行った結果、ＢＧ０３－０９Ｋ菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列は以下の通りであることが示された。
【0043】
ＣＧＧＣＧＣＧＣＴＴＡＡＣＡＣＡＴＧＣＡＡＧＴＣＧＡＧＣＧＡＧＡＡＡＧＧＧＣＴＴＣＧＧＣＣＣＣＧＧＴＡＡＡＧＣＧＧＣＧＣＡＣＧＧＧＴＧＡＧＴＡＡＣＡＣＧＴＡＧＧＴＡＡＴＣＴＧＣＣＣＣＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＴＴＣＣＧＡＡＡＧＧＡＧＣＧＣＴＡＡＴＡＣＡＧＣＡＴＧＡＧＡＣＣＡＣＧＴＣＴＴＣＧＡＡＡＧＡＧＧＡＴＧＡＧＧＴＣＡＡＡＧＣＣＧＧＣＣＴＣＴＴＣＡＣＧＡＡＡＧＣＴＧＧＣＧＣＣＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＣＴＧＣＧＧＣＣＣＡＴＣＡＧＣＴＡＧＴＴＧＧＴＡＧＧＧＴＡＡＴＧＧＣＣＴＡＣＣＡＡＧＧＣＧＡＡＧＡＣＧＧＧＴＡＧＣＴＧＧＴＣＴＧＡＧＡＧＧＡＴＧＡＴＣＡＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＡＡＣＴＧＡＧＡＣＡＣＧＧＴＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴＧＧＧＧＡＡＴＣＴＴＧＣＧＣＡＡＴＧＧＧＣＧＡＡＡＧＣＣＴＧＡＣＧＣＡＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＴＧＡＧＴＧＡＴＧＡＡＧＧＣＣＴＴＣＧＧＧＴＴＧＴＡＡＡＧＣＴＣＴＧＴＧＧＡＧＧＧＧＧＡＣＧＡＡＴＡＡＧＧＧＴＴＧＧＣＴＡＡＣＡＴＣＣＡＧＣＴＣＧＡＴＧＡＣＧＧＴＡＣＣＣＣＴＴＴＡＧＣＡＡＧＣＡＣＣＧＧＣＴＡＡＣＴＣＴＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＧＡＣＡＧＡＧＧＧＴＧＣＡＡＡＣＧＴＴＧＴＴＣＧＧＡＡＴＴＡＣＴＧＧＧＣＧＴＡＡＡＧＣＧＣＧＴＧＴＡＧＧＣＧＧＴＴＣＧＴＡＡＡＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＡＡＡＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＴＡＡＣＣＣＡＧＧＡＡＧＴＧＣＡＣＴＴＧＡＡＡＣＴＣＡＣＧＡＡＣＴＴＧＡＧＴＣＣＣＧＧＡＧＡＧＧＡＡＧＧＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＧＧＴＧＴＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＴＴＣＧＴＡＧＡＴＡＴＣＧＡＧＡＧＧＡＡＣＡＴＣＧＧＴＧＧＣＧＡＡＧＧＣＧＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＡＣＧＣＧＡＡＡＧＣＧＴＧＧＧＧＡＧＣＡＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＴＡＧＴＣＣＡＣＧＣＣＧＴＡＡＡＣＧＡＴＧＧＧＴＧＣＴＡＧＧＴＧＴＣＧＣＧＧＧＣＴＴＴＧＡＣＴＣＣＴＧＣＧＧＴＧＣＣＧＴＡＧＣＴＡＡＣＧＣＡＴＴＡＡＧＣＡＣＣＣＣＧＣＣＴＧＧＧＧＡＧＴＡＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＧＣＴＡＡＡＡＣＴＣＡＡＡＧＧＡＡＴＴＧＡＣＧＧＧＧＧＣＣＣＧＣＡＣＡＡＧＣＧＧＴＧＧＡＧＣＡＴＧＴＧＧＴＴＣＡＡＴＴＣＧＡＣＧＣＡＡＣＧＣＧＣＡＧＡＡＣＣＴＴＡＣＣＴＧＧＧＣＴＡＧＡＡＡＡＴＧＣＡＧＧＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧＡＡＡＧＡＴＣＧＧＧＧＴＧＣＴＣＴＴＣＧＧＡＧＡＡＣＣＴＧＴＡＧＴＴＡＧＧＴＧＣＴＧＣＡＴＧＧＣＴＧＴＣＧＴＣＡＧＣＴＣＧＴＧＴＣＧＴＧＡＧＡＴＧＴＴＧＧＧＴＴＡＡＧＴＣＣＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣＣＴＡＴＣＧＴＴＡＧＴＴＧＣＣＡＧＣＧＧＴＴＣＧＧＣＣＧＧＧＣＡＣＴＣＴＡＧＣＧＡＧＡＣＴＧＣＣＧＡＴＡＴＴＴＡＡＡＴＣＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＧＧＡＴＧＡＣＧＴＣＡＡＧＴＣＣＴＣＡＴＧＧＣＣＣＴＴＡＴＧＴＣＣＡＧＧＧＣＴＡＣＡＣＡＣＧＴＧＣＴＡＣＡＡＴＧＧＧＣＧＧＴＡＣＡＧＡＣＧＧＴＣＧＣＧＡＡＣＣＣＧＣＧＡＧＧＧＧＡＡＧＣＣＡＡＴＣＣＧＡＡＡＡＡＡＣＣＧＴＣＣＴＣＡＧＴＡＣＧＧＡＴＡＡＧＡＧＴＣＴＧＣＡＡＣＴＣＧＡＣＴＣＴＴＴＧＡＡＧＴＴＧＧＡＡＴＣＧＣＴＡＧＴＡＡＴＣＣＣＴＧＡＴＣＡＧＣＡＧＧＣＡＧＧＧＧＴＧＡＡＴＡＣＧＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＧＴＣＧＡＴＴＧＣＴＣＣＡＧＡＡＧＴＧＧＣＴＧＣＧＣＣＡＡＣＣＣＧＣＡＡＧＧＧＡＧＧＣＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＧＡＧＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１）
【0044】
ＢＧ０３－０９Ｋの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列とデータベースおけるＤＮＡとを比較したところ、ＢＧ０３－０９Ｋの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列と他のソランギウム・セルロサムの配列の間の進化距離の差がヌクレオチドレベルで１％未満であることを見出し、ＢＧ０３－０９Ｋがソランギウム・セルロサムと同じであることが証明された。
【0045】
４．２．２エポチロン生合成遺伝子ｅｐｏＤ中の特殊な機能を担う遺伝子であるメチルトランスフェラーゼ（ＭＴ構造ドメイン）断片
増幅プライマーの配列は、以下の通りである。
増幅プライマーの配列は、以下の通りである。
【0046】
ＭＴＷ－Ｆ：５′－ＧＣＴＧＣＴＣＡＣＣＡＣＧＣＣＧＧＡＡＴ－３′（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２）
ＭＴＷ－Ｒ：５′－ＴＣＡＧＣＧＧＡＧＣＣＡＴＣＧＧＣＣＣ－３′（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３）。
結果：ＰＣＲで得られたＤＮＡ産物（１．２２ｋｂ）に対してシーケンシングを行った結果、ＢＧ０３－０９Ｋ菌種のエポチロン生合成遺伝子中のメチルトランスフェラーゼ（ＭＴ構造ドメイン）の機能遺伝子の配列は以下の通りであることが示された。
ＭＴＷ－Ｒ：５′－ＴＣＡＧＣＧＧＡＧＣＣＡＴＣＧＧＣＣＣ－３′（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３）。
結果：ＰＣＲで得られたＤＮＡ産物（１．２２ｋｂ）に対してシーケンシングを行った結果、ＢＧ０３－０９Ｋ菌種のエポチロン生合成遺伝子中のメチルトランスフェラーゼ（ＭＴ構造ドメイン）の機能遺伝子の配列は以下の通りであることが示された。
【0047】
ＴＣＧＧＡＧＧＣＧＧＣＴＧＡＣＧＧＡＴＣＴＣＣＡＣＧＡＡＣＣＧＧＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＧＴＣＣＡＧＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＡＡＴＣＡＡＧＣＧＧＴＧＡＧＴＧＡＣＡＣＣＴＧＧＣＴＧＴＧＧＧＡＣＧＣＣＧＣＧＣＴＧＧＡＣＧＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＣＣＡＧＡＧＣＧＣＧＡＧＣＧＴＧＣＣＣＧＴＣＧＡＣＣＴＧＧＴＧＣＴＣＧＧＣＡＧＣＴＴＣＣＡＴＧＣＧＡＡＧＴＧＧＧＡＧＧＴＣＡＴＧＧＡＧＣＧＣＣＴＣＧＣＧＣＡＧＧＣＧＴＡＣＡＴＣＡＴＣＧＧＣＡＣＴＣＴＣＣＧＣＡＴＡＴＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＡＧＣＧＴＣＡＣＡＣＧＡＴＡＧＡＣＧＡＧＴＴＧＣＴＣＧＴＣＡＧＧＣＴＴＣＡＡＡＴＣＴＣＴＧＴＣＧＴＣＴＡＣＡＧＧＡＡＧＧＴＣＡＴＣＡＡＧＣＧＡＴＧＧＡＴＧＧＡＡＣＡＣＣＴＴＧＴＣＧＣＧＡＴＣＧＧＣＡＴＣＣＴＴＧＴＡＧＧＧＧＡＣＧＧＡＧＡＧＣＡＴＴＴＴＧＴＧＡＧＣＴＣＴＣＡＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＧＡＧＣＣＴＧＡＴＴＴＧＧＣＧＧＣＧＧＴＧＣＴＣＧＡＧＧＡＧＧＣＣＧＧＧＡＧＧＧＴＧＴＴＣＧＣＣＧＡＣＣＴＣＣＣＡＧＴＣＣＴＡＴＴＴＧＡＧＴＧＧＴＧＣＡＡＧＴＴＴＧＣＣＧＧＧＧＡＡＣＧＧＣＴＣＧＣＧＧＡＣＧＴＡＴＴＧＡＣＣＧＧＴＡＡＧＡＣＧＣＴＣＧＣＧＣＴＣＧＡＧＡＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＴＧＧＴＧＧＣＴＣＧＴＴＣＧＡＴＡＴＧＧＣＧＧＡＧＣＧＡＡＴＣＴＡＴＣＧＡＧＡＴＴＣＧＣＣＣＡＴＣＧＣＣＣＧＴＴＡＣＴＣＧＡＡＣＧＧＣＡＴＣＧＴＧＣＧＣＧＧＴＧＴＣＧＴＣＧＡＧＴＣＧＧＣＧＧＣＧＣＧＧＧＴＧＧＴＡＧＣＡＣＣＧＴＣＧＧＧＡＡＴＧＴＴＣＡＧＣＡＴＣＴＴＧＧＡＧＡＴＣＧＧＡＧＣＡＧＧＧＡＣＧＧＧＣＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＣＣＧＣＣＧＴＣＣＴＣＣＣＧＧＴＧＴＴＧＣＴＧＣＣＴＧＡＣＣＧＧＡＣＧＧＡＧＴＡＣＣＡＴＴＴＣＡＣＣＧＡＴＧＴＴＴＣＴＣＣＧＣＴＣＴＴＣＣＴＴＧＣＴＣＧＣＧＣＧＧＡＧＣＡＡＡＧＡＴＴＴＣＧＡＧＡＴＴＡＴＣＣＡＴＴＣＣＴＧＡＡＧＴＡＴＧＧＣＡＴＴＣＴＧＧＡＴＧＴＣＧＡＣＣＡＧＧＡＧＣＣＡＧＣＴＧＧＣＣＡＧＧＧＡＴＡＣＧＣＡＣＡＴＣＡＧＡＧＧＴＴＴＧＡＣＧＴＣＡＴＣＧＴＣＧＣＧＧＣＣＡＡＴＧＴＣＡＴＣＣＡＴＧＣＧＡＣＣＣＧＣＧＡＴＡＴＡＡＧＡＧＣＣＡＣＧＧＣＧＡＡＧＣＧＴＣＴＣＣＴＧＴＣＧＴＴＧＣＴＣＧＣＧＣＣＣＧＧＡＧＧＣＣＴＴＣＴＧＧＴＧＣＴＧＧＴＣＧＡＧＧＧＣＡＣＡＧＧＧＣＡＴＣＣＧＡＴＣＴＧＧＴＴＣＧＡＴＡＴＣＡＣＣＡＣＧＧＧＡＴＴＧＡＴＴＧＡＧＧＧＧＴＧＧＣＡＧＡＡＧＴＡＣＧＡＡＧＡＴＧＡＴＣＴＴＣＧＴＡＴＣＧＡＣＣＡＴＣＣＧＣＴＣＣＴＧＣＣＴＧＣＴＣＧＧＡＣＣＴＧＧＴＧＴＧＡＣＧＴＣＣＴＧＣＧＣＣＧＧＧＴＡＧＧＣＴＴＴＧＣＧＧＡＣＧＣＣＧＴＧＡＧＴＣＴＧＣＣＡＧＧＣＧＡＣＧＧＡＴＣＴＣＣＧＧＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＧＧＡＣＡＧＣＡＣＧＴＧＡＴＣＣＴＣＴＣＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧＧＧＣＡＴＡＧＣＡＧＧＡＧＣＣＧＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４）
【0048】
データベースにおいてＢＧ０３－０９Ｋにおけるエポチロン生合成遺伝子ｅｐｏＤ遺伝子中の特殊な機能を担う遺伝子であるメチルトランスフェラーゼ（ＭＴ構造ドメイン）遺伝子の部分配列と野生型ソランギウム・セルロサムｓｏ ｃｅ９０の当該ＭＴ構造ドメインＤＮＡ配列とを比較した結果、違いがなく、相同性が１００％であることが示され、ＢＧ０３－０９Ｋがソランギウム・セルロサムｓｏ ｃｅ９０と同種であり、且ついずれもエポチロンを産生することができることが証明された。
【0049】
４．２．３グリセリンアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子断片
増幅プライマー配列は、以下の通りである。
ＧＡＰＤＨ－Ｆ：５′－ＴＣＧＴＧＣＴＣＧＡＧＴＧＣＡＣ－３′（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５）
ＧＡＰＤＨ－Ｒ：５′－ＡＧＡＡＧＣＣＣＣＡＣＴＣＧＴＴ－３′（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６）。
結果：ＰＣＲで得られたＤＮＡ産物（０．７ｋｂ）に対してシーケンシングを行った結果は、以下の通りである。
増幅プライマー配列は、以下の通りである。
ＧＡＰＤＨ－Ｆ：５′－ＴＣＧＴＧＣＴＣＧＡＧＴＧＣＡＣ－３′（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５）
ＧＡＰＤＨ－Ｒ：５′－ＡＧＡＡＧＣＣＣＣＡＣＴＣＧＴＴ－３′（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６）。
結果：ＰＣＲで得られたＤＮＡ産物（０．７ｋｂ）に対してシーケンシングを行った結果は、以下の通りである。
【0050】
ＧＡＰＤＨ部分遺伝子配列は、以下の通りである。
ＡＧＡＡＧＣＣＣＣＡＣＴＣＧＴＴＧＴＣＧＴＡＣＣＡＣＧＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣＧＣＧＡＡＧＣＧＧＴＣＧＣＣＧＡＧＧＡＣＣＧＡＣＧＴＣＡＴＧＧＴＧＧＣＧＴＣＧＡＡＣＧＴＧＣＴＧＧＡＧＧＣＣＧＧＣＧＡＧＣＣＧＡＴＧＡＡＧＴＣＧＣＣＣＧＡＧＡＣＧＡＧＣＴＣＣＣＧＧＴＣＧＧＴＧＴＡＧＴＣＧＡＧＧＡＴＧＴＣＣＴＴＣＡＴＣＧＧＡＣＣＣＴＧＣＴＣＧＧＣＧＧＣＣＴＧＣＴＴＣＡＴＣＧＣＧＧＣＧＴＴＧＡＴＧＣＴＧＴＣＣＴＴＣＧＴＧＡＴＣＧＧＣＴＴＣＴＣＧＧＴＣＴＣＧＡＧＧＧＴＧＡＧＧＴＣＣＡＣＧＡＧＣＧＡＧＡＣＧＴＣＧＡＣＣＧＴＧＧＧＧＡＣＧＣＧＧＡＴＣＧＣＧＡＧＣＣＣＧＴＣＧＡＡＣＴＴＧＣＣＣＴＴＧＡＧＣＧＡＣＧＧＧＡＴＧＡＣＣＴＣＧＧＡＣＡＧＣＧＣＣＴＴＣＧＣＧＧＣＧＣＣＧＧＴＧＣＴＣＧＡＧＧＧＧＡＴＣＡＴＧＴＴＧＡＣＣＧＣＧＧＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＣＡＧＧＴＣＧＣＣＣＴＴＣＣＧＧＴＧＣＧＧＧＡＴＧＴＣＧＡＧＣＡＧＧＴＧＣＴＧＧＴＣＧＴＴＣＧＴＧＴＡＣＧＡＧＴＧＣＡＣＣＧＴＣＧＴＣＡＴＣＡＧＧＣＣＧＣＧＧＡＣＧＡＴＧＣＣＧＡＡＧＴＴＧＴＣＧＡＧＣＡＴＣＡＣＣＴＴＧＧＣＧＡＴＧＧＧＧＧＣＧＡＧＧＣＡＧＴＴＣＧＴＣＧＴＧＣＡＧＧＡＧＣＣＧＣＡＣＧＡＧＡＴＧＡＴＣＧＴＧＴＧＣＴＴＣＴＧＣＧＣＧＴＣＧＴＡＧＡＧＣＴＣＧＴＣＧＴＴＣＡＣＧＣＣＣＡＴＧＡＣＧＡＣＣＧＴＧＡＧＧＴＣＧＴＧＧＣＣＣＴＴＧＧＣＧＧＧＣＧＣＧＣＴＧＡＴＧＡＴＣＡＣＧＣＧＣＴＴＧＧＣＧＣＣＧＧＣＧＴＴＣＡＧＧＴＧＧＣＣＧＧＣＧＧＣＣＴＴＣＧＣＣＴＴＧＴＣＣＧＴＧＡＡＧＡＧＧＣＣＣＧＴＧＣＡＣＴＣＧＡＧＣＡＣＧＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７）
ＡＧＡＡＧＣＣＣＣＡＣＴＣＧＴＴＧＴＣＧＴＡＣＣＡＣＧＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣＧＣＧＡＡＧＣＧＧＴＣＧＣＣＧＡＧＧＡＣＣＧＡＣＧＴＣＡＴＧＧＴＧＧＣＧＴＣＧＡＡＣＧＴＧＣＴＧＧＡＧＧＣＣＧＧＣＧＡＧＣＣＧＡＴＧＡＡＧＴＣＧＣＣＣＧＡＧＡＣＧＡＧＣＴＣＣＣＧＧＴＣＧＧＴＧＴＡＧＴＣＧＡＧＧＡＴＧＴＣＣＴＴＣＡＴＣＧＧＡＣＣＣＴＧＣＴＣＧＧＣＧＧＣＣＴＧＣＴＴＣＡＴＣＧＣＧＧＣＧＴＴＧＡＴＧＣＴＧＴＣＣＴＴＣＧＴＧＡＴＣＧＧＣＴＴＣＴＣＧＧＴＣＴＣＧＡＧＧＧＴＧＡＧＧＴＣＣＡＣＧＡＧＣＧＡＧＡＣＧＴＣＧＡＣＣＧＴＧＧＧＧＡＣＧＣＧＧＡＴＣＧＣＧＡＧＣＣＣＧＴＣＧＡＡＣＴＴＧＣＣＣＴＴＧＡＧＣＧＡＣＧＧＧＡＴＧＡＣＣＴＣＧＧＡＣＡＧＣＧＣＣＴＴＣＧＣＧＧＣＧＣＣＧＧＴＧＣＴＣＧＡＧＧＧＧＡＴＣＡＴＧＴＴＧＡＣＣＧＣＧＧＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＣＡＧＧＴＣＧＣＣＣＴＴＣＣＧＧＴＧＣＧＧＧＡＴＧＴＣＧＡＧＣＡＧＧＴＧＣＴＧＧＴＣＧＴＴＣＧＴＧＴＡＣＧＡＧＴＧＣＡＣＣＧＴＣＧＴＣＡＴＣＡＧＧＣＣＧＣＧＧＡＣＧＡＴＧＣＣＧＡＡＧＴＴＧＴＣＧＡＧＣＡＴＣＡＣＣＴＴＧＧＣＧＡＴＧＧＧＧＧＣＧＡＧＧＣＡＧＴＴＣＧＴＣＧＴＧＣＡＧＧＡＧＣＣＧＣＡＣＧＡＧＡＴＧＡＴＣＧＴＧＴＧＣＴＴＣＴＧＣＧＣＧＴＣＧＴＡＧＡＧＣＴＣＧＴＣＧＴＴＣＡＣＧＣＣＣＡＴＧＡＣＧＡＣＣＧＴＧＡＧＧＴＣＧＴＧＧＣＣＣＴＴＧＧＣＧＧＧＣＧＣＧＣＴＧＡＴＧＡＴＣＡＣＧＣＧＣＴＴＧＧＣＧＣＣＧＧＣＧＴＴＣＡＧＧＴＧＧＣＣＧＧＣＧＧＣＣＴＴＣＧＣＣＴＴＧＴＣＣＧＴＧＡＡＧＡＧＧＣＣＣＧＴＧＣＡＣＴＣＧＡＧＣＡＣＧＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７）
【0051】
グリセリンアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）は、微生物解糖において、ＮＡＤ＋及びリン酸が存在する場合にグリセリンアルデヒド３－リン酸がリン酸化及び酸化されて、１，３－ジリン酸グリセリン酸を形成することを触媒する酵素である。ＢＧ０３－０９ＫのＧＡＰＤＨ遺伝子の部分配列をデータベースで比較したところ（データベースにおいてソランギウム・セルロサムＳｏ ｃｅ９０に対応するデータがない）、当該ＤＮＡ配列とソランギウム・セルロサムｓｏ ０１５７－２又はソランギウム・セルロサムｓｏ ｃｅ５６の当該配列の間の進化距離の差がヌクレオチドレベルでそれぞれ１．７％又は３．０であることを見出し、ＢＧ０３－０９Ｋがソランギウム・セルロサムｓｏ ｃｅ５６と同種であることが証明された。
【0052】
４．３菌株ＢＧ０３－０９Ｋの理化学的特性及び形態学的同定
ソランギウム・セルロサムＢＧ０３－０９Ｋ菌株は、セルロースを唯一の炭素源とし且つ硝酸カリウム（ＫＮＯ３）を唯一の窒素源とする培養条件で成長することができる。ＳＴ２無機塩寒天培地の濾紙の上で（培地の成分は、０．１％ＫＮＯ３、０．１％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１％ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．１％Ｋ２ＨＰＯ４、０．０１％ＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０２％ＦｅＣｌ３、０．００２％酵母エキス、微量元素溶液（北京北進縁テクノロジー株式会社）、１％寒天）、菌株ＢＧ０３－０９Ｋは、濃い赤褐色から濃い褐色の子実体を形成した。この菌株は、液体培地での対数増殖期の栄養菌糸体が棒状であり、位相差顕微鏡で平均長さ３～６μｍ且つ厚さ１μｍの、暗くて広い円形末端付きの円柱状桿菌が観察されたが、１０分間後に、特に液体培養の後期又は発酵生産の前期に菌体が集合してヒマワリ菌塊を形成しやすい。
ソランギウム・セルロサムＢＧ０３－０９Ｋ菌株は、セルロースを唯一の炭素源とし且つ硝酸カリウム（ＫＮＯ３）を唯一の窒素源とする培養条件で成長することができる。ＳＴ２無機塩寒天培地の濾紙の上で（培地の成分は、０．１％ＫＮＯ３、０．１％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１％ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．１％Ｋ２ＨＰＯ４、０．０１％ＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０２％ＦｅＣｌ３、０．００２％酵母エキス、微量元素溶液（北京北進縁テクノロジー株式会社）、１％寒天）、菌株ＢＧ０３－０９Ｋは、濃い赤褐色から濃い褐色の子実体を形成した。この菌株は、液体培地での対数増殖期の栄養菌糸体が棒状であり、位相差顕微鏡で平均長さ３～６μｍ且つ厚さ１μｍの、暗くて広い円形末端付きの円柱状桿菌が観察されたが、１０分間後に、特に液体培養の後期又は発酵生産の前期に菌体が集合してヒマワリ菌塊を形成しやすい。
【0053】
実施例４、遺伝子組換え菌株であるソランギウム・セルロサムＢＧ０３－０９Ｋから脱エポキシ化エポチロンＢを生産する
ステップ１、菌種の蘇生及びフラスコ培養
菌種凍結保存用チューブ１～２本を室温で融解させた後、５０ｍＬＢＣＦ２蘇生培地（グルコース３ｇ／Ｌ、フルクトース３ｇ／Ｌ、酵母粉末５ｇ／Ｌ、ペプトン４ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５ｇ／Ｌを含む）に滅菌接種し、ｐＨ７．４で、３４℃±１℃のシェーカーで４±１日培養し、目視で検査すると、菌液は、霧状を呈すべきであり、菌体は、大量の球状粒子に集合していない。培養の特徴がこの要件を満足する菌液を採取し、約５００ｍＬのＢＣＦ種培地を含む三角フラスコに滅菌接種し、３４℃±１℃で３日±１日培養し、目視で検査すると、菌液は、霧状を呈すべきであり、菌体は、大量の球状粒子に集合しておらず、雑菌汚染がない。
ステップ１、菌種の蘇生及びフラスコ培養
菌種凍結保存用チューブ１～２本を室温で融解させた後、５０ｍＬＢＣＦ２蘇生培地（グルコース３ｇ／Ｌ、フルクトース３ｇ／Ｌ、酵母粉末５ｇ／Ｌ、ペプトン４ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５ｇ／Ｌを含む）に滅菌接種し、ｐＨ７．４で、３４℃±１℃のシェーカーで４±１日培養し、目視で検査すると、菌液は、霧状を呈すべきであり、菌体は、大量の球状粒子に集合していない。培養の特徴がこの要件を満足する菌液を採取し、約５００ｍＬのＢＣＦ種培地を含む三角フラスコに滅菌接種し、３４℃±１℃で３日±１日培養し、目視で検査すると、菌液は、霧状を呈すべきであり、菌体は、大量の球状粒子に集合しておらず、雑菌汚染がない。
【0054】
ステップ２、１段種タンク培養
滅菌条件下で、フラスコ培養終了後のフラスコ中の菌種液を１０±２％の接種率で５Ｌの滅菌ＢＣＦ種培地（０．８～１．０％大豆ペプトン、０．５～０．７％フルクトース、０．０５％～０．１％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）を含む１段種タンクに滅菌接種し、下記のプロセス条件で３日±１日培養した。
滅菌条件下で、フラスコ培養終了後のフラスコ中の菌種液を１０±２％の接種率で５Ｌの滅菌ＢＣＦ種培地（０．８～１．０％大豆ペプトン、０．５～０．７％フルクトース、０．０５％～０．１％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）を含む１段種タンクに滅菌接種し、下記のプロセス条件で３日±１日培養した。
【0055】
１段種培養プロセスパラメータは、培養温度３４±１℃、ｐＨ７．１±０．３、酸アルカリで調整し、溶解酸素の設置値を３０％に製御し、吸気量及び撹拌回転数により協働的に製御した。消泡剤で泡をフィードバック製御した。
【0056】
ステップ３、発酵培養
１段種タンクの種液を５±１％の接種率で９０Ｌ滅菌発酵ＦＢＣＦ培地を含む発酵タンクに滅菌接種し、下記のプロセスパラメータに従って１４±２日培養した後にタンクに入れた。発酵過程においてバッチ的補給を行い、３±１日目から、１日に２±１回ずつ補給し、毎回に大豆ペプトン溶液及びフルクトース溶液を補給した。発酵６日目から発酵終了日（１２～１６日）まで、１日毎にサンプリングして脱エポキシ化エポチロンＢの含有量及び雑菌汚染の有無を検出し、発酵収率＞３００ｍｇ／Ｌである。
１段種タンクの種液を５±１％の接種率で９０Ｌ滅菌発酵ＦＢＣＦ培地を含む発酵タンクに滅菌接種し、下記のプロセスパラメータに従って１４±２日培養した後にタンクに入れた。発酵過程においてバッチ的補給を行い、３±１日目から、１日に２±１回ずつ補給し、毎回に大豆ペプトン溶液及びフルクトース溶液を補給した。発酵６日目から発酵終了日（１２～１６日）まで、１日毎にサンプリングして脱エポキシ化エポチロンＢの含有量及び雑菌汚染の有無を検出し、発酵収率＞３００ｍｇ／Ｌである。
【0057】
発酵培養プロセスパラメータは、培養温度３４±１℃、ｐＨ７．１±０．３、酸アルカリで調整し、ＤＯ製御値を３０％とし、吸気量及び撹拌回転数により協働的に製御し、消泡剤で泡をフィードバック制御した。
【0058】
生産発酵培地の処方ＦＢＣＦは、０．６～０．７％大豆ペプトン、０．５～０．７％フルクトース、０．０５～０．１％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、微量元素溶液（北京北進縁テクノロジー株式会社）５～１０ｍｇ／Ｌを含み、且つこれにＸＡＤ樹脂２～５％を加えた。
【0059】
発酵の収率は、発酵培養液をサンプリングして、ＸＡＤメタノール溶出液でＨＰＬＣ検出を行った。ＨＰＬＣパターンを図４Ａに示し、以下のような分析方法により測定された。
【0060】
ＥＬＳＤ－ＬＣ分析方法：ＨＰＬＣ勾配法、ＤＡＤとＥＬＳＤとを併用して検出した。
【0061】
１．１）クロマトグラフィー条件
液体クロマトグラフィー：Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０型ＨＰＬＣ
流動相Ａ：０．１％氷酢酸
流動相Ｂ：アセトニトリル
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
溶出勾配
カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ ＺＯＲＢＡＸ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｐｌｕｓ Ｃ１８ ４．６＊１５０ｍｍ、５μｍ
カラム温度：３５℃
検出器Ａ：Ａｇｉｌｅｎｔ ＤＡＤ検出器、１９０ｎｍ～４００ｎｍでスキャンした検出器Ｂ：Ａｇｉｌｅｎｔ ＥＬＳＤ検出器、蒸発管やドリフトチューブ温度：５０℃；キャリアガスの流速が１．８Ｌ／ｍｉｎである。
液体クロマトグラフィー：Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０型ＨＰＬＣ
流動相Ａ：０．１％氷酢酸
流動相Ｂ：アセトニトリル
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
溶出勾配
カラム温度：３５℃
検出器Ａ：Ａｇｉｌｅｎｔ ＤＡＤ検出器、１９０ｎｍ～４００ｎｍでスキャンした検出器Ｂ：Ａｇｉｌｅｎｔ ＥＬＳＤ検出器、蒸発管やドリフトチューブ温度：５０℃；キャリアガスの流速が１．８Ｌ／ｍｉｎである。
【0062】
ステップ４：発酵樹脂の収穫及び溶出
発酵培養終了後、フィード液を分離篩にかけてＸＡＤ樹脂及び菌体／菌液を分離した。発酵液中のＸＡＤ樹脂を１００メッシュの篩にかけてリンスした後、ＸＡＤ樹脂カラムに装填してメタノールでＸＡＤ樹脂を溶出し、メタノール溶出液をＸＡＤ溶出液として収集し、ＸＡＤ溶出を完了させた後、サンプリングして含有量をＨＰＬＣで分析した。
発酵培養終了後、フィード液を分離篩にかけてＸＡＤ樹脂及び菌体／菌液を分離した。発酵液中のＸＡＤ樹脂を１００メッシュの篩にかけてリンスした後、ＸＡＤ樹脂カラムに装填してメタノールでＸＡＤ樹脂を溶出し、メタノール溶出液をＸＡＤ溶出液として収集し、ＸＡＤ溶出を完了させた後、サンプリングして含有量をＨＰＬＣで分析した。
【0063】
ステップ５：ＰＣカラムによる前処理
ＸＡＤ溶出液を脱脂綿製フィルタに通し、水を加えてメタノール濃度が約４５％（ｖ／ｖ）のサンプル溶液を調製してＰＣカラム（Ｃ１８フィラー）にロードし、６２～８０％メタノール溶液でアイソクラティック／勾配溶出し、製品成分を収集し、サンプリングして含有量をＨＰＬＣで分析した。
ＸＡＤ溶出液を脱脂綿製フィルタに通し、水を加えてメタノール濃度が約４５％（ｖ／ｖ）のサンプル溶液を調製してＰＣカラム（Ｃ１８フィラー）にロードし、６２～８０％メタノール溶液でアイソクラティック／勾配溶出し、製品成分を収集し、サンプリングして含有量をＨＰＬＣで分析した。
【0064】
ステップ６：Ｃカラムによる分離精製
上記のＰＣカラム処理後に基準を満たす収集液に水を加えてメタノール濃度が約５０％（ｖ／ｖ）のサンプル溶液を調製し、Ｃカラム（Ｃ１８フィラー）にロードし、６２～８０％メタノール溶液でアイソクラティック／勾配溶出し、製品成分を収集した。Ｃカラム処理後に基準を満たす収集液中の脱エポキシ化エポチロンＢのＨＰＬＣ純度は、９８％に達し、その他の単一の不純物のピーク面積は、１．０％以下であり、以下の図４Ｂを参照する。
上記のＰＣカラム処理後に基準を満たす収集液に水を加えてメタノール濃度が約５０％（ｖ／ｖ）のサンプル溶液を調製し、Ｃカラム（Ｃ１８フィラー）にロードし、６２～８０％メタノール溶液でアイソクラティック／勾配溶出し、製品成分を収集した。Ｃカラム処理後に基準を満たす収集液中の脱エポキシ化エポチロンＢのＨＰＬＣ純度は、９８％に達し、その他の単一の不純物のピーク面積は、１．０％以下であり、以下の図４Ｂを参照する。
【0065】
バッチ的流加補給で発酵培養時間を１４日±２日まで延長することにより、より高い生産量を得ることができる。この発酵プロセスを使用する場合、発酵タンクにおいて、補給発酵プロセスによって、ＢＧ０３－０９Ｋによる脱エポキシ化エポチロンの生産量は、５００ｍｇ／Ｌに達することができる。ＰＣカラム及びＣカラムにより処理した後、収集された製品のＨＰＬＣ純度は、９８％以上に達することができる。
【0066】
以上、いくつかの実施形態を参照して本発明を開示したが、本明細書で開示され、添付の特許請求の範囲で提供される本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、修正及び変更を行うことができることは明らかである。なお、本開示におけるすべての実施例は、本発明の実施形態を説明するが、それらは、非限定的な例としてのみ提供されるので、このように説明される本発明の様々な態様を限定するものと見なされるべきではないことを理解されたい。本発明は、本開示、以下の特許請求の範囲及びその任意の均等の態様により限定される範囲のすべてを含む。したがって、図面及び詳細は、例示的であって限定するものではないと見なされるべきである。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3-1】
【図3-2】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-04-08
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
組換え菌におけるエポチロン生合成遺伝子クラスター中のｅｐｏＫ遺伝子は不活性化されたものであり、前記ｅｐｏＫ遺伝子は、相同組換え方法により指向性挿入によって不活性化される、脱エポキシ化エポチロンＢを発酵生産するための組換え菌であるソランギウム・セルロサム（Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ）。
【請求項2】
前記組換え菌は、ソランギウム・セルロサムＳｏ ｃｅ９０（Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ Ｓｏ ｃｅ９０）由来のものである請求項１に記載の組換え菌。
【請求項3】
前記ｅｐｏＫ遺伝子は、ヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１を含み、挿入配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のヌクレオチド基のうちの２９１位から１９６０位である請求項１に記載の組換え菌。
【請求項4】
前記菌株は、脱エポキシ化エポチロンＢを主要代謝産物として生産し、エポチロンＡとエポチロンＢを生産しない高収量菌株である請求項１に記載の組換え菌。
【請求項5】
培地中で請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の組換え菌を培養するステップを含む脱エポキシ化エポチロンＢを生産する方法。
【請求項6】
前記培地は、水溶性培地である請求項５に記載の方法。
【請求項7】
種培地ＢＣＦは、０．８～１．０％大豆ペプトン、０．５～０．７％フルクトース、０．０５％～０．１％ＭｇＳＯ
４
・７Ｈ
２
Ｏ及び２５～５０ｍＭのＨＥＰＥＳを含み、ｐＨが７．２～７．６であり、生産発酵培地ＦＢＣＦは、０．６～０．７％大豆ペプトン、０．５～０．７％フルクトース、０．０５～０．１％ＭｇＳＯ
４
・７Ｈ
２
Ｏ及び微量元素溶液５～１０ｍｇ／Ｌを含み、且つｐＨが７．１±０．３である請求項５に記載の方法。
【請求項8】
生産発酵培地にＸＡＤ－１６樹脂を加えて発酵生産を行うステップを含む請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記ＸＡＤ－１６樹脂は２％～５％のＸＡＤ－１６樹脂である請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記発酵過程において１日に回分添加する請求項５から請求項９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
ＰＣカラム及びＣカラムにより脱エポキシ化エポチロンＢを精製するステップをさらに含み、前記精製は６２～８０％メタノール溶液を使用して溶出する請求項５から請求項９のいずれか１項に記載の方法。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0066】
以上、いくつかの実施形態を参照して本発明を開示したが、本明細書で開示され、添付の特許請求の範囲で提供される本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、修正及び変更を行うことができることは明らかである。なお、本開示におけるすべての実施例は、本発明の実施形態を説明するが、それらは、非限定的な例としてのみ提供されるので、このように説明される本発明の様々な態様を限定するものと見なされるべきではないことを理解されたい。本発明は、本開示、以下の特許請求の範囲及びその任意の均等の態様により限定される範囲のすべてを含む。したがって、図面及び詳細は、例示的であって限定するものではないと見なされるべきである。
＜本発明の更なる実施態様＞
［実施態様１］
組換え菌におけるエポチロン生合成遺伝子クラスター中のｅｐｏＫ遺伝子は不活性化されたものである、脱エポキシ化エポチロンＢを発酵生産するための組換え菌であるソランギウム・セルロサム（Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ）。
［実施態様２］
前記ｅｐｏＫ遺伝子は、点突然変異、挿入、欠失又は置換によって不活性化される実施態様１に記載の組換え菌。
［実施態様３］
前記組換え菌は、ソランギウム・セルロサムＳｏ ｃｅ９０（Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ Ｓｏ ｃｅ９０）由来のものである実施態様１又は２に記載の組換え菌。
［実施態様４］
前記ｅｐｏＫ遺伝子は、挿入によって不活性化され、前記ｅｐｏＫ遺伝子は、ヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１を含み、挿入配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のヌクレオチド基のうちの２９１位から１９６０位である実施態様１から実施態様３のいずれか１に記載の組換え菌。
［実施態様５］
前記菌株は、脱エポキシ化エポチロンＢを主要代謝産物として生産する高収量菌株である実施態様１から実施態様４のいずれか１に記載の組換え菌。
［実施態様６］
培地中で実施態様１から実施態様５のいずれか１に記載の組換え菌を培養するステップを含む脱エポキシ化エポチロンＢを生産する方法。
［実施態様７］
前記培地は、水溶性培地であり、例えば、種培地ＢＣＦは、０．８～１．０％大豆ペプトン、０．５～０．７％フルクトース、０．０５％～０．１％ＭｇＳＯ ４ ・７Ｈ ２ Ｏ及び２５～５０ｍＭのＨＥＰＥＳを含み、ｐＨが７．２～７．６であり、生産発酵培地ＦＢＣＦは、０．６～０．７％大豆ペプトン、０．５～０．７％フルクトース、０．０５～０．１％ＭｇＳＯ ４ ・７Ｈ ２ Ｏ及び微量元素溶液５～１０ｍｇ／Ｌを含み、且つｐＨが７．１±０．３である実施態様６に記載の方法。
［実施態様８］
生産発酵培地にＸＡＤ－１６樹脂、例えば２％～５％のＸＡＤ－１６樹脂を加えて発酵生産を行うステップを含む実施態様６又は７に記載の方法。
［実施態様９］
前記発酵過程において１日に回分添加する実施態様６から実施態様８のいずれか１に記載の方法。
［実施態様１０］
ＰＣカラム及びＣカラムにより脱エポキシ化エポチロンＢを精製するステップをさらに含み、前記精製は６２～８０％メタノール溶液を使用して溶出する実施態様６から実施態様９のいずれか１に記載の方法。
＜配列表＞
SEQUENCE LISTING
<110> BEIJING BIOSTAR PHARMACEUTICALS CO., LTD.
CHENGDU BIOSTAR PHARMACEUTICALS, LTD.
<120> RECOMBINANT BACTERIA FOR PRODUCING DE-EPOXIDIZED EPOTHILONE B AND USE THEREOF
<130> LZ2007456CN07
<150> 2020107252973
<151> 2020-07-24
<160> 17
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2699
<212> DNA
<213> Artificial sequences
<220>
<223> Inactivated EpoK fragment
<400> 1
agccgttcgc gcctgggtac gcggaggacc cgttccccgc gatcgagcgc ctgagagagg 60
caacccccat cttctactgg gatgaaggcc gctcctgggt cctcacccga taccacgacg 120
tgtcggcggt gttccgcgac gaacgcttcg cggtcagtcg agaagagtgg gaatcgagcg 180
cggagtactc gtcggccatt cccgagctca gcgatatgaa gaagtacgga ttgttcgggc 240
tgccgccgga ggatcacgct cgggtccgca agctcgtcaa cccgtcgttt aacaggttgg 300
ctgataagtc cccggtctgg atcgatcccc cgtgacctca ggcggaaaac gggaagacac 360
actcatgaga tgcctgcaag caattcgttc tgtatcaggc gcaggagcgt cccgtccggg 420
tcgaccaaag cggccatcgt gcctccccac tcctgcagtt cgggggcatg gatgcgcgga 480
tagccgctgc tggtttcctg gatgccgacg gatttgcact gccggtagaa ctccgcgagg 540
tcgtccagcc tcaggcagca gctgaaccaa ctcgcgaggg gatcgagccc ggggtgggcg 600
aagaactcca gcatgagatc cccgcgctgg aggatcatcc agccggcgtc ccggaaaacg 660
attccgaagc ccaacctttc atagaaggcg gcggtggaat cgaaatctcg tgatggcagg 720
ttgggcgtcg cttggtcggt catttcgaac cccagagtcc cgctcagaag aactcgtcaa 780
gaaggcgata gaaggcgatg cgctgcgaat cgggagcggc gataccgtaa agcacgagga 840
agcggtcagc ccattcgccg ccaagctctt cagcaatatc acgggtagcc aacgctatgt 900
cctgatagcg gtccgccaca cccagccggc cacagtcgat gaatccagaa aagcggccat 960
tttccaccat gatattcggc aagcaggcat cgccatgggt cacgacgaga tcctcgccgt 1020
cgggcatgcg cgccttgagc ctggcgaaca gttcggctgg cgcgagcccc tgatgctctt 1080
cgtccagatc atcctgatcg acaagaccgg cttccatccg agtacgtgct cgctcgatgc 1140
gatgtttcgc ttggtggtcg aatgggcagg tagccggatc aagcgtatgc agccgccgca 1200
ttgcatcagc catgatggat actttctcgg caggagcaag gtgagatgac aggagatcct 1260
gccccggcac ttcgcccaat agcagccagt cccttcccgc ttcagtgaca acgtcgagca 1320
cagctgcgca aggaacgccc gtcgtggcca gccacgatag ccgcgctgcc tcgtcctgca 1380
gttcattcag ggcaccggac aggtcggtct tgacaaaaag aaccgggcgc ccctgcgctg 1440
acagccggaa cacggcggca tcagagcagc cgattgtctg ttgtgcccag tcatagccga 1500
atagcctctc cacccaagcg gccggagaac ctgcgtgcaa tccatcttgt tcaatcatgc 1560
gaaacgatcc tcatcctgtc tcttgatcag atcttgatcc cctgcgccat cagatccttg 1620
gcggcaagaa agccatccag tttactttgc agggcttccc aaccttacca gagggcgccc 1680
cagctggcaa ttccggttcg cttgctgtcc ataaaaccgc ccagtctagc tatcgccatg 1740
taagcccact gcaagctacc tgctttctct ttgcgcttgc gttttccctt gtccagatag 1800
cccagtagct gacattcatc cggggtcagc accgtttctg cggactggct ttctacgtgt 1860
tccgcttcct ttagcagccc ttgcgccctg agtgcttgcg gcagcgtgaa gctgggctgc 1920
aggaattgat ccagaccggg gacttatcag ccaacctgtt acgtcacgcg ccatcgacct 1980
gctgcgcgcc gaaatacagc gcaccgtcga ccagctgctc gatgctcgct ccggacaaga 2040
ggagttcgac gttgtgcggg attacgcgga gggaatcccg atgcgcgcga tcagcgctct 2100
gttgaaggtt ccggccgagt gtgacgagaa gttccgtcgc ttcggctcgg cgactgcgcg 2160
cgcgctcggc gtgggtttgg tgccccaggt cgatgaggag accaagaccc tggtcgcgtc 2220
cgtcaccgag gggctcgcgc tgctccatga cgtcctcgat gagcggcgca ggaacccgct 2280
cgaaaatgac gtcttgacga tgctgcttca ggccgaggcc gacggcagca ggctgagcac 2340
gaaggagctg gtcgcgctcg tgggtgcgat tatcgctgct ggcaccgata ccacgatcta 2400
ccttatcgcg ttcgctgtgc tcaacctgct gcggtcgccc gaggcgctcg agctggtgaa 2460
ggccgagccc gggctcatga ggaacgcgct cgatgaggtg ctccgcttcg acaatatcct 2520
cagaatagga actgtgcgtt tcgccaggca ggacctggag tactgcgggg catcgatcaa 2580
gaaaggggag atggtctttc tcctgatccc gagcgccctg agagatggga ctgtattctc 2640
caggccagac gtgtttgatg tgcgacggga cacgggcgcg agcctcgcgt acggtagag 2699
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial sequences
<220>
<223> Primer QK-F
<400> 2
gcaagcttca ggatctacaa tctcgc 26
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial sequences
<220>
<223> Primer QK-R
<400> 3
cgtctagatt aaacgacggg ttgacga 27
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial sequences
<220>
<223> Primer HK-F
<400> 4
cgtctagagt atacgtcacg cgccatcgac c 31
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial sequences
<220>
<223> Primer HK-R
<400> 5
cgggatccgg agaaagacca tctcccc 27
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial sequences
<220>
<223> Primer BG-K1
<400> 6
atcatatgac acaggagcaa gcgaatcaga gt 32
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequences
<220>
<223> Primer BK-R
<400> 7
gagttctacc ggcagtgcaa atc 23
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial sequences
<220>
<223> Primer BG-K2
<400> 8
cgcctcgagg cgagcaaggg acaccccggg g 31
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequences
<220>
<223> Primer 27F
<400> 9
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequences
<220>
<223> Primer 1495R
<400> 10
ctacggctac cttgttacga 20
<210> 11
<211> 1451
<212> DNA
<213> Sorangium cellulosum
<220>
<223> 16SrRNA
<400> 11
cggcgcgctt aacacatgca agtcgagcga gaaagggctt cggccccggt aaagcggcgc 60
acgggtgagt aacacgtagg taatctgccc ccaggtggtg gataacgttc cgaaaggagc 120
gctaatacag catgagacca cgtcttcgaa agaggatgag gtcaaagccg gcctcttcac 180
gaaagctggc gccaggggat gagcctgcgg cccatcagct agttggtagg gtaatggcct 240
accaaggcga agacgggtag ctggtctgag aggatgatca gccacactgg aactgagaca 300
cggtccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaatcttg cgcaatgggc gaaagcctga 360
cgcagcgacg ccgcgtgagt gatgaaggcc ttcgggttgt aaagctctgt ggagggggac 420
gaataagggt tggctaacat ccagctcgat gacggtaccc ctttagcaag caccggctaa 480
ctctgtgcca gcagccgcgg taagacagag ggtgcaaacg ttgttcggaa ttactgggcg 540
taaagcgcgt gtaggcggtt cgtaaagtca gatgtgaaag ccctgggctt aacccaggaa 600
gtgcacttga aactcacgaa cttgagtccc ggagaggaag gcggaattct cggtgtagag 660
gtgaaattcg tagatatcga gaggaacatc ggtggcgaag gcggccttct ggacggtgac 720
tgacgctgag acgcgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc 780
cgtaaacgat gggtgctagg tgtcgcgggc tttgactcct gcggtgccgt agctaacgca 840
ttaagcaccc cgcctgggga gtacggccgc aaggctaaaa ctcaaaggaa ttgacggggg 900
cccgcacaag cggtggagca tgtggttcaa ttcgacgcaa cgcgcagaac cttacctggg 960
ctagaaaatg caggaacctg gttgaaagat cggggtgctc ttcggagaac ctgtagttag 1020
gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc 1080
gcaaccccta tcgttagttg ccagcggttc ggccgggcac tctagcgaga ctgccgatat 1140
ttaaatcgga ggaaggtggg gatgacgtca agtcctcatg gcccttatgt ccagggctac 1200
acacgtgcta caatgggcgg tacagacggt cgcgaacccg cgaggggaag ccaatccgaa 1260
aaaaccgtcc tcagtacgga taagagtctg caactcgact ctttgaagtt ggaatcgcta 1320
gtaatccctg atcagcaggc aggggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt 1380
cacaccatgg gagtcgattg ctccagaagt ggctgcgcca acccgcaagg gaggcaggcc 1440
cccaaggagt g 1451
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequences
<220>
<223> Primer MTW-F
<400> 12
gctgctcacc acgccggaat 20
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequences
<220>
<223> Primer MTW-R
<400> 13
tcagcggagc catcggccc 19
<210> 14
<211> 1213
<212> DNA
<213> Sorangium cellulosum
<220>
<223> Methyltransferase MT domain
<400> 14
tcggaggcgg ctgacggatc tccacgaacc ggatctcccg cggtccaggg ctccggtgaa 60
tcaagcggtg agtgacacct ggctgtggga cgccgcgctg gacggtggac ggcgccagag 120
cgcgagcgtg cccgtcgacc tggtgctcgg cagcttccat gcgaagtggg aggtcatgga 180
gcgcctcgcg caggcgtaca tcatcggcac tctccgcata tggaacgtct tctgcgctgc 240
tggagagcgt cacacgatag acgagttgct cgtcaggctt caaatctctg tcgtctacag 300
gaaggtcatc aagcgatgga tggaacacct tgtcgcgatc ggcatccttg taggggacgg 360
agagcatttt gtgagctctc agccgctgcc ggagcctgat ttggcggcgg tgctcgagga 420
ggccgggagg gtgttcgccg acctcccagt cctatttgag tggtgcaagt ttgccgggga 480
acggctcgcg gacgtattga ccggtaagac gctcgcgctc gagatcctct tccctggtgg 540
ctcgttcgat atggcggagc gaatctatcg agattcgccc atcgcccgtt actcgaacgg 600
catcgtgcgc ggtgtcgtcg agtcggcggc gcgggtggta gcaccgtcgg gaatgttcag 660
catcttggag atcggagcag ggacgggcgc gaccaccgcc gccgtcctcc cggtgttgct 720
gcctgaccgg acggagtacc atttcaccga tgtttctccg ctcttccttg ctcgcgcgga 780
gcaaagattt cgagattatc cattcctgaa gtatggcatt ctggatgtcg accaggagcc 840
agctggccag ggatacgcac atcagaggtt tgacgtcatc gtcgcggcca atgtcatcca 900
tgcgacccgc gatataagag ccacggcgaa gcgtctcctg tcgttgctcg cgcccggagg 960
ccttctggtg ctggtcgagg gcacagggca tccgatctgg ttcgatatca ccacgggatt 1020
gattgagggg tggcagaagt acgaagatga tcttcgtatc gaccatccgc tcctgcctgc 1080
tcggacctgg tgtgacgtcc tgcgccgggt aggctttgcg gacgccgtga gtctgccagg 1140
cgacggatct ccggcgggga tcctcggaca gcacgtgatc ctctcgcgcg cgccgggcat 1200
agcaggagcc gct 1213
<210> 15
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequences
<220>
<223> Primer GAPDH-F
<400> 15
tcgtgctcga gtgcac 16
<210> 16
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequences
<220>
<223> Primer GAPDH-R
<400> 16
agaagcccca ctcgtt 16
<210> 17
<211> 693
<212> DNA
<213> Sorangium cellulosum
<220>
<223> GAPDH sequence
<400> 17
agaagcccca ctcgttgtcg taccacgaga agatcttcgc gaagcggtcg ccgaggaccg 60
acgtcatggt ggcgtcgaac gtgctggagg ccggcgagcc gatgaagtcg cccgagacga 120
gctcccggtc ggtgtagtcg aggatgtcct tcatcggacc ctgctcggcg gcctgcttca 180
tcgcggcgtt gatgctgtcc ttcgtgatcg gcttctcggt ctcgagggtg aggtccacga 240
gcgagacgtc gaccgtgggg acgcggatcg cgagcccgtc gaacttgccc ttgagcgacg 300
ggatgacctc ggacagcgcc ttcgcggcgc cggtgctcga ggggatcatg ttgaccgcgg 360
cggcgcgcgc gcggcgcagg tcgcccttcc ggtgcgggat gtcgagcagg tgctggtcgt 420
tcgtgtacga gtgcaccgtc gtcatcaggc cgcggacgat gccgaagttg tcgagcatca 480
ccttggcgat gggggcgagg cagttcgtcg tgcaggagcc gcacgagatg atcgtgtgct 540
tctgcgcgtc gtagagctcg tcgttcacgc ccatgacgac cgtgaggtcg tggcccttgg 600
cgggcgcgct gatgatcacg cgcttggcgc cggcgttcag gtggccggcg gccttcgcct 660
tgtccgtgaa gaggcccgtg cactcgagca cga 693
＜本発明の更なる実施態様＞
［実施態様１］
組換え菌におけるエポチロン生合成遺伝子クラスター中のｅｐｏＫ遺伝子は不活性化されたものである、脱エポキシ化エポチロンＢを発酵生産するための組換え菌であるソランギウム・セルロサム（Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ）。
［実施態様２］
前記ｅｐｏＫ遺伝子は、点突然変異、挿入、欠失又は置換によって不活性化される実施態様１に記載の組換え菌。
［実施態様３］
前記組換え菌は、ソランギウム・セルロサムＳｏ ｃｅ９０（Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ Ｓｏ ｃｅ９０）由来のものである実施態様１又は２に記載の組換え菌。
［実施態様４］
前記ｅｐｏＫ遺伝子は、挿入によって不活性化され、前記ｅｐｏＫ遺伝子は、ヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１を含み、挿入配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のヌクレオチド基のうちの２９１位から１９６０位である実施態様１から実施態様３のいずれか１に記載の組換え菌。
［実施態様５］
前記菌株は、脱エポキシ化エポチロンＢを主要代謝産物として生産する高収量菌株である実施態様１から実施態様４のいずれか１に記載の組換え菌。
［実施態様６］
培地中で実施態様１から実施態様５のいずれか１に記載の組換え菌を培養するステップを含む脱エポキシ化エポチロンＢを生産する方法。
［実施態様７］
前記培地は、水溶性培地であり、例えば、種培地ＢＣＦは、０．８～１．０％大豆ペプトン、０．５～０．７％フルクトース、０．０５％～０．１％ＭｇＳＯ ４ ・７Ｈ ２ Ｏ及び２５～５０ｍＭのＨＥＰＥＳを含み、ｐＨが７．２～７．６であり、生産発酵培地ＦＢＣＦは、０．６～０．７％大豆ペプトン、０．５～０．７％フルクトース、０．０５～０．１％ＭｇＳＯ ４ ・７Ｈ ２ Ｏ及び微量元素溶液５～１０ｍｇ／Ｌを含み、且つｐＨが７．１±０．３である実施態様６に記載の方法。
［実施態様８］
生産発酵培地にＸＡＤ－１６樹脂、例えば２％～５％のＸＡＤ－１６樹脂を加えて発酵生産を行うステップを含む実施態様６又は７に記載の方法。
［実施態様９］
前記発酵過程において１日に回分添加する実施態様６から実施態様８のいずれか１に記載の方法。
［実施態様１０］
ＰＣカラム及びＣカラムにより脱エポキシ化エポチロンＢを精製するステップをさらに含み、前記精製は６２～８０％メタノール溶液を使用して溶出する実施態様６から実施態様９のいずれか１に記載の方法。
＜配列表＞
SEQUENCE LISTING
<110> BEIJING BIOSTAR PHARMACEUTICALS CO., LTD.
CHENGDU BIOSTAR PHARMACEUTICALS, LTD.
<120> RECOMBINANT BACTERIA FOR PRODUCING DE-EPOXIDIZED EPOTHILONE B AND USE THEREOF
<130> LZ2007456CN07
<150> 2020107252973
<151> 2020-07-24
<160> 17
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2699
<212> DNA
<213> Artificial sequences
<220>
<223> Inactivated EpoK fragment
<400> 1
agccgttcgc gcctgggtac gcggaggacc cgttccccgc gatcgagcgc ctgagagagg 60
caacccccat cttctactgg gatgaaggcc gctcctgggt cctcacccga taccacgacg 120
tgtcggcggt gttccgcgac gaacgcttcg cggtcagtcg agaagagtgg gaatcgagcg 180
cggagtactc gtcggccatt cccgagctca gcgatatgaa gaagtacgga ttgttcgggc 240
tgccgccgga ggatcacgct cgggtccgca agctcgtcaa cccgtcgttt aacaggttgg 300
ctgataagtc cccggtctgg atcgatcccc cgtgacctca ggcggaaaac gggaagacac 360
actcatgaga tgcctgcaag caattcgttc tgtatcaggc gcaggagcgt cccgtccggg 420
tcgaccaaag cggccatcgt gcctccccac tcctgcagtt cgggggcatg gatgcgcgga 480
tagccgctgc tggtttcctg gatgccgacg gatttgcact gccggtagaa ctccgcgagg 540
tcgtccagcc tcaggcagca gctgaaccaa ctcgcgaggg gatcgagccc ggggtgggcg 600
aagaactcca gcatgagatc cccgcgctgg aggatcatcc agccggcgtc ccggaaaacg 660
attccgaagc ccaacctttc atagaaggcg gcggtggaat cgaaatctcg tgatggcagg 720
ttgggcgtcg cttggtcggt catttcgaac cccagagtcc cgctcagaag aactcgtcaa 780
gaaggcgata gaaggcgatg cgctgcgaat cgggagcggc gataccgtaa agcacgagga 840
agcggtcagc ccattcgccg ccaagctctt cagcaatatc acgggtagcc aacgctatgt 900
cctgatagcg gtccgccaca cccagccggc cacagtcgat gaatccagaa aagcggccat 960
tttccaccat gatattcggc aagcaggcat cgccatgggt cacgacgaga tcctcgccgt 1020
cgggcatgcg cgccttgagc ctggcgaaca gttcggctgg cgcgagcccc tgatgctctt 1080
cgtccagatc atcctgatcg acaagaccgg cttccatccg agtacgtgct cgctcgatgc 1140
gatgtttcgc ttggtggtcg aatgggcagg tagccggatc aagcgtatgc agccgccgca 1200
ttgcatcagc catgatggat actttctcgg caggagcaag gtgagatgac aggagatcct 1260
gccccggcac ttcgcccaat agcagccagt cccttcccgc ttcagtgaca acgtcgagca 1320
cagctgcgca aggaacgccc gtcgtggcca gccacgatag ccgcgctgcc tcgtcctgca 1380
gttcattcag ggcaccggac aggtcggtct tgacaaaaag aaccgggcgc ccctgcgctg 1440
acagccggaa cacggcggca tcagagcagc cgattgtctg ttgtgcccag tcatagccga 1500
atagcctctc cacccaagcg gccggagaac ctgcgtgcaa tccatcttgt tcaatcatgc 1560
gaaacgatcc tcatcctgtc tcttgatcag atcttgatcc cctgcgccat cagatccttg 1620
gcggcaagaa agccatccag tttactttgc agggcttccc aaccttacca gagggcgccc 1680
cagctggcaa ttccggttcg cttgctgtcc ataaaaccgc ccagtctagc tatcgccatg 1740
taagcccact gcaagctacc tgctttctct ttgcgcttgc gttttccctt gtccagatag 1800
cccagtagct gacattcatc cggggtcagc accgtttctg cggactggct ttctacgtgt 1860
tccgcttcct ttagcagccc ttgcgccctg agtgcttgcg gcagcgtgaa gctgggctgc 1920
aggaattgat ccagaccggg gacttatcag ccaacctgtt acgtcacgcg ccatcgacct 1980
gctgcgcgcc gaaatacagc gcaccgtcga ccagctgctc gatgctcgct ccggacaaga 2040
ggagttcgac gttgtgcggg attacgcgga gggaatcccg atgcgcgcga tcagcgctct 2100
gttgaaggtt ccggccgagt gtgacgagaa gttccgtcgc ttcggctcgg cgactgcgcg 2160
cgcgctcggc gtgggtttgg tgccccaggt cgatgaggag accaagaccc tggtcgcgtc 2220
cgtcaccgag gggctcgcgc tgctccatga cgtcctcgat gagcggcgca ggaacccgct 2280
cgaaaatgac gtcttgacga tgctgcttca ggccgaggcc gacggcagca ggctgagcac 2340
gaaggagctg gtcgcgctcg tgggtgcgat tatcgctgct ggcaccgata ccacgatcta 2400
ccttatcgcg ttcgctgtgc tcaacctgct gcggtcgccc gaggcgctcg agctggtgaa 2460
ggccgagccc gggctcatga ggaacgcgct cgatgaggtg ctccgcttcg acaatatcct 2520
cagaatagga actgtgcgtt tcgccaggca ggacctggag tactgcgggg catcgatcaa 2580
gaaaggggag atggtctttc tcctgatccc gagcgccctg agagatggga ctgtattctc 2640
caggccagac gtgtttgatg tgcgacggga cacgggcgcg agcctcgcgt acggtagag 2699
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial sequences
<220>
<223> Primer QK-F
<400> 2
gcaagcttca ggatctacaa tctcgc 26
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial sequences
<220>
<223> Primer QK-R
<400> 3
cgtctagatt aaacgacggg ttgacga 27
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial sequences
<220>
<223> Primer HK-F
<400> 4
cgtctagagt atacgtcacg cgccatcgac c 31
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial sequences
<220>
<223> Primer HK-R
<400> 5
cgggatccgg agaaagacca tctcccc 27
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial sequences
<220>
<223> Primer BG-K1
<400> 6
atcatatgac acaggagcaa gcgaatcaga gt 32
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequences
<220>
<223> Primer BK-R
<400> 7
gagttctacc ggcagtgcaa atc 23
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial sequences
<220>
<223> Primer BG-K2
<400> 8
cgcctcgagg cgagcaaggg acaccccggg g 31
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequences
<220>
<223> Primer 27F
<400> 9
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequences
<220>
<223> Primer 1495R
<400> 10
ctacggctac cttgttacga 20
<210> 11
<211> 1451
<212> DNA
<213> Sorangium cellulosum
<220>
<223> 16SrRNA
<400> 11
cggcgcgctt aacacatgca agtcgagcga gaaagggctt cggccccggt aaagcggcgc 60
acgggtgagt aacacgtagg taatctgccc ccaggtggtg gataacgttc cgaaaggagc 120
gctaatacag catgagacca cgtcttcgaa agaggatgag gtcaaagccg gcctcttcac 180
gaaagctggc gccaggggat gagcctgcgg cccatcagct agttggtagg gtaatggcct 240
accaaggcga agacgggtag ctggtctgag aggatgatca gccacactgg aactgagaca 300
cggtccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaatcttg cgcaatgggc gaaagcctga 360
cgcagcgacg ccgcgtgagt gatgaaggcc ttcgggttgt aaagctctgt ggagggggac 420
gaataagggt tggctaacat ccagctcgat gacggtaccc ctttagcaag caccggctaa 480
ctctgtgcca gcagccgcgg taagacagag ggtgcaaacg ttgttcggaa ttactgggcg 540
taaagcgcgt gtaggcggtt cgtaaagtca gatgtgaaag ccctgggctt aacccaggaa 600
gtgcacttga aactcacgaa cttgagtccc ggagaggaag gcggaattct cggtgtagag 660
gtgaaattcg tagatatcga gaggaacatc ggtggcgaag gcggccttct ggacggtgac 720
tgacgctgag acgcgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc 780
cgtaaacgat gggtgctagg tgtcgcgggc tttgactcct gcggtgccgt agctaacgca 840
ttaagcaccc cgcctgggga gtacggccgc aaggctaaaa ctcaaaggaa ttgacggggg 900
cccgcacaag cggtggagca tgtggttcaa ttcgacgcaa cgcgcagaac cttacctggg 960
ctagaaaatg caggaacctg gttgaaagat cggggtgctc ttcggagaac ctgtagttag 1020
gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc 1080
gcaaccccta tcgttagttg ccagcggttc ggccgggcac tctagcgaga ctgccgatat 1140
ttaaatcgga ggaaggtggg gatgacgtca agtcctcatg gcccttatgt ccagggctac 1200
acacgtgcta caatgggcgg tacagacggt cgcgaacccg cgaggggaag ccaatccgaa 1260
aaaaccgtcc tcagtacgga taagagtctg caactcgact ctttgaagtt ggaatcgcta 1320
gtaatccctg atcagcaggc aggggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt 1380
cacaccatgg gagtcgattg ctccagaagt ggctgcgcca acccgcaagg gaggcaggcc 1440
cccaaggagt g 1451
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequences
<220>
<223> Primer MTW-F
<400> 12
gctgctcacc acgccggaat 20
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequences
<220>
<223> Primer MTW-R
<400> 13
tcagcggagc catcggccc 19
<210> 14
<211> 1213
<212> DNA
<213> Sorangium cellulosum
<220>
<223> Methyltransferase MT domain
<400> 14
tcggaggcgg ctgacggatc tccacgaacc ggatctcccg cggtccaggg ctccggtgaa 60
tcaagcggtg agtgacacct ggctgtggga cgccgcgctg gacggtggac ggcgccagag 120
cgcgagcgtg cccgtcgacc tggtgctcgg cagcttccat gcgaagtggg aggtcatgga 180
gcgcctcgcg caggcgtaca tcatcggcac tctccgcata tggaacgtct tctgcgctgc 240
tggagagcgt cacacgatag acgagttgct cgtcaggctt caaatctctg tcgtctacag 300
gaaggtcatc aagcgatgga tggaacacct tgtcgcgatc ggcatccttg taggggacgg 360
agagcatttt gtgagctctc agccgctgcc ggagcctgat ttggcggcgg tgctcgagga 420
ggccgggagg gtgttcgccg acctcccagt cctatttgag tggtgcaagt ttgccgggga 480
acggctcgcg gacgtattga ccggtaagac gctcgcgctc gagatcctct tccctggtgg 540
ctcgttcgat atggcggagc gaatctatcg agattcgccc atcgcccgtt actcgaacgg 600
catcgtgcgc ggtgtcgtcg agtcggcggc gcgggtggta gcaccgtcgg gaatgttcag 660
catcttggag atcggagcag ggacgggcgc gaccaccgcc gccgtcctcc cggtgttgct 720
gcctgaccgg acggagtacc atttcaccga tgtttctccg ctcttccttg ctcgcgcgga 780
gcaaagattt cgagattatc cattcctgaa gtatggcatt ctggatgtcg accaggagcc 840
agctggccag ggatacgcac atcagaggtt tgacgtcatc gtcgcggcca atgtcatcca 900
tgcgacccgc gatataagag ccacggcgaa gcgtctcctg tcgttgctcg cgcccggagg 960
ccttctggtg ctggtcgagg gcacagggca tccgatctgg ttcgatatca ccacgggatt 1020
gattgagggg tggcagaagt acgaagatga tcttcgtatc gaccatccgc tcctgcctgc 1080
tcggacctgg tgtgacgtcc tgcgccgggt aggctttgcg gacgccgtga gtctgccagg 1140
cgacggatct ccggcgggga tcctcggaca gcacgtgatc ctctcgcgcg cgccgggcat 1200
agcaggagcc gct 1213
<210> 15
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequences
<220>
<223> Primer GAPDH-F
<400> 15
tcgtgctcga gtgcac 16
<210> 16
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequences
<220>
<223> Primer GAPDH-R
<400> 16
agaagcccca ctcgtt 16
<210> 17
<211> 693
<212> DNA
<213> Sorangium cellulosum
<220>
<223> GAPDH sequence
<400> 17
agaagcccca ctcgttgtcg taccacgaga agatcttcgc gaagcggtcg ccgaggaccg 60
acgtcatggt ggcgtcgaac gtgctggagg ccggcgagcc gatgaagtcg cccgagacga 120
gctcccggtc ggtgtagtcg aggatgtcct tcatcggacc ctgctcggcg gcctgcttca 180
tcgcggcgtt gatgctgtcc ttcgtgatcg gcttctcggt ctcgagggtg aggtccacga 240
gcgagacgtc gaccgtgggg acgcggatcg cgagcccgtc gaacttgccc ttgagcgacg 300
ggatgacctc ggacagcgcc ttcgcggcgc cggtgctcga ggggatcatg ttgaccgcgg 360
cggcgcgcgc gcggcgcagg tcgcccttcc ggtgcgggat gtcgagcagg tgctggtcgt 420
tcgtgtacga gtgcaccgtc gtcatcaggc cgcggacgat gccgaagttg tcgagcatca 480
ccttggcgat gggggcgagg cagttcgtcg tgcaggagcc gcacgagatg atcgtgtgct 540
tctgcgcgtc gtagagctcg tcgttcacgc ccatgacgac cgtgaggtcg tggcccttgg 600
cgggcgcgct gatgatcacg cgcttggcgc cggcgttcag gtggccggcg gccttcgcct 660
tgtccgtgaa gaggcccgtg cactcgagca cga 693
【外国語明細書】