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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024008233
(43)【公開日】2024-01-19
(54)【発明の名称】フロログルシノール誘導体
(51)【国際特許分類】
C07C 49/84 20060101AFI20240112BHJP
A61K 31/12 20060101ALI20240112BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240112BHJP
A61K 36/73 20060101ALI20240112BHJP
A23L 33/105 20160101ALI20240112BHJP
A23L 2/52 20060101ALI20240112BHJP
【ＦＩ】
C07C49/84 E CSP
A61K31/12
A61P43/00 105
A61K36/73
A23L33/105
A23L2/52
A23L2/00 F
【審査請求】未請求
【請求項の数】5
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022109936
(22)【出願日】2022-07-07
(71)【出願人】
【識別番号】593106918
【氏名又は名称】株式会社ファンケル
(72)【発明者】
【氏名】櫻田 剛史
(72)【発明者】
【氏名】渡邉 知倫
【テーマコード（参考）】
4B018
4B117
4C088
4C206
4H006
【Ｆターム（参考）】
4B018MD08
4B018ME10
4B018MF01
4B117LC04
4B117LG24
4B117LP01
4C088AB51
4C088CA06
4C088CA14
4C088MA16
4C088NA05
4C088NA14
4C088ZB21
4C088ZC52
4C206AA02
4C206AA03
4C206CB19
4C206KA01
4C206NA14
4C206ZB21
4C206ZC52
4H006AA01
4H006AB20
(57)【要約】 （修正有）
【課題】キンミズヒキ抽出物由来の新規化合物を提供することを課題とする。
【解決手段】抗老化作用を有する新規フロログルシノール誘導体として、５つの化合物を見出した。本発明の化学式で表される化合物は、SPiDER－βGalの蛍光値を低下、即ち老化細胞を減少させる作用を有することが確認された。新規フロログルシノール誘導体の一例として、化学式１で表される化合物を見出した。
（化学式１）
【選択図】図１
【解決手段】抗老化作用を有する新規フロログルシノール誘導体として、５つの化合物を見出した。本発明の化学式で表される化合物は、SPiDER－βGalの蛍光値を低下、即ち老化細胞を減少させる作用を有することが確認された。新規フロログルシノール誘導体の一例として、化学式１で表される化合物を見出した。
（化学式１）
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
化学式１で表される化合物。
（化学式１）
【化1】
【請求項2】
化学式２で表される化合物。
（化学式２）
【化2】
【請求項3】
化学式３で表される化合物。
（化学式３）
【化3】
【請求項4】
化学式４で表される化合物。
（化学式４）
【化4】
【請求項5】
化学式５で表される化合物。
（化学式５）
【化5】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗老化作用を有する新規フロログルシノール誘導体に関する。
【背景技術】
【0002】
加齢に伴う老化は様々な臓器の機能低下、代謝低下を引き起こし、多くの疾患に関与している。近年、加齢により蓄積される老化細胞が注目されている。加齢に伴い生体内に老化細胞が増えると、老化細胞の細胞老化随伴分泌現象（Senescence-Associated Secretory Phenotype: SASP）を介し、周囲の組織に慢性炎症や癌が引き起こされると考えられている。老化細胞により惹起された慢性炎症は全身性の代謝不全・異常を引き起こすことが知られている。また、生体内の老化細胞は、加齢だけでなく高脂肪食摂取などの生活習慣の乱れ、過度のストレス、紫外線等によっても引き起こされることが知られている。このような背景から生体内に蓄積した老化細胞を選択的に除去する物質の探索がされており、いくつかの物質では生活習慣病や加齢性疾患の病態が改善することが報告されている（非特許文献１）。
【0003】
本発明者等は、アグリモール及びそれを含有するキンミズヒキ抽出物の機能性について着目して継続して探求し、抗ヘリコバクターピロリ用組成物（特許文献１）、神経活性化用組成物（特許文献２）、免疫老化改善機能（特許文献３）などを既に提案している。
【0004】
【特許文献1】特開２００３-３４２１９０号公報
【特許文献2】特開２０１８-００８８８８号公報
【特許文献3】特開２０２２-００６２５９号公報
【非特許文献1】Ther Adv Chronic Dis. 2020 Oct 13;11:2040622320964125.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
上記の通り老化細胞を除去することにより、様々な疾病や老化に対して改善、治療効果が得られることから老化細胞の除去を促進する新規の物質が求められている。
【0006】
本発明は、老化細胞の除去を促進する新規の抗老化物質を提供することを課題とする。
【0007】
本発明者らは、上記課題について鋭意検討した結果、キンミズヒキ抽出物より老化細胞除去作用を有する新規化合物を見出した。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明の主な構成は次の通りである。
（１）化学式１で表される化合物。
（１）化学式１で表される化合物。
【0009】
【化1】
【0010】
（２）化学式２で表される化合物。
【0011】
【化2】
（化学式２）
【0012】
（３）化学式３で表される化合物。
【0013】
【化3】
【0014】
（４）化学式４で表される化合物。
【0015】
【化4】
【0016】
（５）化学式５で表される化合物。
【0017】
【化5】
【発明の効果】
【0018】
本発明により、抗老化作用を有する新規フロログルシノール誘導体が提供される。本発明の化合物は、SPiDER－βGalの蛍光値を低下、即ち老化細胞を減少させる作用を有することが確認された。
したがって、本発明の化合物は、抗老化用物質として有用であり、さらには、本発明の化合物を含有する飲食品や医薬品として利用することができる。
したがって、本発明の化合物は、抗老化用物質として有用であり、さらには、本発明の化合物を含有する飲食品や医薬品として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】キンミズヒキからの化合物１-５の単離フロー
【図2】化合物１の液体クロマトグラフ－飛行時間型質量分析(LC-TOFMS)データ
【図3】化合物２の液体クロマトグラフ－飛行時間型質量分析(LC-TOFMS)データ
【図4】化合物３の液体クロマトグラフ－飛行時間型質量分析(LC-TOFMS)データ
【図5】化合物４の液体クロマトグラフ－飛行時間型質量分析(LC-TOFMS)データ
【図6】化合物５の液体クロマトグラフ－飛行時間型質量分析(LC-TOFMS)データ
【図7】化合物１の添加によるSPiDER－βGal の蛍光値を示す図
【図8】化合物２の添加によるSPiDER－βGal の蛍光値を示す図
【図9】化合物３の添加によるSPiDER－βGal の蛍光値を示す図
【図10】化合物４の添加によるSPiDER－βGal の蛍光値を示す図
【図11】化合物５の添加によるSPiDER－βGal の蛍光値を示す図
【発明を実施するための形態】
【0020】
本発明の各新規化合物は、キンミズヒキ（金水引、学名: Agrimonia pilosa）を原料として抽出・精製工程を経ることにより得ることができる。また、化学合成によって得ることも可能である。さらにまた、キンミズヒキ以外の植物であっても、本発明の化合物を含有することが確認できた他の植物体からの抽出物や粗精製物、又は植物体の乾燥物や植物体のペーストを用いて、発明の化合物を単離精製することも可能である。
【0021】
キンミズヒキから本発明の化合物を抽出・精製する場合、通常工業的に用いるいずれの抽出・精製工程であっても適宜組み合わせて用いることができる。原料である植物の葉、茎、根、花等を、適切な時期に採取した後、そのまま、若しくは通常通風乾燥等の乾燥工程に付し、抽出原料とする。上記の乾燥した植物体から抽出を行う場合は、公知の抽出方法を採用することができる。
【0022】
すなわち、原料を粉砕若しくは細切した後、溶媒を用いて抽出を行う。抽出溶媒としては、水や、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール等のアルコール類、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類、ヘキサン、クロロホルム等の親油性の溶媒を、単独若しくは混合溶媒として用いることができる。好ましくはエタノールと水の混合溶媒である。抽出温度は、通常0～100℃、好ましくは5～50℃である。抽出時間は、1時間～10日間程度であり、溶媒量は、乾燥原料あたり通常1～30倍重量、好ましくは5～10倍重量である。抽出操作は、攪拌によっても、浸漬放置によっても良い。
抽出操作は、必要に応じて2～3回繰り返しても良い。また市販されているキンミズヒキの抽出エキス品を化合物の単離・精製の原料としても良い。
上記の操作で得られた粗抽出液から、不溶性残渣を濾過若しくは遠心分離により取り除いた抽出液、あるいは植物の搾汁液からの各化合物の精製は、公知の生薬の分離精製方法であればどのようなものでも良い。通常は、二相溶媒分配法、向流分配法、カラムクロマトグラフィー法、分取高速液体クロマトグラフィー法等を単独又は組み合わせて用いることが好ましい。
例えば二相溶媒分配法としては、前記の抽出液からn－ヘキサン、クロロホルム、メチルエチルケトン、酢酸エチル、酢酸メチル等の溶媒と水との分配により、溶媒相へ目的化合物を回収する方法等があげられる。カラムクロマトグラフィー法としては、イオン交換カラムクロマトグラフィー法、担体として順相系、又は逆相系シリカゲルを用いる方法、DIAION-HP20等を用いる吸着カラムクロマトグラフィー法、担体としてSephadex-LH20等の修飾デキストランゲルを用いるゲルろ過法等があげられる。これらを単独若しくは組み合わせて、また、反復して実施する。分取高速液体クロマトグラフィー法としては、オクタデシルシリカ等を用いる逆相系のカラムを用いる方法、シリカゲル等を用いる順相系のカラムを用いる方法等があげられる。
抽出操作は、必要に応じて2～3回繰り返しても良い。また市販されているキンミズヒキの抽出エキス品を化合物の単離・精製の原料としても良い。
上記の操作で得られた粗抽出液から、不溶性残渣を濾過若しくは遠心分離により取り除いた抽出液、あるいは植物の搾汁液からの各化合物の精製は、公知の生薬の分離精製方法であればどのようなものでも良い。通常は、二相溶媒分配法、向流分配法、カラムクロマトグラフィー法、分取高速液体クロマトグラフィー法等を単独又は組み合わせて用いることが好ましい。
例えば二相溶媒分配法としては、前記の抽出液からn－ヘキサン、クロロホルム、メチルエチルケトン、酢酸エチル、酢酸メチル等の溶媒と水との分配により、溶媒相へ目的化合物を回収する方法等があげられる。カラムクロマトグラフィー法としては、イオン交換カラムクロマトグラフィー法、担体として順相系、又は逆相系シリカゲルを用いる方法、DIAION-HP20等を用いる吸着カラムクロマトグラフィー法、担体としてSephadex-LH20等の修飾デキストランゲルを用いるゲルろ過法等があげられる。これらを単独若しくは組み合わせて、また、反復して実施する。分取高速液体クロマトグラフィー法としては、オクタデシルシリカ等を用いる逆相系のカラムを用いる方法、シリカゲル等を用いる順相系のカラムを用いる方法等があげられる。
【0023】
本発明の化合物を含む飲食の形態としては、キンミズヒキ乾燥物を用いたお茶、各化合物の純品、当該新規化合物の部分精製品、キンミズヒキからの粗抽出物を配合した食品などがあげられる。
【0024】
お茶としては、単独又は他の茶原料と混合して用いても良い。他の茶原料としては、緑茶、ウーロン茶、プーアル茶、紅茶、ほうじ茶、玄米茶、杜仲茶、柿の葉茶、桑の葉茶など、通常お茶として食されるものであれば、どのようなものであっても用いることができる。
【0025】
本発明の化合物を含む飲食品の形態としては、お茶のほか、ドリンク剤、ゼリー、ビスケット、錠剤、丸剤、ソフトカプセル剤、ハードカプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤等、通常食品として提供可能な形態であれば、いずれの形態も用いることができる。副原料として、賦形剤、結合剤、滑沢剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、希釈剤、緩衝剤、抗酸化剤、細菌抑制剤等の添加剤を用いることもできる。
【0026】
本発明の化合物を含有する食品による各新規化合物の有効摂取量は、摂取形態、対象者の健康状態、対象者の年齢等により異なるが、通常成人一日あたり通常0.001～100 mg、好ましくは0.01～10 mg、さらに好ましくは0.1～1 mgである。
【0027】
本発明の化合物を含有する医薬品の投与経路としては、特に限定されない。経口投与・直腸内投与等の経腸投与、経鼻投与などの粘膜投与、静脈内投与・皮下投与などの注射投与等を例示できる。本発明の医薬品の剤型としては、投与方法に適した製剤の形態をとることができる。錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、粉末、丸剤、トローチ剤等の固形剤、溶液、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、注射剤などの液剤、ゲル状の製剤などが例示できる。各化合物の純品、精製物、粗精製物等をそのまま投与しても良いが、薬理的に許容される賦形剤とともに投与しても良い。また記憶等に係る神経の活性化に関する有効成分として、本発明の化合物のみを含有させることができる。そして、さらにその他の神経系の活性化に関する有効成分を併用できる。
賦形剤としては、単糖類、二糖類、多糖類、無機塩、油脂、蒸留水などの製剤として一般に使用可能なものであればいずれも用いることができる。製剤化する際には、結合剤、滑沢剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、希釈剤、緩衝剤、抗酸化剤等の添加剤を用いることもできる。
賦形剤としては、単糖類、二糖類、多糖類、無機塩、油脂、蒸留水などの製剤として一般に使用可能なものであればいずれも用いることができる。製剤化する際には、結合剤、滑沢剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、希釈剤、緩衝剤、抗酸化剤等の添加剤を用いることもできる。
【0028】
本発明の各化合物を含む医薬品としての投与量は、投与経路、剤形、疾患の症状、対象者の年齢等により異なる。一般的に、成人一日あたり0.1～1000 mg、好ましくは0.5～300 mg、さらに好ましくは1～100 mgである。
【実施例0029】
以下に、本発明の各化合物をキンミズヒキから抽出精製し、単離した化合物を特定した実施例を示す。また精製した各化合物を用いたSPiDER－βGal試験例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明する。
【0030】
［抽出・分離・精製］
乾燥キンミズヒキ (Agrimonia pilosa) の粉砕物8 kgを10倍量の90%エタノールで1時間還流抽出し、減圧濃縮することでキンミズヒキ抽出物630 gを得た。キンミズヒキ抽出物を合成吸着材を充填したカラムに供し、水→80%メタノール→メタノール→アセトンの順に通液し、アセトン溶出部を減圧濃縮することでアセトン画分66.5gを得た。
アセトン画分をオクチルシリル化シリカゲル (C8) を充填したカラムに供し、0.1%ギ酸／80%メタノール→0.1%ギ酸／90%メタノール→0.1%ギ酸／メタノール→0.1%ギ酸／アセトンの順に通液し、各溶出部を減圧濃縮することで0.1%ギ酸／80%メタノール画分 (13.0 g)、0.1%ギ酸／90%メタノール画分 (16.2 g)、0.1%ギ酸／メタノール画分 (23.2 g)、0.1%ギ酸／アセトン画分 (14.1 g) を得た。
0.1%ギ酸／アセトン画分をシリカゲルを充填したカラムに供し、n-ヘキサン－酢酸エチル混液 (6：1→5：1)→0.1%ギ酸／メタノールの順に通液し、各溶出部を減圧濃縮することでFr.1 (4.3 g)、2 (4.1 g)、3 (730 mg)、4 (4.7 g)を得た。
Fr.3を更にシリカゲルを充填したカラムに供し、n-ヘキサン－酢酸エチル (6：1)→メタノールの順に通液し、各溶出部を減圧濃縮することでFr.3-1 (122 mg)、3-2 (158 mg)、3-3 (450 mg) を得た。
Fr.3-1をオクタデシル化シリカゲル(C18)カラムを用いた分取HPLCに供し、アセトニトリル－水－0.05%トリフルオロ酢酸系溶媒で分画し、各画分を減圧濃縮することで化合物1 (1 mg)、2 (2 mg)、3 (2 mg)、5 (9 mg) を得た。
Fr.2をC18を充填したカラムに供し、0.1%ギ酸／95%メタノール→0.1%ギ酸／メタノール→0.1%ギ酸／アセトンの順に通液し、各溶出部を減圧濃縮することでFr.2-1 (183 mg)、Fr.2-2 (350 mg)、Fr.2-3 (2.1 g) を得た。
Fr.2-2 をC18カラムを用いた分取HPLCに供し、アセトニトリル－水／0.05%トリフルオロ酢酸系溶媒で分画し、各画分を減圧濃縮することで化合物2 (16 mg)、3 (6 mg)、4 (5 mg) を得た。
Fr.2-3をC8カラムを用いた分取HPLCに供し、アセトニトリル－水－0.05%ギ酸系溶媒で分画し、各画分を減圧濃縮しFr.2-3-1 (105 mg)、2-3-2 (159 mg)、2-3-3 (305 mg)、Fr.2-3-4 (60 mg) を得た。
Fr.2-3-4をフェニル化シリカゲル (Ph) カラムを用いた分取HPLCに供し、メタノール－水－0.05%ギ酸系溶媒で分画し、精製物 (21 mg) を得た。精製物をC18カラムを用いた分取HPLCに供し、アセトニトリル－水／0.05%トリフルオロ酢酸系溶媒で分画し、化合物4(10 mg) を得た。
化合物1-5の分画フローを図1に示す。
乾燥キンミズヒキ (Agrimonia pilosa) の粉砕物8 kgを10倍量の90%エタノールで1時間還流抽出し、減圧濃縮することでキンミズヒキ抽出物630 gを得た。キンミズヒキ抽出物を合成吸着材を充填したカラムに供し、水→80%メタノール→メタノール→アセトンの順に通液し、アセトン溶出部を減圧濃縮することでアセトン画分66.5gを得た。
アセトン画分をオクチルシリル化シリカゲル (C8) を充填したカラムに供し、0.1%ギ酸／80%メタノール→0.1%ギ酸／90%メタノール→0.1%ギ酸／メタノール→0.1%ギ酸／アセトンの順に通液し、各溶出部を減圧濃縮することで0.1%ギ酸／80%メタノール画分 (13.0 g)、0.1%ギ酸／90%メタノール画分 (16.2 g)、0.1%ギ酸／メタノール画分 (23.2 g)、0.1%ギ酸／アセトン画分 (14.1 g) を得た。
0.1%ギ酸／アセトン画分をシリカゲルを充填したカラムに供し、n-ヘキサン－酢酸エチル混液 (6：1→5：1)→0.1%ギ酸／メタノールの順に通液し、各溶出部を減圧濃縮することでFr.1 (4.3 g)、2 (4.1 g)、3 (730 mg)、4 (4.7 g)を得た。
Fr.3を更にシリカゲルを充填したカラムに供し、n-ヘキサン－酢酸エチル (6：1)→メタノールの順に通液し、各溶出部を減圧濃縮することでFr.3-1 (122 mg)、3-2 (158 mg)、3-3 (450 mg) を得た。
Fr.3-1をオクタデシル化シリカゲル(C18)カラムを用いた分取HPLCに供し、アセトニトリル－水－0.05%トリフルオロ酢酸系溶媒で分画し、各画分を減圧濃縮することで化合物1 (1 mg)、2 (2 mg)、3 (2 mg)、5 (9 mg) を得た。
Fr.2をC18を充填したカラムに供し、0.1%ギ酸／95%メタノール→0.1%ギ酸／メタノール→0.1%ギ酸／アセトンの順に通液し、各溶出部を減圧濃縮することでFr.2-1 (183 mg)、Fr.2-2 (350 mg)、Fr.2-3 (2.1 g) を得た。
Fr.2-2 をC18カラムを用いた分取HPLCに供し、アセトニトリル－水／0.05%トリフルオロ酢酸系溶媒で分画し、各画分を減圧濃縮することで化合物2 (16 mg)、3 (6 mg)、4 (5 mg) を得た。
Fr.2-3をC8カラムを用いた分取HPLCに供し、アセトニトリル－水－0.05%ギ酸系溶媒で分画し、各画分を減圧濃縮しFr.2-3-1 (105 mg)、2-3-2 (159 mg)、2-3-3 (305 mg)、Fr.2-3-4 (60 mg) を得た。
Fr.2-3-4をフェニル化シリカゲル (Ph) カラムを用いた分取HPLCに供し、メタノール－水－0.05%ギ酸系溶媒で分画し、精製物 (21 mg) を得た。精製物をC18カラムを用いた分取HPLCに供し、アセトニトリル－水／0.05%トリフルオロ酢酸系溶媒で分画し、化合物4(10 mg) を得た。
化合物1-5の分画フローを図1に示す。
【0031】
［単離した化合物の化学構造の決定］
図7－11に示すように、化合物1-5の化学構造は液体クロマトグラフ－飛行時間型質量分析計(LC-TOFMS)で取得したデータと核磁気共鳴装置(NMR)で取得したデータを非特許文献1に記載されているAgrimol Bのデータと比較することで決定した。
非特許文献1：Chin. Tradit. Herb. Drugs. 2011; 42(2): 255-256.
図7－11に示すように、化合物1-5の化学構造は液体クロマトグラフ－飛行時間型質量分析計(LC-TOFMS)で取得したデータと核磁気共鳴装置(NMR)で取得したデータを非特許文献1に記載されているAgrimol Bのデータと比較することで決定した。
非特許文献1：Chin. Tradit. Herb. Drugs. 2011; 42(2): 255-256.
【0032】
［LC条件］
【0033】
［TOFMS条件］
【0034】
［NMR条件］
【0035】
[化合物1]
Molecular formula: C34H40O12
HR negative-ion ESI-MS: calculated for C34H39O12: m/z 639.2442 [M-H]-, found: 639.2463
Molecular formula: C34H40O12
HR negative-ion ESI-MS: calculated for C34H39O12: m/z 639.2442 [M-H]-, found: 639.2463
【0036】
【化6】
【0037】
[化合物2]
Molecular formula: C35H42O12
HR negative-ion ESI-MS: calculated for C35H41O12: m/z 653.2598 [M-H]-, found: 653.2595
Molecular formula: C35H42O12
HR negative-ion ESI-MS: calculated for C35H41O12: m/z 653.2598 [M-H]-, found: 653.2595
【0038】
【化7】
【0039】
[化合物3]
Molecular formula: C38H48O12
HR negative-ion ESI-MS: calculated for C38H47O12: m/z 695.3068 [M-H]-, found: 695.3074
Molecular formula: C38H48O12
HR negative-ion ESI-MS: calculated for C38H47O12: m/z 695.3068 [M-H]-, found: 695.3074
【0040】
【化8】
【0041】
[化合物4]
Molecular formula: C38H48O12
HR negative-ion ESI-MS: calculated for C38H47O12: m/z 695.3068 [M-H]-, found: 695.3065
Molecular formula: C38H48O12
HR negative-ion ESI-MS: calculated for C38H47O12: m/z 695.3068 [M-H]-, found: 695.3065
【0042】
【化9】
【0043】
[化合物5]
Molecular formula: C37H46O12
HR negative-ion ESI-MS: calculated for C37H45O12: m/z 681.2911 [M-H]-, found: 681.2917
Molecular formula: C37H46O12
HR negative-ion ESI-MS: calculated for C37H45O12: m/z 681.2911 [M-H]-, found: 681.2917
【0044】
【化10】
【0045】
老化細胞除去作用の評価
[培養および処置方法]
ヒト胎児肺線維芽細胞WI38を5x104 cells/mLの濃度になるように10% FBS、1% ペニシリン-ストレプトマイシン(Sigma-Aldrich)、1% 非必須アミノ酸溶液(Sigma-Aldrich)を含むMEM培地(Sigma-Aldrich)で懸濁し、ブラッククリアボトム96ウェルプレート(Greiner)に100 μLずつ播種し、37℃、5% CO2下で24時間培養した。培養24時間後にドキソルビシンを終濃度62.5 nMとなるように添加し更に24時間培養した。ドキソルビシン添加下で24時間培養した後、ドキソルビシンを添加していない培地に交換し、2日間培養を行った。2日間培養した後、培地を交換し化合物1-5 を0（無添加：Control）、0.1、0.3、1.0μg/mLの濃度で添加し3日間培養した。
[培養および処置方法]
ヒト胎児肺線維芽細胞WI38を5x104 cells/mLの濃度になるように10% FBS、1% ペニシリン-ストレプトマイシン(Sigma-Aldrich)、1% 非必須アミノ酸溶液(Sigma-Aldrich)を含むMEM培地(Sigma-Aldrich)で懸濁し、ブラッククリアボトム96ウェルプレート(Greiner)に100 μLずつ播種し、37℃、5% CO2下で24時間培養した。培養24時間後にドキソルビシンを終濃度62.5 nMとなるように添加し更に24時間培養した。ドキソルビシン添加下で24時間培養した後、ドキソルビシンを添加していない培地に交換し、2日間培養を行った。2日間培養した後、培地を交換し化合物1-5 を0（無添加：Control）、0.1、0.3、1.0μg/mLの濃度で添加し3日間培養した。
【0046】
[SA β-Gal活性の評価]
細胞数をCell Count Normalization Kit (DOJINDO)の添付説明書に従い蛍光プレートリーダーで測定した(Ex：350 nm/ Em：461 nm)。細胞数を測定後、反応液を除去し、PBSで洗浄した。続いて、細胞のSenescence-associated β-galactosidase (SA β-Gal)活性をCellular Senescence Plate Assay Kit - SPiDER-βGal (DOJINDO)の添付説明書に従い蛍光プレートリーダーで測定した(Ex：500 nm / Em：550 nm)。得られた蛍光値は先にCell Count Normalization Kitで測定した蛍光値で補正を行った。
細胞数をCell Count Normalization Kit (DOJINDO)の添付説明書に従い蛍光プレートリーダーで測定した(Ex：350 nm/ Em：461 nm)。細胞数を測定後、反応液を除去し、PBSで洗浄した。続いて、細胞のSenescence-associated β-galactosidase (SA β-Gal)活性をCellular Senescence Plate Assay Kit - SPiDER-βGal (DOJINDO)の添付説明書に従い蛍光プレートリーダーで測定した(Ex：500 nm / Em：550 nm)。得られた蛍光値は先にCell Count Normalization Kitで測定した蛍光値で補正を行った。
【0047】
[結果]
図７－１１に示すように、化合物1-5の添加によりSPiDER-βGalの蛍光値が低下、即ち老化細胞数の低下が確認された。
これらの結果から、化合物1-5に老化細胞を除去する作用があることが明らかとなった。
図７－１１に示すように、化合物1-5の添加によりSPiDER-βGalの蛍光値が低下、即ち老化細胞数の低下が確認された。
これらの結果から、化合物1-5に老化細胞を除去する作用があることが明らかとなった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】