特開 2024-81791 がん、炎症または免疫介在性炎症性疾患の防止および処置のためのカンナビノイドおよび医療用マッシュルームの固定した用量の組合せ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024081791

(43)【公開日】2024-06-18

(54)【発明の名称】がん、炎症または免疫介在性炎症性疾患の防止および処置のためのカンナビノイドおよび医療用マッシュルームの固定した用量の組合せ

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/185 20060101AFI20240611BHJP

   A61K 36/068 20060101ALI20240611BHJP

   A61K 36/07 20060101ALI20240611BHJP

   A61K 36/074 20060101ALI20240611BHJP

   A61K 31/352 20060101ALI20240611BHJP

   A61K 31/055 20060101ALI20240611BHJP

   A61K 31/192 20060101ALI20240611BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20240611BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20240611BHJP

   A61P 5/14 20060101ALI20240611BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20240611BHJP

   A61P 7/06 20060101ALI20240611BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20240611BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20240611BHJP

   A61P 11/06 20060101ALI20240611BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20240611BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20240611BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20240611BHJP

   A61P 17/10 20060101ALI20240611BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20240611BHJP

   A61P 19/08 20060101ALI20240611BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20240611BHJP

   A61P 21/04 20060101ALI20240611BHJP

   A61P 25/02 20060101ALI20240611BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240611BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240611BHJP

   A61P 37/00 20060101ALI20240611BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20240611BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240611BHJP

   A61K 9/06 20060101ALI20240611BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20240611BHJP

   A61K 9/10 20060101ALI20240611BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20240611BHJP

   A61K 9/16 20060101ALI20240611BHJP

   A61K 9/19 20060101ALI20240611BHJP

   A61K 9/20 20060101ALI20240611BHJP

   A61K 9/48 20060101ALI20240611BHJP

   A61K 9/70 20060101ALI20240611BHJP

   A61K 9/72 20060101ALI20240611BHJP

【ＦＩ】

A61K36/185

A61K36/068

A61K36/07

A61K36/074

A61K31/352

A61K31/055

A61K31/192

A61P1/04

A61P1/16

A61P5/14

A61P7/00

A61P7/06

A61P9/00

A61P11/00

A61P11/06

A61P13/12

A61P17/00

A61P17/06

A61P17/10

A61P19/02

A61P19/08

A61P21/00

A61P21/04

A61P25/02

A61P29/00

A61P29/00 101

A61P35/00

A61P37/00

A61P37/06

A61P43/00 121

A61K9/06

A61K9/08

A61K9/10

A61K9/14

A61K9/16

A61K9/19

A61K9/20

A61K9/48

A61K9/70 401

A61K9/72

【審査請求】有

【請求項の数】10

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2024061174

(22)【出願日】2024-04-05

(62)【分割の表示】P 2021559480の分割

【原出願日】2020-03-20

(31)【優先権主張番号】62/821,461

(32)【優先日】2019-03-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】521437987

【氏名又は名称】アルビト・エルシーエス・ファーマ・リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100135415

【弁理士】

【氏名又は名称】中濱 明子

(72)【発明者】

【氏名】ラメンスドルフ，イツァク

(72)【発明者】

【氏名】レビー，ヨナ

(57)【要約】      （修正有）

【課題】哺乳類対象における免疫介在性炎症性疾患またはがんを処置するのに有用な組成物を提供する。
【解決手段】組成物は、大麻由来の化合物および医薬用マッシュルームの相乗的な組合せを含む。大麻由来の化合物は、カンナビノイド、テルペン、フェノール化合物およびそれらのあらゆる組合せからなる群から選択されることが好ましく、医薬用マッシュルームは、冬虫夏草、舞茸（グリフォラ・フロンドサ）、ターキーテイル（トラメテス・ベルシコロル、コリオルス・ベルシコロル）、霊芝（ガノデルマ・ルシダム）、チャーガ（イノノタス・オブリクス）、椎茸（レンティナス・エドデス）、アガリクス・ブラゼイ・ムリル、およびそれらのあらゆる組合せからなる群から選択されることが好ましい。
【選択図】図６Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

哺乳類対象において免疫介在性炎症性疾患またはがんを処置するのに有用な組成物およびそれらのあらゆる組合せであって、前記組成物は、
ａ．大麻由来の化合物および
ｂ．医薬用マッシュルーム
の相乗的な組合せを含む、上記組成物。

【請求項2】

免疫介在性炎症性疾患またはがんを相乗的に処置するのに有用な相乗的な組成物およびそれらのあらゆる組合せであって、前記組成物は、
ｃ．ＣＢ１またはＣＢＤ受容体にアゴニスト作用を有する大麻由来の化合物およびそれらのあらゆる組合せ；
ｄ．パターン認識受容体（ＰＲＲ）にアゴニスト作用を有する医薬用マッシュルーム
を含み、
前記大麻由来の化合物は、治療的に抗炎症性であり、前記医薬用マッシュルームは、哺乳類対象において免疫刺激性である、上記組成物。

【請求項3】

前記免疫介在性炎症性疾患が、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；乾癬、リウマチ様関節炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、自己免疫性溶血性貧血、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー；巨細胞動脈炎；ＧＮ、糸球体腎炎；若年性特発性関節炎、リウマチ性多発性筋痛；ＳＡＰＨＯ、滑膜炎、座瘡、膿疱症、骨増殖症、骨炎、全身性エリテマトーデス；血栓性／特発性血小板減少性紫斑病、シェーグレン病、クローン病、多発性筋炎／皮膚筋炎、ヴェグナー肉芽腫症、ヴェグナー血管炎、乾癬、ベーチェット病、多発動脈炎、高安動脈炎、移植片対宿主病、多発動脈炎、サルコイドーシス、成人発症スチル病、化膿性汗腺炎、クリオグロブリン血症性血管炎、壊疽性膿皮症、川崎病、再発性多発性軟骨炎、抗リン脂質抗体症候群、クリオグロブリン血症性血管炎、化膿性汗腺炎、特発性膜性、再発性多発性軟骨炎、セリアック病、慢性Ｃ型肝炎、重症筋無力症、骨髄異形成症候群、天疱瘡、難治性喘息、グレーブス病、壊疽性膿皮症、結節性紅斑、ＳＡＰＨＯ症候群、多中心性網組織球症、Ｂ型慢性肝炎、アミロイドーシス、およびそれらのあらゆる組合せからなる群から選択される、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項4】

前記パターン認識受容体（ＰＲＲ）が、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、マンノース受容体、デクチン１およびそれらのあらゆる組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。

【請求項5】

前記医薬用マッシュルームが、冬虫夏草、舞茸（グリフォラ・フロンドサ）、ターキーテイル（トラメテス・ベルシコロル、コリオルス・ベルシコロル）、霊芝（ガノデルマ・ルシダム）、チャーガ（イノノタス・オブリクス）、椎茸（レンティナス・エドデス）、アガリクス・ブラゼイ・ムリル、およびそれらのあらゆる組合せからなる群から選択される、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項6】

前記大麻由来の化合物が、カンナビノイド、テルペン、フェノール化合物およびそれらのあらゆる組合せからなる群から選択される、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項7】

カンナビノイドが、テトラヒドロカンナビノイド（ｄ９－ＴＨＣ）、テトラヒドロカンナビノイド（ｄ８－ＴＨＣ）、テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ－ｄ９）、テトラヒドロカンナビバリン（ＴＨＣＶ／ＴＨＣ－Ｃ３）、カンナビジオール（ＣＢＤ）、カンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）、カンナビジバリン（ＣＢＤＶ）、カンナビゲロール（ＣＢＧ）、カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）、カンナビノール（ＣＢＮ）、カンナビジオール酸（ＣＢＮＡ）、カンナビクロメン（ＣＢＣ）、カンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）、お
よびそれらのあらゆる組合せの少なくとも１つである、請求項６に記載の組成物。

【請求項8】

テルペンが、モノテルペンまたはセスキテルペンである、請求項６に記載の組成物。

【請求項9】

フェノール化合物が、Ｏ－グリコシド型のカンナフラビンＡ、カンナフラビンＢ、カンナビシンＤ、およびそれらのあらゆる組合せの少なくとも１つである、請求項６に記載の組成物。

【請求項10】

吸入器、シガレット、錠剤、カプセル剤、丸剤、凍結乾燥剤、粉剤、乳剤、顆粒剤、クリーム剤、軟膏剤、ペースト剤、ローションゲル、液剤、溶液剤、パッチおよびそれらのあらゆる組合せからなる群から選択される方式で投与可能なように構成される、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項11】

即時放出、遅延放出、持続放出、制御放出およびそれらのあらゆる組合せからなる群から選択される方式で投与可能なように構成される、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項12】

可溶化剤、安定剤、緩衝液、張度調節物質、増量剤、粘度増強剤／低下剤、界面活性剤、キレート剤、アジュバントおよびそれらのあらゆる組合せからなる群から選択される成分をさらに含む、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項13】

免疫介在性炎症性疾患またはがんを処置する方法およびそれらのあらゆる組合せであって、
ｃ．組成物を提供する工程であって、前記組成物は、ａ．大麻由来の化合物およびｂ．医薬用マッシュルームの相乗的な組合せを含む、工程；および
ｄ．前記組成物を哺乳類対象に投与する工程
を含む、上記方法。

【請求項14】

免疫介在性炎症性疾患またはがんを処置する方法およびそれらのあらゆる組合せであって、
ｅ．ＣＢ１またはＣＢＤ受容体にアゴニスト作用を有する大麻由来の化合物およびそれらのあらゆる組合せ、ならびにパターン認識受容体（ＰＲＲ）にアゴニスト作用を有する医薬用マッシュルームを含む組成物を提供する工程；および
ｆ．前記組成物を哺乳類対象に投与する工程
を含み、前記大麻由来の化合物は、治療的に抗炎症性であり、前記医薬用マッシュルームは、前記哺乳類対象において免疫刺激性である、上記方法。

【請求項15】

哺乳類対象において免疫介在性炎症性疾患またはがんを処置するのに有用な組成物およびそれらのあらゆる組合せであって、
ｃ．パターン認識受容体（ＰＲＲ）にアゴニスト作用を有する少なくとも１つの医薬用マッシュルーム；および
ｄ．少なくとも第２の医薬用マッシュルーム
を含む、上記組成物。

【請求項16】

前記免疫介在性炎症性疾患を処置するのに有用な組成物が、冬虫夏草Ｍマッシュルーム抽出物およびＴＨＣを含む、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項17】

前記免疫介在性炎症性疾患を処置することが、酸化窒素分泌の阻害を含む、請求項１５に記載の組成物。

【請求項18】

前記免疫介在性炎症性疾患を処置するのに有用な組成物が、霊芝マッシュルーム抽出物
およびＴＨＣを含む、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項19】

前記免疫介在性炎症性疾患を処置することが、ＩＬ－６分泌を減少させることからなる、請求項１５に記載の組成物。

【請求項20】

前記免疫介在性炎症性疾患を処置するのに有用な組成物が、冬虫夏草Ｃｓ－４マッシュルーム抽出物ＴＨＣを含む、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項21】

前記免疫介在性炎症性疾患を処置することが、ＴＮＦα分泌を減少させることからなる、請求項１５に記載の組成物。

【請求項22】

前記免疫介在性がんを処置することが、ＣＢＤ、ならびに冬虫夏草（Ｍ）マッシュルーム抽出物および霊芝マッシュルーム抽出物からなる群から選択されるマッシュルーム抽出物を含む組成物によって提供される、請求項１または２に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、一般的に、がん、炎症または免疫介在性炎症性疾患の新規の処置のための手段および方法に関する。
より詳細には、本発明は、がん、炎症または免疫介在性炎症性疾患の防止および処置のための、カンナビノイドおよび医療用マッシュルームの相乗的な相互作用および固定した用量の組合せに関する。

【背景技術】

【0002】

カンナビノイド（ＣＢＤ、ＴＨＣなど）は、公知の抗がん活性を有する有力な抗炎症剤であることがわかっているが、これらの化合物は、免疫介在性プロセスを弱めたり、抑制したり、または減少させる可能性があることも見出された。免疫介在性プロセスを減少させることは、一部の臨床的な徴候において正の影響を有する場合もあるが、免疫刺激および抗炎症性作用が必要なプロセス（例えばがん）に負の影響を及ぼす可能性もある。

【0003】

さらに、がんの処置に使用されるほとんどの化学療法剤は、腫瘍を破壊し、がんの進行を止め、加えて処置の経過中に健康な細胞および組織にダメージを与える可能性があり、さらに、がん免疫性への負の作用が、それらの有益な抗腫瘍作用を部分的に減らす可能性がある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

したがって、抗がん処置として、さらに、他の免疫介在性炎症性疾患（ＩＭＩＤ）のための処置として役立つ新しいより有効でより安全な薬剤への未だ満たされていない必要性がある。

【課題を解決するための手段】

【0005】

発明の要約
抗がん処置として、さらに、他の免疫介在性炎症性疾患（ＩＭＩＤ）のための処置として役立つ新しいより有効でより安全な薬剤への未だ満たされていない必要性があり、この場合、抗炎症性およびプロ免疫性の、主としてプロＴｈ１タイプまたは関連する細胞作用（ＮＫ細胞刺激）の組合せが有益であるとみなすことができる。

【0006】

カンナビノイドは抗炎症性作用を有し、免疫性を抑制するが、医療用マッシュルームは、免疫性を刺激し、一方である程度の抗炎症性作用を有することがわかっており、したがって、特定の条件下で、それらの組合せは、特定の比率で、独特な予想外の範囲の相乗的な抗炎症性活性、加えて選択的なプロ免疫特性を有すると予想される。

【0007】

本発明の１つの目的は、哺乳類対象において免疫介在性炎症性疾患またはがんを処置するのに有用な組成物およびそれらのあらゆる組合せであって、前記組成物は、ａ．大麻由来の化合物およびｂ．医薬用マッシュルームの相乗的な組合せを含む、上記組成物を開示することである。

【0008】

本発明の別の目的は、上記のいずれかで定義した通りの組成物を開示することである。
本発明の１つの目的は、免疫介在性炎症性疾患またはがんを相乗的に処置するのに有用な相乗的な組成物およびそれらのあらゆる組合せであって、前記組成物は、
ａ．ＣＢ１またはＣＢＤ受容体にアゴニスト作用を有する大麻由来の化合物およびそれ
らのあらゆる組合せ；
ｂ．パターン認識受容体（ＰＲＲ）にアゴニスト作用を有する医薬用マッシュルーム
を含み、
前記大麻由来の化合物は、治療的に抗炎症性であり、前記医薬用マッシュルームは、哺乳類対象において免疫刺激性である、上記組成物を開示することである。

【0009】

本発明の別の目的は、前記免疫介在性炎症性疾患が、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；乾癬、リウマチ様関節炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、自己免疫性溶血性貧血、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー；巨細胞動脈炎；ＧＮ、糸球体腎炎；若年性特発性関節炎、リウマチ性多発性筋痛；ＳＡＰＨＯ、滑膜炎、座瘡、膿疱症、骨増殖症、骨炎、全身性エリテマトーデス；血栓性／特発性血小板減少性紫斑病、シェーグレン病、クローン病、多発性筋炎／皮膚筋炎、ヴェグナー肉芽腫症、ヴェグナー血管炎（Ｗｅｇｅｎｅｒ’ｓ ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ）、乾癬、ベーチェット病、多発動脈炎、高安動脈炎、移植片対宿主病、多発動脈炎、サルコイドーシス、成人発症スチル病、化膿性汗腺炎（Ｈｙｄｒａｄｅｎｉｔｉｓ ｓｕｐｐｒａｔｉｖａ）、クリオグロブリン血症性血管炎（Ｃｒｙｏｇｌｏｂｕｌｉｎａｅｍｉｃ ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ）、壊疽性膿皮症、川崎病、再発性多発性軟骨炎、抗リン脂質抗体症候群、クリオグロブリン血症性血管炎、化膿性汗腺炎、特発性膜性、再発性多発性軟骨炎、セリアック病、慢性Ｃ型肝炎、重症筋無力症、骨髄異形成症候群、天疱瘡、難治性喘息、グレーブス病、壊疽性膿皮症、結節性紅斑、ＳＡＰＨＯ症候群、多中心性網組織球症、Ｂ型慢性肝炎、アミロイドーシス、およびそれらのあらゆる組合せからなる群から選択される、上記のいずれかで定義した通りの組成物を開示することである。

【0010】

本発明の別の目的は、前記パターン認識受容体（ＰＲＲ）が、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、マンノース受容体、デクチン１およびそれらのあらゆる組合せからなる群から選択される、上記のいずれかで定義した通りの組成物を開示することである。

【0011】

本発明の別の目的は、前記医薬用マッシュルームが、冬虫夏草、舞茸（グリフォラ・フロンドサ（Grifola frondosa））、ターキーテイル（トラメテス・ベルシコロル（Trametes versicolor）、コリオルス・ベルシコロル（Coriolus versicolor））、霊芝（ガノデルマ・ルシダム（Ganoderma lucidum））、チャーガ（Chaga）（イノノタス・オブリクス（Inonotus obliquus））、椎茸（レンティナス・エドデス（Lentinus edodes））、アガリクス（アガリクス・ブラゼイ・ムリル（Agaricus Blazei Murill））、およびそれらのあらゆる組合せからなる群から選択される、上記のいずれかで定義した通りの組成物を開示することである。

【0012】

本発明の別の目的は、前記大麻由来の化合物が、カンナビノイド、テルペン、フェノール化合物およびそれらのあらゆる組合せからなる群から選択される、上記のいずれかで定義した通りの組成物を開示することである。

【0013】

本発明の別の目的は、カンナビノイドが、テトラヒドロカンナビノイド（ｄ９－ＴＨＣ）、テトラヒドロカンナビノイド（ｄ８－ＴＨＣ）、テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ－ｄ９）、テトラヒドロカンナビバリン（ＴＨＣＶ／ＴＨＣ－Ｃ３）、カンナビジオール（ＣＢＤ）、カンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）、カンナビジバリン（ＣＢＤＶ）、カンナビゲロール（ＣＢＧ）、カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）、カンナビノール（ＣＢＮ）、カンナビジオール酸（ＣＢＮＡ）、カンナビクロメン（ＣＢＣ）、カンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）、およびそれらのあらゆる組合せの少なくとも１つである、上記のいずれかで定義した通りの組成物を開示することである。

【0014】

本発明の別の目的は、テルペンが、モノテルペンまたはセスキテルペンである、上記の
いずれかで定義した通りの組成物を開示することである。
本発明の別の目的は、フェノール化合物が、Ｏ－グリコシド型のカンナフラビン（Cannaflavin）Ａ、カンナフラビンＢ、カンナビシン（Canabisin）Ｄ、およびそれらのあらゆる組合せの少なくとも１つである、上記のいずれかで定義した通りの組成物を開示することである。

【0015】

本発明の別の目的は、前記組成物が、吸入器、シガレット、錠剤、カプセル剤、丸剤、凍結乾燥剤、粉剤、乳剤、顆粒剤、クリーム剤、軟膏剤、ペースト剤、ローションゲル、液剤、溶液剤、パッチおよびそれらのあらゆる組合せからなる群から選択される方式で投与可能なように構成される、上記のいずれかで定義した通りの組成物を開示することである。

【0016】

本発明の別の目的は、前記組成物が、即時放出、遅延放出、持続放出、制御放出およびそれらのあらゆる組合せからなる群から選択される方式で投与可能なように構成される、上記のいずれかで定義した通りの組成物を開示することである。

【0017】

本発明の別の目的は、前記組成物が、可溶化剤、安定剤、緩衝液、張度調節物質、増量剤、粘度増強剤／低下剤、界面活性剤、キレート剤、アジュバントおよびそれらのあらゆる組合せからなる群から選択される成分をさらに含む、上記のいずれかで定義した通りの組成物を開示することである。

【0018】

本発明の１つの目的は、免疫介在性炎症性疾患またはがんを処置する方法およびそれらのあらゆる組合せであって、
ａ．組成物を提供する工程であって、前記組成物は、ａ．大麻由来の化合物およびｂ．医薬用マッシュルームの相乗的な組合せを含む、工程；および
ｂ．前記組成物を哺乳類対象に投与する工程
を含む、上記方法を開示することである。

【0019】

本発明の１つの目的は、免疫介在性炎症性疾患またはがんを処置する方法およびそれらのあらゆる組合せであって、
ａ．ＣＢ１またはＣＢＤ受容体にアゴニスト作用を有する大麻由来の化合物およびそれらのあらゆる組合せ、ならびにパターン認識受容体（ＰＲＲ）にアゴニスト作用を有する医薬用マッシュルームを含む組成物を提供する工程；および
ｂ．前記組成物を哺乳類対象に投与する工程
を含み、
前記大麻由来の化合物は、治療的に抗炎症性であり、前記医薬用マッシュルームは、前記哺乳類対象において免疫刺激性である、上記方法を開示することである。

【0020】

本発明の１つの目的は、哺乳類対象において免疫介在性炎症性疾患またはがんを処置するのに有用な組成物およびそれらのあらゆる組合せであって、前記組成物は、
ａ．パターン認識受容体（ＰＲＲ）にアゴニスト作用を有する少なくとも１つの医薬用マッシュルーム；および
ｂ．少なくとも第２の医薬用マッシュルーム
を含む、上記組成物を開示することである。

【0021】

本発明の別の目的は、前記免疫介在性炎症性疾患を処置するのに有用な組成物が、冬虫夏草Ｍマッシュルーム（Cordyceps M mushroom）抽出物およびＴＨＣを含む、上記のいずれかで定義した通りの組成物を開示することである。

【0022】

本発明の別の目的は、前記免疫介在性炎症性疾患を処置することが、酸化窒素分泌の阻
害を含む、上記のいずれかで定義した通りの組成物を開示することである。
本発明の別の目的は、前記免疫介在性炎症性疾患を処置するのに有用な組成物が、霊芝マッシュルーム抽出物およびＴＨＣを含む、上記のいずれかで定義した通りの組成物を開示することである。

【0023】

本発明の別の目的は、前記免疫介在性炎症性疾患を処置することが、ＩＬ－６分泌を減少させることからなる、上記のいずれかで定義した通りの組成物を開示することである。
本発明の別の目的は、前記免疫介在性炎症性疾患を処置するのに有用な組成物が、冬虫夏草Ｃｓ－４マッシュルーム抽出物ＴＨＣを含む、上記のいずれかで定義した通りの組成物を開示することである。

【0024】

本発明の別の目的は、前記免疫介在性炎症性疾患を処置することが、ＴＮＦα分泌を減少させることからなる、上記のいずれかで定義した通りの組成物を開示することである。
本発明の別の目的は、前記免疫介在性がんを処置することが、ＣＢＤ、ならびに冬虫夏草（Ｍ）マッシュルーム抽出物および霊芝マッシュルーム抽出物からなる群から選択されるマッシュルーム抽出物を含む組成物によって提供される、上記のいずれかで定義した通りの組成物を開示することである。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】酸化窒素の標準参照曲線のためのプレート構成を示す。

【図2A】冬虫夏草Ｃｓ－４（Ａ）およびアガリクス・ブラゼイ（Agaricus Blazei）（Ｂ）を、５０００個のＰＡＮＣ－１細胞と共に２時間、６時間、２４時間、および７２時間インキュベートした。ＸＴＴ試薬キットを使用して生存率を測定した。

【図2B】図２Ａの説明と同じ。

【図3A】冬虫夏草Ｃｓ－４（Ａ）、冬虫夏草Ｍ（Ｂ）、霊芝（Ｃ）、およびアガリクス・ブラゼイ（Agaricus Balzei）（Ｄ）、ターキーテイルＲＭ（Ｅ）、椎茸（Ｆ）、ターキーテイルＭＳ（Ｇ）、チャーガ（Ｈ）、および舞茸（Ｉ）を、１０^５個のＲＡＷ細胞と共に２４時間インキュベートした。上清中の分泌は、グリース（Greiss）試薬キットを使用して測定されなかった。

【図3B】図３Ａの説明と同じ。

【図3C】図３Ａの説明と同じ。

【図3D】図３Ａの説明と同じ。

【図3E】図３Ａの説明と同じ。

【図3F】図３Ａの説明と同じ。

【図3G】図３Ａの説明と同じ。

【図3H】図３Ａの説明と同じ。

【図3I】図３Ａの説明と同じ。

【図4A】冬虫夏草Ｃｓ－４（Ａ）、冬虫夏草Ｍ（Ｂ）、霊芝（Ｃ）、およびアガリクス・ブラゼイ（Ｄ）を、１０^５個のＲＡＷ細胞と共に、ＣＢＤまたはＴＨＣ有りおよび無しで、２４時間インキュベートした。上清中のＩＬ－６およびＴＮＦａを、マルチプレックス（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）によって測定した。

【図4B】図４Ａの説明と同じ。

【図5A】ＣＢＤ（Ａ）およびＴＨＣ（Ｂ）を、１０^５個のＲＡＷ細胞と共に２４時間インキュベートした。上清中の分泌は、グリース試薬キットを使用して測定されなかった。

【図5B】図５Ａの説明と同じ。

【図6A】霊芝（Ａ＋Ｂ）、アガリクス・ブラゼイ（Ｃ＋Ｄ）、冬虫夏草Ｃｓ－４（Ｅ＋Ｆ）、および冬虫夏草Ｍ（Ｇ＋Ｈ）を、１０^５個のＲＡＷ細胞と共に、ＤＭＳＯ、ＣＢＤまたはＴＨＣと２４時間合わせた。上清中の分泌は、グリース試薬キットを使用して測定されなかった。

【図6B】図６Ａの説明と同じ。

【図6C】図６Ａの説明と同じ。

【図6D】図６Ａの説明と同じ。

【図6E】図６Ａの説明と同じ。

【図6F】図６Ａの説明と同じ。

【図6G】図６Ａの説明と同じ。

【図6H】図６Ａの説明と同じ。

【図7A】霊芝、冬虫夏草Ｍ、アガリクス・ブラゼイ、冬虫夏草Ｃｓ－４、ターキーテイル（ＭＳ）（Ａ）、チャーガ、舞茸、ターキーテイル（ＲＭ）および椎茸（Ｂ）を、７５００個のＰＡＮＣ－１細胞と共に７２時間インキュベートした。生存率を、ＸＴＴ試薬キットを使用して測定した。

【図7B】図７Ａの説明と同じ。

【図8A】霊芝、冬虫夏草Ｍ、アガリクス・ブラゼイ、冬虫夏草Ｃｓ－４、ターキーテイル（ＭＳ）（Ａ）、チャーガ、舞茸、ターキーテイル（ＲＭ）および椎茸（Ｂ）を、５０００個のＥＧＬ－１細胞と共に７２時間インキュベートした。生存率を、ＸＴＴ試薬キットを使用して測定した。

【図8B】図８Ａの説明と同じ。

【図9A】ＣＢＤおよびＴＨＣを、７５００個のＰＡＮＣ－１（Ａ）および５０００個のＥＧＬ－１（Ｂ）細胞と共に７２時間インキュベートした。生存率を、ＸＴＴ試薬キットを使用して測定した。

【図9B】図９Ａの説明と同じ。

【図10A】霊芝（Ａ）、冬虫夏草Ｍ（Ｂ）、冬虫夏草Ｃｓ－４（Ｃ）、およびターキーテイル（Ｄ）を、５０００個のＰＡＮＣ－１細胞と共に、ＤＭＳＯ、ＣＢＤまたはＴＨＣと７２時間合わせた。生存率を、ＸＴＴ試薬キットを使用して測定した。

【図10B】図１０Ａの説明と同じ。

【図10C】図１０Ａの説明と同じ。

【図10D】図１０Ａの説明と同じ。

【発明を実施するための形態】

【0026】

好ましい実施態様の詳細な説明
以下の説明は、本発明の全ての章にわたり、全ての当業者が前記発明を利用できるように提供され、この発明を実行する本発明者によって予期される最良の形態を記載する。しかしながら、本発明の全体的な原理は、これらの医学的状態の防止および処置のためのカンナビノイドおよび医療用マッシュルームの相互作用および固定した用量の組合せによって、がん、炎症または免疫介在性炎症性疾患および医学的状態の新規の処置のための手段および方法を提供するように具体的に定義されているため、様々な改変は、当業者にとって明白なままであるように適合される。

【0027】

本発明は、カンナビノイドを治療用マッシュルームと相乗的に組み合わせた組成物によって、がん、炎症または免疫介在性炎症性疾患を処置するための手段および方法を開示する。

【0028】

本発明は、抗炎症性作用と免疫刺激性作用との組み合わされた作用を発揮し、それによって免疫介在性プロセスを抑制したりまたは減少させたりすることなく抗炎症または抗がん薬として作用する組成物を開示する。さらに、本発明によって開示された組成物は天然産物由来であり、それゆえに、がん、炎症または免疫介在性炎症性疾患の発生および発症を抑制するための、より有効でより安全な薬剤の開発において重要な役割を果たし得る。

【0029】

具体的には、本発明は、カンナビノイドと治療用マッシュルームとの相乗的な組合せを開示する。カンナビノイド（ＣＢＤ、ＴＨＣなど）は、抗がん活性を有することがわかっ
ている有力な抗炎症剤であり、これはまた免疫介在性プロセスを弱めたり、抑制したり、または減少させたりもする。免疫介在性プロセスを減少させることは、免疫刺激および抗炎症性作用が必要なプロセス（例えばがん）に負の影響を及ぼす可能性がある。

【0030】

治療用マッシュルームは、主としてＴＨ１、ＮＫおよびマクロファージの極性化に影響を及ぼす免疫促進物質として公知である。これらの特性は、一部の免疫炎症プロセスにおいて、それらの公知の主張されている抗がんおよび調節作用に起因する可能性がある。

【0031】

医薬用マッシュルームによる免疫促進は、一般的に自然免疫を介して起こり、典型的には食細胞によって媒介される。これらの細胞は、侵入する病原体を摂取するか、または病原体の成分と相互作用し、いずれのケースにおいてもサイトカインおよびケモカインの分泌を介して自然免疫と適応免疫をさらに刺激する。細胞表面上のパターン認識受容体（ＰＲＲ）、例えばＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、マンノース受容体およびデクチン１は、微生物において保存された分子パターンを認識することによって応答を開始させる。マッシュルーム由来の免疫調節物質への関心がますます高まっている。例えばレンチナンは、日本でがんを有する患者の処置に広く使用されている。

【0032】

主として担子菌属由来（一部は由来の子嚢菌類由来）の真菌性生物活性多糖および医薬用マッシュルームが周知であり、はるか遠くのアジアで従来の食物や薬の一部として広く使用されており、この１０年間、その医薬特性の理解と天然に生産された医薬品における利用のために懸命な調査の中心であり続けている。実際に、これらのバイオポリマー（主としてｂ－グルカンまたはヘテロ多糖）の一部は、すでに抗腫瘍薬、免疫促進薬または予防薬物として市販されている。これらのバイオポリマーの多くは食用マッシュルームによって生産されるという事実がさらに、これらのバイオポリマーは、それらの免疫調節、抗がん、抗微生物性、コレステロール低下、血糖低下および健康促進特性を利用するための、いかなる重篤な安全性の懸念もない新規の機能性食品および栄養補助食品の配合のための非常に優れた候補となっている。

【0033】

カンナビノイドを治療用マッシュルームと組み合わせることにより、免疫介在性炎症性疾患（ＩＭＩＤ）および医学的状態ならびにがんなどの臨床症状に固有で有力な作用を有する新規の一連の組成が明らかになる。

【0034】

治療用マッシュルームはまた、組み合わされて、免疫介在性炎症性疾患（ＩＭＩＤ）および医学的状態ならびにがんなどの臨床症状への治療作用を有する組成を明らかにする。
免疫介在性炎症性疾患（ＩＭＩＤ）という用語は、本明細書の以下で使用される場合、表面上関連しないようであるが共通の炎症性経路を有する状態の群を集合的に述べるために使用される概念である。

【0035】

免疫介在性炎症性疾患（ＩＭＩＤ）としては、これらに限定されないが、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；乾癬、リウマチ様関節炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、自己免疫性溶血性貧血、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー；巨細胞動脈炎；ＧＮ、糸球体腎炎；若年性特発性関節炎、リウマチ性多発性筋痛；ＳＡＰＨＯ、滑膜炎、座瘡、膿疱症、骨増殖症、骨炎、全身性エリテマトーデス；血栓性／特発性血小板減少性紫斑病、シェーグレン病、クローン病、多発性筋炎／皮膚筋炎、ヴェグナー肉芽腫症、ヴェグナー血管炎、乾癬、ベーチェット病、多発動脈炎、高安動脈炎、移植片対宿主病、多発動脈炎、サルコイドーシス、成人発症スチル病、化膿性汗腺炎、クリオグロブリン血症性血管炎、壊疽性膿皮症、川崎病、再発性多発性軟骨炎、抗リン脂質抗体症候群、クリオグロブリン血症性血管炎、化膿性汗腺炎、特発性膜性、再発性多発性軟骨炎、セリアック病、慢性Ｃ型肝炎、重症筋無力症、骨髄異形成症候群、天疱瘡、難治性喘息、グレーブス病、壊疽性膿皮症、結節性紅斑、ＳＡＰＨＯ症候群、多中心性網組織球症、
Ｂ型慢性肝炎、アミロイドーシス、およびそれらのあらゆる組合せが挙げられる。

【0036】

用語「大麻由来の化合物」は、本明細書の以下で使用される場合、以降、カンナビノイド、テルペンおよびフェノール化合物を含む大麻植物に見出される化合物を指す。用語「カンナビノイド」は、本明細書の以下で使用される場合、以降、脳中の神経伝達物質放出を変更する細胞においてカンナビノイド受容体のリガンドである多様な化学物質のクラスを指す。カンナビノイドは、主として、カンナビス・サティバ（Cannabis sativa）植物
からのマリファナ（大麻の花）およびハシシュ（圧縮大麻樹脂）で発見された。この植物は、８０種を超える植物性カンナビノイドを含有する。マリファナの主要な活性成分は、精神賦活性のΔ９－テトラヒドロカンナビノール（Δ９－ＴＨＣ）であり、これは、部分アゴニストとしてカンナビノイド１（ＣＢ１）およびカンナビノイド２（ＣＢ２）受容体で作用する。マリファナ中に存在する他の重要な天然カンナビノイドは、非精神賦活性のカンナビジオール（ＣＢＤ）、Δ９－テトラヒドロカンナビバリン（Δ９－ＴＨＣＶ）およびカンナビクロメン（ＣＢＣ）［１－３］である。それらのなかでもＣＢＤが、これまで最大の関心が寄せられている。これは、ＣＢ１／ＣＢ２受容体アゴニストの作用に拮抗してΔ９－ＴＨＣの向精神性および他の負の作用を中和することが示されており、これはＣＢ１およびＣＢ２受容体のインバースアゴニストとしての挙動を示すことを数々のデータが示唆している。これらの植物由来カンナビノイドの一部は、医療行為で使用され、例えばΔ９－ＴＨＣ（ドロナビノール）およびその合成アナログ、化学療法によって誘発された吐き気や嘔吐に対するナビロンであり、また食欲刺激薬としても使用される（例えばＡＩＤＳ患者において）。Δ９－ＴＨＣと組み合わされたＣＢＤ（ナビキシモルス）は、多発性硬化症における神経因性疼痛および痙直を緩和するために使用され、さらに、進行がんの疼痛における補助的な鎮痛処置として使用されている。

【0037】

用語「テルペン」は、本明細書の以下で使用される場合、様々な植物によって生産される有機化合物の大きい多様なクラスを指す。テルペンは、分子式Ｃ_５Ｈ_８を有するイソプレン単位から生合成的に誘導される。テルペンの基礎の分子式は、それが多重化したもの、すなわち（Ｃ_５Ｈ_８）ｎであり、式中、ｎは、連結されたイソプレン単位の数である。テルペンは、大麻にその芳香の多様性を付与する芳香性の油である。

【0038】

カンナビジオール（ＣＢＤ）という用語は、本明細書の以下で使用される場合、様々な障害のための処置として近年ますます注目を集めている薬理学的に広範な薬物であるカンナビス・サティバ成分を指す。

【0039】

大麻由来化合物は、
カンナビノイド類：テトラヒドロカンナビノイド（ｄ９－ＴＨＣ）、テトラヒドロカンナビノイド（ｄ８－ＴＨＣ）、テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ－ｄ９）、テトラヒドロカンナビバリン（ＴＨＣＶ／ＴＨＣ－Ｃ３）、カンナビジオール（ＣＢＤ）、カンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）、カンナビジバリン（ＣＢＤＶ）、カンナビゲロール（ＣＢＧ）、カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）、カンナビノール（ＣＢＮ）、カンナビジオール酸（ＣＢＮＡ）、カンナビクロメン（ＣＢＣ）、カンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）；
テルペン類：モノテルペンおよびセスキテルペン；ならびに
フェノール化合物：Ｏ－グリコシド型のカンナフラビンＡ、カンナフラビンＢ、カンナビシンＤ
を含む。

【0040】

用語「約」は、本明細書で使用される場合、既定の量または測定値または値の±２５％を意味する。
用語「治療用マッシュルーム」または「医薬用マッシュルーム」は、本明細書で使用される場合、これらに限定されないが、冬虫夏草、舞茸（グリフォラ・フロンドサ）、ター
キーテイル（トラメテス・ベルシコロル、コリオルス・ベルシコロル）、チャーガ（イノノタス・オブリクス）、霊芝（ガノデルマ・ルシダム）、椎茸（レンティナス・エドデス）、アガリクス・ブラゼイ・ムリルおよびそれらのあらゆる組合せから選択されるマッシュルームを含む。

【0041】

冬虫夏草
背景：冬虫夏草は、ヒポクレア目のバッカクキン科属のなかでも最も多様な属である。すでに報告された４００をこえる種のなかでも、最も多く記録されている種は、コルディセプス・シネンシス（Cordyceps sinensis）である。

【0042】

コルディセプス・シネンシス（C.sinensis）は、中国の医療に用いられる医薬用マッシュルームである。これは、３６００ｍを超えるヒマラヤの山頂で天然に見出される。加えて、Ｃ．シネンシスは、商業的な成長のために、培養された菌糸体の抽出物から生産することができる。Ｃ．シネンシスは、中国薬局方では１９６４年から薬物として分類されている。

【0043】

従来の薬における使用：従来の東洋医学において、Ｃ．シネンシスは、疲労、食欲不振、腎臓の機能不全、結核、慢性気管支炎、男性のインポテンス、および性欲減退症（Chen
PXら、2017）、心臓血管、免疫、内分泌腺、および神経系に関する健康状態を処置する
ことに使用されてきた（Zhu JSら、1998）。

【0044】

加えてＣ．シネンシスは、免疫調節、抗がん、抗老化、抗酸化、および抗炎症活性を有することが報告されている（Tuli HSら、2014；Shashidhar MGら、2013；Nie Sら、2013
）。

【0045】

抽出方法：Ｃ．シネンシスの様々な化合物は、水、メタノール、エタノール、トリプシン、ＭｅＯＨおよびＥｔＯＡｃなどの様々な媒体を使用することによって抽出することができる（Chen PXら、2013）。

【0046】

生物学的に活性な化合物
Ｃ．シネンシスの活性化合物としては、これらに限定されないが、以下のグループ：ヌクレオシド（コルディセピンおよびアデノシン）、多糖（Ｃ．シネンシスから単離された水溶性多糖（ＣＰＳ１）、Ｃ．シネンシスから単離された水溶性多糖（ＣＰＳ２）、および培養されたＣ．シネンシスから単離された酸多糖（ＡＰＣ）、ペプチド（シクロジペプチドおよびコルディミン（Cordymin））ならびにステロール（エルゴステロールおよびシトステロール）が挙げられる。

【0047】

前臨床研究：抗酸化剤などのＣ．シネンシス抽出物を多数の指標のための様々な前臨床研究に使用したところ（Vasiljevic JDら、2016；Wang J1ら、2012；Ji, D.-Bら、2009）、移植後動脈硬化の形成が低下し（Zhang,Yら、２０１１）、抗腫瘍性がみられた（Chen,
Yら、2009）。

【0048】

薬理活性－炎症およびがん：多数の研究が、Ｃ．シネンシス（C.sinesis）の活性化合
物は抗炎症性および抗がん特性を有することを示す。主要な薬理活性は、ＴＮＦ－αおよびＩＣＡＭ－１などの炎症促進性サイトカインの弱化、加えてＰＣＮＡ発現の低減（Zhangら、2011）、ＩＬ－２およびＴＧＦ－β分泌の阻害、ならびにＩＬ－４分泌の強化（Jeongら、2002）によって媒介される。またＣＯＸ－２およびＮＦκＢの阻害も示された（Wang J1ら、2012b）。

【0049】

【表1】

【0050】

舞茸（グリフォラ・フロンドサ）
背景：グリフォラ・フロンドサは、暗い灰色がかった茶色の真菌であり、そのほとんどは、死んだ、死にかけた、または熟成した硬材、例えばオーク、ニレ、カエデ、ヌマミズキ、ブナノキ、およびクリなどの木の幹の切り株の根本またはその付近の地面に見出される。Ｇ．フロンドサは、主として日本の北部の領域、欧州諸国およびアメリカの北東の州に分布しており（Global Biodiversity Information Facility、www.gbif.or、2017）、
さらに、亜熱帯地方の温帯気候の高地でも見出される場合がある（S.H. Hanら、1995）。これは、世界中で、舞茸/クモタケ（日本）、グレイツリーフラワー（gray tree flower
）（中国）、シグノリナ（signorina）マッシュルーム（イタリア）および「ヘンオブザ
ウッズ（hen of the woods）」（北アメリカ）などの様々な名称によって周知である。

【0051】

従来の薬での使用：Ｇ．フロンドサは、従来の中国および日本の「薬草研究」において医薬用マッシュルームとして重用されている。これは、脾臓（Chinese Herbalism Editorial Board、Zhonghua Bencao、Shanghai Science and Technology Press、Shanghai、1999、548～549頁）、胃、および肝臓（C. Zhouら、2013）を保護するとして様々な適応症で使用されており、また神経や気持ちを落ち着かせるためにも使用される場合がある（T. Mizuno、1995）。

【0052】

抽出方法：多糖：熱水→３％シュウ酸ＮＨ_４（１００℃）→５％ＮａＯＨ溶液（３０℃）（Mizuno Tら、1995）。グリフラン（Grifulan）（ＧＲＮ）：Ｇ．フロンドサを、２％グルコース、０．６％ポリペプトン、２％ショ糖および０．１％ダイズ油を含有する１００ｍｌの培地中で、ｐＨ４．５、２５℃で１４日間成長させた。菌糸体をろ過によって分離し、５％グルコースを含有する０．５％クエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）中で、２５℃で６日間インキュベートした。６日間のインキュベーションの後、混合物を遠心分離し、上清溶液を１倍量のエタノールで希釈し、沈殿を８Ｍ尿素中に溶解させた。溶液を、ＤＥＡＤＥ－セファデックス（Sephadex）Ａ－２５によってさらに精製して、汚染タンパク質を除去した。非吸着画分を水に対して透析し、エタノールで沈殿させ、続いて真空中で乾燥
させた（Adachi Yoshiyukiら、1994）。

【0053】

生物学的に活性な化合物：Ｇ．フロンドサ抽出物は、多様な活性化合物、例えばグルカン（例えばＮＭＦ－５Ｎ、グリフォラン（Grifolan）ＬＥ、ＧＦＰ２、ＧＦＰＢＷ１）およびヘテロポリマー（例えばＦＩＩ－３、ＦＩＩＩ－１ａ、ＧＦＰ１）を含有する。またＧ．フロンドサはトレハロース豊富な源でもあり（S.J. Huang、S.Yら、2011）、食品保
存剤、甘味料およびワクチン安定剤として広く使用されてきた。

【0054】

調製された様々な舞茸画分のなかでも、Ｄ画分が、経口投与または注射かどうかにかかわらず、免疫系強化のために非常に有望であることが見出された。β－１，６分岐を有する主鎖としてβ－１，３－グルカンで主として構成される多くの抗腫瘍マッシュルーム多糖を除いて、Ｄ画分の多糖部分は、（１→３）分岐（１→６）－β－グルカンである。Ｄ画分のさらなる精製により、ＭＤ画分を得た（He, Xiruiら、2017）。

【0055】

前臨床研究：Ｇ．フロンドサから単離された多糖の生物活性が、多くの前臨床研究で、抗腫瘍活性、皮膚疾患の処置、免疫調節活性および抗酸化活性などの様々な指標に関して報告されている（He, Xiruiら、2017）。

【0056】

薬理活性－炎症およびがん：数々の研究が、多くの抗腫瘍性多糖は、腫瘍細胞に直接作用するというより、宿主が媒介するメカニズムにより作用することを示してきた。Ｇ．フロンドサの多糖は、生体応答調整物質として有害な生物学的ストレスに耐え、腫瘍細胞の発達に対して免疫性を増加させるように宿主を助けるだけでなく、直接的に腫瘍細胞のアポトーシスも誘導する（He, Xiruiら、2017）。別の研究では、舞茸Ｄ画分が、Ｔｈ－０
細胞から変換されたＴｈ－１細胞が優勢の免疫性の発生を誘導し、結果として細胞性免疫を刺激し、抗腫瘍作用を出現させることが示された（Inoue, Atsuyukiら、2002）。多数
の研究が、舞茸は、免疫機能に対して顕著な有益作用を有することを確認した。舞茸は、マクロファージの作用だけでなく、腫瘍細胞を攻撃できる様々な他の免疫関連細胞、例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および細胞傷害性Ｔ細胞（Ｔｃ）の作用も促進する。舞茸はまた、インターロイキン－１、インターロイキン－２、およびリンフォカインを増加させることによってこれらの細胞の免疫関連の効率も増加させる。舞茸画分は、特定には、特異的な抗腫瘍作用を有するようであり、もしかすると結腸、肺、胃、肝臓、前立腺、脳、および他の臓器における腫瘍の成長を遅くする可能性がある。（注目すべきことに、Ｄ画分に対するいずれの調査参考文献は、ＭＤ画分にも適用され、これは、それらがグリフォラ・フロンドサ由来の同じベータ１，６／１，３グルカンであるためである。）（Mayell, Mark、2001）。

【0057】

【表2】

【0058】

ターキーテイル（トラメテス・ベルシコロル、コリオルス・ベルシコロル）
背景：ターキーテイルは、世界中で死んだ丸太上に成長するマッシュルームの一種である。これは、シチメンチョウの尾羽のようなその茶色の環と黄褐色の見た目から、ターキーテイルと名付けられた。その学名は、トラメテス・ベルシコロルまたはコリオルス・ベルシコロルである。

【0059】

ターキーテイルは、従来の東洋医学において長年にわたり肺疾患を処置するために使用されてきた。日本では、ターキーテイルは、標準的ながん処置と共に与えられる場合、免疫系を強化するために使用されてきた。

【0060】

従来の薬での使用：免疫系のブースティング：抽出方法
Ｔ．ベルシコロルから得られた水性抽出物は、異なる免疫細胞への作用の調節および刺激を含む多様な生物学的活性を有し、加えて近年、がん細胞成長の阻害が実証された。Ｔ．ベルシコロルの熱水および標準化したエタノール－水抽出物から得られた様々な生物活性成分のなかでも、タンパク質結合多糖（ＰＳＫ、クレスチンとしても公知）およびポリサッカロペプチド（ＰＳＰ）は、強い生物学的活性を有していた（Habibi, Emranら、2015）。

【0061】

生物学的に活性な化合物：このマッシュルームから得られたポリサッカロペプチドは、免疫調節、抗腫瘍、および肝保護的な活性を有し、がん患者のための免疫調節および抗腫瘍薬として使用されてきた。密接に関連した多糖であるＰＳＫ（クレスチン）は、日本人の研究者によってＣ．ベルシコロルから単離されたものであり、免疫刺激性活性を有する
ことが実証された。

【0062】

多糖Ｋ（ＰＳＫ）は、ターキーテイルマッシュルームにおいて最もよく知られた活性化合物である。日本において、ＰＳＫは、がんを処置するのに使用される承認されたマッシュルーム製品である（Hobbs C.、2004；Jeong, Sang-Chulら、2015）。

【0063】

前臨床研究：ＰＳＫおよびＰＳＰは、インビトロおよびインビボにおける実証された多様な免疫学的作用、特定には、網内系の活性化、サイトカイン調節（ＩＦＮ－γ生産、ＩＬ－２生産）、樹状細胞生存の強化、Ｔ細胞成熟、ナチュラルキラー細胞活性、抗体産生、ならびに抗腫瘍および抗がん作用を有する。抽出物は、がん細胞のアポトーシスを活性化することによって発癌現象および腫瘍細胞成長を阻害することができる（Hobbs C.、2005）。

【0064】

【表3】

【0065】

椎茸（レンティナス・エドデス）
背景：東洋では古代より、椎茸マッシュルーム（レンティナス・エドデス）は、医薬特性を有することが示された屈指の食用マッシュルームであり、今でもそうである。グルカン成分、特に、精製されたｂ－１，６分岐および三重らせん構造を有するｂ－１，３－Ｄ－グルカンであるレンチナンが、著しい抗腫瘍活性を有することが証明された。レンチナンはまた、免疫賦活薬であることも示されており、腫瘍細胞に対して直接的な細胞傷害作用を生じることなくマクロファージおよびＴ細胞の増殖を刺激すると考えられる（Ng, Mah-Lee、2002）。

【0066】

従来の薬での使用：Ｌ．エドデスは、数々の治療用途で使用される周知の大きい菌類（macrofungus）の１つである。これは、薬理学的特性が証明された数々のよく研究された
調製物の源である。Ｌ．エドデスの医薬特性は、明王朝（１３６９～１６４４年）のころから研究されている。日本の帝国時代からの先人は、椎茸を精力と気力を増加させる「生
命の錬金薬（elixir of the life）」としてみなしていた。Ｌ．エドデスの細胞内（子実体および菌糸体）で、さらに細胞外（培養培地）で、抗生物、抗発癌、抗がん、抗真菌、抗菌および抗ウイルス、抗糖尿病、脂質低下化合物が単離されている。これらの物質の一部は、レンチナン、レクチンおよびエリタデニンであった。椎茸マッシュルームは、低下した免疫機能を伴う疾患（ＡＩＤＳなど）、がん、糖尿病、環境アレルギー、真菌感染、頻繁な流感および風邪、気管支の炎症のための医薬として、さらに、失禁症を制御するために使用される（Bisen, P.S.ら、2010）。

【0067】

抽出方法：酢酸エチル－凍結した椎茸マッシュルーム（２０００ｇ）を、８０％メタノール水溶液（３０００ｍＬ）および５０％メタノール水溶液（３０００ｍＬ）で、５℃で抽出した。抽出物を合わせ、室温、減圧下で、メタノールが除去されるまでロータリーエバポレーターで濃縮した。水性抽出物（２００ｍＬ）を酢酸エチルで２回（３００ｍＬ×２）分配した。合わせた酢酸エチル画分を、室温、減圧下で蒸発させ、続いて凍結乾燥機中で乾燥させた。酢酸エチル画分は、凍結重量の２．１２％の椎茸マッシュルームを含むことを示した（Fang, Nianbaiら、2006）。

【0068】

エタノール沈殿および液体窒素中でのフリーズドライ－この方法により単離されたβ－Ｄ－グルカンは、レンチナンであることが見出された。炭水化物分析カラム、クロマトグラフ法を使用して行われた純度試験から、８７．５０％の有意なレンチナン純度が示された（Yap, Ann-Teck、およびMah-Lee Ng、2001）。

【0069】

粉末化した椎茸子実体（Ａ）を、ＥｔＯＥｔおよびＥｔＯＨの１：１混合物を用いて４２℃で８時間抽出した。抽出を３回繰り返した。得られた抽出物を合わせ、Ｎ２ガス下で蒸発させた。抽出可能な物質（脂質）をＢ画分として得た。椎茸粉末の残留物をＥｔＯＥｔおよびＥｔＯＨ混合物で抽出して、Ｃ画分を得た。抽出（脂質）の不溶性残留物を、グルカンの抽出のために、１２０℃で熱水で２時間処置した。残留物をＥ画分として得た。熱水で処理された椎茸粉末（Ａ）をろ過して、可溶性グルカンを排除し、残留物を画分Ｄとして得た（Nanba Hiroakiら、1987）。

【0070】

生物学的に活性な化合物：科学的な調査により、健康促進活性を有するＬ．エドデスから多くの化合物が単離された。Ｌ．エドデスの子実体は、８８～９２％の水、タンパク質、脂質、炭水化物、加えて、ビタミンおよびミネラルを含有する。マッシュルームは、ビタミン、特に、紫外線（ＵＶ）光と熱の下でカルシフェロール（ビタミンＤ２）を生じるプロビタミンＤ２（エルゴステロール）の優れた源である。これはまた、Ｂビタミン、例えばＢ１（チアミン）、Ｂ２（リボフラビン）およびＢ１２（ナイアシン）なども含有する。脂肪酸は、総脂質の３．３８％を占め、相当量のアミノ酸を含む。グリコーゲン様の多糖に加えて、（１－４）－、（１－６）－Ｄ－グルカンおよび抗腫瘍性多糖、レンチナン、（１－３）－、（１－６）結合ヘテログルカン、ヘテロガラクタン、ヘテロマンナン、キシログルカンなどが同定された。遊離の糖のなかでも、トレハロース、グリセロール、マンニトール、アラビトール、マンノース、およびアラビノースが存在する。椎茸マッシュルームにおいて、食物繊維は、水溶性物質、例えばグルカン、ならびに塩、酸、およびアルカリでのみ抽出可能なタンパク質および水不溶性物質、例えば、細胞壁成分として存在するポリウロニド（酸性多糖）、ヘミセルロース、異糖鎖を有する－グルカン、リグニン、およびキチンからなる（Bisen, P.S.ら、2010）。椎茸マッシュルームにおける抗
がん成分の同定に関して、子実体から抗腫瘍性多糖を単離し、レンチナンと名付けた。その構造は、β－（１→３）－グルカン（Ｃ_６Ｈ_１０Ｏ_５）_ｎであることが確認され、平均分子量は５×１０^５ｋＤａであった。レンチナンは、椎茸マッシュルームにおける主要な抗腫瘍活性成分であることが確立された。しかしながら、哺乳動物は、レンチナンを消化するのに必要な酵素、β－１→３－グルカナーゼがなく、精製されたレンチナンは、経口投与される場合、抗腫瘍活性がないことが報告されている（Fang, Nianbaiら、2006）。

【0071】

前臨床研究：経口投与される椎茸マッシュルーム子実体は、一部の腫瘍のタイプに対して抗癌作用を有すること、およびこれらの作用は株特異的と考えられることが報告された。椎茸マッシュルームを含有する食物は、雌ＩＣＲマウスにおける肉腫－１８０細胞およびＣ３ＨマウスにおけるＭＭ－４６癌腫の成長を有意に低減させたが、他の腫瘍のタイプ、例えばＢ－１６黒色腫、ルイス肺癌、またはｍｅｔｈ－Ａ線維肉腫の成長に対してはほとんど作用がなかった。さらに、椎茸食物の抗がん作用は、マクロファージの活性化ならびにＮＫおよびキラーＴ細胞の両方の細胞傷害作用の増加を伴うことが見出されたことから、この腫瘍阻害活性の１つの可能性のあるメカニズムは免疫監視のブースティングに関与することが示唆される（Fang, Nianbaiら、2006）。

【0072】

薬理活性－炎症およびがん：椎茸マッシュルーム（レンティナス・エドデス）は、抗ウイルス、抗生物、抗炎症性、抗高血圧、および抗がん特性を有するとして記載されており、東洋では何千年もの間、つい最近では西洋でも、健康食品として人気であり続けている（Fang, Nianbaiら、2006）。

【0073】

レンティナス・エドデスは、その免疫調節作用のために、多くの注目を集めてきた。レンチナンは、一種の生体応答調整物質（ＢＲＭ）として周知である。レンチナンの投与後、腫瘍抗原に対するＮＫ（ナチュラルキラー）、ＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）、ＬＡＫ（リンフォカイン活性化キラー）活性およびＤＴＨ（遅延型過敏症）応答の増大が観察された。これらの活性は、レンチナンの抗腫瘍作用に関与する（Bisen, P.S.ら、2010）
。

【0074】

【表4】

【0075】

霊芝（ガノデルマ・ルシダム）
背景：霊芝は、担子菌であり、サルノコシカケ科属に属する菌褶のない真菌である。自然界では、霊芝は、高湿度で薄暗い木々が密集した山で成長する。霊芝は、主として死んだプラム、コナラ（guercus serrata）またはパソニア（pasonia）の木の乾燥した幹の上で繁茂するため、めったにみつからない。このような老木１０，０００本のうち、霊芝が成長しているのはおそらく２または３本であると予想され、それゆえに実際のところ極めて稀である。健康食品産業における霊芝のステータスは、比類ないものである。これは、５，０００年にわたり東洋および西洋の知識と知恵を集結させたものである。健康食品としての、さらに高度に有力な薬としてのその有効性は、全てにおいて３０年にわたる現代の科学的な調査によって実証されてきた。霊芝は、全く副作用がないと安全に主張することができる。

【0076】

ガノデルマ・ルシダムは、その免疫系における支持作用のために、アジアの医師や自然療法医により広く使用され、推奨されている天然の薬である。実験調査と少数の前臨床治験が、Ｇ．ルシダムが有望な抗がんおよび免疫調節特性を有することを示唆している。Ｇ．ルシダムを代替薬として摂取する流行が、がん患者において増加しつつある（Jin, Xingzhongら、2012）。

【0077】

従来の薬での使用：ガノデルマ・ルシダムは、中国、韓国、および日本では何世紀にも
わたり治療薬として使用されてきた。この食用マッシュルームは、人間の生命力を保存し、寿命を長くするとみなされていた。加えて、ガノデルマ・ルシダムは、様々なヒト疾患、例えばアレルギー、関節炎、気管支炎、胃潰瘍、高血糖症、高血圧、慢性肝炎、肝障害、不眠、腎炎、神経衰弱、強皮症、炎症、およびがんを処置するために使用されてきた（Daniel Sliva、2003）。

【0078】

抽出方法：ガノデルマ・ルシダムのチップ化した子実体（１ｋｇ）を、エタノール（９５％、１ｌ）で室温で２４時間抽出して、３５ｇの固体抽出物を得た。エタノール抽出物をクロロホルムに懸濁し、飽和ＮａＨＣＯ_３溶液で抽出した。次いでＮａＨＣＯ_３相を収集し、冷たいＨＣｌ溶液（６Ｎ）でｐＨ３に調整した。得られた沈殿をクロロホルムによって抽出し、１０．９ｇのエタノール可溶性および酸性の成分（ＥＳＡＣ）を黄色の固体として得た（Hu, Hongboら、2002）
ＲｅｉｓｈｉＭａｘ ＧＬｐ（商標）の活性な活性成分は、最大レベルの抽出可能な活性である１３．５％多糖（β－１，３－グルカン）および６％トリテルペン（ガノデリン酸など）として標準化され、それに対して残りの８０％は、製造元の技術報告によればヌクレオシド、脂肪酸、およびアミノ酸で構成されていた。粉末化した抽出物を９５％エタノールと共に３０分間音波処理し、上清を、無水エタノールを使用した連続した音波処理によってさらに抽出した。水不溶性の茶色の粉末、すなわちＧＬＥを、ろ液から減圧下で回収した（０．４５μｍのポリプロピレンフィルターを介して）（Yuen, John WMら、2007）。

【0079】

南中国から収集されたＧ．ルシダムの子実体を洗浄し、崩壊させ、上述したように７０℃で３時間、熱水で２回抽出した。３４種の全ての熱水抽出物をプールし、ＰＳ濃縮画分を、７５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）１６０ＧＡＯ ＥＴ ＡＬ．エタノールの添加によって沈殿させた。ＰＳ濃縮画分を、セファデックスＧ－２５が充填された１．６～１００ｃｍのカラムを使用した高性能陰イオン交換およびゲルろ過クロマトグラフィーによってさらに精製した（Gao, Yihuaiら、2005）。

【0080】

生物学的に活性な化合物：霊芝の有効性は、免疫系の刺激に関与する多糖画分、または様々ながんに対する細胞傷害性活性を実証するトリテルペンのいずれかに起因するものであった（Suarez-Arroyo, Ivette J.ら、2013）。

【0081】

生物学的に活性な多糖は、主としてβ－Ｄ－グルカンの形態であり、ガノデルマ・ルシダム由来の抗腫瘍活性は、主として分岐（１→３）－β－Ｄ－グルカンによって示された。

【0082】

主要な生物活性成分：Ｇ．ルシダムおよび関連の種の化学成分に関して３００を超える報告が公開されている。Ｇ．ルシダムの子実体、菌糸体および胞子は、主としてトリテルペノイド（triterpeniod）、ステロール、ステロイド、脂肪酸、タンパク質、ペプチドおよび微量元素などのおよそ４００種の異なる生物活性化合物を含有している（Babu, P. Dinesh、およびR. S. Subhasree、2008）。

【0083】

前臨床研究：ガノデルマ・ルシダムは、医薬用マッシュルームであり、マウスにおいて抗腫瘍活性を有することが報告されている。さらなる研究によれば、Ｇ．ルシダム多糖（ＰＳ）画分が、この抗腫瘍作用に関与することが示唆されている。１２，１３ Ｇ．ルシダムＰＳは、マクロファージ、Ｔリンパ球、およびＮＫ細胞を活性化し、インビトロでヒト免疫細胞を使用して、さらにインビボでマウスにおいて、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－α、インターロイキン（ＩＬ）、およびインターフェロン（ＩＦＮ）などのサイトカインの生産を誘導することができる。

【0084】

薬理活性－炎症およびがん：ガノデルマ・ルシダムは、構成的に活性な転写因子である核内因子カッパＢ（ＮＦ－κＢ）およびＡＰ－１、を阻害し、それがウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子（ｕＰＡ）およびその受容体ｕＰＡＲの発現の阻害を引き起こす。またガノデルマ・ルシダムは、高度に浸潤性の乳がんおよび前立腺がん細胞の細胞接着および細胞移動も抑制したことから、腫瘍の侵襲を低減するその効力が示唆される。したがって、ガノデルマ・ルシダムは明らかに、がん細胞を用いた実験で抗がん活性を実証したことから、乳がんおよび前立腺がんの代替療法のための栄養補助サプリメントとして見込みのある治療上の可能性を有する（Daniel Sliva、2003）。霊芝で処置した腫瘍は、Ｅ－カドヘリン、ｍＴＯＲ、ｅＩＦ４Ｇ、およびｐ７０Ｓ６Ｋの発現、ならびに細胞外調節キナーゼ（ＥＲＫ１／２）の活性の低減を示した。霊芝は、翻訳に作用する生存および増殖シグナル経路に影響を与えることによってタンパク質合成および腫瘍増殖を抑制することから、霊芝が、乳がんや他のがんのための見込みのある天然治療剤であることが示唆される（Suarez-Arroyo、Ivette J.ら、2013）。

【0085】

ガノデルマ・ルシダム由来の多糖の活性は、β－グルカン多糖と結合する補体受容体３型（ＣＲ３受容体）を介して媒介されることが示唆された。マッシュルーム由来の多糖は、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびマクロファージ依存性免疫系応答の刺激による宿主生物の免疫応答の活性化を介して間接的に腫瘍形成および腫瘍転移を防止することが実証された。ガノデルマ・ルシダムの新鮮な子実体から単離された多糖（ＰＳ－Ｇ）は、ヒト単球－マクロファージからのインターロイキン（ＩＬ）－１β、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－α、およびＩＬ－６の生産、ならびにＴリンパ球からのインターフェロン（ＩＦＮ）－γの生産を刺激した。さらに、これらのＰＳ－Ｇによって誘導されたサイトカインは、ヒト白血病細胞の増殖およびクローン形成能を抑制した。またＰＳ－Ｇは、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）３－キナーゼ／Ａｋｔ経路の活性化を介して自発的なＦａｓ媒介アポトーシスを阻害することによって、免疫応答も強化し、ヒト好中球から抗腫瘍作用を惹起した。加えて、ＰＳ－Ｇは、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）およびプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）経路を介して好中球の食細胞作用を強化した。またガノデルマ・ルシダム由来の多糖は、化学的予防作用も実証し、これは、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）活性の誘導によって媒介された（Daniel Sliva、2003）。

【0086】

加えて、１００種を超える高度に酸素処理された薬理学的に活性なラノスタン型トリテルペンが、ガノデルマ・ルシダムから単離された。

【0087】

【表5】

【0088】

アガリクス・ブラゼイ・ムリル
背景：医薬用マッシュルームであるブラジルの多雨林からのアガリクス・ブラゼイ・ムリルは、感染、アレルギー、およびがんなどの様々な疾患の防止のために、従来の薬で、さらには健康食品として使用されてきた。他の科学者および本発明者らは、このような仮定を裏付ける科学的な証拠があるかどうかを調査した。アガリクス・ブラゼイＭは、免疫調節性の多糖であるβ－グルカンが防府であり、炎症性腸疾患患者における抗炎症性作用に加えて、マウスモデルにおいて抗腫瘍、抗感染、および抗アレルギー性／喘息性の特性を有することが示されている。これらの作用は、自然免疫細胞、例えば単球、ＮＫ細胞、および樹状細胞のマッシュルームでの刺激、ならびにゆがんだＴｈ１／Ｔｈ２バランスおよび炎症の改善を介して媒介される（Hetland, Geirら、2011）。

【0089】

従来の薬での使用
アガリクス・ブラゼイは、日本で広く食べられており処方される医学上重要なマッシュルームである。

【0090】

アガリクス・ブラゼイは、従来、がん、糖尿病、高脂血症、動脈硬化症および慢性肝炎の防止のための健康食品として使用されてきた。
言い伝えによると、この地域の年配の人々は、隣接する社会地域の人々より重篤な疾患に罹りにくく、これは恐らく食物としてアガリクス・ブラゼイを使用していることに起因すると推測される。がんや慢性肝炎の他にも、このマッシュルームは、糖尿病、動脈硬化症および高脂血症などの様々な疾患に対する民間療法で使用されてきた（Hetland, Geir
ら、2008）。

【0091】

抽出方法：熱水、冷たいＮａＯＨ、次いで熱いＮａＯＨでの繰り返しの抽出（Ohno, Naohitoら、2001）。高温水溶性画分の抽出。菌糸体画分（１００ｇ）を、熱水（５００ｍ
ｌ）で３時間、３回抽出した。懸濁液をろ過して、不溶性物質を除去した。減圧下で水性抽出物を蒸発させた後、等しい体積のエタノールを抽出物に添加し、沈殿した多糖を、８，０００ｒｐｍで２０分の遠心分離によって収集した。粗製多糖を水中に溶解させ、蒸留
水に対して透析した。等しい体積のエタノールを再度透析物に添加し、懸濁液を１０，０００ｒｐｍで２０分遠心分離した。得られた多糖画分を溶解させ、凍結乾燥した。これを以降、高温水溶性（hot water-soluble）（ＨＷＳ）画分と称する。

【0092】

ＨＷＳ画分からの抗腫瘍性多糖の単離：ＨＷＳ画分（１００ｍｇ）を１００ｍｌの水中に溶解させた。この溶液を、塩析のために１００％飽和（ＮＨ４）２ＳＯ４に添加し、次いで１２０×ｇで１５分遠心分離した。上清（ＦＡ）および沈殿（ＦＢ）を、セルロースチューブを介して蒸留水に対して透析した。この透析物を蒸発させて少量にし、次いで凍結乾燥した。ＦＡ（５ｍｇ）の水溶液を、０．５Ｍおよび１ＭのＮａＣｌを含有する蒸留水、次いで０．１ＮのＮａＯＨのそれぞれ２０００ｍｌの段階的な溶出を用いたＤＥＡＥ－セファロース（Sepharose）ＣＬ－６Ｂカラム（５．２×３８ｃｍ）でのイオン交換ク
ロマトグラフィーに供した。同じカラムで、蒸留水中の０～２ＭのＮａＣｌの勾配溶出を用いて第２のイオン交換クロマトグラフィーを実行した。活性な画分を、溶離剤として蒸留水を使用したセファロース４Ｂカラム（１．６×９０ｃｍ）でさらに分離した（Mizuno, Masashiら、1999）。

【0093】

Ａ．ブラゼイ（１ｋｇ）の乾燥させた菌本体を、クロロホルム／メタノール（１：１、ｖ／ｖ）（２Ｌ ３ ３）で、還流下で３時間、直接抽出した。クロロホルム／メタノール抽出物を減圧下で濃縮して、茶色の抽出物（２５０ｇ）を得た。クロロホルム／メタノール抽出物（２００ｇ）を、アセトン可溶性（１６０ｇ）および不溶性（４０ｇ）画分に分割した。アセトン可溶性画分（３５ｇ）をさらに、ｎ－ヘキサン不溶性（１６ｇ）および可溶性（１４ｇ）画分に分割した。ｎ－ヘキサン不溶性画分（１５ｇ）をシリカゲルカラムでのクロマトグラフィーにかけ、エルゴステロール（２．４ｇ）を活性物質として単離した（Takaku Takeshiら、2001）。

【0094】

崩壊させ乾燥させた子実体（３ｋｇ）を、還流下で、７０～８０℃で２２時間、８０％エタノールで抽出した。遠心分離および不溶性画分の除去の後、可溶性画分（約２００ｇ）をフリーズドライし、画分１と指定した。次いで不溶性物質（約２．５ｋｇ）を、還流下で、８０～９０℃の水で２２時間抽出し、水溶性画分（約２５０ｇ）を画分２と指定した。水不溶性残留物（約２ｋｇ）を、還流下で１２時間加熱することによって、５％シュウ酸アンモニウムで３回抽出した。約２０リットルの５％シュウ酸アンモニウム可溶性画分を４リットルに濃縮した。２リットルのこの濃縮した画分を、ミリポア（Millipore）
のフィルター（ペリコン（Pericon）ミニカセット）での５ｋＤａの分子量カットオフを
用いた限外ろ過に供し、フリーズドライした。このフリーズドライした画分（最終産物、７１１ｇ）を画分３と指定した。フリーズドライした不溶性残留物（３０９ｇ）を画分４と指定した（Oshiman, Ko-ichiら、2002）。

【0095】

生物学的に活性な化合物
アガリクス・ブラゼイは、ブラジルを起源とし、その子実体に含有される数々の抗腫瘍性多糖の源である。これには、ｂ－（１，６）；ｂ－（１，３）グルカン、酸性ｂ－（１，６）；ａ－（１，３）グルカン、および酸性ｂ－（１，６）；ａ－（１，４）グルカンが含まれる。ほとんどのマッシュルームグルカンと比べると、上記のグルカンは、より高い共通のｂ－（１，３）結合主鎖の代わりに、ｂ－（１，６）グリコピラノースの主鎖を有する。子実体はまた、ａ－（１，４）グルカン主鎖およびｂ－（１，６）グルコピラノシド分岐を４：１の比率で有する３８０，０００Ｄａの抗腫瘍性の水溶性プロテオグルカン、加えて、１つはグルコースとリボースとからなる、グルコース、ガラクトースおよびマンノースを含有する２つの免疫促進性ヘテログルカン、およびキシログルカンも含有する。バイオリアクター中で浸された培養物において、Ａ．ブラゼイはまた、マンノース、グルコース、ガラクトースおよびリボース基と非常に高い分子量（１０００，０００～１００００，０００Ｄａ）を有する、著しい抗腫瘍特性を示す細胞外プロテオグルカンも合
成することができる（Giavasis Ioannis、2010）。

【0096】

前臨床研究：β－グルカンは、公知の抗腫瘍特性を有し、Ａ．ブラゼイの２つの他の成分であるプロテオグリカンおよびエルゴステロールも同様である。Ａ．ブラゼイの明らかな抗腫瘍作用は、β－１，３－グルカンに起因する。加えて、Ａ．ブラゼイから抽出されたβ－１，６－グルカンは、マウスにおいて腫瘍退縮を誘導し、さらに、マウスモデルにおいて、Ａ．ブラゼイ由来β－グルカンの毎日の補充は、卵巣および肺がん細胞の自然転移を低減した。またＡ．ブラゼイから単離されたβ－グルカン－タンパク質複合体は、マウスモデルにおいてＭｅｔｈ Ａ線維肉腫に対して阻害作用を有することも示した（Hetland, Geirら、2008）。

【0097】

薬理活性－炎症およびがん：アガリクス・ブラゼイは、高度に分岐したβ１，３－／１，６－グルカンおよびプロテオグリカンなどの免疫調節物質が豊富である。これらは、自然免疫系の単球、樹状細胞（ＤＣ）、顆粒球、およびＮＫ細胞上のＣＤ１１ｂ／１８（補体受容体３、ＣＲ３）、デクチン－１、およびＴｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）に対する公知のリガンドである。アガリクス・ブラゼイはまた、それぞれ白血病細胞においてアポトーシスを誘導し、腫瘍によって誘導された血管新生を阻害することが見出されているアガリチンおよびエルゴステロール（プロビタミンＤ２）、加えて、糖尿病に対して有用であり得る有力な血糖低下作用を有するイソフラボノイドを含有することも示されている。ＡｂＭは、線維肉腫、骨髄腫、卵巣、肺、および前立腺がんのマウスモデルにおいて、さらに、婦人科系のがん（ＮＫ細胞活性および生活の質の増加）および白血病に対するヒト研究において、抗腫瘍特性を有することが報告されている（Hetland, Geirら、2011）。

【0098】

【表6】

【0099】

チャーガ（イノノタス・オブリクス）
背景：チャーガマッシュルーム（イノノタス・オブリクス）は、担子菌類のタバコウロコタケ科（Hymenochaetaceae）属に属する白色腐朽菌である。チャーガマッシュルームは、ロシア、西シベリア、アジア、および北アメリカにおいてがんを処置するための民間療法で使用されてきた。チャーガマッシュルームは、多くのポリフェノール化合物を含有し、抗細菌性、肝保護的な、および抗腫瘍特性を含む様々な生物学的活性を示すことが示されている（Ham, Seung-Shiら、2009）。

【0100】

従来の薬での使用：チャーガマッシュルームは、ロシアおよび西シベリアにおいて、胃の障害、さらにはがんの予防および処置のための民間療法として使用されてきた。チャー
ガは、その生物活性化合物に基づく、抗細菌性、抗アレルギー性、抗炎症性、および抗酸化性などのヒトの健康のための複数の天然の有益な特性を有すると主張されている（Kang, Ju-Heeら、2015）。これはまた、心臓、肝臓、および胃の疾患、加えて結核を防止および処置するためにも使用されてきた。さらにこれは、従来、ロシア、ポーランド、および多くのバルト諸国において１６世紀から、消化器がん、心臓血管疾患、および糖尿病の処置のために使用されてきた（Kim, Yu Jinら、2011）。

【0101】

抽出方法：イノノタス・オブリクス試料を乾燥させ、粉末化し、－２０℃で貯蔵した。粉末化した試料（５００ｇ）を、４５～５０℃で３時間、３Ｌのメタノール（９９．８％）で２回抽出した。次いでメタノール画分（４５ｇ）をロータリーエバポレーションで蒸発させ、乳化し、水中に溶解させ、酢酸エチル（Ｈ２Ｏ：ＥｔＯＡｃ、５：７、ｖ／ｖ）で３回抽出した。ロータリーエバポレーションの後に酢酸エチル画分（１２ｇ）を得て、乾燥させた抽出物をメタノールに再溶解させた。このストック溶液を、ジクロロメタンと混合したシリカゲル（６０ｇ、２３０～４００メッシュ）を用いて真空クロマトグラフィー（Ｎ－２Ｎ、アイラ（Eyela）、日本、東京）に供した。使用された移動相は、ジクロ
ロメタン中の増加するメタノールの勾配（０～１００％）を用いたジクロロメタンおよびメタノールであり、次の泳動の３分前に１００％ジクロロメタンでカラムを再平衡化した。画分化の成功をＴＬＣによって確認した。３つの酢酸エチル抽出物画分のなかでも、最も生物活性を有する画分、すなわちＶＣＨＧ画分１を選択し、Ｈ２Ｏ：ＭｅＯＨ（１：３０、ｖ／ｖ）と混合したＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ ＲＰ－１８（２５～４０ｍ）を含有する逆相カラム（ＯＤＳ－Ｃ１８）を使用して、３０％メタノールから１００％メタノールの範囲の勾配プログラム（移動相Ａ：メタノール；移動相Ｂ：超純水）で、逆相（ＯＤＳ－Ｃ１８）カラムクロマトグラフィーに供した。４つの画分を単離したところ、そのうちの画分２が、最も高い生物活性を含有していた。画分２をさらに、ジクロロメタンと混合されたシリカゲル（２００ｇ、７０～２３０メッシュ；メルク社（Merck Co.））を含有す
る順相シリカゲルカラム（２．４ｃｍ×１５ｃｍ）を用いて１００％ジクロロメタンから５０％メタノールの範囲の移動相勾配によって溶出させるクロマトグラフィーによって分画した。流速は１．０ｍＬ／分であった。それにより２つの亜画分を得て、これらを亜画分１および２と指定し、両方とも生物活性を示した。亜画分１および２中の化合物を結晶化し、それらのＭＳ（ＪＥＯＬ）、１Ｈ ＮＭＲおよび１３Ｃ ＮＭＲ（ブルカー（Bruker）ＤＲＸ ５００ＭＨｚ）スペクトルを決定することによって分析した（Ham, Seung-Shiら、2009）。

【0102】

Ｉ．オブリクスの菌核（１．３ｋｇ）をメタノール（ＭｅＯＨ）で６回抽出して、抽出物（６７．５ｇ）を得て、これをｎ－ヘキサン、ＣＨ_２Ｃｌ_２、および酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）で連続的に分配した。ＣＨ_２Ｃｌ_２画分（２４ｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、ＣＨＣｌ３／ＥｔＯＡｃ勾配系（５０：１→１：１）で溶出させて、１３個の画分（画分ＭＣ１～１３）を得た。化合物１（１０５．２ｍｇ）を、ＣＨＣｌ_３およびＭｅＯＨ溶媒下で画分ＭＣ３から再結晶させた。画分ＭＣ５を、ｎ－ヘキサン／ＥｔＯＡｃ（１０：１→１：１）の勾配溶出を用いた繰り返しのカラムクロマトグラフィーに供し、結果として、１０個の亜画分（画分ＭＣ５－１～ＭＣ５－１０）を得た。化合物２（９．１ｍｇ）を、ＣＨＣｌ３およびＭｅＯＨ溶媒下で画分ＭＣ５－５から再結晶させて、白色の結晶を得た。画分ＭＣ５－６（５８ｍｇ）を、ｎ－ヘキサン／ＥｔＯＡｃ勾配（７０分にわたりｎ－ヘキサン中ＥｔＯＡｃ ５～１００％、１０分にわたり１００％）を用いたＭＰＬＣに供して、化合物３（７．１ｍｇ）を得て、画分ＭＣ５－１０（１３ｍｇ）を、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＭｅＯＨ勾配（５分にわたり水中ＭｅＯＨ ５０～８０％、１５分にわたり８０～１００％、２５分にわたり１００％）を用いた半分取ＨＰＬＣに供して、化合物４（２．２ｍｇ）を得た。化合物５（３０１．５ｍｇ）および６（８．７ｍｇ）を、ＣＨＣｌ３およびＭｅＯＨ溶媒下で、それぞれ画分ＭＣ７およびＭＣ１０から再結晶させた。画分ＭＣ９を、ｎ－ヘキサン／ＥｔＯＡｃ（１５：１→１：
１）の勾配溶出を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供して、１７個の亜画分（画分ＭＣ９－１～ＭＣ９－１７）を得た。画分ＭＣ９－１４を、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＭｅＯＨ勾配（５分にわたり水中のＭｅＯＨ ５０～８０％、１５分にわたり８０～１００％、２５分にわたり１００％）を用いた半分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供して、化合物７（２．７ｍｇ）および８（３．２ｍｇ）を得た。ＥｔＯＡｃ画分（１２．４ｇ）を、セファデックスＬＨ－２０カラムクロマトグラフィーに供し、１００％ＭｅＯＨで溶出させて、１０個の画分（画分Ｅ１～１０）を得た。画分Ｅ４（７５０ｍｇ）を、ｎ－ヘキサン／ＥｔＯＡｃの勾配溶出（８：５→１：２）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、１０個の亜画分（画分Ｅ４～１～Ｅ４～１０）を得た。化合物９（２．４ｍｇ）を画分Ｅ４～３から単離し、画分Ｅ４～５を、水／ＭｅＯＨ勾配（３０分にわたり水中ＭｅＯＨ ２０～８０％、５分にわたり８０～１００％、５分にわたり１００％）を用いた半分取ＨＰＬＣに供し、化合物１０（１．２ｍｇ）を得た（Kim, Yu Jinら、2011）。

【0103】

乾燥させたチャーガマッシュルーム（８ｋｇ）を、還流下で４時間、９５％エタノールで３回抽出した。抽出物をろ過し、真空中で蒸発させ、エタノール抽出物（２１２．９５ｇ）を得た。次いでこのエタノール抽出物を蒸留水に懸濁し、ｎ－ヘキサン、酢酸エチル、およびｎ－ブタノールで逐次的に分配した。ｎ－ヘキサン画分（２８ｇ）を、ヘキサン－ＥｔＯＡｃ勾配系（３０：１～１５：１～８：１～４：１～１：１、ｖ／ｖ、２Ｌ）を使用したシリカゲルカラムでのクロマトグラフィーにかけて、１１個の画分を得た（画分１～１１）。画分１～１０を、１Ｌの溶媒で溶出させることによって得た。画分１１をヘキサン－ＥｔＯＡｃ（０：１００、ｖ／ｖ、２Ｌ）で溶出させた。画分１５（３６０ｍｇ、白色の結晶）を最終的に、画分１０の再結晶化によって精製した（６５０ｍｇ）。画分１５の同定を、ＮＭＲ分析によって行った。画分１５の化学構造を１Ｈ ＮＭＲによって確認した（kang, Ju-Heeら、2015）。イノノタス・オブリクスからの水性抽出物（ＩＯＡＥ）を、２００ｍｌの温かい水（４０℃）中の粉末化した子実体（１０ｇｍ）を抽出することによって調製した（Mishra, S.K.ら、2013）。

【0104】

生物学的に活性な化合物：このマッシュルームの化学成分に対する以前の調査において、ラノスタン型トリテルペノイド、例えばイノトジオール、トラメテノール酸、およびイノノツオキシド（inonotsuoxide）が、抗腫瘍および抗真菌性活性を有することが報告さ
れている。このマッシュルームにおいて、一部のフェノール化合物も見出された（Kim， Yu Jinら、2011）。

【0105】

Ｉ．オブリクスは、優れた生物活性化合物を含有する。Ｉ．オブリクス由来の３β－ヒドロキシ－ラノスタ－８，２４－ジエン－２１－アールが同定されており、Ｉ．オブリクスの食用マッシュルーム由来の高分子量、水溶性、リグニン様の物質が、１型ヒト免疫不全ウイルスのプロテアーゼを阻害することが報告されている。Ｉ．オブリクスの菌核から単離されたイノトジオールは、７，１２－ジメチル－ベンズ［α］アントラセンを使用したマウス皮膚での２段階発癌現象試験において阻害作用を有することが報告されている。Ｉ．オブリクスの熱水抽出物は、ヒト結腸がん細胞（ＨＴ－２９）の増殖に対して阻害活性を発揮する。それぞれ３β－ヒドロキシル－ラノスタ８，２４－ジエン－２１－アールおよびイノトジアール（ｉｎｏｔｏｄｉａｌ）としての亜画分１および２、ならびにこれらの化合物は、抗突然変異および抗酸化活性を有する。亜画分３はまた、抗突然変異および抗酸化活性も有する（Chung, Mi Jaら、2010）。

【0106】

前臨床研究：チャーガ水性抽出物は、インビトロおよびインビボで結腸直腸がん細胞の増殖を抑制した。これは、アポトーシスのミトコンドリア固有の経路を活性化し、オートファジーを誘導し、細胞周期のＳ期を停止させた。チャーガ水性抽出物は、ｉＮＯＳおよびＣｏｘ－２ならびに炎症促進性サイトカインの発現を阻害し、腸上皮細胞の炎症を改善
した。またこれは、ｐ－カテニンおよびＮＦ－κＢシグナル伝達も下方調節したことから、結腸直腸がん細胞において抗増殖および抗炎症性活性を発揮した（Mishra, S. K.ら、2013）。

【0107】

薬理活性－炎症およびがん：エルゴステロール過酸化物は、ＨＣＴ１１６、ＨＴ－２９、ＳＷ６２０およびＤＬＤ－１ＣＲＣ細胞株において、異なる感受性で、細胞増殖を阻害しただけでなくクローン産生性のコロニー形成も抑制した。これらのＣＲＣ細胞株で観察された成長阻害は、アポトーシスの結果であった。エルゴステロール過酸化物は、β－カテニンの核レベルを阻害し、最終的にｃ－Ｍｙｃ、サイクリンＤ１、およびＣＤＫ－８の転写の低減をもたらした。ｃ－Ｍｙｃ、サイクリンＤ１、およびＣＤＫ－８は、がんにおいて細胞周期およびアポトーシスなどの悪性腫瘍を調節するβ－カテニンの重要な下流標的である（Kang， Ju-Heeら、2015）。用量依存性の方式でのプロカスパーゼ－９（pro-capsase-9）のレベルの低減および切断されたカスパーゼ－９の蓄積増加によって観察されるように、ＩＯＡＥは、ヒトがん細胞株においてカスパーゼ－９を活性化した。続いてＩＯＡＥは、カスパーゼ－３を活性化し、その核の基質をポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ（ｐＡＲＰ）によって切断した（Mishra, S. K.ら、2013）。

【0108】

【表7】

【0109】

ＣＢＤ
背景：大麻は、集合的にカンナビノイドとして公知の一連の少なくとも６６種の化合物の固有な源である。これらのなかでもほとんどが、大麻の主要な精神賦活性成分であるΔ
^９－テトラヒドロカンナビノール（Δ^９－ＴＨＣ）の薬理作用について、さらに精神作用がないカンナビジオール（ＣＢＤ）について知られている。カンナビノイド受容体に対する内因性アゴニストも発見されている。ＣＢ１受容体は、中枢および末梢ニューロンの末端に存在し、そこでこれらは、伝達物質放出を調節する。これはまた、一部の非神経細胞にも存在する。ＣＢ２受容体は、主として免疫細胞によって発現され、それらの役割の１つは、サイトカイン放出を変更することである。ＣＢＤは、ＣＢ１およびＣＢ２受容体に対して、Δ^９－ＴＨＣより一層低い親和性を有し、その薬理学的な作用は、それほどよく特徴付けられていない。

【0110】

ＣＢ１およびＣＢ２受容体はどちらも、Ｇｉ／ｏタンパク質を介して、アデニル酸シクラーゼに負にカップリングされ、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼに正にカップリングされる。ＣＢ１受容体はまた、Ｇｉ／ｏタンパク質を介して、特定のイオンチャネルにもカップリングされ、Ａ型および内向き整流性カリウムチャネルにも正にカップリングされ、Ｎ型およびＰ／Ｑ型カルシウムチャネルにも負にカップリングされ、さらに、Ｄ－タイプカリウムチャネルにもカップリングされる。ＣＢ１受容体はまた、Ｇｓタンパク質を介してアデニル酸シクラーゼを活性化するように作用する場合もある。カンナビノイドＣＢ１およびＣＢ２受容体に関する追加のシグナル伝達メカニズムが提唱されており、これらの説明は、他所で見出すことができる（Pertwee, Roger Ｇ、2004）。説得力のある
証拠によれば、カンナビノイドの使用、またはカンナビノイド受容体およびエンドカンナビノイド系の操作は、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸障害、およびがんにおける痛み、痙直および振戦を含む多くの疾患において、利益がある可能性があることが示唆される。ＣＢＤおよびＣＢＤ豊富な大麻抽出物の可能性のある臨床的な応用としては、抗炎症性および神経保護作用の発生、てんかん、不安障害、緑内障および吐き気の管理、ならびにΔ^９－ＴＨＣの一部の作用の調節が挙げられる。

【0111】

ＣＢＤは、中毒、鎮静および頻脈を含むＴＨＣの一部の望ましくない作用に拮抗し、一方でそれ自体で鎮痛、制吐、および抗発癌性の特性に貢献することが実証されている。現代の臨床治験では、それにより、より高い用量のＴＨＣの投与が許容されており、多発性硬化症における痙直、中枢性疼痛および下部尿路の症状、加えて、睡眠障害、末梢神経障害性疼痛、腕神経叢剥離の症状、リウマチ様関節炎および難治性がん性疼痛の処置における大麻ベースの抽出物のための臨床効果および安全性に関する証拠をもたらす。神経防護作用、薬物依存性、および新生物形成性の障害における大麻全体の抽出物の将来的な適用に関する見通しがさらに調査される。ＴＨＣとＣＢＤの組合せが、有害事象を低減させながら臨床効果を増加させるという仮説が裏付けられている（Russo、Ethan、およびGeoffrey W． Guy、2006）。

【0112】

従来の薬での使用：カンナビス・サティバＬ．（アサ科（Cannabaceae））は、中国に
おいて繊維および種子作物としての利用の長い歴史があり、その痩果（「種子」）に加えて他の植物部分は、ほぼ２０００年にわたり中国の医学書での記録が認められる。東洋医学における大麻の主要な適用は痩果の使用に集中しているが、雌花序および他の植物部分に関する古来の適応症としては、カンナビジオール（ＣＢＤ）およびΔ９－テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）などのカンナビノイドに対する現在の調査対象である痛みや精神疾患などの状態が挙げられる（Brand, E. Joseph、およびZhongzhen Zhao、2017）。

【0113】

抽出方法：大麻の乾燥した花および葉を、ＣＯ_２で、室温で抽出して抽出物を得て、これを蒸発乾固させ、茶色がかった固体を得た。抽出物の一部を、Ｃ１８カラム（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ、流速１ｍｌ／分）を使用したＨＰＬＣ分析（アジレント（Agilent）１
１００）のためにメタノール中に溶解させた（Zhu JSら、1998）。

【0114】

前臨床研究：ＣＢＤは、そのインビトロおよびインビボでの腫瘍細胞に対する活性に基
づき抗新生物剤みなされている。しかしながら、ＣＢＤがこの活性を媒介する正確な分子メカニズムは未だ解明されていない。ＣＢＤは、カンナビノイドおよびバニロイド受容体の活性化とは無関係に、乳がん細胞の細胞死を誘導した。電子顕微鏡法から、オートファジーとアポトーシスの共存と一致する形態が解明された。ウェスタンブロット分析は、これらの発見を確認した。ＣＢＤは小胞体ストレスを誘導し、その後、リン酸化されたｍＴＯＲおよび４ＥＢＰ１、ならびにサイクリンＤ１の減少したレベルにより示された通り、ＡＫＴおよびｍＴＯＲシグナル伝達を阻害する。オートファジーおよびアポトーシスのシグナル伝達経路の間のクロストークをさらに分析することで、本発明者らは、ＭＤＡ－ＭＢ２３１乳がん細胞において、ベクリン１が、ＣＢＤ媒介アポトーシスの誘導において中心的な役割を果たすことを見出した。ＣＢＤは、ベクリン１とＶｐｓ３４との相互作用を強化するが、ベクリン１とＢｃｌ－２との会合を阻害する。加えて、ＣＢＤは、ミトコンドリア膜電位を低減し、ＢＩＤのミトコンドリアへの転移、シトクロムｃのサイトゾルへの放出、最終的には乳がん細胞において固有のアポトーシス経路の活性化を引き起こす。ＣＢＤは、活性酸素種（ＲＯＳ）の生成を増加させ、ＲＯＳ阻害は、アポトーシスおよびオートファジーの誘導をブロックした。本発明者らの研究は、ＣＢＤで処置した乳がん細胞におけるアポトーシスとオートファジーとの複雑な相互作用を解明し、ＣＢＤの抗新生物剤としての見込みのある使用に対する継続調査の価値を強調した。

【0115】

薬理活性－炎症およびがん：カンナビジオール（ＣＢＤ）は、大麻の主要な非精神賦活性の成分であり、その腫瘍細胞に対するインビトロおよびインビボの活性に基づき抗新生物剤とみなされる。カンナビノイドは、がんの成長と拡がりの中心となるシグナル伝達経路を調節することができる。それらは細胞周期の進行および走化性を阻害し、血管新生をブロックする。ＣＢＤは、インビトロで神経膠腫に対して細胞傷害性であり、腫瘍細胞移動を阻害する。加えて、ＣＢＤは、ヒト白血病細胞株において、古典的カスパーゼ経路を活性化し、ＮＯＸ４およびｐ２２（ＰＨＯＸ）機能を強化することによってアポトーシスを誘導する。近年の研究は、ＣＢＤが、乳がんの成長を阻害し、乳がん細胞株において転移のレギュレーターであるＩＤ１を下方調節することを報告している。さらに、ＣＢＤは、ＴＨＣと協同して、神経膠腫細胞においてプログラム細胞死（ＰＣＤ）を誘導する（Shrivastava, Ashutoshら、2011）。またカンナビノイドはアデニル酸シクラーゼの阻害も
誘導し、イオンチャネルに影響を及ぼし、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）、ｃ－Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ、およびｐ３８マイトジェン活性化タンパク質キナーゼを刺激することから、それらは、細胞生存または死の決定において全体的な役割を果たす可能性があることが示される（Vaccani, Angeloら、2005）。

【0116】

【表8】

【0117】

ＴＨＣ
背景：近年、様々な一般的な疾患のための新規の治療剤として、カンナビノイド（マリファナ、カンナビス・サティバの活性成分）およびその誘導体に強い関心がもたれてきた。マリファナの主要な活性成分、Δ^９－テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）の同定は、カンナビノイドは、特異的な細胞表面Ｇタンパク質共役カンナビノイド受容体：ＣＢ１およびＣＢ２を活性化することによって機能するという発見をもたらした。ＣＢ１受容体は、特に脳に豊富であり、ＣＢ２受容体は、免疫系の細胞で高度に発現される。Δ^９－ＴＨＣの作用の多くは、カンナビノイド受容体によって媒介され、そのうちの少なくとも２つの型、ＣＢ１およびＣＢ２が哺乳類組織中に存在する。

【0118】

カンナビノイドは、主として多数の異なる腫瘍細胞型においてアポトーシスを誘導するその能力のために、新規のがん治療剤であるとして提唱されている。ＴＨＣは、マリファナの精神賦活性成分である。加えて、ＴＨＣは、特異的なカンナビノイド受容体を活性化する内因性化合物であるエンドカンナビノイドアナンダミドおよび２－アラキドノイルグリセロールを模擬することによって、多種多様の生物学的作用を発揮する。

【0119】

カンナビノイドは、副作用の一部、例えば、多くの場合にがんに付随する吐き気および嘔吐、体重の減少、食欲の欠如および痛みの処置においてうまく使用されている。Δ^９－ＴＨＣ（ドロナビノール）およびＬＹ１０９５１４（ナビロン）は、がん化学療法に関連する吐き気および嘔吐を処置するために承認されている。がんの緩和処置においてカンナビノイドが使用されるにもかかわらず、カンナビノイドは、それ自体、腫瘍進行のための処置としてまだ使用されていない。

【0120】

腫瘍学におけるＴＨＣの見込みのある将来的な使用の主な制限としては、大部分が知覚の異常からなる、場合によっては幻覚、精神不安、異常な思考、離人症および傾眠からなる主に中枢神経系のレベルでの有害作用を挙げることができる（Ligresti, Alessiaら、2006）。

【0121】

従来の薬での使用：カンナビス・サティバ（Cannabis Sativa）由来の抽出物は、何世
紀にもわたり医薬目的と娯楽目的の両方のための使用されてきた。
抽出方法：種子および苞で構成される大麻を回収すること；種子から苞を分離すること；苞を溶媒で抽出し、それによって抽出物を生産すること、抽出物を、必要に応じて抽出物からΔ^９－ＴＨＣを分割するように配置されたクロマトグラフのカラムに通すこと（Webster, GR Barrie、2002）。

【0122】

Δ^９－ＴＨＣを、ハシシュから、向流分配：自動アセンブリ－２００細胞、１０ｍｌの上および下の相のいずれか、溶媒系：石油－エーテル／メタノール／ジメチルホルムアミド／水、１０：８：２：１によって得た。残留物の蒸発および石油－エーテルでの抽出の後、Δ^９－ＴＨＣが流動的な無色の油状物として単離される［α］^２５ _Ｄ－１４１°（ＥｔＯＨ；ｃ＝３．１６ｗ／ｗ）。これは、Δ^９－ＴＨＣと７．９０／ｏ ｗ／ｗのジメチルホルムアミドの混合物であり、これは、フェノール基の水素結合によって保持される。ジメチルホルムアミドの含量を、ＳＭＲシグナルの統合およびジメチルホルムアミド中のリチウムイソプロピレートでのＴＨＣの滴定によって測定した。アミドを除去するために、この混合物を５０～１００倍量のＣＣｌ_４中に溶解させ、水と共に２回振盪する。有機層を分離し、低温で、減圧下で溶媒を除去する。得られた粘性の油状物は、空気と光に曝露されたらすぐに薄黒くなる（Silva, M． Teresa A.ら、1968）。

【0123】

前臨床研究：腫瘍細胞の成長および生存は、細胞生存および増殖を調節する経路を介したシグナル伝達の増加に依存することが多い。これらのうち２つは、ＭＡＰＫシグナル伝達経路（Ｒａｓ／Ｒａｆ－ＭＡＰＫ、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ１／２））およびＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路を含む。ＣＢ１およびＣＢ２カンナビノイド受容体の両方は、ヘテロ三量体Ｇｉ／ｏ－タンパク質を介してこれらの経路にカップリングされる。ヒトＣＢ１でトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において、ＣＰ５５９４０（高度に有力な非選択的ＣＢ１およびＣＢ２アゴニスト）は、ｐ４２／ｐ４４ ＭＡＰＫ活性を時間および濃度依存性の方式で増加させ、これは、ＣＢ１アンタゴニスト／インバースアゴニストＳＲ１４１７１６Ａによって逆転した［２６］。さらに、ＭＡＰＫの活性化は、百日咳毒素によってブロックされたことから、ＣＢ１とＭＡＰＫとの間のシグナル伝達はＧＴＰ結合タンパク質を含むことが示唆される。ＣＨＯ細胞をＣＢ２でトランスフェクトした場合、ＣＰ５５９４０がｐ４２／ｐ４４ ＭＡＰＫ活性を増加させたため類似の結果が見られ、この作用は、ＳＲ１４４５２８（ＣＢ２選択的アンタゴニスト）と百日咳毒素の両方によってブロックされた。これらの研究からの結果は、ＣＢ１またはＣＢ２受容体のいずれかの活性化が、ＭＡＰＫ経路を介したシグナル伝達の増加をもたらすことを示す（Alexander Amyら、2009）。

【0124】

薬理活性－炎症およびがん：ＴＨＣは、数々の腫瘍細胞型においてアポトーシスを誘導することが示されている。カンナビノイドが、細胞生存およびアポトーシスを制御するシグナル伝達経路の差次的な調節を少なくとも部分的に介して腫瘍細胞を選択的に標的化することができるという証拠が増えつつある。しかしながら、カンナビノイドの抗腫瘍性作用の基礎をなすメカニズムの理解は不十分であり、証拠は、これらの作用が細胞型特異的であり得ることを示唆する。カンナビノイドによって（研究される細胞型およびカンナビノイドに応じて）正または負のいずれかに調節されることが報告されている２つのシグナル伝達経路は、ＲＡＳ－ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路およびＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ経路である（Gree
nhough, Alexanderら、2007）。

【0125】

現在の文献における全体的な同意は、カンナビノイドが抗がん作用を有することを示しているが、Ｄ９－ＴＨＣが、より低い濃度はがん細胞の増殖の増加をもたらし、より高い濃度は細胞増殖の減少を引き起こすという、がん細胞において二相性の作用を有することを示したいくつかの研究がある。例えば、１００～３００ｎＭでのＤ９－ＴＨＣは、ＮＣｌ－Ｈ２９２（肺がん）およびＵ３７３－ＭＧ（膠芽腫）細胞の増殖率においてそれぞれ１．２および２倍の増加をもたらした。対照的に、より高い濃度のＤ９－ＴＨＣ（４～１０ｌＭ）は細胞傷害性であり、アポトーシス細胞の数を増加させた（３０～８０％）。カンナビノイドは、ＣＢ２活性化を介して免疫系の抑制を引き起こし得ることが周知である（Alexander Amyら、2009）。

【0126】

【表9】

【0127】

マッシュルーム抽出物およびカンナビノイドを含む本発明の組成物を、インビトロにおけるその抗炎症性および抗がん作用の両方に関して試験した。
この研究の目的は、以下を評価することであった：
ａ．ＲＡＷ２６４．７細胞に対する異なるマッシュルーム抽出物、ＴＨＣおよびＣＢＤの抗炎症特性。

【0128】

ｂ．ＰＡＮＣ－１およびＥＧＬ－１細胞に対する異なるマッシュルーム抽出物、ＴＨＣおよびＣＢＤの抗がん特性。
本発明で上述された細胞株は、以下の通りである：
ａ．ＲＡＷ２６４．７（ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ－７１（商標））、マウスマクロファージ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）、米国メリーランド州ロックビル）。

【0129】

ｂ．ＰＡＮＣ－１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１４６９（商標））、ヒト膵臓癌。
ｃ．ＥＧＬ－１ヒト肝外胆管癌。
本明細書の以下で記載されるアッセイで試験されたマッシュルーム抽出物は、以下の通りである：
ａ．冬虫夏草Ｃｓ－４（マッシュルームサイエンス（Mushroom Science）、ロット番号Ｗ０００１５７６、ｅｘｐ１１／２０２０）。熱水／アルコール抽出物。

【0130】

ｂ．冬虫夏草－Ｍ（リアルマッシュルーム（Real Mushrooms）、ロット番号１８２７４、ｅｘｐ１０／２０２０）。熱水抽出物。
ｃ．ターキーテイルコロリウス（Turkey Tail Colorius）ＰＳＰ（マッシュルームサイエンス、ロット番号１８２０００４、ｅｘｐ０７／２０２０）。熱水／アルコール抽出物。

【0131】

ｄ．ターキーテイル抽出物（リアルマッシュルーム、ロット番号１８３０５、ｅｘｐ１１／２０２０）。熱水抽出物。
ｅ．椎茸（マッシュルームサイエンス、ロット番号１８００４０１、ｅｘｐ０１／２０２０）。熱水／アルコール抽出物。

【0132】

ｆ．霊芝抽出物４１５（リアルマッシュルーム、ロット番号１８２７０、ｅｘｐ０９／２０２０）熱水／アルコール抽出物。
ｇ．アガリクス・ブラゼイ－フルスペクトル抽出物（マッシュルームサイエンス、ロット番号Ｗ００００００８、ｅｘｐ０８／２０２０）。熱水／アルコール抽出物。

【0133】

ｈ．チャーガ（マッシュルームサイエンス、ロット番号Ｗ０００１５８０、ｅｘｐ１１／２０２０）。熱水／アルコール抽出物。
ｉ．舞茸（マッシュルームサイエンス、ロット番号１８０２５０２、ｅｘｐ１１／２０２０）。熱水／アルコール抽出物。

【0134】

ｊ．ＣＢＤ（カンナビジオール）、ＢＯＬファーマ（BOL Pharma）、ロット番号ＬＧ１８０８６－３６－２。ＣｏＡ。
ｋ．デキサメタゾン（ウェストワードファーマシューティカルズ社（West-ward Pharmaceuticals Corp）、カタログ番号０６４１－０３６７－２５、ロット番号１０８３８１、ｅｘｐ．１０／２０２０）。

【0135】

本明細書の以下で記載されるアッセイで使用されるマッシュルーム抽出物、カンナビノイド溶液および増殖培地を、以下の通り調製した。
マッシュルーム抽出物：
ａ．温かい注射用水（４２℃）の総最終容量の２／３を、乾燥マッシュルーム粉末に添加した。

【0136】

ｂ．懸濁液をボルテックス混合し、遠心分離した（４１００ｒｐｍ、室温、５分）。
ｃ．水溶性画分を含有する上清をきれいなチューブに分離した。
ｄ．総最終容量の５％のＥｔＯＨをペレットに添加し、ボルテックスで混合して、エタノール可溶性画分を抽出した。最終容量になるまで水を適量添加した。

【0137】

ｅ．懸濁液をボルテックスで混合し、遠心分離した。得られた上清を合わせ、再び遠心分離して、死細胞片を除去して、５０ｍｇ／ｍｌの最終濃度を得た。
ｆ．得られた溶液をセルストレーナー（４０～７０ミクロン）に通過させた。

【0138】

ｇ．２つの追加のストックを、媒体（ＷＦＩ中の５％ＥｔＯＨ）で調製した：１０ｍｇ／ｍｌおよび２ｍｇ／ｍｌ。
ｈ．９６μＬの培地に、全ての試験物／媒体を４μＬで細胞に添加し、２ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、および０．０８の最終的な作業濃度（０．２％ＥｔＯＨ、４％ＷＦＩ中）を得た。

【0139】

カンナビノイド溶液
ａ．ＴＨＣ－ＴＨＣを媒体（５％ＤＭＳＯを含有するＷＦＩ）で、１８７５μＭ、５００μＭ、１００μＭ、２５μＭおよび２．５μＭの濃度に希釈した。全ての試験ＴＨＣストック／媒体を、アッセイに応じて細胞で１：１５～１：５に希釈した。

【0140】

ｂ．ＣＢＤ（３１４．４６ｇ／ｍｏｌ）－を、ＥｔＯＨ中に溶解させて１０ｍｇ／ｍｌ（３１．８ｍＭ）の濃度にした。５％ＤＭＳＯを含む３１．８ｍＭエタノール溶液を合わせ、ＷＦＩで５００μＭの最終濃度に希釈することによって５００μＭストック溶液を調製した。得られた溶液をさらに媒体（５％ＤＭＳＯを含有するＷＦＩ）で、５００μＭ、３７５μＭ、１２５μＭ、２５μＭおよび２．５μＭの濃度に希釈した。全ての試験ＣＢＤストック／媒体を、アッセイに応じて細胞で１：１５～１：５に希釈した。

【0141】

ｃ．デキサメタゾン（３９２．４６ｇ／ｍｏｌ）ストック溶液１０ｍｇ／ｍｌ（２５．４７ｍＭ）。ストック溶液をさらに媒体（５％ＥｔＯＨを含有するＷＦＩ）で、２．５μＭ、０．２５μＭ、および０．０２５μＭの濃度に希釈した。９６μＬ培地に、全てのデキサメタゾンストックを４μＬで細胞に添加し、１００ｎＭ、１０ｎＭ、および１ｎＭ（０．２％ＥｔＯＨおよび４％ＷＦＩ中）の最終的な作業濃度を得た。

【0142】

細胞培地の配合：ＲＡＷ増殖培地：１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、４ｍＭのＬ－グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、および１％ペニシリン－ストレプトマイシン溶液（ＰＳ）が補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）高グルコース。

【0143】

細胞をＬＰＳおよび試験物質と共にインキュベートすること：
ａ．細胞を８０％の密集度で回収し、計数し、１×１０^６／ｍｌの最終濃度まで増殖培地に再懸濁した。

【0144】

ｂ．細胞懸濁液を９６ウェルのマイクロタイタープレートに植え付けた（細胞１×１０^５個／１００μｌ／ウェル）。各プレートを表１、表２および表３に示された通りに設計した。

【0145】

ｃ．細胞を１８～２４時間インキュベートした（３７±１０℃、５％ＣＯ２）。
ｄ．増殖培地を除去した；９４μＬの培地および４μＬの媒体、試験物質、および対照を添加した。

【0146】

ｅ．全てのウェルの内容物を上下に３回ピペッティングすることによって混合した。
ｆ．プレートを２時間インキュベートした（３７±１℃、５％ＣＯ２）。
ｇ．全てのウェルに、ＬＰＳ（１０μｌ、１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度のＬＰＳ）を添加した。

【0147】

ｈ．全てのウェルの内容物を上下に３回ピペッティングすることによって混合した。
ｉ．プレートを２４±２時間インキュベートした（３７±１℃、５％ＣＯ２）。
ｊ．９６－マイクロタイタープレートから、ＮＯ分泌アッセイのために培地を５０μｌ収集し、残りをサイトカイン分泌アッセイのために－２０℃で貯蔵した。

【実施例0148】

本発明の組成物の抗炎症特性評価するために、マッシュルーム抽出物およびカンナビノイドとのインキュベーション後におけるＲＡＷ細胞からの酸化窒素（ＮＯ）およびサイトカイン分泌のためのアッセイ、加えて生存率アッセイを行った。

【0149】

【表10】

【0150】

【表11】

【0151】

【表12】

【0152】

細胞増殖および生存率（ＸＴＴアッセイ）
ａ．ＸＴＴ反応溶液を調製した。
ｂ．各ウェルに５０μｌのＸＴＴ反応溶液を添加した。
ｃ．プレートを加湿した雰囲気中（例えば３７℃、５％ＣＯ２）でインキュベートした。ｄ．プレートを穏やかに振盪して、ウェル中に色素を均一に分配した。
ｅ．サンプルの吸光度を、分光光度計（ＥＬＩＳＡリーダー）を用いて、ブランクのようなバックグラウンド対照に対して４５０ｎｍの波長で測定した。
ｆ．参照吸光度を測定するために（非特異的な読み取りを測定するために）、６２０ｎｍの波長を使用して、４５０ｎｍの測定値から引いた。
ｇ．細胞のアイドリングの吸光度は、全てのウェルで０．５～１．５であった。

【0153】

酸化窒素（ＮＯ）試験（グリース（Griess）試験）
ａ．スルファニルアミド溶液およびＮＥＤ溶液をそのまま室温に平衡化した（１５～３０
分）。
ｂ．提供された０．１Ｍ亜硝酸塩標準を培養培地で１：１，０００に希釈することによって、１ｍｌの１００μＭ亜硝酸塩溶液を調製した。
ｃ．亜硝酸塩標準参照曲線のために、２本のカラム（１６ウェル）を非結合９６ウェルプレートで指定した。列Ｂ～Ｈのウェルに、５０μｌのアッセイ培地を分配した（図１）。ｄ．１００μｌの１００μＭ亜硝酸塩溶液を、列Ａの残りの２つのウェルに添加した。即座に連続２倍希釈（５０μｌ／ウェル）をプレートに沿って２連で実行して、亜硝酸塩の標準参照曲線（１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１３および１．５６μＭ）を生成し、ウェルの１．５６μＭのセットから５０μｌを捨てた。
ｅ．亜硝酸塩の標準参照曲線のために、５０μｌのスルファニルアミド溶液を、全ての実験サンプルおよび一連の希釈物を含有するウェルに分配した。
ｆ．プレートを、遮光して、室温で５～１０分間インキュベートした。
ｇ．全てのウェルに５０μｌのＮＥＤ溶液を分配した。
ｈ．プレートを、遮光して、室温で５～１０分間インキュベートした。
ｉ．３０分間以内に、５２０ｎｍ～５５０ｎｍのフィルターを用いたプレートリーダーで吸光度を測定した。
ｊ．ＮＯ分泌の阻害は、細胞の生存率への作用がない（媒体対照と比較して９５％を超える生存率）濃度でのみ関連するとみなされた。図２に、生存率に関する代表的な結果を示す。

【0154】

結果：マッシュルーム抽出物
酸化窒素（ＮＯ）分泌
ａ．霊芝、アガリクス・ブラゼイ（Agaricus Blazai）、冬虫夏草Ｃｓ－４（２ｍｇ／ｍ
ｌ）および冬虫夏草Ｍ（０．０８ｍｇ／ｍｌ）が、２～３の独立した実験において、ＮＯ分泌ＮＯ分泌を阻害することにおける唯一の有効なマッシュルームであった（細胞の生存率への作用がまったくない）。
ｂ．表４は、媒体対照、マッシュルーム抽出物での処置後のＲＡＷ細胞からのＮＯ分泌、およびＮＯ分泌の阻害％の計算（１００％－ＮＯマッシュルーム／ＮＯ媒体×１００％）を記載している。冬虫夏草Ｍが、用量依存的と考えられるＮＯ分泌を阻害することにおいて、最も有効であることが見出された。また霊芝とのインキュベーション後にも著しい阻害を観察できるが、阻害は最大濃度（２ｍｇ／ｍｌ）でしか観察することができなかった。
ｃ．インビトロでは、活性のために（細胞の生存率に影響を与えることなく）極めて狭い範囲が存在したと考えられる。
ｄ．ターキーテイル、舞茸、椎茸およびチャーガは、ＮＯ分泌への作用がなかった（表４を参照）。
ｅ．図３は、ＮＯ分泌の代表的な結果を示す。

【0155】

【表13】

【0156】

サイトカイン分泌
ａ．霊芝、冬虫夏草Ｍ、アガリクス・ブラゼイ、および冬虫夏草Ｃｓ－４を、１０５個のＲＡＷ細胞／ウェルと共に、０．０８～２ｍｇ／ｍｌで２４時間インキュベートした。
ｂ．多重分析（ＣＣＬ３／ＭＩＰ１α、ＩＬ－６、ＩＬ－１β、ＴＮＦα、ＩＬ－１０およびＩＬ－６）のために、細胞からの培地を２連で収集した。
ｃ．これらの条件下で、ＩＬ－４、ＩＬ－１０およびＩＬ－１βは分泌されなかった（検出限界未満であった）。
ｄ．ＣＣＬ３／ＭＩＰ－１α分泌は、サンプルを１：２０に希釈したとしても、検出限界を超えた。
ｅ．表５のＩＬ－６分泌は、媒体対照、マッシュルーム抽出物での処置後のＲＡＷ細胞からのＩＬ－６分泌、およびＩＬ－６分泌の阻害％（１００％－ＩＬ－６マッシュルーム／ＩＬ－６媒体×１００％）またはＩＬ－６分泌の上昇％（ＩＬ－６マッシュルーム／ＩＬ－６媒体×１００％－１００％）の計算を記載している。
ｆ．ＴＮＦα分泌 表６は、媒体対照、マッシュルーム抽出物での処置後のＲＡＷ細胞からのＴＮＦα分泌、およびＴＮＦα分泌の分泌％（ＴＮＦαマッシュルーム／ＴＮＦα媒体×１００％）またはＴＮＦα分泌の上昇％（ＴＮＦαマッシュルーム／ＴＮＦα媒体×１００％－１００％）の計算を記載している。
ｇ．アッセイからの結果はまた、図４にも示される。

【0157】

【表14】

【0158】

【表15】

【0159】

カンナビノイド抽出物
酸化窒素分泌：以下の表７に、カンナビノイド抽出物によるＮＯ分泌に関する結果を示す。
ａ．ＣＢＤは、ＮＯ分泌を阻害することにおいて有効であり、１５～２０μＭで細胞の生存率に影響を及ぼさなかったが、ＴＨＣは２０μＭで影響があった。
ｂ．ほとんど用量応答はなかった。活性のために（細胞の生存率に影響を与えることなく）極めて狭い範囲が存在する。
ｃ．図５に、カンナビノイド抽出物のＮＯ分泌への作用に関する結果も示す。

【0160】

【表16】

【0161】

サイトカイン分泌
ａ．ＣＢＤ（１５μＭ）およびＴＨＣ（２０μＭ）を、１０^５個のＲＡＷ細胞／ウェルと共にインキュベートした。

【0162】

ｂ．多重分析（ＣＣＬ３／ＭＩＰ１α、ＩＬ－６、ＩＬ－１β、ＴＮＦα、ＩＬ－１０およびＩＬ－６）のために、細胞からの培地を２連で収集した。
ｃ．これらの条件下で、ＩＬ－４、ＩＬ－１０およびＩＬ－１βは分泌されなかった（検出限界未満であった）。

【0163】

ｄ．ＣＣＬ３／ＭＩＰ－１α分泌は、サンプルを１：２０に希釈したとしても、検出限界を超えた。
ｅ．ＩＬ－６分泌：
ｉ．ＣＢＤはＩＬ－６分泌に影響を与えなかった。
ｆ．ＴＮＦα分泌：
ｉ．ＣＢＤはＴＮＦα分泌に影響を与えなかった。
ｉｉ．ＴＨＣはＴＮＦα分泌に影響を与えなかった。

【0164】

結果は、図４にも示される。
カンナビノイド抽出物と組み合わせたマッシュルーム抽出物
酸化窒素分泌：表８は、カンナビノイド有り／無しの、媒体対照、マッシュルーム抽出物での処置後のＲＡＷ細胞からのＮＯ分泌、およびＮＯ分泌の阻害％の計算（１００％－ＮＯマッシュルーム／ＮＯ媒体×１００％）を記載している。

【0165】

ａ．ＤＭＳＯ、ＣＢＤ（１５μＭ）またはＴＨＣ（２０μＭ）を、霊芝、冬虫夏草Ｍ、アガリクス・ブラゼイ（Agaricus Blazai）、および冬虫夏草Ｃｓ－４（０．０８～２ｍ
ｇ／ｍｌ）と組み合わせて、１０^５個のＲＡＷ細胞／ウェルと共に２４時間インキュベートした。

【0166】

ｂ．細胞の培地を収集し、ＮＯ分泌に関して測定した（グリースＮＯキット）。
ｃ．霊芝：ＴＨＣは、霊芝（２ｍｇ／ｍｌ）によるＮＯ分泌の阻害を著しく増加させた。ＣＢＤは、わずかな相加効果しかなかった。この組合せが、ＮＯ分泌阻害に関して最も有力な組合せと考えられる。

【0167】

ｄ．冬虫夏草Ｍ（ＲＭ）：ＴＨＣは、冬虫夏草Ｍ（０．０８ｍｇ／ｍｌ）によるＮＯ分泌阻害を強化した。ＣＢＤは、このような作用を有していなかった。
ｅ．冬虫夏草Ｃｓ－４（ＣＳ）：ＴＨＣとＣＢＤの両方が、冬虫夏草Ｃｓ－４（２ｍｇ／ｍｌ）によるＮＯ分泌の阻害を増加させた。

【0168】

ｆ．アガリクス・ブラゼイ：ＴＨＣとＣＢＤの両方が、アガリクス・ブラゼイ（２ｍｇ
／ｍｌ）によるＮＯ分泌の阻害を増加させた。
ｇ．冬虫夏草Ｍ ０．０８ｍｇ／ｍｌとＴＨＣ ２０μＭは、ＮＯ分泌阻害に関して最も有力な組合せである。

【0169】

結果は、図６にも示される。

【0170】

【表17】

【0171】

サイトカイン分泌
ａ．ＤＭＳＯ、ＣＢＤ（１５μＭ）またはＴＨＣ（２０μＭ）を、霊芝、冬虫夏草Ｍ、アガリクス・ブラゼイ（Agaricus Blazai）、および冬虫夏草Ｃｓ－４（０．０８～２ｍ
ｇ／ｍｌ）と組み合わせて、１０^５個のＲＡＷ細胞／ウェルと共にインキュベートした。

【0172】

ｂ．多重分析（ＣＣＬ３／ＭＩＰ１α、ＩＬ－６、ＩＬ－１β、ＴＮＦα、ＩＬ－１０およびＩＬ－６）のために、細胞からの培地を２連で収集した。
ｃ．これらの条件下で、ＩＬ－４、ＩＬ－１０およびＩＬ－１βは分泌されなかった（検出限界未満であった）。

【0173】

ｄ．ＣＣＬ３／ＭＩＰ－１α分泌は、サンプルを１：２０に希釈したとしても、検出限界を超えた。
ｅ．ＩＬ－６分泌（表９は、カンナビノイド有りおよび無しの、媒体対照、マッシュルーム抽出物での処置後のＲＡＷ細胞からのＩＬ－６分泌、およびＩＬ－６分泌の阻害％（１００％－ＩＬ－６マッシュルーム／ＩＬ－６媒体×１００％）またはＩＬ－６分泌の上昇％（ＩＬ－６マッシュルーム／ＩＬ－６媒体×１００％－１００％）の計算を記載している。

【0174】

ｇ．ＴＮＦα分泌：表１０は、カンナビノイド有りおよび無しの、媒体対照、マッシュルーム抽出物での処置後のＲＡＷ細胞からのＴＮＦα分泌、およびＴＮＦαの分泌％（Ｔ
ＮＦαマッシュルーム／ＴＮＦα媒体×１００％）またはＴＮＦα分泌の上昇％（ＴＮＦαマッシュルーム／ＴＮＦα媒体×１００％－１００％）の計算を記載している。
ｉ．ＣＢＤ＋霊芝（２ｍｇ／ｍｌ）は、両方の抽出物単独と比較してＩＬ－６分泌を減少させた（炎症促進性作用）。
ｉｉ．ＣＢＤ＋冬虫夏草Ｃｓ－４（０．０８ｍｇ／ｍｌ）は、両方の抽出物単独と比較してＩＬ－６分泌を減少させた（炎症促進性作用）。・ＣＢＤ＋冬虫夏草Ｃｓ－４（２ｍｇ／ｍｌ）は、冬虫夏草Ｃｓ－４（２ｍｇ／ｍｌ）単独のＩＬ－６分泌への阻害作用を減らした。・ＣＢＤ＋アガリクス・ブラゼイ（Agaricus balzei）（０．４ｍｇ／ｍｌ）は、
アガリクス・ブラゼイ（Agaricus balzei）（０．４ｍｇ／ｍｌ）単独のＩＬ－６分泌へ
の阻害作用を減らした。
ｉｉｉ．ＴＨＣ＋霊芝（０．０８ｍｇ／ｍｌ）は、両方の抽出物単独と比較してＩＬ－６分泌を減少させた。
ｉｖ．ＴＨＣ＋冬虫夏草Ｃｓ－４（２ｍｇ／ｍｌ）が、両方の抽出物単独と比較してＩＬ－６分泌を増加させた。・ＴＨＣ＋冬虫夏草Ｃｓ－４（０．０８ｍｇ／ｍｌ）は、両方の抽出物単独と比較してＩＬ－６分泌を減少させた。・ＴＨＣ＋冬虫夏草Ｍ（０．０８ｍｇ／ｍｌ）は、両方の抽出物単独と比較してＩＬ－６分泌を減少させた。

【0175】

ｈ．ＴＮＦα分泌：
ｉ．ＣＢＤ＋霊芝（２ｍｇ／ｍｌ）は、両方の抽出物単独と比較してＴＮＦα分泌を減少させた。・ＴＨＣ＋霊芝（０．４～２ｍｇ／ｍｌ）は、両方の抽出物単独と比較してＴＮＦα分泌を減少させた。・ＣＢＤ／ＴＨＣ＋冬虫夏草Ｃｓ－４（２ｍｇ／ｍｌ）は、両方の抽出物単独と比較してＴＮＦα分泌を増加させた。
ｉｉ．ＴＨＣ＋冬虫夏草Ｃｓ－４（０．０８ｍｇ／ｍｌ）は、両方の抽出物単独と比較してＴＮＦα分泌を減少させた。
ｉｉｉ．ＴＨＣ＋アガリクス・ブラゼイ（２ｍｇ／ｍｌ）は、両方の抽出物単独と比較してＴＮＦα分泌を減少させたが、ＴＨＣ＋アガリクス・ブラゼイ（０．０８ｍｇ／ｍｌ）は、両方の抽出物単独と比較してＴＮＦα分泌を増加させた。
ｉｖ．ＴＨＣ＋霊芝（０．０８ｍｇ／ｍｌ）は、ＩＬ－６分泌を最も減少させた。ＴＨＣ＋冬虫夏草Ｃｓ－４（２ｍｇ／ｍｌ）は、ＩＬ－６分泌を最も増加させた。
ｖ．ＴＨＣ＋冬虫夏草Ｃｓ－４（０．０８ｍｇ／ｍｌ）は、ＴＮＦα分泌を最も減少させた。

【0176】

図４に結果を示す。

【0177】

【表18】

【0178】

【表19】

【0179】

本明細書の上記で提供されるデータから、マッシュルーム抽出物とＴＨＣまたはＣＢＤとの組合せの抗炎症特性は、各成分単独のものとは著しく異なることを理解することができ、したがってマッシュルーム抽出物のＴＨＣまたはＣＢＤとの相乗的な抗炎症性作用が示される。

【0180】

表８は、マッシュルーム抽出物とＴＨＣまたはＣＢＤの組合せが、各成分単独に比べてＮＯの分泌の減少をもたらし、これらの組合せの抗炎症特性を増加させたことを示すことを具体的に示す。ＮＯ分泌の最大の阻害は、０．０８ｍｇ／ｍｌの冬虫夏草 Ｍと２０μＭのＴＨＣの組合せで観察された。

【0181】

マッシュルーム抽出物とＴＨＣまたはＣＢＤの組合せのＩＬ－６分泌への作用は、ＩＬ－６分泌の減少を示したが、一方でＴＨＣ＋霊芝（０．０８ｍｇ／ｍｌ）は、表９で示されるように、ＴＨＣ＋冬虫夏草Ｃｓ－４（２ｍｇ／ｍｌ）は、ＩＬ－６分泌を最も増加させた。

【0182】

表１０に、マッシュルーム抽出物とＴＨＣまたはＣＢＤとの組合せのＴＮＦα分泌への作用を示す。ＴＮＦα分泌における最大の減少は、ＴＨＣ＋冬虫夏草Ｃｓ－４（０．０８ｍｇ／ｍｌ）で観察されたことから、これは抗炎症活性を示す。

【実施例0183】

マッシュルーム抽出物およびカンナビノイドの様々な組合せでの処置後のｐａｎｃ－１およびｅｇｌ－１細胞の生存率アッセイ
試験システム
ａ．ＰＡＮＣ－１細胞（ヒト膵臓がん細胞）（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、米国メリーランド州ロックビル）。
ｂ．ＥＧＬ－１細胞（ヒト肝外胆管癌）。

【0184】

細胞成長：
ＰＡＮＣ－１／ＥＧＬ－１細胞のための増殖培地：１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのＬ－グルタミン、および１％ペニシリン－ストレプトマイシン溶液（ＰＳ）が補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）高グルコース。

【0185】

ＥＧＬ－１細胞のための増殖培地：１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのＬ－グルタミン、および１％ペニシリン－ストレプトマイシン溶液（ＰＳ）が補充されたＲＰＭＩ－１６４０培地。

【0186】

ＰＡＮＣ－１のためのアッセイ培地：アッセイ培地は、１％ＦＢＳのみを含有していた。
ＥＧＬ－１のためのアッセイ培地：アッセイ培地は、ＤＭＥＭ低グルコース（１ｇ／Ｌ）中に１％ＦＢＳのみを含有していた。

【0187】

実験設計：細胞を試験物質と共にインキュベートすること：
ａ．細胞を８０％の密集度で回収し、計数し、７５×１０^３／ｍｌ（ＰＡＮＣ－１）または５０×１０^３（ＥＧＬ－１）の最終濃度まで増殖培地中に再懸濁した。
ｂ．Ｐａｎｃ－１細胞懸濁液を、細胞７５００個／１００μｌ／ウェルで、９６ウェルのマイクロタイタープレートに植え付け、ＥＧＬ－１細胞懸濁液を、細胞５０００個／１００μｌ／ウェルで、９６ウェルのマイクロタイタープレートに植え付けた。
ｃ．細胞を１８～２４時間インキュベートした（３７±１０℃、５％ＣＯ２）。
ｄ．増殖培地を除去した；８０μＬのアッセイ培地および２０μＬの媒体、試験物質、および対照を添加した。各プレートを表１１、表１２および表１３に示された通りに設計した。
ｅ．全てのウェルの内容物を上下に３回ピペッティングすることによって混合した。
ｆ．プレートを７２±２時間インキュベートした（３７±１℃、５％ＣＯ２）。
ｇ．全てのプレート上の培地を１００μｌの培養培地で置き換えた。

【0188】

ＸＴＴアッセイ
ａ．ＸＴＴ反応溶液を調製した。
ｂ．各ウェルに５０μｌのＸＴＴ反応溶液を添加した。
ｃ．プレートを加湿した雰囲気中（例えば３７℃、５％ＣＯ２）でインキュベートした。ｄ．プレートを穏やかに振盪して、ウェル中に色素を均一に分配した。
ｅ．サンプルの吸光度を、分光光度計（ＥＬＩＳＡリーダー）を用いて、ブランクのようなバックグラウンド対照に対して４５０ｎｍの波長で測定した。
ｆ．参照吸光度を測定するために（非特異的な読み取りを測定するために）、６２０ｎｍの波長を使用して、４５０ｎｍの測定値から引いた。
ｇ．細胞のアイドリングの吸光度は、全てのウェルで０．５～１．５であった。

【0189】

【表20】

【0190】

【表21】

【0191】

表１３：カンナビノイド抽出物のプレートのセットアップ