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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024079677
(43)【公開日】2024-06-11
(54)【発明の名称】医療用の変異体アスパラギナーゼポリペプチド
(51)【国際特許分類】
C12N 9/82 20060101AFI20240604BHJP
C12N 15/55 20060101ALN20240604BHJP
C12N 15/31 20060101ALN20240604BHJP
【ＦＩ】
C12N9/82 ZNA
C12N15/55
C12N15/31
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024026564
(22)【出願日】2024-02-26
(62)【分割の表示】P 2020556768の分割
【原出願日】2019-04-18
(31)【優先権主張番号】62/660,189
(32)【優先日】2018-04-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】516001834
【氏名又は名称】エランコ・ユーエス・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】Ｅｌａｎｃｏ ＵＳ Ｉｎｃ．
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】チャン， ハンチュン
(72)【発明者】
【氏名】グェン， ラム
(72)【発明者】
【氏名】チン， リチャード
(72)【発明者】
【氏名】リー， シー ジアン
(57)【要約】 （修正有）
【課題】増強された安定性、薬力学、及び／又は低下した免疫原性を有する変異体アスパラギナーゼポリペプチドに関連する様々な実施態様を提供する。
【解決手段】少なくとも一つのシステイン置換を含む変異体エルウィニア・クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ（Ｅ．ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）・アスパラギナーゼポリペプチドを提供する。変異体アスパラギナーゼポリペプチドは、ヒト、イヌ、ネコ、及びウマを含む哺乳動物の治療薬として使用することができる。
【選択図】図４
【解決手段】少なくとも一つのシステイン置換を含む変異体エルウィニア・クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ（Ｅ．ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）・アスパラギナーゼポリペプチドを提供する。変異体アスパラギナーゼポリペプチドは、ヒト、イヌ、ネコ、及びウマを含む哺乳動物の治療薬として使用することができる。
【選択図】図４
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも一つのシステイン置換を含む変異体エルウィニア・クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ（Ｅ．ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）・アスパラギナーゼポリペプチド。
【請求項2】
少なくとも一つのＰＥＧ結合可能アミノ酸置換を含む変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチドであって、ＰＥＧに結合したとき、対応する野生型Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチドと比較して免疫原性が低いか、あるいは抗原性が低い、変異体ポリペプチド。
【請求項3】
対応する野生型Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチドの免疫原性又は抗原性部位又はその空間的に近くのアミノ酸位置に少なくとも一つのＰＥＧ結合可能アミノ酸置換を含む変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
【請求項4】
少なくとも一つのシステイン又は少なくとも一つのＰＥＧ結合可能アミノ酸が表面に露出している、請求項１から３の何れか一項に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
【請求項5】
野生型アスパラギナーゼポリペプチドの免疫原性又は抗原性部位が、ヒト又はコンパニオンアニマル種において免疫応答を誘発する、請求項３又は４に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
【請求項6】
コンパニオンアニマル種がイヌ、ネコ、又はウマである、請求項５に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
【請求項7】
少なくとも一つのアミノ酸置換を含み、置換された該アミノ酸が表面に露出している、変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
【請求項8】
変異体ポリペプチドがリーダー配列を欠いている、請求項１から７の何れか一項に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
【請求項9】
標準的タンパク質モデリングソフトウェアによって決定して、少なくとも一つのシステイン、少なくとも一つのアミノ酸、又は少なくとも一つのＰＥＧ結合可能アミノ酸の３０％以上が表面に露出している、請求項１から８の何れか一項に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
【請求項10】
標準的タンパク質モデリングソフトウェアによって決定して、少なくとも一つのシステイン、少なくとも一つのアミノ酸、又は少なくとも一つのＰＥＧ結合可能アミノ酸の３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上が表面に露出している、請求項１から９の何れか一項に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
【請求項11】
少なくとも一つのＰＥＧ結合可能アミノ酸又は少なくとも一つのアミノ酸が、システイン、リジン、又はＰＥＧ結合可能アミノ酸誘導体である、請求項２から１０の何れか一項に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
【請求項12】
少なくとも一つのシステイン、少なくとも一つのアミノ酸、又は少なくとも一つのＰＥＧ結合可能アミノ酸が、三次元タンパク質構造分析によって決定して、免疫原性又は抗原部位から３５オングストローム（Å）以下である、請求項１から１１の何れか一項に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
【請求項13】
少なくとも一つのシステイン、少なくとも一つのアミノ酸、又は少なくとも一つのＰＥＧ結合可能アミノ酸が、三次元タンパク質構造解析によって決定して、免疫原性又は抗原部位から３０Å以下、２５Å以下、２０Å以下、１５Å以下、１０Å以下、又は５Å以下である、請求項１から１２の何れか一項に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
【請求項14】
配列番号：２など、野生型アスパラギナーゼアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１から１３の何れか一項に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
【請求項15】
野生型Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチドが配列番号：２のアミノ酸配列を含む、請求項２から６及び８から１４の何れか一項に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
【請求項16】
免疫原性又は抗原性部位が、配列番号：２のアミノ酸位置４１、７２、２６５、又は２８８に対応する、請求項３から６及び８から１５の何れか一項に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
【請求項17】
少なくとも一つのシステイン、少なくとも一つのアミノ酸置換、又は少なくとも一つのＰＥＧ結合可能アミノ酸置換が、配列番号：２の位置３、４、１７、２６、３７、３８、４１、４２、４４、４５、４７、４８、５１、５３、５４、５５、５６、５９、６０、６８、７２、７９、８２、８３、８４、８５、８７、１１０、１１２、１２３、１２４、１２５、１２７、１８０、１９０、１９１、１９２、１９８、２０２、２０５、２０６、２０８、２１０、２１２、２１３、２１５、２１６、２１９、２３１、２３９、２４０、２４１、２４３、２５７、２６０、２６１、２６４、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２８０、２８６、２８７、２８８、２８９、３１２、３１３、３１５、３１６、３１７、３１８、及び３２２から選択される位置に対応する位置に位置する、請求項１から１６の何れか一項に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
【請求項18】
少なくとも一つのＰＥＧ結合可能アミノ酸置換又は少なくとも一つのアミノ酸置換が、配列番号：２の位置３、４、１７、２６、３７、３８、４１、４２、４４、４５、４７、４８、５１、５３、５４、５５、５６、５９、６０、６８、７２、７９、８２、８３、８４、８５、８７、１１０、１１２、１２３、１２４、１２５、１２７、１８０、１９０、１９１、１９２、１９８、２０２、２０５、２０６、２０８、２１０、２１２、２１３、２１５、２１６、２１９、２３１、２３９、２４０、２４１、２４３、２５７、２６０、２６１、２６４、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２８０、２８６、２８７、２８８、２８９、３１２、３１３、３１５、３１６、３１７、３１８、及び３２２から選択される位置に対応する位置に位置するシステインである、請求項２から１７の何れか一項に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
【請求項19】
少なくとも一つのアミノ酸置換又は少なくとも一つのＰＥＧ結合可能アミノ酸置換が、配列番号：２の位置４、１７、２６、３７、３８、４１、４２、４４、４５、５１、５３、５４、５５、５６、５９、６０、６８、７９、８２、８３、８４、８５、８７、１１２、１２３、１２４、１２５、１２７、１８０、１９０、１９１、１９２、１９８、２０２、２０５、２０６、２０８、２１０、２１２、２１３、２１５、２１６、２３１、２３９、２４０、２４１、２５７、２６０、２６１、２６４、２６７、２６８、２７０、２８０、２８６、２８７、２８８、２８９、３１２、３１３、３１５、３１６、３１７、及び３２２から選択される一又は複数のアミノ酸位置に対応する位置のリジンである、請求項２から１８の何れか一項に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
【請求項20】
配列番号：４、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：８、又は配列番号：９のアミノ酸配列を含む、請求項１から１９の何れか一項に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
【請求項21】
変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチドが、シアル化又はペグ化など、修飾されている、請求項１から２０の何れか一項に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
【請求項22】
請求項１から２１の何れか一項に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチドを含む四量体。
【請求項23】
対応する野生型アスパラギナーゼポリペプチドの不対システイン残基に少なくとも一つのアミノ酸置換を含み、少なくとも一つのアミノ酸置換がシステイン以外の任意のアミノ酸を含む、変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
【請求項24】
対応する野生型アスパラギナーゼポリペプチドの免疫原性又は抗原性部位又はその空間的に近くのアミノ酸位置に少なくとも一つのシステイン置換を、又は該アミノ酸位置に少なくとも一対のシステイン置換を含む、請求項２３に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
【請求項25】
アミノ酸位置に少なくとも一つのシステイン置換又は少なくとも一対のシステイン置換を含む変異体アスパラギナーゼポリペプチドであって、ＰＥＧに結合した場合、対応する野生型アスパラギナーゼポリペプチドと比較して免疫原性又は抗原性が低い、変異体ポリペプチド。
【請求項26】
対応する野生型アスパラギナーゼポリペプチドの免疫原性又は抗原性部位又はその空間的に近くのアミノ酸位置に少なくとも一つのシステイン置換又は該アミノ酸位置に少なくとも一対のシステイン置換を含む変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
【請求項27】
少なくとも一つのシステインが部分的に包埋している、請求項２４から２６の何れか一項に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
【請求項28】
システインが部分的に包埋している、少なくとも一つのシステイン置換を含む変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
【請求項29】
変異体アスパラギナーゼポリペプチドがリーダー配列を欠いている、請求項２４から２８の何れか一項に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
【請求項30】
野生型アスパラギナーゼポリペプチドの免疫原性又は抗原性部位が、ヒト又はコンパニオンアニマル種において免疫応答を誘発する、請求項２４から２９の何れか一項に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
【請求項31】
コンパニオンアニマル種がイヌ、ネコ、又はウマである、請求項３０に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
【請求項32】
標準的タンパク質モデリングソフトウェアによって決定して、少なくとも一つのシステインの５％～２５％が表面に露出している、請求項２４から３１の何れか一項に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
【請求項33】
標準的タンパク質モデリングソフトウェアによって決定して、少なくとも一つのシステインの５％～２５％、５％～２０％、５％～１５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、又は１０％～３０％が表面に露出している、請求項２４から３２の何れか一項に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
【請求項34】
少なくとも一つのシステインが、又は少なくとも一対のシステインが、三次元タンパク質構造解析によって決定して、免疫原性又は抗原性部位から３５オングストローム（Å）以下である、請求項２４から３３の何れか一項に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
【請求項35】
少なくとも一つのシステイン、又は少なくとも一対のシステインが、三次元タンパク質構造解析によって決定して、免疫原性又は抗原性部位から３０Å以下、２５Å以下、２０Å以下、１５Å以下、１０Å以下、又は５Å以下である、請求項２４から３４の何れか一項に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
【請求項36】
配列番号：２、配列番号：１１、又は配列番号１４など、野生型アスパラギナーゼアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２３から３５の何れか一項に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
【請求項37】
野生型アスパラギナーゼポリペプチドが野生型大腸菌アスパラギナーゼポリペプチドである、請求項２３から３５の何れか一項に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
【請求項38】
野生型アスパラギナーゼポリペプチドが、配列番号：２、配列番号：１１、又は配列番号：１４を含む、請求項２３から３７の何れか一項に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
【請求項39】
免疫原性又は抗原性部位が、配列番号：１１のアミノ酸位置５５、５６、５７、５８、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、又は２５８に対応する、請求項２４から３８の何れか一項に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
【請求項40】
少なくとも一つのシステインが、配列番号：１１の５１、５２、１１８、１１９、１９６、２０６、２８５、及び３１１から選択される一又は複数のアミノ酸位置に対応する位置に位置する、請求項２４から３９の何れか一項に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
【請求項41】
システインの少なくとも一対のそれぞれが、表５に列挙されたＣ１－Ｃ２対のシステイン置換から選択される、請求項２４から４０の何れか一項に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
【請求項42】
システインの少なくとも一対が、配列番号：１１のアミノ酸位置１１６及び１２０、アミノ酸位置１９６及び２００、又はアミノ酸位置２２５及び２５２に対応する位置に位置する、請求項２４から４１の何れか一項に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
【請求項43】
配列番号：１２のアミノ酸配列を含む、請求項２３から４２の何れか一項に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
【請求項44】
不対システイン残基が、配列番号：１４のアミノ酸位置４５、６７、及び／又は２４２に対応する位置に位置する、請求項２３から２４、２７、及び２９から４２の何れか一項に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
【請求項45】
配列番号：１５のアミノ酸配列を含む、請求項２３から４４の何れか一項に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
【請求項46】
請求項２３から４５の何れか一項に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチドを含む四量体。
【請求項47】
請求項２３から４５の何れか一項に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチドを含む二量体。
【請求項48】
変異体アスパラギナーゼポリペプチドが、シアル化又はペグ化など、修飾されている、請求項１から４７の何れか一項に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
【請求項49】
変異体アスパラギナーゼポリペプチドがチオールペグ化又はアミンペグ化されている、請求項１から４８の何れか一項に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
【請求項50】
請求項１から２０、及び２３から４５の何れか一項に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項51】
請求項５０に記載の核酸を含むベクター。
【請求項52】
請求項５１に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項53】
細胞が原核細胞である、請求項５２に記載の宿主細胞。
【請求項54】
原核細胞が、Ｅ．クリサンテミ細胞、大腸菌細胞、又はシュードモナス細胞である、請求項５３に記載の宿主細胞。
【請求項55】
細胞が真核細胞である、請求項５２に記載の宿主細胞。
【請求項56】
真核細胞が酵母細胞である、請求項５５に記載の宿主細胞。
【請求項57】
リーダー配列を欠く変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼを発現する大腸菌細胞を培養することを含む、大腸菌細胞において変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼを産生する方法。
【請求項58】
請求項５１から５６の何れか一項に記載の宿主細胞を培養することを含む、変異体アスパラギナーゼポリペプチドを産生する方法。
【請求項59】
変異体アスパラギナーゼポリペプチドが細胞ライセートから単離される、請求項５７又は請求項５８に記載の方法。
【請求項60】
変異体アスパラギナーゼポリペプチドがペリプラズムから単離される、請求項５７から５９の何れか一項に記載の方法。
【請求項61】
変異体アスパラギナーゼポリペプチドが、陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、混合モードカラムクロマトグラフィー、及び／又は疎水性相互作用カラムクロマトグラフィーによって単離される、請求項５７から６０の何れか一項に記載の方法。
【請求項62】
変異体アスパラギナーゼポリペプチドが還元剤と組み合わされる、請求項５７から６１の何れか一項に記載の方法。
【請求項63】
還元剤がＤＴＴである、請求項６２に記載の方法。
【請求項64】
変異体アスパラギナーゼポリペプチドが、ポリオキシエチレン化合物又はシアル酸化合物と組み合わされる、請求項６２から６３の何れか一項に記載の方法。
【請求項65】
ポリオキシエチレン化合物が、α－［３－（３－マレイミド－１－オキソプロピル）アミノ］プロピル－ω－メトキシ，ポリオキシエチレン又はα－スクシンイミジルオキシグルタリル－ω－メトキシ，ポリオキシエチレンである、請求項６４に記載の方法。
【請求項66】
請求項１から５０の何れか一項に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチドと薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
【請求項67】
筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、又は動脈内経路によって、請求項１から５０の何れか一項に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド又は請求項６６に記載の薬学的組成物を投与することを含む、変異体アスパラギナーゼポリペプチドを対象に送達する方法。
【請求項68】
請求項１から５０の何れか一項に記載の治療上有効な量の変異体アスパラギナーゼポリペプチド、又は請求項６６に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む、リンパ腫を有する対象を治療する方法。
【請求項69】
請求項１から５０の何れか一項に記載の治療上有効な量の変異体アスパラギナーゼポリペプチド、又は請求項６６に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む、急性リンパ芽球性白血病を有する対象を治療する方法。
【請求項70】
対象がヒト又はコンパニオンアニマル種である、請求項６７から６９の何れか一項に記載の方法。
【請求項71】
コンパニオンアニマル種がイヌ、ネコ、又はウマである、請求項７０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［関連出願との相互参照］
この出願は、あらゆる目的のためにその全体が出典明示によりここに援用される、２０１８年４月１９日に出願された米国仮出願第６２／６６０１８９号の優先権の利益を主張する。
この出願は、あらゆる目的のためにその全体が出典明示によりここに援用される、２０１８年４月１９日に出願された米国仮出願第６２／６６０１８９号の優先権の利益を主張する。
【0002】
［配列表］
本出願は、電子形式の配列表とともに出願されている。配列表は、２０１９年４月１５日に作成された２０１９－０４－１５＿０１１５７－００１３－００ＰＣＴ＿Ｓｅｑ＿Ｌｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称のサイズ４２Ｋｂのファイルとして提供される。電子形式の配列表における情報は、その全体が出典明示によりここに援用される。
本出願は、電子形式の配列表とともに出願されている。配列表は、２０１９年４月１５日に作成された２０１９－０４－１５＿０１１５７－００１３－００ＰＣＴ＿Ｓｅｑ＿Ｌｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称のサイズ４２Ｋｂのファイルとして提供される。電子形式の配列表における情報は、その全体が出典明示によりここに援用される。
【0003】
［分野］
本開示は、免疫原性が低下し、安定性及び薬物動態が増強された変異体アスパラギナーゼポリペプチド、並びに、例えばヒトの急性リンパ芽球性白血病及びコンパニオンアニマルのリンパ腫を治療するために、同ポリペプチドを産生し使用する方法に関する。
本開示は、免疫原性が低下し、安定性及び薬物動態が増強された変異体アスパラギナーゼポリペプチド、並びに、例えばヒトの急性リンパ芽球性白血病及びコンパニオンアニマルのリンパ腫を治療するために、同ポリペプチドを産生し使用する方法に関する。
【背景技術】
【0004】
その天然の形態では、Ｌ－アスパラギナーゼ（ここではアスパラギナーゼとも呼ぶ）は、Ｌ－アスパラギンのアスパラギン酸及びアンモニアへの転換を触媒する同一のサブユニット（各サブユニット約３５ｋＤａ）から構成される細菌酵素である。大腸菌（エシェリキア・コリ）（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ又はＥ．ｃｏｌｉ）アスパラギナーゼはホモ二量体又はホモ四量体であり得、エルウィニア・クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ又はＥ．ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）（Ｄｉｃｋｅｙａ ｄａｄａｎｔｉｉ、Ｄ．ｄａｄａｎｔｉｉ、Ｄｉｃｋｅｙａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ、Ｄ．ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ等々とも呼ばれる）アスパラギナーゼは四量体である。アスパラギナーゼは、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の患者の治療と、リンパ腫のイヌ及びネコの治療に使用される。一部の白血病細胞はアスパラギンを合成することができず、生存のために循環アスパラギンに依存している。治療薬として、アスパラギナーゼは、そのような細胞から循環アスパラギンを取り除くことができ、細胞死を引き起こさせる。正常細胞はアスパラギンを合成できるため、アスパラギナーゼの影響を受けにくくなっている。
【0005】
残念ながら、アスパラギナーゼに対する過敏症が一般的に報告されている有害事象であり、アスパラギナーゼ治療の終了がしばしば必要となる。天然の大腸菌アスパラギナーゼは、治療量でヒトに導入される場合、免疫原性である場合がある。アスパラギナーゼに対する抗体は排出速度を高める可能性があり、中和抗体は、存在する場合、酵素の有効性を制限する場合がある。
【発明の概要】
【0006】
実施態様１． 少なくとも一つのシステイン置換を含む変異体エルウィニア・クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ（Ｅ．ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様２． 少なくとも一つのＰＥＧ結合可能アミノ酸置換を含む変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチドであって、ＰＥＧに結合したとき、対応する野生型Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチドと比較して免疫原性又は抗原性が低い、変異体ポリペプチド。
実施態様３． 対応する野生型Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチドの免疫原性又は抗原性部位又はその空間的に近くのアミノ酸位置に少なくとも一つのＰＥＧ結合可能アミノ酸置換を含む変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様４． 少なくとも一つのシステイン又は少なくとも一つのＰＥＧ結合可能アミノ酸が表面に露出している、実施態様１から３の何れか一に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様５． 野生型アスパラギナーゼポリペプチドの免疫原性又は抗原性部位が、ヒト又はコンパニオンアニマル種において免疫応答を誘発する、実施態様３又は４に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様６． コンパニオンアニマル種がイヌ、ネコ、又はウマである、実施態様５に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様７． 少なくとも一つのアミノ酸置換を含み、置換された該アミノ酸が表面に露出している、変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様８． 変異体ポリペプチドがリーダー配列を欠いている、実施態様１から７の何れか一に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様９． 標準的タンパク質モデリングソフトウェアによって決定して、少なくとも一つのシステイン、少なくとも一つのアミノ酸、又は少なくとも一つのＰＥＧ結合可能アミノ酸の３０％以上が表面に露出している、実施態様１から８の何れか一に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様１０． 標準的タンパク質モデリングソフトウェアによって決定して、少なくとも一つのシステイン、少なくとも一つのアミノ酸、又は少なくとも一つのＰＥＧ結合可能アミノ酸の３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上が表面に露出している、実施態様１から９の何れか一に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様１１． 少なくとも一つのＰＥＧ結合可能アミノ酸又は少なくとも一つのアミノ酸が、システイン、リジン、又はＰＥＧ結合可能アミノ酸誘導体である、実施態様２から１０の何れか一に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様１２． 少なくとも一つのシステイン、少なくとも一つのアミノ酸、又は少なくとも一つのＰＥＧ結合可能アミノ酸が、三次元タンパク質構造分析によって決定して、免疫原性又は抗原部位から３５オングストローム（Å）以下である、実施態様１から１１の何れか一に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様１３． 少なくとも一つのシステイン、少なくとも一つのアミノ酸、又は少なくとも一つのＰＥＧ結合可能アミノ酸が、三次元タンパク質構造解析によって決定して、免疫原性又は抗原部位から３０Å以下、２５Å以下、２０Å以下、１５Å以下、１０Å以下、又は５Å以下である、実施態様１から１２の何れか一に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様１４． 配列番号：２など、野生型アスパラギナーゼアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、実施態様１から１３の何れか一に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様１５． 野生型Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチドが配列番号：２のアミノ酸配列を含む、実施態様２から６及び８から１４の何れか一に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様１６． 免疫原性又は抗原性部位が、配列番号：２のアミノ酸位置４１、７２、２６５、又は２８８に対応する、実施態様３から６及び８から１５の何れか一に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様１７． 少なくとも一つのシステイン、少なくとも一つのアミノ酸置換、又は少なくとも一つのＰＥＧ結合可能アミノ酸置換が、配列番号：２の位置３、４、１７、２６、３７、３８、４１、４２、４４、４５、４７、４８、５１、５３、５４、５５、５６、５９、６０、６８、７２、７９、８２、８３、８４、８５、８７、１１０、１１２、１２３、１２４、１２５、１２７、１８０、１９０、１９１、１９２、１９８、２０２、２０５、２０６、２０８、２１０、２１２、２１３、２１５、２１６、２１９、２３１、２３９、２４０、２４１、２４３、２５７、２６０、２６１、２６４、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２８０、２８６、２８７、２８８、２８９、３１２、３１３、３１５、３１６、３１７、３１８、及び３２２から選択される位置に対応する位置に位置する、実施態様１から１６の何れか一に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様１８． 少なくとも一つのＰＥＧ結合可能アミノ酸置換又は少なくとも一つのアミノ酸置換が、配列番号：２の位置３、４、１７、２６、３７、３８、４１、４２、４４、４５、４７、４８、５１、５３、５４、５５、５６、５９、６０、６８、７２、７９、８２、８３、８４、８５、８７、１１０、１１２、１２３、１２４、１２５、１２７、１８０、１９０、１９１、１９２、１９８、２０２、２０５、２０６、２０８、２１０、２１２、２１３、２１５、２１６、２１９、２３１、２３９、２４０、２４１、２４３、２５７、２６０、２６１、２６４、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２８０、２８６、２８７、２８８、２８９、３１２、３１３、３１５、３１６、３１７、３１８、及び３２２から選択される位置に対応する位置に位置するシステインである、実施態様２から１７の何れか一に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様１９． 少なくとも一つのアミノ酸置換又は少なくとも一つのＰＥＧ結合可能アミノ酸置換が、配列番号：２の位置４、１７、２６、３７、３８、４１、４２、４４、４５、５１、５３、５４、５５、５６、５９、６０、６８、７９、８２、８３、８４、８５、８７、１１２、１２３、１２４、１２５、１２７、１８０、１９０、１９１、１９２、１９８、２０２、２０５、２０６、２０８、２１０、２１２、２１３、２１５、２１６、２３１、２３９、２４０、２４１、２５７、２６０、２６１、２６４、２６７、２６８、２７０、２８０、２８６、２８７、２８８、２８９、３１２、３１３、３１５、３１６、３１７、及び３２２から選択される一又は複数のアミノ酸位置に対応する位置のリジンである、実施態様２から１８の何れか一に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様２０． 配列番号：４、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：８、又は配列番号：９のアミノ酸配列を含む、実施態様１から１９の何れか一に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様２１． 変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチドが、シアル化又はペグ化など、修飾されている、実施態様１から２０の何れか一に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様２２． 実施態様１から２１の何れか一に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチドを含む四量体。
実施態様２３． 対応する野生型アスパラギナーゼポリペプチドの不対システイン残基に少なくとも一つのアミノ酸置換を含み、少なくとも一つのアミノ酸置換がシステイン以外の任意のアミノ酸を含む、変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様２４． 対応する野生型アスパラギナーゼポリペプチドの免疫原性又は抗原性部位又はその空間的に近くのアミノ酸位置に少なくとも一つのシステイン置換を、又は該アミノ酸位置に少なくとも一対のシステイン置換を含む、実施態様２３に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様２５． アミノ酸位置に少なくとも一つのシステイン置換又は少なくとも一対のシステイン置換を含む変異体アスパラギナーゼポリペプチドであって、ＰＥＧに結合した場合、対応する野生型アスパラギナーゼポリペプチドと比較して免疫原性又は抗原性が低い、変異体ポリペプチド。
実施態様２６． 対応する野生型アスパラギナーゼポリペプチドの免疫原性又は抗原性部位又はその空間的に近くのアミノ酸位置に少なくとも一つのシステイン置換又は該アミノ酸位置に少なくとも一対のシステイン置換を含む変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様２７． 少なくとも一つのシステインが部分的に包埋している、実施態様２４から２６の何れか一に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様２８． システインが部分的に包埋している、少なくとも一つのシステイン置換を含む変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様２９． 変異体アスパラギナーゼポリペプチドがリーダー配列を欠いている、実施態様２４から２８の何れか一に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様３０． 野生型アスパラギナーゼポリペプチドの免疫原性又は抗原性部位が、ヒト又はコンパニオンアニマル種において免疫応答を誘発する、実施態様２４から２９の何れか一に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様３１． コンパニオンアニマル種がイヌ、ネコ、又はウマである、実施態様３０に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様３２． 標準的タンパク質モデリングソフトウェアによって決定して、少なくとも一つのシステインの５％から２５％が表面に露出している、実施態様２４から３１の何れか一に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様３３． 標準的タンパク質モデリングソフトウェアによって決定して、少なくとも一つのシステインの５％～２５％、５％～２０％、５％～１５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、又は１０％～３０％が表面に露出している、実施態様２４から３２の何れか一に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様３４． 少なくとも一つのシステインが、又は少なくとも一対のシステインが、三次元タンパク質構造解析によって決定して、免疫原性又は抗原性部位から３５オングストローム（Å）以下である、実施態様２４から３３の何れか一に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様３５． 少なくとも一つのシステイン、又は少なくとも一対のシステインが、三次元タンパク質構造解析によって決定して、免疫原性又は抗原性部位から３０Å以下、２５Å以下、２０Å以下、１５Å以下、１０Å以下、又は５Å以下である、実施態様２４から３４の何れか一に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様３６． 配列番号：２、配列番号：１１、又は配列番号１４など、野生型アスパラギナーゼアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、実施態様２３から３５の何れか一に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様３７． 野生型アスパラギナーゼポリペプチドが野生型大腸菌アスパラギナーゼポリペプチドである、実施態様２３から３５の何れか一に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様３８． 野生型アスパラギナーゼポリペプチドが、配列番号：２、配列番号：１１、又は配列番号：１４を含む、実施態様２３から３７の何れか一に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様３９． 免疫原性又は抗原性部位が、配列番号：１１のアミノ酸位置５５、５６、５７、５８、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、又は２５８に対応する、実施態様２４から３８の何れか一に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様４０． 少なくとも一つのシステインが、配列番号：１１の５１、５２、１１８、１１９、１９６、２０６、２８５、及び３１１から選択される一又は複数のアミノ酸位置に対応する位置に位置する、実施態様２４から３９の何れか一に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様４１． システインの少なくとも一対のそれぞれが、表５に列挙されたＣ１－Ｃ２対のシステイン置換から選択される、実施態様２４から４０の何れか一に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様４２． システインの少なくとも一対が、配列番号：１１のアミノ酸位置１１６及び１２０、アミノ酸位置１９６及び２００、又はアミノ酸位置２２５及び２５２に対応する位置に位置する、実施態様２４から４１の何れか一に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様４３． 配列番号：１２のアミノ酸配列を含む、実施態様２３から４２の何れか一に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様４４． 不対システイン残基が、配列番号：１４のアミノ酸位置４５、６７、及び／又は２４２に対応する位置に位置する、実施態様２３から２４、２７、及び２９から４２の何れか一に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様４５． 配列番号：１５のアミノ酸配列を含む、実施態様２３から４４の何れか一に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様４６． 実施態様２３から４５の何れか一に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチドを含む四量体。
実施態様４７． 実施態様２３から４５の何れか一に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチドを含む二量体。
実施態様４８． 変異体アスパラギナーゼポリペプチドが、シアル化又はペグ化など、修飾されている、実施態様１から４７の何れか一に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様４９． 変異体アスパラギナーゼポリペプチドがチオールペグ化又はアミンペグ化されている、実施態様１から４８の何れか一に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様５０． 実施態様１から２０、及び２３から４５の何れか一に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチドをコードする単離された核酸。
実施態様５１． 実施態様５０に記載の核酸を含むベクター。
実施態様５２． 実施態様５１に記載のベクターを含む宿主細胞。
実施態様５３． 細胞が原核細胞である、実施態様５２に記載の宿主細胞。
実施態様５４． 原核細胞が、Ｅ．クリサンテミ細胞、大腸菌細胞、又はシュードモナス細胞である、実施態様５３に記載の宿主細胞。
実施態様５５． 細胞が真核細胞である、実施態様５２に記載の宿主細胞。
実施態様５６． 真核細胞が酵母細胞である、実施態様５５に記載の宿主細胞。
実施態様５７． リーダー配列を欠く変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼを発現する大腸菌細胞を培養することを含む、大腸菌細胞において変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼを産生する方法。
実施態様５８． 実施態様５１から５６の何れか一に記載の宿主細胞を培養することを含む、変異体アスパラギナーゼポリペプチドを産生する方法。
実施態様５９． 変異体アスパラギナーゼポリペプチドが細胞ライセートから単離される、実施態様５７又は実施態様５８に記載の方法。
実施態様６０． 変異体アスパラギナーゼポリペプチドがペリプラズムから単離される、実施態様５７から５９の何れか一に記載の方法。
実施態様６１． 変異体アスパラギナーゼポリペプチドが、陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、混合モードカラムクロマトグラフィー、及び／又は疎水性相互作用カラムクロマトグラフィーによって単離される、実施態様５７から６０の何れか一に記載の方法。
実施態様６２． 変異体アスパラギナーゼポリペプチドが還元剤と組み合わされる、実施態様５７から６１の何れか一に記載の方法。
実施態様６３． 還元剤がＤＴＴである、実施態様６２に記載の方法。
実施態様６４． 変異体アスパラギナーゼポリペプチドが、ポリオキシエチレン化合物又はシアル酸化合物と組み合わされる、実施態様６２から６３の何れか一に記載の方法。
実施態様６５． ポリオキシエチレン化合物が、α－［３－（３－マレイミド－１－オキソプロピル）アミノ］プロピル－ω－メトキシ，ポリオキシエチレン又はα－スクシンイミジルオキシグルタリル－ω－メトキシ，ポリオキシエチレンである、実施態様６４に記載の方法。
実施態様６６． 実施態様１から５０の何れか一に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチドと薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
実施態様６７． 筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、又は動脈内経路によって、実施態様１から５０の何れか一に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド又は実施態様６６に記載の薬学的組成物を投与することを含む、変異体アスパラギナーゼポリペプチドを対象に送達する方法。
実施態様６８． 実施態様１から５０の何れか一に記載の治療上有効な量の変異体アスパラギナーゼポリペプチド、又は実施態様６６に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む、リンパ腫を有する対象を治療する方法。
実施態様６９． 実施態様１から５０の何れか一に記載の治療上有効な量の変異体アスパラギナーゼポリペプチド、又は実施態様６６に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む、急性リンパ芽球性白血病を有する対象を治療する方法。
実施態様７０． 対象がヒト又はコンパニオンアニマル種である、実施態様６７から６９の何れか一に記載の方法。
実施態様７１． コンパニオンアニマル種がイヌ、ネコ、又はウマである、実施態様７０に記載の方法。
実施態様２． 少なくとも一つのＰＥＧ結合可能アミノ酸置換を含む変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチドであって、ＰＥＧに結合したとき、対応する野生型Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチドと比較して免疫原性又は抗原性が低い、変異体ポリペプチド。
実施態様３． 対応する野生型Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチドの免疫原性又は抗原性部位又はその空間的に近くのアミノ酸位置に少なくとも一つのＰＥＧ結合可能アミノ酸置換を含む変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様４． 少なくとも一つのシステイン又は少なくとも一つのＰＥＧ結合可能アミノ酸が表面に露出している、実施態様１から３の何れか一に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様５． 野生型アスパラギナーゼポリペプチドの免疫原性又は抗原性部位が、ヒト又はコンパニオンアニマル種において免疫応答を誘発する、実施態様３又は４に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様６． コンパニオンアニマル種がイヌ、ネコ、又はウマである、実施態様５に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様７． 少なくとも一つのアミノ酸置換を含み、置換された該アミノ酸が表面に露出している、変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様８． 変異体ポリペプチドがリーダー配列を欠いている、実施態様１から７の何れか一に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様９． 標準的タンパク質モデリングソフトウェアによって決定して、少なくとも一つのシステイン、少なくとも一つのアミノ酸、又は少なくとも一つのＰＥＧ結合可能アミノ酸の３０％以上が表面に露出している、実施態様１から８の何れか一に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様１０． 標準的タンパク質モデリングソフトウェアによって決定して、少なくとも一つのシステイン、少なくとも一つのアミノ酸、又は少なくとも一つのＰＥＧ結合可能アミノ酸の３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上が表面に露出している、実施態様１から９の何れか一に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様１１． 少なくとも一つのＰＥＧ結合可能アミノ酸又は少なくとも一つのアミノ酸が、システイン、リジン、又はＰＥＧ結合可能アミノ酸誘導体である、実施態様２から１０の何れか一に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様１２． 少なくとも一つのシステイン、少なくとも一つのアミノ酸、又は少なくとも一つのＰＥＧ結合可能アミノ酸が、三次元タンパク質構造分析によって決定して、免疫原性又は抗原部位から３５オングストローム（Å）以下である、実施態様１から１１の何れか一に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様１３． 少なくとも一つのシステイン、少なくとも一つのアミノ酸、又は少なくとも一つのＰＥＧ結合可能アミノ酸が、三次元タンパク質構造解析によって決定して、免疫原性又は抗原部位から３０Å以下、２５Å以下、２０Å以下、１５Å以下、１０Å以下、又は５Å以下である、実施態様１から１２の何れか一に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様１４． 配列番号：２など、野生型アスパラギナーゼアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、実施態様１から１３の何れか一に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様１５． 野生型Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチドが配列番号：２のアミノ酸配列を含む、実施態様２から６及び８から１４の何れか一に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様１６． 免疫原性又は抗原性部位が、配列番号：２のアミノ酸位置４１、７２、２６５、又は２８８に対応する、実施態様３から６及び８から１５の何れか一に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様１７． 少なくとも一つのシステイン、少なくとも一つのアミノ酸置換、又は少なくとも一つのＰＥＧ結合可能アミノ酸置換が、配列番号：２の位置３、４、１７、２６、３７、３８、４１、４２、４４、４５、４７、４８、５１、５３、５４、５５、５６、５９、６０、６８、７２、７９、８２、８３、８４、８５、８７、１１０、１１２、１２３、１２４、１２５、１２７、１８０、１９０、１９１、１９２、１９８、２０２、２０５、２０６、２０８、２１０、２１２、２１３、２１５、２１６、２１９、２３１、２３９、２４０、２４１、２４３、２５７、２６０、２６１、２６４、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２８０、２８６、２８７、２８８、２８９、３１２、３１３、３１５、３１６、３１７、３１８、及び３２２から選択される位置に対応する位置に位置する、実施態様１から１６の何れか一に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様１８． 少なくとも一つのＰＥＧ結合可能アミノ酸置換又は少なくとも一つのアミノ酸置換が、配列番号：２の位置３、４、１７、２６、３７、３８、４１、４２、４４、４５、４７、４８、５１、５３、５４、５５、５６、５９、６０、６８、７２、７９、８２、８３、８４、８５、８７、１１０、１１２、１２３、１２４、１２５、１２７、１８０、１９０、１９１、１９２、１９８、２０２、２０５、２０６、２０８、２１０、２１２、２１３、２１５、２１６、２１９、２３１、２３９、２４０、２４１、２４３、２５７、２６０、２６１、２６４、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２８０、２８６、２８７、２８８、２８９、３１２、３１３、３１５、３１６、３１７、３１８、及び３２２から選択される位置に対応する位置に位置するシステインである、実施態様２から１７の何れか一に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様１９． 少なくとも一つのアミノ酸置換又は少なくとも一つのＰＥＧ結合可能アミノ酸置換が、配列番号：２の位置４、１７、２６、３７、３８、４１、４２、４４、４５、５１、５３、５４、５５、５６、５９、６０、６８、７９、８２、８３、８４、８５、８７、１１２、１２３、１２４、１２５、１２７、１８０、１９０、１９１、１９２、１９８、２０２、２０５、２０６、２０８、２１０、２１２、２１３、２１５、２１６、２３１、２３９、２４０、２４１、２５７、２６０、２６１、２６４、２６７、２６８、２７０、２８０、２８６、２８７、２８８、２８９、３１２、３１３、３１５、３１６、３１７、及び３２２から選択される一又は複数のアミノ酸位置に対応する位置のリジンである、実施態様２から１８の何れか一に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様２０． 配列番号：４、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：８、又は配列番号：９のアミノ酸配列を含む、実施態様１から１９の何れか一に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様２１． 変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチドが、シアル化又はペグ化など、修飾されている、実施態様１から２０の何れか一に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様２２． 実施態様１から２１の何れか一に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチドを含む四量体。
実施態様２３． 対応する野生型アスパラギナーゼポリペプチドの不対システイン残基に少なくとも一つのアミノ酸置換を含み、少なくとも一つのアミノ酸置換がシステイン以外の任意のアミノ酸を含む、変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様２４． 対応する野生型アスパラギナーゼポリペプチドの免疫原性又は抗原性部位又はその空間的に近くのアミノ酸位置に少なくとも一つのシステイン置換を、又は該アミノ酸位置に少なくとも一対のシステイン置換を含む、実施態様２３に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様２５． アミノ酸位置に少なくとも一つのシステイン置換又は少なくとも一対のシステイン置換を含む変異体アスパラギナーゼポリペプチドであって、ＰＥＧに結合した場合、対応する野生型アスパラギナーゼポリペプチドと比較して免疫原性又は抗原性が低い、変異体ポリペプチド。
実施態様２６． 対応する野生型アスパラギナーゼポリペプチドの免疫原性又は抗原性部位又はその空間的に近くのアミノ酸位置に少なくとも一つのシステイン置換又は該アミノ酸位置に少なくとも一対のシステイン置換を含む変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様２７． 少なくとも一つのシステインが部分的に包埋している、実施態様２４から２６の何れか一に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様２８． システインが部分的に包埋している、少なくとも一つのシステイン置換を含む変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様２９． 変異体アスパラギナーゼポリペプチドがリーダー配列を欠いている、実施態様２４から２８の何れか一に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様３０． 野生型アスパラギナーゼポリペプチドの免疫原性又は抗原性部位が、ヒト又はコンパニオンアニマル種において免疫応答を誘発する、実施態様２４から２９の何れか一に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様３１． コンパニオンアニマル種がイヌ、ネコ、又はウマである、実施態様３０に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様３２． 標準的タンパク質モデリングソフトウェアによって決定して、少なくとも一つのシステインの５％から２５％が表面に露出している、実施態様２４から３１の何れか一に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様３３． 標準的タンパク質モデリングソフトウェアによって決定して、少なくとも一つのシステインの５％～２５％、５％～２０％、５％～１５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、又は１０％～３０％が表面に露出している、実施態様２４から３２の何れか一に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様３４． 少なくとも一つのシステインが、又は少なくとも一対のシステインが、三次元タンパク質構造解析によって決定して、免疫原性又は抗原性部位から３５オングストローム（Å）以下である、実施態様２４から３３の何れか一に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様３５． 少なくとも一つのシステイン、又は少なくとも一対のシステインが、三次元タンパク質構造解析によって決定して、免疫原性又は抗原性部位から３０Å以下、２５Å以下、２０Å以下、１５Å以下、１０Å以下、又は５Å以下である、実施態様２４から３４の何れか一に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様３６． 配列番号：２、配列番号：１１、又は配列番号１４など、野生型アスパラギナーゼアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、実施態様２３から３５の何れか一に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様３７． 野生型アスパラギナーゼポリペプチドが野生型大腸菌アスパラギナーゼポリペプチドである、実施態様２３から３５の何れか一に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様３８． 野生型アスパラギナーゼポリペプチドが、配列番号：２、配列番号：１１、又は配列番号：１４を含む、実施態様２３から３７の何れか一に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様３９． 免疫原性又は抗原性部位が、配列番号：１１のアミノ酸位置５５、５６、５７、５８、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、又は２５８に対応する、実施態様２４から３８の何れか一に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様４０． 少なくとも一つのシステインが、配列番号：１１の５１、５２、１１８、１１９、１９６、２０６、２８５、及び３１１から選択される一又は複数のアミノ酸位置に対応する位置に位置する、実施態様２４から３９の何れか一に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様４１． システインの少なくとも一対のそれぞれが、表５に列挙されたＣ１－Ｃ２対のシステイン置換から選択される、実施態様２４から４０の何れか一に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様４２． システインの少なくとも一対が、配列番号：１１のアミノ酸位置１１６及び１２０、アミノ酸位置１９６及び２００、又はアミノ酸位置２２５及び２５２に対応する位置に位置する、実施態様２４から４１の何れか一に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様４３． 配列番号：１２のアミノ酸配列を含む、実施態様２３から４２の何れか一に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様４４． 不対システイン残基が、配列番号：１４のアミノ酸位置４５、６７、及び／又は２４２に対応する位置に位置する、実施態様２３から２４、２７、及び２９から４２の何れか一に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様４５． 配列番号：１５のアミノ酸配列を含む、実施態様２３から４４の何れか一に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様４６． 実施態様２３から４５の何れか一に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチドを含む四量体。
実施態様４７． 実施態様２３から４５の何れか一に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチドを含む二量体。
実施態様４８． 変異体アスパラギナーゼポリペプチドが、シアル化又はペグ化など、修飾されている、実施態様１から４７の何れか一に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様４９． 変異体アスパラギナーゼポリペプチドがチオールペグ化又はアミンペグ化されている、実施態様１から４８の何れか一に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド。
実施態様５０． 実施態様１から２０、及び２３から４５の何れか一に記載の変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチドをコードする単離された核酸。
実施態様５１． 実施態様５０に記載の核酸を含むベクター。
実施態様５２． 実施態様５１に記載のベクターを含む宿主細胞。
実施態様５３． 細胞が原核細胞である、実施態様５２に記載の宿主細胞。
実施態様５４． 原核細胞が、Ｅ．クリサンテミ細胞、大腸菌細胞、又はシュードモナス細胞である、実施態様５３に記載の宿主細胞。
実施態様５５． 細胞が真核細胞である、実施態様５２に記載の宿主細胞。
実施態様５６． 真核細胞が酵母細胞である、実施態様５５に記載の宿主細胞。
実施態様５７． リーダー配列を欠く変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼを発現する大腸菌細胞を培養することを含む、大腸菌細胞において変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼを産生する方法。
実施態様５８． 実施態様５１から５６の何れか一に記載の宿主細胞を培養することを含む、変異体アスパラギナーゼポリペプチドを産生する方法。
実施態様５９． 変異体アスパラギナーゼポリペプチドが細胞ライセートから単離される、実施態様５７又は実施態様５８に記載の方法。
実施態様６０． 変異体アスパラギナーゼポリペプチドがペリプラズムから単離される、実施態様５７から５９の何れか一に記載の方法。
実施態様６１． 変異体アスパラギナーゼポリペプチドが、陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、混合モードカラムクロマトグラフィー、及び／又は疎水性相互作用カラムクロマトグラフィーによって単離される、実施態様５７から６０の何れか一に記載の方法。
実施態様６２． 変異体アスパラギナーゼポリペプチドが還元剤と組み合わされる、実施態様５７から６１の何れか一に記載の方法。
実施態様６３． 還元剤がＤＴＴである、実施態様６２に記載の方法。
実施態様６４． 変異体アスパラギナーゼポリペプチドが、ポリオキシエチレン化合物又はシアル酸化合物と組み合わされる、実施態様６２から６３の何れか一に記載の方法。
実施態様６５． ポリオキシエチレン化合物が、α－［３－（３－マレイミド－１－オキソプロピル）アミノ］プロピル－ω－メトキシ，ポリオキシエチレン又はα－スクシンイミジルオキシグルタリル－ω－メトキシ，ポリオキシエチレンである、実施態様６４に記載の方法。
実施態様６６． 実施態様１から５０の何れか一に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチドと薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
実施態様６７． 筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、又は動脈内経路によって、実施態様１から５０の何れか一に記載の変異体アスパラギナーゼポリペプチド又は実施態様６６に記載の薬学的組成物を投与することを含む、変異体アスパラギナーゼポリペプチドを対象に送達する方法。
実施態様６８． 実施態様１から５０の何れか一に記載の治療上有効な量の変異体アスパラギナーゼポリペプチド、又は実施態様６６に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む、リンパ腫を有する対象を治療する方法。
実施態様６９． 実施態様１から５０の何れか一に記載の治療上有効な量の変異体アスパラギナーゼポリペプチド、又は実施態様６６に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む、急性リンパ芽球性白血病を有する対象を治療する方法。
実施態様７０． 対象がヒト又はコンパニオンアニマル種である、実施態様６７から６９の何れか一に記載の方法。
実施態様７１． コンパニオンアニマル種がイヌ、ネコ、又はウマである、実施態様７０に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【0008】
【0009】
【0010】
【図3】図３は、還元（＋ＤＴＴ）及び非還元（－ＤＴＴ）条件下、異なる反応時間（５分及び６０分）と異なる反応温度（室温及び３７℃）での、未ペグ化並びにチオールペグ化された変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼ（配列番号５）のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。レーン１：未ペグ化、－ＤＴＴ；レーン２：未ペグ化、＋ＤＴＴ；レーン３：チオールペグ化、反応時間５分、ＲＴ、－ＤＴＴ；レーン４：チオールペグ化、反応時間５分、ＲＴ、＋ＤＴＴ；レーン５：チオールペグ化、反応時間６０分、ＲＴ、－ＤＴＴ；レーン６：チオールペグ化、反応時間６０分、ＲＴ、＋ＤＴＴ；レーン７：チオールペグ化、反応時間６０分、３７℃、－ＤＴＴ；レーン８：チオールペグ化、反応時間６０分、３７℃、＋ＤＴＴ。
【0011】
【0012】
［配列の説明］
表１はここで参照される所定の配列の表を提供する。
表１はここで参照される所定の配列の表を提供する。
【発明を実施するための形態】
【0013】
生体分子のペグ化は、循環時間を延長し、タンパク質分解による不活化から保護し、免疫原性又は抗原性部位をマスクし、及び／又は免疫原性を低下させうる。ＯＮＣＯＳＰＡＲ（登録商標）（ペグアスパルガーゼ，Ｓｈｉｒｅ）は、大腸菌由来のＦＤＡ承認のペグ化アスパラギナーゼである。ＯＮＣＡＳＰＡＲ（登録商標）の添付文書に基づくと、アスパラギナーゼの各分子は平均６９～８２のリジン結合ＰＥＧ分子を有しており、およそ４８３～５４８ｋＤａである。しかし、ランダムなペグ化が不均一な生成物をもたらす可能性があり、大腸菌由来のペグ化アスパラギナーゼに対する過敏症が依然として発症する可能性がある。
【0014】
Ｅ．クリサンテミから単離されたアスパラギナーゼもまた研究されている。 Ｅ．クリサンテミ由来の天然アスパラギナーゼであるＥＲＷＩＮＡＺＥ（登録商標）（Ｊａｚｚ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）は、大腸菌由来アスパラギナーゼに対する過敏症を発症した患者のためのペグアスパラガーゼ及び天然大腸菌アスパラギナーゼの代替品としてＦＤＡに承認されている。ＥＲＷＩＮＡＺＥ（登録商標）の添付文書を参照のこと；Gervais, D. Validation of a 30-year-old process for the manufacture of L-asparaginase from Erwinia chrysanthemi. Bioprocess Biosyst Eng (2013) 36:453-60。ＥＲＷＩＮＡＺＥ（登録商標）は不足していると報告されている。２０１８年２月２６日付けのｆｉｅｒｃｅｐｈａｒｍａ．ｃｏｍ／ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ／ｊａｚｚ－ｒｅｌｅａｓｅｓ－ｓｏｍｅ－ｅｒｗｉｎａｚｅ－ｃｈｉｌｄｒｅｎ－ｓ－ｌｅｕｋｅｍｉａ－ｄｒｕｇ－ｈａｓ－ｂｅｅｎ－ｓｈｏｒｔａｇｅを参照のこと。
【0015】
ペグ化された組換えＥ．クリサンテミ・アスパラギナーゼは、ランダムな一級アミンペグ化を使用して報告されている。この生成物は免疫原性が低く、有効性が改善されている。Chien, W., Pharmacology, immunogenicity, and efficacy of a novel pegylated recombinant Erwinia chrysanthemi-derived L-asparaginase. Invest New Drugs (2014) 32: 795-805。しかし、ランダムなペグ化により、不均一な生成物になりうる。従って、細菌アスパラギナーゼへのＰＥＧ結合性アミノ酸の部位特異的取り込みは有利ではあるが、問題がないわけではない。
【0016】
Ｅ．クリサンテミ及び大腸菌アスパラギナーゼの抗原性エピトープが同定され、マッピングされている。Moola, Z.B.等 Epitope mapping and antigenic modification of L-asparaginase. Biochem J. (1994) 302: 921-927及びWerner A.等 Mapping of B-cell epitopes in E. coli asparaginase II, an enzyme used in leukemia treatment. Biol. Chem. (2005) 386: 535-540を参照のこと。それにもかかわらず、文献は、（例えば、チオール特異的結合の部位特異的システイン置換を介して）免疫原性又は抗原性部位を遮蔽するための、ランダムではなく、部位特異的なペグ化を有する変異体細菌アスパラギナーゼ産物は全くないように思われる。ペリプラズムにおける変異体アスパラギナーゼポリペプチドの組換え発現は困難な場合がある。例えば、ペリプラズムの酸化環境が、適切なタンパク質フォールディングのためのペアのシステイン残基間のジスルフィド結合の形成に重要であるが、不対システイン残基がまた酸化され、ペグ化技術を妨げる。
【0017】
免疫原性の問題、臨床アスパラギナーゼ産物の不足、及び非効率的な製造方法のために、免疫原性が低下し、代替供給源に由来し、より効率的な製造方法を使用して製造されるアスパラギナーゼ産物が必要とされる。これらの問題に対処する変異体アスパラギナーゼポリペプチド及び方法は、ここに記載される。
【0018】
本開示は、免疫原性が低下し、安定性及び薬物動態が増強された変異体アスパラギナーゼポリペプチド、並びに、例えばヒトの急性リンパ芽球性白血病及びコンパニオンアニマルのリンパ腫を治療するために同ポリペプチドを産生し使用する方法に関する。読者の便宜のために、ここで使用される用語の次の定義を提供する。
【0019】
ここで使用される場合、「ａ」又は「ａｎ」は、特に明記しない限り、「少なくとも一つ」又は「一又は複数」を意味する。ここで使用される場合、「又は」という用語は、特に明記しない限り、「及び／又は」を意味する。複数の従属請求項の文脈では、他の請求項を引用するときの「又は」の使用は、その請求項を選択的にのみ引用する。
【0020】
［例示的アスパラギナーゼポリペプチド］
変異体アスパラギナーゼポリペプチド、例えば、免疫原性を低下させるためのシステイン及びリジン置換などの、ＰＥＧ結合可能なアミノ酸置換を含む変異体アスパラギナーゼポリペプチドが提供される。
変異体アスパラギナーゼポリペプチド、例えば、免疫原性を低下させるためのシステイン及びリジン置換などの、ＰＥＧ結合可能なアミノ酸置換を含む変異体アスパラギナーゼポリペプチドが提供される。
【0021】
「アミノ酸配列」は、ペプチド又はタンパク質中のアミノ酸残基の配列を意味する。「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために交換可能に使用され、最小長さに限定されない。アミノ酸残基のそのようなポリマーは、天然又は非天然のアミノ酸残基を含み得、限定されないが、アミノ酸残基のペプチド、オリゴペプチド、二量体、三量体、及び多量体を含む。完全長タンパク質とその断片の両方が定義に包含される。その用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、シアル酸付加、アセチル化、リン酸化等々を含む。更に、本開示の目的では、「ポリペプチド」は、タンパク質が所望の活性を維持する限り、天然（又は野生型）配列に対する欠失、付加、及び置換（一般には本質的に保存的）などの修飾を含むタンパク質を指す。これらの修飾は、部位特異的変異誘発などの意図的なものである場合もあれば、タンパク質を産生する宿主の変異又はＰＣＲ増幅によるエラーなどの偶発的なものである場合もある。
【0022】
ここで使用される「アミノ酸誘導体」とは、ヒトに見出される２０の一般的な天然アミノ酸の一つではない任意のアミノ酸、修飾アミノ酸、及び／又はアミノ酸アナログを指す。例示的なアミノ酸誘導体には、ヒトに見出されない天然アミノ酸（例えば、幾つかの微生物に見出されうるセレノシステイン及びピロールリジン）及び非天然アミノ酸が含まれる。限定されないが、例示的なアミノ酸誘導体には、化学製品の製造業者及び販売業者を通じて市販されているアミノ酸誘導体が含まれる（例えば、出典明示によりここに援用される、２０１７年５月６日にアクセスされた、ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ／ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ－ｐｒｏｄｕｃｔｓ．ｈｔｍｌ？ＴａｂｌｅＰａｇｅ＝１６２７４９６５）。宿主細胞、真正細菌シンテターゼに由来する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、直交ｔＲＮＡ、及びアミノ酸誘導体を利用する翻訳系を使用して、一又は複数のアミノ酸誘導体をポリペプチドの特定の位置に組み込むことができる。更なる説明については、例えば、米国特許第９６２４４８５号を参照のこと。
【0023】
ここで使用される「アスパラギナーゼ」又は「Ｌ－アスパラギナーゼ」は、変異体ポリペプチド、前駆体ポリペプチド、成熟ポリペプチド、四量体、二量体、単量体、又は他の任意の形態を含む、アスパラギナーゼの全体又は断片を含むポリペプチドである。
【0024】
例えば、「アスパラギナーゼ」は、特に明記しない限り、植物、哺乳動物（例えば、ブタ及びげっ歯類）、及び細菌（例えば、大腸菌、Ｅ．クリサンテミ、アエロバクター・アエロゲネス（Aerobacter aerogenes）、エロモナス・ハイドロフィラ（Aeromonas hydrophila）、Ａ．リクファシエンス（A. liquefaciens）、Ａ．サルモニシダ（A. salmonicida）、Ａ．シヌオサ（A. sinuosa）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、Ｂ．スブチリス（B. subtilis）、エルウィニア・アミロボラ（Erwinia amylovora）、Ｅ．アラオイデエ（E. araoideae）、Ｅ．カロトボラ（E. carotovora）、Ｅ．ディゾルベンス（E. dissolvens）、Ｅ．フロインデイ（E. freundii）、ハイドロジェノモナス・オイトロファ（Hydrogenomonas eutropha）、Ｈ．パントトロファ（H. pantotropha）、フォトバクテリウム・フィシェリ（Photobacterium fischeri）、プロテウス・アメリカヌス（Proteus americanus）、Ｐ．ミラビリス（P. mirabilis）、Ｐ．モルガニー（P. morganii）、Ｐ．パラメリカヌス（P. paramericanus）、Ｐ．シュードバレリー（P. psudovaleriei）、Ｐ．シンギデス（P. shingides）、Ｐ．ブルガリス（P. vulgaris）、スードモナス・アシドボランス（Psudomonas acidovorans）、Ｐ．アンモニアゲネス（P. ammoniagenes）、Ｐ．アスプレニー（P. asplenii）、Ｐ．オーレオファシエンス（P. aureofaciens）、Ｐ．キャビエ（P. caviae）、Ｐ．コンベクサ（P. convexa）、Ｐ．ダクンヘ（P. dacunhae）、Ｐ．フルオレッセンス（P. fluorescens）、Ｐゲニクラータ（Pgeniculata）、Ｐ．レモンニエリ（P. lemonnieri）、Ｐ．パボナセア（P. pavonacea）、Ｐ．プチダ（P. putida）、Ｐ．レプティリボラ（P. reptilivora）、シュードモナス属（Pseudomonas）、Ｐ．スツッツェリ（P. stutzeri）、Ｐ．シンキサンタ（P. synxantha）、Ｐ．タエトロレンス（P. taetrolens）、セラチア・マルセセンス（Serratia marcescens）、キサントモナス・カンペストリルス（Xanthomonas campestrils）等々；Peterson RE and Ciegler A, L-asparaginase production by various bacteria. Applied Microbiol (1969) 17:929-930を参照）を含む、任意の供給源由来のアスパラギナーゼポリペプチドを意味する。幾つかの実施態様では、アスパラギナーゼは、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、又は配列番号：１５のアミノ酸配列を含む。
【0025】
「野生型」は、天然に存在するポリペプチドの非変異型、又はその断片を指す。野生型ポリペプチドは、組換え的に又は天然に産生されうる。天然に産生される野生型ポリペプチドはまた天然ポリペプチドとも呼ばれる。
【0026】
「変異体」とは、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して最大パーセントの配列同一性を達成した後、如何なる保存的置換も配列同一性の一部として考慮しないで、野生型（又は天然）配列ポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する生物学的に活性なポリペプチドを意味する。そのような変異体には、例えば、ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端において一又は複数のアミノ酸残基が付加され、欠失されているポリペプチドが含まれる。
【0027】
幾つかの実施態様では、変異体は、野生型（又は天然）配列ポリペプチドと、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
【0028】
「生物学的に活性な」エンティティ、又は「生物学的活性」を有するエンティティとは、代謝又は生理的プロセスに関連し又は付随する任意の機能を有し、及び／又は天然に生じる分子の構造的、調節的、又は生化学的機能を有するエンティティである。生物学的に活性なポリペプチド又はその断片には、限定されないが、酵素反応、リガンド－受容体相互作用、又は抗原－抗体結合を含む生物学的反応に関与しうるものが含まれる。生物学的活性は、所望の活性の改善、又は望ましくない活性の減少を含みうる。エンティティは、別の分子との分子相互作用に関与する場合、病状を緩和するのに治療的価値がある場合、免疫応答を誘導するのに予防的価値がある場合、分子の存在を決定する際に診断的及び／又は予後的価値がある場合に、生物学的活性を示しうる。
【0029】
ここで使用される場合、ペプチド、ポリペプチド、又は抗体配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」及び「相同性」は、特定のペプチド又はポリペプチド配列において、配列を整列させ、必要に応じて、ギャップを導入して、配列同一性の一部として保存的置換を考慮しないで、最大配列同一性パーセントを達成した後の、アミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的でのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＣＬＵＳＴＡＬ ＯＭＥＧＡ、ＡＬＩＧＮ、又はＭＥＧＡＬＩＧＮＴＭ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当業者の技量の範囲内である様々な方法で達成することができる。当業者であれば、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のパラメーターを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。
【0030】
ここで使用される場合、「アミノ酸位置ｎに対応する部位」又は「アミノ酸位置ｎに対応する位置」（ここで、ｎは任意の数又は数の範囲である）は、対象及び参照ポリペプチドのアミノ酸配列を整列させ、ギャップを導入した後に、参照ポリペプチドの位置ｎと整列する対象ポリペプチドのアミノ酸位置を指す。対象ポリペプチドの位置が参照ポリペプチドの位置ｎに対応するかどうかの目的のための整列化は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＣＬＵＳＴＡＬ ＯＭＥＧＡ、ＡＬＩＧＮ、又はＭＥＧＡＬＩＧＮＴＭ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当業者の技量の範囲内の様々な方法で達成することができる。当業者は、比較されている二つの配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のパラメーターを含む、アラインメントのための適切なパラメーターを決定することができる。幾つかの実施態様では、対象ポリペプチドと参照ポリペプチドは、異なる長さである。
【0031】
アミノ酸置換には、限定されないが、ポリペプチド中のあるアミノ酸の別のアミノ酸による置換が含まれうる。例示的な置換を表２に示す。アミノ酸置換を目的のタンパク質に導入し、産生物を所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善又は免疫原性の低下についてスクリーニングすることができる。
【0032】
【0033】
アミノ酸は、一般的な側鎖特性に従ってグループ化できる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【0034】
非保存的置換は、これらのクラスの一つのメンバーを別のクラスと交換することを必要とする。
【0035】
幾つかの実施態様では、変異体アスパラギナーゼポリペプチドは、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１２、及び配列番号：１５のアミノ酸配列を含んでいた。
【0036】
「ＰＥＧ結合可能」アミノ酸は、少なくとも一つのＰＥＧ分子と会合するか、又は共有的にもしくは非共有的に結合することができるアミノ酸又はアミノ酸誘導体を指す。
【0037】
幾つかの実施態様では、変異体アスパラギナーゼポリペプチドは、少なくとも一つのＰＥＧ結合可能アミノ酸置換を含む。幾つかの実施態様では、ＰＥＧ結合可能アミノ酸は、リジン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、又はそれらアミノ酸の何れかのアミノ酸誘導体を含む。
【0038】
ここで使用される「ＰＥＧ」は、ポリエチレングリコール部分を指す。
【0039】
ここで使用される「ペグ化」は、一又は複数のＰＥＧ部分が会合しているか、共有的又は非共有的に結合しているポリペプチドを指す。
【0040】
ここで使用される「シアル酸付加」は、一又は複数のシアル酸部分が共有的に結合しているポリペプチドを指す。
【0041】
グリコシル化及びシアル酸付加タンパク質を産生するための様々なアプローチが開発されている。例えば、Savinova等 Applied Biochem & Microbiol. (2015) 51(8): 827-833を参照のこと。
【0042】
幾つかの実施態様では、変異体アスパラギナーゼポリペプチドは、ペグ化及び／又はシアル酸付加される。幾つかの実施態様では、変異体アスパラギナーゼポリペプチドは、システイン、リジン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、又はそれらアミノ酸の任意のもののアミノ酸誘導体、例えばシステイン、リジン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシンのアミノ酸誘導体で、ペグ化及び／又はシアル酸付加される。
【0043】
「表面露出アミノ酸」は、当該技術分野で理解されている任意の標準的タンパク質モデリングソフトウェア、例えば、Ｓｗｉｓｓ－Ｍｏｄｅｌ、ＭＯＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）、Ｒｏｓｅｔｔａ、及びＭｏｄｅｌｌｅｒを使用して決定して、その表面の３０％以上が溶媒にアクセスできるアミノ酸を指す。
【0044】
幾つかの実施態様では、表面露出アミノ酸は、標準的タンパク質モデリングソフトウェアによって決定して、３０％以上の表面露出を有する（又はその表面の３０％以上が溶媒にアクセス可能である）アミノ酸を含む。幾つかの実施態様では、表面露出アミノ酸は、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の表面露出を有するアミノ酸を含む。
【0045】
「部分的に包埋されたアミノ酸」は、当該技術分野で理解されている標準的タンパク質モデリングソフトウェア、例えば、Ｓｗｉｓｓ－Ｍｏｄｅｌ、ＭＯＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）、Ｒｏｓｅｔｔａ、及びＭｏｄｅｌｌｅｒを使用して決定して、その表面の５％～３０％が溶媒にアクセスできないアミノ酸残基を指す。
【0046】
幾つかの実施態様では、部分的に包埋されたアミノ酸は、標準的タンパク質モデリングソフトウェアによって決定して、５％～３０％の表面露出（又はその表面の５％～３０％が溶媒にアクセス可能）を有するアミノ酸を含む。幾つかの実施態様では、表面露出アミノ酸は、５％～２５％、５％～２０％、５％～１５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、又は１０％～３０％の表面露出を有するアミノ酸を含む。
【0047】
ここで使用される「免疫原性又は抗原性部位」は、免疫反応の誘発に関与するポリペプチド内の任意のアミノ酸又は任意のアミノ酸群を指す。
【0048】
幾つかの実施態様では、免疫原性又は抗原性部位は、エピトープ内の任意のアミノ酸である。幾つかの実施態様では、免疫原性又は抗原性部位は、免疫原性又は抗原性部位、あるいは免疫原性又は抗原性部位に空間的に近いアミノ酸がＰＥＧにコンジュゲートされている場合、免疫原性又は抗原性が低い。
【0049】
別のアミノ酸に「空間的に近い」アミノ酸とは、三次元タンパク質モデリングによって決定して、それらの間の三次元の近接を意味する。二つのアミノ酸間の距離が３５オングストローム（Å）以下、３０Å以下、２５Å以下、２０Å以下、１５Å以下、１０Å以下、又は５Å以下ならば、アミノ酸は別のアミノ酸に空間的に近いということができる。
【0050】
ここで使用される場合、「エピトープ」という用語は、抗原結合分子（例えば、抗体、抗体断片、又は抗体結合領域を含むスキャホールドタンパク質）が結合する標的分子（例えば、タンパク質、核酸、炭水化物又は脂質などの抗原）上の部位を指す。エピトープは、アミノ酸、ポリペプチド又は糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面グループを含むことが多く、特異的三次元構造特性並びに特異的電荷特性を有している。エピトープは、標的分子の隣接又は並置された非隣接残基（例えば、アミノ酸、ヌクレオチド、糖、脂質部分）の両方から形成されうる。隣接残基（例えば、アミノ酸、ヌクレオチド、糖、脂質部分）から形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒への曝露の際、保持されるが、三次フォールディングによって形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒での処理の際に失われる。エピトープは、限定されないが、少なくとも３つ、少なくとも５つ又は８～１０の残基（例えば、アミノ酸又はヌクレオチド）を含みうる。幾つかの例では、エピトープは、長さが２０残基（例えば、アミノ酸又はヌクレオチド）未満、１５残基未満、又は１２残基未満である。二つの抗体は、抗原に対して競合的結合を示す場合、抗原内の同じエピトープに結合しうる。幾つかの実施態様では、エピトープは、抗原結合分子上のＣＤＲ残基までの所定の最小距離によって特定されうる。幾つかの実施態様では、エピトープは、上記の距離によって特定され得、そして更に、抗体残基と抗原残基との間の結合（例えば、水素結合）に関与する残基に限定されうる。エピトープは、様々なスキャンによっても同定でき、例えばアラニン又はアルギニンスキャンは、抗原結合分子が相互作用できる一又は複数の残基を示すことができる。明示的に示されない限り、エピトープとしての残基セットは、特定の抗体のエピトープの一部であることから他の残基を除外するものではない。むしろ、そのようなセットの存在は、エピトープの最小シリーズ（又は種のセット）を示す。従って、幾つかの実施態様では、エピトープとして特定された残基セットは、抗原上のエピトープの残基の排他的リストではなく、抗原に関連する最小のエピトープを指定する。
【0051】
幾つかの実施態様では、免疫原性又は抗原性部位は、当該技術分野で理解されているエピトープスキャニング法によって決定されうる。例えば、Moola, ZB, Erwinia chrysanthemi L-asparaginase: epitope mapping and production of antigenically modified enzymes. Biochem J. (1994) 921-927に記載されている方法による。
【0052】
幾つかの実施態様では、免疫原性又は抗原性部位は、配列番号：２のアミノ酸位置３７～４０又は２０５～２１２に対応するエピトープである。幾つかの実施態様では、免疫原性又は抗原性部位は、配列番号：２のアミノ酸位置３７、３８、３９、４０、４１、７２、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２６５、又は２８８に対応する。幾つかの実施態様では、免疫原性又は抗原性部位は、配列番号：１１のアミノ酸位置５５、５６、５７、５８、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、又は２５８に対応する。
【0053】
幾つかの実施態様では、変異体アスパラギナーゼポリペプチドは、配列番号：２の位置３、４、１７、２６、３７、３８、４１、４２、４４、４５、４７、４８、５１、５３、５４、５５、５６、５９、６０、６８、７２、７９、８２、８３、８４、８５、８７、１１０、１１２、１２３、１２４、１２５、１２７、１８０、１９０、１９１、１９２、１９８、２０２、２０５、２０６、２０８、２１０、２１２、２１３、２１５、２１６、２１９、２３１、２３９、２４０、２４１、２４３、２５７、２６０、２６１、２６４、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２８０、２８６、２８７、２８８、２８９、３１２、３１３、３１５、３１６、３１７、３１８、及び３２２から選択される位置に対応する少なくとも一つの位置に少なくとも一つのＰＥＧ結合可能アミノ酸置換又は少なくとも一つのシステイン置換を含む。
【0054】
幾つかの実施態様では、変異体アスパラギナーゼポリペプチドは、配列番号：２の位置４、１７、２６、３７、３８、４１、４２、４４、４５、５１、５３、５４、５５、５６、５９、６０、６８、７９、８２、８３、８４、８５、８７、１１２、１２３、１２４、１２５、１２７、１８０、１９０、１９１、１９２、１９８、２０２、２０５、２０６、２０８、２１０、２１２、２１３、２１５、２１６、２３１、２３９、２４０、２４１、２５７、２６０、２６１、２６４、２６７、２６８、２７０、２８０、２８６、２８７、２８８、２８９、３１２、３１３、３１５、３１６、３１７、及び３２２から選択される位置に対応する少なくとも一つの位置に少なくとも一つのＰＥＧ結合可能アミノ酸置換又は少なくとも一つのリジン置換を含む。
【0055】
幾つかの実施態様では、変異体アスパラギナーゼポリペプチドは、配列番号：１１の５１、５２、１１８、１１９、１９６、２０６、２８５、及び３１１から選択される位置に対応する少なくとも一つの位置に位置する少なくとも一つのシステインを含む。幾つかの実施態様では、変異体アスパラギナーゼポリペプチドは、表５に列挙されたＣ１－Ｃ２対システイン置換の何れか一つ又は組み合わせから選択される少なくとも一対のシステインを含む。例えば、変異体アスパラギナーゼポリペプチドは、配列番号：１１のアミノ酸位置１１６及び１２０、アミノ酸位置１９６及び２００、又はアミノ酸位置２２５及び２５２に対応する位置に位置する一又は複数対のシステインを含みうる。
【0056】
「親和性」という用語は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有相互作用の合計の強さを意味する。パートナーＹに対する分子Ｘの親和性は、一般に解離定数（ＫＤ）によって表すことができる。親和性は、例えば、イムノブロット、ＥＬＩＳＡ ＫＤ、ＫｉｎＥｘ Ａ、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、又は表面プラズモン共鳴装置などの当該技術分野で知られている一般的な方法によって測定することができる。
【0057】
「ＫＤ」、「Ｋｄ」、「Ｋｄ」又は「Ｋｄ値」という用語は、抗体－抗原相互作用の平衡解離定数を指すために交換可能に使用される。幾つかの実施態様では、抗体のＫｄは、供給業者の指示に従って、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）システム（Pall ForteBio LLC, Fremont, CA）などのバイオセンサーを使用するバイオレイヤー干渉法アッセイを使用することによって測定される。簡単に説明すると、ビオチン化抗原をセンサーチップに結合させ、抗体の結合が９０秒間モニターされ、解離が６００秒間モニターされる。希釈及び結合工程用の緩衝液は、２０ｍＭのリン酸、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２である。ドリフトを補正するために、緩衝液のみのブランク曲線を差し引く。データは、ＦｏｒｔｅＢｉｏデータ解析ソフトウェアを使用して２：１結合モデルに適合させ、結合速度定数（ｋｏｎ）、解離速度定数（ｋｏｆｆ）、及びＫｄを決定する。平衡解離定数（Ｋｄ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比率として計算される。「ｋｏｎ」という用語は、抗体の抗原への結合の速度定数を指し、「ｋｏｆｆ」という用語は、抗体／抗原複合体からの抗体の解離の速度定数を指す。
【0058】
「表面プラズモン共鳴」は、例えばＢＩＡｃｏｒｅＴＭシステム（BIAcore International AB, a GE Healthcare company, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.）を使用して、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することにより、リアルタイムの生体特異的相互作用の分析を可能にする光学現象を意味する。更なる説明については、Jonsson等 (1993) Ann. Biol. Clin. 51: 19-26を参照のこと。
【0059】
「バイオレイヤー干渉法」とは、バイオセンサーチップ上の固定化タンパク質の層と内部参照層から反射された光の干渉パターンを分析する光学分析技術を意味する。バイオセンサーチップに結合した分子の数の変化は、リアルタイムで測定できる干渉パターンのシフトを引き起こす。バイオレイヤー干渉法のための非限定的な例示的装置は、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）システム（Pall ForteBio LLC）である。例えば、 Abdiche等, 2008, Anal. Biochem. 377: 209-277を参照のこと。
【0060】
「低減させる」又は「阻害する」とは、参照と比較して、活性、機能、又は量を減少させ、低減させ、又は停止させることを意味する。幾つかの実施態様では、「低減させる」又は「阻害する」とは、２０％以上の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。幾つかの実施態様では、「低減させる」又は「阻害する」とは、５０％以上の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。幾つかの実施態様では、「低減させる」又は「阻害する」とは、７５％、８５％、９０％、９５％、又はそれ以上の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。幾つかの実施態様では、上記の量は、同じ期間にわたり対照用量（プラセボなど）と比較して、ある期間にわたって阻害され又は減少される。ここで使用される「参照」とは、比較目的で使用される任意のサンプル、標準、又はレベルを指す。参照は、健康な又は罹患していないサンプルから取得されうる。幾つかの例では、参照は、コンパニオンアニマルの非罹患又は未治療のサンプルから得られうる。幾つかの例では、参照は、試験又は治療されている動物ではない特定の種の一又は複数の健康な動物から得られる。
【0061】
ここで使用される「実質的に低減された」という用語は、当業者が二つの値の差を、該値によって測定される生物学的特性の文脈において統計的に有意であるとみなすような、数値と参照数値との間の十分に高度な低減を意味する。幾つかの実施態様では、実質的に低減された数値は、参照値と比較しておよそ１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％の何れか一よりも多く低減される。
【0062】
［例示的な発現及び産生］
リーダー配列の有無にかかわらず、アスパラギナーゼポリペプチドの全部又は一部をコードするポリヌクレオチド配列が提供される。相同リーダー配列（すなわち、野生型アスパラギナーゼのリーダー配列）が核酸分子の構築に使用されない場合、別の細菌リーダー配列が使用されうる。
リーダー配列の有無にかかわらず、アスパラギナーゼポリペプチドの全部又は一部をコードするポリヌクレオチド配列が提供される。相同リーダー配列（すなわち、野生型アスパラギナーゼのリーダー配列）が核酸分子の構築に使用されない場合、別の細菌リーダー配列が使用されうる。
【0063】
典型的には、ここに記載のアスパラギナーゼポリペプチドなどの目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、選択された宿主細胞での発現に適した発現ベクター中に挿入される。
【0064】
「ベクター」という用語は、クローン化されたポリヌクレオチド又は宿主細胞内で増殖させることができるポリヌクレオチドを含むように操作することができるポリヌクレオチドを記述するために使用される。ベクターは、次のエレメント：複製起点、目的のポリペプチドの発現を調節する一又は複数の調節配列（例えば、プロモーター又はエンハンサーなど）、又は一又は複数の選択可能マーカー遺伝子（例えば、抗生物質耐性遺伝子及び比色分析で使用できる遺伝子、例えば、β－ガラクトシダーゼなど）の一又は複数を含みうる。「発現ベクター」という用語は、宿主細胞において目的のポリペプチドを発現させるために使用されるベクターを指す。
【0065】
「宿主細胞」は、ベクター又は単離されたポリヌクレオチドのレシピエントでありうるか、又はレシピエントであった細胞を指す。宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞でありうる。例示的な原核細胞には、大腸菌、桿菌、及びシュードモナスが含まれる。例示的な真核細胞には、霊長類又は非霊長類動物細胞などの哺乳動物細胞；酵母などの真菌細胞；植物細胞；及び昆虫細胞が含まれる。非限定的な例示的哺乳動物細胞には、限定されないが、ＮＳ０細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞（Ｃｒｕｃｅｌｌ）、２９３細胞、及びＣＨＯ細胞、並びにそれらの派生体、例えば、２９３－６Ｅ、ＤＧ４４、ＣＨＯ－Ｓ、及びＣＨＯ－Ｋ細胞が含まれる。宿主細胞には単一の宿主細胞の子孫が含まれ、子孫は、自然、偶発的、又は意図的な変異のために、必ずしも元の親細胞と完全に同一（形態又はゲノムＤＮＡ相補体において）であるとは限らない。宿主細胞は、ここで提供されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドでインビボでトランスフェクトされた細胞を含む。
【0066】
ここで使用される「単離された」という用語は、それが典型的には天然に見出されるか又は産生される成分の少なくとも幾つかから分離された分子を指す。例えば、ポリペプチドは、それが産生された細胞の成分の少なくとも幾つかから分離される場合、「単離された」と呼ばれる。ポリペプチドが発現後に細胞によって分泌される場合、ポリペプチドを含む上清をそれを産生した細胞から物理的に分離することは、ポリペプチドを「単離する」とみなされる。同様に、ポリヌクレオチドは、それが典型的には天然に見出される大きなポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチドの場合における、ゲノムＤＮＡ又はミトコンドリアＤＮＡなど）の一部ではない場合、あるいは、例えばＲＮＡポリヌクレオチドの場合、それが産生された細胞の成分の少なくとも幾つかから分離されている場合、「単離された」と呼ばれる。従って、宿主細胞内のベクターに含まれるＤＮＡポリヌクレオチドは、「単離された」と呼ばれうる。幾つかの実施態様では、アスパラギナーゼは、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、及びＣＨＴクロマトグラフィー又は混合モードクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを使用して精製される。
【0067】
［例示的な薬学的組成物］
「薬学的製剤」及び「薬学的組成物」という用語は、活性成分の生物学的活性が有効になることを可能にするような形態であり、製剤が投与される対象に対して容認できないほど毒性のある追加の成分を含まない調製物を指す。
「薬学的製剤」及び「薬学的組成物」という用語は、活性成分の生物学的活性が有効になることを可能にするような形態であり、製剤が投与される対象に対して容認できないほど毒性のある追加の成分を含まない調製物を指す。
【0068】
「薬学的に許容される担体」とは、対象への投与のための「薬学的組成物」を一緒に含む治療剤と共に使用するための、当該分野で一般的な非毒性固体、半固体、又は液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料、製剤補助剤、又は担体を指す。薬学的に許容される担体は、用いられる投薬量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、製剤の他の成分と適合性がある。薬学的に許容される担体は、用いられる製剤に適切である。薬学的に許容される担体の例には、アルミナ；ステアリン酸アルミニウム；レシチン；血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、イヌ又は他の動物アルブミン；緩衝液、例えばリン酸塩、クエン酸塩、トロメタミン又はＨＥＰＥＳ緩衝液；グリシン；ソルビン酸；ソルビン酸カリウム；飽和植物性脂肪酸の部分的グリセリド混合物；水；塩又は電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、又は三ケイ酸マグネシウム；ポリビニルピロリドン、セルロース系物質；ポリエチレングリコール；スクロース；マンニトール；又はアルギニンを含むがこれに限定されないアミノ酸が含まれる。
【0069】
薬学的組成物は、凍結乾燥形態で保存することができる。従って、幾つかの実施態様では、調製方法は、凍結乾燥工程を含む。次に、凍結乾燥された組成物は、対象への投与の前に、典型的には非経口投与に適した水性組成物として、再処方されうる。他の実施態様では、特にポリペプチドが熱的及び酸化的変性に対して非常に安定である場合、薬学的組成物は、対象に直接又は適切な希釈で投与されうる液体として、すなわち水性組成物として保存されうる。凍結乾燥された組成物は、注射用滅菌水（ＷＦＩ）で再構成することができる。ベンジルアルコールなどの静菌試薬が含まれる場合がある。従って、本発明は、固体又は液体の形態の薬学的組成物を提供する。
【0070】
薬学的組成物のｐＨは、投与される場合、約ｐＨ５から約ｐＨ８の範囲でありうる。本発明の組成物は、それらが治療目的で使用される場合、無菌である。無菌性は、除菌濾過膜（例えば、０．２ミクロン膜）による濾過を含む、当該技術分野で知られている幾つかの手段の何れかによって達成することができる。無菌性は、抗菌剤の有無にかかわらず維持されうる。
【0071】
［変異体アスパラギナーゼポリペプチドの使用例］
本発明の変異体アスパラギナーゼポリペプチド又は変異体アスパラギナーゼポリペプチドを含む薬学的組成物は、リンパ腫又は白血病などのがんを含む様々な病状を治療するために有用でありうる。幾つかの実施態様では、本発明の変異体アスパラギナーゼポリペプチド又は変異体アスパラギナーゼポリペプチドを含む薬学的組成物は、ヒトのＡＬＬ又はコンパニオンアニマル種のリンパ腫の治療に使用されうる。
本発明の変異体アスパラギナーゼポリペプチド又は変異体アスパラギナーゼポリペプチドを含む薬学的組成物は、リンパ腫又は白血病などのがんを含む様々な病状を治療するために有用でありうる。幾つかの実施態様では、本発明の変異体アスパラギナーゼポリペプチド又は変異体アスパラギナーゼポリペプチドを含む薬学的組成物は、ヒトのＡＬＬ又はコンパニオンアニマル種のリンパ腫の治療に使用されうる。
【0072】
「コンパニオンアニマル種」という用語は、ヒトのコンパニオンになるのに適した動物を指す。幾つかの実施態様では、コンパニオンアニマル種は、小型哺乳動物、例えばイヌ科動物（canine）、ネコ科動物（feline）、イヌ、ネコ、ウマ、ウサギ、フェレット、モルモット、げっ歯類などである。幾つかの実施態様では、コンパニオンアニマル種は家畜、例えばウマ、ウシ、ブタ等々である。
【0073】
ここで使用される場合、「治療」は、有益な又は所望の臨床結果を得るためのアプローチである。ここで使用される「治療」は、コンパニオンアニマルを含む哺乳動物における疾患の治療薬の任意の投与又は適用を包含する。この開示の目的では、有益な又は望ましい臨床結果には、限定されないが、次の何れか一又は複数が含まれる：一又は複数の症状の緩和、疾患の程度の減少、疾患の広がりの防止又は遅延化、疾患の再発の防止又は遅延化、疾患の進行の遅延又は緩徐化、病状の回復、疾患又は疾患進行の阻害、疾患又はその進行の阻害又は緩徐化、その発症の停止、及び寛解（部分又は完全）。「治療」にまた包含されるものは、増殖性疾患の病理学的帰結の軽減である。ここで提供される方法は、治療のこれらの態様の何れか一又は複数を企図している。上記に沿って、治療という用語は、障害の全ての態様を１００パーセント除去することを要しない。
【0074】
物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストの「治療上有効な量」は、治療される疾患のタイプ、疾患状態、疾患の重症度及び経過、治療目的のタイプ、何らかの以前の治療法、臨床歴、前治療への反応、担当獣医の裁量、動物の年齢、性別、及び体重、並びに動物において所望の反応を誘発する物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストの能力などの要因によって変化しうる。治療上有効な量は、物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストの何らかの毒性又は有害な作用よりも治療上有益な効果がよりまさる量でもある。治療上有効な量は、一又は複数回の投与で送達されうる。治療上有効な量とは、所望の治療又は予防結果を達成するための、必要な投薬量及び期間での有効な量を意味する。
【0075】
幾つかの実施態様では、ここに記載される、変異体アスパラギナーゼポリペプチド又は変異体アスパラギナーゼポリペプチドを含む薬学的組成物は、皮下投与、静脈内注入、又は筋肉内注射によって非経口的に投与される。幾つかの実施態様では、変異体アスパラギナーゼポリペプチド又は薬学的組成物は、ボーラス注射として、又は一定期間にわたる持続注入によって投与される。幾つかの実施態様では、変異体アスパラギナーゼポリペプチド又は薬学的組成物は、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、動脈内、滑液嚢内、髄腔内、又は吸入経路によって投与される。
【0076】
幾つかの実施態様では、用量は、少なくとも二週間又は三週間連続して週一回投与され、幾つかの実施態様では、この治療サイクルが二回以上繰り返され、任意選択的に一又は複数週の無治療期間が組み入れられる。他の実施態様では、治療上有効な用量は、二日から五日間連続して一日一回投与され、幾つかの実施態様では、この治療サイクルが二回以上繰り返され、任意選択的に一又は複数日又は週の無治療期間が組み入れられる。
【0077】
一又は複数種の更なる治療剤「と組み合わせて」の投与は、同時（同時的）と任意の順序での連続又は逐次的投与を含む。「同時に」という用語は、ここでは、投与の少なくとも一部が時間的に重複し、又は一方の治療剤の投与が他方の治療剤の投与に対して短期間内にある、二種以上の治療剤の投与を指すために使用される。例えば、二種以上の治療剤が、ほぼ指定された分数以下の時間分離で投与される。「逐次に」という用語は、ここでは、一又は複数種の薬剤の投与が、一又は複数種の他の薬剤の投与を中止した後に続くか、又は一又は複数種の薬剤の投与が、一又は複数種の他の薬剤の投与前に始まる、二種以上の治療剤の投与を指すために使用される。例えば、二種以上の治療剤の投与は、ほぼ指定された分数を超える時間分離で投与される。ここで使用される場合、「と組み合わせて」は、別の治療モダリティに加えての、ある治療モダリティの投与を指す。而して、「と組み合わせて」とは、動物への他の治療モダリティの投与の前、最中、又は後に、ある治療モダリティの投与を指す。
【0078】
次の実施例は、本開示の特定の態様を例証しており、決して本開示を限定することを意図するものではない。
【実施例0079】
実施例１
大腸菌におけるＥ．クリサンテミ・アスパラギナーゼの発現
その天然宿主細胞で発現される天然Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼは典型的には、処理され、ペリプラズム又は培地に分泌される。大腸菌細胞におけるＥ．クリサンテミ・アスパラギナーゼの発現を調べた。リーダー配列を含む天然Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号：１）を、Ｔ７プロモーター及びカナマイシン耐性遺伝子を有する大腸菌発現ベクターであるｐＥＴ２８ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＸｂａ１及びＨｉｎｄＩＩＩ部位間にクローン化した。得られたプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞中に形質転換した後、６００ｎｍでの光学密度がおよそ１に達するまで、細胞を３７℃においてインキュベートした。次に、１ｍＭのＩＰＴＧを培地に添加し、細胞を３７℃において２時間インキュベートし、Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼタンパク質の発現を誘導した。
大腸菌におけるＥ．クリサンテミ・アスパラギナーゼの発現
その天然宿主細胞で発現される天然Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼは典型的には、処理され、ペリプラズム又は培地に分泌される。大腸菌細胞におけるＥ．クリサンテミ・アスパラギナーゼの発現を調べた。リーダー配列を含む天然Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号：１）を、Ｔ７プロモーター及びカナマイシン耐性遺伝子を有する大腸菌発現ベクターであるｐＥＴ２８ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＸｂａ１及びＨｉｎｄＩＩＩ部位間にクローン化した。得られたプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞中に形質転換した後、６００ｎｍでの光学密度がおよそ１に達するまで、細胞を３７℃においてインキュベートした。次に、１ｍＭのＩＰＴＧを培地に添加し、細胞を３７℃において２時間インキュベートし、Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼタンパク質の発現を誘導した。
【0080】
細胞を浸透圧ショックに供し、ペリプラズムからタンパク質を放出させた。細胞を遠心分離し、上清（浸透圧画分とも呼ぶ）を単離した。細胞ペレットを再懸濁させ、超音波処理に供して細胞を溶解させた。細胞を遠心分離し、ライセート（可溶性画分とも呼ぶ）をペレット（不溶性画分とも呼ぶ）から分離させた。三種の画分（浸透圧、可溶性、及び不溶性画分）をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、クーマシー染色を使用して視覚化した。
【0081】
バンド強度と分子量の違いに基づいて、浸透圧画分には処理されたアスパラギナーゼの収量が非常に低いように見えた一方、全長アスパラギナーゼ生成物の大部分が細胞ペレット（不溶性画分）で観察された。ライセート画分（可溶性画分）には、未処理のアスパラギン生成物が少量観察された。これらの結果は、大腸菌におけるＥ．クリサンテミ・アスパラギナーゼのペリプラズム発現は非効率的であり、未処理のアスパラギナーゼ生成物の大部分が、おそらくリーダー配列のプロセシングの失敗のために、不溶性の形態（例えば、凝集体、封入体など）で細胞内に閉じ込められたことを示唆している。
【0082】
実施例２
Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼの細胞内発現
大腸菌細胞におけるリーダー配列を欠くＥ．クリサンテミ・アスパラギナーゼの発現をまた調べた。そのリーダー配列を欠く天然Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号：３）をｐＥＴ２８ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＸｂａ１及びＨｉｎｄＩＩＩ部位間にクローン化し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換し、実施例１に記載のように１ｍＭのＩＰＴＧの存在下で培養した。細胞を超音波処理によって溶解させ、遠心分離し、ライセート（可溶性画分）及びペレット（不溶性画分）をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、クーマシー染色を使用して視覚化した。驚くべきことに、より高い収量の溶解性の細胞内発現アスパラギナーゼがライセートで観察された。
Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼの細胞内発現
大腸菌細胞におけるリーダー配列を欠くＥ．クリサンテミ・アスパラギナーゼの発現をまた調べた。そのリーダー配列を欠く天然Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号：３）をｐＥＴ２８ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＸｂａ１及びＨｉｎｄＩＩＩ部位間にクローン化し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換し、実施例１に記載のように１ｍＭのＩＰＴＧの存在下で培養した。細胞を超音波処理によって溶解させ、遠心分離し、ライセート（可溶性画分）及びペレット（不溶性画分）をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、クーマシー染色を使用して視覚化した。驚くべきことに、より高い収量の溶解性の細胞内発現アスパラギナーゼがライセートで観察された。
【0083】
実施例３
部位特異的チオールコンジュゲーションのための変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド
グラム陰性菌の分泌タンパク質は、典型的には、ペリプラズム内のチオール－ジスルフィドオキシドレダクターゼによってシステイン残基で触媒されるジスルフィド結合を含んでいる。例えば、天然大腸菌アスパラギナーゼには、タンパク質のただ二つシステイン残基間に一つのジスルフィド結合がある。しかし、Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼの一次アミノ酸配列を調べたところ、このタンパク質にはシステイン残基がないことが明らかになった。この知見は、天然Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼがジスルフィド結合を欠いており、ペリプラズムの酸化環境がこのタンパク質の折り畳みには必要ではない可能性があることを示唆している。
部位特異的チオールコンジュゲーションのための変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド
グラム陰性菌の分泌タンパク質は、典型的には、ペリプラズム内のチオール－ジスルフィドオキシドレダクターゼによってシステイン残基で触媒されるジスルフィド結合を含んでいる。例えば、天然大腸菌アスパラギナーゼには、タンパク質のただ二つシステイン残基間に一つのジスルフィド結合がある。しかし、Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼの一次アミノ酸配列を調べたところ、このタンパク質にはシステイン残基がないことが明らかになった。この知見は、天然Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼがジスルフィド結合を欠いており、ペリプラズムの酸化環境がこのタンパク質の折り畳みには必要ではない可能性があることを示唆している。
【0084】
細菌タンパク質は、ヒトに対して非常に免疫原性がある。細菌タンパク質のペグ化は、免疫原性の位置を遮蔽し、免疫原性を低下させうる。加えて、ペグ化はタンパク質の生体内半減期を延長しうる。ＯＮＣＡＳＰＡＲ（登録商標）（ペグアスパラガーゼ、Ｓｈｉｒｅ）では、大腸菌由来アスパラギナーゼは、表面に露出した第一級アミン（例えば、リジン残基）でペグ化される。残念ながら、そのような非特異的なペグ化は、不均一な生成物を生じうる。タンパク質全体ではなく、特定の免疫原性部位でのペグ化が有利でありうる。
【0085】
天然Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼはシステイン残基を含まないので、一又は複数のシステイン置換を含む変異体はそれらの位置で特異的にペグ化されうる。Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼの免疫原性又は抗原性部位又はその近くへの一又は複数のシステイン残基の導入を調べた。四量体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼの三次元タンパク質構造解析を使用して、ペグ化がその活性部位に影響を与えることなく部位を遮蔽しうる潜在的な免疫原性又は抗原性部位又はその近くの表面露出アミノ酸の位置を特定した。潜在的な免疫原性又は抗原性部位には、成熟アミノ酸配列（配列番号：２）のアミノ酸位置３７～４１、７２、２０５～２１２、２６５、及び２８８が含まれる。表２は、免疫原性低下のための部位特異的ペグ化のためにシステイン残基が導入されうる配列番号：２のアミノ酸位置を列挙している。
【0086】
【0087】
変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチドは、表２に列挙されているアミノ酸位置の何れか一又は何れかの組み合わせに一又は複数のシステイン残基を導入することによって調製することができる。例えば、２、３、４、５、６、又はそれ以上のシステイン残基が、Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼに導入されうる。
【0088】
例として、成熟アミノ酸配列の位置４１、７２、及び２６５に３つのシステインアミノ酸置換を有する（配列番号：４）か、又は位置４１、７２、２６５、及び２８８に４つのシステインアミノ酸置換を有する（配列番号：７）変異体前駆体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチドを調製することができる。
【0089】
実施例４
変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチドの細胞内発現
ペリプラズムの酸化環境はシステイン残基間のジスルフィド結合を触媒するが、システインチオール基は細胞質の還元環境において酸化から保護される。免疫原性又は抗原性部位にシステイン置換を含む変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチドの細胞内発現を、大腸菌細胞で探求した。リーダー配列の代わりにＮ末端ポリＨｉｓタグを有し、成熟アミノ酸配列の位置４１、７２、及び２６５に３つのシステインアミノ酸置換を有する変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号：５）をｐＥＴ２８ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローン化した。得られたプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換した後、６００ｎｍでの光学密度がおよそ１に達するまで、細胞を３７℃においてインキュベートした。次に、１ｍＭのＩＰＴＧを培地に添加し、細胞を３７℃において２時間インキュベートし、変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼタンパク質の発現を誘導した。
変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチドの細胞内発現
ペリプラズムの酸化環境はシステイン残基間のジスルフィド結合を触媒するが、システインチオール基は細胞質の還元環境において酸化から保護される。免疫原性又は抗原性部位にシステイン置換を含む変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチドの細胞内発現を、大腸菌細胞で探求した。リーダー配列の代わりにＮ末端ポリＨｉｓタグを有し、成熟アミノ酸配列の位置４１、７２、及び２６５に３つのシステインアミノ酸置換を有する変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号：５）をｐＥＴ２８ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローン化した。得られたプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換した後、６００ｎｍでの光学密度がおよそ１に達するまで、細胞を３７℃においてインキュベートした。次に、１ｍＭのＩＰＴＧを培地に添加し、細胞を３７℃において２時間インキュベートし、変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼタンパク質の発現を誘導した。
【0090】
細胞を超音波処理によって溶解させ、遠心分離し、Ｎｉセファロースエクセルヒスチンタグ付きタンパク質精製樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１７３７１２０１）を使用するアフィニティークロマトグラフィーと、続くスルホプロピルセファロースファストフロー（ＳＰ ＦＦ）陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１７０７２９０１）を使用する陽イオン交換クロマトグラフィーによってライセートから変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼ（配列番号５）を精製した。ＳＰ ＦＦカラムをｐＨ６、続いてｐＨ７の０．１Ｍのリン酸ナトリウムで洗浄し、タンパク質を０．１Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ７）と１Ｍの塩化ナトリウムの溶液で溶出させた。図１Ａを参照のこと。非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して精製タンパク質を分離し、クーマシー染色を使用して可視化した（図１Ｂ）。
【0091】
加えて、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、精製された変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼ（配列番号：５）の流体力学的半径をＮｏｖｅｘ Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄマーカー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号ＬＣ５８００）のものと比較し、精製されたタンパク質が四量体であったことを確認した。精製したタンパク質を、毎分０．５ｍＬの一定流量で、Ａｇｉｌｅｎｔの１１００クロマトグラフィーシステムと、０．１Ｍのリン酸ナトリウムｐＨ６．６と１Ｍの塩化ナトリウムのランニングバッファーを使用して、ＫＷ－Ｇガードカラムを備えたＳｈｏｄｅｘ ＫＷ８０３カラム（８ｍｍ×３００ｍｍ）にロードした。溶出した物質を、２１４ｎｍの波長での吸光度によってモニターした。精製した変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼ生成物（配列番号：５）は１６．５分で溶出し、溶液中のタンパク質の四量体型の予測分子量（～１１７．４ｋＤａ）と一致した。図２Ａ及び図２Ｂを参照のこと。
【0092】
実施例５
変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチドの部位特異的ペグ化
精製された変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼ（配列番号：５）のコンジュゲーションを、（１）α－スクシンイミジルオキシグルタリル－ω－メトキシ，ポリオキシエチレン（ｍ．ｗ．５ｋＤ；ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＭＥ－０５０ＧＳ；ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いるランダムアミンペグ化、（２）α－［３－（３－マレイミド－１－オキソプロピル）アミノ］プロピル－ω－メトキシ，ポリオキシエチレン（ｍ．ｗ．１０ｋＤ；ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＭＥ－１００ＭＡ；ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いるチオール特異的ペグ化、又は（３）両方の方法を、製造元の指示に従って、使用して実施した。
変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチドの部位特異的ペグ化
精製された変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼ（配列番号：５）のコンジュゲーションを、（１）α－スクシンイミジルオキシグルタリル－ω－メトキシ，ポリオキシエチレン（ｍ．ｗ．５ｋＤ；ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＭＥ－０５０ＧＳ；ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いるランダムアミンペグ化、（２）α－［３－（３－マレイミド－１－オキソプロピル）アミノ］プロピル－ω－メトキシ，ポリオキシエチレン（ｍ．ｗ．１０ｋＤ；ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＭＥ－１００ＭＡ；ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いるチオール特異的ペグ化、又は（３）両方の方法を、製造元の指示に従って、使用して実施した。
【0093】
チオール特異的ペグ化については、異なる反応時間（５分と６０分）と異なる反応温度（室温と３７℃）を試験した。ペグ化タンパク質を、還元（＋ＤＴＴあり）及び非還元（ＤＴＴなし）条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、クーマシー染色を使用して可視化した（図３）。非ペグ化タンパク質は、還元（図３、レーン２）及び非還元条件（図３、レーン３）下で約３５ｋＤａで流れ、精製された変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼ（配列番号：５）にジスルフィド結合が存在しないことを示唆している。ペグ化サンプル（図３、レーン４～９）は、タンパク質のペグ化と一致したより高い分子量で流れた。
【0094】
上記のように、ランダムアミンペグ化及び／又はチオール特異的ペグ化を介してコンジュゲートした変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼ（配列番号：５）のアスパラギナーゼ活性を、アスパラギナーゼ活性アッセイキット（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ；カタログ番号Ｋ７５４－１００）を、製造元の指示に従って二通り使用して、測定した。アッセイの結果を以下の表３に示す。結果は、変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼ（配列番号：５）がペグ化後に酵素活性を維持したことを示している。
【0095】
【0096】
実施例６
部位特異的アミンコンジュゲーションのための変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド
表面に露出した第一級アミン（例えば、リジン）は、アミン反応性ＰＥＧ誘導体にコンジュゲートされうる。ペグ化は特異性が低く、生成物が不均一である場合がある。表面に露出した位置に一又は複数の追加のリジン残基を導入すると、アミン反応性ペグ化のための追加の部位を提供できる。例えば、変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチドは、成熟アミノ酸配列（配列番号：２）のアミノ酸位置４１、７２、２６５、及び２８８などの潜在的な免疫原性又は抗原性部位又はその近くにおいて一又は複数のリジン残基を置換することによって調製することができる。表４には、部位特異的ペグ化のためにリジン残基が導入されうる、成熟アミノ酸配列（配列番号：２）のアミノ酸位置４１、７２、２６５、及び２８８又はその近くのＥ．クリサンテミ・アスパラギナーゼの例示的な表面露出アミノ酸位置を列挙する。
部位特異的アミンコンジュゲーションのための変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチド
表面に露出した第一級アミン（例えば、リジン）は、アミン反応性ＰＥＧ誘導体にコンジュゲートされうる。ペグ化は特異性が低く、生成物が不均一である場合がある。表面に露出した位置に一又は複数の追加のリジン残基を導入すると、アミン反応性ペグ化のための追加の部位を提供できる。例えば、変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチドは、成熟アミノ酸配列（配列番号：２）のアミノ酸位置４１、７２、２６５、及び２８８などの潜在的な免疫原性又は抗原性部位又はその近くにおいて一又は複数のリジン残基を置換することによって調製することができる。表４には、部位特異的ペグ化のためにリジン残基が導入されうる、成熟アミノ酸配列（配列番号：２）のアミノ酸位置４１、７２、２６５、及び２８８又はその近くのＥ．クリサンテミ・アスパラギナーゼの例示的な表面露出アミノ酸位置を列挙する。
【0097】
【0098】
変異体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチドは、表４に列挙されているアミノ酸位置の何れか一又は何れかの組み合わせに一又は複数のリジン残基を導入することによって調製することができる。例えば、２、３、４、５、６、又はそれ以上のリジン残基を、Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼに導入することができる。
【0099】
例として、成熟アミノ酸配列の位置４１（配列番号８）又は位置４１及び２８８（配列番号：９）にリジンアミノ酸置換を有する変異体前駆体Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼポリペプチドを調製することができる。
【0100】
実施例７
部位特異的アミン結合のための変異大腸菌アスパラギナーゼポリペプチド
大腸菌Ｌ－アスパラギナーゼＩＩ（配列番号：１０）は現在、急性リンパ芽球性白血病の治療薬として承認されている。残念ながら、免疫反応が重大な有害な副作用である。部位特異的ペグ化は、免疫学的副作用を低減させるのに有利であろう。天然大腸菌アスパラギナーゼタンパク質には、リーダー配列と、単一のジスルフィド結合を形成する、２つのシステイン残基がある。タンパク質は処理されペリプラズムに分泌され、ジスルフィド結合を形成すると考えられる。Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼとは異なり、大腸菌アスパラギナーゼは、ペリプラズム内でのジスルフィド結合が適切なタンパク質フォールディングに必要でありうるため、細胞内発現には適さない場合がある。大腸菌アスパラギナーゼの部位特異的ペグ化のための異なるアプローチを調べた。
部位特異的アミン結合のための変異大腸菌アスパラギナーゼポリペプチド
大腸菌Ｌ－アスパラギナーゼＩＩ（配列番号：１０）は現在、急性リンパ芽球性白血病の治療薬として承認されている。残念ながら、免疫反応が重大な有害な副作用である。部位特異的ペグ化は、免疫学的副作用を低減させるのに有利であろう。天然大腸菌アスパラギナーゼタンパク質には、リーダー配列と、単一のジスルフィド結合を形成する、２つのシステイン残基がある。タンパク質は処理されペリプラズムに分泌され、ジスルフィド結合を形成すると考えられる。Ｅ．クリサンテミ・アスパラギナーゼとは異なり、大腸菌アスパラギナーゼは、ペリプラズム内でのジスルフィド結合が適切なタンパク質フォールディングに必要でありうるため、細胞内発現には適さない場合がある。大腸菌アスパラギナーゼの部位特異的ペグ化のための異なるアプローチを調べた。
【0101】
大腸菌アスパラギナーゼに特定のペグ化部位を導入するための一つのアプローチは、潜在的な免疫原性又は抗原性部位又はその近くに部分的に包埋されている位置に不対システインを置換することを含む。部分的に包埋されている部位の不対システインのチオール基は、ペリプラズムでの酸化から遮蔽されうるが、ペグ化などのコンジュゲーション反応に十分に曝露されている。四量体大腸菌Ｌ－アスパラギナーゼＩＩの三次元タンパク質構造解析を使用して、ペグ化がその活性部位に影響を与えることなくその部位を遮蔽しうる潜在的な免疫原性又は抗原性部位又はその近くに部分的に包埋されているアミノ酸の位置を特定した。例えば、一又は複数の不対システイン残基は、成熟アミノ酸配列（配列番号：１１）のアミノ酸位置５５～５８、１１４～１１９、２０１～２０７、及び２５２～２５８などの免疫原性又は抗原性部位又はその近くの部分的に包埋されている部位で置換されうる。例として、変異大腸菌アスパラギナーゼポリペプチドは、成熟アミノ酸配列（配列番号：１１）に基づく次のアミノ酸位置の何れか一又は複数で一又は複数の不対システイン残基を置換することによって調製することができる：Ｅ５１Ｃ、Ｑ５２Ｃ、Ｓ１１８Ｃ、Ｔ１１９Ｃ、Ｋ１９６Ｃ、Ｓ２０６Ｃ、Ｄ２８５Ｃ、及びＴ３１１Ｃ。
【0102】
特定のペグ化部位を大腸菌アスパラギナーゼに導入するための第二の方法は、潜在的な免疫原性又は抗原性部位又はその近くに一又は複数の対のシステイン残基を導入することを含む。置換システイン対のチオール基がペリプラズムで酸化されるのではなく、対がジスルフィド結合を形成する必要がある。次に、ジスルフィド結合（元々の結合を含む）を、ＤＴＴなどの還元剤を使用して還元し、結合を可能にすることができる。ペグ化又は標識化は、チオール－インカップリング反応などの様々な化学反応を使用して、対になったシステインを再架橋させることによって達成されうる。Griebenow N.等, Site-specific conjugation of peptides and proteins via rebridging of disulfide bonds using the thiol-yne coupling reaction. Bioconjug Chem (2016) 4: 911-917を参照のこと。
【0103】
四量体大腸菌Ｌ－アスパラギナーゼＩＩの三次元タンパク質構造解析を使用して、ペグ化がその活性部位に影響を与えることなくその部位を遮蔽しうる潜在的な免疫原性又は抗原性部位又はその近くに対のシステイン残基を導入するための位置を特定した。対になったシステインは、四量体タンパク質の同じドメイン内又はドメイン間で導入されうる。例えば、表５は、同じドメイン内又はドメイン間で四量体大腸菌アスパラギナーゼに導入されうる対のシステイン残基（Ｃ１及びＣ２）の組み合わせのリストを示している。例として、図４は、配列番号：１１（配列番号：１２）の位置８及び３２に導入されたシステイン対を有する変異大腸菌アスパラギナーゼポリペプチドの仮想的な三次元構造を示している。追加のシステイン対が図において特定されている。
【0104】
【0105】
大腸菌アスパラギナーゼに特定のペグ化部位を導入するための第三のアプローチは、成熟アミノ酸配列（配列番号：１１）のアミノ酸位置５５～５８、１１４～１１９、２０１～２０７、及び２５２～２５８又は空間的にその近くなど、潜在的な免疫原性又は抗原性部位又は空間的にその近くの表面露出位置に一又は複数の追加のリジン残基を導入することを含む。例えば、次のリジン置換の一又は複数を有する変異体大腸菌アスパラギナーゼポリペプチドを調製することができる：Ｓ５８Ｋ、Ｒ１１６Ｋ、及び／又はＤ２４０Ｋ。
【0106】
実施例８
変異体大腸菌Ｋ－１２アスパラギナーゼポリペプチドＥＬＳＰＡＲ（登録商標）は、ＡＬＬの治療に適用される大腸菌Ｌ－アスパラギナーゼであり、イヌとネコのリンパ腫の治療のために獣医師によって処方されている。ＥＬＳＰＡＲ（登録商標）は大腸菌Ｋ－１２株に由来し、５つのシステイン残基を有している。前駆体アミノ酸配列は配列番号：１３として提供され、成熟配列は配列番号：１４によって提供される。四量体ＥＬＳＰＡＲ（登録商標）の三次元タンパク質構造解析を使用して、配列番号：１４の位置６７及び２００の二つのシステインがおそらくジスルフィド結合を形成し、配列番号：１４の位置４５、６７、及び２４２の残りの三つのシステインはおそらく対になっていないことを特定した。タンパク質凝集の可能性及び／又は他の分子への反応性を低減させるために、不対システインの一つ、二つ、又は三つ全てをセリンなどの他のアミノ酸で置換することができる。例えば、配列番号：１４のアミノ酸位置４５、６７、及び２４２に三つの不対システインの代わりにセリンを有する変異体大腸菌アスパラギナーゼを調製することができる（配列番号：１５）。一又は複数の不対システイン残基を有するアスパラギナーゼポリペプチド（例えば、配列番号：１４のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号：１４の一つ又は二つのシステイン残基のみが置換されているポリペプチド）をコンジュゲーションに使用することができる。
変異体大腸菌Ｋ－１２アスパラギナーゼポリペプチドＥＬＳＰＡＲ（登録商標）は、ＡＬＬの治療に適用される大腸菌Ｌ－アスパラギナーゼであり、イヌとネコのリンパ腫の治療のために獣医師によって処方されている。ＥＬＳＰＡＲ（登録商標）は大腸菌Ｋ－１２株に由来し、５つのシステイン残基を有している。前駆体アミノ酸配列は配列番号：１３として提供され、成熟配列は配列番号：１４によって提供される。四量体ＥＬＳＰＡＲ（登録商標）の三次元タンパク質構造解析を使用して、配列番号：１４の位置６７及び２００の二つのシステインがおそらくジスルフィド結合を形成し、配列番号：１４の位置４５、６７、及び２４２の残りの三つのシステインはおそらく対になっていないことを特定した。タンパク質凝集の可能性及び／又は他の分子への反応性を低減させるために、不対システインの一つ、二つ、又は三つ全てをセリンなどの他のアミノ酸で置換することができる。例えば、配列番号：１４のアミノ酸位置４５、６７、及び２４２に三つの不対システインの代わりにセリンを有する変異体大腸菌アスパラギナーゼを調製することができる（配列番号：１５）。一又は複数の不対システイン残基を有するアスパラギナーゼポリペプチド（例えば、配列番号：１４のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号：１４の一つ又は二つのシステイン残基のみが置換されているポリペプチド）をコンジュゲーションに使用することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-03-27
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも一つのシステイン置換を含む変異体エルウィニア・クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ（Ｅ．ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）・アスパラギナーゼポリペプチド。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0106】
実施例８
変異体大腸菌Ｋ－１２アスパラギナーゼポリペプチドＥＬＳＰＡＲ（登録商標）は、ＡＬＬの治療に適用される大腸菌Ｌ－アスパラギナーゼであり、イヌとネコのリンパ腫の治療のために獣医師によって処方されている。ＥＬＳＰＡＲ（登録商標）は大腸菌Ｋ－１２株に由来し、５つのシステイン残基を有している。前駆体アミノ酸配列は配列番号：１３として提供され、成熟配列は配列番号：１４によって提供される。四量体ＥＬＳＰＡＲ（登録商標）の三次元タンパク質構造解析を使用して、配列番号：１４の位置６７及び２００の二つのシステインがおそらくジスルフィド結合を形成し、配列番号：１４の位置４５、６７、及び２４２の残りの三つのシステインはおそらく対になっていないことを特定した。タンパク質凝集の可能性及び／又は他の分子への反応性を低減させるために、不対システインの一つ、二つ、又は三つ全てをセリンなどの他のアミノ酸で置換することができる。例えば、配列番号：１４のアミノ酸位置４５、６７、及び２４２に三つの不対システインの代わりにセリンを有する変異体大腸菌アスパラギナーゼを調製することができる（配列番号：１５）。一又は複数の不対システイン残基を有するアスパラギナーゼポリペプチド（例えば、配列番号：１４のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号：１４の一つ又は二つのシステイン残基のみが置換されているポリペプチド）をコンジュゲーションに使用することができる。
＜配列表＞
SEQUENCE LISTING
<110> KINDRED BIOSCIENCES, INC.
<120> VARIANT ASPARAGINASE POLYPEPTIDES FOR MEDICAL USE
<130> 01157-0013-00PCT
<150> US 62/660,189
<151> 2018-04-19
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 348
<212> PRT
<213> Dickeya chrysanthemi
<400> 1
Met Glu Arg Trp Phe Lys Ser Leu Phe Val Leu Val Leu Phe Phe Val
1 5 10 15
Phe Thr Ala Ser Ala Ala Asp Lys Leu Pro Asn Ile Val Ile Leu Ala
20 25 30
Thr Gly Gly Thr Ile Ala Gly Ser Ala Ala Thr Gly Thr Gln Thr Thr
35 40 45
Gly Tyr Lys Ala Gly Ala Leu Gly Val Asp Thr Leu Ile Asn Ala Val
50 55 60
Pro Glu Val Lys Lys Leu Ala Asn Val Lys Gly Glu Gln Phe Ser Asn
65 70 75 80
Met Ala Ser Glu Asn Met Thr Gly Asp Val Val Leu Lys Leu Ser Gln
85 90 95
Arg Val Asn Glu Leu Leu Ala Arg Asp Asp Val Asp Gly Val Val Ile
100 105 110
Thr His Gly Thr Asp Thr Val Glu Glu Ser Ala Tyr Phe Leu His Leu
115 120 125
Thr Val Lys Ser Asp Lys Pro Val Val Phe Val Ala Ala Met Arg Pro
130 135 140
Ala Thr Ala Ile Ser Ala Asp Gly Pro Met Asn Leu Leu Glu Ala Val
145 150 155 160
Arg Val Ala Gly Asp Lys Gln Ser Arg Gly Arg Gly Val Met Val Val
165 170 175
Ile Asn Asp Arg Ile Gly Ser Ala Arg Tyr Ile Thr Lys Thr Asn Ala
180 185 190
Ser Thr Leu Asp Thr Phe Arg Ala Asn Glu Glu Gly Tyr Leu Gly Val
195 200 205
Ile Ile Gly Asn Arg Ile Tyr Tyr Gln Asn Arg Ile Asp Lys Leu His
210 215 220
Thr Thr Arg Ser Val Phe Asp Val Arg Gly Leu Thr Ser Leu Pro Lys
225 230 235 240
Val Asp Ile Leu Tyr Gly Tyr Gln Asp Asp Pro Glu Tyr Leu Tyr Asp
245 250 255
Ala Ala Ile Gln His Gly Val Lys Gly Ile Val Tyr Ala Gly Met Gly
260 265 270
Ala Gly Ser Val Ser Val Arg Gly Ile Ala Gly Met Arg Lys Ala Leu
275 280 285
Glu Lys Gly Val Val Val Met Arg Ser Thr Arg Thr Gly Asn Gly Ile
290 295 300
Val Pro Pro Asp Glu Glu Leu Pro Gly Leu Val Ser Asp Ser Leu Asn
305 310 315 320
Pro Ala His Ala Arg Ile Leu Leu Met Leu Ala Leu Thr Arg Thr Ser
325 330 335
Asp Pro Lys Val Ile Gln Glu Tyr Phe His Thr Tyr
340 345
<210> 2
<211> 327
<212> PRT
<213> Erwinia chrysanthemi
<400> 2
Ala Asp Lys Leu Pro Asn Ile Val Ile Leu Ala Thr Gly Gly Thr Ile
1 5 10 15
Ala Gly Ser Ala Ala Thr Gly Thr Gln Thr Thr Gly Tyr Lys Ala Gly
20 25 30
Ala Leu Gly Val Asp Thr Leu Ile Asn Ala Val Pro Glu Val Lys Lys
35 40 45
Leu Ala Asn Val Lys Gly Glu Gln Phe Ser Asn Met Ala Ser Glu Asn
50 55 60
Met Thr Gly Asp Val Val Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Asn Glu Leu
65 70 75 80
Leu Ala Arg Asp Asp Val Asp Gly Val Val Ile Thr His Gly Thr Asp
85 90 95
Thr Val Glu Glu Ser Ala Tyr Phe Leu His Leu Thr Val Lys Ser Asp
100 105 110
Lys Pro Val Val Phe Val Ala Ala Met Arg Pro Ala Thr Ala Ile Ser
115 120 125
Ala Asp Gly Pro Met Asn Leu Leu Glu Ala Val Arg Val Ala Gly Asp
130 135 140
Lys Gln Ser Arg Gly Arg Gly Val Met Val Val Ile Asn Asp Arg Ile
145 150 155 160
Gly Ser Ala Arg Tyr Ile Thr Lys Thr Asn Ala Ser Thr Leu Asp Thr
165 170 175
Phe Arg Ala Asn Glu Glu Gly Tyr Leu Gly Val Ile Ile Gly Asn Arg
180 185 190
Ile Tyr Tyr Gln Asn Arg Ile Asp Lys Leu His Thr Thr Arg Ser Val
195 200 205
Phe Asp Val Arg Gly Leu Thr Ser Leu Pro Lys Val Asp Ile Leu Tyr
210 215 220
Gly Tyr Gln Asp Asp Pro Glu Tyr Leu Tyr Asp Ala Ala Ile Gln His
225 230 235 240
Gly Val Lys Gly Ile Val Tyr Ala Gly Met Gly Ala Gly Ser Val Ser
245 250 255
Val Arg Gly Ile Ala Gly Met Arg Lys Ala Leu Glu Lys Gly Val Val
260 265 270
Val Met Arg Ser Thr Arg Thr Gly Asn Gly Ile Val Pro Pro Asp Glu
275 280 285
Glu Leu Pro Gly Leu Val Ser Asp Ser Leu Asn Pro Ala His Ala Arg
290 295 300
Ile Leu Leu Met Leu Ala Leu Thr Arg Thr Ser Asp Pro Lys Val Ile
305 310 315 320
Gln Glu Tyr Phe His Thr Tyr
325
<210> 3
<211> 328
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Variant E. chrysanthemi asparaginase with no leader sequence for
intracellular expression
<400> 3
Met Ala Asp Lys Leu Pro Asn Ile Val Ile Leu Ala Thr Gly Gly Thr
1 5 10 15
Ile Ala Gly Ser Ala Ala Thr Gly Thr Gln Thr Thr Gly Tyr Lys Ala
20 25 30
Gly Ala Leu Gly Val Asp Thr Leu Ile Asn Ala Val Pro Glu Val Lys
35 40 45
Lys Leu Ala Asn Val Lys Gly Glu Gln Phe Ser Asn Met Ala Ser Glu
50 55 60
Asn Met Thr Gly Asp Val Val Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Asn Glu
65 70 75 80
Leu Leu Ala Arg Asp Asp Val Asp Gly Val Val Ile Thr His Gly Thr
85 90 95
Asp Thr Val Glu Glu Ser Ala Tyr Phe Leu His Leu Thr Val Lys Ser
100 105 110
Asp Lys Pro Val Val Phe Val Ala Ala Met Arg Pro Ala Thr Ala Ile
115 120 125
Ser Ala Asp Gly Pro Met Asn Leu Leu Glu Ala Val Arg Val Ala Gly
130 135 140
Asp Lys Gln Ser Arg Gly Arg Gly Val Met Val Val Ile Asn Asp Arg
145 150 155 160
Ile Gly Ser Ala Arg Tyr Ile Thr Lys Thr Asn Ala Ser Thr Leu Asp
165 170 175
Thr Phe Arg Ala Asn Glu Glu Gly Tyr Leu Gly Val Ile Ile Gly Asn
180 185 190
Arg Ile Tyr Tyr Gln Asn Arg Ile Asp Lys Leu His Thr Thr Arg Ser
195 200 205
Val Phe Asp Val Arg Gly Leu Thr Ser Leu Pro Lys Val Asp Ile Leu
210 215 220
Tyr Gly Tyr Gln Asp Asp Pro Glu Tyr Leu Tyr Asp Ala Ala Ile Gln
225 230 235 240
His Gly Val Lys Gly Ile Val Tyr Ala Gly Met Gly Ala Gly Ser Val
245 250 255
Ser Val Arg Gly Ile Ala Gly Met Arg Lys Ala Leu Glu Lys Gly Val
260 265 270
Val Val Met Arg Ser Thr Arg Thr Gly Asn Gly Ile Val Pro Pro Asp
275 280 285
Glu Glu Leu Pro Gly Leu Val Ser Asp Ser Leu Asn Pro Ala His Ala
290 295 300
Arg Ile Leu Leu Met Leu Ala Leu Thr Arg Thr Ser Asp Pro Lys Val
305 310 315 320
Ile Gln Glu Tyr Phe His Thr Tyr
325
<210> 4
<211> 327
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Variant E. chrysanthemi asparaginase mature sequence with 3
cysteine substitutions
<400> 4
Ala Asp Lys Leu Pro Asn Ile Val Ile Leu Ala Thr Gly Gly Thr Ile
1 5 10 15
Ala Gly Ser Ala Ala Thr Gly Thr Gln Thr Thr Gly Tyr Lys Ala Gly
20 25 30
Ala Leu Gly Val Asp Thr Leu Ile Cys Ala Val Pro Glu Val Lys Lys
35 40 45
Leu Ala Asn Val Lys Gly Glu Gln Phe Ser Asn Met Ala Ser Glu Asn
50 55 60
Met Thr Gly Asp Val Val Leu Cys Leu Ser Gln Arg Val Asn Glu Leu
65 70 75 80
Leu Ala Arg Asp Asp Val Asp Gly Val Val Ile Thr His Gly Thr Asp
85 90 95
Thr Val Glu Glu Ser Ala Tyr Phe Leu His Leu Thr Val Lys Ser Asp
100 105 110
Lys Pro Val Val Phe Val Ala Ala Met Arg Pro Ala Thr Ala Ile Ser
115 120 125
Ala Asp Gly Pro Met Asn Leu Leu Glu Ala Val Arg Val Ala Gly Asp
130 135 140
Lys Gln Ser Arg Gly Arg Gly Val Met Val Val Ile Asn Asp Arg Ile
145 150 155 160
Gly Ser Ala Arg Tyr Ile Thr Lys Thr Asn Ala Ser Thr Leu Asp Thr
165 170 175
Phe Arg Ala Asn Glu Glu Gly Tyr Leu Gly Val Ile Ile Gly Asn Arg
180 185 190
Ile Tyr Tyr Gln Asn Arg Ile Asp Lys Leu His Thr Thr Arg Ser Val
195 200 205
Phe Asp Val Arg Gly Leu Thr Ser Leu Pro Lys Val Asp Ile Leu Tyr
210 215 220
Gly Tyr Gln Asp Asp Pro Glu Tyr Leu Tyr Asp Ala Ala Ile Gln His
225 230 235 240
Gly Val Lys Gly Ile Val Tyr Ala Gly Met Gly Ala Gly Ser Val Ser
245 250 255
Val Arg Gly Ile Ala Gly Met Arg Cys Ala Leu Glu Lys Gly Val Val
260 265 270
Val Met Arg Ser Thr Arg Thr Gly Asn Gly Ile Val Pro Pro Asp Glu
275 280 285
Glu Leu Pro Gly Leu Val Ser Asp Ser Leu Asn Pro Ala His Ala Arg
290 295 300
Ile Leu Leu Met Leu Ala Leu Thr Arg Thr Ser Asp Pro Lys Val Ile
305 310 315 320
Gln Glu Tyr Phe His Thr Tyr
325
<210> 5
<211> 336
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Variant E. chrysanthemi asparaginase mature sequence with 3
cysteine substitutions and N-terminal polyHis tag
<400> 5
Met Ala His His His His His His His Ala Asp Lys Leu Pro Asn Ile
1 5 10 15
Val Ile Leu Ala Thr Gly Gly Thr Ile Ala Gly Ser Ala Ala Thr Gly
20 25 30
Thr Gln Thr Thr Gly Tyr Lys Ala Gly Ala Leu Gly Val Asp Thr Leu
35 40 45
Ile Cys Ala Val Pro Glu Val Lys Lys Leu Ala Asn Val Lys Gly Glu
50 55 60
Gln Phe Ser Asn Met Ala Ser Glu Asn Met Thr Gly Asp Val Val Leu
65 70 75 80
Cys Leu Ser Gln Arg Val Asn Glu Leu Leu Ala Arg Asp Asp Val Asp
85 90 95
Gly Val Val Ile Thr His Gly Thr Asp Thr Val Glu Glu Ser Ala Tyr
100 105 110
Phe Leu His Leu Thr Val Lys Ser Asp Lys Pro Val Val Phe Val Ala
115 120 125
Ala Met Arg Pro Ala Thr Ala Ile Ser Ala Asp Gly Pro Met Asn Leu
130 135 140
Leu Glu Ala Val Arg Val Ala Gly Asp Lys Gln Ser Arg Gly Arg Gly
145 150 155 160
Val Met Val Val Ile Asn Asp Arg Ile Gly Ser Ala Arg Tyr Ile Thr
165 170 175
Lys Thr Asn Ala Ser Thr Leu Asp Thr Phe Arg Ala Asn Glu Glu Gly
180 185 190
Tyr Leu Gly Val Ile Ile Gly Asn Arg Ile Tyr Tyr Gln Asn Arg Ile
195 200 205
Asp Lys Leu His Thr Thr Arg Ser Val Phe Asp Val Arg Gly Leu Thr
210 215 220
Ser Leu Pro Lys Val Asp Ile Leu Tyr Gly Tyr Gln Asp Asp Pro Glu
225 230 235 240
Tyr Leu Tyr Asp Ala Ala Ile Gln His Gly Val Lys Gly Ile Val Tyr
245 250 255
Ala Gly Met Gly Ala Gly Ser Val Ser Val Arg Gly Ile Ala Gly Met
260 265 270
Arg Cys Ala Leu Glu Lys Gly Val Val Val Met Arg Ser Thr Arg Thr
275 280 285
Gly Asn Gly Ile Val Pro Pro Asp Glu Glu Leu Pro Gly Leu Val Ser
290 295 300
Asp Ser Leu Asn Pro Ala His Ala Arg Ile Leu Leu Met Leu Ala Leu
305 310 315 320
Thr Arg Thr Ser Asp Pro Lys Val Ile Gln Glu Tyr Phe His Thr Tyr
325 330 335
<210> 6
<211> 336
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Variant E. chrysanthemi asparaginase sequence with N-terminal
polyHis tag
<400> 6
Met Ala His His His His His His His Ala Asp Lys Leu Pro Asn Ile
1 5 10 15
Val Ile Leu Ala Thr Gly Gly Thr Ile Ala Gly Ser Ala Ala Thr Gly
20 25 30
Thr Gln Thr Thr Gly Tyr Lys Ala Gly Ala Leu Gly Val Asp Thr Leu
35 40 45
Ile Asn Ala Val Pro Glu Val Lys Lys Leu Ala Asn Val Lys Gly Glu
50 55 60
Gln Phe Ser Asn Met Ala Ser Glu Asn Met Thr Gly Asp Val Val Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Gln Arg Val Asn Glu Leu Leu Ala Arg Asp Asp Val Asp
85 90 95
Gly Val Val Ile Thr His Gly Thr Asp Thr Val Glu Glu Ser Ala Tyr
100 105 110
Phe Leu His Leu Thr Val Lys Ser Asp Lys Pro Val Val Phe Val Ala
115 120 125
Ala Met Arg Pro Ala Thr Ala Ile Ser Ala Asp Gly Pro Met Asn Leu
130 135 140
Leu Glu Ala Val Arg Val Ala Gly Asp Lys Gln Ser Arg Gly Arg Gly
145 150 155 160
Val Met Val Val Ile Asn Asp Arg Ile Gly Ser Ala Arg Tyr Ile Thr
165 170 175
Lys Thr Asn Ala Ser Thr Leu Asp Thr Phe Arg Ala Asn Glu Glu Gly
180 185 190
Tyr Leu Gly Val Ile Ile Gly Asn Arg Ile Tyr Tyr Gln Asn Arg Ile
195 200 205
Asp Lys Leu His Thr Thr Arg Ser Val Phe Asp Val Arg Gly Leu Thr
210 215 220
Ser Leu Pro Lys Val Asp Ile Leu Tyr Gly Tyr Gln Asp Asp Pro Glu
225 230 235 240
Tyr Leu Tyr Asp Ala Ala Ile Gln His Gly Val Lys Gly Ile Val Tyr
245 250 255
Ala Gly Met Gly Ala Gly Ser Val Ser Val Arg Gly Ile Ala Gly Met
260 265 270
Arg Lys Ala Leu Glu Lys Gly Val Val Val Met Arg Ser Thr Arg Thr
275 280 285
Gly Asn Gly Ile Val Pro Pro Asp Glu Glu Leu Pro Gly Leu Val Ser
290 295 300
Asp Ser Leu Asn Pro Ala His Ala Arg Ile Leu Leu Met Leu Ala Leu
305 310 315 320
Thr Arg Thr Ser Asp Pro Lys Val Ile Gln Glu Tyr Phe His Thr Tyr
325 330 335
<210> 7
<211> 328
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Variant E. chrysanthemi asparaginase mature sequence with 4
cysteine substitutions
<400> 7
Met Ala Asp Lys Leu Pro Asn Ile Val Ile Leu Ala Thr Gly Gly Thr
1 5 10 15
Ile Ala Gly Ser Ala Ala Thr Gly Thr Gln Thr Thr Gly Tyr Lys Ala
20 25 30
Gly Ala Leu Gly Val Asp Thr Leu Ile Cys Ala Val Pro Glu Val Lys
35 40 45
Lys Leu Ala Asn Val Lys Gly Glu Gln Phe Ser Asn Met Ala Ser Glu
50 55 60
Asn Met Thr Gly Asp Val Val Leu Cys Leu Ser Gln Arg Val Asn Glu
65 70 75 80
Leu Leu Ala Arg Asp Asp Val Asp Gly Val Val Ile Thr His Gly Thr
85 90 95
Asp Thr Val Glu Glu Ser Ala Tyr Phe Leu His Leu Thr Val Lys Ser
100 105 110
Asp Lys Pro Val Val Phe Val Ala Ala Met Arg Pro Ala Thr Ala Ile
115 120 125
Ser Ala Asp Gly Pro Met Asn Leu Leu Glu Ala Val Arg Val Ala Gly
130 135 140
Asp Lys Gln Ser Arg Gly Arg Gly Val Met Val Val Ile Asn Asp Arg
145 150 155 160
Ile Gly Ser Ala Arg Tyr Ile Thr Lys Thr Asn Ala Ser Thr Leu Asp
165 170 175
Thr Phe Arg Ala Asn Glu Glu Gly Tyr Leu Gly Val Ile Ile Gly Asn
180 185 190
Arg Ile Tyr Tyr Gln Asn Arg Ile Asp Lys Leu His Thr Thr Arg Ser
195 200 205
Val Phe Asp Val Arg Gly Leu Thr Ser Leu Pro Lys Val Asp Ile Leu
210 215 220
Tyr Gly Tyr Gln Asp Asp Pro Glu Tyr Leu Tyr Asp Ala Ala Ile Gln
225 230 235 240
His Gly Val Lys Gly Ile Val Tyr Ala Gly Met Gly Ala Gly Ser Val
245 250 255
Ser Val Arg Gly Ile Ala Gly Met Arg Cys Ala Leu Glu Lys Gly Val
260 265 270
Val Val Met Arg Ser Thr Arg Thr Gly Asn Gly Ile Val Pro Pro Asp
275 280 285
Cys Glu Leu Pro Gly Leu Val Ser Asp Ser Leu Asn Pro Ala His Ala
290 295 300
Arg Ile Leu Leu Met Leu Ala Leu Thr Arg Thr Ser Asp Pro Lys Val
305 310 315 320
Ile Gln Glu Tyr Phe His Thr Tyr
325
<210> 8
<211> 328
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Variant E. chrysanthemi asparaginase mature sequence with 1
lysine substitution
<400> 8
Met Ala Asp Lys Leu Pro Asn Ile Val Ile Leu Ala Thr Gly Gly Thr
1 5 10 15
Ile Ala Gly Ser Ala Ala Thr Gly Thr Gln Thr Thr Gly Tyr Lys Ala
20 25 30
Gly Ala Leu Gly Val Asp Thr Leu Ile Lys Ala Val Pro Glu Val Lys
35 40 45
Lys Leu Ala Asn Val Lys Gly Glu Gln Phe Ser Asn Met Ala Ser Glu
50 55 60
Asn Met Thr Gly Asp Val Val Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Asn Glu
65 70 75 80
Leu Leu Ala Arg Asp Asp Val Asp Gly Val Val Ile Thr His Gly Thr
85 90 95
Asp Thr Val Glu Glu Ser Ala Tyr Phe Leu His Leu Thr Val Lys Ser
100 105 110
Asp Lys Pro Val Val Phe Val Ala Ala Met Arg Pro Ala Thr Ala Ile
115 120 125
Ser Ala Asp Gly Pro Met Asn Leu Leu Glu Ala Val Arg Val Ala Gly
130 135 140
Asp Lys Gln Ser Arg Gly Arg Gly Val Met Val Val Ile Asn Asp Arg
145 150 155 160
Ile Gly Ser Ala Arg Tyr Ile Thr Lys Thr Asn Ala Ser Thr Leu Asp
165 170 175
Thr Phe Arg Ala Asn Glu Glu Gly Tyr Leu Gly Val Ile Ile Gly Asn
180 185 190
Arg Ile Tyr Tyr Gln Asn Arg Ile Asp Lys Leu His Thr Thr Arg Ser
195 200 205
Val Phe Asp Val Arg Gly Leu Thr Ser Leu Pro Lys Val Asp Ile Leu
210 215 220
Tyr Gly Tyr Gln Asp Asp Pro Glu Tyr Leu Tyr Asp Ala Ala Ile Gln
225 230 235 240
His Gly Val Lys Gly Ile Val Tyr Ala Gly Met Gly Ala Gly Ser Val
245 250 255
Ser Val Arg Gly Ile Ala Gly Met Arg Lys Ala Leu Glu Lys Gly Val
260 265 270
Val Val Met Arg Ser Thr Arg Thr Gly Asn Gly Ile Val Pro Pro Asp
275 280 285
Glu Glu Leu Pro Gly Leu Val Ser Asp Ser Leu Asn Pro Ala His Ala
290 295 300
Arg Ile Leu Leu Met Leu Ala Leu Thr Arg Thr Ser Asp Pro Lys Val
305 310 315 320
Ile Gln Glu Tyr Phe His Thr Tyr
325
<210> 9
<211> 328
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Variant E. chrysanthemi asparaginase mature sequence with 2
lysine substitutions
<400> 9
Met Ala Asp Lys Leu Pro Asn Ile Val Ile Leu Ala Thr Gly Gly Thr
1 5 10 15
Ile Ala Gly Ser Ala Ala Thr Gly Thr Gln Thr Thr Gly Tyr Lys Ala
20 25 30
Gly Ala Leu Gly Val Asp Thr Leu Ile Lys Ala Val Pro Glu Val Lys
35 40 45
Lys Leu Ala Asn Val Lys Gly Glu Gln Phe Ser Asn Met Ala Ser Glu
50 55 60
Asn Met Thr Gly Asp Val Val Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Asn Glu
65 70 75 80
Leu Leu Ala Arg Asp Asp Val Asp Gly Val Val Ile Thr His Gly Thr
85 90 95
Asp Thr Val Glu Glu Ser Ala Tyr Phe Leu His Leu Thr Val Lys Ser
100 105 110
Asp Lys Pro Val Val Phe Val Ala Ala Met Arg Pro Ala Thr Ala Ile
115 120 125
Ser Ala Asp Gly Pro Met Asn Leu Leu Glu Ala Val Arg Val Ala Gly
130 135 140
Asp Lys Gln Ser Arg Gly Arg Gly Val Met Val Val Ile Asn Asp Arg
145 150 155 160
Ile Gly Ser Ala Arg Tyr Ile Thr Lys Thr Asn Ala Ser Thr Leu Asp
165 170 175
Thr Phe Arg Ala Asn Glu Glu Gly Tyr Leu Gly Val Ile Ile Gly Asn
180 185 190
Arg Ile Tyr Tyr Gln Asn Arg Ile Asp Lys Leu His Thr Thr Arg Ser
195 200 205
Val Phe Asp Val Arg Gly Leu Thr Ser Leu Pro Lys Val Asp Ile Leu
210 215 220
Tyr Gly Tyr Gln Asp Asp Pro Glu Tyr Leu Tyr Asp Ala Ala Ile Gln
225 230 235 240
His Gly Val Lys Gly Ile Val Tyr Ala Gly Met Gly Ala Gly Ser Val
245 250 255
Ser Val Arg Gly Ile Ala Gly Met Arg Lys Ala Leu Glu Lys Gly Val
260 265 270
Val Val Met Arg Ser Thr Arg Thr Gly Asn Gly Ile Val Pro Pro Asp
275 280 285
Lys Glu Leu Pro Gly Leu Val Ser Asp Ser Leu Asn Pro Ala His Ala
290 295 300
Arg Ile Leu Leu Met Leu Ala Leu Thr Arg Thr Ser Asp Pro Lys Val
305 310 315 320
Ile Gln Glu Tyr Phe His Thr Tyr
325
<210> 10
<211> 348
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 10
Met Glu Phe Phe Lys Lys Thr Ala Leu Ala Ala Leu Val Met Gly Phe
1 5 10 15
Ser Gly Ala Ala Leu Ala Leu Pro Asn Ile Thr Ile Leu Ala Thr Gly
20 25 30
Gly Thr Ile Ala Gly Gly Gly Asp Ser Ala Thr Lys Ser Asn Tyr Thr
35 40 45
Val Gly Lys Val Gly Val Glu Asn Leu Val Asn Ala Val Pro Gln Leu
50 55 60
Lys Asp Ile Ala Asn Val Lys Gly Glu Gln Val Val Asn Ile Gly Ser
65 70 75 80
Gln Asp Met Asn Asp Asn Val Trp Leu Thr Leu Ala Lys Lys Ile Asn
85 90 95
Thr Asp Cys Asp Lys Thr Asp Gly Phe Val Ile Thr His Gly Thr Asp
100 105 110
Thr Met Glu Glu Thr Ala Tyr Phe Leu Asp Leu Thr Val Lys Cys Asp
115 120 125
Lys Pro Val Val Met Val Gly Ala Met Arg Pro Ser Thr Ser Met Ser
130 135 140
Ala Asp Gly Pro Phe Asn Leu Tyr Asn Ala Val Val Thr Ala Ala Asp
145 150 155 160
Lys Ala Ser Ala Asn Arg Gly Val Leu Val Val Met Asn Asp Thr Val
165 170 175
Leu Asp Gly Arg Asp Val Thr Lys Thr Asn Thr Thr Asp Val Ala Thr
180 185 190
Phe Lys Ser Val Asn Tyr Gly Pro Leu Gly Tyr Ile His Asn Gly Lys
195 200 205
Ile Asp Tyr Gln Arg Thr Pro Ala Arg Lys His Thr Ser Asp Thr Pro
210 215 220
Phe Asp Val Ser Lys Leu Asn Glu Leu Pro Lys Val Gly Ile Val Tyr
225 230 235 240
Asn Tyr Ala Asn Ala Ser Asp Leu Pro Ala Lys Ala Leu Val Asp Ala
245 250 255
Gly Tyr Asp Gly Ile Val Ser Ala Gly Val Gly Asn Gly Asn Leu Tyr
260 265 270
Lys Ser Val Phe Asp Thr Leu Ala Thr Ala Ala Lys Thr Gly Thr Ala
275 280 285
Val Val Arg Ser Ser Arg Val Pro Thr Gly Ala Thr Thr Gln Asp Ala
290 295 300
Glu Val Asp Asp Ala Lys Tyr Gly Phe Val Ala Ser Gly Thr Leu Asn
305 310 315 320
Pro Gln Lys Ala Arg Val Leu Leu Gln Leu Ala Leu Thr Gln Thr Lys
325 330 335
Asp Pro Gln Gln Ile Gln Gln Ile Phe Asn Gln Tyr
340 345
<210> 11
<211> 326
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 11
Leu Pro Asn Ile Thr Ile Leu Ala Thr Gly Gly Thr Ile Ala Gly Gly
1 5 10 15
Gly Asp Ser Ala Thr Lys Ser Asn Tyr Thr Val Gly Lys Val Gly Val
20 25 30
Glu Asn Leu Val Asn Ala Val Pro Gln Leu Lys Asp Ile Ala Asn Val
35 40 45
Lys Gly Glu Gln Val Val Asn Ile Gly Ser Gln Asp Met Asn Asp Asn
50 55 60
Val Trp Leu Thr Leu Ala Lys Lys Ile Asn Thr Asp Cys Asp Lys Thr
65 70 75 80
Asp Gly Phe Val Ile Thr His Gly Thr Asp Thr Met Glu Glu Thr Ala
85 90 95
Tyr Phe Leu Asp Leu Thr Val Lys Cys Asp Lys Pro Val Val Met Val
100 105 110
Gly Ala Met Arg Pro Ser Thr Ser Met Ser Ala Asp Gly Pro Phe Asn
115 120 125
Leu Tyr Asn Ala Val Val Thr Ala Ala Asp Lys Ala Ser Ala Asn Arg
130 135 140
Gly Val Leu Val Val Met Asn Asp Thr Val Leu Asp Gly Arg Asp Val
145 150 155 160
Thr Lys Thr Asn Thr Thr Asp Val Ala Thr Phe Lys Ser Val Asn Tyr
165 170 175
Gly Pro Leu Gly Tyr Ile His Asn Gly Lys Ile Asp Tyr Gln Arg Thr
180 185 190
Pro Ala Arg Lys His Thr Ser Asp Thr Pro Phe Asp Val Ser Lys Leu
195 200 205
Asn Glu Leu Pro Lys Val Gly Ile Val Tyr Asn Tyr Ala Asn Ala Ser
210 215 220
Asp Leu Pro Ala Lys Ala Leu Val Asp Ala Gly Tyr Asp Gly Ile Val
225 230 235 240
Ser Ala Gly Val Gly Asn Gly Asn Leu Tyr Lys Ser Val Phe Asp Thr
245 250 255
Leu Ala Thr Ala Ala Lys Thr Gly Thr Ala Val Val Arg Ser Ser Arg
260 265 270
Val Pro Thr Gly Ala Thr Thr Gln Asp Ala Glu Val Asp Asp Ala Lys
275 280 285
Tyr Gly Phe Val Ala Ser Gly Thr Leu Asn Pro Gln Lys Ala Arg Val
290 295 300
Leu Leu Gln Leu Ala Leu Thr Gln Thr Lys Asp Pro Gln Gln Ile Gln
305 310 315 320
Gln Ile Phe Asn Gln Tyr
325
<210> 12
<211> 326
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Variant E. coli asparaginase mature sequence with one additional
cysteine pair
<400> 12
Leu Pro Asn Ile Thr Ile Leu Cys Thr Gly Gly Thr Ile Ala Gly Gly
1 5 10 15
Gly Asp Ser Ala Thr Lys Ser Asn Tyr Thr Val Gly Lys Val Gly Cys
20 25 30
Glu Asn Leu Val Asn Ala Val Pro Gln Leu Lys Asp Ile Ala Asn Val
35 40 45
Lys Gly Glu Gln Val Val Asn Ile Gly Ser Gln Asp Met Asn Asp Asn
50 55 60
Val Trp Leu Thr Leu Ala Lys Lys Ile Asn Thr Asp Cys Asp Lys Thr
65 70 75 80
Asp Gly Phe Val Ile Thr His Gly Thr Asp Thr Met Glu Glu Thr Ala
85 90 95
Tyr Phe Leu Asp Leu Thr Val Lys Cys Asp Lys Pro Val Val Met Val
100 105 110
Gly Ala Met Arg Pro Ser Thr Ser Met Ser Ala Asp Gly Pro Phe Asn
115 120 125
Leu Tyr Asn Ala Val Val Thr Ala Ala Asp Lys Ala Ser Ala Asn Arg
130 135 140
Gly Val Leu Val Val Met Asn Asp Thr Val Leu Asp Gly Arg Asp Val
145 150 155 160
Thr Lys Thr Asn Thr Thr Asp Val Ala Thr Phe Lys Ser Val Asn Tyr
165 170 175
Gly Pro Leu Gly Tyr Ile His Asn Gly Lys Ile Asp Tyr Gln Arg Thr
180 185 190
Pro Ala Arg Lys His Thr Ser Asp Thr Pro Phe Asp Val Ser Lys Leu
195 200 205
Asn Glu Leu Pro Lys Val Gly Ile Val Tyr Asn Tyr Ala Asn Ala Ser
210 215 220
Asp Leu Pro Ala Lys Ala Leu Val Asp Ala Gly Tyr Asp Gly Ile Val
225 230 235 240
Ser Ala Gly Val Gly Asn Gly Asn Leu Tyr Lys Ser Val Phe Asp Thr
245 250 255
Leu Ala Thr Ala Ala Lys Thr Gly Thr Ala Val Val Arg Ser Ser Arg
260 265 270
Val Pro Thr Gly Ala Thr Thr Gln Asp Ala Glu Val Asp Asp Ala Lys
275 280 285
Tyr Gly Phe Val Ala Ser Gly Thr Leu Asn Pro Gln Lys Ala Arg Val
290 295 300
Leu Leu Gln Leu Ala Leu Thr Gln Thr Lys Asp Pro Gln Gln Ile Gln
305 310 315 320
Gln Ile Phe Asn Gln Tyr
325
<210> 13
<211> 321
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 13
Met Gly Lys Ala Val Ile Ala Ile His Gly Gly Ala Gly Ala Ile Ser
1 5 10 15
Arg Ala Gln Met Ser Leu Gln Gln Glu Leu Arg Tyr Ile Glu Ala Leu
20 25 30
Ser Ala Ile Val Glu Thr Gly Gln Lys Met Leu Glu Ala Gly Glu Ser
35 40 45
Ala Leu Asp Val Val Thr Glu Ala Val Arg Leu Leu Glu Glu Cys Pro
50 55 60
Leu Phe Asn Ala Gly Ile Gly Ala Val Phe Thr Arg Asp Glu Thr His
65 70 75 80
Glu Leu Asp Ala Cys Val Met Asp Gly Asn Thr Leu Lys Ala Gly Ala
85 90 95
Val Ala Gly Val Ser His Leu Arg Asn Pro Val Leu Ala Ala Arg Leu
100 105 110
Val Met Glu Gln Ser Pro His Val Met Met Ile Gly Glu Gly Ala Glu
115 120 125
Asn Phe Ala Phe Ala Arg Gly Met Glu Arg Val Ser Pro Glu Ile Phe
130 135 140
Ser Thr Ser Leu Arg Tyr Glu Gln Leu Leu Ala Ala Arg Lys Glu Gly
145 150 155 160
Ala Thr Val Leu Asp His Ser Gly Ala Pro Leu Asp Glu Lys Gln Lys
165 170 175
Met Gly Thr Val Gly Ala Val Ala Leu Asp Leu Asp Gly Asn Leu Ala
180 185 190
Ala Ala Thr Ser Thr Gly Gly Met Thr Asn Lys Leu Pro Gly Arg Val
195 200 205
Gly Asp Ser Pro Leu Val Gly Ala Gly Cys Tyr Ala Asn Asn Ala Ser
210 215 220
Val Ala Val Ser Cys Thr Gly Thr Gly Glu Val Phe Ile Arg Ala Leu
225 230 235 240
Ala Ala Tyr Asp Ile Ala Ala Leu Met Asp Tyr Gly Gly Leu Ser Leu
245 250 255
Ala Glu Ala Cys Glu Arg Val Val Met Glu Lys Leu Pro Ala Leu Gly
260 265 270
Gly Ser Gly Gly Leu Ile Ala Ile Asp His Glu Gly Asn Val Ala Leu
275 280 285
Pro Phe Asn Thr Glu Gly Met Tyr Arg Ala Trp Gly Tyr Ala Gly Asp
290 295 300
Thr Pro Thr Thr Gly Ile Tyr Arg Glu Lys Gly Asp Thr Val Ala Thr
305 310 315 320
Gln
<210> 14
<211> 303
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 14
Gln Met Ser Leu Gln Gln Glu Leu Arg Tyr Ile Glu Ala Leu Ser Ala
1 5 10 15
Ile Val Glu Thr Gly Gln Lys Met Leu Glu Ala Gly Glu Ser Ala Leu
20 25 30
Asp Val Val Thr Glu Ala Val Arg Leu Leu Glu Glu Cys Pro Leu Phe
35 40 45
Asn Ala Gly Ile Gly Ala Val Phe Thr Arg Asp Glu Thr His Glu Leu
50 55 60
Asp Ala Cys Val Met Asp Gly Asn Thr Leu Lys Ala Gly Ala Val Ala
65 70 75 80
Gly Val Ser His Leu Arg Asn Pro Val Leu Ala Ala Arg Leu Val Met
85 90 95
Glu Gln Ser Pro His Val Met Met Ile Gly Glu Gly Ala Glu Asn Phe
100 105 110
Ala Phe Ala Arg Gly Met Glu Arg Val Ser Pro Glu Ile Phe Ser Thr
115 120 125
Ser Leu Arg Tyr Glu Gln Leu Leu Ala Ala Arg Lys Glu Gly Ala Thr
130 135 140
Val Leu Asp His Ser Gly Ala Pro Leu Asp Glu Lys Gln Lys Met Gly
145 150 155 160
Thr Val Gly Ala Val Ala Leu Asp Leu Asp Gly Asn Leu Ala Ala Ala
165 170 175
Thr Ser Thr Gly Gly Met Thr Asn Lys Leu Pro Gly Arg Val Gly Asp
180 185 190
Ser Pro Leu Val Gly Ala Gly Cys Tyr Ala Asn Asn Ala Ser Val Ala
195 200 205
Val Ser Cys Thr Gly Thr Gly Glu Val Phe Ile Arg Ala Leu Ala Ala
210 215 220
Tyr Asp Ile Ala Ala Leu Met Asp Tyr Gly Gly Leu Ser Leu Ala Glu
225 230 235 240
Ala Cys Glu Arg Val Val Met Glu Lys Leu Pro Ala Leu Gly Gly Ser
245 250 255
Gly Gly Leu Ile Ala Ile Asp His Glu Gly Asn Val Ala Leu Pro Phe
260 265 270
Asn Thr Glu Gly Met Tyr Arg Ala Trp Gly Tyr Ala Gly Asp Thr Pro
275 280 285
Thr Thr Gly Ile Tyr Arg Glu Lys Gly Asp Thr Val Ala Thr Gln
290 295 300
<210> 15
<211> 303
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Variant E. coli asparaginase mature sequence with no unpaired
cysteines
<400> 15
Gln Met Ser Leu Gln Gln Glu Leu Arg Tyr Ile Glu Ala Leu Ser Ala
1 5 10 15
Ile Val Glu Thr Gly Gln Lys Met Leu Glu Ala Gly Glu Ser Ala Leu
20 25 30
Asp Val Val Thr Glu Ala Val Arg Leu Leu Glu Glu Ser Pro Leu Phe
35 40 45
Asn Ala Gly Ile Gly Ala Val Phe Thr Arg Asp Glu Thr His Glu Leu
50 55 60
Asp Ala Cys Val Met Asp Gly Asn Thr Leu Lys Ala Gly Ala Val Ala
65 70 75 80
Gly Val Ser His Leu Arg Asn Pro Val Leu Ala Ala Arg Leu Val Met
85 90 95
Glu Gln Ser Pro His Val Met Met Ile Gly Glu Gly Ala Glu Asn Phe
100 105 110
Ala Phe Ala Arg Gly Met Glu Arg Val Ser Pro Glu Ile Phe Ser Thr
115 120 125
Ser Leu Arg Tyr Glu Gln Leu Leu Ala Ala Arg Lys Glu Gly Ala Thr
130 135 140
Val Leu Asp His Ser Gly Ala Pro Leu Asp Glu Lys Gln Lys Met Gly
145 150 155 160
Thr Val Gly Ala Val Ala Leu Asp Leu Asp Gly Asn Leu Ala Ala Ala
165 170 175
Thr Ser Thr Gly Gly Met Thr Asn Lys Leu Pro Gly Arg Val Gly Asp
180 185 190
Ser Pro Leu Val Gly Ala Gly Cys Tyr Ala Asn Asn Ala Ser Val Ala
195 200 205
Val Ser Ser Thr Gly Thr Gly Glu Val Phe Ile Arg Ala Leu Ala Ala
210 215 220
Tyr Asp Ile Ala Ala Leu Met Asp Tyr Gly Gly Leu Ser Leu Ala Glu
225 230 235 240
Ala Ser Glu Arg Val Val Met Glu Lys Leu Pro Ala Leu Gly Gly Ser
245 250 255
Gly Gly Leu Ile Ala Ile Asp His Glu Gly Asn Val Ala Leu Pro Phe
260 265 270
Asn Thr Glu Gly Met Tyr Arg Ala Trp Gly Tyr Ala Gly Asp Thr Pro
275 280 285
Thr Thr Gly Ile Tyr Arg Glu Lys Gly Asp Thr Val Ala Thr Gln
290 295 300
変異体大腸菌Ｋ－１２アスパラギナーゼポリペプチドＥＬＳＰＡＲ（登録商標）は、ＡＬＬの治療に適用される大腸菌Ｌ－アスパラギナーゼであり、イヌとネコのリンパ腫の治療のために獣医師によって処方されている。ＥＬＳＰＡＲ（登録商標）は大腸菌Ｋ－１２株に由来し、５つのシステイン残基を有している。前駆体アミノ酸配列は配列番号：１３として提供され、成熟配列は配列番号：１４によって提供される。四量体ＥＬＳＰＡＲ（登録商標）の三次元タンパク質構造解析を使用して、配列番号：１４の位置６７及び２００の二つのシステインがおそらくジスルフィド結合を形成し、配列番号：１４の位置４５、６７、及び２４２の残りの三つのシステインはおそらく対になっていないことを特定した。タンパク質凝集の可能性及び／又は他の分子への反応性を低減させるために、不対システインの一つ、二つ、又は三つ全てをセリンなどの他のアミノ酸で置換することができる。例えば、配列番号：１４のアミノ酸位置４５、６７、及び２４２に三つの不対システインの代わりにセリンを有する変異体大腸菌アスパラギナーゼを調製することができる（配列番号：１５）。一又は複数の不対システイン残基を有するアスパラギナーゼポリペプチド（例えば、配列番号：１４のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号：１４の一つ又は二つのシステイン残基のみが置換されているポリペプチド）をコンジュゲーションに使用することができる。
＜配列表＞
SEQUENCE LISTING
<110> KINDRED BIOSCIENCES, INC.
<120> VARIANT ASPARAGINASE POLYPEPTIDES FOR MEDICAL USE
<130> 01157-0013-00PCT
<150> US 62/660,189
<151> 2018-04-19
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 348
<212> PRT
<213> Dickeya chrysanthemi
<400> 1
Met Glu Arg Trp Phe Lys Ser Leu Phe Val Leu Val Leu Phe Phe Val
1 5 10 15
Phe Thr Ala Ser Ala Ala Asp Lys Leu Pro Asn Ile Val Ile Leu Ala
20 25 30
Thr Gly Gly Thr Ile Ala Gly Ser Ala Ala Thr Gly Thr Gln Thr Thr
35 40 45
Gly Tyr Lys Ala Gly Ala Leu Gly Val Asp Thr Leu Ile Asn Ala Val
50 55 60
Pro Glu Val Lys Lys Leu Ala Asn Val Lys Gly Glu Gln Phe Ser Asn
65 70 75 80
Met Ala Ser Glu Asn Met Thr Gly Asp Val Val Leu Lys Leu Ser Gln
85 90 95
Arg Val Asn Glu Leu Leu Ala Arg Asp Asp Val Asp Gly Val Val Ile
100 105 110
Thr His Gly Thr Asp Thr Val Glu Glu Ser Ala Tyr Phe Leu His Leu
115 120 125
Thr Val Lys Ser Asp Lys Pro Val Val Phe Val Ala Ala Met Arg Pro
130 135 140
Ala Thr Ala Ile Ser Ala Asp Gly Pro Met Asn Leu Leu Glu Ala Val
145 150 155 160
Arg Val Ala Gly Asp Lys Gln Ser Arg Gly Arg Gly Val Met Val Val
165 170 175
Ile Asn Asp Arg Ile Gly Ser Ala Arg Tyr Ile Thr Lys Thr Asn Ala
180 185 190
Ser Thr Leu Asp Thr Phe Arg Ala Asn Glu Glu Gly Tyr Leu Gly Val
195 200 205
Ile Ile Gly Asn Arg Ile Tyr Tyr Gln Asn Arg Ile Asp Lys Leu His
210 215 220
Thr Thr Arg Ser Val Phe Asp Val Arg Gly Leu Thr Ser Leu Pro Lys
225 230 235 240
Val Asp Ile Leu Tyr Gly Tyr Gln Asp Asp Pro Glu Tyr Leu Tyr Asp
245 250 255
Ala Ala Ile Gln His Gly Val Lys Gly Ile Val Tyr Ala Gly Met Gly
260 265 270
Ala Gly Ser Val Ser Val Arg Gly Ile Ala Gly Met Arg Lys Ala Leu
275 280 285
Glu Lys Gly Val Val Val Met Arg Ser Thr Arg Thr Gly Asn Gly Ile
290 295 300
Val Pro Pro Asp Glu Glu Leu Pro Gly Leu Val Ser Asp Ser Leu Asn
305 310 315 320
Pro Ala His Ala Arg Ile Leu Leu Met Leu Ala Leu Thr Arg Thr Ser
325 330 335
Asp Pro Lys Val Ile Gln Glu Tyr Phe His Thr Tyr
340 345
<210> 2
<211> 327
<212> PRT
<213> Erwinia chrysanthemi
<400> 2
Ala Asp Lys Leu Pro Asn Ile Val Ile Leu Ala Thr Gly Gly Thr Ile
1 5 10 15
Ala Gly Ser Ala Ala Thr Gly Thr Gln Thr Thr Gly Tyr Lys Ala Gly
20 25 30
Ala Leu Gly Val Asp Thr Leu Ile Asn Ala Val Pro Glu Val Lys Lys
35 40 45
Leu Ala Asn Val Lys Gly Glu Gln Phe Ser Asn Met Ala Ser Glu Asn
50 55 60
Met Thr Gly Asp Val Val Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Asn Glu Leu
65 70 75 80
Leu Ala Arg Asp Asp Val Asp Gly Val Val Ile Thr His Gly Thr Asp
85 90 95
Thr Val Glu Glu Ser Ala Tyr Phe Leu His Leu Thr Val Lys Ser Asp
100 105 110
Lys Pro Val Val Phe Val Ala Ala Met Arg Pro Ala Thr Ala Ile Ser
115 120 125
Ala Asp Gly Pro Met Asn Leu Leu Glu Ala Val Arg Val Ala Gly Asp
130 135 140
Lys Gln Ser Arg Gly Arg Gly Val Met Val Val Ile Asn Asp Arg Ile
145 150 155 160
Gly Ser Ala Arg Tyr Ile Thr Lys Thr Asn Ala Ser Thr Leu Asp Thr
165 170 175
Phe Arg Ala Asn Glu Glu Gly Tyr Leu Gly Val Ile Ile Gly Asn Arg
180 185 190
Ile Tyr Tyr Gln Asn Arg Ile Asp Lys Leu His Thr Thr Arg Ser Val
195 200 205
Phe Asp Val Arg Gly Leu Thr Ser Leu Pro Lys Val Asp Ile Leu Tyr
210 215 220
Gly Tyr Gln Asp Asp Pro Glu Tyr Leu Tyr Asp Ala Ala Ile Gln His
225 230 235 240
Gly Val Lys Gly Ile Val Tyr Ala Gly Met Gly Ala Gly Ser Val Ser
245 250 255
Val Arg Gly Ile Ala Gly Met Arg Lys Ala Leu Glu Lys Gly Val Val
260 265 270
Val Met Arg Ser Thr Arg Thr Gly Asn Gly Ile Val Pro Pro Asp Glu
275 280 285
Glu Leu Pro Gly Leu Val Ser Asp Ser Leu Asn Pro Ala His Ala Arg
290 295 300
Ile Leu Leu Met Leu Ala Leu Thr Arg Thr Ser Asp Pro Lys Val Ile
305 310 315 320
Gln Glu Tyr Phe His Thr Tyr
325
<210> 3
<211> 328
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Variant E. chrysanthemi asparaginase with no leader sequence for
intracellular expression
<400> 3
Met Ala Asp Lys Leu Pro Asn Ile Val Ile Leu Ala Thr Gly Gly Thr
1 5 10 15
Ile Ala Gly Ser Ala Ala Thr Gly Thr Gln Thr Thr Gly Tyr Lys Ala
20 25 30
Gly Ala Leu Gly Val Asp Thr Leu Ile Asn Ala Val Pro Glu Val Lys
35 40 45
Lys Leu Ala Asn Val Lys Gly Glu Gln Phe Ser Asn Met Ala Ser Glu
50 55 60
Asn Met Thr Gly Asp Val Val Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Asn Glu
65 70 75 80
Leu Leu Ala Arg Asp Asp Val Asp Gly Val Val Ile Thr His Gly Thr
85 90 95
Asp Thr Val Glu Glu Ser Ala Tyr Phe Leu His Leu Thr Val Lys Ser
100 105 110
Asp Lys Pro Val Val Phe Val Ala Ala Met Arg Pro Ala Thr Ala Ile
115 120 125
Ser Ala Asp Gly Pro Met Asn Leu Leu Glu Ala Val Arg Val Ala Gly
130 135 140
Asp Lys Gln Ser Arg Gly Arg Gly Val Met Val Val Ile Asn Asp Arg
145 150 155 160
Ile Gly Ser Ala Arg Tyr Ile Thr Lys Thr Asn Ala Ser Thr Leu Asp
165 170 175
Thr Phe Arg Ala Asn Glu Glu Gly Tyr Leu Gly Val Ile Ile Gly Asn
180 185 190
Arg Ile Tyr Tyr Gln Asn Arg Ile Asp Lys Leu His Thr Thr Arg Ser
195 200 205
Val Phe Asp Val Arg Gly Leu Thr Ser Leu Pro Lys Val Asp Ile Leu
210 215 220
Tyr Gly Tyr Gln Asp Asp Pro Glu Tyr Leu Tyr Asp Ala Ala Ile Gln
225 230 235 240
His Gly Val Lys Gly Ile Val Tyr Ala Gly Met Gly Ala Gly Ser Val
245 250 255
Ser Val Arg Gly Ile Ala Gly Met Arg Lys Ala Leu Glu Lys Gly Val
260 265 270
Val Val Met Arg Ser Thr Arg Thr Gly Asn Gly Ile Val Pro Pro Asp
275 280 285
Glu Glu Leu Pro Gly Leu Val Ser Asp Ser Leu Asn Pro Ala His Ala
290 295 300
Arg Ile Leu Leu Met Leu Ala Leu Thr Arg Thr Ser Asp Pro Lys Val
305 310 315 320
Ile Gln Glu Tyr Phe His Thr Tyr
325
<210> 4
<211> 327
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Variant E. chrysanthemi asparaginase mature sequence with 3
cysteine substitutions
<400> 4
Ala Asp Lys Leu Pro Asn Ile Val Ile Leu Ala Thr Gly Gly Thr Ile
1 5 10 15
Ala Gly Ser Ala Ala Thr Gly Thr Gln Thr Thr Gly Tyr Lys Ala Gly
20 25 30
Ala Leu Gly Val Asp Thr Leu Ile Cys Ala Val Pro Glu Val Lys Lys
35 40 45
Leu Ala Asn Val Lys Gly Glu Gln Phe Ser Asn Met Ala Ser Glu Asn
50 55 60
Met Thr Gly Asp Val Val Leu Cys Leu Ser Gln Arg Val Asn Glu Leu
65 70 75 80
Leu Ala Arg Asp Asp Val Asp Gly Val Val Ile Thr His Gly Thr Asp
85 90 95
Thr Val Glu Glu Ser Ala Tyr Phe Leu His Leu Thr Val Lys Ser Asp
100 105 110
Lys Pro Val Val Phe Val Ala Ala Met Arg Pro Ala Thr Ala Ile Ser
115 120 125
Ala Asp Gly Pro Met Asn Leu Leu Glu Ala Val Arg Val Ala Gly Asp
130 135 140
Lys Gln Ser Arg Gly Arg Gly Val Met Val Val Ile Asn Asp Arg Ile
145 150 155 160
Gly Ser Ala Arg Tyr Ile Thr Lys Thr Asn Ala Ser Thr Leu Asp Thr
165 170 175
Phe Arg Ala Asn Glu Glu Gly Tyr Leu Gly Val Ile Ile Gly Asn Arg
180 185 190
Ile Tyr Tyr Gln Asn Arg Ile Asp Lys Leu His Thr Thr Arg Ser Val
195 200 205
Phe Asp Val Arg Gly Leu Thr Ser Leu Pro Lys Val Asp Ile Leu Tyr
210 215 220
Gly Tyr Gln Asp Asp Pro Glu Tyr Leu Tyr Asp Ala Ala Ile Gln His
225 230 235 240
Gly Val Lys Gly Ile Val Tyr Ala Gly Met Gly Ala Gly Ser Val Ser
245 250 255
Val Arg Gly Ile Ala Gly Met Arg Cys Ala Leu Glu Lys Gly Val Val
260 265 270
Val Met Arg Ser Thr Arg Thr Gly Asn Gly Ile Val Pro Pro Asp Glu
275 280 285
Glu Leu Pro Gly Leu Val Ser Asp Ser Leu Asn Pro Ala His Ala Arg
290 295 300
Ile Leu Leu Met Leu Ala Leu Thr Arg Thr Ser Asp Pro Lys Val Ile
305 310 315 320
Gln Glu Tyr Phe His Thr Tyr
325
<210> 5
<211> 336
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Variant E. chrysanthemi asparaginase mature sequence with 3
cysteine substitutions and N-terminal polyHis tag
<400> 5
Met Ala His His His His His His His Ala Asp Lys Leu Pro Asn Ile
1 5 10 15
Val Ile Leu Ala Thr Gly Gly Thr Ile Ala Gly Ser Ala Ala Thr Gly
20 25 30
Thr Gln Thr Thr Gly Tyr Lys Ala Gly Ala Leu Gly Val Asp Thr Leu
35 40 45
Ile Cys Ala Val Pro Glu Val Lys Lys Leu Ala Asn Val Lys Gly Glu
50 55 60
Gln Phe Ser Asn Met Ala Ser Glu Asn Met Thr Gly Asp Val Val Leu
65 70 75 80
Cys Leu Ser Gln Arg Val Asn Glu Leu Leu Ala Arg Asp Asp Val Asp
85 90 95
Gly Val Val Ile Thr His Gly Thr Asp Thr Val Glu Glu Ser Ala Tyr
100 105 110
Phe Leu His Leu Thr Val Lys Ser Asp Lys Pro Val Val Phe Val Ala
115 120 125
Ala Met Arg Pro Ala Thr Ala Ile Ser Ala Asp Gly Pro Met Asn Leu
130 135 140
Leu Glu Ala Val Arg Val Ala Gly Asp Lys Gln Ser Arg Gly Arg Gly
145 150 155 160
Val Met Val Val Ile Asn Asp Arg Ile Gly Ser Ala Arg Tyr Ile Thr
165 170 175
Lys Thr Asn Ala Ser Thr Leu Asp Thr Phe Arg Ala Asn Glu Glu Gly
180 185 190
Tyr Leu Gly Val Ile Ile Gly Asn Arg Ile Tyr Tyr Gln Asn Arg Ile
195 200 205
Asp Lys Leu His Thr Thr Arg Ser Val Phe Asp Val Arg Gly Leu Thr
210 215 220
Ser Leu Pro Lys Val Asp Ile Leu Tyr Gly Tyr Gln Asp Asp Pro Glu
225 230 235 240
Tyr Leu Tyr Asp Ala Ala Ile Gln His Gly Val Lys Gly Ile Val Tyr
245 250 255
Ala Gly Met Gly Ala Gly Ser Val Ser Val Arg Gly Ile Ala Gly Met
260 265 270
Arg Cys Ala Leu Glu Lys Gly Val Val Val Met Arg Ser Thr Arg Thr
275 280 285
Gly Asn Gly Ile Val Pro Pro Asp Glu Glu Leu Pro Gly Leu Val Ser
290 295 300
Asp Ser Leu Asn Pro Ala His Ala Arg Ile Leu Leu Met Leu Ala Leu
305 310 315 320
Thr Arg Thr Ser Asp Pro Lys Val Ile Gln Glu Tyr Phe His Thr Tyr
325 330 335
<210> 6
<211> 336
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Variant E. chrysanthemi asparaginase sequence with N-terminal
polyHis tag
<400> 6
Met Ala His His His His His His His Ala Asp Lys Leu Pro Asn Ile
1 5 10 15
Val Ile Leu Ala Thr Gly Gly Thr Ile Ala Gly Ser Ala Ala Thr Gly
20 25 30
Thr Gln Thr Thr Gly Tyr Lys Ala Gly Ala Leu Gly Val Asp Thr Leu
35 40 45
Ile Asn Ala Val Pro Glu Val Lys Lys Leu Ala Asn Val Lys Gly Glu
50 55 60
Gln Phe Ser Asn Met Ala Ser Glu Asn Met Thr Gly Asp Val Val Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Gln Arg Val Asn Glu Leu Leu Ala Arg Asp Asp Val Asp
85 90 95
Gly Val Val Ile Thr His Gly Thr Asp Thr Val Glu Glu Ser Ala Tyr
100 105 110
Phe Leu His Leu Thr Val Lys Ser Asp Lys Pro Val Val Phe Val Ala
115 120 125
Ala Met Arg Pro Ala Thr Ala Ile Ser Ala Asp Gly Pro Met Asn Leu
130 135 140
Leu Glu Ala Val Arg Val Ala Gly Asp Lys Gln Ser Arg Gly Arg Gly
145 150 155 160
Val Met Val Val Ile Asn Asp Arg Ile Gly Ser Ala Arg Tyr Ile Thr
165 170 175
Lys Thr Asn Ala Ser Thr Leu Asp Thr Phe Arg Ala Asn Glu Glu Gly
180 185 190
Tyr Leu Gly Val Ile Ile Gly Asn Arg Ile Tyr Tyr Gln Asn Arg Ile
195 200 205
Asp Lys Leu His Thr Thr Arg Ser Val Phe Asp Val Arg Gly Leu Thr
210 215 220
Ser Leu Pro Lys Val Asp Ile Leu Tyr Gly Tyr Gln Asp Asp Pro Glu
225 230 235 240
Tyr Leu Tyr Asp Ala Ala Ile Gln His Gly Val Lys Gly Ile Val Tyr
245 250 255
Ala Gly Met Gly Ala Gly Ser Val Ser Val Arg Gly Ile Ala Gly Met
260 265 270
Arg Lys Ala Leu Glu Lys Gly Val Val Val Met Arg Ser Thr Arg Thr
275 280 285
Gly Asn Gly Ile Val Pro Pro Asp Glu Glu Leu Pro Gly Leu Val Ser
290 295 300
Asp Ser Leu Asn Pro Ala His Ala Arg Ile Leu Leu Met Leu Ala Leu
305 310 315 320
Thr Arg Thr Ser Asp Pro Lys Val Ile Gln Glu Tyr Phe His Thr Tyr
325 330 335
<210> 7
<211> 328
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Variant E. chrysanthemi asparaginase mature sequence with 4
cysteine substitutions
<400> 7
Met Ala Asp Lys Leu Pro Asn Ile Val Ile Leu Ala Thr Gly Gly Thr
1 5 10 15
Ile Ala Gly Ser Ala Ala Thr Gly Thr Gln Thr Thr Gly Tyr Lys Ala
20 25 30
Gly Ala Leu Gly Val Asp Thr Leu Ile Cys Ala Val Pro Glu Val Lys
35 40 45
Lys Leu Ala Asn Val Lys Gly Glu Gln Phe Ser Asn Met Ala Ser Glu
50 55 60
Asn Met Thr Gly Asp Val Val Leu Cys Leu Ser Gln Arg Val Asn Glu
65 70 75 80
Leu Leu Ala Arg Asp Asp Val Asp Gly Val Val Ile Thr His Gly Thr
85 90 95
Asp Thr Val Glu Glu Ser Ala Tyr Phe Leu His Leu Thr Val Lys Ser
100 105 110
Asp Lys Pro Val Val Phe Val Ala Ala Met Arg Pro Ala Thr Ala Ile
115 120 125
Ser Ala Asp Gly Pro Met Asn Leu Leu Glu Ala Val Arg Val Ala Gly
130 135 140
Asp Lys Gln Ser Arg Gly Arg Gly Val Met Val Val Ile Asn Asp Arg
145 150 155 160
Ile Gly Ser Ala Arg Tyr Ile Thr Lys Thr Asn Ala Ser Thr Leu Asp
165 170 175
Thr Phe Arg Ala Asn Glu Glu Gly Tyr Leu Gly Val Ile Ile Gly Asn
180 185 190
Arg Ile Tyr Tyr Gln Asn Arg Ile Asp Lys Leu His Thr Thr Arg Ser
195 200 205
Val Phe Asp Val Arg Gly Leu Thr Ser Leu Pro Lys Val Asp Ile Leu
210 215 220
Tyr Gly Tyr Gln Asp Asp Pro Glu Tyr Leu Tyr Asp Ala Ala Ile Gln
225 230 235 240
His Gly Val Lys Gly Ile Val Tyr Ala Gly Met Gly Ala Gly Ser Val
245 250 255
Ser Val Arg Gly Ile Ala Gly Met Arg Cys Ala Leu Glu Lys Gly Val
260 265 270
Val Val Met Arg Ser Thr Arg Thr Gly Asn Gly Ile Val Pro Pro Asp
275 280 285
Cys Glu Leu Pro Gly Leu Val Ser Asp Ser Leu Asn Pro Ala His Ala
290 295 300
Arg Ile Leu Leu Met Leu Ala Leu Thr Arg Thr Ser Asp Pro Lys Val
305 310 315 320
Ile Gln Glu Tyr Phe His Thr Tyr
325
<210> 8
<211> 328
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Variant E. chrysanthemi asparaginase mature sequence with 1
lysine substitution
<400> 8
Met Ala Asp Lys Leu Pro Asn Ile Val Ile Leu Ala Thr Gly Gly Thr
1 5 10 15
Ile Ala Gly Ser Ala Ala Thr Gly Thr Gln Thr Thr Gly Tyr Lys Ala
20 25 30
Gly Ala Leu Gly Val Asp Thr Leu Ile Lys Ala Val Pro Glu Val Lys
35 40 45
Lys Leu Ala Asn Val Lys Gly Glu Gln Phe Ser Asn Met Ala Ser Glu
50 55 60
Asn Met Thr Gly Asp Val Val Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Asn Glu
65 70 75 80
Leu Leu Ala Arg Asp Asp Val Asp Gly Val Val Ile Thr His Gly Thr
85 90 95
Asp Thr Val Glu Glu Ser Ala Tyr Phe Leu His Leu Thr Val Lys Ser
100 105 110
Asp Lys Pro Val Val Phe Val Ala Ala Met Arg Pro Ala Thr Ala Ile
115 120 125
Ser Ala Asp Gly Pro Met Asn Leu Leu Glu Ala Val Arg Val Ala Gly
130 135 140
Asp Lys Gln Ser Arg Gly Arg Gly Val Met Val Val Ile Asn Asp Arg
145 150 155 160
Ile Gly Ser Ala Arg Tyr Ile Thr Lys Thr Asn Ala Ser Thr Leu Asp
165 170 175
Thr Phe Arg Ala Asn Glu Glu Gly Tyr Leu Gly Val Ile Ile Gly Asn
180 185 190
Arg Ile Tyr Tyr Gln Asn Arg Ile Asp Lys Leu His Thr Thr Arg Ser
195 200 205
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210 215 220
Tyr Gly Tyr Gln Asp Asp Pro Glu Tyr Leu Tyr Asp Ala Ala Ile Gln
225 230 235 240
His Gly Val Lys Gly Ile Val Tyr Ala Gly Met Gly Ala Gly Ser Val
245 250 255
Ser Val Arg Gly Ile Ala Gly Met Arg Lys Ala Leu Glu Lys Gly Val
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Arg Ile Leu Leu Met Leu Ala Leu Thr Arg Thr Ser Asp Pro Lys Val
305 310 315 320
Ile Gln Glu Tyr Phe His Thr Tyr
325
<210> 9
<211> 328
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Variant E. chrysanthemi asparaginase mature sequence with 2
lysine substitutions
<400> 9
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1 5 10 15
Ile Ala Gly Ser Ala Ala Thr Gly Thr Gln Thr Thr Gly Tyr Lys Ala
20 25 30
Gly Ala Leu Gly Val Asp Thr Leu Ile Lys Ala Val Pro Glu Val Lys
35 40 45
Lys Leu Ala Asn Val Lys Gly Glu Gln Phe Ser Asn Met Ala Ser Glu
50 55 60
Asn Met Thr Gly Asp Val Val Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Asn Glu
65 70 75 80
Leu Leu Ala Arg Asp Asp Val Asp Gly Val Val Ile Thr His Gly Thr
85 90 95
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100 105 110
Asp Lys Pro Val Val Phe Val Ala Ala Met Arg Pro Ala Thr Ala Ile
115 120 125
Ser Ala Asp Gly Pro Met Asn Leu Leu Glu Ala Val Arg Val Ala Gly
130 135 140
Asp Lys Gln Ser Arg Gly Arg Gly Val Met Val Val Ile Asn Asp Arg
145 150 155 160
Ile Gly Ser Ala Arg Tyr Ile Thr Lys Thr Asn Ala Ser Thr Leu Asp
165 170 175
Thr Phe Arg Ala Asn Glu Glu Gly Tyr Leu Gly Val Ile Ile Gly Asn
180 185 190
Arg Ile Tyr Tyr Gln Asn Arg Ile Asp Lys Leu His Thr Thr Arg Ser
195 200 205
Val Phe Asp Val Arg Gly Leu Thr Ser Leu Pro Lys Val Asp Ile Leu
210 215 220
Tyr Gly Tyr Gln Asp Asp Pro Glu Tyr Leu Tyr Asp Ala Ala Ile Gln
225 230 235 240
His Gly Val Lys Gly Ile Val Tyr Ala Gly Met Gly Ala Gly Ser Val
245 250 255
Ser Val Arg Gly Ile Ala Gly Met Arg Lys Ala Leu Glu Lys Gly Val
260 265 270
Val Val Met Arg Ser Thr Arg Thr Gly Asn Gly Ile Val Pro Pro Asp
275 280 285
Lys Glu Leu Pro Gly Leu Val Ser Asp Ser Leu Asn Pro Ala His Ala
290 295 300
Arg Ile Leu Leu Met Leu Ala Leu Thr Arg Thr Ser Asp Pro Lys Val
305 310 315 320
Ile Gln Glu Tyr Phe His Thr Tyr
325
<210> 10
<211> 348
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 10
Met Glu Phe Phe Lys Lys Thr Ala Leu Ala Ala Leu Val Met Gly Phe
1 5 10 15
Ser Gly Ala Ala Leu Ala Leu Pro Asn Ile Thr Ile Leu Ala Thr Gly
20 25 30
Gly Thr Ile Ala Gly Gly Gly Asp Ser Ala Thr Lys Ser Asn Tyr Thr
35 40 45
Val Gly Lys Val Gly Val Glu Asn Leu Val Asn Ala Val Pro Gln Leu
50 55 60
Lys Asp Ile Ala Asn Val Lys Gly Glu Gln Val Val Asn Ile Gly Ser
65 70 75 80
Gln Asp Met Asn Asp Asn Val Trp Leu Thr Leu Ala Lys Lys Ile Asn
85 90 95
Thr Asp Cys Asp Lys Thr Asp Gly Phe Val Ile Thr His Gly Thr Asp
100 105 110
Thr Met Glu Glu Thr Ala Tyr Phe Leu Asp Leu Thr Val Lys Cys Asp
115 120 125
Lys Pro Val Val Met Val Gly Ala Met Arg Pro Ser Thr Ser Met Ser
130 135 140
Ala Asp Gly Pro Phe Asn Leu Tyr Asn Ala Val Val Thr Ala Ala Asp
145 150 155 160
Lys Ala Ser Ala Asn Arg Gly Val Leu Val Val Met Asn Asp Thr Val
165 170 175
Leu Asp Gly Arg Asp Val Thr Lys Thr Asn Thr Thr Asp Val Ala Thr
180 185 190
Phe Lys Ser Val Asn Tyr Gly Pro Leu Gly Tyr Ile His Asn Gly Lys
195 200 205
Ile Asp Tyr Gln Arg Thr Pro Ala Arg Lys His Thr Ser Asp Thr Pro
210 215 220
Phe Asp Val Ser Lys Leu Asn Glu Leu Pro Lys Val Gly Ile Val Tyr
225 230 235 240
Asn Tyr Ala Asn Ala Ser Asp Leu Pro Ala Lys Ala Leu Val Asp Ala
245 250 255
Gly Tyr Asp Gly Ile Val Ser Ala Gly Val Gly Asn Gly Asn Leu Tyr
260 265 270
Lys Ser Val Phe Asp Thr Leu Ala Thr Ala Ala Lys Thr Gly Thr Ala
275 280 285
Val Val Arg Ser Ser Arg Val Pro Thr Gly Ala Thr Thr Gln Asp Ala
290 295 300
Glu Val Asp Asp Ala Lys Tyr Gly Phe Val Ala Ser Gly Thr Leu Asn
305 310 315 320
Pro Gln Lys Ala Arg Val Leu Leu Gln Leu Ala Leu Thr Gln Thr Lys
325 330 335
Asp Pro Gln Gln Ile Gln Gln Ile Phe Asn Gln Tyr
340 345
<210> 11
<211> 326
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 11
Leu Pro Asn Ile Thr Ile Leu Ala Thr Gly Gly Thr Ile Ala Gly Gly
1 5 10 15
Gly Asp Ser Ala Thr Lys Ser Asn Tyr Thr Val Gly Lys Val Gly Val
20 25 30
Glu Asn Leu Val Asn Ala Val Pro Gln Leu Lys Asp Ile Ala Asn Val
35 40 45
Lys Gly Glu Gln Val Val Asn Ile Gly Ser Gln Asp Met Asn Asp Asn
50 55 60
Val Trp Leu Thr Leu Ala Lys Lys Ile Asn Thr Asp Cys Asp Lys Thr
65 70 75 80
Asp Gly Phe Val Ile Thr His Gly Thr Asp Thr Met Glu Glu Thr Ala
85 90 95
Tyr Phe Leu Asp Leu Thr Val Lys Cys Asp Lys Pro Val Val Met Val
100 105 110
Gly Ala Met Arg Pro Ser Thr Ser Met Ser Ala Asp Gly Pro Phe Asn
115 120 125
Leu Tyr Asn Ala Val Val Thr Ala Ala Asp Lys Ala Ser Ala Asn Arg
130 135 140
Gly Val Leu Val Val Met Asn Asp Thr Val Leu Asp Gly Arg Asp Val
145 150 155 160
Thr Lys Thr Asn Thr Thr Asp Val Ala Thr Phe Lys Ser Val Asn Tyr
165 170 175
Gly Pro Leu Gly Tyr Ile His Asn Gly Lys Ile Asp Tyr Gln Arg Thr
180 185 190
Pro Ala Arg Lys His Thr Ser Asp Thr Pro Phe Asp Val Ser Lys Leu
195 200 205
Asn Glu Leu Pro Lys Val Gly Ile Val Tyr Asn Tyr Ala Asn Ala Ser
210 215 220
Asp Leu Pro Ala Lys Ala Leu Val Asp Ala Gly Tyr Asp Gly Ile Val
225 230 235 240
Ser Ala Gly Val Gly Asn Gly Asn Leu Tyr Lys Ser Val Phe Asp Thr
245 250 255
Leu Ala Thr Ala Ala Lys Thr Gly Thr Ala Val Val Arg Ser Ser Arg
260 265 270
Val Pro Thr Gly Ala Thr Thr Gln Asp Ala Glu Val Asp Asp Ala Lys
275 280 285
Tyr Gly Phe Val Ala Ser Gly Thr Leu Asn Pro Gln Lys Ala Arg Val
290 295 300
Leu Leu Gln Leu Ala Leu Thr Gln Thr Lys Asp Pro Gln Gln Ile Gln
305 310 315 320
Gln Ile Phe Asn Gln Tyr
325
<210> 12
<211> 326
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Variant E. coli asparaginase mature sequence with one additional
cysteine pair
<400> 12
Leu Pro Asn Ile Thr Ile Leu Cys Thr Gly Gly Thr Ile Ala Gly Gly
1 5 10 15
Gly Asp Ser Ala Thr Lys Ser Asn Tyr Thr Val Gly Lys Val Gly Cys
20 25 30
Glu Asn Leu Val Asn Ala Val Pro Gln Leu Lys Asp Ile Ala Asn Val
35 40 45
Lys Gly Glu Gln Val Val Asn Ile Gly Ser Gln Asp Met Asn Asp Asn
50 55 60
Val Trp Leu Thr Leu Ala Lys Lys Ile Asn Thr Asp Cys Asp Lys Thr
65 70 75 80
Asp Gly Phe Val Ile Thr His Gly Thr Asp Thr Met Glu Glu Thr Ala
85 90 95
Tyr Phe Leu Asp Leu Thr Val Lys Cys Asp Lys Pro Val Val Met Val
100 105 110
Gly Ala Met Arg Pro Ser Thr Ser Met Ser Ala Asp Gly Pro Phe Asn
115 120 125
Leu Tyr Asn Ala Val Val Thr Ala Ala Asp Lys Ala Ser Ala Asn Arg
130 135 140
Gly Val Leu Val Val Met Asn Asp Thr Val Leu Asp Gly Arg Asp Val
145 150 155 160
Thr Lys Thr Asn Thr Thr Asp Val Ala Thr Phe Lys Ser Val Asn Tyr
165 170 175
Gly Pro Leu Gly Tyr Ile His Asn Gly Lys Ile Asp Tyr Gln Arg Thr
180 185 190
Pro Ala Arg Lys His Thr Ser Asp Thr Pro Phe Asp Val Ser Lys Leu
195 200 205
Asn Glu Leu Pro Lys Val Gly Ile Val Tyr Asn Tyr Ala Asn Ala Ser
210 215 220
Asp Leu Pro Ala Lys Ala Leu Val Asp Ala Gly Tyr Asp Gly Ile Val
225 230 235 240
Ser Ala Gly Val Gly Asn Gly Asn Leu Tyr Lys Ser Val Phe Asp Thr
245 250 255
Leu Ala Thr Ala Ala Lys Thr Gly Thr Ala Val Val Arg Ser Ser Arg
260 265 270
Val Pro Thr Gly Ala Thr Thr Gln Asp Ala Glu Val Asp Asp Ala Lys
275 280 285
Tyr Gly Phe Val Ala Ser Gly Thr Leu Asn Pro Gln Lys Ala Arg Val
290 295 300
Leu Leu Gln Leu Ala Leu Thr Gln Thr Lys Asp Pro Gln Gln Ile Gln
305 310 315 320
Gln Ile Phe Asn Gln Tyr
325
<210> 13
<211> 321
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 13
Met Gly Lys Ala Val Ile Ala Ile His Gly Gly Ala Gly Ala Ile Ser
1 5 10 15
Arg Ala Gln Met Ser Leu Gln Gln Glu Leu Arg Tyr Ile Glu Ala Leu
20 25 30
Ser Ala Ile Val Glu Thr Gly Gln Lys Met Leu Glu Ala Gly Glu Ser
35 40 45
Ala Leu Asp Val Val Thr Glu Ala Val Arg Leu Leu Glu Glu Cys Pro
50 55 60
Leu Phe Asn Ala Gly Ile Gly Ala Val Phe Thr Arg Asp Glu Thr His
65 70 75 80
Glu Leu Asp Ala Cys Val Met Asp Gly Asn Thr Leu Lys Ala Gly Ala
85 90 95
Val Ala Gly Val Ser His Leu Arg Asn Pro Val Leu Ala Ala Arg Leu
100 105 110
Val Met Glu Gln Ser Pro His Val Met Met Ile Gly Glu Gly Ala Glu
115 120 125
Asn Phe Ala Phe Ala Arg Gly Met Glu Arg Val Ser Pro Glu Ile Phe
130 135 140
Ser Thr Ser Leu Arg Tyr Glu Gln Leu Leu Ala Ala Arg Lys Glu Gly
145 150 155 160
Ala Thr Val Leu Asp His Ser Gly Ala Pro Leu Asp Glu Lys Gln Lys
165 170 175
Met Gly Thr Val Gly Ala Val Ala Leu Asp Leu Asp Gly Asn Leu Ala
180 185 190
Ala Ala Thr Ser Thr Gly Gly Met Thr Asn Lys Leu Pro Gly Arg Val
195 200 205
Gly Asp Ser Pro Leu Val Gly Ala Gly Cys Tyr Ala Asn Asn Ala Ser
210 215 220
Val Ala Val Ser Cys Thr Gly Thr Gly Glu Val Phe Ile Arg Ala Leu
225 230 235 240
Ala Ala Tyr Asp Ile Ala Ala Leu Met Asp Tyr Gly Gly Leu Ser Leu
245 250 255
Ala Glu Ala Cys Glu Arg Val Val Met Glu Lys Leu Pro Ala Leu Gly
260 265 270
Gly Ser Gly Gly Leu Ile Ala Ile Asp His Glu Gly Asn Val Ala Leu
275 280 285
Pro Phe Asn Thr Glu Gly Met Tyr Arg Ala Trp Gly Tyr Ala Gly Asp
290 295 300
Thr Pro Thr Thr Gly Ile Tyr Arg Glu Lys Gly Asp Thr Val Ala Thr
305 310 315 320
Gln
<210> 14
<211> 303
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 14
Gln Met Ser Leu Gln Gln Glu Leu Arg Tyr Ile Glu Ala Leu Ser Ala
1 5 10 15
Ile Val Glu Thr Gly Gln Lys Met Leu Glu Ala Gly Glu Ser Ala Leu
20 25 30
Asp Val Val Thr Glu Ala Val Arg Leu Leu Glu Glu Cys Pro Leu Phe
35 40 45
Asn Ala Gly Ile Gly Ala Val Phe Thr Arg Asp Glu Thr His Glu Leu
50 55 60
Asp Ala Cys Val Met Asp Gly Asn Thr Leu Lys Ala Gly Ala Val Ala
65 70 75 80
Gly Val Ser His Leu Arg Asn Pro Val Leu Ala Ala Arg Leu Val Met
85 90 95
Glu Gln Ser Pro His Val Met Met Ile Gly Glu Gly Ala Glu Asn Phe
100 105 110
Ala Phe Ala Arg Gly Met Glu Arg Val Ser Pro Glu Ile Phe Ser Thr
115 120 125
Ser Leu Arg Tyr Glu Gln Leu Leu Ala Ala Arg Lys Glu Gly Ala Thr
130 135 140
Val Leu Asp His Ser Gly Ala Pro Leu Asp Glu Lys Gln Lys Met Gly
145 150 155 160
Thr Val Gly Ala Val Ala Leu Asp Leu Asp Gly Asn Leu Ala Ala Ala
165 170 175
Thr Ser Thr Gly Gly Met Thr Asn Lys Leu Pro Gly Arg Val Gly Asp
180 185 190
Ser Pro Leu Val Gly Ala Gly Cys Tyr Ala Asn Asn Ala Ser Val Ala
195 200 205
Val Ser Cys Thr Gly Thr Gly Glu Val Phe Ile Arg Ala Leu Ala Ala
210 215 220
Tyr Asp Ile Ala Ala Leu Met Asp Tyr Gly Gly Leu Ser Leu Ala Glu
225 230 235 240
Ala Cys Glu Arg Val Val Met Glu Lys Leu Pro Ala Leu Gly Gly Ser
245 250 255
Gly Gly Leu Ile Ala Ile Asp His Glu Gly Asn Val Ala Leu Pro Phe
260 265 270
Asn Thr Glu Gly Met Tyr Arg Ala Trp Gly Tyr Ala Gly Asp Thr Pro
275 280 285
Thr Thr Gly Ile Tyr Arg Glu Lys Gly Asp Thr Val Ala Thr Gln
290 295 300
<210> 15
<211> 303
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Variant E. coli asparaginase mature sequence with no unpaired
cysteines
<400> 15
Gln Met Ser Leu Gln Gln Glu Leu Arg Tyr Ile Glu Ala Leu Ser Ala
1 5 10 15
Ile Val Glu Thr Gly Gln Lys Met Leu Glu Ala Gly Glu Ser Ala Leu
20 25 30
Asp Val Val Thr Glu Ala Val Arg Leu Leu Glu Glu Ser Pro Leu Phe
35 40 45
Asn Ala Gly Ile Gly Ala Val Phe Thr Arg Asp Glu Thr His Glu Leu
50 55 60
Asp Ala Cys Val Met Asp Gly Asn Thr Leu Lys Ala Gly Ala Val Ala
65 70 75 80
Gly Val Ser His Leu Arg Asn Pro Val Leu Ala Ala Arg Leu Val Met
85 90 95
Glu Gln Ser Pro His Val Met Met Ile Gly Glu Gly Ala Glu Asn Phe
100 105 110
Ala Phe Ala Arg Gly Met Glu Arg Val Ser Pro Glu Ile Phe Ser Thr
115 120 125
Ser Leu Arg Tyr Glu Gln Leu Leu Ala Ala Arg Lys Glu Gly Ala Thr
130 135 140
Val Leu Asp His Ser Gly Ala Pro Leu Asp Glu Lys Gln Lys Met Gly
145 150 155 160
Thr Val Gly Ala Val Ala Leu Asp Leu Asp Gly Asn Leu Ala Ala Ala
165 170 175
Thr Ser Thr Gly Gly Met Thr Asn Lys Leu Pro Gly Arg Val Gly Asp
180 185 190
Ser Pro Leu Val Gly Ala Gly Cys Tyr Ala Asn Asn Ala Ser Val Ala
195 200 205
Val Ser Ser Thr Gly Thr Gly Glu Val Phe Ile Arg Ala Leu Ala Ala
210 215 220
Tyr Asp Ile Ala Ala Leu Met Asp Tyr Gly Gly Leu Ser Leu Ala Glu
225 230 235 240
Ala Ser Glu Arg Val Val Met Glu Lys Leu Pro Ala Leu Gly Gly Ser
245 250 255
Gly Gly Leu Ile Ala Ile Asp His Glu Gly Asn Val Ala Leu Pro Phe
260 265 270
Asn Thr Glu Gly Met Tyr Arg Ala Trp Gly Tyr Ala Gly Asp Thr Pro
275 280 285
Thr Thr Gly Ile Tyr Arg Glu Lys Gly Asp Thr Val Ala Thr Gln
290 295 300
【外国語明細書】